RU2815823C2

RU2815823C2 - Выделенное биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1

Info

Publication number: RU2815823C2
Application number: RU2021118025A
Authority: RU
Inventors: Алексей Константинович Мисорин; Артур Хамидович Сабиров; Александра Дмитриевна Азарян; Татьяна Андреевна Водопьянова; Сергей Александрович Легоцкий; Александр Андреевич Гордеев; Александр Николаевич Доронин; Валерий Владимирович Соловьев; Дмитрий Валентинович Морозов
Original assignee: Акционерное общество "БИОКАД"
Filing date: 2021-06-21
Publication date: 2024-03-22

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному биспецифическому антителу, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1. Также раскрыты выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело, экспрессионный вектор и клетка-хозяин, содержащие указанную нуклеиновую кислоту, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело. Раскрыты способ получения клетки-хозяина; способ получения указанного антитела; способ ингибирования биологической активности PD-L1 и CD47, с помощью указанного антитела; способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, с помощью указанного антитела; применение указанного антитела для лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47. 13 н. и 32 з.п. ф-лы, 7 ил., 14 табл., 11 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к биспецифическому антителу, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное биспецифическое антитело, вектору экспрессии, клетке-хозяину для получения данного биспецифического антитела и способу получения данной клетки, фармацевтическим композициям, содержащим биспецифическое антитело по изобретению, фармацевтическим композициям, содержащим биспецифическое антитело по изобретению и другие терапевтически активные соединения, способам лечения заболеваний или нарушений, опосредованных CD47 и PD-L1, применению биспецифического антитела или его фармацевтических композиций для лечения заболеваний или нарушений, опосредованных CD47 и PD-L1, и применению биспецифического антитела по изобретению и других терапевтически активных соединений для лечения заболеваний или нарушений, опосредованных CD47 и PD-L1.

Предшествующий уровень техники

Моноклональные антитела в виде химерных, гуманизированных или полностью человеческих молекул доказали свою ценность в качестве эффективных лекарств для лечения ряда нарушений и заболеваний.

Природные молекулы антител человека состоят из двух гомодимеров тяжелых цепей, каждый из которых образует гетеродимер в партнерстве с двумя идентичными молекулами легкой цепи. Обычные моноклональные антитела в виде целых молекул состоят из двухвалентных («двухруких») гетеродимеров тяжелых и легких цепей.

Часто заболевания возникают в результате нескольких патологий и сопровождаются множеством сопутствующих заболеваний. Биспецифические антитела обладают способностью связывать и тем самым нейтрализовать два отличных друг от друга антигена на молекулу антитела. Потенциал значительного улучшения терапевтических свойств (и ценности) лекарственных средств по сравнению с моноклональными антителами сделал биспецифические антитела активной областью исследований. За последние двадцать лет в научной литературе было описано множество решений в отношении сконструированных версий биспецифических антител, как описано в Brinkmann, U and RE Kontermann, 2017, The Making of Bispecific Antibodies, MAbs; 209 Feb/Mar; 9(2):182–212, doi: 10.1080/19420862.2016.1268307.

Терапевтическая направленность PD-1 и других молекул, которые передают сигнал через взаимодействие с PD-1, таких как PD-L1 и PD-L2, является областью интенсивного интереса. Ингибировать сигналы PD-L1 предлагалось в качестве средств для усиления Т-клеточного иммунитета (например, противоопухолевого иммунитета) для лечения злокачественного новообразования и инфекции, включая как острую, так и хроническую инфекцию. Ингибиторы, блокирующие взаимодействие PD-L1 и PD-1, известны, например, из патентных документов WO2004004771, WO2006121168, WO2007005874, WO2008156712, WO2010036959, WO2010077634 и WO2011066389.

Экспрессия и/или активность CD47 наблюдаются в ряде заболеваний и нарушений. Таким образом, существует потребность в терапиях, которые направленно воздействуют на CD47.

Антитела, ингибирующие взаимодействие между CD47 и лигандом SIRPa, описаны в следующих патентных документах WO2014123580, WO2013119714, WO2015191861, WO2011143624, WO2014093678, WO2017053423.

Биспецифические антитела, которые специфически связываются с CD47 и PD-L1, с различными форматами первого и второго антигенсвязывающих участков известны из патентного документа EA201791961 (WO2019068302).

На данный момент в мире нет ни одного биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, одобренного к терапевтическому использованию. В связи с вышесказанным, актуальным является создание новых биспецифических антител, которые специфически связываются с CD47 и PD-L1 и обладают высокой аффинностью к мишеням, хорошими показателями коллоидной, термической и агрегационной стабильности.

Описание изобретения

Авторы изобретения неожиданно установили, что биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1 и имеет общую (одинаковую) легкую цепь в составе первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, обладает более высокими показателями коллоидной, термической и агрегационной стабильности по сравнению с биспецифическим антителом, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1 и имеет другой формат первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, например, выполненных в формате Fab и scFv. Биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1 и имеет общую легкую цепь в составе первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, обладает высокой аффинностью к мишеням.

Использование общей (одинаковой) легкой цепи в первой и второй антигенсвязывающих частях антитела биспецифического антитела описано в Van Blarcom T ET AL., Productive common light chain libraries yield diverse panels of high affinity bispecific antibodies, MAbs. 2018 Feb/Mar;10(2):256-268. doi: 10.1080/19420862.2017.1406570. Данный формат биспецифического антитела позволяет решать острую проблему неправильного спаривания двух разных легких цепей с соответствующими тяжелыми цепями при получении биспецифических антител.

Краткое описание изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному биспецифическому антителу, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, и включает:

1) первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47, и включает:

(a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1,

(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,

(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3; и

(b) вариабельный домен общей легкой цепи, содержащий:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4,

(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5,

(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6;

2) второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с PD-L1 и включает:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7,

(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8,

(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9; и

(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело, характеризующееся тем, что первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47, представляет собой Fab, связанный с мономером Fc-фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело, характеризующееся тем, что второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с PD-L1, представляет собой Fab, связанный с мономером Fc-фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело, характеризующееся тем, что антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG, которое относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG, которое относится к изотипу IgG1 человека.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с CD47 и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с PD-L1 и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело включает вариабельный домен общей легкой цепи для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело включает первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47 и содержит:

(a) вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22,

(b) вариабельный домен общей легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23;

и второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с PD-L1 и содержит:

(a) вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24,

(b) вариабельный домен общей легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело включает тяжелую цепь первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с CD47 и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело включает тяжелую цепь антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с PD-L1 и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело включает общую легкую цепь для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

(a) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25,

(b) общую легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26;

(a) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 27,

(b) общую легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело представляет собой бивалентное антитело.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любое из вышеуказанных биспецифических антител.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения любого из вышеуказанных биспецифических антител и включает трансформирование клетки вышеуказанным экспрессионным вектором.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения любого из вышеуказанных биспецифических антител, которая содержит любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любого из вышеуказанных биспецифических антител, который заключается в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, которая содержит любое из вышеуказанных биспецифических антител в терапевтически эффективном количестве в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, которая содержит любое из вышеуказанных биспецифических антител и по меньшей мере одно другое терапевтически активное соединение.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтической композиции заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтической композиции другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство, средство для гормональной терапии или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтической композиции химиотерапевтическое средство выбирают из группы, которая включает: доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтической композиции другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, которое специфически связывается с HER2 (human epidermal growth factor receptor 2).

В некоторых вариантах осуществления фармацевтической композиции терапевтически активное соединение представляет собой трастузумаб.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтической композиции другое терапевтически активное соединение представляет собой трастузумаб и химиотерапевтическое средство, которое выбирают из группы, включающей доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологической активности PD-L1 и CD47 у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, который включает введение субъекту эффективного количества любого из вышеуказанных биспецифических антител.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, любого из вышеуказанных биспецифических антител или любой из вышеуказанных фармацевтических композиций в терапевтически эффективном количестве.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, любого из вышеуказанных биспецифических антител и по меньшей мере одного другого терапевтически активного соединения.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство, средство для гормональной терапии или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения химиотерапевтическое средство выбирают из группы, которая включает: доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, которое специфически связывается с HER2 (human epidermal growth factor receptor 2).

В некоторых вариантах осуществления способа лечения другое терапевтически активное соединение представляет собой трастузумаб.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения другое терапевтически активное соединение представляет собой трастузумаб и химиотерапевтическое средство, которое выбирают из группы, включающей доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных биспецифических антител или любой из вышеуказанных фармацевтических композиций для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных биспецифических антител и по меньшей мере одного другого терапевтически активного соединения для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47.

В некоторых вариантах осуществления применения заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

В некоторых вариантах осуществления применения другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство, средство для гормональной терапии или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления применения химиотерапевтическое средство выбирают из группы, которая включает: доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

В некоторых вариантах осуществления применения другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, которое специфически связывается с HER2 (human epidermal growth factor receptor 2).

В некоторых вариантах осуществления применения другое терапевтически активное соединение представляет собой трастузумаб.

В некоторых вариантах осуществления применения другое терапевтически активное соединение представляет собой трастузумаб и химиотерапевтическое средство, которое выбирают из группы, включающей доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой карту плазмидного вектора pEE_HCknobLALA_VH_CD47.

Фигура 2 представляет собой карту плазмидного вектора pEE_CLC.

Фигура 3 представляет собой карту плазмидного вектора pEE_HCholeLALA_VH_PD-L1.

Для фигур 1-3

Название	Расшифровка
CMV-promotor	Эукариотический промотор CMV
TPL	5`-нетранслируемая трехсторонняя лидерная последовательность аденовируса
E_MLP	Элемент энхансера главного позднего промотора аденовируса
Intron Acceptor	Акцептор сайт
Kozak	GCCGCCACC
Leader	Сигнальный лидерный мышиный пептид IgK
VH CD47	Ген вариабельного домена тяжелой цепи первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с CD47 Под VH CD47 подразумевается вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с CD47, антитела 09-001
VH PD-L1	Ген вариабельного домена тяжелой цепи первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с PD-L1 Под VH PD-L1 подразумевается вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с PD-L1, антитела 09-001
VL	Ген вариабельного домена общей легкой цепи (common light chain (CLC)). Под VL CLC подразумевается вариабельный домен общей легкой цепи первого и второго антигенсвязывающего фрагмента антитела 09-001
CL	Ген константного домена легкой цепи СL
HCknobLALA	Ген первого, второго и третьего константных доменов тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3), которые содержат мутации LALA (L251A, L252A по сквозной нумерации с начала цепи (L234A, L235A по EU/ L247A, L248A по kabat)) и мутации S371C, T383W по сквозной нумерации с начала цепи (S354C, T366W по EU/S375C, T389W по kabat) по сравнению с CH1, CH2 и CH3 IgG1 человека дикого типа
HCholeLALA	Ген первого, второго и третьего константных доменов тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3), которые содержат мутации LALA (L240A, L241A по сквозной нумерации с начала цепи (L234A, L235A по EU/L247A, L248A по kabat)) и мутации Y355C, T372S, L374A, Y413V по сквозной нумерации с начала цепи (Y349C, T366S, L368A, Y407V по EU/Y370C, T389S, L391A, Y438V по kabat) по сравнению с CH1, CH2 и CH3 IgG1 человека дикого типа
PolyA signal	Сигнал полиаденилирования
EBV origin eukaryotic (OriP)	Эукариотический ориджин репликации вируса Эпштейна-Барр
pUC origin	Прокариотический ориджин репликации
AmpR	Ген бета-лактамазы, обуславливающий устойчивость к ампициллину. Позволяет вести селекцию культуры клеток E.coli
STOP	Стоп-кодон
START	Старт-кодон

Фигура 4 представляет собой электрофореграмму 09-001 в полиакриламидном геле 7,5 % в денатурирующих нередуцирующих условиях после первой стадии очистки на сорбенте с Protein A.

1 -аркер молекулярного веса.

2 - антитело 09-001 (10 мкг).

3 - антитело 09-001 (40 мкг).

Фигура 5 представляет собой электрофореграмму 09-001 в полиакриламидном геле 7,5 % в денатурирующих нередуцирующих условиях после очистки на сорбенте SP Sepharose HP.

1 -аркер молекулярного веса.

2 - антитело 09-001 (10 мкг).

3 - антитело 09-001 (40 мкг).

Фигура 6 представляет собой электрофореграмму 09-001 в полиакриламидном геле 12 % в денатурирующих редуцирующих условиях после очистки на сорбенте SP Sepharose HP.

1-маркер молекулярного веса.

2- антитело 09-001 (10 мкг).

Фигура 7 представляет собой схематичное изображение формата биспецифического антитела с общей легкой цепью, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1.

Определения и общие методы

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

Термин «KD» в данном описании относится к константе аффинности (или константе равновесия, или равновесная константа диссоциации), которую получают из отношения Kd к Ka (т.е. Kd/Ka), и ее выражают в виде молярной концентрации (М).

«Аффинность связывания» обычно относится к силе совокупных нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, «аффинность связывания» относится к внутренней (характерной, истинной) аффинности связывания, которая отражает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы Х к своему партнеру Y обычно можно представить константой аффинности (KD). Желательно, чтобы величина KD составляла примерно 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 6 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее. Аффинность можно измерять обычными методами, известными в уровне техники, включая методы по данному описанию. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно быстрее связывают антиген и имеют тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В уровне техники известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из этих методов можно использовать для целей настоящего изобретения.

Термин «Kd», «koff» или «kdis» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.

Термин «Ka», «kon» или «on-rate» относится к константе скорости ассоциации.

Термин «Response» относится к сигналу связывания антитела с антигеном.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Подробное описание изобретения

Биспецифическое антитело

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1.

Биспецифическое антитело по изобретению является моноклональным антителом.

Термин «моноклональное антитело» или «mAb» относится к антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток.

Биспецифическое антитело по изобретению является рекомбинантным антителом.

Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется в клетке или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности), которая кодирует антитело, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.

Биспецифическое антитело по изобретению является выделенным антителом.

Определение «выделенный» («изолированный»), применяемое для описания различных антител по данному описанию, означает антитело, идентифицированное и выделенное и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой оно экспрессируется. Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки.

Биспецифическое антитело по изобретению имеет общую легкую цепь (CLC (common light chain)) для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента.

На фигуре 7 представлено схематичное изображение формата биспецифического антитела с общей легкой цепью, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1.

Амплификация гена CD47 и/или сверхэкспрессия его белка были обнаружены при многих раковых заболеваниях, например, при любом из заболеваний из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела. Термин «антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область является идентичной во всех антителах одного и того же изотипа, но отличается в антителах различного изотипа. Тяжелые цепи γ, α и δ содержат константную область, которая состоит из трех константных доменов CH1, СН2 и CH3 (выстроены в ряд) и шарнирной области, которая придает гибкость (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99). У млекопитающих известно только два типа легких цепей, которые обозначают как лямбда (λ) и каппа (κ). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании как VL) и константной области легкой цепи. Примерная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. Предпочтительно легкая цепь представляет собой легкую лямбда (λ)-цепь, а константный домен CL предпочтительно представляет собой С-лямбда (λ).

Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), расположенные между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками), и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент», как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. В данном изобретении под «антигенсвязывающим фрагментом» подразумевается Fab-фрагмент, то есть одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1, который связан с мономером Fc-фрагмента.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов широко отличаются в последовательности среди антител. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется на участке вариабельных доменов из 110 аминокислот. Напротив, V области состоят из инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками чрезвычайной вариабельности, называемых «гипервариабельными областями» или CDR. Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, связанных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, связывающие, и в некоторых случаях являющиеся частью бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью FR и с гипервариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, ADCC).

Термин «гипервариабельная область» по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Обычно гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR», и/или такие остатки из «гипервариабельной петли».

«Kabat номенклатура» или «номенклатура по Kabat» применяются в данной заявке к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем остальные аминокислотные остатки в вариабельных участках тяжелой и легкой цепи антитела (Kabat et al. Ann. N.Y. Acad. Sci., 190:382-93 (1971); Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)).

Антитело по данному изобретению, «которое связывает» целевой антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на белок или клетку или ткань, экспрессирующую антиген, и в незначительной степени перекрестно реагирует с другими белками. По данным аналитических методов: сортинга флуоресцентно-активированных клеток (FACS), радиоиммунопреципитации (RIA) или ИФА (ELISA), в таких вариантах изобретения степень связывания антитела с белком, не являющимся «мишенью» (с «нецелевым белком»), составляет менее 10% от связывания антитела с конкретным белком-мишенью. По отношению к связыванию антитела с молекулой-мишенью термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое заметно (измеримо) отличается от неспецифического взаимодействия.

Специфическое связывание можно определять количественно, например, определяя связывание молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. Например, специфическое связывание можно определять конкурентной реакцией с другой молекулой, аналогичной мишени, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание указывается, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. В данном описании термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени можно характеризовать на примере молекулы, имеющей KD к мишени по меньшей мере около 200 нМ, или же по меньшей мере около 150 нМ, или же по меньшей мере около 100 нМ, или же по меньшей мере около 60 нМ, или же по меньшей мере около 50 нМ, или же по меньшей мере около 40 нМ, или же по меньшей мере около 30 нМ, или же по меньшей мере около 20 нМ, или же по меньшей мере около 10 нМ, или же по меньшей мере около 8 нМ, или же по меньшей мере около 6 нМ, или же по меньшей мере около 4 нМ, или же по меньшей мере около 2 нМ, или же по меньшей мере около 1 нМ или выше. В одном варианте изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, практически не связываясь с каким-либо другим полипептидом или эпитопом на полипептиде.

Термин «биспецифическое антитело» означает антитело, содержащее антигенсвязывающие фрагменты, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью».

Кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (англ. fragment crystallizable region, Fc region, Fc) — это концевая часть молекулы иммуноглобулина, которая взаимодействует с Fc-рецептором на поверхности клетки и с некоторыми белками системы комплемента. Данное свойство позволяет антителам активировать иммунную систему. Fc-участок IgG, IgA и IgD изотипов состоит из двух одинаковых белковых фрагментов, соответственно, второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей.

Под «мономером Fc-фрагмента» подразумевается Fc-участок из второго и третьего константных доменов любой одной из двух тяжелых цепей (для IgG, IgA и IgD изотипов).

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело по изобретению включает СН3-домен одной тяжелой цепи, который изменен с образованием Knob, и СН3-домен другой тяжелой цепи, который изменен с образованием Hole, или наоборот.

«Knobs-into-holes» (взаимодействие по типу «выступ-впадина») это подход, с помощью которого можно обойти проблему, связанную с имеющими ошибочные спаривания побочными продуктами. Данный подход направлен на усиление спаривания двух различных тяжелых цепей антитела путем интродукции мутаций в CH3-домены для модификации поверхности раздела в области контакта. На одной цепи имеющие большие размеры аминокислоты заменяли на аминокислоты с короткими боковыми цепями для создания «впадины». И, наоборот, аминокислоты с более крупными боковыми цепями интродуцировали в другой CH3-домен, создавая «выступ». Путем совместной экспрессии этих двух тяжелых цепей получали высокий выход гетеродимерной формации («выступ-впадина») относительно гомодимерной формации («впадина-впадина» или «выступ-выступ») (WO9627011 и WO9850431, а также статью Merchant AM ET ALL., An efficient route to human bispecific IgG, Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81).

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело включает СН3-домен одной тяжелой цепи, который имеет аминокислотные замены S354C/T366W для образования Knob, и СН3-домен другой тяжелой цепи, который имеет аминокислотные замены Y349C/T366S/L368A/Y407V для образования Hole.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело включает СН3-домен одной тяжелой цепи, который имеет аминокислотные замены Y349C/T366S/L368A/Y407 для образования Hole, и СН3-домен другой тяжелой цепи, который имеет аминокислотные замены S354C/T366W для образования Knob.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело включает мономер Fc-фрагмента, где дополнительно вводят замены LALA (L234A и L235A). Данные мутации вводят для снижения эффекторной функции антитела.

Вышеуказанные мутации в Fc фрагменте пронумерованы согласно нумерации аминокислот цепей антител EU (Edelman G.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, ее. 78- 85; Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)».

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное биспецифическое антитело, которое специфично связывается с CD47 и PD-L1, представляет собой антитело 09-001.

Биспецифическое антитело 09-001 включает:

(i) CDR1 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1,

(ii) CDR2 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,

(iii) CDR3 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3; и

(i) CDR1 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4,

(ii) CDR2 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5,

(iii) CDR3 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6;

и

(i) CDR1 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7,

(ii) CDR2 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8,

(iii) CDR3 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9; и

(iii) CDR3 (Kabat) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.

Биспецифическое антитело 09-001 включает:

(i) CDR1 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10,

(ii) CDR2 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11,

(iii) CDR3 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12; и

(i) CDR1 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13,

(ii) CDR2 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14,

(iii) CDR3 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15;

и

(i) CDR1 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16,

(ii) CDR2 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17,

(iii) CDR3 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18; и

(iii) CDR3 (Chothia) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15.

Биспецифическое антитело 09-001 включает:

1) первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47 и включает вариабельный домен общей легкой цепи, содержащий:

(i) CDR1 (IMGT) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19,

(ii) CDR2 (IMGT) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20,

(iii) CDR3 (IMGT) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21;

и

2) второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с PD-L1 и включает вариабельный домен общей легкой цепи, содержащий:

(iii) CDR3 (IMGT) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21.

Биспецифическое антитело 09-001 включает первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47 и содержит:

Биспецифическое антитело 09-001 включает:

первый мономер Fc-фрагмента, который содержит второй и третий константные домены тяжелой цепи (CH2 и CH3) с мутациями LALA (L251A, L252A по сквозной нумерации с начала цепи (L234A, L235A по EU или L247A, L248A по kabat)) и мутации S371C, T383W по сквозной нумерации с начала цепи (S354C, T366W по EU или S375C, T389W по kabat) по сравнению с CH2 и CH3 IgG1 человека дикого типа;

и

второй мономер Fc-фрагмента, который содержит второй и третий константные домены тяжелой цепи (CH2 и CH3) с мутациями LALA (L240A, L241A по сквозной нумерации с начала цепи (L234A, L235A по EU или L247A, L248A по kabat)) и мутации Y355C, T372S, L374A, Y413V по сквозной нумерации с начала цепи (Y349C, T366S, L368A, Y407V по EU или Y370C, T389S, L391A, Y438V по kabat) по сравнению с CH2 и CH3 IgG1 человека дикого типа.

Биспецифическое антитело 09-001 было разработано на основе антитела BCD106-02-001 из патентного документа EA201791961A1 и поэтому 09-001 сравнивается в примерах именно с BCD106-02-001. Последовательности антигенсвязывающего фрагмента в формате scFv, который специфически связывается с CD47, антитела BCD106-02-001 были реклонированы в Fab формат для получения 09-001. Также для биспецифического антитела 09-001 был выбран новый формат с общей легкой цепью (CLC (common light chain)) для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента.

Антитело BCD106-02-001 из патентного документа EA201791961A1 включает первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47 и выполнен в scFv-формате, и второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с PD-L1 и выполнен в Fab-формате.

Антитело BCD106-02-001 из патентного документа EA201791961A1 включает первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47 и содержит:

(b) вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 34;

(b) вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23.

Молекула нуклеиновой кислоты

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует любое из вышеуказанных биспецифических антител.

В любом из указанных выше вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.

Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-27. Молекула нуклеиновой кислоты может также содержать любую комбинацию указанных нуклеотидных последовательностей.

Специалисту в данной области будет очевидно, что аминокислотная последовательность легкой или тяжелой цепи вышеуказанного биспецифического антитела по изобретению или их фрагментов (VH, VL, CDR и так далее) может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по изобретению. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с CD47, биспецифического антитела 09-001 и включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельного домена общей легкой цепи для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента биспецифического антитела 09-001 и включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 29.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи второго антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с PD-L1, биспецифического антитела 09-001 и включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 30.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с CD47, биспецифического антитела 09-001 и включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 31.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность легкой цепи для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента биспецифического антитела 09-001 и включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 32.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи второго антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с PD-L1, биспецифического антитела 09-001 и включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 33.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии биспецифических антител по изобретению.

Экспрессионной вектор

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот. Настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.

Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двуцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы» («вектор экспрессии» или «экспрессионный вектор»)).

Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим вышеуказанные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют вышеуказанное биспецифическое антитело, или его конструктивные части, выбранные из:

вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22,

вариабельный домен общей легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23;

вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24,

тяжелая цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25,

общая легкая цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26;

тяжелая цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 27,

как описано в настоящем документе.

Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).

В некоторых вариантах осуществления изобретения подходящим вектором является тот, который включает места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы).

В некоторых вариантах осуществления изобретения помимо цепочки генов антител, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP)), вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор может включать последовательность контроля экспрессии. Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.

Клетка-хозяин

Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше.

Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую первую тяжелую цепь биспецифического антитела по изобретению, нуклеотидную последовательность, кодирующую общую легкую цепь биспецифического антитела по изобретению, или нуклеотидную последовательность, кодирующую вторую тяжелую цепь биспецифического антитела по изобретению, или все три вышеуказанные последовательности. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.

Молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность легкой или тяжелой цепи вышеуказанного биспецифического антитела, выбранную из:

тяжелая цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 27.

Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (CHO), NS0 клетки, клетки SP2, HEK-293T клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (BHK), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), A549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие вышеуказанное биспецифическое антитело или его часть, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, вышеуказанное биспецифическое антитело продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии вышеуказанного биспецифического антитела по изобретению в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения вышеуказанного биспецифического антитела в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Вышеуказанное биспецифическое антитело может быть выделено из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

Кроме того, уровень продукции биспецифического антитела по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.

Вполне вероятно, что биспецифическое антитело по изобретению в различных клеточных линиях или клетках-хозяевах будут отличаться друг от друга профилем гликозилирования. Однако биспецифическое антитело, описанное в данном документе, является частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия посттрансляционных модификаций.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с использованием человеческих эмбрионов.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.

Способ получения антитела

Настоящее изобретение относится к способам получения биспецифических антител по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения биспецифических антител как определено в настоящем документе, содержащему получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать биспецифическое антитело, культивированию указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии биспецифических антител, и выделению полученных биспецифических антител. Биспецифическое антитело, полученное такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках-хозяевах упоминается в данном документе как «биспецифическое антитело».

Фармацевтические композиции

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, которая содержит любое из вышеуказанных биспецифических антител.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя антитело согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, полиолы, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутриглазного, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.

Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от антитела по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.

В некоторых вариантах осуществления композиции предназначены для улучшения, профилактики или лечения нарушений, которые могут быть связаны с CD47 и/или PD-L1.

Термин «заболевание или нарушение, опосредованное CD47 и PD-L1», подразумевает все заболевания или нарушения, которые либо прямо, либо косвенно связаны с CD47 и/или PD-L1, включая этиологию, развитие, прогресс, персистентность или патологию заболевания или нарушения.

«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, чтобы «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.

В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.

Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения.

«Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного фармацевтического ингредиента, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, масла и инъекционные органические сложные эфиры.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.

Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по данному изобретению, проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.

Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг. В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.

Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно-активные вещества, например , полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner), Плуроник (Pluronic)), натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.

Фармацевтическая композиция по изобретению является стабильной.

Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8ºС. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения в виде стерильных лекарственных средств, предназначенных для введения в организм человека с нарушением целостности кожных покровов или слизистых оболочек, минуя желудочно-кишечный тракт путем инъекций, инфузий или имплантации. В частности, предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную, трансдермальную инъекцию или инфузию; и почечные диализные инфузионные методики. Внутриопухолевая доставка, например, внутриопухолевая инъекция, также может быть применима. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути.

Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по данному изобретению.

Инъекционные лекарственные средства могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, флаконах, полимерных контейнерах, преднаполненных шприцах, устройствах для автоинжекции, но, не ограничиваясь ими. Лекарственные средства для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является лекарственное средство для парентерального введения, где фармацевтическая композиция предоставлена в сухой форме, то есть, порошка или гранул для растворения в подходящем растворителе (например, стерильной апирогенной воде) перед введением. Такое лекарственное средство может быть получено, например, с помощью лиофилизации, т.е. процесса, известного в данной области техники как сушка из замороженного состояния, включающая в себя замораживание препарата и последующее удаление растворителя из замороженного содержимого.

Биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по данному изобретению, может также вводиться интраназально или ингаляционно, самостоятельно, в виде смеси с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем из ингалятора, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель или спрея.

Лекарственное средство для парентерального введения может быть немедленного или модифицированного высвобождения. Лекарственные средства с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.

Терапевтическое применение биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1

В одном аспекте биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, применяется в лечении нарушений, опосредованного с активностью CD47 и PD-L1.

В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола и любого возраста.

В случае опухоли (например, раковой опухоли) терапевтически эффективное количество биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, может уменьшать число раковых клеток; уменьшать начальный размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковыми клетками периферических органов; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, обусловленных расстройством. Биспецифическое антитело по изобретению может, до некоторой степени, предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может вызывать цитостатический и/или цитотоксический эффект. При терапии рака эффективность in vivo можно определять, например, оценивая продолжительность жизни, время до прогрессирования заболевания (ТТР), частоту ответа опухоли на лечение (RR), продолжительность ответа и/или качество жизни.

Используемые в данном документе применения или способы, относящиеся к биспецифическому антителу, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагают, означают, ссылаются или включают:

1) одновременное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,

2) одновременное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,

3) последовательное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также

4) последовательное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.

Биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, может назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии.

«Химиотерапевтическим средством» является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (например, буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (например, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин,например, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин A; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновые антибиотики, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMICIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин, доксорубициноНСl в инъецируемых липосомах (DOXOL®), липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®), пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX®) и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), капецитабин (XELODA®), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2»-трихлортриэтиламин; трихотецены (например, токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («ara-C»); тиотепа; таксоид, например паклитаксел (TAXOL®), препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANETM) и доцетаксел (TAXOTERE®); хлорамбуцил; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; средства на основе платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка, которые предотвращают полимеризацию тубулина из образующихся микротрубочек, включая винбластин (VELBAN®), винкристин (ONCOVIN®), виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин (NAVELBINE®); этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен (TARGRETIN®); бифосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®), тилудронат (SKELID®) или ризендронат (ACTONEL®); троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды,например олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, таких как, например, PKC-альфа, Raf, H-Ras и рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®); rmRH (например, ABARELIX®); BAY439006 (сорафениб; Bayer); SU-11248 (Pfizer); перифосин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®); CCI-779; типифарниб (811577); орафениб, ABT510; ингибитор Bcl-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®); пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже); ингибиторы тирозинкиназ (см. определение ниже); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-FU и лейковорином.

Гормональные средства - это средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли. Примеры таких средств включают антиэстрогены со смешанным профилем агонист/антагонист, включая тамоксифен (NOLVADEX®), 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, торемифен (FARESTON®); идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®), триоксифен, кеоксифен и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX®) и EM800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецепторов эстрогена (ER), ингибировать связывание ДНК, усиливать метаболизм ER и/или снижать уровни ER); ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и эксеместан (AROMASIN®), и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®), летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVISOR®), ацетат мегестрола (MEGASE®), фадрозол, имидазол; агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, включая лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®), гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, включая прогестины, такие как ацетат мегестрола и ацетат медроксипрогестерона, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD); антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; тестолактон; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по изобретению применяют в комбинации с паклитакселом или доцетакселом или доксорубицином или их вариантами или карбоплатином для лечения местнораспространённого или метастатического тройного негативного рака молочной железы (ТНРМЖ) с опухолями, которые экспрессируют PD-L1 или CD47, в качестве 1 линии терапии.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по изобретению применяют в качестве монотерапии или в комбинации с химиотерапией, включающей препарат платины и 5-фторурацил (5-ФУ), для лечения местнораспространённого или метастатического рака головы и шеи (РГШ) в качестве 1 линии терапии.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по изобретению применяют в комбинации со стандартной химиотерапией и/или трастузумабом для лечения местнораспространённого или метастатического рака желудка (РЖ) или пищеводно-желудочного перехода с опухолями, которые экспрессируют HER2 или PD-L1, после 2 или более линий стандартной терапии.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по изобретению применяют в комбинации с ингибиторами тирозинкиназы (например, акситинибом или другим препаратом) для лечения местнораспространённого или метастатического почечно-клеточного рака с опухолями, которые экспрессируют CD47, в качестве 1 линии терапии.

В некоторых вариантах осуществления способа лечения биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по изобретению применяют в комбинации с химиотерапией, включающей препарат платины и паклитаксел или его варианты, для лечения местнораспространённого или метастатического рака шейки матки с опухолями, которые экспрессируют CD47, в качестве 1 линии терапии.

Дозы и пути введения

Биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по данному изобретению, самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных препаратов или методов лечения.

Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (a) уникальных характеристик терапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (b) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.

Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.

Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение биспецифического антитела, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных биспецифических антител. Кроме того, режим дозирования биспецифического антитела по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по данному изобретению. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.

Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.

Предполагается, что подходящая доза биспецифического антитела, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, по данному изобретению может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и например вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.

Примеры

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.

Материалы и общие методы

Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у: Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы согласно нумерации EU (Edelman G.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, ее. 78- 85; Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.

Синтез генов

Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 1400 п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.

Определение последовательностей ДНК

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру.

Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях

Применяли пакет программ фирмы Unipro UGENE версия 1.29 и SnapGene Viewer для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.

Экспрессионные векторы

Для экспрессии описанных в материалах заявки антител применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для экспрессии антител в клетках прокариот (E.coli) кратковременной экспрессии в клетках эукариот (например, в клетках CHO). Помимо экспрессионной кассеты антитела векторы содержали: сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в Е.coli, гены, придающие устойчивость в Е.coli к различным антибиотикам (например, к ампициллину, канамицину).

Слияние генов, содержащих описанные цепи антитела, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза и сборки генов с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для кратковременных трансфекций создавали большие количества плазмид посредством получения плазмид из трансформированных культур E. coli.

Пример 1. Синтез генетических конструкций

Последовательности антигенсвязывающего фрагмента в формате scFv из кандидата BCD106-02-001 (EA201791961A1) были реклонированы в Fab.

Для этого нарабатывали ПЦР продукты, содержащие гены вариабельных доменов тяжелой цепи антитела, с праймерами содержащими сайты рестрикции.

Полученные вариабельные домены тяжелых цепей клонировали в вектор pEE_HCknobLALA по сайтам рестрикции Sal I / Nhe I.

В результате получили плазмиду pEE_HCknobLALA_VH_CD47 (фигура 1).

Плазмиду pEE_HCholeLALA_VH_PD-L1 получали реклонированием вариабельного фрагмента в pEE_HCholeLALA по сайтам рестрикции Sal I / Nhe I (фигура 3).

Для получения общей легкой цепи для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента использовали плазмиду pEE_CLC (фигура 2).

Для получения антитела 09-001 использовались плазмиды, которые представлены в таблице 1.

Таблица 1. Плазмиды для получения антитела 09-001.

Название антитела	Название плазмиды
09-001	pEE_HCknobLALA_VH_CD47
	pEE_HCholeLALA_VH_PD-L1
	pEE_CLC

Пример 2. Наработка и очистка антитела 09-001

Полноразмерные антитела 09-001 продуцировали в клетках постоянной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия CHO-T). Клетки культивировали в бессывороточной среде HyCell TransFx-C компании HyClone с добавлением 8 мМ L-Глутамин и 1 г/л Pluronic 68 в колбах с перегородкой в орбитальных шейкерах-инкубаторах при температуре +37°С, влажности 70 % и в присутствии 5 % СО₂ при 150 оборотах в минуту. Клетки пересевали каждые 3-4 дня с плотностью 0,3*10⁶ клеток/мл.

За день до трансфекции клетки с третьего дня засевали с плотностью 0,9*10⁶ клеток/мл. Транзиентную трансфекцию проводили при концентрации 1,9-2,1*10⁶ клеток/мл. Для приготовления трансфекционной смеси использовали среду RPMI-1640. Отдельно разводили в 5% от общего объема посевного материала RPMI-1640 плазмиды с нагрузкой 0,75 мкг/мл и трансфецирующий агент полиэтиленимин (ПЭИ), из расчета ДНК:ПЭИ – 1:7 по массе. При подготовке смеси использовали котрансфецируемый вектор E2.60, кодирующий энхансер белковой продукции XBP-1S, и котрансфецируемый вектор E2.13, кодирующий RFP, по 5 % от общей нагрузки ДНК. Целевые плазмиды использовали в равном соотношении. Разведенные в RPMI-1640 плазмиды и ПЕИ объединили и инкубировали 10 минут, после чего трансфекционную смесь вносили к клеткам. Суспензионное культивирование осуществляли в колбах с перегородкой на 1000 мл в орбитальных шейкерах-инкубаторах при +37 °С, в присутствии 5 % СО₂ и влажности 70 %, при 150 оборотах в минуту. На следующий день после трансфекции вносили к клеткам 30% Триптон до 1% концентрации и 200 мМ L-Глутамин до 4 мМ и проводили измерение параметров флуоресценции на проточном цитометре Guava для оценки эффективности трансфекции по экспрессии флуоресцентного белка. На второй день после трансфекции культуральную жидкость переносили в колбы с перегородкой на 2000 мл, а затем вносили 12 % Boost 4 до 0,4 % концентрации и BalanCD Growth A в объеме равном посевному материалу. Съем наработки для антитела 09-001 осуществляли на 10 день культивирования. Фильтровали культуральную жидкость через фильтрующий модуль с размером пор 0,22 мкм, а затем проводили измерение концентрации белка на ForteBio.

Антитело 09-001 из культуральной жидкости выделяли и очищали, используя колонку с сорбентом для аффинной хроматографии с Protein A. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку с нагрузкой 10-20 мг белка на 1 мл сорбента, предварительно уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,4). Затем колонку промывали ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающиеся компоненты. Связанные антитела элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер рН 3,5. Полученный элюат выдерживали в кислом pH в течение 30 минут для вирусной инактивации, а затем нейтрализовали 1M раствором Tris-HCl до значения рН 7,0. Далее белок переводили в 20 мМ ацетатный буфер pH 5,0 с помощью диализных кассет для проведения дополнительной очистки на катионообменном сорбенте SP Sepharose HP с целью очистки от агрегатов и фрагментов антител. Колонка с сорбентом была уравновешена 20 мМ ацетатным буфером pH 5,0. Затем антитела наносили на колонку с нагрузкой 10-20 мг белка на 1 мл сорбента. Связанные с сорбентом антитела элюировали в градиенте соли с помощью раствора 20 мМ NaAcO + 1 M NaCl pH 5,0. После очистки белок переводили в 20 мМ ацетатный буфер (pH 5,0) с добавлением 100 мМ трегалозы с помощью диализных кассет, фильтровали через Millex GP 0,22 мкм, переносили в пробирки и хранили при -70°С.

Для контроля чистоты кандидатов использовали электрофорез в полиакриламидном геле и эксклюзионную ВЭЖХ. Электрофорез проводили в полиакриламидном геле 7,5 % в денатурирующих нередуцирующих (фигура 4, фигура 5) и в полиакриламидном геле 12 % в денатурирующих редуцирующих условиях (фигура 6). Определение чистоты белка проводили по интенсивности окрашивания бенда при нагрузке белка на дорожку 40 мкг. Эксклюзионную ВЭЖХ проводили в подвижной фазе 0,05M NaH₂PO₄, 0,3 M NaCl pH=7,0. Результаты по наработке антитела 09-001 представлены в таблице 2.

Таблица 2. Сводная таблица по наработке антитела 09-001.

Название антитела	Продуктивность, мг/л	Содержание мономера по результатам ВЭФ, %	Содержание мономера по результатам эВЭЖХ, %
09-001	123,0	70,6	98,8

Пример 3. Определение аффинности антитела 09-001 на Forte Bio Octet RED 384 к антигену CD47 человека

Исследование аффинности взаимодействия антитела 09-001 с антигеном CD47 человека проводилось методом биослойной интерферометрии на приборе Octet Red384 (ForteBio). Для проведения исследования применялся антиген CD47-FcLama.

Исследование проводилось с применением ковалентной посадки белка (антигенов) на биосенсоры AR2G (Amine Reactive Second-Generation (AR2G) Biosensors, ForteBio). Эксперимент по исследованию кинетических констант состоял из следующих основных этапов: активация сенсоров, загрузка белка на сенсоры, тушение непрореагировавших активированных групп, записи базовой линии, записи ассоциации аналита, записи диссоциации. Активация сенсоров осуществлялась в водном растворе, содержащем 20 мМ EDC и 10 мМ sNHS в течение 300 с. Загрузка антигена на поверхность биосенсоров осуществлялась в натрий-ацетатном буфере с pH 5,0 в течение 300 с. Концентрация белка для загрузки составляла 20 мкг/мл для антигена CD47 человека (CD47-FcLama). Тушение непрореагировавших активных центров на поверхности сенсоров осуществлялось в 1M водном растворе этаноламина с pH 8,5 в течение 300 с. Для проверки неспецифического взаимодействия аналита с сенсорами применялся сенсор, не загруженный антигеном (на этапе загрузки сенсор погружался в натрий-ацетатный буфере с pH 5,0, все остальные этапы аналогичны загруженному антигеном сенсору). Базовая линия и все последующие шаги эксперимента проводились в кинетическом буфере. На этапе ассоциации (продолжительность этапа 300 с) сенсоры с загруженным белком погружались в лунки с раствором аналита (антитело 09-001), приготовленного в кинетическом буфере. Для анализа было выбрано 3 концентрации антител — 68,9 нМ, 34,4 нМ, 17,2 нМ. На этапе диссоциации (продолжительность этапа 600 с) сенсоры погружались в лунки с кинетическим буфером, в которых записывалась базовая линия. Измерения проводились при температуре 30 °C, на всех этапах применялось тангенциальное перемешивание со скоростью 1000 оборотов в минуту. Референсные сенсоры проходили все этапы аналогично сенсорам, применяемым для записи сенсограмм аналита, за исключением этапа ассоциации - на этапе ассоциации данные сенсоры погружались в кинетический буфер без аналита (измерение сигнала референсных сенсоров осуществлялось параллельно с записью основных сенсограмм). Референсный сигнал вычитался из сигнала, полученного на сенсорах, взаимодействующих с аналитом при обработке сенсограмм.

После измерения сенсоры регенерировались в 10 мМ растворе глицина с HCl (pH 1,8) для удаления связавшихся антител (3 цикла регенерации - 5 с регенерацией, затем 5 с нейтрализацией в кинетическом буфере). Затем шаги базовой линии, ассоциации, диссоциации и регенерации повторялись. Всего получено 4 набора сенсограмм - 1 набор до регенерации и 3 набора после. Существенного влияния регенерации на значения констант не выявлено, в связи с этим, средние значения получены для трех повторностей после регенерации.

Для получения численных значений кинетических констант (kon - константа скорости ассоциации, kdis - константа скорости диссоциации, KD - равновесная константа диссоциации) полученные сенсограммы обрабатывались по модели взаимодействия 1:1 («один к одному») при помощи метода Global Fit (подбор одного набора констант kon, kdis, KD для анализа нескольких сенсограмм разных концентраций) программного обеспечения ForteBio Octet Data Analysis 9.0. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты кинетического анализа финальных кандидатов при взаимодействии с антигеном CD47 человека.

Название антитела	KD	kon	kdis
09-001	8,25E-08	5,98E+04	4,78E-03

Вывод

Антитело 09-001 взаимодействует с антигеном CD47 человека, значение KD 83 нМ.

Пример 4. Определение аффинности антитела 09-001 на Forte Bio Octert RED 384 к антигену PDL1 человека

Исследование проводилось аналогично как в примере 3. Было получено 3 набора сенсограмм. Финальные значения констант kon, kdis, KD было получено при помощи усреднения соответствующих значений для трех повторений. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты кинетического анализа антитела 09-001 при взаимодействии с антигеном PD-L1 человека.

Название антитела	KD	kon	kdis
09-001	2,54E-09	3,96E+05	1,00E-03

Вывод

Антитело 09-001 взаимодействует c антигеном PD-L1 человека с аффинностью приблизительно 3 нМ.

Пример 5. Определение аффинности антитела 09-001 на Forte Bio Octert RED 384 к антигену CD47 яванской макаки

Исследование аффинности взаимодействия антитела 09-001 с антигеном CD47 макаки проводилось методом биослойной интерферометрии на приборе Octet Red384 (ForteBio). Для проведения исследования применялся антиген CD47 макаки (cynoCD47(ARCO), ARCO BioSystems, Cat. No.: CD7-C5252; Cynomolgus / Rhesus macaque CD47 Protein, Fc Tag).

Исследование проводилось аналогично как в примере 3. Было получено 3 набора сенсограмм. Финальные значения констант kon, kdis, KD было получено при помощи усреднения соответствующих значений для трех повторностей. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты кинетического анализа финальных кандидатов при взаимодействии с антигеном CD47 макаки.

Название антитела	KD	kon	kdis
09-001	5,70E-08	9,01E+04	5,13E-03

Вывод

Антитело 09-001 взаимодействует с антигеном CD47 макаки (cynoCD47(ARCO)), значение KD 57 нМ.

Пример 6. Проверка одновременного взаимодействия с двумя антигенами PD-L1 и CD47 антитела 09-001 на Forte Bio Octert RED 384

Исследование одновременного взаимодействия с двумя различными антигенами (PD-L1 и CD47) антитела 09-001 проводилось методом биослойной интерферометрии на приборе Octet Red384 (ForteBio). Для проведения исследования применялись антигены PD-L1 и CD47 полученные в компании.

Исследование проводилось с применением ковалентной посадки белка (антигенов) на биосенсоры AR2G (Amine Reactive Second-Generation (AR2G) Biosensors, ForteBio). Эксперимент состоял из следующих основных этапов: загрузка PD-L1 на сенсоры, загрузка антитела 09-001 на сенсоры с PD-L1, взаимодействия с CD47 (аналит). Таким образом, сигнал взаимодействия на последнем этапе эксперимента детектируется при наличии биспецифического антитела способного одновременно связываться с PD-L1 на сенсорах и CD47 находящимся в растворе. Полный перечень шагов (этапов) приведен в таблице 6.

Таблица 6. Этапы эксперимента по проверке одновременного взаимодействия антитела 09-001 с двумя различными антигенами (PD-L1 и CD47).

№ Этапа	Название	Продолжительность этапа, с	Комментарии
1	Базовая линия 1	60	Проверка сенсоров
2	Активация	300	Для ковалентной иммобилизации белка на сенсорах AR2G
3	Загрузка PD-L1	300	Ковалентная иммобилизация PD-L1 на поверхности сенсоров
4	Тушение	300	Тушение непрореагировавших активных центров в 1M этаноламине pH 8,5
5	Базовая линия 2	10	Уравновешивание сенсоров с кинетическим буфером после тушения
6	Загрузка антитела	300	09-001 взаимодействует с сенсорами FAB фрагментом специфичным к PD-L1
7	Базовая линия 3	10	Для оценки скорости диссоциации антитела с сенсоров
8	Ассоциация CD47	90	Проверка взаимодействия антител (связавшихся с PD-L1) к антигену CD47
9	Диссоциация	30	Вспомогательный этап (проверка скорости диссоциации после взаимодействия с CD47)

Активация сенсоров осуществлялась в водном растворе, содержащем 20 мМ EDC и 10 мМ sNHS в течение 300 с. Загрузка антигена PD-L1 на поверхность биосенсоров осуществлялась в натрий-ацетатном буфере с pH 5,0 в течение 300 с. Концентрация белка PD-L1 для загрузки составляла 20 мкг/мл. Тушение непрореагировавших активных центров на поверхности сенсоров осуществлялось в 1M водном растворе этаноламина с pH 8,5 в течение 300 с. Все шаги эксперимента после этапа тушения проводились в кинетическом буфере. Антитело 09-001 загружалось на сенсоры с иммобилизованным PD-L1 в течение 300 с, концентрация антитела составляла 20 мкг/мл (137,7 нМ). На этапе ассоциации (взаимодействия с CD47) сенсоры погружались в раствор с концентрацией CD47 100 мкг/мл (1280 нМ). Для проверки неспецифического взаимодействия аналита CD47 (отрицательный контроль) применялся сенсор с иммобилизованным PD-L1 не загруженный антителом 09-001 (на этапе загрузки антитела сенсор погружался в кинетический буфер, все остальные этапы аналогичны анализируемому сенсору). Обработка сенсограмм проводилась с применение программного обеспечения ForteBio Octet Data Analysisn 9.0. Для заключения об одновременном взаимодействии с двумя различными антигенами анализировался уровень сигнала (параметр response) в конце этапа взаимодействия с CD47. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7. Результаты эксперимента по проверке одновременного взаимодействия антитела 09-001 с двумя антигенами PD-L1 и CD47.

Загруженный на сенсоры белок	Загруженное Антитело	Аналит	Уровень сигнала (response), нм	Комментарии
PD-L1	09-001	CD47	0,6088	Наблюдается сигнал связывания CD47 с антителом 09-001
PD-L1	Кинетический буфер (без антител)	CD47	0,0027	Не выявлено неспецифического связывания CD47 с сенсорами AR2G загруженными PD-L1 (отрицательный контроль)

На последнем этапе эксперимента (ассоциация CD47) наблюдается сигнал взаимодействия 0,6088 нм для антитела 09-001, при этом не выявлено неспецифического сигнала связывания CD47 с не загруженными антителом сенсорами.

Вывод

Антитело 09-001 демонстрирует одновременное связывание с двумя различными антигенами PD-L1 и CD47.

Пример 7. Проверка блокирования взаимодействия CD47 с SIRPα антителом 09-001 на Forte Bio Octert RED 384

Исследование блокирования взаимодействия CD47 и SIRPα (Signal-regulatory protein alpha) антителами 09-001 проводилось методом биослойной интерферометрии на приборе Octet Red384 (ForteBio). Для проведения исследования применялись антигены человека CD47 и SIRPα полученные в компании.

Исследование проводилось с применением ковалентной посадки белка (антигенов) на биосенсоры AR2G (Amine Reactive Second-Generation (AR2G) Biosensors, ForteBio). Эксперимент состоял из следующих основных этапов: загрузка антигена SIRPα на сенсоры, проверка связывания антигена SIRPα со смесями CD47 и антител 09-001 (премикс). В качестве положительного контроля применялся раствор CD47 без добавления антител. Заключение о блокировании взаимодействия проводилось на основании сравнения сигнала (response) премикса и сигнала положительного контроля. Перечень этапов эксперимента представлен в таблице 8.

Таблица 8. Этапы эксперимента проверки блокирования взаимодействия CD47 с SIRPα антителами 09-001.

№ Этапа	Название	Продолжительность этапа, с	Комментарии
1	Базовая линия 1	60	Проверка сенсоров
2	Активация	300	Для ковалентной иммобилизации белка на сенсорах AR2G
3	Загрузка SIRPα	600	Ковалентная иммобилизация SIRPα на поверхности сенсоров
4	Тушение	300	Тушение не прореагировавших активных центров в 1M этаноламине pH 8,5
5	Базовая линия 2	600	Уравновешивание сенсоров с кинетическим буфером после тушения
6	Ассоциация	1200
7	Диссоциация	600	Для оценки скорости диссоциации положительного контроля (вспомогательный этап)

Активация сенсоров осуществлялась в водном растворе, содержащем 20 мМ EDC и 10 мМ sNHS в течение 300 с. Загрузка антигена SIRPα на поверхность биосенсоров осуществлялась в натрий-ацетатном буфере с pH 5,0 в течение 600 с. Концентрация белка SIRPα для загрузки составляла 20 мкг/мл. Для проверки неспецифического взаимодействия аналита с сенсорами применялся сенсор, не загруженный антигеном (на этапе загрузки сенсор погружался в натрий-ацетатный буфере с pH 5,0, все остальные этапы аналогичны загруженному антигеном сенсору). Тушение непрореагировавших активных центров на поверхности сенсоров осуществлялось в 1M водном растворе этаноламина с pH 8,5 в течение 300 с. Все шаги эксперимента после этапа тушения проводились в кинетическом буфере. На этапе ассоциации (продолжительность этапа 1200 с) сенсоры с загруженным белком погружались в лунки с раствором аналита. В качестве аналита на этапе ассоциации применялся раствор, содержащий 250 нМ антитела 09-001 и 50 нМ CD47 в кинетическом буфере. В качестве положительного контроля применялся раствор (аналит) с концентрацией CD47 50 нМ. Измерения проводились при температуре 30 °C, на всех этапах применялось тангенциальное перемешивание со скоростью 1000 оборотов в минуту. Референсные сенсоры проходили все этапы аналогично сенсорам, применяемым для записи сенсограмм аналита, за исключением этапа ассоциации - на этапе ассоциации данные сенсоры погружались в кинетический буфер без аналита (измерение сигнала референсных сенсоров осуществлялось параллельно с записью основных сенсограмм). Референсный сигнал вычитался из сигнала, полученного на сенсорах, взаимодействующих с аналитом при обработке сенсограмм. Обработка сенсограмм проводилась с применением программного обеспечения ForteBio Octet Data Analysisn 9.0. Результаты эксперимента представлены в Таблице 9.

На этапе ассоциации для положительного контроля наблюдается сигнал связывания с SIRPα 0,297 нм, при этом для аналита содержащего CD47 и антитела 09-001 не выявлено сигнала связывания с SIRPα.

Таблица 9. Результаты эксперимента проверки блокирования взаимодействия CD47 с SIRPα антителом 09-001.

Загруженный на сенсоры белок	Аналит	Уровень сигнала (response), нм	Комментарии
SIRPα	250 нМ антитела 09-001 / 25 нМ CD47	0,0042	Нет сигнала связывания, антитело 09-001 блокирует взаимодействие SIRPα и CD47
SIRPα	25 нМ CD47	0,2972	Положительный контроль, демонстрирует связывание SIRPα и CD47 при отсутствии блокирующих антител
Не загруженный сенсор	25 нМ CD47	0,0114	Отрицательный контроль, показывает отсутствие взаимодействия аналита CD47 с не загруженными белком SIRPα сенсорами.

Вывод

Антитело 09-001 блокирует взаимодействие CD47 и SIRPα.

Пример 8. Проверка блокирования взаимодействия PD-1 с PD-L1 антителом 09-001 на Forte Bio Octert RED 384

Исследование блокирования взаимодействия PD-1 и PD-L1 антителом 09-001 проводилось методом биослойной интерферометрии на приборе Octet Red384 (ForteBio). Для проведения исследования применялись антигены человека PD-1 и PD-L1.

Исследование проводилось с применением ковалентной посадки белка (антигенов) на биосенсоры AR2G (Amine Reactive Second-Generation (AR2G) Biosensors, ForteBio). Эксперимент состоял из следующих основных этапов: загрузка антигена PD-1 на сенсоры, проверка связывания антигена PD-1 со смесью PD-L1 и антитела 09-001 (премикс). В качестве положительного контроля применялся раствор PD-L1 без добавления антител. Заключение о блокировании взаимодействия проводилось на основании сравнения сигнала (response) премикса и сигнала положительного контроля. Перечень этапов эксперимента представлен в таблице 10.

Таблица 10. Этапы эксперимента проверки блокирования взаимодействия PD-1 и PD-L1 антителом 09-001.

№ Этапа	Название	Продолжительность этапа, с	Комментарии
1	Базовая линия 1	60	Проверка сенсоров
2	Активация	300	Для ковалентной иммобилизации белка на сенсорах AR2G
3	Загрузка SIRPa	300	Ковалентная иммобилизация PD-1 на поверхности сенсоров
4	Тушение	300	Тушение не прореагировавших активных центров в 1M этаноламине pH 8,5
5	Базовая линия 2	300	Уравновешивание сенсоров с кинетическим буфером после тушения
6	Ассоциация	300
7	Диссоциация	150	Для оценки скорости диссоциации положительного контроля (вспомогательный этап)

Активация сенсоров осуществлялась в водном растворе, содержащем 20 мМ EDC и 10 мМ sNHS в течение 300 с. Загрузка антигена PD-1 на поверхность биосенсоров осуществлялась в натрий-ацетатном буфере с pH 5,0 в течение 300 с. Концентрация белка PD-1 для загрузки составляла 20 мкг/мл. Для проверки неспецифического взаимодействия аналита с сенсорами применялся сенсор, не загруженный антигеном (на этапе загрузки сенсор погружался в натрий-ацетатный буфере с pH 5,0, все остальные этапы аналогичны загруженному антигеном сенсору). Тушение непрореагировавших активных центров на поверхности сенсоров осуществлялось в 1M водном растворе этаноламина с pH 8,5 в течение 300 с. Все шаги эксперимента после этапа тушения проводились в кинетическом буфере. На этапе ассоциации (продолжительность этапа 300 с) сенсоры с загруженным белком погружались в лунки с раствором аналита. В качестве аналита на этапе ассоциации применялся раствор, содержащий 250 нМ антитела 09-001 и 50 нМ PD-L1 в кинетическом буфере. В качестве положительного контроля применялся раствор (аналит) с концентрацией PD-L1 50 нМ.

Измерения проводились при температуре 30 °C, на всех этапах применялось тангенциальное перемешивание со скоростью 1000 оборотов в минуту. Референсные сенсоры проходили все этапы аналогично сенсорам, применяемым для записи сенсограмм аналита, за исключением этапа ассоциации - на этапе ассоциации данные сенсоры погружались в кинетический буфер без аналита (измерение сигнала референсных сенсоров осуществлялось параллельно с записью основных сенсограмм). Референсный сигнал вычитался из сигнала, полученного на сенсорах, взаимодействующих с аналитом при обработке сенсограмм. Обработка сенсограмм проводилась с применением программного обеспечения ForteBio Octet Data Analysisn 9.0. Результаты эксперимента представлены в Таблица . На этапе ассоциации для положительного контроля наблюдается сигнал связывания аналита с PD-1 (1,429 нм), при этом для аналита содержащего PD-L1 и антитела 09-001 не выявлено сигнала связывания с PD-1 (0,007 нм, фоновое значение сигнала).

Таблица 11. Результаты эксперимента проверки блокирования взаимодействия PD1 с PD-L1 антителами 09-001.

Загруженный на сенсоры белок	Аналит	Уровень сигнала (response), нм	Комментарии
PD-1	250 нМ антитела 09-001 / 50 нМ PD-L1	0,0073	Нет сигнала связывания, антитело 09-001 блокирует взаимодействие PD-1 и PD-L1
PD-1	50 нМ PD-L1	1,4288	Положительный контроль, демонстрирует связывание PD-1 и PD-L1 при отсутствии блокирующих антител
Не загруженный сенсор	50 нМ PD-L1	0,0057	Отрицательный контроль, показывает отсутствие взаимодействия аналита PD-L1 с не загруженными белком PD-1 сенсорами.

Вывод

Антитело 09-001 блокирует взаимодействие PD-1 и PD-L1.

Пример 9. Определение термической стабильности при термострессе 50°С

Исследуемые образцы устанавливали в воздушный термостат и термостатировали при 50°С в течение 48 часов. После окончания прогрева интактные и стрессировнные образцы передавали на анализ методом эксклюзионной ВЭЖХ с УФ-детектором. Хроматографию проводили на системе ВЭЖХ Agilent 1100, детектирование проводили при длине волны 220 нм и 280 нм.

Результирующие данные стабильности для 09-001 при инкубировании при 50°С представлены в таблице 12.

Общий вывод: образцы обладают высокой термической стабильностью.

Таблица 12. Результаты исследования термической стабильности антитела 09-001 методом эВЭЖХ.

Пример 10. Определение коллоидной и термической стабильности по точке агрегации белка методом динамического светорассеяния

Для определения температуры агрегации исследуемых образцов методом динамического светорассеяния (DLS) получали зависимость размера частиц в среде от температуры с помощью прибора DynaPro® Plate Reader II при постепенном нагревании от 25 до 80°С. Результаты представлены в таблице 13.

В данном анализе исследовали антитело 09-001 и антитело BCD106-02-001 из патентного документа EA201791961A1.

Таблица 13. Точка агрегации BCD106-02-001 и 09-001.

Название антитела	Буферный раствор	Точка агрегации
BCD106-02-001	Натрий-ацетатный буфер 20 мМ pH=5.0	55,57 ± 0,5°С
09-001	Натрий-ацетатный буфер 20 мМ pH=5.0	64,05 ± 0,5°С

Можно заключить, что 09-001 обладает высокой термоколлоидной стабильностью (точка агрегации в 20mM натрий-ацетатном буфере pH=5,0 составляет более 60,0°С). Антитело BCD106-02-001 обладает меньшей термоколлоидной стабильностью по сравнению с 09-001.

Пример 11. Сравнение исходного биспецифического антитела в формате scFv-Fab и биспецифического антитела в формате CLC (биспецифическое антитело с общей легкой цепью).

Для сравнения в таблице 14 приведены данные для антител BCD106-02-001 и 09-001.

Таблица 14. Результаты исследования агрегационной стабильности антител BCD106-02-001 и 09-001 методом эВЭЖХ.

Данные результаты показывают, что антитело 09-001 обладает более высокой агрегационной стабильностью по сравнению с антителом BCD106-02-001 по данным исследования чистоты, определенной с помощью эВЭЖХ. Также антитело 09-001 обладает более высокой температурой агрегации по сравнению с BCD106-02-001, что свидетельствует о более высокой термоколлоидной стабильности относительно антитела BCD106-02-001.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЗАО "БИОКАД"

<120> Выделенное биспецифическое антитело, которое специфически связывается с

CD47 и PD-L1

<160> 35

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDR1 (Kabat) вариабельного

домена тяжелой цепи первого антигенсвязывающего фрагмента,

который специфически связывается с CD47

<400> 1

Arg Tyr Trp Met Tyr

1 5

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDR2 (Kabat) вариабельного

который специфически связывается с CD47

<400> 2

Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr Thr

1 5 10 15

Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly

20

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDR3 (Kabat) вариабельного

который специфически связывается с CD47

Страница 1

<400> 3

Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

домена общей легкой цепи для первого и второго

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 4

Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile Asn Tyr Pro Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 5

Asn Thr Asn Thr Arg His Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 6

Ala Leu Tyr Met Gly Asn Gly Gly His Met

1 5 10

<210> 7

Страница 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

домена тяжелой цепи второго антигенсвязывающего фрагмента,

который специфически связывается с PD-L1

<400> 7

Asp Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

который специфически связывается с PD-L1

<400> 8

Asp Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

который специфически связывается с PD-L1

<400> 9

Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

Страница 3

<223> аминокислотная последовательность CDR1 (Chothia) вариабельного

который специфически связывается с CD47

<400> 10

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

1 5

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDR2 (Chothia) вариабельного

который специфически связывается с CD47

<400> 11

Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDR3 (Chothia) вариабельного

который специфически связывается с CD47

<400> 12

Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 13

Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile Asn Tyr Pro Gly

Страница 4

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 14

Asn Thr Asn Thr Arg His Ser

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 15

Ala Leu Tyr Met Gly Asn Gly Gly His Met

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

который специфически связывается с PD-L1

<400> 16

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

1 5

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

Страница 5

<220>

который специфически связывается с PD-L1

<400> 17

Ser Trp Ser Gly Ser Asn

1 5

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

который специфически связывается с PD-L1

<400> 18

Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDR1 (IMGT) вариабельного

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 19

Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile Asn Tyr

1 5

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDR2 (IMGT) вариабельного

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 20

Asn Thr Asn

1

Страница 6

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDR3 (IMGT) вариабельного

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 21

Ala Leu Tyr Met Gly Asn Gly Gly His Met

1 5 10

<210> 22

<211> 134

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой

цепи первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически

связывается с CD47

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr

50 55 60

Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

85 90 95

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr

100 105 110

Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Thr Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 23

<211> 110

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

Страница 7

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельного домена общей

легкой цепи для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента

<400> 23

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile

20 25 30

Asn Tyr Pro Gly Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Tyr Met Gly Asn

85 90 95

Gly Gly His Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 24

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

цепи второго антигенсвязывающего фрагмента, который специфически

связывается с PD-L1

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 464

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

Страница 8

<220>

<223> аминокислотная последовательность тяжелой цепи первого

антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с

CD47

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr

50 55 60

Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

85 90 95

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr

100 105 110

Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

130 135 140

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

165 170 175

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

210 215 220

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

225 230 235 240

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

245 250 255

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

275 280 285

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

Страница 9

355 360 365

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

370 375 380

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 26

<211> 216

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность общей легкой цепи для первого и

второго антигенсвязывающего фрагмента

<400> 26

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile

20 25 30

Asn Tyr Pro Gly Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Tyr Met Gly Asn

85 90 95

Gly Gly His Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Страница 10

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 27

<211> 453

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность тяжелой цепи второго

PD-L1

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Gly Pro Gly Gly Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

225 230 235 240

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Страница 11

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 28

<211> 402

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, которая кодирует аминокислотную

последовательность вариабельного домена тяжелой цепи первого

CD47

<400> 28

caagtacagt tggtagagtc tggaggtgga ttagtgcagc ccggagggag cctgcgattg 60

tcatgtgccg caagcggttt caccttctcc cgctattgga tgtattgggt tagacaggct 120

cctgggaagg gtcttgagtg ggtttcctcc atcgaggact cttcaattaa cacaggagga 180

gggacggaaa caacttacta cactgatagc gtgaaaggac ggtttaccat ctctcgcgac 240

aacgcgaaga acaccttata cctccagatg aattccctca gggcagaaga caccgcagtc 300

tattattgcg ctaaagggga ctactactgc accacatatg agtgtcagca ctattatggc 360

atggattatt ggggccaagg tactacagtg actgtttcga gt 402

<210> 29

<211> 330

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

Страница 12

<400> 29

cagactgtgg tgacccagga gccatccctg tcagtgtctc caggagggac ggtcaccctc 60

acctgcggcc tcagttctgg gactgtcact gccattaact accctggttg gtaccagcag 120

acgccaggcc aggctccccg aacccttatc tacaacacaa acacccgaca ctccggcgtc 180

cccgatcgct tctccggatc catctctggt aacaaagccg ccctcaccat cacaggagcc 240

caggccgagg acgaggccga ctattactgt gctctgtaca tgggtaatgg tggccacatg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

<210> 30

<211> 366

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

последовательность вариабельного домена тяжелой цепи второго

PD-L1

<400> 30

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgaggc ctggtgggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacttttgat gattatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagat attagctgga gtggtagtaa cacaaactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccctgt atcactgtgc aagagccccc 300

ttgctcctgg ctatgacttt tggggttggt tcctggggcc aggggaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 31

<211> 1392

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

последовательность тяжелой цепи первого антигенсвязывающего

Страница 13

фрагмента, который специфически связывается с CD47

<400> 31

caagtacagt tggtagagtc tggaggtgga ttagtgcagc ccggagggag cctgcgattg 60

tcatgtgccg caagcggttt caccttctcc cgctattgga tgtattgggt tagacaggct 120

cctgggaagg gtcttgagtg ggtttcctcc atcgaggact cttcaattaa cacaggagga 180

gggacggaaa caacttacta cactgatagc gtgaaaggac ggtttaccat ctctcgcgac 240

aacgcgaaga acaccttata cctccagatg aattccctca gggcagaaga caccgcagtc 300

tattattgcg ctaaagggga ctactactgc accacatatg agtgtcagca ctattatggc 360

atggattatt ggggccaagg tactacagtg actgtttcga gtgctagcac caagggccca 420

tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480

tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540

accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600

agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660

cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcagggg gaccgtcagt cttcctcttc 780

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140

agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260

ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380

tccccgggta aa 1392

<210> 32

Страница 14

<211> 648

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

последовательность общей легкой цепи для первого и второго

антигенсвязывающего фрагмента

<400> 32

cagactgtgg tgacccagga gccatccctg tcagtgtctc caggagggac ggtcaccctc 60

acctgcggcc tcagttctgg gactgtcact gccattaact accctggttg gtaccagcag 120

acgccaggcc aggctccccg aacccttatc tacaacacaa acacccgaca ctccggcgtc 180

cccgatcgct tctccggatc catctctggt aacaaagccg ccctcaccat cacaggagcc 240

caggccgagg acgaggccga ctattactgt gctctgtaca tgggtaatgg tggccacatg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctccgtcact 360

ctgttccctc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcatc 420

agtgacttct accctggagc cgtgacagtg gcttggaaag cagatagcag ccccgtcaag 480

gccggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc tgccagcagc 540

tatctgagcc tgacccctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttca 648

<210> 33

<211> 1359

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

последовательность тяжелой цепи второго антигенсвязывающего

фрагмента, который специфически связывается с PD-L1

<400> 33

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgaggc ctggtgggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacttttgat gattatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagat attagctgga gtggtagtaa cacaaactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cagcctgtat 240

Страница 15

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccctgt atcactgtgc aagagccccc 300

ttgctcctgg ctatgacttt tggggttggt tcctggggcc aggggaccct ggtcaccgtc 360

tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc tgtccttcag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccaaat cttgtgacgg tcctggaggc acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc 720

gcagggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtgcaccct gcccccatcc 1080

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtcctgcg ccgtcaaagg cttctatccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctcgtca gcaagctcac cgtggacaag 1260

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct cccgggaaa 1359

<210> 34

<211> 104

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой

связывается с CD47, антитела BCD106-02-001

<400> 34

Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ala Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Val

Страница 16

1 5 10 15

Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr Ser Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Asn

35 40 45

Ala Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Ile Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100

<210> 35

<211> 210

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность легкой цепи первого

CD47, антитела BCD106-02-001

<400> 35

Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ala Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Val

1 5 10 15

Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr Ser Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Asn

35 40 45

Ala Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Ile Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser

100 105 110

Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala

115 120 125

Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val

130 135 140

Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr

145 150 155 160

Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu

165 170 175

Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln

180 185 190

Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu

195 200 205

Cys Ser

<---

Claims

1. Выделенное биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD47 и PD-L1, и включает:

2. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, характеризующееся тем, что первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47, представляет собой Fab, связанный с мономером Fc-фрагмента.

3. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, характеризующееся тем, что второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с PD-L1, представляет собой Fab, связанный с мономером Fc-фрагмента.

4. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, характеризующееся тем, что антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG.

5. Выделенное биспецифическое антитело по п. 4, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.

6. Выделенное биспецифическое антитело по п. 5, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1 человека.

7. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с CD47, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

8. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с PD-L1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

9. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, где вариабельный домен общей легкой цепи для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.

10. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1,

где первый антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с CD47, включает:

где второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с PD-L1, включает:

11. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, где тяжелая цепь первого антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с CD47, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.

12. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, где тяжелая цепь второго антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с PD-L1, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.

13. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, где общая легкая цепь для первого и второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

14. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1,

15. Выделенное биспецифическое антитело по п. 1, которое представляет собой бивалентное антитело.

16. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует биспецифическое антитело по любому из пп. 1-15.

17. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 16, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

18. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 16, 17.

19. Способ получения клетки-хозяина для получения биспецифического антитела по любому из пп. 1-15, включающий трансформирование клетки экспрессионным вектором по п. 18.

20. Клетка-хозяин для получения биспецифического антитела по любому из пп. 1-15, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 16, 17.

21. Способ получения биспецифического антитела по любому из пп. 1-15, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 20 в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.

22. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, содержащая биспецифическое антитело по любому из пп. 1-15 в терапевтически эффективном количестве в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

23. Фармацевтическая композиция по п. 22, где заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

24. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, содержащая биспецифическое антитело по любому из пп. 1-15 и по меньшей мере одно другое терапевтически активное соединение.

25. Фармацевтическая композиция по п. 24, где заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

26. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 24, 25, где другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство, средство для гормональной терапии или любую их комбинацию.

27. Фармацевтическая композиция по п. 24, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, которая включает: доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

27. Фармацевтическая композиция по п. 24, где антитело представляет собой трастузумаб.

28. Фармацевтическая композиция по п. 24, где комбинация представляет трастузумаб и химиотерапевтическое средство, которое выбирают из группы, включающей доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

29. Способ ингибирования биологической активности PD-L1 и CD47 у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества биспецифического антитела по любому из пп. 1-15.

30. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, биспецифического антитела по любому из пп. 1-15 или фармацевтической композиции по любому из пп. 22-28 в терапевтически эффективном количестве.

31. Способ лечения заболевания или нарушения по п. 30, где заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

32. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, биспецифического антитела по любому из пп. 1-15 и по меньшей мере одного другого терапевтически активного соединения.

33. Способ лечения заболевания или нарушения по п. 32, где заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

34. Способ лечения заболевания или нарушения по любому из пп. 32-33, где другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство, средство для гормональной терапии или любую их комбинацию.

35. Способ лечения заболевания или нарушения по п. 34, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, которая включает: доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

36. Способ лечения заболевания или нарушения по п. 34, где антитело представляет собой трастузумаб.

37. Способ лечения заболевания или нарушения по п. 34, где комбинация представляет трастузумаб и химиотерапевтическое средство, которое выбирают из группы, включающей доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

38. Применение биспецифического антитела по любому из пп. 1-15 или фармацевтической композиции по любому из пп. 22-28 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47.

39. Применение по п. 38, где заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

40. Применение биспецифического антитела по любому из пп. 1-15 и по меньшей мере одного другого терапевтически активного соединения для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредованного PD-L1 и CD47.

41. Применение по п. 40, где заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 и CD47, выбрано из группы: тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), рак головы и шеи (РГШ), рак желудка (РЖ), рак пищеводно-желудочного перехода, аденокарцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, множественная миелома, рак яичника, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак шейки матки.

42. Применение по любому из пп. 40, 41, где другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство, средство для гормональной терапии или любую их комбинацию.

43. Применение по п. 42, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, которая включает: доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.

44. Применение по п. 42, где антитело представляет собой трастузумаб.

45. Применение по п. 42, где комбинация представляет трастузумаб и химиотерапевтическое средство, которое выбирают из группы, включающей доцетаксел, паклитаксел, доксорубицин, препараты платины, карбоплатин, 5-фторурацил, ингибиторы тирозинкиназы, акситиниб, липосомальный доксорубицин, липосомальный паклитаксел или любая их комбинация.