SE464088B - Framstaellning av interferon ur humant genmaterial - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 40 464 088 Föreliggande uppfinning hänför sig till ett förfarande varvid ett specifikt fragment av humant genetiskt DNA, extraherat från humana blodceller produceras i en bakteriofagvektor och användes direkt för att programmera syntesen av IFN i bak- terier, vilka odlats och därvid resulterar i framställning av interferon. Med denna metod föreligger således inte längre behov av lånodragnaçneparationer och reproduk- tion av hela längden komplementärt DNA (cDNA) fTånmRNA. Enligt föreliggande uppfin- ning tages en lämplig del av DNA direkt från en lätt tillgänglig humancell, sasom en vit blodcell och reproduceras i en x -fagvektor. Den önskade IFN-genen störes inte av introner och kan således dirigera IFN-syntesen i bakterier. Hög IFN-aktivitet erhölls genom att infektera lämpliga bakterier, såsom E.coli med en rekombinant - fag innehållande infört humant DNA-material med IFN- 31-genen eller IFN-<1c-genen.

IFN utvanns och renades från det bakteriella lysat som var resultatet av en sådan infektion. Fagerna befanns vara lämpliga vektorer för att introducera humant DNA- fragment i bakterier; A Charon 4A-fagen var speciellt lämplig och ledde till hög pro- duktion av IFN. Uppfinningen hänför sig vidare till införandet av sådana reproducera- de, humana, genetiska DNA-fragment till plasmiduttrycksvektorer, vilka försetts med starka promotorer. Förfarandet kan utföras med olika IFN- U -gener liksom IFN-3 1- gener, förutsatt att dessa saknar introner.

I ett utförande fragmenteradès DNA från en vuxen genom partiell Eco-RI uppslut- ning och reproducerades i Aßharon 4A. Den så erhållna klonen, betecknad klon C15, med infört mänskligt DNA-material av cirka 17 kb, identifierades såsom innehållande en gen för fibroblast interferon IFN-B 1. Restriktionskartläggning visade att denna genjplacerad på ett 1.8 kb Eco RI-fragment, inte stördes av introner. Detta humana genetiska DNA-fragment kan dirigera syntesen av aktivt humant IFN-B 1 i E.coli och i andra lämpliga bakterier. En hög IFN-aktivitet kan erhållas från faglysat. Under vissa betingelser utvanns en aktivitet i storleksordningen av 107 U/liter från fan- lysaten. Lysaten utsättes fördelaktigast för kromatografi, företrädesvis på Cibacron Blue Sepharose ellerliknande kol onner och de så erhållna interferonen har samma immuno- logiska egenskaper och artspecificitet som IFN producerad från humana fibroblaster.

Liknande resultat erhölls med IFN- oc, vars gen identifierades i klon 18-3 innehållan- de ett 13 kb humant genfragment. i I ett ytterligare utförande infördes det humana gen-DNA-fragmentet innehållande IFN- 31- eller IFN-<1C-genen i en plasmid såsom plasmiden pBR322 innehållande recA- promotorn av E.coli. Kulturer av E.coli transformeradeav dessa rekombinanta plasmider ' framställde stora mängden IFN-ß eller IFN-<1 då recA-promotorn infördes med nalidixtn- syra. Detta IFN- ß1-genfragment skars därefter av intill kodsekvensen för det första metioninet av det fullt utvecklade IFN- 31 och bands till det ribosomala bindnings- stället av E.coli eller lac-promotor. Denna lac-promotor modifierades för att inne- hålla bindningsstället för RNA-polymeras av tryptofanpromotorn. Med denna hybrida tryp-lac-promotorn kunde det genetiska IFN-B 1-DNA producera 108 U/liter IFN-6 1 i 10 15 20 25 30 35 40 3 464 oss E.coli minicellstam p679-54. Liknande tillfredsställande utbyten av IFN-q C erhölls då IFN-Q C-genen på lämpligt vis bands till tryp-lac-promotorn. I samtliga fall utvanns IFN-aktiviteten ur bakteriella celler med hjälp av lysis med lysozom och 30%-ig propylen-glykol och renades därefter med avseende på faglysat på en hydro- fobisk kromatografisk bärare. För IFN- 31 är en föredragen bärare Cibacron Blue Sepharose. Elution kan utföras med hjälp av ämnen såsom etylenglykol eller företrä- desvis propylenglykol. Vidare rening av IFN- 31 eller Q C kan utföras med hjälp av immunoaffinitetskromatografi eller monoreproducerande antikroppskolonner eller med hjälp av andra konventionella tekniker.

Således är det klart att humana gen-DNA-fragment kan utnyttjas för högutbytes- produktion av humant IFN i E.coli eller någon annan lämplig värdbakterie. Såsom nämnts ovan innefattar förfarandet enligt föreliggande uppfinning införandet av ett fragment av humant gen-DNA i en lämplig vektor såsom en fag, infektering av en bak- teriekultur med sådana fager, vilket resulterar i lysis av bakterien och utvinning av det resulterande interferon-innehållet av lysatet. Uppfinningen hänför sig till de nya fager som erhålles genom introduktion av humant gen-DNA och speciellt till rekombinanta fager av A-typ såsom klon C15, som resulterar i IFN-5 2 och 1813, som resulterar i IFN- ac. Uppfinningen hänför sig vidare till ett förfarande för fram- ställning av interferon genom införande av humant gen-DNA i en lämplig fag, utvinning av en lämplig DNA-sektion från fagen, införande av denna till uttryck som plasmid i en lämplig bakterien, odling av denna och utvinning av det önskade interferonet. And- ra och ytterligare ändamål med uppfinningen kommer att stå klara av den följande detaljerade beskrivningen som gjorts upp i icke-begränsande syfte.

En viktig fördel med föreliggande uppfinning är att gener från välmående och sjuka individer kan jämföras med avseende på deras förmåga att producera IFN, vilket ger oss möjlighet att studera genetiska defekter vid IFN-produktion.

Framställning av human gen-uppsättning: Högmolekulärt DNA framställdes ur perifera blodceller från en vuxen med 5 - talasemia. DNA-lösningar (40 09) uppslöts separat 30 minuter med 100, 200 eller 300 enheter Eco RI, upphettades därefter 10 minuter till 65°C och anbringades tillsammans på en 30-40%ig sukrosgradient såsom beskrivits. DNA-fragment mellan 10 och 20 kb för- bands med T4 DNA-ligas såsom beskrivits av Mory et al. (1980, Mol. Biol. Reports 6, 203-208) till Å Charon 4A DNA-armar framställda genom Eco RI uppslutning enligt Maniatis et al. (1978, Cell 15, 687-701). In vitro-förpackning gjordes såsom beskri- vits av Hohn och Murray (1977, PNAS 74, 3259-3263) genom blandning av ett flertal_ 8 u l-lösningar av förbindningsreaktionen (0,5 pg vektor DNA och 0,125 p g humant DNA med 50 u l extrakt of E.coly BHB2688 (0205 recA' ( Aimm 434 clts b2 red 3 Eam4 Sam7) m] och ßuaeseo [Nzos vec/l' (i imm 434 aus bz rea s nam 15 sam 7)/ i). Per o g rekombinant DNA erhölls 3x105 pfu, jämfört med 108 pfu/ U g intakt A DNA. En total 10 15 20 25 30 35 _ 40 464 oss 4 mängd av l,8x106 rekombinanta fager utspäddes i 6 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgS04, 0,01% gelatin. Efter tillsats av 0,1 ml klorošorm och avlägsning av skräp genom mikrofug-centrifugering förstärktes fagerna 10 -faldigt genom över- dragning på E.coli DP50 (Leder et al., 1977, Science 196, 175-177) vid 4x103 pfu/15 cm platta. För filtrering ympades 2x104 pfu på 15 cm plattor och dubbla nitrocellulosa- filter lyftes i sekvens såsom angetts av Benton et al., (1977, Science 196, 180-182): Detta arbete utfördes under P3-innehållande betingelser.

Framställning av försöksmaterial av IFN- ß, cDNA: Poly A+ från fibroblast FS11-kulturer av human förhud)inducerade 4 timmar av 100 ug/ml poly(rI):(rC), 50 u g/ml cykloheximid (med 2 pg/nfl aktinomysin 0 under den senaste timmen))framställdes och de två topparna av interferon mRNA fraktio- nerades med hjälp av sukrosgradientcentrifugering såsom beskrivits av Neissenbach et al., (1980 PNAS 77, 7152-7156; Neissenbach et al., 1979, Eur. J. Biochem. 98 1-8).

Denn 11S mRNA (1,5 11g) användes för att framställa RNA-cDNA-hybrider med omvänt transkriptas från myeloblasfifirus av fågel (J. Beard) och oligo (dT) såsom innan Weissenbach et al., (1980, PNAS 77, 7152-7156). RNA-cDNA-hybriderna reproducerades direkt i enlighet med Zain et al., /1979, Cell 16, 851-861), men med användande av dCTP för förlängning ("tailing“) av hybriderna och dG-förlängda, Pst I-klyvda pBR322 såsom vektor (Chang et al., 1978, Nature 275, 617-624). En total mängd av 12.500 tetr amps-transformanter av E.coli MM294 erhölls såsom utsatt av Stenlund et al., (1980, Gene 1.0, 47-52). koianihybridisering utfördes med ÉZp-eDNA-försöksprever transmi- berade antingen från 11S mRNA (6 pg) av inducerade FS11-celler eller från total poly A+-RNA (3,7 u g) av icke-inducerade celler. cDNA-syntesen initierades med hjälp av ett syntetiskt komplementärt startmedel (“primer"), (se Narang et al., 1979, Methods Enxymol. 68, 90-98), 5'GAGATCTTCAGTTTC 3', vilket innefattar Bg1 II-säte för IFN- 81-sekvensen. Med 32p-5' ändmärkta (Houghton et al., 1980, Nucl.Ac. Res. 8, 1913-1931) startmaterial, noterades en förväntad 640-nukleotiders lång cDNA endast då inducerat RNA användes som mall. För att preparera försöksenheterna kyldes 20 pmol startmaterial med vardera RNA i 4 ul 0,4 M KCl vid 30°C under 60 minuter, varefter de inkuberades om 25 l med 200 uCl vardera av 32P-a -dATP och dCTP (båda 400 Ci/mmol), 0,5 mM vardera av dGTP och TTP, 50 mM Tris-HCl hP 8,3, 4 mM MgCl2, 5 mM ditiotretol, 50 ng/ml aktinomysin 0, 4 mM pyrofosfat och 30 enheter omvänt transcrip- tas under 2 timmar vid 3706. Efter tillsats av 25 11g E.coli DNA behandlades reak- tionsblandningen med 0,3 N Na0H 60 minuter vid 7000, neutraliserades och filtrerades genom Sefadex G-50 i 50 mM Tris-Hcl pH 8, 0,1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% dodecylsulfat.

Frå varje RNA erhölls 5x106 cpm cDNA. Kolonier som växt på nitrocellulosafilter fixerades och DNA denaturerades såsom beskrivits av Thayer (1979 Anal. Biochem. 98, 60-63) Varje filter prehybridicerades med 10 ml 6xSET (SET=150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl pH 8) 10xDenhardts lösning (Denhardt 1966, Biochem. Biophys. Res. Conm 10 15 20 25 30 35 40 464 088 23, 641-646). 0,1% Na pyrofosfat, 0,1% dodecyisuifat, 50 ng/mi denaturerat É.coii- DNA under 4 timmar vid 6706. Fiiter hybridiserades vid 6700 under 14-18 timmar i samma iösning med 0,5x106 cpm/fiiter av vardera av de två 32P-cDNA-försöksproverna, 10 ug/mi poiy A och 2,5 119/mi poiy C. Fiitren tvättades under en timme vid 6706 i förhybridiserande iösning, därefter 3 gånger tiii under 30 minuter vid 6700 med 3xSET, 0,1% pyrofosfat, 0,1% dodesyisuifat, därefter 60 minuter vid 2500 med 4xSET, se Maniatis (1978, Ceii 15, 687-701). Fiitren torkades och utsattes för Agfa Curix röntgenfiim med intensifierande fiiter under 1-2 dagar vid -7000.

Av 3.500 fiitrerade koionier, hybridiserade 14 företrädesvös tiii startade cDNA från inducerade mRNA medan 130 hybridicerade också tiii startade cDNA av icke-indu- cerade mRNA. DNA (0,3 pg) av piasmider från den första gruppen hybridicerades på fiiter (Kafatos et ai., 1979, Nuci. Ac. Res. 7, 1541-1552) med det 5'-änd 32 6 cpm) i 6xSSC, 10xDenhardts iösning vid 35°C -märkta startmateriaiet sjäivt (0,3 pmoi, 4x10 under 21 timmar, föijt av tvättning med 6xSSC (900 mM NaCi, 90 mM Na citrat) vid 35°C.

En kion I-6-5 var starkt positiv och DNA-sekvensanaiys (se Maxam et ai., 1980, Methods Enzymoi. 65, 499-560) visade att den innehöii cirka 370 nukieotider från 3'- sidan av IFN- 5,-sekvensen. Ytteriigare 50.000 kioner fiitrerades, viika preparerats såsom tidigare genom införande av dC-föriängda ds-cDNA från sukrosgradient-renat inducerat mRNA i Pst I-iäge av pBR322: andeien IFN- 51-kioner befanns vara 0,16% (80 kioner) i jämföreise med 0,65% IFN-ß 2-kioner.

IFN- 51-kionen I-6-5 beskriven ovan och framstäiid ur FS-11 mRNA användes för att fiitrera humanuppsättningen.

Isoiering av den genetiska kionen: IFN- 61 kion 15 Piasmid DNA från IFN- 61 cDNA-kioner märktes med hjäip av nicköversättning eniigt Rigby et ai., (1977, J. Moi. Bioi. 113, 237-251) tiii 2x208 cpm/ U 9 DNA och hybridicerades vid 106 cpm/fiiter tiii den humana genuppsättningen. Beredningen av fiitren, DNA-denaturationen och hybridiceringsprocesserna utfördes såom beskrivits ovan. Fager från piaque som gav positiv hybridicering överdrogs än en gång vid en densitet av 1-2x102 pfu på 9 cm piattor och återfiitrerades. Detta förfarande upp- repades 3 gånger tiiis mer än 95% av piaquen på piattan hybridicerats tiii IFN- 61 cDNA. Fag-kionen C15 isoierades från en sådan piaque.

Fager iäts växa i fiytande kuiturer såsom beskrivits av Biattner et ei., (1977, Sciense 196, 161-169). E.coii DP50 iäts växa över natten i 1% trypton, 0,5% NaCi, 0,5% jästextrakt, 0,2% maitos, 0,25% MgS04, 0,01% diaminopimeiinsyra, 0,004% tymidin Cirka 0,3 mi av kuituren biandades för föradsorbtion med 0,3 mi 10 mM MgS04, 10 mM CaCi2 och 107 fager under 20 minuter vid 3700. Kuiturerna späddes därefter ut i en 2 iiters-koiv med 500 mi förvärmt medium innehâiiande 1% NZ-amin, 0,5% jästextrakt, 0,5%NaCi, 0,1% kasaminosyror, 0,25% MgS04, 0,01% diaminopimeiinsyra, 0,004% tymidin och inkuberades med god iuftning under 15-18 timmar vid 37°C. Efter fuiiständig iysis 10 15 20 25 30 35 40 464088 aviägsnades ceiiernas avfaii genom centrifugering i kyia 15 minuter vid 7.000 rpm i en Sorvaii GSA-rotor. Från det kiargjorda iysatet utfäiides fagerna med 7%-ig poiy- etyiengiykoi 6.000 och renades genom två på varandra föijande CsCi-gradienter. Fagen C15 DNA renades med fenoi och dess struktur anaiyserades genom restriktionsenzym- uppsiutning, horisontai agaros-gei-eiektrofores i 20 mM tris bas, 10 mM Na acetat,' 1 mM EDTA med 0,5 Llg/mi etidium-bromid, Överförd tiii nitroceiiuiosafiiter (Southern, 1975, J. Moi. Bioi. 98, 503-517) och hybridicering tiii nicköversatta IFN- 51 cDNA såsom ovan. Eco RI-fragment av C15 DNA subkionades i Eco RI-sätet av pBR322 för exakt' restriktionskartiäggning av piasmid-DNA eniigt etabierade metoder, se Boiivar (1979, Methods Enzymoi. 68 245-267).

Anaiys av interferonaktivitet i fagiysat: Kiargjorda fag-IFN-B 1 C15-iysat, framstäiida såsom ovan diaiyserades mot fosfat- buffrad saitiösning (PBS) under 7 timmar. En 10 mi iösning satsadespå en 0,2 mi koionn av Cibacron Biue Sepharose CL6B, (Pharmacia Fine Chem.). Koionnen tvättades med 10-15 mi 1 M NaCi, 0,02 M Na fosfatbuffert pH 7,2 och därefter med 10 mi 50%-ig propyien- giykoi i tvättiösningen. Fraktioner (0,5 mi) uppsamiades och iagrades vid 400; i vissa faii tiiisattes 0,1% humant serumaibumin för stabiiisering. Interferonaktiviteten anaiyserades, såsom beskrivits av Weissenbach et ai., (1979, Eur, J. Biochem. 98, 1-8) genom utspädning av varje fraktion i serie i en 95-facks mikropiatta. Varje fack eiier fördjupning mottog 2-3x104 FS11 human-fibrobiaster i 0,1 mi Minimum Essentiai Medium (Gibco), 5% fosterkaivserum (FCS), 0,5% Gentamycin. Efter 18 timmar vid 3700 aviägsnades mediet och vesikuiära stomatit-virus (VSV) tiiisattes i en mängd av 1 pfu/ceii i medium med 2% FCS. Inhibering av den cytopatiska effekten noterades 30-40 timmar efter infektionen, i jämföreise med IFN-B NIH-standard G023-902-527.

Den antiviraia aktiviteten mättes också genom reduktion av 3H-uridin-inkorporering efter VSV-infektion såsom beskrivits tidigare (Weissenbach et ai., 1979. Eur. J.

Biochem. 98, 1-8). Antiserum tiii IFN-3 erhöiis från harar och anaiyserades såsom tidigare (weissenbach et ai., 1979, Eur. J. Biochem. 98, 1-8). För neutraiisations- testet biandades 0,1 mi antiserum (titrering 104 U/mi) eiier icke-immunt serum med 0,2 mi av 50”-ig suspension av protein A-Sefaros-pärior (Pharmacia Fine Chem.) i PBS, under 1 timme vid 3700. Päriorna tvättades två gånger med PBS och 0,1 mi bakterieiit interferon (100 U/mi) tiiisattes. Efter 2 timmar vid 37°C centrifugerades_ päriorna och supernatanterna anaiyserades med avseende på inhibering av 3H-uridin införiivat i VSV-infekterade ceiier.

Isoiering av gen-kioner: IFN- ac kion 18-3 Två korta enkeifiätade oiigonukieotider, kemiskt syntetiserade såsom ovan, an- vändes för att direkt fiitrera den humana genuppsättningen. Oiigonukieotiderna är' kompiêmentära tiii vaniiga sekvenser av IFN-(X-gener och hade sekvensen 10 15 20 25 30 35 40 7 464 oss 5'CTCTGACAACCTCCC 3' och 5'CCTTCTGGAACTG 3'. OIigonuk1eotiderna användes efter 5'- märkning, såsom ovan, antingen direkt eI1er såsom startmateriai för cDNA-syntes på RNA från Sendai-virus-inducerade humana Ieukemiska ceIIer. 32P-pIigonukIeotiderna eIIer de startade cDNA hybridicerades tiII totaIt 500.500 Ä rekombinanta fager, såsom demonstrerats ovan. Cirka 5x105 cpm användes per 9 cm nitroceiiuïosa-fiiter.

Hybridiceringarna utfördes i pIasttätade kokbehåiïare med minimaI voIym av vätska.

Hybridicering med de 15 bas-startenheterna utfördes enïigt föïjandez Först prehybri- dicering i 6xSSC, 10XDenbardts vid 37°C under 4 timmar; därefter hybridicering i 6xSSC, 1DxDenhardts vid 3700 under 18 timmar och tvättningar, 3-4 gånger, 30 minuter vardera i 6xSSC vid 3706 eIIer tiIIs inget mer kunde räknas i tvättvätskan. För hy- bridicering med de 13 bas-startenheterna, sänktes hybridicerings- och tvätttempera- turerna tiII 3006. TotaIt 16 fager gav positiv hybridicering och ana1yserades vidare genom restriktionskartIäggning och DNA-sekvens-anaIys. KIon 18-3 visades uppbära 3 IFN- d ~genen av vi1ka en hade en sekvens som var identisk med sDNA-kIon (XC av GoeddeI et aI., (1980, Nature 290, 20-25). KIon 18-3 renades såsom beskrivits för k1on C15 ovan. Uttryck av k1on 18-3 i A bakteriofag och efter införande i uttryckan- de piasmid-vektor beskrives i Resuïtat. 6 RESULTAT 1. Struktur av genetiskt IFN-3 1 C15 kIon: Denna fag-k1on isoIerades från en uppsättning human-DNA som deïvis uppsIutits med Eco RI och reproducerats i armarna av 1 Charon 4A. Kionen hybridicerades starkt ti11 tvâ o1ika IFN-5 1 cDNA-prover, vi1ka oberoende framstäïïts av mRNA-fraktioner av två stammar humana fibrobiaster. UppsIutning av fag-DNA i Eco RI visade, förutom de tvâ A -armarna, fyra fragment med 12; 2,6; 1,84 och 0,6 kiiobaser (Fig. 1A). Uver- föring ti11 nitroceiiuiosa med hjäïp av metoden av Sothern (1975, J. MoI. Bio1. 98, 503-517) och hybridicering med nicköversatta DNA från IFN- 31 I-6-5 cDNA-kionen in- dikerade att 1,84 kb-fragmentet innehâIIer IFN- 51-genen. Detta Eco RI-fragment åter- reproducerades i Eco RI-sätet av pBR322; Restriktions-ana1ys av denna 1,84 kb subkïon med BgI II, Pvu II, Pst I, Hinc II och Taq I, och hybridicering med partieII och fuiiängds IFN- B1 cDNA-prover, medgav att dra sïutiedningen att kodningssekvensen för IFN- 5, preprotein (Hinc II-säte) börjar omkring 350 nukIeotider från Eco RI-säte (Fig. 1A). Avståndet me11an de olika restriktions-sätena i det genetiska DNA är samma som i cDNA-sekvensen inom ramen för försöksfeï (TabeII 1). Inga oväntade restriktions- säten fanns inom IFN- B1-kodande regionen, vi1ket indikerar frånvaron av varje mät- bar störande sekvens.

PartieIIa Eco RI uppsïutningar av C15 DNA visade att 0,6 kb Eci RI-fragmentet är pïacerat me1Ian 1,84 och 2,6 kb Eco RI-fragmenten. Ett Bam HI-säte fanns i 2,6 kb, men inte i de andra Eco RI-fragmenten av det införda human-DNA-materiaIet. 1,84 kb 10 15 20 25 30 35 40 464 088' Eco RI-fragmentet, som hybridicerar till IFN- 61 cDNA, återfanns på ett 9,6 kb Bam Hi- fragment av C15 DNA. Såsom visat i fig. 1 kan detta fragment komma enbart från Bam HI-sätet av den högra A-armen (5,1 kb från Eco RI), varvid lämnas 4,5 kb för Eco RI- Bam HI-segmentet av det humana införda materialet och indikeras att 1,84 kb Eco RI- fragmentet måste vara placerat intill den högra Å -armen. Gen-orienteringen (Fig. 1A) bestämdes såsom följer. Då C15 DNA skars av med Pvu II och hybridicerades till full längd eller till 3' halv längd av IFN- 81 cDNA, återfanns ett 0,66 kb-fragment som enbart hybridicerar till 5'-änden av IFN- 61. Men då 1,84 kb Eco RI-delen skars av med Pvu II återfanns 5'-änden av IFN-B 1 på ett mindre 0,54 kb-fragment. Eftersom inget Pvu II-säte återfanns i 0,6 kb Eco RI-delen av det humana införda materialet, måste 0,66 kb Pvu II-fragmentet sluta i A högra arm och således är 5'-änden av IFN- 61 närmast Ahögra arm. Strukturen som visas i fig. 1A stödes av ett antal andra restrik- tionskartläggningsexperiment med användande av Hind III, Sma I och Bgl II- uppslut- ningar. Kodnings-sekvensen för IFN- ßí-genen i klonen C15 infördes således cirka 1.775 nukleotider bort från den starka A PL-promotorn som kontrollerar transkriptio- nen åt vänster (Williams et al., 1980, Genetic Engineering Vol II, sidorna 201-281, Plenum Corp.), och i rätt vänter riktning. Detta tillsammans med frånvaron av mät- bara introner fick oss att undersöka om interferon kan produceras i E.coli infekterat med C15 rekombinerande fag. 2. Utvinning av biologiskt interferonaktivt material från lysat av E.coli infekterat med IFN- B, C15 fag: Fager frân klon C15 läts växa i 500 ml kulturer av E.coli DP50 såsom beskrivits tidigare. 10 ml av klargjort lysat dialyserades och satsades på en liten Cibacron Blue-Sepharose-kolonn (0,3 ml) och fraktionerna analyserades med avseende på inhi- bering av cytopatisk effekt av vesikulärt stomatit-virus (VSV) med en IFN- B-standard som referens. I ett experimentdärfag-titern i lysatet var 1,3x1010 fager/ml obser- verades det interferonaktiva mönster som visas i fig. 2. Totalt 7.500 enheter av IFN- aktivitet utvanns i fraktionerna eluderade med 50%-ig propylenglykol - 1 M NaCl från kolonnen. Dessa skulle motsvara 0,75x106 enheter/liter lysat. I det råa lysatet var emellertid den mätbara aktiviteten mycket lägre, vilket gör det troligt att visst material i lysatet förhindrar korrekt analys av IFN-aktiviteten. Vid ett rekonstruk- tionsexperiment tillsattes ett standard human-IFN- Btill en vild typ A Charon 4A-lysat och aktiviteten mättes till enbart 1/10 av ingående. Då denna blandning passerades genom en Blue-Sepharos-kolonn utvanns 75% av ingående aktivitet. Vid en kontrollkör-- ning analyserades lysat från en vild typ Å Charon 4A-fager och ingen IFN-aktivitet återfanns (Fig. 2).

Det kromatografiska uppträdandet av IFN från lysat av klon C15 kan variera, Vid ett experiment där fag-titern var 3x1011 pfu/ml, var IFN-aktiviteten hög, men kvarhölls inte på Blue-Sepharose-kolonnen. I detta experiment uppgick den totala ak- 10 15 20 25 30 35 40 464 088 tiviteten utvunnen från koionnen tiii 70-80.000 enheter IFN för en ingående sats av 10 m1 iysat (7-8x106 enheter/iiter). De utströmmande fraktionerna reabsorberades på en andra Biue-Sepharose-ko1onn: denna gång kvarhöiis aktiviteten på koionnen men eiuderades åter igen genom tvättning av koionnen med enbart PBS. Humant IFN- B ska11 normait eiuderas från Biue-Sepharos enbart med hydrofoba iösningsmedei (Knight et ai., 1980, Science 207, 525-526). Såiedes biandades standard humant IFN-6 med samma fag- iysat och appiicerades på koionnenz 30% av aktiviteten kvarhöiis icke och utvinning avaktiviteten var enbart 25%. Härigenom förmodas att komponenter av detta iysat för- modiigen destabiiiserat interaktionen av IFN- B, specieiit det producerat av bakte- rier, med Biue-Sepharose. Även om interferon inte kvarhöiis på koionnen aviägsnades över 90% av proteinet av Tysatet från de aktiva fraktionerna, viika hade en specifik aktivitet av 4-5x105 U/m1 protein. Denna partieiia rening var väsentiig för att av- iägsna de kemikaiier som maskerat aktiviteten i det råa iysatet. I ett experiment utvanns också kion C15 IFN-aktiviteten efter kromatografi av ïysatet på karboximetyi- Sepharose (visas icke). 3. Egenskaper för interferon producerat i E.co1i infekterad av kion C15 Interferon-aktiviteten som utvunnits efter kromatografi-steget reducerade 3H- uridin-införiivandet i VSV-infekterade human-ce11er, behandiade med aktinomycin D (Weissenbach, 1979, Eur. J. Biochem. 98, 1-8). Den titrerings-kurva som erhöiis för bakterieiit IFN- B var iiknande motsvarande för standard humant IFN-B (Fig. 3). För att testa de immunoiogiska egenskaperna för bakterieiit IFN biandades den deivis re- nade produkten med anti IFN- B-serum av kanin (inactive on IFN- o) eiier med icke- immunt kanin-serum som förbundits ti11 protein A-Sepharose. Efter centrifugering anaiyserades supernatanten med avseende på IFN-aktivitet: anti IFN-B -serum aviägsna- de a11 interferon aktivitet, medan aktiviteten kvarhöiis då icke-immunt serum använ- des (Fig. 3). Bakterieïit IFN (20 U/mi) neutraiiserades på iiknande sätt efter att bara ha biandats med anti IFN-8 (20 U/m1) på ce11-kuiturerna och anaiyserades genom inhibering av VSV-cytopatisk effekt.

Art-specificiteten för bakterieiit interferon anaïyserades genom jämföreise av oiika ce11-typer. Då humant IFN-ßprodukten av kion-infekterade E.co1i visade mindre än 10% aktivitet på apnjureceiier BSC-1 och ox MDBK-ce11er i jämföreise med human- ceiier. Ingen detekterbar anvirai aktivitet erhöiis pâ mus L eiier A9-ce11er (Tabeii 2 Samma resuitat erhöiis med 6.000 U/mi av bakterieiit IFN producerat av kion C15.

Föreiiggande uppfinning visar sâïedes att IFN- 81-genen isoierad direkt från Eco RI-deifragment av humant gen DNA genom reproducering i Ä Charon 4A kan komma tiii uttryck och ieder ti11 ansamiing av betydande mängder IFN-aktivitet i kuituriysat.

Aktiviteten framstäiid är kiart fibrobiast interferon (ß ) såsom visas genom dess inmunoiogiska egenskaper och dess art-specificitet. Aktiviteten ges av bakterie- kuituren enbart som svar på infektion av IFN- B1 C15 fag-kioner. IFN-aktiviteten som 10 15 20 25 30 35 40 10 464 088 framställts av klon 15 i E.coli liknar human IFN-B med dess kromatografiska egen- skaper på Cibacron Blue Sepharose. Det kromatografiska steget är väsentligt för att utvinna hög aktivitet (upp till 7x106 U/liter) från bakteriellt lysat. Interferoner - ger således de första exemplen på biologiskt aktiva protein som kan produceras av bakterier under dirigering av ett stycke humant DNA taget direkt från genen för in- dividen. 4. eenerisk IFN- a, 18-3 kian Denna klon identifierades genom direkt hybridicering av korta oligonukleotider, vilka kemiskt syntetiserats för att vara komplementära till sekvenserna i IFN- d.

Från totalt 0,5x106 gen-enheter var 16 kloner positiva vid hybridiceringen. De Eco RI- fragment som hybridicerar till oligonukleotiderna sekvensbestämdes och klon 18-3 visades såsom i fig. 1B att innehålla ett 2 kb Eco RI fragment 18-33 (infört material i fig. 1) i vilket genen för,lFN- mRNA som gav upphov till den IFN-cxc-klon som rapporteras av Goeddel et al., (1981, Nature 290, 20-25). Klon 5-1 representerar ett överlappande DNA-fragment. Tillsammans bär klonen 5-1 och klonen 18-3 förutom IFN-a C tvâ andra IFN-u -gener, betecknade d-CZ och a-C4 (Fig. 1B). 5. Uttryck av IFN-genetisk fragment under kontroll av recA-promotor recA-promotorn betecknas som en av de starkaste E.coli-promotorerna. Normalt tryckes den kraftigt tillbaka genom produkten av lex-genen, även då den är närvaran- de på en dupöteñngsdasmid såsom pBR322. Den induceras i närvaro av skadat DNA till att klyva sin egen repressor och undergår induktion till mycket höga nivåer (Sancar och Rupp, 1979, PNAS 76, 3144-3148). Standard-induceringsämnena för recA är nalidixin- syra (vilket blockerar DNA-syntesen) eller mitomycin C (vilket tvärbinder DNA).

En plasmid, pDR1453 innehållande den reproducerade recA-genen, användes för att isolera promotorn på ett TaqI-BamHI-fragment av cirka 1 kilobas. Denna förenades med pBR322 som hade öppnats med Clal och Baml för att plasmid RAP-1. TaqI-ClaI-förening- en âterupprättar Clal-sätet i detta fallet och medger att plasmiden säreget öppnas vid det tredje kod-stället för recA-genen. RAP-2 konstruerades genom avklippning av RAP-1 med Eco RI och Clal, utfyllning av de vidhäftande ändarna och âterförening vilket återupprättar RI-sätet. Då RAP-2 öppnas vid RI-sätet kan främmande DNA införas vid tredje kodningen för recA-proteinet.

RAP-1-vektorn användes för att indirekt uttrycka interferonaktiviteten genom 1 genetiska fragment från den humana gen-uppsättningen. IFN- 31-genen och flera iso- lerade IFN-Q -gener av a C-underklassen producerade stark interferon-aktivitet (såsom bestämd med hjälp av standard antiviral analys) då de infördes i denna plasmid. De RI- fragment av DNA på vilka dessa gener sitter (Fig 1A och B) subklonades till RI-sätena av RAP-1-plasmiden. Plasmiden placerades i en recA+-värd, bakterierna läts växa och 10 15 20 25 30 35 40 11 464 088 inducerades med na1idixinsyra, ce11erna skördades, genomgick iysis med hjäip av iysozym pïus 30%-ig propy1eng1yko1 och extraktet anaiyserades med avseende på anti- virai aktivitet. Nivån av aktivitet är k1art beroende på induktionen med hjäip av na1idixinsyra, varvid optimum 1igger vid 50 119/m1 (Tabe11 3). Intressant nog pro- ducerar i vissa fa11 det genetiska fragmentet aktivitet i båda möj1iga riktningar i förhâ11ande ti11 recA-promotorn. De IFN-B 1- och IFN-d -gener som visade aktivi- tet var a11a pïacerade på DNA Eco RI-fragmenten av 1,8-2 kiiobaser, så att avståndet från promotorn ti11 ATG-start-koden av interferon-genen är i storieksordningen av ett 100-ta1 nukïeotider.

Dessa experiment visar att promotorn fungerar såsom väntat och den medger snabb bestämning av viika interferon-1iknande gener från genuppsättningen som kan vara aktiva. 6. Hög uttryckningsförmåga för IFN- 61-genen under kontro11 av tryp-1ac-hybrid- promotorn _ E ' E Piasmiden PLJ3 (Johnsrud, PNAS, 1978, 75, 5314-5318) innehå11er två 1ac- promotorer vardera 95 baS'PaP1ång, avskiïda av 95 icke-förbundna nukieotider. Detta 285 nuk1eotider ïånga fragment införes i Eco RI-sätet av pïasmiden PMB9. Lac-sekven- serna med 95 bas-par innehå11er operator- och promotor-sekvensen och siutar a11de1es innan ATG förß -gaïactosidas. En kodande DNA-sekvens med en ATG-initiator, införd på rätt avstånd från det ribosoma1a bindningssätet för ß-gaiactosidas-genen bör korrekt uttryckas i E.co1i-ce11er. Eco RI-fragmentet med 285 bas-par återreprodu- cerades ti11 pBR322 vid Eco RI-sätet; rekombinanterna fiitrerades genom tiiiväxt av ceiïerna på pïattor innehåiiande 40 g/m1 X-ga1 och 15 g/m1 tetracykiin. Endast po- sitiva b1å co1onier sammansiogs och DNA renades med hjäip av CsC1 gradient-centrifu- gering. I Två orienteringar av 1ac-promotorn är väntade; mot ampici11in-genen e11er mot tetracyk1in-genen av pBR322. Eftersom vi enbart är intresserade av att ha Eco RI-sätet piacerat me11an 1ac ribosomaïa bindnings-sätet och pBR322-sekvensen, skyddades detta säte genom att binda RNA-po1ymeras ti11 p1asmid DNA, medan yttersätet öppnades med hjä1p av Eco RI-restriktion, ify11des med Kïenows fragment av DNA-poïymeras och åter- förenades. Efter transformation av MM294 E.co1i-ce11er, iso1erades pïasmider och av- ståndet me11an Eco RI-sätet och Bam HI-sätet av pBR322 uppmättes. De piasmider som innehö11 ett fragment med 375 bas-par var de där 1ac-promotorerna var vända mot tetra- cykiin-genen, medan de som innehö11 670 bas-par (375ï295 bas-par) hade 1ac-promoto- rerna vända mot ampici11in-genen.

Från Eco RI 1,84 kb subkïonen av det IFN-31-genetiska fragmentet kiippte vi ett HincII-Bg1II-fragment innehâ11andepreñnterferon-sekvensen. Det fu11ständiga IFN- B1-proteinet innehå11et vid sin NH2-siutände ett metionin som kan utnyttjas som ini- tiator-kod i E.co1i. Där finns två A1uI-säten nära denna ATG-kod separerade av 13 nukieotider, ett A1uI-säte ïigger 8 nuk1eotider framför ATG medan det andra 1igger 10 15 20 25 30 35 40 12 464 088 2 nukieotiaer efter ATG. En partieil AIuI-uppsiutning utfördes på' HincII-Bgill- fragmentet och fragment av cirka 510 bas-pars Iängd isoierades från agaros-geier, Vektorn innehåïïande Iac-promotorerna vända mot tetracykïin-genen genomgick restrik- tion med Eco RI, sätet fy11des i av DNA-poiymeras och kïipptes av igen med BamHI.

Vid förening av A1uI-Bg1II-fragmentet med den ifyïida Eco Ri-BamHI-vektorn återupp- rättades Eco RI-sätet. För att kunna skiija dessa gentemot kionerna innehåiiande ATG-koden (13 nukieotider Iängre) Iäts de erhåiina kionerna genomgå restriktion med Eco RI och Pst1; kionerna innehâiiande de förväntade fragmenten med 151 bas-par sekvens-undersöktes. Därvid återöppnades Eco RI-sätet och avståndet meïian det ribo- somaïa bindnings-sätet och ATG förkortades genom Bai 31-uppsiutning och âterförening.

E.co1i-ce11er transformerade med dessa piasmider såiïades med avseende på IFN-B 1- produktion.

En kion, L-11, befanns producera cirka 3x106 U/Iiter av IFN-3 . Lac-promotor- regionen i denna kion skars av med HpaHI, dvs 17 nukieotider före startpunkten för mRNA. För att ta bort IFN-51-genen användes Sau3a-enzym, viiket kiipper DNA bara 3 nukieotider bortom avsiutningskoden för IFN-31. Detta HpaII-Sau3a 1ac-IFN-ß1- fragment infördes me11an C1aI och HindIII-sätena av en tryp-promotor-piasmid, viiken preparerats eniigt föijande. Ett 180 nukïeotider Iångt TaqI-Taql-fragment från -21 ti11 -201 före start för tryp mRNA togs bort från tryp-piasmiden pEP121-221 och re- producerades i C1aI-sätet av pBR322. Vi vaïde ut den orientering där tryp-promotor- fragmentet är orienterat medurs. Detta förfarande återupprättar ett C1aI-säte vid positionen -21 av tryp-promotorn. Efter förening ti11 Iac-IFN-51-fragmentet formas en hybrid-promotor tryp-Iac före IFN-81-genen. Denna pïasmid TL-11 användes för att transformera E.co1i MM294 e11er E.co1i miniceii-stam p679-54. Dessa bakterier pro- ducerar 108 U/Iiter av IFN-B1 under fermenteringsodïing ti11 en 00650 av 10, viiket demonstrerar att det IFN-61-genetiska DNA-fragmentet är mycket aktivt (fig. 4).

TABELL 1: Restriktions-säten i IFN-B1 av cDNA och genen ReStr¿kt¿onS_ Avstånd meIIan-sätena säten Beräknat från * Mätt från ** t 81 cDNA-sekvensen 61 genetiskt DNA nukieotider nukleotider Taq I-Pvu II 255 250 Hinc II-Pvu II 204 210 Hinc II-Bg] II 570 570 Pvu II -Bgi II 366 360 Pst I -B91 II 363 360 * Från Taniguchi et al, 1980 Gene 10 (11-15).

** Mätt från 1,84 kb Eco RI-fragment De Hinc II och Taq I-säten som tagits i beräkningen är de som Iigger närmast 5'-änden av genen. 10 15 20 25 30 35 13 0 TABELL 2: Art-specificitet för bakterieiit interferon produceáåêêv ggntååskt IFN-31 C15-k1on Interferon titer, U/m1 Interferon-kä11a Människa Apa Oxe Mus Mus FS11 BSC-1 MDBK L A9 ce11er ce11er ce11er ce11er ce11er 1. Människo-ce11er FS11 1,500 32 32 4 4 2. E.co1i infekterad av C15-k1on 1,000 32 32 4 4 Bakterie11t IFN användes efter kromatografi av C15-1ysatet på Cibacron B1ue-Sepharose såsom i fig. 2.

TABELL 3: IFN-Q och ß -aktiviteter erhå11na av genetiska fragment i recA- p1asmiden RAP-1 Försök Ki 011 iwajidlan ïFfihffftivítet 1. RAP-1 (1833)-IFN~dC + nalidixinsyra 500 RAP-1 (1833)-IFN-GC - naïidixinsyra 32_ 2. RAP-1 (1833)-IFN-ac högerorientering 1000 RAP-1 ( 631)-IFN-B1 högerorientering 3000 RAP-1 ( 631)-IFN¥ß1 motsatt orientering 750 Kïon RAP-1 (1833) innehå11er Eco RI-fragmentet med IFN«ac_g¿nen (Fig. 1B).

Kïon RAP-1 ( 631) innehå11er Eco RI-fragmentet med IFN-B1-genen (Fig. 1A).

Fragmenten införes i början av recA-genen. Orientering gives med avseende på recA- promotor-orienteringen.

Förkïarande text ti11 figurerna: Fig. 1A: Schematisk struktur för IFN-31-k1onen C15 DNA a): Schematisk karta över A Charon 4A. De tvâ armarna visas med he1dragna linjer. b): Struktur för det humana DNA-materialet som införes i kionen C15, det svärtade omrâdet visar Eco RI-fragmentet som hybridicerar ti11 IFN-31 cDNA. c): en dubbe1 Iinje. Den enkïa 1injen är deiar av högerarmen av A. PL är den vänstra promotorn för A. d): Läge för IFN-61 mRNA. De övre ska1orna är för a) och b). Den undre skaïan för c) och d). För detaïjer se texten.

Schematisk struktur för IFN-ac-kïonen 18-3 Förstoring av det svärtade fragmentet från b visat som Fig; 1B: Restriktions-karta för de införda materiaïen i två x Charon 4A-k1oner visas.

IFN-ac-genen är betecknad med piïen a1fa-c*. De två andra IFN- a-generna är närvarande nära IFN11c. De införda materia1et visar Eco RI 2 kb-fragmentet 10 15 20 Fig. 2: F19. a; Fig. 4: 464 oss I .M 18-33, viïket innehåiier IFN-u C-generna och återreproducerades i recA- pïasmiden, såsom förkïarat i texten. Symboïer för sätena för restriktions- enzym är visade.

Anaiys av interferon producerat av genetisk k1on IFN-B 1_CJ5 på Bïue-Sepharosê Râïysat av E.co1i DPSÛ infekterat med fag C15 fraktionerades såsom angetts i beskrivningen och IFN-aktiviteten anaiyserades i varje fraktion (l'--0). ' Proteinkoncentrationen uppmättes i samma fraktioner (0- --O). En para11e11 kromatografering och anaiys av ivsat från ).Charon 4A-fagen visas G3---CD.

Titrering av generisk k1on IFN- 61 C15 interferon En fraktion av fag C15 IFN från peiaren i fig. 2 (cirka 103 U/m1) utspäddes 1:40 och utspäddes därefter i serie i mikropïattan för anaiys av IFN genom utspädning av VSV RNA-syntes Go--tå. Humant standard fibrobiast interferon 25 U/mï anaïyserades paraïïeflt (0-----o). KontroH utan VSV ( CI! ) och med VSV utan IFN ( än ) visas. De två spaiterna ti11 höger visar resterande aktivitet av fagen C15 IFN (vid s1ut1ig utspädning 1:40) efter adsorption på immobiïiserat anti IFN-3 eiïer icke-immunt IgG, såsom beskrivits tidigare.

Ti11växt och IFN-produktion i E.co1i innehåïiande piasmid TL11 TL11-pïasmiden innehåïïer en hybrid tryp- 1ac-promotor och den kodande sek- vensen för fuïiständigt humant IFN-B 1, viïket härstammar från det humana genetiska fragmentet såsom beskrivts i texten tidigare. Bakteriekuïturer iäts växa i en 1-iiters New Brunswick-fermentor och vid de angivna tiderna iäts bakterierna genomgå ïysis av ïysozym-propyien-gïykoi och IFN-aktiviteten anaiyserades i human-ce11er aktiverade med VSV. IFN-aktiviteten är beräknad per m1 bakteriekuïtur.

Claims (10)

“S 464 oss PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av humant interferon av fibroblast-typ (B) och av leukocyt-typ (a), k ä n n e t e c k n a t av att humant genomt DNA, som kodar för interferon av fibroblasttyp B1 och leukocyttyp ac samt saknar introner, införes i en lambda-fag och antingen att lämpliga bakterier infekteras med en sådan fagrekombinant eller att från en sådan fag utvinnes ett DNA-segment innehållande IFN-B1-genen eller IFN-oc-genen, vilket införes i en expressionsplasmid av en lämplig bakterie, att bakterierna odlas och att interferonet utvinnes.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att fagen är en lambda-Charon 4A, resulterande i en klon betecknad med C15.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att fagen är lambda-Charon 4A, resulterande i klon 18-3.

4. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t av att den bakterie som infekteras är E.coli.

5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att fagen är lambda-Charon 4A och bakterien är E.coli DP-50.

6. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att en human genom DNA-fraktion utvinnes från sådana fager, införes i en plasmidexpres- sionsvektor av en lämplig bakterie och att bakterien odlas för att producera interferon.

7. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att DNA införes i en plasmid som är försedd med en stark promotor, vilken har förmåga att styra syntesen av humant interferon B1 eller humant interferon oc i en lämplig bakterie.

8. Förfarande enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t av att den använda plasmiden är pBR322 och att den införda genen är IFN-B1 eller IFN-oc-genen.

9. Förfarande enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t av att plasmiden är pBR322 innehållande recA-promotorn för E.c0li.

10. Modifikation av förfarande enligt krav 1 eller krav 6, k ä n n e - t e c k n a d av att det humana genoma DNA-fragmentet innehållande IFN-aC- eller IFN-B1-genen avlägsnas från lambdafagen eller från plasmiden, klippes av bredvid koden för det första metioninet av det fullständiga IFN:et förenat med det ribosomala bindningssätet för E.coli lac-promotorn, vilken är modifierad för att innehålla RNA-polymerasbindningssätet för tryptofan-pro- motorn, varvid erhålles en hybrid tryp-lac-promotor, att plasmiden åter- införes i bakterien och att bakterien odlas för att producera interferon.