SE451161B - Forfarande vid efterbehandling, speciellt fixering, infergning respektive avfergning, av elektroforesgeler - Google Patents

Description

451 161 Efter fixering skall provkomponenterna lokaliseras på gelen n för kvalitativ och/eller kvantitativ analys. Om provet ursprungligen innehöll t ex fluorescerande eller radioaktivt märkta komponenter kan detektionen direkt utföras med hjälp v av lämplig detektor men vanligast förekommande är att banden infärgas så att de blir synliga. I detta fall kontaktas gelen med en lösning som innehåller färgämnen som binder till provkomponenterna men ej till gelmatrisen, Under detta steg är det av vikt att infärgningen blir jämn, då i annat fall en kvantitativ utvärdering blir mycket osäker, vilket innebär att färgämnet jämnt skall tillföras gelytan och vidare ges tid att binda till aktuella komponenter. Den tid detta tar beror bl a på gelens tjocklek, omrörningshastig- heten, koncentrationen hos infärgningslösningen och aktuell temperatur. Med nuvarande teknik sker infärgningen vanligen genom att gelen läggs i ett färgbad som skakas någon gång dà och då. För att säkerställa en fullständig infärgning låter man gärna gelen ligga kvar under en relativt lång tids- period, t ex över natten.

Under infärgningssteget diffunderar färgämnet således in i hela gelmatrisen och det är därför nödvändigt att tvätta bort ickeßbundet färgämne i ett speciellt s k avfärgnings- - bad. När gelen behandlats pà detta sätt framträder banden och deras läge samt area och färgintensitet kan bestämmas för en slutlig utvärdering.

Efter den elektroforetiska separationen ska gelen således genomgå ett antal behandlingssteg: 1) fixering, 2) infärg- ning och 3) borttvättning av icke-bundet färgämne innan utvärderingen påbörjas. Traditionellt genomföras denna sekvens genom att gelen successivt flyttas mellan de olika behållarna och processen tar normalt minst sex timmar, men vanligen låter man t ex infärgningen ske över natt. Behål- larna kan vara försedda med en omrörarenhet som bringar lösningen att cirkulera i behållaren men vanligare är, som nämnts, att behållaren helt enkelt skakas då och dà. 451 161 Processer av detta slag kan páskyndas genom att de genom- föres vid en förhöjd temperatur. Eftersom infärgning vid t ex 50 OC i ett typiskt fall kan gå 2 - 3 gånger snabbare än vid 20 OC, kan àtskillig tid vinnas på detta sätt. För att erhålla jämförbara resultat vid upprepade försök har det därför krävts att de ovan nämnda processparametrarna (gel- tjocklek, koncentrationer, omrörningshastighet, tid och temperatur) hållits konstanta. Detta innebär således att en noggrann termostatering, även av förràdskärl, varit nöd- vändig.

Vi har nu funnit att en avsevärd tidsbesparing och för- enkling av den process, som efter separationen förbereder gelen för analys, kan uppnås om lämpliga steg genomföres i en och samma behållare och processen i sin helhet styrs av en programmerbar elektronisk enhet, t ex en mikrodator.

Gelen placeras i behållaren pà en roterbar hållare, t ex av den typ som visas i Fig 2. Aktuella fixerings-, infärgnings-, avfärgnings-, eller tvättlösningar kan tillföras behållaren via en eller flera ledningar som även utnyttjas för tömning.

För styrning av behållarens fyllnings~ resp tömningssek- venser svarar den elektroniska enheten med hjälp av pumpar och ventiler, t ex magnetventiler, av känt slag, t ex sådana _ som används i vätskekromatografiska system. Behållaren är vidare försedd med en temperatursensor som kontinuerligt förser styrenheten med aktuella temperaturdata och en uppvärmningsanordning, t ex en doppvärmare, med vars hjälp en förutbestämd temperatur uppnås.

Fig 1 visar en schematisk bild av en utrustning som kan användas vid genomförande av förfarandet enligt uppfinningen.

Apparatdelen (1) har en cirkulär fördjupning (3) som avses innehållande aktuella lösningarna. Páfyllning med lösning liksom avtappning sker genom en eller flera kanaler i (3), vilken dessutom innehåller en uppvärmningsenhet. I locket (2) sitter dels temperatursensorn (4) och dels gelhållaren (5) som är roterbar. Den motor som driver denna rotation áterfinnes i den del av locket (2) som markerats med (6). 451 161 Gelhállaren (5) visas även i Pig 2 där (7) indikerar den axel med vilken gelhàllaren är fäst i locket (6). Gel- hàllaren har fyra armar (8 a-d) och gelen (9) hålls pà plats _pá det sätt figuren visar. Efter det att gelen placerats i hállaren stängs locket, varefter önskad sekvens av fixe- rings-, infärgnings- och avfärgningssteg initieras. En elektronisk enhet styr därvid förloppet som innefattar påfyllning/avtappning av lösningar, temperaturmätning, temperaturreglering och rotation av gelhállaren under åtminstone en del av processtiden.

Vid kalibrering genomföres ett processteg, t ex infärgning med Coomassie Blue, med de koncentrationer och den gel- dimension som kommer att användas vid de fortsatta försöken.

Processtiden, vid ett antal temperaturer i ett intervall som - täcker vad som senare kan bli aktuellt, mätes i det nu vältermostaterade systemet. Resultaten, relaterade till värdet vid 20 OC, normaliserat till 1,0, kan typiskt vara: 0,5 vid s °c, 1,4 via so °c, 1,8 vid 40 °c och 2,3 vid 50 OC. Värdet 0,5 vid 5 OC anger således att reaktionen gär hälften så fort vid denna temperatur som vid 20 OC. När den elektroniska enheten försetts med dessa mätdata, från vilka övriga värden inom temperaturíntervallet lätt kan extra- poleras, kan processen sedan genomföras vid valfri tempera- tur inom intervallet. Temperaturen i behållaren registreras kontinuerligt liksom processtiden. Om processtiden vid 20 OC har bestämts till 12 min, vid kontinuerlig rotation av gelen med en frekvens av 2 Hz, avbrytes steget naturligtvis efter denna tid om temperaturen varit konstant. Om lösningen emellertid hade en temperatur av 5 OC, d v s kylskâpskallt, då den pumpades inii behållaren beräknas en längre process- tid ur nämnda kalibreringskurva som kompenserar för att temperaturen i inledningsskedet är lägre än 20 OC. Detta sker genom att processbidragen under varje tidsenhet sum- meIêS. 451 161 Fördelarna med nämnda förfarande inses lätt. Det är således möjligt att välja en hög temperatur, t ex 50 OC, som slut- temperatur för processen men ändå pumpa in lösningar med kraftigt avvikande temperaturer, då den förlängning av totala tiden som detta kräver, korrekt kan beräknas ur kalibreringskurvan. Endast behållaren behöver termostateras i detta fall vilket medför snabbare hantering av lösningar och vidare en förenklad utrustning.

Vid förfarandet enligt uppfinningen roteras gelen i en hållare i stället för att lösningen omröres, t ex med hjälp av magnetomrörare. Detta har visat sig ge ett avsevärt förbättrat resultat. Vi har funnit att en lämplig rotations- hastighet ligger i intervallet 0,1 - 4 Hz, företrädesvis 0,3 - 0,5 Hz, om en hållare med den i Fig l angivna designen används. Rotationen behöver ej vara kontinuerlig, men bör fortgå under minst 20 %, företrädesvis minst 50 % av process- tiden. Alternativa utföringsformer inom ramen för uppfin- ningsidën innefattar t ex alternativa gelhàllare samt drivanordningar som möjliggör byte av rotationsriktning.

Claims (1)

1. 451 161 Krav Förfarande vid efterbehandling, speciellt fixering, infärg- ning respektive avfärgning, av elektroforesgeler innehållande separerade komponenter k ä n n e t e c k n a t a v att gelen placeras pá en hållare, som utgöres av en roterande platta, i en för processen avsedd behållare, vilken behållare är försedd med minst en in-/utloppskanal, en temperatur- sensor och en uppvärmningsanordning, varvid gelen i aktuell fixerings-, infärgníngs- eller avfärgningslösning bringas att rotera under minst 20 %, företrädesvis minst 50 %, av den totala processtid som, baserat på givna processdata och kontinuerlig temperaturmätning, beräknats av en programmerbar elektronisk enhet. vn