RU2817258C2 - Methods of latex agglutination and inhibition of latex agglutination, applicable for all subtypes of influenza a and b viruses, and a test system for their implementation - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine; virology.

SUBSTANCE: described is a test system for detecting subtypes of influenza A and B viruses in a latex agglutination reaction or for detecting specific antibodies to these subtypes of influenza viruses in a latex agglutination inhibition reaction. Test system includes sialylated polymer microspheres created by adsorption of sialylated glycoprotein on the surface of polystyrene microspheres, which are washed with phosphate-saline buffer pH 7.4, centrifuging for 30 s at speed of 10,000 g, then to obtained precipitate of washed microspheres 1% solution of sialylated glycoprotein on phosphate-buffered saline is added to final concentration of 1.0 x 10⁹ polystyrene microspheres per 1.0 ml of solution, then these microspheres are incubated in a solution of sialylated glycoprotein for 1 hour with constant stirring at room temperature and precipitated by centrifugation for 30 s at rate of 10,000 g, then washed with phosphate-buffered saline and resuspended in phosphate-buffered saline with final concentration of 1.0 x 10⁸ sialylated microspheres per 1.0 ml, to stabilize the obtained suspension, a bactericidal agent is added to it and stored at a temperature of +4 °C. Invention differs from previous developments based on immobilisation of specific antibodies on microspheres by the fact that it uses a new reagent for detecting latex-agglutinating activity of any subtypes of influenza A and B viruses. Also described is a method for detecting in a latex agglutination reaction of subtypes of influenza A and B viruses using a test system, consisting in mixing 10.0 mcl of the virus suspension with 1.0 x 10⁶ sialylated polymer microspheres and incubation of the obtained mixture for 50 minutes at a temperature of +4 °C, into which is then added an equal volume of 6% paraformaldehyde solution prepared in phosphate-buffered saline, mixture is fixed at room temperature for 10 minutes, and the fixed material is analyzed by light microscopy.

EFFECT: invention extends the range of laboratory diagnostic tools for detecting any subtypes of influenza A and B virus.

5 cl, 1 dwg, 6 tbl, 5 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицине и вирусологии и может быть применено в лабораторной диагностике для обнаружения всех подтипов вируса гриппа А и В, а также для выявления специфических антител к этим вирусам с помощью тест-системы, основанной на сиалированных полимерных микросферах, в реакциях латекс-агглютинации и торможения латекс-агглютинации.The present invention relates to medicine and virology and can be used in laboratory diagnostics for the detection of all subtypes of influenza A and B viruses, as well as for the detection of specific antibodies to these viruses using a test system based on sialylated polymer microspheres in latex agglutination reactions and inhibition of latex agglutination.

Известно, что многие вирусы обладают гемагглютинирующими свойствами, например вирусы гриппа, арбовирусы, парагриппа, осповакцины, краснухи и других [1]. Рутинные классические способы на основе реакции гемагглютинации (РГА) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА) являются золотым стандартом для детекции всех типов вируса гриппа и нейтрализующих антител к этим вирусам. Обе реакции основаны на способности поверхностного гликопротеина гемагглютинина вируса гриппа взаимодействовать с сиаловыми остатками, расположенными на мембранных белках эритроцитов крови млекопитающих и птиц. Взаимодействие вируса с эритроцитами приводит к их агглютинации, что можно наблюдать по изменению свойств сформированного осадка этих клеток: в отсутствии такого взаимодействия происходит накопление осадка в центре U-образной или V-образной лунки планшета, а при взаимодействии вируса осадок распределяется по всей поверхности дна лунки. В случае РГА к эритроцитам добавляется только суспензия вируса, в случае РТГА к эритроцитам добавляется суспензия вируса в смеси с антителами, которые могут предотвращать взаимодействие вируса с эритроцитами [2].It is known that many viruses have hemagglutinating properties, for example influenza viruses, arboviruses, parainfluenza, vaccinia, rubella and others [1]. Routine classical methods based on the hemagglutination reaction (HRA) and the hemagglutination inhibition reaction (HIT) are the gold standard for the detection of all types of influenza virus and neutralizing antibodies to these viruses. Both reactions are based on the ability of the surface glycoprotein hemagglutinin of the influenza virus to interact with sialic residues located on the membrane proteins of erythrocytes in the blood of mammals and birds. The interaction of the virus with erythrocytes leads to their agglutination, which can be observed by a change in the properties of the formed sediment of these cells: in the absence of such interaction, sediment accumulates in the center of the U-shaped or V-shaped well of the plate, and when the virus interacts, the sediment is distributed over the entire surface of the bottom of the well . In the case of RGA, only a suspension of the virus is added to the erythrocytes; in the case of RGA, a suspension of the virus mixed with antibodies is added to the erythrocytes, which can prevent the interaction of the virus with erythrocytes [2].

Недостатком РГА и РТГА является необходимость использования эритроцитов кур, морской свинки, лошади, человека или др., то есть требуется наличие доноров крови. Более того, приготовленная суспензия эритроцитов сохраняется в рабочем состоянии достаточно ограниченное время - в течение нескольких суток. Для РТГА существуют коммерчески доступные препараты инактивированных вирусов, позволяющие выявлять специфические антитела. Например, такие препараты выпускаются ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» (Санкт-Петербург, Россия).The disadvantage of RGA and RTGA is the need to use erythrocytes from chickens, guinea pigs, horses, humans, or others, that is, blood donors are required. Moreover, the prepared erythrocyte suspension remains in working condition for a fairly limited time - for several days. For RTGA, there are commercially available preparations of inactivated viruses that allow the detection of specific antibodies. For example, such drugs are produced by LLC "Enterprise for the production of diagnostic drugs" (St. Petersburg, Russia).

В настоящее время известны тест-системы для выявления различных патогенов помощью реакции латекс-агглютинации (РЛА). Например, такие тест-системы созданы для детекции патогенных штаммов E.coli [3], возбудителя мелиоидоза [4] и менингита [5], возбудителей лептоспироза [6], легионелл [7] и других патогенов. В них используют полимерные микросферы, конъюгированные со специфическими антителами к определенному патогену. Агглютинация таких микросфер в присутствии патогена происходит за счет специфической реакции «антиген-антитело».Currently, test systems are known for identifying various pathogens using the latex agglutination reaction (RLA). For example, such test systems are designed to detect pathogenic strains of E. coli [3], the causative agent of melioidosis [4] and meningitis [5], the causative agents of leptospirosis [6], legionella [7] and other pathogens. They use polymer microspheres conjugated with specific antibodies to a specific pathogen. Agglutination of such microspheres in the presence of a pathogen occurs due to a specific antigen-antibody reaction.

Прототипом предлагаемого изобретения может служить тест-система на основе полимерных микросфер, а именно: полистироловых частиц с иммобилизованными на их поверхности специфическими антителами, для выявления штаммов вируса гриппа А, содержащих гемагглютинин пятого подтипа (Н5) [8]. Недостатком этой, основанной на использовании полимерных микросфер тест-системы, является невозможность ее использования для выявления других подтипов вируса гриппа в силу специфического взаимодействия иммобилизованных антител только с одним подтипом гемагглютинина.The prototype of the proposed invention can be a test system based on polymer microspheres, namely: polystyrene particles with specific antibodies immobilized on their surface, for identifying influenza A virus strains containing hemagglutinin of the fifth subtype (H5) [8]. The disadvantage of this test system based on the use of polymer microspheres is the impossibility of using it to detect other subtypes of influenza virus due to the specific interaction of immobilized antibodies with only one subtype of hemagglutinin.

Реакция торможения латекс-агглютинации (РТЛА) используется в коммерчески доступном тесте для выявления хорионического гонадотропина в моче. В нем присутствуют два компонента: полимерные микросферы с иммобилизованным хорионическим гонадотропином и специфические антитела к этому гормону. При наличии свободного гормона в исследуемом материале происходит взаимодействие антител с ним, что приводит к отсутствию агрегации микросфер [9]. Для вирусов гриппа тест-системы на основе реакции торможения латекс-агглютинации неизвестны.The latex agglutination inhibition test (LAT) is used in a commercially available test to detect human chorionic gonadotropin in urine. It contains two components: polymer microspheres with immobilized human chorionic gonadotropin and specific antibodies to this hormone. In the presence of free hormone in the test material, antibodies interact with it, which leads to the absence of aggregation of microspheres [9]. For influenza viruses, test systems based on the latex agglutination inhibition reaction are unknown.

В настоящее время неизвестно ни одной стабильной универсальной тест-системы, позволяющей выявлять все подтипы вируса гриппа А и В с помощью латекс-агглютинации или антител к ним в реакции торможения латекс-агглютинации.Currently, there is not a single stable universal test system that can detect all subtypes of influenza A and B viruses using latex agglutination or antibodies to them in the latex agglutination inhibition reaction.

Сущность предлагаемого ИЗОThe essence of the proposed ISO

Настоящее изобретение, в отличие от предшествующих разработок, основанных иммобилизации на микросферах специфических антител, заключается в разработке способа создания нового реагента для выявления латекс-агглютинирующей активности всех подтипов вирусов гриппа А и В, способа детекции всех подтипов вирусов гриппа А и В с помощью латекс-агглютинирующей активности, а также способа детекции специфических антител к любым подтипам вирусов гриппа А и В с помощью реакции торможения латекс-агглютинации и создании тест-системы для выявления всех подтипов вирусов гриппа А и В в РЛА и антител к этим вирусам в РТЛА.The present invention, in contrast to previous developments based on the immobilization of specific antibodies on microspheres, is to develop a method for creating a new reagent for detecting the latex agglutinating activity of all subtypes of influenza A and B viruses, a method for detecting all subtypes of influenza A and B viruses using latex agglutinating activity, as well as a method for detecting specific antibodies to any subtypes of influenza A and B viruses using a latex agglutination inhibition reaction and creating a test system for identifying all subtypes of influenza A and B viruses in RLA and antibodies to these viruses in RLA.

Технический результатTechnical result

Настоящая разработка решает задачу выявления всех подтипов вирусов гриппа А и В, а также специфических антител к ним с помощью чувствительной диагностической системы, основанной на агглютинации полимерных сиалированных микросфер и обладающей стабильностью при длительном хранении (не менее полугода). Изобретение основано на иммобилизации белка, содержащего сиаловые остатки, на полимерных микросферах, что позволяет выявлять все типы и подтипы вирусов гриппа А и В, а также нейтрализующие антитела к ним.This development solves the problem of identifying all subtypes of influenza A and B viruses, as well as specific antibodies to them, using a sensitive diagnostic system based on agglutination of polymer sialylated microspheres and stable during long-term storage (at least six months). The invention is based on the immobilization of a protein containing sialic residues on polymer microspheres, which makes it possible to detect all types and subtypes of influenza A and B viruses, as well as neutralizing antibodies to them.

В предлагаемой разработке полимерные сиалированные микросферы - это частицы сферической формы размером 0,1 - 10 мкм, состоящие из аморфного полимера, в частности - полистирола, несущие на своей поверхности сиалированный гликопротеин.In the proposed development, polymer sialylated microspheres are spherical particles with a size of 0.1 - 10 microns, consisting of an amorphous polymer, in particular polystyrene, carrying a sialylated glycoprotein on their surface.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

На фиг. 1 представлены результаты латекс-агглютинации:In fig. 1 shows the results of latex agglutination:

А - отсутствие агглютинации, т.е. агрегации сиалированных полимерных микросфер, после инкубации с незараженной аллантоисной жидкостью, взятой в качестве контроля;A - absence of agglutination, i.e. aggregation of sialylated polymer microspheres after incubation with uninfected allantoic fluid taken as a control;

Б - агрегация сиалированных полимерных микросфер после инкубации суспензии вируса гриппа А в аллантоисной жидкости.B - aggregation of sialylated polymer microspheres after incubation of a suspension of influenza A virus in allantoic fluid.

Далее приводятся примеры. Однако эти примеры не должны рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения во всех отношениях.The following are examples. However, these examples should not be construed as limiting the scope of the present invention in all respects.

Пример 1. Способ получения полимерных сиалированных микросферExample 1. Method for producing polymer sialylated microspheres

Для изготовления таких микросфер были выбраны полистирольные микросферы диаметром 1,5 мкм концентрацией 5,2×10¹⁰ частиц на 1,0 мл и сиалированный гликопротеин, например - фетуин из эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Связывание сиалированного гликопротеина с микросферами проводили по следующему протоколу:To produce such microspheres, polystyrene microspheres with a diameter of 1.5 microns with a concentration of 5.2 × 10 ¹⁰ particles per 1.0 ml and sialylated glycoprotein, for example, fetuin from fetal bovine serum, were selected. The binding of sialylated glycoprotein to microspheres was carried out according to the following protocol:

1. Полистироловые микросферы промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (рН 7,2 - 7,6) не менее двух раз с помощью центрифугирования суспензии микросфер на скорости 10 000 g в течение одной минуты, затем супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в ФСБ.1. Polystyrene microspheres were washed with phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.2 - 7.6) at least twice by centrifuging the microsphere suspension at 10,000 g for one minute, then the supernatant was removed and the sediment was resuspended in PBS.

2. Готовили 1% раствор сиалированного гликопротеина, например фетуина, на ФСБ.2. Prepare a 1% solution of sialylated glycoprotein, for example fetuin, in PBS.

3. К полученному осадку микросфер добавляли 1% раствор этого белка, приготовленного на ФСБ из расчета 1,0 мл раствора белка на 1,0×10⁹ полистирольных микросфер и инкубировали при комнатной температуре при постоянном перемешивании 1 час.3. A 1% solution of this protein, prepared in PBS at the rate of 1.0 ml of protein solution per 1.0×10 ⁹ polystyrene microspheres, was added to the resulting sediment of microspheres and incubated at room temperature with constant stirring for 1 hour.

4. Далее полученные полистирольные сиалированные микросферы осаждали на скорости 10 000g в течение одной минуты, не менее двух раз промывали и ресуспендировали в ФСБ в концентрации на 1,0×10⁸ частиц на 1,0 мл.4. Next, the resulting polystyrene sialylated microspheres were sedimented at a speed of 10,000g for one minute, washed at least twice and resuspended in PBS at a concentration of 1.0×10 ⁸ particles per 1.0 ml.

5. Для предотвращения бактериальной контаминации в суспензию полистирольных сиалированных микросфер добавляли бактерицидный агент, например тиомерсал до концентрации 0,005%. Суспензию хранили при температуре +4°С. Стабильность этой суспензии сохранялась не менее полугода и ее бактериальная контаминация не выявлена.5. To prevent bacterial contamination, a bactericidal agent, for example thiomersal, was added to the suspension of polystyrene sialylated microspheres to a concentration of 0.005%. The suspension was stored at +4°C. The stability of this suspension was maintained for at least six months and no bacterial contamination was detected.

Пример 2. Исследование агглютинирующей активности вирусов гриппа с помощью предлагаемой реакции латекс-агглютинацииExample 2. Study of the agglutinating activity of influenza viruses using the proposed latex agglutination reaction

Проведение РЛА проводили по следующему протоколу:The RLA was carried out according to the following protocol:

10,0 мкл суспензии полистирольных сиалированных микросфер, полученных в Примере 1, смешивали с 10,0 мкл суспензии тестируемого вируссодержащего материала и инкубировали при +4°С в течение 50 мин в микропробирке. Затем добавляли равный объем 6% раствора параформальдегида, приготовленного на ФСБ, и инкубировали 10 мин при комнатной температуре.10.0 μl of a suspension of polystyrene sialylated microspheres obtained in Example 1 was mixed with 10.0 μl of a suspension of the test virus-containing material and incubated at +4°C for 50 min in a microtube. Then an equal volume of 6% paraformaldehyde solution prepared in PBS was added and incubated for 10 min at room temperature.

Агглютинацию, то есть агрегацию индивидуальных полистирольных сиалированных микросфер, анализировали с помощью световой микроскопии, например фазово-контрастной микроскопии с помощью инвертированного микроскопа. Для этого использовали один из двух вариантов изготовления микроскопических препаратов:Agglutination, that is, the aggregation of individual polystyrene sialylated microspheres, was analyzed using light microscopy, such as phase contrast microscopy using an inverted microscope. To do this, we used one of two options for making microscopic preparations:

1) 4,0 мкл суспензии агрегированных латексных частиц наносили на предметное стекло и накрывали покровным стеклом; или1) 4.0 μl of a suspension of aggregated latex particles was applied to a glass slide and covered with a coverslip; or

2) к объему 20,0 мкл суспензии добавляли 30,0 мкл ФСБ и переносили смесь в лунку плоскодонного 96-луночного планшета, например планшета фирмы «Costar» (США).2) 30.0 μl of PBS was added to a volume of 20.0 μl of suspension and the mixture was transferred into the well of a flat-bottomed 96-well plate, for example a plate from Costar (USA).

Результат латекс-агглютинации оценивали как наличие или отсутствие агглютинации сиалированных полимерных микросфер (фиг. 1).The result of latex agglutination was assessed as the presence or absence of agglutination of sialylated polymer microspheres (Fig. 1).

Результат латекс-агглютинации оценивают либо качественно: как наличие или отсутствие агрегации, либо количественно: как долю сиалированных микросфер в препарате, находящихся в агрегированном состоянии.The result of latex agglutination is assessed either qualitatively: as the presence or absence of aggregation, or quantitatively: as the proportion of sialylated microspheres in the preparation that are in an aggregated state.

Пример 3. Исследование вирусов гриппа с помощью реакции гемагглютинацииExample 3. Study of influenza viruses using the hemagglutination reaction

В тесте использованы 12 вирусов гриппа А разных подтипов гемагглютинина и два вируса гриппа В различных эволюционных линий («ямагатской» и «викторианской»). Исследование проводили стандартным методом с использованием куриных эритроцитов. В качестве контролей были использованы ФСБ (контроль 1) и аллантоисная жидкость из незараженного эмбриона (контроль 2). Результаты представлены в Таблице 1 как максимальное разведение суспензии вируса, при котором детектирована агглютинация эритроцитов.The test used 12 influenza A viruses of different hemagglutinin subtypes and two influenza B viruses of different evolutionary lines (“Yamagata” and “Victorian”). The study was carried out using a standard method using chicken erythrocytes. PBS (control 1) and allantoic fluid from an uninfected embryo (control 2) were used as controls. The results are presented in Table 1 as the maximum dilution of the virus suspension at which erythrocyte agglutination was detected.

Из таблицы видно, что все протестированные вирусы вызывают агглютинацию эритроцитов, при этом в контроле агглютинация отсутствует.The table shows that all tested viruses cause agglutination of erythrocytes, while there is no agglutination in the control.

Пример 4. Исследование вирусов гриппа с помощью реакции латекс-агглютинацииExample 4. Study of influenza viruses using the latex agglutination reaction

С помощью полистирольных сиалированных микросфер, полученных в Примере 1 и способом, описанным в Примере 2, проведена реакция латекс-агглютинации с вирусами, указанными в Примере 3. В качестве контролей были использованы ФСБ (контроль 1) и аллантоисная жидкость из незараженного эмбриона (контроль 2). Результаты представлены в Таблице 2 как максимальное разведение суспензии вируса, при котором детектирована латекс-агглютинация.Using polystyrene sialylated microspheres obtained in Example 1 and the method described in Example 2, a latex agglutination reaction was carried out with the viruses indicated in Example 3. PBS (control 1) and allantoic fluid from an uninfected embryo (control 2) were used as controls ). The results are presented in Table 2 as the maximum dilution of the virus suspension at which latex agglutination was detected.

Из таблицы видно, что все протестированные вирусы вызывают агглютинацию полистирольных сиалированных микросфер, при этом в контроле агглютинация отсутствует.The table shows that all tested viruses cause agglutination of sialylated polystyrene microspheres, while there is no agglutination in the control.

Пример 5. Сравнительное исследование результатов, полученных в реакции гемагглютинации и реакции латекс-агглютинацииExample 5. Comparative study of the results obtained in the hemagglutination reaction and the latex agglutination reaction

Результаты, полученные в Примере 3 и Примере 4, сведены в таблицу 3. Статистическое исследование результатов проводили с помощью программы Statistica 12. Анализ показал, что значения разведений вирусов, полученные в РГА и РЛА, достоверно коррелировали (р<0,05) между собой с очень высоким коэффициентом корреляции (R=0,94).The results obtained in Example 3 and Example 4 are summarized in Table 3. A statistical study of the results was carried out using the Statistica 12 program. The analysis showed that the values of virus dilutions obtained in the RGA and RLA were significantly correlated (p<0.05) with each other with a very high correlation coefficient (R=0.94).

Из таблицы видно, что результаты РЛА и РГА очень близки, разница для всех исследованных вирусов не превышала одно разведение. Таким образом, РЛА адекватный метод и может заменять метод РГА в исследованиях.The table shows that the results of RLA and RGA are very close; the difference for all the viruses studied did not exceed one dilution. Thus, RLA is an adequate method and can replace the RGA method in research.

Пример 6. Реакция торможения гемагглютинацииExample 6. Hemagglutination inhibition reaction

С этой целью были получены иммунные сыворотки к пяти вариантам вируса гриппа А подтипа H7N2. Для этого белые беспородные мыши были иммунизированы исходным вирусом A/Chicken/NJ/294598 - 12/2004-МА (H7N2), либо одним из его четырех мутантов, содержащих аминокислотные замены в гемагглютинине. Для полученных пяти сывороток (обозначенных как сыворотка №1 - №5) была проверена нейтрализующая активность против всех пяти использованных для вакцинации вариантов вируса (обозначенных как вирус №1 - №5) стандартным методом торможения гемагглютинации (РТГА) с помощью куриных эритроцитов.For this purpose, immune sera were obtained against five variants of the influenza A virus of the H7N2 subtype. For this purpose, white outbred mice were immunized with the original virus A/Chicken/NJ/294598 - 12/2004-MA (H7N2), or one of its four mutants containing amino acid substitutions in hemagglutinin. For the five sera obtained (designated as serum No. 1 - No. 5), neutralizing activity was tested against all five virus variants used for vaccination (designated as virus No. 1 - No. 5) using the standard hemagglutination inhibition method (HAI) using chicken erythrocytes.

Результаты РТГА представлены в Таблице 4 как максимальные разведения сывороток, при которых детектировано торможение гемагглютинации для каждого из исследованных вирусов.The results of RTGA are presented in Table 4 as the maximum dilutions of sera at which inhibition of hemagglutination was detected for each of the viruses studied.

Из таблицы видно, что все протестированные сыворотки предотвращают агглютинацию эритроцитов исследованными вирусами.The table shows that all tested sera prevent agglutination of erythrocytes by the tested viruses.

Пример 7. Реакция торможения латекс-агглютинацииExample 7. Latex agglutination inhibition reaction

С помощью полистирольных сиалированных микросфер, полученных в Примере 1, и способом, описанным в Примере 2, исследована нейтрализующая активность мышиных поликлональных сывороток, полученных в Примере 6, в отношении пяти вирусов подтипа H7N2, указанных в Примере 6. Результаты реакции торможения латекс-агглютинации (РЛГА) представлены в Таблице 5 как максимальные разведения сывороток, при которых детектировано торможение агглютинации для каждого из исследованных вирусов.Using polystyrene sialylated microspheres obtained in Example 1 and the method described in Example 2, the neutralizing activity of mouse polyclonal sera obtained in Example 6 was studied against five viruses of the H7N2 subtype specified in Example 6. Results of the latex agglutination inhibition reaction ( RLGA) are presented in Table 5 as the maximum dilutions of sera at which inhibition of agglutination was detected for each of the viruses studied.

Из таблицы видно, что все протестированные сыворотки предотвращают агглютинацию сиалированных полимерных микросфер исследованными вирусами.The table shows that all tested sera prevent agglutination of sialylated polymer microspheres by the tested viruses.

Пример 8. Сравнительное исследование результатов, полученных в реакции РТГА и РТЛАExample 8. Comparative study of the results obtained in the RTGA and RTLA reactions

Результаты, полученные в Примерах 6 и 7, сведены в Таблицу 6. Статистическое исследование результатов проводили с помощью программы Statistica 12. Анализ показал, что значения, полученные в РТГА и РТЛА, достоверно коррелировали (р<0,05) с высоким коэффициентом корреляции (R=0,74).The results obtained in Examples 6 and 7 are summarized in Table 6. A statistical study of the results was carried out using the Statistica 12 program. The analysis showed that the values obtained in RTGA and RTLA were significantly correlated (p < 0.05) with a high correlation coefficient ( R=0.74).

Из таблицы видно, что результаты РТЛА и РТГА близки, разница для всех исследованных сывороток не превышала два разведения. Таким образом, РТЛА - адекватный метод детекции нейтрализующей активности антител, по чувствительности не уступает РТГА, и может заменять метод РТГА в исследованиях.The table shows that the results of RTLA and RTGA are close; the difference for all tested sera did not exceed two dilutions. Thus, RTLA is an adequate method for detecting the neutralizing activity of antibodies, is not inferior in sensitivity to RTGA, and can replace the RTGA method in research.

Таким образом, предлагаемый способ детекции, основанный на агглютинации полимерных сиалированных микросфер при взаимодействии с исследуемым вирусом, является универсальным и адекватным способом для выявления агглютинирующей активности всех подтипов вирусов гриппа А и В. Реакция латекс-агглютинации и реакция торможения латекс-агглютинации с использованием предлагаемых микросфер может заменять или дополнять реакцию гемагглютинации и реакцию торможения гемагглютинации в лабораторной практике. Предлагаемые способы будут менее ресурсозатратными по сравнению с рутинными. В частности, они не требуют использования эритроцитов животных. Созданная тест-система на их основе стабильна и сохраняет все необходимые свойства без изменений при хранении на протяжении, по крайней мере полгода, что позволяет производить такой диагностикум в промышленном масштабе.Thus, the proposed detection method, based on agglutination of polymer sialylated microspheres during interaction with the virus under study, is a universal and adequate method for detecting the agglutinating activity of all subtypes of influenza A and B viruses. Latex agglutination reaction and latex agglutination inhibition reaction using the proposed microspheres can replace or complement the hemagglutination reaction and hemagglutination inhibition reaction in laboratory practice. The proposed methods will be less resource-intensive compared to routine ones. In particular, they do not require the use of animal red blood cells. The test system created on their basis is stable and retains all the necessary properties without changes during storage for at least six months, which makes it possible to produce such a diagnostic on an industrial scale.

Список литературыBibliography

1. Дерябин П.Г., Бутенко A.M., Бурцева Е.И. Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации / Под ред. академика РАН Д.К. Львова // Руководство по вирусологии: Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. Москва: Медицинское информационное агентство, 2013. Стр. 426-4301. Deryabin P.G., Butenko A.M., Burtseva E.I. Reaction of hemagglutination and inhibition of hemagglutination / Ed. Academician of the Russian Academy of Sciences D.K. Lvova // Guide to virology: Viruses and viral infections of humans and animals. Moscow: Medical Information Agency, 2013. Pp. 426-430

2. Palmer D.F., Dowdle W.R., Coleman M.T. and Schild G.C. (1975): Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis. U.S. Department of Health, Education, and Welfare, immunology series no. 6. Centers for Disease Control, Atlanta, GA.2. Palmer D.F., Dowdle W.R., Coleman M.T. and Schild G.C. (1975): Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis. U.S. Department of Health, Education, and Welfare, immunology series no. 6. Centers for Disease Control, Atlanta, GA.

3. Hajra T.K., Bag P.K., Das S.C., Mukherjee S., Khan A., Ramamurthy T. Development of a simple latex agglutination assay for detection of shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) by using polyclonal antibody against STEC. Clin Vaccine Immunol. 2007;14(5):600-604. doi:10.1128/CVI.00342-06D. M. Frolov, Т.V. Senina, Т.V. Zamarina, N.3. Hajra T.K., Bag P.K., Das S.C., Mukherjee S., Khan A., Ramamurthy T. Development of a simple latex agglutination assay for detection of shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) by using polyclonal antibody against STEC. Clin Vaccine Immunol. 2007;14(5):600-604. doi:10.1128/CVI.00342-06D. M. Frolov, T.V. Senina, T.V. Zamarina, N.

4. P. Khrapova, Application of Latex-Agglutination for Rapid Detection of Pathogenic Burkholderia. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2019 (3). doi.org/10.21055/0370-1069-2019-3-106-1104. P. Khrapova, Application of Latex-Agglutination for Rapid Detection of Pathogenic Burkholderia. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2019 (3). doi.org/10.21055/0370-1069-2019-3-106-110

5. Poplin V., Boulware D.R., Bahr N.C. Methods for rapid diagnosis of meningitis etiology in adults. Biomark Med. 2020;14(6):459-479. doi:10.2217/bmm-2019-03335. Poplin V., Boulware D.R., Bahr N.C. Methods for rapid diagnosis of meningitis etiology in adults. Biomark Med. 2020;14(6):459-479. doi:10.2217/bmm-2019-0333

6. Патент RU 2177617 СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛЕПТОСПИРОЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ6. Patent RU 2177617 METHOD OF PREPARATION OF LEPTOSPIROS DIAGNOSTICUM FOR STATEMENT OF LATEX AGGLUTINATION REACTION

7. Sedgwick А.K., Tilton R.C. Identification of Legionella pneumophila by latex agglutination. J Clin Microbiol. 1983 Feb;17(2):365-8. doi:10.1128/jcm.17.2.365-368.1983.7. Sedgwick A.K., Tilton R.C. Identification of Legionella pneumophila by latex agglutination. J Clin Microbiol. 1983 Feb;17(2):365-8. doi:10.1128/jcm.17.2.365-368.1983.

8. Chen J., Jin M., Yu Z. et al. A Latex Agglutination Test for the Rapid Detection of Avian Influenza Virus Subtype H5N1 and its Clinical Application. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2007;19(2):155-160. doi:10.1177/1040638707019002038. Chen J., Jin M., Yu Z. et al. A Latex Agglutination Test for the Rapid Detection of Avian Influenza Virus Subtype H5N1 and its Clinical Application. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2007;19(2):155-160. doi:10.1177/104063870701900203

9. Lim P.L., Choy W.F. An improved latex agglutination-inhibition test for the detection of human chorionic gonadotropin in urine. J Immunol Methods. 1989 Feb 8;117(1):137-9. doi:10.1016/0022-1759(89)90128-2.9. Lim P.L., Choy W.F. An improved latex agglutination-inhibition test for the detection of human chorionic gonadotropin in urine. J Immunol Methods. 1989 Feb 8;117(1):137-9. doi:10.1016/0022-1759(89)90128-2.

Claims (5)

1. Тест-система для детекции подтипов вирусов гриппа А и В в реакции латекс-агглютинации или для детекции специфических антител к этим подтипам вирусов А и В в реакции торможения латекс-агглютинации, главный компонент которой - сиалированные полимерные микросферы, созданные путем адсорбции сиалированного гликопротеина поверхности полистирольных микросфер, которые промывают фосфатно-солевым буфером рН 7,4, центрифугируя в течение 30 с на скорости 10000g, затем к полученному осадку промытых микросфер добавляют 1% раствор сиалированного гликопротеина на фосфатно-солевом буфере, до конечной концентрации 1,0×10⁹ полистирольных микросфер на 1,0 мл раствора, затем эти микросферы инкубируют в растворе сиалированного гликопротеина в течение 1 ч при постоянном перемешивании при комнатной температуре и осаждают центрифугированием в течение 30 с на скорости 10000g, далее промывают фосфатно-солевым буфером и ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере с конечной концентрацией 1,0×10⁸ сиалированных микросфер на 1,0 мл, для стабилизации полученной суспензии в нее добавляют бактерицидный агент и хранят при температуре +4°С. 1. Test system for the detection of subtypes of influenza viruses A and B in the latex agglutination reaction or for the detection of specific antibodies to these subtypes of viruses A and B in the latex agglutination inhibition reaction, the main component of which is sialylated polymer microspheres created by the adsorption of sialylated glycoprotein surfaces of polystyrene microspheres, which are washed with phosphate-buffered saline pH 7.4, centrifuging for 30 s at a speed of 10000 g, then a 1% solution of sialylated glycoprotein in phosphate-buffered saline is added to the resulting sediment of washed microspheres to a final concentration of 1.0 × 10 ⁹ polystyrene microspheres per 1.0 ml of solution, then these microspheres are incubated in a solution of sialylated glycoprotein for 1 hour with constant stirring at room temperature and pelleted by centrifugation for 30 s at a speed of 10000 g, then washed with phosphate-buffered saline and resuspended in phosphate-buffered saline. saline buffer with a final concentration of 1.0×10 ⁸ sialylated microspheres per 1.0 ml, to stabilize the resulting suspension, a bactericidal agent is added to it and stored at a temperature of +4°C. 2. Тест-система по п. 1, в которой в качестве сиалированного гликопротеина, предназначенного для создания сиалированных полимерных микросфер, используют фетуин. 2. The test system according to claim 1, in which fetuin is used as a sialylated glycoprotein intended for creating sialylated polymer microspheres. 3. Тест-система по пп. 1, 2, в которой для главного компонента в качестве бактерицидного агента используют тиомерсал, добавляемый до конечной концентрации 0,005%. 3. Test system according to paragraphs. 1, 2, in which thiomersal is used as a bactericidal agent for the main component, added to a final concentration of 0.005%. 4. Способ детекции в реакции латекс-агглютинации подтипов вирусов гриппа А и В с помощью тест-системы по пп. 1-3, заключающийся в смешивании 10,0 мкл суспензии вируса с 1,0 ×10⁶ сиалированными полимерными микросферами и инкубации полученной смеси 50 мин при температуре +4°С, в которую затем добавляют равный объем 6% раствора параформальдегида, приготовленного на фосфатно-солевом буфере, смесь фиксируют при комнатной температуре 10 мин и анализируют фиксированный материал методом световой микроскопии. 4. A method for detecting subtypes of influenza A and B viruses in a latex agglutination reaction using a test system according to claims. 1-3, which consists of mixing 10.0 μl of a virus suspension with 1.0 × 10 ⁶ sialylated polymer microspheres and incubating the resulting mixture for 50 minutes at a temperature of +4°C, to which an equal volume of 6% paraformaldehyde solution prepared in phosphate is then added -saline buffer, the mixture is fixed at room temperature for 10 minutes and the fixed material is analyzed by light microscopy. 5. Применение тест-системы по пп. 1-3 для детекции подтипов вируса гриппа А и В.5. Application of the test system according to paragraphs. 1-3 for detection of influenza A and B virus subtypes.