SE458237B

SE458237B - Immuno-analysis of serum

Info

Publication number: SE458237B
Application number: SE8306605A
Authority: SE
Inventors: A N Ozkan
Original assignee: Biostar Med Prod
Priority date: 1983-10-03
Filing date: 1983-11-30
Publication date: 1989-03-06
Also published as: DK47484A; SE8306605D0; SE8306605L; GR80292B; DK47484D0; JO1386B1

Abstract

A sample is put on a support plate. This is coated with a nonionic polymer which is able to adsorb any immunocomplex present in the sample. An indication of the quantity and the structure of the immunocomplex is given. The polymer is chosen from polyol, dextran and polyvinyl chloride, polyethylene glycol or mixt. of these. The indication treatment includes, washing the adsorbed polymer layer with a buffer soln. and the addn. of a component chosen from anti-human IgG, IgA, IgD, IgE, IgG4, IgM and mixts. of these, coupled with an enzyme. The level of immunocomplex is given by the change in colour. (Provisional Basid previously advised in week 8522)

Description

458 10 15 20 25 30 35 237 inkluderar radioimmunoassay med Raji-cell, som mäter (el- ler kvantifierar) mängden immunkomplex genom användningen av ett radioaktivt material såsom anti-IgG-I12S-märkt an- tiserum. Efter borttvättning av överskottet av radioaktivt märkt antiserum kan mängden immunkomplex som reagerat med ' det radioaktiva materialet säkerställas genom användning av en scintillationsräknare. Radioimmunoassaytestet med Raji- cell är beskrivet i In Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity, sektion D, kapitel 52 (Academic Press 1976, utgiven av Bloom, B. och J. David). 458 10 15 20 25 30 35 237 includes radioimmunoassay with Raji cell, which measures (or quantifies) the amount of immune complex by the use of a radioactive material such as anti-IgG-I12S-labeled antiserum. After washing away the excess radiolabeled antiserum, the amount of immune complex that has reacted with the radioactive material can be ascertained by using a scintillation counter. The radioimmunoassay test with Raji cell is described in In Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity, Section D, Chapter 52 (Academic Press 1976, published by Bloom, B. and J. David).

Tidigare utvecklade isotypa specificitetstester för klassen eller underklassen av antikroppkomponenten i ett cirkuleran- de immunkomplex utnyttjande ett protein för initial reaktion med ett prov, har utförts men har ej utnyttjat en monobland- ning eller en blandning av monoklona eller polyklona anti- -antikroppar med en enkel eller multipel immunoglobuliniso- typ, såsom IgA, IgD, IgE, IgG, IgG4 eller IgM. Bestämning av antikroppunderklassen kastar ljus över såväl det möjliga ursprunget som prognosen för sjukdomen. Ingen tidigare anti- genspecifik analys är emellertid förut känd som hjälpmedel vid identifiering av cirkulerande immnnkomplexrelaterade sjukdomstillstånd, såsom reumatoid artrit, systemisk lupus erytematosus och liknande.Previously developed isotypic specificity tests for the class or subclass of the antibody component in a circulating immune complex using an initial reaction protein with a sample have been performed but have not used a mono-mixture or a mixture of monoclonal or polyclonal anti-antibodies with a single or multiple immunoglobulin isotype, such as IgA, IgD, IgE, IgG, IgG4 or IgM. Determination of the antibody subclass sheds light on both the possible origin and the prognosis for the disease. However, no previous antigen-specific assay is previously known to aid in the identification of circulating immune complex-related disease states, such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and the like.

Eftersom samtliga tidigare använda tester kräver protein för initial reaktion med ett prov, är det uppenbart att ett mycket billigare material för att bilda ett skikt på en fast bärare skulle avsevärt reducera kostnaden för det använda materialet vid immunoanalysen och därmed reducera slutkost- naden. Dessutom kräver användandet av radioaktiva material vanligen särskild tillåtelse och stora försiktighetsåtgärder vid hantering och användning. Dessutom är det radioaktiva materialet ganska dyrt och riskfyllt.Since all previously used tests require protein for initial reaction with a sample, it is obvious that a much cheaper material to form a layer on a solid support would significantly reduce the cost of the material used in the immunoassay and thus reduce the final cost. In addition, the use of radioactive materials usually requires special permission and great precautions for handling and use. In addition, the radioactive material is quite expensive and risky.

Ett av syftena med föreliggande uppfinning är att ta fram eﬂznytt förfarande för genomförande av en immunoassay av ett prov av kroppsvätska eller liknande för att bestämma identi- 10 15 20 25 30 35 458 237 teten av en antigen i ett cirkulerande immunkomplex och kvan- titeten av detta.kqmplex, att ta fram ett nytt förfarande för genomförande av en immunoassay av ett prov av en kropps- vätska eller liknande för att bestämma klassen eller under- klassen av en antikropp i ett cirkulerande immunkomplex och kvantiteten av detta komplex, att ta fram sådana förfaranden som innebär användning av ett avsevärt billigare material än det protein som erfordrats för tidigare analystyper, att ta fram sådana förfaranden som ger pålitliga och reproducerba- ra resultat, att ta fram förfaranden som kan utföras lättare och på enklare sätt än liknande tester, att ta fram ett me- del som lätt kan produceras i kvantitet och som avsevärt redu- cerar den tid som går åt vid den aktuella analysen, att ta fram ett sådant medel som kan tillverkas så att det kan förva- ras under lång tid, att ta fram ett förfarande för framställ- ning av ett.sådant medel, varmed medlet kan tillverkas effek- tivt och med hög verkningstid och ta fram ett förfarande som kan utföras enkelt och effektivt och till avsevärt lägre kost- nad.One of the objects of the present invention is to develop a novel method for performing an immunoassay of a sample of body fluid or the like to determine the identity of an antigen in a circulating immune complex and the quantity of this complex, to develop a new method for performing an immunoassay of a sample of a body fluid or the like to determine the class or subclass of an antibody in a circulating immune complex and the quantity of this complex, to develop such procedures involving the use of a significantly cheaper material than the protein required for previous types of analysis, to develop methods which give reliable and reproducible results, to develop procedures which can be performed more easily and in a simpler manner than similar tests, to take produce an agent that can be easily produced in quantity and that significantly reduces the time spent on the analysis in question, to produce a such an agent which can be manufactured so that it can be stored for a long time, to develop a process for the manufacture of such an agent, by which the agent can be manufactured efficiently and with a high duration of action and to develop a process which can be carried out easily and efficiently and at a significantly lower cost.

Dessa mål uppnås enligt uppfinningen genom ett förfarande en- ligt ingressen, vilket kännetecknas av att en mottagande del tillhörande en fast bärare behandlas med polyetylenglykol för bildning av ett vätskefilmskikt av polyetylenglykolen vid- häftande till nämnda mottagande del och med förmåga att adsor- bera immunkomplex eller aggregerade gammaglobuliner, den så- lunda behandlade mottagande delen bringas i kontakt med pro- vet som skall analyseras för adsorption av i provet närvaran- de immunkomplex eller aggregerade gammaglobuliner till poly- etylenglykolvätskefilmskiktet och sålunda adsorberade immun- komplex eller aggregerade gammaglobuliner behandlas så att en indikation om sammansättningen och/eller koncentrationen av dessa fås fram.These objects are achieved according to the invention by a process according to the preamble, which is characterized in that a receiving part belonging to a solid support is treated with polyethylene glycol to form a liquid film layer of the polyethylene glycol adhering to said receiving part and capable of adsorbing immune complexes or aggregated gamma globulins, the receiving portion thus treated is contacted with the sample to be assayed for adsorption of immune complexes present in the sample or aggregated gamma globulins to the polyethylene glycol liquid film layer and thus adsorbed immune complexes or aggregated gamma globulins are treated so that if the composition and / or concentration of these is obtained.

Efter att ha fäst polyetylenglykolen på den fasta bäraren, såsom en mikrotitrerplatta, provrör eller liknande, kan de vid assaymetoden enligt uppfinningen använda stegen vara desamma som i motsvarande steg i ELISA-analysen. Den fasta bäraren 458 237 10 15 20 25 30 35 40 mäste emellertid vara en sådan, till vilken polymeren binds och flera plastmaterial har befunnits vara de mest lämpade materialen för bärare, isynnerhet polystyren och polyvinyl- klorid eller varje annat material, som fungerar på samma sätt som de när beskrivna materialen. ' Enligt en utföringsform kan serumprovet bringas att reagera med polymeren och därefter kan ett radioaktivt material använ- das som märksubstans med någon immunglobulin eller anti-im- munglobulin, såsom en anti-human immunglobulin IgG som är fäst vid en radiaktiv märksubstans såsom jod 125 som i sin tur kan bringas att reagera med de av polymeren adsorberade immunkomplexen. Överskottet av reaktanter kan sedan avlägsnas och mängden radioaktivt material reagerat med de adsorberade immunkomplexen uppmätas, såsom med en scintillationsräknare eller liknande, för att ta fram analysvärdena för totala mäng- den cirkulerande immunkomplex eller klasser av antikroppkompo- nent däri eller den specifika antigenkomponenten däri.After attaching the polyethylene glycol to the solid support, such as a microtiter plate, test tube or the like, the steps used in the assay method of the invention may be the same as in the corresponding steps in the ELISA assay. However, the solid support 458 237 10 15 20 25 30 35 40 must be one to which the polymer is bonded and several plastic materials have been found to be the most suitable materials for supports, in particular polystyrene and polyvinyl chloride or any other material operating on the same methods such as the materials already described. In one embodiment, the serum sample may be reacted with the polymer and then a radioactive material may be used as a label with any immunoglobulin or anti-immunoglobulin, such as an anti-human immunoglobulin IgG attached to a radiolabel such as iodine 125 which in turn can be reacted with the immune complexes adsorbed by the polymer. The excess reactants can then be removed and the amount of radioactive material reacted with the adsorbed immune complexes measured, such as with a scintillation counter or the like, to produce the assay values for the total amount of circulating immune complex or classes of antibody component therein or the specific antigen component therein.

För bestämning av den specifika identiteten av antigenkompo- nenten i ett cirkulerande immunkomplex kan man företa stegen i ELISAfanalysen med undantag av att en monoblandning eller blandning av monoklona eller polyklona antikroppar med speci- ficiteter för antigenerna relevanta mot eller specifika för olika cirkulerande immunkomplexrelaterade sjukdomstillstånd kan användas. Exempelvis kan sådana med specificitet för na- tiv DNA användas för att identifiera systemisk lupus erytema- tosus, medan sådana med specificitet för olika ledkomponenter såsom kollagen, elastin och liknande, kan användas för att identififera reumatoid artrit. Ensymkonjugerade monoklona el- ler polyklona antikroppar ersätter sålunda enzymmärkt anti- kroppimmunglobulin som används vid ELISA-analysen för bestäm- ning av immunkomplex.To determine the specific identity of the antigenic component of a circulating immune complex, one can perform the steps of the ELISA assay except that a monoblend or mixture of monoclonal or polyclonal antibodies with specificities of the antigens relevant to or specific for different circulating immune complex related conditions may be used. . For example, those with specificity for native DNA can be used to identify systemic lupus erythematosus, while those with specificity for various joint components such as collagen, elastin and the like can be used to identify rheumatoid arthritis. Enzyme-conjugated monoclonal or polyclonal antibodies thus replace enzyme-labeled antibody immunoglobulin used in the ELISA assay to determine immune complexes.

För bestämning av isotypen eller antikroppunderklassen i ett cirkulerande immunkomplex kan stegen vid ELISA-testet använ- das men den fasta bäraren enligt uppfinningen utnyttjas och ånyo monoklona eller polyklona antikroppar men konjugerade med en enkel immunglobulinisotyp, såsom IgA, IgD, IgE, IgG, IgG4 eller IgM. 10 15 20 25 30 35 40 458 237 5 Medlet enligt uppfinningen användbart vid var och en av nämn- da immunoassayer är en fast bärare med anordning för att mottaga ett beläggningsskikt av ett prov som skall underkas- tas assay och ett vätskefilmskikt av polyetylenglykol på nämn- da anordning häftande vid bäraren och med förmågan att ad-. sorbera immunkomplex och/eller aggregerade gammaglobuliner som kan vara närvarande i provet. Nämnda anordningar kan vara en serie fördjupningar i en plan yta i en titrerplatta eller hål- rummet i ett provrör, som företrädesvis är format av plast, varvid nämnda anordningar har en beläggning eller skikt av en icke proteinhaltig, nonjonisk polymer i vätskefas med förmåga att adsorbera immunkomplex. Förfarandet för framställning av ett sådant medel kan vara detsamma som de första stegen vid ti- digare beskrivna analysmetod. Medlet är också företrädesvis skyddat av ett skikt av film som täcker polymeren och anord- ningen för att ta emot provet för att förhindra avdunstning av skiktet med vätskeformigt material. Titrerplattan kan också framställas av en fast, icke proteinhaltig nonjonisk polymer, som kan formas direkt till en platta med förmåga att adsorbe- ra immunkomplex av här beskrivet slag.To determine the isotype or antibody subclass of a circulating immune complex, the steps of the ELISA test can be used but the solid support of the invention is used and again monoclonal or polyclonal antibodies but conjugated to a simple immunoglobulin type, such as IgA, IgD, IgE, IgG, IgG, IgG, IgG, IgG IgM. The agent according to the invention useful in each of said immunoassays is a solid support with a device for receiving a coating layer of a sample to be subjected to assay and a liquid film layer of polyethylene glycol on said 158. the device adhering to the carrier and having the ability to ad-. sorb immune complexes and / or aggregated gamma globulins that may be present in the sample. Said devices may be a series of depressions in a flat surface of a titer plate or the cavity of a test tube, which is preferably formed of plastic, said devices having a coating or layer of a non-proteinaceous, nonionic polymer in liquid phase capable of adsorbing immune complex. The process for the preparation of such an agent may be the same as the first steps in the method of analysis previously described. The agent is also preferably protected by a layer of film covering the polymer and the device for receiving the sample to prevent evaporation of the layer of liquid material. The titer plate can also be made of a solid, non-proteinaceous nonionic polymer, which can be formed directly into a plate capable of adsorbing immune complexes of the type described herein.

Kort beskrivning av ritningsfigurerna: Fig. 1 visar uppifrån en mikrotitrerplastplatta, som är an- passad att utgöra medlet enligt uppfinningen och är särskilt användbar vid immunoanalysen.Brief description of the drawing figures: Fig. 1 shows from above a microtiter plastic plate, which is adapted to constitute the agent according to the invention and is particularly useful in the immunoassay.

Fig. 2 visar en fragmentarisk tvärsektion utmed linjen 2-2 i fig. 1 i förstorad skala visande den för användning framtag- na mikrotitrerplattan.Fig. 2 shows a fragmentary cross-section along line 2-2 of Fig. 1 on an enlarged scale showing the microtiter plate produced for use.

Fig. 3 visar i längdsektion och i förstorad skala ett prov- rör innefattande ett annat medel användbart vid immunoanaly- sen enligt uppfinningen.Fig. 3 shows in longitudinal section and on an enlarged scale a test tube comprising another agent useful in the immunoassay according to the invention.

Fig. 4 visar en tvärsektion av samma slag som fig. 1 men ta- gen i ett läge för att omfatta en kant av titrerplattan i fig. 1 och visande även ett skyddsskikt som förhindrar eller försenar förångningen av en vätskeformig polymer som häftar vid fördjupningarna i titrerplattan. 45ö 257 . - e 10 15 20 25 30 35 Beskrivning av föredragna utföringsformer: En fast bärare avpassad att ta emot ett testprov, mikrotiterplatta P i fig. såsom en 1 eller provrör T i fig. 3 eller ett polymerpapper format så att det uppvisar fördjupningar eller urtag, behandlas enligt uppfinningen för användning vid detektering av immunkomplex, t.ex. antigen-antikropp- komplex, som kan finnas närvarande i ett humanserumprov från en patient som lider av reumatoid artrit, virusinfektion eller liknande. Såväl plattan P T är företrädesvis formade av en lämplig plast, tumör, hepatit, som provröret såsom poly- styren eller polyvinylklorid. Plattan P är försedd med en serie fördjupningar 20 med en så liten kapacitet som i stor- leksordningen 0,2 cm3 medan kapaciteten för provröret T kan ligga i storleksordningen ca 5,0 cm3. I samband med test- ningen placeras ett stort antal prover av kroppsvätska, såsom humanserum, blodplasma, cerebral spinalvätska eller liknande tillsammans med ett önskat passande antal kontroll- prover i fördjupningarna 20 i plattan P. Fördjupningarna i plattan P kan vara utförda på vilket som helst lämpligt sätt men är här uppdelade i såväl horisontella som vertikala rader med lämpliga indikeringssystem för att ange varje specifik fördjupning. I det i fig. 1 visade systemet kan fördjupningarna i de vertikala raderna identifieras med nummer, såsom från 1 till 12, medan fördjupningarna i de horisontella raderna kan identifieras med bokstäver, såsom från A till H, för att få en noggrannare korrelation av resultaten med proverna som testas. 96 fördjupningar i fig. 1 även om det specifika antalet kan variera alltefter önskemål.Fig. 4 shows a cross section of the same type as Fig. 1 but taken in a position to comprise an edge of the titration plate in Fig. 1 and also showing a protective layer which prevents or delays the evaporation of a liquid polymer which adheres to the depressions in the titer plate. 45ö 257. Description of preferred embodiments: A solid support adapted to receive a test sample, microtiter plate P in Fig. as a 1 or test tube T in Fig. 3 or a polymer paper shaped so as to have depressions or recesses, treated according to the invention for use in the detection of immune complexes, e.g. antigen-antibody complex, which may be present in a human serum sample from a patient suffering from rheumatoid arthritis, viral infection or the like. Both the plate T T are preferably formed of a suitable plastic, tumor, hepatitis, as well as the test tube such as polystyrene or polyvinyl chloride. The plate P is provided with a series of depressions 20 with a capacity as small as in the order of 0.2 cm3, while the capacity of the test tube T can be in the order of about 5.0 cm3. In connection with the testing, a large number of samples of body fluid, such as human serum, blood plasma, cerebral spinal fluid or the like, are placed together with a desired appropriate number of control samples in the depressions in the plate P. The depressions in the plate P can be performed on any suitably but are here divided into both horizontal and vertical rows with suitable indication systems to indicate each specific recess. In the system shown in Fig. 1, the depressions in the vertical rows can be identified by numbers, such as from 1 to 12, while the depressions in the horizontal rows can be identified by letters, such as from A to H, to obtain a more accurate correlation of the results with the samples being tested. 96 depressions in Fig. 1 although the specific number may vary as desired.

Såsom framgår finns Enligt uppfinningen användes en lösning av icke proteinhal- tig, nonjonogen organisk polymer som också har förmåga att adsorbera immunkomplex liksom väta plasten i plattan P och provröret T. Den föredragna nonjoniska polymeren är poly- etenglykol, PEG, dvs. p-isooktylfenyleter men andra före- ninar med förmåga att fungera på samma sätt kan användas.As can be seen, according to the invention, a solution of non-proteinaceous, nonionic organic polymer is used which is also capable of adsorbing immune complexes as well as wetting the plastic in the plate P and the test tube T. The preferred nonionic polymer is polyethylene glycol, PEG, i.e. p-isooctylphenyl ether but other compounds capable of functioning in the same way can be used.

Använd PEG bör ha en molekylvikt mellan ca 2000 och ca 20000, företrädesvis en molekylvikt av 6000-8000. En lösning l 10 15 20 25 30 35 7 458 237 av PEG med PEG-koncentration av ca 5-20%, företrädesvis 9%, hälls eller doppas på plattan P eller avsätts i varje för- djupning 20. Efter tillräckligt läng tid, företrädesvis 12-24 timmar, skakas överskottet av PEG av från plattan kvarlämnande ett skikt 21 i fig. 2 innefattande PEG som häftar vid varje fördjupning i plattan. Ett liknande till- vägagångssätt kan tillämpas för att belägga insidan av prov- röret T i fig. 2 med ett PEG-skikt 31 såsom genom att hälla PEG-lösningen i provröret, låta det stå under till- räckligt lång tid, företrädesvis under 12-24 timmar, och därefter skaka ut lösningsöverskottet.The PEG used should have a molecular weight between about 2000 and about 20,000, preferably a molecular weight of 6,000-8,000. A solution of PEG with a PEG concentration of about 5-20%, preferably 9%, is poured or dipped onto the plate P or deposited in each well 20. After a sufficiently long time, preferably 12-24 hours, the excess PEG is shaken off from the plate leaving a layer 21 in Fig. 2 comprising PEG which adheres to each depression in the plate. A similar procedure can be applied to coat the inside of the test tube T in Fig. 2 with a PEG layer 31 such as by pouring the PEG solution into the test tube, leaving it for a sufficiently long time, preferably for 12 hours. 24 hours, and then shake out the excess solution.

Man kan också räkna med att etylenglykolpolymerer eller -addukter med en molekylvikt av ca 2000 till ca 20000 bör kunna användas med framgång i samband med uppfinningen.It is also contemplated that ethylene glycol polymers or adducts having a molecular weight of about 2,000 to about 20,000 should be successfully used in connection with the invention.

Tester skulle visa att polymermaterial med de rätta vät- nings- och reaktivitetsegenskaperna bör vara lämpliga för användning enligt uppfinningen. Den sålunda på plattan av- satta nonjonogena polymeren är företrädesvis skyddad från luft för att förhindra torkning, såsom med en skyddande anordning såsom skiktet eller filmen 22 i.fig. 4, eftersom exponering för luft, såsom visat i exempel 3, under allt för lång tid kan resultera i att lösningsmedlet förångas och PEG blir ett pulver som tvättas bort när serumet till- sättes såsom beskrives nedan.Tests would show that polymeric materials with the right wetting and reactivity properties should be suitable for use according to the invention. The nonionic polymer thus deposited on the plate is preferably protected from air to prevent drying, such as with a protective device such as the layer or film 22 in FIG. 4, since exposure to air, as shown in Example 3, for too long can result in the solvent evaporating and PEG becoming a powder which is washed away when the serum is added as described below.

Allra helst är det önskvärt att tvätta ut PEG-lösningen ur fördjupningarna i plattan P med en buffertlösning innan PEG-materialet bringas att reagera med serumet innehållan- de immunkomplexet. Typiskt kan en karbonat-bikarbonat- buffertlösning användas vid ett pH av ca 7,6 såsom anges i nedanstående tabell 1: Tabell 1 Na2CO3 1,5 g NaHCO3 2,9 g H O 1 liter 458 237 . . 8 10 1s_ 20 25 30 35 Andra buffertsystem kan användas såsom fosfatbuffertlös- ningen i tabell 2 med ett pH av ca 7,4: Tabell 2 NaCl 8 g KHZPO4 0,2 g Na2HPO312H20 2,9 g KCl 0,2 g H20 1 liter I samtliga fall kan också en passande mängd PEG sättas till buffertlösningen. Om en icke buffrad vattenlösning av PEG har tillsatts kan också en buffertlösning tillsättas med serumet. Det har visat sig att titrerplattan, provröret eller liknande bör vara utformat av plast eftersom den en- ligt uppfinningen användbara nonjoniska polymeren ej ger adekvat vidhäftning till substratet med andra material. En rad olika material kan användas om de uppvisar erforderliga egenskaper för användning vid förfarandet enligt uppfinning- en. ' ' Appliceringen av serumet och resten av analysen kan utföras på samma sätt som den här beskrivna standardanalysen ELISA, vid vilken ett protein används som antigen, såsom beskrives 1 boken från 1979 med titeln The Enzyme Linkea Immunåi sorbent Assay (ELISA) av Bidwell och Bartlett. Fig. 6 i denna bok är en förteckning över den indirekta metoden för analys av antikroppar, som beskrivs utförd enligt följande: 1. Den relevanta antigenen binds till den fasta fasen och tvättas sedan. 2, Det utspädda testserumet tillsättes och inkuberas, var- efter tvättning företas. 3. Ett enzymmärkt antikropp-immunglobulin tillsättes och får reagera, varefter tvättning upprepas. Omärkt antikropp- -immunglobulin följt av märkt antigen till denna andra 10 15 20 25 30 35 9 458 237 antikropp kan också användas. 4, Enzymsubstratet tillsättes. Nedbrytning av substratet leder till en färgförändring. Omfattningen och graden av färgförändring står i relation till mängden antikropp i testserumet i steg 2.Most preferably, it is desirable to wash the PEG solution out of the wells of the plate P with a buffer solution before reacting the PEG material with the serum containing the immune complex. Typically, a carbonate-bicarbonate buffer solution can be used at a pH of about 7.6 as set forth in Table 1 below: Table 1 Na 2 CO 3 1.5 g NaHCO 3 2.9 g H O 1 liter 458 237. . Other buffer systems can be used such as the phosphate buffer solution in Table 2 with a pH of about 7.4: Table 2 NaCl 8 g KH 2 PO 4 0.2 g Na 2 HPO 3 12H 2 O 2.9 g KCl 0.2 g H 2 O 1 liter In all cases, an appropriate amount of PEG can also be added to the buffer solution. If an unbuffered aqueous solution of PEG has been added, a buffer solution can also be added with the serum. It has been found that the titer plate, test tube or the like should be formed of plastic because the nonionic polymer useful according to the invention does not provide adequate adhesion to the substrate with other materials. A variety of materials can be used if they exhibit the required properties for use in the process of the invention. The application of the serum and the remainder of the assay can be performed in the same manner as the standard assay ELISA described herein, in which a protein is used as an antigen, as described in the 1979 book entitled The Enzyme Linkea Immunosorbent Assay (ELISA) by Bidwell and Bartlett. . Fig. 6 of this book is a list of the indirect method of antibody analysis, which is described as follows: 1. The relevant antigen binds to the solid phase and is then washed. 2, The diluted test serum is added and incubated, after which washing is performed. An enzyme-labeled antibody-immunoglobulin is added and allowed to react, after which washing is repeated. Unlabeled antibody-immunoglobulin followed by labeled antigen to this second antibody can also be used. 4, The enzyme substrate is added. Degradation of the substrate leads to a color change. The extent and degree of color change is related to the amount of antibody in the test serum in step 2.

Sedan titrerplattan P har behandlats så att det uppvisar PEG-skiktet 21 placeras en passande mängd humanserum som skall testas eller kontrollserum eller kontrollösning i en fördjupning 20 i titrerplattan för adsorption av PEG- -skiktet 21. Exempelvis kan 50 valda fördjupningen med en kalibrerad pipett, därefter får fl serum sättas till den ut- stå vid t.ex. 37°C under 1 timme eller längre tid såsom upp till 2 timmar vid lägre temperatur, såsom från 37°C ner till 4°c.After the titer plate P has been treated so as to have the PEG layer 21, an appropriate amount of human serum to be tested or control serum or control solution is placed in a well 20 in the titer plate for adsorption of the PEG layer 21. For example, the well can be selected with a calibrated pipette. then fl serum may be added to it endure at e.g. 37 ° C for 1 hour or longer such as up to 2 hours at lower temperature, such as from 37 ° C down to 4 ° c.

Därefter tvättas skiktet 21, i vilket immunkomplexen adsorberats, företrädesvis tre gånger med en lätt förtvâlad fosfatlösning, såsom fosfatbuffertlösning enligt tabell 2, som försatts med 0,5 ml “Tween 20“, en standarddetergent frän Sigma Chemical, St. Louis, Missuori, USA. Andra ekvivalenta detergenter kan naturligtvis användas. Tvätt- ning utföres företrädesvis tre gånger. Sålunda har en, tvâ, tre och fyra tvättar med olika tester visat att tre tvättar är önskvärda men att den fjärde ej visat sig ge någon pâ- visbar förbättring i testets noggrannhet.Thereafter, the layer 21 in which the immune complexes are adsorbed is preferably washed three times with a slightly saponified phosphate solution, such as phosphate buffer solution according to Table 2, which is added with 0.5 ml of "Tween 20", a standard detergent from Sigma Chemical, St. Louis, Missuori, USA. Other equivalent detergents can, of course, be used. Washing is preferably performed three times. Thus, one, two, three and four washes with different tests have shown that three washes are desirable but that the fourth has not been shown to give any demonstrable improvement in the accuracy of the test.

Efter tvättningen kan den relativa mängden immunkomplex bundet till PEG bestämmas med den konventionella radioaktiva metoden, innebärande t.ex. användning av anti IgG-I125, borttvättning av överskottet av den senare och mätning av mängden immunkomplex som reagerat med användning av en scintillationsräknare för bestämning av närvaron och mängden av radioaktivt material. Det har emellertid visat sig att användning av radioaktivt material kan avvaras och resultaten frambringas snabbare i jämförelse med tidigare tester inne- bärande användning av protein, genom att utföra en enzym- bunden immunosorbentanalys, dvs. ELISA-test beskrivet på 458 237 - 10 10 15 20 25 30 35 många ställen i litteraturen och specifikt här ovan. Tidiga- re tester har som nämnts använt protein endast för att be- stämma immunkomplex och ej en icke proteinhaltig, non- jonisk organisk polymer. Föreliggande uppfinning inkluderar sålunda tillsättandet av en antikropp-immunglobulin såsom anti-human IgG kopplat till ett enzym, en konventionell pro- dukt tillgänglig frân Sigma Chemical. Sedan enzymet till- satts får skiktet stå t.ex. vid 37°C under upp till 2 tim- mar, varefter det tvättas ca fyra gånger med fosfatbuffert-- detergentlösningen i tabell 2 eller denna'fosfatbuffertlösning. försatt med 9% PEG.After washing, the relative amount of immune complexes bound to PEG can be determined by the conventional radioactive method, involving e.g. use of anti IgG-I125, washing away the excess of the latter and measuring the amount of immune complexes reacted using a scintillation counter to determine the presence and amount of radioactive material. However, it has been found that the use of radioactive material can be dispensed with and the results produced more rapidly compared to previous tests involving the use of protein, by performing an enzyme-linked immunosorbent assay, ie. ELISA tests described at 458 237 - 10 10 15 20 25 30 35 many places in the literature and specifically above. Previous tests have, as mentioned, used protein only to determine immune complexes and not a non-proteinaceous, nonionic organic polymer. Thus, the present invention includes the addition of an antibody immunoglobulin such as anti-human IgG coupled to an enzyme, a conventional product available from Sigma Chemical. After the enzyme has been added, the layer is allowed to stand e.g. at 37 ° C for up to 2 hours, after which it is washed about four times with the phosphate buffer-detergent solution in Table 2 or this phosphate buffer solution. provided with 9% PEG.

När det valda enzymet är ett fosfatas bör substratet före- trädesvis vara p-nitrofenylfosfat och koncentrationen i storleksordningen 1 mg per ml medan 200 l av substratlös- ningen i tabell 3 därefter tillsättes varje fördjupning i plattan. När det valda enzymet är en peroxidas kan substratet var fenylendiaminfosfat med en liten mängd H2O2.When the enzyme selected is a phosphatase, the substrate should preferably be p-nitrophenyl phosphate and the concentration in the order of 1 mg per ml, while 200 l of the substrate solution in Table 3 is then added to each well in the plate. When the enzyme selected is a peroxidase, the substrate may be phenylenediamine phosphate with a small amount of H2O2.

När det valda enzymet är B-galaktosidas kan substratet vara en galaktosid. För andra typer av antikroppkopplade enzymer kan naturligtvis andra lämpliga substrat användas.When the enzyme selected is β-galactosidase, the substrate may be a galactoside. For other types of antibody-linked enzymes, of course, other suitable substrates may be used.

Valet av lämpligt substrat ligger inom ramen för fackmannens kompetens inom omrâdet immunoanalys.The choice of suitable substrate is within the scope of the person skilled in the art in the field of immunoassay.

Efter ovannämnda steg är nästa reaktion med ett färgreagens, såsom genom tillsats av ett substrat specifikt för enzymet som tillsatts lösningen i tabell 3 vid pH 9,8: Tabell 3 Dietanolamin 10 g MgCl2-6H20 100 mg H20 800 ml Reaktionen med färgreagenset, som äger rum vid rumstempera- tur, ger en färgförândring, om någon sådan sker, inom ca 30 minuter. Reaktionen alstrar en färgförändring beroende på mängden immunkomplex som är bundet till plattan. En färg- reaktion från frånvaro av färg till en mycket svag gul färg- 10 15 20 25 30 35 “l 458 237 representerar mindre än en signifikant mängd immunkomplex.After the above steps, the next reaction with a dye reagent, such as by adding a substrate specific for the enzyme added to the solution in Table 3 at pH 9.8: Table 3 Diethanolamine 10 g MgCl 2 -6H 2 O 100 mg H 2 O 800 ml The reaction with the dye reagent room at room temperature, gives a color change, if any, within about 30 minutes. The reaction produces a color change depending on the amount of immune complex bound to the plate. A dye reaction from the absence of dye to a very faint yellow dye represents less than a significant amount of immune complex.

En intensivt gul färg kan representera en förhållandevis stor mängd immunkomplex. En spektrofotometer av den typ som vanligen används för dokumentering av resultaten vid ett ELISA-test, är i allmänhet mera pålitlig än det mänskliga ögat. En sådan spektofotometer bör förslagsvis avläsas vid en absorbans av 405 nanometer för ett fosfattvättat substrat. Typiskt bör ett sådant substrat åstadkomma ett avläst värde mindre än 0,060 O.D.-enheter vid observation av ett normalt serum. Omvänt har ett värmeaggregerat human- gammaglobulin upphettat till 63°C under 30 minuter fram- bringat ett värde högre än 0,060 O.D.An intense yellow color can represent a relatively large amount of immune complexes. A spectrophotometer of the type commonly used to document the results of an ELISA test is generally more reliable than the human eye. Such a spectrophotometer should preferably be read at an absorbance of 405 nanometers for a phosphate-washed substrate. Typically, such a substrate should provide a read value less than 0.060 O.D. units when observing a normal serum. Conversely, a heat-aggregated human gamma globulin heated to 63 ° C for 30 minutes produced a value higher than 0.060 O.D.

Bestämning av den exakta identiteten av antigenkomponenten i ett cirkulerande immunkomplex utgör ett värdefullt hjälp- medel för diagnos av det förorsakande tillståndet eller syndromet som leder till framkallandet av patologiska nivåer av ett cirkulerande immunkomplex och kan förse läkaren eller veterinären med värdefull etiologisk information om aktuella förhöjda cirkulerande immunkomplexnivâer liksom prognosen för själva sjukdomen. Som nämnts kan en fast bärare med anordningar för att ta emot ett beläggningsskikt av 9-10% polyetylenglykol eller annan lämplig polymer och även ett vätskeprov, dvs. en kroppsvätska från däggdjur eller fåglar eller liknande användas för att underlätta kvalitativ eller kvantitativ bedömning av det cirkulerande immunkomplexet.Determining the exact identity of the antigenic component of a circulating immune complex is a valuable tool for diagnosing the causative condition or syndrome that leads to the induction of pathological levels of a circulating immune complex and can provide the physician or veterinarian with valuable etiological information on current elevated circulating immune complex levels as well as the prognosis for the disease itself. As mentioned, a solid support with devices for receiving a coating layer of 9-10% polyethylene glycol or other suitable polymer and also a liquid sample, i.e. a body fluid from mammals or birds or the like is used to facilitate qualitative or quantitative assessment of the circulating immune complex.

Detta test skiljer sig från den tidigare beskrivningen med användning av antingen en blandning eller en monoblandning av monoklona eller polyklona antikroppar med specificiteter för antigenerna relevanta mot eller specifika för olika cirkulerande immunkomplexrelaterade sjukdomar. De anti- kroppsreagens som används för att bistå vid identifieringen av antigenkomponenten i systemisk lupus erytematosus har sålunda en specificitet för nativ DNA medan de antikropp- reagens som används för att bistå vid identifieringen av reumatoid artrit har specificitet för olika ledkomponenter, såsom kollagen, elastin och liknande. Det bör framhållas att detta är avsett att användas som en separat immunoanalys efter den inledande användningen av det antikroppisotypa 458 237 _ 12 10 15 20 25 30 35 specificitetstestet beskrivet nedan. Möjligheten att kunna bestämma den exakta naturen hos antigenkomponenten i det cirkulerande immunkomplexet är en utomordentligt viktig och önskvärd egenskap hos en analysmetod för cirkulerande immunkomplex. För ett sådant test används en fast bärare av plast anpassad att kunna ta emot ett testprov, såsom ett provrör, mikrotitrerplatta, polymerpapper, skiva eller kort med fördjupningar eller urtag. Den fastazbäraren är formad av en lämplig polymer, företrädesvis av en sådan polymer som polystyren eller polyvinylklorid. För att testa många prover kan man använda en mikrotitrerplatta med 96 fördjup- ningar, en kyvettkassett med 50 fördjupningar eller på annat sätt utformad fast bärare, så att horisontella och vertikala rader av fördjupningar med lämpliga indikerings- system kan identifiera varje enskilt prov.This test differs from the previous description using either a mixture or a monoblend of monoclonal or polyclonal antibodies with specificities for the antigens relevant to or specific for various circulating immune complex-related diseases. Thus, the antibody reagents used to assist in the identification of the antigenic component of systemic lupus erythematosus have a specificity for native DNA, while the antibody reagents used to assist in the identification of rheumatoid arthritis have specificity for various joint components, such as collagen, elastin and similar. It should be noted that this is intended to be used as a separate immunoassay after the initial use of the antibody isotype 458 237 _ 12 10 15 20 25 30 35 35 35 specificity test described below. The ability to determine the exact nature of the antigenic component of the circulating immune complex is an extremely important and desirable feature of a circulating immune complex assay method. For such a test, a solid plastic carrier adapted to be able to receive a test sample is used, such as a test tube, microtiter plate, polymer paper, disk or card with depressions or recesses. The fastaz carrier is formed of a suitable polymer, preferably of a polymer such as polystyrene or polyvinyl chloride. To test many samples, one can use a 96-well microtiter plate, a 50-well cuvette cassette or otherwise designed solid support, so that horizontal and vertical rows of wells with suitable indication systems can identify each individual sample.

Såsom också nämnts tidigare används en lösning av en icke proteinhaltig, nonjonisk organisk polymer med förmåga att kunna adsorbera immunkomplex, likaså som beläggning av den fasta bäraren, varvid den nonjoniska polymeren _ är polyetylenglykol eller PEG. Använd PEG kan ha en molekyl- vikt upp emot ca 20000 med en föredragen molekylvikt av 6000-8000. En lösning av PEG med en föredragen koncentra- tion av 9-10% införes.i varje fördjupning i den fasta bäraren. Efter en inkubationsperiod av mindre än 12 timmar vid 4°c avhälies överskottet av Pas-lösning från den fasta bäraren kvarlämnande ett beläggningsskikt av PEG som häftar vid väggarna i varje fördjupning som finns i den fasta bäraren. Den fasta bäraren innehållande PEG kan förvaras vid 4°C under upp till 60 dagar om den är försluten på lämpligt sätt.As also mentioned previously, a solution of a non-proteinaceous nonionic organic polymer capable of adsorbing immune complexes is used, as well as coating the solid support, the nonionic polymer being polyethylene glycol or PEG. Used PEG can have a molecular weight up to about 20,000 with a preferred molecular weight of 6,000-8,000. A solution of PEG with a preferred concentration of 9-10% is introduced into each well of the solid support. After an incubation period of less than 12 hours at 4 ° C, the excess Pas solution is removed from the solid support leaving a coating layer of PEG which adheres to the walls in each well located in the solid support. The solid support containing PEG can be stored at 4 ° C for up to 60 days if properly sealed.

Efter borttagandet av överskott av PEG från den fasta bäraren är det önskvärt att tvätta fördjupningarna med en buffertlösning innan PEG-beläggningen får reagera med kroppsvätskor innehållande cirkulerande immunkomplex.After removing excess PEG from the solid support, it is desirable to wash the wells with a buffer solution before the PEG coating is allowed to react with body fluids containing circulating immune complexes.

Typiskt kan en fosfatbuffrad koksaltlösning användas såsom vid ett pH av 7,4 1 eller 2. -7,6, såsom anges i ovan angivna tabeller 10 15 20 25 30 35 13 458 2371 Prover av kroppsvätska, såsom plasma, serum, tårar, saliv, semen, urin, peritoneala aspirat, intestinala aspirat, lungaspirat eller cerebral spinalvätska, från patienter som lider av eller misstänks lida av reumatoid artrit, systemisk lupus erytematosus eller olika andra cirkulerande immunkomplexrelaterade sjukdomar liksom kontrollprover, sättes till den PEG-behandlade bäraren, såsom 25lpl, med en kalibrerad pipett till fördjupningarna 20 i plattan P. Varje prov belägger och blir fäst vid PEG-materialet i bäraren, som därefter tvättas tre gånger, såsom med fosfatbuffertlös- ningen i tabell 2 försatt med "Tween 20" på ovan beskrivet sätt. Efter tvättningen inkuberas proverna under ca 1,5 timmar vid 37°C, varefter tvättas tre gånger med fosfat- buffertlösningen enligt tabell 2 försett med “Tween 20" på ovan beskrivet sätt. Därefter införes 1 varje fördjupning i den fasta bäraren en utspädd enzymkonjugerad blandning av antingen monoklona eller polyklona antikroppar med passande antigenspecificitet såsom beskrivits ovan och får inkubera under upp till 45 minuter vid 37°C. Exempel på tillgängliga monoklona antikroppar användbara i samband med uppfinningen för bestämning av antigenspecificitet inkluderar anti-leu 1, anti-leu 2, anti-leu 3, anti-leu 4, anti-leu 5, anti-leu 7, anti-leu 10, anti-leu 11 och anti-leu 12 samt anti-leu M1, anti-leu M2, anti HLA DR, anti leucocyte och anti IgG.Typically, a phosphate buffered saline solution can be used as at a pH of 7.4 1 or 2. -7.6, as indicated in the above tables 10 15 20 25 30 35 13 458 2371 Samples of body fluid, such as plasma, serum, tears, saliva , semen, urine, peritoneal aspirates, intestinal aspirates, lung aspirates or cerebral spinal fluid, from patients suffering from or suspected of suffering from rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus or various other circulating immune complex-related diseases as well as control samples, are added to the PEG-treated vehicle, , with a calibrated pipette to the recesses 20 in the plate P. Each sample is coated and attached to the PEG material in the support, which is then washed three times, as with the phosphate buffer solution in Table 2 supplemented with "Tween 20" as described above. After washing, the samples are incubated for about 1.5 hours at 37 ° C, then washed three times with the phosphate buffer solution according to Table 2 provided with "Tween 20" as described above, then a diluted enzyme-conjugated mixture is introduced into each well of each well in the solid support. of either monoclonal or polyclonal antibodies with appropriate antigen specificity as described above and allowed to incubate for up to 45 minutes at 37 ° C. Examples of available monoclonal antibodies useful in the invention for determining antigen specificity include anti-leu 1, anti-leu 2, anti-leu 3, anti-leu 4, anti-leu 5, anti-leu 7, anti-leu 10, anti-leu 11 and anti-leu 12 and anti-leu M1, anti-leu M2, anti HLA DR, anti leukocyte and anti IgG.

Efter en tvättning med bufferten enligt tabell 1 tre gånger införes SOIPI av enzymsubstratet i varje fördjupning i den fasta bäraren. Enzymsubstratreaktionen inträder under nedbrytning av substratet och resulterar i en färgförändr- ring. Denna reaktion får äga rum vid rumstemperatur under mindre än 20 minuter. Många enzymsystem kan tillämpas i detta sammanhang, såsom peroxidas, fosfatas eller B-galakto- sidas, såsom beskrivits ovan.After washing with the buffer according to Table 1 three times, SOIPI of the enzyme substrate is introduced into each well of the solid support. The enzyme substrate reaction occurs during degradation of the substrate and results in a color change. This reaction is allowed to proceed at room temperature for less than 20 minutes. Many enzyme systems can be used in this context, such as peroxidase, phosphatase or β-galactosidase, as described above.

Efter avslutad enzymsubstratinkubation införes 50 fl av en 2,5 M HZSO4 bäraren. Denna lösning stoppar helt enkelt enzymsubstrat- -stopplösning i varje fördjupning av den fasta reaktionen och stabiliserar därför färgförändringen som inträtt under densamma. I detta skede kan färgförändringarna 458 237 . . 14 10 15 20 25 30 35 som inträffat i fördjupningarna i den fasta bäraren uppmätas antingen visuellt eller med spektrofotometer. Värden som uppnåtts med okända prover bör jämföras med standardprover med känd antigenspecificitet, så att exakt antigenkarakterise- ring av okända prover kan tillskrivas okända prover. Även om en analys av humanprover beskrivits ovan bör det påpekas att sådan analys fungerar lika väl för kroppsvätskor från andra däggdjur eller fåglar.After completion of the enzyme substrate incubation, 50 μl of a 2.5 M H 2 SO 4 support is introduced. This solution simply stops the enzyme substrate stop solution in each well of the solid reaction and therefore stabilizes the color change that has occurred during it. At this stage, the color changes may 458 237. . 14 10 15 20 25 30 35 which has occurred in the depressions in the solid support are measured either visually or with a spectrophotometer. Values obtained with unknown samples should be compared with standard samples with known antigen specificity, so that exact antigen characterization of unknown samples can be attributed to unknown samples. Although an analysis of human samples has been described above, it should be noted that such an analysis works equally well for body fluids from other mammals or birds.

Bestämning av den isotypa (antikroppklass och/eller under- klass) specificiteten hos antikroppkomponenten i ett cirkulerande immunkomplex bidrar till att kasta ljus över såväl ursprunget som prognosen för sjukdomen och är till hjälp i samband med bestämmandet av den exakta identiteten av antigenkomponenten i det cirkulerande immunkomplexet, varvid såväl sådan bestämning som föreliggande bestämning är till hjälp i samband med bestämmandet av mängden immun- komplex. Liksom tidigare behandlas en fast bärare anpassad att ta upp ett testprov, såsom ett provrör, mikrotitrer- platta, skiva eller kort i enlighet med föreliggande uppfin- ning för användning vid den kvantitativa bedömningen av nivàn och antikroppklassen eller underklassen av cirkuleran- de immunkomplex av det slag som finns närvarande i ett prov från human kroppsvätska från patienter som lider av miss- tänkt reumatoid artrit, systemisk lupus erytematosus eller andra cirkulerande immunkomplexrelaterade sjukdomar. En fast bärare av ovannämnt slag används. Stegen vid denna analys kan väsentligen vara desamma som beskrivits ovan i samband med bestämmandet av den exakta identiteten hos antigenkomponenten i immunkomplexet med undantag av att man använder ett enzymmärkt, isotypspecifikt antikropp-konjugat.Determining the isotype (antibody class and / or subclass) specificity of the antibody component of a circulating immune complex helps to shed light on both the origin and prognosis of the disease and is helpful in determining the exact identity of the antigen component of the circulating immune complex. , both such determination and the present determination being helpful in determining the amount of immune complex. As before, a solid support adapted to take up a test sample, such as a test tube, microtiter plate, wafer or card according to the present invention is treated for use in the quantitative assessment of the level and antibody class or subclass of circulating immune complexes of the stroke present in a sample of human body fluid from patients suffering from suspected rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus or other circulating immune complex-related diseases. A solid support of the above kind is used. The steps in this assay may be substantially the same as described above in determining the exact identity of the antigenic component of the immune complex except for the use of an enzyme-labeled, isotype-specific antibody conjugate.

Sådana konjugat är monoklona eller polyklona antikroppar till immunglobuliner specifika för en klass, såsom anti- -human IgE, anti-human IgG, anti-human IgA, anti-human IgD, anti-human IgG4 eller anti-human IgM, var och en fäst till ett passande enzym. Det utspädda konjugatet, t.ex. 1:1000, sättes till fördjupningarna, i vilka proven adsorberats av polymeren på bäraren, såsom 25lfl i varje fördjupning, och får reagera under 30 minuter under inkubation vid 37°C. 10 15 20 25 30 35 15 458 237 Efter tvättning tre gånger med buffert för att befria för- djupningarna från överskott av antikropp-konjugat införes 50pPl enzymsubstrat i varje fördjupning i den fasta bäraren.Such conjugates are monoclonal or polyclonal antibodies to immunoglobulins specific for a class, such as anti-human IgE, anti-human IgG, anti-human IgA, anti-human IgD, anti-human IgG4 or anti-human IgM, each attached to a suitable enzyme. The diluted conjugate, e.g. 1: 1000, is added to the wells in which the samples are adsorbed by the polymer on the support, such as 25 μl in each well, and is allowed to react for 30 minutes while incubating at 37 ° C. After washing three times with buffer to rid the wells of excess antibody-conjugate, 50 μl of enzyme substrate is introduced into each well of the solid support.

Enzymsubstratreaktionen får ske under nedbrytning av substratet och resulterar i en färgförändring. För ett per- oxidas-0-fenylendiaminenzymsubstratsystem är det fungerande substratet sammansatt av nedanstående komponenter: Tabell 4 fosfatbuffrad koksaltlösning 25,00 ml O-fenylendiamin 10,00 mg 30 % väteperoxid 8 , 25 )1l Användningen av isotypa specifika antikroppkonjugat kan också konjugeras med vilket som helst lämpligt enzymsystem, såsom B-galaktosidaset eller fosfatasenzymsystemen.The enzyme substrate reaction may take place during degradation of the substrate and results in a color change. For a peroxidase-O-phenylenediamine enzyme substrate system, the functional substrate is composed of the following components: Table 4 phosphate buffered saline 25.00 ml O-phenylenediamine 10.00 mg 30% hydrogen peroxide 8, 25) The use of isotypic specific antibody conjugates can also be conjugated any suitable enzyme system, such as the β-galactosidase or phosphatase enzyme systems.

Efter en enzym-substratreaktionstid av ca 20 minuter in- föres en 2,5 M HZSO4 stopplösning i var och en av fördjup- ningarna i den fasta bäraren. Därefter kan den relativa färgförändringen som ägt rum i varje fördjupning i den fasta bäraren mätas antingen visuellt eller med spektro- fotometer.After an enzyme-substrate reaction time of about 20 minutes, a 2.5 M H 2 SO 4 stop solution is introduced into each of the wells of the solid support. Thereafter, the relative color change that has occurred in each well of the solid support can be measured either visually or with a spectrophotometer.

Kommersiellt tillgänglig polyetylenglykol eller PEG (såsom denna term förstås) kan tänkas vara mera effektiv än en nonjonisk organisk polymer som är potentiellt reagerbar eller fysikaliskt kompatibel med såväl plattan P som prov- röret T och immunkompleken, såsom dextran eller polyvinyl- klorid, eftersom den senare är mindre effekt och mindre selektiv än polyetylenglykol. Det är tänkbart ehuru ej definitivit fastlagt att växelverkan med immunkomplex kan bero på sterisk exklusion av komplexen från omrâdet för PEG baserat på immunprecipiteringsegenskaper hos PEG-materialet enligt vad som föreslagits av Rampling, W. W. Biochemical Journal (1974). Föreliggande upptäckt är oväntad eftersom polymeren är orörlig på en fast bärare och inte rörlig i lösningen såsom rapporterats, varför teorin med steriskt 458 237 10 15 20 25 30 35 16 hinder ej tycks kunna förklara de här observerade resulta- ten.Commercially available polyethylene glycol or PEG (as this term is understood) may be more effective than a nonionic organic polymer which is potentially reactive or physically compatible with both the plate P and the test tube T and the immune complex, such as dextran or polyvinyl chloride, since the latter is less effective and less selective than polyethylene glycol. It is conceivable, although not definitively established, that interaction with immune complexes may be due to steric exclusion of the complexes from the region of PEG based on immunoprecipitating properties of the PEG material as suggested by Rampling, W. W. Biochemical Journal (1974). The present discovery is unexpected because the polymer is immobile on a solid support and not mobile in the solution as reported, so the theory of steric hindrance does not seem to explain the results observed here.

I vilket fall som helst har användningen av PEG eller någon annan polymer enligt uppfinningen ej föreslagits eller un- dersökts för adsorption av ett immunkomplex på en fast bära- re av här framställt slag.In any case, the use of PEG or any other polymer of the invention has not been proposed or investigated for adsorption of an immune complex on a solid support of the type prepared herein.

Man kan enligt uppfinningen utnyttja bildning och mätning av immunkomplex bildade in vitro för att bestämma den even- tuella närvaron eller frånvaron av ett förutbestämt miss- tänkt tillstånd hos patienten.According to the invention, it is possible to use the formation and measurement of immune complexes formed in vitro to determine the possible presence or absence of a predetermined suspected condition in the patient.

Ett prov av samma serum som också testats utan sådan reak- tion, kan i ett provrör bringas att reagera med den misstänk- ta antigenen, vilket kan resultera i bildning av immunkomp- lex. För att testa med avseende på hepatitantikroppar kan t.ex. ett prov av serumet i ett provrör bringas att reagera med hepatitvirus, såsom under 1 timme vid 37°C och efterföl- jande försiktig skakning.A sample of the same serum that has also been tested without such a reaction can be reacted with the suspected antigen in a test tube, which may result in the formation of an immune complex. To test for hepatitis antibodies, e.g. a sample of the serum in a test tube is reacted with hepatitis virus, such as for 1 hour at 37 ° C and subsequent gentle shaking.

Produkten kan användas som ett prov vid en test enligt upp- finningen med ett annat prov utgörande serum, som ej bringas att reagera med viruset.The product can be used as a sample in a test according to the invention with another sample constituting serum, which is not reacted with the virus.

Om då provet, som bringats att reagera med hepatitvirus fram- bringar en kraftig reaktion med avseende på närvaron av im- munkomplex medan det normala serumet frambringar en mycket lägre reaktion men visar närvaron av immunkomplex, är detta resultat en indikation på ett antikropparna som är specifi- ka för hepatit produceras som ett resultat av närvaron av im- munkomplex.If then the sample, which has been reacted with hepatitis virus, produces a strong reaction with respect to the presence of immune complexes while the normal serum produces a much lower reaction but shows the presence of immune complexes, this result is an indication of an antibody which is specific ka for hepatitis is produced as a result of the presence of immune complexes.

För att undersöka närvaron av ett sjukdomstillstånd tlll följd avnâgon annan specifik sjukdom kan en bakterie, som alstrar denna sjukdom bringas att reagera med ett prov av serumet och en jämförelse mellan resultaten av detta test med sådant omsatt serum med testet för normalt serum är en 10 15 20 25 30 35 17 458 237 indikation på huruvida närvaron av immunkomplex beror av sådana bakterier. För att ett test skall indikera närvaron eller frånvaron av reumatoid artrit kan ett prov av serumet från en patient bringas att reagera med humanimmunglobulin G (IgG), som fungerar som antigen för bildning av immun- komplex. När det sålunda reagerade provet testas tillsammans med ett normalt serumprov är ett jämförelsevis högt avläst värde för provet omsatt med IgG och ett jämförelsevis lägre värde för det normala (icke omsatta) provet, en indikation på närvaron av immunkomplexen frambringade av antikropp mot IgG. På liknande sätt kan DNA sättas till ett serumprov i avsikt att bestämma närvaron eller frånvaron av systemisk lupus erytematosus, dvs. SLE. Liknande indikation med av- seende på andra misstänkta sjukdomstillstånd kan erhållas genom att sätta ett passande virus, bakterier,e1ler andra antigener till ett serumprov och samtidigt testa ett normalt (oreagerat) serumprov. Ändamålsenligheten med den fasta bäraren omsatt med poly- meren och serumtestet för en klass av immunkomplex demonstreras med efterföljande exempel.To examine the presence of a disease state due to any other specific disease, a bacterium which produces this disease may be reacted with a sample of the serum and a comparison of the results of this test with such reacted serum with the test for normal serum is a 20 25 30 35 17 458 237 indication of whether the presence of immune complexes is due to such bacteria. In order for a test to indicate the presence or absence of rheumatoid arthritis, a sample of the serum from a patient may be reacted with human immunoglobulin G (IgG), which acts as an antigen for the formation of immune complexes. When the sample thus reacted is tested together with a normal serum sample, a comparatively high reading value for the sample is digested with IgG and a comparatively lower value for the normal (unreacted) sample is an indication of the presence of the immune complexes produced by antibody to IgG. Similarly, DNA can be added to a serum sample for the purpose of determining the presence or absence of systemic lupus erythematosus, i.e. SLE. A similar indication with regard to other suspected disease states can be obtained by adding a suitable virus, bacteria, or other antigens to a serum sample and at the same time testing a normal (unreacted) serum sample. The suitability of the solid support reacted with the polymer and the serum test for a class of immune complexes is demonstrated by the following examples.

Exempel 1 En titrerplatta motsvarande plattan P i fig. 1 användes. En karbonat-bikarbonatbuffertlösning enligt tabell 1 inne- hållande 9% PEG med en molekylvikt av ca 6000 sattes till fördjupningarna 20 och plattan fick stå under 12 timmar vid 37°C, varefter överskottet av lösning skakades av så att man fick skikten 21 i fig. 2 i fördjupningarna 20. Därefter placerades dubbla prover av humanserum erhållet från olika patienter på ett sjukhus i 72 av de 96 fördjupningarna i plattan. Dessutom placerades negativa kontrollprover av serum från nyfödda barn som sannolikt inte hade några immun- komplex i 21 av fördjupningarna medan fyra positiva kontroll- prov bestående av serum från patienter som kliniskt diagnostiserats såsom havande reumatoid artrit, placerades i fyra av fördjupningarna. Likaså placerades i en fördjup- ning ett kontrollprov för att testa funktionen av Ä '4ss 257 18 10 15 20 25 30 35 substratet bestående av anti-human IgG antigenmärkt med ett fosfatasenzym. Efter tillsats av serumet och prov fick plattan stå under 1 timme vid 37°C för att låta immun- komplexen om sådana fanns i serumproven reagera med PEG- -skikten. Därefter tvättades fördjupningarna tre gånger med fosfatbuffertlösningen enligt tabell 2 försatt med 0,5 ml detergent "Tween 20".Example 1 A titer plate corresponding to the plate P in Fig. 1 was used. A carbonate-bicarbonate buffer solution according to Table 1 containing 9% PEG having a molecular weight of about 6000 was added to the wells 20 and the plate was allowed to stand for 12 hours at 37 ° C, after which the excess solution was shaken to give layers 21 in FIG. 2 in the wells 20. Subsequently, duplicate samples of human serum obtained from different patients were placed in a hospital in 72 of the 96 wells in the plate. In addition, negative control samples of serum from newborns who were likely to have no immune complexes were placed in 21 of the wells, while four positive control samples consisting of serum from patients clinically diagnosed as having rheumatoid arthritis were placed in four of the wells. Also, a control sample was placed in a well to test the function of the substrate consisting of anti-human IgG antigen labeled with a phosphatase enzyme. After addition of the serum and sample, the plate was allowed to stand for 1 hour at 37 ° C to react the immune complexes, if any, in the serum samples with the PEG layers. Then the wells were washed three times with the phosphate buffer solution according to Table 2 supplemented with 0.5 ml of detergent "Tween 20".

Efter tvättningen tillsattes antihuman IgG immunglobulin märkt med ett fosfatasenzym till fördjupningarna och fick inkubera under 2 timmar vid 37°C. Efter inkuberingen av- lägsnades överskottet av antisera och plattan tvättades tre gånger med fosfatbuffertlösningen i tabell 2 innehållande detergent “Tween 20".After washing, anti-human IgG immunoglobulin labeled with a phosphatase enzyme was added to the wells and allowed to incubate for 2 hours at 37 ° C. After the incubation, the excess antisera was removed and the plate was washed three times with the phosphate buffer solution in Table 2 containing detergent "Tween 20".

Efter tvättningen sattes till varje fördjupning en di- etanolaminlösning enligt tabell 3 försatt med p-nitrofenyl- fosfat såsom beskrivits ovan och eventuell reaktion fick äga rum. Efter 30 minuter 37°C uppmättes färgen pâ de rea- gerade skikten i respektive fördjupningarmed en spektro- fotometer avläst vid en absorbans av 405 nanometer. Som väntat hade fördjupningen innehållande substratfunktions- testet dvs. enzymmärkt antihuman IgG antiserum ett värde av 2,0 medan 20 av de 21 antaget normala proven eller nega- tiva kontrollprover uppvisade värden från 0,001 till 0,07 och tvâ visade 0,000 medan ett antaget normalt prov visade 0,793, vilket tydde på en sjukdom av immunkomplextyp.After washing, to each well was added a diethanolamine solution according to Table 3 supplemented with p-nitrophenyl phosphate as described above and any reaction was allowed to proceed. After 30 minutes at 37 ° C, the color of the reacted layers in the respective wells was measured with a spectrophotometer read at an absorbance of 405 nanometers. As expected, the depression containing the substrate function test, ie. enzyme-labeled antihuman IgG antiserum had a value of 2.0 while 20 of the 21 assumed normal samples or negative control samples showed values from 0.001 to 0.07 and two showed 0.000 while an assumed normal sample showed 0.793, which indicated an immune complex type disease .

Resterande testvärden låg mellan 0,02 och 0,575 med skill- naderna för dubbla prover approximerande skillnaderna för dubbla prover inom uppfinnarens erfarenhet beträffande användning av en proteinbeläggning på en fast bäraren av plast och en ELISA-analys eller en radioimmunoanalys med Raji-cell. Man kunde sålunda dra slutsatsen att ovannämnda test var lika tillförlitlig som radioimmunoanalys och ELISA-analys båda utnyttjande protein som skikt som reagerar med plast.Residual test values ranged from 0.02 to 0.575 with the differences for duplicate samples approximating the differences for duplicate samples within the inventor's experience regarding the use of a protein coating on a solid plastic support and an ELISA assay or a Raji cell radioimmunoassay. Thus, it could be concluded that the above test was as reliable as radioimmunoassay and ELISA assay both utilizing protein as a layer that reacts with plastic.

Exempel 2 En titrerplatta motsvarande plattan P i fig. 1 behandlades 10 15 20 25 30 35 19 458 237 på samma sätt som i exempel 1 för frambringande av PEG-skikt 21 i fig. 2. Därefter placerades 32 humanserumprover er- hållna från ett sjukhus i 64 fördjupningar i titrerplattan, dvs. med dubblett för varje prov. 9 negativa kontrollprover, tvâ positiva kontrollprover och en substratkontroll användes också. Samma tillvägagångssätt som i exempel 1 följdes och bedömningen av den uppkomna färgen bedömdes på samma sätt.Example 2 A titer plate corresponding to the plate P in Fig. 1 was treated in the same manner as in Example 1 to produce PEG layer 21 in Fig. 2. Next, 32 human serum samples obtained from a hospital were placed. in 64 depressions in the titer plate, ie. with duplicate for each sample. 9 negative control samples, two positive control samples and one substrate control were also used. The same procedure as in Example 1 was followed and the assessment of the resulting color was assessed in the same way.

Samtliga negativa kontrollprover frambringade ett värde av 0,00 medan de två positiva kontrollproven frambringade av- läsningsvärden 0,78 respektive 0,62 och substratkontroll- provet frambringade en intensiv gul färg och ett värde av 0,881. Det högsta avlästa värdet bortsett från kontrollpro- ven var 0,739 för en patient som var ganska sjuk. 35 av proven frambringade avlästa värden lägre än 0,060 och an- talet beror på det faktum att dubbla prover frambringade ett värde lägre än 0,060 och de andra något högre än 0,060.All negative control samples produced a value of 0.00 while the two positive control samples produced reading values of 0.78 and 0.62, respectively, and the substrate control sample produced an intense yellow color and a value of 0.881. The highest value read apart from the control samples was 0.739 for a patient who was quite ill. 35 of the samples produced read values lower than 0.060 and the number is due to the fact that duplicate samples produced a value lower than 0.060 and the others slightly higher than 0.060.

Av resterande avläsningar låg åtta mellan 0,060 och 0,100, sju låg mellan 0,101 och 0,200, tre låg mellan 0,201 och 0,300, två låg mellan 0,301 och 0,400 medan två dubbelav- läsningar låg över 0,401, nämligen 0,519 och 0,737. Varia- tionen i avläsningarna för dubbelprover låg återigen i linje med uppfinnarens erfarenhet vad beträffar avläsningar frambringade av dubbla prover vid användning av ett protein på en fast plastbärare och en ELISA-analys eller en radio- immunoanalys med Raji-cell.Of the remaining readings, eight were between 0.060 and 0.100, seven were between 0.101 and 0.200, three were between 0.201 and 0.300, two were between 0.301 and 0.400 while two double readings were above 0.401, namely 0.519 and 0.737. The variation in the duplicate sample readings was again in line with the inventor's experience with duplicate sample readings using a protein on a solid plastic support and an ELISA assay or a Raji cell radioimmunoassay.

Efterföljande exempel visar behovet av att upprätthålla vätskeformigt eller vått tillstånd hos polymeren.The following examples illustrate the need to maintain a liquid or wet state of the polymer.

Exempel 3 1 behandla- des på samma sätt som i exempel 1 för frambringande av PEG-skikten 21 i fig. 2. Plattan fick stå oskyddad under fyra dagar vid 37°C. När man sedan önskade använda plattan En titrerplatta svarande mot plattan P i fig. för att testa prover med varmaggregad humangammaglobulin visade det sig att buffertlösningen hade förångats kvar- lämnande ett pulverskikt på plattan, uppenbarligen PEG. 458 10 15 20 25 30 35 237 20 Mycket av detta pulver tvättades bort när en testlösning placerades i en fördjupning, vilket visade att eventuellt tillsatt serum till fördjupningarna skulle tvätta bort pulvret och att plattan ej var användbar för nâgra ytter- ligare steg i detta test.Example 3 1 was treated in the same manner as in Example 1 to produce the PEG layers 21 in Fig. 2. The plate was allowed to stand unprotected for four days at 37 ° C. When it was then desired to use the plate A titer plate corresponding to the plate P in Fig. To test samples with hot aggregate human gamma globulin, it was found that the buffer solution had evaporated leaving a powder layer on the plate, apparently PEG. 458 10 15 20 25 30 35 237 20 Much of this powder was washed away when a test solution was placed in a well, which showed that any serum added to the wells would wash away the powder and that the plate was not useful for any further steps in this test. .

Efterföljande exempel utförda före exempel 1 och 2 visar de jämförande resultaten av tester i enlighet med uppfin- ningen med användning av varmaggregerat humangammaglobulin utnyttjat som positiva kontrollprover i exempel 1 och 2.The following examples carried out before Examples 1 and 2 show the comparative results of tests according to the invention using heat-aggregated human gamma globulin used as positive control samples in Examples 1 and 2.

Exempel 4 En titrerplatta motsvarande plattan P i fig. 1 behandlades på samma sätt som i exempel 1 för_frambringande av PEG- -skikten i fig. 2 medan humanserum upphettades vid 63°C under 30 minuter för erhållande av varmaggregerat human- gammaglobulin. Plattan tvättades med lösningen i tabell 2 försatt med 0,5 ml “Tween 20". Två fördjupningar 20 i fig. 2 fylldes med varmaggregerat gammaglobulin spätt med vatten i ett förhållande 1:4 medan en lösning 1:4 av tvättlösning- en sattes till tvâ andra fördjupningar. Plattan skakades då och då men hölls vid 37°C, tvättades sedan tvâ gånger med tvättlösning som använts enligt ovan. Till var och en av de fyra fördjupningarna sattes en utspädd lösning 1:200 av anti-human IgG kopplat med fosfatasenzym och fick sedan inkubera under 1 timme. Plattan tvättades sedan tvâ gånger med samma tvättlösning och ett p-nitrofenylfosfatsubstrat i mängden 1 mg/ml i substratlösningen i tabell 3 tillsattes.Example 4 A titer plate corresponding to the plate P in Fig. 1 was treated in the same manner as in Example 1 to produce the PEG layers in Fig. 2 while human serum was heated at 63 ° C for 30 minutes to obtain heat aggregated human gamma globulin. The plate was washed with the solution in Table 2 supplemented with 0.5 ml of "Tween 20". Two wells 20 in Fig. 2 were filled with heat-aggregated gamma globulin diluted with water in a ratio of 1: 4 while a 1: 4 solution of the washing solution was added to The plate was occasionally shaken but maintained at 37 ° C, then washed twice with the washing solution used as above, to each of the four wells was added a diluted 1: 200 solution of anti-human IgG coupled with phosphatase enzyme. and then incubated for 1 hour The plate was then washed twice with the same washing solution and a p-nitrophenyl phosphate substrate in the amount of 1 mg / ml in the substrate solution in Table 3 was added.

Efter 40 minuter undersöktes fördjupningarna visuellt och det visade sig att fördjupningarna innehållande tvättlös- ningen båda var klara och utan färg medan fördjupningarna som från början innehöll humangammaglobulinet var klara men hade en intensiv gul färg.After 40 minutes, the depressions were visually examined and it was found that the depressions containing the washing solution were both clear and colorless, while the depressions that originally contained the human gamma globulin were clear but had an intense yellow color.

Exempel 5 En titrerplatta motsvarande plattan P i fig. 1 behandlades på samma sätt som i exempel 1 för frambringande av PEG-skikt 10 15 20 25 30 35 21 458 237 21 i fig. 2 medan ett humanserum upphettades som i exempel 4 för frambringande av humangammaglobulin. Olika prover bereddes med ökande utspädningsgrad såsom framgår av tabell 4 nedan och testet utfördes som i exempel 4 med skillnaden att färgen på substratet uppmättes med en spektro- fotometer ~ som i exempel 1 och 2. De avlästa värdena vid en absorbans av 405 nanometer framgår av nedanstående tabell 5.Example 5 A titer plate corresponding to the plate P in Fig. 1 was treated in the same manner as in Example 1 to produce PEG layer 10 15 20 25 30 35 21 458 237 21 in Fig. 2 while a human serum was heated as in Example 4 to produce humangammaglobulin. Various samples were prepared with increasing dilution as shown in Table 4 below and the test was performed as in Example 4 with the difference that the color of the substrate was measured with a spectrophotometer ~ as in Examples 1 and 2. The readings at an absorbance of 405 nanometers are shown in Table 5 below.

Tabell 5 Utspädning Avläsning på fotospektrometer 1:8 0,360 1:16 0,299 1:32 0,192 1:64 0,101 1:128 0,048 1:256 0,006 1:512 0,000 1:1024 0,000 När ovan erhållna värden fördes in i ett diagram med decimalvärdena angivna som ordinata och utspädningsfaktorer- na uppförda som abskissa på geometrisk basis, dvs. med på varandra följande utspädningar åtskilda med lika stort mellanrum erhölls en rät linje av punkterna för utspäd- ningarna från 1:8 till 1:128. Värdena för utspädningen 1:256 låg ovanför den räta linjen om denna förlängdes medan värdena för 1:512 och 1:1024 låg på abskissaaxeln. Eftersom en sådan rät linje är typisk för tillförlitliga ELISA-tester kunde man konstatera att tillförlitligheten hos föreliggande test hade demonstrerats.Table 5 Dilution Readout on Photo Spectrometer 1: 8 0.360 1:16 0.299 1:32 0.192 1:64 0.101 1: 128 0.048 1: 256 0.006 1: 512 0.000 1: 1024 0.000 When the values obtained above were entered into a diagram with the decimal values given as ordinate and the dilution factors constructed as abscissa on a geometric basis, ie. with successive dilutions separated at equal intervals, a straight line of the points of the dilutions from 1: 8 to 1: 128 was obtained. The values for the 1: 256 dilution were above the straight line if extended, while the values for 1: 512 and 1: 1024 were on the abscissa axis. Since such a straight line is typical of reliable ELISA tests, it could be stated that the reliability of the present test had been demonstrated.

Exempel 6 Fördjupningarna i en titrerplatta motsvarande plattan P belades med en 9%-ig lösning av PEG med en molekylvikt av 6000 och tvättades sedan som i exempel 5. En serie prover framställdes av varmaggregerat gammaglobulin producerat 0458 10 15 20 25 30 35 237 22 som i exempel 4 och vattenlösningar av olika utspädnings- grad framställdes därur med en utspädning som i tabell 4 ovan. För att testa metodens känslighet frystes och tina- des upprepade gånger humanserum för frambringande av aggregerat gammaglobulin och en andra serie prover späddes på samma sätt i vattenlösning som i tabell 5. Därefter sattes 200)ﬂ.Av varje prov till en fördjupning i plattan och underkastades inkubation under 90 minuter vid rums- temperatur. Plattan tvättades sedan tvâ gånger med lösningen i tabell 2 försett med 0,5 ml “Tween 20". Därefter sattes 200 pl anti-human IgG kopplad med fosfatasenzym och spådd 1:500 till varje fördjupning och fick inkubera under 90 minuter och tvättades sedan tvâ gånger med ovannämnda tvätt- lösning. Ett substrat sattes till varje fördjupning, ligen 200 l p-nitrofenylfosfat i substratlösningen i tabell 3 som fått reagera under 40 minuter och därefter sköljts med en 3N Na0H-lösning. näm- Nedanstående tabell 6 visar resultaten av iakttagelser med obeväpnat öga, som ehuru noggrannheten ej var densamma som med en spektrofotometer, var tillräckliga för att visa testets sensitivitet.Example 6 The wells of a titer plate corresponding to plate P were coated with a 9% solution of PEG having a molecular weight of 6000 and then washed as in Example 5. A series of samples were prepared from heat aggregated gamma globulin produced as in Example 4 and aqueous solutions of different degrees of dilution were prepared therefrom with a dilution as in Table 4 above. To test the sensitivity of the method, human serum for producing aggregate gamma globulin was repeatedly frozen and thawed, and a second series of samples were diluted in aqueous solution as in Table 5. Then 200 μl of each sample was added to a well in the plate and subjected to incubation for 90 minutes at room temperature. The plate was then washed twice with the solution in Table 2 supplemented with 0.5 ml of "Tween 20". Then 200 μl of anti-human IgG coupled with phosphatase enzyme was added and diluted 1: 500 to each well and allowed to incubate for 90 minutes and then washed twice. A substrate was added to each well, 200 l of p-nitrophenyl phosphate in the substrate solution of Table 3 which was reacted for 40 minutes and then rinsed with a 3N NaOH solution. Table 6 below shows the results of observations. with an unarmed eye, which although the accuracy was not the same as with a spectrophotometer, were sufficient to show the sensitivity of the test.

Tabell 6 Varmaggregerat Frysta och tinade Utspädning prov prover 1;8 ++ ++ 1:16 ++ ++ 1:64 ++ ++ 1=12s ++ +/- 1:512 +/- - 1:1024 +/- - 1:2048 - - där: ++ anger stark färg +/- svag färg r - klar lösning, utan något gult Följande exempel var ett experiment för att jämföra 10 åw 20 25 23 458 257 polyetylenglykol med en molekylvikt av 20000 med en med molekylvikten 6000: Exempel 7 En 10%-ig lösning av PEG med en molekylvikt av 20000 använ- des för att belägga en platta motsvarande plattan P i-fig. 1 och en 10%-ig lösning av PEG med molekylvikten 6000 använ- des för beläggning av en identisk platta. Båda plattorna tvättades med fosfatlösningen enligt tabell 2 försatt med "Tween 20". Normalt humanserum upphettades som i exempel 4 men serumöverskottet frâncentrifugerades och resten gjordes till dubbelprover med utspädningsgrader som i tabell 7 nedan.Table 6 Heat aggregated Frozen and thawed Dilution sample samples 1; 8 ++ ++ 1:16 ++ ++ 1:64 ++ ++ 1 = 12s ++ +/- 1: 512 +/- - 1: 1024 + / - - 1: 2048 - - where: ++ indicates strong color +/- weak color r - clear solution, without any yellow The following example was an experiment to compare 10 åw 20 25 23 458 257 polyethylene glycol with a molecular weight of 20,000 with a with the molecular weight 6000: Example 7 A 10% solution of PEG with a molecular weight of 20,000 was used to coat a plate corresponding to the plate P in fig. 1 and a 10% solution of PEG with a molecular weight of 6000 was used to coat an identical plate. Both plates were washed with the phosphate solution of Table 2 supplemented with "Tween 20". Normal human serum was heated as in Example 4 but the excess serum was centrifuged off and the residue was made into duplicate samples with dilution rates as in Table 7 below.

Prover av de olika utspädningarna sattes till varje platta och fick stå vid rumstemperatur under 3} timme åtföljda av skakning och följt av tvättning två gånger med den för- tvâlade fosfatlösningen. En lösning 1:200 av antihuman IgG kopplad med ett enzym sattes till varje fördjupning och plattorna skakades i en mikromixer under mellan 10 och 15 minuter, fick sedan inkubera vid 37°C under 30 minuter och vid rumstemperatur under 1š timme. Båda plattorna tvättades sedan med den lätt förtvålade fosfatlösningen och 200lpl p-nitrcfenylfosfatsubstrat tillsattes som i exempel 1 till varje fördjupning. Efter 20 minuter undersöktes fördjup- ningarna innehållande prover visuellt med de i tabell 7 angivna resultaten. 458 10 15 20 25 30 35 237 _ 24 Tabell 7 Utspädning Skikt av PEG 6000 Skikt av PEG 20,000 1:8 ++ - 1:16 ++ +/- 1:32 ++ +/- 1:64 ++ +/- 1:128 ++ + 1:256 +++ +/- 1:512 ++ +/- 1:1024 +++ - 1:2048 - - 1:4096 - - där: +++ anger högsta intensitet ++ anger stark färg +/- anger svag färg - anger klar lösning, ingen färg Av ovan beskrivna test kunde slutsatsen dras att PEG 6000 tycktes reagera effektivare med immunkomplexen.Samples of the various dilutions were added to each plate and allowed to stand at room temperature for 3 hours, followed by shaking followed by washing twice with the saponified phosphate solution. A 1: 200 solution of antihuman IgG coupled with an enzyme was added to each well and the plates were shaken in a micromixer for between 10 and 15 minutes, then incubated at 37 ° C for 30 minutes and at room temperature for 1 hour. Both plates were then washed with the slightly saponified phosphate solution and 200 μl of p-nitrophenyl phosphate substrate was added as in Example 1 to each well. After 20 minutes, the wells containing samples were examined visually with the results given in Table 7. 458 10 15 20 25 30 35 237 _ 24 Table 7 Dilution Layer of PEG 6000 Layer of PEG 20,000 1: 8 ++ - 1:16 ++ +/- 1:32 ++ +/- 1:64 ++ + / - 1: 128 ++ + 1: 256 +++ +/- 1: 512 ++ +/- 1: 1024 +++ - 1: 2048 - - 1: 4096 - - where: +++ indicates the highest intensity + + indicates strong color +/- indicates weak color - indicates clear solution, no color From the tests described above, it could be concluded that PEG 6000 seemed to react more efficiently with the immune complexes.

Det är uppenbart att andra utföringsformer av uppfinningen än de som beskrivits eller antytts ovan kan utnyttjas och att olika förändringar kan utföras utan att man går utanför uppfinningens ram. Exempelvis kan de här beskrivna testerna utformas för att detektera en reducerad nivå av cirkulerande immunkomplex påvisat genom en färgförändring som är mindre än en färgförändring som ett normalt.cirkulerande immun- komplex uppvisar. Detta kan vara en indikation på immuno- suppression antingen till följd av en patologisk immuno- suppressions-sjukdom såsom Acquired Immune Deficiency Syndrome (A.I.D.S.) eller andra eller inducerad genom läke- medelsterapi, antingen oavsiktligt eller på annat sätt, så- som genom användning av immunosuppressiva läkemedel,_sâsom cyklosporin-A använd vid organtransplantationskirurgi.It is obvious that embodiments of the invention other than those described or indicated above can be utilized and that various changes can be made without departing from the scope of the invention. For example, the tests described herein can be designed to detect a reduced level of circulating immune complexes detected by a color change that is less than a color change exhibited by a normal circulating immune complex. This may be an indication of immunosuppression either as a result of a pathological immunosuppression disease such as Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) or others or induced by drug therapy, either unintentionally or otherwise, such as by the use of immunosuppressive drugs, such as cyclosporin-A used in organ transplant surgery.

Claims

10 15 20 25 30 458 237 25 Patentkrav10 15 20 25 30 458 237 25 Patent claims

1. Förfarande för genomförande av immunoassay av ett prov av ett serum eller liknande för bestämning av sammansättningen och/eller koncentrationen av immunkomplex eller aggregerade gammaglobulíner närvarande i provet, k ä n n e t e c k - n a t av att en mottagande del tillhörande en fast bärare behandlas med polyetylenglykol för bildning av ett vätske- filmskíkt av polyetylenglykolen vidhäftande till nämnda mot- tagande del och med förmåga att adsorbera immunkomplex eller aggregerade gammaglobulíner. den sålunda behandlade mottagan- de delen bringas i kontakt med provet som skall analyseras för adsorption av i provet närvarande immunkomplex eller aggregerade gammaglobuliner till polyetylenglykolvätskefilm- skíktet och sålunda adsorberade ímmunkomplex eller aggregera- de gammaglobulíner behandlas så att en indikation om samman- sättningen och/eller koncentrationen av dessa fås fram.Method for carrying out an immunoassay of a sample of a serum or the like for determining the composition and / or concentration of immune complexes or aggregated gamma globulins present in the sample, characterized in that a receiving part belonging to a solid support is treated with polyethylene glycol for forming a liquid film layer of the polyethylene glycol adhering to said receiving member and capable of adsorbing immune complexes or aggregated gamma globulins. the receiving portion thus treated is contacted with the sample to be assayed for adsorption of immune complexes or aggregated gamma globulins present in the sample to the polyethylene glycol liquid film layer and thus adsorbed immune complexes or aggregated gamma globulins are treated so that an indication and composition or composition the concentration of these is obtained.

2. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k_n a t av att polyetylenglykolen har en molekylvíkt mellan ca 2000 och ca 20 000.A process according to claim 1, characterized in that the polyethylene glycol has a molecular weight between about 2000 and about 20,000.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2. k ä n n e t e c k - n a t av att stegen att (al) bäraren. efter bildandet av vätskefílmskiktet av polyetylenglykol därpå. tvättas med en buffertlösninq. (hl) bäraren. efter adsorptíon av immunkomplex eller aggregerade gammaglobulíner på vätskefilmskiktet av poly- etylenglykol. tvättas med en buffertlösning. (cl) en antigen antikroppkomponent kopplad med ett enzym sättes till vätskefilmskiktet och detta skikt får stå en förutbestämd tid. 458 237 10 15 20 25 30 35 26 (dl) skiktet därefter tvättas med en buffertlösning. (el) CES. ett med nämnda komponent reaktívt substrat tillsät- som frambríngar en färgförändring proportionell mot mängden av komponenten kopplad med enzymet. som reagerat med immunkomplex eller aggregerade gammaglobuliner närvarande i skiktet. och (fl) färgförändringen i skiktet mätes med spektrofoto- meter, eller, (az) bäraren. efter bildandet av vätskefilmskiktet av polyetylenglykol därpå, tvättas med en buffertlösning, (bz) aggregerade gammaglobulinen från provet på vätskefilmskiktet av polyetylenglykol. tvättas med en buffertlösníng. bäraren. efter adsorption av immunkomplex eller (cz) antikroppar uppvisande antígenspecificítet sättes till det resulterande skiktet och skiktet får stå en förut- bestämd tid. (dz) skíktet därefter tvättas med en buffertlösning, (ez) ett med antíkroppen reaktívt substrat tillsättes, som frambríngar en färgförändring porportionell mot mängden med enzym kopplad antíkropp som reagerat med i skíktet närvarande immunkomplex eller aggregerade gammaglobuliner. och (f ) 2 färgförändringen i skiktet mäts med spektrofotometer.A method according to claim 1 or 2, characterized in that the steps of the (al) carrier. after the formation of the liquid film layer of polyethylene glycol thereon. washed with a buffer solution. (hl) the carrier. after adsorption of immune complexes or aggregated gamma globulins on the liquid film layer of polyethylene glycol. washed with a buffer solution. (cl) an antigenic antibody component coupled to an enzyme is added to the liquid film layer and this layer is allowed to stand for a predetermined time. 458 237 10 15 20 25 30 35 26 (dl) the layer is then washed with a buffer solution. (el) CES. an additive reactive with said component which produces a color change proportional to the amount of component coupled to the enzyme. which reacted with immune complexes or aggregated gamma globulins present in the layer. and (fl) the color change in the layer is measured with a spectrophotometer, or, (az) the carrier. after the formation of the liquid film layer of polyethylene glycol thereon, washed with a buffer solution, (bz) aggregated gamma globulin from the sample on the liquid film layer of polyethylene glycol. washed with a buffer solution. the carrier. after adsorption of immune complexes or (cz) antibodies having antigen specificity is added to the resulting layer and the layer is allowed to stand for a predetermined time. (dz) the layer is then washed with a buffer solution, (ez) an antibody reactive substrate is added, which produces a color change proportional to the amount of enzyme-linked antibody that has reacted with immune complexes present in the layer or aggregated gamma globulins. and (f) 2 the color change in the layer is measured with a spectrophotometer.

4. Förfarande enligt något av krav l-3, n a t k ä n n e t e c k - av att indíkationsbehandlíngen (a) är utformad för att frambringa en förändring i färg pro- portionell mot mängden av minst en utvald antigen i de adsor- berade ímmunkomplexen och sålunda alstrad färg mäts visuellt eller på spektrofotometrísk väg. 10 15 20 25 30 35 458 237 27 (b) är utformad för att frambringa en förändring i färg pro- portionell mot mängden av minst en utvald immunoglobuliniso- typ i de adsorberade immunkomplexen och sålunda alstrad färg mäts visuellt eller på spektrofotometrisk väg. eller (c) innefattar användning av ett radioaktivt ämne som markör ägnat att frambrínga strålning med en intensitet proportio- nell mot sammansättningen på adsorberade immunkomplex och mängden närvarande strålning mätes.A method according to any one of claims 1-3, characterized in that the indication treatment (a) is designed to produce a change in color proportional to the amount of at least one selected antigen in the adsorbed immune complexes and color thus generated. measured visually or by spectrophotometric means. (B) is designed to produce a change in color proportional to the amount of at least one selected immunoglobulin isotype in the adsorbed immune complexes and thus color obtained is measured visually or by spectrophotometric means. or (c) comprises the use of a radioactive substance as a marker suitable for generating radiation with an intensity proportional to the composition of adsorbed immune complexes and the amount of radiation present is measured.

5. Medel för användning vid genomförande av en immunoassay enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t av att det utgöres av en fast bärare (P) med anordning (20) för att mottaga ett beläggníngsskikt (21) och ett prov som skall underkastas assay, och ett vätskefilmskikt av polyetylenglykol på nämnda anordning häftande vid bäraren och med förmågan att adsorbera immunkomplex och/eller aggregerade gammaglobuliner som kan vara närvarande í provet.Means for use in performing an immunoassay according to claim 1, characterized in that it consists of a solid support (P) with device (20) for receiving a coating layer (21) and a sample to be subjected to assay, and a liquid film layer of polyethylene glycol on said device adhering to the carrier and having the ability to adsorb immune complexes and / or aggregated gamma globulins which may be present in the sample.

6. Medel enligt krav 5. k ä n n e t e c k n a t av att polyetylenglykolen har en molekylvikt mellan ca 2000 och ca 20 000.Agent according to claim 5, characterized in that the polyethylene glycol has a molecular weight between about 2000 and about 20,000.

7. Medel enligt krav 5 eller 6. k ä n n'e t e c k n a t av ett eller flera av följande särdrag : (a) bäraren är ett plastsubstrat (P) med en i huvudsak plan yta och en serie fördjupningar (20) formade i ytan. (b) bäraren innefattar en mikrotiterplatta eller ihåligt plaströr och (c) innefattar en skyddsanordning för den mottagande anord- ningen (20).Agent according to claim 5 or 6, characterized by one or more of the following features: (a) the carrier is a plastic substrate (P) having a substantially flat surface and a series of depressions (20) formed in the surface . (b) the carrier comprises a microtiter plate or hollow plastic tube and (c) comprises a protection device for the receiving device (20).