RU2821573C1 - Method for searching for atp7b gene mutations for diagnosing wilson's disease (wilson-konovalov) - Google Patents
Method for searching for atp7b gene mutations for diagnosing wilson's disease (wilson-konovalov) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2821573C1 RU2821573C1 RU2023110354A RU2023110354A RU2821573C1 RU 2821573 C1 RU2821573 C1 RU 2821573C1 RU 2023110354 A RU2023110354 A RU 2023110354A RU 2023110354 A RU2023110354 A RU 2023110354A RU 2821573 C1 RU2821573 C1 RU 2821573C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- mutant
- mutation
- primers
- exon
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 title claims description 38
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 title claims description 35
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title abstract description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 124
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 claims abstract description 43
- 101150075644 ATP7B gene Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 124
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 80
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 34
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 102200157552 rs28942074 Human genes 0.000 claims description 5
- 102200157153 rs76151636 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 4
- 102220047415 rs137853283 Human genes 0.000 claims description 4
- 102200157554 rs137853284 Human genes 0.000 claims description 4
- 102200159142 rs137853285 Human genes 0.000 claims description 4
- 102200157651 rs28942076 Human genes 0.000 claims description 4
- 102200157335 rs376910645 Human genes 0.000 claims description 4
- 102200157327 rs746485916 Human genes 0.000 claims description 4
- 102200159203 rs752850609 Human genes 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 abstract description 54
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 47
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 17
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 14
- 102100027591 Copper-transporting ATPase 2 Human genes 0.000 description 14
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000007838 multiplex ligation-dependent probe amplification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 101000936280 Homo sapiens Copper-transporting ATPase 2 Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000032538 Depersonalisation Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001317821 Eremina Species 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010023321 Kayser-Fleischer ring Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000008948 Menkes Kinky Hair Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000012583 Menkes disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000025341 autosomal recessive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011867 re-evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102200157197 rs121907990 Human genes 0.000 description 1
- 102200157703 rs121907994 Human genes 0.000 description 1
- 102200157147 rs1286080173 Human genes 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике болезни Вильсона-Коновалова, вызывающей избыток меди в организме, приводящий к отложению меди в различных органах человека.The invention relates to the field of medicine and can be used in the molecular genetic diagnosis of Wilson-Konovalov disease, causing excess copper in the body, leading to copper deposition in various human organs.
Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК, WD) (OMIM 277900) или гепатолентикулярная дегенерация (ГЛД) - это аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, обусловленное нарушением метаболизма меди, которое возникает в результате различных мутаций в гене ATP7B. Несмотря на давнюю историю, хорошую изученность и успешное лечение, БВК до сих пор остается тяжело протекающим заболеванием, которое приводит к утрате трудоспособности, деструктивно влияя на качество жизни пациентов [Еремина Е.Ю. Болезнь Вильсона-Коновалова. Вестник современной клинической медицины. 2011;4(1):38-46.]. Согласно официальной статистике выявляемость БВК составляет 1:35 000-45 000 населения. Вместе с тем, периодически появляются указания на регионы с высокими показателями заболеваемости (превышающие традиционные в 3 - 4 раза) [Shimizu N, Fujiwara J, Ohnishi S, Sato M, Kodama H, Kohsaka T, Inui A, Fujisawa T, Tamai H, Ida S, Itoh S, Ito M, Horiike N, Harada M, Yoshino M, Aoki T. Effects of long-term zinc treatment in Japanese patients with Wilson disease: efficacy, stability, and copper metabolism. Transl Res. 2010 Dec;156(6):350-7. doi: 10.1016/j.trsl.2010.08.007. Epub 2010 Sep 23. PMID: 21078496.; Coffey AJ, Durkie M, Hague S, McLay K, Emmerson J, Lo C, Klaffke S, Joyce CJ, Dhawan A, Hadzic N, Mieli-Vergani G, Kirk R, Elizabeth Allen K, Nicholl D, Wong S, Griffiths W, Smithson S, Giffin N, Taha A, Connolly S, Gillett GT, Tanner S, Bonham J, Sharrack B, Palotie A, Rattray M, Dalton A, Bandmann O. A genetic study of Wilson's disease in the United Kingdom. Brain. 2013 May;136(Pt 5):1476-87. doi: 10.1093/brain/awt035. Epub 2013 Mar 21. PMID: 23518715; PMCID: PMC3634195.]. В России ежегодная выявляемость БВК составляет 1:167000, при гетерозиготном носительстве 1:100 и расчетной распространенности - 1:10000, что указывает на проблемы диагностики данного заболевания [Баязутдинова Г.М., Щагина О.А., Поляков А.В. Мутация с.3207C>A гена АТР7В - наиболее частая причина гепатолентикулярной дегенерации в России: частота и причина распространения. Медицинская генетика. 2018;17(4):25-30. DOI: 10.25557/2073-7998.2018.04.25-30.].Wilson-Konovalov disease (WD) (OMIM 277900) or hepatolenticular degeneration (HLD) is an autosomal recessive inherited disorder of copper metabolism that results from various mutations in the ATP7B gene. Despite its long history, good study and successful treatment, BVD still remains a severe disease that leads to loss of ability to work, destructively affecting the quality of life of patients [Eremina E.Yu. Wilson-Konovalov disease. Bulletin of modern clinical medicine. 2011;4(1):38-46.]. According to official statistics, the detection rate of BVD is 1:35,000-45,000 of the population. At the same time, periodically there are indications of regions with high incidence rates (3-4 times higher than traditional ones) [Shimizu N, Fujiwara J, Ohnishi S, Sato M, Kodama H, Kohsaka T, Inui A, Fujisawa T, Tamai H, Ida S, Itoh S, Ito M, Horiike N, Harada M, Yoshino M, Aoki T. Effects of long-term zinc treatment in Japanese patients with Wilson disease: efficacy, stability, and copper metabolism. Transl Res. 2010 Dec;156(6):350-7. doi: 10.1016/j.trsl.2010.08.007. Epub 2010 Sep 23. PMID: 21078496.; Coffey AJ, Durkie M, Hague S, McLay K, Emmerson J, Lo C, Klaffke S, Joyce CJ, Dhawan A, Hadzic N, Mieli-Vergani G, Kirk R, Elizabeth Allen K, Nicholl D, Wong S, Griffiths W , Smithson S, Giffin N, Taha A, Connolly S, Gillett GT, Tanner S, Bonham J, Sharrack B, Palotie A, Rattray M, Dalton A, Bandmann O. A genetic study of Wilson's disease in the United Kingdom. Brain. 2013 May;136(Pt 5):1476-87. doi: 10.1093/brain/awt035. Epub 2013 Mar 21. PMID: 23518715; PMCID: PMC3634195.]. In Russia, the annual detection of BVD is 1:167000, with heterozygous carriage of 1:100 and estimated prevalence of 1:10000, which indicates problems in diagnosing this disease [Bayazutdinova G.M., Shchagina O.A., Polyakov A.V. Mutation c.3207C>A of the ATP7B gene is the most common cause of hepatolenticular degeneration in Russia: frequency and cause of distribution. Medical genetics. 2018;17(4):25-30. DOI: 10.25557/2073-7998.2018.04.25-30.].
БВК принадлежит к группе заболеваний, которые требуют диагностики на ранних этапах развития болезни. Диагноз БВК определяется сочетанием клинических проявлений и лабораторных показателей, которые указывают на нарушение обмена меди с ее накоплением в печени и мозговой ткани - снижением содержания церулоплазмина в сыворотке крови и повышения суточной экскреции меди с мочой. Однако эти стандартные тесты на раннем этапе заболевания могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Невозможность диагностировать пациента с БВК на раннем этапе заболевания может привести или к потере возможностей патогенетической терапии, или к несоответствующему введению потенциально токсичных препаратов таким пациентам при ложноположительной диагностике [European Association for Study of Liver. EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. J Hepatol 2012;56(03):671-685.; Ferenci P, Stremmel W, Członkowska A, Szalay F, Viveiros A, Stättermayer AF, Bruha R, Houwen R, Pop TL, Stauber R, Gschwantler M, Pfeiffenberger J, Yurdaydin C, Aigner E, Steindl-Munda P, Dienes HP, Zoller H, Weiss KH. Age and Sex but Not ATP7B Genotype Effectively Influence the Clinical Phenotype of Wilson Disease. Hepatology. 2019 Apr;69(4):1464-1476. doi: 10.1002/hep.30280. Epub 2019 Mar 1. PMID: 30232804.].BVD belongs to a group of diseases that require diagnosis in the early stages of the disease. The diagnosis of BVD is determined by a combination of clinical manifestations and laboratory parameters that indicate a violation of copper metabolism with its accumulation in the liver and brain tissue - a decrease in the content of ceruloplasmin in the blood serum and an increase in the daily excretion of copper in the urine. However, these standard tests early in the disease may produce both false-positive and false-negative results. Failure to diagnose a patient with BVD at an early stage of the disease can lead to either the loss of pathogenetic therapy opportunities, or to the inappropriate administration of potentially toxic drugs to such patients in the event of a false positive diagnosis [European Association for the Study of Liver. EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. J Hepatol 2012;56(03):671-685.; Ferenci P, Stremmel W, Członkowska A, Szalay F, Viveiros A, Stättermayer AF, Bruha R, Houwen R, Pop TL, Stauber R, Gschwantler M, Pfeiffenberger J, Yurdaydin C, Aigner E, Steindl-Munda P, Dienes HP, Zoller H, Weiss KH. Age and Sex but Not ATP7B Genotype Effectively Influence the Clinical Phenotype of Wilson Disease. Hepatology. 2019 Apr;69(4):1464-1476. doi: 10.1002/hep.30280. Epub 2019 Mar 1. PMID: 30232804.].
Клиническая диагностика БВК затруднена в связи с широким спектром клинических проявлений и с отсутствием типичных симптомов у пациентов с этим заболеванием. Подозрение на БВК должно возникать в каждом случае необъяснимой печеночной, неврологической или психической дисфункции. При этом методы и тесты для диагностики БВК значительно отличаются у пациентов с печеночной дисфункцией и психоневрологической симптоматикой [European Association for Study of Liver. EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. J Hepatol 2012;56(03):671-685.; Ferenci P, Stremmel W, Członkowska A, Szalay F, Viveiros A, Stättermayer AF, Bruha R, Houwen R, Pop TL, Stauber R, Gschwantler M, Pfeiffenberger J, Yurdaydin C, Aigner E, Steindl-Munda P, Dienes HP, Zoller H, Weiss KH. Age and Sex but Not ATP7B Genotype Effectively Influence the Clinical Phenotype of Wilson Disease. Hepatology. 2019 Apr;69(4):1464-1476. doi: 10.1002/hep.30280. Epub 2019 Mar 1. PMID: 30232804.].Clinical diagnosis of VWD is difficult due to the wide range of clinical manifestations and the lack of typical symptoms in patients with this disease. VCD should be suspected in every case of unexplained hepatic, neurological or psychiatric dysfunction. However, methods and tests for diagnosing BVD differ significantly in patients with liver dysfunction and neuropsychiatric symptoms [European Association for Study of Liver. EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. J Hepatol 2012;56(03):671-685.; Ferenci P, Stremmel W, Członkowska A, Szalay F, Viveiros A, Stättermayer AF, Bruha R, Houwen R, Pop TL, Stauber R, Gschwantler M, Pfeiffenberger J, Yurdaydin C, Aigner E, Steindl-Munda P, Dienes HP, Zoller H, Weiss KH. Age and Sex but Not ATP7B Genotype Effectively Influence the Clinical Phenotype of Wilson Disease. Hepatology. 2019 Apr;69(4):1464-1476. doi: 10.1002/hep.30280. Epub 2019 Mar 1. PMID: 30232804.].
В настоящее время ни один из доступных лабораторных тестов нельзя признать универсальным и специфичным для ранней диагностики БВК [European Association for Study of Liver. EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. J Hepatol 2012;56(03):671-685.]. Для точной постановки диагноза используется соответствие критериям Лейпцига, которые были приняты на 8-м Международном совещании по БВК и болезни Менкеса и приняты в Европейской ассоциации по изучению печени [European Association for Study of Liver. EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. J Hepatol 2012;56(03):671-685.]. Ключевыми клиническими диагностическими признаками, которые легли в основу формирования критериев Лейпцига, стали признаки печеночной дисфункции, острый гемолиз с почечной недостаточностью, расстройства двигательных функций, нервно-психические расстройства и кольца Кайзера-Флейшера на роговице [Ferenci P, Merle U, FolhoVer A, Evstatiev R, Yurdaydin C, Bruha R et al (2005) Phenotype-genotype correlations in Wilson Disease (WD)-results of a multinational study. Hepatology 42(Suppl 1):258A]. Данная система оценки БВК обеспечивает хорошую диагностическую точность у пациентов с ярко выраженными симптомами болезни, но не способна продемонстрировать высокую эффективность у пациентов на ранних этапах заболевания или у их родственников [Nicastro E, Ranucci G, Vajro P, Vegnente A, Iorio R. Re-evaluation of the diagnostic criteria for Wilson disease in children with mild liver disease. Hepatology. 2010 Dec;52(6):1948-56. doi: 10.1002/hep.23910. Epub 2010 Oct 21. PMID: 20967755.].Currently, none of the available laboratory tests can be considered universal and specific for the early diagnosis of BVK [European Association for the Study of Liver. EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. J Hepatol 2012;56(03):671-685.]. For an accurate diagnosis, compliance with the Leipzig criteria, which were adopted at the 8th International Meeting on VLC and Menkes Disease and adopted by the European Association for the Study of Liver, is used. EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. J Hepatol 2012;56(03):671-685.]. The key clinical diagnostic signs that formed the basis for the formation of the Leipzig criteria were signs of liver dysfunction, acute hemolysis with renal failure, motor function disorders, neuropsychiatric disorders and Kayser-Fleischer rings on the cornea [Ferenci P, Merle U, FolhoVer A, Evstatiev R, Yurdaydin C, Bruha R et al (2005) Phenotype-genotype correlations in Wilson Disease (WD) - results of a multinational study. Hepatology 42(Suppl 1):258A]. This system for assessing BVD provides good diagnostic accuracy in patients with pronounced symptoms of the disease, but is not able to demonstrate high efficiency in patients in the early stages of the disease or in their relatives [Nicastro E, Ranucci G, Vajro P, Vegnente A, Iorio R. Re- evaluation of the diagnostic criteria for Wilson disease in children with mild liver disease. Hepatology. 2010 Dec;52(6):1948-56. doi: 10.1002/hep.23910. Epub 2010 Oct 21. PMID: 20967755.].
Прямая молекулярно-генетическая диагностика затруднена из-за наличия 800 возможных мутаций в гене ATP7B (http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/ найдено 10.04.2023). Однако тип мутации играет роль в прогнозировании клинических проявлений. Так же, несколько частых мутаций демонстрируют своеобразное глобальное распределение [Ferenci P. 2006. Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson Disease: impact on genetic testing. Hum Genet 120:151-159.]. Эта особенность используется для установления характерного спектра мутаций для региона и дальнейшего облегчения молекулярно-генетической диагностики и разработки тест-систем.Direct molecular genetic diagnosis is difficult due to the presence of 800 possible mutations in the ATP7B gene (http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/ found 04/10/2023). However, the type of mutation plays a role in predicting clinical manifestations. Also, several common mutations demonstrate a peculiar global distribution [Ferenci P. 2006. Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson Disease: impact on genetic testing. Hum Genet 120:151–159]. This feature is used to establish the characteristic spectrum of mutations for the region and further facilitate molecular genetic diagnosis and development of test systems.
На сегодняшний день известно несколько технических решений для выявления мутаций гена ATP7B.To date, several technical solutions are known for detecting ATP7B gene mutations.
Известен способ поиска мутантных аллелей гена ATP7B с помощью метода парно-концевого чтения на основе платформы массового параллельного секвенирования (NGS, next generation sequencing), позволяющее выявить весь спектр мутаций [Coffey AJ, Durkie M, Hague S, McLay K, Emmerson J, Lo C, Klaffke S, Joyce CJ, Dhawan A, Hadzic N, Mieli-Vergani G, Kirk R, Elizabeth Allen K, Nicholl D, Wong S, Griffiths W, Smithson S, Giffin N, Taha A, Connolly S, Gillett GT, Tanner S, Bonham J, Sharrack B, Palotie A, Rattray M, Dalton A, Bandmann O. A genetic study of Wilson's disease in the United Kingdom. Brain. 2013 May;136(Pt 5):1476-87. doi: 10.1093/brain/awt035. Epub 2013 Mar 21. PMID: 23518715; PMCID: PMC3634195.]. Осуществление данного изобретения предполагает выделение ДНК из образцов биоматериалов пациентов с последующим полным прочтением всего гена ATP7B, представляющего собой очень протяженный фрагмент ДНК длиной не менее 6,5 тыс. пар нуклеотидов. Несмотря на то, что такой подход является достаточно надежным, он имеет несколько существенных недостатков, препятствующих его широкому использованию в клинической практике, таких как высокая цена проведения исследования и необходимого для него оборудования, высокая трудоемкость и высокие требования к квалификации лабораторного работника [Chang IJ, Hahn SH. The genetics of Wilson disease. Handb Clin Neurol. 2017;142:19-34. doi: 10.1016/B978-0-444-63625-6.00003-3. PMID: 28433102; PMCID: PMC5648646.].There is a known method for searching for mutant alleles of the ATP7B gene using the paired-end reading method based on the massively parallel sequencing platform (NGS, next generation sequencing), which allows identifying the entire spectrum of mutations [Coffey AJ, Durkie M, Hague S, McLay K, Emmerson J, Lo C, Klaffke S, Joyce CJ, Dhawan A, Hadzic N, Mieli-Vergani G, Kirk R, Elizabeth Allen K, Nicholl D, Wong S, Griffiths W, Smithson S, Giffin N, Taha A, Connolly S, Gillett GT, Tanner S, Bonham J, Sharrack B, Palotie A, Rattray M, Dalton A, Bandmann O. A genetic study of Wilson's disease in the United Kingdom. Brain. 2013 May;136(Pt 5):1476-87. doi: 10.1093/brain/awt035. Epub 2013 Mar 21. PMID: 23518715; PMCID: PMC3634195.]. The implementation of this invention involves the isolation of DNA from samples of patient biomaterials, followed by a complete reading of the entire ATP7B gene, which is a very extended DNA fragment of at least 6.5 thousand nucleotide pairs in length. Despite the fact that this approach is quite reliable, it has several significant drawbacks that prevent its widespread use in clinical practice, such as the high cost of conducting the study and the equipment required for it, high labor intensity and high requirements for the qualifications of laboratory workers [Chang IJ, Hahn SH. The genetics of Wilson disease. Handb Clin Neurol. 2017;142:19-34. doi: 10.1016/B978-0-444-63625-6.00003-3. PMID: 28433102; PMCID: PMC5648646.].
Таким образом, предложенный способ не может быть применен массово в повседневной практике медицинских учреждений, а с учетом достаточной распространенности мутаций в данном гене среди населения, для оказания своевременной медицинской помощи необходимо проведение скрининга на выявление молекулярно-генетической причины заболевания фактически в каждом крупном населенном пункте или районом центре. Что не может быть осуществлено посредством заявленного выше изобретения.Thus, the proposed method cannot be applied en masse in the daily practice of medical institutions, and taking into account the sufficient prevalence of mutations in this gene among the population, in order to provide timely medical care it is necessary to carry out screening to identify the molecular genetic cause of the disease in virtually every large populated area or district center. Which cannot be accomplished by the invention stated above.
Другим техническим решением для выявления генетических дефектов гена ATP7B является использование секвенирования по Сэнгеру [Lepori MB, Zappu A, Incollu S, Dessì V, Mameli E, Demelia L, Nurchi AM, Gheorghe L, Maggiore G, Sciveres M, Leuzzi V, Indolfi G, Bonafé L, Casali C, Angeli P, Barone P, Cao A, Loudianos G. Mutation analysis of the ATP7B gene in a new group of Wilson's disease patients: contribution to diagnosis. Mol Cell Probes. 2012 Aug;26(4):147-50. doi: 10.1016/j.mcp.2012.03.007. Epub 2012 Mar 29. PMID: 22484412.]. Благодаря высокой надежности и высокоинформативным результатам этот метод заслужил широкое распространение в большинстве стран мира.Another technical solution for identifying genetic defects in the ATP7B gene is the use of Sanger sequencing [Lepori MB, Zappu A, Incollu S, Dessì V, Mameli E, Demelia L, Nurchi AM, Gheorghe L, Maggiore G, Sciveres M, Leuzzi V, Indolfi G , Bonafé L, Casali C, Angeli P, Barone P, Cao A, Loudianos G. Mutation analysis of the ATP7B gene in a new group of Wilson's disease patients: contribution to diagnosis. Mol Cell Probes. 2012 Aug;26(4):147-50. doi: 10.1016/j.mcp.2012.03.007. Epub 2012 Mar 29. PMID: 22484412.]. Due to its high reliability and highly informative results, this method has earned widespread use in most countries of the world.
Минусами данного метода является то, что для проведения секвенирования необходимо пройти множество этапов: выделить ДНК из целевого органа или его части, провести ПЦР, очистить смесь для дальнейшего использования, провести пробоподготовку для секвенирования и само секвенирование. Такая многоэтапность увеличивает вероятность ошибки, является достаточно дорогой из-за использования большого количества лабораторного оборудования и увеличивает время исследования. Поэтому, в настоящее время, секвенирование по Сенгеру не используется широко в целях диагностики заболевания, но благодаря, высокой точности и информативности он остается «золотым стандартом» и применяется для подтверждения результатов других методов диагностики [Chang IJ, Hahn SH. The genetics of Wilson disease. Handb Clin Neurol. 2017;142:19-34. doi: 10.1016/B978-0-444-63625-6.00003-3. PMID: 28433102; PMCID: PMC5648646.].The disadvantages of this method are that to carry out sequencing it is necessary to go through many stages: extract DNA from the target organ or part of it, perform PCR, purify the mixture for further use, carry out sample preparation for sequencing and sequencing itself. Such a multi-stage process increases the likelihood of error, is quite expensive due to the use of a large amount of laboratory equipment, and increases the research time. Therefore, at present, Sanger sequencing is not widely used to diagnose the disease, but due to its high accuracy and information content, it remains the “gold standard” and is used to confirm the results of other diagnostic methods [Chang IJ, Hahn SH. The genetics of Wilson disease. Handb Clin Neurol. 2017;142:19-34. doi: 10.1016/B978-0-444-63625-6.00003-3. PMID: 28433102; PMCID: PMC5648646.].
Среди аналогов так же выделяется MLPA-анализ (Multiplex ligation probe amplification или мультиплексная амплификация лигированных зондов). Эта разновидность мультиплексной ПЦР позволяет амплифицировать несколько (до 60 зондов) образцов только с одной парой праймеров. После денатурации ДНК образца к нему добавляют смесь MLPA-зондов, которые состоят из двух олигонуклеотидов. Если в образце присутствует последовательность комплементарная зонду, то олигонуклеотиды гибридизируются друг за другом так, чтобы быть сшитыми лигазой в единый зонд после чего зонды разной длины амплифицируются. В результате происходит амплификация не ДНК образца, а смеси зондов уникальной длины (от 130 до 500 п.о.). Так же один из праймеров несет флуорисцентную метку для визуализации продуктов амплификации в ходе капиллярного электрофореза. При наличии мутаций в исследуемом образце высота его пиков при анализе будет ниже, чем высота пиков референсного образца. MLPA является высокочувствительным методом и позволяет одновременно определять относительно большое количество копий всех экзонов.Among analogues, MLPA analysis (Multiplex ligation probe amplification or multiplex amplification of ligated probes) also stands out. This type of multiplex PCR allows the amplification of multiple (up to 60 probes) samples with only one pair of primers. After denaturing the DNA of the sample, a mixture of MLPA probes, which consist of two oligonucleotides, is added to it. If the sample contains a sequence complementary to the probe, then the oligonucleotides are hybridized one after another so as to be cross-linked by ligase into a single probe, after which probes of different lengths are amplified. As a result, it is not the DNA of the sample that is amplified, but a mixture of probes of unique length (from 130 to 500 bp). Also, one of the primers carries a fluorescent label for visualization of amplification products during capillary electrophoresis. If there are mutations in the test sample, the height of its peaks during analysis will be lower than the height of the peaks of the reference sample. MLPA is a highly sensitive method and can simultaneously detect a relatively large number of copies of all exons.
Однако, в конечном этапе, результат часто зависит от опыта лабораторного работника и является субьективным. При использовании MLPA сложнее обнаружить однонуклеотидные замены [Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15;30(12):e57. doi: 10.1093/nar/gnf056. PMID: 12060695; PMCID: PMC117299.].However, at the final stage, the result often depends on the experience of the laboratory worker and is subjective. Single nucleotide substitutions are more difficult to detect when using MLPA [Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15;30(12):e57. doi: 10.1093/nar/gnf056. PMID: 12060695; PMCID: PMC117299].
Наиболее близким техническим решением с заявляемому изобретению, принятому за прототип, является способ выявления мутаций гена ATP7B, принцип действия которого основан на сочетании методов ПЦР в реальном времени и мультиплексной аллель-специфичной ПЦР. Данный метод заключается в том, что после выделения ДНК из образца крови пациента по одному из стандартных протоколов проводится аллель-специфическая ПЦР с последующим электрофорезом продуктов амплификации по стандартному протоколу. Отмечено что данный способ с высокой точностью детектирует мутации Arg778Leu, Ala874Val, Leu1083Phe и Asn1270Ser расположенные в 8, 11, 15 и 18 экзонах (Заявка KR № KR20100083487A, МПК C12N15/11, опубл. 22.07.2010).The closest technical solution to the claimed invention, adopted as a prototype, is a method for detecting mutations in the ATP7B gene, the operating principle of which is based on a combination of real-time PCR methods and multiplex allele-specific PCR. This method consists in the fact that after DNA is isolated from a patient’s blood sample according to one of the standard protocols, allele-specific PCR is carried out, followed by electrophoresis of the amplification products according to the standard protocol. It is noted that this method detects with high accuracy the mutations Arg778Leu, Ala874Val, Leu1083Phe and Asn1270Ser located in exons 8, 11, 15 and 18 (Application KR No. KR20100083487A, IPC C12N15/11, published 07/22/2010).
Однако он также не лишен недостатков, в частности, выражающиеся в малом количестве выявляемых мутаций и различиях в спектре мутаций среди азиатских и европейских популяций. Несмотря на глобальное распределение мутаций гена ATP7B большое количество пациентов является носителями редких мутаций. Данный недостаток при диагностике заболевания может привести к ложноотрицательному результату, что повлечет за собой ошибку в диагнозе и угрозу для здоровья пациента. Другим недостатком прототипа является достаточно высокая стоимость метода ПЦР в реальном времени, заключающаяся как в стоимости наборов реагентов, так и в необходимости использования дорогостоящего ПЦР-амплификатора с оптическим модулем для детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе процесса амплификации нуклеиновых кислот. Что с учетом распространенности мутаций в гене ATP7B и необходимости проведения массового скрининга молекулярных причин болезни Вильсона фактически в каждом населенном пункте или районном центре, является существенным затруднением, препятствующим эффективной диагностике болезни и своевременной помощи больным.However, it is also not without drawbacks, in particular, expressed in the small number of detected mutations and differences in the spectrum of mutations between Asian and European populations. Despite the global distribution of ATP7B gene mutations, a large number of patients are carriers of rare mutations. This deficiency in diagnosing the disease can lead to a false negative result, which will entail an error in diagnosis and a threat to the patient’s health. Another disadvantage of the prototype is the rather high cost of the real-time PCR method, which consists both in the cost of reagent kits and in the need to use an expensive PCR amplifier with an optical module for detecting PCR products directly during the process of amplification of nucleic acids. Which, given the prevalence of mutations in the ATP7B gene and the need for mass screening of the molecular causes of Wilson's disease in virtually every locality or regional center, is a significant difficulty that hinders the effective diagnosis of the disease and timely care for patients.
Технической проблемой, поставленной перед данным изобретением, является:The technical problem posed by this invention is:
- повышение количества выявляемых мутантных аллелей для более корректной и всеобъемлющей диагностики.- increasing the number of detected mutant alleles for a more correct and comprehensive diagnosis.
- удешевление и упрощение метода для его более широкого применения в клинической лабораторной диагностике.- reducing the cost and simplifying the method for its wider use in clinical laboratory diagnostics.
Заявленный технический результат достигается тем, что в известном способе выявления мутаций гена ATP7B, в котором предусматривается выделение ДНК из образцов крови пациентов по одному из стандартных протоколов с последующим анализом при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим электрофорезом продуктов амплификации по стандартному протоколу, согласно изобретению, устанавливают мутации в экзонах 6, 8, 10, 12, 14 и 15, при этом используют следующий набор олигонуклеотидных праймеров:The claimed technical result is achieved by the fact that in the known method for detecting mutations of the ATP7B gene, which involves the isolation of DNA from patient blood samples according to one of the standard protocols, followed by analysis using allele-specific PCR followed by electrophoresis of amplification products according to the standard protocol, according to the invention, mutations are established in exons 6, 8, 10, 12, 14 and 15, using the following set of oligonucleotide primers:
- для мутации 1847G>A в экзоне 6 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 1 (мутантный); SEQ ID NO: 2 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 3;- for the 1847G>A mutation in exon 6, forward primers are used: SEQ ID NO: 1 (mutant); SEQ ID NO: 2 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 3;
- для мутации 2304insC в экзоне 8 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 4 (мутантный); SEQ ID NO: 5 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 10;- for the 2304insC mutation in exon 8, forward primers are used: SEQ ID NO: 4 (mutant); SEQ ID NO: 5 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 10;
- для мутации 2128G>A в экзоне 8 применяют прямые праймеры: SEQ ID NO: 6 (мутантный); SEQ ID NO: 7 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 10.;- for the 2128G>A mutation in exon 8, forward primers are used: SEQ ID NO: 6 (mutant); SEQ ID NO: 7 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 10.;
- для мутации 2230T>C в экзоне 8 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 8 (мутантный); SEQ ID NO: 9 (дикий тип) и обратный обратный SEQ ID NO: 10;- for the 2230T>C mutation in exon 8, forward primers are used: SEQ ID NO: 8 (mutant); SEQ ID NO: 9 (wild type) and reverse reverse SEQ ID NO: 10;
- для мутации 2333G>T в экзоне 8 применяют прямые праймеры: SEQ ID NO: 11 (мутантный); SEQ ID NO: 12 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 17;- for the 2333G>T mutation in exon 8, forward primers are used: SEQ ID NO: 11 (mutant); SEQ ID NO: 12 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 17;
- для мутации 2332C>G в экзоне 8 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 13 (мутантный); SEQ ID NO: 14 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 17;- for the 2332C>G mutation in exon 8, forward primers are used: SEQ ID NO: 13 (mutant); SEQ ID NO: 14 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 17;
- для мутации 2336G>A в экзоне 8 применяют прямые праймеры: SEQ ID NO: 15 (мутантный); SEQ ID NO: 16 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 17;- for the 2336G>A mutation in exon 8, forward primers are used: SEQ ID NO: 15 (mutant); SEQ ID NO: 16 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 17;
- для мутации 2501T>A в экзоне 10 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 18 (мутантный); SEQ ID NO: 19 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 20;- for the 2501T>A mutation in exon 10, forward primers are used: SEQ ID NO: 18 (mutant); SEQ ID NO: 19 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 20;
- для мутации 2827G>A в экзоне 12 необходимо используют праймеры: SEQ ID NO: 21 (мутантный); SEQ ID NO: 22 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 23;- for mutation 2827G>A in exon 12, primers must be used: SEQ ID NO: 21 (mutant); SEQ ID NO: 22 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 23;
- для мутации 3207C>A в экзоне 14 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 24 (мутантный); SEQ ID NO: 25 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 32;- for the 3207C>A mutation in exon 14, forward primers are used: SEQ ID NO: 24 (mutant); SEQ ID NO: 25 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 32;
- для мутации 3190G>A в экзоне 14 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 26 (мутантный); SEQ ID NO: 27 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 32;- for the 3190G>A mutation in exon 14, forward primers are used: SEQ ID NO: 26 (mutant); SEQ ID NO: 27 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 32;
- для мутации 3121C>T в экзоне 14 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 28 (мутантный); SEQ ID NO: 29 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 32;- for the 3121C>T mutation in exon 14, forward primers are used: SEQ ID NO: 28 (mutant); SEQ ID NO: 29 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 32;
- для мутации 3222_3243+21del43 в экзоне 14 используют прямые праймеры: SEQ ID NO: 30 (мутантный); SEQ ID NO: 31 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 32;- for mutation 3222_3243+21del43 in exon 14, forward primers are used: SEQ ID NO: 30 (mutant); SEQ ID NO: 31 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 32;
- для мутации 3402delC в экзоне 15 применяют прямые праймеры: SEQ ID NO: 33 (мутантный); SEQ ID NO: 34 (дикий тип) и обратный SEQ ID NO: 35.- for the 3402delC mutation in exon 15, forward primers are used: SEQ ID NO: 33 (mutant); SEQ ID NO: 34 (wild type) and reverse SEQ ID NO: 35.
Другим важным техническим результатом заявляемого изобретения является использования метода аллель-специфической ПЦР вместо метода ПЦР в реальном времени, используемом в прототипе. Эта особенность позволяет снизить требования к лабораторному оборудованию и используемым реактивам, позволяя существенно удешевить и сделать более доступной ПЦР-диагностику болезни Вильсона. Так же гибкость данной системы позволяет многократно расширить список выявляемых мутаций, что повышает точность диагностики, проводимой данным методом.Another important technical result of the claimed invention is the use of the allele-specific PCR method instead of the real-time PCR method used in the prototype. This feature allows us to reduce the requirements for laboratory equipment and the reagents used, allowing us to significantly reduce the cost and make PCR diagnostics of Wilson's disease more accessible. Also, the flexibility of this system allows you to expand the list of detected mutations many times over, which increases the accuracy of diagnostics carried out by this method.
Заявленный способ решает поставленные проблемы и достигает заявленного технического результата за счет:The claimed method solves the problems posed and achieves the stated technical result due to:
- повышения количества выявляемых мутаций до 14 вариантов, встречающихся в экзонах 6, 8, 10, 12, 14 и 15, что соответствует полученным современным данным о спектре наиболее часто встречающихся мутаций гена ATP7B, часть из которых наиболее характерна для Европейской популяции.- increasing the number of detected mutations to 14 variants found in exons 6, 8, 10, 12, 14 and 15, which corresponds to the current data obtained on the spectrum of the most common mutations of the ATP7B gene, some of which are most typical for the European population.
- удешевление и упрощение метода за счет взятого за основу простого ПЦР вместо ПЦР в реальном времени.- reducing the cost and simplifying the method by using simple PCR as a basis instead of real-time PCR.
Таким образом, предложенный способ идентификации генных мутаций и полиморфизмов осуществляют посредством проведения аллель-специфической ПЦР в присутствии специализированных олигонуклеотидных праймеров, соответствующих мутантным и нормальным аллелям гена ATP7B. Использование данных праймеров позволяет упростить диагностику болезни Вильсона и обеспечивают высокую эффективность диагностики за счет выявления как самых распространенных патогенных мутаций гена ATP7B, так и мутаций с умеренным уровнем распространения, но значительно представленными среди Европейской популяции.Thus, the proposed method for identifying gene mutations and polymorphisms is carried out by performing allele-specific PCR in the presence of specialized oligonucleotide primers corresponding to mutant and normal alleles of the ATP7B gene. The use of these primers makes it possible to simplify the diagnosis of Wilson's disease and provide high diagnostic efficiency by identifying both the most common pathogenic mutations of the ATP7B gene and mutations with a moderate level of distribution, but significantly represented among the European population.
Аллель-специфическая ПЦР строится на использовании модифицированных праймеров, подбираемых строго на места мутаций. Зачастую для реализации технологии могут быть использованы два варианта универсальных праймеров: первый вариант - праймер должен быть строго комплементарен по своему 3'-концевому нуклеотиду, соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. Второй вариант - универсальный праймер содержит 3'-концевой нуклеотид, всегда некомплементарный матрице, а мутантный нуклеотид матрицы попадает в его внутреннюю часть. В этом случае продукты ПЦР отсутствуют, если в гибриде во внутреннюю часть праймера попадает любой некомплементарный мутантный нуклеотид матричной ДНК вне зависимости от его точной локализации. Такие праймеры позволяют обнаруживать любые точечные мутации (SNP) в гомозиготном состоянии. Для выявления гетерозиготного состояния анализируемого гена могут быть использованы «мутантный» и «нормальный» праймеры в двух разных пробирках. Для проведения данного теста используют SNPdetect полимеразу. Наша модификация заключается в разработке уникальных праймеров, модифицированных одним нуклеотидным несоответствием в 2-3 положении 3'-конца в дополнении к несоответствию в мутантном праймере. Модификация происходит по правилу сильных и слабых несоответсвий нуклеотидов: сильные несоответствия - это C-C, G-A и A-A; слабые несовпадения - это T-T, T-C, T-G, G-G и A-C [Old, J. M. (n.d.). The Amplification Refractory Mutation System. Nucleic Acid Protocols Handbook, The, 723-727. doi:10.1385/1-59259-038-1:723]. Данная модификация позволяет использовать Taq ДНК-полимеразу, что удешевляет анализ. Визуализация результатов проводится с помощью электрофореза.Allele-specific PCR is based on the use of modified primers, selected strictly to the sites of mutations. Often, to implement the technology, two versions of universal primers can be used: the first option - the primer must be strictly complementary in its 3'-terminal nucleotide corresponding to the nucleotide of the template DNA. The second option is that the universal primer contains a 3'-terminal nucleotide, which is always non-complementary to the template, and the mutant nucleotide of the template ends up in its internal part. In this case, there are no PCR products if any non-complementary mutant nucleotide of the template DNA gets into the internal part of the hybrid, regardless of its exact location. Such primers allow the detection of any point mutations (SNP) in the homozygous state. To identify the heterozygous state of the gene being analyzed, “mutant” and “normal” primers can be used in two different tubes. To perform this test, SNPdetect polymerase is used. Our modification consists of designing unique primers modified by a single nucleotide mismatch at positions 2-3 of the 3' end in addition to the mismatch in the mutant primer. Modification occurs according to the rule of strong and weak nucleotide mismatches: strong mismatches are C-C, G-A and A-A; weak mismatches are T-T, T-C, T-G, G-G, and A-C [Old, J. M. (n.d.). The Amplification Refractory Mutation System. Nucleic Acid Protocols Handbook, The, 723-727. doi:10.1385/1-59259-038-1:723]. This modification allows the use of Taq DNA polymerase, which reduces the cost of analysis. Visualization of the results is carried out using electrophoresis.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:
На фиг.1. приведена карта-схема экзонов гена ATP7B и расположение обнаруженных на них мутаций, которые были использованы для создания праймеров.In Fig.1. A schematic map of the exons of the ATP7B gene and the location of the mutations found on them, which were used to create primers, are shown.
На фиг.2. приведена карта-схема расположения праймеров для поиска мутаций в разных экзонах гена ATP7B, где N - праймер с нормальным аллелем, М - праймер с мутантным аллелем.In Fig.2. A diagram of the location of primers for searching for mutations in different exons of the ATP7B gene is shown, where N is a primer with a normal allele, M is a primer with a mutant allele.
На фиг.3. приведена схема присоединения модифицированного праймера и возникновения «плавающего хвоста» на примере:In Fig.3. A diagram of the attachment of a modified primer and the appearance of a “floating tail” is shown using the example:
(а) несоответствия нет;(a) there is no inconsistency;
(b) наличие одного несоответствия;(b) the presence of one nonconformity;
(в) наличие двух несоответствий, препятствующих получению фрагмента.(c) the presence of two inconsistencies that prevent the fragment from being obtained.
На фиг.4. приведены примеры результатов работы аллель-специфической ПЦР у пациентов с различными мутациями: а) мутация в изучаемом аллеле, находится в гомозиготном состоянии; (б) дикий тип; в) мутация в изучаемом аллеле, но находится в гетерозиготном состоянии.In Fig.4. examples of the results of allele-specific PCR in patients with various mutations are given: a) a mutation in the allele under study is in a homozygous state; (b) wild type; c) a mutation in the allele being studied, but is in a heterozygous state.
На фиг.5. приведены электрофореграммы результатов аллель-специфической ПЦР. WD - условное обозначение, присваеваемое пациентам для обезличивания; М - мутантный аллель; Н - нормальный аллель, при совместном проявлении мутантного и нормального аллеля пациент является гетерозиготным носителем.In Fig.5. Electrophoregrams of the results of allele-specific PCR are shown. WD is a symbol assigned to patients for depersonalization; M - mutant allele; H is a normal allele; with the joint manifestation of a mutant and normal allele, the patient is a heterozygous carrier.
Способ осуществляют следующим образом.The method is carried out as follows.
Перед реализацией заявленного метода предварительно выделяется ДНК из образца венозной крови пациента. После чего проводится аллель-специфическая ПЦР по стандартному протоколу, вариант которого приведен ниже.Before implementing the proposed method, DNA is first isolated from a sample of the patient’s venous blood. After which allele-specific PCR is carried out according to the standard protocol, a version of which is given below.
Реакционная смесь для аллель-специфической ПЦР готовили из расчета на итоговый объем 20 мкл, для чего смешивали следующие компоненты: деионизированная вода - 5,5 мкл; DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) - 10 мкл; смесь праймеров (включающая мутантный прямой праймер, нормальный прямой и обратный праймеры в соответствии с прилагаемым списком олигонуклеотидных последовательностей для каждого аллельного варианта, взятые в концентрации 10 пикомоль/мкл) - по 1 мкл; образец ДНК пациента (10 нг/мкл) - 2,5 мкл. Процедуру аллель-специфической ПЦР проводили при следующих условиях: предварительная денатурация 95°С - 5 мин.; далее для 35 циклов: 95°С денатурация - 30 сек., 65°С отжиг - 30 сек., 72°С синтез - 40 сек.; заключительный цикл 72°С - 3 мин. Визуализацию результатов осуществляли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с добавлением раствора бромистого этидия (10 мг/мл, Evrogen) в TAE буфере (40 мМ Трис-ацетатный буферный раствор, рН 7,6, 1 мМ ЭДТА) и фотографировали на ChemiDoc MP Imaging System (BioRad) в проходящем ультрафиолетовом свете. Для определения длины фрагментов использовали ДНК маркер 1000 пар нуклеотидов (пн) (Evrogen). Олигонуклеотидные праймеры для проведения аллель-специфической ПЦР (ARMS PCR) для выявления 14 мутаций в гене ATP7B приведены в списке последовательностей в конце описания изобретения. Аллель-специфическую ПЦР проводили с праймерами, помещенными в стандартную ПЦР смесь, распределенными по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные последовательности, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. Полученные фрагменты ДНК анализируют методом гель-электрофореза и на основании наличия или отсутствия полос, соответствующих продукту нормального и мутантного варианта, делают заключение о гомо- или гетерозиготном носительстве мутаций в гене ATP7B, или об отсутствии мутации в случае наличии только продукта амплификации аллеля дикого типа.The reaction mixture for allele-specific PCR was prepared based on a final volume of 20 μl, for which the following components were mixed: deionized water - 5.5 μl; DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) - 10 µl; primer mixture (including mutant forward primer, normal forward and reverse primers in accordance with the attached list of oligonucleotide sequences for each allelic variant, taken at a concentration of 10 picomol/μl) - 1 μl; patient DNA sample (10 ng/µl) - 2.5 µl. The allele-specific PCR procedure was carried out under the following conditions: preliminary denaturation 95°C - 5 minutes; further for 35 cycles: 95°C denaturation - 30 sec., 65°C annealing - 30 sec., 72°C synthesis - 40 sec.; final cycle 72°C - 3 min. The results were visualized using electrophoresis in a 1% agarose gel with the addition of a solution of ethidium bromide (10 mg/ml, Evrogen) in TAE buffer (40 mM Tris-acetate buffer solution, pH 7.6, 1 mM EDTA) and photographed on a ChemiDoc MP Imaging System (BioRad) under transmitted ultraviolet light. To determine the length of the fragments, a 1000 nucleotide pair (bp) DNA marker (Evrogen) was used. Oligonucleotide primers for allele-specific PCR (ARMS PCR) to detect 14 mutations in the ATP7B gene are given in the sequence list at the end of the description of the invention. Allele-specific PCR was performed with primers placed in a standard PCR mixture, distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant sequences and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. The resulting DNA fragments are analyzed by gel electrophoresis and, based on the presence or absence of bands corresponding to the product of the normal and mutant variant, a conclusion is made about homo- or heterozygous carriage of mutations in the ATP7B gene, or about the absence of a mutation in the case of the presence of only the amplification product of the wild-type allele.
Пример 1Example 1
Для реализации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяли ДНК из образцов крови пациента WD23, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерам SEQ ID NO: 1 (мутантный) и SEQ ID NO: 2 (дикий тип) на мутацию 1847G>A в экзоне 6 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному аллелю, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого мутантного и обратного праймеров, что свидетельствует о наличии мутации 1847G>A в гомозиготном варианте (Фиг. 5 WD23). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4a).To implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene, DNA was isolated from blood samples of patient WD23, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described higher. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 1 (mutant) and SEQ ID NO: 2 (wild type) for the 1847G>A mutation in exon 6, a fragment corresponding to the mutant allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the electrophoresis band appeared only in the well containing a mixture of the forward mutant and reverse primers, indicating the presence of the 1847G>A mutation in the homozygous variant (Fig. 5 WD23). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengeru sequencing of DNA fragments (Fig. 4a).
Пример 2Example 2
Другим примером демонстрации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, является кровь пациента WD63. Из образца выделяли ДНК затем проводили амплификацию при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 4 (мутантный) и SEQ ID NO: 5 (дикий тип) на мутацию 2304insC в экзоне 8 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному и аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующих полос. Таким образом, полосы на электрофорезе появилась в лунках, содержащих смесь из прямого мутантного и прямого праймера дикого типа, что свидетельствует о наличии мутации 2304insC в гетерозиготном варианте (Фиг. 5 WD63). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4c).Another example of demonstrating a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene is the blood of patient WD63. DNA was isolated from the sample, then amplified using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 4 (mutant) and SEQ ID NO: 5 (wild type) for the 2304insC mutation in exon 8, a fragment corresponding to the mutant and wild-type alleles was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of the corresponding bands. Thus, bands on electrophoresis appeared in wells containing a mixture of the forward mutant and wild-type forward primers, indicating the presence of the 2304insC mutation in the heterozygous variant (Fig. 5 WD63). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengerou sequencing of DNA fragments (Fig. 4c).
Пример 3Example 3
Еще одним примером реализации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, является кровь пациента WD2. Из образца выделяли ДНК затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 6 (мутантный) и SEQ ID NO: 7 (дикий тип) на мутацию 2128G>A в экзоне 8 происходила наработка фрагмента, соответствующего аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого праймера дикого типа и обратного праймеров, что свидетельствует об отсутствии мутации 2128G>A (Фиг. 4b). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа. Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4b).Another example of implementing a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene is the blood of patient WD2. DNA was isolated from the sample, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 6 (mutant) and SEQ ID NO: 7 (wild type) for the 2128G>A mutation in exon 8, a fragment corresponding to the wild type allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the electrophoresis band appeared only in the well containing a mixture of wild-type forward primer and reverse primer, indicating the absence of the 2128G>A mutation (Fig. 4b). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments. These results were confirmed by Sengerou sequencing of DNA fragments (Fig. 4b).
Пример 4Example 4
Так же возможна реализация способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяя ДНК из образцов крови пациента WD41, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами 8 (мутантный) и SEQ ID NO: 9 (дикий тип) на мутацию 2230T>C в экзоне 8 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному аллелю, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого мутантного и обратного праймеров, что свидетельствует о наличии мутации 2230T>C в гомозиготном варианте (Фиг. 5 WD41). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4a).It is also possible to implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene by isolating DNA from blood samples of patient WD41, then DNA amplification was carried out using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers 8 (mutant) and SEQ ID NO: 9 (wild type) for the 2230T>C mutation in exon 8, a fragment corresponding to the mutant allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the band on electrophoresis appeared only in the well containing a mixture of the forward mutant and reverse primers, which indicates the presence of the 2230T>C mutation in the homozygous variant (Fig. 5 WD41). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengeru sequencing of DNA fragments (Fig. 4a).
Пример 5Example 5
Так же возможна реализация способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяя ДНК из образцов крови пациента WD64, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 11 (мутантный) и SEQ ID NO: 12 (дикий тип) на мутацию 2333G>T в экзоне 8 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному и аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующих полос. Таким образом, полосы на электрофорезе появилась в лунках, содержащих смесь из прямого мутантного и прямого праймера дикого типа, что свидетельствует о наличии мутации 2333G>T в гетерозиготном варианте (Фиг. 5 WD64). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4a).It is also possible to implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene by isolating DNA from blood samples of patient WD64, then DNA amplification was carried out using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 11 (mutant) and SEQ ID NO: 12 (wild type) for the 2333G>T mutation in exon 8, a fragment corresponding to the mutant and wild type alleles was produced, which was evident from the results of electrophoresis in the form of the corresponding stripes Thus, bands on electrophoresis appeared in wells containing a mixture of the forward mutant and wild-type forward primers, indicating the presence of the 2333G>T mutation in the heterozygous variant (Fig. 5 WD64). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengeru sequencing of DNA fragments (Fig. 4a).
Пример 6Example 6
Другим примером демонстрации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, является кровь пациента WD4. Из выделяли ДНК затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 13 (мутантный) и SEQ ID NO: 14 (дикий тип) на мутацию 2332C>G в экзоне 8 происходила наработка фрагмента, соответствующего аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого праймера дикого типа и обратного праймеров, что свидетельствует об отсутствии мутации 2332C>G (Фиг. 4b). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа. Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4b).Another example of demonstrating a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene is the blood of patient WD4. DNA was isolated from DNA and DNA was then amplified using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 13 (mutant) and SEQ ID NO: 14 (wild type) for the 2332C>G mutation in exon 8, a fragment corresponding to the wild-type allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the electrophoresis band appeared only in the well containing a mixture of wild-type forward primer and reverse primer, indicating the absence of the 2332C>G mutation (Fig. 4b). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments. These results were confirmed by Sengerou sequencing of DNA fragments (Fig. 4b).
Пример 7Example 7
Помимо вышеперечисленного, для реализации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяли ДНК из образцов крови пациента WD85, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 15 (мутантный) и SEQ ID NO: 16 (дикий тип) на мутацию 2336G>A в экзоне 8 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному аллелю, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого мутантного и обратного праймеров, что свидетельствует о наличии мутации 2336G>A в гомозиготном Фиг. 5 WD85). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4a).In addition to the above, to implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene, DNA was isolated from blood samples of patient WD85, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 15 (mutant) and SEQ ID NO: 16 (wild type) for the 2336G>A mutation in exon 8, a fragment corresponding to the mutant allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the electrophoresis band appeared only in the well containing a mixture of the forward mutant and reverse primers, which indicates the presence of the 2336G>A mutation in homozygous Fig. 5 WD85). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengeru sequencing of DNA fragments (Fig. 4a).
Пример 8Example 8
Еще одним примером реализации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, является кровь пациента WD75. Из образца выделяли ДНК затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 18 (мутантный) и SEQ ID NO: 19 (дикий тип) на мутацию 2501T>A в экзоне 10 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному и аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующих полос. Таким образом, полосы на электрофорезе появилась в лунках, содержащих смесь из прямого мутантного и прямого праймера дикого типа, что свидетельствует о наличии мутации 2501T>A в гетерозиготном варианте (Фиг. 5 WD75). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4c).Another example of implementing a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene is the blood of patient WD75. DNA was isolated from the sample, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 18 (mutant) and SEQ ID NO: 19 (wild type) for the 2501T>A mutation in exon 10, a fragment corresponding to the mutant and wild type alleles was produced, which was evident from the results of electrophoresis in the form of the corresponding stripes Thus, bands on electrophoresis appeared in wells containing a mixture of the forward mutant and wild-type forward primers, indicating the presence of the 2501T>A mutation in the heterozygous variant (Fig. 5 WD75). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengerou sequencing of DNA fragments (Fig. 4c).
Пример 9Example 9
Для реализации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяли ДНК из образцов крови пациента WD5, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 21 (мутантный) и SEQ ID NO: 22 (дикий тип) на мутацию 2827G>A в экзоне 12 происходила наработка фрагмента, соответствующего аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого праймера дикого типа и обратного праймеров, что свидетельствует об отсутствии мутации 2827G>A. Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4b).To implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene, DNA was isolated from blood samples of patient WD5, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described higher. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 21 (mutant) and SEQ ID NO: 22 (wild type) for the 2827G>A mutation in exon 12, a fragment corresponding to the wild type allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the electrophoresis band appeared only in the well containing a mixture of the wild-type forward primer and reverse primers, indicating the absence of the 2827G>A mutation. The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengerou sequencing of DNA fragments (Fig. 4b).
Пример 10Example 10
Помимо вышеперечисленного, для реализации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяли ДНК из образцов крови пациента WD25, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 24 (мутантный) и SEQ ID NO: 25 (дикий тип) на мутацию 3207C>A в экзоне 14 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному аллелю, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого мутантного и обратного праймеров, что свидетельствует о наличии мутации 3207C>A в гомозиготном варианте (Фиг. 5 WD25). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4a).In addition to the above, to implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene, DNA was isolated from blood samples of patient WD25, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 24 (mutant) and SEQ ID NO: 25 (wild type) for the 3207C>A mutation in exon 14, a fragment corresponding to the mutant allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the band on electrophoresis appeared only in the well containing a mixture of the forward mutant and reverse primers, which indicates the presence of the 3207C>A mutation in the homozygous variant (Fig. 5 WD25). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengeru sequencing of DNA fragments (Fig. 4a).
Пример 11Example 11
Так же возможна реализация способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяя ДНК из образцов крови пациента WD21, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 26 (мутантный) и SEQ ID NO: 27 (дикий тип) на мутацию 3190G>A в экзоне 14 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному и аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующих полос. Таким образом, полосы на электрофорезе появилась в лунках, содержащих смесь из прямого мутантного и прямого праймера дикого типа, что свидетельствует о наличии мутации 3190G>A в гетерозиготном варианте (Фиг. 5 WD21). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4c).It is also possible to implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene by isolating DNA from blood samples of patient WD21, then DNA amplification was carried out using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol , described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 26 (mutant) and SEQ ID NO: 27 (wild type) for the 3190G>A mutation in exon 14, a fragment corresponding to the mutant and wild type alleles was produced, which was evident from the results of electrophoresis in the form of the corresponding stripes Thus, bands on electrophoresis appeared in wells containing a mixture of the forward mutant and wild-type forward primers, indicating the presence of the 3190G>A mutation in the heterozygous variant (Fig. 5 WD21). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengerou sequencing of DNA fragments (Fig. 4c).
Пример 12Example 12
Другим примером демонстрации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, является кровь пациента WD9. Из образца выделяли ДНК затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 28 (мутантный) и SEQ ID NO: 29 (дикий тип) на мутацию 3121C>T в экзоне 14 происходила наработка фрагмента, соответствующего аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого праймера дикого типа и обратного праймеров, что свидетельствует об отсутствии мутации 3121C>T. Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4b).Another example of demonstrating a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene is the blood of patient WD9. DNA was isolated from the sample, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 28 (mutant) and SEQ ID NO: 29 (wild type) for the 3121C>T mutation in exon 14, a fragment corresponding to the wild-type allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the electrophoresis band appeared only in the well containing a mixture of wild-type forward primer and reverse primers, indicating the absence of the 3121C>T mutation. The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengerou sequencing of DNA fragments (Fig. 4b).
Пример 13Example 13
Помимо вышеперечисленного, для реализации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяли ДНК из образцов крови пациента WD23, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 30 (мутантный); SEQ ID NO: 31 (дикий тип) на мутацию 3222_3243+21del43 в экзоне 14 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному аллелю, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующей полосы. Таким образом, полоса на электрофорезе появилась только в лунке, содержащей смесь из прямого мутантного и обратного праймеров, что свидетельствует о наличии мутации 3222_3243+21del43 в гомозиготном варианте (Фиг. 5 WD23). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4a).In addition to the above, to implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene, DNA was isolated from blood samples of patient WD23, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described above. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 30 (mutant); SEQ ID NO: 31 (wild type) for the mutation 3222_3243+21del43 in exon 14, a fragment corresponding to the mutant allele was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of a corresponding band. Thus, the band on electrophoresis appeared only in the well containing a mixture of the forward mutant and reverse primers, which indicates the presence of the 3222_3243+21del43 mutation in the homozygous variant (Fig. 5 WD23). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengeru sequencing of DNA fragments (Fig. 4a).
Пример 14Example 14
Для реализации способа диагностики болезни Вильсона посредством выявления мутаций в гене ATP7B, выделяли ДНК из образцов крови пациента WD76, затем проводили амплификацию ДНК при помощи аллель-специфической ПЦР с последующим анализом продуктов реакции гель-электрофорезом в 1% агарозе в соответствии со стандартным протоколом, описанным выше. Аллель-специфическая ПЦР включала праймеры, описанные в формуле изобретения и помещенные в стандартную ПЦР смесь, распределенную по 28 пробиркам, соответствующим 14 парам праймеров, выявляющим мутантные аллели, и 14 парам праймеров, выявляющим соответствующие аллели дикого типа. В лунке с праймерами SEQ ID NO: 33 (мутантный) и SEQ ID NO: 34 (дикий тип) на 3402delC в экзоне 15 происходила наработка фрагмента, соответствующего мутантному и аллелю дикого типа, что было видно по результатам электрофореза в виде соответствующих полос. Таким образом, полосы на электрофорезе появилась в лунках, содержащих смесь из прямого мутантного и прямого праймера дикого типа, что свидетельствует о наличии мутации 3402delC в гетерозиготном варианте (Фиг. 5 WD76). Остальные лунки продемонстрировали отсутствие мутаций и показали наработку исключительно фрагментов гена дикого типа (Фиг. 4b). Данные результаты были подтверждены данными секвенирования фрагментов ДНК по методу Сенгеру (Фиг. 4c).To implement a method for diagnosing Wilson's disease by identifying mutations in the ATP7B gene, DNA was isolated from blood samples of patient WD76, then DNA amplification was performed using allele-specific PCR, followed by analysis of the reaction products by gel electrophoresis in 1% agarose in accordance with the standard protocol described higher. Allele-specific PCR included the primers described in the claims and placed in a standard PCR mixture distributed into 28 tubes corresponding to 14 primer pairs detecting mutant alleles and 14 primer pairs detecting the corresponding wild-type alleles. In the well with primers SEQ ID NO: 33 (mutant) and SEQ ID NO: 34 (wild type) at 3402delC in exon 15, a fragment corresponding to the mutant and wild type alleles was produced, which was visible from the results of electrophoresis in the form of the corresponding bands. Thus, bands on electrophoresis appeared in wells containing a mixture of the forward mutant and wild-type forward primers, indicating the presence of the 3402delC mutation in the heterozygous variant (Fig. 5 WD76). The remaining wells demonstrated the absence of mutations and showed the production of exclusively wild-type gene fragments (Fig. 4b). These results were confirmed by Sengerou sequencing of DNA fragments (Fig. 4c).
Заявляемый способ поиска мутаций гена ATP7B, позволяет исключить выявленные недостатки известных способов и достичь заявляемого технического результата. В отличии от указанного прототипа, заявляемый способ использует обычную амплификацию фрагментов ДНК по протоколу стандартной ПЦР с последующим анализом продуктов стандартным методом электрофореза в агарозном геле, что сильно удешевляет диагностику. Так же заявляемый способ обеспечивает большую эффективность диагностики поскольку выявляет 14 мутаций, расположенных в 6 экзонах, в отличие от прототипа, выявляющего исключительно 4 мутации в 4 экзонах, что еще больше увеличивает точность диагностики, особенно применительно к Европейской популяции, для которой выявляемые мутации по заявляемому способу представляют собой наиболее часто встречающиеся патологические варианты.The claimed method for searching for mutations of the ATP7B gene allows us to eliminate the identified shortcomings of known methods and achieve the claimed technical result. Unlike the specified prototype, the proposed method uses conventional amplification of DNA fragments using a standard PCR protocol, followed by analysis of the products using the standard method of agarose gel electrophoresis, which greatly reduces the cost of diagnosis. Also, the claimed method provides greater diagnostic efficiency since it detects 14 mutations located in 6 exons, in contrast to the prototype, which detects exclusively 4 mutations in 4 exons, which further increases the diagnostic accuracy, especially in relation to the European population, for which the detected mutations according to the claimed method represent the most common pathological variants.
--->--->
Список олигонуклеотидных последовательностей:List of oligonucleotide sequences:
<110> Гарбуз Михаил Максимович<110> Garbuz Mikhail Maksimovich
<120> Способ поиска мутаций гена ATP7B<120> Method for searching for ATP7B gene mutations
<160> 35<160> 35
<210> 1<210> 1
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213>Homosapiens<213>Homosapiens
<400> 1<400> 1
TCATGCTTCCCTGGCCCAGCATCATGCTTCCCTGGCCCAGCA
<210> 2<210> 2
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213>Homosapiens<213>Homosapiens
<400> 2<400> 2
ATGCTTCCCTGGCCCAGCGATGCTTCCCTGGCCCAGCG
<210> 3<210> 3
<211> 24<211> 24
<212> ДНК<212> DNA
<213>Homosapiens<213>Homosapiens
<400> 3<400> 3
TGCTCACTAGCTACATGTGACTAGTGCTCACTAGCTACATGTGACTAG
<210> 4<210> 4
<211> 21<211> 21
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 4<400> 4
CATTCTTCGACACGCCCCCTCCATTCTTCGACACGCCCCCTC
<210> 5<210> 5
<211> 22<211> 22
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 5<400> 5
ACATTCTTCGACACGCCCCCTAACATTCTTCGACACGCCCCCTA
<210> 6<210> 6
<211> 24<211> 24
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 6<400> 6
CTGTCCTTGTCTTTCAGCTCCTTACTGTCCTTGTCTTTCAGCTCTCTTA
<210> 7<210> 7
<211> 24<211> 24
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 7<400> 7
CTGTCCTTGTCTTTCAGCTCCTTGCTGTCCTTGTCTTTCAGCTCCTTG
<210> 8<210> 8
<211> 27<211> 27
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 8<400> 8
GCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTGCGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTGC
<210> 9<210> 9
<211> 27<211> 27
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 9<400> 9
GCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTGTGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTGT
<210> 10<210> 10
<211> 26<211> 26
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 10<400> 10
TTTGGAGATTAGTGACTAGAGCACCTTTTGGAGATTAGTGACTAGAGCACCT
<210> 11<210> 11
<211> 24<211> 24
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 11<400> 11
CTTTGTGTTCATTGCCCTGGGTCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGTCT
<210> 12<210> 12
<211> 23<211> 23
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 12<400> 12
TTTGTGTTCATTGCCCTGGGTCGTTTGTGTTCATTGCCCTGGGGTCG
<210> 13<210> 13
<211> 23<211> 23
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 13<400> 13
CTTTGTGTTCATTGCCCTGGGTGCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGTG
<210> 14<210> 14
<211> 23<211> 23
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 14<400> 14
CTTTGTGTTCATTGCCCTGGGTCCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGTC
<210> 15<210> 15
<211> 20<211> 20
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 15<400> 15
TCATTGCCCTGGGCCGGTCATCATTGCCCTGGGCGGTCA
<210> 16<210> 16
<211> 21<211> 21
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 16<400> 16
TTCATTGCCCTGGGCCGGTTGTTCATTGCCCTGGGCGGTTG
<210> 17<210> 17
<211> 27<211> 27
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 17<400> 17
GACCAACTACATATTCAGTTTTGCACCGACCAACTACATATTCAGTTTTGCACC
<210> 18<210> 18
<211> 22<211> 22
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 18<400> 18
AAGGTGGTCCCTGGGGGAAATTAAGGTGGTCCCTGGGGGAAATT
<210> 19<210> 19
<211> 22<211> 22
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 19<400> 19
AAGGTGGTCCCTGGGGGAAATAAAGGTGGTCCCTGGGGGAAAATA
<210> 20<210> 20
<211> 27<211> 27
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 20<400> 20
GTCTGATTTCCCAGAACTCTTCACATAGTCTGATTTCCCAGAACTCTTCACATA
<210> 21<210> 21
<211> 28<211> 28
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 21<400> 21
TTGACGTTGGTGGTATGGATTGTAATTATTGACGTTGGTGGTATGGATTGTAATTA
<210> 22<210> 22
<211> 26<211> 26
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 22<400> 22
GACGTTGGTGGTATGGATTGTAATTGGACGTTGGTGGTATGGATTGTAATTG
<210> 23<210> 23
<211> 24<211> 24
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 23<400> 23
CAACTGAGCACCAATTGGTGTCTGCAACTGAGCACCAATTGGTGTCTG
<210> 24<210> 24
<211> 22<211> 22
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 24<400> 24
TGCGGAGGCCAGCAGTGAATAATGCGGAGGCCAGCAGTGAATAA
<210> 25<210> 25
<211> 21<211> 21
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 25<400> 25
GCGGAGGCCAGCAGTGAATACGCGGAGGCCAGCAGTGAATAC
<210> 26<210> 26
<211> 20<211> 20
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 26<400> 26
GGCTGTGGTGGGGACTGCTAGGCTGTGGTGGGGACTGCTA
<210> 27<210> 27
<211> 19<211> 19
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 27<400> 27
GCTGTGGTGGGGACTGCTGGCTGTGGTGGGGACTGCTG
<210> 28<210> 28
<211> 19<211> 19
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 28<400> 28
GGCGTCCCCAGGGTCACGTGGCGTCCCCAGGGTCACGT
<210> 29<210> 29
<211> 18<211> 18
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 29<400> 29
GCGTCCCCAGGGTCACGCGCGTCCCCAGGGTCACGC
<210> 30<210> 30
<211> 21<211> 21
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 30<400> 30
CAGGGTCATGCTGGCCACACTCAGGGTCATGCTGGCCACACT
<210> 31<210> 31
<211> 18<211> 18
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 31<400> 31
GCGGGTGCTCCTGCTGGGGCGGGTGCTCCTGCTGGG
<210> 32<210> 32
<211> 21<211> 21
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 32<400> 32
AGACTGCCCGTACTCCCCAAGAGACTGCCCGTACTCCCCAAG
<210> 33<210> 33
<211> 24<211> 24
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 33<400> 33
CTTGGGATACTGCACGGACTTTAGCTTGGGATACTGCACGGACTTTAG
<210> 34<210> 34
<211> 24<211> 24
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 34<400> 34
TTGGGATACTGCACGGACTTCTAGTTGGGATACTGCACGGACTTCTAG
<210> 35<210> 35
<211> 27<211> 27
<212>ДНК<212>DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 35<400> 35
CTCTATGAATTTAAGGCAGCCATAAGCCTCTATGAATTTAAGGCAGCCATAAGC
<---<---
Claims (15)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2821573C1 true RU2821573C1 (en) | 2024-06-25 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2555331C2 (en) * | 2008-10-01 | 2015-07-10 | Дзе Аризона Борд Оф Риджентс, Он Бихаф Оф Дзе Юниверсити Оф Аризона | Glucuronidated acetaminophen as marker of liver disorders |
| US20200393473A1 (en) * | 2018-02-26 | 2020-12-17 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Ezetimibe metabolite as a non-invasive biomarker for non-alcoholic steatohepatitis (nash) |
| RU2743858C1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-03-01 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» | Method for obtaining a gene bank for the diagnosis of liver pathologies |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2555331C2 (en) * | 2008-10-01 | 2015-07-10 | Дзе Аризона Борд Оф Риджентс, Он Бихаф Оф Дзе Юниверсити Оф Аризона | Glucuronidated acetaminophen as marker of liver disorders |
| US20200393473A1 (en) * | 2018-02-26 | 2020-12-17 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Ezetimibe metabolite as a non-invasive biomarker for non-alcoholic steatohepatitis (nash) |
| RU2743858C1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-03-01 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» | Method for obtaining a gene bank for the diagnosis of liver pathologies |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101718940B1 (en) | Epigenetic early diagnostic composition for Alzheimer's disease or mild cognitive impairment | |
| US10851415B2 (en) | Molecular predictors of sepsis | |
| EP2494065A1 (en) | Means and methods for non-invasive diagnosis of chromosomal aneuploidy | |
| CN110029158B (en) | Marfan syndrome detection panel and application thereof | |
| JP2011509096A (en) | Mutations in contact-related protein 2 (CNTNAP2) associated with increased risk of idiopathic autism | |
| Kufova et al. | Newly designed 11-gene panel reveals first case of hereditary amyloidosis captured by massive parallel sequencing | |
| Castro-Sanchez et al. | Whole exome sequencing as a diagnostic tool for patients with ciliopathy-like phenotypes | |
| Zhang et al. | Identification of the BTN3A3 gene as a molecule implicated in generalized pustular psoriasis in a Chinese population | |
| RU2821573C1 (en) | Method for searching for atp7b gene mutations for diagnosing wilson's disease (wilson-konovalov) | |
| US20220074952A1 (en) | Compositions and Methods to Detect Non-Coeliac Gluten Sensitivity | |
| CN115873947A (en) | Nasopharyngeal darcinoma genetic risk assessment system | |
| US20140171371A1 (en) | Compositions And Methods For The Diagnosis of Schizophrenia | |
| WO2021243166A2 (en) | Deterimining risk of spontaneous coronary artery dissection and myocardial infarction and systems and methods of use thereof | |
| KR20200028320A (en) | Biomarker for detecting Alzheimer's disease and diagnosis for Alzheimer's disease | |
| US20140288011A1 (en) | Genetic association | |
| KR102409336B1 (en) | SNP markers for Immunoglobulin A (IgA) nephropathy and IgA vasculitis diagnosis and diagnosis method using the same | |
| CN115927354B (en) | SH3TC2 gene pathogenic mutant and application thereof in preparation of fibula muscular atrophy 4C type diagnostic kit | |
| KR102254341B1 (en) | methods for diagnosing the high risk group of Diabetes based on Genetic Risk Score | |
| CN109207573B (en) | Primer combination, method and kit for constructing various hemophilia target libraries based on high-throughput sequencing | |
| CN103571854B (en) | SUCLA2 gene mutation body and application thereof | |
| US9157119B2 (en) | Methods for diagnosing skin diseases | |
| WO2022019585A1 (en) | Biomarker for diagnosis of intestinal behcet's disease | |
| US11060146B2 (en) | Method and kit for identifying gene mutations | |
| Genovesi | Next generation sequencing approaches in rare diseases: the study of four different families | |
| Fish | Analysis of genetic variations associated with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy |