SE468480B - Modified thioredoxin and its use - Google Patents
Modified thioredoxin and its useInfo
- Publication number
- SE468480B SE468480B SE9101586A SE9101586A SE468480B SE 468480 B SE468480 B SE 468480B SE 9101586 A SE9101586 A SE 9101586A SE 9101586 A SE9101586 A SE 9101586A SE 468480 B SE468480 B SE 468480B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- thioredoxin
- amino acid
- protein
- disulfide
- gly
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
468 480 10 15 20 25 30 35 2 av denaturerade, ickeveckade reducerade proteiner som modeller. Det klassiska modellsystemet är ribonukleas A (RNase). Studier av ribonukleas har lett till upptäckten av PDI som ett luminalt, endoplasmatiskt reticulum-protein i eukaryota celler katalyserande disulfidutbyte och bild- ning av nativa disulfider. In vivo-oxidanten vid bildning av disulfider fràn ditioler är emellertid okänd. 468 480 10 15 20 25 30 35 2 of denatured, unfolded reduced proteins such as models. The classic model system is ribonuclease A (RNase). Studies of ribonuclease have led to the discovery of PDI as a luminal, endoplasmic reticulum protein in eukaryotic cells catalyzing disulfide exchange and imaging native disulfides. The in vivo oxidant in formation of disulfides from dithiols is, however, unknown.
Nyliga utvecklingar av rekombinant teknik möjliggör konstruktion och expression i bakterier, jäst eller andra system av vilken som helst given sekvens av DNA kodande för ett känt eller modifierat protein. Denna procedur är av stor biomedicinsk betydelse, vilket kan exemplifieras genom rekombinant produktion av insulin, insulinliknande tillväxtfaktorer, tillväxthormon, vävnadsplasminogenakti- vator, interferoner, faktor VIII och mànga andra prote- iner. Eftersom huvuddelen av dessa biomedicinskt intres- santa proteiner innehåller ett otal disulfidbindningar kompliceras pà ett allvarligt sätt den allmänna produk- tionen i bakterier, som är ekonomiskt gynnsam, genom bild- ningen av non-nativa, ofta aggregerade och olösliga pro- teiner. Processen kräver därför endera en veckning in vitro eller produktionen mäste utföras i eukaryota cell- system med mycket högre kostnader. Idealiskt skulle pro- duktion av ett rekombinant protein i en bakterieliknande Escherichia coli involvera en konstruktion, där protein- veckning och nativ disulfidbildning skulle uppträda. Al- ternativt skulle en effektiv in vitro-process för alstring av höga utbyten av nativt veckat disulfidbundet protein tillämpas.Recent developments in recombinant technology enable construction and expression in bacteria, yeast or others system of any given sequence of DNA encoding for a known or modified protein. This procedure is of great biomedical significance, which can be exemplified by recombinant insulin production, insulin-like growth factors, growth hormone, tissue plasminogen activity vectors, interferons, factor VIII and many other iner. Since the majority of these biomedical interests santa proteins contain innumerable disulfide bonds seriously complicates the general production of in bacteria, which is economically favorable, by imaging the development of non-native, often aggregated and insoluble pots. The process therefore requires either a fold-in in vitro or production must be performed in eukaryotic systems with much higher costs. Ideally, the production of a recombinant protein in a bacterial-like manner Escherichia coli involve a construct in which protein creasing and native disulfide formation would occur. Al- alternatively, an in vitro production process would be efficient of high yields of native pleated disulfide-linked protein apply.
Proteindisulfidisomeras.Protein disulfide isomerase.
Den mekanism som innebär bildning av nativa disulfi- der är en nätoxidation, där två tiolgrupper bildar en di- sulfid och avger två protoner och två elektroner (Reaktion 1). + 2 H+ + 2 e (1) R-(SH)2 ----- --> RS 2 10 15 20 25 30 35 _t> O\ 03 h O) C) 3 In vivo-oxidanten i denna reaktion är okänd. In vitro-system utnyttjar endera syre i luft som en terminal- oxidant resulterande i en långsam process eller utnyttjar en redox-buffert sammansatt av exempelvis glutation och glutationdisulfid (GSH-GSSG). De principiella reaktionerna i denna process är tiol-disulfidutbytet och den för när- varande tillgängliga kunskapen visar, att nativa disul- fider i ett protein bildas genom en utbytesprocess via non-nativa disulfider under veckning (Creighton, 1990).The mechanism by which the formation of native disulfide is a network oxidation, where two thiol groups form a di- sulfide and emits two protons and two electrons (Reaction 1). + 2 H + + 2 e (1) R- (SH) 2 ----- -> RS 2 10 15 20 25 30 35 _t> O\ 03 hrs O) C) 3 The in vivo oxidant in this reaction is unknown. In in vitro systems use either oxygen in air as a terminal oxidant resulting in a slow process or utilizing a redox buffer composed of, for example, glutathione and glutathione disulfide (GSH-GSSG). The principal reactions in this process, the thiol disulfide yield and the available knowledge shows that native disul- fider in a protein is formed by an exchange process via non-native disulfides during folding (Creighton, 1990).
PDI katalyserar disulfidisomerisering till bildning av en slutstruktur med korrekta disulfider. Enzymet är ett 57 kDa surt protein beläget i lumen av det endoplasmatiska reticulum (ER). Kloning av PDI har avslöjat att den inne- håller två domäner om ca 100 rester med stark likhet med tioredoxin (Edman et al., 1985). Detta antyder, att det aktiva stället i PDI och proteinets mekanism var likartat med tioredoxin. Detta bevisades genom upptäckten att PDI är ett substrat för mammaliskt tioredoxinreduktas (Lund- ström och Holmgren, 1990). Tioredoxin har långtgående karakteriserats under loppet av 25 år, och dess primär- struktur och tredimensionella struktur är känd från rönt- genkristallografi, 2D NMR~och ett omfattande proteinkon- struktionsarbete (beträffande referenser se Holmgren, 1985, 1989 och Dyson et al., 1990; Eklund et al., 1991). I en serie av tidigare publikationer har det visats, att tioredoxin är ett kraftfullt proteindisulfidreduktas vid koppling till NADPH och tioredoxinreduktas (Holmgren, 1984). Tioredoxin innehåller en aktiv redoxdisulfid i dess oxiderade form med aminosyrasekvensen Trp-Cys-Gly-yro-Cys.PDI catalyzes disulfide isomerization to form a final structure with correct disulfides. The enzyme is a 57 kDa acidic protein located in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). Cloning of PDIs has revealed that it holds two domains of about 100 residues with strong similarity to thioredoxin (Edman et al., 1985). This suggests that active site in the PDI and the mechanism of the protein was similar with thioredoxin. This was proved by the discovery of the PDI is a substrate for mammalian thioredoxin reductase (Lund- stream and Holmgren, 1990). Thioredoxin has far-reaching characterized over the course of 25 years, and its primary structure and three-dimensional structure are known from gene crystallography, 2D NMR och and a comprehensive protein con- structural work (for references see Holmgren, 1985, 1989 and Dyson et al., 1990; Eklund et al., 1991). IN a series of previous publications has shown that thioredoxin is a powerful protein disulfide reductase at coupling to NADPH and thioredoxin reductase (Holmgren, 1984). Thioredoxin contains an active redox disulfide in its oxidized form with the amino acid sequence Trp-Cys-Gly-yro-Cys.
Molekylen är så veckad, att en utskjutande del bildas innehållande det aktiva stället inne i en hydrofob yta involverande Trp-31, Cys-32, Pro-34, Pro-76, Gly-92, Ala- 93. Denna yta är konserverad i tioredoxiner från alla ar- ter (Eklund et al., 1991). Mekanismen för tioredoxin har föreslagits involvera en transcient blandad disulfid mel- lan Cys-32 och proteindisulfiden. Ett väsentligt element i denna mekanism är bildningen av ett komplex mellan pro- 468 480 10 15 20 25 30 35 4 teinsubstratet och tioredoxinets hydrofoba yta. Detta gör det möjligt för tioredoxin att katalysera tioldisulfid- utbytesreaktioner med hastighetskonstanter inom inter- vallar 1o4-1o5 M* s* i møtsats till làgmolekylära tiol- er, såsom glutation, merkaptoetanol eller DTT, vilka rea- gerar vid fysiologiskt.pH med hastighetskonstanter av 1 s_l (Holmgren, 1985). Tiore- storleksordningen 1-10 M- doxin visar sålunda i allmänhet en mycket snabb reaktions- kinetik. I andra reaktioner kan tioredoxin uppvisa en unikt högre aktivitet gentemot specifika disulfider, vil- ken väsentligt överskrider den för lågmolekylära tioler. I detta fall kan det antas att tioredoxin, genom bildning av ett komplex med ett protein, alstrar en konformationell ändring som gör en annars begravd disulfid reaktiv. Detta är en central idé för tioredoxin katalyserande tioldisul- fidutbytesprocesser med proteiner, nämligen att vägen för proteinveckning och åtföljande disulfidbildning kan riktas genom katalysatorn. Man kan anta att en liknande mekanism är aktuell vid proteindisulfidisomeras.The molecule is so folded that a protruding part is formed containing the active site within a hydrophobic surface involving Trp-31, Cys-32, Pro-34, Pro-76, Gly-92, Ala- 93. This surface is preserved in thioredoxins from all species ter (Eklund et al., 1991). The mechanism of thioredoxin has proposed to involve a transcently mixed disulfide intermediate lan Cys-32 and the protein disulfide. An essential element of this mechanism is the formation of a complex between 468 480 10 15 20 25 30 35 4 the tin substrate and the hydrophobic surface of thioredoxin. This makes possible for thioredoxin to catalyze thiol disulfide exchange reactions with rate constants within the embankments 1o4-1o5 M * s * in batch to low molecular weight thiol such as glutathione, mercaptoethanol or DTT, which react at physiological.pH with rate constants of 1 s_l (Holmgren, 1985). Tiore- on the order of 1-10 M- doxin thus generally shows a very fast reaction time. kinetics. In other reactions, thioredoxin may have one uniquely higher activity against specific disulfides, which significantly exceeds that of low molecular weight thiols. IN In this case, it can be assumed that thioredoxin, by the formation of a complex with a protein, produces a conformational change that makes an otherwise buried disulfide reactive. This is a key idea for thioredoxin catalyzing thiol disul- fid exchange processes with proteins, namely that the way for protein folding and concomitant disulfide formation can be directed through the catalyst. One can assume that a similar mechanism is relevant in protein disulfide isomerase.
En tidigare rapport (Pigiet och Schuster, 1986) be- skriver veckning av ribonukleas RNase i närvaro av höga koncentrationer av tioredoxin från E.coli. En hastighets- förhöjning observerades, ävensom ett bättre utbyte av slutligt RNase. Kvantiteten av tioredoxin som användes vid denna process var emellertid kemiska snarare än kataly- tiska (25 pM RNase-SH2 och 500 pM Trx-S2). Ingen jämför- else gjordes med PDI och processen krävde mycket långa tider och höga koncentrationer av tioredoxin.An earlier report (Pigiet and Schuster, 1986) writes folding of ribonuclease RNase in the presence of high concentrations of thioredoxin from E.coli. A speed increase was observed, as well as a better yield of finally RNase. The quantity of thioredoxin used in however, this process was chemical rather than catalytic. (25 pM RNase-SH2 and 500 pM Trx-S2). No comparison else was done with PDI and the process required very long times and high concentrations of thioredoxin.
Till följd av bättre tillgänglighet av tioredoxiner jämfört med exempelvis enzymproteinet disulfidisomeras (PDI) skulle det vara en fördel om tioredoxiner kunde ef- fektivt användas vid korrekt veckning eller omveckning av biologiskt aktiva proteiner innehållande disulfidbryggor.Due to better availability of thioredoxins compared to, for example, the enzyme protein disulfide isomerase (PDI) it would be an advantage if thioredoxins could be effectively used when properly folding or refolding biologically active proteins containing disulfide bridges.
Huvudändamålet med föreliggande uppfinning är därför att åstadkomma nya tioredoxiner, vilka är redoxaktiva och vil- ka uppvisar en förbättrad redoxpotential jämfört med nati- va tioredoxiner. 10 15 20 25 30 35 -ß ox oo |> oo o 5 Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma förfaranden för korrekt veckning eller omveckning av di- sulfidförnätade proteiner under användning av sådant mo- difierat tioredoxin.The main object of the present invention is therefore that provide new thioredoxins, which are redox active and show an improved redox potential compared to national and thioredoxins. 10 15 20 25 30 35 -ß ox oo |> oo O 5 Another object of the invention is to achieve procedures for the correct folding or refolding of sulfide crosslinked proteins using such a mode differentiated thioredoxin.
Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma förfaranden för korrekt veckning eller omveckning av di- sulfidförnätade proteiner under förbättrad effektivitet av sådana förfaranden.Another object of the invention is to achieve procedures for the correct folding or refolding of sulfide crosslinked proteins with improved efficiency of such procedures.
Andra ändamål och fördelar med uppfinningen kommer att fullständigt framgå av följande beskrivning.Other objects and advantages of the invention will come to be fully apparent from the following description.
För ovan identifierade ändamål och andra ändamål åstadkommas genom uppfinningen nya tioredoxiner och funk- tionella derivat därav innefattande ett redoxaktivt Cys- Gly-Pro-Cys-ställe, vari aminosyraresten Pro i 34-position har ersatts med His, och vari aminosyrarester med 33-posi- tion är utvald bland Gly och Ala. I detta redox-aktiva ställe eller sekvens avser positionerna 32 till 35 mot- svarande aminosyraresterna Cys, Gly, Pro respektive Cys i E.coli-numrering.For purposes identified above and other purposes the invention provides new thioredoxins and functions derivatives thereof comprising a redox-active Cys- Gly-Pro-Cys site, wherein the amino acid residue Pro is in the 34-position has been replaced by His, and wherein amino acid residues with 33-position tion is selected from Gly and Ala. In this redox active place or sequence refers to positions 32 to 35 corresponding amino acid residues Cys, Gly, Pro and Cys in E.coli numbering.
Den substitution som utföres i ovan definierade redoxaktiva ställe resulterar i_en oväntad förhöjning av redoxpotentialen förutom det faktum att de modifierade tioredoxinerna erhålles med mycket höga utbyten och vidare att de är stabila. Det rön som är förknippat med förelig- gande uppfinning är så mycket mera oväntat som andra ve- tenskapsmän har uttryckt åsikten, att den relativt större effektiviteten av en PDI jämfört med tioredoxin betrakta- des snarare bero på närvaron av katalytiska multipeldomä- ner i PDI än i skillnader i deras aktiv-ställe sekvenser.The substitution performed as defined above redox active site results in an unexpected increase of the redox potential in addition to the fact that they modified the thioredoxins are obtained in very high yields and beyond that they are stable. The findings associated with the present present invention is all the more unexpected as other Scientists have expressed the view that it is relatively larger the effectiveness of a PDI compared to thioredoxin rather due to the presence of catalytic multiple domains down in PDI than in differences in their active-place sequences.
I detta avseende hänvisas till artikeln i Bio.Chem.J. (1991) 275, 349-353, av Hilary C. Hawkins et al., jfr. dess inledande sammanfattning.In this regard, reference is made to the article in Bio.Chem.J. (1991) 275, 349-353, by Hilary C. Hawkins et al., Cf. its initial summary.
Vid en föredragen utföringsform av uppfinningen har tioredoxinerna eller de funktionella derivaten därav i 33- position aminosyraresten Gly. Tioredoxinet enligt förelig- gande uppfinning erhålles företrädesvis från naturligt uppträdande redoxiner genom site-riktad mutagenes. 468 480 10 15 20 25 30 'ss 6 Genom uppfinningen åstadkommes även ett förfarande för framställning in vitro av ett veckat, biologiskt ak- tivt, disulfidbundet protein, vilket förfarande består i omsättning av ett motsvarande oveckat och reducerat prote- in med ett tioredoxin eller funktionellt derivat därav, vari Pro i 34-position ersatts med His, och vari amino- syraresten i 33-position är utvald bland Gly och Ala, vilket resulterar i bildning av nativ disulfid. Även i detta förfarande är det föredraget att position 33 upptas av aminsyraresten Gly.In a preferred embodiment of the invention thioredoxins or their functional derivatives in 33- position amino acid residue Gly. The thioredoxin of the present invention The present invention is preferably obtained from natural occurring redoxins by site-directed mutagenesis. 468 480 10 15 20 25 30 'ss 6 The invention also provides a method for the in vitro production of a folded biological biological active, disulfide-linked protein, which process consists in turnover of a correspondingly unfolded and reduced in with a thioredoxin or functional derivative thereof, wherein the Pro in 34 position is replaced by His, and wherein the amino the acid residue in the 33-position is selected from Gly and Ala, resulting in the formation of native disulfide. Also in in this method, it is preferred that position 33 be occupied of the amino acid residue Gly.
Enligt en ytterligare förbättring med avseende på föreliggande uppfinning utföres en sådan reaktion i när- varo av en katalytisk mängd av en selenit. Sådan kata- lytisk mängd kan ligga inom koncentrationsintervallet från ca 0,1 pM till ca 100 um, speciellt från ca 0,5 till ca 10 pM.According to a further improvement with regard to In the present invention, such a reaction is carried out in be a catalytic amount of a selenite. How to categorize lytic amount may be within the concentration range from about 0.1 pM to about 100 μm, especially from about 0.5 to about 10 pM.
Enligt ett annat alternativ för att utföra detta för- farande kan proteinets reaktion äga rum i närvaro av en redox buffert, såsom en buffert av reducerat och oxiderat glutation, ß-merkaptoetanol eller ditiotreitol.According to another option for carrying out this the reaction of the protein may take place in the presence of a redox buffer, such as a buffer of reduced and oxidized glutathione, ß-mercaptoethanol or dithiothreitol.
Föreliggande-uppfinning är tillämpbar även på omveck- ning av felaktigt veckade proteiner, såsom scramble-pro- teiner, till bildning av den korrekta veckningen med di- sulfidbindningar. En sådan process karakteriseras av om- sättning av ett scramble-protein med ett tioredoxin eller funktionellt derivat därav, vari Pro i 34-position ersatts med His, och vari aminosyraresten i 33-position är utvald bland Gly och Ala, i närvaro av en reduktant eller en re- doxbuffert, glutation, ß-merkaptoetanol eller ditiotreitol. Även denna såsom en buffert av reducerat och oxiderat reaktion kan äga rum i närvaro av en selenit vid koncen- trationsbetingelser liknande de som angivits ovan.The present invention is also applicable to folding misfolded proteins, such as scramble pro- to form the correct fold with di- sulfide bonds. Such a process is characterized by loading of a scramble protein with a thioredoxin or functional derivative thereof, in which Pro in 34-position has been replaced with His, and wherein the amino acid residue in the 33-position is selected among Gly and Ala, in the presence of a reductant or a doxbuffert, glutathione, ß-mercaptoethanol or dithiothreitol. This one too such as a buffer of reduced and oxidized reaction can take place in the presence of a selenite at the concentration conditions similar to those set out above.
Enligt ännu en sida av uppfinningen åstadkommes ett förfarande för bildning av korrekt vikveckning in vitro av ett oveckat och reducerat protein till bildning av ett di- sulfidförnätat protein. I nämnda förfarande omsättes det oveckade och reducerade proteinet med tioredoxin, ett tio- 10 15 20 25 30 35 7 redoxin, vari Pro i 34-position ersatts med His, och vari aminosyraresten i 33-position är utvald från Gly och Ala eller ett funktionellt derivat därav, eller PDI i närvaro av en katalytisk mängd av en selenit, resulterande i bild- ning av nativ disulfid.According to yet another aspect of the invention, there is provided method for forming the correct folding fold in vitro of an unfolded and reduced protein to form a di- sulfide crosslinked protein. In said process it is reacted unfolded and reduced the protein with thioredoxin, a thio- 10 15 20 25 30 35 7 redoxin, wherein Pro in the 34-position is replaced with His, and wherein the amino acid residue in the 33-position is selected from Gly and Ala or a functional derivative thereof, or PDI in the presence of a catalytic amount of a selenite, resulting in native disulfide.
Enligt nämnda aspekt består ett alternativt förfaran- de i korrekt omveckning av ett felaktigt veckat protein genom omsättning med ett tioredoxin, ett tioredoxin, vari Pro i 34-position har ersatts med His, och vari aminosyra- resten i 33-position är utvald från Gly och Ala, eller ett funktionellt derivat därav, eller PDI i närvaro av en NADPH och ett tioredoxinreduktas och en katalytisk mängd av en selenit resulterande i bildning av nativ disulfid.According to that aspect, an alternative procedure those in the correct folding of an incorrectly folded protein by reaction with a thioredoxin, a thioredoxin, wherein Pro in the 34-position has been replaced by His, and wherein the amino acid the rest in the 33-position are selected from Gly and Ala, or one functional derivative thereof, or PDI in the presence of a NADPH and a thioredoxin reductase and a catalytic amount of a selenite resulting in the formation of native disulfide.
Under användning av jämvikten mellan Trx och NADPH i den tioredoxinreduktas(TR)-katalyserade reaktionen (Reak- tion 2) har det befunnits, att redoxpotentialen av P34H- Trx vid pH 7,0 var -235mV jämfört med -270 mV för den vil- da typen (wt) Trx.Using the equilibrium between Trx and NADPH in the thioredoxin reductase (TR) -catalyzed reaction (Rea- 2), it has been found that the redox potential of P34H- Trx at pH 7.0 was -235mV compared to -270 mV for the then type (wt) Trx.
TR E > Trx-suz + NADP* (2) Trxz + NADPH + H* Skillnaden i E0' om 35 mV motsvarar ungefär en faktor av 20 i Keq för Reaktion 3.TR E> Trx-suz + NADP * (2) Trxz + NADPH + H * The difference in E0 'of 35 mV corresponds to approximately one factor of 20 in Keq for Reaction 3.
Keq (3) TIK-S2 + Pr0tGiH-SH2 1g====r> Trx-SH2 + protein-S2 Det högre EQ'-värdet gjorde även P34H-Trx mera likar- tad PDI och bidrog till väsentliga ändringar i Trx-funk- tioner, nämligen förbättrad aktivitet med TR men lägre re- duktion av proteindisulfider. Jämfört med wt-Trx var P34H Trx-S2 ca två gånger så bra som substrat för TR från E.coli och fyra gånger så effektiv med kalvtymus TR. En nyutvecklad fluorometrisk syra tillät direkt registrering av reaktionen mellan insulindisulfider och Trx-SH2. pH 8 och l5°C, andra ordningens konstant för vildtyptioredoxin eller 2 x 104 M_l s-1 och för P34H-Trx om 3 x 103 M'1 s'1 erhölls och en annan jämvikt observerades vilken var för- 10 15 20 25 30 35 468 480 8 enlig med skillnaderna i EQ'-värden.Keq (3) TIK-S2 + Pr0tGiH-SH2 1g ==== r> Trx-SH2 + protein-S2 The higher EQ 'value also made P34H-Trx more similar. PDI and contributed to significant changes in the Trx namely improved activity with TR but lower production of protein disulfides. Compared to wt-Trx, P34H Trx-S2 about twice as good as substrate for TR from E.coli and four times as effective with calf thymus TR. One newly developed fluorometric acid allowed direct registration of the reaction between insulin disulfides and Trx-SH2. pH 8 and 15 ° C, second order constant for wild typtioredoxin or 2 x 104 M_1 s-1 and for P34H-Trx of 3 x 103 M'1 s'1 was obtained and another equilibrium was observed which was 10 15 20 25 30 35 468 480 8 consistent with the differences in EQ 'values.
Föreliggande uppfinning är helt allmänt tillämpbar på produktion av biologiskt aktiva disulfid-förnätade prote- iner, och bland proteiner av intresse kan nämnas insulin, proinsulin, Igf-I Igf-II, t-PA, tillväxthormonfaktor VIIIF och koagulationsfaktorer, interleuciner, pankreatiska mam- malieribonukleaser, lysozymer, pankreatiska mammalietryp- sininhibitorer, interferoner, rennin, prolaktin, human a- l-trypsininhibitor, etc. Gemensamt för samtliga dessa pro- teiner är det förhållandet, att de i korrekt veckad form innehåller disulfidbryggor som åstadkommer korrekt kon- figuration.The present invention is generally applicable to production of biologically active disulfide-crosslinked proteins and proteins of interest include insulin, proinsulin, Igf-I Igf-II, t-PA, growth hormone factor VIIIF and coagulation factors, interleucins, pancreatic mammals malieribonucleases, lysozymes, pancreatic mammalian tryps sinin inhibitors, interferons, rennin, prolactin, human a- l-trypsin inhibitor, etc. Common to all of these pro- teiner is the fact, that they in properly pleated form contains disulfide bridges that provide proper con- figuration.
Med avseende på den sida av uppfinningen vid vilken man vid veckningsreaktionen använder en selenit är mot- jonen eller katjonen som användes ej av väsentlig betyd- else så länge som den är inert i förhållande till reak- tionen, men det är föredraget att använda alkalimetaller eller jordalkalimetaller, varvid natrium och kalium är speciellt föredragna.With respect to the side of the invention at which using a selenite in the folding reaction is the ion or cation which was not used in a significant as long as it is inert in relation to the reaction but it is preferred to use alkali metals or alkaline earth metals, wherein sodium and potassium are especially preferred.
Uppfinningen kommer i det följande att ytterligare beskrivas mera i detalj genom icke inskränkande konkreta exempel. Denna illustration göres i anslutning till bi- lagda ritningar.The invention will in the following further described in more detail by non-restrictive concrete example. This illustration is made in connection with laid drawings.
Förklaring av ritningar Figur 1. Kinetik för återvinnande av RNase-aktivitet från fullständigt reducerad RNase katalyserat genom PDI eller tioredoxiner i närvaro av 100 uM GSSG. RNase, 25 uM, in- kuberades vid 37° i 100 mM kaliumfosfat, pH 7,0, l mM EDTA i frånvaro av tioredoxin eller PDI X---X eller i närvaro av 10 pM ~----~ och 100 pM °----° E.coli w.t. Trx, 10 pM A----A och 100 pM A----A p34H Trx, och l uM I----I och 10 pM D----U PDI. Alikvota mängder avlägsnades från reak- tionsblandningarna och undersöktes med avseende på RNase- aktivitet med 160 pg/ml 2'3'cCMP i 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2. Hydrolys av nukleotiden följdes 10 15 20 25 30 35 468 480 9 spektrofotometriskt vid 288 nm, och återvinningen beräk- nades ur en standardkurva för nativ RNase.Explanation of drawings Figure 1. Kinetics for recovery of RNase activity from completely reduced RNase catalyzed by PDI or thioredoxins in the presence of 100 μM GSSG. RNase, 25 μM, in- was incubated at 37 ° in 100 mM potassium phosphate, pH 7.0, 1 mM EDTA in the absence of thioredoxin or PDI X --- X or in the presence of 10 pM ~ ---- ~ and 100 pM ° ---- ° E.coli w.t. Trx, 10 pM A ---- A and 100 pM A ---- A p34H Trx, and l uM I ---- I and 10 pM D ---- U PDI. Aliquot amounts were removed from the reaction medium. mixtures and were examined for RNase activity with 160 pg / ml 2'3'cCMP in 50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2. Hydrolysis of the nucleotide was followed 10 15 20 25 30 35 468 480 9 spectrophotometrically at 288 nm, and the recovery is calculated from a standard curve for native RNase.
Figur 2. Omveckning av fullt reducerad RNase i närvaro av katalytisk mängd selenit. Försöksbetingelserna var som i Fig. 1 bortsett ifrån tillsats av 1 uM Se032- i stället för GSSG: I frånvaro av PDI eller tioredoxin X----X, i närvaro av 10 pM ~----~ och 100 uM °----° E.coli w.t. Trx, 10 uM A----A och 100 pM A----A P34H tioredoxin, och 1 pM I----I och 10 uM D----D PDI.Figure 2. Refolding of fully reduced RNase in the presence of catalytic amount of selenite. The experimental conditions were as in Fig. 1 except for the addition of 1 μM Se032- instead for GSSG: In the absence of PDI or thioredoxin X ---- X, i presence of 10 μM ~ ---- ~ and 100 μM ° ---- ° E.coli w.t. Trx, 10 μM A ---- A and 100 μM A ---- A P34H thioredoxin, and 1 μM I ---- I and 10 μM D ---- D PDI.
Figur 3. Jämförelse av PDI, w.t. E.coli Trx och P34H Trx vid omveckning av sRNase i närvaro av 100 uM GSH. Slumpvis omoxiderad RNase (25 pM) inkuberades i 100 mM kaliumfosfat pH 7,0, l mM EDTA vid 37° i frånvaro av tioredoxin eller PDI X----X och i närvaro av 10 pM ~----~ och 100 pM °----° E.coli w.t. Trx, 10 pM A----A och 100 pM A----A P34H Trx, och 1 uM I----I och 10 uM D----U PDI. Alikvota mängder av- lägsnades och undersöktes med avseende på RNase-aktivitet såsom i Fig. 1.Figure 3. Comparison of PDI, w.t. E.coli Trx and P34H Trx when refolding sRNase in the presence of 100 μM GSH. Randomly unoxidized RNase (25 pM) was incubated in 100 mM potassium phosphate pH 7.0, 1 mM EDTA at 37 ° in the absence of thioredoxin or PDI X ---- X and in the presence of 10 pM ~ ---- ~ and 100 pM ° ---- ° E.coli w.t. Trx, 10 pM A ---- A and 100 pM A ---- A P34H Trx, and 1 μM I ---- I and 10 μM D ---- U PDI. Aliquot quantities of was removed and examined for RNase activity as in Fig. 1.
Figur 4. Jämförelse av PDI, w.t. E.co1i Trx och P34H Trx vid omveckning av sRNase i närvaro av 100 pM NADPH och 10 nM bovint tioredoxinreduktas. Utan tioredoxin eller PDI X----X eller i närvaro av 10 pM 0----~ och 100 uM °----° E.coli w.t. Trx, 10 pM A----A och 100 pM A----A P34H tio- redoxin, och 1 uM I----I och 10 pM D----D PDI. Försöks- betingelserna var såsom i Fig. 1.Figure 4. Comparison of PDI, w.t. E.co1i Trx and P34H Trx by refolding sRNase in the presence of 100 pM NADPH and 10 nM bovine thioredoxin reductase. Without thioredoxin or PDI X ---- X or in the presence of 10 μM 0 ---- ~ and 100 μM ° ---- ° E.coli w.t. Trx, 10 pM A ---- A and 100 pM A ---- A P34H thio- redoxin, and 1 μM I ---- I and 10 μM D ---- D PDI. Experimental- the conditions were as in Fig. 1.
Figur 5. Effekter av olika koncentrationer av PDI, w.t.Figure 5. Effects of different concentrations of PDI, w.t.
Trx eller P34H Trx på återvinning av RNase-aktivitet från fullt reducerad RNase efter 24 timmar inkubation vid 37°. 5. endast luft §. i närvaro av 100 uM GSSG och Q. _. Värdena utgör medeltal av 2 till 5 i när- varo av l pM SeO3 olika experiment. w.t.Trx or P34H Trx on recovery of RNase activity from fully reduced RNase after 24 hours incubation at 37 °. 5. air only §. in the presence of 100 μM GSSG and Q. _. The values are averages of 2 to 5 in the near varo of l pM SeO3 different experiments. w.t.
Figur 6. Effekter av olika koncentrationer av PDI, 468 480 10 15 20 25 30 '35 10 Trx eller P34H Trx pà återvinning av RNase-aktivitet fràn sRNase efter 24 timmar inkubation vid 37”. 5. i frånvaro av katalytisk tiol §. i närvaro av 100 pM GSH och Q. i närvaro av 10 nM bovint tioredoxinreduktas och 100 pM NADPH. Värdena utgör medeltal från 3 olika experiment.Figure 6. Effects of different concentrations of PDI, 468 480 10 15 20 25 30 '35 10 Trx or P34H Trx on recovery of RNase activity from sRNase after 24 hours incubation at 37 ”. 5. in absence of catalytic thiol §. in the presence of 100 pM GSH and Q. i presence of 10 nM bovine thioredoxin reductase and 100 pM NADPH. The values are averages from 3 different experiments.
EXEMPEL 1 EXPERIMENTELLA PROCEDURER.EXAMPLE 1 EXPERIMENTAL PROCEDURES.
Material - E.coli stam JF52l (A(lac-proAB), thi. supE, metE46, srl 300: :Tn 10 trxA2 (7004), recA.Material - E.coli strain JF52l (A (lac-proAB), thi. supE, metE46, srl 300:: Tn 10 trxA2 (7004), recA.
(F'(raD36, proAB+,lac ZAM15)) (Langsetmo, K., Fuchs, J., och Woodward, (1989) Biochemistry 28, 3221-3220) hjälpar- fag M13K07, och plasmid pUCll8, Vieira, J., och Messing, J. (1987) Methods Enzymol 153, 3-11) var gåvor från Dr. J.(F '(raD36, proAB +, lac ZAM15)) (Langsetmo, K., Fuchs, J., and Woodward, (1989) Biochemistry 28, 3221-3220) phage M13K07, and plasmid pUC118, Vieira, J., and Brass, J. (1987) Methods Enzymol 153, 3-11) were gifts from Dr. J.
Fuchs, St Paul, Mn. Mutagenesvärdstammen E.coli CU 9276 (hsdR17, merAB, recA1, A(lac-proAB), (F'traD36, proAB+, 1ac1qZAM15))och testtemplatet och primer för mutagenes- systemet enligt Vandeyar, M.A., Weiner, M.P., Hutton, C.J. och Batt, C.A. (1988) Gene (Amst) 65, 129-133) tillhanda- hölls av Dr. E. Holmgren, KabiGen, Stockholm. Nukleotid- positioner i pUC1l8-trxA-P34H-kartan under schema 2 hänför sig till Yanisch-Perron, C., Vieira, J. och Messing, J. (1985) Gene (Amst) 33, 103-119).Fuchs, St Paul, Mn. The mutagenesis host strain E.coli CU 9276 (hsdR17, merAB, recA1, A (lac-proAB), (F'traD36, proAB +, 1ac1qZAM15)) and the test template and primer for mutagenesis the system of Vandeyar, M.A., Weiner, M.P., Hutton, C.J. and Batt, C.A. (1988) Gene (Amst) 65, 129-133) held by Dr. E. Holmgren, KabiGen, Stockholm. Nucleotide positions in the pUC118-trxA-P34H map under Scheme 2 to Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene (Amst) 33, 103-119).
Restriktions- och DNA-modifierande enzymer, M13- vektor-DNA, la-35S]dATP, och andra molekylära biologiska material inköptes från Boehringer Mannheim, Pharmacia LKB Biotechnology Inc., och Amersham Corp. För eluering av DNA från agaros användes GeneC1ean-kiten av Bio10l. DNA-sekve- neringsutrustning och T7-DNA-polymeras var frán Pharmacia. 5-Brom-4-k1or-3-indoyl-ß-D-galaktosid och isopropyl-l-tio- ß-D-galaktopyranosid, DTNB, och DTT inköptes fràn Sigma.Restriction and DNA modifying enzymes, M13 vector DNA, 1a-35S] dATP, and other molecular biologicals materials were purchased from Boehringer Mannheim, Pharmacia LKB Biotechnology Inc., and Amersham Corp. For elution of DNA from agarose, the GeneCl1ean kit of Bio101 was used. DNA sequencing equipment and T7 DNA polymerase was from Pharmacia. 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside and isopropyl-1-thio- ß-D-galactopyranoside, DTNB, and DTT were purchased from Sigma.
Tioredoxin av vildtyp renad från E.coli SK3981 (Dyson, H.J., Holmgren, A. och Wright, P.E. (1989) Bio- chemistry 28, 7074-7087), PDI från kalvlever (Hillson, D.A., Lambert, N. och Freedman, R.B. (1984) Methods Enzymol. 107, 281-294, Lundström, J. och Holmgren, A. (1990) J.Biol.Chem. 265, 9114-9120), och tioredoxin- ”l 10 15 20 25 30 35 11 reduktas fràn E.co1i BH 215/pMR13 (Russel, M. och Model, P. (1985) J.Bacterio1. 163, 238-242) och kalvtymus (Luthman, M. och Holmgren, A. (1982) Biochemistry 21, 6628-6633) var homogena beredningar tillgängliga i vàrt laboratorium.Wild-type thioredoxin purified from E.coli SK3981 (Dyson, H.J., Holmgren, A. and Wright, P.E. (1989) Bio- chemistry 28, 7074-7087), PDI from calf liver (Hillson, D.A., Lambert, N. and Freedman, R.B. (1984) Methods Enzymol. 107, 281-294, Lundström, J. and Holmgren, A. (1990) J.Biol.Chem. 265, 9114-9120), and thioredoxin ”L 10 15 20 25 30 35 11 reduced from E. coli BH 215 / pMR13 (Russel, M. and Model, P. (1985) J.Bacterio1. 163, 238-242) and calf thymus (Luthman, M. and Holmgren, A. (1982) Biochemistry 21, 6628-6633) homogeneous preparations were available in the spring laboratory.
Mutantkonstruktion - Ett 0,5-kilobas HindII-fragment innehållande trxA-genen transfererades från pBHK8 (Wallace, B.J. och Kushner, S.R. (1984) Gene (Amst) 32, 399-408) till M13 mp18 under utnyttjning av SmaI-stället av dess polylinkerregion. Ml3-kloner med rätt insats- orientering identifierades genom dideoxisekvenering.Mutant construct - A 0.5-kilobase HindII fragment containing the trxA gene was transferred from pBHK8 (Wallace, B.J. and Kushner, S.R. (1984) Gene (Amst) 32, 399-408) to M13 mp18 using the SmaI site of its polylinker region. Ml3 clones with the right insert orientation was identified by dideoxy sequencing.
En 19-mer oligonukleotid med sekvensen 5' CAT TTT GLA x GLA CTG ACC GCA C 3' syntetiserades av Dr. Sune Kvist, Ludwig Institute for Cancer Research, Stockholms-grenen, och fuserades till M13 mp 18-trxA (schema 2). Detaljer be- träffande den oligonukleotidriktade mutagenesen enligt Vandeyar, M.A., Weiner, M.P., Hutton, C.J. och Batt, C.A. (1988) Gene (Amst) 65, 129-133 och screening med avseende pá mutant direkt genom sekvenering, ävensom subklonings- procedurerna resulterande i expressionsplasmiden pUC118- trxA-P34H var såsom tidigare beskrivits (Krause, G. och Holmgren, A. (1991) J.Biol.Chem. 266, 4056-4066). Enkel- strängad DNA erhállen från hybridfagmiden närvarande i schema 2 tjänade som templat för en annan sekvensbekräf- telse för att exkludera sekundära mutationer. Överexpres- sion av mutanttioredoxin i JF521, en trxA-bakgrund, och rening av mutantproteinet utfördes såsom tidigare rappor- terats (Krause, G. och Holmgren, A. (1991) J.Biol.Chem. 266, 4056-4066).A 19-mer oligonucleotide with the sequence 5 'CAT TTT GLA x GLA CTG ACC GCA C 3 'was synthesized by Dr. Sune Kvist, Ludwig Institute for Cancer Research, Stockholm branch, and fused to M13 mp 18-trxA (Scheme 2). Details be- affecting the oligonucleotide-directed mutagenesis according to Vandeyar, M.A., Weiner, M.P., Hutton, C.J. and Batt, C.A. (1988) Gene (Amst) 65, 129-133 and screening with respect to mutant directly by sequencing, as well as subcloning procedures resulting from the expression plasmid pUC118 trxA-P34H was as previously described (Krause, G. and Holmgren, A. (1991) J.Biol.Chem. 266, 4056-4066). Simple- stranded DNA obtained from the hybrid phagemid present in Scheme 2 served as a template for another sequence confirmation to exclude secondary mutations. Over-express mutation thioredoxin in JF521, a trxA background, and Purification of the mutant protein was performed as previously reported. terats (Krause, G. and Holmgren, A. (1991) J.Biol.Chem. 266, 4056-4066).
För jämförelses skull visar schema 1 domänstruktur av lever-PDI och aktiv sitehomologi till tioredoxin från E.co1i.For comparison, Scheme 1 shows the domain structure of liver PDI and active site homology to thioredoxin from E.co1i.
EXEMPEL 2 EFFEKTIV OMVECKNINGSKATALYS MED P34H TRX OCH ETT NYTT OXIDERINGSSYSTEM UNDER ANVÄNDNING AV KATALYTISKA MÄNGDER AV SELENIT I LUFT. 468 480 10 15 20 25 30 35 12 Resultat Oxidativ veckning_av reducerad RNase Fullt reducerad inaktiv RNase med 8 sulfhydrylgrupper användes som substrat vid omveckningsförsök vid en kon- centration av 25 pM. Dessa betingelser användes tidigare av Pigiet och Schuster, 1986, vilka fann att 500 uM E.co1i Trx gav maximal reaktivering av RNase-aktivitet efter 30- 50 timmar inkubation. En koncentration av 25 uM är även 3- 5 gånger högre än det skenbara Km-värdet för RNase för PDI som nyligen rapporterats av Hawkins et al., 1991, och Lyles och Gilbert, 1991. Inkuberingar utfördes vid 37°C vid pH 7,0 i närvaro av 1 mM EDTA i luft. Under dessa be- tingelser observerades ingen signifikant återvinning av RNase-aktivitet efter 6 timmar inkubation med 1 eller 10 uM PDI, 1, 10 eller 100 pM wt Trx eller 1 eller 10 pM P34H Trx, samtliga tillsatta i dess oxiderade tillstånd (data ej visade). Med 100 pM P34H Trx noterades signifikant re- aktivering (15%). Tidigare har det visats, att en disulfid med låg molekylvikt erfordras för reaktivering: Creighton och Freedman, 1980, använde 100 pM GSSG som oxidant vid sina RNase-omveckningsstudier. Såsom visas i Fig. 1 med 100 uM GSSG var återvinning av RNase-aktivitet nu väsent- lig när reaktionerna följdes under 6 timmar. Två slutsat- ser kan dras från dessa data. För det första var PDI den bästa katalysatorn och var ca 100-faldigt aktivare än wt Trx på en molär basis. För det andra och mest väsentligt var P34H Trx aktivare än wt Trx; i själva verket syntes 10 pM P34H Trx vara aktivare än 100 pM wt Trx. Relationen mellan PDI och P34H Trx var även en faktor 10 i aktivitet på molbas. Utbytet av Pro-34 till His i Trx höjde sålunda disulfidisomerasaktiviteten mycket dramatiskt.EXAMPLE 2 EFFICIENT FOLDING CATALYLE WITH P34H TRX AND A NEW OXIDIZATION SYSTEM USING CATALYTIC QUANTITIES OF SELENITE IN AIR. 468 480 10 15 20 25 30 35 12 Results Oxidative folding_of reduced RNase Fully reduced inactive RNase with 8 sulfhydryl groups was used as a substrate in refolding experiments at a concentration of 25 pM. These conditions were used previously by Pigiet and Schuster, 1986, who found that 500 μM E.co1i Trx gave maximum reactivation of RNase activity after 30- 50 hours incubation. A concentration of 25 μM is also 3- 5 times higher than the apparent Km value of RNase for PDI as recently reported by Hawkins et al., 1991, and Lyles and Gilbert, 1991. Incubations were performed at 37 ° C at pH 7.0 in the presence of 1 mM EDTA in air. During these no significant recovery was observed RNase activity after 6 hours of incubation with 1 or 10 μM PDI, 1, 10 or 100 pM wt Trx or 1 or 10 pM P34H Trx, all added in its oxidized state (data not shown). With 100 pM P34H Trx, significant re- activation (15%). It has previously been shown that a disulfide low molecular weight required for reactivation: Creighton and Freedman, 1980, used 100 pM GSSG as an oxidant at their RNase refinement studies. As shown in Fig. 1 with 100 μM GSSG, recovery of RNase activity was now essential. when the reactions were monitored for 6 hours. Two concluded looks can be deduced from this data. First, the PDI was it best catalyst and was about 100-fold more active than wt Trx on a molar basis. Secondly and most importantly was P34H Trx more active than wt Trx; in fact, 10 appeared pM P34H Trx be more active than 100 pM wt Trx. The relationship between PDI and P34H Trx was also a factor of 10 in activity on molbas. The yield of Pro-34 to His in Trx thus increased disulfide isomerase activity very dramatically.
Experiment med användning av en non-disulfid oxidant ledde till upptäckten att selenit är användbar. Såsom framgår av Fig. 2 fungerar natriumselenit vid en kata- lytisk konstellation av 1 uM väl som oxidant för PDI även- som för tioredoxiner; det slutliga utbytet vid 6 timmar var likartat experimenten i närvaro av 100 pM GSSG. Se- *r 10 15 20 25 30 35 480 13 lenit är en effektiv oxidant av aktiv-siteditiol i tio- redoxin och befrämjar icke-stochiometrisk oxidation genom redoxcykling med syre i luft (Holmgren och Kumar, 1989; Kumar, Björnstedt, Holmgren, manuskript under framställ- ning). Användning av selenit är sålunda ett sätt att undvika tillsats av en redoxbuffert till systemet. Den relativa effektiviteten av P34H Trx var åter lika med eller större än den för 100 pM wt Trx. Även i detta system var sålunda P34H Trx ca tiofaldigt effektivare än wt tio- redoxin.Experiment using a non-disulfide oxidant led to the discovery that selenite is useful. As As can be seen from Fig. 2, sodium selenite acts at a lytic constellation of 1 μM well as oxidant for PDI also as for thioredoxins; the final yield at 6 hours was similar to the experiments in the presence of 100 pM GSSG. See- * r 10 15 20 25 30 35 480 13 lenite is an effective oxidant of active site dithiol in thio- redoxin and promotes non-stochiometric oxidation by redox cycling with oxygen in air (Holmgren and Kumar, 1989; Kumar, Björnstedt, Holmgren, manuscript under preparation ning). The use of selenite is thus a way of avoid adding a redox buffer to the system. The the relative efficiency of P34H Trx was again equal to or greater than that of 100 pM wt Trx. Even in this system Thus, P34H Trx was about ten-fold more effective than redoxin.
Omveckning av scramble-RNase (sRNase) Återvinning av RNase-aktivitet från den inaktiva, slumpvis oxiderade molekylen kräver isomerisering av di- sulfidbindningar genom tiol-disulfidutbyte; detta innebär reduktion- och oxidationcykler. Processen kräver sålunda en tiol, såsom GSH eller DTT, för att initiera reduktion (Creighton och Freedman, 1980). Vi jämförde PDI, wt Trx och P34H Trx under användning av 100 pM GSH som tiol. Un- der dessa betingelser (Fig. 3) uppvisade wt Trx nästan ingen effekt på återvinning av aktivitet vid vare sig lO_ eller 100 pM jämfört med en kontroll utan enzym. I motsats härtill gav P34H Trx väsentlig aktivitet vid 10 uM. Den snabbaste aktiveringen erhölls emellertid med 1 eller 10 pM PDI. Med 100 uM GSH var sålunda P34H Trx aktivare än wt Trx; detta är förmodligen ett uttryck för den högre redox- potentialen (Eo') av P34H Trx. Det är känt, att wt Trx S ej reduceras av 100 pM GSH (opublicerade resultat). 2 Eftersom PDI är ett substrat för mammaliskt tiore- doxinreduktas har vi försökt att använda NADPH och tiore- doxinreduktas som en källa för reducerande ekvivalens för tiol-disulfidutbyte. Såsom framgår av Fig. 4 fungerade 100 pM NADPH och en mycket låg koncentration av tioredoxin- reduktas väl. I teorin är 100 pM NADPH tillräckligt för fullständig reduktion av 25 uM sRNase med 4 disulfider.Folding of scramble RNase (sRNase) Recovery of RNase activity from the inactive, the randomly oxidized molecule requires isomerization of di- sulfide bonds by thiol disulfide exchange; This means reduction and oxidation cycles. The process thus requires a thiol, such as GSH or DTT, to initiate reduction (Creighton and Freedman, 1980). We compared PDI, wt Trx and P34H Trx using 100 pM GSH as thiol. Un- where these conditions (Fig. 3) showed wt Trx almost no effect on activity recovery at either 10_ or 100 pM compared to a control without enzyme. Contrary in addition, P34H Trx gave significant activity at 10 μM. The however, the fastest activation was obtained with 1 or 10 pM PDI. Thus, with 100 μM GSH, P34H Trx was more active than wt Trx; this is probably an expression of the higher redox the potential (Eo ') of P34H Trx. It is known that wt Trx S not reduced by 100 pM GSH (unpublished results). 2 Because PDI is a substrate for mammalian thio doxin reductase, we have tried to use NADPH and thiore- doxin reductase as a source of reducing equivalence for thiol disulfide yield. As shown in Fig. 4, 100 operated pM NADPH and a very low concentration of thioredoxin reduced well. In theory, 100 pM NADPH is enough for complete reduction of 25 μM sRNase with 4 disulfides.
Med 10 nM tioredoxin erhölls effektiv återvinning av ribo- nukleasaktivitet. Återvinningen av aktiviteten var snab- 468 48Û 10 15 20 25 30 35 14 bare och generellt högre än med 100 pM GSH. Under dessa betingelser var PDI den bästa katalysatorn åtföljt av P34H Trx. Relationen mellan wt Trx och P34H Trx var även här en faktor av 10, såsom illustreras av den likadana aktiver- ingen med 100 pM Trx och 10 uM P34H (Fig. 4). Med samtliga dessa tre proteiner fungerar sålunda NADPH och tioredoxin- reduktas som en utmärkt källa till reducerande ekvivalens för disulfidutbytet. Syre i luft konsumerar sedan NADPH, men denna procedur har ej studerats. Dessa resultat visar även att det föreligger inget obligatoriskt krav på gluta- tion eller annan liten disulfid, såsom cystamin, vid pro- teindisulfidisomeringsreaktioner.With 10 nM thioredoxin, efficient recovery of ribo- nuclease activity. The recovery of the activity was rapid 468 48Û 10 15 20 25 30 35 14 bare and generally higher than with 100 pM GSH. Under these conditions, PDI was the best catalyst accompanied by P34H Trx. The relationship between wt Trx and P34H Trx was also one here factor of 10, as illustrated by the similar activation none with 100 pM Trx and 10 μM P34H (Fig. 4). With all of them these three proteins thus function as NADPH and thioredoxin reduced as an excellent source of reducing equivalence for the disulfide exchange. Oxygen in air then consumes NADPH, but this procedure has not been studied. These results show even though there is no mandatory requirement for gluten or other small disulfide, such as cystamine, in tea disulfide isomerization reactions.
Slutligtgutbyte av ribonukleasaktivitet Vid alla jämförelser användes en enkel sats av fullt reducerad eller sRNase. Olika satser uppvisade emellertid olika slutlig återvinning av aktivitet varierande mellan 60 och 95%. Detta har noterats av andra (se Hawkins och Freedman, 1991). I en separat serie av experiment användes ett flertal beredningar och vi bestämde det slutliga ut- bytet av aktivt ribonukleas genom avlägsnande av prover vid 2 timmar (data ej visade) och 24 timmar. Med reducerad RNase resulterade enbart exponering till luft under 24 timmar i hög återvinning av aktivitet, speciellt för 100 pM P34H Trx och 10 pM PDI. Av speciell betydelse är det att långa inkubationer med 1 uM selenit helt allmänt re- sulterade i bättre återvinning av aktivitet än med GSSG.Final replacement of ribonuclease activity In all comparisons, a simple batch of full was used reduced or sRNase. However, different theorems showed different final recovery of activity varying between 60 and 95%. This has been noted by others (see Hawkins and Freedman, 1991). In a separate series of experiments were used several preparations and we decided on the final replacement of active ribonuclease by removal of samples at 2 hours (data not shown) and 24 hours. With reduced RNase only resulted in exposure to air below 24 hours of high activity recovery, especially for 100 pM P34H Trx and 10 pM PDI. It is of special importance that long incubations with 1 μM selenite are generally resulted in better activity recovery than with GSSG.
P34H Trx och selenit utgör sålunda ett utmärkt omveck- ningssystem för ett fullt reducerat protein.P34H Trx and selenite thus constitute an excellent system for a fully reduced protein.
Under användning av likadana inkubationer med sRNase (Fig. 6) erhölls i huvudsak ingen återvinning av aktivitet utan tillsats av en reduktant. Tillsatsen av PDI gav emel- lertid låg men signifikant återvinning av aktivitet, möj- ligen beroende på det faktum att eftersom isolerat PDI innehåller ca en fri sulfhydrylgrupp (Lyles och Gilbert, 1991). Under användning av 100 pM GSH återvanns väsentlig aktivitet utan enzym och låga koncentrationer av wt Trx f) 10 15 20 25 30 35 .P- O”\ OO -PI- OD CD 15 uppvisade ingen effekt i jämförelse med P34H Trx och PDI.Using similar incubations with sRNase (Fig. 6) essentially no recovery of activity was obtained without the addition of a reductant. The addition of PDI low but significant recovery of activity, possible due to the fact that because isolated PDI contains about one free sulfhydryl group (Lyles and Gilbert, 1991). Using 100 pM GSH was significantly recovered activity without enzyme and low concentrations of wt Trx f) 10 15 20 25 30 35 .P- O"\ OO -PI- OD CD 15 showed no effect compared to P34H Trx and PDI.
Utbytena efter 24 timmar under användning av 100 uM NADPH och 10 nM TR uppvisade en gradvis förhöjning i relativ aktivitet i ordningsföljden wt Trx, P34H Trx och PDI.Yields after 24 hours using 100 μM NADPH and 10 nM TR showed a gradual increase in relative activity in the order wt Trx, P34H Trx and PDI.
Slutsatser Pro-34 till His i tioredoxin är ett effektivt pro- teindisulfidisomeras och katalyserar proteinveckning och bildning av nativ disulfid. Proteinet kan erhållas i homo- gen form i stora kvantiteter frán stammen JF521/pUCll8 trxA P34H och är en användbar lättillgänglig mycket stabil och lämplig katalysator.Conclusions Pro-34 to His in thioredoxin is an effective pro- tea disulfide isomerase and catalyzes protein folding and formation of native disulfide. The protein can be obtained in homogeneous gene form in large quantities from strain JF521 / pUCll8 trxA P34H and is a useful easily accessible very stable and suitable catalyst.
Selenit använd aerobiskt i katalytiska mängder liksom 1 pM kan ersätta tidigare använda redoxbuffertar av exem- pelvis GSH och GSSG som en oxidant under omveckning och bildning av disulfider i proteiner katalyserade av PDI eller P34H Trx. Natriumselenit och andra selenderivat är billiga och lättillgängliga. Som reduktant för induktion av tiol-disulfidutbytet involverat i disulfidisomerisering fungerar en låg nivå av tioredoxinreduktas och NADPH väl.Selenite is used aerobically in catalytic amounts as well 1 pM can replace previously used redox buffers of exemplary pelvis GSH and GSSG as an oxidant during refolding and formation of disulfides in proteins catalyzed by PDI or P34H Trx. Sodium selenite and other selenium derivatives are cheap and easily accessible. As a reductant for induction of the thiol disulfide yield involved in disulfide isomerization a low level of thioredoxin reductase and NADPH works well.
E.coli stam JF 521, innehållande expressionsvektorn pUC1l8-trxA-P34H, har deponerats hos DSM 24 maj 1991 med depositionsnummer 6528.E.coli strain JF 521, containing the expression vector pUC118-trxA-P34H, has been deposited with the DSM May 24, 1991 with deposit number 6528.
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9101586A SE468480B (en) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | Modified thioredoxin and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9101586A SE468480B (en) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | Modified thioredoxin and its use |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE9101586D0 SE9101586D0 (en) | 1991-05-24 |
| SE9101586L SE9101586L (en) | 1992-11-25 |
| SE468480B true SE468480B (en) | 1993-01-25 |
Family
ID=20382839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE9101586A SE468480B (en) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | Modified thioredoxin and its use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SE (1) | SE468480B (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6586573B1 (en) | 1999-02-22 | 2003-07-01 | Baxter International Inc. | Albumin-free Factor VIII formulations |
| US10512674B2 (en) | 2008-11-07 | 2019-12-24 | Baxalta Incorporated | Factor VIII formulations |
-
1991
- 1991-05-24 SE SE9101586A patent/SE468480B/en not_active IP Right Cessation
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6586573B1 (en) | 1999-02-22 | 2003-07-01 | Baxter International Inc. | Albumin-free Factor VIII formulations |
| US8058226B2 (en) | 1999-02-22 | 2011-11-15 | Baxter International Inc. | Albumin-free factor VIII formulations |
| US8372800B2 (en) | 1999-02-22 | 2013-02-12 | Baxter International Inc. | Albumin-free factor VIII formulations |
| US8765665B2 (en) | 1999-02-22 | 2014-07-01 | Baxter International Inc. | Albumin-free factor VIII formulations |
| US9352027B2 (en) | 1999-02-22 | 2016-05-31 | Baxalta Incorporated | Albumin-free factor VIII formulations |
| US9669076B2 (en) | 1999-02-22 | 2017-06-06 | Baxalta Incorporated | Albumin-free factor VIII formulations |
| US10512674B2 (en) | 2008-11-07 | 2019-12-24 | Baxalta Incorporated | Factor VIII formulations |
| US11020459B2 (en) | 2008-11-07 | 2021-06-01 | Baxalta Incorporated | Factor VIII formulations |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE9101586L (en) | 1992-11-25 |
| SE9101586D0 (en) | 1991-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Krause et al. | Substitution of the conserved tryptophan 31 in Escherichia coli thioredoxin by site-directed mutagenesis and structure-function analysis | |
| Freedman | Native disulphide bond formation in protein biosynthesis: evidence for the role of protein disulphide isomerase | |
| Holmgren | Thioredoxin structure and mechanism: conformational changes on oxidation of the active-site sulfhydryls to a disulfide | |
| Zhong et al. | Rat and calf thioredoxin reductase are homologous to glutathione reductase with a carboxyl-terminal elongation containing a conserved catalytically active penultimate selenocysteine residue | |
| Hawkins et al. | The reactivities and ionization properties of the active-site dithiol groups of mammalian protein disulphide-isomerase | |
| Holmgren | Thioredoxin and glutaredoxin systems | |
| Jordan et al. | Characterization of Escherichia coli NrdH: A glutaredoxin-like protein with a thioredoxin-like activity profile | |
| Eklund et al. | Structural and functional relations among thioredoxins of different species | |
| Mozhaev et al. | Structure-stability relationships in proteins: new approaches to stabilizing enzymes | |
| Guise et al. | Protein folding in vivo and renaturation of recombinant proteins from inclusion bodies | |
| Li et al. | Thioredoxin activity in the C terminus of Phalaris S protein | |
| Kersteen et al. | Catalysis of protein folding by protein disulfide isomerase and small-molecule mimics | |
| FREEDMAN et al. | Protein disulphide-isomerase and the formation of native disulphide bonds | |
| EP0293793B1 (en) | Polypeptide and production thereof | |
| Shapiro et al. | Identification of functional arginines in human angiogenin by site-directed mutagenesis | |
| Irie et al. | Biochemistry of frog ribonucleases | |
| Rudolph | Renaturation of recombinant, disulfide-bonded proteins from inclusion bodies | |
| Wistow et al. | Gene conversion and splice-site slippage in the argininosuccinate lyases/δ-crystallins of the duck lens: members of an enzyme superfamily | |
| FREEDMAN et al. | Protein disulphide-isomerase: a homologue of thioredoxin implicated in the biosynthesis of secretory proteins | |
| US9976164B2 (en) | Method for producing natively folded proteins in a prokaryotic host | |
| SE468480B (en) | Modified thioredoxin and its use | |
| Guiard et al. | More similarity between bakers' yeast l-(+)-lactate dehydrogenase and liver microsomal cytochrome b 5 | |
| Guo et al. | Can recombinant human glutathione peroxidase 1 with high activity be efficiently produced in Escherichia coli? | |
| Sakakibara et al. | Construction and expression of human aldolase A and B expression plasmids in Escherichia coli host | |
| Jollie et al. | Purification and characterization of microsomal cytochrome b 5 and NADH cytochrome b 5 reductase from Pisum sativum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NAL | Patent in force |
Ref document number: 9101586-7 Format of ref document f/p: F |
|
| NUG | Patent has lapsed |