SE452065B - Antikroppspreparation vars antikroppar er specifika for determinanter i c3 b regionen hos denaturerat humant c3 samt dess anvendning och framstellning - Google Patents

Description

452 065 För närvarande anser man att C3:s struktur är: F- cab _; csa C3d,g c3f ^ '= lf -k d' | S _ S I a a e ja _.m_m._ beta-kedja Flera -S-S- finns.

C3b - De är såväl inter- som intra-"chain". > C3bi + C3f; C3bi > C3c + C3d,g.

I C3d-regionen märks speciellt en tioestergruppering.

C3 anses ha en mycket komplicerad tredimensionell struktur.

Vid aktivering av C3 bildas i ett första steg C3a och C3b, vilket gör att tioestergruppen blir tillgänglig för reaktion “ß med hydroxyl- eller aminogrupper. C3b kan således bindas kovalent till lämpliga acceptorer (màlytor, substrat) som uppvisar sådana grupper, t ex cellväggar, immunkomplex etc.

Som konkurrerande reaktion sker hydrolys. C3b bundet till en acceptor kan delta i den vidare aktiveringssekvensen. C3b inaktiveras genom att fragmenteras till C3bi (= iC3b), vilket i sin tur kan ge C3c och C3d,g. Vid fragmentering och/eller bindning till målytor sker konformationsändringar så att nya antigena determinanter blottas under det att ursprungliga försvinner. Antigena determinanter som ej finns i nativt C3 men väl i fragment därav kallas för neoantigen (neodeterminanter). Ett stort antal översiktsartiklar finns i ämnet (5).

Stora ansträngningar har under årens lopp gjorts för att påvisa neoantigen, samt att ta fram antikroppspreparationer som är riktade mot dem. Speciellt intressant har man ansett, att det är med neoantigen vilkas uppkomst är beroende på 452 065 C3-fragmentens bindning till olika màlytor, såsom immun- komplex. Antikroppspreparationer riktade mot immunkomplex- bundna C3-fragment har ansetts vara användbara för att påvisa C3-innehållande CIC och vävnadsdeponerade C3-fragment (4, 31). Olika metoder för att bestämma immunkomplex har jämförts av Lambert PH et al och Migliorine P et al (14, 15).

Ett antal monoklonaler riktade mot C3 finns beskrivna.

Tamerius, JD et al (25, 26) har framställt monoklonaler riktade mot humant C3 (immunisering med C3). Endast en av dem reagerade specifikt med bara C3-fragment (C3d-regionen).

Lachmann, PJ et al (10, ll, 12, 32) har beskrivit tre olika monoklonaler. Endast en av dem (klon 9) reagerade med neoantigen (i C39-regionen). Burger, R et al (2) har fram- ställt åtta olika monoklonaler genom immunisering med marsvins C3. Alla åtta reagerade med natívt marsvins C3, och av dessa reagerade två dessutom med humant C3 (klonerna 105 och lll). Aguado, MT et al (1) har valt ut vissa av de ovannämnda monoklonalerna och analyserat dem med avseende på användning för detektion av immunkomplex och komplementakti- vering. Whitehead, AS et al (29) har framställt en mono- klonal som reagerar med nativt C3. Ingen av de tidigare kända monoklonalerna har på ett övertygande sätt visats diskriminera mellan acceptorbundet fragment och motsvarande fragment i fri form.

Hanson 0 et al (7) har beskrivit ett adsorberat antiserum med specifícitet riktad mot C3c-epitoper. Preparationen innehåller antikroppar riktade mot flera olika determi- nanter.

Uppfinnarna har själva i ett antal tidigare arbeten visat, att determinanterna som uppkommer när C3b binder kovalent till cellväggen på erytrocyter kan återfinnas i denaturerat C3 (16, 18, 19, 20). Med utgångspunkt från dessa fynd har uppfinnarna klassificerat C3:s antigena determinanter i a) C3(S), vilka är stabila determinanter som återfinns i 452 065 både nativt och denaturerat C3, b) C3(D), vilka är deter- minanter som uppkommer vid denaturering, och c) C3(N), vilka är determinanter som finns i nativt C3 och som ersätts av C3(D) vid denaturering. Som exempel på denaturerande medier som framkallar C3(D)-determinanter kan nämnas SDS (= Sodium dodecylsulfat = natrium laurylsulfat), deoxycholat guanidinhydroklorid och sura eller alkaliska medier (pH < 3 respektive > 10). Determinanterna har hittills ej kunnat påvisas hos fysiologiskt förekommande lösliga former av C3-fragment. Polyklonala kaninantikroppspreparationer har beskrivits, vilka är riktade mot resp typ av determinant, d V s C3(D)alfa, C3(D)beta, C3(D), C3(N), C3(S) och C3(S,N). (alfa och beta står för respektive peptid-kedja i C3, d V s reducerade former har använts vid immuniseringen). l Uppfinningens syften är att erbjuda antikroppspreparationer som har en förbättrad specificitet mot neoantigen (jämfört med tidigare kända preparationer) som uppkommer som en följd av att C3-fragment binder kovalent till en mályta. Bland andra syften kan nämnas att erbjuda förbättrade metoder för att påvisa a) komplementaktivering, b) vävnadsdeponeríng av C3-fragment, d) C3-fragment bundna till celler, d) immun- komplex innehållande C3-fragment etc. Ett tredje syfte är att erbjuda alternativa metoder för diagnos av de tidigare nämnda tillstànden vid vilka komplement är aktiverat.

Slutligen kan som syfte nämnas ett förbättrat sätt att ta fram antikroppspreparationer riktade mot enskilda C3-neo- antigen.

Uppfinningens antikroppspreparationer är monospecifika mot sådana enskilda neoantigen som finns i reducerade former av C3, främst i C3b-regionen av C3 och då i antingen regionens alfa- eller beta-keaja, företräaesvis alfa-kedjan. En antikroppspreparation enligt uppfinningen reagerar således ej med nativt C3 men väl med denaturerad och fullständigt reducerad form därav, d v s med minst en av C3:s polypeptid- kedjor dissocierad från den andra. Preparationen reagerar också med minst ett fragment valt i gruppen C3b, C3bi, C3c, 452 065 C3d,g, C3d, C3g och andra fysiologiskt förekommande C3b- fragment under betingelser som gör att det utvalda frag- mentet uppvisar C3(D)-antigen. Preparationen kan reagera med C3-fragment när de är bundna till något av de tidigare nämnda màlytorna, men ej med motsvarande fria former.

Preparationerna möjliggör immunkemisk bestämning av bundet fragment vid samtidig närvaro av motsvarande fria fragment.

Uppfinningens antikroppar är således riktade mot determi- nanter av C3(D)~typ. Deras bindning till mikrotiterbrunnar belagda med nativt C3 inhiberas kraftigt av C3(D)-deter- minanter, under det att tidigare kända anti-C3-monoklonaler har som kännetecken att inte alls eller bara till ringa grad inhiberas. Under de betingelser som ges för försöken som svarar mot Pig 2, gäller inhiberingsvärden som är större än 50 % för uppfinningens antikroppar.

Uppfinningen avser speciellt antikroppspreparationer riktade mot neoantigen i C3c-regionen.

Antikropparna i preparationerna kan föreligga som anti- kroppsaktiva fragment, t ex Fab, Fab', F(ab') De kan även 2. föreligga som derivatiserade antikroppar. Det väsentliga är att antikroppsfragmenten och derivaten skall uppvisa bio- specifikt affinitet av immuntyp i enlighet med uppfinningen.

Preparationernas antikroppsaktiva komponenter kan vara försedda med analytiskt indikerbara grupper, såsom enzyma- tiskt aktiva, fluorogena, kemiluminogena, radioaktiva, biotínyl grupper etc eller grupper som kan verka som ko- faktor, koenzym, substrat eller kosubstrat etc. Komponen- terna kan föreligga bundna till i testmediet olösliga faser, s k fast fas, t ex fysikaliskt eller kovalent bunden till olika polymerer såsom hydrofila OH- eller NH2-innehållande polymerer eller plastytor såsom de som finns i mikrotiter~ brunnar. 452 065 Preparationerna kan vara i form av en lösning eller suspen- sion till vilken olika tillsatser av för en speciell an- vändning nödvändiga och i och för sig kända kemikalier gjorts. De kan vara frystorkade, de kan vara förpackade tätslutande för att användas som komponenter i ett testkit etc.

Framställningen av en antikroppspreparation enligt uppfin- ningen innebär, att man förmår celler, som potentiellt har förmåga att producera antikroppar med specificitet enligt uppfinningen, att utsöndra dem, varefter dessa isoleras, renas och eventuellt även fragmenteras och/eller derivati- seras på i och för sig känt sätt. Reningen innebär att antikroppar som ej uppfyller de uppsatta specifikationerna avlägsnas. I en vertebrat, företrädesvis varmblodig sådan (t ex däggdjur såsom mus) kan utsöndringen ske in vivo som en följd av att djuret immuniserats med ett immunogen som uppvisar de aktuella neoantigena strukturerna (neodetermi- nanterna). Det sà erhållna immunsvaret är polyklonalt, och ett antiserum erhållit från djuret kommer därför att inne- hålla antikroppar riktade mot alla immunogenets determi- nanter, oberoende av om de är neoantigen eller ej. Poten- tiellt kan man, med lämplig immunsorbent teknik, rena fram de antikroppar som är riktade mot den önskade neoantigenen.

Pâ nuvarande stadium är immunsorbentrening av polyklonala antikroppar omständlig. Det kommer alltid att ge låga utbyten.

Den bästa metoden att erhålla en god antikroppspreparation enligt uppfinningen är så kallad monoklonal teknik (8).

Denna innebär att man efter immuniseringen, fuserar anti- kroppsproducerande plasmaceller med lämplig myelomcell, så att de blir i stånd till snabb och oavbruten tillväxt. Genom att klona och odla de fuserade celler som producerar anti- kroppar med specificitet och korsreaktivitet enligt uppfin- ningen, kan man erhålla antikroppspreparationer som är riktade mot de enskilda antigena determinanter som finns i reducerade former av C3, d v s i dess fria peptidkedjor. 452 065 Odling av de utvalda cellklonerna för produktion av uppfin- ningens antikroppspreparationer kan ske i cellkultur in vitro eller som ascitestumör in vivo. Rening och isolering kan ske som för antikroppar i allmänhet genom saltprecipitering eller genom olika kromatografiska metoder, såsom jonbytes-, affinitets-, gel- etc kromatografi. , Immunogenen som kan användas är sådana som uppvisar de aktuella determinanterna när de exponeras in vívo för immunsystemet. En överraskande stor andel antikroppar med uppfinningens specificitet erhålles i ímmunsvaret om immuno- genet är endera alfa-, eller beta-kedjan i denaturerad form eller lämpliga immunogena fragment av dessa. Exempel på sådana fragment är de som svarar mot respektive kedjas C3b-, C3bi-, C3d,g- och C3c-region.

Uppfinningens antikroppspreparationer kan främst användas inom immunkemisk bestämningsmetodologi av C3-fragment, men de kan även potentiellt användas både in vitro och in vívo m för att modulera komplementaktivering.

De bestämningsmetoder, som är aktuella, innebär att prov innehållande C3-fragment kontaktas med uppfinningens anti- kroppspreparation till bildande av ett immunkomplex, vars bildning och mängd utgör ett kvalitativt respektive kvanti- tativt mått pá provets innehåll av aktuellt C3-fragment. Vid behov kan man även utnyttja ytterligare reaktanter som reagerar med i bildat immunkomplex ingående komponenter.

Praktiska överväganden bestämmer om dessa senare reaktanter skall tillsättas före, efter eller samtidigt med uppfin- ningens antikroppspreparation. Vanligt är att minst en av dem är försedd med lämplig markörgrupp, så kallad analytiskt indikerbar grupp. Mängden av reaktanter avpassas i så fall så att mängden märkt reaktant som inkorporeras i komplexet eller som finns kvar i icke-inkorporerad form utgör ett mått på avsett C3-fragment i provet. 452 065 Ett sätt att indela metoderna är i homogena och heterogena.

Det homogena innebär att en märkt reaktant bestämmes, 3335 att i komplexet inkorporerad märkt reaktant fysiskt sepa- reras från icke-inkorporerad form. Det heterogena innebär att de två formerna av märkt reaktant separeras fysiskt från varandra innan den märkta reaktanten bestämmes i endera eller båda av de två formerna. För att underlätta en separa- tion är det praktiskt om en av reaktanterna är olösliq i testmediet.

Ett andra sätt att indela metoderna är i kompetitiva och icke-kompetitiva. I en kompetitiv metod arrangeras så att tvâ immunreaktanter som har en gemensam epitop (determinant) får tävla om ett underskott homologa bindningsställen på en immunologisk motpart. För bestämning av C3-fragment som finns i ett prov och som uppvisar neoantigen mot vilket en preparation enligt uppfinningen är riktad, låter man provets neoantigen konkurrera med en tillsatt reaktant, som uppvisar samma neoantigen, om antikropparna. Den tillsatta neoanti- genen kan vara i märkt, fastfas-bunden eller löslig form.

Det exakta valet bestäms av praktiska överväganden, såsom i vilken form det aktuella fraqmentet föreligger i provet.

Kompetitiva metoder kallas ofta för inhibitionsmetoder. I en icke-kompetitiv metod arrangeras så att konkurrens ej kan -ske.

Ett tredje sätt att indela metoderna är precipitations och icke-precipitationsmetoder_ Som exempel på användbara fällningsreagens kan nämnas precipiterande antiserum och så kallade fast fas-bundna antikroppar, båda riktade mot i komplexet ingående komponenter, företrädesvis mot anti- kroppskomponenterna. I sammanhanget kan nämnas att neo- determinanter i C3 som regel är icke-repetitiva och därför är monoklonala antikroppar riktade mot dessa icke-precipi- terande. 452 065 Ett fjärde sätt att indela metoderna är enligt markör- gruppen. Man har då radio-, enzym-, fluorescent-, kemi- luminiscent-, enzymsubstrat- immunkemiska metoder etc.

Bland immunkemiska metoder kan dessutom nämnas immunelektro- fores, partikelagglutination, immundiffusion och mikrosko- piering med hjälp av märkta antikroppar.

Det exakta valet av metodologi bestämmes av i vilken form fragmentet i fråga föreligger i provet. Är det ett fragment som är löst i provet och ej bundet till någon målyta, kan man välja metod enligt de principer som gäller för lösliga analyter i allmänhet. Är det ett visst fragment som är bundet till en viss speciell màlyta, måste vederbörlig hänsyn tas till detta vid metodval. Vävnadsdeponerade fragment bestäms således enklast med hjälp av en antíkropps- preparation i märkt form, eventuellt i kombination med mikroskopiering. Fragment bundna till blodceller kan bestäm- mas på analogt sätt, men för kvantifiering har det praktiska fördelar att använda olika inhibitionstekniker.

För att selektivt kunna bestämma specifika fragment som är bundna till specifika lösliga målytor (= M)fordras som regel minst tvà reaktanter. Den ena skall specifikt reagera med ett neoantigen i fragmentet och den andra med lämplig epitop på målytan. Metodologiskt bildar man ett ternärt komplex (reaktant 1.... C3-M... reaktant 2). Inom teknikområdet kallas detta för "sandwich", och de allmänna principer som gäller för "sandwich"-tester kan appliceras vid val av specifik metod.

Uppfinningen avser speciellt ett sätt för bestämning av cirkulerande ímmunkomplex (CIC) till vilka C3-fragment är kovalent bundna. Komplexet innehåller således 1) C3-fragment (C3b, C3bi, C3d,g och C3d är de man hittills vet binder kovalent), 2) antikropp, vilken kan vara av IgA-, IgD-, IgE-, IgG- eller IgM-typ, och 3) antigen. Känd teknik kan i princip användas, med undantag av att man använder en 452 Û65 10 antikroppspreparation med specificítet enligt uppfinningen.

Beroende exakt på vad man vill mäta, förfar man på olika sätt. Vill man bestämma totalmängden immunkomplex inne- hållande ett visst fragment, kan man utnyttja generella fällningsmetoder för immunkomplex i kombination med en antikroppspreparation enligt uppfinningen som är specifik mot just den neodeterminant som finns i det fragment man vill bestämma. Använder man en antikroppspreparation som reagerar med alla tänkbara C3-fragment som kan ingå i immunkomplex, erhåller man totalhalten av immunkomplexbundna C3-fragment. Skall specifika komponenter i C3-fragment innehållande CIC bestämmas, fodras tvà reagens, vardera med specificitet för olika komponenter i CIC. Förutom en anti-C3- fragment-antikroppspreparation fordras då även ett reagens som är specifikt för antikroppsdelen eller antigendelen i aktuellt CIC. Reagenset kan exempelvis vara specifikt för någon av de kända Ig-klasserna eller för antigenet. Even- tuellt kan man tillsammans med dessa reagens även använda ytterligare reagens. Bestämning av immunkomplex innehållande ffi C3-fragment har tidigare beskrivits i ett antal arbeten (1, 21, 23, 31).

Uppfinningen kan appliceras för bestämning i olika typer av prov som innehåller C3 och/eller C3-fragment som uppvisar C3(D)-antigen. Det är tidigare känt att dessa former av C3 finns i t ex vävnader och kroppsvätskor såsom blod, plasma, serum, urin, synovialvätska, cerebrospinalvätska, etc.

Den eller de avsedda immunkemiska reaktionerna utföres under betingelser som är vanliga för den aktuella typen av bestäm- ningsmetoder. Sålunda kan temperaturen vara vald i inter- valla: o - 40 °c, speciellt 15 - 40 °c. Lämplig: pH är vanligen 4,5 - 10, företrädesvis ca 5 - 8,6. Allmänt gäller givetvis att man skall vidta åtgärder som förhindrar akti- vering av komplement eller icke-avsedd denaturering av C3.

Komplementaktiveringen kräver närvaro av proteaser och tvåvärda kalcium- och/eller magnesiumjoner. Det är därför lämpligt att tillsätta proteasinhibitorer eller till dessa 452 065 ll joner komplexbindande agens såsom EDTA. Vid en eventuell tillsats av detergenter och buffertsystem, bör man undvika sådana som kan verka denaturerande på C3.

Uppfinningen preciseras ytterligare i bifogade patentkrav, och den skall nu àskådliggöras med exempel som utgör en del av beskrivning och som på intet sätt avser att inskränka uppfinningen.

MATERIAL OCH METODER C3-gregarationer: Nativt C3 (C3(SN)) renades som tidigare beskrivits (17).

Denaturering av 100 /ug av C3 (C3(SD)) utfördes i 100 /ul 2xl0-3M SDS i 30 min vid 37oC. Denaturerat-reducerat C3 och isolerade C3 alfa- och C3 betakedjor (C3(D)) framställdes enligt Nilsson et al (19). Elastas-genererat C3a, C3c och C3d var en gåva från dr Brian Tack, Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, USA (24). C3b framställdes genom trypsin-digerering (1 % (w/v) trypsin TPCK treated, Worthington, USA) under 2 min vid rumstemperatur (17). C3bi framställdes genom att C3b inkuberades med 5 /ug faktor H och 1 /ug faktïšsl under 60 min vid 37°C. Isotopmärkning av nativt C3 med specifik aktivitet av 30 000 cpm//ug protein (16).

I utfördes med laktoperoxidas till en Antikropps-preparationer: Polyklonala anti-C3-alfa-betakedje-antikroppar (anti-C3(D)) framställdes i kanin som tidigare beskrivits (19).

Monoklonala mus-antikroppar: Grugg I: Monoklonala mus-antikroppar framställda genom immunisering med nativt C3 och C3b och utvalda för sin specificitet för lösligt och erytrocyt-bundet C3b far en 452 065 12 gåva från dr Hans Müller-Eberhard, Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, USA (25).

Grupp II: Dessa antikroppar var framställda genom immuni- sering med hjälp av SDS-denaturerat C3 och utvalda med avseende på specificitet för immunogenet. Två stycken Balb/c honmöss, 8 - 12 veckor gamla, injicerades subkutant med 24 /ug av humant SDS-denaturerat C3 i komplett Freunds adjuvans (FCA, Behringwerke AG, Västtyskland) tillsammans med 20 /ug Lipopolysackarid W (LPS, Difco, katalog nr 3120-25). Åtta veckor senare, på dag 4 före fusering, gavs intraperi- tonealt (i.p.) 100 /ug av SDS-denaturerat C3 i fosfatbuffrad koksaltlösning (pH 7,4). Hybridomen framställdes enligt standardprocedur (6,9), med följande smärre modifikationer.

Fyra olika Sp2/0 cellinjer användes. Ursprungslinjen var Sp2/0.Agl4 (22) och odlades i standardmedium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Paisley, Scotland, katalog nr 041-1966) innehållande 5 % fetalt kalvserum (FCS, Gibco, katalog nr 011-6290) och 25 /ug/ml av Gentamycin (katalog nr G-7507, Sigma Chem Co, USA). Två olika subkloner utvalda för sin förmåga att kunna odlas i serumfritt medium och en subklon odlad i lågserummedium Hy~0,l användes också.

Standard DMEM innehållande 10 % FCS eller HY-0,1 medium användes för selektion och kloning. Klonerna (hybridomen) utvaldes med avseende på förmåga att binda till SDS-denatu- rerat C3 i direktbindnings-ELISA. Av dessa utvaldes fjorton kloner slumpmässigt och testades ytterligare.

Grupp III: Dessa antikroppar var framställda medelst immuni- sering med och utvalda för sin specificitet för denaturerat- reducerat C3. Monoklonala antikroppar från denna grupp framställdes på samma sätt som ovan men med följande modi- fikationer. Möss injicerades subkutant (s.c.) med 30 /ng denaturerat-reducerat C3 i FCA. 30 /ug bostringsdoser av samma antigen i inkomplett Freunds adjuvans (FIA, Behringwerke AG, Västtyskland) gavs i.p. fyra gånger med två veckors intervaller, efter vilket djuren fick vila under 9 månader. Slutbostring med 190 /ug denaturerat-reducerat C3 452 065 13 i PBS gavs i.p. en gång per dag tre dagar innan fusering. En 5Ubk1°n aV mYel0mlinjen Sp2/0.Ag 14 utvaldes för sin od- lingsbarhet i ett lâgseruminnehàllande medium, Hy-0,1, och användes vid fuseringarna. Två olika hybridomlinjer utvaldes och klonades antingen i DMEM-5 % FCS eller lâgseruminne- hållande medium Hy-0,1 %. Klonerna (Hybridomen) utvaldes för sin specificitet i direktbindnings-ELISA. 140 kloner erhölls av vilka 13 slumpmässigt valda testades ytterligare.

Etablerade hybridomlinjer expanderades till 200 ml volym i TC flaskor som kultur av "fed-batch"-typ. De monoklonala antikropparna renades med hjälp av katjonbytes-kromatografi som tidigare beskrivits (3).

Klonselektion för grupp III.

En initial selektion av monoklonalerna gjordes genom att man analyserade reaktiviteten mot polystyrenadsorberat denatu- rerat och reducerat C3. 644 kloner som var positiva påvisades.

Som andra steg i urvalsprocessen jämfördes varje positiv klons reaktivitet mot sju olika fragment och konformations- varianter av C3 i direktbindnings-ELISA. En stor variation av mönstret för monoklonalernas reaktivitet erhölls. Repre- sentanter för varje mönster utvaldes. Kloner med svag reaktivitet uteslöts. På detta sätt utvaldes 140 kloner som alla visade stark reaktivitet mot denaturerade former av C3, men med varierande specificitet och styrka gentemot olika typer av C3-fragment. Av dessa kunde sedan 70 kloner expan- deras till 200 ml odlingsvolym, och från denna grupp ut- valdes sedan 14 stycken slumpmässigt för utökad analys av specificitet. ELISA-testen repeterades och koncentrationen av Ig kvantiterades.

En av de fjorton klonerna visade förlust av reaktivitet och hade slutat producera Ig. De övriga visade samma specifici- tetsmönster som tidigare med en stark specificitet för C3(D) i lösning och är därmed riktade mot neoantigen enligt H 452 065 14 definition. Förekomsten av dessa neoantigen undersöktes sedan i fysiologiska former av bundet C3. För att undvika oönskade konformationsändringar och minskad tillgänglighet till antigenets yta, testades monoklonalernas reaktivitet genom inhiritions- respektive sandwich-ELISA i vilka den monoklonala antikroppen kopplats till en fast fas genom direkt adsorption eller indirekt via ett anti-mus-Ig.

Framställning av partíkelbundet C3: EAC14°xY23b och EACl4°xy23bi-celler framställdes och upp- taget av C3 på cellerna uppskattades med 125I-märkt nativt C3 som tidigare beskrivits (16). 100 mg av Zymosan A (Sigma Chem.Co., USA) som kokats inkuberades med 2,5 ml serum l25I-märkt nativt C3 i 30 min vid 37 OC. Upptaget av C3bi beräknades från mängden partikel- bunden radioaktivitet. innehållande 2 /ug nativt Enzvm-kopplad immunsorbent-metod (ELISA): Direktbindningsmetod: Seriespädda anti-C3-antikroppar fick binda till konstanta mängder C3 eller C3-fragment som adsorberats till brunnarna i mikrotiter-plattor. De bundna antikropparna kvantifierades därefter med hjälp av anti-kanin eller anti-mus-immunglobu- liner som var konjugerade med peroxidas från pepparot (HRP)(DAKO Immunoglobulins A/S, Danmark). Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innehållande 0,1 % TWEEN 20(v/v) och 0,1 % (w/v) bovint serumalbumin (BSA) användes som buffert- lösning vid inkuberingarna. 1. 200 /ul av vardera C3, C3 alfa- och betakedjor, SDS- denaturerat C3, C3c och C3d i PBS (svarande mot 20 nmol C3/l) adsorberades under natt vid 4oC till plastytorna av mikrotiterplattornas brunnar (Immunoplate II F, Nunc, Danmark). 452 065 15 2. 100 /ul antikroppspreparationer i seriespädning inkube- rades under 60 min vid rumstemperatur (RT). 3. 100 /ul gris-anti-immunglobuliner konjugerade med HRP fick under 60 min vid RT binda till de i steg 2 adsor- berade anti-CB-antikropparna. 4. Enzymreaktionen startades genom tillsats av 100 /ul färgreagens (20 mg 1,2-fenylendiamin-dihydroklorid (Fluka AG, Schweiz) och 10 /ul 30 % H2O2 i 75 ml 0,1 M citrat/fosfatbuffert pH 5,0). Reaktionen stoppades efter ungefärligen 10 min med hjälp av 100 /ul 1 M HZSO4. Färgutvecklingen kvantifierades spektrofoto- metriskt vid 492 nm.

Efter stegen 1 - 3 tvättades brunnarna noggrannt 3 gånger i koksaltlösníng som innehöll 0,1 % TWEEN 20.

Inhibitionsmetod: Metoden var en modifiering av direktbindningsmetoden. 100 /ul av seriespätt prov fick konkurrera med det adsorbe- rade antígenet om bindning till en konstant mängd antikropp. 492OD=l erhölls när den fick binda till preadsorberat nativt C3 under 60 min vid RT Antikroppsmängden var vald så att enligt direktbindningsmetoden. Inhibitionsmetoden avslutades med stegen 3 - 4 från direktbindningsmetoden.

Sandwich-ELISA 1. Indirekt bindning av monoklonal till mikrotiterbrunn.

Ett affinitetsrenat Fc-specifikt kanin-anti-mus-Ig adsorberas till mikrotiterbrunnar (NUNC Immunoplate type I) genom att 1,25 /ug Ig/ml i 96x200 /ul får inkubera vid +4°C ca 16 timmar eller mera. Brunnarna får sedan efter tvättning inkubera med en seriespädning ,.1..~... 452 065 16 av monoklonal (kan vara orenad supernatant), 100 /ul/brunn, 1 timma och RT. 2. Immunkomplexanalys 100 /ul av en standardspädning från 1/10 till 1/10240 eller plasmaprover spädda 1/26 inkuberas under en timma vid RT i brunnarna. Därefter inkuberas med ett affini- tetsrenat Fc-specifikt kanin-anti-humant IgG som är beta-galaktosidaskonjugerat och spätt 1/200 (1 timma och RT). Mängden enzym som bands till brunnarna kvanti- fierades med hjälp av PRIST/RAST developing substance (100 /ul, Pharmacia AB) som fick reagera i brunnarna under två timmar varefter reaktionen bröts med 50 /ul 0,66 M Na2CO3; Immunkomglexmodell Aggregerat IgG med bundet C3 prepareras genom att serum aktiveras med en tillsats av 600 /ug aggregerat IgG/ml och inkuberas vid 37°C enligt Lambert P H et al (14).

Prover EDTA-plasma som förvaras vid -7O0C.

SDS-PAGE/Immunblotting: SDS-PAGE utfördes enligt Laemmli et al (13) och immunblot- ting som beskrivits tidigare (16). För ímmunblotting an- vändes anti-mus-immunglobulin som var konjugerat med HRP för att detektera de monoklonala antikropparna. 452 065 17 RESULTAT Specificitet av polyklonala antikroppar från immuniseringar med denaturerat-reducerat C3 respektive denaturerat C3 specificiteten hos polyklonala kanin-anti-C3(D)-antikroppar och hos antisera framställda i möss och riktade mot SDS- denaturerad C3 (frân framställning av grupp II) och denatu- rerat-reducerat C3 (frân framställning av grupp III) karak- täriserades med hjälp av ELISA. Seriespädda antikropps- preparationer testades med direktbindningsmetoden och alla tre typerna av antikroppar visade sig binda till brunnar belagda med nativt C3. De polyklonala antikropparna testades även med inhibitionsmetoden. Därvid fick fastfasbundet C3 konkurrera om antikropparnas bindning med i vätskefasen löst nativt C3 (S- och N-antigen), SDS-denaturerat C3 (S- och D-antigen) och denaturerat-reducerat C3 (D-antigen) (fig.l).

Som väntat inhiberades anti-C3(D)-antikroppar av C3(SD)- och C3(D)- men inte av C3(SN)-antigen, vilket bekräftade att C3(D)-antigen var inblandade i deras bindning. I motsats till detta inhiberades båda typerna av mus-antikroppar av både C3(SD)- och C3(SN)- men bara till en ringa grad av C3(D)-antigen, med den enda skillnaden att det krävdes en lägre dos av C3(SD)- än av C3(SN)-antigen för att inhibera bindningen till brunnarna av antikroppar framställda mot denaturerat-reducerat C3. Slutsatsen är att specificiteten av de båda typerna mus-anti-C3-antisera huvudsakligen är för C3(S)-antigen.

Monoklonala anti-C3-antikroppars specifícitet för lösliga antigen Monoklonala antikroppar från grupp I-III testades indivi- duellt i inhibitions-ELISA för bindning till 25 pmol av olika C3-former som i vätskefas exponerar C3(D)-, C3(SD)- eller C3(SN)-antigen. Som visas i figur 2, inhiberades grupp I bara av C3(SN)- men inte av C3(SD)- eller C3(D)- antigen, vilket tydde pà att C3(N)-antigen i nativt C3 452 065 18 förorsakade inhiberíngen. Även för grupp III var det tydligt att C3(D)- och C3(SD)-antigen påverkade bindningsförmàgan vilket kan härledas till närvaron av C3(D)-antigen. Den begränsade inhibering som förorsakades av nativt C3 berodde troligen på att en liten del av molekylerna denaturerades under framställning och lagring. Antigendosen som behövdes för att erhålla en identisk inhiberingsgrad var mer än 32 gånger högre för både C3(SN)- än för C3(D)-antigen.

Grupp II var mer komplex eftersom antikropparna inhiberades av alla former av C3. Tre av antikropparna inhiberades preferentiellt av C3(D)-antigen, under det att andra pà- verkades mera av C3(SN)- och C3(SD)-antigen. Av detta kan hävdas att antikroppar från grupp II har specificiteten både för C3(S)- och C3(D)-antigener.

Monoklonalernas specifitet för lösliga fragment som ut- trycker S- och N-antigen (2,5 pmol C3b, C3bi, serum, åldrat serum) testades också (fig 3). De olika preparationerna påverkade bindningen av varje grupp på ett liknande sätt.

Grupp I inhiberades avsevärt av alla typer fragment, under det att grupp II visade ett mera heterogent mönster med ett stort område av olika inhibitionsgrader. Grupp III påver- kades bara mâttligt av de olika fragmenten, med undantag av fyra antikroppar som till en viss grad inhiberades av C3bi.

Monoklonala anti-C3-antikroppars specificitet för partikel- bundet C3 Antikropparna i grupp I-III testades individuellt i en av inhibitions-ELISA mot 2,5 pmol av varierande former parti- keibunaet cs (EAc14°xY23b,ßAc14°*Y23bi och zycsbil (fig 4).

Partikelbundet C3 gav inhibition (<90 % bindning) för alla antikroppar i grupp I. Medelnivân av bindning var lägst när EAC14°xy23bi användes. Åtta till nio antikroppar frán grupp II påverkades av partikelbundet C3 och medelvärdena var identiska. Åtta antikroppar från grupp III band till 452 065 19 bundet C3. Av dessa reagerade bara en med både partikel- bundet C3b och partikelbundet C3bi och resten reagerade specifikt med C3bi. De antikropparna i grupp III, som tidigare visat inhibition av i lösning förekommande fysio- logiska C3-fragment (obundna), inhiberades preferentiellt av den bundna formen, eftersom en 64 - 256 gånger högre dos av lösliga fragment behövdes för att uppnå en identisk inhibe- ringsnivà i inhibitions-ELISA.

Fyra av de testade antikropparna som var riktade mot C3bi- regionen ansågs ha en tillräcklig specificitet för att användas vid immunkomplexbestämning.

Monoklonala anti-C3-antikroppars specificitet för fast- fasbundet C3 och fastfasbundna C3-fragment Antikropparna från grupp I-III testades med hjälp av direkt- bindnings-ELISA för bindning till preadsorberat nativt C3, SDS-denaturerat C3, proteasgenererade C3-fragment och C3-alfa- och C3-beta-kedjor (tabell I). Alla antikropparna i grupp I band till nativt C3, men endast en till SDS-denatu- rerat C3, 12 band till C3c och 2 till C3-alfa- eller C3-beta- kedja. I motsats till detta band alla antikropparna i grupp II och III till bàde nativt och denaturerat C3, och majoriteten var dessutom positiva för bindning till C3-alfa- kedja, men fördelningen av deras bindning till proteasgene- rerade fragment liknade dem som antikropparna i grupp I uppvisade. 452 065 20 TABELL I Specificitet hos grupperna I-III för olika fastfasbundna C3-former i ELISA.

C3(SN) C3(SD) C30 C3d C3a C3-alfa C3-beta I 14 1 12 0 O 1 II 14 14 10 2 1 11 III 13 13 9 1 0 10 0 TABELL II Specificitet hos grupperna I-III för reducerade fragment i immunblotting, C3 C3bi C3C C3d 5115 alfa beta 70 kd 36 kd 25 kd I Û 1? 0 0 0 0 II 6 0 III 13 0 ND Monoklonala anti-C3-antikroppars specificitet för reducerade C3-fragment i ímmunblotting Vid immunblotting (tabell II) visade antikropparna från grupp I praktiskt taget ingen reaktivitet, med undantag för en monoklonal som band svagt till beta-kedjan. Grupp II band också svagt, eftersom bara 7 av 14 befanns vara postiva. Med ett undantag band alla antikropparna till 36 kd fragmentet av elastasgenererat C30. Alla antikropparna från grupp III band med hög affinitet till alfa-kedjefragment. 7 monoklo- naler band till fragmentet som var 25 kd och 4 till frag- mentet som var 36 kd (båda från elastasgenererat C3c) och en till elastasgenererat C3d (27). Vid immunblotting var en 452 065 21 antikropp positiv för det 40 kd alfa-kedjefragment som uppkom vid SDS-denaturering vid l00°C (28), men inte för reducerat eller icke-reducerat C3c eller C3d. Det sistnämnda resultatet antyder att antikroppen ifråga skulle kunna binda till C3g-fragmentet (ll).

TABELL III Sammanställning över specificitet hos monoklonala anti-C3(D)- antikroppar utvalda ur grupperna II och III Inhibitions-ELISA IMMUNBLOTTING Partikelbundet Lösligt C3c C3d GROUP C3b C3bi C3b C3bi 25 kd 36 kd _ - - - - - II _ _ _ _ _ + _ - - - - - + - æw _ _ _ _ _ + _ _ _ _ _ _ + _ + + - - - + - - + - - + - - _ + _ _ + - - _ + _ _ + - - III _ + _ - + - - _ + _ _ + - - _ + _ _ + - - _ _ _ _ + - - _ _ _ _ - - + - + - - - 1) - - 1) Bindning till det 40 kd fragment som uppkommer efter SDS-dena- turering vid 100°C. 452 Û65 22 Sammanställning av specificiteter hos anti-C3(D)-antikroppar från grupp II och III Monoklonala antikroppar, vilka preferentiellt inihiberades av C3(D)-antigen uttryckta av denaturerat och denaturerat- reducerat C3 på det sätt som visas i fig 2, definierades som anti-C3(D)-antikroppar. Tre monoklonala antikroppar med anti-C3(D)~specificitet från grupp II och 13 från grupp III utvaldes och deras egenskaper finns sammanställda i tabell III Alla band till alfa-kedjefragment. De som band till 36 kd fragmentet av C3c saknade, med ett undantag, fullständigt reaktivitet mot bundet C3. Den som var positiv band till både C3b och C3bi. 7 antikroppar band till 25 kd fragmentet och, vilket är mycket intressant, 6 av dessa band specifikt till partikelbundet C3bi, vilket även gällde för den mono- klonala antikropp som antogs binda till C3g. Antikroppen som band till C3d reagerade ej med bundet C3.

Analys av immunkomplex i plasmaprover För att få en preliminär uppfattning om vilka halter som är detekterbara för aktuella immunkomplex, hur de fördelas i ett patientmaterial respektive ett normalmaterial, samt hur de kan skilja sig åt när de detekteras med utgångspunkt från olika neoantigen, analyserades ett antal humana plasma (14, 15).

En mindre grupp patienter vars plasma lämnats in för analys av Clq-bindande immunkomplex jämfördes med en mindre grupp friska blodgivares plasma. Patientgruppen utgör en heterogen blandning av misstänkta immunologiska störningar, och man kan förvänta sig immunkomplex av varierande komposition och mängd. Eftersom någon positiv korrelation inte förväntades med Clq-analysen (15) och inte heller kunde påvisas, analy- serades alla plasma som under en viss tidsperiod lämnats in för Clq-analys. Detta skedde oberoende av om Clq-analysen var positiv eller negativ. 452 065 23 Tre monoklonaler valdes ut, adsorberades till mikrotiter- brunnar och användes för att separera ut ímmunkomplexbundet C3 från plasma. En av monoklonalerna var riktad mot ett neoantigen som är exponerat i bundet C3b och C3bi och som är befintligt i C3c:s alfa-fragment med 40 kd i molekylvikt. En andra var riktad mot ett neoantigen som är exponerat i bundet C3bi men ej i bundet C3b och som antas vara riktat mot g-delen i C3d,g. Båda dessa tillhör grupp III mono- klonalerna. Den tredje av monoklonalerna tillhörde grupp II och var riktad mot 20 kd-fragmentet av C3c och reagerade med bundet C3bi.

Någon statistisk behandling, som att bestämma gränser för normalvärden, har inte utförts, då materialet är litet och heterogent. Speciellt patíentgruppen uppvisar inte nägra typiska normalfördelningar. Om stapeldiagrammen i fig 5.1-6 betraktas, ser man en betydande skevhet i fördelningarna och på sina ställen är flera pálagrade på varandra. Patient- gruppen har också en större spridning av sina värden, vilket *H skulle kunna tolkas som att vissa är onormala.

Förekomsten av en grupp patienter som ligger lägre än de normala är i sig intressant och tyder på en hög känslighet i systemet. Tidigare anti-C3-baserade (1, 30) och även ett flertal andra immunkomplexanalyser (14, 15) har huvuddelen av sina normalvärden och många av sina patíentvärden lig- gande pá lägsta detekterbara nivå. I synnerhet är före- komsten av lägre värden pá patientgruppen än de normala ovanlig. Lämnar man det endimensionella betraktelsesättet och sätter in värdena från analyser med två olika monoklo- naler i ett tvädimensionellt koordinatsystem, förstärks skillnaderna mellan normal- och patientvärden (fig 6).

Variationen i reaktivitet mot olika epitoper stöds av teorin att immunkomplex är ett sammanfattande begrepp som döljer en betydande heterogenicitet (15). Den flerdimensionella presentationen gör det möjligt att t ex urskilja en hög kvot av immunkomplexbundet C3d i plasma med låga halter av immunkomplex, och som därför har en relativ anhopning av 452 065 24 metaboliter från ett senare steg i elíminationsprocessen, från ett plasma med mera normal C3d-kvot.

Från analyserna av de fjorton C3(D)-monoklonalerna i grupp III, kan man anta att även övriga expanderade monoklonaler reagerar företrädesvis mot epitoper på C3(D) i lösning, och att de i stor utsträckning reagerar med neoantigen före- kommande på fysiologiska former av partikelbundet C3. En icke obetydlig del av dessa återfinns troligen pà C3 asso- cierat till immunkomplex eller modeller av dessa i form av aggregerat humant IgG. De har vidare varierande specificitet för olika typer av immunkomplexbundet C3. Som de preliminära testerna har visat förekommer de i minst två varianter. De kan därför detektera olika aspekter hos immunkomplexbundet C3, och i kombination kan de ge en förstärkning av infor- mationens upplösning och kvalitet. Det är därför inte orimligt att anta att de resterande klonerna i grupp III kan innehålla antikroppar riktade mot andra neoantigen som betonar andra egenskaper hos immunkomplexen.

Figur 1: Seriespädningar av C3(SN) (O), C3(SD) (O) och C3(D)(¿5) fick konkurrera om bindning till kanin polyklonal anti-C3(D)(I) och antisera framkallat i möss mot SDS-denaturerat (II) och denaturerat-reducerat C3(III) i inhibi- tions-ELISA.

Figur 2: 25 pmol av C3(SN), C3(SD) eller C3(D) fick konkurrera om bindning till de individuella monoklonala antikropparna som tillhörde grupperna I-III i inhibitions-ELISA. få.

Figur 3: Figur 4: Figur 5: Figur 6: 452 065 25 2,5 pmol av C3b, C3bi, C3 från normalt humanserum (NHS) och C3 fragment från åldrat humanserum (AHS) fick konkurrera Om bindning till de individuella monoklonala antikrop- parna i grupperna I-III i inhibitions-ELISA.

Medelvärdena i SEM för de olika gruppernas svar pà varje C3 preparation presenteras. 2,5 pmol partikelbundet C3 föreliggande som EAc4°xY23b, EAc14°xY23bi och zycsbi fick binda till de individuella monoklonala antikropparna i grupperna I-III i inhibi- tions-ELISA.

Histogram över procentuell fördelning av patientmaterial (a) och normalmaterial (bi vid analys med hjälp av de tre i texten Omnämnda monoklonalexemplen. Antikroppen i analys I är riktad mot ett neoantigen som exponeras på bundet C3b och C3bi och är beläget i C3c-delen, i analys II är anti- kroppen riktad mot ett neoantigen som expo- neras pà bundet C3bi, beläget i C3d,g, samt i analys III ett neoantigen som exponeras på bundet C3bi beläget i C3c-delen.

Analyssvaren från samma analyser som i fig 5 plottade mot varandra. Normalmaterial repre- senteras av fyllda rektanglar och patient- material av oifyllda cirklar. 6.1 Analyssvar med antikropp I plottat mot antikropp II. 452 065 26 6.2 Analyssvar med antíkropp III plottat mot antíkropp II. w 10. 0 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 452 065 27 REFERENSER Aguado, MT et al (1985). J Clin Invest 76: 1418-26 Burger, R et al (1982). J Immunol 129: 2042-50 Carlsson, M et al (1985). J Immunol Meth 79: 89-98 moi, T e: al (1984). J Immunol Meth 692 95-104 Fearon, DT et al (1983). Ann Rev Immunol 1: 243-71 Goding, JW (1980). J Immunol Meth 39: 285-308 Hansen, O et al (1983). J Immunol Meth 61: 245-52 Köhler et al (1975). 256: 495-7 Lindell, P et al (1986) (Manuscript in preparation) Lachmann, PJ et al (1980). Immunol 41: 503-15 Lachmann, PJ et al (1982). J Exp Med 156: 205-16 Lachmann, PJ et al (1983). Vox sang 45: 367-72 Laemmli, UK et al (1973). J Mol Biol 80: 575-99 Lambert, PH et al (1978). J Clin Lab Immunol 1: 1-15 Miglioríne, P et al (1984). Clin Immunol Immunopath 32: 298-315 Nilsson, B et al (1985). Scand J Immunol 22: 703-10 Nilsson, UR et al (1975). J Immunol 114: 815-22 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 452 065 28 Nilsson, UR et al (1982). Mol Immunol 19: 1391 Nilsson, UR et al (1980). Mol Immunol 17: 1319-33 Nilsson, UR et al (1982). J Immunol 129: 2594-97 Rodahl, E (1985).

Sect C 93: 125-30 Acta Pathol Microbiol Immunol Scand Schulman, M et al (1978). Nature 276: 269-70 Sekita, K et al (1984). Clin Exp Immunol 55: 487-94 Tack, BF et al (1981). Meth Enzymol 80: 64-101 Tamerius, JD et al (1982). J Immunol 128: 512-4 Tamerius, JD et al (1985). J Immunol 135: 2015-9 Taylor, JC et al (1977). Biochemistry 16: 3390-6 Thomas, ML et al (1982). Proc Natl Acad Sci 79: 1054-58 Whitehead, AS et al (1981). Eur J Immunol 11: 140-6 Pereira AB et al (1980). J Immunol 125: 763-70 Brittiska patentet 2,l09,932 (Inventor Parrat D).

Brittiska patentet 2,117,Sl4 (Inventor: Lachman PJ et al)

Claims (1)

1. 452 065 29 Patentkrav Antikroppspreparation riktad mot en enskild neoantigen som uppkommmer som en följd av att C3-fragment kovalent bindes till sin màlyta och som finns i C3b-regionen av humant C3 men ej i fria fragment därav eller humant nativt C3, k ä n n e t e c k n a d av att den immun- kemiskt reagerar med en antigen determinant i C3b- regionen av alfa- eller beta-kedja i denaturerat humant C3, i vilket disulfidbindningarna har reducerats. Antikroppspreparation enligt krav 1, k ä n n e - t e c k n a d av att neoantigenet, mot vilket prepara- tionen är riktad, är belägen i en C3-region, som är vald bland C3bi-, C3d,g-, C3d-, C3g- och C3c-regionen. Antikroppspreparation enligt krav l eller 2, k ä n n e - t e c k n a d av att den antigena determinant, med vilken den immunkemiskt reagerar, finns i en C3-region som svarar mot ett fysiologiskt förekommande C3-frag- ment med förmåga att kovalent binda till ett cirku- lerande immunkomplex. Antikroppspreparation enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a d av att den är framställd genom att man förmår celler, som potentiellt har förmåga att producera antikroppar vilka immunkemiskt reagerar pà nämnda sätt, att utsöndra antikropparna, varefter antikropparna på i och för sig känt sätt renas och eventuellt även isoleras och/eller derivatiseras pà i och för sig känt sätt. 452 065 30 Användning av en antikroppspreparation enligt något av kraven 1 - 4, för att immunkemiskt påvisa i) C3-frag- ment som uppvisar den neoantigen mot vilken antikropps- preparationen är riktad eller ii) immunkomplex inne- hållande kovalent bundet C3-fragment. Framställning av en antikroppspreparation med preferen- tiell specificitet för en neoantigen som uppkommer som en följd av att C3-fragment kovalent bindes till sin mályta och som finns i C3b-regionen av humant C3 men ej i fria fragment därav, k ä n n e t e c k n a d av att man förmår celler, som potentiellt har förmåga att producera antikroppar vilka immunkemiskt reagerar med en antigen determinant, som finns i C3b-regionen av alfa- eller beta-kedjan av denaturerat humant C3, i vilket disulfidbindningarna som binder samman kedjorna med varandra har reducerats, att utsöndra antikrop- parna, varefter antikropparna pá i och för sig känt sätt renas och eventuellt även isoleras och/eller derivatiseras på i och för sig känt sätt.