SE461101B - USE OF STEMS FROM THE GROUP BACILLUS FOR THE EXTRACTION OF SUCCESS INHIBITORS AND WAY TO MANUFACTURE SUCCESS INHIBITORS - Google Patents

USE OF STEMS FROM THE GROUP BACILLUS FOR THE EXTRACTION OF SUCCESS INHIBITORS AND WAY TO MANUFACTURE SUCCESS INHIBITORS

Info

Publication number
SE461101B
SE461101B SE8901456A SE8901456A SE461101B SE 461101 B SE461101 B SE 461101B SE 8901456 A SE8901456 A SE 8901456A SE 8901456 A SE8901456 A SE 8901456A SE 461101 B SE461101 B SE 461101B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
dsm
inhibitors
sie
subtilis
strains
Prior art date
Application number
SE8901456A
Other languages
Swedish (sv)
Other versions
SE8901456D0 (en
Inventor
W Frommer
Original Assignee
Bayer Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Ag filed Critical Bayer Ag
Publication of SE8901456D0 publication Critical patent/SE8901456D0/en
Publication of SE461101B publication Critical patent/SE461101B/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Description

461 101 kan användas för kontroll och styrning av kolhydratomsättningen hos människor och djur genom hämning av sackaras med hjälp av des- sa verksamma substanser. 461 101 can be used for the control and regulation of carbohydrate metabolism in humans and animals by inhibiting sucrose by means of these active substances.

För att få fram lämpliga stammar använder man sig av nedan beskriv- na metoder.To obtain suitable strains, the methods described below are used.

Från jordprover isoleras på känt sätt stammar från familjen Bacil- laceae, isynnerhet sådana från gruppen Bacillus. Med avympningar från dessa stammar ympar man kulturkolvar med näringslösningar, som möjliggör tillväxt av dessa stammar. Man kan t.ex. använda en nä- ringslösníng som innehåller S g pepton och 3 g köttextrakt per li- ter, men i princip är många andra slags näringslösningar användba- ra, som innehåller lämpliga kol- och kvävekällor och närsalter. pH-värdet i näringslösningen kan varieras inom vida gränser. Före- trädesvis väljes ett utgångs-pH i näringslösningen mellan 6,0 och 8,0.From soil samples, strains from the family Bacillaceae, in particular those from the group Bacillus, are isolated in a known manner. With inoculations from these strains, culture flasks are inoculated with nutrient solutions, which enable the growth of these strains. One can e.g. use a nutrient solution that contains S g peptone and 3 g meat extract per liter, but in principle many other types of nutrient solutions are usable, which contain suitable carbon and nitrogen sources and nutrients. The pH value of the nutrient solution can be varied within wide limits. Preferably, a starting pH in the nutrient solution is chosen between 6.0 and 8.0.

Som kolkälla i näringslösningen ifrågakommer de mest olika organis- ka substanser. Kolhydrater, organiska syror och alkoholer nämnes som exempel.As a carbon source in the nutrient solution, the most diverse organic substances come into question. Carbohydrates, organic acids and alcohols are mentioned as examples.

Som kvävekälla kan jästextrakt, sojamjöl, peptoner, köttextrakt och många andra organiska substanser användas.As a source of nitrogen, yeast extracts, soy flour, peptones, meat extracts and many other organic substances can be used.

Koncentrationen av kol- och kvävekällorna samt närsalterna, av vil- ka FeSO4, CaCO3 och MQSO4 speciellt nämnes, kan varieras inom vida gränser. Den separata tillsatsen av närsalter kan i många fall ute- lämnas, eftersom dessa ofta förekommer som tillsatser i de komplexa kvävekällorna.The concentration of carbon and nitrogen sources as well as the nutrients, of which FeSO4, CaCO3 and MQSO4 are specifically mentioned, can be varied within wide limits. The separate addition of nutrients can in many cases be omitted, as these often occur as additives in the complex nitrogen sources.

Eftersom bildningen av inhíbitorer ofta starkt beror på näringens sammansättning, är det lämpligt att odla stammarna i olika närings- lösningar för optimering av produktionsprestationen. Motsvarande förslag framgår av exemplen.Since the formation of inhibitors often depends strongly on the composition of the industry, it is appropriate to grow the strains in different nutrient solutions to optimize production performance. Corresponding proposals are shown in the examples.

Av näringslösningen fyller man t.ex. 100-200 ml i en 1-liters Er- lenmeyer-kolv, steriliserar på känt sätt, ympar med den stam, som 461 101 skall-undersökas och odlar kolven vid 15-80°C, företrädesvis vid 24-4o°c resp. so-7o°c, för termofile baciiler 1 ekekmaekiner. om kulturen visar tillväxt, vilket i allmänhet kan ses efter 1-10 da- gar, oftast efter 1-5 dagar, så tar man ut ett prov pâ t.ex. 5 ml och separerar cellerna i detta prov genom filtrering eller centri- fugering. Av odlingslösningen satsas 1-100 mikroliter i nedanståen- de beskrivna test, och den hämmande kapaciteten beräknas per ml.The nutrient solution is filled with e.g. 100-200 ml in a 1-liter Erlenmeyer flask, sterilize in a known manner, inoculate with the strain to be examined and grow the flask at 15-80 ° C, preferably at 24-40 ° C resp. about 70 ° C, for thermophilic bacilli 1 ekekmaekiner. if the culture shows growth, which can generally be seen after 1-10 days, usually after 1-5 days, a sample of e.g. 5 ml and separates the cells in this sample by filtration or centrifugation. 1-100 microliters of the culture solution are used in the tests described below, and the inhibitory capacity is calculated per ml.

Cellerna extraheras med 2 x 5 volymer (beräknat på cellvolymen) aceton och därefter med 1 x 5 volymer dietyleter. De förenade ex- trakten indunstas till torrhet, upptages i vatten och lyofiliseras.The cells are extracted with 2 x 5 volumes (calculated on the cell volume) of acetone and then with 1 x 5 volumes of diethyl ether. The combined extracts are evaporated to dryness, taken up in water and lyophilized.

Lyofilisaten satsas i en koncentration av 10-1000 pg/ml i nedan beskrivna test.The lyophilisate is charged at a concentration of 10-1000 pg / ml in the tests described below.

Sackarastest En sackaras-inhibitor-enhet (SIE) definieras som den mängd inhibi- tor, som till 50% inhibiterar två sackarasenheter. En sackarasenhet (SE) är den mängd enzym, som på 1 minut under angivna testbetingel- ser spaltar 1 pmol sackaros till glukos och fruktos. Antalet pmol bildad glukos bestämmes kvantitativt med hjälp av glukosoxidasreak- tionen under betingelser, vid vilka en ytterligare sackarosspalt- ning genom sackarosen inte äger rum. För genomföring av testet för- sättes 0,05 ml av en till 0,12 SE justerad sackaraslösning med 1-20 pg inhibitor eller 1-20 pl av den lösning, som skall testas, och påfylles med 0,1 M natriummaleinatbuffert pH 6,0 till 0,1 ml.Sucrase test A sucrase inhibitor unit (SIE) is defined as the amount of inhibitor that 50% inhibits two sucrase units. A sucrose unit (SE) is the amount of enzyme which, in 1 minute under specified test conditions, breaks down 1 pmol of sucrose into glucose and fructose. The number of pmoles of glucose formed is determined quantitatively by means of the glucose oxidase reaction under conditions in which a further sucrose cleavage by the sucrose does not take place. To perform the test, add 0,05 ml of a sucrose solution adjusted to 0,12 SE with 1-20 pg of inhibitor or 1-20 μl of the solution to be tested and make up to 0,1 M with sodium malinate buffer pH 6. 0 to 0.1 ml.

Därefter bringas till jämvikt 10 minuter vid 35°C, och därefter tillsättes 0,1 ml av en till 35°C förvärmd 0,05 M sackaroslösning i 0,1 M natriummaleinatbuffert pfl 6,0. Därefter inkuberas 20 minuter vid 35°C, och sackarasreaktionen stoppas genom tillsats av 1 ml glu- kosoxidasreagens 2) och man inkuberar ytterligare 30 minuter vid 3s°c. Härefter tillsättes 1 ml 50%-ig a2so4 een mätee vid 545 nm mot ett motsvarande nollprov. För utvärdering beräknas den procen- tuella hämningen av det satsade sackaraset, och från den 50%-iga hämningspunkten omräknas med hjälp av en glukoskalibreringskurva till SIE/g resp. SIE/1. 461 101 1) Lösligt sackaras från slemhinna i svintunntarm enligt B. Borg- Ström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. lg (1958), sid. 1997.It is then equilibrated for 10 minutes at 35 ° C, and then 0.1 ml of a 0.05 M sucrose solution preheated to 35 ° C is added in 0.1 M sodium malinate buffer of 6.0. Then incubate for 20 minutes at 35 ° C, and the sucrose reaction is stopped by adding 1 ml of glucose oxidase reagent 2) and incubating for another 30 minutes at 3s ° C. Then 1 ml of 50% a2SO4 is added at a measurement at 545 nm against a corresponding blank. For evaluation, the percentage inhibition of the invested sucrose is calculated, and from the 50% inhibition point is calculated using a glucose calibration curve to SIE / g resp. SIE / 1. 461 101 1) Soluble sucrose from mucous membrane in pig intestine according to B. Borg-Ström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. lg (1958), p. 1997.

Spädd med 0,1 m natriummaleinatbuffert pH 6,0 till motsvarande 2) SE-halt.Dilute with 0.1 m sodium malinate buffer pH 6.0 to the corresponding 2) SE content.

Glukosoxidasreagenset framställes genom upplösning av 2 mg glu- kosoxidas (Fa. Boehringer, Renhetsgrad I) i 100 ml 0,565 m Tris- HCl-buffert pH 7,0 och sedan tillsättes 1 ml ytaktivt medel (2 g Triton X 100 + 8 g 95% etanol p.a.), 1 ml dianisidinlösning (260 mg o-Dianisidin . 2 HCl i 20 ml H20) och 0,5 ml 0,1%-ig peroxidaslösning i H20. (Fa. Boehringer, Lyophilisat, Renhets- grad II).The glucose oxidase reagent is prepared by dissolving 2 mg of glucose oxidase (Boehringer, I.) in 100 ml of 0.565 m Tris-HCl buffer pH 7.0 and then adding 1 ml of surfactant (2 g Triton X 100 + 8 g 95% ethanol pa), 1 ml of dianisidine solution (260 mg o-Dianisidine. 2 HCl in 20 ml H 2 O) and 0.5 ml of 0.1% peroxidase solution in H 2 O. (Fa. Boehringer, Lyophilisate, Purity II).

Enligt ovan beskrivna metod testades en mängd stammar från famil- jen Bacillaceae. Därvid fanns isynnerhet hos stammar från gruppen Bacillus tydliga sackarasinhiberande aktiviteter. Gynnsammast med hänsyn till utbytet visade sig arterna B. subtilis, B. subtilis var. niger, B. amyloliquefaciens, B. longisporus, B. polymyxa samt B. coagulans.According to the method described above, a number of strains from the family Bacillaceae were tested. In particular, strains from the group Bacillus had clear sucrose-inhibiting activities. The species B. subtilis, B. subtilis var were the most favorable with regard to the yield. niger, B. amyloliquefaciens, B. longisporus, B. polymyxa and B. coagulans.

Den frekvens med vilken enligt den angivna metoden stammar hitta- des, som i resterna visade sig vara aktiva inhibitorer, låg på över 5%. Exempel på speciellt verksamma stammar återges i tabell 1.The frequency with which strains were found according to the stated method, which in the residues turned out to be active inhibitors, was over 5%. Examples of particularly active strains are given in Table 1.

Tabell 1 Bacillus-stammar med sackaras-inhibitor-verkan Art B.Table 1 Bacillus strains with sucrose inhibitory activity Art B.

B.B.

B.B.

B.B.

B.B.

B.B.

B.B.

B.B.

B. subtilis subtilis var. niger amyloliquefaciens coagulans longísporus polymyxa polymyxa polymyxa polymyxa polymyxa polymyxa polymyxa DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM Stam nr. 704 675 (ATCC 9372) 7 (ATCC 23 350) 1 (ATCC 7050) 479 * 365 372 742 292 356 (ATCC 8523) 36 (ATCC 842) 740 5 461 101 ëšå Stam nr.B. subtilis subtilis var. niger amyloliquefaciens coagulans longísporus polymyxa polymyxa polymyxa polymyxa polymyxa polymyxa polymyxa DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM DSM Stam nr. 704 675 (ATCC 9372) 7 (ATCC 23 350) 1 (ATCC 7050) 479 * 365 372 742 292 356 (ATCC 8523) 36 (ATCC 842) 740 5 461 101 ëšå Stam nr.

B -PO lymyxa osm 741 B. subtilis DSM 1050 B. subtilis DSM 1051 B. subtilis DSM 1052 B. subtilis DSM 1053 B. sultilis DSM 1054 B. subtilis DSM 1055 B. subtilis DSM 1055 B. subtilis DSM 1057 'k hämmar även amylaser De anförda stammarna är deponerade under de angivna DSM-numren hos Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM), Göttingen, och kan erhållas därifrån.B -PO lymyxa osm 741 B. subtilis DSM 1050 B. subtilis DSM 1051 B. subtilis DSM 1052 B. subtilis DSM 1053 B. sultilis DSM 1054 B. subtilis DSM 1055 B. subtilis DSM 1055 B. subtilis DSM 1057 'I also inhibit amylases The strains listed are deposited under the DSM numbers indicated at the Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM), Göttingen, and can be obtained therefrom.

Stammarna DSM 704, 740, 741 och 742 beskrives i tabell 2. De övri- ga stammarna är kända genom litteraturen och återfinns i "Cataloque of Strains 1974" för DSM.The strains DSM 704, 740, 741 and 742 are described in Table 2. The other strains are known from the literature and are found in "Cataloque of Strains 1974" for DSM.

För utvinning av sackaras-inhibitorer odlas de ovan anförda stam- marna i de ovan beskrivna näringslösningarna. Därvid skall beaktas att praktiskt taget varje stam för optimal produktion behöver en annan kvalitativt och kvantitativt annorlunda sammansatt närings- lösning.For the recovery of sucrose inhibitors, the strains listed above are grown in the nutrient solutions described above. In doing so, it must be taken into account that practically every strain for optimal production needs a different qualitatively and quantitatively differently composed nutrient solution.

Efter odling 1*10 dagar vid 15-80°C, företrädesvis 24-40°C, resp. för termofiler 50-70°C i skakkolvar eller i jäsningskärl av olika storlek, separeras cellerna från kulturlösningen, och alltefter uppträdandet av inhibitorerna anrikas den verksamma beståndsdelen från kulturlösningen och/eller från cellerna.After cultivation 1 * 10 days at 15-80 ° C, preferably 24-40 ° C, resp. for thermophiles 50-70 ° C in shake flasks or in fermentation vessels of different sizes, the cells are separated from the culture solution, and as the inhibitors appear, the active ingredient is enriched from the culture solution and / or from the cells.

Från kulturlösningen utvinnes inhibitorerna genom lyofilisering el- ler fällning med salter eller vattenlösliga organiska lösningsmedel (såsom lägre alkoholer och ketoner) eller genom adsorption av de verksamma substanserna på jonbytare. 461 101 Från cellerna utvinnes inhibitorerna genom extraktíon med orga- niska lösningsmedel, såsom t.ex. alkoholer, ketoner, etrar, est- rar och sulfoxider.The inhibitors are recovered from the culture solution by lyophilization or precipitation with salts or water-soluble organic solvents (such as lower alcohols and ketones) or by adsorption of the active substances on ion exchangers. The inhibitors are recovered from the cells by extraction with organic solvents, such as e.g. alcohols, ketones, ethers, esters and sulfoxides.

Härför centrifugeras jäsningsansatsen vid 3000-20000 vpm, före- trädesvis 6-10000 vpm under 10-60 minuter eller filtreras, företrä- desvis under tryck och med hjälp av filtreringshjälpmedel och se- pareras på detta sätt i kulturlösning och cellåterstod.For this purpose, the fermentation broth is centrifuged at 3000-20000 rpm, preferably 6-10000 rpm for 10-60 minutes or filtered, preferably under pressure and with the aid of filtration aids, and is thus separated into culture solution and cell residue.

Tabell 2 461 101 Stammarnaa egenskaper Stavar Längd [u Bredd P Gram~rcaktion Sporer cllipsqid/cylindrísk rund -- - terminal/aubtnrminal ccntral/plraccntral Svållda sporuøderceller Rörlighet Haxinnl tillväxttcmpcratur Tillväxt positiv vid °C Tillväxt negativ vid °C DSM 700 -s DSM TU1 2-S DSH 732 3-7 DSN 70Hf 2~k 0.6-0.8 0.6-o,e 0,7-o,s 0,6-0,8 Ö 6 04-014' #0 35 IQ 'O- OOOIO H0 NS Ib O OOOIO 35 50 å O IOOIO S5 60 Katalas Anacrob tillväxt Vogca-Proskaucr-reaktion pH 1 VP - Hediun Eigolb~roaktinn Tillväxt pfl 5,7 NACI $\ HQCI 7\ HaCl 10 Lyaozym (0,001\) I 1 nlo 6 OIIIO IIIIO IOOQO Syrabíldning från D~glukos L-arabinos D-xylol D-mannit ßasbildning från glukos Iedbrytning av Starkclsc Kasein Galatia Tyrosin Hippurat O 0064- II§OQ Q OQO-O IIOÖÅP Ö 0600 llO-Q-O 0 #049 IIOÖÖ 461 101 Iabell 2 (forts.) Stammarnas egenskaper p gsm Es? DSH Ds” vuo 1u1 1u2 voá Pektin , å * Användning av Cítrat _ _ _ 4 Propíonat _ _ _ _ Desamincring av Penylalanin - _ _. aecuxrion av N03' :111 xoz' + . . , Gasbildning från nítrat - - _ - Bildning av kristallina dextriner - _ _ Indol ' ' - _ dihydroxíaceton + + _ Stammarna DSM 740, DSM 741, DSM 742 och DSM 704 tillordnas på grund av sporbildning och aerob tillväxt gruppen Bacillus. De erhållna morfologiska och fysiologiska kännetecknen för stammarna DSM 740, DSM 741 och DSM 742 motsvarar de för Bacillus polymyxa. under det att stammen DSM 704 bör underordnas arten Bacillus subtilis.Table 2 461 101 Strains properties Rods Length [u Width P Gram ~ rcaction Spores clipsqid / cylindrical round - - terminal / aubtnrminal ccntral / plraccntral Swollen spore oder cells Mobility Haxinnl growth cmprature Growth positive at ° C TM1 Growth negative at ° C 2-S DSH 732 3-7 DSN 70Hf 2 ~ k 0.6-0.8 0.6-o, e 0,7-o, s 0,6-0,8 Ö 6 04-014 '# 0 35 IQ' O- OOOIO H0 NS Ib O OOOIO 35 50 å O IOOIO S5 60 Catalase Anacrob growth Vogca-Proskaucr reaction pH 1 VP - Hediun Eigolb ~ roaktinn Growth of 5.7 NACI $ \ HQCI 7 \ HaCl 10 Lyaozyme (0.001 \) I 1 nlo 6 OIIIO IIIIO IOOQO Acid Formation from D ~ glucose L-arabinose D-xylol D-mannitase formation from glucose Degradation of Starkclsc Casein Galatia Tyrosine Hippurate O 0064- II§OQ Q OQO-O IIOÖÅP Ö 0600 llO-QO 0 # 049 (continued) The properties of the strains on gsm Es? DSH Ds ”vuo 1u1 1u2 voá Pectin, å * Use of Citrate _ _ _ 4 Propionate _ _ _ _ Desamincring of Penylalanine - _ _. aecuxrion of NO3 ': 111 xoz' +. . , Nitrate gas formation - - _ - Formation of crystalline dextrins - _ _ Indole '' - _ dihydroxyacetone + + _ Strains DSM 740, DSM 741, DSM 742 and DSM 704 are assigned to the Bacillus group due to spore formation and aerobic growth. The morphological and physiological characteristics obtained for strains DSM 740, DSM 741 and DSM 742 correspond to those of Bacillus polymyxa. while the strain DSM 704 should be subordinate to the species Bacillus subtilis.

Identifíeringen skedde enligt R.E. Gordon, W.C. Haynes, C. Hor-Nay Pong: The Genus Bacillus, Washington 1973.The identification took place according to R.E. Gordon, W.C. Haynes, C. Hor-Nay Pong: The Genus Bacillus, Washington 1973.

Isoleringen av inhibitorn från respektive kulturlösning kan ske på olika sätt: a) Indunstning av kulturlösningen under sänkt tryck (10-50 torr) vid badtemperaturer på 20-100°C, företrädesvis 40-80°C till ca 1/S-1/50 av utgångsvolymen. Det indunstade extraktet filtreras eller centrifugeras, och det klara filtratet (den klara över- vätskan) lyofiliseras eventuellt efter föregående avsaltning. b) Utfällning av inhibitorerna från odlingslösningen (eller de en- ligt a) indunstade odlingslösningarna) genom tillsats av vat- tenlösliga, organiska lösningsmedel, såsom t.ex. alkoholer el- 9 461 101 ler ketoner, företrädesvis metanol, etanol, aceton, upp till en halt av 60-90%. Eftersom vid lägre koncentration av lös- i ningsmedel inaktiva biprodukter utfälles, lämpar sig detta fällningsförfarande speciellt väl för fraktionerad fällning för separation av icke önskade biprodukter. c) Utsaltning av inhibitorerna från extrakten (eller de enligt a) indunstade extrakten), t.ex. med ammoniumsulfat, koksalt osv.The isolation of the inhibitor from the respective culture solution can take place in different ways: a) Evaporation of the culture solution under reduced pressure (10-50 torr) at bath temperatures of 20-100 ° C, preferably 40-80 ° C to about 1 / S-1/50 of the output volume. The evaporated extract is filtered or centrifuged, and the clear filtrate (the clear supernatant) is optionally lyophilized after the previous desalting. b) Precipitation of the inhibitors from the culture solution (or those according to a) evaporated culture solutions) by adding water-soluble organic solvents, such as e.g. alcohols or ketones, preferably methanol, ethanol, acetone, up to a content of 60-90%. Since inert concentrations of solvent inactive by-products precipitate, this precipitation process is particularly well suited for fractional precipitation for the separation of undesired by-products. c) Salting out of the inhibitors from the extracts (or the extracts according to a) evaporated), e.g. with ammonium sulphate, common salt, etc.

Den utfällda fällningen uppsamlas genom centrifugering eller filtrering och tvättas antingen direkt med aceton och eter och torkas i vakuum eller dialyseras efter återupplösning i vatten och lyofiliseras. d) Adsorption av inhibitorerna på jonbytare.The precipitated precipitate is collected by centrifugation or filtration and washed either directly with acetone and ether and dried in vacuo or dialyzed after redissolution in water and lyophilized. d) Adsorption of the inhibitors on ion exchangers.

Detta förfarande lämpar sig för isolering av sådana inhibitorer, som på grund av sin kemiska natur bär laddningar. Desorptionen av inhibitorn sker genom ändring av jonstyrkan eller pH-värdet i elueringsmediet.This method is suitable for the isolation of such inhibitors which, due to their chemical nature, carry charges. The desorption of the inhibitor takes place by changing the ionic strength or pH of the elution medium.

Förutom inhibitorn återfinns i kulturlösningarna ofta oönskade bi- produkter. Separationen av dessa biprodukter kan ske på olika sätt, t.ex. genom värmedenaturering av biprodukterna för inhibitorer, som är värmestabila, eller genom dialys genom motsvarande membran vid lågmolekylära inhibitorer, varvid de oönskade biprodukterna kvarhål- les av membranet, eller genom fraktionerad utfällning (jämför b)) eller genom absorption av biprodukterna på jonbytare.In addition to the inhibitor, unwanted by-products are often found in the culture solutions. The separation of these by-products can take place in different ways, e.g. by heat denaturation of the by-products of inhibitors which are heat-stable, or by dialysis through corresponding membranes of low molecular weight inhibitors, the undesired by-products being retained by the membrane, or by fractional precipitation (compare b)) or by absorption of the by-products on ion exchangers.

Utvinning av inhibitorer från cellerna sker genom extraktion flera gånger av cellerna med organiska lösningsmedel, företrädesvis två extraktioner med 3-5 volymer aceton (beräknat på fuktig cellvolym) under 10-20 minuter och därefter en gång med eter under 5-10 minu- ter. Aceton- och eter-extrakten indunstas till torrhet i vakuum, upptages i vatten och lyofiliseras.Extraction of inhibitors from the cells takes place by extraction several times of the cells with organic solvents, preferably two extractions with 3-5 volumes of acetone (calculated on moist cell volume) for 10-20 minutes and then once with ether for 5-10 minutes. The acetone and ether extracts are evaporated to dryness in vacuo, taken up in water and lyophilized.

De nya substanserna löser sig väl i vatten. En grupp bland inhibito- rerna är värmestabil vid neutrala pH-värden, syrastabil (pH 2), al- kalistabil (pH 12) och dialyserbar. Dessa inhibitorer inaktiveras inte av trypsin och pepsin, de hämmar å andra sidan inte de nämnda enzymerna. De kan inte färgas med vanliga proteinfärgsubstanser. Av gelfiltreringen att döma ligger molekylvikten för dessa inhibitorer över 100 men under 2000. 10 461 101 De bästa inhibitorerna i denna grupp kännetecknas av en extremt hög hämmande aktivitet gentemot sackaras, vilken aktivitet över- träffar alla hittills kända sackazas-inhibitorer.The new substances dissolve well in water. One group among the inhibitors is heat stable at neutral pH values, acid stable (pH 2), alkali stable (pH 12) and dialyzable. These inhibitors are not inactivated by trypsin and pepsin, on the other hand they do not inhibit the mentioned enzymes. They cannot be stained with ordinary protein dyes. Judging by the gel filtration, the molecular weight of these inhibitors is above 100 but below 2000. The best inhibitors in this group are characterized by an extremely high inhibitory activity against sucrase, which activity exceeds all hitherto known sackazase inhibitors.

Vid jäsning av stammen DSM 7 i en näringslösning med sammansättning A (se exempel 4) utvinnes efter jäsning 4 dagar över 400 000 SIE/1, vid en odling av stammen i näringslösning S3 (se exempel 3) utvinnes efter jäsning 6 dagar över 300 000 SIE/1. Genom adsorption på starkt sura katjonbytare i -form och efterföljande desorption med vat- tenhaltig NH3-lösning samt indunstning och lyofilisering av descr- batet erhålles en råinhibitor med sa 40000 SIE/g. Extraktion av råinhibitorn med metanol, indunstning av extraktet till torrhet, återupplösning i vatten och kromatografi av vattenlösningen på svagt sura jonbytare på basis av dextran eller cellulosa, isynnerhet karb- oximetylceâlulosa, desorption med utspädda mineralsyror, företrä- -10 aktiva fraktionerna och lyofilisation av dessa fraktioner ger en desvis 10- N saltsyra, indunstning av de sackaras-inhiDit0riSkt anrikad râprodukt med ca 250 000 SIE/gu Kromatïišafi av den anrika- LD 20) i metanol, indunstning av de sackaras-inhibitoriskt aktiva fraktionerna och de råprodukten på modifierad dextran (Sephadex tillsats av koncentrerade mineralsyror, företrädesvis koncentrerad saltsyra till ett pH-värde av 1-3, ger en kristallin produkt med 540 000 SIE/g. Denna substans är kromatografiskt ren. Som summafor- mel erhölls C6H13O4N respektive C6H14O4NCl för hydrokloriden_ På grund av fysikaliska parametrar (IR-, NMR-, UV-spektra, smältpunkt, specifik vridningsvinkel) och kemiska egenskaper (perjodat-oxida- tion, elementaranalys) är den identisk med en av S. Inoye et al, (Tetrahedron gå, 2125 (1968)) beskriven förening med summaformeln C6H13O4N respektive C6H14O4NCl för hydrokloriden, som av förfat- tarna tillordnats strukturformeln R f] m! no 5 í H H ß s “l 11 461 101 som av författarna föreslagits namnet "1-desoxinojirimycin“.When fermenting the strain DSM 7 in a nutrient solution with composition A (see example 4) after fermentation 4 days over 400,000 SIE / 1 is recovered, during a cultivation of the strain in nutrient solution S3 (see example 3) after fermentation 6 days over 300,000 SIE / 1. By adsorption on strongly acidic cation exchangers in the form and subsequent desorption with aqueous NH3 solution as well as evaporation and lyophilization of the descrbate, a crude inhibitor of about 40,000 SIE / g is obtained. Extraction of the crude inhibitor with methanol, evaporation of the extract to dryness, redissolution in water and chromatography of the aqueous solution on weakly acidic ion exchangers based on dextran or cellulose, in particular carboxymethylcellulose, desorption with dilute mineral acids, preferential fractions of these and lyophilic fractions fractions give a 10 N hydrochloric acid, evaporation of the sucrose-inhibitory-enriched crude product with about 250,000 SIE / gu Chromatics of the enriched LD 20) in methanol, evaporation of the sucrose-inhibitively active fractions and the crude product on modified dextran ( Sephadex addition of concentrated mineral acids, preferably concentrated hydrochloric acid to a pH of 1-3, gives a crystalline product with 540,000 SIE / g. This substance is chromatographically pure, as a sum formula C6H13O4N and C6H14O4NCl were obtained for the hydrochloride. parameters (IR, NMR, UV spectra, melting point, specific angle of rotation) and chemical properties (per iodate oxidation, elemental analysis) is the identical with a compound described by S. Inoye et al, (Tetrahedron go, 2125 (1968)) with the sum formula C6H13O4N and C6H14O4NCl for the hydrochloride, respectively, which the authors have assigned to the structural formula R f] m ! no 5 í H H ß s "l 11 461 101 proposed by the authors the name" 1-deoxinojirimycin ".

Denna förening erhölls av författarna på kemisk väg genom hydre- ring av antibiotikumet nojirimycin. Utgângsprodukten nojirimycin erhålles enligt T. Niida et al. (J. Antibiotics, Ser. A. 20, 62 (1967)) genom jäsning av organismer från gruppen Streptomyces.This compound was obtained chemically by the authors by hydrating the antibiotic nojirimycin. The starting product nojirimycin is obtained according to T. Niida et al. (J. Antibiotics, Ser. A. 20, 62 (1967)) by fermentation of organisms from the group Streptomyces.

Genom föreliggande uppfinning blir det för första gången möjligt att framställa desoxinojirimycin med en arbetsordning genom direkt mikrobiologisk syntes med bra utbyten utan omväg över den relativt instabila och därigenom svårhanterbara nojirimycinen.The present invention makes it possible for the first time to produce deoxinojirimycin with a procedure by direct microbiological synthesis with good yields without detour over the relatively unstable and thereby difficult-to-handle nojirimycin.

Det är utomordentligt överraskande och kunde inte förutsägas att dessa föreningar produceras av organismer från gruppen Bacillus, ef- tersom dessa mikroorganismer i allmänhet är mindre lämpliga som producenter av sekundära substanser och på sin höjd huvudsakligen bildar peptidartade sekundärsubstanser.It is extremely surprising and could not be predicted that these compounds are produced by organisms from the Bacillus group, as these microorganisms are generally less suitable as producers of secondary substances and at most mainly form peptide-like secondary substances.

Dessutom bildas av enskilda stammar, t.ex. DSM 372, sackaras-inhi- bitorer, som i blandning förutom desoxinojirimycin och/eller nojiri- mycin innehåller ytterligare andra med tunnskiktskromatogram tyd- ligt separerbara sackaras-inhibitoriskt aktiva komponenter.In addition, it is formed by individual strains, e.g. DSM 372, sucrase inhibitors, which in admixture with deoxinojirimycin and / or nojirymycin contain other other sucrose-inhibitory active components which can be clearly separated by thin layer chromatograms.

Andra stammar, t.ex. DSM 741, bildar inhibitorer, som i tunnskikts- kromatogram inte uppvisar desoxinojirimycin eller nojirimycin, och som således har annan kemisk struktur.Other strains, e.g. DSM 741, forms inhibitors which, in thin layer chromatograms, do not show deoxinojirimycin or nojirimycin, and which thus have a different chemical structure.

Det är känt att hos djur och människor uppträder efter intag av kol- hydrathaltiga näringsmedel och drycker (t.ex. säd- och potatis- stärkelse, frukt, fruktsaft, öl, choklad) hyperglykemi, som orsakas av en snabb nedbrytning av kolhydraterna genom glykosidhydrolaser (t.ex. saliv- och pankreasamylaser, maltaser, sackaraser) enligt följande schema: Amylas Maltas Stärkelse resp. glykogen -------- -- Maltos -------- -- Glukos Sackaras sackaros --------- -- Glukos + Fruktos 12 461 101 Dessa hYPef91Ykemier är hos diabetiker speciellt starka och ihål- liät UtPfä9lade. Hos adipösa orsakar den på grund av födan upp- kamuahyperglykemin oftast en speciellt stark sekretion av insulin, som i sin tur leder till ökad fettuppbyggnad och sänkt fettnedbryt- ning. I anslutning till sådana hyperglykemier uppträder hos ämnes- omsättningsfriska och adipösa personer på grund av insulinsekretio- nen ofta en hypoglykemi. Det är känt att såväl hypoglykemier som även i magen kvarvarande kymus gynnar»magsaftproduktion, som i sin tur utlöser eller gynnar bildning av en Qastrit, en ulcus ventricu- li eller duodeni.It is known that in animals and humans, hyperglycaemia occurs after ingestion of carbohydrate-containing foods and beverages (eg cereal and potato starch, fruit, juice, beer, chocolate), which is caused by a rapid breakdown of carbohydrates by glycoside hydrolases (eg salivary and pancreatic amylases, maltases, sucrose) according to the following scheme: Amylase Malta Starch resp. glycogen -------- - Maltose -------- - Glucose Sucrose Sucrose --------- - Glucose + Fructose 12 461 101 These hYPef91Ychemicals are especially strong in diabetics and ihål- liät UtPfä9lade. In obese people, due to food, camouflage hyperglycaemia usually causes a particularly strong secretion of insulin, which in turn leads to increased fat build-up and reduced fat breakdown. In connection with such hyperglycaemia, hypoglycaemia often occurs in metabolically healthy and obese people due to insulin secretion. It is known that both hypoglycemias and chymus remaining in the stomach promote gastric juice production, which in turn triggers or promotes the formation of a Qastrit, a ventricular ulcer or duodenum.

Det är vidare känt att i munhâlan spaltas kolhydrater, isynnerhet sackaros genom mikroorganismer och därigenom gynnas kariesbildning.It is further known that carbohydrates, especially sucrose, are broken down in the oral cavity by microorganisms and thereby promote caries formation.

Sjuklig absorption av kolhydrater, t.ex. på grund av intestinalsac- karasbrist orsakar en diarré. Lämpliga doser av en glukosidasinhi- bitor orsakar en konstgjord sjuklig absorption och är därför lämp- lig för att motverka en obstipation.Diseased absorption of carbohydrates, e.g. due to intestinal saccharase deficiency causes a diarrhea. Appropriate doses of a glucosidase inhibitor cause artificial pathological absorption and are therefore suitable for counteracting constipation.

Inhibitorerna enligt uppfinningen är därför lämpliga som terapeutika för följande indikationer.The inhibitors of the invention are therefore suitable as therapeutics for the following indications.

Adipositas, hyperlipoproteinemi, ateroskleros, diabetes, prediabe- tes, gastrit, obstipation, karies.Obesity, hyperlipoproteinemia, atherosclerosis, diabetes, prediabetes, gastritis, constipation, caries.

För breddning av verkningsspektrat kan det vara lämpligt att kom- binera inhibitorer för glykosidhydrolaser, som ömsesidigt komplet- terar sina verkningar, vare sig det rör sig om kombinationer av in- hibitorerna enligt uppfinningen med varandra eller om kombinationer av inhibitorerna enligt uppfinningen med redan kända. Så kan det t.ex. vara lämpligt att kombinera sackaras-inhibitorerna enligt uppfinningen med redan kända amylas-inhibitorer.For broadening the spectrum of action, it may be appropriate to combine inhibitors of glycoside hydrolases which mutually complement their effects, whether they are combinations of the inhibitors of the invention with each other or combinations of the inhibitors of the invention with those already known. Then it can e.g. it may be appropriate to combine the sucrase inhibitors of the invention with already known amylase inhibitors.

Fördelaktiga är även i många fall kombinationer av inhïbitorer av inhibitorerna enligt uppfinningen med kända, orala antidiabetika 05-cytotropa sulfonylurinämnederivat och/eller blodsockerverksamma biguanider) samt med blodlipidsänkande verksamma substanser, såsom clofibrat, nikotinsyra, kolestyramin och andra. 13 461 101 Föreningarna kan administreras utan spädning, t.ex. som pulver el- ler i ett gelatinhölje eller i kombination med en bärare eller i farmaceutisk sammansättning- Farmaceutiska beredningar kan innehålla en större eller mindre mängd av inhibitorn, t.ex. 0,1-99,5% i kombination med en farmaceutiskt godtagbar icke toxisk, inert bärare, varvid bäraren kan innehålla en eller flera fasta, halvfasta eller flytande utspädningsmedel, fyllmedel och/eller icke toxiska, inerta och farmaceutiskt fördrag- bara formuleringshjälpmedel. Sådana farmaceutiska beredningar före- ligger företrädesvis i form av doseringsenheter, dvs fysikaliskt diskreta enheter, som innehåller en bestämd mängd av inhibitorn, som motsvarar en bråkdel eller flera gånger den dos, som erfordras för den önskade hämmande verkningen. Doseringsenheterna kan inne- hålla 1, 2, 3, 4 eller flera engângsdoser eller 1/2, 1/3 eller 1/4 av en engângsdos. En engângsdos innehåller företrädesvis en till- räcklig mängd verksam substans för att vid en administrering enligt ett förut bestämt doseringsschema för en eller flera doseringsenhe- ter uppnå den önskade hämmande verkningen, varvid en hel, en halv eller en tredjedel eller en fjärdedel av dagsdosen vanligen administ- reras 1, 2, 3 eller 4 gånger om dagen. Andra terapeutiska medel kan även intagas. Även om doseringen och doseringsschemat i varje fall måste avvägas noggrant med användning av grundlig fackmannemässig bedömning och under beaktande av patientens ålder, vikt och tillstånd, sjukdomens art och svårighet, ligger doseringen vanligen i ett inter- vall mellan ca 1-1 x 104 SIE/kg kroppsvikt per dag. I många fall uppnår man därvid en tillräcklig terapeutisk verkan med en lägre dos, under det att i andra fall en större dos erfordras.Also advantageous in many cases are combinations of inhibitors of the inhibitors according to the invention with known, oral antidiabetic 05-cytotropic sulfonylurea derivatives and / or blood sugar-acting biguanides) and with blood lipid-lowering active substances, such as clofibrate, nicotinic acid, cholestyramine and others. 13 461 101 The compounds can be administered without dilution, e.g. as a powder or in a gelatin casing or in combination with a carrier or in a pharmaceutical composition. Pharmaceutical preparations may contain a greater or lesser amount of the inhibitor, e.g. 0.1-99.5% in combination with a pharmaceutically acceptable non-toxic inert carrier, wherein the carrier may contain one or more solid, semi-solid or liquid diluents, fillers and / or non-toxic, inert and pharmaceutically acceptable formulation aids. Such pharmaceutical preparations are preferably in the form of dosage units, i.e., physically discrete units, containing a certain amount of the inhibitor corresponding to a fraction or several times the dose required for the desired inhibitory effect. Dosage units may contain 1, 2, 3, 4 or more single doses or 1/2, 1/3 or 1/4 of a single dose. A single dose preferably contains a sufficient amount of active substance to achieve the desired inhibitory effect when administered according to a predetermined dosage schedule for one or more dosage units, with a whole, a half or a third or a quarter of the daily dose usually administered 1, 2, 3 or 4 times a day. Other therapeutic agents may also be taken. Although the dosage and dosing schedule in each case must be carefully weighed using thorough professional judgment and taking into account the patient's age, weight and condition, the nature and severity of the disease, the dosage is usually in the range of about 1-1 x 104 SIE / kg body weight per day. In many cases a sufficient therapeutic effect is achieved with a lower dose, while in other cases a larger dose is required.

Oral administrering kan genomföras under användning av fasta och flytande doseringsenheter, såsom t.ex. pulver, tabletter, dragêer, kapslar, granulat, suspensioner, lösningar och liknande.Oral administration can be performed using solid and liquid dosage units, such as e.g. powders, tablets, dragees, capsules, granules, suspensions, solutions and the like.

Pulver framställes genom nedbrytning av substansen i en lämplig storlek och blandning med en även nedbruten farmaceutisk bärare. Även om ett ätbart kolhydrat, såsom t.ex. stärkelse, laktos, sacka- ros eller glukos vanligen kan användas för detta ändamål. och även användas här, är det önskvärt att använda ett icke metaboliserbart kolhydrat, såsom t.ex. ett cellulosaderivat. 461 101 '4 Sötningsmedel, smaktillsatser, konserveringsmedel, dispergermedel och färgmedel kan även användas.Powders are prepared by decomposing the substance into a suitable size and mixing with an even degraded pharmaceutical carrier. Although an edible carbohydrate, such as e.g. starch, lactose, sucrose or glucose can usually be used for this purpose. and also used here, it is desirable to use a non-metabolizable carbohydrate, such as e.g. a cellulose derivative. 461 101 '4 Sweeteners, condiments, preservatives, dispersants and colorants may also be used.

Kapslarna kan framställas genom beredning av den ovan beskrivna pul- verblandningen och genom fyllning av redan framställda gelatinhöl- jen. Pulverblandningen kan före fyllningen försättas“med glidmedel, såsom t.ex. kiselgel, talk, magnesiumstearat, kalciumstearat eller fast polyetylenglykol. Blandningen kan även försättas med en desin- tegrator eller ett lösningsförmedlande medel såsom t.ex. agar-agar, kalciumkarbonat eller natriumkarbonat, för att förbättra tillgäng- ligheten av inhibitorn vid intag av kapseln.The capsules can be prepared by preparing the powder mixture described above and by filling the gelatin casings already prepared. The powder mixture can be pre-filled with lubricant, such as e.g. silica gel, talc, magnesium stearate, calcium stearate or solid polyethylene glycol. The mixture can also be added with a disintegrator or a solvent such as e.g. agar-agar, calcium carbonate or sodium carbonate, to improve the availability of the inhibitor when taking the capsule.

Framställningen av tabletter sker t.ex. genom framställning av en pulverblandning, grov eller finkornig, och tillsättning av ett glid- medel och dess integrator. Från denna blandning formas tabletter.The production of tablets takes place e.g. by preparing a powder mixture, coarse or fine-grained, and adding a lubricant and its integrator. From this mixture tablets are formed.

En pulverblandning beredes genom blandning av substansen, som på lämp- ligt sätt sönderdelas och kompletteras med ett utdrygningsmedel el- ler en annan bärarsubstans, såsom beskrivits ovan. Eventuellt till- sättes ett bindemedel, t.ex. karboximetylcellulosa, alginat, gele- tin eller polyvinylpyrrolidon, ett lösningsfördröjande medel, såsom t.ex. paraffin, ett resorptionspâskyndande medel, t.ex. ett kvartärt salt och/eller ett absorptionsmedel, såsom t.ex. bentonit, kaolin eller dikalciumfosfat. Pulverblandningen kan granuleras tillsammans med ett bindemedel, såsom t.ex. sirap, stärkelsepasta, akacieslem eller lösningar av cellulusa- eller polymermaterial. Därefter pres- sas produkten genom en stor sikt. Alternativt kan pulverblandningen passeras igenom en tabletteringsmaskin, och de erhållna oregelbundet formade styckena sönderdelas till kornstorlek. För att de erhållna kornen inte skall fastna i de tablettbildande munstyckena kan de försättas med ett glidmedel, såsom t.ex. stearinsyra, stearatsalt, talk eller mineralolja. Denna blandning, som gjorts glidbar, pressas till tablettform. De verksamma substanserna kan även förenas med friflytande, inerta bärare och direkt överföras till tablettform under utelämning av granulat- eller sönderdelningssteget. Produkten kan förses med ett klart eller opakt skyddshölje, t.ex. ett överdrag av schellack, ett överdrag av socker eller polymersubstanser och ett polerat hölje av vax. Färgsubstanser kan tillsättas dessa över- drag, så att man kan skilja mellan de olika doseringsenheterna. 15 461 101 De beredningsformer, som skall administreras oralt, såsom t.ex. lösningar, siraper och elixir, kan framställas i doseringsenheter så att en bestämd mängd preparat innehåller en bestämd mängd verk- sam substans. Sirap kan framställas genom att den verksamma substan- sen löses i en vattenlösning, som innehåller lämpliga smaksubstan- ser. Elixir erhålles genom användning av icke toxiska, alkoholiska bärare. Suspensioner kan framställas genom dispergering av förening- en i ett icke toxiskt bärarmaterial. Lösningsfiörmedlare och emulger- medel, såsom t.ex. etoxilerade isostearylalkoholer och polyoxiety- lensorbitestrar, konserveringsmedel, smakförbättrande tillsatser såsom t.ex. pepparmintsolja eller sackarin och liknande, kan även tillsättas.A powder mixture is prepared by mixing the substance, which is suitably decomposed and supplemented with an excipient or other carrier substance, as described above. If necessary, a binder is added, e.g. carboxymethylcellulose, alginate, gelatin or polyvinylpyrrolidone, a solution retardant, such as e.g. paraffin, a resorption accelerator, e.g. a quaternary salt and / or an absorbent, such as e.g. bentonite, kaolin or dicalcium phosphate. The powder mixture can be granulated together with a binder, such as e.g. syrups, starch paste, acacia slime or solutions of cellulose or polymeric material. The product is then pressed through a large sieve. Alternatively, the powder mixture can be passed through a tableting machine, and the resulting irregularly shaped pieces are broken down into grain size. In order for the obtained grains not to get stuck in the tablet-forming nozzles, they can be added with a lubricant, such as e.g. stearic acid, stearate salt, talc or mineral oil. This mixture, which has been made slidable, is compressed into a tablet form. The active substances can also be combined with free-flowing, inert carriers and transferred directly into tablet form, omitting the granulation or decomposition step. The product can be provided with a clear or opaque protective cover, e.g. a coating of shellac, a coating of sugar or polymeric substances and a polished wax coating. Dyes can be added to these coatings so that a distinction can be made between the different dosage units. The dosage forms to be administered orally, such as e.g. solutions, syrups and elixirs, can be prepared in dosage units so that a certain amount of preparation contains a certain amount of active substance. Syrup can be prepared by dissolving the active substance in an aqueous solution, which contains suitable flavoring substances. Elixir is obtained by the use of non-toxic alcoholic carriers. Suspensions may be prepared by dispersing the compound in a non-toxic carrier material. Solvents and emulsifiers, such as e.g. ethoxylated isostearyl alcohols and polyoxyethylene sorbiters, preservatives, flavor enhancers such as e.g. peppermint oil or saccharin and the like, can also be added.

Doseringsföreskrifterna kan anges på kapseln. Dessutom kan doserin- gen säkerställas så att den verksamma substansen avges fördröjt, t.ex. genom att den verksamma substansen införes i polymersubstanser, vaxer eller liknande.The dosing instructions can be stated on the capsule. In addition, the dosage can be ensured so that the active substance is released delayed, e.g. by introducing the active substance into polymeric substances, waxes or the like.

Förutom de ovan nämnda farmaceutiska sammansättningarna kan t.ex. även livsmedel framställas, som innehåller dessa verksamma substan- ser, t.ex. socker, bröd, potatisprodukter, fruktsaft. öl, choklad och andra konfektartiklar och konserver, såsom t.ex. marmalader, varvid dessa produkter försatts med en terapeutisk verksam mängd av åtminstone en av inhibitorerna enligt uppfinningen.In addition to the above-mentioned pharmaceutical compositions, e.g. foods are also prepared which contain these active substances, e.g. sugar, bread, potato products, fruit juices. beer, chocolate and other confectionery and preserves, such as e.g. marmalades, these products being provided with a therapeutically effective amount of at least one of the inhibitors of the invention.

De inhibitorer som framställes enligt uppfinningen har dessutom den egenskapen att de hos djur i hög grad påverkar förhållandet mellan andelen av icke önskvärt fett och andelen önskvärt fettfattigt kött (magert kött) till fördel för magert kött. Detta är av speciell be- tydelse för uppfödning och hållning av nyttodjur inom jordbruket, t.ex. inom svinuppfödningen men även av stor betydelse för uppföd- ning och hållning av övriga nyttodjur och sällskapsdjur. Användnin- gen av inhibitorerna kan vidare leda till en avsevärd rationalise- ring av utfodringen av djuren både vad beträffar tiden, mängden och kvaliteten. Eftersom de åstadkommer en viss fördröjning av matsmält- ningen förlänges uppehâllstiden för näringsämnena i matsmältnings- trakten, varvid en ad libitum-utfodring möjliggöres till lägre kost- nad. Vidare erhålles vid användning av inhibitorerna enligt uppfin- ningen i mânga fall en avsevärd insparing av värdefullt protein- foder. 461 101 16 De verksamma substanserna kan således användas inom praktiskt ta- get alla områden inom djurnäringen såsom medel för att minska fett- uppbyggnaden samt för insparing av foderäggvita.The inhibitors prepared according to the invention also have the property that in animals they greatly affect the ratio between the proportion of undesirable fat and the proportion of desirable low-fat meat (lean meat) in favor of lean meat. This is of special importance for the breeding and keeping of useful animals in agriculture, e.g. in pig breeding but also of great importance for the breeding and keeping of other useful animals and pets. The use of the inhibitors can further lead to a considerable rationalization of the feeding of the animals both in terms of time, quantity and quality. Since they cause a certain delay in digestion, the residence time of the nutrients in the digestive tract is extended, whereby an ad libitum feeding is made possible at a lower cost. Furthermore, when using the inhibitors according to the invention, in many cases a considerable saving of valuable protein feed is obtained. 461 101 16 The active substances can thus be used in practically all areas in the animal industry as a means of reducing fat build-up and for saving feed egg whites.

Verkan hos de verksamma substanserna beror härvid i stor utsträck- ning pâ djurens art och kön. De verksamma substanserna är speciellt värdefulla för djurarter, som över huvud taget eller under vissa levnadsintervall har en stark tendens till fettanlagring.The effect of the active substances here depends to a large extent on the species and sex of the animals. The active substances are especially valuable for animal species, which at all or during certain life intervals have a strong tendency to fat storage.

Såsom djur, för vilka inhibitorerna kan användas för reducering av fettanlagring och/eller insparing av foderäggvita nämnes t.ex. föl- jande nytto- och sällskapsdjur: varmblodiga djur såsom nötdjur, svin, hästar, fâr, getter, kattor, hundar, kaniner, pälsdjur, t.ex. nertz, chincilla, andra sällskapsdjur, t.ex. marsvin och hamster, arbets- och zoodjur, t.ex. råttor, möss, apor m.fl., fåglar, t.ex. broiler, höns, gäss, änder, kalkontuppar, duvor, papegojor och kanariefâg- lar och kallblodiga djur såsom fiskar, t.ex. karpar och reptiler, t.ex. ormar.Examples of animals for which the inhibitors can be used to reduce fat storage and / or save egg feed whites are mentioned e.g. the following livestock and pets: warm-blooded animals such as cattle, pigs, horses, sheep, goats, cats, dogs, rabbits, fur animals, e.g. nertz, chincilla, other pets, e.g. guinea pigs and hamsters, working and zoo animals, e.g. rats, mice, monkeys, etc., birds, e.g. broilers, chickens, geese, ducks, turkey roosters, pigeons, parrots and canaries and cold-blooded animals such as fish, e.g. carp and reptiles, e.g. snakes.

Den mängd verksam substans, som administreras till djuren för att uppnå den önskade effekten, kan på grund av gynnsamma egenskaper hos den verksamma substansen varieras omfattande. Den ligger företrädes- vis mellan ca 0,5 mg - 2,5 g, isynnerhet 10-100 mg/kg foder. Tiden för administreringen kan uppgå till några timmar eller dagar upp till flera âr. Den passande mängden verksam substans samt den passande tidslängden för administreringen sammanhänger nära med utfordrings- målet. Den beror isynnerhet av djurets art, ålder, kön, hälsotill- stånd och sättet för djurskötseln och är lätt att fastställa för varje fackman.The amount of active substance administered to the animals to achieve the desired effect can be extensively varied due to the beneficial properties of the active substance. It is preferably between about 0.5 mg - 2.5 g, in particular 10-100 mg / kg of feed. The administration time can be a few hours or days up to several years. The appropriate amount of active substance and the appropriate duration of administration are closely related to the challenge goal. It depends in particular on the animal's species, age, sex, state of health and the way of caring for the animals and is easy to determine for each professional.

De verksamma substanserna administreras till djuren med de vanliga metoderna. Administreringssättet beror isynnerhet på djurets art, beteende och allmäntillstând. Så kan administreríngen ske oralt en eller flera gånger om dagen med regelbundna eller oregelbundna tidsintervall. Av lämplighetsskäl användes i de fhæïa fall en oral administrering, isynnerhet i rytmen för djurens närings- och/eller dryckíntag. .The active substances are administered to the animals by the usual methods. The mode of administration depends in particular on the species, behavior and general condition of the animal. Thus, the administration can take place orally once or several times a day at regular or irregular time intervals. For reasons of convenience, an oral administration is used in these cases, especially in the rhythm of the animals' nutritional and / or beverage intake. .

De verksamma substanserna kan administreras som rena substanser el- 17 461 101 ler i formulerad form, varvid med formulerad form förstås såväl i form av förblandning, dvs i blandning med icke toxiska, inerta bä- rare av 90dtYCkli9t slag, som även såsom en del av en totalranson i form av ett tilläggsfoder respektive som blandningsbeståndsdel i ett enda blandfoder. Härvid inneslutes även administrering av lämp- liga beredningar via dricksvattnet.The active substances can be administered as pure substances or in formulated form, by formulated form is meant both in the form of premix, i.e. in mixture with non-toxic, inert carriers of 90dtYCkli9t kind, and also as part of a total ration in the form of an additional feed or as a mixing component in a single mixed feed. This also includes the administration of suitable preparations via the drinking water.

De verksamma substanserna kan eventuellt administreras i formulerad form även tillsammans med andra närings- och verksamma substanser, t.ex. min/eralsalter, spårelement, vitaminer, äggviteämnen, energi- bärare (t.ex. stärkelse, socker, fetter), färgsubstanser Qchgeller smaksubstanser eller andra fodertillsatssubstanser, t.ex. tillväxt- befrämjande medel i lämplig form. De verksamma substanserna kan ges till djuren under eller efter näringsupptaget.The active substances may optionally be administered in formulated form also together with other nutritional and active substances, e.g. min / eral salts, trace elements, vitamins, egg whites, energy carriers (eg starch, sugar, fats), dyes Qchgeller flavors or other feed additives, e.g. growth promoters in suitable form. The active substances can be given to the animals during or after nutrient uptake.

Det är lämpligt att utföra den orala administreringen tillsammans med fodret och/eller dricksvattnet, varvid alltefter behov de verksamma substanserna sättes till den totala mängden eller endast en del av fodret och/eller dricksvattnet.It is convenient to carry out the oral administration together with the feed and / or the drinking water, the active substances being added to the total amount or only a part of the feed and / or the drinking water as required.

De verksamma substanserna kan sättas till fodret och/eller dricks- vattnet genom enkel blandning som rena substanser, företrädesvis i finfördelad form eller i formulerad form i blandning med ätbara, icke toxiska bärare, eventuellt även i form av en förblandning eller ett foderkoncentrat.The active substances can be added to the feed and / or drinking water by simple mixing as pure substances, preferably in finely divided form or in formulated form in mixture with edible, non-toxic carriers, optionally also in the form of a premix or a feed concentrate.

Fodret och/eller dricksvattnet kan t.ex. innehålla de verksamma sub- stanserna enligt uppfinningen i en koncentration av ca 0,001-5,0, isynnerhet 0,02-2,0 vikt-%. Den optimala koncentrationen av den verksamma substansen i fodret och/eller dricksvattnet är isynnerhet beroende på mängden av djuret upptaget foder och/eller dricksvatten och kan lätt fastställas av varje fackman.The feed and / or drinking water can e.g. contain the active substances according to the invention in a concentration of about 0.001-5.0, in particular 0.02-2.0% by weight. The optimum concentration of the active substance in the feed and / or drinking water depends in particular on the amount of feed and / or drinking water taken up by the animal and can be easily determined by any person skilled in the art.

Fodrets slag och dess sammansättning är härvid utan betydelse. Man kan använda alla vanliga, i handeln förekommande eller speciella fodersammansättningar, som företrädesvis innehåller den vanliga för en allsidig näring nödvändiga jämvikten av energi- och äggvitesub- stanser inneslutande vitaminer och mineralämnen. Fodret kan t.ex. 461 101 18 sammansättas av växtsubstanser, t.ex. oljekaksavfall, sädavfall, sädbiprodukter men även av hö, ensilage, rovor och andra foderväx- ter, av djursubstanser, t.ex. kött- och fiskprodukter, benmjöl, fet- ter, vitaminer, t.ex. A-.D-, E-, K- och B-komplex samt speciella. _ proteinkällor, t.ex. jäster, samt vissa aminosyror och mineralämnen och spârelement, såsom t.ex. fosfor och järn, zink, mangan, koppar, kobolt, jod osv.The type of feed and its composition are irrelevant in this respect. You can use all common, commercially available or special feed compositions, which preferably contain the usual balance of energy and egg white substances, including vitamins and minerals, necessary for a balanced diet. The feed can e.g. 461 101 18 composed of plant substances, e.g. oilcake waste, cereal waste, cereal by-products but also of hay, silage, turnips and other fodder plants, of animal substances, e.g. meat and fish products, bone meal, fats, vitamins, e.g. A-.D-, E-, K- and B-complexes and special. _ protein sources, e.g. yeasts, as well as certain amino acids and minerals and trace elements, such as e.g. phosphorus and iron, zinc, manganese, copper, cobalt, iodine, etc.

Förblandningar kan företrädesvis innehålla ca 0,1-50, isynnerhet 0,5- 5,0 vikt-% av den verksamma substansen med formeln I förutom god- tyckliga ätbara bärare och/eller mineralsalter, t.ex. kolsyrat fo- derkalk och framställes med de vanliga blandningsmetoderna.Premixtures may preferably contain about 0.1-50, in particular 0.5-5.0% by weight of the active substance of the formula I in addition to any edible carriers and / or mineral salts, e.g. carbonated lime and is prepared by the usual mixing methods.

Blandfoder innehåller företrädesvis 0,001-5,0, isynnerhet 0,02-2,0 vikt-% av de verksamma substanserna med formeln I förutom de vanliga râsubstanskomponenterna i ett blandfoder, t.ex. sädavfall eller -bi- produkter, oljekaksavfall, djuräggvita, mineraler, spårelement och vitaminer. De kan framställas med de vanliga blandningsmetoderna.Mixed feed preferably contains 0.001-5.0, in particular 0.02-2.0% by weight of the active substances of formula I in addition to the usual raw material components in a mixed feed, e.g. seed waste or by-products, oilcake waste, animal egg whites, minerals, trace elements and vitamins. They can be prepared by the usual mixing methods.

Företrädesvis i förblandningar och blandfodermedel kan de verksamma substanserna eventuellt även skyddas mot luft, ljus och/eller fuktig- het genom att deras yta täcks med ett lämpligt medel, t.ex. med icke toxiska vaxer eller gelatin.Preferably in premixes and compound feedingstuffs, the active substances can optionally also be protected against air, light and / or moisture by covering their surface with a suitable agent, e.g. with non-toxic waxes or gelatin.

Exempel på samansättningen av ett färdigt blandfoder för fåglar, som innehåller en verksam substans enligt uppfinningen: 200 g vete, 340 g majs, 360,3 g sojaavfall, 60 g nöttalg, 15 g di- kalciumfosfat, 10 g kalciumkarbonat, 4 g joderat koksalt, 4,5 g vi- tamin-mineral-blandning och 3,2 g förblandning av verksam substans ger efter noggrann blandning 1 kg foder.Examples of the composition of a finished compound feed for birds, which contains an active substance according to the invention: 200 g wheat, 340 g maize, 360.3 g soy waste, 60 g nut algae, 15 g dicalcium phosphate, 10 g calcium carbonate, 4 g iodinated common salt , 4.5 g of vitamin-mineral mixture and 3.2 g of premix of active substance give, after thorough mixing, 1 kg of feed.

Vitamin-mineral-blandningen består av: 6000 I.E. vitamin A, 1000 I.E. vitamin D3, 10 mg vitamin E, 1 mg vitamin K3, 3 mg riboflavin, 2 mg pyridoxin, 20 mg vitamin B12, 5 mg kalciumpantotenat, 30 mg nikotinsyra, 200 mg kolinklorid och 200 mg MnSO4 x H20, 140 mg ZnSO4 x 7H2O, 100 mg FeSO4 x 7 H20 och 1 20 mg CuSO4 x SHZO. Förblandningen med verksam subatans innehåller “g 461 101 t.ex. 1-desoxinojirimycin i den önskade mängden, t.ex. 1600 mg och dessutom 1 g DL-metionin samt så mycket sojabönmjöl, att 3,2 g för- blandning erhålles.The vitamin-mineral mixture consists of: 6000 I.E. vitamin A, 1000 I.E. vitamin D3, 10 mg vitamin E, 1 mg vitamin K3, 3 mg riboflavin, 2 mg pyridoxine, 20 mg vitamin B12, 5 mg calcium pantothenate, 30 mg nicotinic acid, 200 mg choline chloride and 200 mg MnSO4 x H20, 140 mg ZnSO4 x 7H2O, 100 mg FeSO 4 x 7 H 2 O and 1 20 mg CuSO 4 x SH 2 O. The premix with active subatance contains “g 461 101 e.g. 1-deoxinojirimycin in the desired amount, e.g. 1600 mg and in addition 1 g of DL-methionine and so much soybean flour that 3.2 g of premix are obtained.

Exempel på sammansättning av ett svinblandfoder, som innehåller en verksam substans med formeln I: 630 g fodersädavfall (sammansatt av 200 g majs-, 150 g korn-, 150 g havre- och 130 g veteavfall), 80 g fiskmjöl, 60 g sojaavfall, 58,8 g tapiokamjöl, 38 g öljäst, 50 g vitamin-mineral-blandning för svin (sammansättning t.ex. som för kycklingfoder), 30 g linfrökakor, 30 g majsglutenmjöl, 30 g sojamjöl, 10 g sockerrörmelass och 2 g för- blandning av verksam substans (sammansättning t.ex. som för kyckling- foder) ger efter noggrann blandning 1 kg foder.Examples of the composition of a pigmeal feed containing an active substance of the formula I: 630 g of feed waste (composed of 200 g of maize, 150 g of barley, 150 g of oat and 130 g of wheat waste), 80 g of fishmeal, 60 g of soy waste 58.8 g tapioca flour, 38 g brewer's yeast, 50 g vitamin-mineral mixture for pigs (composition eg as for chicken feed), 30 g flaxseed cakes, 30 g corn gluten flour, 30 g soy flour, 10 g sugar cane molasses and 2 g pre- mixture of active substance (composition eg as for chicken feed) gives after thorough mixing 1 kg of feed.

De angivna foderblandningarna är företrädesvis anpassade för uppföd- ning och gödning av kycklingar och svin, men de kan emellertid an- vändas för uppfödning och gödning av andra djur med samma eller lik- nande sammansättning.The specified feed mixtures are preferably adapted for rearing and fattening chickens and pigs, but they can nevertheless be used for rearing and fattening other animals with the same or similar composition.

Såsom redan nämnts kan inhibitorerna användas var för sig eller även i godtyckliga blandningar med varandra, varvid såväl de rena verk- samma substanserna som även de vid framställningen erhållna råa verksamma substanserna satsas eventuellt efter en grovrening.As already mentioned, the inhibitors can be used individually or even in arbitrary mixtures with each other, whereby both the pure active substances and also the crude active substances obtained in the preparation are optionally charged after a coarse purification.

Exemgel 1 Om man ympar en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en näringslösning med sammansättningen 2,0% majsstärkelse 1,0% glukos 0,5% kaseinhydrolysat 1,0% jästextrakt pH justeras med Na2CO3 till 7,2 + O,4% CaCO3 sterilisation 30 minuter vid 121°C. med en sporsuspension av stammen DSM 704 och odlar kolven vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslësningen efter 5 dagar en ak- tivitet av 70 SIE/ml. 20 461 101 Exemgel 2 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen 7,5% maltextrakt 0,3% kaseinhydrolysat 0,7% jästextrakt 0,31% 'caco3 ' 0,3% KZHPO4 ledningsvatten, sterilisafion 30 minuter vid 121°C pH justeras efter sterilisationen till 6,6-6,8 med K2CO3 ympas med en sporsuspension av stammen DSM 704 och kolven odlas vid 28°C På en rundskakmaskin, så har odlíngslösningen efter 5 dagar en aktivitet av 197 SIE/ml.Example 1 If inoculating a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution with the composition 2.0% corn starch 1.0% glucose 0.5% casein hydrolyzate 1.0% yeast extract pH is adjusted with Na2CO3 to 7.2 + 0, 4% CaCO3 sterilization 30 minutes at 121 ° C. with a spore suspension of the strain DSM 704 and grows the flask at 28 ° C on a round shaker, the culture loading after 5 days has an activity of 70 SIE / ml. 20 461 101 Exemgel 2 About a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution with the composition 7.5% malt extract 0.3% casein hydrolyzate 0.7% yeast extract 0.31% 'caco3' 0.3% KZHPO4 tap water , sterilize for 30 minutes at 121 ° C The pH is adjusted after sterilization to 6.6-6.8 with K2CO3 inoculated with a spore suspension of strain DSM 704 and the flask is grown at 28 ° C. On a round shaker, after 5 days the culture solution has an activity of 197 SIE / ml.

Exemgel 3 - Näringslösning S3 Om en 140 liters jästank, som innehåller 100 liter näringslösning med sammansättningen 7,5% maltextrakt 0,3% kaseinhydrolysat 0,7% jästextrakt 0,3% CaCO3 0,3% KZHPO4 ledningsvatten, sterilisation 30 minuter vid 121°C pH justeras efter sterilisationen till 6,6-6,8 med KZCO3 ympas med 1,2 l förkultur, utvunnen genom odling av 10 1-liters Er- lenmeyerskakkolvar med vardera 120 ml näringslösning med samma sam- mansättning, ympade med stammen DSM 704, och om man odlar under om- röring och luftning 5 dagar vid 28°C så erhålles en odlingslösning, som innehåller 260 SIE/ml.Example gel 3 - Nutrient solution S3 If a 140 liter yeast tank, containing 100 liters of nutrient solution with the composition 7.5% malt extract 0.3% casein hydrolyzate 0.7% yeast extract 0.3% CaCO3 0.3% KZHPO4 tap water, sterilization 30 minutes at 121 ° C The pH is adjusted after sterilization to 6.6-6.8 with KZCO3 inoculated with 1.2 l of preculture, obtained by culturing 10 1-liter Erlenmeyer shake flasks with 120 ml each of nutrient solution of the same composition, inoculated with the DSM strain 704, and if grown under stirring and aeration for 5 days at 28 ° C, a culture solution containing 260 SIE / ml is obtained.

Exemgel 4 - Näringslösning A Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen 3,0% sojamjöl 3,0% glycerin 0,2% CaCO3 ledningsvatten sterilisation 30 minuter vid 121°C ympas med en sporsuspension av stammen DSM 7 och kolven odlas vid 21 O . 28 C pa en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 4 dagar en aktivitet av 437 SIE/ml.Example 4 - Nutrient solution A If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution with the composition 3.0% soybean meal 3.0% glycerin 0.2% CaCO3 tap water sterilization for 30 minutes at 121 ° C is inoculated with a spore suspension of strain DSM 7 and the flask is grown at 21 ° C. 28 C on a round shaker, the culture solution after 4 days has an activity of 437 SIE / ml.

Exemgel 5 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 1, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 7, och kolven odlas vid 28oC på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 5 dagar en aktivitet av 162 SIE/ml.Example 5 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 1 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 7 and the flask is grown at 28 ° C on a shaker, then the culture solution has an activity of 162 SIE / ml.

Exemgel 6 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen 1,0% glukos 1,0% stärkelselösning 0,5% kaseinhydrolysat 0,75% köttextrakt 0,75% peptoner 0,5% jästextrakt 0,1% KZHPO 4 0,3% NaCl 0,1% MgS04 . 7H2O ledningsvatten pH justeras med Na2C03 till 7,2 sterilisation 30 minuter vid 121°C ympas med en sporsuspension av stammen DSM 7, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 5 dagar en aktivitet av 36,4 SIE/ml.Example gel 6 About a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution with the composition 1.0% glucose 1.0% starch solution 0.5% casein hydrolyzate 0.75% meat extract 0.75% peptones 0.5% yeast extract 0 .1% KZHPO 4 0.3% NaCl 0.1% MgSO 4. 7H2O tap water pH is adjusted with Na2CO3 to 7.2 sterilization 30 minutes at 121 ° C inoculated with a spore suspension of strain DSM 7, and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 5 days has an activity of 36.4 SIE / ml.

Exemgel 2 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 200 ml av en närings- lösning enligt exempel 3, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 7, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 6 dagar en aktivitet av 224 SIE/ml.Example 2 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 200 ml of a nutrient solution according to Example 3 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 7 and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution after 6 days has a activity of 224 SIE / ml.

Exemgel 8 Om en 140 liters jästank, som innehåller 100 liter av näringslös- ningen enligt exempel 4, ympas med 1,2 liter förkultur, utvunnen genom odling av 10 1-liters Erlenmeyerskakkolvar med vardera 120 ml 461 101 22 näringslösning med samma sammansättning, ympade med en stam DSM 7, och om man odlar under omröring och luftning 5 dagar vid 28°C, så erhålles en kultürlösfling, som innehåller 286 SIE/ml.Example 8 If a 140 liter yeast tank containing 100 liters of the nutrient solution of Example 4 is inoculated with 1.2 liters of preculture, obtained by culturing 10 1-liter Erlenmeyer shake flasks each containing 120 ml of nutrient solution of the same composition, inoculated with a strain DSM 7, and if grown under stirring and aeration for 5 days at 28 ° C, a culture solution containing 286 SIE / ml is obtained.

Exempel 9 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 2, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 1, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 6 dagar en aktivitet av 28,4 SIE/ml.Example 9 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 2 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 1, and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 6 days has a activity of 28.4 SIE / ml.

Exempel 10 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 1, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 365, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 4 dagar en aktivitet av 15,6 SIE/ml.Example 10 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 1 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 365, and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 4 days has a activity of 15.6 SIE / ml.

Exempel 11 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 2, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 365, och om kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 4 dagar en aktivitet av 25,8 SIE/ml.Example 11 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 2 is inoculated with a spore suspension of the DSM 365 strain, and if the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution has an activity after 4 days of 25.8 SIE / ml.

Exempel 12 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 4, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 741, och om kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 5 dagar en aktivitet av 3,2 SIE/ml. gxempel 13 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen enligt exempel 1, ympas med en spor- suspension av stammen DSM 741, och om kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 5 dagar en aktivitet av 26,4 SIE/ml.Example 12 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 4 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 741, and if the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution has an activity after 5 days. of 3.2 SIE / ml. Example 13 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution of the composition of Example 1 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 741, and if the flask is grown at 28 ° C on a shaker, the culture solution after 5 days an activity of 26.4 SIE / ml.

Exempel 14 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen enligt exempel 2, ympas med en spor- 23 461 101 suspension av stammen DSM 741, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 3 dagar en aktivitet på 24,0 SIE/ml.Example 14 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution of the composition of Example 2 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 741 and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution after 3 days an activity of 24.0 SIE / ml.

Exemgel 15 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen 2,0% majsstärkelse 0,5% glukos 0,3% kaseinhydrolysat pH justerat med Na2C03 till 7,2 + O,4% CaC03 sterilisation 30 minuter vid 121°C ympas med en sporsuspension av stammen DSM 741, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 2 dagar en aktivitet av 81,7 SIE/ml och efter 3 dagar en aktivitet av 121 SIE/ml.Example 15 About a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution with the composition 2.0% corn starch 0.5% glucose 0.3% casein hydrolyzate pH adjusted with Na 2 CO 3 to 7.2 + 0.4% CaCO 3 sterilization minutes at 121 ° C are inoculated with a spore suspension of the strain DSM 741, and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 2 days has an activity of 81.7 SIE / ml and after 3 days an activity of 121 SIE / ml.

Exemgel 16 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 4, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 675, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 5 dagar en aktivitet av 8,6 SIE/ml.Example 16 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 4 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 675 and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 5 days has a activity of 8.6 SIE / ml.

Exemgel 17 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösüng enligt exempel 1, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 675, och om kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 5 dagar en aktivitet av 53,0 SIE/ml.Example 17 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 1 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 675, and if the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution has an activity after 5 days. of 53.0 SIE / ml.

Exemgel 18 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 2, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 675, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 4 dagar en aktivitet av 17,8 SIE/ml.Example 18 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 2 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 675 and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution has a activity of 17.8 SIE / ml.

Exemgel 19 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 4, ympas med en sporsuspension av stammen 24 461 101 DSM 372, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 5 dagar en aktivitet av 5,0 SIE/ml.Example 19 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 4 is inoculated with a spore suspension of strain 24 461 101 DSM 372, and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 5 days an activity of 5.0 SIE / ml.

Exemgel 20 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 1, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 372, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 4 dagar en aktivitet av 21,6 SIE/ml.Example 20 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 1 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 372 and the flask is grown at 28 ° C on a shaker, then the culture solution after 4 days has a activity of 21.6 SIE / ml.

Exemgel 21 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 200 ml av en närings- lösning enligt exempel 2, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 372, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 3 dagar en aktivitet av 26,8 SIE/ml.Example 21 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 200 ml of a nutrient solution according to Example 2 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 372 and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 3 days has a activity of 26.8 SIE / ml.

Exemgel 22 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen 2,0% majsstärkelse 1,0% glukos 0,5% kaseinhydrolysat 0,5% jästextrakt pH justerat med Na2CO3 till 7,2 + 0,4% CaCO3 sterilisation 30 minuter vid 121°C ympas med en sporsuspension av stammen DSM 372, och kolven odlas vid 28°C på en-rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 3 dagar en aktivitet av 26,5 SIE/ml.Example gel 22 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution with the composition 2.0% corn starch 1.0% glucose 0.5% casein hydrolyzate 0.5% yeast extract pH adjusted with Na2CO3 to 7.2 + 0, 4% CaCO3 sterilization for 30 minutes at 121 ° C is inoculated with a spore suspension of strain DSM 372, and the flask is grown at 28 ° C on a single-shaker, then the culture solution has an activity of 26.5 SIE / ml after 3 days.

Exemgel 23 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 22, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 479, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 3 dagar en aktivitet av 7,9 SIE[ml.Example 23 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 22 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 479 and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution after 3 days has a activity of 7.9 SIE [ml.

Exemgel 24 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 6, odlas med en sporsuspension av stammen 25 461 m1 DSM 36, och om kolven odlas vid 28OC på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 3 dagar en aktivitet av 5,4 SIE/ml.Example 24 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 6 is grown with a spore suspension of the strain 25 461 ml DSM 36, and if the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 3 days an activity of 5.4 SIE / ml.

Exemgel 25 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösníng eflliqt GXêmPel 2, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 36, och om kolven odlas vid 28oC på en rundskakmaskin, så har odlingslësningen efter 3 dagar en aktivitet av 5,4 SIE/ml.Example 25 If a 1 liter Erlenmeyer flask, containing 120 ml of a nutrient solution similar to GXêmPel 2, is inoculated with a spore suspension of strain DSM 36, and if the flask is grown at 28 ° C on a shaker, the culture reading after 3 days has an activity of 5 , 4 SIE / ml.

Exemgel 26 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 2, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 356, och kolven odlas vid 28°C på en rnndskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 3 dagar en aktivitet av 8,8 SIE/ml.Example 26 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 2 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 356 and the flask is grown at 28 ° C on a shaker, then the culture solution after 3 days has a activity of 8.8 SIE / ml.

Exemgel 27 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 1, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 292, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 3 dagar en aktivitet av 9,0 SIE/ml.Example 27 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 1 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 292 and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution after 3 days has a activity of 9.0 SIE / ml.

Exemgel 28 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 2, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 292, och om kolven odlas vid 28OC på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 3 dagar en aktivitet av 9,2 SIE/ml.Example 28 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 2 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 292, and if the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution after 3 days has an activity of 9 .2 SIE / ml.

Exemgel 29 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 2, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 742, och om kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 3 dagar en aktivitet av 9,8 SIE/ml.Example 29 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 2 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 742, and if the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution has an activity after 3 days. of 9.8 SIE / ml.

Exemgel 30 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning enligt exempel 1, ympas med en sporsuspension av stammen DSM 740, och kolven odlas vid 28OC på en rundskakmaskin, så har od- lingslösningen efter 4 dagar en aktivitet av 5,7 SIE/ml. 26 461 101 Exempel 31 Odlingslösningen från en 100 liters jästank enligt exempel 3 juste- ras med halvkoncentrerad HCl till pH 3,0-3,5, och bakteriemassan centrifugeras av efter utflockulering. Man erhöll 70 liter mörkbrun odlingslösning med en SIE-halt på 220 000 SIE/liter. Denna lösning sattes mïš en flödeshastighet av 20 liter/timme på en med 12 kg Lewatit SC 104 i H+-form packad kolonn med en diameter av 30 cm.Example 30 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution according to Example 1 is inoculated with a spore suspension of strain DSM 740 and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution after 4 days has an activity of 5.7 SIE / ml. 26 461 101 Example 31 The culture solution from a 100 liter yeast tank according to example 3 is adjusted with semi-concentrated HCl to pH 3.0-3.5, and the bacterial mass is centrifuged off after flocculation. 70 liters of dark brown culture solution with a SIE content of 220,000 SIE / liter were obtained. This solution was applied at a flow rate of 20 liters / hour on a column packed with 12 kg of Lewatit SC 104 in H + form with a diameter of 30 cm.

Den genomrunna vätskan hade praktiskt taget ingen sackarasinhiberan- de aktivitet och kastades bort. Kolonnen tvättades med 50 liter destillerat vatten (tvättvatten I), 20 liter 0,01 N HCl och slutli- gen med ytterligare 20 liter destillerat vatten (tvättvatten II).The run-through liquid had virtually no sucrose inhibitory activity and was discarded. The column was washed with 50 liters of distilled water (wash water I), 20 liters of 0.01 N HCl and finally with another 20 liters of distilled water (wash water II).

För desorption av aktiviteten anslöts 2,5%-ig ammoniak. Parallellt med ökning av ledningsförmågan hos eluatet och ökad brunfärgning eluerades den sackarasinhiberande aktiviteten. De första 20 litrarna upp till det att ledningsförmågan ökade kastades bort, och den akti- vitetshaltiga fraktionen (35 liter) indunstades i rullindunstare och âterlöstes i något vatten (koncentrat 3 liter). Koncentratet lyofi- liserades. Man erhöll 288 g mörkbrun rä produkt I med 38 000 SIE/g.For desorption of the activity, 2.5% ammonia was connected. In parallel with increasing the conductivity of the eluate and increasing browning, the sucrose inhibitory activity was eluted. The first 20 liters up to the increase in conductivity were discarded, and the activity-containing fraction (35 liters) was evaporated in a roller evaporator and redissolved in some water (concentrate 3 liters). The concentrate was lyophilized. 288 g of dark brown crude product I were obtained with 38,000 SIE / g.

Exempel 32 Odlingslösningen från en 100 liters odlingstank enligt exempel 8 jus- terades med halvkoncentrerad HCl till pH 3,0-3,5, och bakteriemas- san centrifugerades av efter utflockulering. Man erhöll 60 liter mörkbrun odlingslösning med en SIE-halt på 240 000 SIE/liter. Denna lösning satsades med en flödeshastighet av 20 liter/timme på en med 12 kg Dowex 50 W x 4 i H+-form packad kolonn med en diameter av 30 cm. Den genomgångna vätskan hade praktiskt taget ingen sackarasin- hiberande effekt och kastades bort. Kolonnen tvättades därefter med 50 liter destillerat vatten (tvättvatten I), 20 liter 0,01 N HCl och därefter ytterligare med 20 liter destillerat vatten (tvättvat- ten II). För desorption av aktiviteten anslöts därefter 2,5%-ig am- moniak. Parallellt med ökningen av ledningsförmågan i eluatet och ökad brunfärgning eluerades den sackarasinhiberande aktiviteten.Example 32 The culture solution from a 100 liter culture tank according to Example 8 was adjusted with semi-concentrated HCl to pH 3.0-3.5, and the bacterial mass was centrifuged off after flocculation. 60 liters of dark brown culture solution with a SIE content of 240,000 SIE / liter were obtained. This solution was charged at a flow rate of 20 liters / hour on a column packed with 12 kg Dowex 50 W x 4 in H + form with a diameter of 30 cm. The liquid passed had virtually no sucrose inhibitory effect and was discarded. The column was then washed with 50 liters of distilled water (wash water I), 20 liters of 0.01 N HCl and then further with 20 liters of distilled water (wash water II). For desorption of the activity, 2.5% ammonia was then added. In parallel with the increase in conductivity in the eluate and increased browning, the sucrose inhibitory activity was eluted.

De första 20 litrarna upp till ökning av ledningsförmågan kastades bort. De fraktioner, som hade aktivitet (35 liter) indunstades i rullindunstare och återlöstes i något vatten (koncentrat 3 liter).The first 20 liters up to increase the conductivity were discarded. The fractions which had activity (35 liters) were evaporated in a roller evaporator and redissolved in some water (concentrate 3 liters).

Koncentratet lyofiliserades. Man erhöll 360 g mörkbrun rå produkt I med 24 000 SIE/g. 27 461 101 Exempel 33 50 9 råprodukt I från exempel 31 finfördelades i mortel och extra- herades därefter med 3 x 300 ml teknisk metanol. Därefter homogeni- serades satsen först 2 minuter i en ultraturraxhomogenisator och därefter omrördes 20 minuter i ett vattenbad med en temperatur av 40-50oC. Efter varje extraktion filtrerades igenom ett veckat fil- ter. Den återstod, som förblev kvar i det veckade filtret efter den tredje extraktionen torkades i vakuum (28,4 g). Eftersom test visade endast låg specifik aktivitet i denna återstod, kastades den bort.The concentrate was lyophilized. 360 g of dark brown crude product I with 24,000 SIE / g were obtained. 27 461 101 Example 33 50 9 crude product I from Example 31 was comminuted in mortar and then extracted with 3 x 300 ml of technical methanol. Thereafter, the batch was first homogenized for 2 minutes in an ultraturrax homogenizer and then stirred for 20 minutes in a water bath at a temperature of 40-50 ° C. After each extraction, it was filtered through a pleated filter. The residue remaining in the pleated filter after the third extraction was dried in vacuo (28.4 g). Because tests showed only low specific activity in this residue, it was discarded.

De metanoliska extrakten förenades och indunstades i vakuum till torr- het. Den i kolven kvarvarande aktiva återstoden löstes i 750 ml H20 (L = 2,8 mS, pH = 7,2) och sattes med en flödeshastighet av 500 ml/timme på en kolonn 5 x 50 cm, fylld med CM-cellulosa i H+-form (CM-cellulosa från firman Whatman, typ C 52). Därefter tvättades med 5 liter vatten, varefter 20 liter 0,002 N HCl anslöts för eluering.The methanolic extracts were combined and evaporated in vacuo to dryness. The active residue remaining in the flask was dissolved in 750 ml of H form (CM cellulose from the company Whatman, type C 52). It was then washed with 5 liters of water, after which 20 liters of 0.002 N HCl were connected for elution.

Den först utkomna vätskan, tvättvattnet och eluatet upptogs i frak- tioner om ca 0,5 liter. Den sackarasinhiberande effekten bestämdes, och alla fraktioner, som innehöll mer än 30 000 SIE/liter, förenades: i den först utkomna vätskan de mörkbrunt färgade fraktionerna 2-4 och i det ljusgula eluatet fraktionerna 16-35. De förenade fraktio- nerna indunstades och lyofiliserades. Man erhöll 18,2 g från frak- tionerna 2-4 i den först utkomna vätskan med en specifik aktivitet på 4000 SIE/g (kastades bort) samt 3,1 g av den s.k. râprodukten II med 250 000 SIE/g (ca 50-60%-ig renhet). Râprodukten II är starkt hygroskopisk och upplöses i luft på kort tid till en klibbig massa.The first liquid, wash water and eluate were taken up in fractions of about 0.5 liters. The sucrose inhibitory effect was determined, and all fractions containing more than 30,000 SIE / liter were combined: in the first liquid obtained the dark brown colored fractions 2-4 and in the light yellow eluate fractions 16-35. The combined fractions were evaporated and lyophilized. 18.2 g of fractions 2-4 were obtained in the first liquid obtained with a specific activity of 4000 SIE / g (discarded) and 3.1 g of the so-called crude product II with 250,000 SIE / g (about 50-60% purity). The crude product II is highly hygroscopic and dissolves in air in a short time to a sticky mass.

EXempel 34 2,5 g av râprodukten II från exempel 33 löstes i 15 ml metaïoš och kromatograferades på en kolonn 5 x 90 cm fylld med Sephadex R LH 20 i metanol för separation av huvudmängden av medföljande peptider.Example 34 2.5 g of the crude product II from Example 33 were dissolved in 15 ml of methanol and chromatographed on a 5 x 90 cm column filled with Sephadex R LH 20 in methanol to separate the major amount of the accompanying peptides.

Vid en flödeshastighet av 100 ml/timme och en temperatur av 4-5°C uppsamlades 10 ml fraktioner. 10 pl av dessa fraktioner sattes på en kiselgelplatta (firma Merck) och undersöktes tunnskiktskromatogra- fiskt i systemet etanol/25%-ig NH3/H20 = 80/10/10- De fr8kti0ner, som enligt tunnskiktskromatografin innehöll inhibitorer, förenades, indunstades till 5-10 ml och återkromatograferades på samma kolonn.At a flow rate of 100 ml / hour and a temperature of 4-5 ° C, 10 ml fractions were collected. 10 μl of these fractions were applied to a silica gel plate (Merck) and examined by thin layer chromatography in the system ethanol / 25% NH 3 / H 2 O = 80/10/10. The fractions containing inhibitors according to the thin layer chromatography were combined, evaporated to 5 -10 ml and chromatographed on the same column.

Man analyserade fraktionferna med tunnskiktskromatografi och förena- de de inhibitorhaltiga fraktionerna, varvid endast ett mycket smalt 28 461 101 omrâde erhölls. Därefter indunstades till torrhet. Den på LH 20 re- nade inhibitorn är till ca 90% ren. För separation av de sista kvar- varande peptidföroreningarna försättes den efter rullindunstning er- hållna återstoden med 2-3 ml metanol och den gula metanoliska lös- ningen försättes med 50 pl koncentrerad saltsyra. Efter kort tid, eventuellt även först efter flera timmar, kristalliserar inhibitorn i form av lätt gula kuber eller kvadrar. Peptiderna blir kvar i mo- derluten. Kristallerna centrifugeras av, tvättas en-gång med iskall metanol och den tvättade fällningen löses därefter under uppvärmning i 2 ml metanol. 4 ml butanol tillsättes och blandningen får stå över natt vid 4°C. De till nästa morgon utfällda färglösa kristallerna centrifugeras av, tvättas en gång med iskall metanol, en gång med aceton och en gång med eter och torkas därefter i vakuum. Utbyte 460 mg av inhibitorn i form av hydroklorid med 540 000 SIE/g.The fractions were analyzed by thin layer chromatography and the inhibitor-containing fractions were combined to give only a very narrow range. Then evaporated to dryness. The inhibitor purified on LH 20 is about 90% pure. To separate the last remaining peptide impurities, the residue obtained after roller evaporation is added with 2-3 ml of methanol and the yellow methanolic solution is added with 50 μl of concentrated hydrochloric acid. After a short time, possibly even only after several hours, the inhibitor crystallizes in the form of slightly yellow cubes or squares. The peptides remain in the mother liquor. The crystals are centrifuged off, washed once with ice-cold methanol and the washed precipitate is then dissolved while heating in 2 ml of methanol. 4 ml of butanol are added and the mixture is allowed to stand overnight at 4 ° C. The colorless crystals which precipitate until the next morning are centrifuged off, washed once with ice-cold methanol, once with acetone and once with ether and then dried in vacuo. Yield 460 mg of the inhibitor in the form of hydrochloride with 540,000 SIE / g.

Exempel 35 För att påvisa sackarasinhibitoriska komponenter i odlingslösning eller râprodukt utnyttjades följande tunnskiktskromatografiska för- farande med efterföljande enzymreaktion på platta, varvid inhibito- riska komponenter påvisas direkt på plattan. Vid denna tunnskikts- kromatografi sättes 1-5 pl av odlingslösningen eller 1-5 pg av pre- paratet på färdiggjorda kiselgelplattor (firma Merck, typ KG 60 F 254) och framkallas med etanol/NH3/H20 = 8/1/1 (I) eller etylacetat/ metanol/vatten = 10/6/4 (II). För att direkt göra de sackarasinhibe- rande komponenterna synliga sprayas man den framkallade och väl tor- kade plattan med enzymgel (20 ml/20 x 20 cm platta) och låter gelen stelna. Därefter förinkuberas 5 minuter i en fuktig kammare vid rums- temperatur, varefter sprayas till mättnad med substratgel. Efter det att dessa två gelskikt stelnat, införas plattan i en fuktig kammare och inkuberas vid 40°C. Inhibitionsfärgning (ljusa fläckar, röd- brun bakgrund) utvecklas efter 60-90 minuter. Vid den tidpunkt, när färgutvecklingen är optimal, avbrytes inkuberingen, och plattan med därpå befintliga agarskikt torkas med varmluftfläkt.Example 35 To detect sucrose inhibitory components in culture solution or crude product, the following thin layer chromatographic procedure was used with subsequent enzyme reaction on plate, wherein inhibitory components are detected directly on the plate. In this thin layer chromatography, 1-5 μl of the culture solution or 1-5 μg of the preparation is placed on prepared silica gel plates (Merck company, type KG 60 F 254) and developed with ethanol / NH 3 / H 2 O = 8/1/1 (I ) or ethyl acetate / methanol / water = 10/6/4 (II). To directly make the sucrose inhibitory components visible, spray the developed and well-dried plate with enzyme gel (20 ml / 20 x 20 cm plate) and allow the gel to solidify. It is then pre-incubated for 5 minutes in a humid chamber at room temperature, after which it is sprayed to saturation with substrate gel. After these two gel layers solidify, the plate is introduced into a humid chamber and incubated at 40 ° C. Inhibition staining (light spots, reddish-brown background) develops after 60-90 minutes. At the time when the color development is optimal, the incubation is interrupted, and the plate with the agar layers present thereon is dried with a hot air fan.

Beredning av gelerna Enzymgel: 1,5 g agaros (från industrin Biologique Francais) suspende- ras i 100 ml 0,2 M Na-maleinatbuffert pH 6,0 och löses därefter ge- nom uppkokning. Den klara agaroslösningen kyles till SOOC och försät- tes under skakning med 250 ml Triton X-100-lösning (2 g Triton X-100 H 29 461 101 + 8 g etanol p.a.) och 0,5 ml dianisidinlösning (20 mg Dianisidin/1 ml aceton). Direkt innan gelen användes tillsättes 1 ml GOD/POD-reafl gens (12,5 mg glukosoxidas, renhetsgrad I, firma Böhringer, best.nr. 15323 och 2,5 mg peroxidas, renhetsgrad II, firma Böhringer, best.nr. 15302, löst i 5 ml maleinatbuffert) och 4-5 enheter sackaras från svintunntarm (enzymberedning på samma sätt som sid. 4, anmärkning 1).Preparation of the gels Enzyme gel: 1.5 g of agarose (from the Biologique Francais industry) is suspended in 100 ml of 0.2 M Na-maleinate buffer pH 6.0 and then dissolved by boiling. The clear agarose solution is cooled to 5 ° C and shaken with 250 ml Triton X-100 solution (2 g Triton X-100 H 29 461 101 + 8 g ethanol pa) and 0.5 ml dianisidine solution (20 mg Dianisidine / 1 ml acetone). Immediately before using the gel, add 1 ml of GOD / POD reagent (12.5 mg glucose oxidase, purity grade I, Böhringer, order no. 15323 and 2.5 mg peroxidase, purity II, Böhringer, order no. 15302, dissolved in 5 ml of maleinate buffer) and 4-5 units are sucked from pig intestine (enzyme preparation in the same way as page 4, note 1).

Gelen måste hållas vid SOOC, tills den sprayas, ty annars stelnar den vid sprayningen i munstycket.The gel must be kept at SOOC until sprayed, otherwise it solidifies during spraying into the nozzle.

Substratgel: 0,5 g agaros suspenderas i 100 ml Na-maleinatbuffert pH 6,0 och löstes under kokning. Därefter kyles till 50°C och 100¿pl Triton (2 g Triton X-100 + 8 g metanol p.a.) tillsättes samt 1 9 sackaros (Serva nr. 35579). Efter lösning av sackarosen kan gelen användas.Substrate gel: 0.5 g of agarose is suspended in 100 ml of Na-maleinate buffer pH 6.0 and dissolved with boiling. Then cool to 50 ° C and 100¿pl Triton (2 g Triton X-100 + 8 g methanol p.a.) is added and 19 sucrose (Serva no. 35579). After dissolving the sucrose, the gel can be used.

Undersökning av odlingslösningarna för stammarna med denna metod gav sackarasinhibitoriska komponenter med följande Rf-värden i sys- tem I: Stammar Rf-Yärq? DSM 7 0,25 DSM 741 _ 0,25; 0,41; 0,50; 0,59; 0,71 DSM 704 0,25 DSM 372 0,25; 0,51; 0,60; 0,71 och följande Rf~värden i system II: Stammar Rffvärde DSM 704 0,05 DSM 479 (0,05); 0,22-0,35; 0,62-0,67; 0,98 DSM 741 (0,05); 0,23-0,35; 0,62-0,67 DSM 372 (0,05): 0,20-0f22 Exemgel 36 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings~ lösning med sammansättningen 1,0% stärkelse 0,1% glukos 0,5% kaseinhydrolysat 1,0% jästextrakt pH justerat med Na2CO3 till 7,2 461 101 3” 4' sterilisation 30 minuter vid 121°C ympas med en sporsuspension av stammen DSM 479, och kolven odlas vid 2800 pâ en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 2 dagar en aktivitet av 20,2 SIE/ml. gkemgel 37 Om en 1 liters Erlenmayerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen 2,0% majsstärkelse 1,0% glukos 0,5% kaseinhydrolysat 1,0% jästextrakt 0,1% K HPO 2 4 pH justerat med Na2CO3 till 7,2 + 0,4% CaCO 3 sterilisation 30 minuter vid 121°C ympas med en sporsuspension av stammen DSM 372, och kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så har odlingslösningen efter 2,5 dagar en aktivitet av 50,3 SIE/ml.Examination of the culture solutions for the strains by this method yielded sucrose inhibitory components with the following Rf values in system I: Strains Rf-Yärq? DSM 7 0.25 DSM 741 _ 0.25; 0.41; 0.50; 0.59; 0.71 DSM 704 0.25 DSM 372 0.25; 0.51; 0.60; 0.71 and the following Rf values in system II: Strains Rff value DSM 704 0.05 DSM 479 (0.05); 0.22-0.35; 0.62-0.67; 0.98 DSM 741 (0.05); 0.23-0.35; 0.62-0.67 DSM 372 (0.05): 0.20-0f22 Exemgel 36 About a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution with the composition 1.0% starch 0.1% glucose 0 .5% casein hydrolyzate 1.0% yeast extract pH adjusted with Na2CO3 to 7.2 461 101 3 ”4 'sterilization 30 minutes at 121 ° C inoculated with a spore suspension of strain DSM 479, and the flask is grown at 2800 on a round shaker. the culture solution after 2 days an activity of 20.2 SIE / ml. gkemgel 37 About a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution with the composition 2.0% corn starch 1.0% glucose 0.5% casein hydrolyzate 1.0% yeast extract 0.1% K HPO 2 4 pH adjusted with Na 2 CO 3 to 7.2 + 0.4% CaCO 3 sterilization 30 minutes at 121 ° C is inoculated with a spore suspension of the strain DSM 372, and the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, then the culture solution has an activity of 2.5 days. 50.3 SIE / ml.

Exemgel 38 Om en 1 liters Erlenmeyerkolv, som innehåller 120 ml av en närings- lösning med sammansättningen enligt exempel 1, 2, 4 eller 6, ympas med sporsuspensioner från de anförda stammarna och om kolven odlas vid 28°C på en rundskakmaskin, så visar odlingslösningen efter 4 da- gar följande aktiviteter: Näringslösning Odlingslösningens aktivitet Stam enligt exempel efter 4 dagar i SIE/ml KA-63 DSM 1060 31 " 6,6 25 7,9 50 4,3 3,8 2,7 8,4 3,6 3,1 u n IAM-1523 DSM 1061 u u u CUT 8108 DSM 1062 NJpNm-JhNm-l-ë- II f 31 461 101 Näringslösning Odlingslösningens aktivitet Stam enligt exempel efter 4 dagar i SIE/ml CUT 8110 DSM 1063 28 " 71 69 104 38 10,6 14,4 54 2,7 28 1,5 10,3 17 3,8 4,1 n S 202 DSM 1Û64 n n S 204 DSM 1065 n S 219 DSM1066 u S 242 DSM TOG7 u IUIfi-*IU-Iøb-JoàIQ-JIÄNJON-lbExample 38 If a 1 liter Erlenmeyer flask containing 120 ml of a nutrient solution of the composition of Example 1, 2, 4 or 6 is inoculated with spore suspensions from the strains indicated and if the flask is grown at 28 ° C on a round shaker, the culture solution after 4 days the following activities: Nutritional solution The activity of the culture solution Strain according to example after 4 days in SIE / ml KA-63 DSM 1060 31 "6.6 25 7.9 50 4.3 3.8 2.7 8.4 3 , 6 3.1 un IAM-1523 DSM 1061 uuu CUT 8108 DSM 1062 NJpNm-JhNm-l-ë- II f 31 461 101 Nutritional solution Culture solution activity Strain according to example after 4 days in SIE / ml CUT 8110 DSM 1063 28 "71 69 104 38 10.6 14.4 54 2.7 28 1.5 10.3 17 3.8 4.1 n S 202 DSM 1Û64 nn S 204 DSM 1065 n S 219 DSM1066 u S 242 DSM TOG7 u IUI fi- * IU -Iøb-JoàIQ-JIÄNJON-lb

Claims (3)

461 101 12 Patentkrav in461 101 12 Patent claims in 1. Användning av stammar från gruppen Bacillus med följande namn och deponeringsbeteckningar B.amyloliquefaciens DSM 7, B.coagulans DSM 1, B.longisporus DSM 479, B.polymyxa DSM 365, DSM 372, DSM 742, DSM 292, DSM 356 (ATCC 8523), DSM 36 (ATCC 842), DSM 740, DSM 741, B.subtilis DSM 704, B.subtilis var.niger DSM 675, B.subtilis DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066, DSM 1067, av vilka B.subtilis DSM 704, B.polymyxa DSM 740, DSM 741 och DSM 742 är nya, för utvinning av sackarasinhibitorer genom odling av dessa stammar med allmänt kända metoder.Use of strains of the group Bacillus with the following names and deposit designations B.amyloliquefaciens DSM 7, B.coagulans DSM 1, B.longisporus DSM 479, B.polymyxa DSM 365, DSM 372, DSM 742, DSM 292, DSM 356 (ATCC 8523), DSM 36 (ATCC 842), DSM 740, DSM 741, B.subtilis DSM 704, B.subtilis var.niger DSM 675, B.subtilis DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066, DSM 1067, of which B.subtilis DSM 704, B.polymyxa DSM 740, DSM 741 and DSM 742 are new, for the recovery of sucrose inhibitors by culturing these strains by commonly known methods. 2. Användning av stammarna B.amyloliquefaciens DSM 7, B.subtilis DSM 704, DSM 675 och B.po1ymyxa DSM 372 för utvin- ning av sackarasinhibitorn 1-desoxinojirimycin.Use of strains B.amyloliquefaciens DSM 7, B.subtilis DSM 704, DSM 675 and B.polymyxa DSM 372 for the recovery of the sucrose inhibitor 1-deoxinojirimycin. 3. Sätt att framställa sackarasinhibitorer enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att stammar från gruppen Bacillus med följande namn och deponeringsbeteckningar B.amyloliquefaciens DSM 7, B.coagulans DSM 1, B.longisporus DSM 479, B.polymyxa DSM 365, DSM 372, DSM 742, DSM 292, DSM 356 (ATCC 8523), DSM 36 (ATCC 842), DSM 740, DSM 741, B.subtilis DSM 704, B.subtilis var.niger DSM 675, B.subtilis DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066, DSM 1067, odlas i vanliga näringslösningar vid temperaturer mellan ca 15 och 80° ca 1-8 dagar under luft- ning i vanliga odlingskärl, cellerna avlägsnas och inhibito~ rerna isoleras från odlingslösningen eller cellextrakten med vanliga reningsförfaranden.Method of preparing sucrose inhibitors according to claim 1, characterized in that strains from the group Bacillus with the following names and deposit designations B.amyloliquefaciens DSM 7, B.coagulans DSM 1, B.longisporus DSM 479, B.polymyxa DSM 365, DSM 372 , DSM 742, DSM 292, DSM 356 (ATCC 8523), DSM 36 (ATCC 842), DSM 740, DSM 741, B.subtilis DSM 704, B.subtilis var.niger DSM 675, B.subtilis DSM 1060, DSM 1061 , DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066, DSM 1067, are grown in ordinary nutrient solutions at temperatures between about 15 and 80 ° for about 1-8 days during aeration in ordinary culture vessels, the cells are removed and the inhibitors isolated from the culture solution or cell extracts by standard purification procedures.
SE8901456A 1976-12-23 1989-04-21 USE OF STEMS FROM THE GROUP BACILLUS FOR THE EXTRACTION OF SUCCESS INHIBITORS AND WAY TO MANUFACTURE SUCCESS INHIBITORS SE461101B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19762658563 DE2658563A1 (en) 1976-12-23 1976-12-23 Glucoside hydrolase inhibitors prodn. from bacteria - esp. Bacillus species useful, e.g., for increasing meat yields and feed efficiency

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE8901456D0 SE8901456D0 (en) 1989-04-21
SE461101B true SE461101B (en) 1990-01-08

Family

ID=5996499

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE7714661A SE442874B (en) 1976-12-23 1977-12-22 Extraction of saccharin inhibitors by cultivation of bacillus and microorganism strains B.SUBTILIS DSM 704, B.POLYMYXA DSM 740,741 AND 742
SE8901456A SE461101B (en) 1976-12-23 1989-04-21 USE OF STEMS FROM THE GROUP BACILLUS FOR THE EXTRACTION OF SUCCESS INHIBITORS AND WAY TO MANUFACTURE SUCCESS INHIBITORS

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE7714661A SE442874B (en) 1976-12-23 1977-12-22 Extraction of saccharin inhibitors by cultivation of bacillus and microorganism strains B.SUBTILIS DSM 704, B.POLYMYXA DSM 740,741 AND 742

Country Status (4)

Country Link
JP (2) JPS62143683A (en)
BE (1) BE862165A (en)
DE (1) DE2658563A1 (en)
SE (2) SE442874B (en)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2907190A1 (en) * 1979-02-23 1980-08-28 Bayer Ag 1-DESOXYNOJIRIMYCIN PRODUCTION
DE3038901A1 (en) * 1980-10-15 1982-05-06 Bayer Ag, 5090 Leverkusen METHOD FOR PRODUCING N-SUBSTITUTED DERIVATIVES OF 1-DESOXYNOJIRIMYCIN
JP2007210675A (en) * 2006-01-10 2007-08-23 Dainippon Printing Co Ltd Recording disc storage case
CN109897795A (en) * 2018-12-26 2019-06-18 佛山市艳晖生物科技有限公司 A kind of microbial bacterial agent and its application on anti-treat constipation

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2064092C2 (en) * 1970-12-28 1983-06-01 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Actinomycete glycoside hydrolase inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
JPS62143683A (en) 1987-06-26
SE8901456D0 (en) 1989-04-21
JPH0119877B2 (en) 1989-04-13
BE862165A (en) 1978-06-22
DE2658563A1 (en) 1978-06-29
SE7714661L (en) 1978-06-24
JPS62155290A (en) 1987-07-10
SE442874B (en) 1986-02-03
DE2658563C2 (en) 1993-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4521335A (en) Aglycone and pseudo-aglycones of the AAD 216 antibiotics
HU187763B (en) Process for producing new polyether compounds
US4307194A (en) Inhibitors, obtained from bacilli, for glycoside hydrolases
SU818492A3 (en) Method of preparing deoxynarasine antibiotic complex
US4065557A (en) Amino sugars and their use in improving the meat:fat ratio in animals
PT78877B (en) Antibiotics produced by kibdelosporangium aridum
SE461101B (en) USE OF STEMS FROM THE GROUP BACILLUS FOR THE EXTRACTION OF SUCCESS INHIBITORS AND WAY TO MANUFACTURE SUCCESS INHIBITORS
US4279894A (en) Streptomyces metabolite
US4328233A (en) α-Glucosidase inhibiting 2-hydroxymethyl-3,4,5-trihydroxy-piperidines
US4168272A (en) Homologs of lasalocid A
DE3782169T2 (en) METHOD FOR PRODUCING ANTIBIOTICA 10381B.
US4670260A (en) Antibiotic for animal feeds
DE2726899C1 (en)
US5254533A (en) Elfamycin
IL46912A (en) Method and animal feed compositions containing certain amino-sugar derivatives for improving the quality of the mea
DE2661012C2 (en)
JPS61233695A (en) Efomycins and manufacture
US5017561A (en) Antibotic 6270B and its use as an anticoccidiosis agent and a feed additive
PL98718B1 (en) METHOD OF MAKING A NEW ANTIBIOTICUM BAY G 7299
DE2658562C2 (en)
GB1583408A (en) Antibiotic x-14547
FI72716C (en) Process for the preparation of novel therapeutically useful 2-hydroxymethyl-3,4,5-trihydroxypiperidine derivatives
US3839559A (en) Anticoccidial method
KR900005858B1 (en) Process for preparation of new antibiotic 6270
KR800000378B1 (en) Process for preparation of antibiotic lasalocid

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed

Ref document number: 8901456-7

Effective date: 19920704

Format of ref document f/p: F