SE468816B - SET AND REAGENT SHIT FOR QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACID MOLECULES - Google Patents

Description

468 816 2 ' approximativa resultat. Likaså mäts RNA med användning av Northern-blotting eller dot-blottingmetoden. Dessa metoder är kvantitativt sett mycket inexakta (Thomas, Metods in Enzymol" lO0,sid.255-266,l983L Kända metoder, såsom Southern- och Northern blottingmetoderna, är långsamma och svåra att utföra. Eftersom de endast ger approximativa resultat är deras diagnostiska värde tveksamt i fall då det är viktigt att känna till antalet av vissa nukleinsyramolekyler per given enhet, såsom en cell. 468 816 2 'approximate results. RNA is also measured using the Northern blotting or dot blotting method. These methods are quantitatively very inaccurate (Thomas, Metods in Enzymol "l00, pp.255-266, l983L Known methods, such as the Southern and Northern blotting methods, are slow and difficult to perform. Because they give only approximate results, their diagnostic value is doubtful in cases where it is important to know the number of certain nucleic acid molecules per given unit, such as a cell.

Sandwich- eller lösningshybridiseringsmetoderna, som beskrivs i amerikanska patentet 4,486,539 och i brittiska patentansökan GB 2 169 403 är kvantitativa (Virtanen et al., Lancet l, sid. 381-383, 1983). Vid metoden enligt föreliggande uppfinning krävs dessutom en standardnukleinsyra med konstant antal kopior, som möjliggör bestämning av antalet relevanta nukleinsyramolekyler per given enhet såsom en cell, kärna, ribosom eller kromosom.The sandwich or solution hybridization methods described in U.S. Patent 4,486,539 and in British Patent Application GB 2,169,403 are quantitative (Virtanen et al., Lancet 1, pp. 381-383, 1983). In addition, the method of the present invention requires a standard nucleic acid with a constant number of copies, which enables the determination of the number of relevant nucleic acid molecules per given unit such as a cell, nucleus, ribosome or chromosome.

Föreliggande uppfinnings syfte är att åstadkomma.en korrekt och snabb kvantitativ metod för bestämning av nuklein- syramolekyler, vilken dessutom är snabbare och lättare att utföra än de som används för närvarande. Metoden kan användas för cancer och prenatal diagnostik, för detektering av ämnen vilka orsakar amplifiering av gener och för påvisning av utvecklingen av t.ex. läkemedelsresistens såväl som för bestämning av uttrycksnivån av messenger RNA. Åtminstone två bestämningar behövs enligt föreliggande upp- finning. Den ena bestämmer nukleinsyramolekylen, som kan vara närvarande i ett flertal kopior, testnukleinsyran. Den andra bestämmer den grundläggande nukleinsyramolekylen som för- delaktigt nog är närvarande i ett konstant antal, standard- nukleinsyran. I metoden enligt uppfinningen, anger en nuklein- syramolekyl en viss nukleotidsekvens på 10-12 nukleotider eller en gen innehållande flera tusen nukleotider. Den kan också avse ett messenger RNA eller en nukleotidsekvens som är 3 -450 Q14 J Vi» betydligt längre än en enda gen, dans en amplikon.The object of the present invention is to provide a correct and fast quantitative method for the determination of nucleic acid molecules, which in addition is faster and easier to perform than those currently used. The method can be used for cancer and prenatal diagnosis, for the detection of substances which cause amplification of genes and for the detection of the development of e.g. drug resistance as well as for determining the expression level of messenger RNA. At least two determinations are needed according to the present invention. One determines the nucleic acid molecule, which may be present in multiple copies, the test nucleic acid. The second determines the basic nucleic acid molecule which is advantageously present in a constant number, the standard nucleic acid. In the method of the invention, a nucleic acid molecule indicates a certain nucleotide sequence of 10-12 nucleotides or a gene containing several thousand nucleotides. It can also refer to a messenger RNA or a nucleotide sequence that is 3 -450 Q14 J Vi »significantly longer than a single gene, dancing an amplicon.

Bestämningen av test- och standardnukleinsyrorna utförs med hjälp av en annars vanlig sandwichhybridiseringsmetod som beskrivs, till exempel, i amerikanska patentet nr 4,486,539 eller en lösningshybridiseringsmetod som beskrivs i brittiska patentansökan nr GB 2 169 403. Uppfinningen avser också ett reagenskit innehållande nukleinsyrareagens, som består av åt- minstone ett testprobepar och åtminstone ett standard probepar.The determination of the test and standard nucleic acids is performed using an otherwise common sandwich hybridization method described, for example, in U.S. Patent No. 4,486,539 or a solution hybridization method described in British Patent Application No. GB 2 169 403. The invention also relates to a reagent kit containing nucleic acid reagents. at least one test probe pair and at least one standard probe pair.

Reagensen, eller proberna, som används i metoden, prepareras med användning av hybrid-DNA tekniker, från nukleinsyror som i tillräcklig grad är homologa med test- och standardnuklein- syrorna. Dessutom kan nukleinsyror, som är tillräckligt homologa, prepareras syntetiskt och halvsyntetiskt.The reagents, or probes, used in the method are prepared using hybrid DNA techniques, from nucleic acids that are sufficiently homologous to the test and standard nucleic acids. In addition, nucleic acids that are sufficiently homologous can be prepared synthetically and semi-synthetically.

Test- och standardnukleinsyrorna kan isoleras direkt från celler och identifieras med hjälp av olika hybridiserings- tekniker. Sådana test- och standardnukleinsyror är emellertid också kommersiellt tillgängliga och tillgängliga från olika genbanker. Test- och standardnukleinsyrorna kan vara antingen DNA eller RNA.The test and standard nucleic acids can be isolated directly from cells and identified using various hybridization techniques. However, such test and standard nucleic acids are also commercially available and available from various gene banks. The test and standard nucleic acids can be either DNA or RNA.

Probepar, som är lämpliga för sandwich- eller lösningshybridi- seringsmetoden, prepareras från nukleinsyror vilka i till- räcklig grad är homologa med test- och standardnukleinsyrorna, med hjälp av hybrid-DNA-tekniker. De relevanta nukleinsyrorna klyvs med hjälp av lämpliga restriktionsenzym; åtminstone två av de resulterande restriktionsfragmenten, som är belägna relativt nära varandra, klonas till åtminstone två lämpliga vektorer. Ett av fragmenten, detektorproben, märks med en lämplig detekterbar markör och det andra, infångningsproben, fixeras antingen till en lämplig bärare eller så fixeras en substans till infångningsproben, vilken substans möjliggör separation av den resulterande hybriden från hybridise- ringsblandningen med hjälp av en annan substans, t.ex. den komplementära komponenten av ett affinitetspar. 468 sis 4 - Test- och standardprobeparen kan förvaras i ett lämpligt reagenskit, i vilket test- och standardprobeparen båda är DNA eller RNA, eller så är testprobeparet DNA och standardprobe- paret RNA eller vice versa.Förbehandlingen och den ytterli- gare behandlingen av proven innan hybridiseringen och hybri- diseringsbetingelserna bör därför rättas efter de i testet använda probeparen.Probe pairs, which are suitable for the sandwich or solution hybridization method, are prepared from nucleic acids which are sufficiently homologous to the test and standard nucleic acids, using hybrid DNA techniques. The relevant nucleic acids are cleaved using appropriate restriction enzymes; at least two of the resulting restriction fragments, which are located relatively close to each other, are cloned into at least two suitable vectors. One of the fragments, the detector probe, is labeled with a suitable detectable marker and the other, the capture probe, is either fixed to a suitable carrier or a substance is fixed to the capture probe, which substance enables separation of the resulting hybrid from the hybridization mixture by another substance. , e.g. the complementary component of an affinity pair. 468 sis 4 - The test and standard sample preparations can be stored in a suitable reagent kit, in which the test and standard sample preparations are both DNA or RNA, or the test sample preparation is DNA and the standard sample RNA or vice versa. The pretreatment and further treatment of the samples before hybridization and hybridization conditions, the probe pairs used in the test should therefore be corrected.

Metoden enligt föreliggande uppfinning är speciellt lämplig för bestämning av antalet nukleinsyramolekyler direkt från cellulära homogenat. Metoden kan naturligtvis också användas för bestämning av renade eller rena nukleinsyror. Innan metoden enligt uppfinningen utförs, bör emellertid den lämpligaste förbehandlingen för nukleinsyraprovet väljas.The method of the present invention is particularly suitable for determining the number of nucleic acid molecules directly from cellular homogenates. Of course, the method can also be used to determine purified or pure nucleic acids. Before carrying out the method of the invention, however, the most suitable pretreatment for the nucleic acid sample should be selected.

Det är möjligt att utföra både DNA och RNA bestämningar med användning av metoden enligt uppfinningen. Om så är nödvändigt görs en denaturering för att erhålla enkelsträngade deoxyribo- nukleinsyror. Enkelsträngade messenger RNA molekyler, som potentiellt stör hybridiseringstestet, kan hydrolyseras, t.ex. med hjälp av alkalisk kokning. Provet denatureras inte i samband med ribonukleinsyrabestämningar, eftersom den dubbel- strängade deoxyribonukleinsyran inte ingriper i RNA bestämning. Det är naturligtvis möjligt att hejda DNA:t med deoxyribonukleas eller ändra det antingen kemiskt eller mekaniskt så att det inte kan deltaga i hybridiserings- reaktionen. I samband med DNA och RNA bestämningar måste därför en lämplig metod för ytterligare behandling av provet väljas, eller alternativt, så kan denna ytterligare behandling uteslutas. Valet av lämplig metod för tillkommande behand- lingenëü'naturligtvis beroende på metoden som användes för den preliminära behandlingen av nukleinsyraprovet. Ett flertal metoder för för- och vidarebehandling av nukleinsyraprov har beskrivits i litteraturen, vilket medför att den mest lämpliga metoden kan väljas för varje fall.It is possible to perform both DNA and RNA determinations using the method of the invention. If necessary, a denaturation is performed to obtain single-stranded deoxyribonucleic acids. Single-stranded messenger RNA molecules that potentially interfere with the hybridization test can be hydrolyzed, e.g. using alkaline boiling. The sample is not denatured in connection with ribonucleic acid determinations, as the double-stranded deoxyribonucleic acid does not interfere with RNA determination. It is, of course, possible to arrest the DNA with deoxyribonuclease or alter it either chemically or mechanically so that it cannot participate in the hybridization reaction. Therefore, in connection with DNA and RNA determinations, an appropriate method for further processing of the sample must be selected, or alternatively, this further processing can be excluded. The choice of the appropriate method for the additional treatment naturally depends on the method used for the preliminary treatment of the nucleic acid sample. A number of methods for pretreatment and further processing of nucleic acid samples have been described in the literature, which means that the most suitable method can be chosen for each case.

Bestämningar i vilka både test- och standardnukleinsyrorna är antingen DNA eller RNA, kan utföras med ett odelat prov. 41 Bestämningar i vilka testnukleinsyrorna är DNA och standard- nukleinsyrorna RNA eller vice versa, måste utföras med ett delat prov, eftersom olika metoder krävs för vidarebehandling.Determinations in which both the test and standard nucleic acids are either DNA or RNA can be performed with an undivided sample. 41 Determinations in which the test nucleic acids are DNA and the standard nucleic acids RNA or vice versa, must be performed with a split sample, as different methods are required for further processing.

Provet kan naturligtvis delas även om test- och standard- nukleinsyrorna är av samma nukleinsyratyp.The sample can of course be divided even if the test and standard nucleic acids are of the same nucleic acid type.

Själva hybridiseringstestet utförs på så sätt att den odelade provlösningen bringas i samtidig kontakt med åtminstone ett testprobepar och ett standardprobepar. Om provlösningen har delats bringas den separat i kontakt med åtminstone ett test- probepar och ett standardprobepar. I det senare fallet, bestäms mängden testnukleinsyraprov i ett reaktionskärl och mängden standardnukleinsyraprov i ett annat.The hybridization test itself is performed in such a way that the undivided sample solution is brought into simultaneous contact with at least one test sample pair and a standard sample pair. If the sample solution has been divided, it is brought into contact separately with at least one test probe pair and a standard probe pair. In the latter case, the amount of test nucleic acid sample in one reaction vessel and the amount of standard nucleic acid sample in another are determined.

Oberoende av om provet är delat eller inte får hybridisering- en äga rum under den tid och de betingelser som är mest för- delaktiga för varje enskilt fall. När reaktionen(erna) har ägt rum, separeras de resulterande test- och standardhybriderna från hybridiseringsblandningen(erna) med hjälp av bäraren, eller med hjälp av ett isoleringsämne såsom den komplementära delen av ett affinitetspar, och tvättas. Den vid test- och standardhybriderna fastsatta markören mäts och resultatet jämförs med standardkurvor. På detta sätt kan antalet nuklein- syremolekyler, som skall studeras, bestämmas per vald enhet.Regardless of whether the sample is divided or not, the hybridization may take place during the time and conditions that are most advantageous for each individual case. Once the reaction (s) has taken place, the resulting test and standard hybrids are separated from the hybridization mixture (s) by means of the carrier, or by means of an isolating agent such as the complementary part of an affinity pair, and washed. The marker attached to the test and standard hybrids is measured and the result is compared with standard curves. In this way, the number of nucleic acid molecules to be studied can be determined per selected unit.

Metoden enligt uppfinningen har praktiskt diagnostiskt värde, särskilt vid detektering av vissa typer av cancer. I små- celligt lungcarcinom, är c-myc genen ofta amplifierad och dess uttrycksnivå är väsentligen högre än i normal vävnad. Vid neuroblastom är N-myc genen amplifierad.The method according to the invention has practical diagnostic value, especially in the detection of certain types of cancer. In small cell lung carcinoma, the c-myc gene is often amplified and its expression level is significantly higher than in normal tissue. In neuroblastoma, the N-myc gene is amplified.

Metoden enligt föreliggande uppfinning kan också användas för påvisande av de mutagena eller carcinogena effekterna av vissa ämnen eller utvecklingen av läkemedelsresistens. Det är känt att selektion p g a yttre påverkan kan resultera i ökat ut- tryck av en viss gen. Vid behandling av cancer, utvecklar cellerna ett motstånd mot ett givet läkemedel genom amplifiering av den gen, vars uttrycksprodukt inaktiverar 468 sis 6 - läkemedlet. Exempel på detta är metotrexat, som inducerar amplifiering av genen för dihydrofolatreduktas (DHFR). Ett ytterligare exempel är amplifiering av genen för metallo- tionin under inflytande av kadmium.The method of the present invention can also be used to detect the mutagenic or carcinogenic effects of certain substances or the development of drug resistance. It is known that selection due to external influences can result in increased expression of a certain gene. In the treatment of cancer, the cells develop a resistance to a given drug by amplifying the gene, whose expression product inactivates the 468 sis 6 drug. An example of this is methotrexate, which induces amplification of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene. A further example is the amplification of the metallothionein gene under the influence of cadmium.

En gens uttrycksnivå har betydelse med avseende på cellens fenotyp och funktion. Detta kan undersökas genom mätning av mängden messenger-RNA, som står i relation till den därav kodade mängden protein. Transkriptionsprodukten av en onkogen bestämmer på vilket sätt den slutligen kommer att uttryckas.A gene's expression level is important with respect to the cell's phenotype and function. This can be examined by measuring the amount of messenger RNA, which is related to the amount of protein encoded thereby. The transcription product of an oncogene determines how it will eventually be expressed.

Uttrycksnivåerna av en onkogen varierar beroende på celltyp, differentieringsnivå och cellens utvecklingsfas. Vid vissa stadier i fostrets utveckling, kopieras exempelvis c-myc onkogenen snabbt, medan detta sker mycket långsamt vid ett annat stadium. Amplifieringsgraden står ofta i relation till genens uttrycksnivå, fastän den senare kan öka signifikant utan den förra. I sådana fall bestäms onkogenens roll på bästa sätt genom mätning av dess uttrycksnivå snarare än antalet kopior. I vissa fall kan kvantitativ bestämning av messenger RNA vara enklare och bekvämare än kvantifiering av själva genprodukten.Exempelvis kan c-myc onkogenen nämnas, som är ett labilt protein som snabbt koagulerar av värme.The expression levels of an oncogene vary depending on the cell type, differentiation level and cell development phase. At certain stages in fetal development, for example, the c-myc oncogene is copied rapidly, while this occurs very slowly at another stage. The degree of amplification is often related to the level of expression of the gene, although the latter can increase significantly without the former. In such cases, the role of the oncogene is best determined by measuring its expression level rather than the number of copies. In some cases, quantitative determination of messenger RNA may be simpler and more convenient than quantification of the gene product itself. For example, the c-myc oncogene may be mentioned, which is a labile protein that rapidly coagulates by heat.

Metoden enligt uppfinningen kan också användas för att identi- fiera ett flertal kromosomdefekter såsom Down's syndrom. Vid prenatal diagnostik är det också möjligt att bestämma huruvida fostret är defekt, dvs. homozygot med avseende på en viss recessiv gen.The method of the invention can also be used to identify a variety of chromosome defects such as Down's syndrome. In prenatal diagnosis, it is also possible to determine whether the fetus is defective, ie. homozygous for a particular recessive gene.

Metoden enligt uppfinningen och nukleinsyrereagensen som används i metoden beskrivs närmare nedan.The method of the invention and the nucleic acid reagents used in the method are described in more detail below.

EXEMPEL l Kvantifiering av en amplifierad onkogen 7 I J:- CN CO CO _ .x CH a) Nukleinsyrareagens och preparering av dessa STANDARDPROBER Cellstandardnukleinsyra. Genen c-Ki-rasl är närvarande i alla humana celler. Probeparen för sandwich-hybridisering preparerades genom subkloning av HindIII fragmentet av c-Ki- rasl genen, med en längd på 3¿3kb, vars restriktionsmönster har beskrivits av Chang et al” PNAS 79, sid.4848-52, 1982.EXAMPLE 1 Quantification of an amplified oncogene 7 I J: - CN CO CO _ .x CH a) Nucleic acid reagents and preparation of these STANDARD PROBLEMS Cell standard nucleic acid. The gene c-Ki-rasl is present in all human cells. The probe hybridization for sandwich hybridization was prepared by subcloning the HindIII fragment of the c-Kirasl gene, 3 kb in length, the restriction pattern of which has been described by Chang et al., PNAS 79, pp. 4848-52, 1982.

Fragmentet är'tillgängligt4 t.ex.klonat.i pBR322 plasmiden (ATCC 41032) och kan erhållas från t.ex. från ATCC culture collection.The fragment is available 4 eg cloned into the pBR322 plasmid (ATCC 41032) and can be obtained from e.g. from the ATCC culture collection.

Ytterligare behandling av cellstandardnukleinsyra. Ovan beskrivna pBR322 behandlades med restriktionsenzymerna BglII och HindIII och de resulterande fragmenten isolerades från agarosgelen; renade fragment belägna nära intill varandra subklonades i två lämpliga vektorer för preparering av detektor- och infångningsproberna.Further treatment of cell standard nucleic acid. The pBR322 described above was treated with the restriction enzymes BglII and HindIII and the resulting fragments were isolated from the agarose gel; purified fragments located close to each other were subcloned into two suitable vectors for preparation of the detector and capture probes.

Standarddetektorprobe. Ett BglII-BglII fragment med en längd på ca l.l kb, subklonades i restriktionsenzymstället för BamHI av pBR322 plasmiden och märktes med hjälp av nick-translation med l251-märkt dcTP.Standard detector probe. A BglII-BglII fragment approximately 1.1 kb in length was subcloned into the BamHI restriction enzyme site of the pBR322 plasmid and labeled by nick translation with 125 I-labeled dcTP.

Standardinfångningsprobe. BglII-HindIII fragmentet på ca 0.5 kb insattes i fagvektorernaMl3 mplO och mpll mellan restrik- tionsställena för restriktionsenzymerna BamHI och HindIII och fixerades till ett nitrocellulosafilter (150 ng DNA/dia l cm).Standard capture probe. The BglII-HindIII fragment of about 0.5 kb was inserted into the phage vectors M13 mpl0 and mp11 between the restriction sites of the restriction enzymes BamHI and HindIII and fixed to a nitrocellulose filter (150 ng DNA / dia 1 cm).

TESTPROBER ïestnukleinsyra. Ett probepar för sandwich-hybridisering preparerades från en klonad c-myc gen, som kan erhållas t.ex. från ATCC culture collection (ATCC 41010). Genens restrik- tionsmönster har beskrivits av Watt et al., PNAS 80, sid. 6307-6311, 1983. f , 8 4b8 Sšó - Ytterligare behandling av testnukleinszran. c-myc genen behandlades med restriktionsenzymerna HindIII, XbaI och Pstl och fragmenten isolerades från agarosgelen, renades och sub- klonades i lämpliga vektorer i syfte att preparera detektor- och ínfångningsproberna.TEST TEST is a nucleic acid. A probe pair for sandwich hybridization was prepared from a cloned c-myc gene, which can be obtained e.g. from the ATCC culture collection (ATCC 41010). The gene restriction pattern has been described by Watt et al., PNAS 80, p. 6307-6311, 1983. f, 8 4b8 Sšó - Further treatment of test nucleic acid. The c-myc gene was treated with the restriction enzymes HindIII, XbaI and PstI and the fragments were isolated from the agarose gel, purified and subcloned into appropriate vectors in order to prepare the detector and capture probes.

Testdetektorprobe. De enkelsträngade svansarna av HindIII-XbaI restriktionsfragmentet av c-myc genen, med en längd på 3.7 kb, gjordes dubbelsträngade med hjälp av DNA-polymeras. HindIII linkers insattes med hjälp av T4-DNA-ligas i de resulterande DNA-fragmenten med jämna ändar; efter fenolextraktion behandlades DNA:t med restriktionsenzymet HindIII. DNA- fragmentet klonades därefter i pBR322 plasmiden vid restrik- tionsstället för restriktionsenzymet HindIII och märktes med hjälp av nick-translation med 125I-märkt dCTP.Test detector probe. The single-stranded tails of the HindIII-XbaI restriction fragment of the c-myc gene, 3.7 kb in length, were double-stranded using DNA polymerase. HindIII linkers were inserted by T4 DNA ligase into the resulting even-ended DNA fragments; after phenol extraction, the DNA was treated with the restriction enzyme HindIII. The DNA fragment was then cloned into the pBR322 plasmid at the restriction site of the restriction enzyme HindIII and labeled by nick translation with 125 I-labeled dCTP.

Testinfångningsprobe. Det 1.1 kb långa XbaI-PstI fragmentet av c-myc genen klonades i fagkloningsvektorernaMl3 mpl0 och mpll mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna Xbal och Pstl och fixerades till nitrocellulosafiltret (150 ng DNA/dia 1 cm). b) Bestämning av standardkurvan Provet som användes för bestämning av standardkurvan bestod av en alkaliskt-denaturerad pBR322 klon av c-myc genen. Sandwich- hybridiseringslösningen, till vilken ovan nämnda testprober tillsattes, bestod av 4 x SSC, 1 x Denhardtlösning, 200_pg/ml herring sperm DNA och O.2% SDS. Hybridiseringen ägde rum vid 650C under 17-19 timmar, varefter filtrena tvättades i tvättlösningen (0.l x SSC 0.2% SDS) vid 50°C. Den vid sandwich-hybriderna fästa markeringen räknades därefter i en gammaräknare. 17 Tabêll 1 Prov CEN molekyler/test c-myc-filter 0 40 106 vs s X 106 190 107 340 108 2200 c) Bestämning av antalet gener.Test capture probe. The 1.1 kb XbaI-PstI fragment of the c-myc gene was cloned into the phage cloning vectors M13 mp10 and mp11 between the restriction sites of the restriction enzymes XbaI and PstI and fixed to the nitrocellulose filter (150 ng DNA / dia 1 cm). b) Determination of the standard curve The sample used to determine the standard curve consisted of an alkaline-denatured pBR322 clone of the c-myc gene. The sandwich hybridization solution, to which the above test probes were added, consisted of 4 x SSC, 1 x Denhardt solution, 200_pg / ml herring sperm DNA and 0.2% SDS. The hybridization took place at 65 ° C for 17-19 hours, after which the filters were washed in the washing solution (0.1 l SSC 0.2% SDS) at 50 ° C. The mark attached to the sandwich hybrids was then counted in a gamma counter. 17 Table 1 Sample CEN molecules / test c-myc filter 0 40 106 vs s X 106 190 107 340 108 2200 c) Determination of the number of genes.

Proven innefattade l) celler från human placenta ochífi Colo 320 celler, som kan erhållas t.ex. från ATCC culture collection (ATCC-CCC22OL DNA isolerades från båda proverna, och samma mängd cell-DNA, denaturerat genom alkalisk kokning, tillsattes till båda testerna. Alkalisk denaturering hydroly- serade allt tänkbart RNA närvarande i provet.The samples included l) cells from the human placenta and fi Colo 320 cells, which can be obtained e.g. from the ATCC culture collection (ATCC-CCC22OL DNA was isolated from both samples, and the same amount of cell DNA, denatured by alkaline boiling, was added to both assays. Alkaline denaturation hydrolyzed any conceivable RNA present in the sample.

Testet utfördes genom att både c-myc och c-Ki-rasI filtrena och de två märkta reagensen tillsattes till varje prov, vilket möjliggjorde mätning av både standard- och test-DNA för varje prov.På basis av c-Ki-rasI bestämningar, fann man att varje test innehöll samma mängd DNA och man kan dra slutsatsen att c-myc genen i Colo 320 celler är närvarande i ett ca 16-20 gånger högre kopieantal än i den normala situationen. Resulta- ten visas i tabell 2.The test was performed by adding both the c-myc and c-Ki-rasI filters and the two labeled reagents to each sample, which allowed the measurement of both standard and test DNA for each sample. it was found that each test contained the same amount of DNA and it can be concluded that the c-myc gene in Colo 320 cells is present in an approximately 16-20 times higher copy number than in the normal situation. The results are shown in Table 2.

Tabell 2 Prov c-Ki-rasï filter c-myc filter CPN* CPN* antal Humana placentaceller 486 340 107 cola 320 celler 432 3205 1.6 1 108 1% ä: i MM 468 816 10 - *) avläsningen som erhölls från det tomma filtret har dragits av från avläsningarna.Table 2 Sample c-Ki-rasï filter c-myc filter CPN * CPN * number of Human placental cells 486 340 107 cola 320 cells 432 3205 1.6 1 108 1% ä: in MM 468 816 10 - *) the reading obtained from the empty filter has been deducted from the readings.

EXEMPEL 2 Kvantifiering av amplifierad gen a) Nukleinsyrareagens och preparering av dessa STANDARDPROBER Cellstandardnukleinsyra. Kontrollnukleinsyran togs från promoterarean av musens metallotioningen, dvs. MT genen, och DNA:t omedelbart uppströms därav. Strukturen av MT genen har beskrivits av Pavlakis och Hamer, PNAS 80, sid. 397-401, 1983. Referensnukleinsyrafragmentet är tillgängligt t.ex. klonat i pBPV-MMTneo (432-12) vektorn (ATCC 37224) och kan er- hållas, t.ex. från ATCC culture collection.EXAMPLE 2 Quantification of amplified gene a) Nucleic acid reagents and preparation of these STANDARD PROBESES Cell standard nucleic acid. The control nucleic acid was taken from the promoter area of the mouse metal lotion, i.e. The MT gene, and the DNA immediately upstream thereof. The structure of the MT gene has been described by Pavlakis and Hamer, PNAS 80, p. 397-401, 1983. The reference nucleic acid fragment is available e.g. cloned into the pBPV-MMTneo (432-12) vector (ATCC 37224) and can be obtained, e.g. from the ATCC culture collection.

Ytterligare behandling av cellstandardnukleinsyra. Ovan beskrivna MT gen behandlades med restriktionsenzymerna Kpnl, BglII och EcoRI för subkloning i pATl53 plasmiden. Kpnl svansen omvandlades till en HindIII svans med en linker.Further treatment of cell standard nucleic acid. The MT gene described above was treated with the restriction enzymes KpnI, BglII and EcoRI for subcloning into the pAT153 plasmid. The Kpnl tail was transformed into a HindIII tail with a linker.

Standarddetektorprobe. EcoRI-Kpnl-(HindIII) fragmentet med längden cirka 1.2 kb och placerad uppströms av metallotionin- genens promotorarea, klonades till pATl53 plasmiden mellan restriktionsområdena för restriktionsenzymerna EcoRI och HindIII och märktes med hjälp av nick-translation med 32p- märkt nukleosidtrifosfat.Standard detector probe. The EcoRI-KpnI (HindIII) fragment, approximately 1.2 kb in length and located upstream of the promoter region of the metallothionein gene, was cloned into the pAT153 plasmid between the restriction regions of the restriction enzymes EcoRI and HindIII and labeled by nick translation with 32 P-labeled nucleoside triphosphate.

Standardinfångningsprobe. Det 0.8 kb långa Kpnl-BglII frag- mentet innefattande promotorarean av metallotioningenen och arean uppströms av denna klonades i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 mellan restriktionsområdena för restriktione- enzymerna Kpnl och BamHI och fixerades till nitrocellulosa- filtret. n ) ll 'bifi CN CX) OC --\ ON TESTPROBER Testnukleinszra. Probeparet för sandwich-hybridiseringstestet preparerades med användning av den kommersiellt tillgängliga pMTVdhfr plasmiden (Bethesda Research Laboratories, produkt nr. 5369SS), vars struktur beskrivs av Lee et al., Nature 294, sid. 228-232, 1981.Standard capture probe. The 0.8 kb KpnI-BglII fragment comprising the promoter region of the metal lotion gene and the area upstream of it was cloned into the phage vectors M13 mpl8 and M13 mpl9 between the restriction regions of the restriction enzymes KpnI and BamHI and fixed to the nitrocellulose filter. n) ll 'bi fi CN CX) OC - \ ON TESTPROBER Testnukleinszra. The probe pair for the sandwich hybridization assay was prepared using the commercially available pMTVdhfr plasmid (Bethesda Research Laboratories, Product No. 5369SS), the structure of which is described by Lee et al., Nature 294, p. 228-232, 1981.

Ytterligare behandling av testnukleinsyra. Plasmiden pMTVdhfr innehållande cDNA av dihydrofolatreduktas (DHFR) genen behandlades med restriktionsenzymerna HindIII och BglII.Further treatment of test nucleic acid. The plasmid pMTVdhfr containing the cDNA of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene was treated with the restriction enzymes HindIII and BglII.

Testdetektorprobe. HindIII-BglII fragmentet, som var 0.75 kb långt och motsvarar arean som kodar för DHFR genen av pMTVdhfr plasmiden, insattes i plasmid vektorn pATl53 mellan restrik- tionsområdena för restriktionsenzymen HindIII och BamHI och märktes med hjälp av nick-translation med 32?-märkt nukleo- sidtrifosfat.Test detector probe. The HindIII-BglII fragment, which was 0.75 kb long and corresponds to the region encoding the DHFR gene of the pMTVdhfr plasmid, was inserted into the plasmid vector pAT153 between the restriction regions of the restriction enzyme HindIII and BamHI and labeled by 32-labeled nucleo-nickel translation. side triphosphate.

Testinfångningsprobe. Ett 1.4 kb långt HindIII fragment taget från MMTV genarean av pMTVdhfr plasmiden klonades i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9. b) Bestämning av standardkurvan Provet som användes för testet var renat DNA från pMTVdhfr plasmiden. Själva testet utfördes såsom beskrivits i exempel Ib förutom att en vätskescintillationsräknare användes för räkning. Den resulterande standardkurvan visas i tabell 3.Test capture probe. A 1.4 kb HindIII fragment taken from the MMTV gene region of the pMTVdhfr plasmid was cloned into the phage vectors M13 mpl8 and M13 mpl9. b) Determination of the standard curve The sample used for the test was purified DNA from the pMTVdhfr plasmid. The test itself was performed as described in Example Ib except that a liquid scintillation counter was used for counting. The resulting standard curve is shown in Table 3.

Tabell 3 Prov cpm molekyler/test DHFR filter 0 17 105 45 3 x 105 79 107 210 468 816 12 - c) Bestämning av antalet gener Cellinjer avledda från musfibroblastcellen NIH 3T3 och tillgängliga från ATCC culture collection med numret CRL 1658, som har transfekterats med olika mängder av cDNA som motsvarar mRNA:t av DHFR genen, odlades på cellodlingsplattor och använ- des såsom prov. Cellerna lyserades med användning av natrium- dodecylsulfat och deras DNA sönderdelades genom att det trycktes igenom en fin injektionsnål från en spruta. Ett 250 pl prov motsvarande ca 105 celler togs från homogenatet och 50 pl NaOH tillsattes. Provet kokades och neutraliserades med ättiksyra och hybridiseringsblandningen. Totalvolymen var 0.5 ml. Alla ovan beskrivna prober tillsattes samtidigt och ett sik. blankfilter tillsattes såsom bakgrundskontroll. Hybridi- sering, tvättning och räkning av märkningen utfördes såsom i Exempel lb förutom att en vätskescintillationsräknare användes för räkning. Resultaten visas i tabell 4.Table 3 Sample cpm molecules / test DHFR filter 0 17 105 45 3 x 105 79 107 210 468 816 12 - c) Determination of the number of genes Cell lines derived from the mouse fibroblast cell NIH 3T3 and available from the ATCC culture collection with the number CRL 1658, which have been transfected with Various amounts of cDNA corresponding to the mRNA of the DHFR gene were grown on cell culture plates and used as samples. The cells were lysed using sodium dodecyl sulfate and their DNA was broken down by pushing through a fine syringe from a syringe. A 250 μl sample corresponding to about 105 cells was taken from the homogenate and 50 μl of NaOH was added. The sample was boiled and neutralized with acetic acid and the hybridization mixture. The total volume was 0.5 ml. All the probes described above were added simultaneously and a whitefish. blank filters were added as a background check. Hybridization, washing and counting of the label were performed as in Example 1b except that a liquid scintillation counter was used for counting. The results are shown in Table 4.

Tabell 4 Cell MT Antal celler DHFR cpm* 1 provet CPN* Antal mole- Antal kyler i 3 kopior provet Kontrollcell (utan ' 6 6 DHFR-CDNA) 182 1.05 X 10 21 < 106 - Lmje: 138 0.9 x 106 ao 3 x 1o 3 Linje n 21o 1.25 x 105 732 s x 107 40 * cpm: avläsningen från blankfiltret har dragits av MT-genen är en intern markör, som mäter antalet närvarande celler i ett prov. Resultaten visar att 106 celler i detta prov gav en MT-specifik signal på 165 + 20 cpm. DHFR-reagensen mäter mängden DHFR-cDNA. Antalet celler härleddes från den MT- specifika signalen. Det var således möjligt att bestämma antalet DHFR-cDNA kopior i olika cellinjer såsom visas i tabell 4.Table 4 Cell MT Number of cells DHFR cpm * 1 sample CPN * Number of moles- Number of coolers in 3 copies of the sample Control cell (without '6 6 DHFR-CDNA) 182 1.05 X 10 21 <106 - Lmje: 138 0.9 x 106 ao 3 x 1o 3 Line n 21o 1.25 x 105 732 sx 107 40 * cpm: the reading from the blank filter has been subtracted from the MT gene is an internal marker, which measures the number of cells present in a sample. The results show that 106 cells in this sample gave an MT-specific signal of 165 + 20 cpm. The DHFR reagent measures the amount of DHFR cDNA. The number of cells was derived from the MT-specific signal. Thus, it was possible to determine the number of DHFR cDNA copies in different cell lines as shown in Table 4.

II 13 _ 4 c fn cb ...i Tx EXEMPEL 3 Kvantifiering av messenger RNA a) Nukleinsyrareagens och preparering av dessa Med användning av de i Exempel 2 beskrivna testproberna är det också möjligt att mäta mängden mRNA som härstammar från DHFR- cDNA. Strukturen av pMTVdhfr plasmiden är beskaffad på så sätt att transkriptionen av DHFR genen börjar vid MMTV promotern.II 13 _ 4 c fn cb ... i Tx EXAMPLE 3 Quantification of messenger RNA a) Nucleic acid reagents and their preparation Using the test probes described in Example 2, it is also possible to measure the amount of mRNA derived from DHFR cDNA. The structure of the pMTVdhfr plasmid is such that transcription of the DHFR gene begins at the MMTV promoter.

Det resulterande MRNA:t är ca 1.0 kb långt. Av detta, här- stammar ca 0.25 kb från MMTV promotorarean och resten från DHFR-CDNA (Lee et al., Nature 294, sid. 228-232, 1981).The resulting MRNA is approximately 1.0 kb long. Of this, approximately 0.25 kb is derived from the MMTV promoter region and the remainder from the DHFR CDNA (Lee et al., Nature 294, pp. 228-232, 1981).

STANDARDPROBER Cellstandardnukleinsyran, standarddetektorn och standardin- fångningsproben var såsom beskrevs i Exempel 2.STANDARD PROBESES The cell standard nucleic acid, standard detector and standard capture probe were as described in Example 2.

TESTPROBER Testnukleinsyran, testdetektorn och testinfångningsproben var så beskaffade såsom beskrevs i Exempel 2. b) Bestämning av standardkurvan Provet som användes för bestämning av standardkurvan bestod av messenger RNA motsvarande dihydrofolatreduktasgenen producerad med hjälp av in vitro-transkription. Det för transkriptionen nödvändiga DNA:t preparerades genom subkloning av det 1.4 kb långa HindIII fragmentet av MMTV promotorn av pMTVdhfr plasmiden och det 0.75 kb långa HindIII-BglII fragmentet (DHFR-cDNA) bredvid varandra i pSP64 plasmiden (Promega Biotec) mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna HindIII och BamHI. RNA-provet förvarades i en o.2% SDS lösning (ag).TEST TESTS The test nucleic acid, test detector and test capture probe were as described in Example 2. b) Determination of the standard curve The sample used to determine the standard curve consisted of messenger RNA corresponding to the dihydrofolate reductase gene produced by in vitro transcription. The DNA required for transcription was prepared by subcloning the 1.4 kb HindIII fragment of the MMTV promoter of the pMTVdhfr plasmid and the 0.75 kb HindIII-BglII fragment (DHFR cDNA) side by side into the pSP64 plasmid (Promega Biotec) between the restriction sites of restriction sites. HindIII and BamHI. The RNA sample was stored in a 0.2% SDS solution (ag).

Sandwich-hybridiseringstestet utfördes såson1 beskrevs i 460 816 14 - Exemplen lb och 2b men denaturering uteslöts.The sandwich hybridization test was performed as described in Examples 1b and 2b but denaturation was omitted.

Tabell s ,Prov cpm molekyler/test DHFR filter 0 20 s X 106 ss 107 130 s x 107 390 108 ess c) Bestämning 32 antalet messenger RNA molekyler Antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar DHFR genen, bestämdes från de i Exempel 2 beskrivna cellinjerna.Table s, Sample cpm molecules / test DHFR filter 0 20 s X 106 ss 107 130 s x 107 390 108 ess c) Determination 32 number of messenger RNA molecules The number of messenger RNA molecules corresponding to the DHFR gene was determined from the cell lines described in Example 2.

Cellerna lyserades med användning av natriumdodecylsulfat och deras DNA sönderdelades något genom att de pressades från en spruta genom en fin injektionsnål. Ett 250_pl prov av homo- genatet togs, vilket motsvarade ca 5 x 106 celler. Homogenatet tillsattes därefter till sandwich-hybrídiseringstestet utan denaturering. Sandwich-hybridisering ägde rum såsom beskrevs i Exemplen 2c och lb, förutom att endast DHFR proberna tillsattes till hybridiseringslösningen. I ett likadant prov på 250 pl homogenat, bestämdes cellantalet med användning av den i Exempel 2c beskrivna MT-proben.The cells were lysed using sodium dodecyl sulfate and their DNA was slightly decomposed by being forced from a syringe through a fine injection needle. A 250 μl sample of the homogenate was taken, which corresponded to about 5 x 10 6 cells. The homogenate was then added to the sandwich hybridization test without denaturation. Sandwich hybridization took place as described in Examples 2c and 1b, except that only the DHFR probes were added to the hybridization solution. In a similar sample of 250 μl of homogenate, the cell number was determined using the MT probe described in Example 2c.

Resultaten visas i tabell 6. _Tabell 6 C811 HT Antal celler DHFR cpm* 1 Provet Cpm* Antal mole- Antal kyler i per provet cell Lies 1 300 3.5 X 106 1405 3.45 x 108 100 Liqp 11 430 4.2 1 105 4000 2 X 109 s00 V? W 463 316 *cmpz Avläsningen från blankfiltret har dragits av.The results are shown in Table 6. _Table 6 C811 HT Number of cells DHFR cpm * 1 Sample Cpm * Number of moles- Number of moles in per sample cell Lies 1 300 3.5 X 106 1405 3.45 x 108 100 Liqp 11 430 4.2 1 105 4000 2 X 109 s00 V? W 463 316 * cmpz The reading from the blank filter has been subtracted.

Resultaten visade att cellinje I producerade per cell ca 100 messenger RNA molekyler från DHFR generna och cellinje II producerade ca 500 messenger RNA molekyler från DHFR-generna.The results showed that cell line I produced about 100 messenger RNA molecules from the DHFR genes per cell and cell line II produced about 500 messenger RNA molecules from the DHFR genes.

EXEMPEL 4 Kvantifiering av amplifierad gen med hjälp av lösningshybridi- sering a) Nukleinsyrareagens och preparering av dessa STANDARDPROBER Cellstandardnukleinsyra, standarddetektor, standardinfång- ningsprobe var så beskaffade såsom beskrivits i Exempel 2. Det 1.2 kb långa EcoRI-KpnI-(HindIII) fragmentet i pATl53 märktes med hjälp av nick-translation med l25I-märkt deoxycytidin. De 0.8 kb långa KpnI-BglII fragmenten i Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 modifierades med biotin med användning av Phot0probeTM reagenset (Vector laboratories, CA, USA, produkt nr SP-1000).EXAMPLE 4 Quantification of Amplified Gene by Solution Hybridization a) Nucleic Acid Reagents and Preparation of These STANDARD PROBESES Cell standard nucleic acid, standard detector, standard capture probe were as described in Example 2. The 1.2 kb EcoRI-KplI fragment (HindIII) was labeled by nick translation with 125 I-labeled deoxycytidine. The 0.8 kb KpnI-BglII fragments in M13 mpl8 and M13 mpl9 were modified with biotin using the Phot0probeTM reagent (Vector Laboratories, CA, USA, Product No. SP-1000).

TESTPROBER Testnukleinsyran, testdetektorn och testinfångningsproben var så beskaffade såsom beskrivits i Exempel 2. Det 0.75 kb långa HindIII-BglII fragmentet i pATl53 var märkt med l25I-märkt deoxycytidin. Det 1.4 kg långa HindIII fragmentet i Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 biotinylerades med användning av PhotoprobeTM såsom ovan. b) Bestämning av standardkurvorna En cellstandardkurva preparerades med användning av en känd mängd celler, från vilka hybridiseringssignalen mättes med an- vändning av standardproberna för igenkänning av MT-genen. En standardkurva för testnukleinsyra preparerades med pMTVdhfr 468 ere 16 - plasmiden och testproberna som känner igen denna plasmid.TEST PROBESES The test nucleic acid, test detector and test capture probe were as described in Example 2. The 0.75 kb HindIII-BglII fragment in pAT153 was labeled with 125 I-labeled deoxycytidine. The 1.4 kg HindIII fragment in M13 mpl8 and M13 mpl9 was biotinylated using PhotoprobeTM as above. b) Determination of the standard curves A cell standard curve was prepared using a known amount of cells, from which the hybridization signal was measured using the standard probes for recognition of the MT gene. A standard curve for test nucleic acid was prepared with the pMTVdhfr 468 ere 16 plasmid and the test probes recognizing this plasmid.

Hybridiseringarna utfördes i 200,ul av en lösning innehållande 0.6 M NaCl, 20 mM fosfatbuffert, pH 7.5, l mM EDTA, 4% polyetylenglykol (PEG 6000) i 1.5 timmar vid 700C. Efter reaktionen tillsattes 50¿U.streptavidin-agarose(Betheseda Research Laboratories, Maryland, USA, produktnr. 5942SA), och 1 M NaCl, l0mM natriumfosfat, pH 7.5, 1 mM EDTA tillsattes till en slutlig volym på 500_pl. Hybriderna uppsamlades på streptavidin-agarosen vid 37°C i 15 min. Agarosen tvättades en gång i 5 minuter med den buffrade l M NaCl-lösningen vid 37°C och två gånger i 2 minuter med 15 mM NaCl, 1.5 mM natrium- citrat vid 55°C. Mängden bundna hybrider bestämdes genom att agarosen mättes i en gammaräknare.(Syvänen et al” Nucleic Acids Res. 14, 5037-5048, 1986). Resultaten visas i tabell 7 och 8.The hybridizations were performed in 200 μl of a solution containing 0.6 M NaCl, 20 mM phosphate buffer, pH 7.5, 1 mM EDTA, 4% polyethylene glycol (PEG 6000) for 1.5 hours at 70 ° C. After the reaction, 50 μl of streptavidin-agarose (Betheseda Research Laboratories, Maryland, USA, Product No. 5942SA) was added, and 1 M NaCl, 10 mM sodium phosphate, pH 7.5, 1 mM EDTA was added to a final volume of 500 μl. The hybrids were collected on the streptavidin agarose at 37 ° C for 15 minutes. The agarose was washed once for 5 minutes with the buffered 1 M NaCl solution at 37 ° C and twice for 2 minutes with 15 mM NaCl, 1.5 mM sodium citrate at 55 ° C. The amount of bound hybrids was determined by measuring the agarose in a gamma counter (Syvänen et al., Nucleic Acids Res. 14, 5037-5048, 1986). The results are shown in Tables 7 and 8.

Tabell 7 .Prov CEN celler/test MT prober o,a X 106 162 1,6 x 106 216 3 x 106 zss Tabell 8 PIOV 52111 molekyler/test DHFR prober 106 148 s x 106 394 s x 1o7 2240 fi* J:- CN CO 'D .a J\ 17 c) Bestämning av antalet gener Prov av de i Exempel 2 beskrivna cellinjerna behandlades på liknande sätt, förutom att volymen per prov, motsvarande approximativt 2 x 106 celler, var 125;11. Bestämningen av antalet celler och antalet testnukleinsyramolekyler utfördes i separata kärl genom tillsats av cellprovet, lämpliga detektor- och infångningsprober, och komponenterna i hybridi- seringsblandningen till en slutlig volym på 200141. Kontroll- analyser utan cellstandard eller test-DNA inkluderades.Table 7.Sample CEN cells / test MT probes o, a X 106 162 1.6 x 106 216 3 x 106 zss Table 8 PIOV 52111 molecules / test DHFR probes 106 148 sx 106 394 sx 1o7 2240 fi * J: - CN CO C) Determination of the number of genes Samples of the cell lines described in Example 2 were treated in a similar manner, except that the volume per sample, corresponding to approximately 2 x 10 6 cells, was 125; 11. The determination of the number of cells and the number of test nucleic acid molecules was performed in separate vessels by adding the cell sample, appropriate detector and capture probes, and the components of the hybridization mixture to a final volume of 200141. Control assays without cell standard or test DNA were included.

Hybridisering, uppsamling av hybrider, tvättning och mätning utfördes såsom i exempel 4. Resultaten avlästes från standard- kurvor, som preparerades parallellt såsom beskrevs i Exempel 4b. Resultaten visas i tabell 9.Hybridization, hybridization, washing and measurement were performed as in Example 4. The results were read from standard curves, which were prepared in parallel as described in Example 4b. The results are shown in Table 9.

Tabell 9 Cell HT DHFR cpm* Antal celler cpm* Antal Antal i provet molekyler kopior ' ' - i provet 6 5 Kbntrollcell 253 2.3 x 10 73 < 10 - . . 6 6 Liqp I 210 1.5 x 10 233 3.8 x 10 3 _ . 6 7 Liqp II 237 2.1 x 10 3059 8.8 x 10 42 * cpm: värden från kontrollanalyser utan cellstandard eller testnukleinsyra har dragits av.Table 9 Cell HT DHFR cpm * Number of cells cpm * Number Number in the sample molecules copies '' - in the sample 6 5 Kbntrollcell 253 2.3 x 10 73 <10 -. . 6 6 Liqp I 210 1.5 x 10 233 3.8 x 10 3 _. 6 7 Liqp II 237 2.1 x 10 3059 8.8 x 10 42 * cpm: values from control assays without cell standard or test nucleic acid have been subtracted.

Claims (13)

4> O\ :n OT ...<- O | 18 PATENTKRAV4> O \: n OT ... <- O | 18 PATENT REQUIREMENTS 1. Kvantitativt sätt för bestämninganrnukleinsyramolekyler med en sandwich- eller lösningshybridiseringsmetod, k ä n n e - t e c k n a t av att antalet av en given nukleinsyramolekyl per given biologisk enhet bestäms genom jämförelse mellan antalet testnukleinsyramolekyler, som potentiellt är närvarande i flera kopior i den biologiska enheten, och antalet valda standardnuk- leinsyramolekylery som fördelaktigt nog är närvarande i ett konstant antal per samma biologiska enhet.Quantitative method for determining nucleic acid molecules by a sandwich or solution hybridization method, characterized in that the number of a given nucleic acid molecule per given biological unit is determined by comparing the number of test nucleic acid molecules potentially present in several copies and the number in the biological unit selected standard nucleic acid molecules that are advantageously present in a constant number per same biological unit. 2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att de i provet närvarande nukleinsyramolekylerna a) omvandlas, om så är nödvändigt, till en form så att de kan deltaga i hybridiseringsreaktionen, b) alla tänkbara nukleinsyror, som potentiellt stör hybridiseringsreaktionen, om så är nödvändigt omvandlas till en form så att de inte kan inverka på hybridiseringstestet, c) bringas i kontakt, antingen odelade, eller om så är nödvändigt delade, med åtminstone ett testprobepar som i tillräcklig grad är homologt med den potentiellt i flera kopior närvarande nukleinsyran och med åtminstone ett valt och lämpligt standardprobepar som i tillräcklig grad är homologt med nuklein- syramolekylen, som fördelaktigt nog är närvarande i ett konstant antal, varvid detektorproberna av nämnda testprobepar och nämnda standardprobepar märks med en lämplig, detekterbar markör och infångningsproberna har fixerats till en lämplig bärare eller så fixeras en substans till nämnda infàngningsprober, vilket möjliggör isolering av de resulterande hybriderna, d) efteratthybridiseringsreaktionen,ellerreaktionerna, har ägt rum separeras testhybriden och standardhybriden, om så är nödvändigt, och nämnda fastsatta markör mäts, varvid antalet nukleinsyramolekyler per given enhet erhålls genom att antalet test och standardnukleinsyror jämförs. 19 '468 SHS2. A method according to claim 1, characterized in that the nucleic acid molecules present in the sample a) are converted, if necessary, into a form so that they can participate in the hybridization reaction, b) all conceivable nucleic acids which potentially interfere with the hybridization reaction, if so is necessary to be converted into a form so that they can not affect the hybridization test, c) contacted, either undivided, or if necessary divided, with at least one test probe pair that is sufficiently homologous to the potentially multiple copy nucleic acid; and with at least one selected and suitable standard probe pair that is sufficiently homologous to the nucleic acid molecule, which is advantageously present in a constant number, the detector probes of said test probe pairs and said standard probe pairs being labeled with a suitable, detectable marker and the capture probes being suitably fixed to carrier or a substance is fixed to said capture probes, which makes it possible Isolation of the resulting hybrids, d) after the hybridization reaction, or reactions, has taken place, the test hybrid and the standard hybrid are separated, if necessary, and said attached marker is measured, obtaining the number of nucleic acid molecules per given unit by comparing the number of tests and standard nucleic acids. 19 '468 SHS 3. Sätt enligt krav 1 och 2, k ä n n e t e c k n a t av att test- och standardnukleinsyrorna är deoxyribonukleinsyror.3. A method according to claims 1 and 2, characterized in that the test and standard nucleic acids are deoxyribonucleic acids. 4. Sätt enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t av att testnukleinsyran är ribonukleinsyra och standardnukleinsyran är deoxyribonukleinsyra.4. A method according to claims 1 and 2, characterized in that the test nucleic acid is ribonucleic acid and the standard nucleic acid is deoxyribonucleic acid. 5. Sätt enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t av att test- och standardnukleinsyrorna är ribonukleinsyror.5. A method according to claims 1 and 2, characterized in that the test and standard nucleic acids are ribonucleic acids. 6. Sätt enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t av att testnukleinsyran är deoxyribonukleinsyra och standardnuklein- syran är ribonukleinsyra.6. A method according to claims 1 and 2, characterized in that the test nucleic acid is deoxyribonucleic acid and the standard nucleic acid is ribonucleic acid. 7. Sätt enligt krav 1, 2, 3 och4, k ä n n e t e c k n a t av att detektorproben av standardprobeparet - en hybridplasmid innefattande ett l.l kb BglII-BglII fragment av HindIII fragmentet av den humana c-Ki-rasl genen, varvid nämnda HindIII fragment klonats i pBR322 plasmiden och nämnda BglII- BglII fragment är subklonats i restriktionsstället för restriktionsenzymet BamHI i pBR322 plasmiden - och infång- ningsproberna - hybridfager innefattande ett 0.5 kb BglII- HindIII fragment av HindIII fragmentet av den humana c-Ki-rasI genen, varvid nämnda HindIII fragment klonats j. pBR322 plasmiden och nämnda BglII-HindIII fragment subklonas i fagvektorerna Ml3 mplO och Ml3 mpll mellan restriktione- ställena för restriktionsenzymerna BamHI och HindIII - bringas, antingen individuellt eller tillsammans med testprobeparet, i kontakt med ett odelat, eller om så är nödvändigt delat, nukleinsyraprov.A method according to claims 1, 2, 3 and 4, characterized in that the detector probe of the standard probe pair - a hybrid plasmid comprising a 11 kb BglII-BglII fragment of the HindIII fragment of the human c-Ki rasl gene, said HindIII fragment being cloned into The pBR322 plasmid and said BglII-BglII fragment are subcloned into the restriction site of the restriction enzyme BamHI in the pBR322 plasmid - and the capture probes - hybrid phage comprising a 0.5 kb BglII-HindIII fragment of the HindIII fragment of the human c-Ki rasII gene. cloned the pBR322 plasmid and said BglII-HindIII fragments are subcloned into the phage vectors M13 mplO and M13 mp11 between the restriction sites of the restriction enzymes BamHI and HindIII - brought, either individually or together with the test probe pair, into contact with each other if necessary. , nucleic acid test. 8. Sätt enligt krav 1, 2, 3 och 4, k ä n n e t e c k n a t av att detektorproben och standardprobeparet - en hybrid- plasmid innefattande ett 1.2 kb EcoRI-KpnI(HindIII) fragment uppströms från promotorarean av musens metallotioningen, vilket fragment har har subklonats i pATl53 plasmiden mellan 4f58 8¶ 6 20 ' restriktionsställena för restriktionsenzyrnerna EcoRI och HindIII - och infångningsproberna - hybridfager innefattande ett 0.8 kb KpnI-BglII fragment från promotorarean av metall- lotioningenen och arean uppströms av denna, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna Kpnl och BamHI - bringas, antingen individuellt eller tillsammans med test- probeparet,í.kontakt med ett odelat, eller om så är nödvän- digt delat nukleinsyraprov.Method according to claims 1, 2, 3 and 4, characterized in that the detector probe and the standard probe pair - a hybrid plasmid comprising a 1.2 kb EcoRI-KpnI (HindIII) fragment upstream of the promoter area of the mouse metal lotion, which fragment has been subcloned into The pAT153 plasmid between the restriction sites of the restriction enzymes EcoRI and HindIII - and the capture probes - hybrid phage comprising a 0.8 kb KpnI-BglII fragment from the promoter region of the metal lotion gene and the area upstream thereof, which fragment has been subcloned into mpl9 between the restriction sites of the restriction enzymes Kpn1 and BamHI - is brought, either individually or together with the test probe pair, into contact with an undivided, or if necessary, divided nucleic acid sample. 9. Sätt enligt krav l, 2, 3, 6, 7 och 8, k ä n n e t e c k- n atzav att,i.syfte att bestämma amplifieringsgraden av c- myc onkogenen och/eller antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar denna gen, detektorproben av testprobeparet - en hybridplasmid innefattande ett 3.7 kb HindIII-Xbal fragment av c-myc genen, vilket fragmentet har subklonats i pBR322 plasmiden vid restriktionsstället för restriktionsenzymet HindIII - och infångningsproberna - hybridfager innefattande ett 1.1 kb XbaI-PstI fragment av c-myc genen, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mplO och Ml3 mpll mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna XbaI och PstI - bringas, antingen individuellt eller tillsammans med standard- probeparet, i kontakt med ett odelat, eller om så är nödvän- digt ett delat, nukleinsyraprov.9. A method according to claims 1, 2, 3, 6, 7 and 8, characterized in that, for the purpose of determining the degree of amplification of the c-myc oncogene and / or the number of messenger RNA molecules corresponding to this gene, the detector probe of the test probe pair - a hybrid plasmid comprising a 3.7 kb HindIII-XbaI fragment of the c-myc gene, which fragment has been subcloned into the pBR322 plasmid at the restriction enzyme HindIII restriction site - and the capture probes - hybrid phage comprising a 1.1 kb XbaI c-Pc gene , which fragment has been subcloned into the phage vectors M13 mpl0 and M13 mp11 between the restriction sites of the restriction enzymes XbaI and PstI - is brought, either individually or together with the standard probe pair, into contact with an undivided, or if necessary a split, nucleic acid sample. 10. Sätt enligt krav 1, 2, 3, 6, 7 och 8, k ä n n e t e c k- n a t av att, i syfte att bestämma amplifieringsgraden av di- hydrofolatreduktas eller DHFR-genen och/eller antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar denna gen, detektor- proben av testprobeparet, en hybridplasmid innefattande ett 0.75 kb HindIII-BglII fragment som kodar för DHFR-genen av pMTVdhfr plasmiden, vilket fragment har subklonats i pATl532 plasmidvektorn mellan restriktionsställena för restriktions- enzymerna HindIII och BamHI - och infångningsproberna - hybridfager innefattande ett 1.4 kb HindIII fragment av MMTV- genarean av pMTVdhfr-plasmiden, vilket fragment har sub- klonats i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 vid restrik- tionsstället för restriktionsenzymet HindIII - bringas, w 21 468 Efiu antingen individuellt eller tillsammans med standardprobe- paret, i kontakt med ett odelat, eller om så är nödvändig: delat, nukleinsyraprov.10. A method according to claims 1, 2, 3, 6, 7 and 8, characterized in that, in order to determine the degree of amplification of the dihydrofolate reductase or the DHFR gene and / or the number of messenger RNA molecules corresponding thereto, gene, the detector probe of the test probe pair, a hybrid plasmid comprising a 0.75 kb HindIII-BglII fragment encoding the DHFR gene of the pMTVdhfr plasmid, which fragment has been subcloned into the pAT1532 plasmid vector between the restriction sites of the restriction enzymes HindIII and Bam a 1.4 kb HindIII fragment of the MMTV gene region of the pMTVdhfr plasmid, which fragment has been subcloned into the phage vectors M13 mpl8 and M13 mpl9 at the restriction site of the restriction enzyme HindIII - is brought, w 21 468 Efiu either individually or together with the standard probe, in contact with an undivided, or if necessary: divided, nucleic acid sample. 11. ll. Reagenskit för kvantitativ bestämning av nukleinsyra- molekyler, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda kit innehåller åtminstone ett testprobepar och åtminstone ett standardprobepar, varvid detektorproberna av både testprobe- paret och standardprobeparet är märkta med en lämplig markör, och varvid infångningsproberna har fixerats till en lämplig bärare eller också har en substans fixerats till nämnda infångningsprober,_vilket möjliggör isolering av sandwichhybrider.11. ll. Reagent kits for quantitative determination of nucleic acid molecules, characterized in that said kits contain at least one test probe pair and at least one standard probe pair, the detector probes of both the test probe and the standard probe pair being labeled with a suitable marker, and having capture traps having or a substance has been fixed to said capture probes, which enables the isolation of sandwich hybrids. 12. Reagenskit enligt krav ll, k ä n n e t ecrk n a t av att detektorproben av testprobeparet, som används för bestämning av amplifieringsgraden av c-myconkogenen och/eller antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar denna gen, är en hybridplasmid innefattande ett 3.7 kb HindIII-Xbal restriktionsfragment av c-myc genen, vilket fragment har sub- klonats i pBR322 plasmiden vid restriktionsstället för restriktionsenzymet HindIII, och infångningsproberna är hybridfager innefattande ett l.l kb XbaI-PstI fragment av c~ myc genen, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mplO och H13 mpll mellan restriktionsställena för restrik- tionsenzymerna XbaI och PstI, och detektorproben av standard- probeparet är ett l.l kb BglII-BglII fragment av HindIII fragmentet av den humana c-Ki-rasI genen, vilket HindIII fragmentet har klonats i pBR322 plasmiden och nämnda BglII- BglII fragment har subklonats i pBR322 plasmiden vid restrik~ tionsstället för restriktionsenzymet BamHI, och infångnings- proberna är hybridfager innefattande ett 0.5 kb BglII-HindIII fragment av HindIII-fragmentet av c-Ki-rasl genen, varvid nämnda HindIII fragment har subklonats i pBR322 plasmiden av c-Ki-rasI genen, och nämnda BglII-HindIII fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mplO och Ml3 mpll mellan restriktionsställena för restrik-tionsenzymerna BamHI och HindIII. 468 816 22 -Reagent kit according to claim 11, characterized in that the detector probe of the test probe pair used to determine the degree of amplification of the c-myconcogen and / or the number of messenger RNA molecules corresponding to this gene is a hybrid plasmid comprising a 3.7 kb HindIII XbaI restriction fragment of the c-myc gene, which fragment has been subcloned into the pBR322 plasmid at the restriction site of the restriction enzyme HindIII, and the capture probes are hybrid phage comprising a 11 kb XbaI-PstI fragment of the c-myc gene, which fragment has been subcloned into the phage vectors M H13 mp11 between the restriction sites of the restriction enzymes XbaI and PstI, and the detector probe of the standard probe pair is a 11 kb BglII-BglII fragment of the HindIII fragment of the human c-Ki-rasI gene, which HindIII fragment has been cloned into the pBR322 plasmid and BglII fragments have been subcloned into the pBR322 plasmid at the restriction site of the restriction enzyme BamHI, and capture the probes are hybrid phage comprising a 0.5 kb BglII-HindIII fragment of the HindIII fragment of the c-Ki-rasl gene, said HindIII fragment being subcloned into the pBR322 plasmid of the c-Ki-rasI gene, and said BglII-HindIII fragment being subcloned into the phage vectors M13 mplO and M13 mp11 between the restriction sites of the restriction enzymes BamHI and HindIII. 468 816 22 - 13. Reagenskit enligt krav ll, k ä n n e t e c k n a t av att detektorproben av testprobeparet, som används vid bestämning av amplifieringsgraden av dehydrofolatreduktaset eller DHFR- genen och/eller antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar denna gen, är en hybridplasmid innefattande ett Ö.75 kb HindIII-BglII fragment, som kodar för DHFR-genen av pMTVdhfr plasmiden, vilket fragment har subklonats i pATl53 plasmid- vektorna mellan restriktionsställena för restriktione- enzymerna Hindlll och BamHI, och infångningsproberna är hybridfager innefattande ett l.4 kb HindIII fragment av MMTV genarean av pMTVdhfr-plasmiden, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 vid restriktionsstället för restriktionsenzymet HindIII, och detektorproberna av standardprobeparet är en hybridplasmid innefattande ett 1.2 EcoRI-Kpnl fragment uppströms från promotorarean av musens metallotioningen, vilket fragment har subklonats i pATl53 plasmiden mellan restriktionsställena för restriktionsenzy- merna EcoRI och HindIII, och infångningsproberna är hybrid- fager innefattande ett 0.8 kb KpnI-BglII fragment av metallo- tioningenen från promotorarean och arean uppströms av denna, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna KpnI och BamHI.Reagent kit according to claim 11, characterized in that the detector probe of the test probe pair used in determining the degree of amplification of the dehydrofolate reductase or DHFR gene and / or the number of messenger RNA molecules corresponding to this gene is a hybrid plasmid comprising an Ö.75 kb HindIII-BglII fragments encoding the DHFR gene of the pMTVdhfr plasmid, which fragment has been subcloned into the pAT153 plasmid vectors between the restriction sites of the restriction enzymes HindIII and BamHI, and the capture probes are hybrid phages comprising a 1.4 kb HindIII fragment of the MMTV gene fragment the pMTVdhfr plasmid, which fragment has been subcloned into the phage vectors M13 mpl8 and M13 mpl9 at the restriction site of the restriction enzyme HindIII, and the detector probes of the standard probe pair is a hybrid plasmid comprising a 1.2 EcoRI-KpnI fragment upstream of the metal ring restriction sites for res the traction enzymes EcoRI and HindIII, and the capture probes are hybrid phage comprising a 0.8 kb KpnI-BglII fragment of the metallothionein gene from the promoter region and the area upstream thereof, which fragment has been subcloned into the phage vectors M13 mpl8 and M13 mpl9 between the restriction sites and BamHI.