RU2815686C9 - Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках - Google Patents
Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815686C9 RU2815686C9 RU2023122864A RU2023122864A RU2815686C9 RU 2815686 C9 RU2815686 C9 RU 2815686C9 RU 2023122864 A RU2023122864 A RU 2023122864A RU 2023122864 A RU2023122864 A RU 2023122864A RU 2815686 C9 RU2815686 C9 RU 2815686C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fluorescence intensity
- hyaluronic acid
- dna
- breaks
- fluorescein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 210000003794 male germ cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 title abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 27
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 229920002749 Bacterial cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 239000005016 bacterial cellulose Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 231100001074 DNA strand break Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 108010025899 gelatin film Proteins 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012897 dilution medium Substances 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 241000032681 Gluconacetobacter Species 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках. Осуществляют разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином. Полученные результаты сравнивают с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%. Сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля. При интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля выявляют, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными. Способ обеспечивает повышение эффективности обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов за счёт их фиксации на поверхности бактериальной целлюлозы через сродство гиалуроновой кислоты к рецепторам мужских половых клеток. 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины для выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) половых клеток мужчин и может быть использовано для обнаружения сперматозоидов, имеющих повреждения в ДНК, у мужчин, перенесших Covid-19.
Мужское бесплодие – это глобальная проблема человечества. Перспективным решением данной проблемы в урологии является исследование жизнеспособности мужских половых клеток и выявление фрагментации геномной ДНК за счёт меченных олигонуклеотидов.
На мировом рынке представлено много различных тестов и методик для определения разрывов в ДНК сперматозоидов.
На мировом рынке представлено много различных тестов и методик для определения разрывов в ДНК сперматозоидов.
Известен TUNEL-тест, сущность которого заключается в том, что при добавлении специального реактива находятся сперматозоиды с поврежденной ДНК и окрашиваются. Отличительной чертой позднего апоптоза является обширная фрагментация геномной ДНК, которая создает множество двунитевых разрывов ДНК (DSBs) с доступной 3'-гидроксил (3'-OH) группой. TUNEL анализ идентифицирует апоптозные клетки с помощью терминальной деоксинуклеотидил трансфераза (TdT)-опосредованного добавления меченых (X) деоксиуридин трифосфат нуклеотидов (X-dUTP) к 3'-OH концу разрыва ДНК цепи, что затем визуализируется способом, соответствующим внедренной метке, таким образом служа показателем процентного соотношения апоптозных клеток в анализируемой клеточной популяции. Чувствительность анализа зависит от эффективности внедрения модицицированных dUTP, что определяется размером прикрепленной метки (Kyrylkova, K. Detection of apoptosis by TUNEL assay / K. Kyrylkova, S. Kyryachenko. – Текст : электронный // Methods Mol Biol : электронный журнал. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22566045/. – Дата публикации: 2012).
Недостатками TUNEL-теста являются дороговизна данного метода оценки фрагментации ДНК, а также не достаточно стандартизированные пороговые значения. Также данный метод Tunel Assay является неспецифичным, так как используется для оценки других повреждений в организме.
Известен другой тест, который также представлен на рынке – HALOSPERM тест (Halotech, Испания). Он основан на обнаружении разрывов ДНК по дисперсии хроматина вокруг ядра клетки после гидролиза. Сперматозоиды обрабатывают раствором кислоты, затем после инкубации клетки прокрашивают и просматривают в световом микроскопе. Сперматозоиды, которые содержат целую ДНК, образуют ореол дисперсии («halo-эффект»). Сперматозоиды с фрагментированной ДНК образуют минимальный ореол или не образуют его вообще. Метод прост в использовании (Феськов, А.М. Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин с повышенным содержанием незрелых спермиев в эякуляте / А.М. Феськов. – Текст : электронный // Мир медицины и биологии : электронный журнал. – URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=17947630. Дата публикации: 2012).
Недостатком данного способа является относительно низкая чувствительность и специфичность по сравнению с другими методами исследования фрагментации ДНК.
Известен способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, заключающийся в том, что на преаналитическом этапе проводят фиксацию сперматозоидов на предметных стеклах и детектируют в них гидроксиметилированную ДНК с помощью иммунофлуоресценции, затем оценивают при микроскопическом анализе флуоресценцию в не менее чем 5000 индивидуальных сперматозоидов, при этом нормой считают долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, не превышающую 0,5% от общего числа проанализированных сперматозоидов (RU 2673472, МПК G01N 33/53, опубл. 27.11.2018).
Недостатками заявленного способа являются сложность подготовки к исследованию, так как на рынке не представлено готового набора для проведения анализа, а также подсчёт клеток осуществляется лаборантом, где не исключается человеческая ошибка, что ведет к недостоверности данных.
Наиболее близким по сущности к предлагаемому решению является способ оценки генетической полноценности сперматозоидов , включающий использование пробы эякулята in vitro в среде для разбавления, в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми, генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными (RU 2679312, МПК G01N 33/52, опубл. 07.02.2019). Данный способ является прототипом тест-системы.
Недостатками данного способа являются малая специфичность и эффективность, так как молекулы гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, находятся в растворе, что не позволяет зафиксировать клетки.
Таким образом, представленные способы оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах малоэффективны, обладают малой чувствительностью и специфичностью, а также некоторые являются недостоверными.
Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов и обеспечении доступности используемых компонентов за счёт природного механизма, основанного на взаимодействии специфических рецепторов с гиалуроновой кислотой, находящейся на поверхностной мембране яйцеклетки и изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой.
Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках включает разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции регистрируется с максимумом излучения 512 нм, полученные результаты сравниваются с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%. Сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля. При интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.
Предложенный способ обеспечивает эффективное обнаружение поврежденных сперматозоидов с фрагментированной геномной ДНК за счёт фиксации данных клеток на поверхность бактериальной целлюлозы через сродство гиалуроной кислоты к рецепторам мужских половых клеток. Это улучшает и облегчает проведение дальнейшего анализа. В данном случае используется биоразлагаемая, прочная и с высокой частотой – бактериальная целлюлоза. Одним из главных плюсов также является то, что ее можно «сшить» с любыми молекулами.
В данном способе бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой используется в качестве контроля для измерения интенсивности флуоресценции, а результаты исследования выражаются в процентах относительно контроля.
Способ осуществляется следующим образом. Для получения бактериальной целлюлозы используют штамм бактерии рода Gluconacetobacter. Культивирование и получение гель-пленки проводят известным способом в среде Шрама Хетрикс.
Бактериальную целлюлозу очищают от избытка клеток, промывая 4-5 раз 1Н NaOH с выдержкой 30 мин при 80°С и проводят нейтрализацию избытка щелочи промыванием дистиллированной водой до рН 7. Затем очищенную бактериальную целлюлозу размером 2×4 см, весом 8 мг и толщиной 20 мкм высушивают при комнатной температуре и проводят сшивание флуоресцеин гиалуроновой кислоты с бактерицидной целлюлозой.
Для этого 5 мг флуоресцеин гиалуроновой кислотой растворяют в 10 мл 1%-ного раствора NaOH. Разведенный раствор флуоресцеин гиалуроновой кислоты поместить в емкость с бактериальной целлюлозой, так чтобы раствор покрывал пленку. Раствор оставляют на 60 мин, периодически перемешивая по 5 мин. Сшивание производят с помощью сшивающего агента 20%-ным 1,4-бутандиол-диглицидиловым эфиром; для этого 3 мл раствора разводят в 1%-ном растворе NaOH в соотношении 1:5, добавляют к бактериальной целлюлозе. Раствор перемешать стерильной лопаточкой в течение 10 мин. Гель-пленку поместить на водяную баню на 3 часа при 52°С для лучшего протекания реакции сшивки. Об эффективности сшивки судят по интенсивности поглощения на FTIR-ИК спектрах в диапазоне 1075-1000 см-1, свидетельствующей об образовании эфирных связей между компонентами композиции.
После иммобилизации гель-пленку переместить в лабораторную посуду для in vitro исследований (чашка Петри культуральная, 60 мм с центральным отверстием), на поверхность которой наносится препарат спермы (в 1 – биологическая жидкость здоровых мужчин-доноров; во 2 – биологическая жидкость, полученная от мужчин, переболевших Covid-19) – 300-400 мкл. Полученные пробы оставить на 10-15 мин при 37°С для инкубации, после чего регистрируют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения с максимумом при 494 нм и максимумом излучения при 512 нм.
Контрольным образцом является бактериальная целлюлоза с иммобилизованными остатками флуоресцеин гиалуроновой кислоты, интенсивность флуоресценции которой принимается как 100%. Снижение интенсивности флуоресценции при добавлении сперматозоидов до 40% относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными; при интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.
Было показано, что у мужчин, переболевших Covid-19, процент связавшихся клеток с флуоресцеин гиалуроновой кислотой ниже за счёт снижения интенсивности флуоресценции, что свидетельствует о том, что после перенесенной болезни половые клетки утрачивают рецептор к гиалуроновой кислоте и являются генетически неполноценными.
Исследование проводилось на сперматозоидах, полученных от мужчин-доноров. У каждого мужчины уточнялись следующие данные: переболел ли Covid-19, период болезни и степень тяжести. С полученным эякулятом проводились исследования на полноценность генетической информации (Пример 1, 2).
Пример 1.
В соответствии с заявленным способом была взята проба эякулята у пациента А, который официально не болел Covid-19. Далее семенную жидкость в количестве 300-400 мкл нанесли на поверхность бактериальной целлюлозы с иммобилизованной на ней гиалуроновой кислотой, меченной флуоресцеином в чашку Петри. Данный образец оставили на 10-15 мин для инкубации при температуре 37°С. После инкубации проводили измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 512 нм против контроля, в качестве которого использовалась бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой без эякулята. Интенсивность флуоресценции пробы пациента А. составила 19,33%, означающая, что сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными.
Пример 2.
В соответствии с заявленным способом была взята проба эякулята у пациента Б, который официально переболел Covid-19 в конце 2021 года. Далее семенную жидкость в количестве 300-400 мкл нанесли на поверхность бактериальной целлюлозы с иммобилизованной на ней гиалуроновой кислотой, меченной флуоресцеином в чашку Петри. Данный образец оставили на 10-15 мин для инкубации при температуре 37°С. После инкубации проводили измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 512 нм против контроля, в качестве которого использовалась бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой без эякулята. Интенсивность флуоресценции пробы пациента Б. составила 50,7%, означающая, что сперматозоиды имеют большое количество разрывов ДНК и являются генетически неполноценными.
По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов и обеспечить доступность используемых компонентов за счёт природного механизма, основанного на взаимодействии специфических рецепторов с гиалуроновой кислотой, находящейся на поверхностной мембране яйцеклетки и изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой.
Claims (1)
- Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках, включающий разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, отличающийся тем, что интенсивность флуоресценции регистрируется с максимумом излучения 512 нм, полученные результаты сравниваются с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином, интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%, сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля, при интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля выявляют, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2815686C1 RU2815686C1 (ru) | 2024-03-20 |
RU2815686C9 true RU2815686C9 (ru) | 2024-04-16 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2679312C1 (ru) * | 2017-09-12 | 2019-02-07 | Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" | Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов |
RU2730947C1 (ru) * | 2020-01-17 | 2020-08-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" | Способ для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2679312C1 (ru) * | 2017-09-12 | 2019-02-07 | Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" | Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов |
RU2730947C1 (ru) * | 2020-01-17 | 2020-08-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" | Способ для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ROMAN MONTANANA C. Assessment of DNA structure and integrity in the human spermatozoon. Tesis doctoral. Birmingham, 2019, 252 p.. GONZALEZ-MARIN C. et al. Types, Causes, Detection and Repair of DNA Fragmentation in Animal and Human Sperm Cells. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 14026-14052. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9428810B2 (en) | Detection of a target in a preservative solution | |
US8026065B2 (en) | Assessment of oocyte competence | |
CN110198711A (zh) | 癌症检测方法 | |
KR20060069862A (ko) | 자동화된 세포학적 시료 분류 | |
JP2009543089A (ja) | 細胞状態に関連したグリコシル化パターン検出の方法と試験(分析) | |
CN110108889B (zh) | 一种用于诊断IgA肾病的试剂盒及其应用 | |
US20200166528A1 (en) | Methods for Improving Assays of Biological Samples | |
RU2815686C9 (ru) | Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках | |
RU2815686C1 (ru) | Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках | |
CN115948544B (zh) | Cited4和/或metrn在椎间盘退变程度的鉴别诊断中的应用 | |
JP2013504319A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ及び/又はクラリスロマイシン抵抗性を検出するためのペプチド核酸プローブ、キット及び方法、及びその使用 | |
WO2019113827A1 (en) | Sandwich and species-specific nucleic acid aptamers against plasmodium lactate dehydrogenase for malaria diagnosis | |
KR20180081445A (ko) | 핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법 | |
Nagy et al. | Use of routinely collected amniotic fluid for whole-genome expression analysis of polygenic disorders | |
CN107779503A (zh) | 阿尔茨海默相关的差异表达基因及其应用 | |
CN113278616B (zh) | 可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme及试剂盒 | |
Guo et al. | Identification and validation of metabolism-related genes signature and immune infiltration landscape of rheumatoid arthritis based on machine learning | |
JP5522665B2 (ja) | ヌクレオチドの抽出方法 | |
JP4197797B2 (ja) | クリプトスポリジウムのオーシスト濃度の検査方法 | |
EP3338090A1 (fr) | Méthode individuelle prédictive des effets génotoxiques d'agents chimiques ou biochimiques, cassant l'adn | |
CN115287336A (zh) | 一种检测人淋巴细胞eb病毒感染和免疫检查点表达水平的方法 | |
CN101586165A (zh) | 检测OTOF基因2975-2978delAG突变的试剂盒 | |
EP3882361A1 (en) | Lateral flow assay for detecting the presence of coronavirus in a biological sample | |
RU2627455C1 (ru) | Способ изготовления биомеханического сенсора для измерения сил адгезии в системе "клетка-клетка" | |
Salami et al. | Aptamers-Based Gold-Micro-Array for High-Selective Detection of Bacteria Using Fluorescence Microscopy |