SE506461C2 - Method for size fractionation of high molecular weight molecules, using electroosmotic flow in a capillary tube - Google Patents

Abstract

A process for the size-fractionation of high-molecular-weight molecules in a mixture thereof using an electroosmotic flow of said molecules contained in a low ionic strength buffer, said process being performed in a capillary tube. The invention is based on the concept of using a capillary tube having an inner diameter not exceeding the cross-sectional size of the largest molecules by a factor greater than about 10 (ten).

Description

sne 461 2 10 l5 20 25 30 35 en packad kolonn eller i en öppen rörformig mikrokapillär R.; J.; Anal.Chem. 58 (86) 3036) under användning av ett enkelt lösningsmedel (Tijssen, Bos, van Kreveld, M.E., för masstransport. Separationen beror på närvaron av en tryckinducerad hastighetsprofil med Poisseuille-flöde el- ler Taylor-flöde inne i röret, vari stora partiklar på basis av sin storlek exkluderas från de långsammaste strömningslinjerna närmast väggen. Detta medför att de Elektrostatiska effek- ter, speciellt uttalade i buffertar av låg jonstyrka, kan elueras före de mindre analyterna. även påverka denna separationsprocess (DosRamos, G.J.; Silebi, C.A., J.Colloid Interface Sci. 133 (89) 302) ge- nom en elektrisk dubbelskiktrepulsion mellan laddade ytor och analyter. sne 461 2 10 l5 20 25 30 35 a packed column or in an open tubular microcapillary R .; J .; Anal.Chem. 58 (86) 3036) using a single solvent (Tijssen, Bos, van Kreveld, ME) for mass transport, the separation being due to the presence of a pressure-induced velocity profile with Poisseuille flow or Taylor flow inside the tube, in which large particles on the basis of its size is excluded from the slowest flow lines closest to the wall, which means that the electrostatic effects, especially pronounced in buffers of low ionic strength, can be eluted before the smaller analytes, also affect this separation process (DosRamos, GJ; Silebi, CA J.Colloid Interface Sci. 133 (89) 302) by means of an electrical double layer repulsion between charged surfaces and analytes.

Det är välkänt att det elektrokinetiska bulkflödes- beteendet i en kapillär påverkas genom egenskaper hos det elektriska dubbelskikt som föreligger nära intill den ka- pillära innerytan. Kapillära elektroforesseparationer ut- föres vanligen i rör med en radie av 25-50 um och i buf- fertar med saltkoncentrationer inom mM-området. När en spänning appliceras över en sådan kapillär är den obser- verade elektroosmotiska flödesprofilen i huvudsak platt J.W.; K.D., 218 (81) 209) och överlagras den elektroforetiska separationen.It is well known that the electrokinetic bulk flow behavior of a capillary is affected by properties of the electrical bilayer located close to the capillary inner surface. Capillary electrophoresis separations are usually performed in tubes with a radius of 25-50 μm and in buffers with salt concentrations within the mM range. When a voltage is applied across such a capillary, the observed electroosmotic flow profile is substantially flat J.W .; K.D., 218 (81) 209) and superimposed on the electrophoretic separation.

(Jorgensson, Lukacs, J.Chromatogr.(Jorgensson, Lukacs, J.Chromatogr.

Teoretiska beräkningar har emellertid visat, att det är möjligt att erhålla en elektroosmotisk flödeshastighets- profil liknande det tryckinducerade Poisseuille-flödet i rör med små innerdiametrar och vätskemedia med låga C.L.; Whitehead, R., J.Phys.Chem. 69 Enligt dessa beräkningar alstras en nära pa- jonstyrkor (Rice, (65) 4017). rabolisk flödesprofil när de radiellt motstående elek- triska dubbelskikten börjar överlappa varandra.However, theoretical calculations have shown that it is possible to obtain an electroosmotic flow rate profile similar to the pressure-induced Poisseuille flow in small inner diameter tubes and low C.L. Liquid media; Whitehead, R., J.Phys.Chem. 69 According to these calculations, a close peony strength is generated (Rice, (65) 4017). rabolic flow profile when the radially opposite electric double layers begin to overlap.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ny teknik, varmed de med den kända tekniken såsom diskuterats ovan förknippade problemen elimineras eller åtminstone väsentligt reduceras.An object of the present invention is to provide new technology, whereby the problems associated with the known technology as discussed above are eliminated or at least substantially reduced.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att 15 20 25 30 35 3 sos 4e1 åstadkomma ett förfarande för storleksfraktionering av molekyler med hög molekylvikt, vilket förfarande baseras på användning av ett elektroosmotiskt flöde av nämnda mo- lekyler innehàllna i en buffert, företrädesvis med låg jonstyrka, såsom mindre än ca 10 mM. Den undre gränsen bestämmes av kravet att det elektriska dubbelskiktet nätt och jämnt etableras. Ännu ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande för sådan storleksfraktionering av ett spektrum av molekyler under användning av mycket trånga kapillära rör med innerdiametrar av mindre än ca l nM.Another object of the present invention is to provide a method for size fractionation of high molecular weight molecules, which method is based on the use of an electroosmotic flow of said molecules contained in a buffer, preferably with low ionic strength. , such as less than about 10 mM. The lower limit is determined by the requirement that the electric double layer is barely established. Yet another object of the invention is to provide a method for such size fractionation of a spectrum of molecules using very narrow capillary tubes with inner diameters of less than about 1 nM.

Ytterligare ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma separation av molekyler med hög molekylv;kt,= varav de större har tvärsnittsdimensioner som närmar sig innerdimensionerna hos de använda kapillärrören. _ Ännu ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande, varigenom ett acceptabelt flöde i ett ka- pillärrör kan alstras som ej kunde erhållas genom att tillgripa hydrodynamisk separation under användning av ett externt inloppstryck.A further object of the invention is to provide separation of high molecular weight molecules, the larger ones of which have cross-sectional dimensions approaching the inner dimensions of the capillary tubes used. Yet another object of the invention is to provide a method by which an acceptable flow in a capillary tube can be generated which could not be obtained by resorting to hydrodynamic separation using an external inlet pressure.

För dessa och andra ändamål som kommer att förstås genom följande framställning åstadkommes genom uppfin- ningen ett förfarande för storleksfraktionering av mole- kyler med hög molekylvikt under användning av ett elek- troosmotiskt flöde av nämnda molekyler innehàllna iïen buffert av låg jonstyrka, varvid nämnda förfarande utfö¥ res i ett kapillärrör. Uppfinningen baserar sig på sär- draget av att använda ett kapillärrör som har en innerdi- ameter, vilken ej överstiger de största molekylernas" tvärsnittsstorlek med en faktor större än ca 10.For these and other purposes which will be understood from the following preparation, the invention provides a process for size fractionation of high molecular weight molecules using an electrosmotic flow of said molecules containing a low ionic strength buffer, said process carrying out Taken in a capillary tube. The invention is based on the feature of using a capillary tube having an inner diameter which does not exceed the cross-sectional size of the largest molecules by a factor greater than about 10.

I föreliggande framställning betyder uttrycket ”tvärsnittsstorlek” bruttodimensionen i ett plan vinkel~ rätt mot kapillärrörets längdriktning under driftbeting; elser.In the present invention, the term "cross-sectional size" means the gross dimension at a flat angle ~ right with the longitudinal direction of the capillary tube under operating condition; elser.

Ett föredraget operativt intervall för en sådan fak- tor är från ca 2 till ca 10. Även om detta intervall en+ dast är föredraget kan en faktor av mindre än 2 reducera 10 15 20 25 30 35 den fria rörligheten hos större molekyler, medan vid fak- torer överstigande lO fraktioneringseffektiviteten tende- rar att minska.A preferred operative range for such a factor is from about 2 to about 10. Although this range a + only is preferred, a factor of less than 2 may reduce the free movement of larger molecules, while in fact tors in excess of 10 fractionation efficiency tend to decrease.

Uttryckt i absoluta tal är det föredraget att inner- diametern av de använda kapillärrören företrädesvis är mindre än ca 1 um och kan speciellt vara ca 500 nm eller mindre.Expressed in absolute numbers, it is preferred that the inner diameter of the capillary tubes used is preferably less than about 1 μm and may in particular be about 500 nm or less.

Den undre gränsen för innerdiametern för de vid fraktioneringsprocessen använda kapillärrören är ej spe- ciellt kritisk och kan vara väsentligt mindre än 500 nm.The lower limit of the inner diameter of the capillary tubes used in the fractionation process is not particularly critical and may be substantially less than 500 nm.

I praktiken begränsas den undre gränsen måhända av möj- ligheten att åstadkomma mycket små diametrar medan an- vändbara kapillärrör ändå erhålles.In practice, the lower limit may be limited by the possibility of achieving very small diameters while still obtaining usable capillary tubes.

Rörlängden kan variera inom mycket vida gränser och ett praktiskt område kan vara från ca 10 cm till ca 10 m, varvid ett speciellt föredraget område är från ca 20 cm till ca 2 m.The pipe length can vary within very wide limits and a practical range can be from about 10 cm to about 10 m, with a particularly preferred range being from about 20 cm to about 2 m.

Med avseende på fraktioneringen av molekyler bärande en elektrisk laddning är det enligt en utföringsform av uppfinningen med användning av laddade molekyler nödvän- digt att molekylerna har ett nettoladdningstecken som är detsamma som det för kapillärrörets vägg. Genom ett så- dant arrangemang erhålles en fraktionering varigenom mindre molekyler rör sig snabbare än stora molekyler.With respect to the fractionation of molecules carrying an electric charge, according to an embodiment of the invention, using charged molecules, it is necessary that the molecules have a net charge sign which is the same as that of the capillary wall. By such an arrangement a fractionation is obtained whereby smaller molecules move faster than large molecules.

Om å andra sidan de molekyler som skall separeras är i huvudsak oladdade resulterar förfarandet i en situation där stora molekyler rör sig snabbare än små molekyler.On the other hand, if the molecules to be separated are substantially uncharged, the process results in a situation where large molecules move faster than small molecules.

De molekyler som skall separeras genom användning av förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan ha en mo- lekylstorlek som varierar inom mycket vida gränser. Mole- kylvikten kan sålunda variera från storleksordningen 106 och kan uppnå mycket höga värden, såsom flera tiotal mil- lioner och t o m upp till flera miljarder. Vilka som helst högmolekylära molekyler kan separeras under till- gripande av tekniken enligt föreliggande uppfinning, och som exempel kan nämnas proteiner, DNA, RNA, polysackari- der, organiska polymerer etc. Föreliggande uppfinning är 10 15 20 25 30 35 5 sne 461 speciellt lämpad för fraktionering av molekyler tillhö- rande det biotekniska omràdet, såsom proteiner, DNA:n och RNA:n.The molecules to be separated using the method of the present invention can have a molecular size that varies within very wide limits. The molecular weight can thus vary from the order of 106 and can reach very high values, such as several tens of millions and even up to several billion. Any high molecular weight molecules can be separated using the technique of the present invention, and examples include proteins, DNA, RNA, polysaccharides, organic polymers, etc. The present invention is particularly suitable. for fractionation of molecules belonging to the biotechnological field, such as proteins, DNA and RNA.

Föreliggande uppfinning är sålunda baserad på det nya konceptet med tillgripande av användning av ett elek- troosmotiskt flöde, varigenom flödesprofilen utnyttjas för storleksfraktionering. Detta àstadkommes genom an- vändning av mycket smala kapillärrör inom en diameterdi- mension inom nanometerområdet. Màlanalyterna är molekyler med molekylstorlekar som nästan närmar sig kapillärrörets innerdiameter. Det är föredraget att använda en buffert av låg jonstyrka, och ett elektriskt fält appliceras_över kapillärröret för att framdriva vätskeseparationsmediet genom röret. Det betonas åter att det ej är lämpligt att använda ett internt inloppstryck för att alstra den er- forderliga flödet i en kapillär av sådan dimensionf Tryckdriven hydrodynamisk separation är med andra ord ej praktiskt användbar för att åstadkomma den önskade frak- tioneringen. ä I V Föreliggande uppfinning kommer nu att ytterligare illustreras mera i detalj under hänvisning till bifàgda ritningar, vari: Fig. l är en schematisk illustration av flödesbe- tingelserna i ett kapillärrör, där de molekyler som ska fraktioneras har en laddning av samma tecken som den för de omgivande kapillärinnerväggarna; un Fig. 2 är en motsvarande illustration, där neutrala eller oladdade molekyler underkastas fraktionering; Fig. 3A är ett diagram som visar separation i enlig- het med uppfinningen vid 4 olika jonstyrkor i de använda buffertlösningarna; Fig. 3B visar storlekarna av de molekylära fraktio- nerna av den använda blandningen angivna i tusental bas- (kbp); Fig. 4A visar ett diagram över fraktioneringen av en par blandning av molekyler under användning av uppfinningen: och 506 461 6 10 15 20 25 30 35 Fig. 4B visar storlekarna av molekylerna i nämnda blandning àtergivna i kbp.The present invention is thus based on the new concept of resorting to the use of an electroosmotic flow, whereby the flow profile is used for size fractionation. This is achieved by using very narrow capillary tubes within a diameter dimension within the nanometer range. The target analytes are molecules with molecular sizes that almost approach the inner diameter of the capillary tube. It is preferred to use a low ionic strength buffer, and an electric field is applied across the capillary tube to propel the liquid separation medium through the tube. It is again emphasized that it is not suitable to use an internal inlet pressure to generate the required flow in a capillary of such a dimension. In other words, pressure-driven hydrodynamic separation is not practically useful in achieving the desired fractionation. IV The present invention will now be further illustrated in more detail with reference to the accompanying drawings, in which: Fig. 1 is a schematic illustration of the flow conditions in a capillary tube, where the molecules to be fractionated have a charge of the same sign as that of the surrounding capillary inner walls; Fig. 2 is a corresponding illustration, in which neutral or uncharged molecules are subjected to fractionation; Fig. 3A is a graph showing separation in accordance with the invention at 4 different ionic strengths in the buffer solutions used; Fig. 3B shows the sizes of the molecular fractions of the mixture used, expressed in thousands of bases (kbp); Fig. 4A shows a diagram of the fractionation of a pair of mixtures of molecules using the invention: and Fig. 4B shows the sizes of the molecules in said mixture represented in kbp.

Två huvudtyper för det nya separationssystemet kan särskiljas, vilka baseras pà olika mekanismer.Two main types of the new separation system can be distinguished, which are based on different mechanisms.

Figur 1 visar den första typen, där analyterna har en nettoladdning med samma laddningstecken som kapillär- väggen. Figur 1 illustrerar med andra ord schematiskt principen med en separation baserad pà närvaro av en dif- ferentiell elektroosmotisk flödesprofil och en repelle- rande elektrostatisk kraft. En storleksseparation mellan de mindre molekylerna (1) och de större molekylerna (2) i analyten beror på den hastighetsskillnad som de två kom- ponenterna underkastas genom att de upptar en olikartad (4). porten av analyterna genom elektroosmotiskt flöde (3) del av tvärsnitts-ytan i kapillärröret Under trans- tvingas de samtidigt mot kapillärens centrum genom en elektrostatisk repulsion som utövas av de laddade kapil- lärväggarna (feta pilar, Fig. 1). Molekylens hastighet kan genom en första approximation beräknas genom integre- ring av dess hastighetskomponenter i olika strömningslin- jer över dess tvärsnitt och dividering av det erhållna värdet med dess tvärsnittsyta. De större komponenterna (2) kommer att påverkas mera av de långsammare ström- ningslinjerna närmare kapillärväggarna och kommer därför att inbromsas jämfört med de mindre komponenterna. De elektrostatiska krafter som repellerar negativt laddade molekyler bort från kapillärväggen och fokuserar dem i potentialkällan i kapillärens centrum nedbringar även möjligheten för skadlig provadsorption.Figure 1 shows the first type, where the analytes have a net charge with the same charge sign as the capillary wall. In other words, Figure 1 schematically illustrates the principle of a separation based on the presence of a differential electroosmotic flow profile and a repellent electrostatic force. A size separation between the smaller molecules (1) and the larger molecules (2) in the analyte depends on the rate difference that the two components are subjected to by occupying a different one (4). port of the analytes by electroosmotic flow (3) part of the cross-sectional area of the capillary tube During trans- forced they are simultaneously towards the center of the capillary by an electrostatic repulsion exerted by the charged capillary walls (fat arrows, Fig. 1). The velocity of the molecule can be calculated by a first approximation by integrating its velocity components in different flow lines over its cross section and dividing the obtained value by its cross section area. The larger components (2) will be affected more by the slower flow lines closer to the capillary walls and will therefore be decelerated compared to the smaller components. The electrostatic forces that repel negatively charged molecules away from the capillary wall and focus them in the potential source in the center of the capillary also reduce the possibility of harmful sample adsorption.

I den andra typen kan oladdade molekyler separeras genom samma mekanism som vid hydrodynamisk kromatografi, såsom illustreras i Figur 2. Denna figur illustrerar så- lunda schematiskt principen för separationsmekanismen för HDC i kapillärrör. De större partiklarna är i större ut- sträckning steriskt hindrade från att nå de làngsammaste strömningslinjerna nära väggen av en cylindrisk kapillär.In the second type, uncharged molecules can be separated by the same mechanism as in hydrodynamic chromatography, as illustrated in Figure 2. This figure thus schematically illustrates the principle of the separation mechanism for HDC in capillary tubes. The larger particles are to a greater extent sterically prevented from reaching the slowest flow lines near the wall of a cylindrical capillary.

Här är elueringsordningen omkastad jämförd med i det 10 15 20 25 30 35 7 5Û6;461 första fallet. Eftersom molekylerna ej underkastas elek- trostatisk repellering från kapillärväggen kommer de att fördelas statistiskt över kapillärens hela tvärsnitt, varvid drivkraften utgöres av molekylär diffusion; Mole- kyler med en radie inom storleksomràdet för kapillärens innerdiameter kommer att fraktioneras alltefter storlek, eftersom hela tvärsnittet hos de mindre molekylerna kan uppehålla sig även i de långsammare regionerna näfa väg- gen, vilket ej är möjligt för de större molekylerna. I motsats till situationen i det första fallet kommer de sålunda att transporteras med lägre hastighet än de stör- re molekylerna. Denna separationsprincip är på ett grund- läggande sätt likartad den klassiska hydrodynamiska kro- matografin. Den väsentliga skillnaden som ligger i före- liggande uppfinning är emellertid det sätt varpå flödet alstras för àstadkommande av den hydrodynamiska separa- tionen. Exklusionsskiktet för smà partiklar illustreras i figur 2 med den övre streckade linjen, medan exklusions- skiktet för stora partiklar illustreras med den streckade linjen nedtill i figuren.Here, the elution order is reversed compared to in the first case. Since the molecules are not subjected to electrostatic repelling from the capillary wall, they will be distributed statistically over the entire cross-section of the capillary, the driving force being molecular diffusion; Molecules with a radius within the size range of the inner diameter of the capillary will be fractionated according to size, since the entire cross-section of the smaller molecules can reside even in the slower regions near the wall, which is not possible for the larger molecules. In contrast to the situation in the first case, they will thus be transported at a lower speed than the larger molecules. This separation principle is fundamentally similar to classical hydrodynamic chromatography. However, the essential difference inherent in the present invention is the manner in which the flow is generated to effect the hydrodynamic separation. The exclusion layer for small particles is illustrated in Figure 2 with the upper dashed line, while the exclusion layer for large particles is illustrated with the dashed line at the bottom of the figure.

Den första typen som illustreras i Figur 1, där lad- dade molekyler separeras, är speciellt riktad mot store leksseparation med fritt flöde av stora biomolekyler, så- som DNA, i ett pulslöst elektriskt fält. Uppfinningen är emellertid ej inskränkt till denna speciella tillämpning.The first type illustrated in Figure 1, where charged molecules are separated, is specifically directed to large free flow separation of large biomolecules, such as DNA, in a pulse-free electric field. However, the invention is not limited to this particular application.

Uppfinningen kommer nu att ytterligare illustreras genom exempel under hänvisning till figurerna 3A, SB, 4A och 4B, men det bör observeras, att dessa exempel ej är avsedda att inskränka uppfinningens omfattning.The invention will now be further illustrated by way of example with reference to Figures 3A, SB, 4A and 4B, but it should be noted that these examples are not intended to limit the scope of the invention.

EXEMPBL 1 I detta exempel användes en blandning av lamda-DNA- fragment digererade under användning av Bind III i en koncentration av 0,7 ng/pl. Denna blandnings sammansätt- ning återges i Figur 3B, varvid de respektive talen avser kilobaspar.EXAMPLE 1 In this example, a mixture of lamda DNA fragments digested using Bind III at a concentration of 0.7 ng / μl was used. The composition of this mixture is shown in Figure 3B, the respective figures referring to kilobase pairs.

Storleksfraktioneringen i enlighet med föreliggande 506 10 15 20 25 30 35 461 8 uppfinning utföres under användning av kapillärrör med en ytterdiameter av 40 um och en innerdiameter av 0,5 um.The size fractionation in accordance with the present invention is carried out using capillary tubes having an outer diameter of 40 μm and an inner diameter of 0.5 μm.

Kapillärrörets aktiva längd är 60 cm. Kapillärrören fyl- les från början med en boratbuffert, vars jonstyrka vari- eras från 50 mM ned till 50 uM, Varje kapillär innehållande från början boratbuffert fyl- såsom visas i Figur 3A. les sedan vid dess ena ände med DNA-blandningen genom elektrokinetisk injektion från den ena änden under 8 se- kunder vid en pàlagd spänning av 4700 V.The active length of the capillary tube is 60 cm. The capillary tubes are initially filled with a borate buffer, the ionic strength of which varies from 50 mM down to 50 μM. Each capillary containing initially borate buffer is filled as shown in Figure 3A. then read at one end of the DNA mixture by electrokinetic injection from one end for 8 seconds at a applied voltage of 4700 V.

De sålunda fyllda kapillärrören underkastas därefter storleksfraktionering av innehàllna analyter i enlighet med föreliggande uppfinning under användning av en sepa- rationsspänning över röret av +10 000 V, en fältstyrka av ca 170 V/cm, och resultatet av fraktioneringen bestämmes genom användning av laserinducerad fluorescensdetekte- ring. För detekteringen färgas DNA-fragmenten före fyll- ningen först med en bis-interkalator YoYo (Molecular Pro- bes, Eugene OR, USA). En Ar+-laserinducerad detektor med konfokal fluroescens (488 nm exitation) användes som de- tekteringsanordning.The capillary tubes thus filled are then subjected to size fractionation of contained analytes in accordance with the present invention using a separation voltage across the tube of +10 000 V, a field strength of about 170 V / cm, and the result of the fractionation is determined using laser-induced fluorescence detection. ring. For detection, the DNA fragments are first stained before filling with a bis-intercalator YoYo (Molecular Probes, Eugene OR, USA). An Ar + laser-induced detector with confocal fluorescence (488 nm excitation) was used as a detection device.

Figur 3 visar resultaten av fraktioneringen utförd i enlighet med föreliggande uppfinning, och det framgår att sänkning av jonstyrkan hos den använda bufferten resulte- rar i förbättrad separation. En jonstyrka av 50 uM ger sålunda effektiv separation av DNA-molekylerna, en sepa- ration som ej kunde uppnås genom att tillgripa hydrodyna- misk separation av konventionellt slag, eftersom ett ka- pillärrör med en innerdiameter av ca 0,5 uM ej genom ex- ternt applicerat tryck kunde åstadkomma ett användbart flöde genom kapillären så att en praktiskt användbar se- paration kunde uppnås.Figure 3 shows the results of the fractionation performed in accordance with the present invention, and it can be seen that lowering the ionic strength of the buffer used results in improved separation. An ionic strength of 50 μM thus provides efficient separation of the DNA molecules, a separation which could not be achieved by resorting to hydrodynamic separation of conventional kind, since a capillary tube with an inner diameter of about 0.5 μM does not by e.g. ternally applied pressure could provide a useful flow through the capillary so that a practically useful separation could be achieved.

EXEMPEL 2 Ett experiment liknande det i Exempel 1 ovan be- skrivna utföres med användning av en guideline GX-174 ladder som DNA-fragmentblandning med en sammansättning enligt Figur 4B, åter angiven som kbp. I detta exempel 10 15 20 25 30 35 9 2 soei4e1 användes en jonstyrka hos bufferten av 50 uM, och injek- tionen av provet utföres i 25 sekunder vid en applicerad spänning av 4000 V. Själva separationen utföres vid en applicerad spänning om 2000 V.EXAMPLE 2 An experiment similar to that described in Example 1 above is performed using a guideline GX-174 ladder as a DNA fragment mixture with a composition according to Figure 4B, again indicated as kbp. In this example, an ionic strength of the buffer of 50 μM is used, and the injection of the sample is performed for 25 seconds at an applied voltage of 4000 V. The separation itself is performed at an applied voltage of 2000 V.

Figur 4A visar resultatet av separationen utförd i enlighet med föreliggande uppfinning, och såsom framgår av diagrammet erhålles en mycket effektiv separation el- ler fraktionering av de 25 komponenterna i blandningen. I själva verket motsvarar de individuella toppar som kan ses i Figur 4A enkla DNA-molekyler. Återigen kan sägas att denna separation kunde ej erhållas genom tillgripande av hydrodynamisk separation eller annan konventionell se- parationsteknik. få Storleken, orienteringen och konformationen av stora DNA-molekyler i vattenlösningar är beroende på etfi antal faktorer. Det är välkänt, att DNA-spiralen sväller och ökar i storlek när saltkoncentrationen minskar. Under så- dana betingelser ökar även tjockleken av det elektriska dubbelskiktet nära kapillärväggarna. Den sfäriska spira- len av DNA kan tänjas genom applicering av ett starkt elektriskt fält och/eller genom att den tvingas genom en trång passage. Storleken av formförändringen i det elek- triska fältet är vidare även beroende på saltkoncentra- tionen (Diekmann, S.: Pörschke, D., Biophys.Chem.:lG (82) 261). Sådana faktorer kan tas i beaktande i ansluäning till optimering av separationer i enlighet med principer- na för den beskrivna uppfinningen. _ Det optimala valet av innerdiameter för separa- tionskapillärer av submikronstorlek för att erhållë opti- mal separation är relaterad till den geometriska radien av de molekyler som skall separeras, såsom visas i både Fig. 1 och Fig. 2. Det är emellertid ej alltid enkelt att förutsäga molekylradien genom att endast känna molëkyl- vikten, såsom i dalton. Oftast är formen, storleken, kon- formationen och gyrationsradien för polymera molekëlerë beroende på ett antal faktorer, såsom det omgivande medi- et (jonkoncentration, solvateringkraft, dielektriska 506 461 10 10 15 .20 25 30 35 egenskaper, etc.). Polymerer av en viss molekylvikt kan sålunda svälla eller tänjas beroende pà mediet. Även det över separationsröret applicerade elektriska fältet kan förändra analyternas form (detta gäller speciellt laddade molekyler, sàsom DNA). För de laddade analyterna är jon- molnet (det elektriska dubbelskiktet) kring analyterna en väsentlig faktor som påverkar separa- som är närvarande tionen. Den differentiella hydrodynamiska kraften som ut- övas pà analyterna under separationen kan vidare förändra analyternas konformation (molekylerna sträcker sig (tän- jes) helt enkelt eller deformeras till en annan konforma- tion). Detta kan uppträda även för icke laddade typer.Figure 4A shows the result of the separation performed in accordance with the present invention, and as can be seen from the diagram, a very efficient separation or fractionation of the 25 components in the mixture is obtained. In fact, the individual peaks seen in Figure 4A correspond to simple DNA molecules. Again, this separation could not be obtained by resorting to hydrodynamic separation or other conventional separation techniques. The size, orientation and conformation of large DNA molecules in aqueous solutions depend on a number of factors. It is well known that the DNA helix swells and increases in size as the salt concentration decreases. Under such conditions, the thickness of the electrical bilayer near the capillary walls also increases. The spherical spiral of DNA can be stretched by applying a strong electric field and / or by forcing it through a narrow passage. Furthermore, the magnitude of the shape change in the electric field also depends on the salt concentration (Diekmann, S .: Pörschke, D., Biophys.Chem.:lG (82) 261). Such factors may be considered in connection with the optimization of separations in accordance with the principles of the described invention. The optimal choice of inner diameter for submicron size separation capillaries to obtain optimal separation is related to the geometric radius of the molecules to be separated, as shown in both Fig. 1 and Fig. 2. However, it is not always easy to predict the molecular radius by feeling only the molecular weight, as in daltons. Most often, the shape, size, conformation and gyration radius of polymeric molecules depend on a number of factors, such as the surrounding medium (ion concentration, solvating force, dielectric properties, etc.). Thus, polymers of a certain molecular weight may swell or stretch depending on the medium. The electric field applied across the separation tube can also change the shape of the analytes (this applies especially to charged molecules, such as DNA). For the charged analytes, the ion cloud (the electrical bilayer) around the analytes is a significant factor affecting the separation present. The differential hydrodynamic force exerted on the analytes during the separation can further alter the conformation of the analytes (the molecules simply stretch (stretch) or deform into another conformation). This can also occur for uncharged types.

Vid optimering av separationen för en speciell typ och storlek av analyt är det därför ej endast kapillärens innerdiameter utan även ovannämnda faktorer som måste tas i övervägande. .Therefore, when optimizing the separation for a particular type and size of analyte, it is not only the inside diameter of the capillary but also the above factors that must be considered. .

En intressant eventuell möjlighet vid föreliggande uppfinning är användning av ett pulserat elektriskt fält (jfr. Schwarz et al,. ibid.), i stället för en kontinuer- lig elektrisk potential över separationskolonnen. Detta utnyttjas i stor utsträckning exempelvis för separation av stora DNA-fragment genom gelelektrofores. I princip tänjes DNA-molekylerna under applicering av det elektris- ka fältet. Under den efterföljande perioden när inget elektriskt fält är närvarande uppträder en relaxation av DNA-molekylerna, där molekylerna strävar att återgå till sin ursprungliga spiralkonformation. Relaxationsprocedu- ren uppträder i tidsdomänen och är beroende av molekyl- storlek. Genom att upprepa proceduren och justera frek- vensen av den intermittenta spänningsappliceringen kan separationen optimeras för en given storleksordning av molekyler. Sammma procedur kan utnyttjas vid föreliggande uppfinning för att förbättra separation av laddade analy- ter. Genom att applicera ett pulserat fält över den ka- pillära separationskolonnen av submikronstorlek äger en storleksselektiv separation rum. Den periodiska konforma- tionsändringen hos analyterna förhöjer effekten av de 10 15 20 25 30 35 11 i 5064161 hydrodynamiska effekter som beskrives i den andra typen.An interesting possible possibility in the present invention is the use of a pulsed electric field (cf. Schwarz et al., Ibid.), Instead of a continuous electric potential across the separation column. This is widely used, for example, for the separation of large DNA fragments by gel electrophoresis. In principle, the DNA molecules are stretched during the application of the electric field. During the subsequent period when no electric field is present, a relaxation of the DNA molecules occurs, where the molecules strive to return to their original helical conformation. The relaxation procedure occurs in the time domain and is dependent on molecular size. By repeating the procedure and adjusting the frequency of the intermittent voltage application, the separation can be optimized for a given size of molecules. The same procedure can be used in the present invention to improve the separation of charged analytes. By applying a pulsed field over the capillary separation column of submicron size, a size-selective separation takes place. The periodic conformational change of the analytes enhances the effect of the hydrodynamic effects described in the second type.

Taylor-hastighetsprofilen påverkas av ett antal _ driftparametrar. Av första betydelse är kapillärens in- nerdiameter som måste vara tillräckligt liten. Av stor betydelse är även separationsmediets jonstyrka. Jp lägre jonstyrkan är desto tjockare är det elektriska dubbel- skiktet och desto bättre fraktioneringen. Alstringen av den elektroosmotiska flödesprofilen förbättras därför ge- nom reduktion av mediets jonkoncentration. För jämförel- sevis ”stora” kapillärer, såsom upp till 1 um, är det gynnsamt att använda media med låg jonstyrka.The Taylor velocity profile is affected by a number of _ operating parameters. Of first importance is the inner diameter of the capillary, which must be sufficiently small. Of great importance is also the ionic strength of the separation medium. The lower the ionic strength, the thicker the electric double layer and the better the fractionation. The generation of the electroosmotic flow profile is therefore improved by reducing the ion concentration of the medium. For comparatively “large” capillaries, such as up to 1 μm, it is favorable to use media with low ionic strength.

Tjockleken hos det elektriska dubbelskiktet (och därmed tendensen att bilda en flödesprofil av Taylor-typ) kan ytterligare påverkas genom applicering av en extern spänning över kapillärens inner- och yttervägg. Det icke ledande kapillärmaterialet (glas, smält silikaf verkar som ett dielektrikum, och innerväggens laddning påverkas (jfr. med verkan av en elektrisk kondensor). För att åstadkomma detta driftsätt är det nödvändigt att täcka kapillärväggens utsida med ett ledande material, exempel- vis en metall. En spänning appliceras sedan mellan elek- trolyten inne i kapillärröret och det omgivande kondukti- va materialet. Nämnda spänning kan vara av samma sämr- leksordning som den spänning som appliceras för separa- tionen och kan även vara pulsad (jfr. Tung-Liang Huang et al., ”Mechanistic Studies of Electroosmotic Control at the Capillary-Solution Interface", Anal.Chem. 1993, 65, 2887-2893).The thickness of the electrical bilayer (and thus the tendency to form a Taylor-type flow profile) can be further affected by applying an external voltage across the inner and outer walls of the capillary. The non-conductive capillary material (glass, molten silica acts as a dielectric, and the charge of the inner wall is affected (cf. with the action of an electric condenser). To achieve this mode of operation, it is necessary to cover the outside of the capillary wall with a conductive material, e.g. A voltage is then applied between the electrolyte inside the capillary tube and the surrounding conductive material, said voltage may be of the same inferior order as the voltage applied to the separation and may also be pulsed (cf. Tung-Liang Huang et al., "Mechanistic Studies of Electroosmotic Control at the Capillary-Solution Interface", Anal.Chem. 1993, 65, 2887-2893).

Ehuru föreliggande uppfinning illustrerats i huvud- sak under hänvisning till separationen av DNA-fragment eller molekyler i en blandning därav, är det väsentligt att notera att uppfinningen är lika tillämpbar på andra molekyler av hög molekylvikt. Uppfinningen skall därför anses vara inskränkt endast i enlighet med ordalydelsen i bilagda patentkrav.Although the present invention has been illustrated primarily with reference to the separation of DNA fragments or molecules in a mixture thereof, it is essential to note that the invention is equally applicable to other high molecular weight molecules. The invention is therefore to be considered limited only in accordance with the wording of the appended claims.

Claims (12)

506 461 12 10 115 20 25 30 PATENTKRAV506 461 12 10 115 20 25 30 PATENT REQUIREMENTS 1. Förfarande för storleksfraktionering av molekyler med hög molekylvikt i en blandning därav under användning av ett elektroosmotiskt flöde av nämnda molekyler inne- hållna i en buffert av låg jonstyrka, varvid nämnda för- farande utföres i ett kapillärrör, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man använder ett kapillärrör med en in- nerdiameter ej överstigande tvärsnittsstorleken för de största molekylerna med en faktor större än ca 10 (tio).A method for size fractionating high molecular weight molecules in a mixture thereof using an electroosmotic flow of said molecules contained in a low ionic strength buffer, said method being performed in a capillary tube, characterized therefrom, that a capillary tube with an inner diameter not exceeding the cross-sectional size of the largest molecules with a factor greater than about 10 (ten) is used. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - att nämnda faktor är från ca 2 (tio). t e c k n a t därav, (två) till ca 102. A method according to claim 1, characterized in that said factor is from about 2 (ten). t e c k n a t thereof, (two) to about 10 3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n - n e t e c k n a t därav, att nämnda innerdiameter är mindre än ca 1 um.3. A method according to claim 1 or 2, characterized in that said inner diameter is less than about 1 μm. 4. Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n n e - t e c k n a t att nämnda diameter är mindre än ca 500 nm. därav,A method according to claim 3, characterized in that said diameter is less than about 500 nm. hence, 5. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att rörlängden är från ca 10 cm till ca 10 m.5. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the pipe length is from about 10 cm to about 10 m. 6. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att de molekyler som skall separeras har ett nettoladdningstecken, som är detsamma som det för kapillärrörväggen, varigenom små mo- lekyler rör sig snabbare än stora molekyler.6. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the molecules to be separated have a net charge sign, which is the same as that of the capillary tube wall, whereby small molecules move faster than large molecules. 7. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att de molekyler som skall separeras är i huvudsak oladdade, varigenom stora molekyler rör sig snabbare än små molekyler.7. A method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the molecules to be separated are substantially uncharged, whereby large molecules move faster than small molecules. 8. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att de molekyler som skall separeras är utvalda bland proteiner, polysack- 10 15 13 i 506 arider, organiska polymerer, DNA, RNA.Process according to any one of the preceding claims, characterized in that the molecules to be separated are selected from proteins, polysaccharides in 506 arids, organic polymers, DNA, RNA. 9. Förfarande enligt patentkravet 8, Å k ä n n e t e c k n a t därav, att de molekyler som skall separeras är DNA-molekyler omfattande upp till ca tio miljoner kbp. Å9. The method of claim 8, characterized in that the molecules to be separated are DNA molecules comprising up to about ten million kbp. Oh 10. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att en konstant separationsspänning appliceras över kapillärröret.10. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that a constant separation voltage is applied across the capillary tube. 11. ll. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 9, k ä n n e t e c k n a t därav, att ett pulseranäe elektriskt separeringsfält appliceras över kapillärröret.11. ll. A method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that a pulsed electric separation field is applied over the capillary tube. 12. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att en konstant eller pulserande spänning appliceras mellan elektrolyten inne i kapillärröret och en ledande beläggning på utsidan av kapillärröret.12. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that a constant or pulsating voltage is applied between the electrolyte inside the capillary tube and a conductive coating on the outside of the capillary tube.