SE0800272A1 - Förfarande för framställning av mikropartiklar innehållande växtsterol - Google Patents

Abstract

Föreliggande uppfinning avses att öka fysiologisk aktivitet och biotillgânglighet hosväxtsteroler genom att blanda kristallina vättsteroler med delvis vattenlösliga material ien smälta för att generera en amorf struktur av växtsteroler. Därefter behandlas detmnorfa materialet med vattenlösnirig under omrörning för att erhålla ett pulver somuppvisar en högt utvecklad yta Pulvret kan separeras från vattenfasen och torkas. Denresulterande produkten används lärnpligen för tillverlmíng av tabletter, piller ellerkapslar-_

Description

UppfinningsområdeDenna uppfinnin g häntör sig till kompositio.piller, för konsumtion av växtsteroler, i form högt utvecklade tvättsvarnpliknande ytor, i s Uppfinningens bakgrundUppkomsten av hj ärt-kärlsj ukdornar hos índ '09 01/26 15:11 FAX 46 8 4291070 BRANN PATENTBYRA AB ~> PRV 0084 6 8 42 9 i 0 701vÄxTsTERoLKoMrosITIoNER MED FöRHöJD B1OTLLLGÄNGLIGHET ner och preparat, i synnerhet tabletter elleri av aktiverade mikropartiklar som uppvisaryfie att sänka kolesterolhalten i blodet. 'vider uppvisar ofta en komplex bakgrund avhängig av ärftliga och åld ersrelaterade faktorer, men därutöver även riskfaktorer beroende av livsfóririg, s.k. modifierbara ris faktorer. Smnmantaget kan dessa faktorer användas till att bedöma den individuella rislken för uppkomst av hj äit-kärlsjukdomar [l , 2]. En av dessa faktorer är halten av kolesteisärskilt höga halter av LDL-kolesterol (Lowstarkt förknippade med en ökad sannolikhet en vital del av eukaryota djur-celler, med ecellmembranet. Därutöver fungerar kolestervitamin D, gallsyror och diverse hormoner [en rad olika kemiskt besläktade växtsteroler skillnaden mellan väntsteroler och kolestero 01 i blodet. Höga serumnivåer av kolesterol,Density Lipoprotein), är epidemiologiskt att utveckla hjärt-kärlsjukd om [3]. Kolesterol*n viktig funktion att balansera fluiditeten i al som byggsten för biosyntes av tex. 4]. Växtceller, å andra sidan, är beroende av För liknande funktioner. Den huvudsakliga ligger i en substituent (vanligtvis metyl- eller etyl-) på kolatom 24 enligt sterolnome iklaturen [5]. Steroler hör till kategorin tfitexpener. 4000 olika triterpener har till dags dato isolerats, omkring 100 av dessa kan klassas som växtsteroler [6, 7]. Intressant nosteroler, medan dj urceller endast har bibehål vâxtsterolema är de så kallade 4-desrnetyl~s“ g har växtceller utvecklat en mångfald.lit kolesterol. De vanligast förekommande :erolemet av vilka sitosterol, stigmasterol, campesterol, brassicasterol och avenosterol de vanligast förekommande växtsterolerna. 4-rnetyl- och 4,4~dimetyl-steroler är mindre råmaterial i syntesen Ll-desmetyl-steroler [växtsterolenta en dubbelbindning vid kolat mättade steroler, så kallade stanoler, kan äve vanligt förekommande och används som 7ïnYttennera bär de vanligast förekommande s, följaktligen kanas de AS-stefolef. rum :n isoleras från sädesslagskällor, fram fiir allt 'os 01/26 15:11 FAX 46 s 4291070 BRANN PATENTBYRA AB -> PRV Elmia46 8 4291070 råg och vete. Växtsteroler kan extraheras från de oljerika delarna av växter, och därtöräven från motsvarande växtolj or, så som majs-, raps- eller tallolja [8].

Då växtsteroler fiirekornmer i praktiskt taget allt växtrnaterial innehåller en typiskvästerländsk diet ungefär 100 till 400 mg av växtsteroler per dag, vegetarianer placerarsig naturligtvis i den övre delen av detta intervall [9]. De stora kemiska likhetema mellanväxtsteroler eller kolesterol till trots, kan en tydlig skillnad uppmätas i responsen tillkonsumtion av växtsteroler eller kolesterol. Medan kolesterol effektivt absorberas i tarm en, absorberas växtsterolerria, å andra sidan, knappast över huvud taget. Därutöverföreligger en markant skillnad i responsen till dessa molekyler i serumet. Kolesterollagras i kroppen, medan växtsteroler vanligtvis snabbt avstöts genom gallan. Demolekylära skillnaderna leder till att kolesterolabsorptionen i tannen effektivt blockerasmed hjälp av växtsteroler.

De kolesterolsänkande egenskaperna hos växtsteroler dokumenterades Först tidigt 50-talgenom studier av kolesterolabsorption hos kycklingar som matades med växtsterolberíkatfoder utförda av Peterson [l 0]. Förståelsen av växtsterolers effekt på djur och människorförbättrades genom studier utförda av Pollak, Best, F arquar och många andra [11].Typiskt erhålls en kolesterolsänlming i storleksordningen 10 % vid konsumtion avadekvata doser av växtsterol, med nästan uteslutande en sänkning av LDL-kolesterolserumhalter; varken l-lDL-kolesterol- eller triglyeeridserurrihalter påverkassignifikant [12]. Cytellin, ett kolesterolsärilmnde preparat baserat på krístallinaväxtsteroler lanserades av Eli Lilly redan 1955. Produkten uppvisade ett antal svåratillkortakomrnanden, så som en dålig sensorisk profil och, av större vikt, en synnerligenhög dagsdos för klinisk verkan -i storleksordningen tiotals gram. Följaktligen drogsprodukten tillbaka från marknaden 1982. 1995 lanserade Raisio Benecol, ett margarinbaserat på en patenterad metod för beredning av stanoler, hydrogenerade steroler,fórestrade med fettsyror. Genom sammanlânkningen av stanoler med fettsyror viatöresiring kan oljelösligheten ökas med en tiopotens. Därutöver observerades en markantökning i stanolers/sterolers fysiologiska verkan, då en 10 till 15 % sänkning av LDL-kolesterol kunde uppnås vid daglig dosering i intervallet 1 till 3 g. Sedan 1995 har ettantal liknande produkter och tekniska lösningar presenterats [8]. Ett antal teorier har fiamlagts gällande vwsterolers kolesterolsärikande mekanism, Lex. genom tävling i '09 01/26 15:11 FAX 46 8 4291070 BRANN PÅTENTBYRA AB -> PRV Qlülü 46 8 4291070 miceller i tarmen, blockering av cellulära receptorer på tarrnväggen och/eller ökadomvänd transport tillbaka in i tannutryrnmct. Oavsett den exakta rnekanismen beror denkolesterolsänlcande verkan av en sänkning av kolesterolabsorptionen till serumet medungefar 50 %. Det är viktigt att notera att växtsteroler absorberas i låg utsträckning, runt5 %, i jämförelse med runt 60 % för kolesterol. Vidare reducerar den snabba avstötriingenvia gallan den cirkulerande poolen av växtsterol till mindre än l % i en frisk individ.Ytterinera omvandlas inte växtsternler till kolesterol eller vice versa i däggdjur varför cirkulerande växtsteroler endast härrör från konsumerad föda.

Värt att notera är att varken kristallina steroler eller växtsterolesfiar är direkt tillgängligaför kolesterolsänkande ändamål, snarare behöver växtsterolrnolekylerna föreligga ihydrolyserat och dissocierat tillstånd för att effektivt påverkakolesterolabsorptiOrlsprocessen i tarmen [13].

Tekniska lösningar för att leverera växtsterolberikade preparat kan indelas i tvåhuvudkategorier: i) Kemislct, d.v.s. genom kovalent bindning, förändrade växtsteroler,t.ex. törestrade vâxtsteroler eller växtstanoler; ii) Fysikaliskt-kemiskt modifieradeväxtsteroler, beroende av svag växelverkan tör att bibehålla växtsteroler i biotillgänglig,fysiologiskt aktiv form. Pâ grund av deras relativt låga smältpunkt och förhöjdaoljelöslighet kan törestrade växtsteroler vanligtvis genom ernulgcring med delvishydrolyserade lipider och gallsyror bilda system som uppvisar relativt liten droppstorlekoch därigenom stor ytarea med lätthet tillgänglig för lipasaktivitet i tarmen. Lipaserhydrolyserar i sin tur den kovalenta bindnin gen mellan fettsyra och växtsterol och frigörväxtsterolerna i monomolkylär dissocierad fisiologiskt aktiv form. Vanliga problem somkan uppstå vid tillämpning av förestrade växtsteroler är: Förkortad produktlivslängd, sommedför krav på kylda lörvarlngsutryrnmen. Därutöver ökar de kemiska processtegenavsevärt produktionskostnadema och förändrar sammansättningen och/eller den kemiskastrukturen från den naturliga sammansättningen och strukturen som återfinns i detursprungliga växtrnaterialet. Tekniska lösningar som baseras på fysikalisk-kemiskaförändringar av steroler inbegriper: i) Upplösning av steroler, dock endast till nivåer omett par procent, i lämpliga oljor, ii) Bildning av miltrokristallina suspensioner för att garantera en stor yta mellan sterolkristaller och omgivande livsmedelsmatris, iii) Bildning 'os 01/26 15:11 FAX 46 s 4291070 BRANN PATENTBYRA AB s PRV o1146 8 4291070 av olj e- eller vattenbaserade emulsioner genom tillämpning av lämpligaemulgeringsmedel med eller utan tillsats av kristalltillväxtinhibitorer. Den fysiologiskaeffektiviteten hos luistalliiia växtsteroler är fortfarande högst tvivelaktig, och det är intetroligt att dessa preparat tillhandahåller en lika effektiv kolesterolsänkande verkan somLex. en lämpligt beredd emulsion eller växtsterol- eller växtstanolestrar i en lämpligoljebaserad miljö. Emulsionsbaserade tekniska lösningar tenderar att ge upphov till ännusvårare problem med produktlivslängd än sterol- eller stanolesnar. Dessutom tenderaremulsionsbaserade sterolberedningar att till sin natur vara termodynarniskt iiistabila,d.v.s. de är vanliga emulsioner (ej mikroernulsioner), och beror därav på tillsats av lämpliga stabiliseringsmedel för lângtidsstabilitet.

Lämpliga livsmedelsmatriser inkluderar mej eriprodukter, såsom mjölk och yoghurt,juicer och juicedrycker, feta bredbara smörgåspålägg eller livsmcdelsoljor och bröd.Berikning av flertalet av de nämnda livsmedelsprodulcterna med växtsteroler innefattarutspädning av växtsterolerna till en relativt låg koncentration, vanligtvis klart under 10 %,i produkter med begränsad livslängd.

Sammanfattningsvis, utvecklingen av biotillgängliga, eller fysiologiskt aktiva,beredningar av växtsteroler har det gemensamt att en stor tillgänglig yta måste genereras itarmen fiir att tillgodose en effektiv molekylâr transport till de aktiva centrumen ochunderlätta esteras- och lipasaktivitet. På grund av den relativt stora rekommenderadedoseringen, l till 3 gram om dagen, har de flesta våxtsterolberikade livsmedel doseringari storleksordningen 20 till 40 gram bredbart pålägg, eller l0O till 200 ml av dryck. Därförär dessa tekniska lösningar otillräckliga för att bereda torra och, med avseende påvâxtsteroler, högt koncentrerade och fysiologiskt högaktiva slutprodukter, såsom tablettereller pulver, på grund av stabilitetsproblem vid långtidsförvaring, i vissa fall den lågafysiologiska aktiviteten hos sterolberedningen eller det fysikalisk~kemiska tillståndet hossterolberedningen, Lex. produkten är i vätskeforrn. Mot denna bakgrund är det tydligt attmed inriktning mot kolesterolsänlming är fysiologiskt aktiva amorfa mikropaitiklar innehållande växtsteroler med en stor utvecklad yta eftersu-ävansvärda. '09 01/26 15211 FAX 46 8 4291070 BRANN PÅTENTBYRA AB -> PRV 012 46 8 429l070 Utvecklingen av effektiva beredningar av växtsteroler för produktion av kompakta ochkoncentrerade vehíklar, såsom tabletter eller kapslar, ger i likhet med populära vitamin-och mineralberedningar upphov till stora fördelar for såväl producenten somkonsumenten av växtsterolprodultten. Växtsterolberednirigen måste prepareras pâ etteffektivt sätt fór att en höggradigt biotillgänglig form av växtsterolberedningen skabibehållas, till och med efter slutforrnulering och tablettpressning, utan törlust avaktivitet- Relativt få patent beskriver kompositioner och metoder för beredning avväxtsterolberikade tabletter eller piller. Pat US2006/0024352 beskriver tillverkning avkosttillskott berikade med växtsteroler i form av tabletter, kapslar eller suspensioner.Uppfmningen beskriver tillämpningen av mikroniserade eller icke-milcroniserade pulverav steroler i kombination med vanliga tablettexcipienter. Ingen speciell form avberedning för att höja växtsterolernas fysiologiska aktivitet beskrivs.

US pat 2006/0234948 beskriver växtsterolkompositioner innehållande lignaner fiirtillverkning av tabletter innehållande mellan 50 och 400 mg av växtsteroler. Växtsteroleroch andra ingredienser beskrivs endast som fint sönderdelade.

US pat 20061025 1790 beskriver växtsteroler omkristalliserade itriglycerider för tablett-eller pillertillämpnirigar.

Stanol-lecitinlösnirxgar i kloroform har använts for produktion av mikropartildar fiån enblandning av växtstanoler och lecitin genom spraytorknin g följt av granulering medpolyvinylpyrrolidon och andra excipienter. Tabletter som erhålls frân denna särskildakomposition och tillverkningsmetod uppvisar en statistiskt signifikant kolesterolsänkandeverkan. Dessa resultat påvisar att högaktiva mikropartiklar kan erhållas, den presenterademetod framstår dock som svår att tillämpa på industriell Skala [14]. i Våra preliminära studier visar på att det finns metoder att enkelt och effektivt omvandlaväxtsterolkristaller med låg fysiologisk aktivitet till partiklar med hög koncentration avväxtsteroler som uppvisar en avsevärt ökad fysiologisk kolesterolsârrkande verkan.Processen innefattar ett antal steg och tillhandahåller en metod som endast inbegriper ingredienser av livsmedels- eller motsvarande farmakopékvalitet Beskrivning av uppfinningen '09 01/26 15:12 FAX 46 8 4291070 BRANN PÅTENTBYRA AB -> PRV 013 46 8 4291070 6 Gemensamt fór kristallina steroler är att starka van der Waals-interaktioner ochvätebindningar stabiliserar kristallstruktmen. I vattenlösning bidrar också den hydrofobaeffekten till att effektivt minska den tillgängliga ytan mot omgivningen. Genom attblanda med vissa ämnen, såsom tensider fiån gruppen nonjoniska, anjoniska ellerzwittctj oniska tensider med en isomerisk sammansättning på kolvätekedjan mellan 8 och20 kolatomer, mono- eller diglyceríder eller fettsyror kan den lcristalliria ordningen brytasfor att generera en :unorf struktur som möjliggör vidare behandling. Följaktligen kan enamorf, icke-kristallin struktur erhållas genom att blanda växtsteroler med delvisvattenlösli gt material, Lex. tensider eller suspensionsstabiliseräde ämnen, fettsyror ellerfettsyraderivat till en komposition som vid smältning genererar en molekylär blandning Ikarakteriserad av en homogen massa bestående av endast en amorf fas. Därefter kan denmolekylära blandningen malas eller på andra sätt fint sönderdelas eller rivas. Därefierblandas det fint sönderdelade pulvret med vatten i närvaro eller frånvaro avsuspensionstabiliserande ämnen, magnesium-, kal cium- eller natriumkarbonater ellermotsvarande vätekarbonater eller -hydroxiden Under omrörning löses den delvisvattenlösliga komponenten av pulvret ut i vattnet och genererar en osmotisk fördelningmellan vattenbulklösningen och växtsterohnikropartikeln. Typiskt uppvisar enmikroniserad beredning av växtsteroler runt 50 m2 yta/ g växtsterol. Vi uppskattar att ytankan ökas till menen 1oo een soo m* yta/g vaxieiefrn genom inblandning med delvisvattenlösligt material, som bidrar till att sänka ytspänningen mot vattenlösningen ochtillika delvis löses ut, vilket resulterar i en uppruggad yta såväl som porer irnikropartiklarna. Därutöver kan ytterligare delvis vattenlösliga komponenter, såsomtensider, sättas till vattenlösningen för att öka effektiviteten i behandlingen avväxtsterolrnilcropartiklarria. Vidare kan ytterligare komponenter tillsättas för attstabilisera det porösa tillståndet för de behandlade mikropartiklarna, Lex. pektin, stärkelseeller liknande polysackaridmaterial. Genom kontroll av behandlingsmetoden medavseende på omrörningsfiârhållanden, temperatur hos vattenbulken och koncentration ochsammansättning av de vattenlösliga tillsatta komponenterna kan porositet ochhygroskopiska egenskaper, d.v.s. vätbarhet, hos pzutiklarnas porer finj usteras, vilket harstor betydelse med avseende på upplösningstakten och solubiliseríngen av växtsterolerna i den slutliga produktformen, vilket i sin tur i stor utsträckning bestämmer den '09 0_l._/__26 15:12 FAX 46 8 4291070 BRANN PÅTENTBYRA AB -> PRV 014 46 8 429l070 fysiologiska aktiviteten hos växtsterolberedningen. Det finns möjligheten att utarbetaönskvärda egenskaper hos växtsterolniilcropartildama, vilket ger omfattandekontïollmöjligheter med avseende på partiklarna för att Optimeraslutprodulctegenskapeina. De behandlade mikropartildarna kan separeras frånvattenlösningen genom filtrering, eentrifugering, avdunstning av vatten eller vilken somhelst känd form av separationsteknik. Partiklama kan torkas För erhållande av ettproduktpulver med utmärkta egenskaper med avseende på fysiologisk kolesterolsänkandeaktivitet och sensoriska prestanda. Produktpulvret kan användas för tillverkning avtabletter, piller, kapslar eller sättas till livsmedel på olika sätt-_ En preliminär klinisk studieutfiârd med tabletter tillverkade enligt de beskriva principerna har bekräfiat attÜsiclogiskt hö gaktiva växtsterolmikropartiklar kan erhållas och bibehållas i slutligtablettform. Uppfinningens beskaffenhet illustreras, men begränsas inte, av Följande exempel.

Exempel Exempel l. 70 g växtsterol, 26 g stearinsyra och 4 g mono-glyceryl-myristat blandas ochsmâlts genom uppvärrnning till en homogen lösning vid en uppskattad smältpurikt på ca.95 °C. Lösningen kyls och överförs till och rnals i en kvarn- Därefier överförs detresulterande pulvret till 0,5 liter vatten vid rumstemperatur och omrörs varsamt, 100 varvper minut med en paddelomrörare. Efter 30 mirluters omrörning separerasväxtsterolrnikropartilclama 'från vattenlösningen genom tiluering och torkas undervakuum. Utbyte: 98,7 gram växtsterolrnilrropartiklar med en medelstorlek på 30 um.

Exempel 2. 70 g växtsterol, 26 g stearinsyra och 4 g mono-glyceryl-myristat blandas ochsrnälts genom uppvärmning till en homogen lösning vid en uppskattad smältpunld på ca.95 °C. Lösningen kyls och överförs till och mals i en kolloidkvarn. Därefter överförs detresulterande pulvret till 0,5 liter vatten innehållande 2 % lecitin vid rumstemperatur ochomrörs vid 20000 varv per minut med en turrax. Efter 10 minuters omrörning separerasväxtsterolrnilcopartiklama från vattenlösningen genom filtrerin g och torkas under valcuum. Utbyte: 96,3 gram växtsterolmikropartiklar med en medel storlek på 15 um. 'os 01/26 15:12 FAX 46 s 42s1u7o BRANN PATENTBYRA As s PRV 01546 8 4291070 Exempel 3, 70 g växtsterol, 26 g stearinsyra och 4 g mono-glyceryl-stearat blandas ochsniälts genom uppvärmning till en homogen lösning vid en uppskattad smältpunkt på ca.94 °C_ Lösningen kyls och överförs till och mals i en kolloidkvarn. Därefier överförs detresulterande pulvret till 0,5 liter vatten innehållande 0,5 % dinatriunikarbonat vidrumstemperatur och omrörs vid 20000 varv per minut med en turrax. Efter 10 minutersomrörning separeras växtsterolmikropartiklarna från vattenlösningen genom filtreringoch torkas under vakuum. Utbyte: 98 gram växtsterolrnikropartildar med en medelstorlekpå 15 um.

Exempel 4. 70 g växtsterol, 28 g stearinsyra och '2 g monov-glyceryl-laurat blandas ochsmâlts genom uppvärmning till en homogen lösning vid en uppskattad smâltpunkt på ca.99 °C. Lösningen kyls och överförs till och mals i en kolloidkvam. Därefier överförs detresulterande pulvret till 0,5 liter vatten innehållande 0,5 % pektin vid rumstemperatur ochomrörs vid 20000 varv per minut med en turrax. Efter 10 minuters omrörning separerasvâxtsterolmilcropartiklarna från vattenlösningen genom filtrering och torkas undervakuurn. Utbyte: 99,6 gram växtsterolrnilcropartiklar med en rnedelstorlek på 15 um.

Exempel 5. 70 g växtsterol, 26 g stearinsyra och 4 g mono-glyceryl-myristat blandas ochsmälts genom uppvärmning till en homogen lösning vid en uppskattad smältpunkt på ca.95 °C. Lösningen kyls och överförs till och mals i en kolloidkvam. Därefter överförs detresulterande pulvret till 0,5 liter vatten vid rumstemperatur och omrörs vid 20000 varvper minut med en turrax. Efier 10 minuters omrörning separerasväxtsterolmilšropartiklarna från vattenlösningen genom filtrering och torkas undervakuum. 50 g av det resulterande produktpulvret blandas med 30 g xylitol, 10 gpregelatiniserad majsstärkelse, 4 g askorbinsyra, 0,5 g aspartam och 0,8 g mentol.Blandningen pressas direkt till tuggbara tabletter av totalvikt 1,4 g innehållande 500 mgväxsterol med utrnärkta resultat med avseende på friabilitet, stabilitet och sensoriska prestanda.

Exempel 6. 70 g väsrtsterol, 26 g steaiinsyra och 4 g mono-glyceryl-myristat blandas och smälts genom uppvärmning till en homogen lösning vid en uppskattad smältpunkt på 95 '09 01/26 15:12 FAX 46 8 4291070 BRANN PITENTBYRA AB -> PRV 016 46 8 4291070 °C. Lösningen kyls och överfiñrs till och mals i en kolloidlwam. Därefter överförs detresulterande pulvret till 0,5 liter vatten innehållande 2 % lecitin vid rumstemperatur ochomrörs vid 20000 varv per minut med en turrax- Efter 10 minuters omrörning separerasväxtsterolrnikropartiklarna från vattenlösníngen genom filtrering och torkas undervakuum. Produktpulvret granuleras från en mcdclpartiltelstorlek om 15 pm till 150 pm.50 g av det resulterande granulerade produktpulvret blandas med 5 g mikrokrisrallincellulosa, 10 g pregelatiniserad majsstärkelse, 4 g naüiumkroskamiellos och 2 gmagnesiumstearat. Blandningen pressas direkt till tabletter av totalvikt 1 g innehållande700 mg växsterol med utmärkta resultat med avseende på fi-iabilitet, stabilitet och sensoriska prestanda.

Referenser 1. Wood, D.; de Becker, G.; Faergeman, 0.; Graham, 1.; Mancia, G.;Pyöräla, K. et al. European Heart Journal, 1998, 19, 1434. 2. Grundy, S. IVL; Cleeman, J. I.; Daniels, S. R.; Donato, K. A.; Eckel, R. 1-1.;Franklin, B. A.; Gordon, D. 1.; Krauss, R. IVL; Savage, P- 1.; Smith, S- C-JL; Spertus, .T . A.; Costa, F. Circulation, 2005, 112, 2735. 3. Law, M. R.; Wald, N. 1.; Thompson, S. G. Br. Med. J. 1994, 308, 367. 4. Stryer, L. Biochemistry 4* ed. W. H. Freeman and Czo: New York 1995sid. 691-710. 5. Moss, G. P. The namenclature of steroids. Recommendatiorzs TUPAC-TheInternational Union of Pure and Applied Chemistry Eur. J. Biochem.1989, 186, 429. 6. Methods in Plant Biochemistry vol. 7 Goad, J- L.; Charlewood, B. V_;Banrhorpe, D. V. eds. London: Academic Press 1991 sid. 369-434. 7. Akíhisa, T.; lšokke, W. C. M. C.; Tamura, T. Physiology andBiochemistry of sterols Patterson, G. W.; Nes W. D. red. American OilChemists Society 1991 sid. 118-157. 8. Moreau, R. A.; Whitaker, B. D.; Hicks, K. B. Progress Lipíd Res. 2002,41, 457. '09 01/26 15:12 FAX 46 8 4291070 BRANN PÅTENTBYRA AB -> PRV 017 46 8 4291070 9. Piironcn, V.; Lindsay, D. G.; Miettinen, T. A.; Toivo, J .; Lampi, A.-L. J.Sci. FoodAgric. 2000, 80, 939. 10- Peterson, D. W. Proc. Soc- Exp. Med. Bíol. 1951, 78, 143. 11. Pollak. O. J .; Kritchevsky, D. A. Monographies in Atherasclerosis:Sitosterol Karger: Basel 1981- 12. Katan, M-; Grundy, S. M.; Jones, P.; Law, M-; Miettinen, T.; Paoletti, R.Maya Clin. Prcc. 2003, 78, 965- 13. Mattson, F. M. Grundy, S. M.; Crouse, J- R- Am. J. Clin. Nutr. 1982, 35,697. 14. McPherson, T. B.; Ostlund, R. E; Goldberg, A. C.; Bateman, I. I-I.;Schimmoeller, L; Spilburg, C. A. J. Pharm. Pharmacol. 2005, 57, 889. 15. Pat U'S2006/0024352; U.S. pat2006/0234948; U.S. pat2006/0251790