SE464448B - FUSOGEN Phospholipid Vesicle Containing A Quaternary Ammonium Hydroxide Salt In The Membrane And A Procedure For Its Preparation - Google Patents
FUSOGEN Phospholipid Vesicle Containing A Quaternary Ammonium Hydroxide Salt In The Membrane And A Procedure For Its PreparationInfo
- Publication number
- SE464448B SE464448B SE8601408A SE8601408A SE464448B SE 464448 B SE464448 B SE 464448B SE 8601408 A SE8601408 A SE 8601408A SE 8601408 A SE8601408 A SE 8601408A SE 464448 B SE464448 B SE 464448B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- salt
- liposomes
- ammonium hydroxide
- quaternary ammonium
- hydroxide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
464 448 Vidare har en mångfald användningar av liposomer som j överföringsmedel föreslagits i talrika patent. Sålunda 5 anger den nyssnämnda patentskriften 4 235 871 talrika aktiva föreningar och beredningar inkapslade i liposo- _ men för införlivning i celler. U.S. patent 4 394 448 är inriktad speciellt på införande av desoxiribonuklein- syra (DNA) eller fragment därav i en levande cell, var- vid DNA eller fragmentet därav inkapslas i en lipidve- sikel och denna bringas i kontakt med en cell, så att införandet sker. U.S. patent 4 199 565, 4 201 767, 4 261 975 och 4 235 877 anger införlivning av ett vi- ralt eller bakteriellt antigen i liposomer, som inne- håller ett positivt laddat aminohaltigt ytaktivt medel, vilket kan vara ett kvaternärt ammoniumhalidsalt. U.S. patent 4 483 929 anger ett immunoreaktant liposomrea- gens med förmåga att ingå i en immunospecifik reaktion med en känd antikropp. Ehuru det har påvisats, att fos- folipidliposomer är.i stånd att införa sitt innehåll i odlade celler såväl som i celler av specifika vävnader hos hela djur, har dessa liposomer veterligen visats vara endast relativt dåliga bärare i alla kända använd- ningar. Det förmodas att dessa kända liposomer inför de av dem burna substanserna, dvs läkemedlen, i cellerna med endocytoslika processer- Följaktligen kommer endast en liten andel av de molekyler som är infångade i lipo- somerna att nå mottagarcellernas cytoplasma. Vidare har det konstaterats, att när liposomer injiceras i djur, inklusive människor, fosfolipidliposomerna är inerta och icke immunogena upp till en viss koncentration. Först vid relativt höga koncentrationer blir liposomerna im- - munogena och toxiska. Dessa liposomer enligt teknikens ståndpunkt är visserligen i stånd att agglutinera cel- ~ ler, men de är inte fusogena och är ur stånd att smälta ihop med en cellmembran eller framkalla fusion av celler med varandra. 464 448 Det har också konstaterats, att höljen av vissa animaliska virus, såsom de från Sendai-virus er- hållna, är fusogena, och de har visats tjäna som en effektiv bärare för införande av molekyler i odlade celler, såsom anges i "A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes“, av Vain- stein et al., Biochimica et Biophysica Acta, 773 (1984), sid. 181-188. Den fusogena aktiviteten av dessa virus torde bero på närvaro av specifika viralglykoproteiner i virushöljena. Det förefaller emellertid som om närva- ro av ett protein i de fusogena viralhöljena gör dessa vesikler immunogena och därför opraktiska för använd- ning in vivo. Injektion av viralhöljen i djur framkal- lar bildning av specifika antivirala antikroppar, vil- ket begränsar deras användbarhet som biologisk bärare in vivo. 464 448 Furthermore, a variety of uses of liposomes as transfer agents have been proposed in numerous patents. Thus, the aforementioned patent discloses 4,235,871 numerous active compounds and preparations encapsulated in the liposome for incorporation into cells. U.S. U.S. Patent 4,394,448 is particularly directed to the introduction of deoxyribonucleic acid (DNA) or fragments thereof into a living cell, wherein the DNA or fragment thereof is encapsulated in a lipid vesicle and contacted with a cell so that the introduction occurs . U.S. Patents 4,199,565, 4,201,767, 4,261,975 and 4,235,877 disclose the incorporation of a viral or bacterial antigen into liposomes which contain a positively charged amino-containing surfactant, which may be a quaternary ammonium halide salt. U.S. U.S. Patent 4,483,929 discloses an immunoreactant liposome reagent capable of involved in an immunospecific reaction with a known antibody. Although it has been shown that phospholipid liposomes are capable of introducing their contents into cultured cells as well as into cells of specific tissues in whole animals, these liposomes have been known to be only relatively poor carriers in all known uses. It is believed that these known liposomes introduce the substances carried by them, ie the drugs, into the cells by endocytosis-like processes. Consequently, only a small proportion of the molecules trapped in the liposomes will reach the cytoplasm of the recipient cells. Furthermore, it has been found that when liposomes are injected into animals, including humans, the phospholipid liposomes are inert and non-immunogenic up to a certain concentration. Only at relatively high concentrations do the liposomes become immunogenic and toxic. Although these prior art liposomes are capable of agglutinating cells, they are not fusogenic and are unable to fuse with a cell membrane or induce fusion of cells with each other. 464 448 It has also been found that the envelopes of certain animal viruses, such as those derived from Sendai viruses, are fusogenic, and have been shown to serve as an effective carrier for the introduction of molecules into cultured cells, as set forth in "A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes ”, by Vainstein et al., Biochimica et Biophysica Acta, 773 (1984), pp. 181-188. The fusogenic activity of these viruses is likely to be due to the presence of specific viral glycoproteins in the virus envelopes However, the presence of a protein in the fusogenic viral envelopes appears to render these vesicles immunogenic and therefore impractical for use in vivo. Injection of the viral envelopes into animals induces the formation of specific antiviral antibodies, which limits their usefulness. as a biological carrier in vivo.
Den rapporterade litteraturen visar därför, attehurufosfolipidvesikler har insetts vara ett poten- tiellt betydelsefullt redskap för att införliva läke- medel.och andra cellmodifierande material i celler, den- na teknik på grund av de kända liposomernas begränsning- ar har fått endast begränsad framgång.The reported literature therefore shows that atrophospholipid vesicles have been recognized as a potentially important tool for incorporating drugs and other cell modifying materials into cells, this technique due to the limitations of the known liposomes has had only limited success.
Det är följaktligen huvudsyftet med förelig- gande uppfinning att erbjuda_liposomer som är fusogena och som smälter ihop med en cellmembran och framkallar fusion av celler med varandra.Accordingly, it is the principal object of the present invention to provide liposomes which are fusogenic and which fuse with a cell membrane and induce fusion of cells with each other.
Det är ett annat syfte att erbjuda ett förfa- rande för att framställa liposomer, som smälter ihop med en cellmembran och framkallar fusion av celler.It is another object to provide a process for producing liposomes which fuse with a cell membrane and induce fusion of cells.
Föreliggande uppfinnings syften ernås genom införlivning av ett kvaternärt ammoniumhydroxidsalt i en liposoms membran antingen under liposomens framställ- ning eller efter framställningen. Det har befunnits, att närvaro av det kvaternära ammoniumhydroxidsaltet i fosfolipidvesikelns membran tillåter vesikeln att smäl- ta ihop med en cellmembran och framkalla fusion av cel- 464 448 ler. Om vesikeln är laddad med ett läkemedel eller nâ- gon annan cellmodifierande substans, kommer vesikelns , innehåll att mikroinjiceras i djur- eller växtcellen.The objects of the present invention are achieved by incorporating a quaternary ammonium hydroxide salt into a membrane of a liposome either during the preparation of the liposome or after the preparation. It has been found that the presence of the quaternary ammonium hydroxide salt in the membrane of the phospholipid vesicle allows the vesicle to fuse with a cell membrane and induce fusion of cells. If the vesicle is loaded with a drug or other cell-modifying substance, the contents of the vesicle will be microinjected into the animal or plant cell.
Det kvaternära ammoniumhydroxidsaltets förmåga att om- 1 vandla fosfolipidvesiklerna från icke fusogena till fu- ' sogena vesikler är synnerligen förvånande med tanke på att andra kvaternära ammoniumsalter än hydroxidsalterna ger vesikler som inte är fusogena. Sålunda har det visat sig,att fosfolipidvesikler innehållande kvaternära ammo- niumhalider,kvaternära ammoniumacetatochliknande,inte smälter ihop med en cell och således inte heller mikroinjice- rar vesiklernas innehålli.encell.Dessa vesikler reagerar likadant som de kända icke fusogena vesiklerna och synes införliva sitt innehåll i cellernafgenom en endocytoslik- nande process. De fusogena egenskaperna hos liposomerna enligt föreliggande uppfinning erbjuder å andra sidan ett bekvämt medel att införliva vilken som helst cell- modifierande substans, som kan infângas i en fosfolipid- vesikel, direkt i en växt- eller djurcell i väsentligen kvantitativa mängder.The ability of the quaternary ammonium hydroxide salt to convert the phospholipid vesicles from non-fusogenic to fusogenic vesicles is particularly surprising given that quaternary ammonium salts other than the hydroxide salts yield non-fusogenic vesicles. Thus, it has been found that phospholipid vesicles containing quaternary ammonium halides, quaternary ammonium acetate and the like, do not fuse with a cell and thus do not microinject the contents of the vesicles into a single cell. These vesicles react similarly to the known non-fusogenic and viscous contents. in the cells through an endocytosis-like process. The fusogenic properties of the liposomes of the present invention, on the other hand, offer a convenient means of incorporating any cell-modifying substance that can be entrapped in a phospholipid vesicle directly into a plant or animal cell in substantially quantitative amounts.
Detkvaternäraammoniumhydroxidsaltet för in- förlivning i fosfolipidvesikelns vägg eller membran har formeln R1 - N - R3 OH vari R1 är en stor alkylgrupp eller en kombination av . en alkyl- och arylradikal som bibringar saltet ytaktiva egenskaper, och R2, R3 och R» är grenkedjiga alkylradi- kaler med 1 till 20 kolatomer eller en arylradikal eller R2 och R3 tillsammans kan vara en 5-ledad eller 6-ledad 464 448 heterocyklisk radikal, såsom pyrrol eller pyridin. Sär- skilt föredragna föreningar är de ytaktiva medlen ce- tylbensyldimetylammoniumhydroxid, hexadecyltrimetylam- moniumhydroxid, cetyltrimetylammoniumhydroxid, diisobu- tylkresoxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid, diiso- butylfenoxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid, me- tyldodecylbensyltrimetylammoniumhydroxid, metyldodecyl- xylenbis(trimetylammoniumhydroxid), N-alkyl-(C12,C1u,- C16)-dimetylbensylammoniumhydroxid och oktylkresoxiet- oxietyldimetylbensylammoniumhydroxid. Det är väsentligt, att det kvaternära ammoniumhydroxidsaltet har ytaktiva egenskaper och innehåller hydroxiradikalen, så att den bibringar fosfolipidvesikeln fusogena egenskaper. Mäng- den kvaternärt ammoniumhydroxidsalt i vesiklerna varie- rar normalt från ca 5 till 750 ug per 1 mg fosfolipid och företrädesvis från ca 50 till 250 pg kvaternärt am- moniumhydroxidsalt per 1 mg fosfolipid.The quaternary ammonium hydroxide salt for incorporation into the wall or membrane of the phospholipid vesicle has the formula R 1 - N - R 3 OH wherein R 1 is a large alkyl group or a combination of. an alkyl and aryl radical which imparts surfactant properties to the salt, and R 2, R 3 and R 2 are branched chain alkyl radicals having 1 to 20 carbon atoms or an aryl radical or R 2 and R 3 together may be a 5-membered or 6-membered heterocyclic radical , such as pyrrole or pyridine. And in particular preferred compounds are the surfactants cement tylbensyldimetylammoniumhydroxid, hexadecyltrimetylam- hydroxide, cetyltrimetylammoniumhydroxid, diisobutyl tylkresoxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid, diisopropyl butylfenoxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid, methylene tyldodecylbensyltrimetylammoniumhydroxid, metyldodecyl- xylenbis (hydroxide), N-alkyl (C12, C1u, - C16) -dimethylbenzylammonium hydroxide and octylcresoxy-oxyethyldimethylbenzylammonium hydroxide. It is essential that the quaternary ammonium hydroxide salt has surfactant properties and contains the hydroxy radical so that it imparts fusogenic properties to the phospholipid vesicle. The amount of quaternary ammonium hydroxide salt in the vesicles normally ranges from about 5 to 750 ug per 1 mg of phospholipid and preferably from about 50 to 250 pg of quaternary ammonium hydroxide salt per 1 mg of phospholipid.
De enligt föreliggande uppfinning användbara liposomerna kan vara vilka som helst av de kända lipo- somerna. Exemplifierande liposomer innefattar de natur- liga och syntetiska fosfokolinhaltiga lipiderna med en fettsyrakedja av 12 till 20 kolatomer och en fettsyra- kedja med minst 8 kolatomer, exemplifierade av dimyri- stoylfosfatidylkolin, dioleoylfosfatidylkolin, dipal- mitoylfosfatidylkolin,,distearovlfosfatidylkolin, fos- fatidylkolinc3fl1sfingomyelin; samt kolesterol och lik- nande. Liposomerna kan framställas med nâgra av de väl- kända publicerade metoderna, såsom sonikation av fosfo- -«li idsus ensioner, reverserad indunstnin 'ellerneh dra- P 9 Y tíëñ av torkade lager av fosfolipidmolekyler. Lämpliga metoder beskrivs i "Procedure for Preparation of Lipo- somes with Large Internal Aqueous Space and High Cap- ture by Reverse-Phase Evaporation", av Szoka et al, an- förd ovan; "Dehydration-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes", av Kirby och Gregoriadis, anförd ovan, såväl som andra kända 464 448 metoder, såsom användning av tensider (se Szoka och Pa- pahadjopoulos, Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 2 (1980), sid. 467-480). Dessutom kan den cellmodifierande sub- stansen, som kan inneslutas i liposomen och mikroinji- ceras i djur- eller växtceller genom fusion med liposo- merna enligt föreliggande uppfinning, vara någon av de tidigare föreslagna substanserna. Det har befunnits, att substanser, som kan inkapslas i liposomen och mikro- injiceras i en cell enligt uppfinningen, inkluderar DNA och DNA-fragment, farmaceutiskt aktiva föreningar och beredningar därav såsom kolhydrater, nukleotider, poly- nukleotider, både naturliga och syntetiska, influensa- vacciner och antigener samt andra substanser, som kan påverka djur- och växtcellers fysiologi.The liposomes useful in the present invention may be any of the known liposomes. Exemplary liposomes include the natural and synthetic phosphocholine-containing lipids having a fatty acid chain of 12 to 20 carbon atoms and a fatty acid chain having at least 8 carbon atoms, exemplified by dimyristoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, dipalcataphylphylylphosphonylpholinylphosphonylpholinyl as well as cholesterol and the like. The liposomes can be prepared by any of the well-known published methods, such as sonication of phospholipids, reversed evaporation or removal of dried layers of phospholipid molecules. Suitable methods are described in "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", by Szoka et al., Cited above; "Dehydration-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes", by Kirby and Gregoriadis, cited above, as well as other known 464,448 methods, such as the use of surfactants (see Szoka and Papahadjopoulos, Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 2 (1980), pp. 467-480). In addition, the cell-modifying substance that can be entrapped in the liposome and microinjected into animal or plant cells by fusion with the liposomes of the present invention may be any of the previously proposed substances. It has been found that substances which can be encapsulated in the liposome and micro-injected into a cell of the invention include DNA and DNA fragments, pharmaceutically active compounds and preparations thereof such as carbohydrates, nucleotides, polynucleotides, both natural and synthetic, influenza. vaccines and antigens as well as other substances which may affect the physiology of animal and plant cells.
Följande exempel belyser föredragna sätt att framställa de fusogena liposomerna enligt uppfinningen.The following examples illustrate preferred methods of preparing the fusogenic liposomes of the invention.
Exempel 1 Införlivning av kvaternärt ammoniumhydroxid- salt i liposommembraner under liposomframställning 2 mg oladdad fosfolipid, fosfatidylkolin (PC), och 1 mg kolesterol intorkas ur kloroformlösningar. Det av PC och kolesterol erhållna torra skiktet solubilise- ras med 1 ml dietyleter, och den erhållna lösningen sätts till en suspension innehållande 2 mg oktylkres- oxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid (Q-salt) i acetatbuffert vid pH 7,0. Den erhållna suspensionen om- rörs sedan kraftigt och ljudbehandlas kortvarigt i en -badsonikator. Reversindunstade stora enlamelliga lipo- samer framställs sedan med den metod som beskrivs i' "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", av Szoka et al, ovan. överskott av icke införlivat Q-salt avlägsnas genom tillsats av SM-2 Bio-beads enligt den metod som beskrivs i "A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes" av Vainstein et al, 464 448 ovan. Sålunda inkuberas omkring 50 - 80 mg SM-2 Bio- beads med ovan beskrivna fosfolipider och Q-salt un- der 40 - 60 minuter vid rumstemperatur under mild om- skakning i en slutlig volym av 1 ml acetatbuffert. En kvantitativ uppskattning visar, att omkring 30 - 40 % av det tillsatta Q-saltet införlivas i fosfolipiddubbel- skiktet (300 - 400 pg Q-salt per mg PC). För framställ- ning av liposomer laddade med en komponent av intresse sätts de önskade komponenterna, såsom droger, enzymer, RNA eller DNA, till bufferten, vari fosfolipiderna är suspenderade, såsom beskrivs i "Procedure for Prepara- tion of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", av Szoka et al, ovan.Example 1 Incorporation of quaternary ammonium hydroxide salt into liposome membranes during liposome preparation 2 mg of uncharged phospholipid, phosphatidylcholine (PC), and 1 mg of cholesterol are dried from chloroform solutions. The dry layer obtained by PC and cholesterol is solubilized with 1 ml of diethyl ether, and the resulting solution is added to a suspension containing 2 mg of octylcreoxyethoxyethyldimethylbenzylammonium hydroxide (Q-salt) in acetate buffer at pH 7.0. The resulting suspension is then stirred vigorously and sonicated briefly in a bath sonicator. Reverse-evaporated large single lamellar liposomes are then prepared by the method described in "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", by Szoka et al., Supra. Excess unincorporated Q salt is removed by the addition of SM-2 Bio-beads according to the method described in "A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes" by Vainstein et al, 464 448 above. Thus, about 50-80 mg of SM-2 Biobeads are incubated with the above-described phospholipids and Q-salt for 40-60 minutes at room temperature with gentle shaking in a final volume of 1 ml of acetate buffer. A quantitative estimate shows that about 30-40% of the added Q-salt is incorporated into the phospholipid bilayer (300-400 pg of Q-salt per mg of PC). To prepare liposomes loaded with a component of interest, the desired components, such as drugs, enzymes, RNA or DNA, are added to the buffer in which the phospholipids are suspended, as described in "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space". and High Capture by Reverse-Phase Evaporation ", by Szoka et al., supra.
Det i exempel 1 angivna förfarandet för fram- ställning av fusogena liposomer.rekommenderas inte när laddade molekyler infångas i liposomerna. Under vissa betingelser och vid ett visst pH blir varje negativt laddad komponent komplexbunden vid den kvaternära am- moniumhydroxiden och utfälld därmed. Eftersom det kva- ternära ammoniumhydroxidsaltet är positivt laddat, sam- verkar det elektrostatiskt med varje negativt laddad molekyl, såsom nukleinsyrorna, exemplifierade av DNA eller RNA, vilka är starkt negativt laddade vid neut- ralt pH. Bildning av sådana komplex mellan det posi- tivt laddade kvaternära ammoniumhydroxidsaltet och de negativt laddade molekylerna minskar infångningseffek- tiviteten (antalet inom varje liposom infângade moleky- ler) och liposomernas fusogena aktivitet. Följaktligen anges i exempel 2 en andra metod för framställning av fusogena liposomer, vari direkt kontakt mellan det kva- ternära ammoniumhydroxidsaltet och de infångade mole- kylerna undviks. 464 449 Exempel 2 Insats av Q-salt i redan framställda laddade liposomer Laddade liposomer framställs såsom beskrivs i exempel 1 eller i enlighet med ovan beskrivna tidi- gare publicerade metoder. Till skillnad från den i exempel 1 beskrivna metoden tillsätts inte Q-saltet under framställningen av liposomerna, utan efter till- sats av de laddade liposomerna till en suspension inne- hållande laddade omförseglade liposomer. Inkubation av Q-saltet med en suspension av omförseglade liposomer resulterar i införlivning av Q-saltmolekylens hydro- foba del i liposomens fosfolipiddubbelskikt.The procedure set forth in Example 1 for the preparation of fusogenic liposomes is not recommended when charged molecules are trapped in the liposomes. Under certain conditions and at a certain pH, each negatively charged component becomes complexed to the quaternary ammonium hydroxide and precipitates thereby. Because the quaternary ammonium hydroxide salt is positively charged, it interacts electrostatically with any negatively charged molecule, such as the nucleic acids exemplified by DNA or RNA, which are strongly negatively charged at neutral pH. The formation of such complexes between the positively charged quaternary ammonium hydroxide salt and the negatively charged molecules reduces the capture efficiency (the number of molecules captured within each liposome) and the fusogenic activity of the liposomes. Accordingly, Example 2 discloses a second method for preparing fusogenic liposomes in which direct contact between the quaternary ammonium hydroxide salt and the entrapped molecules is avoided. 464 449 Example 2 Insertion of Q-salt into already prepared charged liposomes Charged liposomes are prepared as described in Example 1 or according to the previously published methods described above. Unlike the method described in Example 1, the Q salt is not added during the preparation of the liposomes, but after the addition of the charged liposomes to a suspension containing charged resealed liposomes. Incubation of the Q salt with a suspension of resealed liposomes results in the incorporation of the hydrophobic portion of the Q salt molecule into the phospholipid bilayer of the liposome.
Förfarandet utförs som följer: En suspension innehållande fosfolipidvesikler (liposomer) framställda av 2 mg PC och 1 mg kolesterol, suspenderade i 400 ul acetatbuffert, sätts till ett rör innehållande 3 mg Q-salt i 20 ul acetatbuffert. Den erhållna blandningen omrörs kraftigt, varefter den inkuberas 10 - 15 minu- ter vid 37°C med sakta omskakning. överskott av fritt icke införlivat Q-salt bortskaffas genom adsorption på SM-2 Bio-beads, såsom beskrivs ovan. En kvantitativ uppskattning visade igen, att omkring 30 % av det till- satta Q-saltet införlivades i fosfolipiddubbelskiktet. fFörfarandet enligt exempel 2 kan vara fördel- aktigt för vissa framställningar framför förfarandet enligt exempel 1, i det att molekyler som innesluts i liposomen uppfångas inom liposomen före tillsats av Q-saltet; därför kan ingen samverkan ske mellan det inneslutna materialet och det tillsatta ytaktiva med- let. Dessutom är de med förfarandet enligt exempel 2 framställda Q-saltbärande liposomernas fusogena egen- skaper överlägsna de med förfarandet enligt exempel 1 framställda liposomernas.The procedure is performed as follows: A suspension containing phospholipid vesicles (liposomes) prepared from 2 mg PC and 1 mg cholesterol, suspended in 400 μl acetate buffer, is added to a tube containing 3 mg Q salt in 20 μl acetate buffer. The resulting mixture is stirred vigorously, after which it is incubated for 10 - 15 minutes at 37 ° C with slow shaking. excess free unincorporated Q-salt is disposed of by adsorption on SM-2 Bio-beads, as described above. A quantitative estimate again showed that about 30% of the added Q salt was incorporated into the phospholipid bilayer. The process of Example 2 may be advantageous for certain preparations over the process of Example 1, in that molecules entrapped in the liposome are trapped within the liposome prior to the addition of the Q salt; therefore, no interaction can occur between the entrapped material and the added surfactant. In addition, the fusogenic properties of the Q salt-bearing liposomes prepared by the method of Example 2 are superior to those of the liposomes prepared by the method of Example 1.
De i exempel 2 beskrivna av fosfatidylkolin och kolesterol sammansatta liposomernas (PC/kolesterol- V\ 464 448 liposomernas) förmåga att framkalla cellfusion studera- des genom inkubation med mänskliga erytrocyter och med hepatomvävnadskulturceller (HTC) i jämförelse med kont- roller. Q-salt, som är oktylkresoxietoxietyl-dimetyl- bensylammoniumhydroxid, C-salt som är oktylkresoxietoxi- etyldimetyl-bensylammoniumklorid, och B-salt, som är bensyl-dimetyl-hexadecylammoniumbromid, införlivades i redan bildade liposomer, såsom beskrivs i exempel 2. I dessa försök inkuberades antingen fritt Q-salt (5 - 10 ug) eller fritt C-salt (5 - 10 ng) eller fritt B-salt (5 - 10 pg) eller liposomer bärande dessa kvaternära ammoniummolekyler (20 pg PC) med en cellsuspension (106 celler) under 15 minuter vid 3700. Agglutinering av cel- ler och cellfusion följdes genom observation i ett fas- mikroskop. Resultaten är tabulerade i tabell I.The ability of the liposomes (PC / Cholesterol Liposomes) of phosphatidylcholine and cholesterol described in Example 2 to study cell fusion was studied by incubation with human erythrocytes and with hepatoma tissue culture cells (HTC) in comparison with controls. Q-salt, which is octylcresoxyethoxyethyl-dimethyl-benzylammonium hydroxide, C-salt, which is octylcreoxyethoxyethyldimethyl-benzylammonium chloride, and B-salt, which is benzyl-dimethyl-hexadecylammonium bromide, were incorporated into the already formed liposomes 2, as described in I. experiments, either free Q-salt (5 - 10 μg) or free C-salt (5 - 10 ng) or free B-salt (5 - 10 pg) or liposomes bearing these quaternary ammonium molecules (20 pg PC) were incubated with a cell suspension ( 106 cells) for 15 minutes at 3700. Agglutination of cells and cell fusion were monitored by observation in a phase microscope. The results are tabulated in Table I.
Tabell I Karakterisering av liposomer bärande fusogena och icke fusogena kvaternära ammoniumsalter Humanerytrocyter inkuberade Agglutination Cellfusion med: PC/kolesterol-liposomer.... - - Fritt Q-salt (OH_-salt).... + + PC/kolesterol-liposomer bä- rande Q-salt (OH_-salt).... + +++ Fritt c-salt (c1"-sa1t).... + - PC/kolesterol-C-salt (Cl-- salt) . . . . . . ... . . . . . . . . . . . .. + - Fritt B-salt..... = . ; . . . . . .. + - PC/kolesterol-liposomer bä- rande B-salt............... + - 464 448 Tabell I (forts.) HTC-inkuberade med: Agglutination Cellfusion PC/kolesterol-liposomer.... - - Fritt Q-salt (oH'-sa1t).... + + PC/kolesterol-liposomer bä- rande Q-salt (0H_-salt).... + +++ Fritt C-salt (Cl--salt).... + - PC/kolesterol-C-salt (Cl_- salt) . . . . . . . . ... . . . . . . . . . .. + - B-salt...... . . . . . . ......... + - PC/kolesterol-liposomer bä- rande B-salt . . . . . . . . . . . . ... + - De i tabell I sammanfattade resultaten visar följande: (1) Liposomer sammansatta av PC/kolesterol men utan kvaternära ammoniummolekyler hade ingen inver- kan på agglutinering eller cellfusion av humanerytrocy- ter eller HTC-celler. (2) Alla de använda kvaternära ammoniummole- kylerna (Q-salt, C-salt och B-salt), vare sig i fri form eller införlivade i liposomer, var i stånd att framkalla cellagglutinering. Detta torde bero på bindningen av de positivt laddade kvaternära ammoniumsaltmolekylerna vid de negativt laddade cellmembranerna. (3) Endast Q-saltet, dvs hydroxidsaltet, vare sig i fri form eller införlivat i liposomer, kunde fram- .kalla cellfusion. Framkallandet av cellfusion med lipo- somer oärande Q-salt var mycket högre än med fritt Q- salt. De kvaternära ammoniumklorid- och -bromidsalterna framkallade inte cellfusion trots att de kan bindas vid cellmembraner, såsom kan härledas ur deras förmåga att framkalla cellagglutination.Table I Characterization of liposomes bearing fusogenic and non-fusogenic quaternary ammonium salts Human erythrocytes incubated Agglutination Cellfusion with: PC / cholesterol liposomes .... - - Free Q-salt (OH_-salt) .... + + PC / cholesterol liposomes bä - edge Q-salt (OH_-salt) .... + +++ Free c-salt (c1 "-sa1t) .... + - PC / cholesterol-C-salt (Cl-- salt)... ........... + + Free B-salt ..... =.;..... .. + - PC / cholesterol liposomes bearing B-salt ............... + - 464 448 Table I (continued) HTC-incubated with: Agglutination Cellfusion PC / cholesterol liposomes .... - - Free Q-salt (oH'-salt) .... + + PC / cholesterol liposomes bearing Q-salt (OH-salt) .... + +++ Free C-salt (Cl - salt) .... + - PC / cholesterol-C-salt (Cl_-salt).................. .. + - B-salt ......... ......... + - PC / cholesterol liposomes bearing B-salt.......... ... + - The results summarized in Table I show the following: : (1) Liposomes composed of PC / cholesterol but without quaternary ammonium molecules had no effect on agglutination or cell fusion of human erythrocytes or HTC cells. (2) All the quaternary ammonium molecules used (Q-salt, C-salt and B-salt), either in free form or incorporated into liposomes, were capable of inducing cell agglutination. This is likely due to the binding of the positively charged quaternary ammonium salt molecules to the negatively charged cell membranes. (3) Only the Q salt, i.e. the hydroxide salt, either in free form or incorporated into liposomes, could induce cell fusion. The induction of cell fusion with liposomer-free Q-salt was much higher than with free Q-salt. The quaternary ammonium chloride and bromide salts did not induce cell fusion although they can bind to cell membranes, as can be deduced from their ability to induce cell agglutination.
Fusion av liposomer bärande ett kvaternärt am- moniumhydroxidsalt med celler visas också av deras för- måga att mikroinjicera sitt innehåll i djur- och växt- n 464 448 11 cellers cytoplasma. Tre system har använts för att kons- tatera fusion av Q-salt bärande liposomer med levande celler och mikroinjektion av innehållet i dessa, på föl- jande sätt: (1) Toxinet ricin-A-kedja inneslöts i liposo- merna, och dessa laddade liposomer inkuberades med cel- ler i kultur, såsom HTC. Ricin A inhiberar cellprotein- syntesen och dödar därför celler endast när det före- kommer inne i cellerna. Till skillnad från hela ricin- molekylen (ricin innehållande både A- och B-enheten) kan ricin-A-kedjan inte för sig själv tränga in i cel- lerna. När den förekommer utanför cellen har den såle- des inte någon letal effekt. (2) SVQÛ-DNA, dvs DNA extraherad ur viruset SVQO, inneslöts i liposomerna. Liposomer laddade med SVQO-DNA inkuberades med odlade HTC. Mikroinjektion av Svro-DNA i HTC-cellerna observerade genom uppträdandet av ett specifikt protein, SVQO-T-antigen. Syntes av SV40-T-antigen induceras endast när SV40-DNA införs i cellens cytoplasma varifrån den överförs till cellkärnan.Fusion of liposomes bearing a quaternary ammonium hydroxide salt with cells is also shown by their ability to microinject their contents into the cytoplasm of animal and plant cells. Three systems have been used to detect fusion of Q-salt-bearing liposomes with living cells and microinjection of their contents, as follows: (1) The toxin ricin-A chain was entrapped in the liposomes, and these charged liposomes were incubated with cells in culture, such as HTC. Ricin A inhibits cell protein synthesis and therefore kills cells only when present inside the cells. Unlike the entire ricin molecule (ricin containing both the A and B units), the ricin A chain cannot penetrate the cells on its own. When it occurs outside the cell, it thus has no lethal effect. (2) SVQÛ DNA, ie DNA extracted from the SVQO virus, was entrapped in the liposomes. Liposomes loaded with SVQO DNA were incubated with cultured HTC. Microinjection of Svro DNA into the HTC cells observed through the appearance of a specific protein, SVQO-T antigen. Synthesis of SV40-T antigen is induced only when SV40 DNA is introduced into the cytoplasm of the cell from where it is transferred to the cell nucleus.
Det är också att märka, att (a) uppträdande av SVQO-T-antigen förekom endast i levande celler, enär den kräver aktiv proteinsyntes; och (b) fria SV40-DNA-mole- kyler är vid inkubering med levande celler ur stånd att tränga in i cellerna, och dessa fria molekyler framkal- lar således inte syntes av T-antigenet. (3) Fluorescensmärkta proteinmolekyler, näm- ligen fluorescensmärkt bovinserumalbumin, BSA, inne- slöts i liposomerna, Laddade liposomer inkuberades se- dan med antingen växtprotoplaster eller en suspension av växtceller. Fusionsförmedlad mikroinjektion observe- rades genom att uppträdandet av intracellulär fluorescens följdes. 464 448 12 (a) Fusionsförmedlad mikroinjektion av ri- cin-A-kedja med fusogena liposomer De i tabell II sammanfattade resultaten visar, att endast liposomer laddade med ricin-A-kedja och bä- rande det kvaternära ammoniumhydroxidsaltet (Q-saltet) framkallade en stark inhibering av proteinsyntesen och ett höggradigt dödande av HTC. Inget dödande iakttogs vare sig med oladdade liposomer eller med fri ricin-A- kedja. Som synes framkallades mycket litet dödande ut- över kontrollerna av liposomer bärandet det kvaternära ammoniumkloridsaltet (C-saltet), vilket tyder på ingen eller i huvudsak ingen fusion av liposomer och celler.It is also to be noted that (a) appearance of SVQO-T antigen occurred only in living cells, since it requires active protein synthesis; and (b) free SV40 DNA molecules are unable to enter the cells upon incubation with living cells, and thus these free molecules do not induce synthesis of the T antigen. (3) Fluorescently labeled protein molecules, namely fluorescently labeled bovine serum albumin, BSA, were included in the liposomes. Charged liposomes were then incubated with either plant protoplasts or a suspension of plant cells. Fusion-mediated microinjection was observed by monitoring the occurrence of intracellular fluorescence. 464 448 12 (a) Fusion-mediated microinjection of ricin-A chain with fusogenic liposomes The results summarized in Table II show that only liposomes charged with ricin-A chain and bearing the quaternary ammonium hydroxide salt (Q salt) developed a strong inhibition of protein synthesis and a high-level killing of HTC. No killing was observed either with uncharged liposomes or with free ricin A chain. Apparently, very little killing was induced beyond the controls of liposomes bearing the quaternary ammonium chloride salt (C-salt), indicating no or substantially no fusion of liposomes and cells.
Tabell II Förmåga hos fusogena liposomer laddade med ricin A att inhibera proteinsyntes och döda HTC HTC inkuberade med Inhibition av HTC dödade proteinsyntes (%) (%) PC/kolesterol-liposomer._.. 0 Fri ricin-A-kedja . . . . . . . . .. 5 PC/kolesterol-liposomer lad- dade med ricin A . . . . . . . . . .. 6 7 PC/kolesterol-liposomer bä- rande Q-salt (OH--salt).... 5 8 PC/kolesterol-liposomer lad- dade med ricin-A-kedja och bärande Q-salt zon'-sawfy.. a 90 95 PC/kolesterol-liposomer lad- dade med ricin-A-kedja och bärande C-salt (Cl_-salt).. 17 14 Ricin-A-kedja fångades först i PC/kolesterol- liposomer med den metod som beskrivs i "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation“, U V) 464 448 13 av Szoka et al, ovan, varefter kvaternärt ammoniumsalt (antingen OH_- eller Cl--saltet) införlivades i liposom- dubbelskiktet, såsom ovan anges. I försöken inkuberades - 20 pg liposomer med 106 celler under 30 minuter vid 37oC, under vilken tid liposomerna reagerade med cellerna. Vid inkubationstidens slut tvättades celler- na och inkuberades ytterligare 12 h i ett odlingsmedium, varefter proteinsyntesen (genom införlivning av 3H-leu- cin) och cellernas viabilitet (genom färgning med try- panblått) bedömdes. (b) Fusionsförmedlad mikroinjektion av SVl, 0 -DNA Resultaten i tabell III visar, att fusogena liposomer kan användas för mikroinjektion av aktiva ge- ner (DNA-molekyler) i celler under kultur, såsom HTC.Table II Ability of fusogenic liposomes loaded with ricin A to inhibit protein synthesis and kill HTC HTC incubated with Inhibition of HTC killed protein synthesis (%) (%) PC / cholesterol liposomes._ .. 0 Free ricin A chain. . . . . . . . .. 5 PC / cholesterol liposomes loaded with ricin A. . . . . . . . . .. 6 7 PC / cholesterol liposomes carrying Q-salt (OH - salt) .... 5 8 PC / cholesterol liposomes loaded with ricin A chain and carrying Q-salt zon'-sawfy .. a 90 95 PC / cholesterol liposomes loaded with ricin-A chain and bearing C-salt (Cl_-salt) .. 17 14 Ricin-A chain was first captured in PC / cholesterol liposomes by the method described in "Procedure for the Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", UV) 464 448 13 by Szoka et al., supra, after which quaternary ammonium salt (either the OH_ or Cl - salt) was incorporated into In the experiments, - 20 pg of liposomes were incubated with 106 cells for 30 minutes at 37 ° C, during which time the liposomes reacted with the cells. At the end of the incubation period, the cells were washed and incubated for another 12 h in a culture medium, after which protein synthesis ( by incorporation of 3 H-leucine) and cell viability (by staining with trypan blue) were assessed. mediated microinjection of SV1,0 DNA The results in Table III show that fusogenic liposomes can be used for microinjection of active genes (DNA molecules) into cells under culture, such as HTC.
Alla försöksbetingelser och inkubationen med HTC var såsom beskrivs i tabell II för ricin A. SVQO-DNA in- stängdes i liposomer, såsom beskrivs i "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation“, av Szoka et al, ovan. Uppträdandet av Svro-T-antigen uppskattades på ovan beskrivet sätt med hjälp av spe- cifik fluorescensmärkt anti-SV~0-T-antigenantikropp.All experimental conditions and incubation with HTC were as described in Table II for ricin A. SVQO DNA was entrapped in liposomes, as described in "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", by Szoka et al., Supra The occurrence of Svro-T antigen was estimated as described above using specific fluorescently labeled anti-SV ~ O-T antigen antibody.
Tabell III Förmåga hos laddade fusogena liposomer (li- posomer bärande Q-salt) att mikroinjicera Svro-DNA HTC-inkuberad med liposomer SVQO-T-antigen-positiva laddade med Svgo-DNA celler (t av samtliga; PC/kolesterol-liposomer..... 0 PC/kolesterol bärande Q-salt (oH'-salt) . . . . . . . . . . . . . . . . ._ PC/kolesterol bärande C-salt (c1'-salt) . . . . . . . . . . . . . . . . ._ o - 15 464 448 14 Det specifika T-antigenet syntes i kärnan av - 15 % av celler inkuberade med liposomer laddade med SV40-DNA och bärande Q-salt (OH--salt). Inget T-an- tigen syntes i celler inkuberade med PC/kolesterol lad- dade med SVQU-DNA, men bärande C-salt (Cl--salt). (c) Fusionsförmedlad injektion av fluorescent BSA i protoplaster och växtcellssuspension av Petunia hybrida Protoplaster av celler från Petunia hybrida framställdes med konventionella metoder, såsom beskrivs i litteraturen. Fluorescent BSA inneslöts i liposomer, såsom beskrivs för ricin-A-kedja, och sedan införlivades Q-salt i de laddade liposomernas membran, såsom beskrivs ovan. I försöket inkuberades 10 - 20 pg laddade liposo- mer med 5 x 105 protoplaster eller växtceller. Efter - 60 minuters inkubation vid 28°C följdes uppträdan- det av intracellulär fluorescens genom användning av fluorescensmikroskopi.Table III Ability of charged fusogenic liposomes (Q-salt-bearing liposomes) to microinject Svro DNA HTC-incubated with liposomes SVQO-T antigen-positive charged with Svgo DNA cells (t of all; PC / cholesterol liposomes). .... 0 PC / cholesterol-bearing Q-salt (oH'-salt)............. ._ PC / cholesterol-bearing C-salt (c1'-salt). The specific T antigen was synthesized in the nucleus of - 15% of cells incubated with liposomes loaded with SV40 DNA and bearing Q-salt. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ... (OH - salt) No T-antigen was found in cells incubated with PC / cholesterol loaded with SVQU DNA, but bearing C-salt (Cl - salt). (C) Fusion-mediated injection of fluorescent BSA in protoplasts and plant cell suspension of Petunia hybrida Protoplasts of cells of Petunia hybrida were prepared by conventional methods as described in the literature, fluorescent BSA was entrapped in liposomes as described for ricin A chain, and then Q-salt was incorporated into the charged li the membranes of the posomes, as described above. In the experiment, 10 - 20 pg of charged liposomes were incubated with 5 x 105 protoplasts or plant cells. After -60 minutes of incubation at 28 ° C, the occurrence of intracellular fluorescence was monitored using fluorescence microscopy.
Tabell IV Fusionsförmedlad injektion av fluorescent bovinserumalbumin i växtprotoplaster av växtcellssus- pension av Petunia hybrida Petunia-protoplaster inkuberade med liposomer laddade med fluor- escent BSA PC/kolesterol........ . . . . . . . . . _.Table IV Fusion-mediated injection of fluorescent bovine serum albumin into plant protoplasts of plant cell suspension of Petunia hybrida Petunia protoplasts incubated with liposomes loaded with fluorescent BSA PC / cholesterol ......... . . . . . . . . _.
PC/kolesterol bärande Q-salt (OH_-salt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..PC / cholesterol bearing Q-salt (OH_-salt). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
Petunia-cellsuspension inkuberad med liposomer laddade med fluorescent BSA PC/kolesterol . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Petunia cell suspension incubated with liposomes loaded with fluorescent BSA PC / cholesterol. . . . . . . . . . . . . . . . . ..
PC/kolesterol bärande Q-salt (oflf-salt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..PC / cholesterol-bearing Q-salt (o fl f-salt). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
Förekomst av intra- cellulär fluorescens (% av samtliga celler) 80 60 (å 464 448 Av resultaten i tabell IV framgår, att lipo- somer bärande Q-salt (OH_-salt) också kan mikroinjice- ” ra sitt innehåll i växtprotoplaster. Uppträdandet av fluorescens kan resultera endast från fusion av de laddade liposomerna med växtprotoplasterna. Varje annan process skulle leda till ett annat slags uppträdande av fluorescens. Resultaten i tabell IV visar, att förutom fusion (eller mikroinjektion) med växtprotoplaster lad- dade liposomer kunde smälta ihop med och mikroinjicera sitt innehåll i växtceller som omges av en cellvägg.Presence of intracellular fluorescence (% of all cells) 80 60 (å 464 448 The results in Table IV show that liposomes bearing Q-salt (OH_-salt) can also microinject their content in plant protoplasts. of fluorescence can result only from fusion of the charged liposomes with the plant protoplasts.Every other process would lead to a different kind of behavior of fluorescence.The results in Table IV show that in addition to fusion (or microinjection) with plant protoplasts charged liposomes could fuse with and microinjecting their contents into plant cells surrounded by a cell wall.
Till följd av närvaron av det starkt laddade Q-saltet synes liposomerna kunna gå genom cellväggen och smälta ihop med cellmembranen.Due to the presence of the highly charged Q salt, the liposomes appear to be able to pass through the cell wall and fuse with the cell membranes.
Användningar av de kvaternärt ammoniumhyd- roxidsalt bärande liposomerna Sedan framställningen av liposomer innehål- lande kvaternära ammoniumhydroxidsalter åskådliggjorts och de kvaternärt ammoniumhydroxidsalt i vesikelmembra- nerna innehållande liposomernas förmåga att smälta ihop med celler och framkalla cellfusion, under mikroinjek- tion av vesiklernas innehåll i cellen påvisats, anges olika användningar av liposomerna enligt uppfinningen. (1) Användning av fritt Q-salt (OH-) eller liposomer bärande Q-salt (OH-) som reagens för att fram- kalla cellfusion Djurcellsfusion, såsom har påvisats för de föreliggande liposomerna, är av största betydelse för genexpressionsundersökningar. Vidare har växtprotoplast- fusion många kommersiella tillämpningar, som kan reda till utveckling av nya växtarter med förbättrade egen- skaper. (2) Användning av fusogena liposomer för mik- roinjektion av olika komponenter i odlade djur- och växtceller Laddade fusogena liposomer kan användas för mikroinjektion av DNA, RNA, proteiner (enzymer, hormoner) *464 44s 16 och läkemedel i odlade celler. Dessutom kan de användas för mikroinjektion av organeller eller andra komponen- ter eller molekyler, som kan inneslutas i liposomerna.Uses of the quaternary ammonium hydroxide salt bearing liposomes Since the preparation of liposomes containing quaternary ammonium hydroxide salts has been illustrated and the quaternary ammonium hydroxide salt in the vesicle membranes containing the ability of the liposomes to fuse with cells and induce microcellular fusion, various uses of the liposomes of the invention are indicated. (1) The use of free Q-salt (OH-) or liposomes bearing Q-salt (OH-) as reagents to induce cell fusion Animal cell fusion, as has been demonstrated for the present liposomes, is of paramount importance for gene expression studies. Furthermore, plant protoplast fusion has many commercial applications, which can lead to the development of new plant species with improved properties. (2) Use of fusogenic liposomes for microinjection of various components in cultured animal and plant cells Charged fusogenic liposomes can be used for microinjection of DNA, RNA, proteins (enzymes, hormones) * 464 44s 16 and drugs in cultured cells. In addition, they can be used for microinjection of organelles or other components or molecules that can be entrapped in the liposomes.
Mikroinjektion av DNA, RNA eller organeller i celler, särskilt i växtprotoplaster eller växtceller, har en väsentlig kommersiell betydelse liksom hela fältet av genetisk teknik med växt- och djurceller. Vidare kan på grundval av försök med växt- och djurceller sägas, att liposomer bärande ett kvaternärt ammoniumhydroxidsalt kan smälta ihop med och mikroinjicera sitt innehåll i vilka som helst celler varmed de kan inkuberas. Såle- des kan dessa liposomer även smälta ihop med bakterie-, jäst- och algprotoplaster. (3) Användning av fusogena liposomer för av- givning av olika komponenter i celler in vivo, nämli- ggn vävnad eller celler av hela djur Fusogena liposomer kan efter injektion i la- boratoriedjur eller människor användas som bärare för avgivning av läkemedel, hormoner eller proteiner, såsom enzymer, och DNA. Denna metod kan användas för drog-, enzym- och genterapi. Icke fusogena laddade liposomer används för närvarande som bärare för läkemedel för te- rapi. Fusogena liposomer kan emellertid bli mycket ef- fektivare än icke fusogena liposomer som biologiska bä- rare, eftersom de injicerar sitt innehåll direkt i cell- cytoplasmat. (4) Användning av fusogena liposomer för ut- veckling av ett nytt icke isotopiskt känsligt analys- system för diagnostiska syften Liposomer bärande kvaternära ammoniumhydroxid- salter smälter ihop med andra liposomer. Fusion mellan liposomerna leder till läckning av deras innehåll. Den- na läckning beror specifikt på samverkan och fusion mel- lan liposomerna. Beroende på närvaro av de positivt lad- dade molekylerna av kvaternärt ammoniumhydroxidsalt, samverkar liposomer bärande dessa kvaternära ammonium- 464 448 17 molekyler inte med varandra, utan repellerar varandra.Microinjection of DNA, RNA or organelles into cells, especially in plant protoplasts or plant cells, has a significant commercial significance as does the whole field of genetic engineering with plant and animal cells. Furthermore, on the basis of experiments with plant and animal cells, it can be said that liposomes bearing a quaternary ammonium hydroxide salt can fuse with and microinject their contents into any cells with which they can be incubated. Thus, these liposomes can also fuse with bacterial, yeast and algal protoplasts. (3) Use of fusogenic liposomes for the delivery of various components in cells in vivo, namely tissue or cells of whole animals Fusogenic liposomes can be used as carriers for the delivery of drugs, hormones or proteins after injection into laboratory animals or humans. , such as enzymes, and DNA. This method can be used for drug, enzyme and gene therapy. Non-fusogenically charged liposomes are currently used as carriers for drugs for therapy. However, fusogenic liposomes can be much more effective than non-fusogenic liposomes as biological carriers, as they inject their contents directly into cell cytoplasm. (4) Use of fusogenic liposomes for the development of a new non-isotopically sensitive assay system for diagnostic purposes Liposomes bearing quaternary ammonium hydroxide salts fuse with other liposomes. Fusion between the liposomes leads to leakage of their contents. This leakage is specifically due to the interaction and fusion between the liposomes. Due to the presence of the positively charged molecules of quaternary ammonium hydroxide salt, liposomes bearing these quaternary ammonium molecules do not interact with each other, but repel each other.
Som ovan berörts, kan de samverka och smälta ihop en- dast med liposomer saknande det kvaternära ammoniumhyd- roxidsaltet. Två molekyler med förmåga att samverka med varandra med hög affinitet tvingar emellertid liposomer bärande det kvaternära ammoniumhydroxidsaltet att smälta ihop med varandra genom att övervinna den positiva ladd- ningens repulsionskrafter. Om ett specifikt antigen in- förlivas i de kvaternärt ammoniumhydroxidsalt bärande liposommembranerna, kommer således en mot detta antigen framställd antikropp att driva liposomerna att samverka.As mentioned above, they can only interact and fuse together with liposomes lacking the quaternary ammonium hydroxide salt. However, two molecules capable of interacting with each other with high affinity force liposomes bearing the quaternary ammonium hydroxide salt to fuse with each other by overcoming the repulsive forces of the positive charge. Thus, if a specific antigen is incorporated into the quaternary ammonium hydroxide salt-bearing liposome membranes, an antibody produced against that antigen will drive the liposomes to interact.
Samverkan mellan liposomer bärande kvaternärt ammonium- hydroxidsalt leder till fusion och frigivning av liposom- innehållet. En kvantitativ uppskattning av frigivnings- processen (frigivning av fluorescerande färgämne eller annat reagens) blir ett mått på samverkan mellan antigen och antikropp. Således kan fusion mellan liposomer bä- rande ett kvaternärt ammoniumhydroxidsalt användas för att kvantitativt bedöma samverkan mellan antikropp och dess antigen eller hormon och dess passande receptor.Interaction between liposomes bearing quaternary ammonium hydroxide salt leads to fusion and release of the liposome content. A quantitative estimate of the release process (release of fluorescent dye or other reagent) becomes a measure of the interaction between antigen and antibody. Thus, fusion between liposomes bearing a quaternary ammonium hydroxide salt can be used to quantitatively assess the interaction between antibody and its antigen or hormone and its appropriate receptor.
Detta system kan därför användas för att bestämma små mängder antigen eller hormon i en biologisk vätska.This system can therefore be used to determine small amounts of antigen or hormone in a biological fluid.
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71986285A | 1985-04-04 | 1985-04-04 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8601408D0 SE8601408D0 (en) | 1986-03-26 |
| SE8601408L SE8601408L (en) | 1986-10-05 |
| SE464448B true SE464448B (en) | 1991-04-29 |
Family
ID=24891665
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8601408A SE464448B (en) | 1985-04-04 | 1986-03-26 | FUSOGEN Phospholipid Vesicle Containing A Quaternary Ammonium Hydroxide Salt In The Membrane And A Procedure For Its Preparation |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61274739A (en) |
| AU (1) | AU585330B2 (en) |
| BE (1) | BE904536A (en) |
| BR (1) | BR8601554A (en) |
| CA (1) | CA1262863A (en) |
| CH (1) | CH668005A5 (en) |
| DE (1) | DE3610873A1 (en) |
| ES (1) | ES8802401A1 (en) |
| FR (1) | FR2579891B1 (en) |
| GB (1) | GB2188900B (en) |
| IL (1) | IL78348A (en) |
| IT (1) | IT1189877B (en) |
| NL (1) | NL8600794A (en) |
| NZ (1) | NZ215696A (en) |
| SE (1) | SE464448B (en) |
| ZA (1) | ZA862466B (en) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4897355A (en) * | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US5545412A (en) * | 1985-01-07 | 1996-08-13 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-[1, (1-1)-dialkyloxy]-and N-[1, (1-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-n,n,n-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4818537A (en) * | 1986-10-21 | 1989-04-04 | Liposome Technology, Inc. | Liposome composition for treating dry eye |
| JPS63275522A (en) * | 1987-05-01 | 1988-11-14 | Terumo Corp | Artificial erythrocyte and production thereof |
| JPH04283207A (en) * | 1991-03-13 | 1992-10-08 | Kao Corp | Vesicle and polymer vesicle |
| CN1241902A (en) * | 1996-10-25 | 2000-01-19 | 孟山都公司 | Composition and method for treating plants with exogenous chemicals |
| JP4155601B2 (en) * | 1996-10-25 | 2008-09-24 | モンサント・テクノロジー・エルエルシー | Compositions and methods for treating plants with exogenous chemicals |
| WO2013039994A2 (en) * | 2011-09-12 | 2013-03-21 | Cure Pharmaceutical Corp. | Apparatus, composition, and related methods for transdermal delivery of active ingredients |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4515736A (en) * | 1983-05-12 | 1985-05-07 | The Regents Of The University Of California | Method for encapsulating materials into liposomes |
| US4789633A (en) * | 1984-04-19 | 1988-12-06 | University Of Tennessee Research Corporation | Fused liposome and acid induced method for liposome fusion |
| NZ214716A (en) * | 1985-01-07 | 1989-04-26 | Syntex Inc | 1,2-dialkoxy-omega-trialkylammonium cationic surfactants |
-
1986
- 1986-03-26 SE SE8601408A patent/SE464448B/en not_active IP Right Cessation
- 1986-03-27 NL NL8600794A patent/NL8600794A/en not_active Application Discontinuation
- 1986-03-31 IL IL78348A patent/IL78348A/en unknown
- 1986-04-01 DE DE19863610873 patent/DE3610873A1/en not_active Withdrawn
- 1986-04-02 CA CA000505702A patent/CA1262863A/en not_active Expired
- 1986-04-02 BE BE0/216489A patent/BE904536A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-04-03 NZ NZ215696A patent/NZ215696A/en unknown
- 1986-04-03 IT IT83340/86A patent/IT1189877B/en active
- 1986-04-03 ZA ZA862466A patent/ZA862466B/en unknown
- 1986-04-03 ES ES553703A patent/ES8802401A1/en not_active Expired
- 1986-04-03 CH CH1297/86A patent/CH668005A5/en not_active IP Right Cessation
- 1986-04-03 JP JP61077505A patent/JPS61274739A/en active Pending
- 1986-04-03 AU AU55622/86A patent/AU585330B2/en not_active Ceased
- 1986-04-03 FR FR868604760A patent/FR2579891B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-04 BR BR8601554A patent/BR8601554A/en unknown
- 1986-04-08 GB GB8608468A patent/GB2188900B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT8683340A0 (en) | 1986-04-03 |
| FR2579891B1 (en) | 1990-02-02 |
| GB2188900B (en) | 1990-04-04 |
| CH668005A5 (en) | 1988-11-30 |
| NL8600794A (en) | 1986-11-03 |
| DE3610873A1 (en) | 1986-10-09 |
| FR2579891A1 (en) | 1986-10-10 |
| ES553703A0 (en) | 1988-05-16 |
| IL78348A (en) | 1989-08-15 |
| BR8601554A (en) | 1986-12-09 |
| SE8601408D0 (en) | 1986-03-26 |
| AU585330B2 (en) | 1989-06-15 |
| BE904536A (en) | 1986-07-31 |
| CA1262863A (en) | 1989-11-14 |
| IL78348A0 (en) | 1986-07-31 |
| IT1189877B (en) | 1988-02-10 |
| ES8802401A1 (en) | 1988-05-16 |
| ZA862466B (en) | 1986-11-26 |
| GB8608468D0 (en) | 1986-05-14 |
| JPS61274739A (en) | 1986-12-04 |
| AU5562286A (en) | 1986-10-09 |
| NZ215696A (en) | 1989-07-27 |
| SE8601408L (en) | 1986-10-05 |
| GB2188900A (en) | 1987-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5776908A (en) | Amphiphilic derivatives of piperazine | |
| Papahadjopoulos et al. | Incorporation of lipid vesicles by mammalian cells provides a potential method for modifying cell behaviour | |
| JP5480764B2 (en) | Amphoteric liposomes and uses thereof | |
| US5744625A (en) | Cationic transport reagents | |
| EP0750663B1 (en) | Apparatus and method for efficient incorporation of molecules into cells | |
| US4235871A (en) | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles | |
| JP5885833B2 (en) | Aminolipids, their synthesis and use | |
| SE464448B (en) | FUSOGEN Phospholipid Vesicle Containing A Quaternary Ammonium Hydroxide Salt In The Membrane And A Procedure For Its Preparation | |
| US5980935A (en) | Cationic lipids and methods of use therefor | |
| CN1915968A (en) | Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery | |
| GB2140822A (en) | Transformation of plant cells | |
| US6316260B1 (en) | Tetraether lipid derivatives and liposomes and lipid agglomerates containing tetraether lipid derivatives, and use thereof | |
| KR20220146590A (en) | Amino lipid compounds, methods for their preparation, and applications thereof | |
| CA2269502C (en) | Tetraether lipid derivatives and liposomes and lipid agglomerates containing tetraetherlipid derivatives, and use thereof | |
| US4571332A (en) | 125 I and 131 I labeled phospholipids | |
| Saitoh et al. | Binding of organic cations to brush border membrane from rat small intestine | |
| US5419914A (en) | Phospholipid analogue vesicle | |
| US5665879A (en) | Amphiphilic derivatives of piperazine | |
| Edwards et al. | Analytical utility of liposome: from past to present | |
| Hume | A comparative study of niosomes (non-ionic surfactant vesicles) and liposomes: their stability in biological environments | |
| Nakanishi et al. | Liposome-mediated introduction of macromolecules into living animal cells with the aid of HVJ (Sendai virus) | |
| EP0319136A1 (en) | Novel liposomes and a process for their preparation | |
| CN114832117A (en) | Cell penetrating peptide modified nucleic acid-cation thermosensitive liposome and preparation method thereof | |
| Makins | The theory and practical applications of liposome-protoplast interactions | |
| Zhang | Polymer-Supported Electrofusion of Protoplasts: A Novel Method and a Synergistic Effect |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8601408-1 Effective date: 19921005 Format of ref document f/p: F |