SE443803B - Forfarande for enzymatisk framstellning av l-karnitin - Google Patents

Description

- 8103851-s bättringar ofta kan erhållas genom administration av D,L- karnitin. USA-patentskriften 3 810 994 beskriver använd- ning av D,L-karnitin vid behandling av fettma. 4 Nyligen har emellertid en ökande rädsla spridit sig E för att endast använda den vänstervridande isomeren av kar- É nitin för åtminstone några terapeutiska applikationer. på Det har i själva verket visat sig att D-karnitin är en kon- ï kurrerande inhibitor för karnitin-länkade enzymer, t.ex. kar- nitinacetyltransferas (CAT) och karnitinpalmityltransferas (PTC). Det har nyligen visats, att D-karnitin kan utarma hjärtvävnadens halt av L-karnitin. Det är följaktligen väsentligt att uteslutande L-karnitin administreras på pa- @ tienter under medicinsk behandling av hjärtåkommor eller för att sänka blodlipidhalten.

Många förfaranden har föreslagits för att framställa karnitin i industriell skala. Den kemiska syntesen av karni- tin leder emellertid oundviklingen till en racemisk blandning av D- och L-isomererna. Följaktligen måste återupplösnings- metoder (resolution methods) tillgripas för att erhålla de separata optiska antipoderna från racematet.

En typisk återupplösningsmetod, vid vilken D,L-karnitin- amid hydroklorid används som utgångsmaterial för återupplös- ningen, beskrivs i belgiska patentskriften 660 039. Ett sådant förfarande omfattar användning av D-kamfersyra för att framställa D-kamferatet av D,L-karnitinamid. En alkoholisk lösning av denna förening underkastas fraktionerad kristalli- sation till bildning av L-isomeren som första fraktion, vil- ken faller ut i lösningen.

För att bilda D-kamferatet av D,L-karnitinamid är det först och främst nödvändigt att bilda ammoniumsaltet av D- kamfersyra med ammoniak. Det ammonium-D-kamferat som bildas överförs därefter till silver-D-kamferatet genom omsättning med silvernitrat. Eftersom karnitinamiden föreligger i form av hydrokloridsaltet är bildningen av silversaltet väsentlig för att eliminera kloridjonen. Ett sådant förfarande blir därför mycket dyrbart (på grund av den absolut nödvändiga , ..- ~: 8103851-5 användningen av silverföreningen) och svårt att utföra i industriell skala genom de olika åtgärderna i förfarandet som måste utföras i frånvaro av ljus i syfte att undvika mar- kerad svärtning i reaktionsbehållarna på grund av den stora mängd silverklorid som bildas. D-kamferatet av D,L-karnitin- amid kan dessutom bli orent genom närvaron av silverjoner.

Sedan D-kamferatet av L-karnitinamid utkristalliserats ur den alkoholiska lösningen krävs det dessutom ytterligare åtgärder, om föreningen skall överföras till L-karnitin.

Franska patentansökningen 77 22 183 har nyligen beskrivit en enzymatisk process, vid vilken L-karnitin uteslutande syn- tetiseras genom asymmetrisk reduktion av dehydrokarnitin, (CH3)3N+-C82-E-CH2-C00-, med karnitin-dehydrogenas, ett ko- 0 enzym som kan användas av dehydrogenaset för reduktionen, t.ex. nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), och ett kemiskt eller enzymatiskt-reagens som kan reducera den oxiderade formen av NAD till dess reducerade form, NADH. Karnitin-dehydrogenaset isoleras från en bakterie av släktet Pseudomonas.

Detta förfarande liksom även andra förfaranden i syfte att framställa läkemedel är baserat på användning av bakte- rier och har mängd nackdelar: 1. Enzymsystemen måste renas noggrant med åtföljande besvärliga reningsförfaranden och höga kostnader- i synnerhet då förfarandet utförs i industriell skala. 2. Även det bildade L-karnitinet skulle kräva omsorgs- full rening för att separera det från bakteriella metaboliter och föroreningar, som kunde vara toxis- ka och innebära hälsorisker.

Dessutom skulle NADH (en dyrbar reaktant) icke verka sti- mulerande på reaktionen, då intakta bakterier använts, efter- som ämnet icke skulle trängligenom bakteriernas cellvägg.

Genom föreliggande uppfinning framkommer ett förfarande för enzymatisk framställning av uteslutande L-karnitin, vil- ket icke är baserat nå användning av bakterier som källa för det enzymsystem som skall användas vid förfarandet.

W 8103851-5 Uppfinningen är baserad på upptäkten att sporerna av Nuerospora crassa har ett hydroxylasenzym, som 1 beröring med T-butyrobetain i ett hydroxylgruppdonerande lösnings- medel i närvaro av natrium-2-oxoglutarat, ferrøjoner och et: reduktionsmedel, selektivt överför Y-butyrobetain till i huvudsak enbart rent L-karnitin.

Y-butyrobetain, (CB3)N-CH2-CH2-CH2-COOH, är en känd förening och kan lätt framställas genom en kemisk syntes.

Ett förfarande för framställning av Y-butyrobetain beskrivs t.ex. i Can. J. Chem âi (1976) sid. 3310-3311. Innehållet i artikeln är avsett att bilda del av föreliggande ansökning.

Hydroxylering av Y-butyrobetain till L-karnitin är känd för att förekomma i levande organismer. I själva verket har forskningar under några år tillbaka definitivt fastställt att karnitinets biosyntetiska väg är följande: rflš + - _ - H3N -CH2-CH2-C82-CH2-CH-C00 1 ysin S-adenosylmetionin lysin-metyl-transferas (proteinbundet) NH; + _ .

(CH3)3N -CH2-CH2-C82-CH2-åñ-C00 6-N-trimetyl-lysin lvflš (cu3)3N*-ca2-cnzfcnz-ïn-cn-coo' OH trimetyl-3-hydroxi-lysin (ca3)3N*-cnz-cnz-caz-coo' 4-rrimetylamino-butyra: ' L (7-butyro-betain) (ca +-ca--ca-ca -coo' karnitin 3,3” 2 , 2 OH Hydroxylering av ï-butyrobetain till L-karnitin med hjälp av en ur råttlever isolerad partiellt renad löslig proteinfraktion har tidigare beskrivits. Se Biochemistry, vol. 6, No S maj 1967, sid. 1271-1282.

Det har emellertid aldrig tidigare beskrivits att ett 7-butyrobetain-hydroxylas-enzym finns närvarande i sporerna 8103851-5 av Neurospora crassa och att detta hydroxylasenzym kan fri- sättas (så att det blir tillgängligt för v-butyrobetain- överföringen) genom'en behandling av sporerna som åstadkom- mer en modifikation av strukturen.

Enligt uppfinningen är förfarandet för framställning av L-karnitin baserat på omsättning av 1-butyrobetain med ett hydroxylasenzym, och kännetecknas av att det omfattar åt- gärden att man bringar en lösning av (a) 7-butyrobetain; (b) natrium-2-oxoglutarat; (c) ett reduktionsmedel; och (d) en ferrojonkälla som katalysator för hydroxyleringen i ett hydroxylgruppdonerande lösningsmedel i beröring med en fas innehållande utsöndringsprodukterna från sporerna av möglet Neurospora crassa§ Fasen innehållande sporutsöndringsprodukterna erhålles antingen genom kemisk-fysikalisk behandling av sporerna med en detergent eller genom att utsätta sporerna för mekanisk behandling, t.ex. med en ultraljuddesintegrator.

I syfte att optimera utbytet av L-karnitin innehåller lösningen dessutom (e) företrädesvis katalas.

Lösningsmedel Det lösningsmedel i vilket 7-butyrobetain, natrium-2- oxoglutarat, reduktionsmedlet och hydroxyleringskatalysatorn är lösta, är utvalt ur gruppen som omfattar vatten, buffer- lösningar, lägre alkanoler med 1 till 4 kolatomer och bland- ningar därav.

En kaliumfosfatbufferlösning med pH 7 utgör det lämpliga lösningsmedlet.

Reduktionsmedel Reduktionsmedlet för användning vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning är vilket reduktionsmedel som helst som är lämpligt för att reducera ferrijoner (Fe+3) till ferri- joner (Fe+2). be senare verkar som katalysator vid hydroxyle- ringsomsättningen av 7-butyrobetain genom hydroxylasenzymet i sporerna av Neurospora crassa. Följaktligen bör varje 8103851-5 ferrijon som kan bildas omedelbart på nytt överföras till oxidationsstadiet +2.

Icke begränsande exempel på lämpliga reduktionsmedel utgör alkalimetall-ditioniter, askorbinsyra och alkalimetall- salter därav.

Ferrojonkälla Som källa för ferrojoner kan användas vilket som helst ¿ vattenlösligt ferrosalt,vars anjondel icke inaktiverar hydroxy- lasenzymaktiviteten.

Lämpliga ferrosalter är FeSO¿, (NH4)2Fe(SO4)2 och Fe(SCN)2, varvid den förra föreningen är särskilt lämplig. uunseflfinå Spgrer Även om sporerna av vilken stam som helst av Neurospora crassa med fördel kan användas vid förfarandet enligt upp- finningen, har det befunnits att stammarna ATCC 9279, ATCC 13837, ATCC 15514 och ATCC 24924 är speciellt lämpliga.

Förfarandena för tillväxt, isolering och rening av spo- rerna av Neurospora crassa faller inom det som genomsnitts- fackmannen på mikrobiologiområdet kan göra.

Ett lämpligt förfarande är emellertid det förfarande som anges av M. Cortat et all in 'Conidiation of Neurospora Crassa in Submerged Culture without Mycelial Phase', Arch. Micro- biøi. gå, :os-309 (1914). ' De sålunda tillväxta och isolerade sporerna kan lagras obegränsad tid utan förlust av eller väsentlig nedgång i fråga om enzymaktiviteten.

Behandling av sporer sporerna behandlas antingen med en detergent, t.ex.

TRITON X-100, eller med mekaniska anordningar, i synnerhet desintegratorer baserade på ultraljud. Genom dessa behand- lingar frisätts hydroxyleringsenzymet och åstadkommes en fas innehållande ett hydroxyleringsenzym} som kan eller icke kan innehålla âterstoderna av de behandlade sporerna och används vid förfarandet enligt uppfinningen. 8103851-5 Uppmätning av 1-butyrobetain-hydroxylasaktiviteten Y-bytyrobetain-hydroxylasaktiviteten uppmäts i ett reak- tionskärl innehållande en sådan mängd av fasen innehållande spormodifikationsprodukterna, som är tillräcklig för att ge en enzymkoncentration av ca.S-30 p mol/ml, 1-butyrobetain (2-14 mm, (Nn4)2re(so4)2(o,s-2 um, natrmmasxørbat (10-14 mn), natrium-2-oxoglutarat (1,4-3 mm), katalas (1-1,4 g/1) i kaliumfosfatbuffer (14 mM) vid pH 7.

Sedan reaktionsblandningen inkuberats 30-60 min vid 37°C filtreras densamma genom 0,7 MILLIPORE-filter för att avlägsna sporerna och filtratet analyseras efter L-karnitin genom metoden av David J. Pearscn et al., "Methods of Enzymatic Analysis", vol. 4 (2:a upplagan), 1974, sid. 1758, Academic Press, Inc. ~ Provet under examination testas mot en kontroll innehål- lande samma komponenter med undantag av att inget ï-butyro- betain tillsätts.

För att avskilja eventuellt oreagerat 7-butyrobetain från L-karnitin är det lämpligt att använda det av Göran Lindstedt i Biochemistry, vol. 6, nr. 5, maj 1967, sid. 1271- 1282, beskrivna förfarandet.

Av det föregående framgår.att den enzymatiska metoden enligt föreliggande uppfinning ger åtskilliga fördelar över förfaranden enligt teknikens ståndpunkt.

En del av dessa fördelar finns angivna nedan: (1) Utöver de kemiska förfarandena enligt teknikens stånd- punkt (vilka, såsom redan angetts ovan, samtliga ger racemis- ka blandningar av både D- och L-karnitin) erbjuder förfaran- det enligt uppfinningen fördelen att producera uteslutande väsentligen rent L-karnitin i högt utbyte (ca. 80 %). Ater- upplösningen av racematet till den vänstervridande och den högervridande formen och den efterföljande överföringen av den senare till D,L-karnitin genom återupplösning, undviks sålunda totalt. (2) Utöver det enzymatiska förfarandet enligt teknikens ståndpunkt, vilket är baserat på användning av bakterier som källa för det enzym som skall användas vid förfarandet, erbju- 8103851-5 8 der förfarandet enligt uppfinningen den fördelen att inga omständliga och dyrbara reningsförfaranden måste utföras i fråga om antingen det använda enzymet eller det framställda L-karnitinet. Hydroxylasenzymet behöver icke ens isoleras från sporberedningen, vilken kan användas säkert som sådan och det erhållna L-karnitinet utvinnes i huvudsak i ren, kristalliserad form. Med de på bakterier baserade enzymatis- ka förfarandena skulle omvänt både enzymet och framför allt L-karnitinet kräva långtgående rening för att undvika förore- ning av bakterier och bakteriemetaboliter. (31 Sporer av Neurospora crassa kan framställas i stora mängder och lagras i torr form. De kan användas efter önske- mål utan väsentlig förlust av enzymaktivitet.

Claims (9)

8103851-5 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av L-karnitin genom omsättning av Y-butyrobetain med ett hydroxylasenzym, k ä n - n e t e c k n a t a v att man bringar en fas innehållande frisättningsprodukterna från sporer av möglet Neurospora Crassa i beröring med en lösning i ett hydroxylgruppsdoneran- de lösningsmedel av ' a) Y-butyrobetain; b) natrium-2-oxoglutarat;- c) ett reduktionsmedel; och d) en ferrojonkälla som hydrox)leringskatalysator.

2. Föifarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att lösningen även innehåller (e) katalas.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att lösningsmedlet är utvalt ur gruppen som omfattar vatten, bufferlösningar, lägre alkanoler med 1 till 4 kolato- mer och blandningar därav.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att reduktionsmedlet är utvalt från gruppen innehållande ett alkalimetall-ditionit, askorbinsyra och alkalimetall- salter därav.

5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att ferrojonkällan är utvald ur gruppen, som omfattar Peso4, (Nn4)2Fe(so¿)2 och Pe(scN)2.

6. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att möglet av Neurospora crassa är utvalt ur gruppen, som omfattar stammarna ATCC 13837, ATCC 24914, ATCC 9279 och Arcc 15514. '

7. ' 7. Förfarande enligt krav 1, k_ä n n e t e c k n a t a v att fasen innehållande sporfrisättningsprodukterna er- hålles genom att behandla sporerna med en detergent.

8. Förfarande enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t a v att detergenten är TRITON X-100.

9. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att fasen innehållande sporfrisättningsprodukterna er- hålles genom att sporerna utsätts för mekanisk behandling med en disintegrator på ultraljudbasis. 'v