RU2815960C2 - Antibodies which bind to split form of mutant calreticulin, and agent for diagnosing, preventing or treating myeloproliferative growth - Google Patents
Antibodies which bind to split form of mutant calreticulin, and agent for diagnosing, preventing or treating myeloproliferative growth Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815960C2 RU2815960C2 RU2021128127A RU2021128127A RU2815960C2 RU 2815960 C2 RU2815960 C2 RU 2815960C2 RU 2021128127 A RU2021128127 A RU 2021128127A RU 2021128127 A RU2021128127 A RU 2021128127A RU 2815960 C2 RU2815960 C2 RU 2815960C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- seq
- acid sequence
- asp
- Prior art date
Links
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 title description 7
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 title description 6
- 230000002071 myeloproliferative effect Effects 0.000 title description 2
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 claims abstract description 148
- 201000007224 Myeloproliferative neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 59
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 8
- 101000793651 Homo sapiens Calreticulin Proteins 0.000 claims abstract 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 211
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 72
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 63
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 51
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 51
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 50
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 47
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 38
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 74
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 44
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 27
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 25
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 23
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 23
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 21
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 18
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 18
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 18
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 16
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 16
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 15
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 101150117824 Calr gene Proteins 0.000 description 12
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 11
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 10
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 101100072420 Caenorhabditis elegans ins-5 gene Proteins 0.000 description 8
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- DKQCWCQRAMAFLN-UBHSHLNASA-N Asp-Trp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DKQCWCQRAMAFLN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 6
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 6
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 6
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 6
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 6
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 5
- QKWYXRPICJEQAJ-KJEVXHAQSA-N Pro-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O QKWYXRPICJEQAJ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 5
- 230000002072 anti-mutant effect Effects 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 4
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N Asp-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N Phe-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 4
- AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N Pro-Gly-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 4
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FDALPRWYVKJCLL-PMVVWTBXSA-N Thr-His-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(O)=O FDALPRWYVKJCLL-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 4
- JAWUQFCGNVEDRN-MEYUZBJRSA-N Thr-Tyr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N)O JAWUQFCGNVEDRN-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 4
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 4
- 102100034196 Thrombopoietin receptor Human genes 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 4
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- CNKBMTKICGGSCQ-ACRUOGEOSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diamino-1-oxohexyl]amino]-1-oxo-3-phenylpropyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CNKBMTKICGGSCQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 3
- NQUNIMFHIWQQGJ-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-5-thiocyanatobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(SC#N)=CC=C1[N+]([O-])=O NQUNIMFHIWQQGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- YWWATNIVMOCSAV-UBHSHLNASA-N Ala-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YWWATNIVMOCSAV-UBHSHLNASA-N 0.000 description 3
- HMRWQTHUDVXMGH-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HMRWQTHUDVXMGH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N Ala-Glu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 3
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N Ala-Tyr-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)CC1=CC=C(O)C=C1 AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 3
- ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N Ala-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N 0.000 description 3
- OVQJAKFLFTZDNC-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OVQJAKFLFTZDNC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- POZKLUIXMHIULG-FDARSICLSA-N Arg-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N POZKLUIXMHIULG-FDARSICLSA-N 0.000 description 3
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- LVHMEJJWEXBMKK-GMOBBJLQSA-N Asn-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LVHMEJJWEXBMKK-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 3
- YRTOMUMWSTUQAX-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YRTOMUMWSTUQAX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N Asn-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 3
- CBHVAFXKOYAHOY-NHCYSSNCSA-N Asn-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CBHVAFXKOYAHOY-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- UGIBTKGQVWFTGX-BIIVOSGPSA-N Asp-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O UGIBTKGQVWFTGX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 3
- WNGZKSVJFDZICU-XIRDDKMYSA-N Asp-Leu-Trp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N WNGZKSVJFDZICU-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 3
- QNIACYURSSCLRP-GUBZILKMSA-N Asp-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QNIACYURSSCLRP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- NZWDWXSWUQCNMG-GARJFASQSA-N Asp-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O NZWDWXSWUQCNMG-GARJFASQSA-N 0.000 description 3
- QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N Asp-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- KESWRFKUZRUTAH-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KESWRFKUZRUTAH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- BRRPVTUFESPTCP-ACZMJKKPSA-N Asp-Ser-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BRRPVTUFESPTCP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- 102100021849 Calretinin Human genes 0.000 description 3
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 3
- IVCOYUURLWQDJQ-LPEHRKFASA-N Gln-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O IVCOYUURLWQDJQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 3
- JXBZEDIQFFCHPZ-PEFMBERDSA-N Gln-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N JXBZEDIQFFCHPZ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 3
- ZXGLLNZQSBLQLT-SRVKXCTJSA-N Gln-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N ZXGLLNZQSBLQLT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- XZUUUKNKNWVPHQ-JYJNAYRXSA-N Gln-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XZUUUKNKNWVPHQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- VOUSELYGTNGEPB-NUMRIWBASA-N Gln-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VOUSELYGTNGEPB-NUMRIWBASA-N 0.000 description 3
- ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 3
- AVZHGSCDKIQZPQ-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O AVZHGSCDKIQZPQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- PBFGQTGPSKWHJA-QEJZJMRPSA-N Glu-Asp-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O PBFGQTGPSKWHJA-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 3
- ALCAUWPAMLVUDB-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ALCAUWPAMLVUDB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- YLJHCWNDBKKOEB-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YLJHCWNDBKKOEB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N Glu-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- ITVBKCZZLJUUHI-HTUGSXCWSA-N Glu-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ITVBKCZZLJUUHI-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 3
- QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N Glu-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 3
- UCZXXMREFIETQW-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UCZXXMREFIETQW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- VXEFAWJTFAUDJK-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O VXEFAWJTFAUDJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- NZAFOTBEULLEQB-WDSKDSINSA-N Gly-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN NZAFOTBEULLEQB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- LURCIJSJAKFCRO-QWRGUYRKSA-N Gly-Asn-Tyr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LURCIJSJAKFCRO-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N Gly-Asp-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N Gly-Asp-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N 0.000 description 3
- JNGJGFMFXREJNF-KBPBESRZSA-N Gly-Glu-Trp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JNGJGFMFXREJNF-KBPBESRZSA-N 0.000 description 3
- TWTPDFFBLQEBOE-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O TWTPDFFBLQEBOE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- WDXLKVQATNEAJQ-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Asp Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WDXLKVQATNEAJQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N Gly-Thr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 3
- WTUSRDZLLWGYAT-KCTSRDHCSA-N Gly-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)CN WTUSRDZLLWGYAT-KCTSRDHCSA-N 0.000 description 3
- DYKZGTLPSNOFHU-DEQVHRJGSA-N His-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N DYKZGTLPSNOFHU-DEQVHRJGSA-N 0.000 description 3
- KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N His-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- CKRJBQJIGOEKMC-SRVKXCTJSA-N His-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CKRJBQJIGOEKMC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- QLBXWYXMLHAREM-PYJNHQTQSA-N His-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N QLBXWYXMLHAREM-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 3
- 101000898072 Homo sapiens Calretinin Proteins 0.000 description 3
- DXUJSRIVSWEOAG-NAKRPEOUSA-N Ile-Arg-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DXUJSRIVSWEOAG-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- FJWYJQRCVNGEAQ-ZPFDUUQYSA-N Ile-Asn-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N FJWYJQRCVNGEAQ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 3
- NBJAAWYRLGCJOF-UGYAYLCHSA-N Ile-Asp-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N NBJAAWYRLGCJOF-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 3
- HVWXAQVMRBKKFE-UGYAYLCHSA-N Ile-Asp-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HVWXAQVMRBKKFE-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 3
- XLDYDEDTGMHUCZ-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XLDYDEDTGMHUCZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 3
- PFTFEWHJSAXGED-ZKWXMUAHSA-N Ile-Cys-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)O)N PFTFEWHJSAXGED-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- KMBPQYKVZBMRMH-PEFMBERDSA-N Ile-Gln-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KMBPQYKVZBMRMH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 3
- FBGXMKUWQFPHFB-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N FBGXMKUWQFPHFB-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 3
- DTPGSUQHUMELQB-GVARAGBVSA-N Ile-Tyr-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 DTPGSUQHUMELQB-GVARAGBVSA-N 0.000 description 3
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KAFOIVJDVSZUMD-DCAQKATOSA-N Leu-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O KAFOIVJDVSZUMD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- KAFOIVJDVSZUMD-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Gln Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O KAFOIVJDVSZUMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- QUYCUALODHJQLK-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QUYCUALODHJQLK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N Lys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 3
- XNKDCYABMBBEKN-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XNKDCYABMBBEKN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- AFLBTVGQCQLOFJ-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O AFLBTVGQCQLOFJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- CNGOEHJCLVCJHN-SRVKXCTJSA-N Lys-Pro-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CNGOEHJCLVCJHN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- FJVJLMZUIGMFFU-BQBZGAKWSA-N Met-Asp-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O FJVJLMZUIGMFFU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- VOOINLQYUZOREH-SRVKXCTJSA-N Met-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N VOOINLQYUZOREH-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- WXJXYMFUTRXRGO-UWVGGRQHSA-N Met-His-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CNC=N1 WXJXYMFUTRXRGO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- LXVFHIBXOWJTKZ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asn-Tyr Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O LXVFHIBXOWJTKZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- WMGVYPPIMZPWPN-SRVKXCTJSA-N Phe-Asp-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N WMGVYPPIMZPWPN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- CSDMCMITJLKBAH-SOUVJXGZSA-N Phe-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O CSDMCMITJLKBAH-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 3
- HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N Phe-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 3
- KZRQONDKKJCAOL-DKIMLUQUSA-N Phe-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KZRQONDKKJCAOL-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 3
- OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N Phe-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N 0.000 description 3
- WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- RVEVENLSADZUMS-IHRRRGAJSA-N Phe-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RVEVENLSADZUMS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- JTKGCYOOJLUETJ-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JTKGCYOOJLUETJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- YFNOUBWUIIJQHF-LPEHRKFASA-N Pro-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O YFNOUBWUIIJQHF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 3
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- WVOXLKUUVCCCSU-ZPFDUUQYSA-N Pro-Glu-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WVOXLKUUVCCCSU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 3
- QGOZJLYCGRYYRW-KKUMJFAQSA-N Pro-Glu-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QGOZJLYCGRYYRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- JMVQDLDPDBXAAX-YUMQZZPRSA-N Pro-Gly-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 JMVQDLDPDBXAAX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- DWGFLKQSGRUQTI-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DWGFLKQSGRUQTI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- KBUAPZAZPWNYSW-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 KBUAPZAZPWNYSW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- QUBVFEANYYWBTM-VEVYYDQMSA-N Pro-Thr-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QUBVFEANYYWBTM-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 3
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- HVKMTOIAYDOJPL-NRPADANISA-N Ser-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HVKMTOIAYDOJPL-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 3
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- PTWIYDNFWPXQSD-GARJFASQSA-N Ser-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O PTWIYDNFWPXQSD-GARJFASQSA-N 0.000 description 3
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 3
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 3
- YLXAMFZYJTZXFH-OLHMAJIHSA-N Thr-Asn-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O YLXAMFZYJTZXFH-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 3
- LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N Thr-Glu-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 3
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 3
- KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- DOBIBIXIHJKVJF-XKBZYTNZSA-N Thr-Ser-Gln Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O DOBIBIXIHJKVJF-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 3
- XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N Thr-Ser-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 3
- XEVHXNLPUBVQEX-DVJZZOLTSA-N Thr-Trp-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)NCC(=O)O)N)O XEVHXNLPUBVQEX-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 3
- 108010070774 Thrombopoietin Receptors Proteins 0.000 description 3
- FKAPNDWDLDWZNF-QEJZJMRPSA-N Trp-Asp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N FKAPNDWDLDWZNF-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 3
- MKDXQPMIQPTTAW-SIXJUCDHSA-N Trp-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N MKDXQPMIQPTTAW-SIXJUCDHSA-N 0.000 description 3
- ILDJYIDXESUBOE-HSCHXYMDSA-N Trp-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N ILDJYIDXESUBOE-HSCHXYMDSA-N 0.000 description 3
- VMXLNDRJXVAJFT-JYBASQMISA-N Trp-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O VMXLNDRJXVAJFT-JYBASQMISA-N 0.000 description 3
- TVOGEPLDNYTAHD-CQDKDKBSSA-N Tyr-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 TVOGEPLDNYTAHD-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 3
- DANHCMVVXDXOHN-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DANHCMVVXDXOHN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- VTCKHZJKWQENKX-KBPBESRZSA-N Tyr-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O VTCKHZJKWQENKX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 3
- GOPQNCQSXBJAII-ULQDDVLXSA-N Tyr-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N GOPQNCQSXBJAII-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- JXGWQYWDUOWQHA-DZKIICNBSA-N Val-Gln-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N JXGWQYWDUOWQHA-DZKIICNBSA-N 0.000 description 3
- MLADEWAIYAPAAU-IHRRRGAJSA-N Val-Lys-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N MLADEWAIYAPAAU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- JAKHAONCJJZVHT-DCAQKATOSA-N Val-Lys-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JAKHAONCJJZVHT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- GVNLOVJNNDZUHS-RHYQMDGZSA-N Val-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GVNLOVJNNDZUHS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- PGBMPFKFKXYROZ-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N PGBMPFKFKXYROZ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010045350 alanyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 3
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 3
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 3
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 3
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 108010010096 glycyl-glycyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010063431 methionyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 3
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 3
- UCIYCBSJBQGDGM-LPEHRKFASA-N Ala-Arg-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N UCIYCBSJBQGDGM-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- VNFSAYFQLXPHPY-CIQUZCHMSA-N Ala-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNFSAYFQLXPHPY-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 2
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- GOWZVQXTHUCNSQ-NHCYSSNCSA-N Arg-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GOWZVQXTHUCNSQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- MTYLORHAQXVQOW-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O MTYLORHAQXVQOW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- OMKZPCPZEFMBIT-SRVKXCTJSA-N Arg-Met-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OMKZPCPZEFMBIT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- ZRNWJUAQKFUUKV-SRVKXCTJSA-N Arg-Met-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O ZRNWJUAQKFUUKV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- DDBMKOCQWNFDBH-RHYQMDGZSA-N Arg-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O DDBMKOCQWNFDBH-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- HUZGPXBILPMCHM-IHRRRGAJSA-N Asn-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HUZGPXBILPMCHM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- QNJIRRVTOXNGMH-GUBZILKMSA-N Asn-Gln-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O QNJIRRVTOXNGMH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- RDLYUKRPEJERMM-XIRDDKMYSA-N Asn-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RDLYUKRPEJERMM-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- LRCIOEVFVGXZKB-BZSNNMDCSA-N Asn-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LRCIOEVFVGXZKB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- ZVTDYGWRRPMFCL-WFBYXXMGSA-N Asp-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZVTDYGWRRPMFCL-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 2
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N Asp-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- ZUNMTUPRQMWMHX-LSJOCFKGSA-N Asp-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZUNMTUPRQMWMHX-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- GEEXORWTBTUOHC-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)CN=C(N)N GEEXORWTBTUOHC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- HKALUUKHYNEDRS-GUBZILKMSA-N Cys-Leu-Gln Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HKALUUKHYNEDRS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- PGBLJHDDKCVSTC-CIUDSAMLSA-N Cys-Met-Gln Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PGBLJHDDKCVSTC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- PRBLYKYHAJEABA-SRVKXCTJSA-N Gln-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PRBLYKYHAJEABA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- VSXBYIJUAXPAAL-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O VSXBYIJUAXPAAL-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- ILKYYKRAULNYMS-JYJNAYRXSA-N Gln-Lys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ILKYYKRAULNYMS-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- LPIKVBWNNVFHCQ-GUBZILKMSA-N Gln-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LPIKVBWNNVFHCQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- OTQSTOXRUBVWAP-NRPADANISA-N Gln-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OTQSTOXRUBVWAP-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- JVZLZVJTIXVIHK-SXNHZJKMSA-N Glu-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N JVZLZVJTIXVIHK-SXNHZJKMSA-N 0.000 description 2
- NTNUEBVGKMVANB-NHCYSSNCSA-N Glu-Val-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O NTNUEBVGKMVANB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- FGPLUIQCSKGLTI-WDSKDSINSA-N Gly-Ser-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O FGPLUIQCSKGLTI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- UMBDRSMLCUYIRI-DVJZZOLTSA-N Gly-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)CN)O UMBDRSMLCUYIRI-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 2
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- VPKIQULSKFVCSM-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VPKIQULSKFVCSM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- NRFGTHFONZYFNY-MGHWNKPDSA-N Leu-Ile-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NRFGTHFONZYFNY-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 2
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- RJEFZSIVBHGRQJ-SRVKXCTJSA-N Met-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O RJEFZSIVBHGRQJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- PHURAEXVWLDIGT-LPEHRKFASA-N Met-Ser-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N PHURAEXVWLDIGT-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N Phe-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- LTAWNJXSRUCFAN-UNQGMJICSA-N Phe-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O LTAWNJXSRUCFAN-UNQGMJICSA-N 0.000 description 2
- FXEKNHAJIMHRFJ-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N FXEKNHAJIMHRFJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HJSCRFZVGXAGNG-SRVKXCTJSA-N Pro-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HJSCRFZVGXAGNG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 2
- SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N Ser-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- KRPKYGOFYUNIGM-XVSYOHENSA-N Thr-Asp-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O KRPKYGOFYUNIGM-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- WNZRNOGHEONFMS-PXDAIIFMSA-N Trp-Ile-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O WNZRNOGHEONFMS-PXDAIIFMSA-N 0.000 description 2
- JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N Tyr-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- FGVFBDZSGQTYQX-UFYCRDLUSA-N Tyr-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FGVFBDZSGQTYQX-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- SZEIFUXUTBBQFQ-STQMWFEESA-N Tyr-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O SZEIFUXUTBBQFQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- 108010081404 acein-2 Proteins 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 108010018691 arginyl-threonyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 108010005652 splenotritin Proteins 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150084229 ATXN1 gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N Arg-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WQSCVMQDZYTFQU-FXQIFTODSA-N Asn-Cys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WQSCVMQDZYTFQU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QUAWOKPCAKCHQL-SRVKXCTJSA-N Asn-His-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QUAWOKPCAKCHQL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MVXJBVVLACEGCG-PCBIJLKTSA-N Asn-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MVXJBVVLACEGCG-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- RTFXPCYMDYBZNQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RTFXPCYMDYBZNQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NSTBNYOKCZKOMI-AVGNSLFASA-N Asn-Tyr-Glu Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O NSTBNYOKCZKOMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N Asp-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101800004419 Cleaved form Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- KXUKWRVYDYIPSQ-CIUDSAMLSA-N Cys-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXUKWRVYDYIPSQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DTMLKCYOQKZXKZ-HJGDQZAQSA-N Gln-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DTMLKCYOQKZXKZ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- WQWMZOIPXWSZNE-WDSKDSINSA-N Gln-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O WQWMZOIPXWSZNE-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SMLDOQHTOAAFJQ-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SMLDOQHTOAAFJQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XFAUJGNLHIGXET-AVGNSLFASA-N Gln-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XFAUJGNLHIGXET-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N Glu-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- WATXSTJXNBOHKD-LAEOZQHASA-N Glu-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WATXSTJXNBOHKD-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- DLISPGXMKZTWQG-IFFSRLJSSA-N Glu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DLISPGXMKZTWQG-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QGZSAHIZRQHCEQ-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QGZSAHIZRQHCEQ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- IFHJOBKVXBESRE-YUMQZZPRSA-N Gly-Met-Gln Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN IFHJOBKVXBESRE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- IGBBXBFSLKRHJB-BZSNNMDCSA-N His-Lys-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IGBBXBFSLKRHJB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000997832 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK2 Proteins 0.000 description 1
- ZGKVPOSSTGHJAF-HJPIBITLSA-N Ile-Tyr-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N ZGKVPOSSTGHJAF-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HXWALXSAVBLTPK-NUTKFTJISA-N Leu-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N HXWALXSAVBLTPK-NUTKFTJISA-N 0.000 description 1
- DPWGZWUMUUJQDT-IUCAKERBSA-N Leu-Gln-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O DPWGZWUMUUJQDT-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N Leu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PBIPLDMFHAICIP-DCAQKATOSA-N Lys-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PBIPLDMFHAICIP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PRSBSVAVOQOAMI-BJDJZHNGSA-N Lys-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN PRSBSVAVOQOAMI-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- AEIIJFBQVGYVEV-YESZJQIVSA-N Lys-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O AEIIJFBQVGYVEV-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- WZVSHTFTCYOFPL-GARJFASQSA-N Lys-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O WZVSHTFTCYOFPL-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YLLWCSDBVGZLOW-CIUDSAMLSA-N Met-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YLLWCSDBVGZLOW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UOENBSHXYCHSAU-YUMQZZPRSA-N Met-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O UOENBSHXYCHSAU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N Phe-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- LXUJDHOKVUYHRC-KKUMJFAQSA-N Phe-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N LXUJDHOKVUYHRC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HTXVATDVCRFORF-MGHWNKPDSA-N Phe-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N HTXVATDVCRFORF-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N Phe-Pro-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N Phe-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- HJEBZBMOTCQYDN-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HJEBZBMOTCQYDN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- UAJAYRMZGNQILN-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O UAJAYRMZGNQILN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DJACUBDEDBZKLQ-KBIXCLLPSA-N Ser-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DJACUBDEDBZKLQ-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WGDYNRCOQRERLZ-KKUMJFAQSA-N Ser-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)N WGDYNRCOQRERLZ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N Thr-Phe-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- NBIIPOKZPUGATB-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O NBIIPOKZPUGATB-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Gln Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- BYSKNUASOAGJSS-NQCBNZPSSA-N Trp-Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N BYSKNUASOAGJSS-NQCBNZPSSA-N 0.000 description 1
- QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N Tyr-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NJLQMKZSXYQRTO-FHWLQOOXSA-N Tyr-Glu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 NJLQMKZSXYQRTO-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N Tyr-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MDXLPNRXCFOBTL-BZSNNMDCSA-N Tyr-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MDXLPNRXCFOBTL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 102100033444 Tyrosine-protein kinase JAK2 Human genes 0.000 description 1
- MJFSRZZJQWZHFQ-SRVKXCTJSA-N Val-Met-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MJFSRZZJQWZHFQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
[0001][0001]
Настоящее изобретение относится к средству для диагностики, профилактики или лечения миелопролиферативного новообразования.The present invention relates to an agent for the diagnosis, prevention or treatment of a myeloproliferative neoplasm.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for creating the invention
[0002][0002]
У части пациентов с Philadelphia-отрицательными миелопролиферативными новообразованиями (MPN) нуклеотидная делеция или вставка обнаружена в экзоне 9 гена кальретикулина (CALR) (Непатентная литература 1 и 2). Уже было обнаружено, что мутантный белок CALR, продуцируемый мутантным геном CALR, имеет онкогенность, независимо вызывающую миелопролиферативное новообразование (MPN) путем постоянной активации рецептора тромбопоэтина (Непатентная литература 3-6).In a subset of patients with Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), a nucleotide deletion or insertion was found in exon 9 of the calreticulin gene (CALR) (Non-Patent Literature 1 and 2). It has already been found that the mutant CALR protein produced by the mutant CALR gene has oncogenicity, independently causing myeloproliferative neoplasm (MPN) by persistently activating the thrombopoietin receptor (Non-Patent Literature 3-6).
[0003][0003]
Мутация CALR гена, обнаруженная у MPN пациентов, представляет собой мутацию со сдвигом рамки, которая обязательно локализуется в последнем экзоне, и сдвиг в аминокислотной рамке считывания посредством мутации со сдвигом рамки всегда +1. Из этого следует, что последовательность, которой нет у дикого типа, присутствует на карбокси-конце мутантного CALR белка, и, в частности, 44 аминокислоты карбокси-конца являются общими для почти всех мутантных CALR белков. В качестве примера, Фиг. 1 показывает сравнение последовательностей карбокси-концов типа 52-нуклеотидной делеции (Del 52), которая является наиболее частой мутацией из мутаций гена CALR, обнаруженных у MPN пациентов, и типа 5-нуклеотидной вставки (Ins 5), которая является следующей наиболее частой мутацией, с соответствующей областью белка CALR дикого типа.The CALR gene mutation found in MPN patients is a frameshift mutation that is necessarily located in the last exon, and the amino acid reading frame shift by frameshift mutation is always +1. It follows that a sequence not present in the wild type is present at the carboxy terminus of the mutant CALR protein, and in particular the carboxy terminus 44 amino acids are common to almost all mutant CALR proteins. As an example, FIG. 1 shows a comparison of the carboxy terminus sequences of the 52 nucleotide deletion type (Del 52), which is the most common mutation of the CALR gene mutations found in MPN patients, and the 5 nucleotide insertion type (Ins 5), which is the next most common mutation. with the corresponding region of the wild-type CALR protein.
Поскольку мутантный белок CALR, вызывающий MPN, экспрессируется в опухолевых клетках, предположили возможность, что последовательность, специфическая для мутантного белка CALR, вызванного мутацией со сдвигом рамки считывания, станет маркером для диагноза или терапевтической мишенью в качестве неоантигена (Патентная литература 1 и 2).Since the mutant CALR protein causing MPN is expressed in tumor cells, the possibility has been proposed that a sequence specific for the mutant CALR protein caused by a frameshift mutation would become a marker for diagnosis or a therapeutic target as a neoantigen (Patent Literature 1 and 2).
Перечень цитируемых документовList of cited documents
Патентная литератураPatent literature
[0004][0004]
Патентная литература 1: JP-A-2016-537012Patent Literature 1: JP-A-2016-537012
Патентная литература 2: WO2016/087514APatent Literature 2: WO2016/087514A
Непатентная литератураNon-patent literature
[0005][0005]
Непатентная литература 1: Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al., Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms, The New England journal of medicine, 2013, 369: 2379-90Non-patent literature 1: Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al., Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms, The New England journal of medicine, 2013, 369: 2379-90
Непатентная литература 2: Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al., Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2, The New England journal of medicine, 2013, 369: 2391-405Non-patent literature 2: Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al., Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2, The New England journal of medicine, 2013, 369: 2391-405
Непатентная литература 3: Araki M, Yang Y, Masubuchi N, et al., Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms, Blood, 2016, 127: 1307-16Non-patent literature 3: Araki M, Yang Y, Masubuchi N, et al., Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms, Blood, 2016, 127: 1307-16
Непатентная литература 4: Elf S, Abdelfattah NS, Chen E, et al., Mutant Calreticulin Requires Both Its Mutant C-terminus and the Thrombopoietin Receptor for Oncogenic Transformation, Cancer Discov., 2016, 6: 368-81Non-Patent Literature 4: Elf S, Abdelfattah NS, Chen E, et al., Mutant Calreticulin Requires Both Its Mutant C-terminus and the Thrombopoietin Receptor for Oncogenic Transformation, Cancer Discov., 2016, 6: 368-81
Непатентная литература 5: Marty C, Pecquet C, Nivarthi H, et al., Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis, Blood, 2016, 127: 1317-24Non-Patent Literature 5: Marty C, Pecquet C, Nivarthi H, et al., Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis, Blood, 2016, 127: 1317-24
Непатентная литература 6: Vainchenker W, Kralovics R., Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms, Blood, 2017, 129: 667-79Non-patent literature 6: Vainchenker W, Kralovics R., Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms, Blood, 2017, 129: 667-79
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Техническая задачаTechnical challenge
[0006][0006]
Однако было доказано, что антитело, которое распознает последовательность (неоантиген), специфическую для мутантного белка CALR, появляющегося в результате мутации со сдвигом рамки, не может правильно определить мутантный белок CALR в клеточном экстракте или на клеточной поверхности.However, it has been proven that an antibody that recognizes a sequence (neoantigen) specific for a mutant CALR protein resulting from a frameshift mutation cannot correctly detect the mutant CALR protein in a cell extract or on the cell surface.
Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение способов детекции, способных безошибочно обнаруживать мутантный ген CALR и белок MPN, средства для диагностики, профилактики или лечения MPN и способа скрининга для выявления терапевтического средства для лечения MPN.Accordingly, it is an object of the present invention to provide detection methods capable of accurately detecting mutant CALR gene and MPN protein, means for diagnosing, preventing or treating MPN, and a screening method for identifying a therapeutic agent for treating MPN.
Решение задачиThe solution of the problem
[0007][0007]
Авторы настоящего изобретения также осуществили функциональный анализ мутантных белков CALR и в результате обнаружили, что многие из экспрессируемых мутантных белков CALR расщепляются в последовательности (Фиг. 1), специфической для мутантных белков, и что в значительной степени экспрессируется мутантные белки CALR, в которых большая часть последовательности, предполагаемая как неоантиген, утеряна. Соответственно, было получено антитело, которое специфически распознает существенно короткую аминокислотную последовательность, расположенную на амино-концевой стороне сайта расщепления в неоантигене, и было подтверждено, что расщепленные мутантные белки CALR экспрессировались не только в культивируемых клетках, но также в клетках периферической крови пациента и тромбоцитах пациента. Кроме того, было обнаружено, что при использовании этого антитела чувствительность детекции в отношении мутантного белка CALR на поверхности клетки значительно улучшается, и, кроме того, достигается превосходный терапевтический эффект в отношении MPN. На основе этих результатов было обнаружено, что для диагностики или лечения пациентов с MPN, имеющих мутацию гена CALR, могут быть разработаны фармацевтические продукты, демонстрирующие более высокую эффективность путем обнаружения или нацеливания не только на полноразмерный тип (тип без расщепления), но и на мутантные белки CALR, включая типы расщепления. Кроме того, были веские основания для предположения, что эффект фармацевтического продукта, нацеленного на последовательность, которая теряется в результате расщепления, может быть увеличен путем предотвращения расщепления мутантного белка CALR, и настоящее изобретение было осуществлено.The present inventors also performed a functional analysis of mutant CALR proteins and, as a result, discovered that many of the expressed mutant CALR proteins are cleaved in sequence (Fig. 1) specific for the mutant proteins, and that the mutant CALR proteins are largely expressed, in which most the sequence predicted to be a neoantigen is lost. Accordingly, an antibody was generated that specifically recognizes a substantially short amino acid sequence located at the amino-terminal side of the cleavage site in the neoantigen, and it was confirmed that the cleaved mutant CALR proteins were expressed not only in cultured cells, but also in patient peripheral blood cells and platelets patient. In addition, it was found that by using this antibody, the detection sensitivity for mutant cell surface CALR protein was significantly improved and, in addition, excellent therapeutic effect against MPN was achieved. Based on these results, it was found that for the diagnosis or treatment of patients with MPN who have a CALR gene mutation, pharmaceutical products could be developed that demonstrate higher efficacy by detecting or targeting not only the full-length type (non-cleavage type) but also the mutant CALR proteins, including cleavage types. Moreover, there was good reason to believe that the effect of a pharmaceutical product targeting a sequence that is lost by cleavage could be increased by preventing the cleavage of the mutant CALR protein, and the present invention has been made.
[0008][0008]
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает следующее [1]-[14].Thus, the present invention provides the following [1]-[14].
[0009][0009]
[1] Антитело или его функциональный фрагмент, которое связывается с расщепленным мутантным белком CALR, включающее сайт распознавания антигена в (a) полипептидной цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, или в (b) полипептидной цепи, состоящей из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в SEQ ID NO:1.[1] An antibody or functional fragment thereof that binds to a cleaved mutant CALR protein comprising an antigen recognition site on (a) a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, or on (b) a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in SEQ ID NO:1.
[2] Антитело или его функциональный фрагмент, которое связывается с расщепленным мутантным CALR белком в соответствии с аспектом [1], где антитело или его функциональный фрагмент выбирают из следующих (c), (d) и (e):[2] An antibody or a functional fragment thereof that binds to a cleaved mutant CALR protein in accordance with aspect [1], wherein the antibody or a functional fragment thereof is selected from the following (c), (d) and (e):
(c) антитело, в котором CDR1, CDR2 и CDR3 VH-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:17, 18 и 19, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:17, 18 и 19; и CDR1, CDR2 и CDR3 VL-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:26, 27 и 28, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:26, 27 и 28;(c) an antibody wherein the CDR1, CDR2 and CDR3 immunoglobulin VH chains are polypeptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17, 18 and 19, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in amino acid sequences SEQ ID NO:17, 18 and 19; and CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VL chain are polypeptides consisting of the amino acid sequences SEQ ID NO: 26, 27 and 28, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequences SEQ ID NO: 26, 27 and 28;
(d) антитело, в котором CDR1, CDR2 и CDR3 VH-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:20, 21 и 22, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:20, 21 и 22; и CDR1, CDR2 и CDR3 VL-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:29, 30 и 31, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:29, 30 и 31; и(d) an antibody wherein the CDR1, CDR2 and CDR3 immunoglobulin VH chains are polypeptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in amino acid sequences SEQ ID NO:20, 21 and 22; and CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VL chain are polypeptides consisting of the amino acid sequences SEQ ID NO: 29, 30 and 31, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequences SEQ ID NO: 29, 30 and 31; And
(e) антитело, в котором CDR1, CDR2 и CDR3 VH-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:23, 24 и 25, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:23, 24 и 25; и CDR1, CDR2 и CDR3 VL-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:32, 33 и 34, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:32, 33 и 34.(e) an antibody wherein the CDR1, CDR2 and CDR3 immunoglobulin VH chains are polypeptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23, 24 and 25, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in amino acid sequences SEQ ID NO:23, 24 and 25; and CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VL chain are polypeptides consisting of the amino acid sequences SEQ ID NO: 32, 33 and 34, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequences SEQ ID NO: 32, 33 and 34.
[3] Антитело или его функциональный фрагмент, которое связывается с расщепленным мутантным CALR белком в соответствии с аспектом [1] или [2], выбранное из следующих (C), (D) и (E):[3] An antibody or functional fragment thereof that binds to a cleaved mutant CALR protein according to aspect [1] or [2], selected from the following (C), (D) and (E):
(C) антитело, содержащее VH-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и VL-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8;(C) an antibody comprising an immunoglobulin VH chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, or an amino acid sequence with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and an immunoglobulin VL chain consisting of from the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, or an amino acid sequence with a deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:8;
(D) антитело, содержащее VH-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и VL-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9; и(D) an antibody comprising an immunoglobulin VH chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, or an amino acid sequence with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, and an immunoglobulin VL chain consisting of from the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, or an amino acid sequence with a deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:9; And
(E) антитело, содержащее VH-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, и VL-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10.(E) an antibody comprising an immunoglobulin VH chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, or an amino acid sequence with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and an immunoglobulin VL chain consisting of from the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, or an amino acid sequence with a deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
[4] Антитело или его функциональный фрагмент, которое конкурирует с антителом в соответствии с аспектом [2] или [3] за связывание с частью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, в расщепленном мутантном белке CALR.[4] An antibody or functional fragment thereof that competes with an antibody of aspect [2] or [3] for binding to a portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 in a cleaved mutant CALR protein.
[5] Фармацевтическая композиция, включающая антитело или его функциональный фрагмент в соответствии с любым из аспектов [1]-[4].[5] A pharmaceutical composition comprising an antibody or a functional fragment thereof according to any one of aspects [1]-[4].
[6] Фармацевтическая композиция в соответствии с аспектом [5], где фармацевтическая композиция представляет собой средство для диагностики, профилактики или лечения миелопролиферативного новообразования.[6] The pharmaceutical composition according to aspect [5], wherein the pharmaceutical composition is an agent for the diagnosis, prevention or treatment of a myeloproliferative neoplasm.
[7] Способ детекции связанного с миелопролиферативным новообразованием мутантного белка CALR, включающий детекцию следующего полипептида (a) или (b) в биологическом образце:[7] A method for detecting a myeloproliferative neoplasm-associated mutant CALR protein, comprising detecting the following polypeptide (a) or (b) in a biological sample:
(a) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1; или(a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1; or
(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в SEQ ID NO:1.(b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence with deletion, substitution or addition of one or more amino acids in SEQ ID NO:1.
[8] Способ детекции мутантного белка CALR в соответствии с аспектом [7], где детекция полипептида (a) или (b) является иммунологической детекцией с использованием антитела или его функционального фрагмента в соответствии с любым из аспектов [1]-[4].[8] A method for detecting a mutant CALR protein in accordance with aspect [7], wherein detection of polypeptide (a) or (b) is immunological detection using an antibody or a functional fragment thereof in accordance with any of aspects [1]-[4].
[9] Способ скрининга на терапевтическое средство от миелопролиферативного новообразования, включающий скрининг для выявления лекарственного средства, которое связывается со следующим полипептидом (a) или (b):[9] A method of screening for a therapeutic agent for a myeloproliferative neoplasm, comprising screening for a drug that binds to the following polypeptide (a) or (b):
(a) полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1; или(a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1; or
(b) полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в SEQ ID NO:1.(b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in SEQ ID NO:1.
[10] Способ диагностики миелопролиферативного новообразования, включающий детекцию следующего полипептида (a) или (b) в биологическом образце:[10] A method for diagnosing a myeloproliferative neoplasm, comprising detecting the following polypeptide (a) or (b) in a biological sample:
(a) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1; or(a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1; or
(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в SEQ ID NO:1.(b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence with deletion, substitution or addition of one or more amino acids in SEQ ID NO:1.
[11] Способ диагностики в соответствии с аспектом [10], где детекция полипептида (a) или (b) является иммунологической детекцией с использованием антитела или его функционального фрагмента в соответствии с любым из аспектов [1]-[4].[11] The diagnostic method according to aspect [10], wherein the detection of polypeptide (a) or (b) is immunological detection using an antibody or a functional fragment thereof according to any one of aspects [1]-[4].
[12] Способ профилактики или лечения миелопролиферативного новообразования, включающий введение антитела или его функционального фрагмента в соответствии с любым из аспектов [1]-[4].[12] A method for preventing or treating a myeloproliferative neoplasm, comprising administering an antibody or a functional fragment thereof according to any one of aspects [1]-[4].
[13] Антитело или его функциональный фрагмент в соответствии с любым из аспектов [1]-[4] для применения в диагностике миелопролиферативного новообразования.[13] An antibody or functional fragment thereof according to any one of aspects [1]-[4] for use in the diagnosis of a myeloproliferative neoplasm.
[14] Применение антитела или его функционального фрагмента в соответствии с любым из аспектов [1]-[4] для получения средства для диагностики миелопролиферативного новообразования.[14] Use of an antibody or a functional fragment thereof in accordance with any of aspects [1]-[4] for the preparation of an agent for diagnosing a myeloproliferative neoplasm.
Эффекты изобретенияEffects of the invention
[0010][0010]
С использованием антитела, имеющего сайт распознавания антигена (эпитоп) в вышеуказанной полипептидной цепи (а) или (b), можно обнаружить мутантный белок CALR, вызванный расщеплением мутантного белка CALR, и значительно улучшить чувствительность детекции в отношении мутантного белка CALR на поверхности клетки. Соответственно, чувствительность детекции MPN значительно улучшается при использовании средства для диагностики MPN по настоящему изобретению. Кроме того, можно осуществлять специфическую профилактику или лечение MPN с использованием этого антитела. Кроме того, терапевтическое средство от MPN можно подвергнуть скринингу для выявления лекарственного средства, которое связывается с полипептидом (а) или (b).By using an antibody having an antigen recognition site (epitope) in the above polypeptide chain (a) or (b), the mutant CALR protein caused by cleavage of the mutant CALR protein can be detected, and the detection sensitivity of the mutant CALR protein on the cell surface can be significantly improved. Accordingly, the detection sensitivity of MPN is greatly improved by using the MPN diagnostic tool of the present invention. In addition, specific prophylaxis or treatment of MPN can be performed using this antibody. In addition, a therapeutic agent for MPN can be screened to identify a drug that binds to polypeptide (a) or (b).
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
[0011][0011]
[Фиг. 1] Фиг. 1 представляет диаграмму, показывающую характеристики мутантных белков CALR. Мутация гена CALR, ответственная за развитие у пациентов миелопролиферативных новообразований, представляет собой +1 мутацию со сдвигом рамки, и аминокислотая последовательность, характерная для мутантных белков, обнаружена в карбокси-концевой области мутантных белков CALR, продуцируемых в результате мутации. SP: сигнальная последовательность, N: N домен, и P: P домен. Стрелка указывает сайт, с которого начинаются аминокислотные последовательности, отличающиеся от последовательности дикого типа (WT).[Fig. 1] Fig. 1 is a diagram showing the characteristics of mutant CALR proteins. The CALR gene mutation responsible for the development of myeloproliferative neoplasms in patients is a +1 frameshift mutation, and the amino acid sequence characteristic of mutant proteins is found in the carboxy-terminal region of the mutant CALR proteins produced by the mutation. SP: signal sequence, N:N domain, and P:P domain. The arrow indicates the site at which amino acid sequences that differ from the wild type (WT) begin.
[Фиг. 2] Фиг. 2 представляет диаграмму, показывающую антитела, которые распознают последовательности на амино-концевой стороне CALR белка и карбокси-концевой стороне мутантных белков CALR. Антитело, которое распознает последовательность на амино-концевой стороне CALR белка, является коммерчески доступным антителом (анти-CALR антитело), которое распознает аминокислотную последовательность на амино-концевой стороне сайта мутации мутантных белков CALR. Кроме того, антитело, которое распознает последовательность карбокси-конца каждого мутантного белка CALR, является коммерчески доступным антителом (антитело против мутантного CALR), которое распознает аминокислотную последовательность, которая является новообразованной на карбокси-концевой стороне CALR белка в результате мутации нуклеотидной последовательности.[Fig. 2] Fig. 2 is a diagram showing antibodies that recognize sequences on the amino-terminal side of a CALR protein and the carboxy-terminal side of mutant CALR proteins. An antibody that recognizes a sequence on the amino-terminal side of a CALR protein is a commercially available antibody (anti-CALR antibody) that recognizes an amino-terminal sequence on the amino-terminal side of the mutation site of mutant CALR proteins. In addition, an antibody that recognizes the carboxy-terminal sequence of each mutant CALR protein is a commercially available antibody (anti-mutant CALR antibody) that recognizes an amino acid sequence that is newly formed on the carboxy-terminal side of the CALR protein as a result of mutation of the nucleotide sequence.
[Фиг. 3] Фиг. 3 представляет диаграмму, показывающую результаты иммуноблот-анализа белков, секретируемых из UT-7/TPO клеток (Komatsu N. et al., Blood, 1996, 87, 4552-4556), с использованием антитела Фиг. 2. Поскольку vec представляет собой клетку, трансфицированную только вектором экспрессии, эндогенный CALR белок обнаруживается как в UT-7/TPO клетка/CALR (WT). В Del 52 типе и Ins 5 типе мутантный белок CALR, имеющий молекулярную массу меньше, чем у полноразмерного мутантного белка CALR, обнаруживаемого антителом против мутантного CALR, обнаруживается только анти-CALR антителом (звездочка на чертеже). В частности, поскольку полноразмерный мутантный белок CALR типа Ins 5 подвергается электрофорезу до по существу такого же положении, что и эндогенный CALR белок дикого типа, Ins 5 тип не может специфически обнаруживаться анти-CALR антителом.[Fig. 3] Fig. 3 is a graph showing the results of immunoblot analysis of proteins secreted from UT-7/TPO cells (Komatsu N. et al., Blood, 1996, 87, 4552-4556) using the antibody FIG. 2. Since the vec is a cell transfected with expression vector only, endogenous CALR protein is found as in UT-7/TPO cell/CALR (WT). In Del 52 type and Ins type 5, a mutant CALR protein having a molecular weight less than that of the full-length mutant CALR protein detected by the anti-mutant CALR antibody is detected only by the anti-CALR antibody (asterisk in the figure). In particular, because the full-length Ins 5 mutant CALR protein is electrophoresed to essentially the same position as the endogenous wild-type CALR protein, the Ins 5 type cannot be specifically detected by the anti-CALR antibody.
[Фиг. 4] Фиг. 4 представляет схематическую диаграмму, показывающую белки, в которых FLAG-метки слиты с амино (N) концами и карбокси (C) концами типичных мутантных CALR белков, Del 52 типа и Ins 5 типа. Мутантный тип-специфические последовательности показаны черным цветом, а FLAG-метки показаны наклонными линиями.[Fig. 4] Fig. 4 is a schematic diagram showing proteins in which FLAG tags are fused to the amino (N) termini and carboxy (C) termini of typical mutant CALR proteins, Del 52 type and Ins type 5. Mutant type-specific sequences are shown in black and FLAG tags are shown as slanted lines.
[Фиг. 5] Фиг. 5 представляет график, показывающий результаты измерения количеств мутантных CALR белков на клеточных поверхностях методом проточной цитометрии с использованием анти-FLAG антитела. В клетках, экспрессирующих мутантный белок CALR, имеющий FLAG-метку на N-конце, на котором метка остается, независимо от присутствия или отсутствия расщепления, был обнаружен сильный сигнал по сравнению с клетками, в которых C-концевой FLAG отсечен в результате расщепления, происходящего в последовательности, специфической для мутантного белка CALR. При этом наблюдается разница, вызванная тем, что уровень экспрессии Del 52 типа ниже, чем уровень экспрессии Ins 5 типа.[Fig. 5] Fig. 5 is a graph showing the results of measuring the amounts of mutant CALR proteins on cell surfaces by flow cytometry using an anti-FLAG antibody. In cells expressing a mutant CALR protein that has a FLAG tag at the N-terminus, at which the tag remains regardless of the presence or absence of cleavage, a strong signal was detected compared with cells in which the C-terminal FLAG is cut off as a result of cleavage occurring in a sequence specific for the mutant CALR protein. In this case, a difference is observed due to the fact that the expression level of type 5 Del is lower than the expression level of type 5 Ins.
[Фиг. 6] Фиг. 6 показывает антитело, которое распознает мутантный тип-специфическую последовательность на амино-концевой стороне сайта расщепления белка, продуцируемого в мутантный CALR белок-специфической последовательности (черный).[Fig. 6] Fig. 6 shows an antibody that recognizes a mutant type-specific sequence at the amino-terminal side of a protein cleavage site produced into a mutant CALR sequence-specific protein (black).
[Фиг. 7] Фиг. 7 показывает результаты анализа клеток методом проточной цитометрии, используемого на Фиг. 3, с использованием антитела Фиг. 6. Разница в распознавании, которая вызвана положениями, в которых слита FLAG-метка, исчезла. При этом наблюдается разница, заключающаяся в том, что уровень экспрессии Del 52 типа типа ниже, чем уровень экспрессии Ins 5 типа.[Fig. 7] Fig. 7 shows the results of the flow cytometry cell analysis used in FIG. 3, using the antibody of FIG. 6. The difference in recognition that is caused by the positions at which the FLAG tag is fused has disappeared. In this case, a difference is observed that the expression level of type 5 Del 52 is lower than the expression level of type 5 Ins.
[Фиг. 8] Фиг. 8 представляет диаграмму, показывающую детекцию CALR белка расщепленного типа в клетках миелопролиферативного новообразования пациента. Клеточные экстракты, полученные из клеток пациента, анализировали методом иммуноблотинга с использованием антитела, которое распознает аминокислотную последовательность на амино-концевой стороне сайта расщепления белка, продуцируемого в мутантный CALR белок-специфической последовательности. В мононуклеарных клетках периферической крови и тромбоцитах пациентов с миелопролиферативным новообразованием, имеющих мутацию гена CALR, была обнаружена экспрессия расщепленного мутантного белка CALR, который может распознаваться антителом.[Fig. 8] Fig. 8 is a graph showing the detection of split-type CALR protein in a patient's myeloproliferative neoplasm cells. Cell extracts obtained from the patient's cells were analyzed by immunoblotting using an antibody that recognizes the amino acid sequence at the amino-terminal side of the cleavage site of the protein produced in the sequence-specific mutant CALR protein. Expression of a cleaved mutant CALR protein, which can be recognized by an antibody, was detected in peripheral blood mononuclear cells and platelets from patients with myeloproliferative neoplasms with a mutation in the CALR gene.
[Фиг. 9] Фиг. 9 представляет диаграмму, показывающую, что все из антител клона B3, C6 и G1 распознают полноразмерные и расщепленные мутантные CALR белки. Диаграмма показывает результаты иммуноблот-анализа белков, секретируемых из UT-7/TPO клеток, с использованием антитела клона B3 и антител клона C6 и G1. Как полноразмерные типы, Del 52 тип и Ins 5 тип, каждый слитый с FLAG-меткой ниже от сигнальной последовательности на амино-конце, так и расщепленные типы, имеющие более низкие молекулярные массы, также обнаруживались любым из B3, C6 и G1 антител, как в анти-FLAG антителе.[Fig. 9] Fig. 9 is a graph showing that clone B3, C6 and G1 antibodies all recognize full-length and cleaved mutant CALR proteins. The diagram shows the results of immunoblot analysis of proteins secreted from UT-7/TPO cells using clone B3 antibody and clone C6 and G1 antibodies. Both the full-length types, Del 52 type and Ins 5 type, each fused to a FLAG tag downstream of the signal sequence at the amino terminus, and the split types, having lower molecular weights, were also detected by any of the B3, C6 and G1 antibodies, both in anti-FLAG antibody.
[Фиг. 10] Фиг. 10 представляет диаграмму, показывающую, что все из антител клона B3, C6 и G1 распознают мутантные CALR белки на клеточных поверхностях. Диаграмма показывает результаты измерения количеств мутантных CALR белков на клеточных поверхностях UT-7/TPO клеток, экспрессирующих мутантный CALR белок Del 52 типа или Ins 5 типа, слитый с FLAG-меткой, и UT-7/TPO/vec клеток, трансфицированных только вектором экспрессии, методом проточной цитометрии с использованием антитела клона B3 и антител клона C6 и G1. При этом, поскольку уровень экспрессии Del 52 типа ниже, чем уровень экспрессии Ins 5 типа, наблюдается разница в интенсивности сигнала из-за типа мутации.[Fig. 10] Fig. 10 is a graph showing that clone B3, C6 and G1 antibodies all recognize mutant CALR proteins on cell surfaces. The diagram shows the results of measuring the amounts of mutant CALR proteins on the cell surfaces of UT-7/TPO cells expressing mutant CALR protein type Del 52 or Ins type 5 fused to a FLAG tag, and UT-7/TPO/vec cells transfected with the expression vector only , by flow cytometry using antibody clone B3 and antibodies clone C6 and G1. Moreover, since the expression level of type 5 Del is lower than the expression level of type 5 Ins, there is a difference in signal intensity due to the type of mutation.
[Фиг. 11] Фиг. 11 представляет график, показывающий результаты оценки активности связывания антител клона B3, C6 и G1 с мутантным белком CALR. Специфичность связывания антитела клона B3, антител клона C6 и G1 и крысиного IgG в качестве контроля с мутантным CALR белком Del 52 типа оценивали методом ELISA. Зависимое от концентрации специфическое связывание с мутантным белком CALR было обнаружено во всех антителах клона B3, C6 и G1.[Fig. 11] Fig. 11 is a graph showing the results of evaluating the binding activity of clone B3, C6 and G1 antibodies to the mutant CALR protein. The binding specificity of clone B3 antibodies, clone C6 and G1 antibodies, and rat IgG as a control to the Del 52 mutant CALR protein was assessed by ELISA. Concentration-dependent specific binding to the mutant CALR protein was detected in all clone B3, C6, and G1 antibodies.
[Фиг. 12] Фиг. 12 представляет график, показывающий результаты оценки силы связывания антитела клона B3 с антигеном, используемым для продукции антитела, методом поверхностного плазмонного резонанса. Силу связывания антитела клона B3 и антигена, используемого для продукции антитела, оценивали методом поверхностного плазмонного резонанса.[Fig. 12] Fig. 12 is a graph showing the results of evaluating the binding strength of an antibody of clone B3 to an antigen used for antibody production by surface plasmon resonance. The binding strength of the clone B3 antibody and the antigen used to produce the antibody was assessed by surface plasmon resonance.
[Фиг. 13A] Фиг. 13A представляет диаграмму, показывающую результаты идентификации антиген-распознающих последовательностей антител клона B3, C6 и G1 методом иммуноблотинга. Белки, каждый содержащий аланин (A), заменяющий одну аминокислоту в мутантном белке CALR типа Del 52, показанном на диаграмме, экспрессировали и реактивность соответствующих антител в отношении белков оценивали методом иммуноблотинга. Интактный означает мутантный CALR белок Del 52 типа, не имеющий аминокислотной замены. Аминокислоты, обведенные жирной черной линией, представляют собой антигенные последовательности, используемые для продукции антител.[Fig. 13A] FIG. 13A is a graph showing the results of identification of antigen recognition sequences of clone B3, C6 and G1 antibodies by immunoblotting. Proteins each containing an alanine (A) substituting one amino acid in the Del 52 type CALR mutant protein shown in the diagram were expressed and the reactivity of the corresponding antibodies to the proteins was assessed by immunoblotting. Intact means a Del 52 mutant CALR protein that does not have an amino acid substitution. The amino acids outlined with a thick black line are the antigenic sequences used to produce antibodies.
[Фиг. 13B] Фиг. 13B представляет диаграмму, показывающую результаты идентификации антиген-распознающих последовательностей антител клона B3, C6 и G1 методом ELISA. Реактивности соответствующих антител в отношении тех же белков, которые показаны на Фиг. 13A, оценивали методом ELISA. Интактный означает мутантный CALR белок Del 52 типа, на имеющий аминокислотной замены. Аминокислоты, обведенные жирной черной линией, представляют собой антигенные последовательности, используемые для продукции антител.[Fig. 13B] FIG. 13B is a graph showing the results of identification of antigen recognition sequences of clone B3, C6 and G1 antibodies by ELISA. The reactivity of the corresponding antibodies against the same proteins shown in Fig. 13A was assessed by ELISA. Intact means a type 52 mutant CALR protein that has an amino acid substitution. The amino acids outlined with a thick black line are the antigenic sequences used to produce antibodies.
[Фиг. 14] Фиг. 14 представляет диаграмму, показывающую аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению.[Fig. 14] Fig. 14 is a diagram showing the amino acid sequences of the heavy chain variable regions of antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention.
[Фиг. 15] Фиг. 15 представляет диаграмму, показывающую аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению.[Fig. 15] Fig. 15 is a diagram showing the amino acid sequences of the light chain variable regions of antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention.
[Фиг. 16] Фиг. 16 представляет диаграмму, показывающую нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению.[Fig. 16] Fig. 16 is a diagram showing the nucleotide sequences of the heavy chain variable regions of antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention.
[Фиг. 17] Фиг. 17 представляет диаграмму, показывающую нуклеотидные последовательности вариабельных областей легкой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению.[Fig. 17] Fig. 17 is a diagram showing the nucleotide sequences of light chain variable regions of antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention.
[Фиг. 18] Фиг. 18 представляет диаграмму, показывающую терапевтический эффект на MPN мышиную модель с использованием B3 мышиного химерного антитела. B3 химерное антитело или растворитель (PBS) вводили модельным мышам с миелопролиферативным новообразованием (CALR Del 52 мыши), полученным путем трансплантации гематопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих мутантный CALR белок Del 52 типа, или контрольным мышам после трансплантации гематопоэтических стволовых клеток, трансфицированных контрольным вектором, каждую неделю, начиная с 9-й недели после трансплантации, и оценивали эффект подавления тромбоцитоза, характерного для мышиной модели миелопролиферативного новообразования.[Fig. 18] Fig. 18 is a graph showing the therapeutic effect on the MPN mouse model using the B3 mouse chimeric antibody. B3 chimeric antibody or vehicle (PBS) was administered to a model mouse model of myeloproliferative neoplasm (CALR Del 52 mice) obtained by transplantation of hematopoietic stem cells expressing the mutant CALR protein Del 52 type, or to control mice after transplantation of hematopoietic stem cells transfected with a control vector, each week, starting from the 9th week after transplantation, and assessed the effect of suppressing thrombocytosis, characteristic of a mouse model of myeloproliferative neoplasm.
Описание вариантов осуществленияDescription of Embodiments
[0012][0012]
Полипептид (a) или (b) по настоящему изобретению, который используют в способе детекции связанного с MPN мутантного белка CALR, и используют в способе диагностики и в качестве мишени для профилактики или лечения MPN, представляет собой полипептид, остающийся на карбокси-концевой стороне после расщепления последовательности (44 аминокислоты, общие для мутантных CALR белков на Фиг. 1), специфической для мутантных CALR белков.The polypeptide (a) or (b) of the present invention, which is used in a method for detecting MPN-associated mutant CALR protein, and is used in a diagnostic method and as a target for the prevention or treatment of MPN, is a polypeptide remaining on the carboxy-terminal side after cleavage of the sequence (44 amino acids common to the mutant CALR proteins in Fig. 1) specific to the mutant CALR proteins.
CALR белок дикого типа включает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2), показанную на Фиг. 1. Кроме того, тип 52-нуклеотидной делеции (Del 52), который представляет собой наиболее часто встречающуюся мутацию среди мутаций гена CALR, включает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:3), показанную на Фиг. 1. Кроме того, тип 5-нуклеотидной вставки (Ins 5), который представляет собой следующую наиболее часто встречающуюся мутацию среди мутаций гена CALR, включает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:4), показанную на Фиг. 1. Кроме того, область, заключенная в рамку на Фиг. 1, представляет собой аминокислотную последовательность, общую для большинства мутантных CALR белков. Расщепленный мутантный белок CALR включает только 13 аминокислот на амино-концевой стороне этой общей области. Авторы настоящего изобретения обнаружили что эта общая область расщепляется с образованием расщепленных мутантных CALR белков, и что теряется бóльшая часть общей области из мутантных CALR белков.The wild type CALR protein includes the amino acid sequence (SEQ ID NO:2) shown in FIG. 1. In addition, the 52-nucleotide deletion type (Del 52), which is the most common mutation among CALR gene mutations, includes the amino acid sequence (SEQ ID NO:3) shown in FIG. 1. In addition, the 5-nucleotide insertion type (Ins 5), which is the next most common mutation among CALR gene mutations, includes the amino acid sequence (SEQ ID NO:4) shown in FIG. 1. Moreover, the area enclosed by a frame in FIG. 1 is the amino acid sequence common to most mutant CALR proteins. The cleaved mutant CALR protein includes only 13 amino acids on the amino-terminal side of this general region. The present inventors have discovered that this common region is cleaved to produce cleaved mutant CALR proteins, and that most of the common region is lost from the mutant CALR proteins.
[0013][0013]
Полипептид (a) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность, имеющая делецию, замену или добавление одной-нескольких аминокислот, в виде полипептида (b) предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую делецию, замену или добавление одной-четырех аминокислот, более предпочтительно аминокислотную последовательность, имеющую делецию, замену или добавление одной-трех аминокислот в SEQ ID NO:1. Более конкретно, аминокислотная последовательность, имеющая делецию трех аминокислот с карбокси-концевой стороны SEQ ID NO:1, является более предпочтительной. Кроме того, идентичность между аминокислотной последовательностью полипептида (b) и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 предпочтительно составляет 80% или больше, более предпочтительно 85% или больше и еще более предпочтительно 90% или больше.Polypeptide (a) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1. The amino acid sequence having the deletion, substitution or addition of one to more amino acids in the form of polypeptide (b) is preferably an amino acid sequence having the deletion, substitution or addition of one to four amino acids, more preferably an amino acid sequence having the deletion, substitution or addition of one - three amino acids in SEQ ID NO:1. More specifically, an amino acid sequence having a deletion of three amino acids from the carboxy-terminal side of SEQ ID NO:1 is more preferred. Moreover, the identity between the amino acid sequence of the polypeptide (b) and the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more.
[0014][0014]
В способе детекции связанного с MPN мутантного белка CALR и в способе диагностики, профилактики или лечения MPN по настоящему изобретению используют антитело или его функциональный фрагмент, которое связывается с полипептидом (a) или (b) в биологическом образце.The method for detecting MPN-associated mutant CALR protein and the method for diagnosing, preventing or treating MPN of the present invention uses an antibody or a functional fragment thereof that binds to polypeptide (a) or (b) in a biological sample.
[0015][0015]
Антитело может представлять собой любое антитело, имеющее сайт распознавания антигена (эпитоп) в полипептидной цепи (a) или (b), и может связываться только с расщепленным мутантным белком CALR или может связываться как с расщепленным мутантным белком CALR, так и с полноразмерным мутантным белком CALR, и антитело предпочтительно представляет собой антитело, специфическое в отношении "мутантного белка CALR", которое связывается как с расщепленным мутантным белком CALR, так и с полноразмерным мутантным белком CALR. Конкретные примеры антитела включают антитела, выбранные из следующих (c), (d) и (e):The antibody may be any antibody having an antigen recognition site (epitope) on the polypeptide chain (a) or (b), and may bind only to the cleaved mutant CALR protein or may bind to both the cleaved mutant CALR protein and the full length mutant protein CALR, and the antibody is preferably a "mutant CALR protein" specific antibody that binds to both the cleaved mutant CALR protein and the full length mutant CALR protein. Specific examples of the antibody include antibodies selected from the following (c), (d) and (e):
(c) антитело, в котором CDR1, CDR2 и CDR3 VH-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:17, 18 и 19, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:17, 18 и 19; и CDR1, CDR2 и CDR3 VL-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:26, 27 и 28, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:26, 27 и 28;(c) an antibody wherein the CDR1, CDR2 and CDR3 immunoglobulin VH chains are polypeptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17, 18 and 19, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in amino acid sequences SEQ ID NO:17, 18 and 19; and CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VL chain are polypeptides consisting of the amino acid sequences SEQ ID NO: 26, 27 and 28, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequences SEQ ID NO: 26, 27 and 28;
(d) антитело, в котором CDR1, CDR2 и CDR3 VH-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:20, 21 и 22, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:20, 21 и 22; и CDR1, CDR2 и CDR3 VL-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:29, 30 и 31, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:29, 30 и 31; and(d) an antibody wherein the CDR1, CDR2 and CDR3 immunoglobulin VH chains are polypeptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in amino acid sequences SEQ ID NO:20, 21 and 22; and CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VL chain are polypeptides consisting of the amino acid sequences SEQ ID NO: 29, 30 and 31, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequences SEQ ID NO: 29, 30 and 31; and
(e) антитело, в котором CDR1, CDR2 и CDR3 VH-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:23, 24 и 25, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:23, 24 и 25; и CDR1, CDR2 и CDR3 VL-цепи иммуноглобулина представляют собой полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:32, 33 и 34, соответственно, или аминокислотных последовательностей с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:32, 33 и 34.(e) an antibody wherein the CDR1, CDR2 and CDR3 immunoglobulin VH chains are polypeptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23, 24 and 25, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in amino acid sequences SEQ ID NO:23, 24 and 25; and CDR1, CDR2 and CDR3 of the immunoglobulin VL chain are polypeptides consisting of the amino acid sequences SEQ ID NO: 32, 33 and 34, respectively, or amino acid sequences with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequences SEQ ID NO: 32, 33 and 34.
[0016][0016]
Аминокислотная последовательность, имеющая делецию, замену или добавление одной-нескольких аминокислот в каждой из аминокислотных последовательностей, соответственно представленных в SEQ ID NO:17-34, предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую делецию, замену или добавление одной-четырех аминокислот, более предпочтительно аминокислотную последовательность, имеющую делецию, замену или добавление одной-трех аминокислот, и еще более предпочтительно аминокислотную последовательность, имеющую делецию, замену или добавление одной или двух аминокислот в SEQ ID NO:17-34. Кроме того, идентичность между каждой из аминокислотных последовательностей, соответственно представленных в SEQ ID NO:17-34, и аминокислотной последовательностью, имеющей делецию, замену или добавление одной-нескольких аминокислот соответствующей аминокислотной последовательности, предпочтительно составляет 80% или больше, более предпочтительно 85% или больше и еще более предпочтительно 90% или больше.An amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one to more amino acids in each of the amino acid sequences respectively presented in SEQ ID NO: 17-34 is preferably an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one to four amino acids, more preferably an amino acid a sequence having a deletion, substitution or addition of one to three amino acids, and even more preferably an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one or two amino acids in SEQ ID NO: 17-34. In addition, the identity between each of the amino acid sequences respectively presented in SEQ ID NO: 17-34 and the amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one or more amino acids of the corresponding amino acid sequence is preferably 80% or greater, more preferably 85% or more and even more preferably 90% or more.
[0017][0017]
Антитело, имеющее сайт распознавания антигена (эпитоп) в полипептидной цепи (a) или (b), еще более предпочтительно представляет собой антитело, выбранное из следующих (C), (D) и (E):The antibody having an antigen recognition site (epitope) on the polypeptide chain (a) or (b) is even more preferably an antibody selected from the following (C), (D) and (E):
(C) антитело, содержащее VH-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и VL-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8;(C) an antibody comprising an immunoglobulin VH chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, or an amino acid sequence with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and an immunoglobulin VL chain consisting of from the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, or an amino acid sequence with a deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:8;
(D) антитело, содержащее VH-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и VL-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9; и(D) an antibody comprising an immunoglobulin VH chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, or an amino acid sequence with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, and an immunoglobulin VL chain consisting of from the amino acid sequence of SEQ ID NO:9, or an amino acid sequence with a deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:9; And
(E) антитело, содержащее VH-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, и VL-цепь иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, или аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10.(E) an antibody comprising an immunoglobulin VH chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, or an amino acid sequence with the deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and an immunoglobulin VL chain consisting of from the amino acid sequence of SEQ ID NO:10, or an amino acid sequence with a deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
[0018][0018]
Аминокислотная последовательность, имеющая делецию, замену или добавление одной-нескольких аминокислот в каждой из аминокислотных последовательностей, соответственно представленных в SEQ ID NO:5-10, предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую делецию, замену или добавление одной-десяти аминокислот, более предпочтительно аминокислотную последовательность, имеющую делецию, замену или добавление одной-восьми аминокислот, и еще более предпочтительно аминокислотную последовательность, имеющую делецию, замену или добавление одной-пяти аминокислот, в SEQ ID NO:5-10. Кроме того, идентичность между каждой из аминокислотных последовательностей, соответственно представленных в SEQ ID NO:5-10, и аминокислотной последовательностью, имеющей делецию, замену или добавление одной-нескольких аминокислот соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5-10, предпочтительно составляет 80% или больше, более предпочтительно 85% или больше и еще более предпочтительно 90% или больше.An amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one to more amino acids in each of the amino acid sequences respectively presented in SEQ ID NO: 5-10 is preferably an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one to ten amino acids, more preferably an amino acid a sequence having a deletion, substitution or addition of one to eight amino acids, and even more preferably an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one to five amino acids, in SEQ ID NO:5-10. In addition, the identity between each of the amino acid sequences respectively presented in SEQ ID NO:5-10 and the amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one or more amino acids of the corresponding amino acid sequence of SEQ ID NO:5-10 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more and even more preferably 90% or more.
[0019][0019]
Антитело по настоящему изобретению включает последовательности каждой CDR антител (c)-(e) или последовательности VH области и VL области иммуноглобулина антител (C)-(E), и амино последовательности областей, отличных от этих областей, конкретно не ограничиваются. Соответственно, антитело по настоящему изобретению может представлять собой антитело млекопитающего, отличного от крысы, такое как человеческое антитело, или может представлять собой гуманизированное антитело. Более конкретно, антитело может представлять собой химерное антитело, содержащее вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела млекопитающего, отличного от человека, например крысы, и константные области тяжелой цепи и легкой цепи человеческого антитела, и такое антитело можно получить путем лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область крысиного антитела, с ДНК, кодирующей константную область человеческого антитела, включения этого в вектор экспрессии и введения вектора хозяину для продуцирования. Гуманизированное антитело также называют реконструированным человеческим антителом, и его получают путем трансплантации CDR антитела млекопитающего, отличного от человека, например крысиного антитела, в CDR человеческого антитела, и используемый для этого общий метод рекомбинации генов также известен. В конкретном примере последовательность ДНК, разработанная для лигирования CDR крысиного антитела с каркасной областью (FR) человеческого антитела, синтезируют из нескольких олигонуклеотидов, полученных таким образом, чтобы включать часть, перекрывающуюся с концевой частью, методом ПЦР. Полученную ДНК лигируют с ДНК, кодирующей константную область человеческого антитела, затем это включают в вектор экспрессии, и вектор экспрессии вводят хозяину для продуцирования гуманизированного антитела (см. публикацию Европейской патентной заявки № EP239400 и публикацию международной патентной заявки WO96/02576). FR человеческого антитела, которую лигируют через CDR, выбирают таким образом, чтобы CDR образовывала благоприятный антиген-связывающий сайт. При необходимости аминокислота из FR вариабельной области антитела может быть заменена так, чтобы CDR реконструированного человеческого антитела образовывала соответствующий антиген-связывающий сайт (Sato, K. et al., Cancer Res., 1993, 53, 851-856).The antibody of the present invention includes the sequences of each CDR of antibodies (c)-(e) or the sequences of the VH region and VL region of the immunoglobulin antibodies (C)-(E), and the amino sequences of regions other than these regions are not particularly limited. Accordingly, the antibody of the present invention may be a non-rat mammalian antibody, such as a human antibody, or may be a humanized antibody. More specifically, the antibody may be a chimeric antibody comprising the heavy chain and light chain variable regions of a non-human mammalian antibody, such as a rat, and the heavy chain and light chain constant regions of a human antibody, and such antibody can be produced by ligating DNA encoding the variable region of a rat antibody, with DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, and introducing the vector into a host for production. A humanized antibody is also called a reshaped human antibody and is produced by transplanting the CDR of a non-human mammalian antibody, such as a rat antibody, into the CDR of a human antibody, and the general gene recombination method used for this is also known. In a specific example, a DNA sequence designed to ligate the CDR of a rat antibody to the framework region (FR) of a human antibody is synthesized from several oligonucleotides prepared to include a portion overlapping the terminal portion by PCR. The resulting DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, which is then incorporated into an expression vector, and the expression vector is administered to a host to produce a humanized antibody (see European Patent Application Publication No. EP239400 and International Patent Application Publication WO96/02576). The human antibody FR that is ligated through the CDR is selected such that the CDR forms a favorable antigen binding site. If necessary, an amino acid from the FR variable region of an antibody can be replaced so that the CDR of the reshaped human antibody forms the corresponding antigen binding site (Sato, K. et al., Cancer Res., 1993, 53, 851-856).
[0020][0020]
Кроме того, способы получения человеческих антител также известны. Например, человеческие лимфоциты сенсибилизируют in vitro желаемым антигеном или клеткой, экспрессирующей желаемый антиген, и сенсибилизированные лимфоциты сливают с клетками миеломы человека, такими как U266, с получением желаемого человеческого антитела, обладающего активностью связывания с антигеном (см. JP-B-1-59878). Кроме того, желаемое человеческое антитело можно получить путем иммунизации трансгенного животного, имеющего весь репертуар генов человеческого антитела, желаемым антигеном (см. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735). Кроме того, также известен метод пэннинга для получения человеческого антитела с использованием библиотеки человеческих антител. Например, вариабельную область человеческого антитела экспрессируют в виде одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага методом фагового дисплея, и можно выбрать фаг, который связывается с антигеном. Путем анализа гена выбранного фага можно определить последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область человеческого антитела, которая связывается с антигеном. Если определена ДНК последовательность scFv, которая связывается с антигеном, человеческое антитело можно получить путем получения подходящего вектора экспрессии, содержащего эту последовательность. Такие способы уже хорошо известны, и можно сослаться на WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388.In addition, methods for producing human antibodies are also known. For example, human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen or a cell expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to produce the desired human antibody having antigen binding activity (see JP-B-1-59878 ). In addition, the desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with the desired antigen (see WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 and WO 96/33735). In addition, a panning method for producing a human antibody using a library of human antibodies is also known. For example, the variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of a phage by phage display, and the phage that binds to the antigen can be selected. By analyzing the gene of the selected phage, the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. Once the DNA sequence of the scFv that binds to the antigen has been determined, a human antibody can be produced by preparing a suitable expression vector containing this sequence. Such methods are already well known and reference may be made to WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 and WO 95/15388.
[0021][0021]
Класс антитела конкретно не ограничивается, и включены антитела, имеющие любой из изотипов, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Принимая во внимание, например, простоту очистки, IgG является предпочтительным.The class of the antibody is not particularly limited, and antibodies having any of the isotypes such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE are included. Considering, for example, ease of purification, IgG is preferred.
[0022][0022]
Примеры функциональных фрагментов включают низкомолекулярные антитела, такие как фрагменты антител и модифицированные антитела. Конкретные примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv и диатела.Examples of functional fragments include small molecule antibodies such as antibody fragments and modified antibodies. Specific examples of antibody fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, scFv and diabodies.
[0023][0023]
Кроме того, что касается антител по настоящему изобретению, антитело, которое используют для детекции полипептида (a) или (b), может представлять собой любое антитело, которое связывается с этими полипептидами. Альтернативно, антитело, которое используют для профилактики или лечения MPN, предпочтительно представляет собой антитело, которое связывается с полипептидом (a) или (b) и обладает цитотоксической активностью.Moreover, with respect to the antibodies of the present invention, the antibody that is used to detect polypeptide (a) or (b) can be any antibody that binds to these polypeptides. Alternatively, the antibody that is used for the prevention or treatment of MPN is preferably an antibody that binds to polypeptide (a) or (b) and has cytotoxic activity.
[0024][0024]
Антитело, которое связывается с расщепленным мутантным белком CALR, может представлять собой любое антитело, которое связывается с полипептидной цепью, включающей последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и предпочтительно представляет собой антитело, которое конкурирует с по меньшей мере одним из вышеуказанных антител и их функциональных фрагментов за связывание с частью аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, в расщепленном мутантном белке CALR.The antibody that binds to the cleaved mutant CALR protein may be any antibody that binds to a polypeptide chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:1, and is preferably an antibody that competes with at least one of the above antibodies and their functional fragments for binding to part of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, in the cleaved mutant CALR protein.
[0025][0025]
В данном случае биологический образец, используемый в способе детекции, представляет собой, например, биологический образец, взятый у субъекта и включающий полипептид (а) или (b). В частности, примеры образцов включают цельную кровь, плазму, сыворотку, лимфоциты, лимфатическую жидкость, тромбоциты, мононуклеарные клетки, гранулоциты, жидкости организма, такие как слюна и моча, и образцы тканей (жидкость костного мозга и ткань костного мозга), полученные биопсией костного мозга.Here, the biological sample used in the detection method is, for example, a biological sample taken from a subject and includes polypeptide (a) or (b). In particular, examples of samples include whole blood, plasma, serum, lymphocytes, lymph fluid, platelets, mononuclear cells, granulocytes, body fluids such as saliva and urine, and tissue samples (bone marrow fluid and bone marrow tissue) obtained by bone marrow biopsy brain
[0026][0026]
Примеры способа детекции полипептида (a) или (b) включают жидкостную хроматографию, масс-спектрометрию, иммунологический метод и метод, использующий молекулу с низкой или средней молекулярной массой, обладающую специфической связывающей способностью, или нуклеиновую кислоту, или производное нуклеиновой кислоты, и иммунологический метод предпочтителен с учетом его простоты и высокой чувствительности.Examples of the polypeptide detection method (a) or (b) include liquid chromatography, mass spectrometry, an immunological method and a method using a low or medium molecular weight molecule having a specific binding ability, or a nucleic acid or a nucleic acid derivative, and an immunological method preferred given its simplicity and high sensitivity.
[0027][0027]
Иммунологический способ предпочтительно представляет собой иммунологический способ с использованием антитела или его функционального фрагмента, включающего сайт распознавания антигена (эпитоп) в полипептидной цепи (a) или (b). Эпитоп в полипептидной цепи (a) или (b) может представлять собой любую последовательность, присутствующую в полипептидной цепи (a) или (b), и предпочтительно представляет собой пептид, включающий три или более последовательных аминокислот в полипептидной цепи (a) или (b), и более предпочтительно пептид, включающий пять или более последовательных аминокислот в полипептидной цепи (a) или (b).The immunological method is preferably an immunological method using an antibody or a functional fragment thereof comprising an antigen recognition site (epitope) on a polypeptide chain (a) or (b). The epitope in polypeptide chain (a) or (b) may be any sequence present in polypeptide chain (a) or (b), and is preferably a peptide comprising three or more consecutive amino acids in polypeptide chain (a) or (b ), and more preferably a peptide comprising five or more consecutive amino acids in the polypeptide chain (a) or (b).
[0028][0028]
Антитело, используемое в иммунологическом способе, может быть любым антителом, полученным с использованием пептида, включающего, например, три или более последовательных аминокислот в полипептидной цепи (а) или (b), в качестве антигена, и может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом, и предпочтительным является моноклональное антитело. Моноклональное антитело может быть получено, например, путем получения антитело-продуцирующих клеток путем сенсибилизации пептидом, включающим три или более последовательных аминокислот в полипептидной цепи (а) или (b), слияния антитело-продуцирующих клеток с миеломными клетками с получением гибридом, выбора клона, продуцирующего целевое антитело, и размножения этой клетки.The antibody used in the immunological method may be any antibody produced using a peptide comprising, for example, three or more consecutive amino acids in the polypeptide chain (a) or (b) as an antigen, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and a monoclonal antibody is preferred. A monoclonal antibody can be produced, for example, by producing antibody-producing cells by sensitizing with a peptide comprising three or more consecutive amino acids in the polypeptide chain (a) or (b), fusing the antibody-producing cells with myeloma cells to produce hybridomas, selecting a clone, producing the target antibody, and propagation of this cell.
[0029][0029]
В качестве иммунологического способа можно использовать, например, любой из иммунохроматографии, иммуноферментного анализа (EIA), радиоиммуноанализа (RIA), метода коагуляции, нефелометрии, проточной цитометрии, иммуноокрашивания тканей и иммуноблоттинга, такого как вестерн-блоттинг. В данном случае иммуноблоттинг представляет собой метод, в котором полипептид переносится на мембрану, и полипептид на мембране обнаруживается антителом. При детекции антитела, например, используют ферментную метку или флуоресцентную метку.As the immunological method, for example, any one of immunochromatography, enzyme-linked immunostaining assay (EIA), radioimmunoassay (RIA), coagulation method, nephelometry, flow cytometry, tissue immunostaining and immunoblotting such as Western blotting can be used. In this case, immunoblotting is a technique in which a polypeptide is transferred to a membrane and the polypeptide on the membrane is detected by an antibody. When detecting an antibody, for example, an enzyme tag or a fluorescent tag is used.
Если полипептид (а) или (b) обнаружен в биологическом образце, можно сделать вывод, что этот биологический образец является биологическим образцом, полученным от пациента с миелопролиферативным новообразованием.If polypeptide (a) or (b) is detected in a biological sample, it can be concluded that the biological sample is a biological sample obtained from a patient with a myeloproliferative neoplasm.
[0031][0031]
Средство для диагностики MPN по настоящему изобретению содержит антитело, имеющее сайт распознавания антигена (эпитоп) в полипептидной цепи (а) или (b). Это антитело предпочтительно представляет собой антитело, описанное выше.The MPN diagnostic agent of the present invention contains an antibody having an antigen recognition site (epitope) in a polypeptide chain (a) or (b). This antibody is preferably the antibody described above.
Кроме того, средство для диагностики MPN по настоящему изобретению может включать, например, буфер и протокол измерения в дополнение к антителу.Moreover, the MPN diagnostic tool of the present invention may include, for example, a buffer and a measurement protocol in addition to an antibody.
[0032][0032]
Фармацевтическая композиция, такая как средство для профилактики или лечения MPN, по настоящему изобретению по меньшей мере содержит описанное выше антитело и может быть получена путем формулирования вместе с фармацевтически приемлемым носителем, например, путем смешивания, растворения, эмульгирования, инкапсулирования или лиофилизации.A pharmaceutical composition, such as an agent for the prevention or treatment of MPN, of the present invention at least contains the antibody described above and can be prepared by formulation together with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, by mixing, dissolving, emulsifying, encapsulating or lyophilizing.
[0033][0033]
MPN в качестве мишени для профилактики или терапии с использованием фармацевтической композиции по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой MPN, в котором обнаружен мутантный CALR.The MPN as a target for prevention or therapy using the pharmaceutical composition of the present invention is preferably an MPN in which a mutant CALR is detected.
[0034][0034]
Подходящие композиции для перорального введения представляют собой, например, жидкость, полученную растворением эффективного количества антитела по настоящему изобретению в разбавителе, таком как вода или физиологический раствор, капсулу, гранулу, порошок или таблетку, содержащие эффективное количество антитела в виде твердого вещества или гранулы, суспензию, полученную путем суспендирования эффективного количества антитела в соответствующей дисперсионной среде, и эмульсию, полученную путем диспергирования и эмульгирования раствора эффективного количества антитела в соответствующей дисперсионной среде.Suitable compositions for oral administration are, for example, a liquid prepared by dissolving an effective amount of an antibody of the present invention in a diluent such as water or saline, a capsule, granule, powder or tablet containing an effective amount of the antibody in the form of a solid or granule, suspension , obtained by suspending an effective amount of the antibody in a suitable dispersion medium, and an emulsion obtained by dispersing and emulsifying a solution of an effective amount of the antibody in a suitable dispersion medium.
[0035][0035]
Для парентерального введения антитело по настоящему изобретению можно сформулировать в виде лекарственной формы, такой как раствор для инъекций, суспензия, эмульсия, крем, мазь, ингаляционная форма и суппозиторий, вместе с фармацевтически приемлемым растворителем, эксципиентом, связующим, стабилизатором, диспергатором и т.д. Для получения препарата для инъекций антитело по настоящему изобретению можно растворить в водном растворе, предпочтительно в физиологически совместимом буфере, таком как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой буферный раствор. Кроме того, фармацевтический продукт по настоящему изобретению может образовывать, например, суспензию, раствор или эмульсию в масляном или водном носителе. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению получают в форме порошка, и водный раствор или суспензию можно получить с использованием стерильной воды или т.п. перед использованием. Для ингаляционного введения антитело по настоящему изобретению измельчают в порошок и смешивают с соответствующей основой, такой как лактоза или крахмал, с образованием порошковой смеси. Суппозиторий можно получить путем смешивания антитела по настоящему изобретению с обычной основой для суппозиториев, такой как масло какао. Кроме того, терапевтическое средство по настоящему изобретению может быть получено в виде композиции с замедленным высвобождением путем инкапсуляции с использованием полимерной матрицы или т.п.For parenteral administration, the antibody of the present invention can be formulated in a dosage form such as an injection, suspension, emulsion, cream, ointment, inhalation form and suppository, together with a pharmaceutically acceptable solvent, excipient, binder, stabilizer, dispersant, etc. . To prepare an injectable preparation, the antibody of the present invention can be dissolved in an aqueous solution, preferably in a physiologically compatible buffer such as Hank's solution, Ringer's solution or physiological saline. In addition, the pharmaceutical product of the present invention may form, for example, a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous vehicle. Alternatively, the antibody of the present invention is obtained in the form of a powder, and an aqueous solution or suspension can be prepared using sterile water or the like. before use. For inhalation administration, the antibody of the present invention is ground into a powder and mixed with an appropriate base, such as lactose or starch, to form a powder mixture. A suppository can be prepared by mixing the antibody of the present invention with a conventional suppository base such as cocoa butter. Moreover, the therapeutic agent of the present invention can be prepared as a sustained release composition by encapsulation using a polymer matrix or the like.
[0036][0036]
Способ скрининга на терапевтическое средство для MPN по настоящему изобретению отличается тем, что осуществляют скрининг на антитело, белок, молекулу с низкой или средней молекулярной массой, нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты, которое распознает полипептид (а) или (b). В частности, проиллюстрирована разработка лекарственного средства на основе антитела, обладающего антитело-зависимой цитотоксической активностью или комплемент-зависимой цитотоксической активностью, с использованием антитела, которое распознает полипептид (а) или (b). Вышеописанное антитело по настоящему изобретению является примером лекарственного средства на основе антитела, полученного методом скрининга по настоящему изобретению. В дополнение к этому, приведен пример разработки противоопухолевого средства, которое доставляет, например, соединение с низкой или средней молекулярной массой, нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты, или белок, обладающие цитотоксическим эффектом, конкретно в опухолевые клетки, путем получения соединения с низкой или средней молекулярной массой, нуклеиновой кислоты или производного нуклеиновой кислоты, или белка, которые специфически связываются с полипептидом (а) или (b).The method for screening for a therapeutic agent for MPN of the present invention is characterized in that it screens for an antibody, protein, low or medium molecular weight molecule, nucleic acid or nucleic acid derivative that recognizes polypeptide (a) or (b). In particular, the development of an antibody drug having antibody-dependent cytotoxic activity or complement-dependent cytotoxic activity using an antibody that recognizes polypeptide (a) or (b) is illustrated. The above-described antibody of the present invention is an example of an antibody drug obtained by the screening method of the present invention. In addition, an example is provided of the development of an antitumor agent that delivers, for example, a low or medium molecular weight compound, a nucleic acid or nucleic acid derivative, or a protein having a cytotoxic effect specifically to tumor cells by producing a low or medium molecular weight compound. molecular weight, nucleic acid or nucleic acid derivative, or protein that specifically binds to polypeptide (a) or (b).
ПримерыExamples
[0037][0037]
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры, но оно не ограничивается этими примерами.The present invention will now be described in more detail with reference to examples, but it is not limited to these examples.
[0038][0038]
[Пример испытания 1][Test example 1]
(1) Материалы и метод испытания(1) Materials and test method
[1] Анти-CALR антитело[1] Anti-CALR antibody
Кроличье моноклональное антитело клон D3E6 (Cat# 12238), изготовитель Cell Signaling Technology, Inc.Rabbit monoclonal antibody clone D3E6 (Cat# 12238), manufactured by Cell Signaling Technology, Inc.
[0039][0039]
[2] Антитело против мутантного CALR[2] Antibody against mutant CALR
Мышиное моноклональное антитело клон CAL2 (Cat# DIA-CAL), изготовитель Dianova GmbHMouse monoclonal antibody clone CAL2 (Cat# DIA-CAL), manufacturer Dianova GmbH
[0040][0040]
[3] Антитело, которое распознает мутантный белок CALR на амино-концевой стороне сайта расщепления[3]An antibody that recognizes a mutant CALR protein at the amino-terminal side of the cleavage site
Синтезировали пептид, имеющий цистеин на карбокси-конце или амино-конце аминокислотной последовательности (RRMMRTKMR), включенной в SEQ ID NO:1, и конъюгировали с белком-носителем, гемоцианином лимфы улитки (KLH). Конъюгат использовали для иммунизации 8-недельных самок крыс WKY/Izm и после бустер-иммунизации собирали лимфоциты. Лимфоциты сливали с клетками мышиной миеломы SP2 методом PEG и получали гибридомы путем культивирования в селективной среде. Специфичность антитела в культуральном супернатанте определяли методом ELISA с использованием иммунизированного пептида или очищенного белка с получением гибридом (клоны B3, C6 и G1), продуцирующих антитела, которые связываются с мутантными CALR белками, включая расщепленный тип. Антитела (B3 антитело, C6 антитело и G1 антитело), продуцируемые этими гибридомами, очищали и использовали в испытаниях.A peptide having a cysteine at the carboxy-terminal or amino-terminal end of the amino acid sequence (RRMMRTKMR) included in SEQ ID NO:1 was synthesized and conjugated to a carrier protein, keyhole limpet hemocyanin (KLH). The conjugate was used to immunize 8-week-old female WKY/Izm rats and lymphocytes were collected after boost immunization. Lymphocytes were fused with SP2 murine myeloma cells using the PEG method and hybridomas were obtained by culturing in a selective medium. The specificity of the antibody in the culture supernatant was determined by ELISA using the immunized peptide or purified protein to produce hybridomas (clones B3, C6 and G1) producing antibodies that bind to mutant CALR proteins, including the cleaved type. Antibodies (B3 antibody, C6 antibody and G1 antibody) produced by these hybridomas were purified and used in the tests.
[0041][0041]
[4] Метод испытания[4] Test method
Человеческую клеточную линию мегакариобластного лейкоза UT-7/TPO трансфицировали вектором, экспрессирующим мутантный CALR белок типа Del 52 или Ins 5, вектором, экспрессирующим CALR дикого типа в качестве контроля, или пустым вектором. Полученные UT-7/TPO/CALR Del 52 и UT-7/TPO/CALR Ins 5 клетки, неопластически пролиферирующие, UT-7/TPO/CALR (WT) клетки и UT-7/TPO/vec клетки, соответственно, высевали при плотности 6,0×105 клеток/мл в Opti-MEM среду (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# 31985070) и культивировали в 5% CO2 при 37°C в течение 32 часов. В данном случае UT-7/TPO/CALR WT и UT-7/TPO/vec клетки культивировали в среде, содержащей 10 нг/мл тромбопоэтина (TPO). Культуральные супернатанты получали путем удаления клеток из культуральных растворов центрифугированием (15000g × 10 мин, 4°C), каждую из полученных фракций подвергали термообработке в присутствии восстановителя, затем подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану методом электропереноса и подвергали взаимодействию с TBS-T раствором (0,1% Tween-20, 150 мМ хлорида натрия, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5), содержащим 5% снятого молока, при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим взаимодействием при 4°C в течение ночи с 5% BSA/TBS-T раствором, содержащим антитело, которое распознает как дикий тип, так и мутантный тип (кроличье моноклональное антитело D3E6, Cell Signaling Technology, Inc., Cat# 12238), или коммерчески доступное антитело, которое распознает карбокси-концевую последовательность мутантного типа (мышиное моноклональное антитело CAL2, Dianova GmbH, Cat# DIA-CAL-250). После промывки TBS-T раствором осуществляли взаимодействие в растворе 5% снятого молока/TBS-T, содержащем пероксидаза-меченное анти-кроличье IgG антитело (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat# sc-2030) или пероксидаза-меченное анти-мышиное IgG антитело (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat# sc-2005), при комнатной температуре в течение 1 часа. PVDF мембрану промывали TBS-T раствором и затем подвергали взаимодействию с пероксидазным люминесцентным реагентом (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# 34094). Детекцию сигналов осуществляли с использованием преобразующего изображение устройства FUSION (изготовитель Vilber-Lourmat S.A.).The human megakaryoblastic leukemia cell line UT-7/TPO was transfected with a vector expressing mutant CALR protein type Del 52 or Ins 5, a vector expressing wild-type CALR as a control, or an empty vector. The resulting UT-7/TPO/CALR Del 52 and UT-7/TPO/CALR Ins 5 neoplastically proliferating cells, UT-7/TPO/CALR (WT) cells and UT-7/TPO/vec cells, respectively, were seeded at density of 6.0 x 10 5 cells/ml in Opti-MEM medium (Thermo Fisher Scientific KK, Cat# 31985070) and cultured in 5% CO 2 at 37°C for 32 hours. Here, UT-7/TPO/CALR WT and UT-7/TPO/vec cells were cultured in medium containing 10 ng/ml thrombopoietin (TPO). Culture supernatants were obtained by removing cells from culture solutions by centrifugation (15000g × 10 min, 4°C), each of the resulting fractions was subjected to heat treatment in the presence of a reducing agent, then subjected to electrophoresis in polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate, transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane by electrotransfer and reacted with TBS-T solution (0.1% Tween-20, 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5) containing 5% skim milk at room temperature for 1 hour followed by reaction at 4°C overnight with a 5% BSA/TBS-T solution containing an antibody that recognizes both wild type and mutant (rabbit monoclonal antibody D3E6, Cell Signaling Technology, Inc., Cat# 12238), or commercial an available antibody that recognizes the carboxy-terminal sequence of the mutant type (mouse monoclonal antibody CAL2, Dianova GmbH, Cat# DIA-CAL-250). After washing with TBS-T solution, reaction was carried out in a solution of 5% skim milk/TBS-T containing peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat# sc-2030) or peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat# sc-2005), at room temperature for 1 hour. The PVDF membrane was washed with TBS-T solution and then reacted with peroxidase fluorescent reagent (Thermo Fisher Scientific KK, Cat# 34094). Signal detection was carried out using an image converting device FUSION (manufactured by Vilber-Lourmat SA).
[0042][0042]
Мутантный CALR белок Del 52 типа, имеющий гистидиновую метку, вставленную ниже от сигнальной последовательности на амино-конце, экспрессировали в HEK293T клетках и культуральный супернатант, содержащий секретированный мутантный белок CALR, получали центрифугированием (15000g × 10 мин, 4°C). Полученный супернатант наносили на HisTrap колонку (GE Healthcare, Cat# 17531901), колонку промывали буфером для очистки (0,3 M хлорида натрия, 25 мМ Tris-HCl, pH 7,4), содержащим 20 мМ имидазола, и мутантный белок CALR очищали буфером для очистки, содержащим 50 мМ имидазола. Очищенный белок подвергали взаимодействию с 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислотой (NTCB) для цианирования цистеинового остатка и затем осуществляли фрагментацию в щелочных условиях. Массу фрагментов белка определяли с использованием времяпролетного масс-спектрометра с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией и сайт расщепления определяли из информации о пептидной последовательности мутантного CALR белка Del 52 типа.Del 52 type mutant CALR protein having a histidine tag inserted downstream of the signal sequence at the amino terminus was expressed in HEK293T cells and the culture supernatant containing the secreted mutant CALR protein was obtained by centrifugation (15,000 g x 10 min, 4°C). The resulting supernatant was applied to a HisTrap column (GE Healthcare, Cat# 17531901), the column was washed with purification buffer (0.3 M sodium chloride, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4) containing 20 mM imidazole, and the mutant CALR protein was purified purification buffer containing 50 mM imidazole. The purified protein was reacted with 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid (NTCB) to cyanate the cysteine residue and then fragmented under alkaline conditions. The mass of protein fragments was determined using a matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer, and the cleavage site was determined from the peptide sequence information of the Del 52 mutant CALR protein.
[0043][0043]
Мутантный CALR белок Del 52 типа или Ins 5 типа, меченный FLAG-меткой ниже от сигнальной последовательности на амино-конце или меченный FLAG-меткой на карбокси-конце, экспрессировали в UT-7/TPO клетках и клетки культивировали с использованием модифицированной Дульбекко среды Искова (IMDM), содержащей 10% фетальной бычьей инактивированной сыворотки, в 5% CO2 при 37°C. Клетки (1×105) в пролиферативной стадии промывали PBS (фосфатный буфер, содержащий 137 мМ хлорида натрия и 27 мМ хлорида калия) и затем подвергали взаимодействию с мышиным антителом к последовательности DYKDDDDK tag (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Cat# 014-22383) или крысиным антителом против мутантного CALR, которое распознает амино-концевую сторону сайта расщепления, в 2% FBS/PBS растворе на льду в течение 30 минут. После взаимодействия клетки промывали 2% FBS/PBS раствором и затем подвергали взаимодействию с анти-мышиным IgG-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# A21235) и анти-крысиным IgG-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# A21247), соответственно, в качестве вторичных антител в 2% FBS/PBS растворе на льду в течение 30 минут. После завершения реакции клетки собирали центрифугированием и подвергали взаимодействию с PBS раствором, содержащим 2% параформальдегида, на льду в течение 15 минут. В завершение, клетки промывали путем добавления раствора 2% FBS/PBS, затем осуществляли центрифугирование (400g × 5 мин, 4°C) и супернатант сливали. Затем к клеткам добавляли 300 мл 2% FBS/PBS раствора и сигналы количественно определяли методом проточной цитометрии с использованием FACS Calibur (изготовитель BD biosciences).Del 52 type or Ins type 5 mutant CALR protein tagged with a FLAG tag downstream of the signal sequence at the amino terminus or tagged with a FLAG tag at the carboxy terminus was expressed in UT-7/TPO cells and the cells were cultured using Dulbecco's modified Iscove's medium (IMDM) containing 10% inactivated fetal bovine serum in 5% CO 2 at 37°C. Cells (1x10 5 ) in the proliferative stage were washed with PBS (phosphate buffer containing 137 mm sodium chloride and 27 mm potassium chloride) and then reacted with a mouse antibody to the DYKDDDDK tag sequence (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Cat# 014-22383 ) or a rat anti-mutant CALR antibody that recognizes the amino-terminal side of the cleavage site, in a 2% FBS/PBS solution on ice for 30 minutes. After interaction, cells were washed with 2% FBS/PBS solution and then reacted with anti-mouse IgG-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific KK, Cat# A21235) and anti-rat IgG-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific KK, Cat# A21247), respectively, as secondary antibodies in a 2% FBS/PBS solution on ice for 30 minutes. After completion of the reaction, cells were collected by centrifugation and exposed to PBS containing 2% paraformaldehyde on ice for 15 minutes. Finally, the cells were washed by adding 2% FBS/PBS solution, then centrifugation was performed (400 g × 5 min, 4°C) and the supernatant was discarded. 300 ml of 2% FBS/PBS solution was then added to the cells and signals were quantified by flow cytometry using FACS Calibur (manufactured by BD biosciences).
[0044][0044]
Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови получали путем центрифугирования (500g × 10 мин, 4°C) периферической крови, собранной в пробирке Шпица, содержащей антикоагулянт, суспендирования полученной клеточной фракции в растворе PBS и последующего наложения суспензии на раствор для разделения лимфоцитов Lymphosep (MP biomedicals, каталожный номер 11444815), осуществляя центрифугирование (1500 об/мин 30 мин, комнатная температура), с получением лейкоцитарной пленки, добавляя раствор PBS к полученной лейкоцитарной пленке для ресуспендирования, затем осуществляя центрифугирование (1500 об/мин 10 мин, комнатная температура) и удаление супернатанта. Полученные мононуклеарные клетки периферической крови суспендировали в растворе RIPA (150 мМ хлорида натрия, 1 мМ EDTA, 1% NP-40, 1% дезоксихолата натрия, 2 мМ ортованадата натрия (V), 10 мМ β-глицерофосфорной кислоты, 1 мкг/мл апротинина, 2 мкг/мл E-64, 1 мкг/мл лейпептина, 0,67 мкг/мл бестатина, 0,67 мкг/мл пепстатина, 43,5 мкг/мл PMSF, 20 мМ трис-HCl, pH 7,4), а затем обрабатывали ультразвуком с последующим центрифугированием (15000 g × 15 мин, 4°C). Супернатант собирали в виде клеточного экстракта. Полученный клеточный экстракт подвергали термообработке в присутствии восстановителя, затем подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану методом электропереноса и подвергали взаимодействию с раствором TBS-T, содержащим 5% снятого молока, при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим взаимодействием с 5% раствором BSA/TBS-T, содержащим крысиное антитело против мутантного CALR, которое распознает амино-концевую сторону сайта расщепления, при 4°C в течение ночи. После промывки раствором TBS-T осуществляли взаимодействие с раствором 5% снятого молока/TBS-T, содержащим пероксидаза-меченное анти-крысиное IgG антитело (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat# sc-2006), при комнатной температуре в течение 1 часа. PVDF мембрану промывали раствором TBS-T и затем подвергали взаимодействию с пероксидазным люминесцентным реагентом. Детекцию сигналов осуществляли с использованием преобразующего изображение устройства FUSION.Human peripheral blood mononuclear cells were obtained by centrifuging (500 g × 10 min, 4°C) peripheral blood collected in a Spitz tube containing anticoagulant, suspending the resulting cell fraction in PBS, and then applying the suspension to Lymphosep lymphocyte separation solution (MP biomedicals, catalog number 11444815), performing centrifugation (1500 rpm 30 min, room temperature), to obtain buffy coat, adding PBS solution to the resulting buffy coat to resuspend, then performing centrifugation (1500 rpm 10 min, room temperature) and removing supernatant. The obtained peripheral blood mononuclear cells were suspended in RIPA solution (150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2 mM sodium orthovanadate (V), 10 mM β-glycerophosphoric acid, 1 μg/ml aprotinin , 2 µg/ml E-64, 1 µg/ml leupeptin, 0.67 µg/ml bestatin, 0.67 µg/ml pepstatin, 43.5 µg/ml PMSF, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) , and then treated with ultrasound followed by centrifugation (15000 g × 15 min, 4°C). The supernatant was collected as a cell extract. The resulting cell extract was heat-treated in the presence of a reducing agent, then subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane by electrotransfer, and reacted with a TBS-T solution containing 5% skim milk at room temperature for 1 hour. followed by reaction with a 5% BSA/TBS-T solution containing a rat anti-mutant CALR antibody that recognizes the amino-terminal side of the cleavage site at 4°C overnight. After rinsing with TBS-T solution, react with 5% skim milk/TBS-T solution containing peroxidase-labeled anti-rat IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat# sc-2006) at room temperature for 1 hour . The PVDF membrane was washed with TBS-T solution and then reacted with a peroxidase luminescent reagent. Signal detection was carried out using an image converting device FUSION.
[0045][0045]
Тромбоциты получали центрифугированием периферической крови, собранной в пробирке Шпица, содержащей EDTA (500 г 10 мин, 4°C), подвергая полученный супернатант центрифугированию (500g × 10 мин, 4°C)) и промывая полученный осадок при помощи 500 мкл очищающего раствора для тромбоцитов (10 мМ цитрата натрия, 150 мМ хлорида натрия, 1 мМ EDTA, 1% декстрозы, pH 7,4) два раза. Полученные тромбоциты суспендировали в растворе RIPA и затем их обрабатывали ультразвуком с последующим центрифугированием (15000 g × 15 мин, 4°C). Супернатант собирали в виде клеточного экстракта. Полученный клеточный экстракт подвергали термообработке в присутствии восстановителя, затем подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану методом электропереноса и подвергали взаимодействию с раствором TBS-T, содержащим 5% снятого молока, при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим взаимодействием с раствором 5% BSA/TBS-T, содержащим крысиное антитело против мутантного CALR (антитело B3), которое распознает амино-концевую сторону сайта расщепления, при 4°C в течение ночи. После промывки раствором TBS-T осуществляли взаимодействие с раствором 5% снятого молока/TBS-T, содержащим пероксидаза-меченное анти-крысиное IgG антитело (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat# sc-2006), при комнатной температуре в течение 1 часа. PVDF мембрану промывали раствором TBS-T и затем подвергали взаимодействию с пероксидазным люминесцентным реагентом. Детекцию сигналов осуществляли с использованием преобразующего изображение устройства FUSION.Platelets were obtained by centrifuging peripheral blood collected in a Spitz tube containing EDTA (500 g × 10 min, 4°C), subjecting the resulting supernatant to centrifugation (500 g × 10 min, 4°C)) and washing the resulting pellet with 500 μl of purification solution for platelets (10 mM sodium citrate, 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 1% dextrose, pH 7.4) twice. The resulting platelets were suspended in a RIPA solution and then treated with ultrasound followed by centrifugation (15,000 g × 15 min, 4°C). The supernatant was collected as a cell extract. The resulting cell extract was heat-treated in the presence of a reducing agent, then subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane by electrotransfer, and reacted with a TBS-T solution containing 5% skim milk at room temperature for 1 hour. followed by reaction with a 5% BSA/TBS-T solution containing a rat anti-mutant CALR antibody (antibody B3), which recognizes the amino-terminal side of the cleavage site, at 4°C overnight. After washing with TBS-T solution, react with 5% skim milk/TBS-T solution containing peroxidase-labeled anti-rat IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat# sc-2006) at room temperature for 1 hour. The PVDF membrane was washed with TBS-T solution and then reacted with a peroxidase luminescent reagent. Signal detection was carried out using an image converting device FUSION.
[0046][0046]
(2) Результат(2) Result
CALR белки, содержащиеся в культуральных супернатантах UT-7/TPO/CALR Del 52 и UT-7/TPO/CALR Ins 5 клеток, неопластически пролиферирующих, UT-7/TPO/CALR (WT) клеток в качестве контроля и UT-7/TPO/vec клеток, которые были получены путем трансфекции человеческой клеточной линии мегакариобластного лейкоза UT-7/TPO вектором, экспрессирующим мутантный CALR белок Del 52 типа или Ins 5 типа, вектором, экспрессирующим CALR дикого типа, и пустым вектором, соответственно, оценивали с использованием антитела, которое распознает как дикий тип, так и мутантный тип (моноклональное антитело D3E6, Cell Signaling Technology, Inc., Cat# 12238), и коммерчески доступного антитела, которое распознает карбокси-концевую последовательность мутантного типа (моноклональное антитело CAL2, Dianova GmbH, Cat# DIA-CAL-250) (Фиг. 2). В результате, иммуноблоттинг с использованием антитела (антитела B3), которое распознает белки CALR дикого типа и мутантного типа, выявил полосы, которые не могут распознаваться антителом к мутантному типу, в дополнение к эндогенному CALR, в клетках, экспрессирующих мутантный белок CALR (Фиг. 3).CALR proteins contained in culture supernatants of UT-7/TPO/CALR Del 52 and UT-7/TPO/CALR Ins 5 neoplastically proliferating cells, UT-7/TPO/CALR (WT) cells as control and UT-7/ TPO/vec cells that were generated by transfecting the human megakaryoblastic leukemia cell line UT-7/TPO with a vector expressing Del 52 or Ins type 5 mutant CALR protein, a vector expressing wild-type CALR, and an empty vector, respectively, were assessed using an antibody that recognizes both wild type and mutant type (monoclonal antibody D3E6, Cell Signaling Technology, Inc., Cat# 12238), and a commercially available antibody that recognizes the carboxy-terminal sequence of the mutant type (monoclonal antibody CAL2, Dianova GmbH, Cat# DIA-CAL-250) (Fig. 2). As a result, immunoblotting using an antibody (antibody B3) that recognizes wild-type and mutant CALR proteins revealed bands that could not be recognized by the mutant antibody, in addition to endogenous CALR, in cells expressing the mutant CALR protein (Fig. 3).
[0047][0047]
Из пептидных фрагментов, полученных фрагментацией с использованием NTCB на амино-концевой стороне от цистеинового остатка, пептидные фрагменты, обнаруженные только в расщепленном типе мутантного белка CALR (использовали Del 52 тип), имели молекулярную массу 25827,7 и 25418,4. В качестве сайтов расщепления мутантного CALR белка Del 52 типа, были идентифицированы сайт между 380-м метиониновым остатком и 381-м аргининовым остатком и сайт между 377-м метиониновым остатком и 378-м аргининовым остатком путем сравнения указанных выше численных значений и вычисленных молекулярных масс, определенных от положения расщепленного цистеинового остатка.Of the peptide fragments obtained by fragmentation using NTCB at the amino-terminal side of the cysteine residue, the peptide fragments found only in the cleaved type of CALR mutant protein (Del 52 type was used) had molecular weights of 25827.7 and 25418.4. As the cleavage sites of the Del 52 mutant CALR protein, the site between methionine residue 380 and arginine residue 381 and the site between methionine residue 377 and arginine residue 378 were identified by comparing the above numerical values and the calculated molecular masses. , determined from the position of the cleaved cysteine residue.
[0048][0048]
Мутантный CALR белок Del 52 типа или Ins 5 типа, меченный FLAG-меткой ниже от сигнальной последовательности на амино-конце или меченный FLAG-меткой на карбокси-конце, экспрессировали в UT-7/TPO клетках и экспрессию мутантного белка CALR на поверхности клеток анализировали методом проточной цитометрии с использованием анти-FLAG антитела. В клетках, экспрессирующих мутантный белок CALR, имеющий FLAG-метку на амино-конце, наблюдали более сильный сигнал по сравнению с сигналом в клетках, экспрессирующих мутантный белок CALR, имеющий на карбокси-конце FLAG-метку (Фиг. 4 и 5). Затем осуществляли анализ клеточных линий методом проточной цитометрии, как показано на Фиг. 4 и 5, с использованием антитела, полученного в результате иммунизации пептидом, включающим последовательность, специфическую для амино-концевой стороны сайта расщепления мутантного белка CALR, что приводило к исчезновению разницы в количественном уровне детекции из-за положений вставки FLAG-метки (Фиг. 6 и 7). На основании этого результата было показано, что установление сайта распознавания антигена на карбокси-концевой стороне последовательности, специфической для мутантного белка CALR, остающегося после расщепления, является важным для создания более чувствительного испытательного реагента или более сильного терапевтического средства.Del 52 type or Ins type 5 mutant CALR protein tagged with a FLAG tag downstream of the signal sequence at the amino terminus or tagged with a FLAG tag at the carboxy terminus was expressed in UT-7/TPO cells and cell surface expression of the mutant CALR protein was analyzed by flow cytometry using anti-FLAG antibody. In cells expressing a mutant CALR protein having a FLAG tag at the amino terminus, a stronger signal was observed compared to the signal in cells expressing a mutant CALR protein having a carboxy terminus FLAG tag (Fig. 4 and 5). The cell lines were then analyzed by flow cytometry as shown in FIG. 4 and 5, using an antibody generated by immunization with a peptide including a sequence specific to the amino-terminal side of the cleavage site of the mutant CALR protein, which resulted in the disappearance of the difference in the quantitative level of detection due to the positions of the FLAG tag insertion (Fig. 6 and 7). Based on this result, it was shown that the establishment of an antigen recognition site on the carboxy-terminal side of the sequence specific for the mutant CALR protein remaining after cleavage is important for the development of a more sensitive test reagent or a more potent therapeutic agent.
[0049][0049]
Действительно, когда клеточные экстракты мононуклеарных клеток периферической крови и тромбоцитов, полученные от положительных на мутацию гена CALR пациентов, анализировали методом иммуноблоттинга с использованием антитела, специфического для аминоконцевой стороны сайта расщепления мутантного CALR, наблюдали экспрессию расщепленного мутантного белка CALR, как в клеточных линиях (Фиг. 8). Эти результаты показали, что такое же расщепление на самом деле происходит и в клетках пациента, и что установка сайта распознавания антигена на карбокси-концевой стороне, остающейся после расщепления, важна для создания более чувствительного испытательного реагента или более сильного терапевтического средства.Indeed, when cell extracts of peripheral blood mononuclear cells and platelets obtained from CALR mutation-positive patients were analyzed by immunoblotting using an antibody specific for the amino-terminal side of the mutant CALR cleavage site, expression of the cleaved mutant CALR protein was observed as in the cell lines (Fig. . 8). These results showed that the same cleavage actually occurs in patient cells, and that installing an antigen recognition site on the carboxy-terminal side remaining after cleavage is important for creating a more sensitive test reagent or a more potent therapeutic agent.
[0050][0050]
[Пример испытания 2][Test example 2]
(1) Подтверждение, что три антитела распознают полноразмерные и расщепленные мутантные CALR белки(1) Confirmation that three antibodies recognize full-length and cleaved mutant CALR proteins
UT-7/TPO клетки, экспрессирующие мутантный CALR белок Del 52 типа или Ins 5 типа, имеющие FLAG-метку, вставленную ниже от сигнальной последовательности на амино-конце, культивировали и культуральные супернатанты, содержащие секретированные мутантные CALR белки, получали центрифугированием (1600g × 5 мин, 4°C). Полученные культуральные супернатанты каждый подвергали термообработке в присутствии SDS и восстановителя, затем подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану методом электропереноса и подвергали взаимодействию с раствором TBS-T, содержащим 5% снятого молока, при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим взаимодействием с 5% раствором BSA/TBS-T, содержащим крысиное антитело, клон B3, C6 или G1, или мышиное антитело к последовательности DYKDDDDK tag (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Cat# 014-22383), при 4°C в течение ночи. После промывки раствором TBS-T реакционные продукты подвергали взаимодействию с раствором 5% снятого молока/TBS-T, содержащим пероксидаза-меченное козлиное анти-крысиное IgG антитело (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 112-035-003) или пероксидаза-меченное козлиное анти-мышиное IgG антитело (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 115-035-003), при комнатной температуре в течение 1 часа. PVDF мембраны промывали раствором TBS-T и затем подвергали взаимодействию с пероксидазным люминесцентным реагентом. Детекцию сигналов осуществляли с использованием преобразующего изображение устройства FUSION.UT-7/TPO cells expressing type 52 mutant CALR protein or type 5 Ins mutant CALR protein having a FLAG tag inserted downstream of the signal sequence at the amino terminus were cultured and culture supernatants containing secreted mutant CALR proteins were obtained by centrifugation (1600g × 5 min, 4°C). The resulting culture supernatants were each heat-treated in the presence of SDS and a reducing agent, then subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane by electrotransfer, and reacted with a TBS-T solution containing 5% skim milk at room temperature in for 1 hour followed by interaction with a 5% BSA/TBS-T solution containing a rat antibody, clone B3, C6 or G1, or a mouse antibody to the DYKDDDDK tag sequence (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Cat# 014-22383), at 4 °C overnight. After washing with TBS-T solution, the reaction products were reacted with a 5% skim milk/TBS-T solution containing peroxidase-labeled goat anti-rat IgG antibody (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 112-035-003) or peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 115-035-003), at room temperature for 1 hour. PVDF membranes were washed with TBS-T solution and then reacted with a peroxidase luminescent reagent. Signal detection was carried out using an image converting device FUSION.
В результате, как показано на Фиг. 9, было подтверждено, что антитела всех клонов B3, C6 и G1 распознают полноразмерные и расщепленные мутантные CALR белки.As a result, as shown in FIG. 9, it was confirmed that antibodies from all clones B3, C6 and G1 recognized full-length and cleaved mutant CALR proteins.
[0051][0051]
(2) Подтверждение, что три антитела распознают мутантные CALR белки на клеточных поверхностях(2) Confirmation that three antibodies recognize mutant CALR proteins on cell surfaces
Мутантный CALR белок Del 52 типа или Ins 5 типа, меченный FLAG-меткой ниже от сигнальной последовательности на амино-конце, экспрессировали в UT-7/TPO клетках и клетки культивировали с использованием IMDM среды, содержащей 10% фетальной бычьей инактивированной сыворотки, в 5% CO2 при 37°C. Клетки (1×105) в пролиферативной стадии промывали PBS и затем подвергали взаимодействию с мышиным антителом к последовательности DYKDDDDK tag (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Cat# 014-22383) или крысиным антителом клона B3, C6 или G1 в растворе 2% FBS/PBS на льду в течение 30 минут. После взаимодействия клетки промывали раствором 2% FBS/PBS и затем подвергали взаимодействию с анти-мышиным IgG-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# A21235) и анти-крысиным IgG-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# A21247), соответственно, в качестве вторичных антител в растворе 2% FBS/PBS на льду в течение 30 минут. После завершения реакции клетки собирали центрифугированием и подвергали взаимодействию с раствором PBS, содержащим 4% параформальдегида, на льду в течение 15 минут. В завершение, клетки промывали путем добавления раствора 2% FBS/PBS, затем осуществляли центрифугирование (400g × 5 мин, 4°C) и супернатант сливали. Затем к клеткам добавляли 300 мл раствора 2% FBS/PBS и сигналы количественно определяли методом проточной цитометрии с использованием FACS Calibur (изготовитель BD biosciences).Mutant CALR protein Del 52 type or Ins type 5, tagged with a FLAG tag downstream of the signal sequence at the amino terminus, was expressed in UT-7/TPO cells and the cells were cultured using IMDM medium containing 10% fetal bovine serum in 5 % CO 2 at 37°C. Cells (1x10 5 ) in the proliferative stage were washed with PBS and then reacted with a mouse antibody to the DYKDDDDK tag sequence (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Cat# 014-22383) or a rat antibody clone B3, C6 or G1 in a solution of 2% FBS /PBS on ice for 30 minutes. After interaction, cells were washed with 2% FBS/PBS and then reacted with anti-mouse IgG-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific KK, Cat# A21235) and anti-rat IgG-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific KK, Cat# A21247), respectively, as secondary antibodies in a solution of 2% FBS/PBS on ice for 30 minutes. After completion of the reaction, cells were collected by centrifugation and exposed to PBS containing 4% paraformaldehyde on ice for 15 minutes. Finally, the cells were washed by adding 2% FBS/PBS solution, then centrifugation was performed (400 g × 5 min, 4°C) and the supernatant was discarded. 300 ml of 2% FBS/PBS solution was then added to the cells and signals were quantified by flow cytometry using FACS Calibur (manufactured by BD biosciences).
В результате, как показано на Фиг. 10, было подтверждено, что антитела всех клонов B3, C6 и G1 распознают мутантный белок CALR на клеточных поверхностях.As a result, as shown in FIG. 10, antibodies from all clones B3, C6, and G1 were confirmed to recognize the mutant CALR protein on cell surfaces.
[0052][0052]
[Пример испытания 3][Test Example 3]
(Оценка авидности антитела к антигену)(Assessment of antibody avidity to antigen)
(1) Оценка авидности к антигену методом ELISA(1) Antigen avidity assessment by ELISA
В ELISA планшет (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Cat# MS-8896F) добавляли 100 нг на лунку очищенного мутантного CALR белка Del 52 типа или BSA в качестве контроля и подвергали взаимодействию с PBS, содержащим 5 мг/мл BSA, при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали PBS и затем подвергали взаимодействию с PBS, содержащим 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 или 800 нг/мл антитела клона B3, C6 или G1, или крысиного IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat# 2026) и 5 мг/мл BSA, при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали PBS и затем подвергали взаимодействию с PBS, содержащим 16 нг/мл пероксидаза-меченного козлиного анти-крысиного IgG антитела (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 112-035-003) и 5 мг/мл BSA, при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки лунок раствором TBS-T в лунки добавляли раствор TMB (Nacalai Tesque, Cat# 05298-80) и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре в течение 15 минут и затем в лунки добавляли 1 M водный раствор серной кислоты. Измеряли поглощение при 450 нм и 620 нм и определяли разность между поглощениями. Разницу в BSA в качестве контроля вычитали из каждой разности.In an ELISA plate (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Cat# MS-8896F), 100 ng per well of purified Del 52 mutant CALR protein or BSA was added as a control and reacted with PBS containing 5 mg/ml BSA at room temperature. temperature for 1 hour. Wells were washed with PBS and then reacted with PBS containing 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, or 800 ng/ml clone B3, C6, or G1 antibody or rat IgG (Santa Cruz Biotechnology , Inc. Cat# 2026) and 5 mg/ml BSA, at room temperature for 1 hour. Wells were washed with PBS and then reacted with PBS containing 16 ng/ml peroxidase-labeled goat anti-rat IgG antibody (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 112-035-003) and 5 mg/ml BSA, at room temperature in within 1 hour. After washing the wells with TBS-T solution, TMB solution (Nacalai Tesque, Cat# 05298-80) was added to the wells and left to react at room temperature for 15 minutes and then 1 M aqueous sulfuric acid solution was added to the wells. The absorbance was measured at 450 nm and 620 nm and the difference between the absorbances was determined. The difference in BSA as a control was subtracted from each difference.
В результате, как показано на Фиг. 11, продемонстрировано, что антитела (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению все связываются с мутантным белком CALR даже при низких концентрациях.As a result, as shown in FIG. 11, it is demonstrated that the antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention all bind to the mutant CALR protein even at low concentrations.
[0053][0053]
(2) Оценка авидности к антигену методом поверхностного плазмонного резонанса(2) Assessment of antigen avidity by surface plasmon resonance
Сенсорные чипы (GE Healthcare, Cat# BR100530) для анализа методом поверхностного плазмонного резонанса загружали в анализатор поверхностного плазмонного резонанса Biacore T200 (GE Healthcare) и уравновешивали буфером HBS-EP (GE Healthcare, Cat# BR100669). Антитело клона B3, доведенное до концентрации 10 мкг/мл Ацетатом 5.5 (GE Healthcare, Cat# BR100352), было иммобилизовано с использованием набора для связывания аминов (GE Healthcare, Cat# BR100050) в иммобилизованном количестве 200 RU. Затем измеряли поверхностный плазмонный резонанс с использованием пептида, содержащего цистеин на амино-конце аминокислотной последовательности (RRMMRTKMR), включенной в SEQ ID NO:1, доведенного до концентраций 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 нМ при помощи HBS-EP буфера, и константу диссоциации получали с использованием программы Biacore T200 Evaluation Software.Sensor chips (GE Healthcare, Cat# BR100530) for surface plasmon resonance analysis were loaded into a Biacore T200 surface plasmon resonance analyzer (GE Healthcare) and equilibrated with HBS-EP buffer (GE Healthcare, Cat# BR100669). Clone B3 antibody, adjusted to a concentration of 10 μg/ml with Acetate 5.5 (GE Healthcare, Cat# BR100352), was immobilized using an amine coupling kit (GE Healthcare, Cat# BR100050) in an immobilized amount of 200 RU. Surface plasmon resonance was then measured using a peptide containing a cysteine at the amino terminus (RRMMRTKMR) included in SEQ ID NO:1, adjusted to concentrations of 20, 10, 5, 2.5 and 1.25 nM with HBS- Buffer EP and dissociation constant were obtained using Biacore T200 Evaluation Software.
В результате, как показано на Фиг. 12, было продемонстрировано, что антитело по настоящему изобретению сильно связывается с мутантным белком CALR.As a result, as shown in FIG. 12, it was demonstrated that the antibody of the present invention binds strongly to the mutant CALR protein.
[0054][0054]
[Пример испытания 4][Test example 4]
(Идентификация распознающего антиген сайта антитела)(Identification of the antigen recognition site of an antibody)
Было подтверждено, что антитела клона B3, C6 и G1 распознают аминокислотную последовательность, используемую в качестве антигена, на мутантном белке CALR. Реактивность соответствующих антител против мутантных белков CALR, каждый из которых содержит аланин (A), заменяющий одну аминокислоту в каждом положении аминокислот, используемых в качестве антигена, и аминокислот вокруг него, оценивали методом иммуноблотинга (Фиг. 13A) и ELISA (Фиг. 13B).Antibodies of clone B3, C6 and G1 were confirmed to recognize the amino acid sequence used as antigen on the mutant CALR protein. The reactivity of the corresponding antibodies against mutant CALR proteins, each containing an alanine (A) replacing one amino acid at each position of the amino acids used as the antigen and the amino acids around it, was assessed by immunoblotting (Fig. 13A) and ELISA (Fig. 13B) .
[0055][0055]
(1) Иммуноблотинг(1) Immunoblotting
Мутантные CALR белки Del 52 типа, каждый из которых содержит аланин (A), заменяющий одну аминокислоту в каждом положении аминокислот в области от 367-го треонина (T) до 378-го аргинина (R), или белок, не имеющий замен, экспрессировали в клетках HEK 293T и культуральные супернатанты, содержащие секретированные мутантные CALR белки, получали центрифугированием (1600g × 5 мин, 4°C). Полученные растворы белков каждый подвергали термообработке в присутствии SDS и восстановителя, подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану методом электропереноса и подвергали взаимодействию с раствором TBS-T, содержащим 5% снятого молока, при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим взаимодействием с раствором 5% BSA/TBS-T, содержащим пероксидаза-меченное антитело клона B3, C6 или G1 или мышиное анти-CALR антитело (Abcam plc., Cat# ab22683), при 4°C в течение ночи. PVDF мембрану, которая взаимодействовала с мышиным анти-CALR антителом, промывали раствором TBS-T и затем подвергали взаимодействию с раствором 5% снятого молока/TBS-T, содержащим пероксидаза-меченное анти-мышиное IgG антитело (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 115-035-003), при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем все PVDF мембраны промывали раствором TBS-T и затем подвергали взаимодействию с пероксидазным люминесцентным реагентом (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# 34094). Детекцию сигналов осуществляли с использованием преобразующего изображение устройства FUSION (изготовитель Vilber-Lourmat S.A.).Del 52 mutant CALR proteins, each containing an alanine (A) substituting one amino acid at each amino acid position in the region from threonine 367 (T) to arginine 378 (R), or a protein having no substitutions, were expressed in HEK 293T cells and culture supernatants containing secreted mutant CALR proteins were obtained by centrifugation (1600 g × 5 min, 4°C). The resulting protein solutions were each heat-treated in the presence of SDS and a reducing agent, subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane by electrotransfer, and reacted with a TBS-T solution containing 5% skim milk at room temperature for 1 hour followed by reaction with a 5% BSA/TBS-T solution containing peroxidase-labeled clone B3, C6 or G1 antibody or mouse anti-CALR antibody (Abcam plc., Cat# ab22683) at 4°C overnight. The PVDF membrane that was reacted with the mouse anti-CALR antibody was washed with TBS-T solution and then reacted with a 5% skim milk/TBS-T solution containing peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 115-035-003), at room temperature for 1 hour. All PVDF membranes were then washed with TBS-T solution and then reacted with peroxidase fluorescent reagent (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# 34094). Signal detection was carried out using an image converting device FUSION (manufactured by Vilber-Lourmat S.A.).
В результате, как показано на Фиг. 13A, было продемонстрировано, что антитела по настоящему изобретению распознают сайт между 1-м аргинином и 9-м аргинином SEQ ID NO:1.As a result, as shown in FIG. 13A, it has been demonstrated that the antibodies of the present invention recognize the site between the 1st arginine and the 9th arginine of SEQ ID NO:1.
[0056][0056]
(2) ELISA(2) ELISA
ELISA планшет, с которым связывали мутантные CALR белки, полученные описанным выше способом, подвергали взаимодействию с PBS, содержащим 5 мг/мл BSA, при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали PBS и затем подвергали взаимодействию с PBS, содержащим 200 нг/мл антитела клона B3, C6 или G1 или мышиного анти-CALR антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat# sc-373863) и 5 мг/мл BSA, при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали PBS и затем подвергали взаимодействию с PBS, содержащим 16 нг/мл пероксидаза-меченного козлиного анти-крысиного IgG антитела (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 112-035-003) или козлиного анти-мышиного IgG антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat# sc-2005) и 5 мг/мл BSA, при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки лунок раствором TBS-T в лунки добавляли раствор TMB и оставляли для взаимодействия при комнатной температуре в течение 15 минут и затем в лунки добавляли 1 M водный раствор серной кислоты. Измеряли поглощение при 450 нм и 620 нм и определяли разницу между поглощением.The ELISA plate to which the mutant CALR proteins obtained as described above were bound was reacted with PBS containing 5 mg/ml BSA at room temperature for 1 hour. Wells were washed with PBS and then reacted with PBS containing 200 ng/ml clone B3, C6, or G1 antibody or mouse anti-CALR antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat# sc-373863) and 5 mg/ml BSA, at room temperature for 1 hour. Wells were washed with PBS and then reacted with PBS containing 16 ng/ml peroxidase-labeled goat anti-rat IgG antibody (Jackson Immuno Research Inc., Cat# 112-035-003) or goat anti-mouse IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology , Inc., Cat# sc-2005) and 5 mg/ml BSA, at room temperature for 1 hour. After washing the wells with TBS-T solution, TMB solution was added to the wells and left to react at room temperature for 15 minutes and then 1 M aqueous sulfuric acid solution was added to the wells. The absorbance was measured at 450 nm and 620 nm and the difference between the absorbance was determined.
В результате, как показано на Фиг. 13B, было продемонстрировано, что антитела по настоящему изобретению распознают сайт между 1-м аргинином и 9-м аргинином SEQ ID NO:1.As a result, as shown in FIG. 13B, the antibodies of the present invention have been demonstrated to recognize the site between the 1st arginine and the 9th arginine of SEQ ID NO:1.
[0057][0057]
[Пример испытания 5][Test Example 5]
(Определение информации о последовательности антитела по настоящему изобретению)(Determination of sequence information of the antibody of the present invention)
В качестве информации о последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению, полноразмерные последовательности кДНК тяжелой цепи и легкой цепи определяли путем получения мРНК из клеток, продуцирующих антитела, с использованием набора PureLinc RNA Mini kit (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# 12183025), синтеза кДНК с использованием полученных мРНК в качесте матриц и праймеров для обратной транскрипции, специфических для тяжелой цепи и легкой цепи, путем быстрой амплификации концов кДНК, затем клонирования этих кДНК в плазмиды и анализа плазмид с использованием секвенирования по Сэнгеру.As information about the sequence of the heavy chain and light chain of the antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention, the full-length cDNA sequences of the heavy chain and light chain were determined by obtaining mRNA from antibody-producing cells using the PureLinc RNA Mini kit (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# 12183025), cDNA synthesis using the resulting mRNAs as templates and reverse transcription primers specific for the heavy chain and light chain, by rapidly amplifying the ends of the cDNA, then cloning these cDNAs into plasmids and analyzing the plasmids using sequencing Sanger.
Результаты показаны на Фиг. 14-17 и в SEQ ID NO:5-34.The results are shown in Fig. 14-17 and SEQ ID NO:5-34.
[0058][0058]
Фиг. 14 показывает аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению. Фиг. 15 показывает аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению. Фиг. 16 показывает нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению. Фиг. 17 показывает нуклеотидные последовательности вариабельных областей легкой цепи антител (B3, C6 и G1) по настоящему изобретению.Fig. 14 shows the amino acid sequences of the heavy chain variable regions of antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention. Fig. 15 shows the amino acid sequences of the light chain variable regions of antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention. Fig. 16 shows the nucleotide sequences of the heavy chain variable regions of antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention. Fig. 17 shows the nucleotide sequences of the light chain variable regions of antibodies (B3, C6 and G1) of the present invention.
[0059][0059]
SEQ ID NO:5 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи B3 антитела. SEQ ID NO:6 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи C6 антитела. SEQ ID NO:7 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи G1 антитела. SEQ ID NO:8 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи B3 антитела. SEQ ID NO:9 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи C6 антитела. SEQ ID NO:10 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи G1 антитела.SEQ ID NO:5 is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the B3 antibody. SEQ ID NO:6 is the amino acid sequence of the C6 heavy chain variable region of the antibody. SEQ ID NO:7 is the amino acid sequence of the G1 antibody heavy chain variable region. SEQ ID NO:8 is the amino acid sequence of the antibody B3 light chain variable region. SEQ ID NO:9 is the amino acid sequence of the C6 light chain variable region of the antibody. SEQ ID NO:10 is the amino acid sequence of the G1 light chain variable region of the antibody.
SEQ ID NO:11 представляет собой нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи B3 антитела. SEQ ID NO:12 представляет собой нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи C6 антитела. SEQ ID NO:13 представляет собой нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи G1 антитела. SEQ ID NO:14 представляет собой нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи B3 антитела. SEQ ID NO:15 представляет собой нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи C6 антитела. SEQ ID NO:16 представляет собой нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи G1 антитела.SEQ ID NO:11 is the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the B3 antibody. SEQ ID NO:12 is the nucleotide sequence of the C6 heavy chain variable region of the antibody. SEQ ID NO:13 is the nucleotide sequence of the antibody G1 heavy chain variable region. SEQ ID NO:14 is the nucleotide sequence of the antibody B3 light chain variable region. SEQ ID NO:15 is the nucleotide sequence of the C6 light chain variable region of the antibody. SEQ ID NO:16 is the nucleotide sequence of the antibody G1 light chain variable region.
[0060][0060]
SEQ ID NO:17 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 VH антитела B3. SEQ ID NO:18 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 VH антитела B3. SEQ ID NO:19 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 VH антитела B3. SEQ ID NO:20 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 VH антитела C6. SEQ ID NO:21 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 VH антитела C6. SEQ ID NO:22 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 VH антитела C6. SEQ ID NO:23 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 VH антитела G1. SEQ ID NO:24 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 VH антитела G1. SEQ ID NO:25 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 VH антитела G1. SEQ ID NO:26 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 VL антитела B3. SEQ ID NO:27 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 VL антитела B3. SEQ ID NO:28 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 VL антитела B3. SEQ ID NO:29 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 VL антитела C6. SEQ ID NO:30 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 VL антитела C6. SEQ ID NO:31 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 VL антитела C6. SEQ ID NO:32 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 VL антитела G1. SEQ ID NO:33 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 VL антитела G1. SEQ ID NO:34 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 VL антитела G1.SEQ ID NO:17 is the amino acid sequence of CDR1 VH antibody B3. SEQ ID NO:18 is the CDR2 amino acid sequence of VH antibody B3. SEQ ID NO:19 is the CDR3 amino acid sequence of VH antibody B3. SEQ ID NO:20 is the amino acid sequence of CDR1 VH antibody C6. SEQ ID NO:21 is the CDR2 amino acid sequence of the C6 VH antibody. SEQ ID NO:22 is the CDR3 amino acid sequence of the C6 VH antibody. SEQ ID NO:23 is the amino acid sequence of CDR1 VH antibody G1. SEQ ID NO:24 is the CDR2 amino acid sequence of the G1 antibody VH. SEQ ID NO:25 is the CDR3 amino acid sequence of the G1 antibody VH. SEQ ID NO:26 is the amino acid sequence of CDR1 VL antibody B3. SEQ ID NO:27 is the amino acid sequence CDR2 of VL antibody B3. SEQ ID NO:28 is the CDR3 amino acid sequence of VL antibody B3. SEQ ID NO:29 is the amino acid sequence CDR1 of VL antibody C6. SEQ ID NO:30 is the CDR2 amino acid sequence of the C6 antibody VL. SEQ ID NO:31 is the CDR3 amino acid sequence of the C6 VL antibody. SEQ ID NO:32 is the amino acid sequence of CDR1 VL antibody G1. SEQ ID NO:33 is the CDR2 amino acid sequence of the VL antibody G1. SEQ ID NO:34 is the CDR3 amino acid sequence of the VL antibody G1.
[0061][0061]
[Пример испытания 6][Test Example 6]
(Оценка терапевтического эффекта)(Evaluation of therapeutic effect)
Химерное B3 антитело получали путем слияния вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела клона B3 и константных областей тяжелой цепи и легкой цепи соответствующего мышиного IgG2a и вводили модельным мышам с миелопролиферативным новообразованием, полученным путем прививки гематопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих мутантный ген CALR типа Del 52, и оценивали терапевтический эффект химерного антитела.The chimeric B3 antibody was prepared by fusing the variable regions of the heavy chain and light chain of the antibody clone B3 and the constant regions of the heavy chain and light chain of the corresponding murine IgG2a and was administered to a model mouse model of myeloproliferative neoplasm obtained by grafting hematopoietic stem cells expressing the mutant CALR gene type Del 52, and the therapeutic effect of the chimeric antibody was evaluated.
Вектор экспрессии, содержащий B3 мышиный химерный ген тяжелой цепи и легкой цепи, лигированный с последовательностью гена, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи антитела клона B3 и константную область мышиного IgG2a, или с последовательностью гена, кодирующей вариабельную область легкой цепи антитела клона B3 и константную область мышиного иммуноглобулина κ, трансфицировали в клетки ExpiCHO-S (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# A29127) и клетки культивировали с использованием среды для экспрессии ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific K.K., Cat# A2910001) в 5% CO2 при 37°C в течение 10 дней. Культуральные супернатанты собирали центрифугированием (4000g × 30 мин, 4°C) и каждый наносили на колонку HiTrap Protein G HP (GE Healthcare, Cat# 29048581) для прикрепления химерного антитела к колонке, затем элюировали с использованием 0,1 M Глицина-HCl (pH 2,7). Элюируемые фракции, нейтрализованные 1 M Tris-HCl (pH 9,0), диализовали против PBS с получением B3 мышиного химерного антитела.An expression vector containing a B3 murine heavy chain-light chain chimeric gene ligated to a gene sequence encoding a clone B3 antibody heavy chain variable region and a murine IgG2a constant region, or a gene sequence encoding a clone B3 antibody light chain variable region and a murine IgG2a constant region. immunoglobulin κ were transfected into ExpiCHO-S cells (Thermo Fisher Scientific KK, Cat# A29127) and cells were cultured using ExpiCHO expression medium (Thermo Fisher Scientific KK, Cat# A2910001) in 5% CO 2 at 37°C for 10 days. Culture supernatants were collected by centrifugation (4000 g × 30 min, 4°C) and each applied to a HiTrap Protein G HP column (GE Healthcare, Cat# 29048581) to attach the chimeric antibody to the column, then eluted using 0.1 M Glycine-HCl ( pH 2.7). The eluted fractions, neutralized with 1 M Tris-HCl (pH 9.0), were dialyzed against PBS to obtain the B3 mouse chimeric antibody.
Для оценки терапевтического эффекта B3 мышиного химерного антитела использовали модельных мышей с трансплантированным костным мозгом. Клетки костного мозга очищали от бедренных костей конгенных мышей B6.CD45.1 в возрасте 8-10 недель (Sankyo Labo Service Corporation, Inc.) и c-kit-положительные клетки, меченные APC-меченным анти-c-kit антителом, выделяли, а также выделяли LSK клетки, являющиеся Ter119, CD4, CD8, Gr-1, CD45R, CD3e и CD11b-отрицательными и CD117 и Sca1-положительными. Клетки инфицировали ретровирусом, содержащим pMSCV-IRES-GFP вектор, экспрессирующий мутантный ген CALR типа Del 52, или контрольный вектор. Через 72 часа после заражения 4000 клеток LSK на мышь трансплантировали мышам C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель (Oriental Yeast Co., Ltd.), дважды облученных излучением при 6 Грей. Через некоторое время подсчитывали число тромбоцитов в периферической крови с использованием автоматического многоканального счетчика клеток крови (Sysmex Corporation, Cat# pocH-100iV Diff). Через два месяца после трансплантации, после подтверждения тромбоцитоза, который является фенотипом миелопролиферативного новообразования, вызываемого экспрессией мутантного гена CALR, вводили B3 мышиное химерное антитело или растворитель (PBS) при 250 мкг на мышь каждую неделю через 9 недель после трансплантации, и оценивали эффект подавления тромбоцитоза, специфический для B3 мышиного химерного антитела.Bone marrow transplanted mouse models were used to evaluate the therapeutic effect of the B3 mouse chimeric antibody. Bone marrow cells were purified from the femurs of 8- to 10-week-old congenic B6.CD45.1 mice (Sankyo Labo Service Corporation, Inc.), and c-kit-positive cells labeled with APC-labeled anti-c-kit antibody were isolated. and also isolated LSK cells that were Ter119, CD4, CD8, Gr-1, CD45R, CD3e and CD11b negative and CD117 and Sca1 positive. Cells were infected with a retrovirus containing a pMSCV-IRES-GFP vector expressing the mutant Del 52 CALR gene or a control vector. At 72 hours postinfection, 4000 LSK cells per mouse were transplanted into 8- to 10-week-old C57BL/6J mice (Oriental Yeast Co., Ltd.) irradiated twice at 6 Gy. After some time, the number of platelets in the peripheral blood was counted using an automatic multichannel blood cell counter (Sysmex Corporation, Cat# pocH-100iV Diff). Two months after transplantation, after confirmation of thrombocytosis, which is a phenotype of myeloproliferative neoplasm caused by the expression of a mutant CALR gene, B3 mouse chimeric antibody or vehicle (PBS) was administered at 250 μg per mouse every week for 9 weeks after transplantation, and the effect of suppressing thrombocytosis was assessed , a B3-specific mouse chimeric antibody.
В результате, как показано на Фиг. 18, антитело по настоящему изобретению показало отличный терапевтический эффект на MPN.As a result, as shown in FIG. 18, the antibody of the present invention showed excellent therapeutic effect on MPN.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES
<110> ДЗЮНТЕНДО ЭДЬЮКЕЙШНЕЛ ФАУНДЕЙШН<110> JUNTENDO EDUCATIONAL FOUNDATION
<120> АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С РАСЩЕПЛЕННОЙ ФОРМОЙ МУТАНТНОГО<120> ANTIBODIES THAT BIND TO THE CLEAVED FORM OF THE MUTANT
КАЛЬРЕТИКУЛИНА, И СРЕДСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ CALRETICULIN, AND A MEANS FOR DIAGNOSIS, PREVENTION OR
ЛЕЧЕНИЯ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ TREATMENT OF MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIS
<130> JUSM0023<130> JUSM0023
<150> JP 2019-036119<150> JP 2019-036119
<151> 2019-02-28<151> 2019-02-28
<160> 34<160> 34
<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 13<211> 13
<212> Белок<212> Protein
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
Arg Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg MetArg Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met
1 5 101 5 10
<210> 2<210> 2
<211> 417<211> 417
<212> Белок<212> Protein
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 2<400> 2
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala ValMet Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 151 5 10 15
Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp GlyAla Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30 20 25 30
Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly LysTrp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys
35 40 45 35 40 45
Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp LysPhe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys
50 55 60 50 55 60
Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala SerGly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser
65 70 75 8065 70 75 80
Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe ThrPhe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr
85 90 95 85 90 95
Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys LeuVal Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu
100 105 110 100 105 110
Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu TyrPhe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr
115 120 125 115 120 125
Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys ValAsn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val
130 135 140 130 135 140
His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys AspHis Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp
145 150 155 160145 150 155 160
Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile ValIle Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val
165 170 175 165 170 175
Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val GluArg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu
180 185 190 180 185 190
Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys IleSer Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile
195 200 205 195 200 205
Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala LysLys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys
210 215 220 210 215 220
Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro GluIle Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu
225 230 235 240225 230 235 240
His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu GluHis Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu
245 250 255 245 250 255
Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr LysMet Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys
260 265 270 260 265 270
Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly ThrGly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr
275 280 285 275 280 285
Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro SerTrp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser
290 295 300 290 295 300
Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp GlnIle Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln
305 310 315 320305 310 315 320
Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp GluVal Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu
325 330 335 325 330 335
Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys AlaAla Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala
340 345 350 340 345 350
Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu LysAla Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys
355 360 365 355 360 365
Glu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu AspGlu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp
370 375 380 370 375 380
Lys Glu Asp Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu AspLys Glu Asp Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp
385 390 395 400385 390 395 400
Lys Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Pro Gly Gln Ala Lys Asp GluLys Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Pro Gly Gln Ala Lys Asp Glu
405 410 415 405 410 415
LeuLeu
<210> 3<210> 3
<211> 411<211> 411
<212> Белок<212> Protein
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 3<400> 3
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala ValMet Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 151 5 10 15
Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp GlyAla Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30 20 25 30
Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly LysTrp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys
35 40 45 35 40 45
Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp LysPhe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys
50 55 60 50 55 60
Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala SerGly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser
65 70 75 8065 70 75 80
Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe ThrPhe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr
85 90 95 85 90 95
Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys LeuVal Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu
100 105 110 100 105 110
Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu TyrPhe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr
115 120 125 115 120 125
Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys ValAsn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val
130 135 140 130 135 140
His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys AspHis Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp
145 150 155 160145 150 155 160
Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile ValIle Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val
165 170 175 165 170 175
Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val GluArg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu
180 185 190 180 185 190
Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys IleSer Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile
195 200 205 195 200 205
Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala LysLys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys
210 215 220 210 215 220
Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro GluIle Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu
225 230 235 240225 230 235 240
His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu GluHis Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu
245 250 255 245 250 255
Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr LysMet Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys
260 265 270 260 265 270
Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly ThrGly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr
275 280 285 275 280 285
Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro SerTrp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser
290 295 300 290 295 300
Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp GlnIle Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln
305 310 315 320305 310 315 320
Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp GluVal Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu
325 330 335 325 330 335
Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys AlaAla Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala
340 345 350 340 345 350
Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Thr ArgAla Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Thr Arg
355 360 365 355 360 365
Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met Arg Arg Thr ArgArg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met Arg Arg Thr Arg
370 375 380 370 375 380
Arg Lys Met Arg Arg Lys Met Ser Pro Ala Arg Pro Arg Thr Ser CysArg Lys Met Arg Arg Lys Met Ser Pro Ala Arg Pro Arg Thr Ser Cys
385 390 395 400385 390 395 400
Arg Glu Ala Cys Leu Gln Gly Trp Thr Glu AlaArg Glu Ala Cys Leu Gln Gly Trp Thr Glu Ala
405 410 405 410
<210> 4<210> 4
<211> 430<211> 430
<212> Белок<212> Protein
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 4<400> 4
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala ValMet Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 151 5 10 15
Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp GlyAla Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30 20 25 30
Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly LysTrp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys
35 40 45 35 40 45
Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp LysPhe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys
50 55 60 50 55 60
Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala SerGly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser
65 70 75 8065 70 75 80
Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe ThrPhe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr
85 90 95 85 90 95
Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys LeuVal Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu
100 105 110 100 105 110
Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu TyrPhe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr
115 120 125 115 120 125
Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys ValAsn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val
130 135 140 130 135 140
His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys AspHis Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp
145 150 155 160145 150 155 160
Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile ValIle Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val
165 170 175 165 170 175
Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val GluArg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu
180 185 190 180 185 190
Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys IleSer Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile
195 200 205 195 200 205
Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala LysLys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys
210 215 220 210 215 220
Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro GluIle Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu
225 230 235 240225 230 235 240
His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu GluHis Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu
245 250 255 245 250 255
Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr LysMet Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys
260 265 270 260 265 270
Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly ThrGly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr
275 280 285 275 280 285
Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro SerTrp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser
290 295 300 290 295 300
Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp GlnIle Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln
305 310 315 320305 310 315 320
Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp GluVal Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu
325 330 335 325 330 335
Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys AlaAla Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala
340 345 350 340 345 350
Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu LysAla Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys
355 360 365 355 360 365
Glu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu AspGlu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp
370 375 380 370 375 380
Asn Cys Arg Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met ArgAsn Cys Arg Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met Arg
385 390 395 400385 390 395 400
Arg Thr Arg Arg Lys Met Arg Arg Lys Met Ser Pro Ala Arg Pro ArgArg Thr Arg Arg Lys Met Arg Arg Lys Met Ser Pro Ala Arg Pro Arg
405 410 415 405 410 415
Thr Ser Cys Arg Glu Ala Cys Leu Gln Gly Trp Thr Glu AlaThr Ser Cys Arg Glu Ala Cys Leu Gln Gly Trp Thr Glu Ala
420 425 430 420 425 430
<210> 5<210> 5
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 5<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly SerGln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 151 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg AsnSer Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn
20 25 30 20 25 30
Phe Ile His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp IlePhe Ile His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys PheGly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala TyrAsn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe CysMet Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Asn Tyr Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Gly Asn Tyr Asn Tyr Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Val Met Val Thr Val Ser SerVal Met Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 6<210> 6
<211> 121<211> 121
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 6<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly SerGln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 151 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser TyrSer Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Val His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asp Gly Leu Glu Trp IlePhe Val His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asp Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn His Lys PheGly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Asn Gly Lys Ser Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala TyrAsn Gly Lys Ser Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe CysMet Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala Trp GlyAla Arg Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala Trp Gly
100 105 110 100 105 110
Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser SerGln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 7<210> 7
<211> 121<211> 121
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 7<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly SerGln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 151 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser TyrSer Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Val His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asp Gly Leu Glu Trp IlePhe Val His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asp Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys PheGly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala TyrAsn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe CysMet Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala Trp GlyAla Arg Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala Trp Gly
100 105 110 100 105 110
Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser SerGln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 8<210> 8
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 8<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 151 5 10 15
Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser TyrGlu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Phe Ala Ala Asn Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyPhe Ala Ala Asn Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro TyrGlu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu AsnThr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Asn
100 105 100 105
<210> 9<210> 9
<211> 112<211> 112
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 9<400> 9
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ala Thr Ile GlyAsp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ala Thr Ile Gly
1 5 10 151 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp SerGln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30 20 25 30
Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln SerAsp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val ProPro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60 50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys IleAsn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 8065 70 75 80
Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln AlaSer Gly Met Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95 85 90 95
Thr His Gly Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu LysThr His Gly Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110 100 105 110
<210> 10<210> 10
<211> 112<211> 112
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 10<400> 10
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ala Thr Ile GlyAsp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ala Thr Ile Gly
1 5 10 151 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp SerGln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30 20 25 30
Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln CysAsp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Cys
35 40 45 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val ProPro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60 50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys IleAsn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 8065 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln GlySer Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95 85 90 95
Thr His Gly Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu LysThr His Gly Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110 100 105 110
<210> 11<210> 11
<211> 357<211> 357
<212> ДНК<212> DNA
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 11<400> 11
caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt
60 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc cgtaacttta tacactggat aaaacagcag tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc cgtaacttta tacactggat aaaacagcag
120 120
cctggaaatg gccttgagtg gattgggtgg atttttcctg gagatggtga tacagagtac cctggaaatg gccttgagtg gattgggtgg atttttcctg gagatggtga tacagagtac
180 180
aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcagaca aatcgtccag cacagcctat aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcagaca aatcgtccag cacagcctat
240 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaggaaat atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaggaaat
300 300
tacaactacg agtactttga ttactggggc caaggagtca tggtcacagt ctcctca tacaactacg agtactttga ttactggggc caaggagtca tggtcacagt ctcctca
357 357
<210> 12<210> 12
<211> 363<211> 363
<212> ДНК<212> DNA
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 12<400> 12
caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt
60 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agttactttg tgcactggat aaaacagcag tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agttactttg tgcactggat aaaacagcag
120 120
cctggagatg gccttgagtg gattgggtgg atttatcctg gagatggtga tacagagtac cctggagatg gccttgagtg gattgggtgg atttatcctg gagatggtga tacagagtac
180 180
aatcacaagt tcaatgggaa gtcaacactc actgcagaca gatcctccag tacagcctat aatcacaagt tcaatgggaa gtcaacactc actgcagaca gatcctccag tacagcctat
240 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagggaat atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagggaat
300 300
tactatgatg gtcgggaagt tatggatgcc tggggtcaag gagcttcagt cactgtctcc tactatgatg gtcgggaagt tatggatgcc tggggtcaag gagcttcagt cactgtctcc
360 360
tca tca
363 363
<210> 13<210> 13
<211> 363<211> 363
<212> ДНК<212> DNA
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 13<400> 13
caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt
60 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agttactttg tgcactggat aaaacagcag tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agttactttg tgcactggat aaaacagcag
120 120
cctggagatg gccttgagtg gattgggtgg atttatcctg gagatggtga tacagagtac cctggagatg gccttgagtg gattgggtgg atttatcctg gagatggtga tacagagtac
180 180
aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcagaca gatcctccag tacagcctat aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcagaca gatcctccag tacagcctat
240 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagggaat atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagggaat
300 300
tactatgatg gtcgggaagt tatggatgcc tggggtcaag gagcttcagt cactgtctcc tactatgatg gtcgggaagt tatggatgcc tggggtcaag gagcttcagt cactgtctcc
360 360
tca tca
363 363
<210> 14<210> 14
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 14<400> 14
gacatccaga tgacacagtc tccggcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtctcc gacatccaga tgacacagtc tccggcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtctcc
60 60
atcgagtgtc tagcaagtga ggacatttac agttatttag catggtatca acagaagcca atcgagtgtc tagcaagtga ggacatttac agttatttag catggtatca acagaagcca
120 120
gggaaatctc ctcagctcct gatctttgct gcaaataggt tgcaagatgg ggtcccatca gggaaatctc ctcagctcct gatctttgct gcaaataggt tgcaagatgg ggtcccatca
180 180
cggttcagtg gcagtggatc tggcacacag ttttctctca agatcagcgg catgcaacct cggttcagtg gcagtggatc tggcacacag ttttctctca agatcagcgg catgcaacct
240 240
gaagatgaag gggattattt ctgtctacag ggttccaagt ttccgtacac ctttggacct gaagatgaag gggattattt ctgtctacag ggttccaagt ttccgtacac ctttggacct
300 300
gggaccaagc tggaactgaa c gggaccaagc tggaactgaa c
321 321
<210> 15<210> 15
<211> 336<211> 336
<212> ДНК<212> DNA
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 15<400> 15
gatgttgtgc tgacccagac tccacccact ttatcggcta ccattggaca atcggtctcc gatgttgtgc tgacccagac tccacccact ttatcggcta ccattggaca atcggtctcc
60 60
atctcttgca ggtcaagtca gagtctctta gatagtgatg gagaaaccta tttaaattgg atctcttgca ggtcaagtca gagtctctta gatagtgatg gagaaaccta tttaaattgg
120 120
ttgctacaga ggccaggcca atctccacag cttctaattt attcggtctc caacctggaa ttgctacaga ggccaggcca atctccacag cttctaattt attcggtctc caacctggaa
180 180
tctggggtcc ccaacaggtt cagtggcagt gggtcagaaa cagatttcac actcaaaatc tctggggtcc ccaacaggtt cagtggcagt gggtcagaaa cagatttcac actcaaaatc
240 240
agtggaatgg aggctgaaga tttgggagtt tactactgca tgcaagctac ccatggtccg agtggaatgg aggctgaaga tttgggagtt tactactgca tgcaagctac ccatggtccg
300 300
tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaa tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaa
336 336
<210> 16<210> 16
<211> 336<211> 336
<212> ДНК<212> DNA
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 16<400> 16
gatgttgtgc tgacccagac tccacccact ttatcggcta ccattggaca atcggtctcc gatgttgtgc tgacccagac tccacccact ttatcggcta ccattggaca atcggtctcc
60 60
atctcttgca ggtcaagtca gagtctctta gatagtgatg gagaaaccta tttaaattgg atctcttgca ggtcaagtca gagtctctta gatagtgatg gagaaaccta tttaaattgg
120 120
ttgctacaga ggccaggcca atgtccacag cttctaattt attcggtatc caacctggaa ttgctacaga ggccaggcca atgtccacag cttctaattt attcggtatc caacctggaa
180 180
tctggggtcc ccaacaggtt cagtggcagt gggtcagaaa cagatttcac actcaaaatc tctggggtcc ccaacaggtt cagtggcagt gggtcagaaa cagatttcac actcaaaatc
240 240
agtggagtgg aggctgaaga tttgggagtt tactactgca tgcaaggtac ccatggtccg agtggagtgg aggctgaaga tttgggagtt tactactgca tgcaaggtac ccatggtccg
300 300
tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaa tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaa
336 336
<210> 17<210> 17
<211> 10<211> 10
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 17<400> 17
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Phe Ile HisGly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Phe Ile His
1 5 101 5 10
<210> 18<210> 18
<211> 17<211> 17
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 18<400> 18
Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe AsnTrp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Asn
1 5 10 151 5 10 15
GlyGly
<210> 19<210> 19
<211> 10<211> 10
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 19<400> 19
Gly Asn Tyr Asn Tyr Glu Tyr Phe Asp TyrGly Asn Tyr Asn Tyr Glu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 101 5 10
<210> 20<210> 20
<211> 10<211> 10
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 20<400> 20
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Val HisGly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Val His
1 5 101 5 10
<210> 21<210> 21
<211> 17<211> 17
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 21<400> 21
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn His Lys Phe AsnTrp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn His Lys Phe Asn
1 5 10 151 5 10 15
GlyGly
<210> 22<210> 22
<211> 12<211> 12
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 22<400> 22
Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp AlaGly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala
1 5 101 5 10
<210> 23<210> 23
<211> 10<211> 10
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 23<400> 23
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Val HisGly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Val His
1 5 101 5 10
<210> 24<210> 24
<211> 17<211> 17
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 24<400> 24
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe AsnTrp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Asn
1 5 10 151 5 10 15
GlyGly
<210> 25<210> 25
<211> 12<211> 12
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 25<400> 25
Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp AlaGly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala
1 5 101 5 10
<210> 26<210> 26
<211> 11<211> 11
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 26<400> 26
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr Leu AlaLeu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 101 5 10
<210> 27<210> 27
<211> 7<211> 7
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 27<400> 27
Ala Ala Asn Arg Leu Gln AspAla Ala Asn Arg Leu Gln Asp
1 515
<210> 28<210> 28
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 28<400> 28
Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Tyr ThrLeu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Tyr Thr
1 515
<210> 29<210> 29
<211> 16<211> 16
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 29<400> 29
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr Leu AsnArg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 151 5 10 15
<210> 30<210> 30
<211> 7<211> 7
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 30<400> 30
Ser Val Ser Asn Leu Glu SerSer Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 515
<210> 31<210> 31
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 31<400> 31
Met Gln Ala Thr His Gly Pro Tyr ThrMet Gln Ala Thr His Gly Pro Tyr Thr
1 515
<210> 32<210> 32
<211> 16<211> 16
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 32<400> 32
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr Leu AsnArg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 151 5 10 15
<210> 33<210> 33
<211> 7<211> 7
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 33<400> 33
Ser Val Ser Asn Leu Glu SerSer Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 515
<210> 34<210> 34
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Rattus norvegicus<213> Rattus norvegicus
<400> 34<400> 34
Met Gln Gly Thr His Gly Pro Tyr ThrMet Gln Gly Thr His Gly Pro Tyr Thr
1 515
<---<---
Claims (22)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019-036119 | 2019-02-28 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021128127A RU2021128127A (en) | 2023-03-28 |
RU2815960C2 true RU2815960C2 (en) | 2024-03-25 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015036599A1 (en) * | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh | Mutant calreticulin for the diagnosis of myeloid malignancies |
WO2016087514A1 (en) * | 2014-12-02 | 2016-06-09 | Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh | Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015036599A1 (en) * | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh | Mutant calreticulin for the diagnosis of myeloid malignancies |
RU2668808C2 (en) * | 2013-09-16 | 2018-10-02 | Цемм - Форшунгсцентрум Фюр Молекуларе Медицин Гмбх | Mutant calreticulin for diagnosis of myeloid malignancies |
WO2016087514A1 (en) * | 2014-12-02 | 2016-06-09 | Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh | Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
VANNUCCHI A.M. et al. Calreticulin mutation-specific immunostaining in myeloproliferative neoplasms: pathogenetic insight and diagnostic value. LEUKEMIA. 2014, v.28, n.9, pp.1811-1818. МЕЛИКЯН А.Л. и др. Классические Ph-негативные миелопролиферативные неоплазии. Материалы 56-го конгресса Американского гематологического общества (декабрь 2014 г., Сан-Франциско). КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ. 2015, т.8, н.2, сс.201-213. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109563169B (en) | anti-HLA-G specific antibodies | |
CA2367901C (en) | Monoclonal antibodies, antigens and diagnosis and therapy of malignant diseases | |
US20220098290A1 (en) | Antibodies that bind to cleaved form of mutant calreticulin, and diagnostic, preventive, or therapeutic agent for myeloproliferative neoplasm | |
JP2022512954A (en) | NKG2A antibody and its production method and use | |
CN114560941B (en) | Antibodies to CLDN18.2 and uses thereof | |
CN113166257B (en) | CD47 antibody and preparation method and application thereof | |
US20220064323A1 (en) | Therapeutic Anti-CD9 Antibody | |
JP7384493B2 (en) | Anti-CLL1 antibody and its use | |
EP4205764A1 (en) | Anti-truncated mutant calr-cd3 bispecific antibody and pharmaceutical composition | |
AU2015313268A1 (en) | Cancer-cell-specific antibody, anticancer agent, and cancer testing method | |
CN111196854A (en) | OX40 antibody and preparation method and application thereof | |
CN115386006A (en) | anti-GPRC 5D antibody, preparation method and application thereof | |
CN111201244A (en) | anti-AQP 3 monoclonal antibodies that specifically bind to the extracellular domain of aquaporin 3(AQP3) and uses thereof | |
RU2815960C2 (en) | Antibodies which bind to split form of mutant calreticulin, and agent for diagnosing, preventing or treating myeloproliferative growth | |
CN111434686B (en) | Anti-human PBX1 monoclonal antibody, preparation method thereof and application thereof in clinical diagnosis of recurrent abortion | |
KR20220108137A (en) | Uses of MMP Inhibition | |
KR20220048028A (en) | Anti-CD19 antibodies and uses thereof | |
CN114761042A (en) | IL-38 specific antibodies | |
CN111704668B (en) | anti-CCR 4 antibodies and their use in treating cancer | |
US20220064334A1 (en) | Anti-idiotypic antibodies against anti-klk2 antibodies | |
CN117186235A (en) | Bispecific antibody of anti-4-1 BB/anti-EGFRvIII, preparation method and application thereof | |
JP2023535684A (en) | Anti-idiotypic antibody against anti-GPRC5D antibody | |
CN117157401A (en) | Antibodies against pancreatic cancer stem cells | |
CN115611984A (en) | NKp46 antibody, and preparation method and application thereof | |
CN117677396A (en) | IL-38 specific antibodies |