RU2815906C9 - Methods of producing induced smooth muscle cells - Google Patents
Methods of producing induced smooth muscle cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815906C9 RU2815906C9 RU2021129050A RU2021129050A RU2815906C9 RU 2815906 C9 RU2815906 C9 RU 2815906C9 RU 2021129050 A RU2021129050 A RU 2021129050A RU 2021129050 A RU2021129050 A RU 2021129050A RU 2815906 C9 RU2815906 C9 RU 2815906C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- smooth muscle
- expression
- ismc
- cell
- Prior art date
Links
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 397
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 124
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 111
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 70
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 30
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 53
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 52
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 claims description 50
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 claims description 49
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 claims description 49
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 49
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 claims description 42
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 claims description 41
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 claims description 41
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 claims description 35
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 claims description 30
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 29
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 28
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims description 27
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims description 25
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims description 23
- 102100029937 Smoothelin Human genes 0.000 claims description 23
- 101710151526 Smoothelin Proteins 0.000 claims description 23
- 102100032817 Integrin alpha-5 Human genes 0.000 claims description 20
- 101000994369 Homo sapiens Integrin alpha-5 Proteins 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 19
- 208000034347 Faecal incontinence Diseases 0.000 claims description 18
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 17
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 17
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 10
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 206010021639 Incontinence Diseases 0.000 claims description 9
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 9
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 9
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 9
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 8
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 8
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 claims description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 claims description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 claims description 5
- 206010021518 Impaired gastric emptying Diseases 0.000 claims description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 208000001288 gastroparesis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010020853 Hypertonic bladder Diseases 0.000 claims description 4
- 208000009722 Overactive Urinary Bladder Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004168 Underactive Urinary Bladder Diseases 0.000 claims description 4
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020629 overactive bladder Diseases 0.000 claims description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 4
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims 7
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 53
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 32
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 26
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 26
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 25
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 230000009756 muscle regeneration Effects 0.000 description 17
- 101100351033 Mus musculus Pax7 gene Proteins 0.000 description 14
- 210000001187 pylorus Anatomy 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 11
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 10
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 238000001964 muscle biopsy Methods 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 9
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 9
- JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(O)=C(O)C(S(O)(=O)=O)=C2 JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 8
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 8
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 8
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 8
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 7
- -1 alcian blue Chemical compound 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 5
- 101710092112 Calponin-1 Proteins 0.000 description 5
- 102000002585 Contractile Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010068426 Contractile Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 5
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 5
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 4
- 108700015928 Mitogen-activated protein kinase 13 Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004323 caveolae Anatomy 0.000 description 4
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 4
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000615866 Antho Species 0.000 description 3
- 102100023073 Calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101001049859 Homo sapiens Calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 3
- 101000688345 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 14A Proteins 0.000 description 3
- 102100024039 Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 102100024147 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 14A Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000003932 Transgelin Human genes 0.000 description 3
- 108090000333 Transgelin Proteins 0.000 description 3
- 102100033632 Tropomyosin alpha-1 chain Human genes 0.000 description 3
- 101710128188 Tropomyosin alpha-1 chain Proteins 0.000 description 3
- 101710186379 Tropomyosin-1 Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 210000000062 pectoralis major Anatomy 0.000 description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 102000038650 voltage-gated calcium channel activity Human genes 0.000 description 3
- 108091023044 voltage-gated calcium channel activity Proteins 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- PJOHVEQSYPOERL-SHEAVXILSA-N (e)-n-[(4r,4as,7ar,12br)-3-(cyclopropylmethyl)-9-hydroxy-7-oxo-2,4,5,6,7a,13-hexahydro-1h-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-4a-yl]-3-(4-methylphenyl)prop-2-enamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1\C=C\C(=O)N[C@]1(CCC(=O)[C@@H]2O3)[C@H]4CC5=CC=C(O)C3=C5[C@]12CCN4CC1CC1 PJOHVEQSYPOERL-SHEAVXILSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102100039675 Adenylate cyclase type 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100032158 Adenylate cyclase type 6 Human genes 0.000 description 2
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 101000693933 Arabidopsis thaliana Fructose-bisphosphate aldolase 8, cytosolic Proteins 0.000 description 2
- 102100024654 Calcitonin gene-related peptide type 1 receptor Human genes 0.000 description 2
- 102100023074 Calcium-activated potassium channel subunit beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100024436 Caldesmon Human genes 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102100025334 Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100036703 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13 Human genes 0.000 description 2
- 102100040754 Guanylate cyclase soluble subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710196893 Guanylate cyclase soluble subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001049849 Homo sapiens Calcium-activated potassium channel subunit beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000910297 Homo sapiens Caldesmon Proteins 0.000 description 2
- 101150013399 ITGA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000000510 Integrin alpha3 Human genes 0.000 description 2
- 108010041357 Integrin alpha3 Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 2
- 241000220619 Megaselia pectoralis Species 0.000 description 2
- 102100031787 Myosin regulatory light polypeptide 9 Human genes 0.000 description 2
- 101710107065 Myosin regulatory light polypeptide 9 Proteins 0.000 description 2
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102100023616 Neural cell adhesion molecule L1-like protein Human genes 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037339 Protein kinase C epsilon type Human genes 0.000 description 2
- 101710144382 Protein kinase C epsilon type Proteins 0.000 description 2
- 102100033194 Rho guanine nucleotide exchange factor 11 Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UNZIDPIPYUMVPA-UHFFFAOYSA-M Sulpyrine Chemical compound O.[Na+].O=C1C(N(CS([O-])(=O)=O)C)=C(C)N(C)N1C1=CC=CC=C1 UNZIDPIPYUMVPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000003970 Vinculin Human genes 0.000 description 2
- 108090000384 Vinculin Proteins 0.000 description 2
- 102000003734 Voltage-Gated Potassium Channels Human genes 0.000 description 2
- 108090000013 Voltage-Gated Potassium Channels Proteins 0.000 description 2
- 101000678336 Xenopus laevis Actin, alpha skeletal muscle 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000678338 Xenopus tropicalis Actin, alpha cardiac muscle 2 Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229930185229 antidesmin Natural products 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 102100033065 cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- ZOOGRGPOEVQQDX-KHLHZJAASA-N cyclic guanosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)O[P@](O)(=O)O[C@@H]1[C@H](O)[C@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-KHLHZJAASA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000003064 k means clustering Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 210000004944 mitochondria-rich cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000004220 muscle function Effects 0.000 description 2
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 2
- 230000004070 myogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 2
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 102100030390 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-1 Human genes 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 1
- 102000004008 5'-Nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 1
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 1
- 101150019464 ARAF gene Proteins 0.000 description 1
- 101710194151 Adenylate cyclase type 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710194245 Adenylate cyclase type 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- PSMZEXSMYRRSKG-UHFFFAOYSA-N C(C)(=O)OCC[N+](C)(C)C.S(I)I Chemical compound C(C)(=O)OCC[N+](C)(C)C.S(I)I PSMZEXSMYRRSKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010025714 CD146 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710118454 Calcitonin gene-related peptide type 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023243 Calcium-activated potassium channel subunit beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100023241 Calcium-activated potassium channel subunit beta-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920000049 Carbon (fiber) Polymers 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 241000277305 Electrophorus electricus Species 0.000 description 1
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031509 Fibrillin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010030229 Fibrillin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710099690 Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710137151 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13 Proteins 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 101000583063 Homo sapiens 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000760563 Homo sapiens Calcitonin gene-related peptide type 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001049845 Homo sapiens Calcium-activated potassium channel subunit beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001049846 Homo sapiens Calcium-activated potassium channel subunit beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001049842 Homo sapiens Calcium-activated potassium channel subunit beta-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000857888 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000975421 Homo sapiens Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101001000061 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12A Proteins 0.000 description 1
- 101001000998 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000771237 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase A-Raf Proteins 0.000 description 1
- 101000635938 Homo sapiens Transforming growth factor beta-1 proprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 101000944219 Homo sapiens cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108010032354 Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007640 Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100024037 Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010041014 Integrin alpha5 Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101150094768 Mcam gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 102000005604 Myosin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010084498 Myosin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710155723 Non-muscle caldesmon Proteins 0.000 description 1
- 101150101087 Nt5e gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000006989 PAX7 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010008164 PAX7 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150095742 PLA2G2A gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102100036547 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12A Human genes 0.000 description 1
- 102100035620 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Human genes 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 101710085364 Rho guanine nucleotide exchange factor 11 Proteins 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- 108010031873 Secretory Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 102000005473 Secretory Phospholipases A2 Human genes 0.000 description 1
- 102100029437 Serine/threonine-protein kinase A-Raf Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030742 Transforming growth factor beta-1 proprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N acepromazine Chemical compound C1=C(C(C)=O)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005054 acepromazine Drugs 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710083099 cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000004917 carbon fiber Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 102000008395 cell adhesion mediator activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000555 contractile cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- MCBBFDNTCVNDCE-UHFFFAOYSA-N cyclopenta-1,3-diene cyclopenta-2,4-diene-1-carbonyl cyanide iron(2+) Chemical compound [Fe++].c1cc[cH-]c1.O=C(C#N)[c-]1cccc1 MCBBFDNTCVNDCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940120889 dipyrone Drugs 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 1
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 1
- 229940082150 encore Drugs 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005071 external anal sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 102000049018 human NCAM1 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010569 immunofluorescence imaging Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000000111 lower esophageal sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 230000017813 membrane repolarization Effects 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001611 motor endplate Anatomy 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009753 muscle formation Effects 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002463 poly(p-dioxanone) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000622 polydioxanone Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000012232 skeletal muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000016160 smooth muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000002948 striated muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000352 supercritical drying Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000001942 upper esophageal sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000025102 vascular smooth muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к способам получения индуцированных клеток гладких мышц (iSMC), к клеткам iSMC, к iSMC для применения в способе лечения заболевания или расстройства, либо для применения в инжиниринге тканей, и к применению клеток скелетных мышц для получения iSMC.The present invention relates to methods for producing induced smooth muscle cells (iSMCs), to iSMC cells, to iSMCs for use in a method of treating a disease or disorder or for use in tissue engineering, and to the use of skeletal muscle cells to produce iSMCs.
Дегенерация гладких мышц, например, в сфинктерах, может вызывать изнуряющие заболевания, такие как недержание кала. Происходящие из скелетных мышц клетки (SMDC) эффективно используются в клиниках для регенерации сфинктеров скелетных мышц, таких как наружный сфинктер прямой кишки или сфинктер мочевого пузыря. Однако мало что известно о in vitro дифференцировке гладких мышц и об in vivo регенеративном потенциале клеток гладких мышц, полученных из SMDC, в отношении гладких мышц.Degeneration of smooth muscles, such as those in the sphincters, can cause debilitating diseases such as fecal incontinence. Skeletal muscle-derived cells (SMDCs) are effectively used clinically to regenerate skeletal muscle sphincters, such as the external rectal sphincter or the bladder sphincter. However, little is known about in vitro smooth muscle differentiation and the in vivo regenerative potential of SMDC-derived smooth muscle cells for smooth muscle.
Сфинктеры представляют собой кольцевые мышцы, регулирующие продвижение твердых и/или жидких веществ, и могут состоять либо из скелетной мышцы, такой как наружный сфинктер прямой кишки, либо гладкой мышцы, такой как внутренний сфинктер прямой кишки и сфинктер привратника (Al-Ali и др., 2009; Ramkumar & Schulze, 2005). Нарушение функционирования мышц сфинктера ануса и привратника ассоциировано с недержанием кала и гастропарезом, соответственно (Abrahamsson, 2007; Rao, 2004). Дегенерация гладкой мышцы внутреннего сфинктера прямой кишки является известной причиной пассивного недержания кала (Vaizey и др., 1997), основного типа недержания кала, поражающего 78% всех пациентов с недержанием кала (Mimura и др., 2004). Несмотря на то, что недержание кала не опасно для жизни, оно серьезно влияет на качество жизни пациентов (Meyer & Richter, 2015) и имеет показатель распространенности до 12% у мужчин и женщин (Goode и др., 2005; Quander и др., 2005). Консервативные методы лечения, такие как применение объемообразующих агентов, имеют ограниченный успех у пациентов с высокой степенью недержания, а хирургические подходы характеризуются высоким уровнем заболеваемости и осложнений (J.Y. Wang & Abbas, 2013).Sphincters are circular muscles that regulate the movement of solid and/or liquid substances and can consist of either skeletal muscle, such as the external rectal sphincter, or smooth muscle, such as the internal rectal sphincter and pyloric sphincter (Al-Ali et al. , 2009; Ramkumar & Schulze, 2005). Impaired functioning of the anal and pyloric sphincter muscles is associated with fecal incontinence and gastroparesis, respectively (Abrahamsson, 2007; Rao, 2004). Degeneration of the smooth muscle of the internal rectal sphincter is a known cause of passive fecal incontinence (Vaizey et al., 1997), the main type of fecal incontinence affecting 78% of all patients with fecal incontinence (Mimura et al., 2004). Although not life-threatening, fecal incontinence has a significant impact on patients' quality of life (Meyer & Richter, 2015) and has a prevalence rate of up to 12% in men and women (Goode et al., 2005; Quander et al., 2015). 2005). Conservative treatments, such as the use of bulking agents, have limited success in patients with severe incontinence, and surgical approaches are characterized by high rates of morbidity and complications (J.Y. Wang & Abbas, 2013).
Функциональные свойства ткани гладких мышц зависят от существования высокодифференцированных клеток гладких мышц, экспрессирующих сократительные белки, такие как альфа-актин гладких мышц (aSMA), десмин и смутелин (SMTN) (Capetanaki и др., 1997; van Eys и др., 2007; J. Wang и др., 2006), а также функциональные потенциал-зависимые кальциевые и калиевые каналы, обеспечивающие индуцирование регулируемого клеточного сокращения (Sanders, 2008). Выделение и применение аналогичных клеток для лечения дефектов гладких мышц может быть перспективным вариантом лечения. Однако, в настоящее время на рынке не существует терапии с использованием клеток гладких мышц. Выделение клеток гладких мышц, способных регенерировать дефектную ткань гладких мышц, представляет собой первое предварительное условие на пути к клиническому применению этих клеток. Известным из уровня техники методом получения клеток гладких мышц является применение в качестве источника ткани гладких мышц. Эти первичные клетки гладких мышц нашли эффективное применение для регенерации гладких мышц в животной модели пассивного недержания кала (Bohl и др., 2017), однако первичные клетки гладких мышц труднодоступны в случае живых людей для аутологичного лечения, они гетерогенны по своей природе и могут иметь ограничения в отношении способности к пролиферации (Sandison & McCarron, 2015), вследствие этого они меньше подходят в качестве кандидатов для клеточной терапии с целью регенерации гладких мышц у человека. Поэтому, в качестве подхода было предложено применение обладающих высокой способностью к пролиферации стволовых клеток/клеток-предшественников, готовых дифференцироваться в клетки гладких мышц.The functional properties of smooth muscle tissue depend on the existence of highly differentiated smooth muscle cells expressing contractile proteins such as alpha smooth muscle actin (aSMA), desmin and smoothelin (SMTN) (Capetanaki et al., 1997; van Eys et al., 2007; J. Wang et al., 2006), as well as functional voltage-dependent calcium and potassium channels that induce regulated cell contraction (Sanders, 2008). Isolating and using similar cells to treat smooth muscle defects may be a promising treatment option. However, there are currently no smooth muscle cell therapies on the market. Isolation of smooth muscle cells capable of regenerating defective smooth muscle tissue represents the first prerequisite towards the clinical application of these cells. A method known in the art for obtaining smooth muscle cells is to use smooth muscle tissue as a source. These primary smooth muscle cells have found effective use for smooth muscle regeneration in an animal model of passive fecal incontinence (Bohl et al., 2017), however, primary smooth muscle cells are difficult to access in living humans for autologous treatment, are heterogeneous in nature and may have limitations in terms of their ability to proliferate (Sandison & McCarron, 2015), they are therefore less suitable as candidates for cell therapy for smooth muscle regeneration in humans. Therefore, the use of highly proliferative stem/progenitor cells that are ready to differentiate into smooth muscle cells has been proposed as an approach.
Показано, что стволовые клетки/клетки-предшественники, такие как мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (MSC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), обладают трансдифференцировочным потенциалом в отношении линии клеток гладких мышц (Bajpai и др., 2012; Park и др., 2013), а также регенеративным потенциалом in vivo в отношении гладких мышц (Li и др., 2016). iPSC особенно перспективны с точки зрения возможности их дифференцировки в клетки гладких мышц и функциональных свойств in vitro (Bajpai и др., 2012), а полученные из iPSC клетки-предшественники клеток гладких мышц продемонстрировали регенеративный потенциал in vivo в отношении сфинктера уретры (Li и др., 2016), однако опасения, связанные с безопасностью, такие как генетическая нестабильность и образованием тератом, ограничивают их полезность (Jung и др., 2012). Клеточные продукты, полученные из MSC взрослых людей, не вызывали серьезных проблем со здоровьем в большинстве клинических испытаний (Y. Wang и др., 2012). Однако, их клиническая эффективность в регенерации гладких мышц остается неясной.Stem/progenitor cells such as multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been shown to have transdifferentiation potential in the smooth muscle cell lineage (Bajpai et al., 2012; Park et al., 2012). 2013), as well as in vivo regenerative potential for smooth muscle (Li et al., 2016). iPSCs are particularly promising in terms of their ability to differentiate into smooth muscle cells and functional properties in vitro (Bajpai et al., 2012), and iPSC-derived smooth muscle cell progenitor cells have demonstrated regenerative potential in vivo for the urethral sphincter (Li et al. ., 2016), but safety concerns such as genetic instability and teratoma formation limit their usefulness (Jung et al., 2012). Cell products derived from adult MSCs did not cause serious health problems in most clinical trials (Y. Wang et al., 2012). However, their clinical effectiveness in smooth muscle regeneration remains unclear.
Было обнаружено, что ткань скелетных мышц является источником стволовых клеток и клеток-предшественников, таких как MSC и миогенные клетки-предшественники, происходящие из сателлитных клеток, при этом ожидается, что оба эти вида будут обладать высокой регенеративной способностью (Yin и др., 2013). В клиниках показано, что клетки, происходящих из скелетных мышц (SMDC), обогащенные по CD56-положительным клеткам, улучшают проблему недержания кала, ассоциированную со слабостью наружного сфинктера прямой кишки (A. Frudinger и др., 2010, 2015; Andrea Frudinger и др., 2018). Кроме того, было обнаружено, что клетки, происходящие из скелетных мышц, пересаженные в детрузорную мышцу мочевого пузыря, улучшают функционирование мочевого пузыря (Huard и др., 2002). Однако в отношении дифференцировки SMDC в клетки гладких мышц и их выделения или их регенеративной способности in vivo имеются ограниченные сведения (Lu и др., 2011), и ни в одном из исследований не произведена оценка терапевтического потенциала происходящих из SMDC клеток гладких мышц (индуцированных клеток гладких мышц) в отношении регенерации гладких мышц сфинктера.Skeletal muscle tissue has been found to be a source of stem and progenitor cells such as MSCs and satellite cell-derived myogenic progenitor cells, both of which are expected to have high regenerative capacity (Yin et al., 2013 ). In clinics, skeletal muscle-derived cells (SMDCs) enriched for CD56-positive cells have been shown to improve fecal incontinence problems associated with external rectal sphincter weakness (A. Frudinger et al., 2010, 2015; Andrea Frudinger et al. ., 2018). In addition, skeletal muscle-derived cells transplanted into the detrusor muscle of the bladder have been found to improve bladder function (Huard et al., 2002). However, limited knowledge is available regarding SMDC differentiation into smooth muscle cells and their release or their regenerative capacity in vivo (Lu et al., 2011), and no studies have assessed the therapeutic potential of SMDC-derived smooth muscle cells (induced cells). smooth muscle) in relation to the regeneration of sphincter smooth muscle.
Подходы с использованием клеточной терапии для регенерации ткани гладких мышц крайне желательны и основаны на применении клеток, компетентных в отношении регенерации гладких мышц. Ввиду недостатков способов из предшествующего уровня техники необходимы новые способы получения клеток гладких мышц.Cell therapy approaches for smooth muscle tissue regeneration are highly desirable and rely on the use of cells competent for smooth muscle regeneration. Due to the shortcomings of the prior art methods, new methods for obtaining smooth muscle cells are needed.
Frudinger и др. (2018) сообщают о выделении CD56+ клеток, происходящих из скелетных мышц, называемых SMDC, как показано на Фиг. 6 в работе Frudinger и др. (2018) (Andrea Frudinger и др., 2018). Среди других клеток указанные клетки характеризуются отрицательной экспрессией aSMA, CD49a и CD146, как показано на Фиг. 15 описания настоящего изобретения. Кроме того, как утверждается в работе Frudinger и др. (2018), SMDC характеризуются положительной экспрессией Рах-7 (Andrea Frudinger и др., 2018). SMDC, описанные в работе Frudinger и др. (2018), представляют собой скелетно-миогенные клетки, то есть они способны сливаться с образованием многоядерных мышечных трубочек.Frudinger et al. (2018) report the isolation of skeletal muscle-derived CD56+ cells called SMDCs, as shown in Fig. 6 in Frudinger et al. (2018) (Andrea Frudinger et al., 2018). Among other cells, these cells are characterized by negative expression of aSMA, CD49a and CD146, as shown in FIG. 15 description of the present invention. Additionally, as stated in Frudinger et al. (2018), SMDCs are characterized by positive expression of Pax-7 (Andrea Frudinger et al., 2018). SMDCs described in Frudinger et al. (2018) are skeletal myogenic cells, meaning they are capable of fusion to form multinucleated myotubes.
ЕР 2206774 А1 касается клеточных популяций, обладающих способностями к дифференцировке, которые получают путем выделения из мышечной ткани, более конкретно из ткани скелетных и/или сердечных мышц, предпочтительно из эндомизиальной и/или сердечной ткани (Marolleau и др., 2010). Клеточная популяция из ЕР 2206774 А1 содержит положительные по ALDH (альдегиддегидрогеназа) клетки и в значительной мере обладает способностью к миогенной, и/или адипогенной, и/или остеогенной дифференцировке. В частности, в ЕР 2206774 А1 описаны ALDH+/CD34- клетки, ALDH+/CD34+ клетки и SMALD (альдегиддегидрогеназа из скелетных мышц)/34+ клетки, все из которых являются CD146-, как показано в Таблицах 1 и 3 и на Фиг. 8 в ЕР 2206774 А1. Кроме того, в ЕР 2206774 А1 описаны клетки SMALD/34-. Указанные клетки являются CD146+ и компетентны в отношении слияния, как показано на Фиг. 3 в ЕР 2206774 А1.EP 2206774 A1 concerns cell populations with differentiation capabilities, which are obtained by isolation from muscle tissue, more particularly from skeletal and/or cardiac muscle tissue, preferably from endomysial and/or cardiac tissue (Marolleau et al., 2010). The cell population from EP 2206774 A1 contains ALDH (aldehyde dehydrogenase) positive cells and is largely capable of myogenic and/or adipogenic and/or osteogenic differentiation. In particular, EP 2206774 A1 describes ALDH+/CD34- cells, ALDH+/CD34+ cells and SMALD (skeletal muscle aldehyde dehydrogenase)/34+ cells, all of which are CD146-, as shown in Tables 1 and 3 and FIG. 8 in EP 2206774 A1. In addition, EP 2206774 A1 describes SMALD/34- cells. These cells are CD146+ and fusion competent, as shown in FIG. 3 in EP 2206774 A1.
В исследованиях Lecourt S. и др. (2010) показано, что скелетная мышца человека является важным источником различных клеток-предшественников с возможными перспективами для терапевтического применения. С одной стороны, описаны CD56+ клетки, представляющие собой клетки CD49a- и CD49e+. С другой стороны, описаны клетки CD56-, представляющие собой клетки CD146- и SMA- (Lecourt S. и др., 2010).Research by Lecourt S. et al. (2010) shows that human skeletal muscle is an important source of various progenitor cells with possible prospects for therapeutic use. On the one hand, CD56+ cells, which are CD49a- and CD49e+ cells, have been described. On the other hand, CD56- cells, which are CD146- and SMA- cells, have been described (Lecourt S. et al., 2010).
В работе Thurner и др. (2018) описана разработка анализа активности in vitro для клеток, происходящих из скелетных мышц человека. В частности, описано выделение как CD56+, так и CD56- клеток, происходящих из скелетных мышц (SMDC). Как показано на Фиг. 15 описания настоящего изобретения, и CD56+, и CD56- SMDC, описанные в Thurner и др. (2018), являются aSMA-, CD146- и CD49a-. Кроме того, как показано на Фиг. 2а в Thurner и др. (2018), CD56+ клетки обладают AChE (ацетилхолинэстеразной) активностью более 1000 отн. мЕд (относительных миллиединиц)/г.Thurner et al (2018) describe the development of an in vitro activity assay for human skeletal muscle-derived cells. In particular, the isolation of both CD56+ and CD56− skeletal muscle-derived cells (SMDCs) has been described. As shown in FIG. 15 of the present invention, both CD56+ and CD56- SMDCs described in Thurner et al. (2018) are aSMA-, CD146- and CD49a-. Moreover, as shown in FIG. 2a in Thurner et al. (2018), CD56+ cells have AChE (acetylcholinesterase) activity of more than 1000 rel. honey (relative milliunits)/g.
В основе настоящего изобретения лежит техническая задача предложения способа получения iSMC, которые являются безопасными и эффективными при применении в способе лечения заболевания или расстройства у субъекта. Другая техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в предложении клеток, которые являются безопасными и эффективными для применения в регенерации ткани гладких мышц.The technical object of the present invention is to provide a method for producing iSMCs that are safe and effective when used in a method of treating a disease or disorder in a subject. Another technical objective underlying the present invention is to provide cells that are safe and effective for use in smooth muscle tissue regeneration.
Эта техническая задача решается объектами изобретения, определенными в формуле изобретения.This technical problem is solved by the objects of the invention defined in the claims.
Приведенные ниже графические материалы образуют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Данное изобретение может быть лучше понято со ссылкой на один или более чем один из этих графических материалов в сочетании с подробным описанием конкретных воплощений, представленных в данной заявке.The following graphics form part of the present description and are included to further demonstrate certain aspects of the present invention. The present invention may be better understood by reference to one or more of these drawings in conjunction with the detailed description of the specific embodiments presented herein.
На Фиг. 1 показана характеристика происходящих из скелетных мышц МРС (миогенных клеток-предшественников) и MSC в соответствии с их дифференцировочным потенциалом. Дифференцировочный потенциал МРС и MSC, оцениваемый после дифференцировки in vitro в адипогенные, хондрогенные, остеогенные и скелетно-миогенные линии путем культивирования в соответствующих средах для дифференцировки и детектирования посредством окрашивания с использованием красителей масляного красного О (адипоциты), альцианового синего (хондроциты), ализаринового красного S (остеоциты) и анти-десмина/Хехста (ядра и миоциты) соответственно. Показаны репрезентативные изображения (масштабная линейка = 100 мкм) по меньшей мере трех отдельных препаратов (А). Количественное определение адипогенного, хондрогенного, остеогенного и скелетно-миогенного дифференцировочного потенциала MSC и МРС путем расчета средней интенсивности окрашивания в поле зрения для окрашивания масляным красным О, альциановым синим или ализариновым красным С (S) или путем расчета индекса слияния для по меньшей мере трех отдельных образцов соответственно (В). Данные представлены в виде среднего значения ± SD (стандартное отклонение) для МРС и MSC из по меньшей мере трех отдельных биоптатов мышц. Статистическое сравнение проводили с использованием непарных t-критериев Стьюдента (значение р<0,05 считалось значимым).In FIG. Figure 1 shows the characterization of skeletal muscle-derived MPCs (myogenic progenitor cells) and MSCs according to their differentiation potential. Differentiation potential of MPCs and MSCs assessed after in vitro differentiation into adipogenic, chondrogenic, osteogenic and skeletal myogenic lineages by culture in appropriate differentiation media and detection by staining with oil red O (adipocytes), alcian blue (chondrocytes), alizarin red S (osteocytes) and anti-desmin/Hoechst (nuclei and myocytes), respectively. Representative images (scale bar = 100 μm) of at least three individual preparations are shown (A). Quantification of adipogenic, chondrogenic, osteogenic, and skeletal myogenic differentiation potential of MSCs and MPCs by calculating the average staining intensity per field of view for oil red O, alcian blue, or alizarin red C staining (S) or by calculating the fusion index for at least three separate samples, respectively (B). Data are presented as mean ± SD (standard deviation) for MPCs and MSCs from at least three separate muscle biopsies. Statistical comparisons were performed using unpaired Student's t tests (p value <0.05 was considered significant).
На Фиг. 2 показана характеристика происходящих из скелетных мышц МРС и MSC и полученных из них iSMC по экспрессии маркеров их клеточной поверхности. Экспрессию маркеров линий мезенхимальных (CD105, 90, 73), миогенных (CD56), гемопоэтических (CD34) клеток и клеток гладких мышц (CD146 и CD49a) на происходящих из скелетных мышц МРС и MSC, а также полученных из них iSMC для каждого из по меньшей мере трех отдельных биоптатов скелетных мышц человека, оценивали методом проточной цитометрии. В качестве контроля продемонстрирована экспрессия маркеров линий клеток гладких мышц CD146 и CD49a в популяциях клеток гладких мышц, происходящих из мочевого пузыря человека (hBd-SMC). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (стандартная ошибка среднего).In FIG. Figure 2 shows the characterization of skeletal muscle-derived MPCs and MSCs and iSMCs derived from them by the expression of their cell surface markers. Expression of mesenchymal (CD105, 90, 73), myogenic (CD56), hematopoietic (CD34) and smooth muscle cell lineage markers (CD146 and CD49a) on skeletal muscle-derived MPCs and MSCs, as well as iSMCs derived from them, for each at least three separate human skeletal muscle biopsies were assessed by flow cytometry. As a control, expression of smooth muscle cell lineage markers CD146 and CD49a was demonstrated in human bladder-derived smooth muscle cell (hBd-SMC) populations. Data are presented as mean ± SEM (standard error of the mean).
На Фиг. 3 показаны результаты экспрессии внутриклеточных маркеров в SMDC (МРС и MSC) и iSMC. Детектирование общих миогенных маркеров (десмина) и миогенных маркеров гладких мышц (aSMA, смутелина) в МРС и MSC, а также в полученных из них iSMC, осуществляли посредством иммуноцитохимии, и показаны репрезентативные изображения (А) (масштабная линейка = 100 мкм). Процентное содержание клеток, положительных в отношении aSMA, смутелина или десмина, среди МРС, MSC и полученных из них iSMC оценивали путем количественного определения экспрессирующих соответствующий маркер клеток на полученных с использованием иммуноцитохимии изображениях культур из по меньшей мере трех отдельных биоптатов мышц человека (В). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM.In FIG. Figure 3 shows the expression results of intracellular markers in SMDCs (MRCs and MSCs) and iSMCs. Detection of general myogenic markers (desmin) and smooth muscle myogenic markers (aSMA, smoothelin) in MPCs and MSCs, as well as iSMCs derived from them, was performed by immunocytochemistry, and representative images are shown (A) (scale bar = 100 μm). The percentage of cells positive for aSMA, smoothelin, or desmin among MPCs, MSCs, and their derived iSMCs was assessed by quantifying cells expressing the corresponding marker in immunocytochemically imaged cultures from at least three separate human muscle biopsies (B). Data are presented as mean ± SEM.
На Фиг. 4 показаны изменения в экспрессии генов в ходе трансдифференцировки SMDC (МРС и MSC) в iSMC. Изменения в экспрессии генов оценивали при помощи микроматричного анализа от MSC и МРС до MSC-iSMC и MPC-iSMC, культивированных в среде для роста (MSC и МРС) или среде для дифференцировки гладких мышц (MSC-iSMC и MPC-iSMC) в течение 6 суток соответственно, полученных из двух отдельных биоптатов мышц человека. Кластер генов, одинаковым образом положительно регулируемых (А) или отрицательно регулируемых (В) как в MSC, так и в МРС в ходе дифференцировки в iSMC, полученный с помощью кластеризации методом k-средних, изображен на тепловых картах. Звездочками (*) отмечены гены, которые были либо положительно (log2 FC (кратность изменений) ≥1), либо отрицательно регулируемыми (log2 FC≤-1) в обоих типах клеток. Статистическое сравнение проводили с использованием критерия хи-квадрат, считая значимым р-значение ниже 0,05. Результаты изменения экспрессии генов показаны на Фиг. 4 (С).In FIG. Figure 4 shows changes in gene expression during transdifferentiation of SMDCs (MRCs and MSCs) into iSMCs. Changes in gene expression were assessed by microarray analysis from MSC and MPC to MSC-iSMC and MPC-iSMC cultured in growth medium (MSC and MPC) or smooth muscle differentiation medium (MSC-iSMC and MPC-iSMC) for 6 days, respectively, obtained from two separate human muscle biopsies. The cluster of genes similarly positively regulated (A) or negatively regulated (B) in both MSCs and MPCs during differentiation into iSMCs obtained using k-means clustering is depicted in heat maps. Asterisks (*) indicate genes that were either up-regulated (log2 FC (fold change) ≥1) or down-regulated (log2 FC≤-1) in both cell types. Statistical comparisons were performed using the chi-square test, considering a p-value below 0.05 to be significant. The results of gene expression changes are shown in Fig. 4 (C).
На Фиг. 5 показана способность МРС и iSMC к слиянию. Образование мышечных трубочек (способность к слиянию) наблюдали с использованием флуоресцентной микроскопии после окрашивания красителем Хехст33342 для визуализации ядер. Основываясь на изображениях, определяли индекс слияния (FI) (А) и количество ядер на трубочку (В). Клетки по меньшей мере с 3 ядрами принимали за трубочки. Проводили сравнение результатов измерений между МРС и происходящими из них iSMC.In FIG. Figure 5 shows the ability of MPC and iSMC to merge. Myotube formation (ability to fuse) was observed using fluorescence microscopy after staining with Hoechst33342 to visualize the nuclei. Based on the images, the fusion index (FI) (A) and the number of nuclei per tube (B) were determined. Cells with at least 3 nuclei were considered to be tubules. The measurement results were compared between MPCs and iSMCs derived from them.
На Фиг. 6 показано образование функциональных ионных каналов в ходе трансдифференцировки МРС в iSMC. Анализ зависящих от напряжения входящих кальциевых (А) и выходящих калиевых токов (В) в МРС и происходящих из них iSMC, а также в происходящих из мочевого пузыря клетках гладких мышц (hBd-SMC). Кривые зависимости импеданс-напряжение (I-V) для каждой из по меньшей мере трех клеток МРС, iSMC (происходящих из МРС) и hBd-SMC, демонстрируют наличие функциональных Cav (А) и Kv (В) каналов в iSMC (происходящих из МРС) и в hBd-SMC, но не в МРС.In FIG. Figure 6 shows the formation of functional ion channels during transdifferentiation of MPCs into iSMCs. Analysis of voltage-dependent inward calcium (A) and outward potassium currents (B) in MPCs and their-derived iSMCs, as well as in bladder-derived smooth muscle cells (hBd-SMCs). Impedance-voltage (I-V) curves for each of at least three MPC cells, iSMC (MRC-derived) and hBd-SMC, demonstrate the presence of functional Cav (A) and Kv (B) channels in iSMC (MRC-derived) and in hBd-SMC but not in MPC.
На Фиг. 7 показана сократительная способность SMDC и iSMC в решетках коллагенового геля. Количественное определение сократительной способности SMDC (MSC и МРС), происходящих из них iSMC и происходящих из мочевого пузыря клеток гладких мышц (hBd-SMC) проводили при помощи сокращения решетки коллагенового геля. Сокращение геля, выраженное в процентном отношении от исходного размера, в течение 48 часов для клеток, полученных на стадии (а) по настоящему изобретению (МРС или MSC), и клеток, полученных путем трансдифференцировки в iSMC на стадии (б) по настоящему изобретению, а также контрольных клеток гладких мышц мочевого пузыря (hBd-SMC), показано в виде гистограммы (А). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для препаратов клеток из каждого из по меньшей мере трех отдельных биоптатов мышц человека или анализа hBd-SMC. Репрезентативные стереомикроскопические изображения коллагеновых гелей со встроенными МРС и MSC и происходящими из каждого из них iSMC, а также hBd-SMC в лунках 24-луночного планшета (В).In FIG. Figure 7 shows the contractility of SMDCs and iSMCs in collagen gel lattices. Quantification of contractility of SMDCs (MSCs and MPCs), their-derived iSMCs, and bladder-derived smooth muscle cells (hBd-SMCs) was performed using collagen gel lattice contraction. The gel reduction, expressed as a percentage of the original size, over 48 hours for cells obtained in step (a) of the present invention (MRC or MSC) and cells obtained by transdifferentiation into iSMC in step (b) of the present invention, and control bladder smooth muscle cells (hBd-SMC), shown as a histogram (A). Data are presented as mean ± SEM of cell preparations from each of at least three separate human muscle biopsies or hBd-SMC assays. Representative stereomicroscope images of collagen gels with embedded MPCs and MSCs and iSMCs derived from each, as well as hBd-SMCs in the wells of a 24-well plate (B).
На Фиг. 8 показан фенотип клеток гладких мышц iSMC, происходящих из mMPC, и их приживление в ткани гладких мышц in vivo. Процентное содержание десмин- и aSMA-положительных клеток в iSMC, происходящих из мышиных МРС (mMPC), показано в виде гистограммы (А). Детектирование сигнала флуоресценции от флуоресцентных гранул и локализации экспрессии трансгена TdTomato в интактной мышце сфинктера привратника посредством визуализации in vivo (В). Детектирование экспрессии белка альфа-актина гладких мышц (aSMA), экспрессии TdTomato в привитых iSMC и наложение (MERGE) TdTomato и белка aSMA осуществляли посредством иммуногистохимии в гистологических срезах сфинктера привратника через 12 недель после имплантации. Контрастное окрашивание ядер для каждого изображения выполняли с использованием DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол). Показаны репрезентативные изображения для n=8 подвергнутых инъекции мышей (С).In FIG. Figure 8 shows the phenotype of mMPC-derived iSMC smooth muscle cells and their engraftment into smooth muscle tissue in vivo. The percentage of desmin- and aSMA-positive cells in mouse MPC-derived iSMCs (mMPCs) is shown as a histogram (A). Detection of fluorescence signal from fluorescent beads and localization of TdTomato transgene expression in intact pyloric sphincter muscle by in vivo imaging (B). Detection of alpha smooth muscle actin (aSMA) protein expression, TdTomato expression in grafted iSMCs, and superposition (MERGE) of TdTomato and aSMA protein were performed by immunohistochemistry in histological sections of the pyloric sphincter at 12 weeks post-implantation. Nuclear counterstaining for each image was performed using DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole). Representative images for n=8 injected mice are shown (C).
На Фиг. 9 показаны полученные с помощью светового и сканирующего электронного микроскопа изображения колец ткани. Выполненные с помощью светового микроскопа изображения кольца ткани, полученной в результате 3D культивирования iSMC, происходящих из МРС, расположенного вокруг центрального положения агарозной матрицы, при разном увеличении (А и В). Выполненные с помощью сканирующего электронного микроскопа изображения кольца ткани, полученной в результате 3D культивирования iSMC, происходящих из МРС, при разном увеличении (С и D).In FIG. Figure 9 shows light and scanning electron microscope images of tissue rings. Light microscope images of a ring of tissue obtained from 3D culture of MPC-derived iSMCs arranged around a central position of the agarose matrix at different magnifications (A and B). Scanning electron microscope images of a ring of tissue obtained from 3D culture of MPC-derived iSMCs at different magnifications (C and D).
На Фиг. 10 показана экспрессия сократительных белков в происходящих из SMDC и iSMC кольцах ткани с использованием иммунофлуоресценции. Иммунофлуоресцентное окрашивание общих миогенных маркеров (десмин) и миогенных маркеров гладких мышц (aSMA) совместно с контрастным окрашиванием (Хехст) ядер проводили на криосрезах колец ткани, полученной в результате 3D культивирования МРС, а также происходящих из них iSMC.In FIG. 10 shows the expression of contractile proteins in SMDC- and iSMC-derived tissue rings using immunofluorescence. Immunofluorescence staining of general myogenic markers (desmin) and myogenic smooth muscle markers (aSMA) together with counterstaining (Hoechst) of nuclei was performed on cryosections of tissue rings obtained as a result of 3D cultivation of MPCs, as well as iSMCs derived from them.
На Фиг. 11 показаны полученные с помощью трансмиссионного электронного микроскопа изображения колец ткани.In FIG. Figure 11 shows transmission electron microscope images of tissue rings.
Изображения, полученные с использованием трансмиссионной электронной микроскопии ультратонких срезов колец ткани, полученной в результате 3D культивирования iSMC, на которых показаны кавеолы (острие стрелки) на клеточной мембране двух соседних клеток (А и В), многочисленные нитеобразные структуры в цитоплазме (С) и аккумулированные в плотных тельца филаменты (стрелки) (D).Transmission electron microscopy images of ultrathin sections of tissue rings obtained from 3D iSMC culture, showing caveolae (arrowhead) on the cell membrane of two adjacent cells (A and B), numerous filamentous structures in the cytoplasm (C), and accumulated in dense bodies there are filaments (arrows) (D).
На Фиг. 12 приведены результаты количественного определения изменений в экспрессии генов в ходе трансдифференцировки SMDC (МРС и MSC) в iSMC. Изменения в экспрессии генов оценивали посредством микроматричного анализа от MSC и МРС до MSC-iSMC и MPC-iSMC, культивированных в среде для роста (MSC и МРС) или среде для дифференцировки гладких мышц (MSC-iSMC и MPC-iSMC) в течение 6 суток соответственно, полученных из двух отдельных биоптатов мышц человека. Чтобы сравнить дифференцировку гладких мышц для MSC и МРС, показаны log2-кратные изменения ассоциированных с гладкими мышцами генов в образцах MSC против MSC-iSMC (MSC) и МРС против MPC-iSMC (МРС). Звездочками (*) отмечены гены, представляющие собой положительно (log2≥1) или отрицательно регулируемые гены (log2≤-1).In FIG. Figure 12 shows the results of quantitative determination of changes in gene expression during transdifferentiation of SMDC (MRC and MSC) into iSMC. Changes in gene expression were assessed by microarray analysis from MSC and MPC to MSC-iSMC and MPC-iSMC cultured in growth medium (MSC and MPC) or smooth muscle differentiation medium (MSC-iSMC and MPC-iSMC) for 6 days respectively, obtained from two separate human muscle biopsies. To compare smooth muscle differentiation between MSC and MPC, log2-fold changes in smooth muscle-associated genes are shown in MSC versus MSC-iSMC (MSC) and MPC versus MPC-iSMC (MPC) samples. Asterisks (*) indicate genes that are positively (log2≥1) or negatively regulated genes (log2≤-1).
На Фиг. 13 показаны результаты анализа методом проточной цитометрии окрашенных с использованием анти-CD49e антитела и окрашенных с использованием изотипического контроля мышиных MPC-iSMC в соответствии с примером 15.In FIG. 13 shows the results of flow cytometry analysis of anti-CD49e antibody stained and isotype control stained mouse MPC-iSMCs according to Example 15.
Точечные диаграммы для IgG1-изотипического контроля (А) и анти-CD49e (В) положительных MPC-iSMC, демонстрирующие наличие 0,14% контрольных и 9,5% CD49e-положительных клеток соответственно.Dot plots for IgG1 isotype control (A) and anti-CD49e (B) positive MPC-iSMCs showing the presence of 0.14% control and 9.5% CD49e-positive cells, respectively.
На Фиг. 14 показаны результаты анализа AChE (ацетилхолинэстеразной) и CK (креатинкиназной) активности МРС и MPC-iSMC, где ферментативные активности измеряли до и после культивирования клеток в среде для дифференцировки скелетных мышц (SKDiff).In FIG. 14 shows the results of the AChE (acetylcholinesterase) and CK (creatine kinase) activity assays of MPCs and MPC-iSMCs, where enzymatic activities were measured before and after cell culture in skeletal muscle differentiation medium (SKDiff).
Проводили измерение и сравнение AChE активности (А) и CK активности (В) в МРС и MPC-iSMC, в каждом случае до и после культивирования в среде для дифференцировки скелетных мышц (SKDiff) в течение 6 суток. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для клеток, полученных из по меньшей мере трех отдельных биоптатов мышц человека. Статистический анализ проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента, считая значение р<0,05 значимым.AChE activity (A) and CK activity (B) in MPCs and MPC-iSMCs were measured and compared, in each case before and after culture in skeletal muscle differentiation medium (SKDiff) for 6 days. Data are presented as mean ± SEM of cells obtained from at least three separate human muscle biopsies. Statistical analysis was performed using paired Student's t test, considering p < 0.05 as significant.
На Фиг. 15 приведено общее описание свойств и экспрессии маркеров в клетках отдельных типов, описанных в данной заявке. CD56+ SMDC и CD56- SMDC (Thurner и др., 2018) и SMDC (Frudinger и др., 2018) получали, как описано в примере 18. МРС и MSC получали, как описано в примере 1. MPC-iSMC и MSC-iSMC получали, как описано в примере 2. Экспрессия определенного маркера указана знаком «+», если по меньшей мере 50% клеток тестируемой популяции клеток экспрессировали соответствующий клеточный маркер. Экспрессия определенного маркера указана знаком «-», если менее 50% клеток тестируемой популяции клеток экспрессировали соответствующий клеточный маркер. AChE ферментативная активность определенной популяции клеток указана как «+», если данная популяция клеток обладает AChE активностью по меньшей мере 1000 отн. мЕд./мг белка, измеренной согласно примеру 17. AChE ферментативная активность определенной популяции клеток указана как «-», если данная популяция клеток обладает AChE активностью менее 1000 отн. мЕд./мг белка, измеренной согласно примеру 17. CK ферментативная активность определенной популяции клеток указана как «+», если данная популяция клеток обладает CK активностью по меньшей мере 100 отн. мЕд./мг белка, измеренной согласно примеру 17. CK ферментативная активность определенной популяции клеток указана как «-», если данная популяция клеток обладает CK активностью менее 100 отн. мЕд./мг белка, измеренной согласно примеру 17.In FIG. 15 provides a general description of the properties and expression of markers in the individual cell types described in this application. CD56+ SMDC and CD56- SMDC (Thurner et al., 2018) and SMDC (Frudinger et al., 2018) were prepared as described in Example 18. MPC and MSC were prepared as described in Example 1. MPC-iSMC and MSC-iSMC was prepared as described in Example 2. Expression of a particular marker is indicated by a “+” if at least 50% of the cells in the cell population tested expressed the corresponding cellular marker. Expression of a particular marker is indicated with a “-” if less than 50% of the cells in the cell population tested expressed the corresponding cellular marker. The AChE enzymatic activity of a given cell population is indicated as “+” if that cell population has an AChE activity of at least 1000 rel. honey/mg protein, measured according to example 17. AChE enzymatic activity of a certain cell population is indicated as “-” if this cell population has an AChE activity of less than 1000 rel. mU/mg protein measured according to example 17. CK enzymatic activity of a certain cell population is indicated as “+” if this cell population has a CK activity of at least 100 rel. honey/mg protein, measured according to example 17. CK enzymatic activity of a certain cell population is indicated as “-” if this cell population has a CK activity of less than 100 rel. honey/mg protein measured according to example 17.
Использование артиклей "а" и "an" в сочетании с термином "содержащий" в формуле изобретения и/или в описании может означать «один», но также согласуется со значением «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более чем один».The use of the articles "a" and "an" in combination with the term "comprising" in the claims and/or description may mean "one", but is also consistent with the meaning "one or more", "at least one" and "one or more than one."
Термин «примерно» означает, что включены указанное значение плюс или минус 5% от указанного значения, либо стандартная ошибка для измерений данного значения.The term “about” means that the specified value plus or minus 5% of the specified value, or the standard error for measurements of that value, are included.
Термин «анальное недержание», использованный в данном описании, относится к любой нежелательной потере содержимого кишечника через анус, например газов, жидких или твердых фекалий. Термин включает в себя все три степени тяжести: степень 1 = только газообразные, степень 2 = жидкие и мягкие фекалии, степень 3 = твердые, сформированные фекалии.The term "anal incontinence" as used herein refers to any unwanted loss of intestinal contents through the anus, such as gas, liquid or solid feces. The term includes all three grades of severity: grade 1 = gaseous only, grade 2 = liquid and soft feces, grade 3 = hard, formed feces.
Термин «сфинктер прямой кишки» или «аппарат сфинктера прямой кишки», использованный в данном описании, относится, в частности к Musculus sphincter ani externus и к Musculus puborectalis как части Musculus levator ani. Однако он также включает М. pubococcygeus, М. ischiococcygeus,M. iliococcygeus nN. pudendus.The term "rectal sphincter" or "rectal sphincter apparatus" as used herein refers in particular to the Musculus sphincter ani externus and the Musculus puborectalis as part of the Musculus levator ani. However, it also includes M. pubococcygeus, M. ischiococcygeus, M. iliococcygeus nN. Pudendus.
Термин «клетки, происходящие из скелетных мышц» или «SMDC» относится к клеткам, полученным из ткани скелетных мышц, содержащей компетентные в отношении слияния клетки, например миобласты, или некомпетентные в отношении слияния клетки, например мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, которые могут представлять собой первичные клетки и/или культивированные in vitro клетки и, альтернативно, к другим клеткам с миогенным или мультидифференцировочным потенциалом (например, из подвергнутой липосакции ткани или других содержащих стволовые клетки тканей, таких как костный мозг). Этот термин также включает клетки, происходящие из жировой ткани, которые могут быть выделены и использованы для дифференцировки в клетки гладких мышц. Термин «клетки, происходящие из скелетных мышц» или «SMDC» также относится к популяции клеток, выделенной из мышечной ткани.The term “skeletal muscle-derived cells” or “SMDC” refers to cells derived from skeletal muscle tissue containing fusion-competent cells, such as myoblasts, or fusion-incompetent cells, such as multipotent mesenchymal stromal cells, which may be primary cells and/or in vitro cultured cells and, alternatively, to other cells with myogenic or multidifferentiation potential (eg, from liposuction tissue or other stem cell-containing tissues such as bone marrow). The term also includes adipose tissue-derived cells that can be isolated and used to differentiate into smooth muscle cells. The term "skeletal muscle-derived cells" or "SMDC" also refers to a population of cells isolated from muscle tissue.
Термин «клетки гладких мышц, происходящие из мочевого пузыря человека (hBd-SMC)» относится к популяциям клеток, содержащим клетки гладких мышц из мочевого пузыря человека. hBd-SMC имеются в продаже у PromoCell® (номер по каталогу: С-12571) и демонстрируют фенотипические и функциональные характеристики клеток гладких мышц, которые в настоящем изобретении предполагается получить посредством iSMC, происходящих из клеток скелетных мышц.The term “human bladder-derived smooth muscle cells (hBd-SMC)” refers to cell populations containing smooth muscle cells from the human bladder. hBd-SMCs are commercially available from PromoCell® (catalog number: C-12571) and exhibit the phenotypic and functional characteristics of smooth muscle cells, which the present invention proposes to obtain through skeletal muscle cell-derived iSMCs.
Термин «инъекция», использованный в данном описании, относится к впрыскиванию раствора для инъекций, содержащего упомянутые выше клетки, из устройства для инъекции в конкретное место в организме человека, в частности в мышечную ткань, обеспечивающую анальное удерживание или рядом с ней. Процесс инъекции может быть, без ограничения этим, статическим, т.е. устройство для инъекции остается в достигнутом положении. Альтернативно, процесс инъекции является динамическим. Например, в некоторых воплощениях настоящего изобретения инъекция происходит одновременно с отведением устройства для инъекции от места инъекции.The term "injection" as used herein refers to the injection of an injection solution containing the above-mentioned cells from an injection device into a specific location in the human body, particularly into or adjacent to anal continence muscle tissue. The injection process may, without limitation, be static, i.e. the injection device remains in the achieved position. Alternatively, the injection process is dynamic. For example, in some embodiments of the present invention, the injection occurs simultaneously with the retraction of the injection device from the injection site.
Термин «место инъекции», использованный в данном описании, относится к месту в организме человека, такому как место, расположенное близко к мышечной ткани, обеспечивающей анальное удерживание, или являющееся такой мышечной тканью, где начинается процесс инъекции. Место инъекции не обязательно совпадает с местом, где процесс инъекции заканчивается.The term "injection site" as used herein refers to a location in the human body, such as a location close to or being the muscle tissue where the injection process begins. The injection site is not necessarily the same as where the injection process ends.
Термин «устройство для инъекции», использованный в данном описании, относится к любому устройству, подходящему для проникновения в ткань человека с целью достижения интересующего места инъекции и способного доставлять растворы, в частности растворы, содержащие происходящие из мышц клетки, в интересующее место инъекции.The term "injection device" as used herein refers to any device suitable for penetrating human tissue to reach an injection site of interest and capable of delivering solutions, particularly solutions containing muscle-derived cells, to the injection site of interest.
Термин «недержание фекалий», использованный в данном описании, относится только к нежелательной потере жидкости или сформированных фекалий через анус.The term "fecal incontinence" as used herein refers only to the unwanted loss of fluid or formed feces through the anus.
Термин «пассивное недержание», использованный в данном описании, относится к утрате сенсорного распознавания потери фекалий. Он включает низкие значения базового давления в анальном канале вследствие дефектов гладкой мышцы внутреннего сфинктера прямой кишки и/или отсутствие сенсорной способности у слизистой оболочки анального канала и прямой кишки.The term "passive incontinence" as used herein refers to the loss of sensory recognition of loss of feces. It involves low baseline anal pressures due to defects in the smooth muscle of the internal rectal sphincter and/or lack of sensory ability in the anal and rectal mucosa.
Термин «CD56+» или «CD56-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD56. Термины «CD56+» или «CD56-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD56.The term “CD56+” or “CD56-positive” as used herein refers to a cell expressing the cellular marker CD56. The terms "CD56+" or "CD56-positive" may also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cell marker CD56 .
Термин «CD56-» или «CDB56-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD56. Термины «CD56-» или «CD56-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD56.The term "CD56-" or "CDB56-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell marker CD56. The terms "CD56-" or "CD56-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cell marker CD56.
Термин «мультипотентный», использованный в данном описании, относится к дифференцировочному потенциалу мезенхимальных клеток, характеризуемых дифференцировочным потенциалом in vitro по меньшей мере в отношении адипогенных, хондрогенных и остеогенных линий.The term "multipotent" as used herein refers to the differentiation potential of mesenchymal cells characterized by in vitro differentiation potential of at least adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineages.
Термин «олигопотентный», использованный в данном описании, относится к дифференцировочному потенциалу мезенхимальных клеток, характеризуемых дифференцировочным потенциалом in vitro, ограниченным миогенными линиями, такими как клетки гладких, поперечнополосатых и сердечных мышц.The term "oligopotent" as used herein refers to the differentiation potential of mesenchymal cells characterized by in vitro differentiation potential limited to myogenic lineages such as smooth, striated and cardiac muscle cells.
Термин «мезенхимальные клетки», использованный в данном описании, относится к клеткам, положительным по CD105, CD90 и CD73 и отрицательным по CD14, CD19, CD34, CD45 и HLA-DR (человеческие лейкоцитарные антигены, сублокус DR) (МНСП (главный комплекс гистосовместимости II класса)).The term "mesenchymal cells" as used herein refers to cells positive for CD105, CD90 and CD73 and negative for CD14, CD19, CD34, CD45 and HLA-DR (human leukocyte antigens, DR sublocus) (MHC (major histocompatibility complex) II class)).
Термин «CD34+» или «CD34-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD34. Термины «CD34+» или «CD34-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD34.The term "CD34+" or "CD34-positive" as used herein refers to a cell expressing the cell marker CD34. The terms “CD34+” or “CD34-positive” can also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cell marker CD34.
Термин «CD34-» или «CD34-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD34. Термины «CD34-» или «CD34-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD34. В особо предпочтительном воплощении термин «CD34-» или «CD34-отрицательная» также может быть использован для популяции клеток, содержащей разные клетки, если предпочтительно не более 19, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD34.The term "CD34-" or "CD34-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell marker CD34. The terms "CD34-" or "CD34-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cell marker CD34. In a particularly preferred embodiment, the term "CD34-" or "CD34-negative" may also be used for a cell population comprising different cells if preferably no more than 19, 10, 5, 4, 3, 2, 1 or 0 percent of the cell population express cell marker CD34.
Термин «CD146+» или «CD146-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD146. Термины «CD146+» или «CD146-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD146.The term “CD146+” or “CD146-positive” as used herein refers to a cell expressing the cell marker CD146. The terms "CD146+" or "CD146-positive" may also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cell marker CD146 .
Термин «CD146-» или «CD146-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD146. Термины «CD146-» или «CD46-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD146.The term "CD146-" or "CD146-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell marker CD146. The terms "CD146-" or "CD46-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cell marker CD146.
Термин «CD49a+» или «CD49a-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD49a. Термины «CD49a+» или «CD49a-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD49a.The term “CD49a+” or “CD49a-positive” as used herein refers to a cell expressing the cell marker CD49a. The terms "CD49a+" or "CD49a-positive" can also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cell marker CD49a .
Термин «CD49a-» или «CD49a-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD49a. Термины «CD49a-» или «CD49a-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD49a.The term "CD49a-" or "CD49a-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell marker CD49a. The terms "CD49a-" or "CD49a-negative" can also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cell marker CD49a.
Термин «CD73+» или «CD73-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD73. Термины «CD73+» или «CD73-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD73.The term “CD73+” or “CD73-positive” as used herein refers to a cell expressing the cell marker CD73. The terms "CD73+" or "CD73-positive" may also be used for a cell population containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, or 99 percent of the cell population express the cell marker CD73 .
Термин «CD73-» или «CD73-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD73. Термины «CD73-» или «CD73-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD73.The term "CD73-" or "CD73-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell marker CD73. The terms "CD73-" or "CD73-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cell marker CD73.
Термин «CD90+» или «CD90-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD90. Термины «CD90+» или «CD90-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD90.The term "CD90+" or "CD90-positive" as used herein refers to a cell expressing the cell marker CD90. The terms "CD90+" or "CD90-positive" may also be used for a cell population comprising different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, or 99 percent of the cell population express the CD90 cell marker .
Термин «CD90-» или «CD90-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD90. Термины «CD90-» или «CD90-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD90.The term "CD90-" or "CD90-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell marker CD90. The terms "CD90-" or "CD90-negative" can also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cell marker CD90.
Термин «CD105+» или «CD105-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD105. Термины «CD105+» или «CD105-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD105.The term "CD105+" or "CD105-positive" as used herein refers to a cell expressing the cell marker CD105. The terms "CD105+" or "CD105-positive" may also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cell marker CD105 .
Термин «CD105-» или «CD105-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD105. Термины «CD105-» или «CD105-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD105.The term "CD105-" or "CD105-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell marker CD105. The terms "CD105-" or "CD105-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cell marker CD105.
Термин «aSMA+» или «aSMA-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер aSMA. Термины «aSMA+» или «aSMA-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер aSMA.The term "aSMA+" or "aSMA-positive" as used herein refers to a cell expressing the cellular marker aSMA. The terms "aSMA+" or "aSMA-positive" may also be used for a cell population containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, or 99 percent of the cell population express the aSMA cell marker .
Термин «aSMA-» или «aSMA-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер aSMA. Термины «aSMA-» или «aSMA-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер aSMA.The term "aSMA-" or "aSMA-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cellular marker aSMA. The terms "aSMA-" or "aSMA-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cellular marker aSMA.
Термин «десмин-положительная» или «десмин+», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер десмин. Термин «десмин-положительная» также может быть использован для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер десмин.The term “desmin-positive” or “desmin+” as used herein refers to a cell expressing the cellular marker desmin. The term “desmin-positive” can also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cell marker desmin.
Термин «десмин-отрицательная» или «десмин-», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер десмин. Термин «десмин-отрицательная» также может быть использован для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер десмин.The term “desmin-negative” or “desmin-” as used herein refers to a cell that does not express the cell marker desmin. The term "desmin negative" may also be used for a population of cells containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1, or 0 percent of the population cells express the cellular marker desmin.
Термин «смутелин-положительная» или «смутелин+», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер смутелин. Термин «смутелин-положительная» также может быть использован для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер смутелин.The term “smutelin-positive” or “smutelin+” as used herein refers to a cell expressing the cell marker smoothelin. The term "smutelin-positive" can also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cell marker smoothelin.
Термин «смутелин-отрицательная» или «смутелин-», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер смутелин. Термин «смутелин-отрицательная» также может быть использован для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер смутелин.The term “smutelin-negative” or “smutelin-” as used herein refers to a cell that does not express the cell marker smoothelin. The term "smutelin negative" may also be used for a population of cells containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1, or 0 percent of the population cells express the cell marker smoothelin.
Термин «компетентная в отношении слияния» или «скелетно-миогенная», использованный в данном описании, относится к клеткам, способным сливаться в многоядерные мышечные трубочки по меньшей мере с 50, 60, 70, 80, 90 или 100 процентами ядер внутри многоядерных мышечных трубочек после культивирования в средах для дифференцировки скелетных мышц в течение 5-7 суток.The term "fusion competent" or "skeletal myogenic" as used herein refers to cells capable of fusing into multinucleated myotubes with at least 50, 60, 70, 80, 90, or 100 percent of the nuclei within the multinucleated myotubes. after cultivation in media for skeletal muscle differentiation for 5-7 days.
Термин «некомпетентная в отношении слияния» или «не скелетно-миогенная», использованный в данном описании, относится к клеткам, не способным сливаться в многоядерные мышечные трубочки меньше чем с 50% или не более чем с 49, 30, 20, 10 или 0 процентов ядер внутри многоядерных мышечных трубочек после культивирования в средах для дифференцировки скелетных мышц в течение 5-7 суток.The term "fusion-incompetent" or "non-skeletal myogenic" as used herein refers to cells that fail to fuse into multinucleated myotubes with less than 50% or no more than 49, 30, 20, 10, or 0 percent of nuclei inside multinucleated myotubes after cultivation in skeletal muscle differentiation media for 5-7 days.
Термин «среды для дифференцировки скелетных мышц», использованный в данном описании, относится к средам для культивирования клеток, которые индуцируют слияние в многоядерные компетентные в отношении слияния клетки или миогенные клетки, такие как, например, миобласты. Однако указанный термин также относится к среде для культивирования клеток, не содержащей каких-либо веществ, необходимых для индуцирования слияния, в случае, если многоядерные компетентные в отношении слияния клетки или миогенные клетки способны сливаться без соответствующего индуцирования.The term “skeletal muscle differentiation media” as used herein refers to cell culture media that induce fusion into multinucleated fusion competent cells or myogenic cells, such as, for example, myoblasts. However, the term also refers to a cell culture medium that does not contain any substances necessary to induce fusion in the event that multinucleated fusion competent cells or myogenic cells are capable of fusion without appropriate induction.
Термин «среды для дифференцировки гладких мышц», использованный в данном описании, относится к средам для культивирования клеток, которые индуцируют трансдифференцировку клеток с получением гладкомышечного фенотипа. Однако указанный термин также относится к среде для культивирования клеток, не содержащей каких-либо веществ, необходимых для индуцирования трансдифференцировки, в случае, если клетки способны к трансдифференцировке без соответствующего индуцирования.The term “smooth muscle differentiation media” as used herein refers to cell culture media that induce cell transdifferentiation to a smooth muscle phenotype. However, the term also refers to a cell culture medium that does not contain any substances necessary to induce transdifferentiation in case the cells are capable of transdifferentiation without appropriate induction.
Термин «среда для роста клеток», использованный в данном описании, относится к любой среде, подходящей для инкубации клеток млекопитающих, таких как SMDC, которая способствует прикреплению указанных клеток млекопитающих на поверхность резервуара для инкубации, а также их пролиферации.The term “cell growth medium” as used herein refers to any medium suitable for the incubation of mammalian cells, such as SMDC, that promotes the attachment of said mammalian cells to the surface of the incubation reservoir, as well as their proliferation.
Термин «сократительный», использованный в данном описании, относится к сокращению решетки коллагенового геля, составляющему по меньшей мере 40% от первоначального размера геля, за 48 часов.The term "contractile" as used herein refers to a contraction of the collagen gel lattice of at least 40% of the original gel size in 48 hours.
Термин «несократительный», использованный в данном описании, относится к сокращению решетки коллагенового геля, составляющему менее 40% от первоначального размера геля, за 48 часов.The term "non-contractile" as used herein refers to a contraction of the collagen gel lattice of less than 40% of the original gel size in 48 hours.
Термин «TGF-бета» используется для обозначения трансформирующего ростового фактора-бета, который представляет собой многофункциональный цитокин, принадлежащий суперсемейству трансформирующих ростовых факторов, которое включает в себя три разных изоформы (TGF-β 1, 2 и 3) и многие другие сигнальные белки, продуцируемые всеми линиями лейкоцитов. Термин «TGF-бета» используется как синоним терминам «TGF-β», «TGF-b», «TGFb» и «TGFB».The term "TGF-beta" is used to refer to transforming growth factor-beta, which is a multifunctional cytokine belonging to the transforming growth factor superfamily, which includes three different isoforms (TGF-β 1, 2 and 3) and many other signaling proteins, produced by all leukocyte lines. The term "TGF-beta" is used interchangeably with the terms "TGF-β", "TGF-b", "TGFb" and "TGFB".
Термин «AChE-положительная» или «AChE+», использованный в данном описании, относится к ацетилхолинэстеразной ферментативной активности, составляющей по меньшей мере 1*103 отн. мЕд. на мг клеточного белка, измеренной в клетках, которые культивировали в среде для дифференцировки гладких мышц, например, как описано в примерах в данной заявке. Альтернативно, ацетилхолинэстеразную ферментативную активность можно определить при помощи любого теста, известного в данной области техники, как описано, например, в работе Thurner и др., 2018.The term “AChE-positive” or “AChE+” as used herein refers to acetylcholinesterase enzyme activity of at least 1*10 3 rel. honey. per mg of cellular protein, measured in cells that were cultured in smooth muscle differentiation medium, for example, as described in the examples in this application. Alternatively, acetylcholinesterase enzymatic activity can be determined using any test known in the art, as described, for example, in Thurner et al., 2018.
Термин «AChE-отрицательная» или «AChE-», использованный в данном описании, относится к ацетилхолинэстеразной ферментативной активности, составляющей менее 1*103 отн. мЕд. на мг клеточного белка, измеренной в клетках, которые культивировали в среде для дифференцировки гладких мышц, как описано, например, в примерах в данной заявке. Альтернативно, ацетилхолинэстеразную ферментативную активность можно определить при помощи любого теста, известного в данной области техники, как описано, например, в работе Thurner и др., 2018.The term "AChE-negative" or "AChE-" as used herein refers to acetylcholinesterase enzyme activity of less than 1*10 3 rel. honey. per mg of cellular protein, measured in cells that were cultured in smooth muscle differentiation medium, as described, for example, in the examples in this application. Alternatively, acetylcholinesterase enzymatic activity can be determined using any test known in the art, as described, for example, in Thurner et al., 2018.
Термин «CK-положительная» или «CK+», использованный в данном описании, относится к креатинкиназной активности, составляющей по меньшей мере 1*102 отн. мЕд. на мг клеточного белка, измеренной в клетках, которые культивировали в среде для дифференцировки гладких мышц, как описано, например, в примерах в данной заявке. Альтернативно, креатинкиназную ферментативную активность можно определить при помощи любого теста, известного в данной области техники, как описано, например, в работе Thurner и др., 2018.The term “CK-positive” or “CK+” as used herein refers to a creatine kinase activity of at least 1*10 2 Rel. honey. per mg of cellular protein, measured in cells that were cultured in smooth muscle differentiation medium, as described, for example, in the examples in this application. Alternatively, creatine kinase enzyme activity can be determined using any test known in the art, as described, for example, in Thurner et al., 2018.
Термин «CK-отрицательная» или «CK-», использованный в данном описании, относится к креатинкиназной ферментативной активности, составляющей менее 1*102 отн. мЕд. на мг клеточного белка, измеренной в клетках, которые культивировали в среде для дифференцировки гладких мышц, как описано, например, в примерах в данной заявке. Альтернативно, креатинкиназную активность можно определить, используя любой тест, известный в данной области техники, как описано, например, в Thurner и др. (2018), или как будет определено специалистом в данной области техники при проведении анализа.The term "CK-negative" or "CK-" as used herein refers to creatine kinase enzyme activity of less than 1*10 2 rel. honey. per mg of cellular protein, measured in cells that were cultured in smooth muscle differentiation medium, as described, for example, in the examples in this application. Alternatively, creatine kinase activity can be determined using any test known in the art, as described, for example, in Thurner et al. (2018), or as determined by one skilled in the art when performing the assay.
Термин «CD49e+» или «CD49e-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD49e. Термины «CD49e+» или «CD49e-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD49e.The term “CD49e+” or “CD49e-positive” as used herein refers to a cell expressing the cellular marker CD49e. The terms "CD49e+" or "CD49e-positive" can also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cell marker CD49e .
Термин «CD49e-» или «CD49e-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD49e. Термины «CD49e-» или «CD49e-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер CD49e.The term "CD49e-" or "CD49e-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell marker CD49e. The terms "CD49e-" or "CD49e-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cell marker CD49e.
Термин «Рах-7+» или «Рах-7-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей транскрипционный фактор Рах-7. Термины «Рах-7+» или «Рах-7-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер Рах-7.The term "Pax-7+" or "Pax-7 positive" as used herein refers to a cell expressing the Pax-7 transcription factor. The terms "Pax-7+" or "Pax-7 positive" may also be used for a population of cells containing different cell types, if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the population cells express the cellular marker Pax-7.
Термин «Рах-7-» или «Рах-7-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер Рах-7. Термины «Рах-7-» или «Рах-7-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер Рах-7.The term "Pax-7-" or "Pax-7-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cellular marker Pax-7. The terms "Pax-7-" or "Pax-7-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4. 3, 2, 1, or 0 percent of the cell population express the cellular marker Pax-7.
Термин «SSEA4+ (стадиеспецифический эмбриональный антиген 4+)» или «SSEA4-положительная», использованный в данном описании, относится к клетке, экспрессирующей маркер клеточной поверхности SSEA4. Термины «SSEA4+» или «SSEA4-положительная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер SSEA4.The term “SSEA4+ (stage-specific embryonic antigen 4+)” or “SSEA4-positive” as used herein refers to a cell expressing the cell surface marker SSEA4. The terms "SSEA4+" or "SSEA4-positive" may also be used for a population of cells containing different cell types if preferably at least 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 or 99 percent of the cell population express the cellular marker SSEA4 .
Термин «SSEA4-» или «SSEA4-отрицательная», использованный в данном описании, относится к клетке, не экспрессирующей маркер клеточной поверхности SSEA4. Термины «SSEA4-» или «SSEA4-отрицательная» также могут быть использованы для популяции клеток, содержащей разные типы клеток, если предпочтительно менее 50% или не более 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов популяции клеток экспрессируют клеточный маркер SSEA4.The term "SSEA4-" or "SSEA4-negative" as used herein refers to a cell that does not express the cell surface marker SSEA4. The terms "SSEA4-" or "SSEA4-negative" may also be used for a cell population containing different cell types, preferably less than 50% or no more than 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2. 1 or 0 percent of the cell population express the cellular marker SSEA4.
Термин «МРС» или «клетки МРС», использованный в данном описании, относится к миогенным клеткам-предшественникам. В частности, термин «МРС» относится к миогенным клеткам-предшественникам, которые характеризуются отрицательной экспрессией aSMA, CD49a и CD14б. МРС являются скелетно-миогенными и не мультипотентными. МРС также могут характеризоваться положительной экспрессией CD105, CD90, CD73, CD56, десмина, AChE и/или CK, и/или отрицательной экспрессией CD34. Пример свойств МРС показан на Фиг. 15.The term "MRC" or "MRC cells" as used herein refers to myogenic progenitor cells. Specifically, the term “MPC” refers to myogenic progenitor cells that are characterized by negative expression of aSMA, CD49a, and CD14b. MRS are skeletal myogenic and not multipotent. MPCs may also be characterized by positive expression of CD105, CD90, CD73, CD56, desmin, AChE and/or CK, and/or negative expression of CD34. An example of MPC properties is shown in Fig. 15.
Термин «MSC» или «клетки MSC», использованный в данном описании, относится к мезенхимальным стромальным клеткам. В частности, термин «MSC» или «клетки MSC» относится к мезенхимальным стромальным клеткам, которые характеризуются отрицательной экспрессией aSMA, CD49a и CD14б. MSC являются не компетентные в отношении слияния и не скелетно-миогенные, но мультипотентными. MSC также могут характеризоваться положительной экспрессией CD105, CD90, CD73 и/или десмина, и/или отрицательной экспрессией CD56, CD34, десмина, AChE и/или CK. Пример свойств MSC показан на Фиг. 15.The term "MSC" or "MSC cells" as used herein refers to mesenchymal stromal cells. In particular, the term “MSC” or “MSC cells” refers to mesenchymal stromal cells that are characterized by negative expression of aSMA, CD49a and CD14b. MSCs are neither fusion competent nor skeletal myogenic, but multipotent. MSCs may also be characterized by positive expression of CD105, CD90, CD73 and/or desmin, and/or negative expression of CD56, CD34, desmin, AChE and/or CK. An example of MSC properties is shown in FIG. 15.
Согласно настоящему изобретению предложены способы получения индуцированных клеток гладких мышц (iSMC) из клеток, происходящих из скелетных мышц (SMDC).The present invention provides methods for producing induced smooth muscle cells (iSMC) from skeletal muscle-derived cells (SMDC).
Индуцированные клетки гладких мышц, происходящие из клеток скелетных мышцInduced smooth muscle cells derived from skeletal muscle cells
Первый объект настоящего изобретения относится к способу получения индуцированных клеток гладких мышц (iSMC), где способ включает стадии: (а) получения от субъекта клеток, происходящих из скелетных мышц; (б) трансдифференцировки клеток, происходящих из скелетных мышц, путем культивирования этих клеток в среде, содержащей TGF-бета, в частности, TGFb1, TGFb2 и/или TGFb3, и гепарин, с получением iSMC. В особенно предпочтительном воплощении клетки, происходящие из скелетных мышц, подвергают трансдифференцировке на стадии (б) путем культивирования этих клеток в среде, содержащей TGFb1 и/или TGFb3, более предпочтительно TGFb1, и гепарин, с получением iSMC. Стадию (б) по настоящему изобретению проводят in vitro или ex vivo. Соответственно, способ по настоящему изобретению представляет собой способ in vitro или ex vivo.A first aspect of the present invention relates to a method for obtaining induced smooth muscle cells (iSMC), wherein the method includes the steps of: (a) obtaining skeletal muscle-derived cells from a subject; (b) transdifferentiating skeletal muscle-derived cells by culturing the cells in a medium containing TGF-beta, in particular TGFb1, TGFb2 and/or TGFb3, and heparin, to obtain iSMC. In a particularly preferred embodiment, skeletal muscle-derived cells are transdifferentiated in step (b) by culturing the cells in a medium containing TGFb1 and/or TGFb3, more preferably TGFb1, and heparin, to obtain iSMC. Step (b) of the present invention is carried out in vitro or ex vivo. Accordingly, the method of the present invention is an in vitro or ex vivo method.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения стадию (б) проводят в среде для культивирования клеток, содержащей 1-10 мкг/мл TGFb1 и 10-30 мкг/мл гепарина или 1-6 Ед/мл гепарина.In a preferred embodiment of the present invention, step (b) is carried out in a cell culture medium containing 1-10 μg/ml TGFb1 and 10-30 μg/ml heparin or 1-6 U/ml heparin.
В предпочтительном воплощении iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б) способа по настоящему изобретению, характеризуются положительной экспрессией aSMA, CD49a и CD146.In a preferred embodiment, iSMC obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b) of the method of the present invention, are characterized by positive expression of aSMA, CD49a and CD146.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения клетки, происходящие из скелетных мышц, представляют собой миогенные клетки-предшественники (МРС), характеризующиеся положительной экспрессией CD56 и десмина и отрицательной экспрессией CD34; альтернативно, клетки, происходящие из скелетных мышц, представляют собой мезенхимальные стромальные клетки (MSC), характеризующиеся положительной экспрессией CD105, CD73 и отрицательной экспрессией CD34 и CD56.In a preferred embodiment of the present invention, the skeletal muscle-derived cells are myogenic progenitor cells (MPCs) characterized by positive expression of CD56 and desmin and negative expression of CD34; alternatively, skeletal muscle-derived cells are mesenchymal stromal cells (MSCs), characterized by positive expression of CD105, CD73 and negative expression of CD34 and CD56.
В предпочтительном воплощении изобретения клетки, происходящие из скелетных мышц, представляют собой олигопотентные МРС.In a preferred embodiment of the invention, the skeletal muscle-derived cells are oligopotent MPCs.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения клетки, происходящие из скелетных мышц, представляют собой MSC, характеризующиеся отрицательной экспрессией десмина и/или положительной экспрессией CD90.In another preferred embodiment of the present invention, the skeletal muscle-derived cells are MSCs characterized by negative expression of desmin and/or positive expression of CD90.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения клетки, происходящие из скелетных мышц, представляют собой мультипотентные MSC.In another preferred embodiment of the present invention, the skeletal muscle-derived cells are multipotent MSCs.
Предпочтительно, в способе по настоящему изобретению предусматривается, что iSMC, происходящие из МРС на стадии (б), характеризуются положительной экспрессией aSMA, CD49a, десмина, CD56 и CD146 и отрицательной экспрессией CD34; и предусматривается, что iSMC, происходящие из MSC на стадии (б), характеризуются положительной экспрессией aSMA, CD49a и CD146 и отрицательной экспрессией CD56.Preferably, the method of the present invention requires that iSMCs derived from MPCs in step (b) are characterized by positive expression of aSMA, CD49a, desmin, CD56 and CD146 and negative expression of CD34; and it is envisaged that iSMCs derived from MSCs in stage (b) are characterized by positive expression of aSMA, CD49a and CD146 and negative expression of CD56.
В другом предпочтительном воплощении изобретения iSMC, происходящие из МРС на стадии (б), дополнительно характеризуются положительной экспрессией смутелина.In another preferred embodiment of the invention, iSMCs derived from MPCs in step (b) are further characterized by positive expression of smoothelin.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения iSMC, происходящие из MSC на стадии (б), дополнительно характеризуются отрицательной экспрессией десмина и/или CD34.In another preferred embodiment of the present invention, iSMCs derived from MSCs in step (b) are further characterized by negative expression of desmin and/or CD34.
CD73 или 5'-нуклеотидаза (5'-NT), также известная как экто-5'-нуклеотидаза, представляет собой фермент, который у людей кодируется геном NT5E. CD73 обычно служит для превращения AMP (аденозинмонофосфата) в аденозин. CD73 экспрессируется на лимфоцитах, фибробластах, клетках гладких мышц, эндотелиальных клетках и миобластах. CD73 представляет собой маркер мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (MSC) в соответствии с минимальными критериями для MSC, предложенными Международным обществом по клеточной терапии (ISCT) (Dominici и др., 2006).CD73 or 5'-nucleotidase (5'-NT), also known as ecto-5'-nucleotidase, is an enzyme encoded by the NT5E gene in humans. CD73 typically serves to convert AMP (adenosine monophosphate) to adenosine. CD73 is expressed on lymphocytes, fibroblasts, smooth muscle cells, endothelial cells and myoblasts. CD73 is a marker of multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) according to the minimum criteria for MSCs proposed by the International Society for Cellular Therapy (ISCT) (Dominici et al., 2006).
CD105 также известен как эндоглин. Он представляет собой интегральный мембранный гомодимерный белок I типа с субъединицами размером 90 кДа, обнаруженный на эндотелиальных клетках сосудов и синцитиотрофобластах плаценты. CD105 слабо экспрессируется на стромальных фибробластах. Он также экспрессируется на активированных моноцитах и тканевых макрофагах. Экспрессия CD105 усиливается на активированном эндотелии в тканях, подвергающихся ангиогенезу, например в опухолях, или в случаях заживления ран или воспаления кожи. CD105 является компонентом TGF-β рецепторной системы в эндотелиальных клетках пупочной вены человека и связывается с TGF-β1 и -β3 с высокой аффинностью. CD105 представляет собой маркер мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (MSC) в соответствии с минимальными критериями для MSC, предложенными Международным обществом по клеточной терапии (ISCT) (Dominici и др., 2006). Поскольку настоящее изобретение предусматривает выделение iSMC из МРС и/или MSC посредством инкубации последних с TGFb, экспрессия CD105, вследствие его роли в качестве корецептора TGFb, может быть полезной для успеха способа, описанного в данной заявке. Таким образом, в настоящем изобретении раскрыто выделение MSC или МРС (пример 1), которые являются CD105-положительными (Фиг. 2) и поэтому полезными для выделения iSMC (пример 2).CD105 is also known as endoglin. It is an integral membrane homodimeric type I protein with 90 kDa subunits found on vascular endothelial cells and syncytiotrophoblasts of the placenta. CD105 is weakly expressed on stromal fibroblasts. It is also expressed on activated monocytes and tissue macrophages. CD105 expression is upregulated on activated endothelium in tissues undergoing angiogenesis, such as tumors, or in cases of wound healing or skin inflammation. CD105 is a component of the TGF-β receptor system in human umbilical vein endothelial cells and binds to TGF-β1 and -β3 with high affinity. CD105 is a marker of multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) according to the minimum criteria for MSCs proposed by the International Society for Cellular Therapy (ISCT) (Dominici et al., 2006). Since the present invention involves isolating iSMC from MPCs and/or MSCs by incubating the latter with TGFb, expression of CD105, due to its role as a TGFb co-receptor, may be beneficial to the success of the method described herein. Thus, the present invention discloses the isolation of MSCs or MPCs (Example 1) that are CD105 positive (Figure 2) and therefore useful for isolating iSMCs (Example 2).
Была описана экспрессия CD34 в происходящих из мышц стволовых клетках и покоящихся сателлитных клетках (Qu-Petersen и др., 2002). Кроме того, CD34-положительные клетки, происходящие из скелетных мышц, демонстрировали усиленную регенерацию дистрофина в дистрофической скелетной мышце (Jankowski и др., 2002). В уровне техники известно применение CD34+ клеток, происходящих из скелетных мышц, для создания клеток гладких мышц in vitro и применение CD34+ клеток, происходящих из скелетных мышц, для наращивания гладких мышц (Capelli и др., 2002). Однако нормальные эндогенные гладкие мышцы являются, как правило, CD34-отрицательными (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000174059-CD34/tissue/primary+data), но гладкие мышцы с онкогенным статусом часто становятся CD34+ клетками (van de Rijn и др., 1994). Таким образом, клетки, полученные способами по настоящему изобретению, не содержащие CD34, могут быть полезными для регенерации гладких мышц и менее склонными к злокачественной трансформации. Следуя способам по настоящему изобретению, CD34-отрицательные клетки, происходящие из скелетных мышц, получают на первой стадии и дифференцируют в CD34-отрицательные iSMC на второй стадии (примеры 1 и 2).Expression of CD34 in muscle-derived stem cells and quiescent satellite cells has been described (Qu-Petersen et al., 2002). In addition, CD34-positive skeletal muscle-derived cells showed enhanced dystrophin regeneration in dystrophic skeletal muscle (Jankowski et al., 2002). It is known in the art to use skeletal muscle-derived CD34+ cells to generate smooth muscle cells in vitro and to use skeletal muscle-derived CD34+ cells to build up smooth muscle (Capelli et al., 2002). However, normal endogenous smooth muscle is typically CD34 negative (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000174059-CD34/tissue/primary+data), but smooth muscle with tumorigenic status often becomes CD34+ cells (van de Rijn and al., 1994). Thus, cells produced by the methods of the present invention that do not contain CD34 may be beneficial for smooth muscle regeneration and less prone to malignant transformation. Following the methods of the present invention, CD34-negative skeletal muscle-derived cells are obtained in the first step and differentiated into CD34-negative iSMCs in the second step (Examples 1 and 2).
CD146 представляет собой поверхностный белок и рецептор субъединицы ламинина альфа 4, который присутствует во внеклеточном матриксе развивающейся ткани гладких мышц (Iivanainen и др., 1995). Кроме того, было показано, что CD146 экспрессируется в стволовых клетках, происходящих из костного мозга, коммитированных в линию клеток гладких мышц (Espagnolle и др., 2014). Как представлено на Фиг. 2, происходящие из мочевого пузыря клетки гладких мышц являются положительными по CD146. Обобщая сказанное, клетки CD146+ отмечают популяцию коммитированных клеток гладких мышц как предпочтительную для применения в регенерации гладких мышц и/или инжиниринге тканей. Способы по настоящему изобретению позволяют выделять CD146+ iSMC из клеток, происходящих из скелетных мышц.CD146 is a surface protein and laminin alpha 4 subunit receptor that is present in the extracellular matrix of developing smooth muscle tissue (Iivanainen et al., 1995). Additionally, CD146 has been shown to be expressed in bone marrow-derived stem cells committed to the smooth muscle cell lineage (Espagnolle et al., 2014). As shown in FIG. 2, bladder-derived smooth muscle cells are CD146 positive. In summary, CD146+ cells mark the committed smooth muscle cell population as preferable for applications in smooth muscle regeneration and/or tissue engineering. The methods of the present invention allow the isolation of CD146+ iSMCs from skeletal muscle-derived cells.
CD56, также известный как молекула адгезии нервных клеток (NCAM), представляет собой маркер миогенного коммитирования, экспрессируемый в миобластах скелетных мышц in vitro (Belles-Isles и др., 1993) и ткани гладких мышц in vivo (Romanska и др., 1996). CD56 присутствует в компетентных в отношении слияния десмин+ SMDC (называемых в настоящем описании МРС), а также iSMC, происходящих из последних. CD56 является основным маркером для установления различий между МРС и описанными здесь, происходящими из скелетных мышц MSC, поскольку как MSC, так и iSMC, происходящие из последних, являются CD56-отрицательны ми. CD56+ iSMC, полученные способом по настоящему изобретению, могут быть наиболее подходящими для регенерации гладких мышц.CD56, also known as neural cell adhesion molecule (NCAM), is a myogenic commitment marker expressed in skeletal muscle myoblasts in vitro (Belles-Isles et al., 1993) and smooth muscle tissue in vivo (Romanska et al., 1996) . CD56 is present in desmin+ fusion-competent SMDCs (herein referred to as MPCs) as well as iSMCs derived from the latter. CD56 is the main marker for distinguishing between MPCs and the skeletal muscle-derived MSCs described here, since both MSCs and iSMCs derived from the latter are CD56 negative. CD56+ iSMCs obtained by the method of the present invention may be most suitable for smooth muscle regeneration.
Альфа-актин гладких мышц (aSMA) является одним из первых маркеров коммитирования гладких мышц во время развития (McHugh, 1995). Его присутствие является важным для функционирования и сократительной способности вследствие механотрансдукции в клетках гладких мышц (J. Wang и др., 2006). Таким образом, использование aSMA в качестве маркера для iSMC, предназначенных для регенерации функции гладких мышц, имеет важное значение. Способы по настоящему изобретению (пример 2) позволяют получать клетки aSMA+ из клеток, происходящих из скелетных мышц (Фиг. 3).Alpha smooth muscle actin (aSMA) is one of the first markers of smooth muscle commitment during development (McHugh, 1995). Its presence is important for function and contractility due to mechanotransduction in smooth muscle cells (J. Wang et al., 2006). Therefore, the use of aSMA as a marker for iSMCs designed to regenerate smooth muscle function is important. The methods of the present invention (Example 2) make it possible to obtain aSMA+ cells from skeletal muscle-derived cells (Figure 3).
Десмин представляет собой один из самых первых известных миогенных маркеров, присутствующих во всех типах мышц. Отсутствие десмина может приводить к мышечной дегенерации и нарушению функционирования (Capetanaki и др., 1997). Таким образом, применение десмин + клеток для регенерации мышц является предпочтительным. Как показано на Фиг. 3, iSMC, происходящие из МРС, являются десмин-положительными.Desmin represents one of the earliest known myogenic markers, present in all muscle types. The absence of desmin can lead to muscle degeneration and dysfunction (Capetanaki et al., 1997). Therefore, the use of desmin+ cells for muscle regeneration is preferred. As shown in FIG. 3, MPC-derived iSMCs are desmin positive.
CD49a или белок интегрин-альфа (также VLA-1 (очень поздний антиген-1)), являющийся результатом экспрессии и трансляции гена ITGA1 (интегрина-альфа 1), присутствует в процессе развития гладких мышц, особенно обнаруживается в ткани гладких мышц, такой как аорта (Belkin и др., 1990). Способы по настоящему изобретению позволяют выделять CD49a-положительные iSMC из CD49a-отрицательных МРС или MSC. Как показано на Фиг. 2, происходящие из мочевого пузыря человека клетки гладких мышц (hBd-SMC) также являются положительными по CD49a.CD49a or integrin alpha protein (also VLA-1 (very late antigen-1)), resulting from the expression and translation of the ITGA1 (integrin alpha 1) gene, is present during smooth muscle development, especially found in smooth muscle tissue such as aorta (Belkin et al., 1990). The methods of the present invention allow the isolation of CD49a-positive iSMCs from CD49a-negative MPCs or MSCs. As shown in FIG. 2, human bladder-derived smooth muscle cells (hBd-SMC) are also CD49a positive.
Функциональные свойства ткани гладких мышц зависят от существования высокодифференцированных клеток гладких мышц, экспрессирующих сократительные белки, такие как смутелин (Niessen и др., 2005). Кроме того, смутелин является хорошо известным маркером для полностью дифференцированных клеток гладких мышц и является первым маркером, который исчезает при нарушении работы гладких мышц (van Eys и др., 2007). Таким образом, применение клеток смутелин+ для регенерации ткани гладких мышц может быть благоприятным. Способы по настоящему изобретению (примеры 2 и 5) позволяют выделять смутелин+ iSMC из смутелин- МРС (Фиг. 3).The functional properties of smooth muscle tissue depend on the existence of highly differentiated smooth muscle cells expressing contractile proteins such as smoothelin (Niessen et al., 2005). In addition, smoothelin is a well-known marker for fully differentiated smooth muscle cells and is the first marker to disappear when smooth muscle function is impaired (van Eys et al., 2007). Thus, the use of smoothelin+ cells for the regeneration of smooth muscle tissue may be beneficial. The methods of the present invention (examples 2 and 5) make it possible to isolate smoothelin+ iSMC from smoothelin-MRC (Fig. 3).
Как описано выше, упомянутые маркеры CD146, CD56, aSMA, CD34, десмин, CD49a, смутелин являются важными для идентификации и/или функционировании клеток гладких мышц, комбинация данных маркеров может быть полезной для идентификации iSMC, подходящих для регенерации гладких мышц. В данном описании продемонстрированы способы, позволяющие выделять iSMC с комбинациями рассматриваемых маркеров (пример 2).As described above, the mentioned markers CD146, CD56, aSMA, CD34, desmin, CD49a, smoothelin are important for the identification and/or function of smooth muscle cells, a combination of these markers may be useful for identifying iSMCs suitable for smooth muscle regeneration. This description demonstrates methods that allow the isolation of iSMC with combinations of the markers in question (example 2).
Более подробно, в настоящем изобретении предложен способ получения iSMC из МРС, происходящих из скелетных мышц. iSMC, происходящие из МРС, являются CD56+, aSMA+, CD49a+, десмин+, CD146+ и CD34-. Последние маркеры, которые описаны выше, полезны для идентификации клеток гладких мышц, поскольку, например, hBd-SMC являются положительными по CD146 и CD49a клетки (Фиг. 2) и, таким образом, предпочтительными для клеток, используемых в качестве клеток, регенерирующих гладкие мышцы. Комбинация экспрессии маркеров CD56+, aSMA+, CD49a+, десмин+, CD146+ и CD34- является перспективной и новой для полученных in vitro iSMC из МРС, происходящих из скелетных мышц человека.In more detail, the present invention provides a method for producing iSMC from skeletal muscle-derived MPCs. MPC-derived iSMCs are CD56+, aSMA+, CD49a+, desmin+, CD146+ and CD34-. The latter markers, which are described above, are useful for identifying smooth muscle cells since, for example, hBd-SMC are CD146 and CD49a positive cells (Figure 2) and are thus preferred for cells used as smooth muscle regenerating cells . The combination of expression of CD56+, aSMA+, CD49a+, desmin+, CD146+ and CD34- markers is promising and novel for in vitro-derived iSMCs from human skeletal muscle-derived MPCs.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения iSMC из MSC, происходящих из скелетных мышц. iSMC, происходящие из MSC скелетных мышц, являются aSMA+, CD146+, CD49a+, CD56- и предпочтительно также десмин- и/или CD34-. Положительная экспрессия aSMA, CD49a и CD146 и отрицательная экспрессия CD56 и предпочтительно также CD34, подходят для идентификации этих клеток в качестве происходящих из MSC клеток гладких мышц и имеют отношение к функционированию iSMC в качестве клеток, регенерирующих гладкие мышцы. Комбинация экспрессии маркеров aSMA+, CD146+, CD49a+ и CD56- на iSMC из MSC, происходящих из скелетных мышц, является перспективной и новой по сравнению с предшествующими способами в данной области техники.In addition, the present invention provides a method for producing iSMCs from skeletal muscle-derived MSCs. iSMCs derived from skeletal muscle MSCs are aSMA+, CD146+, CD49a+, CD56- and preferably also desmin- and/or CD34-. Positive expression of aSMA, CD49a and CD146 and negative expression of CD56 and preferably also CD34 are suitable for identifying these cells as MSC-derived smooth muscle cells and are relevant to the functioning of iSMCs as smooth muscle regenerating cells. The combination of expression of aSMA+, CD146+, CD49a+ and CD56- markers on iSMCs from skeletal muscle-derived MSCs is promising and novel compared to prior methods in the art.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения способ включает проведение после стадии (а) стадии (a1), включающей пролиферацию клеток, происходящих из скелетных мышц, предпочтительно с получением 20-40 × 106 клеток.In another preferred embodiment of the present invention, the method comprises following step (a) with step (a1) involving the proliferation of skeletal muscle-derived cells, preferably producing 20-40 x 10 6 cells.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения клетки, происходящие из скелетных мышц, пролиферируют с получением 50 × 106 клеток.In a particularly preferred embodiment of the present invention, skeletal muscle-derived cells proliferate to produce 50 x 10 6 cells.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения стадию (б) проводят в течение одних-шести суток. В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения стадию (б) проводят в течение трех-шести суток.In another preferred embodiment of the present invention, step (b) is carried out over one to six days. In a particularly preferred embodiment of the present invention, step (b) is carried out over three to six days.
Другой объект настоящего изобретения относится к индуцированным клеткам гладких мышц (iSMC), полученным способом по настоящему изобретению.Another aspect of the present invention relates to induced smooth muscle cells (iSMC) obtained by the method of the present invention.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), полученные из МРС, характеризуются положительной экспрессией aSMA, CD49a, десмина, CD56 и CD146 и отрицательной экспрессией CD34.In another preferred embodiment of the present invention, induced smooth muscle cells (iSMCs) derived from MPCs are characterized by positive expression of aSMA, CD49a, desmin, CD56 and CD146 and negative expression of CD34.
Как уже указывалось выше, комбинация присутствия маркеров aSMA, CD49a, десмина, CD56 и CD146, или отсутствия CD34 в iSMC из МРС является предпочтительной ввиду фенокопирования профиля природной экспрессии клеток гладких мышц способами, описанными в данной заявке.As discussed above, the combination of the presence of the markers aSMA, CD49a, desmin, CD56 and CD146, or the absence of CD34 in iSMC from MPC is preferred due to the phenocopying of the natural expression profile of smooth muscle cells by the methods described herein.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), полученные из МРС, являются некомпетентными в отношении слияния.In another preferred embodiment of the present invention, induced smooth muscle cells (iSMCs) derived from MPCs are fusion incompetent.
Слияние одноядерных миогенных клеток-предшественников (МРС) или других компетентных в отношении слияния происходящих из мышц клеток (например миобластов) в многоядерные мышечные трубочки является предпосылкой для образования и регенерации скелетных мышц (Rochlin и др., 2010). Однако, поскольку ткань гладких мышц in vivo состоит не из многоядерных мышечных трубочек, а в значительной степени из дифференцированных одноядерных клеток гладких мышц, то для регенерации гладких мышц предпочтительными являются некомпетентные в отношении слияния клетки. Таким образом, в настоящем изобретении предусматривается, что iSMC из МРС, а также iSMC из MSC являются некомпетентными в отношении слияния. В то время как МРС, полученные, как показано в примере 1 настоящего изобретения, являются компетентными в отношении слияния, iSMC, полученные, как показано в примере 2 настоящего изобретения, и в конечном итоге предназначенные для применения в ткани гладких мышц, являются некомпетентными в отношении слияния. Это относится как к MPC-iSMC, так и к MSC-iSMC по настоящему изобретению, например, как показано на Фиг. 15.Fusion of mononucleated myogenic progenitor cells (MPCs) or other fusion-competent muscle-derived cells (e.g. myoblasts) into multinucleated myotubes is a prerequisite for skeletal muscle formation and regeneration (Rochlin et al., 2010). However, since smooth muscle tissue in vivo does not consist of multinucleated myotubes but largely of differentiated mononuclear smooth muscle cells, fusion-incompetent cells are preferred for smooth muscle regeneration. Thus, the present invention provides that the iSMC from the MPC as well as the iSMC from the MSC are merge incompetent. While MPCs prepared as shown in Example 1 of the present invention are fusion competent, iSMCs prepared as shown in Example 2 of the present invention and ultimately intended for use in smooth muscle tissue are fusion incompetent. mergers. This applies to both the MPC-iSMC and the MSC-iSMC of the present invention, for example, as shown in FIG. 15.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), полученные из MSC, характеризуются положительной экспрессией aSMA, CD49a и CD146 и отрицательной экспрессией CD56.In another preferred embodiment of the present invention, induced smooth muscle cells (iSMCs) derived from MSCs are characterized by positive expression of aSMA, CD49a and CD146 and negative expression of CD56.
Предпочтительно, iSMC, происходящие из MSC, дополнительно характеризуются отрицательной экспрессией десмина и/или CD34.Preferably, MSC-derived iSMCs are further characterized by negative expression of desmin and/or CD34.
Поскольку MSC, происходящие из скелетных мышц, отличаются от МРС в отношении CD56, то iSMC, также происходящие из MSC, являются CD56-отрицательными. Однако, iSMC, происходящие из MSC, являются aSMA+, CD146+ и CD34-, что наряду с iSMC, происходящими из МРС, является репрезентативным для коммитирования iSMC, полученных из MSC, в гладкие мышцы и, следовательно, полезным. Кроме того, положительная экспрессия мезенхимальных маркеров CD90, CD105, CD73 в iSMC, происходящих из MSC согласно настоящему изобретению, является предпочтительной ввиду мезенхимальной природы необходимой ткани гладких мышц.Since skeletal muscle-derived MSCs differ from MPCs with respect to CD56, iSMCs, also MSC-derived ones, are CD56 negative. However, MSC-derived iSMCs are aSMA+, CD146+, and CD34-, which along with MPC-derived iSMCs are representative of the commitment of MSC-derived iSMCs to smooth muscle and therefore beneficial. In addition, positive expression of the mesenchymal markers CD90, CD105, CD73 in iSMCs derived from the MSCs of the present invention is advantageous due to the mesenchymal nature of the desired smooth muscle tissue.
Экспрессию различных маркеров, которые описаны выше, предпочтительно тестируют in vitro. Кроме того, экспрессия различных маркеров, которые описаны выше, относится к их экспрессии в соответствующих клетках in vitro. В предпочтительном воплощении экспрессия aSMA и десмина in vitro в соответствующих клетках, как определено выше, совпадает с их соответствующей экспрессией in vivo.The expression of the various markers that are described above is preferably tested in vitro. In addition, the expression of the various markers that are described above refers to their expression in the corresponding cells in vitro. In a preferred embodiment, the expression of aSMA and desmin in vitro in the corresponding cells, as defined above, coincides with their corresponding expression in vivo.
Предпочтительно, индуцированные клетки гладких мышц (iSMC) экспрессируют функциональные кальциевые и/или калиевые каналы.Preferably, induced smooth muscle cells (iSMC) express functional calcium and/or potassium channels.
Функциональные свойства ткани гладких мышц зависят от существования функциональных потенциал-зависимых кальциевых и калиевых каналов, позволяющих индуцировать регулируемое сокращение клеток и регулировать мембранный потенциал соответственно (Sanders, 2008). При нейронной стимуляции мембраны клеток гладких мышц деполяризуются, что вызывает открывание чувствительных к потенциалу кальциевых каналов и позволяет ионам кальция поступать в клетку из межклеточного пространства (Sanders, 2008). Это событие в последующем запускает каскады передачи сигнала, в конечном итоге приводящие к актин/миозин-индуцируемому сокращению клеток гладких мышц, необходимому, в частности, для функционирования, например, внутреннего сфинктера прямой кишки для сжатия и удерживания жидкости, газа и твердых веществ от непроизвольного высвобождения из прямой кишки (Webb, 2003). Кроме того, после индуцированной нейронами деполяризации мембраны клеток гладких мышц открываются потенциал-зависимые калиевые каналы, чтобы вызвать реполяризацию мембраны и обеспечить дальнейшую деполяризацию в случае последующих сигналов от нейронов. Таким образом, наличие кальциевых и калиевых каналов на iSMC пригодно для идентификации функциональных iSMC in vitro. Функциональные iSMC фактически необходимы для регенерации нарушения функционирования, например, внутреннего сфинктера прямой кишки, недостаточно функционального у пациентов с недержание кала. Настоящее изобретение позволяет получать iSMC из клеток, происходящих из скелетных мышц, с функциональными потенциал-зависимыми как калиевыми, так и кальциевыми каналами, что может быть желательным для их применения в регенерации гладких мышц.The functional properties of smooth muscle tissue depend on the existence of functional voltage-gated calcium and potassium channels to induce controlled cell contraction and regulate membrane potential, respectively (Sanders, 2008). Upon neuronal stimulation, the membranes of smooth muscle cells depolarize, which causes the opening of voltage-sensitive calcium channels and allows calcium ions to enter the cell from the intercellular space (Sanders, 2008). This event subsequently triggers signal transduction cascades ultimately leading to actin/myosin-induced contraction of smooth muscle cells, required in particular for the functioning of, for example, the internal rectal sphincter to compress and retain fluid, gas and solids from involuntary release. release from the rectum (Webb, 2003). In addition, following neuronal-induced depolarization of the smooth muscle cell membrane, voltage-gated potassium channels open to induce membrane repolarization and allow further depolarization in the event of subsequent neuronal signals. Thus, the presence of calcium and potassium channels on iSMCs is useful for identifying functional iSMCs in vitro. Functional iSMCs are in fact necessary for the regeneration of impaired functioning, for example, the internal rectal sphincter, which is insufficiently functional in patients with fecal incontinence. The present invention makes it possible to obtain iSMC from skeletal muscle-derived cells with functional voltage-gated both potassium and calcium channels, which may be desirable for their use in smooth muscle regeneration.
Предпочтительно, индуцированные клетки гладких мышц (iSMC) представляют собой сократительные клетки in vitro. Одной из типичных функций ткани гладких мышц является сокращение (Webb, 2003). Чтобы протестировать сократительную способность in vitro, клетки сеют на коллагеновый гель и количественно определяют уменьшение размера коллагенового геля в течение некоторого периода времени как показатель сократительной способности. Авторы изобретения обнаружили, что iSMC из МРС и iSMC из MSC являются сократительными по сравнению с МРС и MSC, из которых они происходят.Preferably, the induced smooth muscle cells (iSMCs) are contractile cells in vitro. One of the typical functions of smooth muscle tissue is contraction (Webb, 2003). To test contractility in vitro, cells are seeded onto collagen gel and the decrease in collagen gel size over a period of time is quantified as an indicator of contractility. The inventors have discovered that iSMCs from MPCs and iSMCs from MSCs are contractile compared to the MPCs and MSCs from which they are derived.
Предпочтительно, индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), в частности MPC-iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б), являются CD49e-. Экспрессию CD49e предпочтительно тестируют in vitro. CD49e также известный как интегрин-альфа 5, представляет собой молекулу клеточной адгезии, которая создает гетеродимерный рецептор с интегрином-бета 1 для связывания фибронектина, фибриногена и фибриллина-1. Поскольку ингибиторы фибронектина были достаточными для усиления экспрессии генов гладких мышц, передача сигнала с участием фибронектина, поддерживаемая посредством CD49e, может препятствовать экспрессии в гладких мышцах. Авторы изобретения обнаружили, что iSMC из мышиных МРС являются дефицитными по CD49e. Дефицит CD49e может быть полезен в ослабления передачи сигнала с участием фибронектина, и таким образом, CD49e- iSMC, полученные согласно настоящему изобретению, могут быть полезнее клеток, известных в данной области техники, в их применении для регенерации гладких мышц.Preferably, the induced smooth muscle cells (iSMC), in particular MPC-iSMC, obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b), are CD49e-. CD49e expression is preferably tested in vitro. CD49e, also known as integrin alpha 5, is a cell adhesion molecule that forms a heterodimeric receptor with integrin beta 1 to bind fibronectin, fibrinogen and fibrillin-1. Because fibronectin inhibitors were sufficient to enhance smooth muscle gene expression, CD49e-mediated fibronectin signaling may interfere with expression in smooth muscle. We discovered that iSMCs from murine MPCs are CD49e deficient. CD49e deficiency may be beneficial in attenuating fibronectin signaling, and thus CD49e-iSMCs produced according to the present invention may be more beneficial than cells known in the art in their use for smooth muscle regeneration.
В альтернативном предпочтительном воплощении индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), в частности MPC-iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б), являются CD49e+. Экспрессию CD49e предпочтительно тестируют in vitro.In an alternative preferred embodiment, the induced smooth muscle cells (iSMC), in particular MPC-iSMC, obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b), are CD49e+. CD49e expression is preferably tested in vitro.
Предпочтительно, индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), в частности MPC-iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б), являются AChE-. Экспрессию AChE предпочтительно тестируют in vitro. Одной из типичных функций скелетных миогенных клеток является экспрессия активного фермента AChE во время слияния in vitro (Thurner и др., 2018), что необходимо для прекращения действия нервных сигналов на моторных концевых пластинках. Однако гладкая мышца не иннервируется моторными нейронами и, следовательно, ее сокращение не регулируется в основном ацетилхолином, когда требуется наличие AChE для прекращения. Авторы изобретения проанализировали iSMC, выделенные согласно примеру 3, в отношении AChE активности согласно примеру 17 и обнаружили, что iSMC являются AChE- (Фиг. 14).Preferably, the induced smooth muscle cells (iSMC), in particular MPC-iSMC, obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b), are AChE-. AChE expression is preferably tested in vitro. One of the typical functions of skeletal myogenic cells is the expression of the active enzyme AChE during in vitro fusion (Thurner et al., 2018), which is necessary to terminate the action of neural signals at the motor end plates. However, smooth muscle is not innervated by motor neurons and therefore its contraction is not primarily regulated by acetylcholine, requiring the presence of AChE to terminate. We analyzed iSMCs isolated according to Example 3 for AChE activity according to Example 17 and found that iSMCs were AChE- (Fig. 14).
Предпочтительно, индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), в частности MPC-iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б), являются CK-. Экспрессию CK предпочтительно тестируют in vitro. Одной из типичных функций скелетных миогенных клеток является экспрессия активного фермента CK во время слияния in vitro (Thurner и др., 2018), что необходимо для сокращения скелетных мышц. Однако сокращение гладких мышц не регулируется креатинкиназой (CK), и поэтому не является необходимым для клеток гладких мышц. Авторы изобретения обнаружили, что iSMC (пример 3), которые были проанализированы в отношении CK активности (пример 17), являются CK- (Фиг. 14).Preferably, the induced smooth muscle cells (iSMC), in particular MPC-iSMC, obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b), are CK-. CK expression is preferably tested in vitro. One of the typical functions of skeletal myogenic cells is the expression of active CK enzyme during in vitro fusion (Thurner et al., 2018), which is necessary for skeletal muscle contraction. However, smooth muscle contraction is not regulated by creatine kinase (CK) and is therefore not essential for smooth muscle cells. The inventors found that iSMC (Example 3) that were analyzed for CK activity (Example 17) are CK- (Fig. 14).
В предпочтительном воплощении индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), в частности MPC-iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б), являются Рах-7-отрицательными, в частности, если экспрессию Рах-7 тестируют in vitro. В еще одном предпочтительном воплощении индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), в частности MPC-iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б), являются Pax-7-положительными, в частности, если экспрессию Рах-7 тестируют in vitro. Рах-7 представляет собой транскрипционный фактор, обнаруженный в клетках, коммитированных в линии гладких мышц (Krauss и др., 2016). Делеция Рах-7 в tunica muscularis мышей приводит к уменьшению массы скелетных мышц и увеличению массы гладких мышц (Worl и др., 2009).In a preferred embodiment, induced smooth muscle cells (iSMC), in particular MPC-iSMC, obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b), are Pax-7 negative, in particular if Pax-7 expression is tested in vitro. In another preferred embodiment, induced smooth muscle cells (iSMCs), in particular MPC-iSMCs, obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b), are Pax-7 positive, in particular if Pax-7 expression is tested in vitro. Pax-7 is a transcription factor found in cells committed to the smooth muscle lineage (Krauss et al., 2016). Deletion of Pax-7 in mouse tunica muscularis results in decreased skeletal muscle mass and increased smooth muscle mass (Worl et al., 2009).
В предпочтительном воплощении индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), в частности MPC-iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б), являются SSEA4-отрицательными. В еще одном предпочтительном воплощении индуцированные клетки гладких мышц (iSMC), в частности MPC-iSMC, полученные согласно способу по настоящему изобретению, предпочтительно на стадии (б), являются 88ЕА4-положительными. Экспрессию SSEA4 предпочтительно тестируют in vitro. SSEA4 представляет собой маркер клеточной поверхности, обнаруженный в плюрипотентных стволовых клетках, которые известны своим широким пролиферативным потенциалом и ввиду этого представляют риск в отношении онкогенеза.In a preferred embodiment, induced smooth muscle cells (iSMC), in particular MPC-iSMC, obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b), are SSEA4 negative. In yet another preferred embodiment, induced smooth muscle cells (iSMC), in particular MPC-iSMC, obtained according to the method of the present invention, preferably in step (b), are 88EA4 positive. Expression of SSEA4 is preferably tested in vitro. SSEA4 is a cell surface marker found in pluripotent stem cells, which are known for their broad proliferative potential and therefore pose a tumorigenesis risk.
Способы лечения на основе индуцированных клеток гладких мышцTreatment methods based on induced smooth muscle cells
Другой объект настоящего изобретения относится к индуцированным клеткам гладких мышц (iSMC) для применения в способе лечения заболевания или расстройства у субъекта. Предпочтительно, субъектом является человек или животное. В частности, согласно настоящему изобретению предложены индуцированные клетки гладких мышц (iSMC) для применения в способе лечения организма человека или животного посредством хирургического вмешательства или терапии. Более конкретно, согласно настоящему изобретению предложены индуцированные клетки гладких мышц (iSMC) для применения в клеточной терапии, в частности в терапии с использованием клеток гладких мышц.Another aspect of the present invention relates to induced smooth muscle cells (iSMC) for use in a method of treating a disease or disorder in a subject. Preferably, the subject is a human or animal. In particular, the present invention provides induced smooth muscle cells (iSMCs) for use in a method of treating a human or animal body through surgery or therapy. More specifically, the present invention provides induced smooth muscle cells (iSMCs) for use in cell therapy, particularly in smooth muscle cell therapy.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения заболевание или расстройство представляет собой дефекты гладких мышц. Предпочтительно, дефекты гладких мышц выбраны из группы, состоящей из анального недержания, недержания мочи, рефлюксной болезни, гастропареза, гиперактивного и малоактивного мочевого пузыря.In another preferred embodiment of the present invention, the disease or disorder is a smooth muscle defect. Preferably, the smooth muscle defects are selected from the group consisting of anal incontinence, urinary incontinence, reflux disease, gastroparesis, overactive and underactive bladder.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения заболевание или расстройство представляет собой недержание кала, в частности пассивное недержание кала. Соответственно, настоящее изобретение также относится к iSMC для применения в способе лечения анального недержания, недержания мочи, рефлюксной болезни, гастропареза, гиперактивного и малоактивного мочевого пузыря и, в частности, недержания кала, более конкретно пассивного недержания кала.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the disease or disorder is fecal incontinence, in particular passive fecal incontinence. Accordingly, the present invention also relates to iSMC for use in a method of treating anal incontinence, urinary incontinence, reflux disease, gastroparesis, overactive and underactive bladder, and in particular fecal incontinence, more particularly passive fecal incontinence.
Предпочтительно, iSMC инъецируют в ткань гладких мышц субъекта, нуждающегося в iSMC. Предпочтительно, iSMC инъецируют в количестве, эффективном для лечения дефектов гладких мышц. Эффективное количество подлежащего введению соединения может быть легко определено специалистами в данной области техники во время доклинических испытаний и клинических испытаний методами, известными врачам и клиницистам.Preferably, the iSMC is injected into the smooth muscle tissue of a subject requiring iSMC. Preferably, iSMC is injected in an amount effective to treat smooth muscle defects. The effective amount of the compound to be administered can be readily determined by those skilled in the art during preclinical trials and clinical trials by methods known to physicians and clinicians.
Регенерация нуждающейся в этом ткани гладких мышц, такой как ослабленная, атрофическая или поврежденная гладкая мышца, например сфинктеров, таких как внутренний анальный, внутренний уретральный, нижний или верхний сфинктеры пищевода, посредством введения клеток требует, чтобы клетки были локально введены в нуждающуюся в этом ткань. Локальное введение iSMC может регенерировать гладкую мышцу путем приживления инъецированных iSMC в месте введения. В предшествующем уровне техники (Chancellor и др., 2001) раскрыты полученные из скелетных мышц клетки, охарактеризованные как десмин+, CD34+ и Blc-2+, и их применение в наращивании мягкой ткани (например гладкой мышцы), такой как сфинктер мочевого пузыря или прямой кишки. В противоположность этому, в настоящем изобретении описано выделение CD34-, CD56+, десмин+ МРС или мультипотентных CD34-, CD56-, CD73+ и CD105+ MSC клеток, происходящих из скелетных мышц, на первой стадии. Из указанных клеток скелетной мышцы на второй стадии могут быть выделены iSMC после обработки TGFb1 и гепарином. Таким образом, эти iSMC приобретают фенотип клеток гладких мышц в результате экспрессии маркера гладких мышц, такого как, например, aSMA и CD146, и поэтому могут быть полезны для регенерации гладких мышц. Предпочтительно эти iSMC используют в способе лечения нуждающегося в этом субъекта посредством инъекции указанному субъекту. Авторы изобретения обнаружили, что iSMC, полученные способами по настоящему изобретению, будучи введенными в ткань гладких мышц сфинктера привратника, приживались в месте инъекции и интегрировались в ткань гладких мышц.Regeneration of smooth muscle tissue in need, such as weakened, atrophic or damaged smooth muscle, such as sphincters such as the internal anal, internal urethral, lower or upper esophageal sphincters, by cell administration requires that the cells be locally injected into the tissue in need . Local administration of iSMC can regenerate smooth muscle by engrafting the injected iSMC at the injection site. The prior art (Chancellor et al., 2001) discloses skeletal muscle-derived cells characterized as desmin+, CD34+, and Blc-2+, and their use in growing soft tissue (eg, smooth muscle), such as the bladder sphincter or rectum. In contrast, the present invention describes the isolation of CD34-, CD56+, desmin+ MPCs or multipotent CD34-, CD56-, CD73+ and CD105+ skeletal muscle-derived MSC cells in a first step. From these skeletal muscle cells, iSMC can be isolated at the second stage after treatment with TGFb1 and heparin. Thus, these iSMCs acquire a smooth muscle cell phenotype through the expression of a smooth muscle marker such as aSMA and CD146, for example, and may therefore be useful for smooth muscle regeneration. Preferably, these iSMCs are used in a method of treating a subject in need thereof by injection into said subject. The inventors found that iSMCs produced by the methods of the present invention, when injected into smooth muscle tissue of the pyloric sphincter, engrafted at the injection site and integrated into the smooth muscle tissue.
Предпочтительно, iSMC вводят в необходимую мягкую ткань посредством многократных инъекций.Preferably, iSMC is introduced into the desired soft tissue through multiple injections.
Показано, что многократные инъекции SMDC в скелетную мышцу улучшают приживление клеток в мышце (Skuk и др., 2014). Настоящее изобретение предусматривает инъекцию iSMC в мягкую ткань, такую как, например, ткань гладкой мышцы, в нескольких местах одного и того же континуума ткани. В частности, клетки могут быть введены с использованием нескольких игл, каждая из которых инъецирует определенное количество клеток.Repeated injections of SMDC into skeletal muscle have been shown to improve cell engraftment into the muscle (Skuk et al., 2014). The present invention involves injecting iSMC into soft tissue, such as, for example, smooth muscle tissue, at multiple locations along the same tissue continuum. In particular, cells can be injected using multiple needles, each of which injects a specific number of cells.
iSMC по настоящему изобретению могут быть введены в форме фармацевтической композиции, содержащей iSMC и фармацевтически приемлемый разбавитель, эксципиент или носитель. Соответственно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей iSMC по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, эксципиент или носитель.The iSMCs of the present invention may be administered in the form of a pharmaceutical composition containing the iSMCs and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier. Accordingly, the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the iSMC of the present invention and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier.
В другом воплощении настоящего изобретения iSMC используют в изготовлении лекарственного средства для лечения анального недержания, недержания мочи, рефлюксной болезни, гастропареза, гиперактивного и малоактивного мочевого пузыря и, в частности, недержания кала, более конкретно пассивного недержания кала.In another embodiment of the present invention, iSMC is used in the manufacture of a medicament for the treatment of anal incontinence, urinary incontinence, reflux disease, gastroparesis, overactive and underactive bladder, and in particular fecal incontinence, more particularly passive fecal incontinence.
Инжиниринг тканейTissue Engineering
Другой объект настоящего изобретения относится к применению индуцированных клеток гладких мышц в инжиниринге тканей.Another aspect of the present invention relates to the use of induced smooth muscle cells in tissue engineering.
Ткань гладких мышц часто образует в организме человека структуры в форме кольца/трубки, такие как кровеносные сосуды и внутренний сфинктер прямой кишки. Применение iSMC, полученных в данной заявке, для получения структур в форме кольца/трубки можно использовать для инжиниринга кровеносных сосудов или мышц сфинктера in vitro. Сконструированные in vitro структуры гладких мышц можно использовать для замены структуры гладких мышц с нарушенной функцией, таких как гладкомышечные сфинктеры, например у пациентов с недержанием кала. Авторы изобретения обнаружили, что iSMC, полученные согласно настоящему изобретению, могут восстанавливать пространственные структуры в форме кольца, аналогичные структуре, например, внутреннего сфинктера прямой кишки. Было обнаружено, что клетки в этих тканевых кольцах экспрессируют маркерные белки гладких мышц, такие как aSMA и десмин. Экспрессия сократительных белков aSMA и десмина в кольцах ткани, полученных с использованием клеток по настоящему изобретению, требуется для функционирования этих колец ткани и поэтому является полезным для применения указанных колец ткани в замещении ткани.Smooth muscle tissue often forms ring/tube-shaped structures in the human body, such as blood vessels and the internal rectal sphincter. The use of iSMCs obtained in this application to obtain ring/tube-shaped structures can be used to engineer blood vessels or sphincter muscles in vitro. In vitro engineered smooth muscle structures can be used to replace smooth muscle structures with impaired function, such as smooth muscle sphincters, for example in patients with fecal incontinence. The inventors have found that iSMC obtained according to the present invention can restore ring-shaped spatial structures similar to the structure of, for example, the internal rectal sphincter. Cells in these tissue rings were found to express smooth muscle marker proteins such as aSMA and desmin. Expression of the contractile proteins aSMA and desmin in tissue rings produced using the cells of the present invention is required for the function of these tissue rings and is therefore useful for the use of said tissue rings in tissue replacement.
Кроме этого, в настоящем изобретении было обнаружено, что происходящие из iSMC сфинктеры, сконструированные in vitro, обладают ультраструктурными свойствами природных гладких мышц, такими как чрезвычайно распространенные актиновые структуры и плотные тельца, необходимые для механотрансдукции, и, следовательно, для функционирования конструкций из гладких мышц. Кроме того, сконструированные из ткани сфинктеры, полученные в настоящем изобретении, позволяют формировать в клетках кавеолы. Известно, что кавеолы необходимы для регуляции кальция, например, посредством возбуждения-сокращения, возбуждения-транскрипции и фармакомеханического сопряжения (Popescu и др., 2006). Таким образом, iSMC, полученные в соответствии с настоящим изобретением, являются перспективными для применения в инжиниринге тканей.In addition, the present invention has found that iSMC-derived sphincters engineered in vitro possess the ultrastructural properties of natural smooth muscle, such as the extremely abundant actin structures and dense bodies required for mechanotransduction, and therefore the function of smooth muscle constructs. . In addition, the tissue-constructed sphincters obtained in the present invention allow the formation of caveolae in the cells. Caveolae are known to be essential for calcium regulation, for example through excitation-contraction, excitation-transcription and pharmacomechanical coupling (Popescu et al., 2006). Thus, iSMCs obtained in accordance with the present invention are promising for use in tissue engineering.
Скрининг лекарственных средствDrug screening
В другом объекте настоящего изобретения iSMC предназначены для применения в скрининге лекарственных средств.In another aspect of the present invention, iSMCs are intended for use in drug screening.
Применение iSMC для создания структур гладких мышц in vitro может оказаться полезным для тестирования новых лекарственных средств и их влияния на клетки гладких мышц in vitro до того, как какое-либо потенциально опасное лекарственное средство-кандидат должно быть использовано в исследованиях на животных или человеке.The use of iSMC to generate smooth muscle structures in vitro may be useful for testing new drugs and their effects on smooth muscle cells in vitro before any potentially harmful drug candidate must be used in animal or human studies.
Клетки, происходящие из скелетных мышц, для создания индуцированных клеток гладких мышцSkeletal muscle-derived cells to create induced smooth muscle cells
Другой объект настоящего изобретения относится к применению клеток, происходящих из скелетных мышц, для получения индуцированных клеток гладких мышц (iSMC).Another aspect of the present invention relates to the use of skeletal muscle-derived cells to produce induced smooth muscle cells (iSMC).
В часто используемых методах из уровня техники для получения клеток гладких мышц in vitro используют индуцированные плюрипотентные стволовые клети (Dash и др., 2016), происходящие жировой ткани мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (G. Wang и др., 2015) или происходящие из костного мозга мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (Espagnolle и др., 2014), с очевидностью отличающиеся по происхождению от клеток, происходящих из скелетных мышц, использованных в настоящем изобретении в качестве источника для получения индуцированных клеток гладких мышц. Недостаток клеток, используемых в современном уровне техники, например iPSC, используемых для получения клеток гладких мышц, состоит в риске злокачественной трансформации ввиду применения генной инженерии, необходимой для получения iPSC. В другом методе из уровня техники описаны CD34+ клетки, происходящие из скелетных мышц, в качестве источника клеток гладких мышц. Вследствие этого, указанные клетки культивируют в среде для дифференцировки в течение 2-4 недель (Lu и др., 2011). В настоящем изобретении впервые для получения iSMC используют клетки CD34-, происходящие из скелетных мышц, выделенные согласно способам по настоящему изобретению. Указанные происходящие из скелетных мышц клетки хорошо подходят для выделения iSMC, поскольку осуществление способа по настоящему изобретению занимает менее 1 недели.Commonly used prior art methods for generating smooth muscle cells in vitro use induced pluripotent stem cells (Dash et al., 2016), adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stromal cells (G. Wang et al., 2015), or bone marrow-derived cells. multipotent mesenchymal stromal cells (Espagnolle et al., 2014), clearly different in origin from the skeletal muscle-derived cells used in the present invention as a source for obtaining induced smooth muscle cells. A disadvantage of the cells used in the current state of the art, such as iPSCs used to generate smooth muscle cells, is the risk of malignant transformation due to the genetic engineering required to obtain iPSCs. Another method in the prior art describes skeletal muscle-derived CD34+ cells as a source of smooth muscle cells. Consequently, these cells are cultured in differentiation medium for 2-4 weeks (Lu et al., 2011). In the present invention, for the first time, skeletal muscle-derived CD34- cells isolated according to the methods of the present invention are used to obtain iSMCs. These skeletal muscle-derived cells are well suited for isolating iSMCs since the process of the present invention takes less than 1 week to complete.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения происходящие из скелетных мышц клетки представляют собой олигопотентные миогенные клетки-предшественники (МРС), характеризующиеся положительной экспрессией CD56 и десмина и отрицательной экспрессией CD34; или происходящие из скелетных мышц клетки представляют собой мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (MSC), характеризующиеся положительной экспрессией CD105, CD73 и отрицательной экспрессией CD34 и CD56.In a preferred embodiment of the present invention, the skeletal muscle-derived cells are oligopotent myogenic progenitor cells (MPCs) characterized by positive expression of CD56 and desmin and negative expression of CD34; or skeletal muscle-derived cells are multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) characterized by positive expression of CD105, CD73 and negative expression of CD34 and CD56.
Приведенные ниже примеры поясняют настоящее изобретение, но их не следует считать ограничивающими.The following examples illustrate the present invention, but they should not be considered limiting.
ПримерыExamples
Пример 1. Выделение клеток, происходящих из скелетных мышц (SMDC) Example 1 Isolation of Skeletal Muscle Derived Cells (SMDC)
В зависимости от приведенных ниже методов выделения, SMDC были обогащены либо человеческими миогенными клетками-предшественниками (МРС), либо мышиными миогенными клетками-предшественниками (mMPC), либо человеческими мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (MSC).Depending on the isolation methods below, SMDCs were enriched in either human myogenic progenitor cells (MPCs), murine myogenic progenitor cells (mMPCs), or human multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs).
Выделение миогенных клеток-предшественников (МРС), происходящих из скелетных мышц человекаIsolation of myogenic progenitor cells (MPCs) derived from human skeletal muscle
Более подробно, биоптат скелетной мышцы отбирали из М. pectoralis major или М. biceps brachii страдающего недержанием пациента. Чтобы отобрать биоптат, сначала вскрывали кожу, делая надрез длиной примерно 1 см над мышцей, пока не достигали фасции М. pectoralis major. После вскрытия фасции отбирали 1 см3 мышечной ткани (биоптат). Биоптат переносили непосредственно в среду для транспортировки биоптатов, предварительно охлажденную до примерно 4°С и содержащую основную среду Хэма F10 с добавлением гентамицина (в конечной концентрации 1-5 мкг/мл). Биоптат хранили в течение примерно 26 часов при 1-11°С в среде для транспортировки биоптатов. Затем биоптат переносили в чашку Петри, заполненную 1xPBS (забуференный фосфатом физиологический раствор). Ткань мышцы отделяли от соединительной ткани, используя стерильные пинцет и скальпель. Затем ткань мышцы переносили в другую чашку Петри, заполненную 1xPBS, и разрезали на кусочки размером 2-3 мм2 с использованием скальпеля. После дополнительной стадии переноса, как описано выше, кусочки ткани дополнительно разрезали на кусочки размером 1 мм. Наконец, кусочки переносили в центрифужную пробирку, заполненную 1xPBS, и центрифугировали в течение 10 минут при 1300 об/мин. После центрифугирования супернатант удаляли и ткань мышцы ресуспендировали в 1xPBS с добавлением гентамицина (8 мкг/мл). Затем суспензию мышечной ткани охлаждали до 2-8°С в течение 48 часов. После охлаждения суспензию мышечной ткани центрифугировали в течение 10 минут при 1300 об/мин, затем супернатант удаляли и добавляли 2,5 мл раствора для расщепления, содержащего 1-5 мг/мл коллагеназы, 2-4% (об./об.) буфера HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), 0,1-10% (об./об.) фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 5-10 мкг/мл гентамицина в среде Хэма F10. Затем суспензию мышечной ткани инкубировали в течение 6-20 часов при 37°С, 5% СО2. Затем суспензию центрифугировали при 1300 об/мин в течение 10 минут, супернатант удаляли, осадок после центрифугирования ресуспендировали в среде, содержащей 10-20% (об./об.) FCS, 1-3 нг/мл bFGF (основный фактор роста фибробластов) и 3-10 мкг/мл гентамицина в среде Хэма F10, и высевали во флаконы для культивирования клеток. SMDC, прикрепленные к дну флакона для культивирования дополнительно поддерживали путем замены среды каждые 3-4 суток и субкультивирования с последующим откреплением после достижения конфлюэнтности. Субкультивирование проводили, пока не достигали уровня SMDC от 1×107 до 5×107.In more detail, a skeletal muscle biopsy was collected from M. pectoralis major or M. biceps brachii from an incontinent patient. To obtain a biopsy, the skin was first opened by making an approximately 1 cm incision above the muscle until the fascia of M. pectoralis major was reached. After opening the fascia, 1 cm 3 of muscle tissue was taken (biopsy). The biopsy was transferred directly into biopsy transport medium, pre-cooled to approximately 4°C and containing Ham's F10 basic medium supplemented with gentamicin (final concentration 1-5 μg/ml). The biopsy was stored for approximately 26 hours at 1-11°C in biopsy transport medium. The biopsy was then transferred to a Petri dish filled with 1xPBS (phosphate buffered saline). The muscle tissue was separated from the connective tissue using sterile forceps and a scalpel. The muscle tissue was then transferred to another Petri dish filled with 1xPBS and cut into 2-3 mm 2 pieces using a scalpel. After an additional transfer step as described above, the tissue pieces were further cut into 1 mm pieces. Finally, the pieces were transferred to a centrifuge tube filled with 1xPBS and centrifuged for 10 minutes at 1300 rpm. After centrifugation, the supernatant was removed and muscle tissue was resuspended in 1xPBS supplemented with gentamicin (8 μg/ml). The muscle tissue suspension was then cooled to 2-8°C for 48 hours. After cooling, the muscle tissue suspension was centrifuged for 10 minutes at 1300 rpm, then the supernatant was removed and 2.5 ml of digestion solution containing 1-5 mg/ml collagenase, 2-4% (v/v) buffer was added HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid), 0.1-10% (v/v) fetal calf serum (FCS) and 5-10 μg/ml gentamicin in Ham's F10 medium. The muscle tissue suspension was then incubated for 6-20 hours at 37°C, 5% CO 2 . The suspension was then centrifuged at 1300 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed, the centrifugation pellet was resuspended in a medium containing 10-20% (v/v) FCS, 1-3 ng/ml bFGF (basic fibroblast growth factor) and 3-10 μg/ml gentamicin in Ham's F10 medium and seeded into cell culture flasks. SMDCs attached to the bottom of the culture flask were further maintained by replacing the medium every 3–4 days and subculturing, followed by detachment once confluence was achieved. Subculture was carried out until the SMDC level was reached from 1x10 7 to 5x10 7 .
Выделение мышиных миогенных клеток-предшественников (mMPC), происходящих из скелетных мышцIsolation of murine myogenic progenitor cells (mMPCs) derived from skeletal muscle
Мышиные МРС получали из биоптатов скелетных мышц Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J, кратко, мышей TdTomato (Jackson Laboratory, Maine, USA). Взрослых мышей умерщвляли посредством смещения шейных позвонков с последующим захватом и отделением кожи на спине. Затем с использованием ножниц и скальпеля получали скелетную мышцу из длинных мышц спины (Longissimus dorsi), икроножной мышцы (Gastrocnemius) и передней большеберцовой мышцы (Tibialis anterior). Мышцы переносили в стерильную чашку Петри и покрывали 1xPBS. Затем с использованием пинцета и скальпеля удаляли из скелетной мышцы и отбрасывали оставшуюся соединительную ткань. После этого мышечную ткань расщепляли, используя набор для расщепления скелетных мышц (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany), следуя инструкциям производителя. Для отделения миогенных клеток-предшественников (mMPC) от немиогенных SMDC использовали набор для выделения сателлитных клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Собранные mMPC и немиогенные SMDC центрифугировали, как описано выше, и ресуспендировали в среде для роста мышиных клеток, состоящей из DMEM (модифицированная Дульбекко среды Игла)/среда Хэма F12 с добавлением 20% FCS и bFGF. Мышиные SMDC культивировали в покрытых коллагеном колбах для культивирования, подготовленных путем покрытия поверхности колб для культивирования коллагеном I из хвоста крыс, разбавленным 1:10 в 1xPBS, в течение 1 часа при 37°С. Субкультивирования проводили так же, как и для SMDC человека. Наконец, клетки открепляли от стенок сосуда для культивирования клеток, ресуспендировали в среде и использовали незамедлительно или подвергали криоконсервации в жидком азоте до дальнейшего применения.Murine MPCs were obtained from skeletal muscle biopsies of Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J, briefly, TdTomato mice (Jackson Laboratory, Maine, USA). Adult mice were sacrificed by cervical dislocation followed by grasping and slicing of dorsal skin. Skeletal muscle was then prepared using scissors and a scalpel from the long dorsi (Longissimus dorsi), gastrocnemius (Gastrocnemius) and tibialis anterior (Tibialis anterior) muscles. The muscles were transferred to a sterile Petri dish and covered with 1xPBS. The skeletal muscle was then removed using forceps and a scalpel and the remaining connective tissue was discarded. The muscle tissue was then digested using a skeletal muscle digestion kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) following the manufacturer's instructions. A satellite cell isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) was used to separate myogenic progenitor cells (mMPCs) from non-myogenic SMDCs according to the manufacturer's instructions. Collected mMPCs and non-myogenic SMDCs were centrifuged as described above and resuspended in murine cell growth medium consisting of DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)/Ham's F12 medium supplemented with 20% FCS and bFGF. Mouse SMDCs were cultured in collagen-coated culture flasks prepared by coating the surface of the culture flasks with rat tail collagen I diluted 1:10 in 1xPBS for 1 hour at 37°C. Subcultures were performed in the same manner as for human SMDC. Finally, cells were detached from the walls of the cell culture vessel, resuspended in medium, and used immediately or cryopreserved in liquid nitrogen until further use.
Выделение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (MSC), происходящих из скелетных мышц человекаIsolation of multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) derived from human skeletal muscle
MSC выделяли согласно Thurner и др., 2018. Сначала SMDC выделяли из биоптатов мышц (Musculus pectoralis major или Latissimus dorsi) и размножали в среде с цГМФ (циклический гуанозинмонофосфат). Клетки поддерживали с использованием стандартных методов культивирования клеток. Кратко, клетки культивировали в среде для роста, содержащей основную среду Хэма F-10 с добавлением 10% FCS (инактивированной при 57°С в течение 40 минут), bFGF и гентамицин, и инкубировали при 37°С, 5% CO2. Среду для роста заменяли каждые 2-3 суток. Для проведения субкультивирования и сбора клетки один раз промывали 1xPBS и инкубировали с 1х раствором трипсина в течение 5 минут при 37°С. Клетки промывали средой для роста и центрифугировали при 400*g в течение 10 минут, супернатант отбрасывали и осадок после центрифугирования ресуспендировали в среде для роста. Затем MSC очищали методом сортировки магнитно-активированных клеток (MACS). Для этого использовали набор MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) для CD56 человека. Кратко, после сбора и подсчета клетки центрифугировали при 400*g в течение 10 минут, супернатант отбрасывали и клетки ресуспендировали в 10 мл буфера для MACS. После следующей стадии центрифугирования (400*g в течение 10 минут) осадок после центрифугирования ресуспендировали в 80 мкл буфера для MACS. Затем добавляли 20 мкл обладающего магнитными свойствами антитела к CD56 на 1×107 клеток и инкубировали в течение 15 минут при 4°С. После этого осуществляли сортировку клеток с использованием сепаратора Mini MACS, и CD56- MSC собирали в проходящем потоке. Наконец, клетки ресуспендировали в среде и подвергали криоконсервации в жидком азоте до дальнейшего применения, либо использовали незамедлительно.MSCs were isolated according to Thurner et al., 2018. First, SMDCs were isolated from muscle biopsies (Musculus pectoralis major or Latissimus dorsi) and propagated in cGMP (cyclic guanosine monophosphate) medium. Cells were maintained using standard cell culture techniques. Briefly, cells were cultured in growth medium containing Ham's F-10 basal medium supplemented with 10% FCS (inactivated at 57°C for 40 minutes), bFGF and gentamicin, and incubated at 37°C, 5% CO 2 . The growth medium was replaced every 2-3 days. For subculture and collection, cells were washed once with 1xPBS and incubated with 1x trypsin solution for 5 minutes at 37°C. Cells were washed with growth medium and centrifuged at 400*g for 10 minutes, the supernatant was discarded and the centrifugation pellet was resuspended in growth medium. MSCs were then purified by magnetically activated cell sorting (MACS). For this purpose, a MicroBeads kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) for human CD56 was used. Briefly, after collection and counting, cells were centrifuged at 400*g for 10 min, the supernatant was discarded, and the cells were resuspended in 10 ml MACS buffer. After the next centrifugation step (400*g for 10 minutes), the centrifugation pellet was resuspended in 80 μl of MACS buffer. Then 20 μl of magnetic CD56 antibody was added per 1×10 7 cells and incubated for 15 minutes at 4°C. Cell sorting was then performed using a Mini MACS separator and CD56-MSCs were collected in flow. Finally, cells were resuspended in medium and cryopreserved in liquid nitrogen until further use or used immediately.
Пример 2. Трансдифференцировка SMDC в iSMC и их выделение МРС, мышиные МРС или MSC, полученные в примере 1, высевали на стенки сосуда для культивирования и культивировали в среде для роста до конфлюэнтности примерно 70%. Затем клетки один раз промывали DMEM/F12 (Thermo Scientific, MA, USA). Затем клетки покрывали средой для дифференцировки гладких мышц, состоящей из смеси DMEM/F12 с добавлением рекомбинантного TGFb1 человека (Thermo Scientific, MA, USA), натриевой соли гепарина из слизистой оболочки кишечника свиньи (Sigma-Aldrich Co. LLC, МО, USA), инактивированной нагреванием (57°С, 40 минут) фетальной телячьей сывороткой (Gibco, Thermo Scientific, MA, USA) и гентамицина (Sandoz GmbH, Tirol, Austria) до конечной концентрации 10 нг/мл; 3,84 мкг/мл и 5% (об./об.) соответственно. Окончательно клетки культивировали в среде для дифференцировки гладких мышц в течение 3-6 суток при 37°С, 5% СО2. Среду заменяли каждые 3-4 суток. Для выделения клетки открепляли от стенок сосудов для культивирования и собирали в виде суспензии.Example 2 Transdifferentiation of SMDCs into iSMCs and Their Isolation MPCs, murine MPCs or MSCs obtained in Example 1 were seeded onto the walls of a culture vessel and cultured in growth medium to approximately 70% confluency. Cells were then washed once with DMEM/F12 (Thermo Scientific, MA, USA). The cells were then coated with smooth muscle differentiation medium consisting of DMEM/F12 supplemented with recombinant human TGFb1 (Thermo Scientific, MA, USA), sodium heparin from porcine intestinal mucosa (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA), heat-inactivated (57°C, 40 minutes) fetal bovine serum (Gibco, Thermo Scientific, MA, USA) and gentamicin (Sandoz GmbH, Tirol, Austria) to a final concentration of 10 ng/ml; 3.84 μg/ml and 5% (v/v), respectively. Finally, the cells were cultured in smooth muscle differentiation medium for 3-6 days at 37°C, 5% CO 2 . The medium was replaced every 3-4 days. For isolation, cells were detached from the walls of culture vessels and collected as a suspension.
Пример 3. Дифференцировочный потенциал SMDCExample 3. Differentiation potential of SMDC
Для осуществления адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировки in vitro в каждый из 6-луночных планшетов (NUNC, Thermo Scientific, MA, USA) высевали по 500000 клеток, полученных согласно примеру 1, и культивировали в среде для роста в течение 24 часов при 37°С, 5% СО2. Затем клетки один раз промывали 5 мл смеси DMEM/Хэма F12 и в каждом случае покрывали 5 мл среды для адипогенной, хондрогенной или остеогенной дифференцировки. Среда для адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировки состояла из основной среды для остеогенной/адипогенной дифференцировки StemXVivo™ (R&D Systems Inc., MN, USA с добавлением среды для адипогенной дифференцировки для человека/мыши/крысы StemXVivo (R&D Systems Inc., MN, USA), добавкой для остеогенной дифференцировки для человека StemXVivo (R&D Systems Inc., MN, USA) или добавкой для хондрогенеза STEMPro® (Gibco®, Thermo Scientific, MA, USA) соответственно, согласно инструкциям производителя. Кроме того, в среды для дифференцировки добавляли гентамицин (Sandoz GmbH, Austria) с достижением конечной концентрации 3,83 мкг/мл. В каждом случае клетки культивировали в течение 14 суток в соответствующей среде для дифференцировки, которую меняли каждые 2-3 суток. Через 14 суток культивирования успешность дифференцировки оценивали по присутствию адипоцитов, хондроцитов и остеоцитов, визуализированных посредством окрашивания с использованием масляного красного О (адипоциты), альцианового синего (хондроциты) и ализаринового красного S (остеоциты) соответственно. Количественное определение окрашивания масляным красным О, альциановым синим и ализариновым красным S проводили с использованием микроскопических изображений, полученных в результате многих отдельных экспериментов, с помощью программного пакета Image j. В связи с этим, загружали изображения и выполняли разделение цветовых каналов. Красные каналы использовали для регистрации окрашивания масляным красным О и ализариновым красным S, в то время как синий канал использовали для регистрации окрашивания альциановым синим. Фон устраняли путем настройки общего порога, а для количественного определения с применением Image j использовали среднюю интенсивность пикселей в поле. Статистическое сравнение проводили, применяя непарный t-критерий Стьюдента, считая значение р<0,05 значимым (*). р<0,01, р<0,001 отмечали как * или ** соответственно. Дифференцировку скелетных мышц инициировали в культуре клеток в 24-луночных пластиковых планшетах Nunclon™ Delta Surface (Thermo Scientific, MA, USA) путем замены ростовой среды на среду для дифференцировки клеток скелетных мышц (500 мл, PromoCell GmbH, Germany), с добавлением 10 мл добавки к среде для дифференцировки клеток скелетных мышц (PromoCell GmbH, Germany) и 240 мкл раствора гентамицина (8 мг/мл; Sandoz GmbH, Austria), как описано ранее (Thurner и др., 2018).To carry out adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation in vitro, 500,000 cells obtained according to example 1 were seeded into each of the 6-well plates (NUNC, Thermo Scientific, MA, USA) and cultured in growth medium for 24 hours at 37°C C, 5% CO 2 . The cells were then washed once with 5 ml of DMEM/Ham's F12 mixture and in each case covered with 5 ml of adipogenic, chondrogenic or osteogenic differentiation medium. Adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation media consisted of StemXVivo™ Osteogenic/Adipogenic Differentiation Basic Medium (R&D Systems Inc., MN, USA with the addition of StemXVivo Human/Mouse/Rat Adipogenic Differentiation Medium (R&D Systems Inc., MN, USA ), StemXVivo Human Osteogenic Differentiation Supplement (R&D Systems Inc., MN, USA) or STEMPro® Chondrogenesis Supplement (Gibco®, Thermo Scientific, MA, USA), respectively, according to the manufacturer's instructions. In addition, differentiation media were added. gentamicin (Sandoz GmbH, Austria) to achieve a final concentration of 3.83 μg/ml. In each case, the cells were cultured for 14 days in the appropriate differentiation medium, which was changed every 2-3 days. After 14 days of cultivation, the success of differentiation was assessed by the presence. adipocytes, chondrocytes, and osteocytes visualized by staining with oil red O (adipocytes), alcian blue (chondrocytes), and alizarin red S (osteocytes), respectively. Quantification of oil red O, alcian blue, and alizarin red S staining was performed using microscopic images obtained from many individual experiments using the Image j software package. In this regard, images were loaded and color channel separation was performed. The red channels were used to record oil red O and alizarin red S staining, while the blue channel was used to record alcian blue staining. Background was removed by adjusting the overall threshold, and the average pixel intensity in the field was used for quantification using Image j. Statistical comparisons were performed using an unpaired Student's t test, considering a p value <0.05 significant (*). p<0.01, p<0.001 were noted as * or **, respectively. Skeletal muscle differentiation was initiated in cell culture in 24-well plastic Nunclon™ Delta Surface plates (Thermo Scientific, MA, USA) by replacing the growth medium with skeletal muscle cell differentiation medium (500 ml, PromoCell GmbH, Germany), with the addition of 10 ml skeletal muscle cell differentiation medium supplements (PromoCell GmbH, Germany) and 240 μl of gentamicin solution (8 mg/ml; Sandoz GmbH, Austria) as previously described ( Thurner et al., 2018 ).
МРС и MSC, полученные согласно примеру 1, тестировали в отношении дифференцировки in vitro в адипогенные, хондрогенные, остеогенные и скелетные миогенные линии клеток в соответствующих условиях культивирования. Окрашивание на адипоциты, хондроциты, остеоциты и мышечные трубочки осуществляли так, как описано ранее. Клетки с положительным окрашиванием масляным красным О и ализариновым красным S отсутствовали в МРС, и можно было обнаружить только низкие уровни клеток с окрашивания альциановым синим. Среди MSC, после культивирования в среде для адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировки, были обнаружены клетки с положительным окрашиванием масляным красным О, альциановым синим и ализариновым красным S соответственно (Фиг. 1А, В), что подтверждало их обогащение мультипотентными клетками и статус мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, как определено Международным обществом по клеточной терапии (Dominici и др., 2006). Только в МРС были обнаружены десмин-положительные многоядерные мышечные трубочки (Фиг. 1А). Количественное определение интенсивности окрашивания масляным красным О, альциановым синим и ализариновым красным S после адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировки in vitro соответственно, а также расчет индекса слияния после скелетно-миогенной дифференцировки MSC и МРС выявили значительно более высокую интенсивность окрашивания масляным красным О (р=0,0117), альциановым синим (р=0,0020) и ализариновым красным S (р=0,0012) MSC по сравнению с МРС, в то время как более высокий индекс слияния (р=0,0007) был обнаружен у МРС по сравнению с MSC (Фиг. 1В). Таким образом, МРС представляют собой мезенхимальные олигопотентные клетки, коммитированные в миогенную линию. Кроме того, MSC являются мультипотентными и способны к адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировке in vitro.MPCs and MSCs prepared according to Example 1 were tested for in vitro differentiation into adipogenic, chondrogenic, osteogenic and skeletal myogenic cell lines under appropriate culture conditions. Staining for adipocytes, chondrocytes, osteocytes, and myotubes was performed as previously described. Cells with positive oil red O and alizarin red S staining were absent from the MRS, and only low levels of cells with alcian blue staining could be detected. Among MSCs, after culture in adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation media, cells with positive staining for oil red O, alcian blue and alizarin red S, respectively, were found (Fig. 1A, B), confirming their enrichment in multipotent cells and the status of multipotent mesenchymal stromal cells, as defined by the International Society for Cell Therapy (Dominici et al., 2006). Only in MRS were desmin-positive multinucleated myotubes detected ( Fig. 1A ). Quantification of oil red O, alcian blue, and alizarin red S staining intensity after adipogenic, chondrogenic, and osteogenic differentiation in vitro, respectively, and calculation of the fusion index after skeletal myogenic differentiation of MSCs and MPCs revealed significantly higher oil red O staining intensity (p= 0.0117), Alcian Blue (p=0.0020) and Alizarin Red S (p=0.0012) MSC compared to MPC, while a higher fusion index (p=0.0007) was found in MPC compared with MSC (Figure 1B). Thus, MPCs are mesenchymal oligopotent cells committed to the myogenic lineage. In addition, MSCs are multipotent and capable of adipogenic, chondrogenic, and osteogenic differentiation in vitro.
Пример 4. Экспрессия поверхностных маркеровExample 4: Expression of Surface Markers
Чтобы оценить экспрессию поверхностных маркеров, выполняли проточную цитометрию на проточном питометре Guava easyCyte 6НТ 2L (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). Кратко, клетки, полученные согласно примеру 1, собирали, покрывая 1х раствором трипсина при 37°С в течение 5 минут, центрифугировали при 400*g и ресуспендировали в 1xPBS с добавлением 1% FCS. 40000 клеток ресуспендировали в 195 мкл 1xPBS и инкубировали после добавления 5 мкл CD34-PE, CD56-PE, CD146-PE, IgG1-PE, IgG1-FITC, CD90-PE, CD105-PE (все от Beckman Coulter, СА, USA), CD49a-FITC (Miltenyi Biotec, Germany) или CD73-PE (Becton Dickinson, NJ, USA) в течение 30 минут в пробирке типа эппендорф объемом 1,5 мл при 4°С в темноте. Затем клетки промывали 1 мл PBS, центрифугировали при 400*g в течение 10 минут и ресуспендировали в 195 мкл 1xPBS в 96-луночном круглодонном планшете. Затем в каждую реакционную смесь вносили 5 мкл красителя для определения жизнеспособности, 7-аминоактиномицина D (Beckman Coulter Inc., France), и планшет инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре (КТ) в темноте. Наконец, используя программное обеспечение Guava InCyte™ в версии 2.3, получали информацию о клеточных событиях. Гистограммы и точечные диаграммы получали на основании как минимум 5000 событий при скорости потока образца 1,8 мкл/мл. Факт положительного окрашивания подтверждали путем сравнения с изотипическим контролем, установленным как отрицательный на по меньшей мере 95%, или путем сравнения с контрольными (отрицательными) клетками.To assess the expression of surface markers, flow cytometry was performed on a Guava easyCyte 6HT 2L flow pitometer (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). Briefly, cells obtained according to example 1 were collected by covering with 1x trypsin solution at 37°C for 5 minutes, centrifuged at 400*g and resuspended in 1x PBS supplemented with 1% FCS. 40,000 cells were resuspended in 195 µl 1xPBS and incubated after adding 5 µl CD34-PE, CD56-PE, CD146-PE, IgG1-PE, IgG1-FITC, CD90-PE, CD105-PE (all from Beckman Coulter, CA, USA) , CD49a-FITC (Miltenyi Biotec, Germany) or CD73-PE (Becton Dickinson, NJ, USA) for 30 minutes in a 1.5 ml Eppendorf tube at 4°C in the dark. Cells were then washed with 1 ml PBS, centrifuged at 400*g for 10 minutes and resuspended in 195 µl 1xPBS in a 96-well round bottom plate. Each reaction mixture was then spiked with 5 μL of viability dye, 7-aminoactinomycin D (Beckman Coulter Inc., France), and the plate was incubated for 10 min at room temperature (RT) in the dark. Finally, using Guava InCyte™ software version 2.3, information about cellular events was obtained. Histograms and scatter plots were obtained from a minimum of 5000 events at a sample flow rate of 1.8 μL/mL. Positive staining was confirmed by comparison with an isotype control set to be at least 95% negative or by comparison with control (negative) cells.
Чтобы охарактеризовать МРС и MSC, по меньшей мере 4 образца от отдельных пациентов, полученные способами, использованными в примере 1, а также iSMC, происходящие из них способами, использованными в примере 2, тестировали на наличие маркеров мезенхимальных линий (CD105, CD90 и CD73), гемопоэтического маркера (CD34), миогенного маркера (CD56) и маркера линии гладких мышц (CD146). Среднее значение % положительных клеток, составляющее ≥50, рассматривали как положительное, в то время как среднее значение<50% рассматривали как отрицательное. Таким образом, было обнаружено, что клетки всех типов оказались положительными в отношении CD105, CD90 и CD73, но отрицательными в отношении CD34 (Фиг. 2). Более того, МРС и происходящие из них iSMC оказались CD56+, a MSC и происходящие из них iSMC оказались CD56-.To characterize MPCs and MSCs, at least 4 samples from individual patients obtained by the methods used in Example 1, as well as iSMCs derived from them by the methods used in Example 2, were tested for the presence of mesenchymal lineage markers (CD105, CD90 and CD73) , hematopoietic marker (CD34), myogenic marker (CD56) and smooth muscle lineage marker (CD146). A mean of % positive cells of ≥50 was considered positive, while a mean of <50% was considered negative. Thus, all cell types were found to be positive for CD105, CD90, and CD73 but negative for CD34 (Figure 2). Moreover, MPCs and their iSMCs were CD56+, and MSCs and their iSMCs were CD56−.
Интересно, что экспрессия поверхностного маркера CD146, ассоциированного с коммитированием MSC в гладкие мышцы сосудов (Espagnolle и др., 2014), и CD49a, экспрессируемого в процессе развития гладких мышц (Belkin и др., 1990), была отрицательной как в МРС, так и в MSC, но положительной в происходящих из них iSMC (Фиг. 2).Interestingly, the expression of the surface marker CD146, associated with MSC commitment to vascular smooth muscle (Espagnolle et al., 2014), and CD49a, expressed during smooth muscle development (Belkin et al., 1990), were negative in both MSC and and in MSCs, but positive in iSMCs derived from them (Fig. 2).
Пример 5. Экспрессия внутриклеточных маркеровExample 5 Expression of Intracellular Markers
Проводили иммунофлуоресцентное окрашивание для обнаружения экспрессии внутриклеточных маркеров непосредственно на покрытых желатином 24-луночных планшетах или покровных стеклах, помещенных в 6-луночные планшеты, как описано ранее (Thurner и др., 2018). Для флуоресцентного иммуномечения альфа-актина гладких мышц (aSMA), смутелина или десмина клетки инкубировали с мышиным антителом к альфа-актину гладких мышц (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA), с мышиным антителом к смутелину (Merck Millipore, MA, USA), с антителом к тяжелой цепи миозина гладких мышц (Merck Millipore, MA, USA) или с кроличьим антителом к десмину (Thermo Scientific, MA, USA) соответственно, в каждом случае разбавленными 1:100 в среде для блокирования. Использовали вторичные козьи антимышиные антитела, конъюгированные с Alexa488, или ослиные антикроличьи антитела, конъюгированные с Alexa547 (Thermo Scientific, MA, USA), разбавленные 1:200 в среде для блокирования. Контрастное окрашивание ядер проводили посредством инкубации клеток с красителем Хехст33342 (Sigma-Aldrich Co. LLC, МО, USA), разбавленным до конечной концентрации 2 мкг/мл в PBST (PBS с 0,1% тритона Х-100). Клетки заливали средой Entellan® (Merck Millipore, MA, USA) и герметично закрывали покровными стеклами. Результаты окрашивания сравнивали с (1) методиками без первичных антител и (2) с клетками, отрицательными в отношении к тестируемым антителам. Для количественного определения положительных клеток осуществляли наложение картин окрашивания с использованием красителя Хехст и с использованием антител и анализировали множественные изображения по меньшей мере трех независимых препаратов клеток. Общее количество клеток с положительным окрашиванием антителами делили на общее количество клеток (ядер) по оценкам с окрашиванием Хехст. Для сравнения клеток, полученных в примерах 1 и 2, рассчитывали значения средней и стандартной ошибки.Immunofluorescence staining was performed to detect the expression of intracellular markers directly on gelatin-coated 24-well plates or coverslips placed in 6-well plates as previously described ( Thurner et al., 2018 ). For fluorescent immunolabeling of alpha smooth muscle actin (aSMA), smoothelin or desmin, cells were incubated with mouse anti-alpha smooth muscle actin antibody (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA), with mouse anti-smotelin antibody (Merck Millipore, MA, USA), with anti-smooth muscle myosin heavy chain antibody (Merck Millipore, MA, USA) or with rabbit anti-desmin antibody (Thermo Scientific, MA, USA), respectively, in each case diluted 1:100 in blocking medium. Alexa488-conjugated goat anti-mouse or Alexa547-conjugated donkey anti-rabbit antibodies (Thermo Scientific, MA, USA) diluted 1:200 in blocking medium were used. Nuclear counterstaining was performed by incubating cells with Hoechst33342 dye (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA) diluted to a final concentration of 2 μg/ml in PBST (PBS with 0.1% Triton X-100). Cells were embedded in Entellan® medium (Merck Millipore, MA, USA) and sealed with coverslips. Staining results were compared with (1) techniques without primary antibodies and (2) with cells negative for the antibodies tested. To quantify positive cells, Hoechst and antibody staining patterns were superimposed and multiple images of at least three independent cell preparations were analyzed. The total number of cells with positive antibody staining was divided by the total number of cells (nuclei) assessed with Hoechst staining. To compare the cells obtained in examples 1 and 2, the values of the mean and standard error were calculated.
МРС и MSC, полученные согласно примеру 1, а также происходящие из них iSMC, описанные в примере 2, анализировали в отношении экспрессии внутриклеточных сократительных белков гладких мышц (aSMA, смутелин), а также общего миогенного маркера десмина, посредством флуоресцентного иммуноокрашивания. МРС и MSC являлись aSMA- и смутелин-. В противоположность этому было обнаружено, что iSMC, выделенные как из MSC, так и из МРС, являлись aSMA+ (Фиг. 3). Кроме того, было обнаружено, что iSMC, выделенные из МРС как в примере 2, являлись смутелин+. Анализ внутриклеточной экспрессии десмина выявил, что MSC и выделенные из них iSMC являлись десмин-. В противоположность этому, и МРС, и выделенные из них iSMC являются десмин+ (Фиг. 3).The MPCs and MSCs obtained according to Example 1, as well as the iSMCs derived from them described in Example 2, were analyzed for the expression of intracellular smooth muscle contractile proteins (aSMA, smoothelin), as well as the common myogenic marker desmin, by fluorescent immunostaining. MPC and MSC were aSMA- and smoothelin-. In contrast, iSMCs isolated from both MSCs and MPCs were found to be aSMA+ (Figure 3). In addition, it was found that iSMC isolated from MPC as in Example 2 were smoothelin+. Analysis of intracellular desmin expression revealed that MSCs and iSMCs isolated from them were desmin-. In contrast, both MPCs and iSMCs isolated from them are desmin+ (Figure 3).
Пример 6. Экспрессия геновExample 6 Gene Expression
Суммарную РНК из 1×106 МРС или MSC, в каждом случае полученных, как показано в примере 1, и происходящих из них iSMC, как показано в примере 2, выделяли с использованием набора RNEasy (QIAGEN, Hilden, Germany) согласно инструкциям производителей. Подготовку образцов для микроматричной гибридизации осуществляли, как описано в руководствах NuGEN Ovation PicoSL WTA System V2 и NUGEN Encore Biotin Module (NuGEN Technologies, Inc., San Carlos, CA, USA). Гибридизованные матрицы промывали и окрашивали в Affymetrix Fluidics Station FS450 и сигналы флуоресценции измеряли с использованием Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G. Управление жидкостями и функциями сканирования осуществляли, используя программное обеспечение Affymetrix GeneChip Command Console в версии 4.1.3. Обработку образцов проводили в сервис-бюро и центральной лаборатории фирмы Affimetrix, "KFB - Center of Excellence for Fluorescent Bioanalytics" (Regensburg, Germany).Total RNA from 1×10 6 MPCs or MSCs, in each case obtained as shown in example 1, and iSMCs derived from them, as shown in example 2, was isolated using the RNEasy kit (QIAGEN, Hilden, Germany) according to the manufacturers' instructions. Sample preparation for microarray hybridization was performed as described in the NuGEN Ovation PicoSL WTA System V2 and NUGEN Encore Biotin Module manuals (NuGEN Technologies, Inc., San Carlos, CA, USA). Hybridized arrays were washed and stained in an Affymetrix Fluidics Station FS450 and fluorescence signals were measured using an Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G. Fluids and scanning functions were controlled using Affymetrix GeneChip Command Console software version 4.1.3. Samples were processed in the service bureau and central laboratory of Affimetrix, "KFB - Center of Excellence for Fluorescent Bioanalytics" (Regensburg, Germany).
Суммарные сигналы от набора зондов по шкале log2 рассчитывали, используя алгоритм RMA с применением Affymetrix GeneChip Expression Console в версии 1.4. Идентификаторы набора зондов с наивысшим log2-кратным изменением между МРС и MPC-iSMC использовали для последующего анализа и сравнения с log2-кратными изменениями между MSC и MSC-iSMC. Обзор всех проанализированных генов и соответствующие log2-кратные изменения между MSC и MSC-iSMC, а также между МРС и MPC-iSMC показаны на Фиг 12. Log2-кратные изменения ≥1 рассматривались как признак положительной регуляции и поэтому отмечены звездочкой (*). Для визуализации log2-кратных изменений и выполнения иерархической кластеризации, а также кластеризации k-средних в соответствии с эвклидовым расстоянием создавали тепловые карты с использованием программного обеспечения Multiple Expression Viewer (MeV 3.1.0).Total probe set log2 signals were calculated using the RMA algorithm using Affymetrix GeneChip Expression Console version 1.4. Probe set IDs with the highest log2-fold change between MPC and MPC-iSMC were used for subsequent analysis and comparison with log2-fold change between MSC and MSC-iSMC. An overview of all genes analyzed and the corresponding log2-fold changes between MSC and MSC-iSMC, and between MPC and MPC-iSMC are shown in Figure 12. Log2-fold changes ≥1 were considered as an indication of up-regulation and are therefore marked with an asterisk (*). Heat maps were generated using Multiple Expression Viewer (MeV 3.1.0) software to visualize log2-fold changes and perform hierarchical clustering as well as k-means clustering according to Euclidean distance.
Для исследования изменений генной экспрессии, ассоциированных с выделением iSMC по настоящему изобретению, проводили микроматричный анализ. Подробно анализировали смутелин (SMTN), кальпонин 1 (CNN1), тропомиозин 1 (ТРМ1), трансгелин (TGLN, SM22), интегрин-альфа-3 (ITGA3), интегрин-альфа-1 (ITGA1, CD49a), винкулин (VCL) и ген молекулы клеточной адгезии клеток меланомы (МСАМ, CD146) (Espagnolle и др., 2014; Miano, 2010; Xie и др., 2011), а также связанный с миогенным коммитированием ген десмина (DES) (Capetanaki и др., 1997) вместе со всеми генами, необходимыми для сокращения гладких мышц сосудов ("KEGG PATHWAY: Vascular smooth muscle contraction - Homo sapiense (human)" дата не указана). Изменения в экспрессии генов между МРС и происходящими из них iSMC сравнивали с изменениями между MSC и происходящими из них iSMC. Считая значение log2 FC, равное 1 или более, и значение log2 FC, равное -1 или менее, соответствующими положительной и отрицательной регуляции соответственно, 20,33 процента из 123 протестированных генов характеризовались положительной регуляцией и только 3,25 процента отрицательной регуляцией в процессе дифференцировки МРС в MPC-iSMC, что свидетельствует о дифференцировке в направлении фенотипа клеток гладких мышц. Характеризующиеся положительной регуляцией гены KEGG кластера или известные маркерные гены клеток гладких мышц в MPC-iSMC в сравнении с МРС представляли собой PPP1R14A (от англ. protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 14A), KCNMB1 (от англ. potassium calcium-activated channel subfamily M regulatory beta subunit 1), PLCB4 (от англ. фосфолипаза С, форма β 4), ACTG2 (от англ. actin gamma 2), ITPR1 (от англ. inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1), ADCY6 (от англ. adenylate cyclase type 6), CALCRL (от англ. calcitonin gene-related peptide type 1 receptor precursor), KCNMA1, GNA13 (от англ. guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13), CNN1, ADCY2 (от англ. adenylate cyclase type 2), KCNMB4, GUCY1A3 (от англ. guanylate cyclase soluble subunit alpha-3), ARAF (от англ. A-Raf proto-oncogene), ITGA1, PPP1R12A, MAPK1 (от англ. митоген-активируемая протеинкиназа 1), CALD1 (от англ. non-muscle caldesmon), KCNMB2, PRKACB (от англ. cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta), ARHGEF11 (от англ. rho guanine nucleotide exchange factor 11), PPP1R12C, ITPR2, PLCB1 и SMTN (Фиг. 12).Microarray analysis was performed to examine gene expression changes associated with the isolation of iSMCs according to the present invention. Smutelin (SMTN), calponin 1 (CNN1), tropomyosin 1 (TPM1), transgelin (TGLN, SM22), integrin alpha 3 (ITGA3), integrin alpha 1 (ITGA1, CD49a), vinculin (VCL) were analyzed in detail. and the melanoma cell adhesion molecule (MCAM, CD146) gene (Espagnolle et al., 2014; Miano, 2010; Xie et al., 2011), as well as the myogenic commitment-associated desmin gene (DES) (Capetanaki et al., 1997 ) along with all the genes necessary for the contraction of vascular smooth muscle ("KEGG PATHWAY: Vascular smooth muscle contraction - Homo sapiense (human)" no date specified). Changes in gene expression between MPCs and their derived iSMCs were compared with changes between MSCs and their derived iSMCs. Considering a log2 FC value of 1 or more and a log2 FC value of -1 or less to correspond to positive and negative regulation, respectively, 20.33 percent of the 123 genes tested were up-regulated and only 3.25 percent were down-regulated during differentiation MPC in MPC-iSMC, indicating differentiation towards a smooth muscle cell phenotype. The genes of the KEGG cluster characterized by positive regulation or known marker genes of smooth muscle cells in MPC-iSMC in comparison with MPC were PPP1R14A (from the English protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 14A), KCNMB1 (from the English potassium calcium-activated channel subfamily M regulatory beta subunit 1), PLCB4 (from the English phospholipase C, form β 4), ACTG2 (from the English actin gamma 2), ITPR1 (from the English inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1), ADCY6 (from the English adenylate cyclase type 6), CALCRL (from the English calcitonin gene-related peptide type 1 receptor precursor), KCNMA1, GNA13 (from the English guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13), CNN1, ADCY2 (from the English adenylate cyclase type 2), KCNMB4, GUCY1A3 (guanylate cyclase soluble subunit alpha-3), ARAF (A-Raf proto-oncogene), ITGA1, PPP1R12A, MAPK1 (mitogen-activated protein kinase 1), CALD1 (from the English non-muscle caldesmon), KCNMB2, PRKACB (from the English cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta), ARHGEF11 (from the English. rho guanine nucleotide exchange factor 11), PPP1R12C, ITPR2, PLCB1 and SMTN (Fig. 12).
Считая значение log2 FC, равное 1 или больше, и значение log2 FC, равное -1 или меньше, как соответствующие положительной и отрицательной регуляции соответственно, 12,20 процента из 123 протестированных генов характеризовались положительной регуляцией и только 3,25 процента отрицательной регуляцией в процессе дифференцировки MSC в MSC-iSMC, что свидетельствует о дифференцировке в направлении фенотипа клеток гладких мышц. Характеризующимися положительной регуляцией генами KEGG кластера или известными маркерными генами клеток гладких мышц в MSC-iSMC в сравнении с MSC были АСТА2 (от англ. actin alpha 2), ACTG2, CALD1, GNAQ (от англ. guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha), ITPR1, MAPK1, MYL9 (от англ. myosin regulatory light polypeptide 9), KCNMA1, PLCB4, PPP1R14A, PRKCE (от англ. protein kinase С epsilon type), CNN1, TPM1, TAGLN (трансгелин) и ITGA1 (Фиг. 12). Данные о том, что экспрессия гена ITGA1, кодирующего белок CD49a, и SMTN, кодирующего белки смутелина, характеризовалась положительной регуляцией в MPC-iSMC, подкрепляют данные авторов настоящего изобретения о повышенном процентном содержании CD49a-положительных клеток и смутелин-положительных клеток в MPC-iSMC по сравнению с МРС, подтверждая тем самым экспрессию маркеров клеток гладких мышц в MPC-iSMC. Данные о том, что экспрессия гена ITGA1, кодирующего CD49a, характеризовалась положительной регуляцией в MSC-iSMC, подкрепляют данные авторов настоящего изобретения о повышенном процентном содержании CD49a-положительных клеток в MSC-iSMC по сравнению с MSC, подтверждая тем самым экспрессию маркеров клеток гладких мышц в MSC-iSMC.Considering a log2 FC value of 1 or greater and a log2 FC value of -1 or less as corresponding to positive and negative regulation, respectively, 12.20 percent of the 123 genes tested were positively regulated and only 3.25 percent were negatively regulated in the process differentiation of MSCs into MSC-iSMCs, indicating differentiation towards a smooth muscle cell phenotype. Up-regulated KEGG cluster genes or known smooth muscle cell marker genes in MSC-iSMC compared to MSC were ACTA2 (actin alpha 2), ACTG2, CALD1, GNAQ (guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha), ITPR1, MAPK1, MYL9 (myosin regulatory light polypeptide 9), KCNMA1, PLCB4, PPP1R14A, PRKCE (protein kinase C epsilon type), CNN1, TPM1, TAGLN (transgelin) and ITGA1 (Fig. . 12). The data that the expression of the ITGA1 gene, encoding the CD49a protein, and SMTN, encoding the smoothelin proteins, was characterized by positive regulation in MPC-iSMC, reinforces the data of the authors of the present invention about the increased percentage of CD49a-positive cells and smoothelin-positive cells in MPC-iSMC compared with MPC, thereby confirming the expression of smooth muscle cell markers in MPC-iSMC. The finding that the expression of the ITGA1 gene encoding CD49a was up-regulated in MSC-iSMCs reinforces our findings of an increased percentage of CD49a-positive cells in MSC-iSMCs compared to MSCs, thereby confirming the expression of smooth muscle cell markers in MSC-iSMC.
Несмотря на то, что экспрессия поверхностного белка CD146 (МСАМ) характеризовалась положительной регуляцией в MPC-iSMC, в экспериментах с микроматрицами не было обнаружено, что экспрессия гена МСАМ характеризовалась положительной регуляцией, что свидетельствует о посттранскрипционной регуляции экспрессии CD146. Кроме того, кластерный анализ k-средних для log2 FC измененной генной экспрессии в МРС и MSC в процессе дифференцировки в MPC-iSMC и MSC-iSMC привел к идентификации одинаково положительно (Фиг. 4А) и отрицательно регулированных (Фиг. 4В) генов среди МРС и MSC, когда из них были выделены iSMC соответственно. В то время как PP1R14A, ACTG2, PLCB4, ITPR1, МАРК1, CNN1, ITGA1 и KCNMA1 характеризовались положительной регуляцией как в МРС, так и в MSC, ген PLA2G2A (от англ. group 2А secretory phospholipase А2, membrane associated precursor) характеризовался отрицательной регуляцией в обоих типах клеток. В целом, 75,61 процента протестированных генов одинаковым образом характеризуются положительной, отрицательной регуляцией или не подвергаются регуляции как в МРС, так и в MSC в процессе дифференцировки в iSMC. Хотя, в МРС было обнаружено большее количество генов с положительной регуляцией и меньшее количество генов с отрицательной регуляцией (20,33% с положительной и 3,25% с отрицательной регуляцией), чем в MSC (12,20% с положительной и 5,69% с отрицательной регуляцией), никакой значимой разницы в процентном содержании характеризующихся положительной или отрицательной регуляцией генов между МРС и MSC не обнаружено (Фиг. 4С).Although CD146 surface protein (MCAM) expression was up-regulated in MPC-iSMCs, MCAM gene expression was not found to be up-regulated in microarray experiments, suggesting post-transcriptional regulation of CD146 expression. Additionally, k-means cluster analysis of log2 FC altered gene expression in MPCs and MSCs during differentiation into MPC-iSMCs and MSC-iSMCs resulted in the identification of equally up-regulated (Figure 4A) and down-regulated (Figure 4B) genes among MPCs and MSCs when iSMCs were isolated from them, respectively. While PP1R14A, ACTG2, PLCB4, ITPR1, MAPK1, CNN1, ITGA1 and KCNMA1 were characterized by positive regulation in both MPCs and MSCs, the PLA2G2A gene (from the English group 2A secretory phospholipase A2, membrane associated precursor) was characterized by negative regulation in both cell types. Overall, 75.61 percent of the genes tested were similarly upregulated, downregulated, or not regulated in both MPCs and MSCs during differentiation into iSMCs. Although, more up-regulated genes and fewer down-regulated genes were found in MPCs (20.33% up-regulated and 3.25% down-regulated) than in MSC (12.20% up-regulated and 5.69% up-regulated). % down-regulated), no significant difference was found in the percentage of up- or down-regulated genes between MPCs and MSCs (Fig. 4C).
Пример 7. Способность к слияниюExample 7: Fusion Ability
Способность к слиянию МРС и iSMC из примеров 1 и 2, соответственно, оценивали согласно их индексу слияния (FI). Чтобы определить индекс слияния (FI), клетки, индуцированные для дифференцировки клеток скелетных мышц в примере 3, дважды промывали PBS и фиксировали 4% PFA (параформальдегид) в течение 10 минут. Затем клетки трижды промывали PBS и окрашивали 2 мкг/мл раствором Хехст33342 в течение 20 минут. Для каждого образца во время визуализации иммунофлуоресценции фиксировали по меньшей мере три поля и осуществляли наложение с фазово-контрастными изображениями, чтобы облегчить детектирование ядер и границ клеток. Индекс слияния рассчитывали для каждого фиксированного поля посредством деления количества ядер в трубочках на общее количество ядер в поле с последующим расчетом среднего значения для всех проанализированных полей. Только клетки, которые имеют по меньшей мере 3 ядра, считались мышечными трубочками. Для статистического анализа в каждой группе анализировали по меньшей мере 3 популяции, полученные от разных пациентов.The fusion ability of MPCs and iSMCs from Examples 1 and 2, respectively, was evaluated according to their fusion index (FI). To determine fusion index (FI), cells induced to differentiate into skeletal muscle cells in Example 3 were washed twice with PBS and fixed with 4% PFA (paraformaldehyde) for 10 minutes. Cells were then washed three times with PBS and stained with 2 μg/ml Hoechst33342 for 20 minutes. For each sample, at least three fields were recorded during immunofluorescence imaging and overlaid with phase-contrast images to facilitate detection of nuclei and cell boundaries. The fusion index was calculated for each fixed field by dividing the number of nuclei in the tubules by the total number of nuclei in the field and then calculating the average for all fields analyzed. Only cells that have at least 3 nuclei were considered myotubes. For statistical analysis, at least 3 populations obtained from different patients were analyzed in each group.
Количественное определение FI показало, что значительно большее количество МРС претерпевало скелетный миогенез по сравнению с iSMC, выделенными из них в примере 2, что свидетельствует об уменьшении скелетно-миогенного потенциала МРС после выделения iSMC из МРС (Фиг. 5А). Кроме того, трубочки, образованные iSMC, содержали значительно меньше ядер, чем трубочки, образованные МРС (Фиг. 5В). В целом, МРС оказываются компетентными в отношении слияния, в то время как происходящие из них iSMC можно считать некомпетентными в отношении слияния.Quantification of FI showed that significantly more MPCs underwent skeletal myogenesis compared to the iSMCs isolated from them in Example 2, indicating a decrease in the skeletal myogenic potential of MPCs after the isolation of iSMCs from MPCs (Figure 5A). In addition, tubules formed by iSMC contained significantly fewer nuclei than tubules formed by MPC (Figure 5B). In general, MPCs appear to be fusion competent, while iSMCs derived from them can be considered fusion incompetent.
Пример 8. ЭлектрофизиологияExample 8. Electrophysiology
Анализ с использованием метода пэтч-кламп проводили на МРС и iSMC, полученных в примерах 1 и 2 соответственно, согласно ранее опубликованному протоколу (Park и др., 2013) с небольшой конкретной адаптацией эксперимента. Операции осуществляли следующим образом. Электрофизиологическую регистрацию проводили в конфигурации «целая клетка» с использованием усилителя для пэтч-кламп Axopatch 200А (Axon Instruments, Foster City). Пипетки для пэтч-кламп с сопротивлением 1-4 MΩ были выполнены из боросиликатного стекла (GC150F-7.5, Clark Electromedical Instruments, UK) и заполнены раствором для пипеток. Все данные оцифровывали с использованием интерфейса DIGIDATA 1200 (Axon Instruments, Foster City), сглаживали с помощью четырехполюсного фильтра Бесселя и сохраняли на диске. Кривые токов регистрировали при 10 кГц и фильтровали при 2 кГц. Для сбора данных использовали пакет программ pClamp (в версии 10.0 от Axon Instruments, Inc.). Для проведения анализа использовали Microcal Origin 7.0. Если не указано иное, реагенты получали от Sigma-Aldrich. Входящий ток потенциал-зависимых Cav-каналов вызывали приложением деполяризующих импульсов (500 мс) от удерживающего потенциала от -50 до 50 мВ. Наложенные кривые токов от Kv-каналов вызывали ступенчатыми деполимеризующими импульсами от -80 до 60 мВ с шагом 20 мВ от удерживающего потенциала от 80 мВ в случае МРС, MPC-iSMC и hBd-SMC.Patch clamp analysis was performed on the MPCs and iSMCs obtained in Examples 1 and 2, respectively, according to a previously published protocol (Park et al., 2013) with minor specific adaptations to the experiment. The operations were carried out as follows. Electrophysiological recordings were performed in a whole-cell configuration using an Axopatch 200A patch-clamp amplifier (Axon Instruments, Foster City). Patch clamp pipettes with a resistance of 1–4 MΩ were made of borosilicate glass (GC150F-7.5, Clark Electromedical Instruments, UK) and filled with pipette solution. All data were digitized using a DIGIDATA 1200 interface (Axon Instruments, Foster City), smoothed using a four-pole Bessel filter, and stored on disk. Current traces were recorded at 10 kHz and filtered at 2 kHz. The pClamp software package (version 10.0 from Axon Instruments, Inc.) was used for data acquisition. Microcal Origin 7.0 was used for analysis. Unless otherwise stated, reagents were obtained from Sigma-Aldrich. The inward current of voltage-gated Ca v channels was induced by applying depolarizing pulses (500 ms) from a holding potential of -50 to 50 mV. Superimposed current curves from K v channels were induced by stepwise depolymerizing pulses from −80 to 60 mV in 20 mV steps from a holding potential of 80 mV in the case of MPC, MPC-iSMC, and hBd-SMC.
Было обнаружено, что клетки, полученные согласно примеру 2, не демонстрировали чувствительных к напряжению входящих и выходящих токов потенциал-зависимых кальциевых или потенциал-зависимых калиевых каналов соответственно. В противоположность этому, iSMC, происходящие из МРС в примере 2, продемонстрировали чувствительные к напряжению как входящие, так и выходящие токи, что также было обнаружено в hBd-SMC (Фиг. 6). Таким образом, выделение iSMC посредством инкубации с TGFb1 и гепарином приводит к функциональному созреванию.It was found that cells prepared according to Example 2 did not exhibit voltage-sensitive inward and outward currents of voltage-gated calcium channels or voltage-gated potassium channels, respectively. In contrast, iSMCs derived from MPCs in example 2 exhibited voltage-sensitive both inward and outward currents, which was also found in hBd-SMCs (Figure 6). Thus, isolation of iSMCs by incubation with TGFb1 and heparin leads to functional maturation.
Пример 9. Сокращение решетки коллагенового геляExample 9 Reduction of Collagen Gel Lattice
Чтобы измерить сократительную способность, MSC и МРС, полученные согласно примеру 1, а также происходящие из них iSMC согласно примеру 2, рассевали в решетке коллагенового геля и выполняли количественное определение уменьшения размера геля в процентном отношении. Подробнее, удаляли культуральные среды от субконфлюэнтных клеток из стандартных сосудов для культивирования клеток, и клетки дважды промывали 1xPBS. Затем клетки покрывали трипсином и инкубировали в течение 5 минут при 37°С. После этого клетки открепляли, постукивая по стенкам сосуда для культивирования, и ресуспендировали после добавления основной среды DMEM/среда Хэма F12. Затем клетки центрифугировали при 400*g в течение 10 минут.To measure contractility, MSCs and MPCs obtained according to Example 1, as well as iSMCs derived from them according to Example 2, were dispersed into a collagen gel lattice and the percentage reduction in gel size was quantified. In detail, culture media from subconfluent cells was removed from standard cell culture vessels and cells were washed twice with 1xPBS. The cells were then coated with trypsin and incubated for 5 minutes at 37°C. The cells were then detached by tapping the walls of the culture vessel and resuspended after adding DMEM/Ham's F12 basal medium. The cells were then centrifuged at 400*g for 10 minutes.
Супернатант удаляли и клеточный осадок после центрифугирования ресуспендировали в DMEM/среда Хэма F12 с получением 6*105 клеток в мл. Для каждого геля 400 мкл клеточной суспензии смешивали с 200 мкл раствора коллагена из кожи крупного рогатого скота (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA). Затем добавляли 3 мкл 0,1 М раствора NaOH, после чего сразу же выполняли ресуспендирование и перенос 500 мкл этой смеси в лунку 24-луночного планшета (NUNC, Thermo-Fisher Scientific, MA, USA). Затем 24-луночный планшет инкубировали в течение 30 минут при 37°С для образования геля. После этого каждый гель покрывали 500 мкл DMEM/среда Хэма F12 и открепляли от дна 24-луночного планшета, чтобы он плавал на поверхности, используя стерильный наконечник для пипетки. Наконец, гели инкубировали при 37°С, 5% CO2 в течение 24 часов, чтобы обеспечить сокращение геля под действием включенных клеток. Для количественной оценки степени сокращения геля получали стереомикроскопические изображения и площадь геля рассчитывали с использованием программного обеспечения FIJI (Image J).The supernatant was removed and the cell pellet after centrifugation was resuspended in DMEM/Ham's F12 medium to obtain 6*10 5 cells per ml. For each gel, 400 μl of cell suspension was mixed with 200 μl of bovine skin collagen solution (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA). Then, 3 μL of 0.1 M NaOH solution was added, after which 500 μL of this mixture was immediately resuspended and transferred into a well of a 24-well plate (NUNC, Thermo-Fisher Scientific, MA, USA). The 24-well plate was then incubated for 30 minutes at 37°C to form a gel. Each gel was then coated with 500 μl of DMEM/Ham's F12 medium and released from the bottom of a 24-well plate to float on the surface using a sterile pipette tip. Finally, the gels were incubated at 37°C, 5% CO 2 for 24 hours to allow the gel to contract under the influence of the included cells. To quantify the extent of gel contraction, stereomicroscopic images were obtained and the gel area was calculated using FIJI software (Image J).
В анализе сокращения решетки коллагенового геля было обнаружено, что МРС и MSC, выделенные в соответствии со стадией (а) настоящего изобретения (пример 1), не обладают сократительной способностью. В противоположность этому, iSMC, выделенные в соответствии со стадией (б) настоящего изобретения (пример 2) из МРС и MSC показали значительно более высокую сократительную способность, чем клетки, из которых они происходят (МРС, MSC). Таким образом, было обнаружено, что SMDC, трансдифференцированные в iSMC и выделенные в соответствии со стадией (б) (пример 2), обладают сократительной способностью по сравнению с клетками, выделенными на стадии (а) (пример 1; Фиг. 7).In a collagen gel lattice contraction assay, it was found that MPCs and MSCs isolated in accordance with step (a) of the present invention (Example 1) do not have contractility. In contrast, iSMCs isolated according to step (b) of the present invention (Example 2) from MPCs and MSCs showed significantly higher contractility than the cells from which they originate (MSCs, MPCs). Thus, SMDCs transdifferentiated into iSMCs and isolated according to step (b) (Example 2) were found to have contractility compared to cells isolated in step (a) (Example 1; FIG. 7).
Пример 10. Регенерация гладких мышц с использованием iSMCExample 10: Smooth muscle regeneration using iSMC
Для проверки потенциала iSMC, полученных согласно примеру 2, в отношении регенерации гладких мышц, iSMC, происходящие из мышиных МРС (полученные согласно примеру 1) инъецировали в сфинктер привратника взрослым самкам мышей линии SHO-PrkdcscidHrhr. Для этого мышей сначала анестезировали путем применения 100 мг/кг кетамина, 10 мг/кг ксилазина и 3 мг/кг ацепромазина внутрибрюшинно. Во время этой процедуры применяли защитный крем для глаз. Криоконсервированные клетки снова размораживали, один раз промывали 1xPBS и центрифугировали при 400*g в течение 10 минут, после чего клетки ресуспендировали в 1xPBS с достижением конечной концентрации 40000000 клеток/мл. Тем временем мышей, которые получали клетки, помещали на греющую плиту для поддержания температуры тела при 37°С. Затем 25 мкл клеточной суспензии (содержащей 1000000 клеток) смешивали с 5 мкл полистирольных гранул FluoSpheres®, 15 мкм, желто-зеленых или синих (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA), необходимых для отслеживания места инъекции после хирургической операции. Для инъекции iSMC в сфинктер привратника выполняли срединную лапаротомию с последующей локализацией области сфинктера привратника и применением 30 мкл смеси клеток с FluoSpheres, используя иглу калибра 28G, соединенную со шприцем объемом 1 мл. Слой брюшины и кожно-мышечной ткани закрывали по отдельности последовательным сшиванием с использованием рассасывающейся одноволоконной хирургической нити 6-0 PDS plus (полидиоксанон с асептическим покрытием) (Ethicon). В послеоперационном периоде применяли 200 мг новалгина (Metamizol®) на килограмм массы тела подкожно в течение трех суток. Через 12 недель после инъекции клеток мышей умерщвляли смещением шейных позвонков для получения образцов и изображения мышц сфинктера привратника.To test the smooth muscle regeneration potential of iSMCs prepared in Example 2, murine MPC-derived iSMCs (prepared in Example 1) were injected into the pyloric sphincter of adult female SHO-Prkdc scid Hr hr mice. To do this, mice were first anesthetized with 100 mg/kg ketamine, 10 mg/kg xylazine, and 3 mg/kg acepromazine intraperitoneally. A protective eye cream was used during this procedure. Cryopreserved cells were thawed again, washed once with 1xPBS and centrifuged at 400*g for 10 minutes, after which the cells were resuspended in 1xPBS to achieve a final concentration of 40,000,000 cells/ml. Meanwhile, the mice that received the cells were placed on a hot plate to maintain their body temperature at 37°C. Then, 25 μl of cell suspension (containing 1,000,000 cells) was mixed with 5 μl of FluoSpheres® polystyrene beads, 15 μm, yellow-green or blue (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA), required for tracking the injection site after surgery. To inject iSMC into the pyloric sphincter, a midline laparotomy was performed, followed by localization of the pyloric sphincter region and application of 30 μl of cell mixture with FluoSpheres using a 28-gauge needle connected to a 1-ml syringe. The peritoneal and musculocutaneous tissue layers were closed separately by serial suturing using 6-0 PDS plus (aseptic-coated polydioxanone) absorbable single-filament surgical suture (Ethicon). In the postoperative period, 200 mg of novalgin (Metamizol®) per kilogram of body weight was administered subcutaneously for three days. Twelve weeks after cell injection, mice were sacrificed by cervical dislocation to sample and image the pyloric sphincter muscles.
Визуализацию только что выделенных областей сфинктера привратника проводили с использованием системы визуализации in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer, MA, USA), применяя программное обеспечение Living Image®, версия 4.5.2 (PerkinElmer, MA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, сфинктеры привратника подвергнутых инъекции и контрольных SHO-мышей помещали в стеклянную чашку Петри и размещали в системе IVIS. Получали флуоресцентные изображения на высоте 2 см с автоматическим временем экспозиции для соответствующих длин волн поглощения и излучения TdTomato и желтых гранул Fluosphere. После этого интенсивности сигналов корректировали, чтобы избавиться от фоновых сигналов, сравнивая с эксплантатами сфинктера от контрольных мышей.Imaging of newly isolated areas of the pyloric sphincter was performed using the IVIS Spectrum in vivo imaging system (PerkinElmer, MA, USA) using Living Image® software version 4.5.2 (PerkinElmer, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. Briefly, pyloric sphincters from injected and control SHO mice were placed in a glass Petri dish and placed in the IVIS system. Fluorescence images were acquired at a height of 2 cm with automatic exposure times for the corresponding absorption and emission wavelengths of TdTomato and Fluosphere yellow beads. Signal intensities were then adjusted to eliminate background signals by comparison with sphincter explants from control mice.
Для гистологического анализа животных подвергали глубокой анестезии изофлураном и умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Интересующую ткань незамедлительно иссекали и криофиксировали посредством помещения в охлажденный жидким азотом 2-метилбутан. С использованием криостата Leica 1950 делали срезы ткани толщиной 15 мкм, помещали на предметные стекла Superfrost plus и хранили при -20°С до дальнейшей обработки. Для проведения иммуногистологического анализа срезы фиксировали 4%-ным раствором PFA и промывали PBS, содержащим 0,1% твин-20 (Sigma-Aldrich). Блокирование и разбавление антител осуществляли, используя раствор PBS, содержащий 1% фракции бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich), 0,2% желатина рыбьей кожи (Sigma-Aldrich) и 0,1% твин-20 (Sigma-Aldrich). Первичные антитела к tdTomato (Sicgen) или aSMA (Thermo Scientific, MA, USA) разбавляли 1:100 в среде для блокирования, последующую инкубацию проводили в течение ночи при 4°С. Вторичные антитела (Thermo Scientific) разбавляли 1:500 и применяли при комнатной температуре в течение 4 часов. Ядра окрашивали раствором DAPI, разбавленным до рабочей концентрации 0,5 мкг/мл (Sigma-Aldrich). После этого срезы закрепляли, используя реагент Prolong Gold Antifade (Life Technologies). Флуоресцентные изображения получали, используя конфокальный микроскоп LSM 710 и программное обеспечение ZEN 2011 Black (Carl Zeiss).For histological analysis, animals were deeply anesthetized with isoflurane and sacrificed by cervical dislocation. The tissue of interest was immediately excised and cryofixed by placing it in liquid nitrogen-cooled 2-methylbutane. Using a Leica 1950 cryostat, tissue sections were cut at 15 µm thickness, placed on Superfrost plus slides and stored at -20°C until further processing. For immunohistological analysis, sections were fixed with 4% PFA and washed with PBS containing 0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich). Antibody blocking and dilution were performed using a PBS solution containing 1% bovine serum albumin fraction (Sigma-Aldrich), 0.2% fish skin gelatin (Sigma-Aldrich), and 0.1% Tween-20 (Sigma-Aldrich). Primary antibodies to tdTomato (Sicgen) or aSMA (Thermo Scientific, MA, USA) were diluted 1:100 in blocking medium, followed by overnight incubation at 4°C. Secondary antibodies (Thermo Scientific) were diluted 1:500 and applied at room temperature for 4 hours. Nuclei were stained with DAPI solution diluted to a working concentration of 0.5 μg/ml (Sigma-Aldrich). Sections were then mounted using Prolong Gold Antifade reagent (Life Technologies). Fluorescence images were obtained using an LSM 710 confocal microscope and ZEN 2011 Black software (Carl Zeiss).
Авторы изобретения обнаружили, что iSMC, выделенные согласно примеру 2 из экспрессирующих репортерный белок TdTomato МРС, полученных согласно примеру 1, поддавались обнаружению и были солокализованы с совместно введенными флуоресцентными гранулами в области сфинктера привратника через 12 недель после имплантации, что свидетельствует о приживлении iSMC в месте инъекции. Гистологическое исследование с последующим флуоресцентным иммуноокрашиванием на TdTomato и aSMA показало, что TdTomato-положительные клетки iSMC были обнаружены внутри кольцевой мышцы сфинктера привратника, а также в мышечном слое слизистой оболочки рядом с совместно введенными флуоресцентными гранулами (Фиг. 8). TdTomato-положительные клетки iSMC, расположенные в слое гладких мышц сфинктера привратника, также экспрессировали белок aSMA, что свидетельствует не только о приживлении в ткани гладких мышц, но также о сохранении фенотипических характеристик клеток гладких мышц после приживления, необходимого для регенерации гладких мышц (Фиг. 8).We found that iSMCs isolated in Example 2 from TdTomato reporter protein-expressing MPCs prepared in Example 1 were detectable and colocalized with co-injected fluorescent beads in the pyloric sphincter region 12 weeks postimplantation, indicating engraftment of iSMCs at the site. injections. Histological examination followed by fluorescent immunostaining for TdTomato and aSMA showed that TdTomato-positive iSMC cells were found within the circular pyloric sphincter muscle as well as in the muscular layer of the mucosa adjacent to the co-injected fluorescent beads (Fig. 8). TdTomato-positive iSMC cells located in the smooth muscle layer of the pyloric sphincter also expressed aSMA protein, indicating not only engraftment into smooth muscle tissue, but also maintenance of the phenotypic characteristics of smooth muscle cells after engraftment necessary for smooth muscle regeneration (Fig. 8).
Пример 11. Инжиниринг ткани гладких мышцExample 11 Smooth muscle tissue engineering
Чтобы исследовать пригодность клеток, полученных способами, описанными в данной заявке, для применения в инжиниринге тканей, проводили 3D-культивирование клеток. Использовали метод, позволяющий получить кольцеобразные сфинктероподобные структуры, уже известный в данной области техники (Gwyther и др., 2011), используя клетки, полученные согласно примеру 1 или 2. Для получения культуральных сосудов для 3D-культивирования, изготавливали матрицу с кольцевидной резьбой (внутренний диаметр 4 мм; внешний диаметр 10 мм) из нержавеющей стали для получения автоклавируемой негативной PDMS (полидиметилсилоксан) матрицы. Затем готовили 2%-ный (масс/об.) раствор агарозы, отвешивая 5 г агарозы с низкой температурой гелеобразования (Sigma-Aldrich, MA, USA) в колбу Schott®, заполненную до 250 мл основной средой Хэма F10. Затем и PDMS- матрицу и раствор агарозы автоклавировали при 121°С в течение 20 минут. Затем PDMS матрицу заполняли раствором агарозы в стерильных условиях, после чего инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, чтобы дать агарозе затвердеть. На следующей стадии затвердевшую агарозу высвобождали из PDMS матрицы, из агарозы вырезали кубики, каждый из которых содержал одну кольцеобразную матрицу, и переносили в 6-луночный планшет, заполненный 2 мл основной среды Хэма F10, после чего хранили при 37°С до дальнейшего применения. Для 3D-культивирования, клетки, полученные в примере 1, центрифугировали при 400*g в течение 10 минут и клеточный осадок после центрифугирования ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 5×106 клеток/мл. Затем в агарозную матрицу добавляли 200 мкл клеточной суспензии, после чего инкубировали при 37°С в течение 48 часов без дальнейших сотрясений, чтобы позволить клеткам образовать кольца. По окончании времени инкубации среду вне матрицы в 6-луночном планшете отбрасывали и в 6-луночный планшет осторожно вносили 5 мл среды, как в примере 1, для получения 3D-культур МРС или MSC, либо любой из них, как в примере 2, для получения 3D-культур iSMC. Клетки культивировали в течение 6 суток, чтобы достичь созревания, при 37°С, 5% СО2 до проведения анализа. Через 6 суток культивирования клетки анализировали с использованием стандартной световой микроскопии, приготовления криосрезов с последующим иммуноокрашиванием (пример 12) или окрашиванием Н&Е (гематоксилином и эозином), сканирующей электронной микроскопии или приготовления полу/ультратонких срезов с последующим окрашиванием толуидиновым синим или с использованием трансмиссионной электронной микроскопии. МРС, полученные согласно примеру 1, которые подвергали трансдифференцировке с получением iSMC, как описано в примере 2, формировали кольцеобразные сфинктеры с применением описанных выше методов, основанных на работе Gwyther и др., 2014 (Фиг. 9).To investigate the suitability of cells obtained by the methods described herein for use in tissue engineering, 3D cell culture was performed. A method was used to obtain ring-shaped sphincter-like structures, already known in the art (Gwyther et al., 2011), using cells obtained according to example 1 or 2. To obtain culture vessels for 3D cultivation, a matrix with a ring-shaped thread (internal diameter 4 mm; outer diameter 10 mm) from stainless steel to obtain an autoclavable negative PDMS (polydimethylsiloxane) matrix. A 2% (w/v) agarose solution was then prepared by weighing 5 g of low gel point agarose (Sigma-Aldrich, MA, USA) into a Schott® flask filled to 250 ml with Ham's basic medium F10. Then, both the PDMS matrix and the agarose solution were autoclaved at 121°C for 20 minutes. The PDMS matrix was then filled with the agarose solution under sterile conditions, followed by incubation at room temperature for 1 hour to allow the agarose to solidify. In the next step, the solidified agarose was released from the PDMS matrix, the agarose was cut into cubes, each containing one ring-shaped matrix, and transferred to a 6-well plate filled with 2 ml of Ham's F10 basic medium, and then stored at 37°C until further use. For 3D cultivation, the cells obtained in example 1 were centrifuged at 400*g for 10 minutes and the cell pellet after centrifugation was resuspended in the culture medium to obtain a concentration of 5×10 6 cells/ml. 200 μL of cell suspension was then added to the agarose matrix, followed by incubation at 37°C for 48 hours without further shaking to allow the cells to form rings. At the end of the incubation time, the medium outside the matrix in the 6-well plate was discarded and 5 ml of medium was carefully added to the 6-well plate, as in example 1, to obtain 3D cultures of MPCs or MSCs, or any of them, as in example 2, to obtaining 3D iSMC cultures. Cells were cultured for 6 days to reach maturation at 37°C, 5% CO 2 before analysis. After 6 days of culture, cells were analyzed using standard light microscopy, cryosectioning followed by immunostaining (Example 12) or H&E (hematoxylin and eosin) staining, scanning electron microscopy or semi/ultrathin sectioning followed by toluidine blue staining or transmission electron microscopy . MPCs prepared in Example 1 that were transdifferentiated to iSMCs as described in Example 2 were formed into ring-shaped sphincters using the methods described above based on the work of Gwyther et al., 2014 (Figure 9).
Пример 12. Приготовления криосрезов и иммуноокрашивание Example 12 Preparation of cryosections and immunostaining
Для гистологического анализа кольцеобразных 3D-культур (биоинженерные сфинктеры), полученных согласно примеру 11, кольца осторожно извлекали из агарозной матрицы и, с использованием стерильной ложки, промывали путем переноса в пробирку типа эппендорф, заполненную 1xPBS, и затем фиксировали и подвергали пермеабилизации путем погружения в предварительно охлажденный до -20°С MetOH на 5 минут. Затем кольца промывали, три раза разбавляя MetOH 1xPBS после удаления половины раствора. Биоинженерные сфинктеры криофиксировали путем быстрого погружения в охлажденный в жидком азоте 2-метилбутан. Из образца делали срезы толщиной 15 мкм с использованием криостата СМ1950 (Leica, Germany) и срезы помещали на предметные стекла Superfrost plus (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA) и хранили при -20°С до дальнейшей обработки. Блокирование и разбавление антител осуществляли, используя раствор PBS, содержащий 1% фракции бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA), 0,2% желатина рыбьей кожи (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA) и 0,1% твин-20 (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA). Первичное антитело к aSMA (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA) разбавляли 1:100 в среде для блокирования, после чего инкубировали в течение ночи при 4°С. Вторичные антитела (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA) разбавляли 1:500 и использовали при комнатной температуре в течение 4 часов. Ядра окрашивали DAPI, разбавленным до рабочей концентрации 0,5 мкг/мл (Sigma-Aldrich Co. LLC, МО, USA), и филаменты актина окрашивали посредством инкубирования с фаллоидином (Thermo-Fisher Scientific, MA USA), разбавленным 1:100 в PBS, в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого срезы закрепляли, используя Prolong Gold Antifade (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA). Флуоресцентные изображения получали, используя инвертированный микроскоп Nikon Eclipse TE2000-U.For histological analysis of the ring-shaped 3D cultures (bioengineered sphincters) prepared according to Example 11, the rings were carefully removed from the agarose matrix and, using a sterile spoon, washed by transferring into an Eppendorf tube filled with 1xPBS, and then fixed and permeabilized by immersion in pre-cooled to -20°C MetOH for 5 minutes. The rings were then washed by diluting three times with MetOH 1xPBS after half the solution had been removed. Bioengineered sphincters were cryofixed by rapid immersion in liquid nitrogen-cooled 2-methylbutane. The sample was sectioned at 15 μm thickness using a CM1950 cryostat (Leica, Germany) and the sections were placed on Superfrost plus slides (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA) and stored at -20°C until further processing. Blocking and dilution of antibodies was carried out using a PBS solution containing 1% bovine serum albumin fraction (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA), 0.2% fish skin gelatin (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA) and 0.1% Tween-20 (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA). Primary antibody to aSMA (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA) was diluted 1:100 in blocking medium and then incubated overnight at 4°C. Secondary antibodies (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA) were diluted 1:500 and used at room temperature for 4 hours. Nuclei were stained with DAPI diluted to a working concentration of 0.5 μg/ml (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA), and actin filaments were stained by incubation with phalloidin (Thermo-Fisher Scientific, MA USA), diluted 1:100 in PBS, for 20 minutes at room temperature. Sections were then mounted using Prolong Gold Antifade (Thermo-Fisher Scientific, MA, USA). Fluorescence images were obtained using a Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope.
Было обнаружено, что клетки в кольцах ткани, полученных согласно примеру 10, были положительными в отношении альфа-актина гладких мышц и десмина (Фиг. 10). В то время в кольцах ткани, происходящих из МРС, экспрессия aSMA осуществлялась в основном клетками внешнего слоя кольца, в содержащих iSMC кольцах ткани aSMA-экспрессирующие клетки были распределены по всему кольцу. Более конкретно, было обнаружено, что большее количество клеток в кольцах, которые были образованы из МРС, дифференцированных в iSMC в процессе 3D культивирования в соответствии с комбинацией примеров 2 и 10, экспрессировали aSMA, чем клетки в кольцах, которые были образованы из МРС (Фиг. 10). В противоположность этому, десмин экспрессировался во всех кольцах ткани, происходящих как из МРС, так и из iSMC (Фиг. 10).It was found that the cells in the tissue rings prepared according to Example 10 were positive for alpha smooth muscle actin and desmin (Figure 10). While in MPC-derived tissue rings aSMA expression was carried out mainly by cells in the outer layer of the ring, in iSMC-containing tissue rings aSMA-expressing cells were distributed throughout the entire ring. More specifically, it was found that more cells in rings that were formed from MPCs differentiated into iSMCs in the 3D culture process according to the combination of Examples 2 and 10 expressed aSMA than cells in rings that were formed from MPCs (Fig. . 10). In contrast, desmin was expressed in all tissue rings derived from both MPC and iSMC (Fig. 10).
Пример 13. Сканирующая электронная микроскопияExample 13: Scanning electron microscopy
Сканирующую электронную микроскопию проводили на факультете гистологии и эмбриологии Медицинского университета города Инсбрука, благодаря помощи Angelika Flörl и Kristian Pfaller. Для анализа 3D-культивированных клеток, полученных согласно примеру 1 и 2 (как описано в разделе 3.2.26), при помощи сканирующей электронной микроскопии кольца высвобождали из агарозных матриц, один раз промывали в пробирке Eppendorf® объемом 1,5 мл, используя 1xPBS, и затем фиксировали предварительно охлажденным (-20°С) MetOH с последующей фиксацией в течение 1 часа в 1%-ном растворе тетраоксида осмия, дегидратацией с использованием EtOH и сушкой в критической точки в установке для высушивания образцов в критической точке Bal-Tec CPD 030 (Balzers, Lichtenstein). Образцы закрепляли, используя проводящий армированный углеродными волокнами цемент Leit-C по Göcke (Piano GmbH, Wetzlar, Germany) на алюминиевых стержнях, покрытых методом напыления слоем Au/Pd 15 нм (Balzers), и исследовали на сканирующем электронном микроскопе Gemini 982 (Carl Zeiss). МРС, полученные согласно примеру 1 и подвергнутые трансдифференцировке в iSMC, как описано в примере 2, в процессе 3D-культивирования (пример 2), выглядели удлиненными и как неотъемлемая часть кольца ткани на поверхности колец ткани, которые были образованы в примере 10 (Фиг. 9). На поверхности кольца клетки выглядели неповрежденными и потенциально жизнеспособными (Фиг. 9).Scanning electron microscopy was performed at the Department of Histology and Embryology of the Medical University of Innsbruck, thanks to the help of Angelika Flörl and Kristian Pfaller. To analyze 3D cultured cells prepared according to Examples 1 and 2 (as described in section 3.2.26) by scanning electron microscopy, the rings were released from the agarose matrices, washed once in a 1.5 ml Eppendorf® tube using 1xPBS, and then fixed with pre-cooled (-20°C) MetOH, followed by fixation for 1 hour in 1% osmium tetroxide solution, dehydration using EtOH and critical point drying in a Bal-Tec CPD 030 critical point dryer. (Balzers, Lichtenstein). Specimens were cemented using Göcke conductive carbon fiber reinforced cement Leit-C (Piano GmbH, Wetzlar, Germany) onto sputter-coated aluminum rods with 15 nm Au/Pd (Balzers) and examined on a Gemini 982 scanning electron microscope (Carl Zeiss ). MPCs prepared according to Example 1 and transdifferentiated into iSMCs as described in Example 2 during the 3D culture process (Example 2) appeared elongated and as an integral part of the tissue ring on the surface of the tissue rings that were formed in Example 10 (Fig. 9). On the surface of the ring, the cells appeared intact and potentially viable (Figure 9).
Пример 14. Трансмиссионная электронная микроскопияExample 14 Transmission electron microscopy
Трансмиссионную электронную микроскопию проводили на кольцах ткани, полученных согласно примеру 10. Для этого кольца высвобождали из агарозной матрицы и переносили в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл, заполненную 1xPBS, для промывки. Затем образцы переносили в чистую пробирку Eppendorf®, заполненную 2,5%-ным глутаровым альдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,3), для фиксации и хранения (4°С). После фиксации по меньшей мере в течение 24 ч кольца дважды промывали фосфатным буфером и затем фиксировали в 1%-ном OsO4 в течение 45 минут. После этого кольца трижды промывали дистиллированной водой, каждый раз 15 минут. Затем кольца подвергали обезвоживанию в EtOH с возрастающей концентрацией (70, 80, 90, 100%), каждый раз в течение 30 минут, и после этого дважды инкубировали в свежей порции 100%-ного ацетона, каждый раз в течение 20 минут. Затем образцы погружали в смесь ацетон-эпон (2:1) на 150 минут, после чего инкубировали в смеси ацетон-эпон (1:2) в течение ночи. Наконец, кольца инкубировали при вращении в чистом эпоне на вращающем устройстве в течение 24 часов с заменой эпона через 8 часов. Для полимеризации эпона кольца инкубировали при 60°С в течение 24 часов. Залитые эпоном образцы подрезали, используя Ultratrim (Reichert), и ультратонкие срезы готовили, используя Ultracut S (Reichert). Ультратонкие срезы просматривали при 80 кВ с использованием трансмиссионного электронного микроскопа СМ120 ТЕМ (от Philips/FEI), оснащенного камерой с зарядовой связью (CCD) MORADA (от Olympus/SIS).Transmission electron microscopy was performed on tissue rings prepared in Example 10. To do this, the rings were released from the agarose matrix and transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube filled with 1xPBS for washing. Samples were then transferred to a clean Eppendorf® tube filled with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) for fixation and storage (4°C). After fixation for at least 24 hours, the rings were washed twice with phosphate buffer and then fixed in 1% OsO 4 for 45 minutes. After this, the rings were washed three times with distilled water, each time for 15 minutes. The rings were then dehydrated in increasing concentrations of EtOH (70, 80, 90, 100%), each time for 30 minutes, and then incubated twice in a fresh portion of 100% acetone, each time for 20 minutes. The samples were then immersed in acetone-epon (2:1) for 150 minutes, followed by incubation in acetone-epon (1:2) overnight. Finally, the rings were incubated while rotating in clean Epon on a rotator for 24 hours, with the Epon replaced after 8 hours. To polymerize the epon, the rings were incubated at 60°C for 24 hours. Epon-embedded specimens were trimmed using Ultratrim (Reichert), and ultrathin sections were prepared using Ultracut S (Reichert). Ultrathin sections were viewed at 80 kV using a CM120 TEM transmission electron microscope (from Philips/FEI) equipped with a MORADA charge-coupled device (CCD) camera (from Olympus/SIS).
Трансмиссионная электронная микроскопия колец ткани, полученных согласно примеру 10, выявила, что клетки сформировали кавеолы вблизи своей плазматической мембраны (Фиг. 11А и В). Кроме этого, было обнаружено, что клетки в кольцах ткани имели преобладающую актиновую структуру (Фиг. С), которая в некоторых частях клеток образовывала плотно упакованные структуры, подобные плотным тельцам (Фиг. D).Transmission electron microscopy of tissue rings obtained according to example 10 revealed that the cells formed caveolae close to their plasma membrane (Fig. 11A and B). In addition, it was found that the cells in the tissue rings had a predominant actin structure (Figure C), which in some parts of the cells formed densely packed structures similar to dense bodies (Figure D).
Пример 15. Экспрессия поверхностных маркеров в мышиных MPC-iSMC Example 15 Surface Marker Expression in Murine MPC-iSMC
Чтобы оценить экспрессию поверхностных маркеров в мышиных MPC-iSMC, выполняли проточную цитометрию на проточном цитометре Guava easyCyte 6НТ 2L (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). Кратко, мышиные MPC-iSMC, полученные согласно примеру 1, использовали для методов окрашивания с применением антител на имеющейся в продаже панели для скрининга мышиных маркеров клеточной поверхности (BD Biosciences, NJ, USA). Для этого клетки суспендировали в среде для роста в концентрации 1,25*106 клеток на мл и аликвоты клеточной суспензии объемом 100 мкл смешивали со всеми первичными антителами в 96-луночных планшетах в соответствии с инструкциями производителя. Эту смесь инкубировали в течение 30 минут при 4°С, после чего в каждую лунку добавляли по 100 мкл среды для роста, планшеты центрифугировали в течение 5 минут при 300*g, удаляли супернатант, в каждую лунку добавляли по 200 мкл среды для роста, центрифугировали еще раз, удаляли супернатант и клетки ресуспендировали в 100 мкл раствора биотинилированных вторичных антител (приготовленного в соответствии с инструкциями производителя). Клетки снова инкубировали в течение 30 минут при 4°С, после чего в каждую лунку добавляли по 100 мкл среды для роста, планшеты центрифугировали в течение 5 минут при 300*g, удаляли супернатант, в каждую лунку добавляли по 200 мкл среды для роста, центрифугировали еще раз, удаляли супернатант и клетки ресуспендировали в 100 мкл конъюгированного с Alexa647 стрептавидина (приготовленного в соответствии с инструкциями производителя). Клетки снова инкубировали в течение 30 минут при 4°С, после чего в каждую лунку добавляли по 100 мкл среды для роста, планшеты центрифугировали в течение 5 минут при 300*g, удаляли супернатант, в каждую лунку добавляли 200 мкл среды для роста, центрифугировали еще раз, удаляли супернатант и клетки ресуспендировали в 200 мкл среды Хэма F10 с добавлением 10% FCS. Наконец, используя программное обеспечение Guava InCyte™ в версии 2.3, получали информацию о клеточных событиях. Гистограммы и точечные диаграммы получали на основании как минимум 5000 событий при скорости потока образца 1,8 мкл/мл. Положительное окрашивание получали путем сравнения с изотипическим контролем, установленным по меньшей мере как отрицательный на 95%, или путем сравнения с контрольными (отрицательными) клетками. Было обнаружено, что мышиные iSMC из примера 3 являются CD49e- (Фиг. 13).To evaluate the expression of surface markers in mouse MPC-iSMCs, flow cytometry was performed on a Guava easyCyte 6HT 2L flow cytometer (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). Briefly, murine MPC-iSMCs prepared according to Example 1 were used for antibody staining methods on a commercially available murine cell surface marker screening panel (BD Biosciences, NJ, USA). To do this, cells were suspended in growth medium at a concentration of 1.25 * 10 6 cells per ml and 100 μl aliquots of the cell suspension were mixed with all primary antibodies in 96-well plates according to the manufacturer's instructions. This mixture was incubated for 30 minutes at 4°C, after which 100 μl of growth medium was added to each well, the plates were centrifuged for 5 minutes at 300*g, the supernatant was removed, 200 μl of growth medium was added to each well, centrifuged again, the supernatant was removed, and the cells were resuspended in 100 μl of biotinylated secondary antibody solution (prepared according to the manufacturer's instructions). The cells were again incubated for 30 minutes at 4°C, after which 100 μl of growth medium was added to each well, the plates were centrifuged for 5 minutes at 300*g, the supernatant was removed, 200 μl of growth medium was added to each well, centrifuged again, the supernatant was removed, and the cells were resuspended in 100 μl of Alexa647-conjugated streptavidin (prepared according to the manufacturer's instructions). The cells were again incubated for 30 minutes at 4°C, after which 100 μl of growth medium was added to each well, the plates were centrifuged for 5 minutes at 300*g, the supernatant was removed, 200 μl of growth medium was added to each well, and centrifuged. again, the supernatant was removed and the cells were resuspended in 200 μl of Ham's F10 medium supplemented with 10% FCS. Finally, using Guava InCyte™ software version 2.3, information about cellular events was obtained. Histograms and scatter plots were obtained from a minimum of 5000 events at a sample flow rate of 1.8 μL/mL. Positive staining was obtained by comparison with an isotype control set to at least 95% negative or by comparison with control (negative) cells. The murine iSMCs from Example 3 were found to be CD49e- (Figure 13).
Пример 16. Анализ внутриклеточного маркера методом проточной цитометрииExample 16. Analysis of intracellular marker by flow cytometry
Кратко, МРС и MPC-iSMC, полученные согласно примеру 1, собирали, покрывая прикрепленные клетки 1х трипсином при 37°С в течение 5 минут, после открепления клетки центрифугировали при 400×g. Выполняли подсчет числа клеток и отбирали аликвоты для получения 50000 клеток/реакционная смесь, которые затем центрифугировали при 400×g, после чего ресуспендировали в растворе для фиксации и пермеабилизации Cytofix/Cytoperm от BD (BD Biosciences, Pharmingen™) и инкубировали при 4°С в течение 20 мин. После этого клетки промывали буфером для пермеабилизации/промывки от BD (разбавленным 1:10 в дистиллированной воде) (BD Biosciences, Pharmingen™) и центрифугировали. Затем клетки ресуспендировали в 1×PBS и инкубировали с конъюгатом IgG изотипический контроль-Alexa488 (Bioss Antibodies Inc., MA, USA) или конъюгатом антитело к Рах-7-Alexa488 (Bioss Antibodies Inc., MA, USA) в течение 1 ч при 4°С в темноте. После этого клетки центрифугировали, промывали буфером для пермеабилизации/промывки от BD (разбавленным 1:10 в дистиллированной воде) и после заключительной стадии центрифугирования ресуспендировали в 1xPBS. Используя программное обеспечение Guava InCyte™ в версии 2.3, получали информацию о клеточных событиях. Гистограммы получали на основании как минимум 3000 событий при скорости потока образца 1,8 мкл/мл. Содержание положительно окрашенных клеток в процентах получали путем сравнения с изотипическим контролем, установленным как отрицательный на 99%.Briefly, MPCs and MPC-iSMCs prepared according to example 1 were collected by coating attached cells with 1x trypsin at 37°C for 5 minutes, after detachment, the cells were centrifuged at 400×g. Cell counts were performed and aliquots were taken to obtain 50,000 cells/reaction, which were then centrifuged at 400×g, then resuspended in BD Cytofix/Cytoperm Fixation and Permeabilization Solution (BD Biosciences, Pharmingen™) and incubated at 4°C. within 20 min. Cells were then washed with BD Permeabilization/Wash Buffer (diluted 1:10 in distilled water) (BD Biosciences, Pharmingen™) and centrifuged. Cells were then resuspended in 1×PBS and incubated with isotype control-Alexa488 IgG conjugate (Bioss Antibodies Inc., MA, USA) or anti-Pax-7 antibody-Alexa488 conjugate (Bioss Antibodies Inc., MA, USA) for 1 h at 4°C in the dark. Cells were then centrifuged, washed with BD permeabilization/wash buffer (diluted 1:10 in distilled water), and after a final centrifugation step, resuspended in 1xPBS. Using Guava InCyte™ software version 2.3, information about cellular events was obtained. Histograms were obtained from a minimum of 3000 events at a sample flow rate of 1.8 μL/mL. The percentage of positively stained cells was obtained by comparison with an isotype control set to 99% negative.
Пример 17. Анализ ферментативных активностейExample 17. Analysis of enzymatic activities
Измерение ацетилхолинэстеразной активностиMeasurement of acetylcholinesterase activity
Подготовка реагентов и стандартовPreparation of reagents and standards
Американская ассоциация общественного здравоохранения (АРНА). Фосфатный буфер, рН 7,2 (Sigma-Aldrich Co. LLC, Germany) готовили в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, добавляли 17 г порошкообразной смеси (монокалийфосфат 22,66 г/л и карбонат натрия 7,78 г/л) в 400 мл дистиллированной воды. После добавления 0,5 мл тритона Х-100 смесь растворяли с использованием магнитной мешалки в течение 30 минут при комнатной температуре. Конечный объем доводили до 500 мл в мерном цилиндре и использовали без дополнительного разбавления. Этот буфер хранили при 4°С до использования. Для каждого анализа AChE готовили свежий реактив Эллмана (5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота, DTNB; 0,5 мМ), отвешивая 2 мг в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл. Навеску растворяли в 1 мл фосфатного буфера (рН 7,2; с 0,1% тритона Х-100) путем вихревого перемешивания в течение 1-2 минут. Конечный объем доводили до 10 мл в пробирке фирмы Falcon объемом 15 мл с помощью фосфатного буфера (рН 7,2; с 0,1% тритона X-100), и хранили при 4°С до использования. Для каждого анализа AChE готовили свежий раствор ацетилхолина тиоиодида (ATI; 5,76 мМ), отвешивая 2 мг в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл. Навеску растворяли в 1,2 мл дистиллированной воды путем вихревого перемешивания в течение 1-2 минут и затем хранили при 4°С до использования.American Public Health Association (APHA). Phosphate buffer, pH 7.2 (Sigma-Aldrich Co. LLC, Germany) was prepared according to the manufacturer's instructions. Briefly, 17 g of powder mixture (monopotassium phosphate 22.66 g/L and sodium carbonate 7.78 g/L) was added to 400 ml of distilled water. After adding 0.5 ml Triton X-100, the mixture was dissolved using a magnetic stirrer for 30 minutes at room temperature. The final volume was adjusted to 500 ml in a graduated cylinder and used without further dilution. This buffer was stored at 4°C until use. For each AChE assay, fresh Ellman's reagent (5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid, DTNB; 0.5 mM) was prepared by weighing 2 mg into a 1.5-mL Eppendorf tube. The sample was dissolved in 1 ml of phosphate buffer (pH 7.2; with 0.1% Triton X-100) by vortex mixing for 1-2 minutes. The final volume was adjusted to 10 ml in a 15 ml Falcon tube with phosphate buffer (pH 7.2; with 0.1% Triton X-100) and stored at 4°C until use. For each AChE assay, a fresh solution of acetylcholine thioiodide (ATI; 5.76 mM) was prepared by weighing 2 mg into a 1.5-mL Eppendorf tube. The sample was dissolved in 1.2 ml of distilled water by vortex mixing for 1-2 minutes and then stored at 4°C until use.
Стандартные разведения AChE готовили в фосфатном буфере (рН 7,2; с 0,1% тритона Х-100) и использовали незамедлительно. Готовый к применению концентрированный (50 ед./мл) раствор AChE (из Electrophorus electricus) приобретали у ААТ Bioquest® Inc., Sunnyvale, СА, USA. Его разбавляли в соответствии с инструкциями производителя, чтобы получить 1000 мЕд/мл AChE, который дополнительно разбавляли в соотношении 1:2 с получением 8 разных разведений в диапазоне 4-500 мЕд/мл.Standard dilutions of AChE were prepared in phosphate buffer (pH 7.2; with 0.1% Triton X-100) and used immediately. A ready-to-use concentrated (50 U/ml) solution of AChE (from Electrophorus electricus) was purchased from AAT Bioquest® Inc., Sunnyvale, CA, USA. It was diluted according to the manufacturer's instructions to obtain 1000 mU/mL AChE, which was further diluted 1:2 to yield 8 different dilutions ranging from 4–500 mU/mL.
Колориметрическое измерениеColorimetric measurement
Чтобы измерить активность AChE, клетки, полученные путем культивирования в среде для дифференцировки скелетных мышц согласно примеру 3, обрабатывали следующим образом: среду для дифференцировки осторожно удаляли из 24-луночного планшета и сразу же добавляли 300 мкл 0,5 мМ раствора DTNB (приготовленного в фосфатном буфере, рН 7,2; с 0,1% тритона Х-100). Через 2 минуты инкубирования в темноте при комнатной температуре добавляли 50 мкл 5,76 мМ раствора ATI (приготовленного в дистиллированной воде). Содержимое реакционных смесей инкубировали в течение 60 минут при 30°С в темноте, после чего проводили измерение оптической плотности (OD) при 412 нм на микропланшетном ридере Anthos Zenyth 340rt (Biochrom Ltd., Cambridge, UK).To measure AChE activity, cells obtained by culturing in skeletal muscle differentiation medium according to Example 3 were treated as follows: differentiation medium was carefully removed from the 24-well plate and 300 μl of 0.5 mM DTNB solution (prepared in phosphate solution) was immediately added buffer, pH 7.2; with 0.1% Triton X-100). After 2 minutes of incubation in the dark at room temperature, 50 μl of 5.76 mM ATI solution (prepared in distilled water) was added. The contents of the reaction mixtures were incubated for 60 minutes at 30°C in the dark, after which optical density (OD) was measured at 412 nm on an Anthos Zenyth 340rt microplate reader (Biochrom Ltd., Cambridge, UK).
Для анализа стандарта фермента AChE: разведения стандарта фермента AChE (ААТ® Bioquest, Sunnyvale, USA) в диапазоне от 500 до 4 мЕд/мл готовили так, как описано выше, и 200 мкл каждого разведения стандарта фермента AChE смешивали с 300 мкл 0,5 мМ раствора DTNB и 50 мкл 5,76 мМ раствора ATI. OD этой смеси измеряли в течение 60 минут в 24-луночном планшете.For AChE enzyme standard analysis: dilutions of AChE enzyme standard (AAT® Bioquest, Sunnyvale, USA) ranging from 500 to 4 mU/ml were prepared as described above, and 200 μl of each dilution of AChE enzyme standard was mixed with 300 μl of 0.5 mM DTNB solution and 50 μl of 5.76 mM ATI solution. The OD of this mixture was measured over 60 minutes in a 24-well plate.
Расчет AChE в отн. мЕд./мг белкаCalculation of AChE in rel. honey/mg protein
AChE в отн. мЕд. рассчитывали на основании значений OD412, полученных при проведении в течение 60 мин колориметрического измерения клеток, посредством экстраполяции линейных стандартных кривых, полученных на основании стандартных измерений AChE (OD при 412 нм через 7 или 8 минут). Затем рассчитывали значения AChE в отн. мЕд./мг белка путем деления AChE в отн. мЕд. на мг общего белка (рассчитанного согласно примеру 19) соответствующих клеток, культивированных в среде для дифференцировки клеток скелетных мышц.AChE in rel. honey. calculated from OD 412 values obtained from 60 min colorimetric cell measurements by extrapolation of linear standard curves obtained from standard AChE measurements (OD at 412 nm after 7 or 8 min). Then the AChE values were calculated in rel. honey/mg protein by dividing AChE into rel. honey. per mg of total protein (calculated according to example 19) of the corresponding cells cultured in skeletal muscle cell differentiation medium.
Измерение креатинкиназной активностиMeasurement of creatine kinase activity
Чтобы измерить активность CK, клетки, полученные культивированием в среде для дифференцировки скелетных мышц согласно примеру 3, обрабатывали следующим образом: среду от клеток, выращенных в 24-луночном планшете, аккуратно удаляли и клетки промывали 1 мл солевого раствора Тирода (Sigma-Aldrich Co. LLC, МО, USA). Сразу же после этого непосредственно к клеткам добавляли 70 мкл лизирующего буфера. Лизирующий буфер готовили путем добавления 10 мкл тритона-Х-100 к 10 мл dH2O (LC-MS-Ultrachromasol, Fluka). Через 5 минут инкубирования при 4°С в темноте добавляли 400 мкл CK-NAC (CK, активированной N-ацетилцистеином) (Thermo Scientific, MA, USA), предварительно растворенной путем добавления 10 мл dH2O. Реакционную смесь анализировали с использованием микропланшетного ридера Anthos Zenith 340rt (Biochrom Ltd., Cambridge, UK) с установкой на 30°C, измеряя поглощение OD при 340 нм. Если не указано иное, для последующего анализа использовали значения OD340 нм, взятые через 21 минуту после добавления CK-NAC. CK-активность в отн. мЕд. рассчитывали в соответствии с инструкциями производителя и, если не указано иное, нормировали путем деления ее на мг общего белка соответствующих клеток.To measure CK activity, cells obtained by culturing in skeletal muscle differentiation medium according to Example 3 were treated as follows: the medium from cells grown in a 24-well plate was carefully removed and the cells were washed with 1 ml of Tyrode's saline solution (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA). Immediately thereafter, 70 μl of lysis buffer was added directly to the cells. Lysis buffer was prepared by adding 10 μl Triton-X-100 to 10 ml dH 2 O (LC-MS-Ultrachromasol, Fluka). After 5 minutes of incubation at 4°C in the dark, 400 μl of CK-NAC (CK activated by N-acetylcysteine) (Thermo Scientific, MA, USA), previously dissolved by adding 10 ml of dH 2 O, was added. The reaction mixture was analyzed using a microplate reader Anthos Zenith 340rt (Biochrom Ltd., Cambridge, UK) set at 30°C, measuring absorbance OD at 340 nm. Unless otherwise stated, OD values of 340 nm taken 21 min after addition of CK-NAC were used for subsequent analysis. CK activity in rel. honey. was calculated according to the manufacturer's instructions and, unless otherwise stated, normalized by dividing by the mg of total protein of the corresponding cells.
В то время как было обнаружено, что МРС из примера 3, проанализированные в отношении AChE и CK активности согласно этому примеру, являлись AChE+ и CK+, было обнаружено, что iSMC по настоящему изобретению (пример 3) являлись AChE- и CK- (Фиг. 14).While the MPCs of Example 3 analyzed for AChE and CK activity according to this example were found to be AChE+ and CK+, the iSMCs of the present invention (Example 3) were found to be AChE- and CK- (Fig. 14).
Пример 18. Сравнение клеток по настоящему изобретению с клетками, известными в данной области техникиExample 18 Comparison of Cells of the Present Invention with Cells Known in the Art
В работе Thurner и др., 2018, описано выделение SMDC, которые были охарактеризованы как являющиеся либо CD56+, либо CD56-. Чтобы сравнить клетки, описанные в работе Thurner и др., 2018, с клетками по настоящему изобретению, с авторами упомянутого исследования связались и попросили предоставить образцы. Авторы согласились передать клетки, выделенные согласно Thurner и др., 2018 и, таким образом, эти клетки можно было протестировать согласно примерам 3, 4, 5, 7, 8, 9, 16 и 17 по настоящему изобретению и сравнить с МРС, MSC, MPC-iSMC и MSC-iSMC, выделенными согласно примеру 1. Результаты показаны на Фиг. 15.Thurner et al., 2018, described the isolation of SMDCs that were characterized as being either CD56+ or CD56−. To compare the cells described in Thurner et al., 2018 with the cells of the present invention, the authors of the mentioned study were contacted and asked to provide samples. The authors agreed to donate the cells isolated according to Thurner et al., 2018 and thus these cells could be tested according to examples 3, 4, 5, 7, 8, 9, 16 and 17 of the present invention and compared with MPC, MSC, MPC-iSMC and MSC-iSMC isolated according to Example 1. The results are shown in FIG. 15.
В работе Frudinger и др., 2018, описано выделение SMDC, которые были охарактеризованы как CD56+. Чтобы сравнить клетки, описанные в работе Frudinger и др., 2018, с клетками по настоящему изобретению, с авторами упомянутого исследования связались и попросили предоставить образцы. Авторы согласились передать клетки, выделенные согласно Frudinger и др., 2018, и, таким образом, эти клетки были протестированы согласно примерам 3, 4, 5, 7, 8, 9, 16 и 17 по настоящему изобретению и их сравнили с МРС, MSC, MPC-iSMC и MSC-iSMC, выделенными согласно примеру 1. Результаты показаны на Фиг. 15.Frudinger et al., 2018, described the isolation of SMDCs that were characterized as CD56+. To compare the cells described in Frudinger et al., 2018 with the cells of the present invention, the authors of the mentioned study were contacted and asked to provide samples. The authors agreed to donate the cells isolated according to Frudinger et al., 2018, and thus these cells were tested according to examples 3, 4, 5, 7, 8, 9, 16 and 17 of the present invention and were compared with MPC, MSC , MPC-iSMC and MSC-iSMC isolated according to Example 1. The results are shown in FIG. 15.
Пример 19. Количественное определение белкаExample 19 Protein Quantification
Клетки, полученные путем культивирования в среде для дифференцировки скелетных мышц согласно примеру 3, анализировали для количественного определения общего белка в соответствии с работой Thurner и др., 2018. Для этого прикрепленные клетки сначала дважды промывали PBS, затем покрывали PBST (с 0,1% тритона Х-100) и потом инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем лизат ресуспендировали и переносили в пробирку Eppendorf®, быстро перемешивали вихревым способом и далее центрифугировали в течение 4 минут при 1200*g. Наконец, прозрачный супернатант переносили в чистую пробирку типа эппендорф и концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белков с бицинхониновой кислотой (ВСА Protein Assay Kit) от Pierce (Thermo Scientific, MA, USA) в соответствии с инструкциями производителя путем измерения OD при 540 нм, применяя микропланшетный ридер Anthos Zenyth 340rt (Biochrom Ltd., Cambridge, UK).Cells obtained by culturing in skeletal muscle differentiation medium according to Example 3 were analyzed for total protein quantification according to Thurner et al., 2018. To do this, adherent cells were first washed twice with PBS, then overlaid with PBST (with 0.1% Triton X-100) and then incubated for 10 minutes at room temperature. The lysate was then resuspended and transferred to an Eppendorf® tube, quickly vortexed and then centrifuged for 4 minutes at 1200*g. Finally, the clear supernatant was transferred into a clean Eppendorf tube and the protein concentration was determined using the bicinchoninic acid protein assay kit (BCA Protein Assay Kit) from Pierce (Thermo Scientific, MA, USA) according to the manufacturer's instructions by measuring OD at 540 nm using an Anthos Zenyth 340rt microplate reader (Biochrom Ltd., Cambridge, UK).
СсылкиLinks
Abrahamsson, H. (2007). Gut, 56(6), 877-883.Abrahamsson, H. (2007). Gut, 56(6), 877-883.
Al-Ali, S., Blyth, P., Beatty, S., Duang, A., Parry, В., & Bissett, I.P. (2009). Journal of Anatomy, 215(2), 212-220.Al-Ali, S., Blyth, P., Beatty, S., Duang, A., Parry, V., & Bissett, I.P. (2009). Journal of Anatomy, 215(2), 212-220.
Bajpai, V.K., Mistriotis, P., Loh, Y.-H., Daley, G.Q., & Andreadis, S.T. (2012). Cardiovascular Research, 96(b), 391-400.Bajpai, V.K., Mistriotis, P., Loh, Y.-H., Daley, G.Q., & Andreadis, S.T. (2012). Cardiovascular Research, 96(b), 391-400.
Belkin, V.M., Belkin, A.M., & Koteliansky, V.E. (1990). The Journal of Cell Biology, 111(5 Pt 1), 2159-2170.Belkin, V.M., Belkin, A.M., & Koteliansky, V.E. (1990). The Journal of Cell Biology, 111(5 Pt 1), 2159-2170.
Bohl, J.L., Zakhem, E., & Bitar, K.N. (2017). Stem Cells Translational Medicine, 6(9), 1795-1802.Bohl, J.L., Zakhem, E., & Bitar, K.N. (2017). Stem Cells Translational Medicine, 6(9), 1795-1802.
Capelli, С.C, Chancellor, M.В., Huard, J., & Qu, Z. (2002). WO 2001078754 A3. Capetanaki, Y., Milner, D.J., & Weitzer, G. (1997). Cell Structure and Function, 22(1), 103-116.Capelli, S. C., Chancellor, M. V., Huard, J., & Qu, Z. (2002). WO 2001078754 A3. Capetanaki, Y., Milner, D. J., & Weitzer, G. (1997). Cell Structure and Function, 22(1), 103-116.
Chancellor, M.В., Huard, J., Capelli, С.C, & Qu, Z. (2001). WO 2001078754 A2.Chancellor, M. V., Huard, J., Capelli, S. C., & Qu, Z. (2001). WO 2001078754 A2.
Dash, В.C, Levi, K., Schwan, J., Luo, J., Bartulos, O., Wu, H., Qiu, C., Yi, Т., Ren, Y., Campbell, S., Rolle, M.W., & Qyang, Y. (2016). Stem Cell Reports, 7(1), 19-28.Dash, V.C., Levi, K., Schwan, J., Luo, J., Bartulos, O., Wu, H., Qiu, C., Yi, T., Ren, Y., Campbell, S. , Rolle, M. W., & Qyang, Y. (2016). Stem Cell Reports, 7(1), 19–28.
Dominici, M., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F., Krause, D., Deans, R., Keating, A., Prockop, D., & Horwitz, E. (2006). Cytotherapy, 8(4), 315-317.Dominici, M., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F., Krause, D., Deans, R., Keating, A., Prockop, D., & Horwitz , E. (2006). Cytotherapy, 8(4), 315-317.
Espagnolle, N., Guilloton, F., Deschaseaux, F., Gadelorge, M., Sensébé, L., & Bourin, P. (2014). Journal of Cellular and Molecular Medicine, 18(1), 104-114.Espagnolle, N., Guilloton, F., Deschaseaux, F., Gadelorge, M., Sensébé, L., & Bourin, P. (2014). Journal of Cellular and Molecular Medicine, 18(1), 104-114.
Frudinger, A., Kölle, D., Schwaiger, W., Pfeifer, J., Paede, J., & Halligan, S. (2010). Gut, 59(1), 55-61.Frudinger, A., Kölle, D., Schwaiger, W., Pfeifer, J., Paede, J., & Halligan, S. (2010). Gut, 59(1), 55-61.
Frudinger, A., Pfeifer, J., Paede, J., Kolovetsiou-Kreiner, V., Marksteiner, R., & Halligan, S. (2015). Colorectal Disease: The Official Journal of the Association of Coloproctology of Great Britain and Ireland, 17(9), 794-801.Frudinger, A., Pfeifer, J., Paede, J., Kolovetsiou-Kreiner, V., Marksteiner, R., & Halligan, S. (2015). Colorectal Disease: The Official Journal of the Association of Coloproctology of Great Britain and Ireland, 17(9), 794-801.
Frudinger, Andrea, Marksteiner, R., Pfeifer, J., Margreiter, E., Paede, J., & Thurner, M. (2018). Stem Cell Research & Therapy, 9(1), 233, 9(1), 233.Frudinger, Andrea, Marksteiner, R., Pfeifer, J., Margreiter, E., Paede, J., & Thurner, M. (2018). Stem Cell Research & Therapy, 9(1), 233, 9(1), 233.
Goode, P.S., Burgio, K.L., Halli, A.D., Jones, R.W., Richter, H.E., Redden, D. Т., Baker, P.S., & Allman, R.M. (2005). Journal of the American Geriatrics Society, 53(A), 629-635.Goode, P.S., Burgio, K.L., Halli, A.D., Jones, R.W., Richter, H.E., Redden, D.T., Baker, P.S., & Allman, R.M. (2005). Journal of the American Geriatrics Society, 53(A), 629-635.
Huard, J., Yokoyama, Т., Pruchnic, R., Qu, Z., Li, Y., Lee, J.Y., Somogyi, G. Т., de Groat, W.C, & Chancellor, M.B. (2002). Gene Therapy, 9(23), 1617-1626.Huard, J., Yokoyama, T., Pruchnic, R., Qu, Z., Li, Y., Lee, J.Y., Somogyi, G.T., de Groat, W.C., & Chancellor, M.B. (2002). Gene Therapy, 9(23), 1617-1626.
Iivanainen, A., Sainio, K., Sariola, H., & Tryggvason, K. (1995). FEBSLetters, 365(2-3), 183-188.Iivanainen, A., Sainio, K., Sariola, H., & Tryggvason, K. (1995). FEBSLetters, 365(2-3), 183-188.
Jung, Y., Bauer, G., & Nolta, J.A. (2012). Stem Cells (Dayton, Ohio), 30(1), 42-47.Jung, Y., Bauer, G., & Nolta, J.A. (2012). Stem Cells (Dayton, Ohio), 30(1), 42-47.
Krauss, R.S., Chihara, D., & Romer, A.I. (2016). Skeletal Muscle, 6.Krauss, R. S., Chihara, D., & Romer, A. I. (2016). Skeletal Muscle, 6.
Lecourt, S., Marolleau, J.-P., Fromigué, O., Vauchez, K., Andriamanalijaona, R., Ternaux, В., Lacassagne, M.-N., Robert, I., Boumédiene, K., Chéreau, F., Marie, P., Larghéro, J., Fiszman, M., & Vilquin, J.-T. (2010). Experimental Cell Research, 316(15), 2513-2526.Lecourt, S., Marolleau, J.-P., Fromigué, O., Vauchez, K., Andriamanalijaona, R., Ternaux, V., Lacassagne, M.-N., Robert, I., Boumédiene, K. , Chéreau, F., Marie, P., Larghéro, J., Fiszman, M., & Vilquin, J.-T. (2010). Experimental Cell Research, 316(15), 2513-2526.
Li, Y., Wen, Y., Wang, Z., Wei, Y., Wani, P., Green, M., Swaminathan, G., Ramamurthi, A., Pera, R.R., & Chen, B. (2016). STEM CELLS Translational Medicine, 5(12), 1719.Li, Y., Wen, Y., Wang, Z., Wei, Y., Wani, P., Green, M., Swaminathan, G., Ramamurthi, A., Pera, R.R., & Chen, B. 2016). STEM CELLS Translational Medicine, 5(12), 1719.
Lu, S.-H., Lin, A. T. L., Chen, K.-K., Chiang, H. S., & Chang, L.S. (2011). Journal of Cellular and Molecular Medicine, 15(3), 587-592.Lu, S.-H., Lin, A. T. L., Chen, K.-K., Chiang, H. S., & Chang, L. S. (2011). Journal of Cellular and Molecular Medicine, 15(3), 587-592.
Marolleau, J.-P., Vauchez, K., & Vilquin, J.-T. (2010). EP 2206774 A1.Marolleau, J.-P., Vauchez, K., & Vilquin, J.-T. (2010). EP 2206774 A1.
McHugh, K.M. (1995). Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists, 204(3), 278-290.McHugh, K.M. (1995). Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists, 204(3), 278-290.
Meyer, I., & Richter, H.E. (2015). Women's Health (London, England), 11(2), 225-238.Meyer, I., & Richter, H.E. (2015). Women's Health (London, England), 11(2), 225-238.
Mimura, Т., Kaminishi, M., & Kamm, M.A. (2004). Digestive Surgery, 21(3), 235-241.Mimura, T., Kaminishi, M., & Kamm, M.A. (2004). Digestive Surgery, 21(3), 235-241.
Niessen, P., Rensen, S., Deursen, J. van, Man, J.D., Laet, A.D., Vanderwinden, J.-M., Wedel, Т., Baker, D., Doevendans, P., Hofker, M., Gijbels, M., & Eys, G. van. (2005). Gastroenterology, 129(5), 1592-1601.Niessen, P., Rensen, S., Deursen, J. van, Man, J.D., Laet, A.D., Vanderwinden, J.-M., Wedel, T., Baker, D., Doevendans, P., Hofker, M. ., Gijbels, M., & Eys, G. van. (2005). Gastroenterology, 129(5), 1592-1601.
Park, W.S., Heo, S.C., Jeon, E.S., Hong, D.H., Son, Y.K., Ko, J.-H., Kim, H. K., Lee, S.Y., Kim, J.H., & Han, J. (2013). American Journal of Physiology. Cell Physiology, 305(4), C377-91.Park, W. S., Heo, S. C., Jeon, E. S., Hong, D. H., Son, Y. K., Ko, J.-H., Kim, H. K., Lee, S. Y., Kim, J. H., & Han, J. (2013). American Journal of Physiology. Cell Physiology, 305(4), C377-91.
Popescu, L.M., Gherghiceanu, M., Mandache, E., & Cretoiu, D. (2006). Journal of Cellular and Molecular Medicine, 10(4), 960-990.Popescu, L. M., Gherghiceanu, M., Mandache, E., & Cretoiu, D. (2006). Journal of Cellular and Molecular Medicine, 10(4), 960-990.
Quander, C.R., Morris, M.C., Melson, J., Bienias, J.L., & Evans, D.A. (2005). The American Journal of Gastroenterology, 100(4), 905-909.Quander, C.R., Morris, M.C., Melson, J., Bienias, J.L., & Evans, D.A. (2005). The American Journal of Gastroenterology, 100(4), 905-909.
Qu-Petersen, Z., Deasy, В., Jankowski, R., Ikezawa, M., Cummins, J., Pruchnic, R., Mytinger, J., Cao, В., Gates, C., Wernig, A., & Huard, J. (2002). The Journal of Cell Biology, 157(5), 851-864.Qu-Petersen, Z., Deasy, V., Jankowski, R., Ikezawa, M., Cummins, J., Pruchnic, R., Mytinger, J., Cao, V., Gates, C., Wernig, A ., & Huard, J. (2002). The Journal of Cell Biology, 157(5), 851-864.
Ramkumar, D., & Schulze, K.S. (2005). Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society, 17 Suppl 1, 22-30. Rao, S.S.C. (2004). Gastroenterology, 126(1 Suppl 1), S14-22. Rochlin, K., Yu, S., Roy, S., & Baylies, M.K. (2010). Developmental Biology, 341(1), 66-83.Ramkumar, D., & Schulze, K.S. (2005). Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society, 17 Suppl 1, 22-30. Rao, S.S.C. (2004). Gastroenterology, 126(1 Suppl 1), S14-22. Rochlin, K., Yu, S., Roy, S., & Baylies, M.K. (2010). Developmental Biology, 341(1), 66-83.
Romanska, H.M., Bishop, A.E., Moscoso, G., Walsh, F.S., Spitz, L., Brereton, R. J., & Polak, J.M. (1996). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 22(4), 351-358.Romanska, H.M., Bishop, A.E., Moscoso, G., Walsh, F.S., Spitz, L., Brereton, R.J., & Polak, J.M. (1996). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 22(4), 351-358.
Sanders, K.M. (2008). Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society, 20 Suppl 1, 39-53.Sanders, K.M. (2008). Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society, 20 Suppl 1, 39-53.
Sandison, M., & McCarron, J. (2015). The FASEB Journal, 29(1 Supplement), 418.8.Sandison, M., & McCarron, J. (2015). The FASEB Journal, 29(1 Supplement), 418.8.
Skuk, D., Goulet, M., & Tremblay, J. P. (2014). Cell Transplantation, 23(1), 13-25.Skuk, D., Goulet, M., & Tremblay, J. P. (2014). Cell Transplantation, 23(1), 13-25.
Thurner, M., Asim, F., Garczarczyk-Asim, D., Janke, K., Deutsch, M., Margreiter, E., Troppmair, J., & Marksteiner, R. (2018). PLOS ONE, 13(3), e0194561.Thurner, M., Asim, F., Garczarczyk-Asim, D., Janke, K., Deutsch, M., Margreiter, E., Troppmair, J., & Marksteiner, R. (2018). PLOS ONE, 13(3), e0194561.
Vaizey, C.J., Kamm. M.A., & Bartram, С.I. (1997). Lancet (London, England), 349(9052), 612-615.Vaizey, C. J., Kamm. M.A., & Bartram, S.I. (1997). Lancet (London, England), 349(9052), 612-615.
van de Rijn, M., Hendrickson, M.R., & Rouse, R.V. (1994). Human Pathology, 25(8), 766-771.van de Rijn, M., Hendrickson, M. R., & Rouse, R. V. (1994). Human Pathology, 25(8), 766-771.
van Eys, G.J., Niessen, P.M., & Rensen, S.S. (2007). Trends in Cardiovascular Medicine, 17(1), 26-30.van Eys, G.J., Niessen, P.M., & Rensen, S.S. (2007). Trends in Cardiovascular Medicine, 17(1), 26-30.
Wang, G., Jacquet, L., Karamariti, E., & Xu, Q. (2015). The Journal of Physiology, 593(14), 3013-3030.Wang, G., Jacquet, L., Karamariti, E., & Xu, Q. (2015). The Journal of Physiology, 593(14), 3013-3030.
Wang, J.Y., & Abbas, M.A. (2013). The Permanente Journal, 17(3), 65-73.Wang, J.Y., & Abbas, M.A. (2013). The Permanente Journal, 17(3), 65-73.
Wang, J., Zohar, R., & McCulloch, C.A. (2006). Experimental Cell Research, 312(3), 205-214.Wang, J., Zohar, R., & McCulloch, C.A. (2006). Experimental Cell Research, 312(3), 205-214.
Wang, Y., Han, Z., Song, Y., & Han, Z.C. (2012). Stem Cells International, 2012.Wang, Y., Han, Z., Song, Y., & Han, Z.C. (2012). Stem Cells International, 2012.
Webb, R.C. (2003). Advances in Physiology Education, 27(A), 201-206.Webb, R.C. (2003). Advances in Physiology Education, 27(A), 201-206.
Worl, J., Breuer, C., & Neuhuber, W.L. (2009). Developmental Dynamics, 238(4), 864-874.Worl, J., Breuer, C., & Neuhuber, W.L. (2009). Developmental Dynamics, 238(4), 864-874.
Yin, H., Price, F., & Rudnicki, M.A. (2013). Physiological Reviews, 93(1), 23-67.Yin, H., Price, F., & Rudnicki, M.A. (2013). Physiological Reviews, 93(1), 23-67.
Claims (23)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP19164574.6 | 2019-03-22 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021129050A RU2021129050A (en) | 2023-04-24 |
RU2815906C2 RU2815906C2 (en) | 2024-03-25 |
RU2815906C9 true RU2815906C9 (en) | 2024-05-07 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2206774A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-07-14 | Genzyme Corporation | Muscle-derived cells having differentiation capacities |
WO2014044867A1 (en) * | 2012-09-24 | 2014-03-27 | Innovacell Biotechnologie Ag | Potency assay for skeletal muscle derived cells |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2206774A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-07-14 | Genzyme Corporation | Muscle-derived cells having differentiation capacities |
WO2014044867A1 (en) * | 2012-09-24 | 2014-03-27 | Innovacell Biotechnologie Ag | Potency assay for skeletal muscle derived cells |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JACOBO TREBOL et al., Stem cell therapy for faecal incontinence: Current state and future perspectives,World Journal of Stem Cells, 2018, vol. 10, no. 7, pages 82-105. * |
LECOURT S. et al.: "Characterization of distinct mesenchymal-like cell populations from human skeletal muscle in situ and in vitro", EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 316, no. 15, 2010, pp. 2513-2526. MARCO THURNER et al.: "Development of an in vitro potency assay for human skeletal muscle derived cells, PLOS one, 2018, v. 13(3), pp. 1-22. ANDREA FRUDINGER et al., Skeletal muscle-derived cell implantation for the treatment of sphincterrelated faecal incontinence, Stem Cell Research & Therapy, 2018, vol. 9, no. 1. * |
ЛЕБЕДЕВА О.С. и др., Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: новые возможности в нейробиологии и нейротрансплантологии, Анналы клинической и экспериментальной неврологии, vol. 5, no. 4, 2011, pp. 37-45. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dekel et al. | Isolation and characterization of nontubular sca-1+ lin− multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney | |
Arnhold et al. | Isolation and characterization of bone marrow–derived equine mesenchymal stem cells | |
Pereira et al. | Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation | |
JP5863639B2 (en) | Method for obtaining an index relating to the state of an intervertebral disc, a method for treating or preventing an intervertebral disc disorder, and a method for evaluating potential or quality of nucleus pulposus cell population | |
KR102254082B1 (en) | Method for producing retinal pigment epithelial cell sheet | |
Tamaki et al. | Synchronized reconstitution of muscle fibers, peripheral nerves and blood vessels by murine skeletal muscle-derived CD34−/45− cells | |
WO2007015906A2 (en) | Methods and compositions for smooth muscle reconstruction | |
EP1979471A1 (en) | Enrichment of cells | |
JPWO2003027281A1 (en) | Skeletal muscle stroma-derived multipotent stem cells | |
US9211306B2 (en) | Cellular therapeutic agent for incontinence or urine comprising stem cells originated from decidua or adipose | |
Ghionzoli et al. | Human amniotic fluid stem cell differentiation along smooth muscle lineage | |
Thurner et al. | Generation of myogenic progenitor cell-derived smooth muscle cells for sphincter regeneration | |
EP3942020B1 (en) | Methods for obtaining induced smooth muscle cells | |
JP2021506285A (en) | How to get muscle-derived cells | |
JPWO2008150001A1 (en) | adipocluster | |
Galli et al. | Adult neural stem cells | |
RU2815906C9 (en) | Methods of producing induced smooth muscle cells | |
RU2815906C2 (en) | Methods of producing induced smooth muscle cells | |
KR102522295B1 (en) | Isolation and culture conditions of peripheral blood-derived stem cells and induction of differentiation into progenitor cells using them | |
WO2012115298A1 (en) | Agent for treating urinary incontinence including stem cells derived from amniotic fluid | |
Yu | Identification and characterization of cartilage progenitor cells by single cell sorting and cloning | |
KR20210046196A (en) | Mesenchymal stem cell originated from equine amniotic membrane and its use | |
Abedin et al. | 3D models of glioblastoma interaction with cortical cells | |
Blazsek et al. | Purification and processing of blood-forming tissue units, the haematons, in searching for mammalian stem cell niches | |
WO2007075056A1 (en) | Method of preparing cell for heart tissue regeneration |