SE462497B - Saett foer att aktivitetsbestaemma polymeraser - Google Patents

Description

2 49%, som på en del därav måste vara hybridiserad med en s.k. primer i 10 15 30 35 form av en deoxiribonukleotidoligomer eller ett t-RNA, som krävs för att initiera den av polymeraset katalyserade polymerisationsreaktionen.

Som radioaktiva isotoper för substratmärkningen har vanligtvis använts “H eller °”P.

Mer specifikt beskrivs i US-A-3 755 086 ett sätt att påvisa ak- tivitet av omvänt transkriptas i renade cellextrakt- eller plasmaprov från däggdjur eller fåglar, varvid som mall används en polymer av RNA- typ hybridiserad med en syntetisk tymidinpolynukleotidoligomer med 2-24 nukleotidenheter som primer. Vid denna metod sätts det renade provet till en reaktionslösning innehållande mallen och “H-märkt nukleosidtri- fosfat. Efter inkubering stoppas reaktionen, och mallen fälls ut genom ,;1lsats av triklorättiksyra (TCA) och upptas på ett filter. Därefter placeras det torkade filtret i scintillationsvätska, och den i mallen upptagna radioaktiviteten, som är ett mått på polymerasaktiviteten, mäts med vätskescintillationsteknik.

Liknande metoder specifikt inriktade på HIV-bestämning via omvänt transkriptas har beskrivits bl.a. av A. D. Hoffman et al., Virology 151, 326-335 (1985) och M. H. Lee et al., J. Clin. Microbiol., sept. 1987, sid. 1717-1721.

Dessa konventionella metoder för bestämning av omvänt transkrip- tas-aktivitet lider dock av flera nackdelar. Således kan inte analys ske direkt på kliniska prov på grund av närvaro av störande faktorer, såsom RNAser, fosfataser och kompetitiva nukleotider. Vidare begränsar TCA-fällningen på filter den använda provvolymen, och därmed känslig- heten, väsentligt genom den av filterstorleken beroende bakgrunden vid scintillationsbestämningen av radioaktiviteten. En ytterligare nackdel är användningen av 3H som radioaktiv isotop, eftersom den dels på grund av den förhållandevis långa halveringstiden ger låg specifik aktivitet och därför inte kan användas vid låga substratkoncentrationer, och dels på grund av strålningstypen ger problem med absorption av strålningen i provet, s.k. quenching. Dessutom krävs användning av scintillations- vätska för aktivitetsbestämningen, varigenom den möjliga kliniska användbarheten begränsas. Den ovannämnda isotopen °”P som också används i liknande sammanhang har visserligen hög specifik aktivitet, så att den kan användas vid låga substratkoncentrationer, men den korta hal- veringstiden (14 dygn) gör den olämplig för praktiskt bruk. Isotopen 355 som likaså använts för dessa ändamål ger på grund av sin svaga 10 15 30 35 3 462 497 betastrålning betydande problem med quenching.

Syntetiska polynukleotider immobiliserade på en bärare, t.ex. agaros, har tidigare använts för affinitetsrening av polymeraser.

Vidare har bärarbundna mallar använts för framställning av specifika enkelsträngade DNA-prober (P. L. Ashley et al., Anal. Biochem. låg, 95-103 (1984)). Vidare beskriver B. I. Milavetz et al., Mol. Pharma- col., lå, 496-503 (1977), användning av po1y(A)-agaros som immobili- serad mall för identifiering av bindningsreaktioner som äger rum vid polymerisation av DNA och undersökning av olika läkemedels (ansamyci- ner) inhiberande verkan på DNA-syntesen. För studium av läkemedels- inhiberingen fick t.ex. läkemedlen lösta i en buffert passera genom en kolonn som innehöll polymeraset bundet till po1y(A)-agaros hybridiserad med oligo(dT),,_,8 som primer och som framställts genom upptagning av polymeraset på poly(A)-agarosen och sedan tillsats av primern. Därefter bestämdes kolonnmaterialets polymerasaktivitet genom inkubering i en reaktionslösning med “H-deoxitymidintrifosfat (°H-dTTP). Efter hydrolys med Na0H och fällning av mall/primer-materialet med TCA bestämdes den i mallen inkorporerade radioaktiviteten. Även om själva polymeriserings- reaktionen utfördes på den immobiliserade mallen, krävde således den efterföljande radioaktivitetsmätningen frigöring av mallen från bäraren och utfällning med TCA som vid den ovan beskrivna bestämningsmetoden för polymerasaktivitet.

Liknande metoder som beskrivits ovan för bestämning av omvänt transkriptas har utnyttjats för mätning av DNA-polymeras, dvs. att man följt inkorporeringen av en radioaktiv nukleotid i en fri DNA-mall i lösning genom mätning efter fällning på filterpapper med TCA eller etanol. Som mall har vanligtvis nukleasbehandlat, s.k. aktiverat, DNA använts och som radioaktiv isotop “H eller °”P. De ovan diskuterade nackdelarna hos de hittills använda bestämningsmetoderna för omvänt transkriptas gäller därför även bestämningen av DNA-polymeras.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är ett förbättrat förfarande för kvantitativ bestämning av polymerasaktivitet, genom vilket de flesta eller samtliga av nackdelarna hos de tidigare kända metoderna elimineras. Ett annat syfte med uppfinningen är användning av ett nytt radioaktivt märkt substrat vid bestämning av polymerasaktivitet, vilket avsevärt ökar känsligheten vid bestämningarna och dessutom förenklar det tekniska förfarandet. Dessa syften uppnås med ett förfarande resp. ett substrat, som har de i patentkraven angivna särdragen, och som 462 497 4 10 15 30 35 beskrivs närmare nedan.

Uppfinningen avser således i en första aspekt ett förfarande för kvantitativ bestämning av polymerasaktivitet i ett prov genom inku- bering av provet med en naturlig eller helt eller delvis syntetisk polynukleotidmall och nödvändiga substrat innefattande minst ett till mallen komplementärt, radioaktivt märkt nukleosidtrifosfat, separation av mallen från substratet och mätning av den i mallen inkorporerade radioaktiviteten, som är väsentligen proportionell mot polymeras- aktiviten i provet, varvid förfarandet kännetecknas av att mallen är immobiliserad på en bärare och att det radioaktivt märkta nukleosidtri- fosfatet är märkt med en gammastrålande isotop, samt att mätningen av den inkorporerade radioaktiviteten utförs direkt på den immobiliserade mallen utan frigöring därav från bäraren.

Genom att enligt uppfinningen använda en immobiliserad mall och mäta den upptagna radioaktiviteten direkt på den immobiliserade mallen utan föregående frigöring därifrån uppnås flera fördelar. Således elimineras den tidigare provvolymbegränsande, och därmed känslighets- reducerande, TCA-utfällningen på filter, så att större provvolymer kan användas och känsligheten följaktligen ökas. Tack vare att mätningen dessutom utförs direkt på den imobiliserade mallen förenklas även det tekniska analysförfarandet betydligt. Vidare eliminerar användningen av en gammastrålande isotop det tidigare problemet med quenching och behovet av scintillationsvätska.

Enligt en föredragen utföringsform av uppfinningen inkuberas mallen först separat med provet för upptagning av det i provet ingående polymeraset på mallen, varefter mallen med det affinitetsbundna polyme- raset efter tvättning förs i kontakt med reagenslösningen innehållande det radioaktivt märkta substratet och, i det fall sådan krävs, primer, såsom när polymeraset som skall bestämmas är omvänt transkriptas Primern kan därvid vara närvarande på mallen från början eller addera vid bestämningen.

Genom att på så sätt före den egentliga polymerasbestämningen in- kubera mallen med provet har det överraskande visat sig att polymeras- bestämning kan ske direkt på kliniska prov, såsom serum och lymfocytex- trakt tagna direkt från patienten. De störande faktorer, såsom RNAser (i hög koncentration i cellextrakt och även i cellsupernatanter) och kompetitiva nukleotider, som förekommer i kliniska prov, förefaller således ha låg affinitet till mallen. 10 15 25 30 35 5 97 Som kommer att diskuteras närmare längre fram kan mallen even- tuellt skyddas under affinitetsbindningen av polymeraset, dvs. "upp- fiskningssteget", och/eller under den efterföljande enzymaktivitetsbe- stämningen med lämpliga agens.

Som bärare för imobilisering av mallen kan såväl "halvfasta" ma- terial, såsom geler, som fasta kroppar användas. Metoder för koppling av polynukleotider till olika bärare är kända och kommer inte att beskrivas närmare här. Som exempel på geler kan nämnas agarosgeler och Sepharosëâ (pärlformad agarosgel saluförd av Pharmacia AB). Kommer- siellt tillgängliga immobiliserade mallar som kan användas för uppfin- ningens syften är t.ex. poly(A)-agaros (poly(A) kovalent bundet till CNBr-aktiverad agaros; P-L Biochemicals, USA), poly(A)Sepharosé9 (Phar- macia AB). Exempel på fasta bärare är t.ex. kulor eller pärlor (även mikro- eller makrokulor) av plast, t.ex. polystyrenkulor. En lämplig fast bärare på grund av den förenklade separation den erbjuder är magnetiska kulor, t.ex. tosylerade magnetiska Dynabeads (Dynal AS, Oslo, Norge).

Den bärarimmobiliserade mall som skall användas i varje speciellt fall beror givetvis i första hand på det polymeras som skall bestämmas.

För bestämning av omvänt transkriptas skall således mallen vara en polynukleotidkedja av RNA-typ, varvid den kan vara en homopolymer, såsom poly(rA), po1y(rU). poly(rG), poly(rC) och poly(rI), eller en av kombinationer därav uppbyggd syntetisk, halvsyntetisk eller naturlig sampolymer. Medan det i fallet med en homopolymer endast krävs motsva- rande komplementära nukleosidtrifosfat eller -analog som substrat, kräver givetvis en sampolymer användning av komplementära substrat till samtliga ingående nukleotider, varvid dock endast ett av substraten behöver vara märkt.

Som tidigare nämnts krävs en primer för att initiera polymerisa- tionsreaktionen vid analys av omvänt transkriptas. I föreliggande sammanhang avses med primer en med mallen hybridiserbar nukleotidkedja, såsom en oligonukleotid. Som primer för poly(rA) fungerar t.ex. oligo- (dT), och för poly(rC) oligo(dG). Beroende på ursprunget kan olika omvänt transkriptas uppvisa skilda preferenser för olika mall/primer- kombinationer.

Eftersom DNA-polymeraser naturligt verkar på mallar i form av dub- belsträngade DNA-kedjor försedda med s.k. "nicks", dvs. hål i den ena strängen, kan den av bäraren uppburna mallen i detta fall utgöras av en 462 497 6 10 15 25 30 35 naturlig, halvsyntetisk eller syntetisk dubbel nukleotidkedja av DNA- typ försedd med enkelsträngsregioner. Även i detta fall kan nukleotid- kedjorna vara homo- eller sampolymerer. Alternativt kan en enkel nuk- leotidkedga med minst en dubbelsträngsregion fungera som mall.

Som immobiliserat mallmaterial för RNA-polymeras kan en dubbel- strängad naturlig eller syntetisk eller halvsyntetisk DNA-kedja använ- das. I detta fall krävs inga enkelsträngsregioner, men primer kan ibland vara nödvändig beroende på det speciella RNA-polymeraset. För RNA-beroende RNA-polymeraser krävs givetvis immobiliserat RNA "primat" på lämpligt sätt.

Eftersom RNAser (t.ex. i lymfocyter) spjälkar fosfoesterbindning- ar, är mallen lämpligen kemiskt modifierad för att helt eller delvis hindra sådan spjälkning. Detta kan t.ex. uppnås genom 2'-0-metylering (po1y(Cm) etc.), P-metylering eller P-sulfonering. Sådan modifiering av polynukleotider är i och för sig känd tidigare, se t.ex. Murray and Atkinson, Biochem. Z(ll), 4023-4029 (1968), vars innehåll införlivas häri genom hänvisning.

Det substrat som används för den av polymerastet katalyserade polymerisationsreaktionen beror på den använda mallen och skall således omfatta nukleosidtrifosfat eller -analoger komplementära till alla i mallen ingående nukleotider. Som angivits ovan är enligt uppfinningen minst ett nukleosidtrifosfat märkt med en gammastrâlande radioaktiv isotop.

Den gamastrålande isotopen är företrädesvis en sådan med en halveringstid i intervallet ca 20 dagar till ett år. Särskilt lämpliga för uppfinningens ändamål är jodisotoper, företrädesvis **5I, som har en halveringstid pâ 60 dagar och en specifik aktivitet större än 2000 Ci/mmol.

Tack vare användningen av en gammastrålande isotop elimineras quenching-problem och behovet av scintillatinnsvätska, och mätning direkt på den immobiliserade mallen i enlighet med uppfinningsförfaran- det möjliggörs.

Ett särskilt lämpligt radioaktivt märkt substrat för uppfinningens ändamål är 1251-5-jod-2'-deoxiuridintrifosfat, i det följande kallat 1251-IUdRTP. Förutom att *°5I har en för ändamålen lämplig halverings- tid, är praktisk att hantera och enkel att mäta på grund av gammastrâl- ningen, har IUdRTP stora likheter med det naturliga substratet TTP (deoxitymidintrifosfat), varvid skillnaden mellan substraten består i 10 15 25 30 35 462 497 7 att IUdRTP har en jodatom i femställning på nukleotidbasen, medan TTP har en metylgrupp (vars van der Waalradie endast är något mindre). 1251-IUdRTP kan exempelvis framställas genom behandling av 1251- jod-deoxiuridin (IUdR) med Herpes simplex-enzymer och efterföljande kromatografisk separation av de erhållna produkterna, 125I-jod-deoxi- uridin-monofosfat (IUdRMP) och 1251-IUdRTP. 1251-IUdRTP liksom subst- ratanaloger därtill är föremål för en andra aspekt av föreliggande uppfinning, såsom kommer att beskrivas närmare längre fram.

För mätning direkt på serumprover och liknande som innehåller substratnedbrytande enzymer kan substratet skyddas genom tillsats av en eller flera trinukleotider, som inte ingår i polymerisationsreaktionen, men som engagerar enzymet ifråga. För b1.a. det ovannämnda substratet 1251-IUdRTP har cytidintrifosfat (CTP) visat sig vara en utmärktßkyddfi- faktor. Andra tänkbara skyddsfaktorer är t.ex. UTP, IUTP, 5-MeUTP.

Med den modifierade varianten av uppfinningsmetoden med ett in- ledande "uppfiskningssteg" kan den användas direkt på kliniska prov, olika isoleringsmaterial, lymfocyter, supernatanter, etc., i motsats till de tidigare metoderna, som för viruspolymeraser varit begränsade till pelleterat virusmaterial. Exempelvis kan analys ske direkt på lymfocyter utan föregående odling.

En för närvarande intressant tillämpning av uppfinningen när det gäller aktivitetsbestämning för omvänt transkriptas är bestämning av replikationsaktivitet hos HIV, det virus som i förlängningen orsakar AIDS. Mängden omvänt transkriptas från HIV i ett patientprov är ett mått på denna aktivitet, och noggrann bestämning därav är av stort värde för analys av aktivitetens relation till sjukdomsutveckling och uppföljning av resultatet av terapi. Synnerligen intressant ter sig härvid möjligheten att kunna bestämma den enskilda patientens enzym- känslighet för olika nukleotidanaloger som används som terapeutika.

När det gäller HIV kan uppfinningen med fördel även användas vid mätning av antikroppar som blockerar HIV-omvänt transkriptasaktivitet.

Det har nämligen visat sig att nivån av antikroppar mot omvänt tran- skriptas i sera är direkt relaterad till sjukdomens stadium (se t.ex.

R. Schatterjee et al., J. Clin. Imun., Vol. 7, nr. 3, 1987), och mätning av antikroppsnivån är därför intressant ur prognostisk syn- vinkel. Sådan antikroppsmätning, som tidigare krävt framrening av IgG- fraktioner från serat, kan med uppfinningsmetoden utföras direkt på det kliniska serumprovet. Således inkuberas en definierad mängd av HIV- 462 497 8 10 15 25 30 35 omvänt transkriptas med olika serumutspädningar, varefter kvarvarande mängd ej blockerat enzym bestäms med uppfinningsmetoden.

Väsentligt för möjligheten till direkt analys med uppfinningsmeto- den är för det första den ökade känsligheten, som möjliggör mätning av låga enzymmängder, vilket gör att höga antikroppstitrar erhålls, och för det andra att, som nämnts ovan, icke-enzymstörande nukleotid(er), såsom cytidintrifosfat (CTP), kan tillsättas för att engagera substrat- nedbrytande enzymer i serum. Det senare möjliggör långtidsanalyser med serum närvarande. Dessa kriterier för ökad känslighet vid mätningar på HIV-omvänt transkriptas är också väsentliga för direkta DNA-polymeras- mätningar i serum från friska individer och från sådana med olika slags sjukdomar.

Tack vare den förbättrade känsligheten hos uppfinningsmetoden jäm- fört med de tidigare kända bestämningsmetoderna torde uppfinningen även kunna få tillämpningar på polymerasbestämningar som hittills inte varit möjliga.

Exempelvis antyds i W. Sibrowski et al., Z. Gastroenterologie 1987, 25, 673-676, möjlighet att påvisa NANB-hepatit genom bestämning av aktiviteten för det orsakande retrovirusets omvända transkriptas.

Vidare kan exempelvis referensnivâer av DNA-polymeras mätas direkt i serum hos friska individer, vilket i kombination med förhöjda nivåer vid olika sjukdomar ger en ny klinisk parameter för sjukdomsbedömning.

Polymerasbestämningsmetoden enligt uppfinningen är givetvis inte begränsad till prov från människor, utan kan likaväl tillämpas på djurprover, t.ex. för bestämning av leukovirusaktivitet.

Tillämpning av sättet enligt uppfinningen på kvantitativ bestäm- ning av HIV-omvänt transkriptas kan exempelvis ske på följande sätt: Immobiliserad mall funktior ll för viralt omvänt transkriptas (t.ex. poly(rA)-polystyrenkulor) förinkuberas direkt med ett orenat prov (t.ex. supernatant, cell-extrakt, serum). Efter noggrann tvätt (t.ex. dest. vatten) tillsätts lämplig reaktionsblandning, innefattande primer (t.ex. oligo(dT) za-18), märkt substrat (t.ex. 1251-IUdRTP) och andra nödvändiga komponenter (däribland Mg”*). Efter inkubering och tvätt (dest. vatten) mäter man den i mallen upptagna radioaktiviteten med gammaräknare. Det erhållna mätvärdet är direkt relaterat till aktiviteten av omvänt transkriptas i provet. Även om utförande av uppfinningsmetoden med en gelformig eller partikulär mall i vanliga provrör ger betydande fördelar jämfört med .om 10 15 25 9 462 497 nuvarande metoder, så kan det tekniska förfarandet förenklas ytter- ligare exempelvis genom bindning av mallen till en enda hanterber makrokula eller genom utförande av analysen i ett minikolonnsystem.

Som ovan nämnts avser en andra aspekt av uppfinningen användning av 1251-IUdRTP och substratanaloger därtill vid bestämning av poly- merasaktivitet. Med substratanaloger till 1251-IUdRTP avses *”5I-märkta modifierade nukleosidtrifosfater med väsentligen samma substratfunktion som 1251-IUdRTP. *“5I-IUdRTP har den följande strukturformeln Som exempel på tänkbara substratanaloger kan således nämnas sådana där ett eller flera av vätena i ställningarna 3,6,2',3',4' och 5' är ersatta med fluor och/eller flera av vätena i 4'- och 5'-ställning är utbytta mot CH3, CHQF, CHF2, CF3, jod eller brom och/eller en eller flera av de i molekylen förekommande syreatomerna är ersatta med sva- velatomer, särskilt syreatomerna i u-fosfatgruppen. Alternativt eller i kombination med de ovannämnda modifieringarna kan *25I-atomer sitta i 4'- eller 5'-ställning, varvid 5-ställningen kan vara substituerad med CH,, CHF,, CF,, jod eller brom.

Användningen av 1251-IUdRTP och dess substratanaloger är inte begränsad till det nya förfarandet med immobiliserad mall enligt den första aspekten av uppfinningen, utan de nya substraten kan lika väl användas för bestämningsmetoder baserade på fri mall i lösning, för vilka de innebär en betydande förbättring. Vid dessa förfaranden ut- nyttjar man för separation av substrat och produkt, såsom nämnts tidi- gare, utfällning av DNAt på filtrerpapper eller liknande med TCA eller etanol, eller också bindning till jonbytare fäst på filtrerpapper, såsom DEAE-filtrerpapper. Tack vare att man med de nya 1251-märkta substraten undviker quenching möjliggörs ett annat, effektivt sätt att separera substrat och produkt, nämligen att låta DNAt bindas till ett 10 462 497 10 15 30 35 flertal mindre kroppar eller produkter med jonbytargrupper fästa på ytan. Dessa kroppar eller partiklar kan ha lämplig densitet för att medge separation endast genom självsedimentation, varvid t.ex. kisel- pulver visat sig vara användbart. Alternativt kan t.ex. s.k. magne- tiska kulor utnyttjas, där separation sker med hjälp av magnet. Upp- repad tvätt kan därför enkelt utföras. Denna separationsteknik är inte bara enklare utan även känsligare jämfört med konventionell filterlapp- teknik, som ju är volymbegränsad.

I det följande kommer uppfinningen att beskrivas närmare med av- eseende på det föredragna substratet 1251-IUdRTP, framställning av några immobiliserade mallar, studier av parametrar vid specifika utförings- former av uppfinningsmetoden samt några speciella tillämpningsexempel.

Följande förkortningar och varunamn används: lUdRTP = 5'-jod-2'-deoxiuridintrifosfat IUdRPM = 5-jod-2'-deoxiuridinmonofosfat IUdR = 5-jod-2'-deoxiuridin prA = poly(rA) = polyadenylsyra prG = po1y(rG) = polyguanylsyra ATP = adenosintrifosfat DTE = ditioerytritol DEAE-cellulosa = dietylaminoetyl-cellulosa RT = omvänt transkriptas (reverse transcriptase) EGTA = etylenglykol-bis-(8-aminoetyleter)-N,N'-tetra- ättiksyra NP 40 = Nonidet P40 HEPES = N-2-hydroxietylpiperazin-N'-Z-etansulfonsyra odT = oligodeoxitymidylsyra TTP = tymidintrifosfat CTP = cytidintrifosfat TCA = triklorättiksyra BSA = bovinserumalbumin AMV = "avian myeloic leukemia" (myeloisk fâgelleukemi) HIV = humant immunbristvirus PBL = perifera blodlymfocyter Sepharosé9 = varumärke för agarosgel saluförd av Pharmacia AB FicolÉ9 = varumärke för sampolymer mellan sukros och epiklor- f) AI 10 15 30 11 462 497 hydrin saluförd av Pharmacia AB Triton X-100 polyetylenglyko1-p-isooktylfenyleter TLC tunnskiktskromatografi FRAMSTÄLLNING AV *”5I-IUdRTP (SUBSTRAT) A. Enzgmframställning Herpes simplex-virus typ 1, stam C42, odlades pâ BHK-C138-celler, såsom beskrivits av Gronowitz S., Källander C., Infec, Immun. 29: 425- 434 (1980). 16-24 timmar efter virusinfektionen pelleterades cellerna i en centrifug, och cellerna tvättades i en fysiologisk saltlösning och âtersuspenderades därefter i 10 ml buffert bestående av HEPES, 25 mM; MgS0g, 10 mM; ATP, 4 mM; DTE, 10 mM; och glycerol, 25%; pH 7,4. Cel- lerna sonikerades därefter i 2x30 sekunder. Efter centrifugering av cellerna vid 250.000 x g i 120 minuter späddes supernatanten 1/8 med bufferten ovan och frystes i små portioner vid -70°C.

B. Syntes av 1251-IUdRMP och *25I-IUdRTP För syntes av *25I-IUdRMP och 1251-IUdRTP bereddes en reak- tionsblandning med följande komponenter: HEPES, 89,4 mM; MgC12 8,1 mM; KCl, 17,7 mM; NaF, 2,1 mM; ATP, 4 mM; och DTE, 5 mM; pH 7,4. Vid stan- dardförfarandet indunstades bärarlösningen (vattenzetanol) med 2-3 mCi 1251-IUdR (2.000 Ci/mmol). Det kvarvarande 1251-IUdR återlöstes i 500 ul av reaktionsblandningen och inkuberades vid 37°C med 50 ul av den i steg A ovan erhållna enzympreparationen under önskad tidsperiod, van- ligen 90 till 120 minuter. Efter inkubation stoppades reaktionen genom att provröret hölls i kokande vatten i 5 minuter.

C. Rening Kromatografisystemet bestod av en standardglaskolonn med 10 mm innerdiameter packad med en 3 ml bädd av DEAE-cellulosagel (Whatman).

Kolonnen var ansluten till en peristaltikpump P-3 (Pharmacia AB), som tillät direkt och omvänt flöde. Det använda flödet var 0,5-0,75 ml per min., och absorbansen (OD255) övervakades kontinuerligt med envägsmoni- tor UV-1 ansluten till en enkanalskrivare REC-481 (Pharmacia AB).

Radioaktiviteten i elueringsmedlet övervakades med en enkel anord- ning bestående av en modifierad bärbar monitor för detektering av 462 10 15 20 30 497 m gammastrâlning (scintillationsmätare typ 5.40, Miniinstruments Ltd., Burnham on Crouch, England). Monitorns Nal-kristall placerades framför slangen som ledde eluenten från kolonnen. En enkanalspennskrivare var ansluten parallellt med monitorns högtalare.

Före varje körning tvättades kolonnen med IM HCI och jämviktades med vatten. Provet applicerades överst på kolonnen med användning av en pump, och obundet material eluerades med tre kolonnvolymer destillerat vatten. IUdR som inte användes vid reaktionen eluerades med 10 ml etanol (95%). Flödet från kolonnen reverserades, och material som inte hade trängt in i gelen eller adsorberats urtvättades med vatten. IUdRMP eluerades specifikt från kolonnen med 10 mM amoniumacetat, pH 5, vilket i hög grad påverkade laddningen hos monofosfatgruppen och minskade bindningen av IUdRMP till DEAE-cellulosan. IUdRTP eluerades slutligen med 25 mM MgCl,. Produktens identitet och renhet bestämdes med TLC.

De uppsamlade topparna förvarades vid +4°C efter tillsats av 0,02% mertiolat som konserveringsmedel. Denna IUdRTP-preparation användes i de följande försöken och analyserna utan ytterligare behandling.

FRAMSTÄLLNING AV IMMUBILISERADE MALLAR prA kopplat till magnetiska kulor prA med hög molekylvikt (Pharmacia AB) kopplades till tosylerade magnetiska Dynabeads M 450 (Dynal AS, Oslo, Norge) i närvaro av över- skott av prA. Kopplingsproceduren och behandlingen av kulorna skedde i överensstämmelse med tillverkarens anvisningar för koppling av IgG, med undantag av att IgG ersattes med prA (slutkoncentration 150 us/ml). prA bundet till polystyrenkulor av alkylamintyp (1/4" diameter) aktiverades med bärnstenssyraanhydrid, Polystyrenkulor av alkylamintyp (Pierce) och prA med hög molekylvikt (Pharmacia AB) kopplades till kulorna med användning av etyl-3-(3-dime- tylaminopropyl)-karbodiimid enligt standardförfaranden. prA bundet till Sepharoség (prA-gel) Poly-A-Sepharoséï*(Pharmacia AB), en kommersiell produkt av låg- molekylär prA bundet till Sepharoseëi Aktiverat DNA kopplat till Sepharosëa 10 15 20 25 30 35 ” 462 497 A) Koppling till aktiverad CH-Sepharoség Aktiverat (deoxiribonukleasbehandlat) kalvtymus-DNA (Pharmacia AB) kopplades till aktiverad gg-Sepharosëg (Pharmacia AB). Tillverkarens kopplingsprocedur och rekommenderade inkubationstider användes. Till 0,5 g Sepharosé® togs 1,5 mg DNA. Produkten förvarades i 50 mM Hepes- buffert, pH 8,0, med 0,05% mertiolat som konserveringsmedel.

B) Koppling till CNBr-Sepharoseâ Aktiverat DNA enligt ovan kopplades till cyanbromidaktiverad Sepharosëâ (Pharmacia AB), enligt tillverkarens beskrivning med föl- jande modifieringar; kopplingsbuffertz 10 mM KH,P04; blockeringsmedel: etanolamin; tvätt: 200 mM KCl omväxlande med tris-buffert, pH 8,0.

Produkten förvarades i tris-bufferten med 0,05% mertiolat. (Till 0,5 g Sepharoséâ togs 1,5 g DNA).

Icke aktiverat DNA kopplat till fast fas Tidigare studier har visat att enkelsträngat DNA lätt kan kopplas till fast fas, medan utbytet vid försök att koppla dubbelsträngat varit lågt. Detta problem har tidigare kringgåtts genom etablering av enkel- strängade regioner terminalt i dubbelsträngat DNA. För att erhålla gott utbyte av kopplat dubbelsträngat DNA utnyttjades här att DNA-hybridise- ringen är temperaturberoende, dvs. den kemiska kopplingen till den fasta matrisen har utförts vid hög temperatur 90-l00°C, eftersom enkel- strängsbetingelser då föreligger. Därefter sänktes temperaturen endera snabbt eller långsamt beroende på hur väl basparningen skulle ske, dvs. om många "nicks" och stor oordning önskades eller ej. I syfte att öka mängden "nicks" och enkelsträngsregioner värmdes även fast matris med kopplat DNA enligt ovan till 90-100°C, och vid denna temperatur till- sattes hårt "nickat" homologt DNA, dvs. korta bitar av likadant DNA, alternativt homologt RNA, allt i syfte att öka användbarheten av det kopplade DNAt som substrat vid kvantifiering av DNA-polymeriserande enzym.

A) Primär tillverkning av immobliserad mall DNA (2,5 mg/ml) löstes i 0,0lM KH,P0g under upphettning till 90- 95°C. Därefter tillsattes droppvis under omrörning svälld och tvättad CNBr 45-gel (Pharmacia AB), enligt tillverkarens instruktioner (l g torrvikt/100 ml DNA-lösning). Kopplingsreaktionen fick fortgå under 4 timmar till över natt under fortsatt omrörning och vid 90-95°C, var- 462 497 ” 10 20 25 30 35 efter gelen fick sedimentera och supernatanten avlägsnades. Därefter adderades 100 ml etanolamin, och blandningen omrördes under 2 timmar för inaktivering av eventuellt ej förbrukade CNBr-grupper. Slutligen tvättades gelen i glasfiltertratt med 90-100°C varm lösning av 1) 200 mM KCI i 5 mM tris-H01, pH 8,0 och 2) endast 5 mM tris-H01. Gelen suspenderades därefter i 5 mM tris-HCI, pH 8, och fick sedan svalna eller också sattes det hela i ett bad vid 90°C, vars uppvärmning sedan slogs ifrån, så att gelen långsamt fick svalna. Den färdiga matrisen förvaras sedan i tris-HCl-bufferten efter tillsats av natriumazid.

B) Ytterligare aktivering av immobiliserad DNA-mall Användbarheten av den immobiliserade mallen vid DNA-polymerasana- lys kan förstärkas genom introduktion av fler "nicks" eller primerstäl- len. Betingelserna för optimal mall varierar för olika typer av DNA- polymeriserande enzym. En principiell beskrivning av mallaktivering ges i det följande.

Immobiliserad DNA-mall enligt ovan upphettades till 90-100°C, varefter önskad primer, t.ex. olika grad av DNAs-degenererat homologt DNA tillsattes. Därefter sänktes temperaturen, så att basparning er- hölls, varefter gelen tvättades under stringenta betingelser med salt och tris-Hcl-buffert för avlägsning av partiellt bundet DNA. Pâ analogt sätt kan standardmallen förbättras genom högtemperatursaddition av homolog RNA-primer alternativt syntetisk DNA- eller RNA-primer.

RT-AKTIVITETSBESTÃMNINGSMETODER RT-aktivitetsbestämning_med fri mall (referens resp. enligt uppfin- Linea) Analysförfarandet är en modifiering av tidigare publicerade för- faranden, t.ex. i A.D. Hoffmann et aL, Virology lfij, 326-335 (1985).

Reaktionsblandningen bestod av (slutkoncentration): tris-HCI, 10 mM, pH 8,0; MgC12, 4mM; BSA, 0,5 mg/ml; NHÅCI, 100 M; NP 40, 0,37%; EGTA, 0,25 mM; prA, 0,625 H8/ml; 8x10'° mg/ml; “H-TTP 6xl0"M. Enligt uppfinningen användes 1251-IUdRTP istället för ”H-TTP vid ca 5xl0'°M (spec. aktivitet 220 Ci/mmol), såvida inte annat anges. 0dT1a-za» Analysvolym, inklusive 102 prov, var 250 ul. Reaktionsblandningen och prov (innehållande polymeras) blandades i ett provrör och inkuberades önskad tid under långsam skakning vid 30°C. Reaktionen stoppades genom 4) 10 15 20 25 30 35 15 462 497 pipettering av alikvoter, vanligtvis 40 ul, på 3 cm” små glasfiberfil- ter, RNA/DNA-hybriden utfälldes med TCA, och efter tvättning mättes radioaktiviteten i precipitatet med gammaräknare (Packard Autogamma 200), vilken representerar inkorporeringen av märkt 'zsl-IUdRTP i mallen. Enligt uppfinningen kan separationer av mall från nukleotid även ske med självsedimenterande eller magnetisk fast fas, till vilken DEAE-grupper kopplats (se även stycket "DNA-polymerasbestämning med fri mall" nedan).

RT-aktivitetsbestämning enligt uppfinningen - standardförfarande Slutkoncentrationen av komponenterna vid analyserna var, såvida inte annat anges: tris-H01-buffert, pH 8, 10 mM; KCl, 75 mM; MgCl,, 4mM; EGTA, 0,19 mM; DTE, 10 mM; BSA, 0,5 mg/ml; NP-40, 0,38%; 0dT;°_1a, 1,0 pg/ml för korta mallar och 0,05 ng/ml för långa mallar; IUdRTP 5,0, 10-8 mM och användning av 0,1-1,0 uCi 1251-IUdRTP per rör; 50 ul/rör av mall immobiliserad på magnetiska kulor (107/ml) eller på gel (5 g/40 ml), eller en på makrokula (av Pierce-typ); 50 ul prov för enzymanalys.

Den totala analysvolymen var 500 ul, om inte annat anges. Efter bland- ning av komponenterna (förrâdslösningar), tillsats av immobiliserad mall och enzymprov inkuberades provrören vid 30-35°C, och reaktionen stoppades efter önskad tid genom tvättning av den fasta matrisen fem gånger i 2,5 ml destillerat vatten. Det i den fasta matrisen inför- 1ivade*25I-IUdRMP bestämdes i en gammaräknare. Normalt utfördes analy- serna med trippelprov, och reaktionen avslutades efter ca 1-2 timmar för det första provröret, efter 3-4 timar för det andra provröret, och det sista provröret inkuberades över natten för kontroll av enzym- aktivitetens linearitet med tiden.

RT-aktivitetsbestämning enligt uppfinningen - modifierat förfarande med enzymrening För avlägsning av störande faktorer och koncentrering av RT inku- berades 0,25-1,0 ml cellkulturvätska, lymfocytextrakt eller serum först med 0,050 ml immobiliserad mall i 30 minuter vid 30°C. Den immobilise- rade mallen tvättades sedan fyra gånger (2,5 ml) med destillerat vat- ten, varefter komponenterna för RT-aktivitetsbestämning enligt uppfin- ningen tillsattes till de ovan angivna slutkoncentrationerna, och RT- aktiviteten bestämdes med det ovan beskrivna standardförfarandet. 462 497 10 15 25 30 35 16 DNA-polymerasbestämning med fri mall Reaktionsblandningen bestod av tris-H01, 10 mM pH 8; MgCl,,4 mn; bovinserumalbumin, 0,5 g/1; 100 mM vardera av deoxiadenosintrifosfat, deoxiguanosintrifosfat och deoxicytidintrifosfat; cytidintrifosfat, 0,5 mM; icke radioaktivt joddeoxiuridintrifosfat, 50 nM; aktiverat kalv- tymus-DNA, 0,5 3/1; ditioerytritol, 5 mM. *°5I-IUdRTP, l-5 nM (2-10 mCi/1). Slutvolym, inklusive 10 vol-Z prov var 200 ul.

Mängden radioaktiv nukleotid inkorporerad i DNAt bestämdes på något av följande sätt: a) Reaktionen stoppades genom att prov, vanligen 40 ul, av reaktions- blandningen sattes på lappar av vanligt filtrerpapper (Whatman SMM).

Lapparna tvättades sedan i fyra bad med triklorättiksyra, och den kvarvarande radioaktiviteten mättes i en gammaräknare. b) Alternativt sattes proverna på DEAE-filterlappar, som tvättades i 5% Na2HP0i enligt Lindell et al, Science 1970, vol. 170:447-448. Därvid tvättades substratet bort, medan mallen satt kvar på papperet och mängden inkorporerad isotop mättes i en gammaräknare. c) Enligt en i samband med föreliggande uppfinning framtagen ny teknik användes en reaktionsblandningsvolym på 200 ul, till vilken man efter avslutad polymerisationsreaktion satte 70 mg DEAE-kiselpulver (DEAE-Si500, Serva, Heidelberg). Rören med reaktionsblandning och DEAE- pulver skakades två minuter på rörskak, varefter pulvret fick själv- sedimentera och supernatanten sögs av. Pulvret tvättades genom omväx- lande tillsats av 2 ml 5% Na,HPO. och avsugning ax supernatanten. Det till pulvret bundna radioaktiva DNAt räknades i en gamaräknare. Meto- den lämpar sig även för större provvolymer.

DNA-polymerasbestämningfmed immobiliserad mall Reaktionsblandningen var densamma som ovan, med undantag av att aktiverat DNA ersattes med immobiliserad DNA-mall (50 ul gelsuspen- sion). Slutvolymen var 500 ul. Oförbrukat substrat sköljdes bort från mallen genom tvätt 5 ggr med 10 um NaH,P0. i dest. vatten, varefter gelen mättes i gammaräknare.

STUDIUH AV RT-AKTIVITETSBESTÄHNINGSFÖRFARANDEN I det följande redovisas försök utförda med standard- resp. den modifierade RT-aktivitetsbestämningsmetoden med avseende på olika 10 15 20 30 35 17 462 497 Paramêt Tal" - Anvanda RT och kliniska prov Renat AMV-RT (Pharmacia AB). Kliniska prov simulerades genom blandning av detta enzym och det undersökta provet.

Genklonat HIV-RT framställt ur bakterier (från prof. Bror Strand- berg, BMC, Uppsala).

Lysat från HIV-infekterade lymfocytkulturer behandlat med Triton X100 (slutkonc. 1,32) (erhållet från Statens Bakteriologiska Labora- torium, Stockholm).

Supernatanter från virusisoleringsförsök (erhållna från Statens Bakteriologiska Laboratorium, Stockholm).

Effektivitet för immobiliserad mall I enlighet med det ovan beskrivna standardförfarandet för RT- aktivitetsbestämning enligt uppfinningen utfördes analyser av varie- rande mängder AMV-RT resp. genklonat HIV-RT med de tidigare beskrivna immobiliserade mallarna för bestämning av deras kapacitet. Resultaten visas i de bifogade ritningsfigurerna 1-4.

I Fig. IA, B visas tidsberoendet för substratomsättningen med AMV- RT (Fig. IA) och partiellt renat HIV-RT (Fig. IB) med primer-modifierad Sepharosé3LprA-gel som immobiliserad mall. Tillgänglig **5I-IUdRTP var ca 230.000 cpm per rör, och 1/3.200-utspädningen av AMV-RT motsvarar 0,28 enheter enzym. Av Fig. IA framgår att en linjär inkorporering med tiden erhölls med låga enzymmängder, medan det mesta substratet upptogs redan efter kort tid med överskott av AMV-enzym. Resultaten i Fig. IA indikerar även att tillräckligt med mall' jämfört med IUdRTP-substrat var närvarande på matrisen.

I Fig. IC visas tidsberoendet för substratomsättningen med AMV-RT och användning av prA bundet till norska magnetiska kulor som immobili- serad mall. Tillgänglig **”I-IUdRTP var ca 103.000 cpm per rör, och 1/1.600-utspädningen av AMV-RT motsvarar 0,56 enheter enzym.

I Fig. 2A, B visas sambandet mellan AMV-RT-mängd och katalytisk aktivitet vid användning av prA-Sepharoséâ (Fig. 2A) eller prA-norska magnetiska kulor (Fig. 28) som immobiliserad mall. Tillgänglig 1251- IUdRTP var ca 230.000 och 103.000 cpm per rör för Fig. A resp.Fig. B, och 1/1.600-utspädningen av AMV-RT motsvarar 0,56 enheter enzym. Av dessa figurer framgår att substratomsättningen var proportionell mot 462 497 10 15 30 18 enzymmängden, så länge som överskott av substrat var närvarande.

I Pig. 3A visas sambandet mellan koncentration av primer (odT,,_1,) och katalytisk aktivitet av AMV-RT vid användning av prA- norska magnetiska kulor. 3,5 enheter AMV-RT användes per rör. 1/100- utspädningen av primer motsvarar 0,5 pg per rör. Som framgår av figuren erhölls ingen enzymreaktion i frånvaro av primer.

Fig. 38 visar motsvarande försök utfört med användning av AMV-RT (7,5 enheter/rör) och prA kopplat till polystyren-makrokulor.

I Fig. 4A, B visas effekten av koncentrationen av immobiliserad mall vid konstant förhållande mall/primer vid användning av primer- modifierad prA-Sepharoséâ (Fig. 4A) eller prA-norska magnetiska kulor (Fig. 48). Tillgänglig 1*°I-IUdRTP var ca 600.000 cpm per rör, och ca 2,5 enheter AMV-RT användes per rör. 1/1-mängden modifierad prA-Sepha- roséß motsvarar 50 ul gel per rör, medan 1/1-mängden prA-norska mag- netiska kulor motsvarar 4x10' kulor per rör. Som framgår av Fig. 4B var mall/primer-mängden hastighetsbegränsande med inkorporering av låga substratmängder vid alla testade koncentrationer av norska kulor, medan Fig. 4A visar att ett mättat system uppnåddes vid ca 25 nl modifierad prA-gel per analysrör.

Effekt av orenade kliniska prov och lymfocytextrakt vid standardmetoden enligt uppfinningen För att demonstrera svårigheterna med att bestämma RT-aktivitet direkt på orenade kliniska prov och lymfocytextrakt med standardmetoden enligt uppfinningen, och således även med de tidigare kända metoderna baserade på användning av fri mall, utfördes följande försök på extrakt och supernatanter från PBL-kultur.

Försöken utfördes genom att man blandade proven med lämplig mängd renat AMV-RT och därefter analyserade RT-aktiviteten med den tidigare beskrivna standardmetoden för RT-aktivitetsbestämning enligt uppfin- ningen med användning av prA-Sepharoséíïmall. Resultaten visas i Tabell 1, som anger utvunnen procent AMV-RT-aktivitet i förhållande till analystiden. 462 497 19 Tabell 1 Typ av 96 prov i Utvinning av AMV-RT- prov analysblandning aktivitet (96) efter 1"2 h över natt-inkubering Kontroll 0 100 100 Medium från PBL-kulturer C803 50 89,9 133,0 C808 50 115,2 110,0 C809 50 113,0 137,8 C801 50 88,9 75,3 C748 50 35,2 12,3 Extrakt från PBL-kulturer C803 50 44,7 1,4 C808 50 24,7 0,2 C809 50 45,0 4,5 C801 50 17,0 0,0 C748 50 8,4 0,5 Humanserum Tk7485 30 0,0 1,6 Tk9232 30 8 14,5 Tkl2310 30 12,9 13,5 pl 10 79,7 99 pl 50 eb 59,4 p2 10 68,6 79,4 p2 50 19,2 97,9 eb = ej bestämd 20 462 497 10 15 Som framgår av Tabell l ovan reducerade PBL-extrakten kraftigt utvinningen av RT-aktivitet redan efter kort analystid, medan lång- tidsanalysen visade att produkten bröts ned. Däremot hade endast en av de fem supernatanterna från oinfekterade cellkulturer signifikant effekt på RT-utvinningen.

Försök att utvinna RT-aktivitet från prov med höga serumkon- centrationer komplicerades även av ospecifik bakgrundsökning. sannolikt pâ grund av proteinprecipitering. Försöksresultaten visar emellertid att graden av störning varierade både med serumkoncentration och med serumursprung. när sera från» friska personer och personer med olika sjukdomar jämfördes, såsom exemplifieras för perniciös anemi fp) i Tabell 1. Dessutom var effekten av serum av kompetitiv natur och pro- duktdestruktion föreföll knappast ske.

Bindning_av RT till mall vid standard- resp. modifierad metod Förmågan hos immobiliserad mall att binda RT undersöktes på föl- jande sätt: AMV-RT eller HIV-RT blandades med prA-Sepharosëëloch inkuberades i 20-90 minuter vid 30°C under konstant blandning, varefter gelen tvät- tades fyra gånger och mängden bundet RT bestämdes genom tillsats av reaktionsblandning innefattande primer för att initiera reaktionen såsom beskrivits ovan. Motsvarande försök utfördes med undantag av att ingen tvättning av gelen utfördes före tíllsatsen av reakt;onsbland- ningen, dvs. ekvivalent med den ovan beskrivna standardmetoden enligt uppfinningen. Resultaten från representativa försök med AMV-RT och genklonat HIV-RT anges i Tabell 2 nedan. Beträffande analysförfaran- dena i Tabell 2 anger "direkt" standardmetoden, medan "fiskn." anger den modifierade metoden enligt uppfinningen med inledande "fiskning" av RT. 462 497 21 _E n.m . wš o on nn\oo\om oon n nno _ mnm _ on_ o_o _ om .cxwü oom o_ nno _ onm m om_ ono _ om Éušu ._.~_|I w _E 3 .Såå n oo 312: 2. PS oo SN _ »ä 2 om_ än 2 8 .Emm mm_ on oom _ ooo _m on_ o_o o_ om Éoàu ._.~_.._._ n _E n._ . WB o no mnm\no_\om_ nom o__ nn_ _ nom nn on_ oom n_ nm .cxwfl non mo nn_ _ nmm mm on _ onn m nm Éuàu mmO o .moon ..._.~_|>_I on o__\_m\_w m_o o__ oon _ mn_ om oom onn o_ om_ .cxmfi oon oo_ oon _ won om oom ooo n_ om_ øxošu o_o n oo nn\mn\mn ooo om_ nno _ oon _n on_ own n_ om .cxwfl oon nnm nno _ mmn no om_ on_ nm om wxušv m.o o no oo_\|\nn_ onm onm omn _ I oom m_m on om .cxmfl mno o_m omn _ ooo mo oom omn mm om wxuho o._ n |=| o no on\wn\mn mnn mn oom o mnn n nmm ono _ om_ .Exflm ....| m no oonnnšm mnn mm mnm o ono m .cxwfi 1.... o om nn\on\_n oo_ om won n on_ _ .cxwfi .oxå .öfio .Såå m om monmnšonmo omm _n on_ n Gmn n o .cxflw omm oo oom o own o nmm oom m om_ »xušu nå m nm wm_\n__\nm mmo nn non _ omm no o_o _ ooon om_ ...šmfi om nm_\on\om ooo mn non _ ooo mm o_o _ mno n om_ .cxwfl mno _o non _ omm nn o_o _ own n om_ 3.9.3 n._ GS ___\__\_ .EE mcouofi o? .EE .EE .EE øocm.. Cm..

.Eu »vtåwxmahm ___ ___ E» __ __ Ba _ _ E» ...äran :Évflšcvo ...c ._aEov_ äcxmfi >ø wEEEÉD Emo |mn_mc< Eou nmšmšm Eau |m.__m:< ..w>_mc< ._.~_..>_>_< xæwoæm m :unmh 22 462 497 10 15 30 Som framgår av Tabell 2 ovan utvanns normalt 80 - >l00% av AMV-RT- aktiviteten på gelen jämfört med referensen, medan ännu högre aktivitet utvanns med affinitetsreningen eller "fiskningen" med immobiliserad mall vid användning av halvrenat HIV-RT. Av tabellen framgår vidare effekten av olika inkubationstider för affinitetsreningssteget.

Tidsberoende för RT-utvinnigggur PBL-supernatant, extrakt och serum I Fig. SA visas resultat av försök avseende utvinning av AMV-RT- aktivitet från odlade PBL-extrakt som funktion av tiden. I figuren anger de heldragna linjerna den modifierade metoden innefattande fisk- ningssteget, medan de streckade linjerna avser standardmetoden med direkt analys. Försöket utfördes med tre olika PBL-extrakt (C803. C805 resp. C509). Som referens användes motsvarande mängd AMV-RT (1.3 en- heter per rör) som inte blandades med PBL-extrakt.

Figur SB visar motsvarande resultat med AMV-RT i blandat i serum.

Försöket utfördes med 6 olika serumprovblandningar bestående av 200 ul outspätt serum med 10 ul enzym tillsatt (0,9 enhet per rör). Som refe- rens användes utvinningen av AMV-RT från buffert.

Figur 6A, B visar resultat från försök med fiskning av HIV-RT ur kliniska prov, nämligen från infekterade PBL-kultursupernatanter (Pig. 6A) och i PBL-extrakt (Fig. 6B). Jämförelse gjordes mellan standardme- toden med direkt analys (streckade linjer) och den modifierade metoden med fiskning (heldragna linjer). Som immobiliserad mall användes modi- fierad prA-Sepharosëêl Av de ovan redovisade resultaten framgår att god utvinning erhölls både från PBL-supernatanter, vilket antydde frånvaro av affinitetsstö- rande faktorer, och från serum, vilket visade att kompetitiva agens inte binds utan kan borttvättas. Värdena för PBL-extrakten visar att huvuddelen av produktförstörande substanser avlägsnas i affinitetsste- get. och utvinningar på mellan 40 och 75% av AMV-RT-aktiviteten uppnåd- des.

Eftersom väsentligen kvantitativ utvinning är önskvärd och efter- som det inte kunde uteslutas att de produktförstörande faktorerna reducerade prA-mängden på den fasta fasen och dessutom avlägsnade något av det RT som var bundet till prA-mallen, utfördes de nedan redovisade försöken. m 20 30 35 23 462 MÄTNING AV PRODUKT-MALL-FÖRSTÖRANDE FAKTORER I PBL-EXTRAKT ÛCH UNDER- SÖKNING AV SKYDDANDE AGENS För att mäta störande aktiviteter i orenade prov användes tva olika modellsystem.

Enligt det första systemet inkuberades orenat prov med immobilise- rad mall (prA-Sepharoséëö utan primer under en given tid följt av om- sorgsfull tvättning av mallen, varefter mallens funktion bestämdes med det onodifierade analysförfarandet enligt uppfinningen.

Enligt det andra systemet framställdes en 1251-märkt mallhybrid genom långvarig inkubering av överskott av AMV-RT med komplett reak- tionslösning följt av grundlig tvättning. Avlägsningen av produkt faan gelen bestämdes sedan för olika kliniska prov.

För försöken framställdes en stor sats av extrakt av PBL isolerat fran normal mänsklig "buffy coat" genom Ficolß5Lgradientcentrifuge- rinà. gtörning hos PBL-extrakt vid RT-aktivitetsbestämning PBL-extraktets RT-analysstörande förmåga kontrollerades genom ut- förande av såväl standard- som den modifierade metoden enligt uppfin- ningen pâ prA-gel. Serieutspädningar av PBL-extraktet (outspätt cell- extrakt motsvarar 10' celler/ml) inkuberades 240 minuter i analysbland- ning med 0,28 enheter AMV-RT och 300.000 cpm 1251-IUdRTP tillgängligt.

Som kontroll mättes RT-aktiviteten i frånvaro av PBL-extrakt. Resul- taten visas i Figur 7. Som framgår av denna figur hade PBL-extraktet förmåga att störa direkta RT-mätningar (standardmetoden) åtminstone ned till en utspädning motsvarande 1,0 x 10* lymfocyter/ml. Med användning av den modifierade analysmetoden med en inledande "fisknings"-procedur kunde störningseffekten vid en 140 minuters analys elimineras upp till en PBL-koncentration av 7,8 x 10* lymfocyter/ml. inverkan av olika tvättprocedurer på RT-utvinning Effekten av olika tvättprocedurer vid fiskningssteget på utvin- ningen av AMV-RT-aktivitet ur ett extrakt av 1,5 x 105 PBL/ml bestämdes genom mätning av den utvunna aktiviteten med en 240 minuters nnalvs.

PBL-koncentrationen valdes för att ge signifikant störning av RT-4ktí- vitetsbestämningen efter fiskningssteget men ändå kvarlämna mätbar enzymaktivitet. Följande två tvättprocedurer användes: tvättning fem 462 497 2” 10 15 30 35 gånger med 6,6 gângers utspädning i varje steg (procedur 1); och tvärt- ning fem gånger med 40 gângers utspädning i varje steg (procedur 2;.

Som kontroll användes RT i buffert och tvättning av prA-gelen enligt procedur I. Resultaten visas i Fig. 8. Som framgår därav varierade den utvunna RT-aktiviteten med de använda tvättprocednrerna. Resultaten visar således närvaro av kvarvarande små mängder störande faktorer även efter fem upprepade tvättar. pRa-mallförstörande faktorer i PBL-extrakt Med hjälp av det ovannämnda första modellsystemet bestämdes när- varo av prA-mallförstörande faktorer i PBL-extrakt på följande sätt: Modifierad prA-gel förinkuberades 15, 30 resp. 70 minuter med vart och ett av extrakt från 7,8 x 10* PBL/ml, extrakt från 1,9 x 10* PBL/- ml, extrakt från total buffy coat motsvarande 3,1 x l0° PBL/ml och extrakt från total buffy coat motsvarande 7,8 x 105 PBL/ml. Därefter bestämdes prA-gelens förmåga att fungera som mall vid 240 minuters analys med 0,28 enheter AMV-RT efter inkubation och noggrann tvättning av gelen. Som kontroll användes funnen RT-aktivitet med prA-mall in- kuberad med buffert. Resultaten visas i Fig. 9. Av dessa framgår klart att pra-gelens förmåga att fungera som mall minskade, när förinkube- ringstiden med PBL-extraktet ökade, vilket antyder närvaro av förstö- rande enzymer.

Inverkan av störande faktor i PBL-extrakt på bildad RNA/DNA-hybrid och inhibering därav För att undersöka inverkan av de störande enzymerna i PBL-extrak- tet på den vid analysförfarandet bildade RNA-DNA-reaktionsprodukten användes det ovannämnda andra modellsystemet. Försök (ej redovisade här) visade att den märkta RNA-DNA-hybriden faktiskt bröts ned som.en linjär funktion av tiden och mängden använt PBL-extrakt.

Detta modellsystem användes sedan för att studera de störande enzymernas aktivitetsgrad och möjliga inhibitorer. Således bestämdes effekten av reducerande medel (DTE) på aktiviteten av RNA-DNA-hybrid- förstörande enzymer genom inkubering av den '°*I-märkta RNA-DNA-hybri- den i 240 minuter med extrakt från 2 x 10* PBL/ml vid olika DTE-kon- centrationer och efterföljande mätning av kvarvarande radioaktivitet på gel resp. i vätskefas. Som kontroll användes radioaktivt märkt hybrid inkuberad i buffert. Resultaten, som visas i Fig. 10, antyder att L!! 10 15 30 25 462 497 analysförfarandet bör utföras i frånvaro av DTE.

Pâ motsvarande sätt bestämdes inhiberande verkan av prG pâ de RNA- DNA-hybridförstörande enzymernas aktivitet genom inkubering av den 1251-märkta RNA-DNA-hybriden i 240 minuter med extrakt från 2 x 105 PBL!ml vid olika prG-koncentrationer och med radioaktivt märkt hybrid inkuberad i buffert som kontroll. Resultaten visas i Pig. 11 och an- tyder att prG är en kompetitiv inhibitor för de störande enzymernas reaktion.

Skydd av prA-mall med prG Som framgår av de olika försök beträffande störande faktorer som beskrivits ovan förstörs prA-mallen till en del under inkubation med PBL-extrakt, sannolikt av RNAser. Detta kan störa både utvinni gen av RT vid uppfiskningssteget och reaktionshastigheten eller lineariteten för den efterföljande aktivitetsbestämningen. Störningen under RT-akti- vitetsbestämningen skulle även kunna återspegla en verkan hos samma enzym att förstöra eller frigöra reaktionsprodukten, dvs. RNA-DNA- hybriden. Genom fiskningssteget vid den modifierade RT-bestämningsmeto- den enligt uppfinningen elimineras uppenbarligen det mesta av produkt- förstörande enzym, men ett medel som skyddar RNA-DNA-hybriden skulle vara användbart för att reducera tvättningsproceduren. Ett väsentligt problem är därför att skydda prA-mallen under fiskningssteget. Detta skulle kunna ske genom införande av selektiva fysikaliska eller kemiska betingelser. Både tillsats av direkta RNAS-inhibitorer och utelämnande av substanser väsentliga för RNAs-aktivitet är således tänkbara.

Förutsatt att samma enzym är ansvarigt för destruktionen av prA-mall och RNA-DNA-hybrid, så skulle, som redan nämnts ovan, fiskningssteget vid RT-bestämningsförfarandet företrädesvis utföras i frånvaro av DTE.

Vidare kan 'således, som också framgått ovan, prG användas för att skydda RNA-DNA-hybriden efter fiskningssteget vid den efterföljande aktivitetsbestämningen.

Eftersom HIV-RT tidigare är känt för att ha jämförelsevis låg affinitet till prG, skulle detta kunna vara ett möjligt skyddande agens för den immobiliserade prA-mallen. För att bestämma effekten av olika koncentrationer prG på de olika stegen av RT-aktivitetsanalysen utför- des en 75 minuters analys av aktiviteten av renat genklonat HIV-RT, dels med standardmetoden med en direkt aktivitetsbestämning på odT-prA- gel i närvaro av olika koncentrationer prG, och dels med den modifie- 462 497 % lä IJ u» 30 rade metoden med föregående "fiskning" av HIV-RT ur lösningar iflflßhål- lande olika mängder prG följt av noggrann tvätt av gelen, och därefter bestämning av den bundna enzymaktiviteten i frånvaro av prG. Resultaten för den direkta enzymaktivitetsbestämningen visas 1 Pig. 12A och för bestamningen med separat fiskningssteg i Fig. 128. Av resultaten framgår att prG inte stör RT-aktiviteten under analysen men stör bind- ningen av RT till prA vid fisknings-proceduren. Därav kan man således sluta sig till att prG kan vara användbart för att skydda RNA-DNA- hvbriden efter fiskning, dvs. för att eliminera kvarvarande RSAs- aktivitet.

Bestämning_av HIV-RT-blockerande antikroppar Närvaro av HIV-RT-blockerande antikroppar i serumprov bestämdes på följande sätt. Olika spädningar av serum från HIV-infekterad resp. frisk person inkuberades vid 37°C i 75 min. med HIV-RT eller AMV-RT for kontroll. Därefter bestämdes kvarvarande RT-aktivitet dels med immu- biliserad mall och uppfiskningssteg, och dels med fri mall i lösning, varvid dock CTP tillsattes som substratskydd och med 0,5 mh spermin närvarande. Resultaten visas i Fig. 13A, B.

I Fig. 13A visas således den enzymblockerande kapaciteten hos ett serum från en HIV-positiv individ jämfört med serum från en HIV-nega- tiv. Den serummängd som krävdes för 50% inhibition av HIV-RT motsvarar 13 ng IgG. Fig. 138 illustrerar sambandet mellan erforderlig mängd serum för 502 RT-inhibition och mängd RT vid analysen. Av figuren framgår även att det HIV-positiva serumet inte blockerar AMV-RT.

Dessa resultat visar att bestämningen av RT-aktivitet enligt föreliggande uppfinning kan utföras direkt på serum på grund av sys- temets höga känslighet. Den senare beror till stor del på användningen av 1251-IUdRTP som substrat samt även på möjligheten att skydda sub- stratet med CTP vid långtidsanalys. Den höga känslighet som uppnås, vilken kan exemplifieras av att endast 10 ng IgG behövdes vid den ovan beskrivna analysen jämfört med 300 ng för det starkaste HIV-serat enligt Chatterjee R. et al, J. Clin. Immunol. Vol. 7. No. 3, 1987, innebär givetvis att en större spännvidd av antikroppstitrar kan erhål- las. 15 'JO 30 N 462 497 STUDIUM AV DNA-POLYMERASAKTIVITETSBESTÄMNING Bestämning av aktivitet för Klenows enzym Med hjälp av det ovan beskrivna förfarandet för DNA-polymeras- bestämning med immobiliserad mall mättes aktiviteten för Klenows enzvm pá olika gelmallar. Vid försöket användes gelbunden mall framställd som och dels l ml av gelen, i närvaro eller frånvaro av beskrivits ovan. dels som sådan ("oprimad") aktiverad 4"pri- mad") genom uppkokning av spermidin (2 mM). med 0,4 ml DNAs-behandlat DNA och tvätt med hög saltkoncentration före användningen. Det DNAs-behandlade DNAt cprimernß erhölls genom “nickning" av 40 ml DNA-lösning innehållande S mg DNA;nl ng/ml DNAs 4 å timme, DNAset inaktiverades därefter genom värmning vid 70°C i 20 min., varefter DNA1 fälldes med hestämníngen användes 2 x l0“° resp. 2 x 10"* enheter av Klenows enzym. med 125 (slutkoncentratíon) vid 37°C i etanol och KCI, tvättades och âterspäddes till 8 nl. Vid Resultaten redovisas i den följande Tabell 3.

Tabell 3 z Uppmätt aktivitet (cpm) 2xl0'“ enhet Klenow 2xl0'* enhet Klenow Mall efter hö efter 1005 efter 45 efter 1005 min. min. min. min. primnd\ 2 810 66 384 30 540 *l99 392 primad + 1 875 47 796 20 115 143 644 lspermidin apr-ifran l ass 7 332 1 575 31 aso bakgrund 295 264 210 seo * ej linjär på grund av substratutarmning Av tabellen framgår klart den utmärkta känslighetsförbättring som uppnås med den aktiverade mallen (ca 10 gånger).

Jämförelse av °H-TTP och **5I-IUdRTP vid DNA-polvmerasbestämning Försök utfördes med bestämning av DNA-polymerasaktivitet med frl mall såsom beskrivits ovan, varvid man som substrat använde dels 462 497 28 IÛ IJ gl 30 35 *iii-IUdRTP enligt uppfinningen och dels det tidigare kända substratet ”H-TTP med samma mängd radioaktivitet (0,27 nCi/40 ul) vid olika slut- koncentration av IUdRTP respektive TTP. Figur 14A visar aktiviteten hos ett renat enzym, Klenow, och Figur 148 DNA-polymeras-aktiviteten 1 ett serumprov från en leukemipatient. På grund av den låga specifika akti- viteten kan inte 1 nCi/40 ul erhållas vid lägre koncentrationer än ca 8 x 10"' M av “H-TTP. Detta innebär, som framgår av Figur 14A, att ca 12 ggr högre känslighet erhålls vid optimal ***I-IUdRTP-konceutration än *H-TTP vid 8 x 10"' M. Skillnaden i känslighet blir ännu större om analysen skall köras med större mängd radioaktiv nuklid. Förutom den högre räkneeffektiviteten för 1251 (62%) jämfört med 'H (302) beror könslighetsskillnaden även på enzymets kinetik. Motsvarande känslighet- sökning har konstaterats vid analyser av AMV-RT eller HIV-RT.

Skvdd av '°5I-IUdRT2/genom tillsats av CTP Inkubering av **5I-IUdRTP med serum i frånvaro av mall visar pä förbrukning av substratet som inte beror på inkorporering i DNA. Detta kan bero på att substratet utnyttjas av andra enzymer än DNA-polymeras.

Man har sålunda t.ex. påvisat närvaro i serum av flera former av tymi- dintrifosfatnukleotidhydrolas, ett enzym som bryter ned TTP. Det hat visat sig att närvaro av cytidintrifosfat (CTP) i reaktionsblandningen eliminerar den i serum befintliga mall-oberoende nedbrytningen av substratet. Resultat från inkubering av serum och substrat med 2 mM CTP över natt visas i Pig. ISA och ISB. Som framgår av Fig. ISA förstördes mindre än 10% av substratet vid närvaro av 2mM CTP. medan mer än 90% av substratet förstördes i frånvaro av CTP. Dock gav höga koncentrationer av CTP inhibering av serumpolymerasaktiviteten, såsom visas i Fig. 158.

Med 0,5 mM CTP i reaktionsblandningen erhölls den bästa sammanlagda effekten, och en avsevärd förbättring av lineariteten för -nkorpore- ringen av det märkta substratet uppnâddes. CTP kan givetvis användas i samtliga fall där man vill förhindra nedbrytning av '**I-IUdRTP-sub- stratet, förutsatt att CTP inte stör den önskade reaktionen. CTP an- vänds därför med fördel även vid RT-aktivitetsmätningen, såsom för HIV- RT.

Bindningg till DEAE-bärare istället för TCA-utfällning vid bestämnirg med fri mall Genom att binda DNAt till DEAE-papper istället för att precipitera 10 IJ g!! 30 29 462 497 med triklorättiksyra har en viss förbättring av lineariteten med t1d erhållits. Detta torde bero på att en viss fragmentering av mallen under inkubationen kan förekomma, och att DEAE-papperet bättre kan fånga upp eventuella frisatta oligonukleotider än TCA-fällning.

Den övre gränsen för den provvolym som tas ur reaktionshlandningen till lapparna är begränsad av den volym lapparna kan absorbera. Efter- som en ökad lappstorlek ger ökad bakgrund på grund av försämrad tvätt- effekt och är opraktisk, är ca 40 ul den största användbara volymen.

Den ovan beskrivna tekniken att binda DNAt till DEAE-pulver tillåter emellertid lätt mätning av 500 ul-volymer, vilket möjliggör direkt enrörsbestämning utan provtagning.

Detektion av serum-DNA-polymerasaktivitet hos friska individer Det har vidare visat sig att användning av *”5I-IUdRTP enligt upp- finningen i kombination med den ovan beskrivna tillsatsen av CTP som substratskydd och DEAE-separation möjliggör mätning av DNA-po1ymeras- referensnivâer hos friska individer, vilket exemplifieras i Fig. 16. som visar mängd produkt vid 5 resp. 10% slutkoncentration av serum i analysen som funktion av analystiden.

Analysproduktens DNAs-känslighet bestämdes genom att produkten efter inkubation över natt fördelades på två rör, varefter DNAs sattes till det ena röret och samma volym vatten till det andra som kontroll.

Efter inkubation bestämdes mängd kvarvarande produkt genom TCA-fällning resp. genom bindning till DEAE-papper. Resultaten visas i Tabell 4 nedan.

För att kontrollera typen av DNA-polymeriserande aktivitet 1 DNA- serumet gjordes förinkubering av serumprovet med monoklonal antikropp fanti-DNA-polymeras-u-antikropp nr. SJK 13220) resp. med vatten som kontroll. Därefter bestämdes den kvarvarande DNA-polymeriserande akti- viteten hos serumet genom en övernatt-assay (1275 min.). Dessa resultat visas i Tabell 5 nedan.

Tabell 4 kvarvarande produkt (cpm) efter inkubering med Prov H20 DNAS TCA- DEAE- TCA- DEAE- sep. sep. sep. sep. 50 l0l 21 084 21 756 2 960 3 212 50 104 46 588 52 104 2 568 6 004 462 497 3° 10 Tabell 5 DNA-polymeriserande aktivitet (cpm) Serum- Prov inkub. Prov inkub.

Prov med vatten med antikropp 50 101 39 392 2 832 50 102 9 904 3 784 50 104 41 024 16 800 50 109 24 536 2 672 Som framgår av försöksresultaten är produkten vid analys av referensserum DNAs-känslig, och enzymreaktioner kan inhiberas genom förinkuhation av referensprovet med monoklonala antikroppar som bloc- kerar u-DNA-polymeras, vilket visar att substratet byggs in i DNA och att det aktiva enzymet är av a-DNA-polymeras-karaktär. Eftersom man tidigare konstaterat förhöjda DNA-polymeras-nivåer i serum från patien- ter med olika sjukdomar, och att denna aktivitet förefaller vara sjuk- domsrelaterad. bör således DNA-polymerasmätning utgående från referens- nivåer kunna utgöra en klinisk-kemisk parameter för rutinmässig analys, när vidare klinisk dokumentation har skett.

Uppfinningen är givetvis inte begränsad till de ovan speciellt beskrivna utföringsformerna, utan många modifieringar och ändringar ligger inom ramen för den allmänna uppfinningstanken sådan den anges i de efterföljande patentkraven. 1983-ll-30

Claims (12)

10 15 20 25 30 462 497 31 P A T E N T K R A V

1. Sätt att kvantitativt bestämma nukleinsyrapolymerasak- tivitet i ett prov innefattande inkubering av provet med en naturlig eller helt eller delvis syntetisk polynukleotidmall och en reagenslösning innehållande nödvändiga substrat inne- fattande minst ett till mallen komplementärt radioaktivt märkt nukleosidtrifosfat, separation av mallen från substra- tet och mätning av den i mallen inkorporerade radioaktivite- ten, som är väsentligen proportionell mot polymerasaktivite- ten i provet, varvid, när primer krävs, denna antingen kan vara hybridiserad till mallen från början eller adderas vid bestämningen, k ä n n e t e c k n a t av att mallen är immobiliserad på en bärare, att nämnda nukleosidtrifosfat är märkt med en gam- mastrålande isotop och att mätningen av den inkorporerade radioaktiviteten utförs direkt på den immobiliserade mallen utan frigöring därav från bäraren.

2. Sätt enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t av att man först inkuberar provet med den immobiliserade mallen för upptagning av polymeras- aktivitet därpå, och efter separation av mallen från provet inkuberar denna med reagenslösningen innefattande det radio- aktivt märkta nukleosidtrifosfatet för bestämning av den på mallen upptagna polymerasaktiviteten.

3. Sätt enligt patentkravet 1 eller 2, där polymeraset är omvänt transkriptas, k ä n n e t e c k n a t av att den immobiliserade mallen är en enkel nukleotidkedja av RNA-typ och att mallen hybridise- ras med en deoxiribonukleotid-primer.

4. Sätt enligt patentkravet 1 eller 2, där polymeraset är DNA-polymeras, k ä n n e t e c k n a t av att den immobiliserade mallen är en dubbel nukleotidkedja med enkelsträngsregioner eller en 462 497 32 20 25 30 enkel nukleotidkedja med minst en dubbelsträngsregion.

5. Sätt enligt patentkravet 1 eller 2, där polymeraset är ett RNA-polymeras, att mallen, beroende på typ av RNA-polymeras, är antingen DNA med erforderlig primer eller RNA med erforderlig primer. k ä n n e t e c k n a t av

6. Sätt enligt något av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda radioaktiva isotop är en jodisotop, företrädesvis 1251.

7. Sätt enligt något av pfïentkraven 1-4 och 6, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda nukleosidtrifosfat är ett jod-2'-deoxiuridin-trifosfat, 5-jod-2'- deoxiuridintrifosfat. företrädesvis

8. Sätt enligt något av patentkraven 1-7, k ä n n e t e c k n a t av att den immobiliserade mallen är kemiskt modifierad för att inte nedbrytas av RNAser och DNA- ser, företrädesvis genom 2'-O-metylering, P-metylering eller P-sulfonering.

9. Sätt enligt något av patentkraven 1-8, k ä n n e t e c k n a t av att den bärare på vilken mallen är immobiliserad är en gel, mikrosfär eller kula.

10. Sätt enligt något av patentkraven 3 eller 5-9, k ä n n e t e c k n a t av att man för att skydda mallen tillsätter en eller flera RNAs-inhibitorer, särskilt polygua- nylsyra.

11. Sätt enligt något av patentkraven 1-10, k ä n n e t e c k n a t av att man tillsätter en eller flera trinukleotider som inte ingår i polymerisationsreaktionen men som skyddar det radioaktivt märkta substratet mot nedbrytande enzymer, särskilt cytidintrifosfat. 462 497 33

12. Användning av sättet enligt något av patentkraven 1-ll vid bestämning av antikroppar mot omvänt transkriptas i ett prov, särskilt HIV-omvänt transkriptas, genom inkubering av provet med en definierad mängd omvänt transkriptas och där- efter bestämning av kvarvarande, ej antikroppsblockerat om- vänt transkriptas.