SE506421C2

SE506421C2 - Monoclonal antibodies to Pseudomonas aeruginosa and preparations containing them, test kit containing the preparation, and cell lines expressing the antibodies

Info

Publication number: SE506421C2
Application number: SE8702734A
Authority: SE
Inventors: Mark E Lostrom; Anthony W Siadak; Mae Joanne Rosok
Original assignee: Genetic Systems Corp
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1987-07-02
Publication date: 1997-12-15
Also published as: IL83047A0; ATA168387A; IE60888B1; SE8702734D0; IT1221940B; AT399885B; PT85247B; PT85247A; GB2192185A; ES2013321A6; KR880001815A; FR2601458B1; DE3722098C2; FR2601458A1; AU7495887A; DK172840B1; BE1000743A3; AU615162B2; CH677796A5; IL83047A

Abstract

Cell lines have been produced that secrete monoclonal antibodies which bind to the flagellar proteins of selected Pseudomonas aeruginosa strains. Some of these antibodies have been found to be protective against lethal challenges of P. aeruginosa. Pharmaceutical compositions containing these antibodies, can be used singly or in combination with other monoclonal antibodies, blood plasma fractions and antimicrobial agents, to form prophylactic and therapeutic compositions.

Description

10 15 20 25 30 35 506 421 l--J byggande atgärder och behandling. 10 15 20 25 30 35 506 421 l - J construction measures and treatment.

En metod som har beaktats är förstärkning av värddjurets immunsvstem genom aktiv eller passiv immunisering. Sa exempelvis har det konstaterats att aktiv immunisering av människa eller försöksdjur med bakteriella helcells- vacciner eller renade bakteriella endotoxiner fran Q. aeruginosa leder till utvecklingen av specifika opsoniska antikroppar riktade primärt mot determinanter pa de ater- kommande oligosackarid-enheterna i de lipopolysackarid- (LPS)-molekyler som är lokaliserade pa det yttre cell- aeruginosa (se Pollack, M., Immunoglobu- lins: Characteristics and Uses of Intravenous Prepara- Alving, B.M. 79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979). membranet av E. tions, och Finlayson, J.S., red., sid. 73- Dylika antikroppar har, vare sig de har alstrats aktivt eller överförts passivt, visat sig skydda mot de letala verkningarna av en E. aeruginosa-infektion i en mangfald och vid vissa preliminära L.5. och Pollack, 119- djurmodeller (Pollack, sugra) undersökningar med människor (gg Young, M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L., red. sid. 32, Hans Huber, 1980).One method that has been considered is the strengthening of the host animal immune system by active or passive immunization. Sa for example, it has been found that active immunization of human or experimental animals with bacterial whole cell vaccines or purified bacterial endotoxins from Q. aeruginosa leads to the development of specific opsonic antibodies directed primarily at determinants of the atherosclerotic future oligosaccharide units in the lipopolysaccharide units (LPS) molecules located on the outer cell aeruginosa (see Pollack, M., Immunoglobu- lins: Characteristics and Uses of Intravenous Prepara- Alving, B.M. 79, U.S. Pat. Department of Health and Human Services, 1979). the membrane of E. tions, and Finlayson, J.S., ed., p. 73- Such antibodies, although actively generated, have or transmitted passively, proved to protect against the lethal the effects of an E. aeruginosa infection in a variety and at some preliminary L.5. and Pollack, 119- animal models (Pollack, sugra) studies with humans (gg Young, M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L., eds. sid. 32, Hans Huber, 1980).

Ovan angivna rapporter visar att immunoterapeutiska metoder skulle kunna utnyttjas för att förebygga och be- handla bakteriesjukdomar orsakade av E. aeruginosa, sasom genom administrering av poolade humanimmunoglobuliner, vilka innehaller antikroppar mot den infekterande stammen eller de infekterande stammarna. Humanimmunoglobuliner definieras i föreliggande sammanhang som den del a. fraktionerad humanplasma som är anrikad pa antikroppar, bland vilka finns representerade specifika antikroppar mot stammar av E. aeruginosa. Till följd av vissa inneboende begränsningar vid användning av humanimmuno- globulinkomoonenter är fortfarande denna metod för be- handling av sjukdomar orsakade av E. aeruginosa föremal 10 15 20 25 30 35 soaí421 för undersökning (se exemgelvis Collins, M.S. och Roby, R.E., Am. J. Med., 7ó(3A): 168-174, (1984), och för närvarande finns icke nagra kommersiella produkter till-t;¿ gängliga som utnyttjar dessa komponenter.The above reports show that immunotherapeutic methods could be used to prevent and trade bacterial diseases caused by E. aeruginosa, sasom by administration of pooled human immunoglobulins, which contain antibodies to the infecting strain or the infecting strains. Human immunoglobulins is defined in the present context as the part a. fractionated human plasma enriched in antibodies, among which are represented specific antibodies against strains of E. aeruginosa. As a result of some inherent limitations in the use of human immuno- globulin components is still this method of action of diseases caused by E. aeruginosa objects 10 15 20 25 30 35 soaí421 for examination (see, for example, Collins, M.S. and Roby, R.E., Am. J. Med., 70 (3A): 168-174, (1984), and for at present there are no commercial products available; available that utilize these components.

En sadan begränsning förknippad med immunoglobulinbered- ningar är att de utgörs av pooler av prov fran ett tusen- _ tal eller flera donatorer, vilka prover har valts ut i förväg med avseende pa närvaron av speciella anti-Pseudofl monas-antikroppar. Denna poolning leder till en Å medelvärdestiter av individuella antikroppstitrar, vilket” som bäst resulterar i mattliga ökningar i den resulterande titern av de önskade antikropparna.Such a restriction associated with immunoglobulin preparation is that they consist of pools of samples from a thousand number or more donors, in which samples have been selected advance with respect to the presence of special anti-Pseudofl monas antibodies. This pooling leads to an Å mean titers of individual antibody titers, which " which best results in moderate increases in it resulting titer of the desired antibodies.

En annan begränsning är att själva preselektionsprocessen kräver dyrbar kontinuerlig "screening" av donatorpoolen för att ombesörja jämn produktkvalitet. Trots dessa an- strängningar kan immunoglobulinprodukter fortfarande uppvisa avsevärda variationer fran sats till sats och bland produkter fran olika geografiska omraden.Another limitation is that the preselection process itself requires expensive continuous "screening" of the donor pool to ensure consistent product quality. Despite these strictures, immunoglobulin products can still show considerable variations from batch to batch and among products from different geographical areas.

Ytterligare en sadan begränsning som är inneboende hos immunoglobulinberedningar är att deras användning W resulterar i samtidig administrering av stora mängder avv främmande proteinartade substanser (som kan innefatta I virus sasom de vira som nyligen har visat sig vara associerade med förvärvat immunbristsvndrom <ê:quired lmmune Deficiencv Syndrome eller AIDS), med potential att astadkomma ogynnsama biologiska verkningar.Another such limitation that is inherent in immunoglobulin preparations are that their use W results in co-administration of large amounts of avv foreign proteinaceous substances (which may include I viruses such as the viruses that have recently been shown to be associated with acquired immune deficiency syndrome <ê: quired lmmune Deficiencv Syndrome or AIDS), with potential to produce adverse biological effects.

Kombinationen av laga titrar av önskade antikroppar och en hög halt av frammande substanser kan ofta begränsa, till suboptimala nivaer, den mängd av specifika och saledes gvnnsama immunoglobuliner som kan administreras till patienten. År 197? rapporterades Hohler och Milstein sin seminal- 10 15 20 25 30 35 506 421 upptäckt att vissa muscellinjer kunde sammansmältas (fusioneras) med musmjältceller för skapande av hybridom, som vart och ett skulle kunna utsöndra antikroppar med en enda specificitet, d.v.s. monoklonala antikroppar (Hohler, G. och Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975)).The combination of low titers of desired antibodies and a high content of foreign substances can often limit, to suboptimal levels, the amount of specific and thus beneficial immunoglobulins that can be administered to the patient. Year 197? Hohler and Milstein reported their seminal 10 15 20 25 30 35 506 421 discovered that certain mouse cell lines could be fused (fused) with mouse spleen cells to create hybridomas, which each could secrete antibodies with one even specificity, i.e. monoclonal antibodies (Hohler, G. and Milstein, C., Nature, 256: 495-497 (1975)).

Med tillkomsten av denna teknologi blev det möjligt att i vissa fall framställa stora mängder av ytterst specifika murinantikroppar mot en speciell determinant eller determinanter pa antigener. Därefter blev det under användning av senare utvecklad teknik möjligt att framställa monoklonala humanantikroppar (se exempelvis U.S. 4,464,4ó5, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).With the advent of this technology, it became possible to i some cases produce large quantities of highly specific murine antibodies to a particular determinant or determinants of antigens. Then it came under use of later developed technology possible to produce human monoclonal antibodies (see, e.g. U.S. 4,464,4ó5, which is incorporated herein by reference by reference thereto).

Det inses att i vissa situationer monoklonala musantikroppar eller beredningar av dylika antikroppar kan medföra problem vid användning pa människa. Sa exempelvis har det rapporterats att monoklonala musanti- ákroppar, som har använts vid försöksundersökningar för behandling av vissa humansjukdomar, kan framkalla ett immunsvar som gör dem ineffektiva (Levy, R.L., and Miller, R.A., Ann. Rev. Med., 34: 107-116 (1983)). Med nyligen gjorda framsteg inom rekombinant DNA-teknologi, sasom framställning av chimera monoklonala mus/human-anti- kroppar, kan dessa problem emellertid elimineras. Metoder för framställning av monoklonala humanantikroppar är ocksa nu tillgängliga (se, Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, 5.6., et al., red., Plenum Publishing Corp. (1985), som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).It is understood that in some situations monoclonal mouse antibodies or preparations of such antibodies can cause problems when used on humans. Sa for example, it has been reported that monoclonal mouse bodies, which have been used in experimental studies for treatment of certain human diseases, can cause one immune responses that make them ineffective (Levy, R.L., and Miller, R.A., Ann. Reef. Med., 34: 107-116 (1983)). With recently advances in recombinant DNA technology, such as preparation of chimeric mouse / human anti-human monoclonal bodies, however, these problems can be eliminated. Methods for the production of human monoclonal antibodies is also now available (see, Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, 5.6., Et al., Eds., Plenum Publishing Corp. (1985), which is incorporated herein by reference description by reference thereto).

Under användning av hvbridom- och/eller celltransforma- tionsteknik har ett antal grupper rapporterat framställ- ningen av monoklonala antikroppar, som skyddar mot E. aeruginosa-infektioner. Monoklonala antikroppar har framställts, vilka är reaktiva med avseende pa olika 10 15 20 25 30 35 SÛ6421 Ul epitoper av ﬁ. aerugihosa, innefattande specifika enkel- å och multipelserotyp-vtepitoper. sasom det som aterfinns 1:, LPS-molekuler hos bakterier (se exempelvis de amerikanska: patentansökningarna 734,624 och 807,394, vilka bada införf livas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).Using hybridoma and / or cell transformation technology, a number of groups have reported the production of monoclonal antibodies, which protect against E. aeruginosa infections. Monoclonal antibodies have prepared, which are reactive with respect to various 10 15 20 25 30 35 SÛ6421 Ul epitopes of ﬁ. aerugihosa, including specific single-river and multipelserotype vtepitopes. as it is found in 1 :, LPS molecules in bacteria (see for example the American: patent applications 734,624 and 807,394, both of which are incorporated herein by reference live with this description by reference thereto).

Man har även framställt protektiva monoklonala anti- kroppar, som är specifika med avseende pa E. ag¿gg¿ggga; ß -exotouin A (se exempelvis den amerikanska patentansök- ningen 742,l70, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).Protective monoclonal antibodies have also been prepared. bodies specific for E. agggggggga; ß -exotouin A (see, for example, U.S. Patent Application- 742, 170, which is incorporated herein by reference by reference thereto).

Ehuru användning av monoklonala antikroppar, som är specifika med avseende pa LPS-regionen av E. aergginosa eller bakteriernas exotoniner, kan tillhandahalla till- räckligt skydd i vissa situationer, är det i allmänhet föredraget att ha bredare skyddsmöjlighet. Sa exempelvis skulle det vid profylaktiska behandlingar med avseende pa potentiella infektioner hos människa vara föredraget att administrera en antikropp eller antikroppar protektiva mot en mangfald E. aeruginosa-stammar. Likaledes skulle det vid terapeutiska tillämpningar, där serotypen eller serotyperna av den infekterande stammen respektive de infekterande stammarna ej är känd (a), vara föredraget att administrera en antikropp eller en kombination av antikroppar, som är effektiva mot de flesta, om ej alla, av de kliniskt viktiga E. aeruginosa-serotyperna. Det 7 idealiska skulle vara att tillhandahalla antikroppar, som är reaktiva oberoende av traditionella serotvpnings- scheman.Although the use of monoclonal antibodies, that is specific for the LPS region of E. aergginosa or the exotonins of the bacteria, may provide adequate protection in certain situations, it is in general preferred to have a broader protection option. Said for example it would in prophylactic treatments with regarding potential infections in humans be preferred to administer an antibody or antibodies protective against a diversity E. aeruginosa strains. Likewise, it would at therapeutic applications, where the serotype or the serotypes of the infecting strain and those infecting strains not known (a), may be preferred to administer an antibody or a combination of antibodies, which are effective against most, if not all, of the clinically important E. aeruginosa serotypes. It 7 ideal would be to provide antibodies, which are reactive independently of traditional serotyping scheman.

En aspekt av E. aeruginosa-fysiologin, som har visat sig, bidra till organismens virulens, är motiliteten, en för- maga som härrör huvudsakligen fran närvaron av en flagell Infect. and lmmun., 38:l29b-1298). E. aeruginosa utmärksï 10 15 20 25 30 35 506 421 av att uppvisa en enda flagell i ena anden av sin stavfor- made struktur. Modellstudier med branda möss har visat att en större procentuell andel möss överlevde när icke- -mobila E. aeruginosa-stammar ympades i försöksbränn- skador an när mobila stammar användes. (McManus, A. et al. (1980), Burns, 6: 235-239 och Nontie. T.. et al. (1982), Infect. and Immun., §§:1296-1298). ändra under- sökningar avseende patogenesen av E. aeruginosa har visat att djur, som har immuniserats med flagellantigen- beredningar, skyddades da det brändes och infekterades med mobila stammar av bakterierna (gg, Holder, I. et al. (1982), lnfect. and Immun., 35: 276-280).One aspect of E. aeruginosa physiology that has been shown to be contribute to the virulence of the organism, motility is a stomach derived mainly from the presence of a flagellum Infect. and lmmun., 38: l29b-1298). E. aeruginosa excelsï 10 15 20 25 30 35 506 421 of displaying a single flagellum in one spirit of its made structure. Model studies with fire mice have shown that a larger percentage of mice survived when non- mobile E. aeruginosa strains were inoculated into experimental burns. damage when mobile trunks were used. (McManus, A. et al. (1980), Burns, 6: 235-239 and Nontie. T .. et al. (1982), Infect. and Immun., §§: 1296-1298). change sub- searches regarding the pathogenesis of E. aeruginosa have demonstrated that animals immunized with flagellar antigen preparations, were protected when burned and infected with mobile strains of the bacteria (gg, Holder, I. et al. (1982), Infect. and Immun., 35: 276-280).

Vad som är viktigt är att E. aeruginosa-flageller har studerats medelst serologiska metoder och har rapporterats falla inom tva antigeniska huvudgrupper. som betecknas H1 och H2 av E. Lanyi (1970, Acta Microbiol.What is important is that E. aeruginosa flagella have studied by serological methods and has reported to fall within two main antigenic groups. as H1 and H2 are designated by E. Lanyi (1970, Acta Microbiol.

Acad. Sci. Hung.. 17: 35-48) och typ a och typ b av Ansorg, R. (1978, Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Ürig. A, 242:228-238). Serologisk typning av flageller av bada laboratorierna visade att Q;-flageller (Lanyi. B., sugra) eller flageller av typ b (Ansorg. R., sugra) var serologiskt homogena, d.v.s. nagra undergrupper har icke identifierats. Denna serologiskt homogena flagelltyp be- tecknas i det följande som typ b. Det andra huvud- antigenet, H2 (Lanyi. B.. ggggg) eller flagell av typ a (Qnsorg, R., sugra). innehöll fem undergrupper. Detta antigen betecknas i det följande som flagell av typ a och de fem undergrupperna som as, a,, az, as och aa. De fem undergrupperna av typ a uttrycks i varierande kombina- tioner hos olika stammar av E. aeruginosa. som uppbär typ a, med undantag av antigenet ao. Antigenet ao aterfanns pa alla flageller av typ a. ehuru graden av dess expression varierade bland stammarna. väfmê- m I-l 'Û TJ Ij| ll |U Ett serotvoningsschema. som baserar 10 15 20 25 30 35 506 421 stabila somatiska huvudantigenerna av E. aeruginosa, betecknas som Habs-schemat. vilket nyligen har införlivats med schemat tillhörande the International Antigenic Typing System (se Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33:256 (1983).) Flagelltyperna av Habs-referensstammarna av ﬁ. aeruginosa har karakteriserats medelst immunofluor- escens med polyklonala sera av R. Ansorg (1978, Zbl.Acad. Sci. Hung .. 17: 35-48) and type a and type b of Ansorg, R. (1978, Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Ürig. A, 242: 228-238). Serological typing of flagella of bada laboratories showed that Q; flagella (Lanyi. B., sugra) or type b flagella (Ansorg. R., sugra) var serologically homogeneous, i.e. no subgroups have not identified. This serologically homogeneous flagella type is hereinafter referred to as type b. The second main the antigen, H2 (Lanyi. B .. ggggg) or flagellum of type a (Qnsorg, R., sugra). contained five subgroups. This antigen is hereinafter referred to as type a and flagella the five subgroups as as, a ,, az, as and aa. The five subgroups of type a are expressed in varying combinations ions of different strains of E. aeruginosa. which bears type a, with the exception of the antigen ao. The antigen ao was found on all flagella of type a. although the degree of its expression varied among the strains. väfmê- m I-l 'U TJ Ij | ll | U A serotonicity schedule. which bases 10 15 20 25 30 35 506 421 stable somatic major antigens of E. aeruginosa, referred to as the Habs scheme. which has recently been incorporated with the schedule belonging to the International Antigenic Typing System (see Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33: 256 (1983).) The flagellar types of the Habs reference strains of ﬁ. aeruginosa has been characterized by immunofluorescence stage with polyclonal sera by R. Ansorg (1978, Zbl.

Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242: 228-238) eller genom 1984, Q.Baked. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242: 228-238) or by 1984, Q.

Clin. Hicrobiol., 20:84-BB). Habs-stammarna 2. 3, 4, 5, objektglas-coagglutination (Ansorg, R. et al., ll och 12 ar stammar. som uppbär flageller av typ¿ b, och Habs-stammarna 1, 6, 8 och 9 uppbär flageller av typ a. Ett stort antal av stammarna av E. aeruginosa skulle saledes kunna kännas igen av ett litet antal monof Vklonala antikroppar, som är specifika med avseende pa flagellära proteiner.Clin. Hicrobiol., 20: 84-BB). Habs tribes 2. 3, 4, 5, slide coagglutination (Ansorg, R. et al., ll and 12 ar strains. carrying flag¿s of type¿ b, and Habs strains 1, 6, 8 and 9 carry flagella of type a. A large number of the strains of E. aeruginosa could thus be recognized by a small number of monof Vclonal antibodies, specific for pa flagellar proteins.

Följaktligen föreligger ett signifikant behov av monoklo+ _nala antikroppar med förmaga att reagera med epitoper pa¿ flagellära proteiner och i vissa fall även med förmaga att tillhandahalla skydd mot multipla serotyper av E. aeruginosa. Vidare skulle vissa av dessa antikroppar vara lämpliga för användning vid profylaktisk och terapeutisk behandling av E. aeruginosa-infektioner liksom vid diagnos av dylika infektioner. Föreliggande uppfinning fyller dessa behov.Consequently, there is a significant need for monoclo + nal antibodies capable of reacting with epitopes on flagellar proteins and in some cases even with ability to provide protection against multiple serotypes of E. aeruginosa. Furthermore, some of these antibodies would be suitable for use in prophylactic and therapeutic treatment of E. aeruginosa infections as well as in the diagnosis of such infections. Present invention meets these needs.

SAMMQNFATTNING QV UPFFINNINGEN Nya cellinjer tillhandahalles, vilka kan producera monoklonala antikroppar med förmaga att binda till flageller närvarande pa de flesta stammar av E. aeruginosa-bakterier. De monoklonala antikropparna reagerar specifikt med epitoper pa flagellproteiner hos E. aeruginosa och kan skilja mellan flageller av typ a 10 15 w' 25 30 35 506 421 och typ b hos bakterierna. Vidare tillhandahalles ett sätt att behandla en människa, som är utsatt för infek- tion av eller redan är infekterad med E. aeru inosa, genom administrering av en profylaktisk eller terapeutisk mängd av en beredning, som innehaller minst en monoklonal antikropp eller bindningsfragment därav med förmaga att reagera med flagellerna hos E. aeruginosa-stammar, varvid beredningen företrädesvis även innefattar en fysiologiskt godtagbar bärare. Beredningen kan även innehalla en eller flera av följande: ytterligare monoklonala antikroppar med förmaga att reagera med E. aggggiggäa-exotoxin A; monoklonala antikroppar med förmaga att reagera med serotyp-determinanter pa LPS av E. aeruginosa; en gamma- globulinfraktion fran humanblodplasma; en gamma-globulin- fraktion fran humanblodplasma, där plasman kan erhallas fran människor som uppvisar förhöjda nivaer av immuno- globuliner reaktiva med E. aeruginosa; och ett eller flera antimikrobiella medel. Vidare tillhandahalles fram- ställning av diagnostiska testsatser.SUMMARY OF THE INVENTION New cell lines are provided, which can produce monoclonal antibodies capable of binding to flagella present on most strains of E. aeruginosa bacteria. The monoclonal antibodies reacts specifically with epitopes on flagellar proteins in E. aeruginosa and can distinguish between flagella of type a 10 15 w ' 25 30 35 506 421 and type b of the bacteria. Furthermore, one is provided way of treating a person who is exposed to of or already infected with E. aeru inosa, by administration of a prophylactic or therapeutic amount of a formulation containing at least one monoclonal antibody or binding fragment thereof capable of react with the flagella of E. aeruginosa strains, wherein the formulation preferably also comprises a physiological one acceptable carrier. The preparation may also contain one or several of the following: additional monoclonal antibodies capable of reacting with E. aggggiggäa exotoxin A; monoclonal antibodies capable of reacting with serotype determinants on LPS of E. aeruginosa; a gamma- globulin fraction from human blood plasma; a gamma-globulin- fraction from human blood plasma, where the plasma can be obtained from people who show elevated levels of immuno- globulins reactive with E. aeruginosa; and one or several antimicrobial agents. Furthermore, status of diagnostic test kits.

BESKRIVNING AV DE FÖREDRQGNA UTFÖRINGSFÜRMERNA I enlighet med föreliggande uppfinning tillhandahalles nya celler med förmaga att producera monoklonala antikroppar och beredningar, som innefattar dylika anti- kroppar, vilka beredningar selektivt kan känna igen de aeruginosa- varvid individuella antikroppar typiskt känner flageller som är närvarande pa en mangfald E. -stammar, igen en typ av E. aggggiggga-flageller. Föreliggande celler har identifierbara kromosomer, där mikroblinje-DNA fran dem eller en förstadiecell har omlagrats för kodning av en antikropp med ett bindningsställe för en epitop pa ett flagellärt protein, som är gemensam för vissa E. aeruginosa-stammar. För flagellara proteiner av typ a kan pan-reaktiva monoklonala antikroppar framställas; och för flagellära proteiner av typ b innefattas antikroppar. 10 15 20 25 30 35 506» 421 som är pan-reaktiva eller reagerar med minst cirka 70% av de flagellbarande stammarna. Dessa monoklonala anti- 7 kroppar kan användas pa en mangfald olika satt inne¥attan4 de diagnos och terapi.DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS In accordance with the present invention, there is provided new cells capable of producing monoclonal antibodies and preparations comprising such antibodies bodies, which preparations can selectively recognize them aeruginosa- wherein individual antibodies typically sense flagella present on a variety of E. strains, again a type of E. aggggiggga flagella. Present cells have identifiable chromosomes, where microbline DNA from them or a precursor cell has been rearranged for coding of an antibody with a binding site for an epitope pa a flagellar protein, which is common to some E. aeruginosa strains. For flagellar proteins of type a pan-reactive monoclonal antibodies can be prepared; and for type b flagellar proteins, antibodies are included. 10 15 20 25 30 35 506 »421 which are pan-reactive or react with at least about 70% of the flagellar-bearing tribes. These monoclonal anti- 7 bodies can be used in a variety of different ways inside ¥ attan4 the diagnosis and therapy.

De monoklonala antikroppar som tillhandahalls pa detta sätt är speciellt användbara vid behandling eller profylax av allvarliga sjukdomar orsakade av &. aeruginosa. aerugi~ Qgâå är tillgängliga 4ör direktkontakt med antikroppmole- Ytproteinerna pa flagellerna av E. kylerna, vilket saledes troligen skulle inhibera motili- teten hos organismen och/eller underbygga andra verkningﬁ ar som är gynnsamma {ör de infekterade varddjuren.The monoclonal antibodies provided thereon methods are especially useful in treatment or prophylaxis of serious diseases caused by &. aeruginosa. aerugi ~ Qgâå are available 4ör direct contact with antibody molecules The surface proteins on the flagella of E. the refrigerators, which would thus probably inhibit the organism and / or substantiate other effects ﬁ which are favorable to the infected vertebrates.

Framställningen av monoklonala antikroppar kan astad- kommas genom immortalisering av en cellinje med förmaga att uttrycka nukleinsyrasekvenser, som kodar för anti- kroppar, vilka är speci¥ika för en epitop pa de +lagellära proteinerna hos multipla stammar av E. aerugi- nosa. Den immortaliserade cellinjen kan vara en daggdjursr cellinje, som har transformerats genom onkogenes, genom trans4ektion, mutation eller liknande. Dylika celler inne~ fattar myelomlinjer, lym+omlinjer eller andra cellinjer med förmaga att underbygga eupressionen och utsöndringen av immunoglobulinet eller bindningsfragment därav LQ vitro. Immunoglobulinet eller fragmentet därav kan vara ett naturligt förekommande immunoglobulin fran ett annat däggdjur an de föredragna mus- eller humankallorna, som zroduceras genom trans¥ormation av en lymíocyt, speciellt en eplenocyt, med hjälp av ett virus eller genom samman- emaltning av lym4ocyten med en neoplastisk cell. exempelvis ett myelom, ¥ör framställning av en hybridcell- linje. erhalles splenocyten fran ett djur, som Typiskt har immuniserats mot flagellära antigener eller ¥ragment:= därav innehallande ett eoitopiekt ställe. lmmuniserings~ 10 15 20 25 30 35 506 421 10 protokoll är väl kända och kan variera avsevärt men ända vara effektiva. (se, Golding, Nonoclonal Antibodies: Principles and PracticgL Academic Press, N.Y. (1983), som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.) Hybridcellinjerna kan klonas och underkastas screening i enlighet med konventionell teknik och antikroppar i de överliggande cellvätskorna kan pavisas, vilka har för- maga att binda till flagellära E. aeruginosa-determinan- ter. De lämpliga hybridcellinjerna ifraga kan därefter fa växa i storskalig kultur eller injiceras i peritonealhalan hos ett lämpligt värddjur för produktion av askites- vätska.The production of monoclonal antibodies can provide by immortalization of a cell line with ability to express nucleic acid sequences encoding anti- bodies, which are specific to an epitope on them the lagellar proteins of multiple strains of E. aerugi- sniff. The immortalized cell line may be a mammalian cell cell line, which has been transformed by oncogenesis, by trans4ection, mutation or the like. Such cells inside ~ takes myeloma lines, lymph + omelines or other cell lines with the ability to substantiate eupression and excretion of the immunoglobulin or binding fragment thereof LQ vitro. The immunoglobulin or fragment thereof may be a naturally occurring immunoglobulin from another mammals and the preferred mouse or human calves, which produced by transformation of a lymphocyte, in particular an eplenocyte, by means of a virus or by emulation of the lymphocyte with a neoplastic cell. for example, a myeloma, for the production of a hybrid cell line. the splenocyte is obtained from an animal, which Typical have been immunized against flagellar antigens or ¥ fragments: hence containing an eotopic place. immunization ~ 10 15 20 25 30 35 506 421 10 Protocols are well known and can vary considerably but still be effective. (see, Golding, Nonoclonal Antibodies: Principles and PracticgL Academic Press, N.Y. (1983), som incorporated into this description by reference thereto.) The hybrid cell lines can be cloned and screened in in accordance with conventional techniques and antibodies in the the overlying cell fluids can be detected, which have stomach to bind to flagellar E. aeruginosa determinant ter. The appropriate hybrid cell lines in question can then be obtained grow in large-scale culture or injected into the peritoneal tail of a suitable host animal for the production of ascites liquid.

Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning är cellerna transformerade humanlymfocyter, som producerar monoklonala humanantikroppar, företrädesvis protektiva ig ¿¿¿g, mot tillgängliga epitoper, som är specifika för minst ett flagellärt protein. Lymfocyterna kan erhallas fran humandonatorer, som är exponerade för eller har exponerats för de lämpliga flagellbärande stammarna ifraga av E. aeruginosa. En föredragen cellstyrd trans- formationsprocess beskrivs i detalj i U.S. 4,4ó4,4ó5, som införlivas härmed genom hänvisning därtill.According to one embodiment of the present invention, the cells transformed human lymphocytes, which produce human monoclonal antibodies, preferably protective ig ¿¿¿G, against available epitopes, which are specific to at least one flagellar protein. The lymphocytes can be obtained from human donors, who are exposed to or have exposed to the appropriate flagellar strains questioned by E. aeruginosa. A preferred cell-controlled transport formation process is described in detail in U.S. Pat. 4,4ó4,4ó5, som is hereby incorporated by reference.

Genom tillgangen till antikropparna enligt föreliggande uppfinning, vilka är kända att vara specifika för de flagellära proteinerna, kan i vissa fall de överliggande vätskorna vid efterföljande försök underkastas screening vid en konkurrensanalys med föreliggande monoklonala anti- kroppar som ett medel att identifiera ytterligare exempel pa anti-flagellära monoklonala antikroppar. Saledes kan hybridcellinjer lätt framställas fran en mangfald källor baserad pa tillgängligheten hos föreliggande antikroppar, som är specifika för speciella flagellära antigener. 10 15 20 25 30 35 _vilka är kända för varje djurart. ses, ll När hybridcellinjer är tillgängliga, som producerar antij kroppar specifika för föreliggande epitopiska ställen, kan alternativt dessa hybridcellinjer sammansmältas med andra neoplastiska B-celler, där dylika B-celler kan tjäna som recipienter för genomisk DNA, som kzdar för i synnerhet receptorerna. Ehuru neoplastiska gnagar-, rattdjur-B-celler är det som vanligen utnyttjas, kan andra däggdjursarter användas, sasom hardjur, nötkreatur, far, häst, svin, fagel eller liknande.By accessing the antibodies of the present invention invention, which are known to be specific to those flagellar proteins, in some cases the overlying ones the liquids in subsequent experiments are subjected to screening in a competition analysis with the present monoclonal anti- bodies as a means of identifying further examples on anti-flagellar monoclonal antibodies. Thus can Hybrid cell lines are easily produced from a variety of sources based on the availability of the present antibodies, which are specific for special flagellar antigens. 10 15 20 25 30 35 _which are known for each animal species. ses, ll When hybrid cell lines are available, which produce anti bodies specific for the present epitopic sites, alternatively, these hybrid cell lines can be fused with other neoplastic B cells, where such B cells can serve as recipients of genomic DNA, which kzdar for especially the receptors. Although neoplastic rodent, Steering wheel B cells are what are commonly used, can other mammalian species are used, such as hardy animals, cattle, father, horse, pig, bird or the like.

De monoklonala antikropparna kan tillhöra vilken som helst av immunoglobulinklasserna eller- underklasserna, sasom Igﬁ, IgD, Igâ, IgE, eller underklasser av IgG, I allmänhet kan de monoklonala antikropparna användas intakta eller som sasom Fv, Fab, F(ab*)2, bindningsfragment, men vanligt- vis intakta.The monoclonal antibodies may belong to any one preferably of the immunoglobulin classes or subclasses, such as Ig ﬁ, IgD, Igâ, IgE, or subclasses of IgG, In general, they can the monoclonal antibodies are used intact or as sasom Fv, Fab, F (ab *) 2, binding fragments, but usually show intact.

Cellinjerna enligt föreliggande uppfinning kar finna annan användning än för direkt framställning av de mono-f klonala antikropparna. Cellinjerna kan sammansmältas medå andra celler (sasom pa lämpligt sätt läkemedels-märkt Ü humanmyelom, musmvelom eller lymfoblastoida hcmanceller)m för framställning av hybridom och saledes tillhandahallaä transferering av de gener som kodar för de monoklonala anti-i kropparna. Alternativt kan cellinjen användas som en kälia till de kromosomer som kodar för immunoglobulznerna, ä W vilka kan isoleras och överföras till celler medelst annan teknik än fusion. Vidare kan de gener som kodar för de monoklonala antikropparna isoleras och användas i å enlighet med rekombinant DNA-teknik för framstå lning avf f det specifika immunoglobulinet i en mangfald -ärddjur. q Genom preparering av CDNA-bibliotek fran budtarar-RNA kan speciellt en enda cDNA-klon isoleras, vilken Lodar för V immunoglobulinet och är fri fran introner, oc* införas tå» 421 10 15 20 25 30 35 506 421 12 lämpliga prokaryotiska eller eukaryotiska expressions- vektorer och därefter transformeras till ett värddjur för (se allmänt, U.S. 4,172,124; och 4.423,147. slutlig bulkframställning 4,350,ó83; 4,363,799; 4,38l,292; Se även, Kennett et Monoclonal Antibodies, Plenum, New York (1980) al., och däri angivna hänvisningar, vilka samtliga införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.) I enlighet med hybrid-DNA-teknologi kan närmare bestämt immunoglobulinerna eller fragmenten enligt föreliggande uppfinning framställas i bakterier eller jäst. (Se, Boss, et al., Nucl. Acid. Res., 12:E791 och Wood et al., Nature 314:44ó, vilka bada införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.) Sa exempelvis kan budbärar- -RNA, som transkriberas frän de gener som kodar för de lätta och tunga kedjorna av de monoklonala antikroppar som produceras av en cellinje enligt föreliggande upp- finning, isoleras medelst differentiell cDNA-hybridisering under utnyttjande av cDNA fran andra BALB/c-lymfocyter än föreliggande klon. mRNQ, som ej hybridiserar, är rik pa de meddelanden som kodar för de önskade immunoglobulin- kedjorna. Allt efter behov kan denna process upprepas för att ytterligare öka de önskade mRNA-nivaerna. Den avdragna mRNA-beredningen kan därefter transkriberas omvänt för tillhandahallande av en cDNA-blandning, som är anrikad med avseende pa de önskade sekvenserna. RNA kan därefter hydrolyseras med en lämplig RNase och ssDNA kan dubbelsträngas med DNA-polymeras I och slumpinitiatorer, exempelvis slumpartat fragmenterad kalvtvmus-DNA. Den resulterande dsDNA kan därefter klonas genom införande i en lämplig vektor, exempelvis virus-vektorer sasom lambda- pACYCl84. -gﬁr -vektorer eller plasmid-vektorer (sasom pBRu¿_. etc.). Genom att framkalla prover baserade pa kända sekvenser för de konstanta regionerna av de lätta och tunga kedjorna kan sadana cDNA-kloner som innehaller den gen 10 15 20 25 30 35 5o6§421 som kodar för de önskade lätta och tunga kedjorna identi-f fieras genom hybridisering. Därefter kan generna utskäraﬁ fran plasmiderna, manipuleras för avlägsnande av över- : flödig DNA uppströms om initieringskodonen eller konstant region-DNQ och därefter införas i en lämplig vektor för 7 transformation av en värdcell och slutligen expression av genen.The cell lines of the present invention may be found use other than for the direct production of the mono-f the clonal antibodies. The cell lines can be fused together other cells (as appropriately drug-labeled Ü human myeloma, mouse myeloma or lymphoblastoid hcman cells) m for the production of hybridomas and thus provided transfer of the genes encoding the anti-i monoclonal the bodies. Alternatively, the cell line can be used as a keel to the chromosomes encoding the immunoglobulins, ä W which can be isolated and transferred to cells by technology other than fusion. Furthermore, the genes that encode the monoclonal antibodies are isolated and used in å in accordance with recombinant DNA technology for the production of f the specific immunoglobulin in a variety of vertebrates. q By preparing CDNA libraries from buddarar RNA can especially a single cDNA clone is isolated, which Lodar for V immunoglobulin and is free of introns, and * is introduced toe » 421 10 15 20 25 30 35 506 421 12 appropriate prokaryotic or eukaryotic expression vectors and then transformed into a host animal for (see generally, U.S. 4,172,124; and 4,423,147. final bulk production 4,350, ó83; 4,363,799; 4.38l, 292; See also, Kennett and Monoclonal Antibodies, Plenum, New York (1980) al., and references therein, all of which incorporated into this description by reference thereto.) In accordance with hybrid DNA technology, more specifically the immunoglobulins or fragments of the present invention invention is prepared in bacteria or yeast. (See, Boss, et al., Nucl. Acid. Res., 12: E791 and Wood et al., Nature 314: 44ó, both of which are incorporated herein by reference by reference thereto.) Thus, for example, -RNA, which is transcribed from the genes that encode them the light and heavy chains of the monoclonal antibodies produced by a cell line of the present invention finning, isolated by differential cDNA hybridization using cDNA from BALB / c lymphocytes other than present clone. mRNQ, which does not hybridize, is rich in the messages encoding the desired immunoglobulin the chains. As needed, this process can be repeated for to further increase the desired mRNA levels. The stripped mRNA preparation can then be transcribed conversely to provide a cDNA mixture, which is enriched with respect to the desired sequences. RNA can then hydrolyzed with an appropriate RNase and ssDNA can double-stranded with DNA polymerase I and random initiators, for example, randomly fragmented calf tv DNA. The the resulting dsDNA can then be cloned by insertion into a suitable vector, for example viral vectors such as lambda pACYCl84. -g ﬁ r vectors or plasmid vectors (such as pBRu¿_. etc.). By developing samples based on known sequences for the constant regions of the light and heavy the chains can be such cDNA clones that contain that gene 10 15 20 25 30 35 5o6§421 which encodes the desired light and heavy chains identi-f by hybridization. Then the genes can excrete ﬁ from the plasmids, are manipulated to remove over-: fluid DNA upstream of the initiation codon or constant region DNQ and then inserted into a suitable vector for 7 transformation of a host cell and finally expression of genes.

Lämpligen kan värddäggdjursceller (exempelvis musceller)~*“ användas för bearbetning av kedjan (exempelvis förena det tunga och lätta kedjorna) för framställning av ett intakf immunoglobulin och vidare utsöndra immunoglobulinet fritt fran ledarsekvensen. om sa önskas. Alternativt kan man V använda encelliga mikroorganismer för framställning av dee tva kedjorna, där ytterligare manipulation kan krävas föru att avlägsna de DNA-sekvenser som kodar för den sekret.riska ledaren och processignaler under det att de- tillhandahaller en initieringskodon vid 5'-änden av den Ä sekvens som kodar för den tunga kedjan. Fä detta sätt kan immunoglobuliner framställas och bearbetas sa att de kan; sammanföras och glykosyleras i andra celler än däggdjursfi celler. Dm sa önskas kan var och en av kedjorna trunkerasš sa att de bibehaller atminstone den variabla regionen, å vilken därefter kan manipuleras för tillhandahallande av andra immunoglobuliner eller fragment, som är specifika för flagellat-epitoperna.Suitably, host mammalian cells (e.g., mouse cells) may be used for machining the chain (for example, joining it heavy and light chains) for the production of an intactf immunoglobulin and further secrete the immunoglobulin freely from the leader sequence. if so desired. Alternatively, one can V use unicellular microorganisms to produce dee two chains, where further manipulation may be required before to remove the DNA sequences that encode it secretarial leader and process signals while de- provides an initiation codon at the 5 'end of the Ä sequence encoding the heavy chain. Get this way can immunoglobulins are prepared and processed so that they can; combined and glycosylated in cells other than mammalian fiber cells. If desired, each of the chains can be truncated said that they maintain at least the variable region, å which can then be manipulated to provide other immunoglobulins or fragments, which are specific for the flagellate epitopes.

De monoklonala antikropparna enligt föreliggande upp- finning är speciellt användbara pa grund av sin specifici* tet för antigener hos praktiskt taget alla för närvarandev aeruginosa-varianter. antikropparna är dessutom protektiva Lg vivo, kända E. Vissa av de monoklonala vilket medger införlivande därav med farmaceutiska produkter, sasom antikroppkombinationer för bakterieinfektioner.The monoclonal antibodies of the present invention are particularly useful because of their specificity * antigens in virtually all of them at present aeruginosa variants. the antibodies are also protective Lg vivo, known E. Some of the monoclonal which allows its incorporation into pharmaceutical products, such as antibody combinations for bacterial infections.

Monoklonala antikroppar enligt föreliggande uppfinning kan 10 15 20 25 30 35 506 421 14 även finna vidsträckt användning ig vitro. Sa exempelvis kan de monoklonala antikropparna användas för typning av mikroorganismer. för isolering av specifika E. aeruginosa- för selektivt avlägsnande av E. -stammar, aeruoinosa- -celler i en heterogen blandning av celler eller liknande.Monoclonal antibodies of the present invention can 10 15 20 25 30 35 506 421 14 also find widespread use in vitro. Said for example the monoclonal antibodies can be used for typing microorganisms. for the isolation of specific E. aeruginosa for selective removal of E. strains, aeruoinosa- cells in a heterogeneous mixture of cells or the like.

För diagnostiska ändamal kan de monoklonala antikropparna antingen vara märkta eller omärkta. Typiskt innefattar diagnostiska analysmetoder detektering av bildningen av ett komplex genom bindning av den monoklonala antikroppen till flagellen hos E. I omärkt aeruginosa-organismen. form finner antikropparna användning vid agglutinations- -analyser. Vidare kan omärkta antikroppar användas i kom- bination med andra märkta antikroppar (sekundära anti- kroppar), som är reaktiva med den monoklonala anti- kroppen, sasom antikroppar specifika för immunoglobulin.For diagnostic purposes, the monoclonal antibodies may either be labeled or unlabeled. Typically includes diagnostic analysis methods detection of the formation of a complex by binding the monoclonal antibody to the flagellum of E. I unmarked aeruginosa organisms. form, the antibodies find use in agglutination -analyzes. Furthermore, unlabeled antibodies can be used in combination with other labeled antibodies (secondary bodies) which are reactive with the monoclonal antibody the body, such as antibodies specific for immunoglobulin.

Alternativt kan de monoklonala antikropparna märkas direkt. En mangfald markörer kan användas, sasom radio- nuklider, fluorescerande medel, enzymer, enzymsubstrat, encym-cofaktorer, enzym-inhibitorer, ligander (speciellt haptener), etc. Talrika typer av immunoanalysmetoder finns tillgängliga och som exempel härpa hänvisas till de ameri- kanska patentskrifterna 3,B17,827, 3,8SO.752. 3.901.654, 3, 35,074, 3,?84,S33, 3,996,345, 4,034,074 och 4,098,B76, vilka samtliga införlivas med denna beskrivning genom hän- visning därtill.Alternatively, the monoclonal antibodies can be labeled Immediately. A variety of markers can be used, such as radio nuclides, fluorescent agents, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, ligands (especially haptens), etc. Numerous types of immunoassay methods exist available and by way of example reference is made to the perhaps Patents 3, B17,827, 3,8SO.752. 3,901,654, 3, 35,074, 3, 84, S33, 3,996,345, 4,034,074 and 4,098, B76, all of which are incorporated herein by reference. display in addition.

Vanligen utnvttjas de monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning vid enzvm-immunoanalys. där före- liggande antikroppar eller sekundära antikroppar fran en annan art konjugeras till ett enzym. När ett prov. som innehaller E. aeruginosa av en viss serotyp, sasom human- blod eller lysat därav. kombineras med föreliggande anti- kroppar inträder bindning mellan antikropparna och de molekyler som uppvisar den önskade epitopen. Dwlika celler kan därefter separeras fran icke-bundna reagens 10 15 20 25 30 35 5o@ 421 och en sekundär antikropp (märkt med ett enzym) till- sättas. Därefter bestämmes närvaron av det antikropp- -enzym-konjugat som är specifikt bundet till cellen.Usually the monoclonal antibodies according to present invention in enzyme immunoassay. where lying antibodies or secondary antibodies from one another species is conjugated to an enzyme. When a test. as contains E. aeruginosa of a certain serotype, such as human blood or lysed thereof. combined with the present anti- bodies bind between the antibodies and those molecules that exhibit the desired epitope. Dwlika cells can then be separated from unbound reagents 10 15 20 25 30 35 5o @ 421 and a secondary antibody (labeled with an enzyme) put. Thereafter, the presence of the antibody is determined. enzyme-conjugate that is specifically bound to the cell.

Annan konventionell teknik, som är välkänd för fack- mannen, kan även utnyttjas.Other conventional techniques, which are well known to those skilled in the art. man, can also be exploited.

Testsatser kan även tillhandahallas för användning med föreliggande antikroppar för att pavisa E. aeruginosa i lösningar eller närvaron av flagellära E. ag;gQ¿gg§a-ant¶- gener. Saledes kan föreliggande monoklonala antikropp- Å beredning enligt föreliggande uppfinning tillhandahällasl vanligen i lyofiliserad form, antingen separat eller till sammans med ytterligare antikroppar, som är specifika med avseende pa andra gram-negativa bakterier. Antikropparna,,, som kan vara konjugerade till en markör eller vara okonjugerade, ingar i testsatserna med buffertämnen, sasom Tris, fosfat, karbonat, etc, stabiliseringsmedel, biocider, inerta proteiner, exempelvis bovinserumalbuming eller liknande.Test kits can also be provided for use with present antibodies to detect E. aeruginosa in solutions or the presence of flagellar E. ag; gQ¿gg§a-ant¶- gener. Thus, the present monoclonal antibody- Å preparation according to the present invention is provided usually in lyophilized form, either separately or in addition together with additional antibodies specific for with respect to other gram-negative bacteria. The antibodies ,,, which may be conjugated to a marker or be unconjugated, in the test batches of buffer substances, such as Tris, phosphate, carbonate, etc, stabilizers, biocides, inert proteins, for example bovine serum albumin or similar.

I allmänhet är dessa material närvarande¿ i en mängd mindre än cirka 5 vikt%, räknat pa mängden av: aktiva antikropp, och är vanligen närvarande i en total mängd av minst cirka 0,001 viktï, anyo räknat pa anti- kroppskoncentrationen. Ofta är det önskvärt att inför- liva ett inert utdrygningsmedel eller excipient för ut- spädning av de aktiva bestandsdelarna, varvid excipienten kan vara närvarande i en mängd fran cirka 1 till 99 viktﬂ av den totala beredningen. När en sekundär antikropp medq förmaga att binda till den monoklonala antikroppen använ- des, är denna vanligen närvarande i en separat ampull. Den; sekundära antikroppen är typiskt konjugerad till en markör och bereds pa ett sätt analogt med ovan beskrivnaw antikroppsberedningar.In general, these materials are present¿ in an amount less than about 5% by weight, based on the amount of: active antibody, and is usually present in a total amount of at least about 0.001% by weight, calculated on the body concentration. It is often desirable to introduce an inert excipient or excipient for dilution of the active ingredients, wherein the excipient may be present in an amount of from about 1 to 99 weight ﬂ of the total preparation. When a secondary antibody medq able to bind to the monoclonal antibody used des, this is usually present in a separate ampoule. The; the secondary antibody is typically conjugated to a marker and is prepared in a manner analogous to that described above antibody preparations.

De monoklonala antikropparna, speciellt monoklonala humanantikroppar, enligt denna uppfinning kan även införﬁ livas som komponenter i farmaceutiska beredningar, vilkas 10 15 20 25 30 35 506 421 16 innehaller en terapeutisk eller profylaktisk mängd av minst en av de monoklonala antikropparna enligt denna upp- En farma- finning och en farmaceutiskt effektiv bärare. ceutisk bärare bör vara en kompatibel ogiftig substans, som är lämplig för administrering av de monoklonala anti- kropparna till patienten. Sterilt vatten. alkohol, fetter, växer och inerta fasta ämnen kan användas som bärare. Farmaceutiskt godtagbara adjuvantia (buffert- medel, dispergeringsmedel) kan även införlivas med den farmaceutiska beredningen. Dylika beredningar kan inne- halla en enda monoklonal antikropp, som är specifik för stammar av en flagellär typ av E. aeruginosa. Alternativt kan en farmaceutisk beredning innehalla tva eller flera monoklonala antikroppar för bildning av en "cocktail". Sa exempelvis är en cocktail, som innehaller monoklonala antikroppar mot bada typerna av flageller eller mot grupper av de olika E. aeruginosa-stammarna (e empelvis olika serotyper), en universalprodukt med aktivitet mot det stora flertalet av de kliniska isolaten av denna speciella bakterie.The monoclonal antibodies, especially monoclonal human antibodies, according to this invention may also face ﬁ lived as components of pharmaceutical preparations, which 10 15 20 25 30 35 506 421 16 contains a therapeutic or prophylactic amount of at least one of the monoclonal antibodies of this invention A pharmaceutical finning and a pharmaceutically effective carrier. pharmaceutical carrier should be a compatible non-toxic substance, suitable for the administration of the monoclonal antibodies the bodies of the patient. Sterile water. alcohol, fats, waxes and inert solids can be used as carrier. Pharmaceutically acceptable adjuvants (buffer agents, dispersants) can also be incorporated into it the pharmaceutical preparation. Such preparations may contain hold a single monoclonal antibody specific for strains of a flagellar type of E. aeruginosa. Alternatively a pharmaceutical preparation may contain two or more monoclonal antibodies to form a "cocktail". Sa for example, is a cocktail, which contains monoclonal antibodies against both types of flagella or against groups of the various E. aeruginosa strains (e.g., e.g. different serotypes), a universal product with activity against the vast majority of its clinical isolates special bacteria.

Molförhallandet mellan de olika monoklonala antikroppskom- ponenterna skiljer sig vanligen icke at med mer än en faktor 10, vanligare icke med mer än en faktor 5, och mol- >_\ förhallandet är vanligen cirka 1:1-e med avseende pa de övriga antikroppskomponenterna.The molar ratio between the different monoclonal antibody compounds the components usually do not differ by more than one factor 10, more commonly not by more than one factor 5, and mol- > _ \ the ratio is usually about 1: 1-e with respect to de the other antibody components.

De monoklonala antikropparna enligt föreliggande upp- finning kan även användas 1 kombination med existerande blodolasmaprodukter. sasom kommersiellt tillgängliga gammaglobulin- och immunoglobulinprodukter. som användes vid profvlaktisk eller terapeutisk behandling av E. aeruginosa-sjukdomar hos människa. För immunoglobuli- ner erhalles företrädesvis plasman fran humandonatorer, 1 som uppvisar förhöjda nivaer av immunoglobuliner, vilka är reaktiva med avseende pa Q. aeruginosa. (För allmän 10 15 20 25 30 35 soe 421 17 É _ U “Intravenous Immunef Med., information hänvisas till kompendiet Globulin and the Compromised Host," Amer. J. 7ó(3a), 1984, 30 mars, sid. 1-23 , vars innehall inför- livas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.) Föreliggande monoklonala antikroppar kan användas som separat administrerade beredningar, som tillförs jämte antibiotika eller antimikrobiella medel. Typiskt kan de antimikrobiella medlen innefatta ett anti-pseudomonalt penicillin (exempelvis karbenicillin) jämte en amino- glykosid (exempelvis gentamycin, tobramycin, et:.>, men talrika ytterligare medel (exempelvis cefaldsporiner), som är välkända för fackmannen, kan även användas.The monoclonal antibodies of the present invention finning can also be used in combination with existing blood oil products. as commercially available gamma globulin and immunoglobulin products. which was used in the prophylactic or therapeutic treatment of E. aeruginosa diseases in humans. For immunoglobuli- The plasma is preferably obtained from human donors, 1 which show elevated levels of immunoglobulins, which are reactive with respect to Q. aeruginosa. (Too general 10 15 20 25 30 35 soe 421 17 É _ U “Intravenous Immunef With., information is referred to the compendium Globulin and the Compromised Host, "Amer. J. 7ó (3a), 1984, March 30, p. 1-23, the contents of which are live with this description by reference thereto.) The present monoclonal antibodies can be used as separately administered preparations, which are added together antibiotics or antimicrobials. Typically, they can antimicrobial agents include an anti-pseudomonal penicillin (for example carbenicillin) together with an amino glycoside (for example gentamycin, tobramycin, et:.>, but numerous additional agents (e.g. cephalosporins), which are well known to those skilled in the art can also be used.

De monoklonala antikropparna och farmaceutiska bered- ningarna därav enligt denna uppfinning är speciellt an- vändbara för oral eller parenteral administrering. Före- trädesvis kan de farmaceutiska beredningarna administre- ras barenteralt, d.v.s. subkutant, intramuskulärt eller intravenöst. Saledes tillhandahaller denna uppfinning beredningar för parenteral administrering, vilka inne- fattar en lösning av den monoklonala antikroppsn eller en cocktail därav upplöst i en godtagbar bärare. företrädes- vis en vattenhaltig sädan. En mangfald vattenhaltiga bärare kan användas. exempelvis vatten, buffrat vatten, O, 2 saltlösning, 0,32 glycin och liknande. Dessa lösningar är sterila och i allmänhet fria fran partikel-vi formigt material. Eeredningarna kan steriliseras medelst konventionell välkänd steriliseringsteknik. Dessa bered- ningar kan innehalla sadana farmaceutiskt godtagbara hjälpsubstanser som krävs för att appronimera fysiologis- ka betingelser, säsom pH-reglerande medel och buffert- medel, tomicitetsreglerande medel och liknande, exempel- vis natriumacetat, natriumklorid. kaliumklorid. kalcium- -klorid, natriumlaktat etc. koncentrationen av antikropp i dessa beredningar kan variera inom vida gränser, d.v.s.i 10 15 20 25 30 35 506 421 18 viktï, vanligen minst cirka l viktï. fran mindre än cirka 0,5 viktï till sa mycket som 15 eller 20 och valet därav baserar sig primärt pa vätskevolymer. viskositeter etc., allt efter det valda administreringssättet.The monoclonal antibodies and pharmaceutical preparations the uses thereof of this invention are particularly reversible for oral or parenteral administration. Before- In addition, the pharmaceutical preparations may be administered race barenterally, i.e. subcutaneously, intramuscularly or intravenously. Thus, this invention provides preparations for parenteral administration, which contain take a solution of the monoclonal antibody or a cocktail thereof dissolved in an acceptable carrier. preferred show an aqueous grain. A variety of aqueous carrier can be used. for example water, buffered water, 0.2 saline, 0.32 glycine and the like. These solutions are sterile and generally free of particulate matter shaped material. The preparations can be sterilized by conventional well-known sterilization techniques. These preparations may contain such pharmaceutically acceptable excipients required to approximate physiological conditions, such as pH adjusting agents and buffer agents, tomicity adjusting agents and the like, e.g. show sodium acetate, sodium chloride. potassium chloride. calcium- chloride, sodium lactate, etc. the concentration of antibody in these preparations can vary within wide limits, i.e. i 10 15 20 25 30 35 506 421 18 weight, usually at least about 1 weight. from less than about 0.5 weight to as much as 15 or 20 and the choice of which it is based primarily on liquid volumes. viscosities etc., depending on the mode of administration chosen.

Saledes kan en typisk farmaceutisk beredning för intra- muskulär injektion framställas innehallande 1 ml sterilt buffrat vatten och 50 mg monoklonal antikropp. En typisk beredning för intravenös infusion kan framställas inne- ha lande 250 ml steril Ringers lösning och 150 mg mono- klonal antikropp. Aktuella metoder för framställning av parenteralt administrerbara beredningar är kända eller uppenbara för fackmannen och beskrivs närmare i detalj Pharmaceutical Science, 15:e exempelvis i Reminqton's _uppl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), som införlivas med denna beskrivning genom hän- visning därtill.Thus, a typical pharmaceutical preparation for intravenous muscular injection is prepared containing 1 ml of sterile buffered water and 50 mg monoclonal antibody. A typical preparation for intravenous infusion can be prepared by 250 ml of sterile Ringer's solution and 150 mg of mono- clonal antibody. Current methods for producing parenterally administrable preparations are known or obvious to the person skilled in the art and described in more detail Pharmaceutical Science, 15th for example in Reminqton's _uppl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), which is incorporated herein by reference. display in addition.

De monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning kan lyofiliseras för lagring och rekonstitueras i en lämplig bärare före användning. Denna teknik har visat sig vara effektiv med konventionella immunoglobuliner och inom tekniken känd lyofiliserings- och rekonstitueringsteknik kan användas. Det är uppenbart för fackmannen att lyofili- sering och rekonstituering kan leda till varierande grad av förlust av antikroppsaktivitet (exempelvis med konven- tionella immunoglobuliner tenderar IgM-antikroppar att uppvisa större aktivitetsförlust än Igü-antikroppar) och för kompensation att användningsnivaerna maste justeras därav.The monoclonal antibodies of this invention may lyophilized for storage and reconstituted in an appropriate carrier before use. This technology has proven to be effective with conventional immunoglobulins and within technology known lyophilization and reconstitution technology Can be used. It is obvious to those skilled in the art that lyophilization and reconstitution can lead to varying degrees loss of antibody activity (for example with conventional tional immunoglobulins, IgM antibodies tend to show greater loss of activity than Igü antibodies) and for compensation that the levels of use must be adjusted hence.

Beredningarna, som innehaller föreliggande monoklsnala antikroppar eller en cocktail därav, kan administreras för profvlaktisk och/eller terapeutisk behandling av admini- É. aeruginosa-infektioner. För terapeutiskt bruk streras beredningarna till en patient, som redan har 10 15 20 25 30 so§í421 19 infekterats med en eller flera E. aeruginosa-serotyper, kg en mängd som är tillräcklig för att bota eller atminstone partiellt hindra infektionen och dess komplikationer. En mängd. som är adekvat för att astadkomma detta, 5 definieras som en "terapeutiskt effektiv dos". Mängder, som är effektiva för detta ändamal, beror pa infektionene svarighetsgrad och det allmänna tillstandet hos patientens eget immunsystem men varierar i allmänhet fram kilo kroppsvikt,; cirka 1 till cirka 200 mg antikropp per varvid doser av 5-25 mg per kilo vanligen används. Nan maste halla i minnet att materialen enligt denna uppfinning allmänt kan användas för allvarliga sjukdoms- tillstànd, d.v.s. livshotande eller potentiellt livshotan de situationer, speciellt bakteremi och endotonemi till följd av E. aeruginosa.The formulations containing the present monoclonal antibodies or a cocktail thereof, may be administered for prophylactic and / or therapeutic treatment of admini- E. aeruginosa infections. For therapeutic use the preparations are transferred to a patient who already has 10 15 20 25 30 so§í421 19 infected with one or more E. aeruginosa serotypes, kg an amount sufficient to cure or at least partially prevent the infection and its complications. One amount. adequate to achieve this, 5 defined as a "therapeutically effective dose". Quantities, which are effective for this purpose, depend on the infections degree of liability and the general condition of the patient's own immune system but generally varies kilo body weight ,; about 1 to about 200 mg of antibody per with doses of 5-25 mg per kilogram usually used. Nan must keep in mind that the materials according to this invention can generally be used for serious disease condition, i.e. life-threatening or potentially life-threatening the situations, especially bacteremia and endotonemia to followed by E. aeruginosa.

Vid profvlaktiska tillämpningar administreras bered- ningar, som innehaller föreliggande antikropp eller en cocktail därav, till en patient som ej redan har infek- terats av E. aeruginosa i syfte att förstärka patientens resistens mot en dylik potentiell infektion. En sadan 7 mängd definieras som en “profylaktiskt effektiv dos". Vid: denna användning beror även här de exakta mängderna pa patientens hälsotillstand och allmänna immunitetsniva ment varierar i allmänhet fran 0,1 till 25 mg/kilo, speciellt V 0,5-2,5 mg/kilo.In prophylactic applications, the preparation is administered containing the present antibody or a cocktail thereof, to a patient who does not already have by E. aeruginosa in order to enhance the patient's resistance to such a potential infection. And then 7 amount is defined as a "prophylactically effective dose". this use also depends here on the exact amounts of pa the patient's state of health and general immunity levels generally ranges from 0.1 to 25 mg / kg, especially V 0.5-2.5 mg / kilo.

Enkel- eller multipeladministreringar av beredningarna kan utföras med dosnivaer och doseringsmönster som be- A stämmes av den behandlande läkaren. Under alla omständigjwm heter bör de farmaceutiska beredningarna tillhandahalla en mängd av antikroppen eller antikropparna enligt denna uppfinning som är tillräcklig för effektiv behandling eller profylax av patienten. 10 15 20 25 30 506 421 FÖRSÖHSEESFRIVNING EXEMFEL 1 Exempel 1 askadliggör den metodik som användes +ör att framställa en monoklonal antikropp fran rattdjur. vilken binder speci4ikt till E. aeruginosa-flageller.Single or multiple administrations of the preparations can be performed with dose levels and dosing patterns as required sued by the attending physician. Under all circumstancesjwm the pharmaceutical preparations should provide an amount of the antibody or antibodies thereof invention sufficient for effective treatment or prophylaxis of the patient. 10 15 20 25 30 506 421 DISCLAIMER EXAMPLE 1 Example 1 disables the methodology used produce a monoclonal antibody from rat animals. which binds specifically to E. aeruginosa flagella.

Tre manader gamla BALB/c-möss immuniserades intraperito- nealt atta ganger med livskraftiga E. aeruginosa-bak- terier av Fisher-immunotyp l och Fisher-immunotyp 2 (A.T.C.C. %27312 och #273l3) var eller varannan vecka under totalt nio veckor. De initiella doserna av bakterierna var 8 N 10* och 1 107 organismer per mus av E. aeruginosa Fisher-immunotyp 1 respektive Fisher- tiil ao-faiaigt -immunotyp 2 och doseringen ökades ZO- under loppet av immuniseringen.Three-month-old BALB / c mice were immunized intraperitoneally. eight times with viable E. aeruginosa Fisher immunotype 1 and Fisher immunotype 2 (A.T.C.C.% 27312 and # 273l3) every two weeks for a total of nine weeks. The initial doses of the bacteria were 8 N 10 * and 1,107 organisms per mouse of E. aeruginosa Fisher immunotype 1 and Fisher tiil ao-faiaigt immunotype 2 and the dose was increased ZO- during the course of immunization.

Tre dagar efter den sista injektionen avlagsnades mjälten fran en mus aseptiskt och en enkelcellsuspension fram- stalldes genom försiktig rotation av organet mellan de matterade ändarna av tva sterila objektglas. Enkarniga mjaltceller kombinerades 1 ett förhallande av 4:1 med (NSI-1, erhallna fran Dr. C.Three days after the last injection, the spleen was removed from a mouse aseptically and a single cell suspension was made by careful rotation of the organ between them matte ends of two sterile slides. Enkarniga spleen cells were combined in a ratio of 4: 1 with (NSI-1, obtained from Dr. C.

England) musmyelom-log-fas-celler Milstein. Molecular Research Council. Cambridge. och íusionerades för alstring av hvbridom enligt det för- +arande som har beskrivits av Tam et al. (1?82, Infect. lmmun., 3é:1042-1053). Den slutliga hybridcellsuspen- sionen spaddes till en koncentration av 1,5 u 10° celler per ml i RPMI-hvbrid-HAT (RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) innehallande 1-2 värme-inaktiverat kalv¥ostereerum, 1 mM natriumpvruvat, lüüpg/ml penicillin och strepto- mycin, 1.0 r lO** M hypouantin. 4.0 10"? M aminopterin och l.o 10"” M tvmidin). som innefattade 2,0 x 10° per 10 15 20 25 30 35 so@§421 ml av nyframställda BALB/c-tymocyter som matarceller.England) mouse myeloma log phase cells Milstein. Molecular Research Council. Cambridge. and was infused to produce hybridoma according to the procedure + arande described by Tam et al. (1? 82, Infect. lmmun., 3rd: 1042-1053). The final hybrid cell suspension the ion was spat on to a concentration of 1.5 u 10 ° cells per ml in RPMI-hybrid HAT (RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) containing 1-2 heat-inactivated calf ¥ ostereerum, 1 mM sodium tested, lüüpg / ml penicillin and strepto- mycin, 1.0 r lO ** M hypouantin. 4.0 10 "? M aminopterin and l.o 10 "(M tvmidin)., which included 2.0 x 10 ° per 10 15 20 25 30 35 so @ §421 ml of freshly prepared BALB / c thymocytes as feeder cells.

Elandningen utströks (200 ul per fack) pa plattor med 96¿W fack (#3596, Costar, Cambridge, MA). Hulturerna matades genom avlägsnande och ersättning av 50% av volymen i varje fack med färsk RPMI-hybrid-HAT varannan eller var_¿lf tredje dag. överliggande odlingsvätskor analyserades med\ aeruginosa-antikroppar 0 när ceiiš avseende pa närvaron av anti- E. medelst enzymlänkad immunosorbensanalys i facken, växten nade natt cirka 40% sammanflytning van-V ligen inom 7-10 dagar.The landing was spread (200 ul per compartment) on plates with 96¿W compartment (# 3596, Costar, Cambridge, MA). The hultures were fed by removing and replacing 50% of the volume in each compartment with fresh RPMI-hybrid-HAT every other or every_¿lf third day. overlying culture fluids were analyzed with \ aeruginosa antibodies 0 when ceiiš regarding the presence of anti- E. by enzyme-linked immunosorbent assay in the compartments, the plant nade night about 40% confluence van-V within 7-10 days.

De överliggande odlingsvätskorna fran hybridcellerna analyserades samtidigt pa yttermembranpreparat fran var _och en av de tva immuniserande bakterierna. Yttermembranﬁ preparat isolerades medelst en modifikation av den metod: som har angivits av Tam et al. (1982. Infect. Immun., 3b:l042-1053), som införlivas med denna beskrivning genom Bakterierna aeruginosa Fisher- hänvisning därtill. (E. -immunotyp 1 och Fisher-immunotyp 2) ympades i tryptikasä -soja-odlingsmedium (TSBV och fick växa lb-18 timmar vidQ 34°C under luftning i ett roterande skakbad. Bakteriernal? skördades genom centrifugering och tvättades tva ganger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,14 M NaCl. 3 mh KC1, 8 mM NåzHPO4 -7 H20, 1,5 mﬂ HH=FÜ4, PH 7,2), som innehöll ISO'trypsininhiberingsenheter (T.I.U.) aprotinin i per ml (Sigma, St. Louis, M0).The overlying culture fluids from the hybrid cells were analyzed simultaneously on outer membrane preparations from var and one of the two immunizing bacteria. Outer membrane ﬁ preparations were isolated by a modification of the method: as reported by Tam et al. (1982. Infect. Immun., 3b: 1042-1053), which is incorporated herein by reference The bacteria aeruginosa Fisher- reference thereto. (E. immunotype 1 and Fisher immunotype 2) were inoculated into trypticase soy culture medium (TSBV and allowed to grow lb-18 hours at Q) 34 ° C during aeration in a rotary shaker bath. Bacterial? was harvested by centrifugation and washed twice with phosphate buffered saline (PBS, 0.14 M NaCl. 3 mh KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 -7 H 2 O, 1.5 m ISO 'trypsin inhibitors (T.I.U.) contained aprotinin in per ml (Sigma, St. Louis, M0).

Pelleten fran den slutliga centrifugeringen atersuspen- derades i 0,17 M trietanolamin, 20 mM dinatrium-etylen- (EDTA) och homogeniserades där- -diamin-tetraättiksyra efter pa is under 10 minuter. Cellfragmentet pelleteradee fran homogenatet vid 14,900 x g och kasserades och den överliggande vätskan centrifugerades anvo enligt ovan.The pellet from the final centrifugation is resuspended. was dissolved in 0.17 M triethanolamine, 20 mM disodium ethylene (EDTA) and was thus homogenized -diamine tetraacetic acid after on ice for 10 minutes. The cell fragment pelleteradee from the homogenate at 14,900 x g and discarded the supernatant was centrifuged using as above.

Pelleten kasserades anyo och membranen oelletiserades fran den överliggande vätskan genom centrifugering vid 10 15 20 25 30 35 so6 421 l40,000 x g under en timme. Den överliggande vätskan kasserades och membranpelleterna förvarades över natten vid 4“C i 10 ml PBS, ml. Nästa dag atersuspenderades pelleterna genom virvel- som innehöll 75 T.I.U. aprotinin per bildning och alikvoterades därefter och förvarades vid -70'C. Proteinhalten hos varje pellet bestämdes medelst den metod som har angivits av Lowry et al. (1951, Q.The pellet was discarded anyo and the membranes were oelletized from the supernatant by centrifugation at 10 15 20 25 30 35 so6 421 l40,000 x g in one hour. The supernatant was discarded and the membrane pellets were stored overnight at 4 ° C in 10 ml PBS, ml. The next day, the pellets were resuspended by vortexing. which contained 75 T.I.U. aprotinin per formation and then aliquoted and stored at -70 ° C. The protein content of each pellet was determined by the method set forth by Lowry et al. (1951, Q.

Eiol. Chem., 193:2ó5-275). ântigenplattorna för ELISA preparerades som följer.Eiol. Chem., 193: 20-25-275). the antigen plates for ELISA were prepared as follows.

Yttermembranpreparaten späddes till 5 pg per ml protein i PBS och 50pl av lösningarna utströks i varje fack pa en platta med 96 fack (Linbro #76-031-05, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA), förseglades och inkuberades över natten vid 37°C. Übundet antigen avlagsnades fran plattor- 100 ul 5% bovinserumalbumin (BSA) i na och (vikt/volym) PBS sattes till varje fack och plattorna inkuberades under en timme vid Z7°C.The outer membrane preparations were diluted to 5 pg per ml of protein in PBS and 50 μl of the solutions were spread in each compartment on one plate with 96 compartments (Linbro # 76-031-05, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA), was sealed and incubated over at night at 37 ° C. Unbound antigen was removed from the plate. 100 ul 5% bovine serum albumin (BSA) i and (weight / volume) PBS was added to each compartment and the plates were incubated for one hour at Z7 ° C.

Efter avlägsnande av icke-absorberat BSA replikatutströks överliggande vätskor (S0ul) fran varje fack pa fusions- i motsvarande fack pa antigenplattorna och in- 37°C. plattorna kuberades 30 minuter vid Den obundna antikroppen avlägsnades fran facken och plattorna tvättades tre ganger med 100 ul 1% (vikt/volym) BSQ-PBS per fack. Där- efter sattes 50 ul per fack av pa lämpligt sätt utspätt Inc.. Burlingame, Vi d biotinvlerat get-anti-mus-Igü (Tago, CH) I7°C. ovan och därefter sattes till facken 50ul av ett i för- till varje f ck och inkuberades under 30 minuter a Plattorna tvattades tre ganger sasom beskrivits väg framställd avidin: biotinylerat pepparrotsperonidas- (Vectastain ABC Hit, Vector Laboratories. Inc., CQ), -komplex Eurlingame, som hade framställts enligt till- verkarens specifikationer. Efter 30 minuter vid rumstempe- ratur avlägsnades Vectastain-reagenset fran facken, facken tvättades enligt ovan och därefter tillsattes 100 10 15 BBQ lf J W m1 per fack av substrat, o-fenylendiamin (0,8 mg/ml i 0,1 M citratbuffert, pH 5,0, blandat med en lika stor volym 0,03 volymï H2D=). minuter vid rumstemperatur i mörker och reaktionerna av- bröts därefter genom tillsats av SO pl EN H2 S04 per fack.After removal of unabsorbed BSA, the replicate was plated supernatants (SO2) from each compartment of the fusion in the corresponding compartments on the antigen plates and 37 ° C. the plates was incubated for 30 minutes with the unbound antibody was removed from the compartments and the plates were washed three times times by 100 μl 1% (w / v) BSQ-PBS per compartment. Where- after, 50 μl per compartment was diluted appropriately Inc .. Burlingame, Vi d biotin-derived goat anti-mouse IgU (Tago, CH) 17 ° C. above and then added to the compartments 50ul of a pre- to each compartment and incubated for 30 minutes a The plates were washed three times as described avidin: biotinylated horseradish peronidase (Vectastain ABC Hit, Vector Laboratories. Inc., CQ), -complex Eurlingame, which had been produced in the manufacturer's specifications. After 30 minutes at room temperature The Vectastain reagent was removed from the compartments, the compartments were washed as above and then 100 were added 10 15 BBQ lf J W m1 per compartment of substrate, o-phenylenediamine (0.8 mg / ml i 0.1 M citrate buffer, pH 5.0, mixed with an equal volume 0.03 volume H2D =). minutes at room temperature in the dark and the reactions was then broken by adding SO p1 EN H2 SO4 per compartment.

Hybridomceller, som avsöndrar monoklonala antikroppar, .\:,a. vilka binder till endera av de tva antigenpreparaten, l lokaliserades genom mätning av absorbansen vid 490 nm avà rr de kolorimetriska reaktionerna 1 varje íack med en "Dynatech Model 580 NicroELlSA reader” (Alexandria, VA),å ä Cellerna i antikropp, undersöktes närmare sasom -immunotyp 2. Detta fack beskrivs nedan.Hybridoma cells secreting monoclonal antibodies . \ :, a. which bind to either of the two antigen preparations, l was located by measuring the absorbance at 490 nm avà rr the colorimetric reactions 1 each with one "Dynatech Model 580 NicroELlSA reader" (Alexandria, VA), å ä The cells in antibody, was examined in more detail sasom -immunotype 2. This compartment described below.

Substratet inkuberades under Zﬁš ett fack med beteckningen Pa3 IVC2 producerade som band endast till antigenplattan med Fishefá 10 15 20 25 30 35 506 421 24 Den monoklonala antikroppen och den klonala cellinjen fran detta fack identifieras bada genom beteckningen Paï IVC2 i följande text. Paš IVC2-celler fran moderfacket miniklonades och klonades medelst den granssbädnings- teknik som har beskrivits av Tam et al. (1982, lnfect.The substrate was incubated during Z ﬁ š a compartment with the designation Pa3 IVC2 produced which bound only to the antigen plate with Fishefá 10 15 20 25 30 35 506 421 24 The monoclonal antibody and the clonal cell line from this compartment both are identified by the designation Paï IVC2 in the following text. Paš IVC2 cells from the mother compartment minicloned and cloned by the spruce bed techniques described by Tam et al. (1982, lnfect.

Immun.. 36:lO42-1053). som innehaller monoklonal (BÅLB/C Askitesvatska. antikropp med hög titer, framställdes pa CBb F;-möss (honmöss) C57BL/6 (hanmöss> Fl) enligt det förfarande som har beskrivits av Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36:1ü42- 1053 . Tva till tre manader gamla CBb F,-möss av hankön erhöll injektioner intraperitonealt med 0,5 ml pristan (2. 6, 10. 14-tetrametylpentadekan. Aldrich Chemical Co..Immun., 36: 1042-1053). which contains monoclonal (BÅLB / C Askitesvatska. antibody with high titer, was produced on CBb F; mice (female mice) C57BL / 6 (male mice> F1) according to the procedure described by Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36: 1ü42- 1053 Male to two to three months old male CBb F received injections intraperitoneally with 0.5 ml of pristan (2. 6, 10. 14-Tetramethylpentadecane. Aldrich Chemical Co ..

Milwaukee, NI) 10-21 dagar före intraoeritoneal injektion med log-fas-Paš IVC2-celler i RPMI. Varje mus erhöll en injektion av 0.5-1 107 celler i 0,5 ml. Efter cirka tva veckor avlagsnades den ackumulerade vätskan fran mössen varannan eller var tredje dag. Honcentrationen av anti- kropp i askitesvätskan bestämdes medelst agaros-gelelek- Beckman Instruments, Inc.. Brea, EA) trofores (Paragon. och all askites som innehöll 5 mg/ml eller mera antikropp poolades, alikvoterades och frystes vid -70°C.Milwaukee, NI) 10-21 days before intraoeritoneal injection with log-phase Paš IVC2 cells in RPMI. Each mouse received one injection of 0.5-1 107 cells in 0.5 ml. After about two weeks, the accumulated fluid was removed from the mice every other or every third day. The female concentration of anti- body in the ascites fluid was determined by agarose gel Beckman Instruments, Inc .. Brea, EA) trophes (Paragon. and all ascites containing 5 mg / ml or more antibody was pooled, aliquoted and frozen at -70 ° C.

Harakterisering av det molekylära obiektmal som binds av den monoklonala antikrobpen overliggande odlingsvatska fran den klonade Pai IVC2-cell- linjen analvserades medelst ELISA sasom beskrivits ovan ba vttermembranbreparat fran samtliga sju Fisher-immuno- aeruginosa (A.T.C.C. 27312-2?Z1B). E. aureofaciens (A.T.C.C. 13?85) (A.T.C.C. 8047). tvpstammar av E. och ﬁlebsiella pneumoniae samtliga framställda enligt ovan. Anti- kroooen Pai IVCI band till vttermembranpreparaten av 6 och 7 av E. aeruginoea men ej till de övriga Fisher-immotvperna, E. agg§gi¿;¿§Q§. eller Fisher-immunotvperna 2.Characterization of the molecular object template bound by the monoclonal antibody supernatant from the cloned Pai IVC2 cell the line was analyzed by ELISA as described above water membrane preparations from all seven Fisher immuno- aeruginosa (A.T.C.C. 27312-2? Z1B). E. aureofaciens (A.T.C.C. 13? 85) (A.T.C.C. 8047). tvp stems of E. and bs lebsiella pneumoniae all prepared as above. Anti- kroooen Pai IVCI band to the water membrane preparations of 6 and 7 of E. aeruginoea but not to the other Fisher immotvperna, E. agg§gi¿; ¿§Q§. or Fisher immunotypes 2.

Q. gneumoniae. 10 15 20 25 30 35 ,Fisher-immunotyperna 2, _, 506 å 421 Det specifika antigen som identifierades av antikroppen Pa3 IVC2 identifierades medelst radioimmunprecipitation-Å» I korthet innebär denna analysmetod att man inkuberar radioaktivt märkta antigener med antikroppen Paï IVC2 och en speciell källa till protein A, vilket resulterar i bildningen av olösliga antikropp:antigen-komplex. Dessa komplex tvättas för avlägsnande av eventuellt icke-specif fikt bundet antigen och därefter dissocieras komplexen och separeras i en polyakrylamidgel. De dominerande radioaktiva ämnen som aterfinns i gelen identifieras därigenom som motsvarande antigen eller antigener till vilket eller vilka antikroppen Paï IVC2 binder.Q. gneumoniae. 10 15 20 25 30 35 , Fisher immunotypes 2, _, 506 to 421 The specific antigen identified by the antibody Pa3 IVC2 was identified by radioimmunoprecipitation-Å » In short, this method of analysis involves incubating radiolabeled antigens with the antibody Paï IVC2 and a special source of protein A, resulting in the formation of insoluble antibody: antigen complex. These complexes are washed to remove any non-specific bound antigen and then the complexes are dissociated and separated in a polyacrylamide gel. The dominant radioactive substances found in the gel are identified thereby as the corresponding antigen or antigens to which antibody or antibody Paï IVC2 binds.

Alikvoter (25 pg) av lösliga yttermembranpreparat fran -v ~l 4 och 5 av E. aeruoinosa märktes radioaktivt i fast fas med 1251 under använding W av Iodo-gen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker och Speck, 1978, Biochem. Bioghys. Res. Commun., 80:84?-l ,857; Markwell och Fox, 1978, Biochemistry, 17:4807-4817)i Detta förfarande resulterade i jodering av exponerade tyrosinaterstoder av de flesta, om ej samtliga proteiner ingaende i yttermembranpreparaten.Aliquots (25 pg) of soluble outer membrane preparations from -v ~ l 4 and 5 of E. aeruoinosa labeled radioactive in solid phase with 1251 using W of Iodo gene (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker and Speck, 1978, Biochem. Bioghys. Res. Commun., 80: 84? -L , 857; Markwell and Fox, 1978, Biochemistry, 17: 4807-4817) i This procedure resulted in iodination of exposed tyrosinate residues of most, if not all, proteins ingested in the outer membrane preparation.

För att minska icke-specifik bindning av yttermembrananti~ genen till antikroppen Paš IVC2 inkuberades först de (5 x radioaktivt märkta preparaten 10* pulser per minut Der analvs) under en timme vid 4°C med normalt BALB/c-muS- serum (slutspädning 1:40). overliggande Paš IVC2-odlingsf innehallande antikroppen Pa3 IVC2 sattes Efter vätska (0,5 ml) därefter till vart och ett av yttermembranproven. inkubering av antigen och antikropp under en timme vid 4°C tillsattes källan till protein A, lgG50RB (ü.Û95 ml per prov) (The Enzyme Center, Inc., Boston, MA) och in- kuberades under ytterligare 30 minuter vid 4°C (ﬁessler,{> S.W., 1?75, J. Immunol., 115:1bl7-1622). IgGSORB fram- ställdes enligt tillverkarens specifikationer ocn strax före användning åörebvggdes icke-specifika reaktioner 10 15 20 25 30 35 under tio minuter och tillvaratogs i 506 421 26 genom blockering av potentiellt reaktiva ställen med odlingsmedium genom tvättning av IgG5DRB tva ganger med RPMI-hybrid HAT).To reduce non-specific binding of outer membrane antigen gene for the antibody Paš IVC2 was first incubated (5 x radiolabeled preparations 10 * pulses per minute Analyze) for one hour at 4 ° C with normal BALB / c serum (final dilution 1:40). overlying Paš IVC2 culture f containing the antibody Pa3 IVC2 was added After liquid (0.5 ml) then to each of the outer membrane samples. incubation of antigen and antibody for one hour at At 4 ° C, the source was added to protein A, IgG50RB (ü.Û95 ml per sample) (The Enzyme Center, Inc., Boston, MA) and was incubated for an additional 30 minutes at 4 ° C (ﬁ essler, {> S.W., 1? 75, J. Immunol., 115: 1bl7-1622). IgGSORB was set according to the manufacturer's specifications and soon before use, non-specific reactions were performed 10 15 20 25 30 35 for ten minutes and recovered in 506 421 26 by blocking potentially reactive sites with culture medium by washing IgG5DRB twice with RPMI hybrid HATRED).

(RPMI-hybrid-HAT-medium med uteslutning av Antigen-antikropp-IQBSDRB-komplexen pelleterades vid 1500 x g under tio minuter vid 4°C, tvättades tva ganger med fosfat-RIPA-buffert (10 mM fosfat, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 1,0 vo1vmZ Triton X-100, 1,02 (vikt/volym) natrium- deoxicholat, 0,12 (vikt/volym) natriumdodecvlsulfat (SDS) och 1,0 volymï aprotinin); tva ganger med hög saltbuffert 1 volvml beta- -merkaptoetanoll; (0.02 M Iris-Hcl, och en gang med lys-buffert 0,5 M Naßl, 1979, pH 7,5, 0,05 volymk Nonidet P-40) (Rohrschneider et al., Proc. Natl. Acad.(RPMI hybrid HAT medium excluding The antigen-antibody-IQBSDRB complexes were pelleted at 1500 x g for ten minutes at 4 ° C, washed twice with phosphate-RIPA buffer (10 mM phosphate, pH 7.2, 0.15 M NaCl, 1.0 v / vMZ Triton X-100, 1.02 (w / v) sodium deoxycholate, 0.12 (w / v) sodium dodecyl sulfate (SDS) and 1.0 volume of aprotinin); two times with high salt buffer 1 volvml beta- -mercaptoethanol; (0.02 M Iris-Hcl, and once with lys buffer 0.5 M Naßl, 1979, pH 7.5, 0.05 volume Nonidet P-40) (Rohrschneider et al., Proc. Natl. Acad.

U.S.A., 76:4479-4483. olemet, (0.125 M Tris-HCl, Sci., Antigen, som var bundet till kom- frigjordes genom inkubering med orovbuffert pH 6,8, 2% SDS, 2 volymï vid 95°C (vikt/volym) beta-merkaptoetanol och 20 volymï glycerol) den överliggande vätskan efter centrifugering vid 1500 x g under tio minuter.U.S.A., 76: 4479-4483. olemet, (0.125 M Tris-HCl, Sci., Antigen, which was bound to com- was released by incubation with agitation buffer pH 6.8, 2% SDS, 2 vol at 95 ° C (weight / volume) beta-mercaptoethanol and 20 volumes of glycerol) the overlying one the liquid after centrifugation at 1500 x g for ten minutes.

De överliggande vätskeoroverna apolicerades därefter pa 14% polyakrvlamidgeler, som innehöll SDS och hade fram- ställts medelst (1978, FEBS Lett., (1?79. J. Bacteriol., den metod som anges av B. Lugtenberg et 5B:254-258) 140:902-?10). al. modifierad av Hancock och Carey som infër- livas med denna beskrivning genom hanvisning dartíll) gelen genom elehtrofores Efter ättik- och antigenerna seoarerades i over natten vid en konstant soänning av 50V. fixering av gelen i 40 volymk metanol, 10 volvmï svra och 5 volvmï glvcerol över natten torkades den pa Whatman 3 MM-oaoper via en Biorad-geltorh (Richmond. CA).The overlying liquid orbs were then apolizated on 14% polyacrylamide gels, which contained SDS and had produced set by (1978, FEBS Lett., (1? 79. J. Bacteriol., the method specified by B. Lugtenberg et 5B: 254-258) 140: 902-? 10). al. modified by Hancock and Carey as an infer- live with this description by male reference dartíll) gel by electrophoresis After vinegar and the antigens were secreted in overnight at a constant voltage of 50V. fixation of the gel in 40 volmk methanol, 10 volmmï svra and 5 volvmï glvcerol overnight it was dried on Whatman 3 MM oaoper via a Biorad gel tower (Richmond. CA).

Den torkade gelen täcktes med olastfilm och exoonerades för Kodak X-AR-film under 18 timmar vid rumstemoeratur.The dried gel was covered with unloaded film and exoned for Kodak X-AR film for 18 hours at room temperature.

Resultaten av detta försök visade att Paš IVC2 band till 10 15 _20 25 30 35 5oe 421 27 endast ett antigen i yttermembranpreparatet av endast F*- Fisher-immunotyp s av E. aeruginosa och ej till nagot annat antigen närvarande i de övriga yttermembranprepa- raten. Molekylvikten (MV) åör antigenet i gelen var cirka“ 53000 dalton, vid bestämning genom jämförelse av dess _ mobilitet med mobiliteten hos **C-märkt proteinstandard ågg MV 92500; BSA, MV 69000: E NV 3013043; (fosforylas B. ovalbumin, MV 46000; 12000) (New England Nuclear, kolsyraanhydras, cytohrom C, MV Boston, MA), som separerades i samma gel. Molekylvikten för detta antigen korreleradeÉ med molekylvikten hos flagellin, aeruginosa, (1982, Infect. förlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill. det protein som utgör W flagellerna hos E. sasom har rapporterats av¿ Montie et al. lmmun., 35:281-288), som inåt Vidare undersöktes Paß IVC2 medelst ELISA under användning av Habs-stammarna 1-12 av E. aeruginosa ;@~ mikrotiterplattor med 96 fack. vilka +ixerades med etanol pa Antigenplattorna prepa- rerades som följer. -Ä Kulturer av varje organism, vilka hade fatt sta över' natten. pelleterades, tvättades tva ganger med PBS och atersuspenderades däreíter i PBS till ett Aaèa-värde av 0.2 0.D.-enheter. De utsoadda bakterierna utströks i åachv (50 ul per fack) och centrifugerades däreiter vid PBS till facken 1500 x g under 15 minuter vid rumstemperatur. (95%) Efter det att luftades och därefter sattes etanol under 15 minuter vid rumstemperatur. etanolen hade avlägsnas +ran facken lufttorkades plattorna och tacktes därefter och förvarades vid 4°C till dess de skulle användas.The results of this experiment showed that Paš IVC2 bound to 10 15 _20 25 30 35 5oe 421 27 only one antigen in the outer membrane preparation of only F * - Fisher immunotype s of E. aeruginosa and not to anything other antigen present in the other outer membrane preparations rates. The molecular weight (MV) of the antigen in the gel was approximately 53000 daltons, when determined by comparison of its _ mobility with the mobility of ** C-labeled protein standard eggs MV 92500; BSA, MV 69000: E NV 3013043; (phosphorylase B. ovalbumin, MV 46000; 12000) (New England Nuclear, carbonic anhydrase, cytochrome C, MV Boston, MA), which was separated in the same gel. The molecular weight of this antigen correlated with the molecular weight of flagellin, aeruginosa, (1982, Infect. be incorporated into this description by reference thereto. the protein that makes up W the flagella of E. sasom have been reported by¿ Montie et al. lmmun., 35: 281-288), as inward Furthermore, Paß IVC2 was examined by ELISA use of Habs strains 1-12 of E. aeruginosa; 96-compartment microtiter plates. which were +xerted with ethanol pa The antigen plates are prepared were as follows. -Ä Cultures of each organism, which had taken hold ' at night. pelleted, washed twice with PBS and was resuspended in PBS to an Aaèa value of 0.2 0.D. units. The secreted bacteria were plated in åachv (50 ul per compartment) and then centrifuged at PBS to the unions 1500 x g for 15 minutes at room temperature. (95%) After was aerated and then ethanol was added for 15 minutes at room temperature. the ethanol had been removed + the compartments were air dried the plates and then thanked and stored at 4 ° C until they were to be used.

Resultaten av ELISA-testen, utförda sasom beskrivits ovan. visade att Paï IVC2 band till de etanol4ixerade Habs-stammarna 2, 3, 4, S, 7, 10. 11 och 12. Detta speci- ficitetsmönster antydde att Paä IVCE band till 1978.The results of the ELISA test, performed as described above. showed that Paï IVC2 bound to the ethanol4ixated Habs strains 2, 3, 4, S, 7, 10. 11 and 12. This speci- ficity patterns suggested that Paä IVCE tied to 1978.

E. aeruginosa-+1age1lerna av typ b (Ansorg, R., 10 15 20 25 30 35 506 421 28 Zbl. Bakt. Hyg.. I. Abt. Orig. A, 242:22 -238: Ansorg, R.. et al.. 1984, J. Clin. Microbiol.. 20:84-BB. vilka bada införlivas med denna beskrivning genom hanvisning därtill). Baserad pa denna specificitetsbestämning med avseende pa monoklonal Paï IVC2 uppbär E. aeruginosa- -referensstammarna Fisher-immunotyp 2. Fisher-immunotyp 6 och Fisher~immunotyp 7 flageller av typ b. Av föregaende försöksdata kan man dra den slutsatsen att Pa? IVC2 binder specifikt till E. aggggiggâg-flagellin av typ b.E. aeruginosa- + 1age1lerna type b (Ansorg, R., 10 15 20 25 30 35 506 421 28 Zbl. Baked. Hyg .. I. Abt. Orig. A, 242: 22 -238: Ansorg, R. et al., 1984, J. Clin. Microbiol .. 20: 84-BB. which both are incorporated into this description by reference thereto). Based on this specification determination with with respect to pa monoclonal PaI IVC2 carries E. aeruginosa- reference strains Fisher immunotype 2. Fisher immunotype 6 and Fisher ~ immunotype 7 type b flagella. Of the foregoing experimental data, one can conclude that Pa? IVC2 binds specifically to E. aggggiggâg flagellin type b.

SHYDDSAKTIVITET IN VIVO AV Päï IVC2 Djurförsök utfördes för att fastställa om den monoklonala antikroppen Paš IVC2 skulle skydda en mus, som hade utsatts för flerfaldiga LD=°-doser av levande modellen var modellen me., 1983,. g.IN VIVO ACTIVITY BY Päï IVC2 Animal experiments were performed to determine whether the monoclonal the antibody Paš IVC2 would protect a mouse, which had exposed to multiple LD = ° doses of live the model was the model me., 1983,. g.

E. aeruginosa-bakterier. Den valda M.S., Trauma, 23:530-534, som införlivas med denna beskrivning med brända möss (Collins. and Roby, genom hänvisning därtill). Grupper av möss utsattes för en allvarlig brännskada enligt författarnas protokoll och utsattes därefter omedelbart för 5-10 LD=°-doser av Fisher-immunotyo 7. Monoklonal antikropp administrerades intraperitonealt som högtiteraskites (0,2 ml intraperito- nealt) före astadkommandet av brännskador och infektion.E. aeruginosa bacteria. The selected M.S., Trauma, 23: 530-534, which is incorporated herein by reference with burnt mice (Collins. and Roby, by reference thereto). Groups of mice were exposed a serious burn according to the authors' protocol and was then immediately exposed to 5-10 LD = ° doses of Fisher Immunothio 7. Monoclonal antibody was administered intraperitoneally as high titerarchitis (0.2 ml intraperitoneally nealt) before causing burns and infection.

Nagon ökning i antalet överlevande konstaterades ej hos Paš IVC2-behandlade djur jämfört med sadana som ej erhöll nagon antikropp.No increase in the number of survivors was found in Paš IVC2-treated animals compared to those not received any antibody.

EXEMPEL 2 Exempel visar metodiken för framställning ax en rattdjurs-hvbridomcellinje. som alstrar en monoklonal rattdjursantikropp mot E. aeruginosa-flagellin av typ b. vilken skyddar ig vivo.EXAMPLE 2 Examples show the methodology for preparation ax one rat animal hybridoma cell line. which produces a monoclonal wheeled antibody to type b E. aeruginosa flagellin. which protects ig vivo.

Vuxna BALB/c-möss av honkön erhöll först injektioner intraperitonealt med livskraftig E. aeruginosa Fisher- (ATCC Nr. 27317) (B x följt -immungtyp g 10* organismer). 10 15 20 25 30 35 '29 tva veckor senare av en injektion med livskraftig E. aeruginosa Fisher-immunotyp 5 (ATCC Nr. 27316) (4 x Under den därpa följande tvaveckors- aeruginosa Fisher- lü* organismer). perioden administrerades livskraftig E. -immunotyp 5 och Fisher-immunotyp 6 tillsammans i tva inër jektioner per vecka. Doseringen av varje organism ökadesn sa att slutdoseringen var tiofaldigt större än den W initiella doseringen. En sista injektion av yttermembran~ preparat av E. aeruginosa Fisher-immunotvp 6 (50 ug protein), som hade framställts enligt den metod som har and H. (1978, 1. gavs fyra dagar efter den angivits av R.E.N. Hancock Nikaido sacteriui., 13e=3e1-390), sista injektionen med livskraftiga bakterier. Tre dagar efter den sista immuniseringen avlägsnades mjälten fran en mus och mjaltcellerna preparerades för hybridisering sasom beskrivits i exempel 1. r överlíggande odlingsvätskor fran hybridomcellerna analy-H serades med avseende pa närvaron av anti-E. aeruginosa- -antikroppar medelst ELISA pa den tionde dagen efter fusion enligt de förfaranden som anges i exempel 1, med undantag av att antigenet för ELISA-plattorna var livs- kraftiga bakterier, som hade immobiliserats i facken till mikrotiterplattorna om 96 fack. Plattorna preparerades som följer.Female adult BALB / c mice first received injections intraperitoneally with viable E. aeruginosa Fisher (ATCC No. 27317) (W x followed -immune type g 10 * organisms). 10 15 20 25 30 35 '29 two weeks later by an injection of viable E. aeruginosa Fisher immunotype 5 (ATCC No. 27316) (4 x During the following two-week aeruginosa Fisher- lü * organisms). the period was administered vigorously E. immunotype 5 and Fisher immunotype 6 together in two indes injections per week. The dosage of each organism was increased said that the final dose was ten times greater than the W initial dosage. A final injection of outer membrane ~ preparation of E. aeruginosa Fisher immunotype 6 (50 ug protein), which had been prepared according to the method used and H. (1978, 1). was given four days after it stated by R.E.N. Hancock Nikaido sacteriui., 13e = 3e1-390), last the injection of viable bacteria. Three days later the last immunization, the spleen was removed from a mouse and the spleen cells were prepared for hybridization as well described in Example 1. r overlying culture fluids from the analyte-H hybridoma cells were observed with respect to the presence of anti-E. aeruginosa- antibodies by ELISA on the tenth day after fusion according to the procedures set forth in Example 1, with except that the antigen for the ELISA plates was viable. strong bacteria, which had been immobilized in the compartments to the 96-compartment microtiter plates. The plates were prepared that follows.

Femtio mikroliter poly-L-lysin (PLL) (1 ug/ml i PBS) (Sigma #P-1524, St. Louis, MO) sattes till varje fack i 96-facks plattorna (Linbro) och inkuberades under 30 minuter vid rumstemperatur. Icke-adsorberat PLL avlägs- nadee och facken tvattades tre ganger med PBS. Bakterie-V kulturer, som hade fatt växa över natten i TSB, tvättades en gang med PBS och atersuspenderades därefter i PBS till ett D.D.asa nm-värde av 0,2. Femtio mikroliter av bakteriesuspensionerna sattes till varje fack i plattan och fick binda vid 37°C under en timme. Icke-bundna bak-I terier avlagsnades och därefter tvättades facken tre ganger med saltlösning- Tween (O,9Z (vikt/volym) NaCl, sne 421 10 15 20 25 30 35 506 421 “m 0,05 volymZ Tween-20).Fifty microliters of poly-L-lysine (PLL) (1 μg / ml in PBS) (Sigma # P-1524, St. Louis, MO) was added to each compartment in 96-compartment plates (Linbro) and incubated for 30 minutes at room temperature. Non-adsorbed PLL removed nadee and the trays were washed three times with PBS. Bacteria-V cultures, which had been allowed to grow overnight in TSB, were washed once with PBS and then resuspended in PBS to one D.D.ase nm value of 0.2. Fifty microliters of the bacterial suspensions were added to each compartment of the plate and allowed to bind at 37 ° C for one hour. Unbound back-I terries were removed and then the trays three were washed times with brine- Tween (0.9Z (w / v) NaCl, sne 421 10 15 20 25 30 35 506 421 “M 0.05 volume Z Tween-20).

Icke-specifik bindning av antikropparna blockerades genom tillsats av 200 ul/fack av blockeringsbuffert (PBS fettfri Louis, MO) innehallande 5% (vikt/volym) (Sigma, St. torrmjölk, 0.01 volymZ Antifoam A och 0,01% (vikt/volym) timerosal) till facken och inkubering under en timme vid rumstemperatur. överskottet blockerings- buffert avlägsnades och facken tvattades tre ganger med saltlösning-Tween sasom beskrivits ovan. överliggande odlingsvätskor (50 ul) replikatutströks i motsvarande fack pa analysplattorna och inkuberades vid rumstemperatur under 30 minuter. De överliggande odlings- vätskorna avlägsnades och facken tvattades fem ganger med saltlösning-Tween.Non-specific binding of the antibodies was blocked by addition of 200 μl / compartment of blocking buffer (PBS) fat free Louis, MO) containing 5% (w / v) (Sigma, St. powdered milk, 0.01 volume Z Antifoam A and 0.01% (weight / volume) thimerosal) to the compartments and incubation below one hour at room temperature. excess blocking buffer was removed and the compartments were washed three times with saline-Tween as described above. supernatants (50 μl) were replicated in corresponding compartments on the assay plates and incubated at room temperature for 30 minutes. The overlying cultivars the liquids were removed and the compartments were washed five times saline-Tween.

En enzymkonjugerad andrastegs-antikropp (pepparrotsperoxi- das-konjugerad get-anti-mus-Igß + IgM) (Tago, Inc., Burlingame, CA) späddes i PBS innehallande 0,1 volymï Tween-20 och 0,22 (vikt/volym) BSA enligt tidigare bestämda titreringar och därefter sattes 50 ul av reagensen till varje fack och inkubering skedde 30 minuter vid rumstemperatur. överskottet reagens avlägs- nades; facken tvättades fem ganger med saltlösning-Tween; och 100 ul o-fenylendiamin-substrat per fack tillsattes och inkubering skedde 30 minuter sasom beskrivits i exempel 1. Reaktionerna avbröts sasom angivits i exempel 1 och därefter skedde avläsning vid A490 nm pa en Bio-Tek EL-310 Automated EIA Flate Reader.An enzyme-conjugated second-stage antibody (horseradish peroxygen) das-conjugated goat anti-mouse IgS + IgM) (Tago, Inc., Burlingame, CA) was diluted in PBS containing 0.1 v / v Tween-20 and 0.22 (w / v) BSA as before determined titrations and then 50 μl was set off reagents to each compartment and incubation was performed minutes at room temperature. the excess reagent is removed nades; the compartments were washed five times with brine-Tween; and 100 μl of o-phenylenediamine substrate per compartment was added and incubation took place for 30 minutes as described in Example 1. The reactions were stopped as indicated in Example 1 and then reading took place at A490 nm on a Bio-Tek EL-310 Automated EIA Flate Reader.

Medelst ovan beskrivna metoder analyserades de överliggan- de odlingsvätskorna fran fusionen med avseende pa som band till E. aeruginosa men ej till närvaron av antikroppar, -u Fisher-immunotyperna 1, 2. o eller 4, kontrollplattorna. som hade framställts med samma PLL- och blockeringsprocess men utan bakterier. overliggande vilken band till nagon av vätskor. som innehöll antikropp, 10 15 20 25 30 35 31 soag421 dessa fyra Fisher-immunotyper, analyserades en andra ganë. under användning av var och en av de sju Fisher-immunotypf Antikropp närvarande i den över- ll PaF4 IVE8 band endast 6 och 7. bakterierna separat. liggande vätskan fran ett fack, till E.Using the methods described above, the overlying the culture fluids from the merger with respect to pa as bound to E. aeruginosa but not to the presence of antibodies, -u Fisher immunotypes 1, 2. o or 4, the control plates. which had been produced with the same PLL and blocking process but without bacteria. overlying which bond to any of liquids. which contained antibody, 10 15 20 25 30 35 31 soag421 these four Fisher immunotypes, a second gan was analyzed. using each of the seven Fisher immunotypes Antibody present in the over- ll PaF4 IVE8 tape only 6 and 7. the bacteria separately. lying liquid from a compartment, to e.

Celler fran facket FaF4 IVEB klonades genom gränsspäd- aeruginosa Fisher-immunotyperna 2, ningsmetoder sasom har beskrivits i exempel 1. Den monof klonala antikroppen och den klonala cellinjen fran detta Å fack identifieras bada med beteckningen PaF4 IVE8 i föl-V jande text. Askitesvatska innehallande hög titer av monof klonal antikropp producerades sasom beskrivits i exempel í“ med undantag av att BALB/c-möss användes istället för CBóF;.Cells from the FaF4 IVEB compartment were cloned by border diluent. aeruginosa Fisher immunotypes 2, methods as described in Example 1. The monof clonal antibody and the clonal cell line from this Å compartments are identified both by the designation PaF4 IVE8 in foal-V jande text. Askitesvatska containing high titer of monof clonal antibody was produced as described in Example I except that BALB / c mice were used instead CBóF ;.

SPECIFICITET HOS E_E4 IVEB En analys, som utfördes för att identifiera det antigen som bands av den monoklonala antikroopen PaF4 IVE8, var indirekt immunofluorescens ba bakterieorganismer. Var ooh en av de sju Fisher-referensimmunotyperna av E. aeruoinåsa plus en icke-flagellär stam av E. aeruginosa (PAIOE, _:: A.T.C.C. 29260, Leifson, 1951, J. Bacteriol., 62: 377-38%) och Esgner-ichia ägg 37°E i TSB. Bakterierna pelleterades genom centrifu-å gering och tvättades därefter tva ganger i PBS. växa över natten vid Varje stam atersuspenderades i PBS till ett 0.D.a.°nm-värde aví P- Fl 32 fy: Bakteriesusoensionerna späddes därefter ytterligare i fön- hallandet 1:150 och orover om 20 ul placerades i de indifg viduella facken pa Carlson-objektglas (Carlson Scientifié Inc., Peotone. IL) och torkades pa objektglaset vid 4Ü'C¿ överliggande odlingsvätskor (25 ul) av PaF4 IVE8 inkube-í rades pa de torkade bakterieproverna pa objektglasen i en fuktkammare vid rumstemperatur under 30 minuter. i Icke-bunden antikropp tvättades bort fran objektglasen genom att dessa doppades i destillerat vatten. fa 10 15 20 25 30 35 506 421 Efter det att objektglasen hade torkats inkuberades (FITC)-konjugerad get-anti-mus- PBS) fluorescein-isotiocyanat -Igß + IgM (25 ul per fack i CA) en spadning av 1:40 i (Tago, Burlingame. pa objektglasen under 30 minuter vid rumstemperatur i en fuktkammare i mörker. Übjektglasen tvattades anyo i destillerat vatten och torkades och tacktes därefter med ett tackglas.SPECIFICITY OF E_E4 IVEB An assay, performed to identify the antigen bound by the monoclonal antibody PaF4 IVE8, var indirect immunofluorescence in bacterial organisms. Be ooh one of the seven Fisher reference immunotypes of E. aeruoin nose plus a non-flagellar strain of E. aeruginosa (PAIOE, _ :: A.T.C.C. 29260, Leifson, 1951, J. Bacteriol., 62: 377-38%) and Esgner-ichia eggs 37 ° E and TSB. The bacteria were pelleted by centrifugation and then washed twice in PBS. grow overnight at Each strain was resuspended in PBS to a 0.D.a. ° nm value avi P- Fl 32 fy: The bacterial suspensions were then further diluted in slope 1: 150 and orover of 20 ul were placed in the indifg video compartments on Carlson slides (Carlson Scientificé Inc., Peotone. IL) and dried on the slide at 4Ü'C¿ supernatants (25 μl) of PaF4 IVE8 incubated row on the dried bacterial samples on the slides in one humidity chamber at room temperature for 30 minutes. in Unbound antibody was washed away from the slides by dipping these in distilled water. fa 10 15 20 25 30 35 506 421 After the slides were dried, they were incubated (FITC) -conjugated goat anti-mouse PBS) fluorescein isothiocyanate -Igß + IgM (25 ul per compartment i CA) a spade of 1:40 i (Tago, Burlingame. On slides for 30 minutes at room temperature in a humid chamber in the dark. The slides were washed anyo in distilled water and was dried and then thanked with a tack glass.

PBS (9:1).PBS (9: 1).

SOM monterades med glycerol i Übjektglasen studerades därefter i ett fluorescensmikroskop.AS mounted with glycerol in the slides was then studied under a fluorescence microscope.

Fluorescensfärgning observerades endast pa Fisher-immuno- typerna 2, 6 och 7 av E. aeruoinosa och konstaterades vara ett sinusformat mönster (linje). som utgick fran endast en ande av organismerna. Detta Etår i överens- stammelse med morfologin hos och lokaliseringen av den enda polara flagellen hos dessa bakterier.Fluorescence staining was observed only on Fisher immunoassays. types 2, 6 and 7 of E. aeruoinosa and were found be a sinusoidal pattern (line). which was based on only one spirit of the organisms. This Year in accordance origin with the morphology of and its location single polar flagella of these bacteria.

Reaktionen mellan PaF4 IVE8 och flageller bekräftades medelst immunoblotting-analys. Yttermembranantigener fran _E. aeruginosa Fisher-immunotyp 6 (se exempel 1) separerades genom elektrofores i en 14% polyakrylamidgel, som innehöll SDS. sasom beskrivits i exempel 1. med undantag av att elektroforesen kördes under fem timmar vid en konstant strömstvrka av SO mëmp. I förväg färgade molekvlviktsmarkörer (lvsozym, MV 14300; beta-laktog1o- MV 18400; bumin. MV 43000; B, MV 97400; MD) alfa-chymotrypsinogen. M 25700: oval- MV 58000: (BR-L, bulin, bovinserumalbumin. fosforvlas och myosin. MV 200000 Gaithersburg, införlivades med samma polyakrvlamidgel.The reaction between PaF4 IVE8 and flagella was confirmed by immunoblotting analysis. Outer membrane antigens from _E. aeruginosa Fisher immunotype 6 (see Example 1) separated by electrophoresis in a 14% polyacrylamide gel, which contained SDS. as described in Example 1. with except that the electrophoresis was run for five hours at a constant current of SO mëmp. Pre-colored molecular weight markers (lysozyme, MV 14300; beta-lactog MV 18400; bumin. MV 43000; B, MV 97400; MD) alpha-chymotrypsinogen. M 25700: oval- MV 58000: (BR-L, bulin, bovine serum albumin. phosphorylated and myosin. MV 200000 Gaithersburg, was incorporated with the same polyacrylamide gel.

Antigener överfördes fran polyakrylamidgelen till ett nitrocellulosamembran, (NCM). (0,45 um. Schleicher & Schuell. Keen. NH) 1 (1979), en Tris-glvcin-metanol-buffert Natl. Acad. U.5.A., SDB, Inc..Antigens were transferred from the polyacrylamide gel to a nitrocellulose membrane, (NCM). (0.45 um. Schleicher & Schuell. Keen. NH) 1 (1979), and Tris-glycine-methanol buffer Natl. Acad. U.5.A., SDB, Inc ..

(Towbin et al. Proc. Sci.. 7ó:4350-4354). innehallande 0,052 (vikt/volym) över natten vid 4°C vid en konstant strómstvrka av 200 mA.(Towbin et al. Proc. Sci. 7ó: 4350-4354). containing 0.052 (w / v) above overnight at 4 ° C at a constant current of 200 mA.

Efter ëverföringen inkuberades NCM i 0.05 volvmï Tween-20 i PBS E.. et 1982, Q.After the transfer, NCM was incubated in 0.05 volm of Tween-20 in PBS E .. et 1982, Q.

(PBS-Tweeny (Batteiger, 10 15 20 25 30 35 506 421 Immunol. Meth., 55:297-307) under en timme vid rums- temperatur. För detta steg och samtliga efterföljande steg placerades den bricka som innehöll NCM pa en skakplatt- form för att ombesörja fördelning av lösningen över helaww NCM.(PBS-Tweeny (Batteiger, 10 15 20 25 30 35 506 421 Immunol. Meth., 55: 297-307) for one hour at room temperature. For this step and all subsequent steps the tray containing NCM was placed on a shaker plate. form to take care of the distribution of the solution over the wholeww NCM.

Efter en timme avhälldes PBS-Tween-lösningen och PaF4 IVEB-askites (spädd 1:1000 i PBS-Tween) inkuberades med NCM under en timme vid rumstemperatur. tillsattes och NCM tvättades därefter fem ganger, fem minuter varje gang, med PBS-Tween för att avlägsna icke-bunden antikropp. Alkaliskt fosfatas-konjugerad get-anti-mus IgG+lgM specifikationer och inkuberades med NCM under en timme (Tago, Inc.) späddes enligt tillverkarens vid rumstemperatur. NCM tvättades fem ganger sasom »beskrivits ovan och ett substrat, som innehall bromklor-g indolylfosfat och nitroblatt-tetrazolium (Sigma.After one hour, the PBS-Tween solution and PaF4 were poured off IVEB ascites (diluted 1: 1000 in PBS-Tween) incubated with NCM for one hour at room temperature. was added and NCM was then washed five times, five minutes each gang, with PBS-Tween to remove unbound antibody. Alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG + 1gM specifications and incubated with NCM for one hour (Tago, Inc.) was diluted according to the manufacturer at room temperature. NCM was washed five times as usual »Described above and a substrate containing bromochloro-g indolyl phosphate and nitroblatt tetrazolium (Sigma.

St.Louis, MD) och hade framställts sasom beskrivits av Leary et al. (1983, Natl. Acad. U.S.A., eo-4045-4049), Froc. Sci., tillsattes och inkuberades 10-20 minuter sub- vid rumstemperatur. Reaktionen avbröts genom att stratet borttvättades med destillerat vatten. visade att PaF4 IVEB band specifikt till ett enda antigen med en molekylvikt av Resultaten av detta försök 53000 dalton i yttermembranpreparatet. Resultaten av den_ indirekta immunofluorescens-analysen och immunoblotting visar att PaF4 IVES binder till flagellerna hos E. aerugi- HDSå.St. Louis, MD) and had been prepared as described by Leary et al. (1983, Natl. Acad. U.S.A., eo-4045-4049), Froc. Sci., was added and incubated for 10-20 minutes sub- at room temperature. The reaction was stopped by the filtrate was washed with distilled water. showed that PaF4 IVEB band specifically to a single antigen with a molecular weight of The results of this experiment 53000 daltons in the outer membrane preparation. The results of the_ indirect immunofluorescence analysis and immunoblotting shows that PaF4 IVES binds to the flagella of E. aerugi- HDSo.

Den flagelltyp som PaF4 IVEB kände igen bestämdes medelst ELISA. Habs-stammarna 1-12 (A.T.C.C. #33348-Ešïíë) bands var och en till facken i mikrotiterplattor om 55 fack (Linbro) med PLL och ELISA utfördes sasom beskrivits tidigare i detta exempel. Källan till antikropcen PaF4 g\ IVES var överliggande odlingsvätska. Positiva reaktioner: som innehöll Habs-stammarna E, 3. 4, vilket visar att PaF4 IVEE binder konstaterades i fack, 5, 7, io, 11 och 1:, 10 15 20 25 30 35 5oeg421 55-4 till flageller av typ b. Skyddsdata bestämda LQ vivo aterges nedan i exempel 4.The type of flag that PaF4 IVEB recognized was determined by ELISA. Habs strains 1-12 (A.T.C.C. # 33348-Ešïíë) bands each to the compartments in microtiter plates of 55 compartments (Linbro) with PLL and ELISA was performed as described earlier in this example. The source of the antibody PaF4 g \ IVES was the supernatant. Positive reactions: which contained the Habs tribes E, 3. 4, indicating that PaF4 IVEE binds found in trades, 5, 7, 10, 11 and 1 :, 10 15 20 25 30 35 5oeg421 55-4 to type b flagella. Protection data determined LQ vivo is shown below in Example 4.

EXEMPEL 3 Exempel 3 visar metodiken för framställning av en ratt- djurs-hybridomcellinje, som producerar den monoklonala antikropp vilken är reaktiv med anti-E. aeruginosa-fla- geller av typ a och skyddar Lg vivo.EXAMPLE 3 Example 3 shows the methodology for preparing a steering wheel. animal hybridoma cell line, which produces the monoclonal antibody which is reactive with anti-E. aeruginosa-fla- gels of type a and protects Lg vivo.

Lymfoidcellkällan för fusionen var en mjalte fran en immuniserad BALB/c-mus, som hade erhallit injektioner fyra ganger intraperitonealt under en sexveckors-period av renade flageller typ a fran Habe- (â.T.C.C. (10-20 pg protein) 333353 och 33355). -stammarna 6 och B Flagellerna renades enligt den metod som har angivits av T.C. (1982, 35:28!-288, införlivas med denna beskrivning genom hänvisning Montie et al. Infect. Immun., som därtill) med undantag av att den slutliga centrifugering- en av flagellerna utfördes vid 100000 x g under en timme och ej vid 40000 x g under tre timmar. En andra modifika- tion som gjordes vid vissa förfaranden var att flagellerna fran bakterierna underkastades skjuvning under 30 sekunder i en blandare istallet för under tre 1985, Infect. lmmun.. 49:770- minuter. (Allison et al.. 774).The lymphoid cell source for the fusion was a spleen from one immunized BALB / c mouse that had received injections four times intraperitoneally over a six-week period of purified flagella type A from Habe- (â.T.C.C. (10-20 pg protein) 333353 and 33355). strains 6 and B The flagella were purified according to the method indicated by T.C. (1982, 35: 28-228, incorporated into this description by reference Montie et al. Infect. Immun., Som in addition) except that the final spin one of the flagella was performed at 100,000 x g for one hour and not at 40,000 x g for three hours. A second modification tion made in certain proceedings was that the flagella from the bacteria were subjected to shear for 30 seconds in a mixer instead of under three 1985, Infect. lmmun .. 49: 770- minutes. (Allison et al. 774).

Proteinkoncentrationerna hos varje preparat bestämdes med (Bio-Rad. Richmond. CA) (LFS) Bio-Rad Proteinanalys och närvaron av kontaminerande lipopolysackarid fast- stalldes genom mätning av HDD-halten (Harkhanis, Y.D.. et 85:595-601).The protein concentrations of each preparation were determined by (Bio-Rad. Richmond. CA) (LFS) Bio-Rad Protein Analysis and the presence of contaminating lipopolysaccharide was measured by measuring the HDD content (Harkhanis, Y.D .. et 85: 595-601).

Anal. Biochem., Molekvívikterna al.. 1978, hos flagellproteinerna bestamdes genom att man jämförde en SDS-polyakrylamidgel med migreringen Molekyl- deras migrering i hos proteinstandardmarkörer (BRL) (se exempel I). vikten för Habs e-flagellin var 51700 dalton och för Habs E-flagellin 47200 dalton. Dessa värden stammer överens med de som har erhallits av J.S. Alllison et al. (1985. 10 15 20 25 30 35 49:770-774, som införlivas med denna be~ skrivning genom hänvisning därtill).Anal. Biochem., Molecular Weights al .. 1978, of the flagellar proteins were determined by comparing an SDS-polyacrylamide gel with the migration Molecular- their migration in in protein standard markers (BRLs) (see Example I). the weight for Habs e-flagellin was 51700 daltons and for Habs E-flagellin 47200 dalton. These values agree with those obtained by J.S. Alllison et al. (1985. 10 15 20 25 30 35 49: 770-774, which is incorporated herein by reference writing by reference thereto).

Infect.Immun., Fusion av splenocyter fran flagellin-immuniserade möss P och NS-1-myelomceller utfördes tre dagar efter den sistaï immuniseringen sasom beskrivits i exemplen 1 och 2. När hybridomcellerna växte till en konfluens av cirka 40% (dag 7) replikatutströks överliggande odlingsvätskor i motsvarande fack hos tre olika antigenplattor. PLL-bunden T E. aeruginosa Fisher-immunotyp 1 (se exempel 2 för prepaf rering) och formalinfixerad Habs 6 och Habs 9.Infect.Immun., Fusion of splenocytes from flagellin-immunized mice P and NS-1 myeloma cells were performed three days after the last one the immunization as described in Examples 1 and 2. When the hybridoma cells grew to a confluence of about 40% (day 7) replicated overlying culture fluids in corresponding compartments of three different antigen plates. PLL-bound T E. aeruginosa Fisher immunotype 1 (see Example 2 for prepaf formalin-fixed Habs 6 and Habs 9.

Bakterierna för de formalinfixerade antigenplattorna ficﬁu växa. na antigenplattor. Utspädda bakterier vid A,.°) sattes till de individuella facken (50 ul per fack) hos Linbro mikrotiterplattor med 96 fack och q plattorna centrifugerades därefter vid 1200 x g under 20 minuter vid rumstemperatur. De överliggande vätskorna av? _lägsnades fran facken och 75 pl av 0,2 vo1ymZ formalin i; PÉS sattes till varje fack och inkuberades under 15 minuter vid rumstemperatur. Efter det att formalinet hade avlägsnats fran facken lufttorkades plattorna och förvara- des vid 4°C framtill användning. Formalin ändrade icke antigeniciteten hos flagellerna, sasom framgar av förmagan hos anti-flagell-antisera att agglutinera formalin-behandlade organismer (Lanyi. B.. 1970, äcta Hicrobiol. Acad. Sci., Hung.. 17:35-48). Stammen E. aeru¶, giggäa Fisher-:mmunotyp 1 införlivades som kontroll efter sasom framgar av V Microbiol.. 1985, Soc. Wash., D.C., p. det fack som betecknade Fàé IIG5 som denna stam var icke-flagellär, betfärgs-infärgning (Manual of Clin.The bacteria for the formalin-fixed antigen plates fic ﬁ u grow. and antigen plates. Diluted bacteria at A, °) was added to the individual compartments (50 μl per compartments) at Linbro microtiter plates with 96 compartments and q the plates were then centrifuged at 1200 x g for 20 h minutes at room temperature. The supernatants of? was removed from the compartments and 75 μl of 0.2 v / v 2 formalin in; PÉS was added to each compartment and incubated for 15 hours minutes at room temperature. After the formalin had removed from the compartments, the plates were air-dried and stored at 4 ° C prior to use. Formalin did not change the antigenicity of the flagella, as evidenced by ability of anti-flagellar antisera to agglutinate formalin-treated organisms (Lanyi. B .. 1970, äcta Hicrobiol. Acad. Sci., Hung .. 17: 35-48). Strains E. aeru¶, giggäa Fisher-: mmunotype 1 was incorporated as a control after as stated by V Microbiol .. 1985, Soc. Wash., D.C., p. the compartment designated Fàé IIG5 as this strain was non-flagellar, Manual of Clin.

Lennette. red. ñmer. Microbiol.. 1099). Hvbridceller i producerade en antikropp, som band till Habs 6 och Habs Å (bada stammar uppbarande flageller av typ a) men ej till, Fisher-immunotyp 1.Lennette. red. ñmer. Microbiol .. 1099). Hvbrid cells in produced an antibody, which bound to Habs 6 and Habs Å (both strains bearing flagella of type a) but not to, Fisher immunotype 1.

Celler fran fack_FAó IIG5 underkastades subodling och 506 421 tvättades och späddes sasom beskrivits för PLL-bundw (0,2 cam-enheter 10 15 20 25 35 36 klonades sasom beskrivits i föregaende exempel. Den mono- klonala antikroppen och den klonala cellinjen fran detta fack identifieras bada med beteckningen Fâó IIE5 i följan- de text. Askites producerades i BALB/c-möss sasom beskri- vits i exempel 2.Cells from fack_FAó IIG5 were subjected to subculture and 506 421 was washed and diluted as described for PLL bundw (0.2 cam units 10 15 20 25 35 36 was cloned as described in the previous example. The mono- clonal antibody and the clonal cell line thereof compartments are identified both by the designation Fâó IIE5 in the following the text. Askites were produced in BALB / c mice as described in joke in Example 2.

Specificitet hos FA6 IIG5 Specificiteten hos antikroppen Fﬁó IIE5 bestämdes medelst indirekt immunofluorescens och immunoblotting. Indirekt immunofluorescens utfördes i huvudsak sasom beskrivits i exempel 2 med följande modifikationer.Specificity of FA6 IIG5 The specificity of the antibody F 2 IIE5 was determined by indirect immunofluorescence and immunoblotting. Indirectly immunofluorescence was performed essentially as described in Example 2 with the following modifications.

Bakteriekulturer. som hade fatt växa över natten pa tryptikas-soja-agar vid 30°C, avlagsnades fran plattorna _med bomullstoppar och atersuspenderades i PBS till ett 9660-värde av 0,2 0.D.-enheter. Formalin (O,37 volvmï slutkoncentration i PBS) sattes till suspensionen under virvelbildning. Efter inkubering vid rumstemperatur under 15 minuter späddes bakterierna i förhallandet 1:12 med PBS och EH ul av denna suspension placerades i de indivi- duella facken pa Carlson-objektglas. Efter torkning prepa- rerades objektglasen för mikroskopering sasom beskrivits i exempel 2. Källan till antikropp var överliggande odlingsvatska fran Fêé IIG5-cellinjen.Bacterial cultures. which had been allowed to grow overnight on trypticase-soy agar at 30 ° C, was removed from the plates _with cotton tops and resuspended in PBS to one 9660 value of 0.2 0.D. units. Formalin (0.37 volvmï final concentration in PBS) was added to the suspension below vortex formation. After incubation at room temperature below For 15 minutes, the bacteria were diluted in a ratio of 1:12 PBS and EH ul of this suspension were placed in the individual dual compartments on Carlson slides. After drying, prepare the slides were subjected to microscopy as described in Example 2. The source of antibody was overlying culture fluid from the Fêé IIG5 cell line.

Fluorescerande färgning av Fâó IIG5-antikroppen konsta- terades endast med E. aeruginosa-stammar uppbarande flageller av typ a men icke med nagon av de som uppbar typ b. Det observerade fluorescensmönstret var ett sinus- format linjemönster. som visade att Fâb IIG5 band till flagellerna. Fluorescenssignalen förstärktes genom be- handling av bakterierna med formalin men behandlingen krävdes icke för att visualisera den flagellara fargningen med antikropoen. exempel 2.Fluorescent staining of the Fâó IIG5 antibody only with E. aeruginosa strains bearing flagella of type a but not with any of those who received type b. The observed fluorescence pattern was a sinusoidal format line pattern. which showed that Fâb IIG5 tied to the flagella. The fluorescence signal was amplified by action of the bacteria with formalin but the treatment was not required to visualize the flagellar the staining with the antibody. Example 2.

Immunoblotting utfördes s som beskrivits i a hallan till antigener av flagelltyp a var de renade 10 15 go 25 30 35 506 421 37 flagellara preparaten (se detta exempel). äntigenen separerades i 10% polyakrylamidgeler innehallande SDB (Laemmli. U.K., 1970, Nature 227:óBO-685) och överfördes till ett NCM. Freparat av Fëó 1155, överliggande odlingsvätska eller askites i spaddningen (London), antingen l:1000, fick reagera med NCM och reaktionen pavisades medi ett lämpligt enzvmkonjugerat reagens och enzymsubstrat 1 sasom beskrivits i exempel 2. Immunoblotting-analysen visade att Fab 1165 bana spe=1+1kt till fiageiiin mv 51700 av Habs 6 och flagellin MV 47200 av Habs B.Immunoblotting was performed as described in a hall to flagella type a antigens where they were purified 10 15 go 25 30 35 506 421 37 flagellar preparations (see this example). äntigenen separated in 10% polyacrylamide gels containing SDB (Laemmli. U.K., 1970, Nature 227: óBO-685) and transferred to an NCM. Preparation of Fëó 1155, supernatant or ascites in the spade (London), either 1: 1000, was allowed to react with NCM and the reaction was shown medi a suitable enzyme-conjugated reagent and enzyme substrate 1 as described in Example 2. The immunoblotting assay showed that Fab 1165 path spe = 1 + 1kt to fiageiiin etc. 51700 av Habs 6 and flagellin MV 47200 by Habs B.

Bekräftelse pa att Fâb IIG5 reagerade endast med flagell- -typ a och ej typ b erhölls med ELISA, dar Habs-stammar 1-12 bands individuellt med PLL till facken i Linbro mikrotiterplattor med 96 fack. Antikroppen band endast till Habs-stammarna 1, 6, 8 och 9, som är de enda av de tolv stammarna som uppbär flageller av typ a, (se Qnsorg, R., et al.. 1984, J. Clin. Microbiol., 20:84-88, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill). Skyddsstudier gg vivg askadliggörs i exempel 4; nedan.Confirmation that Fâb IIG5 reacted only with flagellum type a and not type b were obtained by ELISA, where Habs strains 1-12 were tied individually with PLL to the unions in Linbro 96-compartment microtiter plates. The antibody bound only to Habs strains 1, 6, 8 and 9, which are the only ones of the twelve strains bearing type a flagella, (see Qnsorg, R., et al., 1984, J. Clin. Microbiol., 20: 84-88, which is incorporated herein by reference thereto). Precautionary studies gg vivg ashless are exemplified in example 4; below.

EXEMPEL 4 Exempel 4 askadliggör skydd av möss, som passivt har immuniserats med antikroppar FaF4 IVEB och Fâó IIGS mot infektion av E. aeruginosa i modellen med brand mus.EXAMPLE 4 Example 4 disables the protection of mice that are passive immunized with antibodies FaF4 IVEB and Fâó IIGS against infection of E. aeruginosa in the model with fire mouse.

De anti-flagellara'monoklonala antikropparna testades i modellen med brand mus enligt den metod som nar beskri- Robv (1983, J. vits av M.S. Collins and R.E. Trauma, of-=1o-5:4, .'.-- n uæ som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill). För ekvddsstudier renades alla anti+§ kroppar medelst protein A-Sepharose-kromatografi (Ey, P.L.. et al., 1978. Immunochemistry, 15:42?-43é. som in- förlivas med denna beskrivning genom hanvisning dartill). och dialvserades i PBS-buffert. Den stam som upobar lageller av tvp a och som användes vid djurfärsöken var, 10 15 20 25 35 506 421 ie E. aeru inosa PAEZO (fran Dr.The anti-flagellar monoclonal antibodies were tested in model with fire mouse according to the method described Robv (1983, J. joke by M.S. Collins and R.E. Trauma, or- = 1o-5: 4, .'.-- n uæ incorporated into this specification by reference thereto). For equivocal studies, all anti + § were purified bodies by protein A-Sepharose chromatography (Ey, P.L. et al., 1978. Immunochemistry, 15: 42? -43é. as in- be embedded with this description by male reference thereto). and dialyzed in PBS buffer. The tribe that upobar lagels of tvp a and used in the animal mince search were, 10 15 20 25 35 506 421 ie E. aeru inosa PAEZO (from Dr.

MQ) E. agruginosa Fisher-immunotyp 2 (A.T.C.C.MQ) E. agruginosa Fisher immunotype 2 (A.T.C.C.

James Pennington, FIF Boston, och stammen av flagell-typ b var referensstammen 27313).James Pennington, FIF Boston, and the flagellar type b strain was the reference strain 27313).

Fyrtio mikrogram av renad monoklonal antikrooo tillfördes varje mus intravenöst 1-I timmar ¥öre astadkommandet av brännskada och infektion. skadan hade astadkommits erhöll djuren 0,5 ml innehallande de infekterande bakterierna, sarskorpan.Forty micrograms of purified monoclonal antibody was added each mouse intravenously 1-I hours ¥ öre the achievement of burn and infection. the damage had been done, the animals received 0.5 ml containing the infecting bacteria, sarskorpan.

Resultaten III varje organism. av Tabellerna I och TABEL I. -flagelltyo a H I l -b Behandling 1 Qﬁt i -f 1 agël 1 100 1 ÛÜ IC-'Ü a, Fab 1165 100 Anti-flagell 100 20 b, PaF4 Ivee Icke-soecifik anti-LP5-mono- klonal anti- kropp 100 PBS. inga bakte- rier Lnfektionsdosen var cirka Procentuell vid modellen med bränd mus* naii Pas, under 10 LD=o-doser för djurförsöken visas i överlevnad pa dag* 100 90 10 80 50 w w 90 BO 10 10 10 Omedelbart efter det att bränn- Skyddsstudie av en monoklonal antikrooo av anti- BO 10 10 30 01 *Möss infekterades under med cirka IÜ LDQQ' 10 15 20 25 30 35 so6 421 -doser av E. aeruginnsa PA220. 2Procentsi¥fran baserar sig pa överlevnaden hes möss i grupper om tio djur, med undantag av kontrollgruppen med endast Pas. 0 efter astadkommande av brannskada och infektion. som bestod av fem möss. Dagarna är räknade Tabell II. Skvddsstudie av en mondklonal antikropp av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus* Behandling 1 Procentuell överlevnad pa dag2MÅm h) fl -b f.The results III each organism. of Tables I and TABLE I. -flagelltyo a hrs I l -b Treatment 1 Q ﬁ t i -f 1 agël 1 100 1 ÛÜ IC-'Ü a, Fab 1165 100 Anti-flagell 100 20 b, PaF4 Ivee Non-specific anti-LP5 mono- clonal anti- body 100 PBS. no baking rier The infection dose was approx Percentage with the model with burned mouse * naii Pas, during 10 LD = o-doses for the animal experiments are shown in survival by day * 100 90 10 80 50 w w 90 BO 10 10 10 Immediately after burning Protection study of a monoclonal antibody of anti- STAY 10 10 30 01 * Mice were infected during with approx IÜ LDQQ ' 10 15 20 25 30 35 so6 421 doses of E. aeruginnsa PA220. 2Percentage is based on the survival of mice in groups of ten animals, with the exception of the control group with only Pas. 0 after causing burns and infection. which consisted of five mice. The days are numbered Table II. Skvdds study of a mouth clonal antibody of anti-flagellar type b in the model with burnt mouse * Treatment 1 Percentage survival per day2MÅm hrs) fl -b f.

O* \| N 6 Anti-flagell b, PaF4 IVES 100 100 90 Q0 90 90 90 90 Anti-flagell a, Fab 1155 :oo :o 10 10 10 10 lo lo aåxø Icke-specifik anti-LPS-mono- klonal anti- kropp 100 20 20 20 20 20 20 20 V20 PS5, inga bakterier 100 100 100 100 100 100 100 100 _100 *Möss in¥ekterades under sarskornan med cirka 10 LD=°- 'ä -doser av E.aeruginosa Fisher-immunetyp e. 2Prdcentsiffran baserar sig pa överlevnaden hos möss i 10 15 20 25 30 35 506 421 grupper om tio djur med undantag av kontrollgruppen med endast PBS som bestod av fem möss. Dagarna är räknade efter astadkommande av brännskada och infektion.O* \ | N 6 Anti-flagell b, PaF4 IVES 100 100 90 Q0 90 90 90 90 Anti-flagell a, Fab 1155: oo: o 10 10 10 10 lo lo aåxø Non-specific anti-LPS mono- clonal anti- body 100 20 20 20 20 20 20 20 20 V20 PS5, inga bacteria 100 100 100 100 100 100 100 100 100 _100 * Mice were incubated under the scar with about 10 LD = ° - 'ä -doses of E. aeruginosa Fisher immunotype e. The percentage is based on the survival of mice in 10 15 20 25 30 35 506 421 groups of ten animals with the exception of the control group with only PBS which consisted of five mice. The days are numbered after causing burns and infection.

Mycket signifikant överlevnad konstaterades hos möss. som hade behandlats med anti-a-antikropp eller anti-b-anti- kropp och därefter infekterats med motsvarande antigen. I motsats härtill dog 80-90% av de obehandlade men infekterade mössen eller djuren. som hade behandlats med en icke-matchande antiflagellär monoklonal antikropp eller icke-specifik anti-LPS-antikropp. Üförmagan hos antikroppen av anti-flagelltyp a att skydda moss fran en letal infektion av E. aeruginosa Fisher-immunotyp 2, som uppbär flageller av typ b, och oförmagan hos antikroppen av anti-flagelltyp b att skydda möss fran en letal infek- tion av E. aeruginosa PAEEO. som uppbär tvp a, bekräftade Lg viïg den specificitet hos antikropparna som hade kon- staterats LQ vitro. överlevnad hos brända möss. som ej hade infekterats. visade att brännskadan i sig icke var letal.Very significant survival was found in mice. as had been treated with anti-a-antibody or anti-b-anti- body and subsequently infected with the corresponding antigen. IN in contrast, 80-90% of the untreated men died infected mice or animals. which had been treated with a non-matching anti-flagellar monoclonal antibody or non-specific anti-LPS antibody. Üförmagan hos the antibody of anti-flagellar type a to protect moss from one lethal infection of E. aeruginosa Fisher immunotype 2, which carries type b flagella, and indigestion of the antibody of anti-flagella type b to protect mice from a lethal infection tion of E. aeruginosa PAEEO. which bears tvp a, confirmed Due to the specificity of the antibodies that had stated LQ vitro. survival in burnt mice. as not had been infected. showed that the burn itself was not letal.

EXEMPEL 5 Exempel 5 askadliggör den extensiva korsreaktiviteten hos FaF4 IVE8 och FQ6 IIG5 med kliniska E. aeruginosa-isolat, vilket visar den kliniska användbarheten av dessa anti- kroppar vid immunoterapi av E. aeruginosa-infektioner. kliniska isolat erhölls fran sjukhus och kliniker.EXAMPLE 5 Example 5 ash damages the extensive cross-reactivity of FaF4 IVE8 and FQ6 IIG5 with clinical E. aeruginosa isolates, demonstrating the clinical utility of these bodies in immunotherapy of E. aeruginosa infections. clinical isolates were obtained from hospitals and clinics.

Isolaten härrörde fran en mangfald isoleringsställen o inklusive blod, sar. rsspirati nsorganen. urin och öron.The isolates originated from a variety of isolation sites O including blood, sar. rsspirati nsorganen. urine and ears.

Totalt undersöktes 157 isolat.A total of 157 isolates were examined.

PaF4 IVE8 band specifikt till 34 kliniska isolat (222), medan antikroopen av flagelltvp a, Fäo IIG5, nd till ba 102 kliniska isolat (65%) för totalt 136 av 15* isolat (87%). âv de 21 tammar som ej kändes igen av endera III 10 15 20 25 30 35 so@ 421 '41 antikroppen var 19 icke-flagellära, sasom visades genomšf infargning med betfärg. Därför band bada antikropparna t kombination till 136 av 138 (98%) av flagellära kliniska isolat. vilket bekräftar tidigare rapporter (se, R.PaF4 IVE8 bound specifically to 34 clinical isolates (222), while the antibody of flagellvp a, Fäo IIG5, nd to ba 102 clinical isolates (65%) for a total of 136 of 15 * isolates (87%). of the 21 tams that were not recognized by either III 10 15 20 25 30 35 so @ 421 '41 the antibody was 19 non-flagellar, as shown by genomšf dyeing with beet paint. Therefore, both antibodies bound t combination to 136 of 138 (98%) of flagellar clinical isolate. which confirms previous reports (see, R.

Ansorg, 1978, Zbl. Baht. Hyg., I Abt. Drig. A, 242:228-; 238, som införlivas med denna beskrivning genom hänvis-,7¶ ning därtill). @»l EXEMPEL 6 Exempel 6 askadliggör metoder för framställning av mono¥“ klonala humanantikroppar, som binder till E. aeruginosaw -flageller av typ b.Ansorg, 1978, Zbl. Baht. Hyg., I Abt. Drig. A, 242: 228-; 238, which is incorporated herein by reference. addition). @ »L EXAMPLE 6 Example 6 neutralizes methods for producing mono clonal human antibodies, which bind to E. aeruginosaw flags of type b.

Ett perifert blodprov fran en individ, som hade immuniserats med ett högmolekylärt polysackaridpreparatl: (Pier et al., 1984 Infect. Immun., 45:309), tjänade somia källa till B-celler. Enkärniga celler separerades fràn ä blodet medelst standardcentrifugeringsteknik pa Ficoll-Faque: scanu. J. ciin. Lab. Invgšg., 21-77> och 4'l ' tvättades tva gänger i kalcium/magnesium-fri fosfatbuffrèd saltlösning (PBS).A peripheral blood sample from an individual who had immunized with a high molecular weight polysaccharide preparation: (Pier et al., 1984 Infect. Immun., 45: 309), served somia source of B cells. Mononuclear cells were separated from ä the blood by standard spin technique on Ficoll-Faque: scanu. J. ciin. Lab. Invgšg., 21-77> and 4'l ' was washed twice in calcium / magnesium-free phosphate buffer saline (PBS).

De enkärninga cellerna befriades fran T-celler under användning av en modifierad E-rosetterings-teknik. I Å korthet innebar detta att cellerna först ätersuspenderadšs till en koncentration av 1 107 cellerrml i PBS inne- ä hallande 20% kalvfosterserum susoension infördes därefter i ett 17 x 100 mm rund- á bottnat bolystvrenrör, till vilket sattes 1 x 10' 2-aminon -isotiouronium-bromid KAET)-behandlade röda blodkroooar 7 fran far fran en 10%-ig (volvmï) lösning i Iscoves modi-1 fierade Dulbecco-medium (Iscoves medium) (Madsen och Johnson <1?79) Q¿ Immun. Methods, 27:61). Suspensionen blandades mvcket försiktigt under S-10 minuter vid 4°C och de E-rosetterade cellerna avlägsnades därefter genom centrifugering oa Ficoll-Paque under B minuter vid 2500 x g vid 4°C. E-rosett-negativa enkärniga perifer- 10 15 20 25 30 35 506 421 042 blodceller (E*PBMC), som samlades vid gransytan. tillvara- togs och tvattades en gang i Iscoves medium och ater- suspenderades i detsamma innehallande 15 vo1ym% FCS.The mononuclear cells were freed from T cells below use of a modified E-rosetting technique. In Å In short, this meant that the cells were first resuspended to a concentration of 1,107 cell ml in PBS sloping 20% fetal calf serum susoension was then introduced in a 17 x 100 mm round bottomed bolystren tube, to which was added 1 x 10 '2-aminone -isothiouronium bromide KAET) -treated red blood cells 7 from father from a 10% (volvmï) solution in Iscove's modi-1 celebrated Dulbecco medium (Iscoves medium) (Madsen and Johnson <1? 79) Q¿ Immun. Methods, 27:61). The suspension mixed mvcket gently for S-10 minutes at 4 ° C and the E-rosetted cells were then removed by centrifugation oa Ficoll-Paque for B minutes at 2500 x g at 4 ° C. E-rosette-negative mononuclear peripheral 10 15 20 25 30 35 506 421 042 blood cells (E * PBMC), which collected at the spruce surface. manufacturing was taken and washed once in Iscove's medium and re- was suspended in the same containing 15 v / v% FCS.

L-glutamin (2 mmol/1, penicillin (100 IE/ml), streptomvcin (100 ug/ml), hvpoxantin (1 l0_“N), aminopterin (4 x io-VM) och tymidin (1,6 x 10“°M). Detta medium betecknas i det följande som HAT-medium.L-glutamine (2 mmol / l, penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100 μg / ml), hvpoxanthin (10 10 N), aminopterin (4 x 10-VM) and thymidine (1.6 x 10 6 ° M). This medium is denoted in it following as HAT medium.

Cellstvrd transformation av E'PBMC astadkoms genom samodling av dessa celler med en transformerande cellinje.Cell-mediated transformation of E'PBMC was accomplished by co-culture of these cells with a transforming cell line.

Den transformerande cellinjen var en Epstein-Barr kärn- antigen (EBNA)-oositiv lymfoblastoidhumancellinje, som härrörde fran etylmetansulfonat (EMS)-mutagenes av den lymfoblastoida cellinjen GM 1500, följt av selektion i närvaro av 30 ug/ml 6-tioguanin för att förläna cellerna brist pa hypoxantin-guanin-fosforibosyl-transferas (HGPRT) och saledes göra cellerna HAT-känsliga. Denna cellinje betecknas som 1A2-cellinjen och har deponerats vid the American Type Culture Collection (A.T.C.C.) den D? mars 1982 under A.T.C.C.-beteckningen Nr. CRL 8119. 1A2-celler i logaritmisk tillväxtfas suspenderades i HAT- medium och kombinerades därefter med E'PBMC i ett för- hallande av femton IAS-celler per PBMC. Cellblandningen utströks pa trettio rundbottnade mikrotiterplattor med 96 fack (Costar 3799) i en koncentration av 32000 celler/fack och i en volym av 200 ul per fack och inkuberades vid 37°C i fuktig atmosfär innehallande 6% C02. kulturer matades oa dagarna 5 och 8 efter utstrykning genom ersättning av halva den överliggande vätskan med färskt HAT-medium. Sexton dagar efter utstrykning konstaterades att 100% av facken innehöll prolifererande celler och att i de flesta av facken cellerna hade tillräcklig densitet för avlägsnande och analvs av de överliggande vatskorna med avseende pa anti-E. aeruginosa-anti- -kroppar.The transforming cell line was an Epstein-Barr nuclear antigen (EBNA) -oositive lymphoblastoid human cell line, as derived from ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenesis thereof lymphoblastoid cell line GM 1500, followed by selection in presence of 30 μg / ml 6-thioguanine to confer the cells deficiency of hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transferase (HGPRT) and thus make the cells HAT-sensitive. This cell line is referred to as the 1A2 cell line and has been deposited at the American Type Culture Collection (A.T.C.C.) on D? March 1982 under the designation A.T.C.C. CRL 8119. Logarithmic growth phase 1A2 cells were suspended in HAT medium and then combined with E'PBMC in a retrieval of fifteen IAS cells per PBMC. The cell mixture was coated on thirty round-bottomed microtiter plates with 96 compartment (Costar 3799) at a concentration of 32000 cells / compartment and in a volume of 200 μl per compartment and incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 6% CO 2. cultures were fed oa days 5 and 8 after smearing through replacement of half the supernatant with fresh HAT medium. Sixteen days after smearing were noted that 100% of the compartments contained proliferating cells and that in most of the compartments the cells had sufficient density for removal and analysis of the overlying ones the water shoes with respect to anti-E. aeruginosa anti- -bodies.

De överliggande vätskorna underkastades screening med avseende pa närvaron av anti-E. aeruginosa-antikroppar 10 15 20 25 35 4: under användning av den i exempel 2 beskrivna ELISA-tek-Å niken men med följande modifikationer. En pool av de sju Fisher-immunotyp-referensstammarna (A.T.C.C. Nr. 27312- 2731e> bands :iii fiatboctnade' mikrotiterplattor med 96 fack (Immulon II, Dvnatech), som hade förbehandlats med poly-L-lysin, inkuberades och _ tvättades sasom beskrivits i exempel 2. Efter blockering! av icke-specifika bindningsställen och tvättning av i plattorna sattes 50 pl PBS innehallande 0,1 volymï Tween-år -20 och 0,22 (vikt/volym) BSA till varje fack. överligganšgp de odlingsvatskor (SO pl) replikatutströks därefter i motåif svarande fack pa analysplattorna och pa kontrollplattor,,j_ som hade behandlats med PLL och blockerats men som ej innehöll bakterier. Efter inkubering och tvättning sattes: enzymkonjugerade andrastegs-antikroppar (50 ml per fack>,_ pepparrotsperoxidas-konjugerat get-anti-human- Igß och get-anti-human-IgM, som pa lämpligt sätt hade spätts i PBS innehallande 0,1 ESA, beskrivits i exempel ¿. vøiymx Twesn-20 och 0,22 (vikt/voiymfa till facken och analysen fullbordades sasom överliggande vätskor. som innehöll antikropp som band till poolen av Fisher-immunotyper men ej till kontroll- plattan, analyserades en andra gang under användning av _ var och en av de sju Fisher-immunotyp-bakterierna separati Antikropp närvarande i den överliggande vätskan fran ett 20Hi1. n :l band endast till Fisher-immunotyperna 2, 6 “ aeruginosa. upprepade ganger med minskande laga celldensiteter till fack, och 7 av E. Cellerna underkastades subodling dess samtliga fack med tillväxt avsöndrade antikropp.The supernatants were subjected to screening regarding the presence of anti-E. aeruginosa antibodies 10 15 20 25 35 4: using the ELISA-tech-Å described in Example 2 niken but with the following modifications. A pool of the seven Fisher immunotype reference strains (A.T.C.C. No. 27312- 2731e> bands: iii fiatboctnade ' 96-compartment microtiter plates (Immulon II, Dvnatech), som had been pretreated with poly-L-lysine, incubated and was washed as described in Example 2. After blocking! of non-specific binding sites and washing of i the plates were charged with 50 μl of PBS containing 0.1 volume of Tween-year -20 and 0.22 (w / v) BSA to each compartment. överligganšgp the culture broths (SO p1) were then replicated in motif corresponding compartments on the analysis plates and on control plates ,, j_ which had been treated with PLL and blocked but which did not contained bacteria. After incubation and washing were added: enzyme-conjugated second-stage antibodies (50 ml per compartment>, _ horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human Igß and goat anti-human IgM, which had been appropriately diluted PBS containing 0.1 ESA, described in example ¿. vøiymx Twesn-20 and 0.22 (weight / voiymfa to the unions and the analysis was thus completed supernatants. which contained antibody as band to the pool of Fisher immunotypes but not to the control plate, was analyzed a second time using each of the seven Fisher immunotype bacteria separately Antibody present in the supernatant from one 20Hi1. n : l bound only to the Fisher immunotypes 2, 6 " aeruginosa. repeatedly with decreasing low cell densities to compartment, and 7 of E. The cells were subjected to subculture its all compartments with growth secreted antibody.

Cellinjen och den monoklonala antikroppen (lgﬁ-isotyp) identifieras bada med beteckningen 2OH11 i det följande.The cell line and the monoclonal antibody (Ig ﬁ isotype) are both identified by the designation 2OH11 in the following.

En andra transformation utfördes, där källan till B- -celler härrörde fran periferiblodet fran en patient med :lr systisk fibros och som var känd att ha en kronisk E. H aeruginosa-infektion. E'PBMC framställdes sasom §_ s0¿ 421 10 15 20 25 30 35 506 421 44 beskrivits ovan och samodlades med den transformerande cellinjen. 1A2, i ett förhallande av 72 IAS-celler per E'PBMC. Cellblandningen utströks i femton rundbottnade mikrotiterplattor med 96 fack i en koncentration av 7,4 10* celler per fack och odlades enligt ovan. overliggande vätskor analyserades medelst ELISQ med avseende pa närvaron av anti- E. aeruginosa-antikroppar sexton dagar efter det att transformationen hade utstrykts.A second transformation was performed, where the source of the B- -cells derived from the peripheral blood of a patient with: lr cystic fibrosis and which was known to have a chronic E. H aeruginosa infection. E'PBMC was produced as §_ s0¿ 421 10 15 20 25 30 35 506 421 44 described above and co-cultured with the transforming cell line. 1A2, at a ratio of 72 IAS cells per E'PBMC. The cell mixture was spread in fifteen round bottoms 96-compartment microtiter plates at a concentration of 7.4 10 * cells per compartment and cultured as above. overlying liquids were analyzed by ELISQ with regarding the presence of anti-E. aeruginosa antibodies sixteen days after the transformation had been ironed out.

Analysen utfördes sasom beskrivits för föregaende transfor- mation med undantag av att poolen av E. aeruginosa-stammar. som användes för den initiella screeningen. bestod av Fisher-immunotyp-referensstammarna F2. F4. Fb och F7 (A.T.C.C. nr. 27313. 27315, 27316 och 27317) och tre kliniska isolat fran Genetic Systems Corporation Ürganism Bank (GSCDB), som hade olika LPS-immunotyper och flagell- typer. Det kliniska isolatet PSA 1277 (ESCÜB) uppbär flageller av typ a och Fisher-immunotyp 1 LPS; det andra isolatet PSA G98 (BSCÜB) uppbär flageller av typ a och LPS; och det tredje isolatet PSA Fó25 (GSCÜB) uppbär flageller av typ b och Fisher-immunotyp 5 Fisher-immunotyp 3 LPS. Denna blandning av referensstammar och kliniska isolat betecknas som den flagellära E. aeruginosa-poolen. överliggande vätskor, som innehöll antikropp. vilken band till plattor innehallande den flagellära E. aeruginosa- -poolen men ej till de FLL-överdragna kontrollplattorna, analyserades medelst ELISA en andra gang med avseende pa Ett fack, ECI. band och till de individuella stammarna i poolen. till referensstammarna F2. Fb och F7 det klinis- ka isolatet Fó25.The analysis was performed as described for the previous transformation. mation except that the pool of E. aeruginosa strains. which was used for the initial screening. consisted of Fisher immunotype reference strains F2. F4. Fb and F7 (A.T.C.C. Nos. 27313, 27315, 27316 and 27317) and three clinical isolates from Genetic Systems Corporation Organism Bank (GSCDB), which had different LPS immunotypes and flagellar types. The clinical isolate PSA 1277 (ESCÜB) carries type a flagella and Fisher immunotype 1 LPS; the other the isolate PSA G98 (BSCÜB) carries type a and flagella LPS; and the third isolate PSA Fó25 (GSCÜB) carries type b and Fisher immunotype 5 flagella Fisher immunotype 3 LPS. This mixture of reference strains and clinical isolate is referred to as the flagellar E. aeruginosa pool. supernatants, which contained antibody. which band to plates containing the flagellar E. aeruginosa- the pool but not to the FLL-coated control plates, was analyzed by ELISA a second time with respect to pa A compartment, ECI. band and to the individual trunks in the pool. to the reference strains F2. Fb and F7 the clinical ka isolatet Fó25.

Kloning av cellinjen EC! utfördes genom att man först subodlade cellerna i tva omgangar med subkultur av lag densitet. först med 20 celler per fack i plattorna med 96 fack. följt av odling med 2 celler per fack. Formell kloning av de specifika antikropp-producerande cellerna utfördes genom att cellerna utströks i en densitet av cirka 1 cell/fack i Terasaki-plattor med 72 fack (Nunc UI 10 15 _20 25 30 35 506 421 #1-36538) i en volym av 10 pl/fack av HAT-medium, som saknade aminopterin-komponenten (HT-medium). Plattorna -v placerades i en inkubator under 2-d timmar för att medge; avsättning av cellerna pa bottnen av facken och under- Ä söktes därefter mikroskopiskt av tva personer med avseen- de pa fack som innehöll en enda cell. Facken matades dag- ligen med HT-medium och när utväxten var tillräcklig överfördes cellerna till en rundbottnad platta med 96 fack. Alla fack med utväxt analyserades medelst ELISA med avseende pa E. aeruginosa-stammar, som uppbar flageller av typ b, och samtliga befanns producera den lämpliga antikroppen ifraga. Cellinjen och den monoklonala anti- kroppen identifieras bada med beteckningen ECI i (IgM-isotyp) följande text.Cloning of the cell line EC! was performed by first subcultured the cells in two rounds with subculture of teams density. first with 20 cells per compartment in the 96-well plates compartment. followed by culture with 2 cells per compartment. Formal cloning of the specific antibody-producing cells was performed by plating the cells at a density of about 1 cell / compartment in 72-compartment Terasaki plates (Nunc UI 10 15 _20 25 30 35 506 421 # 1-36538) in a volume of 10 μl / compartment of HAT medium, as lacked the aminopterin component (HT medium). The plates -v was placed in an incubator for 2-d hours to allow; deposition of the cells at the bottom of the compartments and under- Ä was then searched microscopically by two persons with those in compartments that contained a single cell. The compartments were fed daily with HT medium and when the growth was sufficient the cells were transferred to a 96-well round bottom plate compartment. All outgrown compartments were analyzed by ELISA with respect to E. aeruginosa strains, which carried flagella of type b, and all were found to produce the appropriate one the antibody in question. The cell line and the monoclonal antibody the body is identified both by the designation ECI i (IgM isotype) the following text.

Det antigen som identifierades med 2OH11 och 361 var flageller sasom framgick av indirekt immunofluorescens och immunoblotting. Dessa metoder utfördes i huvudsak sasom beskrivits i exemplen 2 och 3. aeruginosa-stammar, referens-Fisher-immunotyper 27313, 27317 och 27318) fluoreecensanalys preparerades E. uppbar flageller av typ b, F2, Fb och F7 (A.T.C.C. nr. och en stamm upobarande flageller av typ a, referens-Fisher- (A.T.C.C. nr. 27315), Heferensstammarnas flagelltyp bestämdes genom -immunotyp 4 sasom beskrivits i exempel 3. typning med de monoklonala rattdjureantikrobparna PaF4 IVE3 och FA6 IIG5. l tion sasom beskrivits i exempel 2. Källorna till bada antikropparna var överliggande odlingsvatskor och det FITC-konjugerade reagenset var FITC-konjugerat ;et-anti- Burlingame, Cê) i spådd- 0.52 (flervärt) PBS, -human-Ig &Tago, (vikt/volym) 82-041-2, ningen 1:1OO i som innehöll -gammaglobuliner (Miles Scientific, Cat. No.The antigen identified by 2OH11 and 361 was flagella as evidenced by indirect immunofluorescence and immunoblotting. These methods were mainly performed as described in Examples 2 and 3. aeruginosa strains, reference Fisher immunotypes 27313, 27317 and 27318) fluorescence analysis was prepared E. carried flagella type b, F2, Fb and F7 (A.T.C.C. Nos. And a strain of unarmed flagella of type a, reference Fisher- (A.T.C.C. No. 27315), The flag type of the heferin strains was determined by -immunotype 4 as described in Example 3. typing with the rat monoclonal antibodies PaF4 IVE3 and FA6 IIG5. l tion as described in Example 2. The sources of bathing the antibodies were overlying culture fluids and that The FITC-conjugated reagent was FITC-conjugated; Burlingame, Cê) in predicted 0.52 (multi-valued) PBS, -human-Ig & Tago, (weight / volume) 82-041-2, 1: 100 in which contained -gammaglobulins (Miles Scientific, Cat. No.

Naperville, IL) och 0,12 (vikt/volym) natriumazid som konserveringemedel.Naperville, IL) and 0.12 (w / v) sodium azide as preservative.

Fluorescenefargning av antikropparna 2OHl1 och ÉC1 obeer-f verades endast med E. aeruginosa-stammar, som uppbar För indirekt immuno- som Dbjektglasen preparerades för examina-Å bovin- 506 421 46 ílageller av typ b, och ej med den stam som uppbar flageller av typ a, nämligen referens-Fisher-immunotypen 4. Det observerade fluorescensmönstret var ett sinuslinje- mönster härrörande fran ena anden av bakterierna. vilket visade att antikropparna band till bakteriernas flageller. 10 15 20 25 30 35 so§,421 47 ¿¿ ' lmmunoblotting utfördes sasom beskrivits i exempel 2 aeruginosa-re¥erens- 27313), och Renade šlageller av typ b fran E. stammarna Fisher-immunotyp 2 (A.T.C.C. nr. renade flageller av typ a fran referensstammarna Habs 6 och Habs 8 (A.T.C.C. vvwcv nr. och 33355) framställdes sasom beskrivits i exempel 3. Antigener separerades i en 10% polyakrylamidgel (se exempel 3) och överfördes till ett NCM. överliggande odlingsvätskor innehallande anti- 3C1, innehallande en icke-speci+ik humanantikropp och odlingsfl kropparna 2OHl1 eller överliggande odlingsvätskor medier inkuberades med NCM och reaktionen pavisades med 1 ett alkaliskt fosfatas-konjugerat get-anti-human-Ig (flëﬁ“ CA) Enzymsubstrat framställdes sasom vart) (Tago, Burlingame, utspätt i PBS innehållande 0,05 volymﬁ Tween-20. beskrivits i exempel 2. Immunoblottinganalysen visade atä _bada antikropparna band till ílagellinproteinet av Fisher- _.. -immunotyp 2 med molekylvikten Sauuü och ej till ¥lagel1inproteinet av Habs 6 med molekylvikten 51700 ochï ej heller till flagellinproteinet av Habs 8 med molekyl-šï. vikten 47200. Ingen reaktion konstaterades vare sig med qen icke-speci¥ika humanantikroppen eller odlingsmedierna.Fluorescence staining of the antibodies 2OH11 and ÉC1 obeer-f only with E. aeruginosa strains, which received For indirect immuno- as The slides were prepared for examina-Å bovine 506 421 46 ílageller of type b, and not with the strain that bore flagella of type a, namely the reference Fisher immunotype 4. The observed fluorescence pattern was a sinusoidal patterns derived from one spirit of the bacteria. which showed that the antibodies bound to the bacterial flagella. 10 15 20 25 30 35 so§, 421 47 ¿¿' Immunoblotting was performed as described in Example 2 aeruginosa-re ¥ erens- 27313), and Purified type b strokes from E. strains Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. no. purified type A flagella from the reference strains Habs 6 and Habs 8 (A.T.C.C. vvwcv no. and 33355) were prepared as described in Example 3. Antigens were separated into one 10% polyacrylamide gel (see Example 3) and transferred to an NCM. supernatants containing anti- 3C1, containing a non-specific human antibody and culture fl the bodies 2OHl1 or overlying culture fluids media were incubated with NCM and the reaction was paused with 1 an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human Ig (fl CA) Enzyme substrates were prepared as follows where) (Tago, Burlingame, diluted in PBS containing 0.05 volume ﬁ Tween-20. described in Example 2. The immunoblotting assay showed that bath the antibodies bound to the ílagellin protein of Fisher _ .. -immunotype 2 with the molecular weight Sauuü and not to The lagel1in protein of Habs 6 with the molecular weight 51700 ochï nor to the flagellin protein of Habs 8 with molecular šï. weight 47200. No reaction was observed with either qen non-specific human antibody or culture media.

Ytterligare bekräftelse pa att antikropparna 2OHll och H 361 band endast till flageller av typ b och ej till typ @,_ erhölls medelst ELISA, där Habs-stammar 1-12 bands indivi- duellt med PLL till ëacken i Immulon mikrotiterplattor i med 96 fack. Antikropparna band endast till Habs-stammarna 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 och 12, vilka är stammar som uppbäﬂ». <1ae4> J. clan. microbini., 2o=a4>.“ï typ b (Ansorg et al.Further confirmation that the antibodies 2OH11 and H 361 bands only for flagella of type b and not for type @, _ obtained by ELISA, in which Habs strains 1-12 bands were individually duel with PLL to ëacken in Immulon microtiter plates in with 96 compartments. The antibodies bound only to the Habs strains 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 and 12, which are strains that support ﬂ ». <1ae4> J. clan. microbini., 2o = a4>. “ï type b (Ansorg et al.

EXQMPLE 7 Exempel 7 askadliggör metoder +ör ¥ramstallning av en monoklonal humanantikropp, som binder till E. aeruoinosa~ -flageller av typ a.EXQMPLE 7 Example 7 neutralizes methods + initialization of a human monoclonal antibody, which binds to E. aeruoinosa ~ flags of type a.

Ett peri¥eriblodprov +ran en person, som hade immuniseraﬁs med ett högmolekylart polvsackaridpreparat (Pier et al. 10 15 20 25 30 35 506 421 48 (1981) Infect. lmmun., 34:46l), tjänade som källa till E-celler. De enkärniga cellerna separerades fran blodet och befriades därefter fran T-celler sasom beskrivits i exempel 6. Cellerna frystes därefter i FCS innehallande 10% dimetylsulfoxid i en tank med flytande kväve. Vid ett senare tillfälle tinades cellerna snabbt vid 37°C, tvättades en gang i lscoves medium och atersuspenderades i HQT-medium. Cellstyrd transformation astadkomms genom samodling av E“PBMC med IAZ-celler i ett förhallande av 30 1A2-celler per E”PBMC. Cellblandningen utströks i 30 vävnadsodlingsplattor med 96 fack i en koncentration av 62000 celler per fack. Üdlingarna matades pa den sjunde dagen efter utstrykningen genom ersättning av halva volymen med HAT-medium. Cellproliferation konstaterades i 100% av facken pa den fjortonde dagen efter utstrykning och överliggande vätskor avlägsnades fran facken och analyserades vid denna tidpunkt.A periodic blood test + ran a person, who had immunized with a high molecular weight polysaccharide preparation (Pier et al. 10 15 20 25 30 35 506 421 48 (1981) Infect. lmmun., 34: 46l), served as the source of E-cells. The mononuclear cells were separated from the blood and was then freed from T cells as described in Example 6. The cells were then frozen in FCS containing 10% dimethyl sulfoxide in a tank with liquid nitrogen. By one later, the cells thawed rapidly at 37 ° C, was washed once in lscove medium and resuspended in HQT medium. Cell-controlled transformation is accomplished by co-culture of E 'PBMC with IAZ cells in a ratio of 1A2 cells per E ”PBMC. The cell mixture was plated in 30 tissue culture plates with 96 compartments in a concentration of 62000 cells per compartment. The lizards were fed on the seventh the day after the ironing by replacing half the volume with HAT medium. Cell proliferation was found in 100% of the trades on the fourteenth day after ironing and supernatants were removed from the compartments and was analyzed at this time.

De överliggande vätskorna analyserades medelst ELISA med aeruginosa-antikroppar genom användning av den flagellära E. aeruginosa-poolen avseende pa närvaron av anti-E. och PLL-behandlade plattor som kontroll, sasom beskrivits i exempel o. overliggande vätskor, som innehöll anti- kroppar, vilka band till den flagellära poolen men ej till PLL-kontrollplattorna, analyserades anvo pa de indi- viduella bakteriestammarna i den flagellära poolen. Ett ZIBB, ,.Å.._. fack, innehöll antikropp som band till PSA lax/, PSA G98 och referens-Fisher-immunotyp 4, vilka är de tre stammar i den flagellära poolen som uppbär flageller av typ a.The supernatants were analyzed by ELISA aeruginosa antibodies by using the flagellar E. aeruginosa pool regarding the presence of anti-E. and PLL-treated plates as control, as described in examples and supernatants, which contained anti- bodies, which bind to the flagellar pool but not to the PLL control plates, were analyzed using the indi- vidual bacterial strains in the flagellar pool. One ZIBB, , .Å .._. compartment, contained antibody that bound to PSA salmon /, PSA G98 and Reference Fisher immunotype 4, which are the three strains in the flagellar pool that carry flagella off type a.

Kloning av cellinjen 2158 astadkomms sasom beskrivits i exempel 6 för cellinjen 3Cl med följande modifikationer i det formella kloningssteget. Efter det att facken i Terasaki-plattorna hade undersökts med avseende pa närvaron av en enda cell. överfördes varje cell fran Terasaki-plattan till ett individuellt fack 1 en rundbott- nad odlingsolatta med 95 fack i en volym av 100 ul HAT- 10 15 20 25 35 49 505 421 -medium. som saknade aminopterin~komponenten (HT-medium).Cloning of cell line 2158 is accomplished as described in Example 6 for the cell line 3Cl with the following modifications in the formal cloning step. After the compartments in The Terasaki plates had been examined for pa the presence of a single cell. each cell was transferred from The Terasaki plate to an individual compartment 1 a round bottom cultivation solatta with 95 compartments in a volume of 100 μl HAT 10 15 20 25 35 49 505 421 -medium. which lacked the aminopterin ~ component (HT medium).

Icke transformerande. HAT-känsliga lymfoblastdida celler _: införlivades med samtliga fack i en densitet av 500 V celler/fack som matarceller. Fem dagar efter utstrykningg sattes 100 pl av HAT-medium till facken för att selektivå¿ döda matarcellerna. Facken matades anyo pa dagarna 7 ochi 9 efter utstrykning genom ersättning av halften av den överliggande vätskan med HAT-medium. Cellerna matades därr_ efter med HT-medium till dess cellerna hade tillrackligf,, densitet för att detektera närvaron av antikropp medelstí ELISA. Samtliga fack med utväxt producerade antikropp. 1 som band till E. aeruginosa-stammar uppbärande flageller: av typ a. Cellinjen och den monoklonala antikroppen (IgG1-isotyp) identifieras bada med beteckningen 2188 i följande text.Non-transforming. HAT-sensitive lymphoblastoid cells _: was incorporated into all compartments at a density of 500 V cells / compartments as feeder cells. Five days after ironing 100 μl of HAT medium was added to the compartments to selectively kill the food cells. The compartments were fed anyo on days 7 and 9 after smearing by replacing half of it the supernatant with HAT medium. The cells were fed there_ after with HT medium until the cells had sufficient density to detect the presence of antibody medium ELISA. All compartments with outgrown produced antibody. 1 as bands to E. aeruginosa strains bearing flagella: of type a. The cell line and the monoclonal antibody (IgG1 isotype) is both identified by the designation 2188 i the following text.

Det antigen som identifierades med 2138 var flageller sasom kunde visas med indirekt immunofluorescens och immunoblotting (se exempel 6 för en närmare beskrivning av teknikerna). Fluorescensfargning av antikropøen 2188 konstaterades endast med E.aeruginosa-referensstammen Fisher-immunotyp 4 (A.T.C.C. nr. 27315). som uppbär aeruginosa-referens- 27313). flageller av typ a. och ej med E. stammen immunotyp 2 (A.T.C.C. nr. som uppbär flageller av typ a. Det konstaterade flourescensmönstret¿ var ett sinuslinjemönster harrörande fran ena änden av ä bakterierna, vilket visade att antikroppen band till bakf teriernas flageller.The antigen identified by 2138 was flagella as could be shown by indirect immunofluorescence and immunoblotting (see Example 6 for a more detailed description) of the technologies). Fluorescence staining of the antibody 2188 was found only with the E.aeruginosa reference strain Fisher immunotype 4 (A.T.C.C. No. 27315). which bears aeruginosa reference 27313). flagella of type a. and not with E. strain immunotype 2 (A.T.C.C. No. bearing flagella of type a. The observed fluorescence pattern¿ was a sine line pattern moving from one end of ä the bacteria, which showed that the antibody bound to bakf terials flagella.

Immunoblotting utfördes sasom beskrivits i exempel 2.Immunoblotting was performed as described in Example 2.

Renade flageller av typ a fran E. aeruginosa-referens- _H stammen Habs 6 (A.T.C.C. nr. 33353) och renade flagellerﬁ av typ b fran E. aerudinosa-referensstammen Fisher-immuno- typ 2 (A.T.C.C. nr. 27313) framställdes sasom beskrivitsè. i exempel 3. Antigener separerades i en 10%-ig polyakrylê och överfördes till ett Nam. 1 amidgel (se exempel 3) överliggande odlingsvatskor, som innehöll antingen 21BB'šl eller en icke-specifik humanantikropp. och odlingsmedier: 10 15 20 25 30 35 506 421 fick reagera med NCM och reaktionen pavisades med ett al- kaliskt fosfatas-konjugerat get-anti-human-lg (flervart) och enzvmsubstrat sasom beskrivits i exemplen 2 och 6.Purified flagella of type a from E. aeruginosa reference-H strain Habs 6 (A.T.C.C. No. 33353) and purified flagella ﬁ type b from the E. aerudinosa reference strain Fisher immuno- type 2 (A.T.C.C. No. 27313) was prepared as described. in Example 3. Antigens were separated in a 10% polyacrylic and was transferred to a Nam. 1 amide gel (see Example 3) overlying cultivation waters, containing either 21BB'šl or a non-specific human antibody. and culture media: 10 15 20 25 30 35 506 421 was reacted with NCM and the reaction was demonstrated with a calic phosphatase-conjugated goat anti-human Ig (multiple) and enzyme substrates as described in Examples 2 and 6.

Immunoblottinganalysen visade att antikroppen ZIBB endast band till flagellinproteinet av Habs 6 med molekylvikten 51700 och ej till ílagellinproteinet av Fisher-immunotvp 'ﬂ c med molekylvikten 53000. Ingen reaktion observerades med den icke-specifika humanantikroppen eller odlings- medierna.The immunoblotting assay showed that the antibody ZIBB only bound to the flagellin protein of Habs 6 by molecular weight 51700 and not to the ílagellin protein of Fisher immunotype 'ﬂ c with a molecular weight of 53000. No reaction was observed with the non-specific human antibody or culture medium the media.

EXEMPEL E Exempel 8 askadliggör skydd av möss, som passivt har immuniserats med anti-flagellära humanantikroppar 2OH11, 3C1 och 2188 mot infektion med E. modellen aeruginosa i med brand mus.EXAMPLE E Example 8 disables the protection of mice that have passive immunized with anti-flagellar human antibodies 2OH11, 3C1 and 2188 against infection with the E. model aeruginosa i with fire mouse.

De monoklonala anti-+lagel1ära humanantikropparna testades i modellen med bränd mus (se exempel 4). _Antikropparna 21BB och IOH11 preparerades genom utfall- ning av överliggande odlingsvätskor, som hade slstrats av respektive cellinjer, med amoniumsulfat (slutkoncentration 50%) Mishell.The anti- + monoclonal human antibodies was tested in the model with a burned mouse (see example 4). Antibodies 21BB and IOH11 were prepared by precipitation. of supernatants, which had been discarded respective cell lines, with ammonium sulphate (final concentration 50%) Mishell.

(Good et al., Selected Methods in Cellular Immunolooy, B.B. 5.M.. W.J. 27?-286). och Shiigi, Freeman & Co., iaao, red., San Francisco, CA, Fällningen soluoilisera- des i PBS, dialvserades mot PBS över natten vid 4°C och sterilfiltrerades därefter före administrering till djur.(Good et al., Selected Methods in Cellular Immunolooy, B.B. 5.M .. W.J. 27? -286). and Shiigi, Freeman & Co., iaao, ed., San Francisco, CA, The precipitate soluoilizes in PBS, dialyzed against PBS overnight at 4 ° C and sterile was then filtered before administration to animals.

Hallan till antikropp SBI och den använda icke-specifika anti-LPS-antikroppen som negativ kontroll vid denna under- sökning var överliggande odlingsvatska. Som positiv kontroll +är varje undersökning användes den lamoliga renade monoklonala rattdjursantikroopen PaF4 IWEE eller P4 Fëó IG5. ﬁ IT m anvandes o S, S E U Den stam som uppbar ilageller av ty o ÉCÜÜ H ~~ _>4'_ TU ff I) a vid djurförsëken var det kliniska isolat (GSCÜE), stammen med flageller av typ o var det kliniska isolatet F. som uttrvcker Fisher-immunotvp 1 LP . och 10 15 2.0 25 30 35 soel421 som uttrycker Fisher-immundtyb 6 LPS. (0,45 ml) 0,05 ml) FSA A447 (GSCOB), Humanantikrnpparna §örblandades med bakterierna (mer än 5 LD.@°-doser i och invmpades under ear~ ekdrpan omedelbart efter det brannekadan hade astad- kommits. Resultaten av djurföreöken atgee i tabellerna III, IV och V.Hallan to antibody SBI and the used non-specific the anti-LPS antibody as a negative control in this sub- search was overlying cultivation water. As positive control + is each examination used the lamoliga purified rat monoclonal antibody PaF4 IWEE or P4 Fëó IG5. ﬁ IT m is used O S, S E U The tribe that carried ilageller of ty o ECU H ~~ _> 4'_ TU ff IN) a in animal experiments it was clinical isolate (GSCÜE), the strain with flagella of type o was the clinical isolate F. which expresses Fisher immunotype 1 LP. and 10 15 2.0 25 30 35 soel421 which expresses Fisher immune type 6 LPS. (0.45 ml) 0.05 ml) FSA A447 (GSCOB), The human antibodies were premixed with the bacteria (more than 5 LD. @ ° doses in and inoculated during ear ~ ekdrpan immediately after the fire has been commits. The results of the animal multiplication atgee in the tables III, IV and V.

TABELL III. kroppen 21B8 av anti-flagelltyp al vid modellen med bränd~ Skyddeetudie av den mdnoklonala humananti- mus Procentuell överlevnad pa dag: Behandling 1 2 T 4 5 6 7 8 9 Rattdjurs- 100 100 100 100 88 88 BB BB V88 -anti-flagell a, FA6 IIGSS HLI m år! _ an t i " 1 O O I O O 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO -flagell a, 2138 Hccman-anti- mc» c» c» o c» I c» o c» o -flagell D, 2OH11 PBS 100 25 12 M H D-l H b* n l-e H b-I IJ I-ﬂ rJ *Möeeen inëekteradee under earekdrpan med mer än 5 LD,°°ﬁ -doser av E. aeruginnea PSA A522.TABLE III. body 21B8 of anti-flagell type al in the model with burnt ~ Protection study of the mdnoclonal human anti- mouse Percentage survival per day: Treatment 1 2 T 4 5 6 7 8 9 Steering wheel- 100 100 100 100 88 88 BB BB V88 -anti-flagell a, FA6 IIGSS HLI m years! _ an t i "1 O O I O O 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO -flagell a, 2138 Hccman-anti- mc »c» c »o c» I c »o c» o -flagell D, 2OH11 PBS 100 25 12 M hrs D-l hrs b * n smile hrs bi IJ I- ﬂ rJ * Möeeen inëekteradee during earrekdrpan with more than 5 LD, °° ﬁ doses of E. aeruginnea PSA A522.

*Den prdcentuella överlevnaden baserar eig pa antalet 506 421 möss som överlevde per grupp om atta djur. Dagarna avser efter astadkommande av brännskada och infektion. 3Renad antikropp (10 ug i 0,45 ml PBS) +örblandades med 5 bakterierna och administrerades under sarskorpan efter astadkommande av brannskada och in{ektion.* The percentage survival is based on the number 506 421 mice that survived per group of eight animals. The days refer to after causing burns and infection. Purified antibody (10 μg in 0.45 ml PBS) + was mixed with 5 bacteria and was administered under the scab after causing burns and injections.

TABELL IV. Skyddsstudie av den monoklonala humananti- 10 kroppen 2OH11 av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus* __________________________________________________________ __1 Procentuell överlevnad pa dag: 15 Behandling 1 I T 4 5 6 7 E Q RattdJurs-anti- -flagell b, 20 PaF4 IVEB= 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- -flagell b, 20H 1 1 100 100 1 00 1 00 1 00 100 100 1 00 1 00 2 5 Human-anti- -flagell a, 2 1 BB 1 00 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 Mgg 1 Ey- 30 0 0 0 0 0 0 0 0 *Mossen infekterades under sarekorpan med mer an 5 LD1°°- -doser av det kliniska E. aeruoinosa-isolatet FEA Q447. 35 *Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet möss som överlevde per gruoo om fem djur. Da efter astadkommande_av brannshada och infektion. 10 15 20 25 30 35 _-flagell b, U U so§0421 =Renad antikroop (10 pg i 0,45 ml PBS) förblandades med bakterierna och administrerades under sarskorpan efter astadkommande av brännskada och iníektion.TABLE IV. Protection study of the human monoclonal Body 2OH11 of anti-flagell type b in the model with burnt mouse* ______________________________________________________________ __1 Percentage survival per day: 15 Treatment 1 I T 4 5 6 7 E Q RattdJurs anti- -flagell b, 20 PaF4 IVEB = 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- -flagell b, 20H 1 1 100 100 1 00 1 00 1 00 100 100 1 00 1 00 2 5 Human-anti- -flagell a, 2 1 BB 1 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 Mgg 1 Ey- 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 * The moss was infected under the sarekorpan with more than 5 LD1 °° - doses of the clinical E. aeruoinosa isolate FEA Q447. 35 * The percentage survival is based on the number mice that survived per gruoo about five animals. Yes after the onset of burns and infection. 10 15 20 25 30 35 _-flagell b, U U so§0421 Purified antibody (10 pg in 0.45 ml PBS) was premixed with the bacteria and was administered under the scab after causing burns and injection.

TABELL V. Skvddsstudie av den monoklonala humanantikroppgn 301 av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus _____________.._.__.._..._______..________._____..___.._-__.__...___..._~'_. _... .i _: Procentuell överlevnad pa dag* H M b U 0 w W m Behandling 1 RattdJurs-anti- -flagell b, FaF4 IVE8$ 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- 301 100 100 80 80 SO BO BO 80 EG Icke-specifik monoklonal anti- ~LPS-antikropp 100 O O O O O O O 10 L ______________________________________________________ -..,......1 *Mössen infekterades -doser av PSA A447. under sarskorpan med mer än 5 LDiøø?Ä *Den procentuella överlevnaden baserar =ig pa antalet grupper om fem djur. Dagarna avser efter \f astadkommande av orannskada och in+ektion. 3Renad antikrooo (40 ug> administrerades intravenöst tvaw timmar före astadkommandet av brannskada och infektion.TABLE V. Conservation study of the human monoclonal antibody data 301 of anti-flagellum type b in the model with a burned mouse _____________.._.__.._..._______..________._____..___.._-__.__...___..._ ~ '_. _... .i _: Percentage survival per day * hrs M b U 0 w W m Treatment 1 RattdJurs anti- -flagell b, FaF4 IVE8 $ 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- 301 100 100 80 80 SO BO BO 80 EG Non-specific anti-monoclonal ~ LPS Antibody 100 O O O O O O O O 10 L ______________________________________________________ - .., ...... 1 * The mice were infected doses of PSA A447. under the sarcorpa with more than 5 LDiøø? Ä * The percentage survival is based on the number groups of five animals. The days refer to after \ f causing injury and injection. Purified antibody (40 ug> was administered intravenously tvaw hours before the onset of burns and infection.

En mycket signifikant overlevnad konstaterades hos möss, 10 15 20 25 30 35 lsoe 421 som hade behandlats med antikroppen av anti-flagelltyp a eller nagon av de tva antikropparna av anti-flagelltyp b efter infektion med motsvarande antigen. Ümvant dog BB-100% av de obehandlade men infekterade mössen eller de som hade behandlats med en icke-matchande anti- -flagellar monoklonal antikropp eller icke-specifik anti- -LPS-antikropp. Sasom kunde konstateras med de monoklonala rattdjursantikropparna (se exempel 4) skyddar de anti-4lagellara humanantikropparna specifikt mot letal- infektion endast av de organismer som uppbär motsvarande flagelltvp, d.v.s. humanantikroppen av anti-flagelltvp a astadkom skydd mot letalinfektion av den organism som uppbar flagelltyp a och icke typ.b och antikropoarna av anti-flagelltyp b skyddade möss, som hade infekterats med stammar uppbarande ëlagelltyp b men ej organismer uppbarande typ a. _}EMPEL 9 Exempel 9 askadliggör korsreaktiviteten hos de anti- -flagellara humanantikropparna 2OH11, 3C1 och BIBB med kliniska E. aeruginosa-isolat.A very significant survival was observed in mice, 10 15 20 25 30 35 lsoe 421 which had been treated with the anti-flagella type antibody a or any of the two antibodies of anti-flagellar type b after infection with the corresponding antigen. Umvvant dog BB-100% of the untreated but infected mice or those who had been treated with a non-matching anti- flagella monoclonal antibody or non-specific antibody -LPS antibody. As could be ascertained with those the rat monoclonal antibodies (see Example 4) protect the anti-4lagellar human antibodies specifically against lethal infection only by the organisms that carry the equivalent flagelltvp, i.e. the human antibody of anti-flagellar TV a provided protection against lethal infection of the organism that carried flagellar type a and not type.b and the antibodies of anti-flagella type b protected mice, which had been infected with strains bearing ëlagell type b but not organisms supporting type a. _} EMPEL 9 Example 9 neutralizes the cross-reactivity of the -flagellar human antibodies 2OH11, 3C1 and BIBB with clinical E. aeruginosa isolates.

Kliniska E. aeruginosa-isolat (115). som hade erhallits fran sjukhus och kliniker och isolerats i huvudsak fran brännskador och blod, identifierades sasom uppoarande +lage1ler av typ a eller typ b genom typning med de monoklonala rattdjursantikropparna FA6 IIG5 eller PaF4 Femtiofem av de kliniska IVEB (se exemplen 2, I och 5). isolate identi¥ierades som uppbarande ilageller av tyo a 3 genom reaktion med den monoklonala rattdgursantakroppen Fâb IIGS och 5? identifierades som uopoarande tvo b genom deras reaktion med den monoklonala rattdjursantikroooen PaF4 IUEE.Clinical E. aeruginosa isolates (115). which had been obtained from hospitals and clinics and isolated mainly from burns and blood, were identified as emerging + type a or type b layers by typing with the the rat monoclonal antibodies FA6 IIG5 or PaF4 Fifty-five of the clinical IVEB (see Examples 2, I and 5). isolate was identified as bearing ilageller by tyo a 3 by reaction with the steering wheel monoclonal antibody Get IIGS and 5? was identified as unopoarande tvo b by their reaction with the rat monoclonal anticoar PaF4 IUEE.

Horsreaktiwiteten nos den monoklonala humanantikropoen av ti- anti-flagelltyp a, var omiattande genom att an kropoen kande igen 54 av de Eb kliniska :solat ﬂëoïl som 10 15 _20 25 30 35 UI UI so§ 421 uppbar flageller av typ a. Morsreaktiviteten nos 2OH11 med de isolat som uppbar flageller av typ b var aven om- 7 fattande genom att 2OH11 kande igen samtliga S9 isolat (1002). I motsats härtill band den aterstaende monoklo- nala antikroppen av anti-flagelltyp b, 3C1, till endast 43 av de 59 isolaten (73%). Dessa resultat visar att EOHI1 binder till en pan-reaktiv epitop (d.v.s. en epitop> närvarande pa minst cirka 95% av de flagellara > E. aeruginosa-stammarna), medan ECI binder till en epitopï som ej är närvarande pa alla flagellinmolekyler av typ bla Även om antigenet av flagelltyp b ar serologiskt homDgentš“ vid analys med polyklonala antisera (Lanvi, B., supra), för 2OH11 och 3C1 överraskande att flagellerna av typ b su ra, and Ansprg, R., visar korsreaktivitetsmönstren har minst tva separata epitoper som kan identifieras av monoklonala antikroppar.The horse reactivity nos the human monoclonal antibody off ti- anti-flagell type a, was unmatched by an kropoen kande again 54 of the Eb clinical: solat ﬂ ëoïl as 10 15 _20 25 30 35 UI UI so§ 421 carried flagella of type a. The parent reactivity nos 2OH11 with the isolates carrying flagella type b were also re- 7 comprehending by 2OH11 recognizing all S9 isolates (1002). In contrast, the remaining monoclonal nal antibody of anti-flagellar type b, 3C1, to only 43 of the 59 isolates (73%). These results show that EOHI1 binds to a pan-reactive epitope (i.e. an epitope> present on at least about 95% of the flagellar> E. aeruginosa strains), while ECI binds to an epitope which is not present on all flagellin molecules of type bla Although the flagella-type antigen is serologically homDgentš “ when analyzed with polyclonal antisera (Lanvi, B., supra), for 2OH11 and 3C1 surprising that the flagella of type b su ra, and Ansprg, R., show the cross-reactivity patterns has at least two separate epitopes that can be identified by monoclonal antibodies.

Den omfattande korsreaktiviteten hos antikropparna 2138 och 2OH11 med kliniska P. aeruginosa-isolat visar den speciella kliniska användbarheten av dessa antikroppar aeruginosa-infektioner. vid immunoterapi av E.The extensive cross-reactivity of the antibodies 2138 and 2OH11 with clinical P. aeruginosa isolate shows it special clinical utility of these antibodies aeruginosa infections. in immunotherapy of E.

EXENPEL 10 Exempel 10 askadliggör metoder för +ramställning av ett vtterligare exempel pa en monoklonal humanantikropp, som binder till E. aeruginosa-ilageller av typ b, liksom denna antikropps skyddsaktivitet mot infektion med E. aeruginosa vid modellen med bränd mus.EXAMPLE 10 Example 10 disables methods for + framing of a further examples of a human monoclonal antibody, which binds to E. b. type b aeroginosa ilagelles, as well This antibody's protective activity against infection with E. aeruginosa in the model with a burned mouse.

En trans¥ormerad cellinje preparerades och klonades i »u huvudsak sasom beskrivits i exempel /, med undantag av att den transformerade cellblandningen utströks pa 20 vavnadsodlingsplattor med 96 tack i en koncentration av cirka 2250 E'PBMC per fack. dverliggande vätskor analy- serades initiellt medelst ELISA pa den flagellara poolen, med undantag av att Fisher- sasom beskrivits i exempel 6, Ü -immunotyp-referensstammarna e och 4 saknades 1 poolen. 10 15 20 25 30 35 506 421 Positiva fack analyserades därefter pa var och en av stammarna i den flagellära poolen inklusive Fisher-immuno- typ 2 och 4. Den slutligen isolerade cellinjen och den identifieras bada monoklonala antikroppen (IQG-isotyp) med beteckningen 12D7 i följande text.A transformed cell line was prepared and cloned into »U essentially as described in example /, with the exception of that the transformed cell mixture was spread on 20 tissue culture plates with 96 tack in a concentration of about 2250 E'PBMC per compartment. supernatants analyzed initially by ELISA on the flagellar pool, with the exception that Fisher- as described in Example 6, Ü -immunotype reference strains e and 4 were missing in the pool. 10 15 20 25 30 35 506 421 Positive compartments were then analyzed on each of strains in the flagellar pool including Fisher immuno- type 2 and 4. The finally isolated cell line and the identified bada monoclonal antibody (IQG isotype) with the designation 12D7 in the following text.

Den monoklonala humanantikroppen 12D7 visade omfattande korsreaktivitet med isolat av anti-flagelltyp a och kande igen 54 av de 56 testade kliniska isolaten (96%), som Skyddsaktiviteten för den mono- tabell VI. uppbar flageller av typ a. klonala antikroppen 12D7 visas i Skvddsstudier- na utfördes i huvudsak sasom beskrivits i exempel 4, med undantag av att den infekterande dosen var 1 Lüiom och att den infekterande stammen var 1624, ett kliniskt isolat som uttrycker Fisher-immunotyp 2 LPS och flageller vav typ a.The human monoclonal antibody 12D7 showed extensive cross-reactivity with anti-flagella type a and jug isolates again 54 of the 56 clinical isolates tested (96%), which The protection activity of the mono- Table VI. carried flagella of type a. clonal antibody 12D7 is shown in Skvddsstudier- were carried out essentially as described in Example 4, with except that the infecting dose was 1 Lüiom and that the infecting strain was 1624, a clinical isolates expressing Fisher immunotype 2 LPS and flagella vav typ a.

TABELL VI. Skyddsstudie av den monoklonala humananti- kroppen 1207 av anti-flagelltyp a vid modellen med bränd mus* Procentuell överlevnad pa dag* Behandling: 1 I I 4 5 6 " 8 9 Human-anti- -flagell a, 120? 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- -Fisher 2 LP5. :H9 90 90 90 90 90 90 90 90 90 Rattdjurs- -anti-ïlagell a. 1165 100 100 100 100 100 100 100 100 100 10 15 20 25 30 35 sne 57 Human-anti- -flagell b, 15F4 100 37.5 25 25 25 25 25 25 25 ___-__.-____________.__.________.__.___.__.___________________.__.,.,.,Q..TABLE VI. Protection study of the human monoclonal the body 1207 of anti-flagell type a in the model with burnt mouse* Percentage survival per day * Treatment: 1 I I 4 5 6 "8 9 Human-anti- -flagell a, 120? 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- -Fisher 2 LP5. : H9 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 Steering wheel -anti-ïlagell a. 1165 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 10 15 20 25 30 35 sne 57 Human-anti- -flagell b, 15F4 100 37.5 25 25 25 25 25 25 25 ___-__.-____________.__.________.__.___.__.___________________.__.,.,., Q ..

*Mössen in+ekterades under sarskorpan med 1 Lüioo (950 CPU) av E. aeruginosa 1624.* The mice in + were echoed under the crust with 1 Lüioo (950 CPU) by E. aeruginosa 1624.

*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag av gruppen 15F4 där N=8. Dagarna avser efter astadkommande av brännskada och infektion. 0,5 ml PBS) intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn- °Renad antikropp (50 pg i administrerades skada och infektion.* The percentage survival is based on the number surviving mice per group of ten animals, with the exception of group 15F4 where N = 8. The days are after arrival of burn and infection. 0.5 ml PBS) intraperitoneally two hours before the onset of burns. Purified antibody (50 pg) was administered injury and infection.

EXENPEL 11 Exempel 11 askadliggör framställningen av en monoklonal humanantikropp, som reagerar med E. aeruginosa av flagellf typ b, och skyddet av möss, som passivt har immuniseratswﬂd med denna antikroop mot infektion med E. aeruginosa vid modellen med bränd mus.EXAMPLE 11 Example 11 ash damages the preparation of a monoclonal human antibody, which reacts with E. aeruginosa of flagellum type b, and the protection of mice that have been passively immunized with this antibody against infection with E. aeruginosa at the model with a burned mouse.

En transformerad cellinje preparerades och klonades i huvudsak sasom beskrivits i exempel 10, med undantag av att transformationsförhallandet 1A2 till B-cell var cirka? 6Û:1 och den trans+ormerade cellblandningen utströks pa femton plattor i en koncentration av cirka 1930 E'PBMC per fack.A transformed cell line was prepared and cloned into essentially as described in Example 10, with the exception of that the transformation ratio 1A2 to B-cell was approximately? 6Û: 1 and the trans + normalized cell mixture was plated on fifteen plates in a concentration of about 1930 E'PBMC per compartment.

E. stammar innefattande G98 3, ilagelltyp a) och 1739 {lagelltyp b) Cellen analyserades även pa en pool av aeru inosa- (Fisher-immunotyp (ett kliniskt isolat -immunotvp 5, och bekräftades pa en annan M" pool av E. aeruginosa-stammar: 1277. GQB, I73§ och Fisheršv P4, Fa och F?. -immunotyper F2, Den slutligen isolerade cellinjen och den utsöndrade monoklonala antikroppen 42 1 av Fisher1§ï 506 A421 (lgßl-isotyp) identifieras bada med beteckningen 288 i följande text.E. strains comprising G98 3, ilagell type a) and 1739 {layer type b) The cell was also analyzed on a pool of aeru inosa- (Fisher immunotype (a clinical isolate -immunotvp 5, and was confirmed on another M " pool of E. aeruginosa strains: 1277. GQB, I73§ and Fisheršv P4, Fa and F ?. -immunotypes F2, The finally isolated the cell line and the secreted monoclonal antibody 42 1 by Fisher1§ï 506 A421 (lgßl isotype) are both identified by the designation 288 i the following text.

En immunp+luorescensanalys, som utfördes med EEE, var positiv pa en Fisher-immunotypstam 2 av flagelltyp b men negativ pa en Fisher-immunotyp-referensstam 4 av ¥1agell- typ a. Vid test pa klinisk isolat reagerade 59/5? (1002) av isolat av flagelltyp b positivt.An immuno + fluorescence assay, performed with EEE, was positive on a Fisher immunotype strain 2 of flagellum type b men negative on a Fisher immunotype reference strain 4 of ¥ 1agell- type a. When tested on clinical isolates, 59/5 reacted? (1002) of flagell type b isolate positive.

Skyddsaktiviteten hos 288 visas i tabell VII.The protective activity of 288 is shown in Table VII.

Skyddsstudierna utfördes sasom beskrivits i exempel 10, med undantag av att klinisk isolat F1b4 (Fisher-immunotyp 4, flagelltvp b) användes för infektionen.The protection studies were performed as described in Example 10, with the exception of clinical isolate F1b4 (Fisher immunotype 4, flagellar TV b) was used for the infection.

TABELL VII. Skyddsstudie av den monoklonala humananti- kroppen EEE av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus* Procentuell överlevnad pa dagz Behandling 1 2 3 4 S é 7 B 9 Human-anti- -flagell b, 2B8= 100 89 89 89 89 B9 8? B? 89 Rattdjurs- -anti-flagell b.TABLE VII. Protection study of the human monoclonal the body EEE of anti-flagellum type b in the model with burnt mouse* Percentage survival per day Treatment 1 2 3 4 S é 7 B 9 Human-anti- -flagell b, 2B8 = 100 89 89 89 89 89 B9 8? B? 89 Steering wheel -anti-flagell b.

PaF4 IVEB“ 100 100 100 100 100 100 90 90 90 Rattdjurs- -anti-Fisher 2 Lpg! VH3~ gg :Q 20 20 20 “Û 20 20 70 .__ *Mossen infekterades under sarskorpan med 1 Lßiøo (105 10 15 20 25 30 35 sø§ 421 CFU) av E. aeruginosa F1b4.PaF4 IVEB “100 100 100 100 100 100 90 90 90 90 Steering wheel -anti-Fisher 2 Lpg! VH3 ~ gg: Q 20 20 20 “Û 20 20 70 .__ * The moss was infected under the crust with 1 Lßiøo (105 10 15 20 25 30 35 sø§ 421 CFU) of E. aeruginosa F1b4.

*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag för: gruppen 288 där N=9. Dagarna avser efter astadkommande aya brännskada och infektion. 3Renad antikropp (SO ug i 0,5 ml PBS) administrerades _ intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn-_» skada och infektion.* The percentage survival is based on the number surviving mice per group of ten animals, with the exception of: group 288 where N = 9. The days refer to the aya coming burn and infection. Purified antibody (50 μg in 0.5 ml PBS) was administered intraperitoneally two hours before the onset of burns. injury and infection.

*Renad antikropp (5 pg i 0,5 ml PBS) administrerades intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn~~ skada och infektion.Purified antibody (5 pg in 0.5 ml PBS) was administered intraperitoneally two hours before the onset of burns injury and infection.

EXEMPEL 12 Exempel 12 askadliggör framställningen av en annan mono-g hlonal humanantikropp, som reagerar med E. aeruginosa avÉ flagel1typ_b, och skydd av möss. som har immuniserats passivt med denna antikropp mot infektion med E. aerugingea vid modellen med bränd mus.EXAMPLE 12 Example 12 detoxifies the preparation of another mono-g global human antibody, which reacts with E. aeruginosa avÉ flagel1type_b, and protection of mice. who have been immunized passively with this antibody against infection with E. aerugingea at the model with burned mouse.

En transformerad cellinje framställdes och klonades i huvudsak sasom beskrivits i exempel 7, med följande undantag. En annan individ immuniserades (Pier et al. (1984) 45:309) och tjänade som B-cellkälla och utstryk- ningsnivan av E“PBMC var cirka 2099 celler per fack.A transformed cell line was prepared and cloned into essentially as described in Example 7, with the following exception. Another individual was immunized (Pier et al. (1984) 45: 309) and served as a B cell source and smear The level of E “PBMC was approximately 2099 cells per compartment.

Screeningen utfördes pa ooolade Fisher-immunotyper 1-7.-É Den slutligen isolerade cellinjen och den utsöndrade monoklonala antikroopen (lgß,-isotvp) identifieras bada ¿ med beteckningen 14C1 i följande text.The screening was performed on ooola Fisher immunotypes 1-7.-É It finally isolated the cell line and secreted it monoclonal antibodies (lgß, -isotvp) are identified both ¿ with the designation 14C1 in the following text.

Vid klinisk drovninâ var 59/59 (1002) av isolat av flagelltvp b positiva med 14C1. škyddsstudierna utfördeså sasom beskrivits för exempel 1 tabell VIII. 11 ovan och resultaten visasl 10 15 20 25 30 35 _-Fisher 2 506 421 60 TABELL VIII. kroppen 1401 av anti-+lage1ltyp b vid modellen med bränd Skvddsstudie av den monoklonala humananti- mus* ll u ß L m w m n Behandling” 1 Human-anti- -flagell b, 14C1 100 100 100 100 100 90 90 90 90 Rattdjurs- -anti-flagell b, PaF4 IVE8 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- LPS, VHB 100 40 20 20 20 20 20 20 _________._.___________.________.____________________._____.___-< *Mössen infekterades under sarskorpan med mer än 1 LD1°° (90 CFU) av E. aeruginosa F1ó4.In clinical cases, 59/59 (1002) of isolates were of flagelltvp b positive with 14C1. The safety studies were also performed as described for example 1 Table VIII. 11 above and the results are shown 10 15 20 25 30 35 _-Fisher 2 506 421 60 TABLE VIII. body 1401 of anti- + lage1ltype b in the model with burnt Conservation study of the human monoclonal mouse* ll u ß L m w m n Treatment ”1 Human-anti- -flagell b, 14C1 100 100 100 100 100 90 90 90 90 90 Steering wheel -anti-flagell b, PaF4 IVE8 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- LPS, VHB 100 40 20 20 20 20 20 20 20 _________._.___________.________._______________________.___- < * Mice were infected under the scab with more than 1 LD1 °° (90 CFU) of E. aeruginosa F1ó4.

*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag av or open PaF4 IVE8 där N=?. u Dagarna avser efter astadkommande av brännskada och infektion.* The percentage survival is based on the number surviving mice per group of ten animals, with the exception of or open PaF4 IVE8 where N = ?. u The days refer to after causing burn and infection.

°Renad antikropp (50 pg i 0,5 ml PBS) administrerades intraperitonealt tva timmar före astadkommande av brann- skada och in§ektion.Purified antibody (50 pg in 0.5 ml PBS) was administered intraperitoneally two hours before the onset of the fire injury and injection.

Av det ovan sagda ëramgar att cellinjerna enligt föreliggande uppfinning tillhandahaller medel för fram- ställning av monoklonala antikroppar och fragment därav, 10 sug 421 61 vilka är reaktiva med E. aeruginosa-flageller och kors- protektiva mot olika E. aeruginosa-stammar. Ett antal monoklonala antikroppar har överraskande isolerats, vilka var reaktiva med olika epitoper pa varje typ av flagell.From the above it appears that the cell lines according to The present invention provides means for producing status of monoclonal antibodies and fragments thereof, 10 sug 421 61 which are reactive with E. aeruginosa flagella and cross- protective against various E. aeruginosa strains. A number of monoclonal antibodies have surprisingly been isolated, which be reactive with different epitopes on each type of flagellum.

Antikropparna enligt föreliggande uppfinning medger en V mer ekonomisk och lättare framställning av pro+ylaktiska och terapeutiska beredningar för använding mot infektioner orsakade av de flesta Q. aeruginosa-stammar-L na. Vidare tillhandahåller cellinjerna antikroppar, vilka finner användning vid immunoanalyser och andra välkända förfaranden.The antibodies of the present invention allow a V more economical and easier production of pro + ylactic and therapeutic preparations for use against infections caused by most Q. aeruginosa strains-L na. Furthermore, the cell lines provide antibodies, which finds use in immunoassays and other well known procedures.

Claims

soe,421 70 15 20 25 30 35 61 PATENTKRAVsoe, 421 70 15 20 25 30 35 61 PATENTKRAV

1. Monoklonal antikropp eller bindningsfragment därav kännetecknad av att den har förmåga att specifikt reagera med en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa- bakterier till att hämma bakteriernas motilitet vilken monoklonal antikropp eller bindningsfragment därav skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa-infektion.A monoclonal antibody or binding fragment thereof characterized in that it is capable of specifically reacting with a flagellar protein epitope of Pseudomonas aeruginosa bacteria to inhibit the motility of the bacteria which monoclonal antibody or binding fragment thereof protects in vivo against Pseudomonas aerugection.

2. Monoklonal antikropp enligt krav 1, kännetecknad av, att den har förmåga att blockera bindningen till epitopen av monoklonala antikroppar producerade av cellinjer med beteckningarna ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 och CRL 9301.Monoclonal antibody according to claim 1, characterized in that it is capable of blocking the binding to the epitope of monoclonal antibodies produced by cell lines designated ATCC deposit numbers HB 9129, HB 9130, CRL 9300 and CRL 9301.

3. Monoklonal antikropp enligt krav 1, kännetecknad av att den har samma bindningsspecificitet till en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa som någon av de monoklonala anti-kropparna med ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 Och CRL 9301. 'Monoclonal antibody according to claim 1, characterized in that it has the same binding specificity to a flagellar protein epitope of Pseudomonas aeruginosa as any of the monoclonal antibodies with ATCC deposit numbers HB 9129, HB 9130, CRL 9300 and CRL 9301. '

4. Monoklonal antikropp enligt krav 3, kännetecknad av, att den är konjugerad med en markör med förmåga att till- handahålla en detekterbar signal.A monoclonal antibody according to claim 3, characterized in that it is conjugated to a marker capable of providing a detectable signal.

5. Monoklonal antikropp enligt krav 4, kännetecknad av, att markören är ett fluorescerande medel eller ett enzym.Monoclonal antibody according to claim 4, characterized in that the marker is a fluorescent agent or an enzyme.

6. Beredning av monoklonala antikroppar, kännetecknad av, att en första av dessa monoklonala antikroppar har förmåga att reagera med en flagellär proteinepitop av flagelltyp a eller flagelltyp b av Pseudomonas aeruqinosa till att hämma bakteriernas motilitet och att den monoklonala antikroppen skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruqinosa-infektion. 10 75 _20 25 30 35 esPreparation of monoclonal antibodies, characterized in that a first of these monoclonal antibodies is capable of reacting with a flagellar protein flagella or flagella type b of Pseudomonas aeruginosa to inhibit the motility of the bacteria and that the monoclonal antibody protects Ponudinosa in vivo. -infection. 10 75 _20 25 30 35 es

7. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att en andra av nämnda monoklonala antikroppar har förmåga att reagera med en flagelltyp som ej är reaktiv med nämnda första mono- klonala antikropp. išfFormulation according to claim 6, characterized in that a second of said monoclonal antibodies is capable of reacting with a type of flagella which is not reactive with said first monoclonal antibody. isp

8. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att nämnda första antikropp är en monoklonal humanantikropp. 6Formulation according to claim 6, characterized in that said first antibody is a human monoclonal antibody. 6

9. Beredning omfattande en eller flera monoklonala anti- kroppar eller bindningsfragment därav såsom definierats i krav 1, 6 eller 8 och en gammaglobulinfraktion från ånman- blodplasma och/eller ett antibiotiskt medel. á ' zA formulation comprising one or more monoclonal antibodies or binding fragments thereof as defined in claim 1, 6 or 8 and a gamma globulin fraction from human blood plasma and / or an antibiotic agent. á 'z

10. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att epitopen uppvisas av minst cirka 70% av flagellerna av typ b.@Formulation according to claim 6, characterized in that the epitope is present in at least about 70% of the flagella of type b.

ll. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att epitopen uppvisas enbart av flagellerna av typ b. 'll. Preparation according to Claim 6, characterized in that the epitope is presented only by the type b flagella.

12. Beredning enligt krav 11, kännetecknad av, att antikroppen är pan-reaktiv.Formulation according to Claim 11, characterized in that the antibody is pan-reactive.

13. Farmaceutisk beredning, kännetecknad av, att denﬁ 2 innefattar en eller flera monoklonala antikroppar eller bindningsfragment därav såsom definierats i något avÅ I kraven 1, 6 eller 8 och en fysiologiskt godtagbar bäåare.Pharmaceutical formulation, characterized in that it comprises one or more monoclonal antibodies or binding fragments thereof as defined in any one of claims 1, 6 or 8 and a physiologically acceptable carrier.

14. Farmaceutisk beredning användbar för behandling Ållar profylax av en Pseudomonas aeruginosa-infektion, känna- atc i reagerar med en aeruginosa till skyddar in vivo tecknad av, den innefattar en monoklonal antikro§p som flagellär proteinepitop av Pseudomog¿§f att hämma bakteriernas motilitet och som i mot Pseudomonas aeruginosa-infektion Ni: medel, en gammaglobulinfraktion från_human- antimikrobiellt blodplasma och en fysiologiskt godtagbar bärare. 506 421 10 15 20 25 30 35 6414. Pharmaceutical Preparation Useful for Treatment If prophylaxis of a Pseudomonas aeruginosa infection is known to react with an aeruginosa to protect in vivo, it comprises a monoclonal antibody as a flagellar protein epitope of Pseudomogaff to inhibit bacterial motility. and as against Pseudomonas aeruginosa infection Ni: agent, a gamma globulin fraction from human antimicrobial blood plasma and a physiologically acceptable carrier. 506 421 10 15 20 25 30 35 64

15. Farmaceutisk beredning enligt krav 14, kännetecknad av, att antikroppen är en monoklonal humanantikropp och att gammaglobulinfraktionen från humanblodplasma har erhållits från människor med förhöjda nivåer av immunoglobuliner, som reagerar med Pseudomonas aeruginosa-bakterier eller produkter därav.Pharmaceutical preparation according to Claim 14, characterized in that the antibody is a human monoclonal antibody and in that the gamma globulin fraction from human blood plasma has been obtained from humans with elevated levels of immunoglobulins which react with Pseudomonas aeruginosa bacteria or products thereof.

16. Farmaceutisk beredning innefattande minst två mono- klonala antikroppar, kännetecknad av, att var och en av antikropparna specifikt reagerar med en flagellär protein- epitop i olika typer av flagellärt Pseudomonas aeruginosa- protein till att hämma bakteriernas motilitet och kan behandla eller förhindra Pseudomonas aeruginosa-infektioner och att de skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa- infektion.Pharmaceutical preparation comprising at least two monoclonal antibodies, characterized in that each of the antibodies specifically reacts with a flagellar protein epitope in different types of flagellar Pseudomonas aeruginosa protein to inhibit the motility of the bacteria and can treat or prevent Pseudomonas aeruginosa. infections and that they protect in vivo against Pseudomonas aeruginosa infection.

17. Beredning enligt krav 16, kännetecknad av, att minst en av de monoklonala antikropparna är en monoklonal human- antikropp.Formulation according to Claim 16, characterized in that at least one of the monoclonal antibodies is a human monoclonal antibody.

18. Beredning enligt krav 16, kännetecknad av, att den innefattar minst en monoklonal humanantikropp med förmåga att reagera med minst en serotypisk determinant på en lippolysackarid-molekyl av Pseudomonas aeruginosa och/eller en monoklonal antikropp, som reagerar med endotoxin A.Formulation according to claim 16, characterized in that it comprises at least one human monoclonal antibody capable of reacting with at least one serotypic determinant on a lipolysaccharide molecule of Pseudomonas aeruginosa and / or a monoclonal antibody which reacts with endotoxin A.

19. Cellinje, kännetecknad av, att den producerar en mono- klonal antikropp med förmåga att specifikt reagera med en flagellär proteintyp på Pseudomonas aeruginosa-flageller av typ a eller typ b till att hämma bakteriernas motilitet och att den monoklonala antikroppen skyddar in vivo mot Pseudo- monas aeruginosa-infektion.Cell line, characterized in that it produces a monoclonal antibody capable of specifically reacting with a flagellar protein type of Pseudomonas aeruginosa flagella of type a or type b to inhibit the motility of bacteria and that the monoclonal antibody protects in vivo against Pseudo - monas aeruginosa infection.

20. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den är en hybridcellinje. 10 15 20 25 30 Qi?Cell line according to Claim 19, characterized in that it is a hybrid cell line. 10 15 20 25 30 Qi?

21. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den producerar monoklonala humanantikroppar.Cell line according to claim 19, characterized in that it produces human monoclonal antibodies.

22. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den är§ någon av cellinjerna ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 OCh CRL 9301.Cell line according to Claim 19, characterized in that it is one of the cell lines ATCC Deposit Nos. HB 9129, HB 9130, CRL 9300 and CRL 9301.

23. Sätt att producera monoklonala antikroppar, som är specifika med avseende på flagellära proteiner av Pseudomonas aeruginosa och hämmar bakteriernas motilitet och kan behandla eller förhindra Pseudomonas aeruginosa- infektioner, kännetecknat av, att man odlar minst en av cellinjerna enligt krav 22 och utvinner antikropparnå.Methods of producing monoclonal antibodies which are specific for flagellar proteins of Pseudomonas aeruginosa and inhibit bacterial motility and can treat or prevent Pseudomonas aeruginosa infections, characterized in that at least one of the cell lines according to claim 22 is cultured and the antibody is recovered.

24. Sätt att påvisa närvaron av Pseudomonas aeruginogaiiï ett prov, kännetecknat av, att man kombinerar provetimed en monoklonal antikropp till en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa och som hämmar bakteriernas mdti- litet och skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosaÄ T z infektion, och detekterar komplexbildningen.24. A method of detecting the presence of Pseudomonas aeruginogaiiï in a sample, characterized in that the sample is combined with a monoclonal antibody into a flagellar protein epitope of Pseudomonas aeruginosa and which inhibits bacterial activity and protects in vivo against Pseudomonas aeruginos .

25. Testsats för användning vid påvisande av närvaron av Pseudomonas aeruginosa-bakterier, kännetecknad av, att den innefattar en monoklonal antikroppberedning innehållånﬁe minst en monoklonal antikropp, varvid antikroppen reagerar med en typ-specifik flagellär proteinepitop av bakterierna till att hämma bakteriernas motilitet och skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa-infektion, och markörer som tillhandahåller en detekterbar signal kovalent bundna till antikroppen eller bundna till andra antikroppar, som reagerar med den monoklonala antikroppen.Test kit for use in detecting the presence of Pseudomonas aeruginosa bacteria, characterized in that it comprises a monoclonal antibody preparation containing at least one monoclonal antibody, the antibody reacting with a type-specific flagellar protein epitope of the bacteria to inhibit and protect the bacteria. vivo against Pseudomonas aeruginosa infection, and markers that provide a detectable signal covalently bound to the antibody or bound to other antibodies that react with the monoclonal antibody.