RU2814332C1 - Method for cryopreservation of intermediate product of blood coagulation factor viii - Google Patents
Method for cryopreservation of intermediate product of blood coagulation factor viii Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814332C1 RU2814332C1 RU2022120771A RU2022120771A RU2814332C1 RU 2814332 C1 RU2814332 C1 RU 2814332C1 RU 2022120771 A RU2022120771 A RU 2022120771A RU 2022120771 A RU2022120771 A RU 2022120771A RU 2814332 C1 RU2814332 C1 RU 2814332C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fviii
- factor viii
- blood coagulation
- coagulation factor
- cryopreservation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 88
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 87
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 82
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 61
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 43
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 27
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 claims description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 35
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 abstract description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 312
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 312
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 84
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 38
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 33
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 26
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 23
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 22
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 21
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 20
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 18
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 18
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 17
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 17
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 14
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 13
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 12
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 9
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 8
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 8
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 8
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 8
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229910001679 gibbsite Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 2
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000603 anti-haemophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD
[0001] Настоящая заявка относится к технической области препаратов крови и, в частности, относится к способу криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови и способу приготовления препарата фактора VIII свертывания крови, включая способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови.[0001] This application relates to the technical field of blood products and, in particular, relates to a method for cryopreservation of a blood clotting factor VIII intermediate and a method for preparing a blood clotting factor VIII preparation, including a method for cryopreservation of a blood clotting factor VIII intermediate.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART
[0002] Препарат фактора VIII свертывания крови (далее в настоящем документе также именуется как препарат FVIII) - это препарат крови, обладающий особым эффектом в отношении профилактики и лечения кровотечений у пациентов с гемофилией А. Инфузия препарата фактора VIII свертывания крови пациентам с гемофилией А может непосредственно восполнять уровень FVIII в плазме пациента, тем самым обеспечивая лечение или предотвращая кровотечение и облегчая симптомы. Гемофилия А представляет собой связанное с полом генетическое заболевание, а средний уровень заболеваемости гемофилией А составляет около 1/5000. Клинические проявления включают в себя самопроизвольное или неостановимое кровотечение в суставах, мышцах, внутренних органах и глубоколежащих тканях после незначительной травмы. Заболевание часто начинается в детском возрасте, а повторные кровоизлияния в суставы приводят к прогрессирующей дисфункции суставов и ограничению физических возможностей детей. Когда у пациентов с гемофилией А после травмы наблюдается непрерывное кровотечение, обусловленное дефектами механизма свертывания крови, им необходимо ввести достаточное количество препарата FVIII. Хотя указанный препарат FVIII обладает значительным гемостатическим эффектом, он является неустойчивым in vivo, и при повторном кровотечении требуется повторная инфузия. Если профилактическую терапию концентрированным FVIII осуществлять путем регулярных инфузий, то пациенты, страдающие тяжелой формой гемофилии, могут жить почти так же, как и обычные люди. Поэтому, несмотря на то, что общее число пациентов с гемофилией А относительно невелико, потребность в препарате FVIII является огромной.[0002] Blood clotting factor VIII drug (hereinafter also referred to as FVIII drug) is a blood product that has a special effect in preventing and treating bleeding in patients with hemophilia A. Infusion of blood clotting factor VIII drug in patients with hemophilia A can directly replenish the patient's plasma FVIII levels, thereby providing treatment or preventing bleeding and relieving symptoms. Hemophilia A is a sex-linked genetic disorder, and the average incidence of hemophilia A is about 1/5000. Clinical manifestations include spontaneous or uncontrollable bleeding in joints, muscles, internal organs and deep tissues after minor trauma. The disease often begins in childhood, and repeated hemorrhages in the joints lead to progressive joint dysfunction and limited physical capabilities of children. When patients with hemophilia A experience continuous bleeding after trauma due to defects in the blood clotting mechanism, they need to be given a sufficient amount of FVIII. Although this FVIII preparation has a significant hemostatic effect, it is unstable in vivo and repeated infusion is required if rebleeding occurs. If prophylactic therapy with concentrated FVIII is given through regular infusions, patients suffering from severe hemophilia can live almost as well as normal people. Therefore, although the total number of patients with hemophilia A is relatively small, the need for FVIII is enormous.
[0003] Заместительная терапия с применением фактора свертывания крови по-прежнему остается наиболее эффективной мерой гемостаза при острых кровотечениях в случае гемофилии. Принцип лечения заключается в выявлении на ранней стадии, применении достаточного количества и прохождении полного курса лечения. При выборе дозировки и продолжительности лечения путем заместительной терапии следует учитывать место кровотечения и его тяжесть. Острое кровотечение следует лечить, учитывая обстоятельства: может быть выбран генетически рекомбинантный препарат FVIII или полученный из крови препарат FVIII с инактивированный вирусом, а для нестандартного пациента может быть выбран криопреципитат или свежезамороженная плазма. Однако существует риск заражения вирусами, передающимися при переливании крови. Поэтому следует, по возможности, избегать его применения для лечения детей с гемофилией.[0003] Coagulation factor replacement therapy continues to be the most effective measure of hemostasis for acute bleeding in hemophilia. The principle of treatment is to detect it at an early stage, apply a sufficient amount and complete the full course of treatment. When choosing the dosage and duration of treatment with replacement therapy, the location of bleeding and its severity should be taken into account. Acute bleeding should be treated based on the circumstances: a genetically recombinant FVIII preparation or a blood-derived FVIII preparation with inactivated virus may be chosen, and for the unusual patient, cryoprecipitate or fresh frozen plasma may be chosen. However, there is a risk of contracting viruses transmitted through blood transfusions. Therefore, its use should be avoided whenever possible in the treatment of children with hemophilia.
[0004] Проблемы, возникающие при клиническом применении рекомбинантных продуктов FVIII, включают в себя: повторное применение высоких доз генетически рекомбинантного FVIII высокой степени чистоты; повышенный риск выработки антител из-за ингибиторов, т. е. антител, ингибирующих FVIII (Государственное управление по контролю качества медикаментов и продуктов питания (SFDA) и Европейское Агентство по оценке лекарственных препаратов (EMEA) предупреждают о риске образования антител при применении рекомбинантного фактора VIII свертывания крови человека, Pharmacovigilance Express News, 2006, 3(3): 187); и проблематичность антитела, ингибирующего FVIII, с точки зрения его автоматического клиренса, что, в свою очередь, вызывает неконтролируемое кровотечение, повышенную частоту госпитализаций и повреждение суставов, приводящих, в конечном итоге, к повышению заболеваемости и смертности. По сравнению с высокочистым FVIII генетической рекомбинации уровень ингибирующих антител к FVIII, которые вырабатываются после повторного применения FVIII, полученного из крови, является более низким, особенно у детей с гемофилией А. Поэтому для пациентов с гемофилией А, нуждающихся в долгосрочной инфузии FVIII, ингибирующее антитело к FVIII, полученному из крови, является более безопасным, и в то же время его цена ниже, а медицинская нагрузка - меньше. Таким образом, существует потребность в дальнейшей разработке и оптимизации технологического маршрута получения продукта FVIII из плазмы человека для обеспечения доступности профилактических/терапевтических препаратов и возможности выбора клинических препаратов для пациентов с гемофилией А.[0004] Problems encountered in the clinical use of recombinant FVIII products include: repeated use of high doses of genetically recombinant FVIII of high purity; increased risk of antibody development due to inhibitors, i.e. antibodies that inhibit FVIII (SFDA and EMEA warn of risk of antibody formation with recombinant factor VIII human blood coagulation, Pharmacovigilance Express News, 2006, 3(3): 187); and the problematic nature of FVIII inhibitory antibodies to undergo automatic clearance, which in turn causes uncontrolled bleeding, increased hospitalization and joint damage, ultimately leading to increased morbidity and mortality. Compared with high-purity genetic recombination FVIII, the level of inhibitory antibodies to FVIII that are produced after repeated administration of blood-derived FVIII is lower, especially in children with hemophilia A. Therefore, for patients with hemophilia A requiring long-term FVIII infusion, inhibitory antibody to FVIII obtained from blood is safer, and at the same time its price is lower and the medical burden is less. Thus, there is a need to further develop and optimize the process route for obtaining the FVIII product from human plasma to ensure the availability of prophylactic/therapeutic drugs and the possibility of choosing clinical drugs for patients with hemophilia A.
[0005] Способ кислотного осаждения в сочетании с очисткой колоночной хроматографией представляет собой один из классических способов получения FVIII из крови. Его принцип заключается в следующем: FVIII является нерастворимым при низких температурах; около 50% FVIII в плазме осаждают с помощью криопреципитации; криопреципитат плазмы, в качестве раствора для растворения исходного материала, адсорбирует витамин К-зависимые факторы свертывания крови через алюминиевый гель, тем самым разрывая цепь свертывания крови; FVIII является не активированным и теряет активность в процессе производства. Согласно характеристикам аминокислотных остатков белковой молекулы фибриногена (Fg), удаление Fg происходит путем осаждения в условиях кислого рН, в то время как большая часть FVIII остается в надосадочной жидкости. Из-за ограничения производительности обработки на этапе предварительной очистки крупномасштабное производство препарата FVIII затруднено. Реальность, с которой сталкиваются различные компании, производящие препараты из крови, заключается в том, что при выпуске человеческого иммуноглобулина, человеческого альбумина и других продуктов для внутривенного введения, компании-производители препаратов крови могут получить только ограниченный объем готового продукта FVIII, который соответствует входному количеству плазмы в каждой партии. Производительность обработки на этапе предварительной очистки, таком как этап технологического процесса перед стерилизацией и фильтрацией маточного раствора, значительно понижена по сравнению с производительностью обработки на таких этапах технологического процесса, как промежуточная упаковка и сублимационная сушка. Таким образом, масштаб производства препарата FVIII в определенной степени ограничены масштабом приготовления криопреципитата плазмы исходного материала и масштабом приготовления промежуточного продукта перед стерилизацией и фильтрацией маточного раствора. Однако компании, производящие препараты крови, не могут решить вышеуказанные проблемы, просто увеличив количество плазмы на входе, поскольку производственная линия FVIII разработана на основе линии для производства важных препаратов крови, таких как человеческий иммуноглобулин и человеческий альбумин. Следовательно, количество продукта FVIII, которое, соответственно, может быть получено компаниями-производителями препаратов крови от каждой партии вводимой в производство плазмы, является ограниченным. Для компаний, производящих препараты крови, после завершения производственной линии фиксируют количество плазмы в каждой входной партии, и производственная линия не может быть изменена по желанию без одобрения отдела контроля и управления производством лекарственных средств. Для расширения производственных мощностей обычно применяют параллельный способ, обеспечивающий увеличение объема выпуска за то же время, но это выдвигает все более высокие требования к капиталовложениям, организации и инфраструктуре. В заключение, независимо от масштаба производства компаний-производителей препаратов крови, всегда существует противоречие между масштабами производства препарата FVIII на начальном и конечном этапах.[0005] The acid precipitation method in combination with column chromatography purification is one of the classical methods for obtaining FVIII from blood. Its principle is as follows: FVIII is insoluble at low temperatures; about 50% of FVIII in plasma is precipitated by cryoprecipitation; Plasma cryoprecipitate, as a solution for dissolving the starting material, adsorbs vitamin K-dependent blood clotting factors through the aluminum gel, thereby breaking the blood clotting chain; FVIII is not activated and loses activity during the manufacturing process. According to the characteristics of the amino acid residues of the protein molecule fibrinogen (Fg), removal of Fg occurs by precipitation under acidic pH conditions, while most of the FVIII remains in the supernatant. Due to processing throughput limitations in the prepurification step, large-scale production of the FVIII formulation is difficult. The reality that various blood product companies face is that when producing human immunoglobulin, human albumin and other intravenous products, blood product companies can only obtain a limited amount of finished FVIII product that matches the input quantity plasma in each batch. The processing capacity of the pre-cleaning step, such as the process step before sterilization and filtration of the mother liquor, is significantly reduced compared to the processing capacity of process steps such as intermediate packaging and freeze drying. Thus, the scale of production of the FVIII preparation is limited to a certain extent by the scale of preparation of plasma cryoprecipitate of the starting material and the scale of preparation of the intermediate product before sterilization and filtration of the mother liquor. However, blood product companies cannot solve the above problems by simply increasing the amount of plasma input, since the FVIII production line is designed based on the line for the production of important blood products such as human immunoglobulin and human albumin. Consequently, the amount of FVIII product that can be obtained by blood product companies from each batch of plasma introduced into production is limited. For blood product companies, after the production line is completed, the amount of plasma in each input batch is fixed, and the production line cannot be changed at will without the approval of the drug production control department. To expand production capacity, a parallel method is usually used, providing an increase in output in the same time, but this places increasingly higher demands on capital investment, organization and infrastructure. In conclusion, regardless of the scale of production of blood product manufacturing companies, there is always a tension between the scale of production of FVIII product at the upstream and downstream stages.
[0006] Поэтому, с одной стороны, для удовлетворения потребности пациентов с гемофилией А в доступности профилактических/лечебных препаратов и возможности выбора клинических препаратов; и, с другой стороны, для решения проблемы, связанной с увеличением объема производства продуктов FVIII компаниями-производителями препаратов крови, существует потребность в безотлагательной разработке технологического процесса получения продукта FVIII, который подходит для крупномасштабного производства и обеспечивает гибкость в применении.[0006] Therefore, on the one hand, to meet the needs of patients with hemophilia A for the availability of preventive/therapeutic drugs and the possibility of choosing clinical drugs; and, on the other hand, to address the increasing volume of production of FVIII products by blood product manufacturing companies, there is an urgent need to develop a process for producing FVIII product that is suitable for large-scale production and provides flexibility in application.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
[0007] Для решения упомянутых выше технических проблем в настоящем изобретении предложен способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови, который помогает гибко обеспечить крупномасштабное производство препарата FVIII.[0007] To solve the above-mentioned technical problems, the present invention provides a method for cryopreserving a coagulation factor VIII intermediate that helps flexibly enable large-scale production of FVIII preparation.
[0008] Настоящее изобретение осуществлено за счет применения следующих схем.[0008] The present invention is accomplished by using the following circuits.
[0009] В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови. Способ включает в себя: криоконсервацию в качестве промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови любого из концентрированного раствора FVIII или хроматографического элюента FVIII перед получением маточного раствора, или перед концентрированием путем ультрафильтрации, или после концентрирования путем ультрафильтрации в процессе получения препарата фактора VIII и их комбинаций или вариантов.[0009] In one aspect, the present invention provides a method for cryopreserving a factor VIII coagulation intermediate. The method includes: cryopreservation as an intermediate product of blood coagulation factor VIII of any of the concentrated solution of FVIII or the chromatographic eluent of FVIII before obtaining the mother solution, or before concentration by ultrafiltration, or after concentration by ultrafiltration in the process of obtaining the preparation of factor VIII and their combinations or variants .
[0010] Когда термин «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению конкретно относится к хроматографическому элюенту FVIII, он необязательно представляет собой хроматографический элюент FVIII, обладающий аффинностью к гепарину, или анионный хроматографический элюент FVIII.[0010] When the term "FVIII intermediate" of the present invention specifically refers to a FVIII chromatography eluent, it is not necessarily a heparin affinity FVIII chromatography eluent or an anionic FVIII chromatography eluent.
[0011] Когда термин «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению конкретно относится к концентрированному раствору FVIII перед получением маточного раствора, он, предпочтительно, представляет собой концентрированный раствор FVIII до стерилизации и фильтрации перед получением маточного раствора; предпочтительно концентрированный раствор FVIII до наномембранной фильтрации перед получением маточного раствора; и, предпочтительно, концентрированный раствор FVIII до ультрафильтрации перед получением маточного раствора.[0011] When the term "FVIII intermediate" of the present invention specifically refers to a concentrated FVIII solution prior to producing a mother liquor, it is preferably a concentrated FVIII solution prior to sterilization and filtration prior to producing a mother liquor; preferably a concentrated FVIII solution prior to nanomembrane filtration before obtaining a mother liquor; and preferably a concentrated FVIII solution prior to ultrafiltration before obtaining a mother liquor.
[0012] В одном варианте осуществления вариант «промежуточного продукта FVIII» по настоящему изобретению может представлять собой концентрированный раствор FVIII, полученный путем регулирования концентрации хроматографического элюента FVIII путем диализа и/или буфера. Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой раствор FVIII, концентрированный с помощью ультрафильтрации, полученный путем ультрафильтрации вышеупомянутого концентрированного раствора FVIII. Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой раствор образца после того, как концентрация вышеуказанного раствора FVIII, концентрированного с помощью ультрафильтрации, отрегулирована буфером и до получения маточного раствора.[0012] In one embodiment, a variant of the "FVIII intermediate" of the present invention may be a concentrated FVIII solution obtained by adjusting the concentration of the FVIII chromatographic eluent through dialysis and/or buffer. In addition, the so-called “FVIII intermediate” of the present invention may also be an ultrafiltration concentrated FVIII solution obtained by ultrafiltration of the above-mentioned concentrated FVIII solution. In addition, the so-called “FVIII intermediate” of the present invention can also be a sample solution after the concentration of the above ultrafiltration-concentrated FVIII solution is adjusted with a buffer until a mother liquor is obtained.
[0013] В одном варианте осуществления вариант «промежуточного продукта FVIII» по настоящему изобретению может представлять собой концентрированный раствор FVIII, полученный путем инактивации вирусов хроматографического элюента FVIII.[0013] In one embodiment, a variant of the "FVIII intermediate" of the present invention may be a concentrated FVIII solution prepared by inactivating FVIII chromatographic eluent viruses.
[0014] В одном варианте осуществления вариант «промежуточного продукта FVIII» по настоящему изобретению может представлять собой хроматографический элюент, в который добавлен активный защитный агент FVIII.[0014] In one embodiment, a variant of the "FVIII intermediate" of the present invention may be a chromatographic eluent to which an active FVIII protecting agent has been added.
[0015] Кроме того, скорость замораживания промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови больше или равна 1 °С/мин, а сохраняют промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови в условиях температур от -15 °С до -196 °С.[0015] In addition, the freezing rate of the factor VIII intermediate is greater than or equal to 1 °C/min, and the factor VIII intermediate is stored at temperatures ranging from -15 °C to -196 °C.
[0016] Кроме того, скорость замораживания находится в диапазоне от 1 °C/мин до 10 °C/мин.[0016] In addition, the freezing speed is in the range of 1 °C/min to 10 °C/min.
[0017] Кроме того, скорость замораживания находится в диапазоне от 1 °C/мин до 3 °C/мин.[0017] In addition, the freezing speed is in the range of 1 °C/min to 3 °C/min.
[0018] Кроме того, скорость замораживания находится в диапазоне от 1,5 °C/мин до 3 °C/мин.[0018] In addition, the freezing speed is in the range of 1.5 °C/min to 3 °C/min.
[0019] В конкретном варианте осуществления скорость замораживания составляет 1,5 °C/мин.[0019] In a specific embodiment, the freezing rate is 1.5 °C/min.
[0020] Кроме того, промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют в условиях температур от -20 °С до -80 °С.[0020] In addition, the coagulation factor VIII intermediate is stored at temperatures ranging from -20°C to -80°C.
[0021] Кроме того, промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют в условиях температур от -20 °С до -55 °С.[0021] In addition, the coagulation factor VIII intermediate is stored at temperatures ranging from -20°C to -55°C.
[0022] Кроме того, промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови сохраняют с помощью жидкого азота или сухого льда.[0022] In addition, the factor VIII intermediate is preserved using liquid nitrogen or dry ice.
[0023] Упомянутый выше промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови имеет удельную активность ≥1 МЕ/мг, или ≥10 МЕ/мг, или ≥50 МЕ/мг, или ≥70 МЕ/мг, или ≥100 МЕ/мг, или ≥200 МЕ/мг или ≥1000 МЕ/мг.[0023] The above coagulation factor VIII intermediate has a specific activity of ≥1 IU/mg, or ≥10 IU/mg, or ≥50 IU/mg, or ≥70 IU/mg, or ≥100 IU/mg, or ≥ 200 IU/mg or ≥1000 IU/mg.
[0024] Раствор промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови имеет рН от 6,5 до 7,5.[0024] The factor VIII intermediate solution has a pH of 6.5 to 7.5.
[0025] В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения препарата фактора VIII свертывания крови, включающий в себя описанный выше способ криоконсервации промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови.[0025] In another aspect, the present invention provides a method for producing a blood clotting factor VIII preparation, including the method of cryopreserving a blood clotting factor VIII intermediate described above.
[0026] В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ снижения осаждения примесей продукта фактора VIII свертывания крови. В технологическом процессе получения продукта фактора VIII свертывания крови промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови подвергают криоконсервации в соответствии с описанным выше способом криоконсервации.[0026] In yet another aspect, the present invention provides a method for reducing the deposition of coagulation factor VIII product contaminants. In the technological process for producing the blood clotting factor VIII product, the blood clotting factor VIII intermediate product is cryopreserved in accordance with the cryopreservation method described above.
[0027] В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ улучшения долгосрочной стабильности продукта фактора VIII свертывания крови. В технологическом процессе получения продукта фактора VIII свертывания крови промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови подвергают криоконсервации в соответствии с описанным выше способом криоконсервации.[0027] In another aspect, the present invention provides a method for improving the long-term stability of a blood clotting factor VIII product. In the technological process for producing the blood clotting factor VIII product, the blood clotting factor VIII intermediate product is cryopreserved in accordance with the cryopreservation method described above.
[0028] В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает продукт, полученный с помощью вышеупомянутого способа.[0028] In yet another aspect, the present invention provides a product obtained using the above method.
[0029] Кроме того, указанный продукт представляет собой препарат FVIII или комплекс FVIII и фактора фон Виллебранда (vWF).[0029] In addition, the specified product is a preparation of FVIII or a complex of FVIII and von Willebrand factor (vWF).
[0030] Настоящее изобретение обладает следующими полезными техническими эффектами.[0030] The present invention has the following useful technical effects.
[0031] По настоящему изобретению раствор промежуточного продукта FVIII замораживают при скорости замораживания, которая превышает или равна 1 °C/мин, и подвергают криоконсервации в течение длительного периода в условиях температур от -15 °С до -196 °С. Результаты испытаний подтверждают, что применение криоконсервации промежуточного продукта FVIII по способу согласно настоящему изобретению может обеспечить улучшенную удельную активность без изменения активности FVIII. Кроме того, способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII согласно настоящему изобретению может, в определенной степени, улучшить стабильность промежуточного продукта FVIII.[0031] In the present invention, the FVIII intermediate solution is frozen at a freezing rate greater than or equal to 1 °C/min and cryopreserved for an extended period at temperatures ranging from -15 °C to -196 °C. The test results confirm that the use of cryopreservation of the FVIII intermediate by the method of the present invention can provide improved specific activity without affecting FVIII activity. In addition, the cryopreservation method of the FVIII intermediate according to the present invention can, to a certain extent, improve the stability of the FVIII intermediate.
[0032] Криоконсервированный раствор промежуточного продукта препарата фактора VIII свертывания крови может быть в дальнейшем применен в качестве маточного раствора для последующего процесса производства FVIII и в качестве сырья для получения готового продукта, а также он может быть применен для приготовления готового продукта FVIII надлежащего качества, соответствующего требованиям «Китайской фармакопеи», издание 2015 г. Результаты испытаний на стабильность готового продукта FVIII подтверждают, что упомянутый выше готовый продукт FVIII может иметь стабильные свойства в течение 48 месяцев при хранении в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C.[0032] The cryopreserved solution of the coagulation factor VIII drug intermediate can be further used as a mother liquor for the subsequent FVIII production process and as a raw material for the preparation of a finished product, and it can also be used to prepare a finished FVIII product of adequate quality, corresponding requirements of the Chinese Pharmacopoeia, 2015 edition. The stability test results of the finished FVIII product confirm that the above-mentioned finished FVIII product can have stable properties for 48 months when stored in a refrigerator at a temperature of 2 °C to 8 °C.
[0033] Таким образом, при условии, что скорость восстановления активности FVIII и скорость восстановления удельной активности не снижены, а также при условии, что стабильность препарата FVIII при длительном хранении не ухудшена, способ криоконсервации раствора промежуточного продукта фактора VIII свертывания крови препарата согласно настоящему изобретению может повысить гибкость технологического процесса производства FVIII и способствовать увеличению объема производства и выработке препарата FVIII в больших масштабах.[0033] Thus, provided that the rate of recovery of FVIII activity and the rate of recovery of specific activity are not reduced, and provided that the stability of the FVIII preparation during long-term storage is not degraded, the method for cryopreserving a solution of the coagulation factor VIII intermediate product of the drug according to the present invention may increase the flexibility of the FVIII manufacturing process and facilitate increased production and production of the FVIII drug on a larger scale.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS
[0034] На ФИГ. 1 представлена блок-схема технологического процесса получения готового продукта FVIII, в которой заштрихованный участок представляет собой этап технологического процесса, на котором получают так называемый «промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови» по настоящему изобретению.[0034] In FIG. 1 is a flow diagram for the production of a finished FVIII product, in which the shaded area represents the process step that produces the so-called "factor VIII intermediate" of the present invention.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDESCRIPTION OF IMPLEMENTATION OPTIONS
[0035] Чтобы ясно разъяснить цели, технические схемы и преимущества настоящего изобретения, настоящее изобретение подробно описано ниже в сочетании с конкретными примерами. Следует понимать, что конкретные примеры, описанные в настоящем документе, предназначены только для разъяснения настоящего изобретения, а не для ограничения его объема.[0035] To clearly explain the objectives, technical schemes and advantages of the present invention, the present invention is described in detail below in combination with specific examples. It should be understood that the specific examples described herein are intended only to illustrate the present invention and not to limit its scope.
[0036] Как известно специалистам в данной области техники, все технологические процессы, применяемые в существующем промышленном производстве продукта FVIII, получаемого из крови, или технологические процессы, которые разработаны и оптимизированы дополнительно, выполняют безостановочно и без перерывов. Поскольку содержание FVIII в сыворотке является крайне незначительным (от 0,05 мг/л до 0,1 мг/л) и он является чрезвычайно нестабильным в условиях in vitro, потеря активности препарата FVIII или раствора очищенного промежуточного продукта при комнатной температуре является очень заметной. Таким образом, в масштабе промышленного производства, изготовление препарата FVIII начинается с подготовки исходного материала плазмы путем криопреципитации до инактивации вирусов, при этом все рабочие процедуры следует выполнять безостановочно и без перерывов, даже если для удобства проведения эксперимента в лаборатории на различных стадиях очистки ученые часто сохраняют образцы белка с помощью криоконсервации. Кроме того, отдел надзора за производством лекарственных средств не разрешает включать в технологический процесс производства препарата FVIII хранение различных партий очищенных промежуточных материалов и объединение эквивалентных количеств очищенных промежуточных материалов из разных партий. Причина заключается в том, что активность FVIII может быть снижена при замораживании и оттаивании промежуточного продукта (Стабильность фактора фон Виллебранда и FVIII в криопреципитате собачьих при различных условиях хранения, Stokol T и соавт. Res Vet Sci. (1995)), что, в свою очередь, непосредственно влияет на активность и качество готового продукта. Возможным механизмом этого нежелательного результата могут быть небольшие кристаллы льда и относительно большая площадь поверхности раздела лед-жидкость, которые могут образовываться в процессе замораживания белкового раствора, что может увеличить степень воздействия на белковые молекулы поверхности раздела лед-жидкость, тем самым повышая риск инактивации из-за денатурации белков; а во время процесса оттаивания рекристаллизация белкового раствора дополнительно подвергает молекулы белка на границе раздела лед-жидкость воздействию значительного поверхностного натяжения или механического усилия сдвига, тем самым усиливая повреждение (источник «Effect of freezing and thawing rates on denaturation of proteins in aqueous solutions», Biotechnology and Bioengineering, VOL. 82, No. 6, June 20, 2003).[0036] As is known to those skilled in the art, all processes used in the existing industrial production of the FVIII blood product, or processes that are further developed and optimized, are carried out non-stop and without interruption. Because serum FVIII levels are extremely low (0.05 mg/L to 0.1 mg/L) and are extremely unstable in vitro, the loss of activity of the FVIII preparation or purified intermediate solution at room temperature is very noticeable. Thus, on an industrial scale, the preparation of FVIII preparation begins with the preparation of plasma starting material by cryoprecipitation until the viruses are inactivated, and all operating procedures must be carried out non-stop and without interruption, even if, for the convenience of carrying out the experiment in the laboratory, scientists often save protein samples using cryopreservation. In addition, FDA does not permit the storage of different batches of purified intermediates or the pooling of equivalent quantities of purified intermediates from different batches into the FVIII manufacturing process. The reason is that FVIII activity may be reduced by freezing and thawing of the intermediate product (Stability of von Willebrand factor and FVIII in canine cryoprecipitate under different storage conditions, Stokol T et al. Res Vet Sci. (1995)), which in turn turn, directly affects the activity and quality of the finished product. A possible mechanism for this undesirable result may be the small ice crystals and relatively large ice-liquid interface area that can form during the freezing process of the protein solution, which may increase the degree of exposure of the protein molecules to the ice-liquid interface, thereby increasing the risk of inactivation of the protein. for protein denaturation; and during the thawing process, recrystallization of the protein solution further exposes the protein molecules at the ice-liquid interface to significant surface tension or mechanical shear, thereby increasing damage (source "Effect of freezing and thawing rates on denaturation of proteins in aqueous solutions", Biotechnology and Bioengineering, VOL. 82, No. 6, June 20, 2003).
[0037] Кроме того, в технологическом процессе производства продукта FVIII, описанном или зарегистрированном в патентных документах, других научных документах и справочной литературе в этой области (например, «Blood Transfusion Therapy and Blood Preparations» под редакцией Liu Junxiang), такой этап криоконсервации промежуточного продукта FVIII еще не описан и не введен. Например, компания Taibang Biological Group Co., Ltd., которая является отечественным производителем препаратов крови, имеет патент CN108218981A, в котором описан способ получения FVIII. В частности, для получения готового продукта FVIII указанный способ включает в себя: растворение криопреципитата плазмы в качестве исходного материала; осуществление его кислотного осаждения, адсорбцию на геле DEAE Sephadex A-50, инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D), колоночную хроматографию с применением геля TOYOPEARL DEAE-650M, ультрафильтрацию, получение полуфабриката и готового продукта. В качестве другого примера, для получения готового продукта FVIII способ получения FVIII, описанный в патенте CN107880112A, который принадлежит компании Hualan Biological Engineering, Inc., включает в себя: растворение криопреципитата плазмы в качестве исходного материала с помощью раствора трометамина; выполнение его осаждения полиэтиленгликолем, инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D), колоночную хроматографию с применением геля ToyopearlDEAE 650M, ультрафильтрацию, получение полуфабриката и готового продукта FVIII. Способ получения FVIII, описанный в патенте CN107337727A, который принадлежит компании Wuhan Blood Products Co., Ltd., включает в себя: растворение криопреципитата плазмы в качестве исходного материала; получение маточного раствора для начальной экстракции путем осаждения полиэтиленгликолем и инактивации вирусов; получение очищенного экстракционного маточного раствора путем анионообменной хроматографии; получение очищенного раствора с помощью ультрафильтрационного диализа; и получение готового продукта FVIII путем сублимационной сушки, инактивации сухим жаром и упаковки. Ни один из перечисленных выше способов получения препарата FVIII, как описано вышеуказанными компаниями-производителями препаратов крови, не включает в себя этап криоконсервации промежуточного продукта FVIII.[0037] In addition, in the manufacturing process of the FVIII product described or registered in patent documents, other scientific documents and reference literature in this field (for example, "Blood Transfusion Therapy and Blood Preparations" edited by Liu Junxiang), such a step of cryopreservation of the intermediate FVIII product has not yet been described or introduced. For example, Taibang Biological Group Co., Ltd., which is a domestic blood product manufacturer, has patent CN108218981A, which describes a method for producing FVIII. In particular, to obtain the finished FVIII product, this method includes: dissolving plasma cryoprecipitate as a starting material; carrying out its acid precipitation, adsorption on DEAE Sephadex A-50 gel, inactivation of viruses using the solvent-detergent (S/D) method, column chromatography using TOYOPEARL DEAE-650M gel, ultrafiltration, obtaining a semi-finished product and a finished product. As another example, to obtain a finished FVIII product, the method for producing FVIII described in patent CN107880112A, which belongs to Hualan Biological Engineering, Inc., includes: dissolving plasma cryoprecipitate as a starting material with a tromethamine solution; performing its precipitation with polyethylene glycol, inactivation of viruses using the solvent-detergent (S/D) method, column chromatography using ToyopearlDEAE 650M gel, ultrafiltration, obtaining semi-finished and finished product FVIII. The method for producing FVIII described in patent CN107337727A, which belongs to Wuhan Blood Products Co., Ltd., includes: dissolving plasma cryoprecipitate as a starting material; obtaining a mother liquor for initial extraction by precipitation with polyethylene glycol and inactivation of viruses; obtaining a purified extraction mother liquor by anion exchange chromatography; obtaining a purified solution using ultrafiltration dialysis; and obtaining a finished FVIII product by freeze-drying, dry heat inactivation and packaging. None of the above methods for obtaining the FVIII product, as described by the above-mentioned blood product manufacturing companies, includes the step of cryopreservation of the FVIII intermediate product.
[0038] Благодаря многолетней практике в сфере массового производства заявитель обнаружил, что в масштабах производства неожиданный технический эффект практического отсутствия потери в скорости восстановления активности FVIII и удельной активности может быть достигнут за счет специального управления условиями криоконсервации промежуточного продукта FVIII. В то же время заявитель также неожиданно обнаружил, что после криоконсервации вышеупомянутого раствора промежуточного продукта FVIII при низкой температуре степень осаждения видимых посторонних веществ при комнатной температуре снижена. Путем выявления показателя С активности FVIII криоконсервированного раствора промежуточного продукта FVIII после хранения при комнатной температуре в течение 24 часов было обнаружено, что потеря активности FVIII замедляется, а стабильность при комнатной температуре значительно улучшена.[0038] Through many years of practice in the field of mass production, the applicant has discovered that at scale production the unexpected technical effect of virtually no loss in the rate of recovery of FVIII activity and specific activity can be achieved through special control of the cryopreservation conditions of the FVIII intermediate product. At the same time, the applicant also unexpectedly discovered that after cryopreserving the above-mentioned FVIII intermediate solution at a low temperature, the deposition rate of visible foreign matter at room temperature was reduced. By identifying the FVIII activity C value of a cryopreserved FVIII intermediate solution after storage at room temperature for 24 hours, it was found that the loss of FVIII activity was slowed down and stability at room temperature was significantly improved.
[0039] В способе криоконсервации промежуточного продукта FVIII по настоящему изобретению скорость замораживания для криоконсервации промежуточного продукта FVIII составляет не менее 1 °C/мин, предпочтительно в диапазоне от 1 °C/мин до 10 °C/мин, более предпочтительно в диапазоне от 1 °С/мин до 3 °С/мин и более предпочтительно - в диапазоне от 1,5 °С/мин до 3 °С/мин. Когда промежуточный продукт FVIII полностью заморожен, температуру замораживания следует поддерживать по меньшей мере такой, чтобы хранить промежуточный продукт FVIII в полностью замороженном состоянии. Промежуточный продукт FVIII по настоящему изобретению после замораживания в указанных выше условиях затем хранят при температуре от -15 °С до -196 °С, предпочтительно от -20 °С до -80 °С и, более предпочтительно, от -20 °С до -55 °С.[0039] In the FVIII intermediate cryopreservation method of the present invention, the freezing rate for cryopreservation of the FVIII intermediate is at least 1 °C/min, preferably in the range of 1 °C/min to 10 °C/min, more preferably in the range of 1 °C/min to 3 °C/min and more preferably in the range of 1.5 °C/min to 3 °C/min. When the FVIII intermediate is completely frozen, the freezing temperature should be maintained at least such that the FVIII intermediate is kept completely frozen. The FVIII intermediate of the present invention, after being frozen under the above conditions, is then stored at a temperature of -15°C to -196°C, preferably -20°C to -80°C and more preferably -20°C to - 55 °C.
[0040] В некоторых конкретных вариантах осуществления промежуточный продукт FVIII замораживают и хранят с применением жидкого азота или сухого льда.[0040] In some specific embodiments, the FVIII intermediate is frozen and stored using liquid nitrogen or dry ice.
[0041] В некоторых вариантах осуществления продолжительность криоконсервации промежуточного продукта FVIII может составлять от 0 до 24 месяцев или более.[0041] In some embodiments, the duration of cryopreservation of the FVIII intermediate may be from 0 to 24 months or more.
[0042] В некоторых случаях промежуточный продукт FVIII имеет удельную активность (МЕ/мг) ≥1 МЕ/мг. В других случаях удельная активность (МЕ/мг) промежуточного продукта FVIII составляет ≥10 МЕ/мг, или ≥50 МЕ/мг, или ≥70 МЕ/мг, или ≥100 МЕ/мг, или ≥200 МЕ/мг или ≥1000 МЕ/мг.[0042] In some cases, the FVIII intermediate has a specific activity (IU/mg) of ≥1 IU/mg. In other cases, the specific activity (IU/mg) of the FVIII intermediate is ≥10 IU/mg, or ≥50 IU/mg, or ≥70 IU/mg, or ≥100 IU/mg, or ≥200 IU/mg, or ≥1000 IU/mg.
[0043] В некоторых вариантах осуществления раствор промежуточного продукта препарата FVIII имеет показатель pH в диапазоне от 6,5 до 7,5. В некоторых конкретных вариантах осуществления буфер промежуточного продукта FVIII может представлять собой буфер, содержащий одну или более аминокислот. Буфер может представлять собой любой из цитратно-натриевого буфера, фосфатного буфера, трис-буфера и т. д. Изоэлектрическая точка комплекса FVIII-vWF находится в диапазоне от 5,5 до 6,0. При pH от 6,5 до 7,5 комплекс FVIII-vWF заряжен отрицательно, что подходит для дальнейшей очистки FVIII способом анионной хроматографии. В то же время нейтральные условия при pH от 6,5 до 7,5 способствуют защите активности FVIII.[0043] In some embodiments, the FVIII drug intermediate solution has a pH in the range of 6.5 to 7.5. In some specific embodiments, the FVIII intermediate buffer may be a buffer containing one or more amino acids. The buffer may be any of sodium citrate buffer, phosphate buffer, Tris buffer, etc. The isoelectric point of the FVIII-vWF complex is in the range of 5.5 to 6.0. At pH 6.5 to 7.5, the FVIII-vWF complex is negatively charged, which is suitable for further purification of FVIII by anion chromatography. At the same time, neutral conditions at a pH of 6.5 to 7.5 help protect FVIII activity.
[0044] Кроме того, в способе криоконсервации промежуточного продукта FVIII по настоящему изобретению его эффект криоконсервации в меньшей степени зависит от других предыдущих этапов технологического процесса. После оттаивания криоконсервированного промежуточного продукта FVIII с последующим выполнением таких технологических операций, как фильтрация, приготовление полуфабриката, стерилизация, промежуточная упаковка, сублимационная сушка и инактивация сухим жаром можно получить препарат FVIII надлежащего качества, удовлетворяющий требованиям «Китайской фармакопеи» (издание 2015 г. ).[0044] In addition, in the cryopreservation method for the FVIII intermediate of the present invention, its cryopreservation effect is less dependent on other previous process steps. After thawing the cryopreserved FVIII intermediate product, followed by technological operations such as filtration, semi-finished product preparation, sterilization, intermediate packaging, freeze drying and dry heat inactivation, it is possible to obtain an FVIII preparation of adequate quality that meets the requirements of the Chinese Pharmacopoeia (2015 edition).
[0045] Так называемый «препарат FVIII» в настоящем описании может также упоминаться как «препарат антигемофильного глобулина».[0045] The so-called “FVIII preparation” in the present description may also be referred to as “antihemophilic globulin preparation”.
[0046] Так называемый «технологический процесс изготовления препарата FVIII» в настоящем описании относится ко всему технологическому процессу изготовления препарата FVIII. Способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII, который будет освещен в примерах настоящего описания, может служить связующим звеном в общем технологическом процессе производства препарата FVIII.[0046] The so-called “technological process for manufacturing the FVIII preparation” in the present description refers to the entire technological process for manufacturing the FVIII preparation. The method of cryopreservation of the FVIII intermediate product, which will be highlighted in the examples of this description, can serve as a link in the overall technological process for the production of the FVIII drug.
[0047] В предшествующем уровне техники процесс производства FVIII начинается с криопреципитата плазмы, при этом промежуточный продукт FVIII получают с помощью множества этапов, таких как гель-адсорбция, инактивация вирусов и хроматография, а для получения готового продукта FVIII промежуточный продукт FVIII дополнительно готовят и помещают в промежуточную упаковку для проведения сублимационной сушки или других процессов инактивации вирусов. Как правило, он включает в себя множество конкретных этапов: приготовление криопреципитата плазмы, растворение криопреципитата для получения растворяющего раствора и фильтрация осадка; выполнение кислотного осаждения в растворяющем растворе путем регулирования pH; адсорбция надосадочной жидкости гелем; и проведение инактивации вирусов, хроматографии, ультрафильтрации, стерилизации и т. п. на проточном растворе после гель-адсорбции; и, для окончательного получения готового продукта FVIII, выполнение таких этапов, как дозирование, промежуточная упаковка, сублимационная сушка и инактивация вирусов сухим жаром.[0047] In the prior art, the FVIII production process begins with plasma cryoprecipitate, wherein the FVIII intermediate is produced through multiple steps such as gel adsorption, virus inactivation and chromatography, and to obtain the final FVIII product, the FVIII intermediate is further prepared and placed in intermediate packaging for freeze-drying or other virus inactivation processes. Typically, it involves many specific steps: preparing plasma cryoprecipitate, dissolving the cryoprecipitate to obtain a dissolution solution, and filtering the precipitate; performing acid precipitation in a solvent solution by adjusting the pH; adsorption of supernatant liquid by gel; and carrying out virus inactivation, chromatography, ultrafiltration, sterilization, etc. on a flow solution after gel adsorption; and, to finally obtain the finished FVIII product, performing steps such as dosing, intermediate packaging, freeze drying and dry heat inactivation of viruses.
[0048] Для реализации настоящего изобретения базовый технологический маршрут получения препарата FVIII является следующим: приготовление криопреципитата плазмы; растворение криопреципитата плазмы для получения растворяющего раствора; выполнение предварительного осаждения растворяющего раствора путем регулирования pH и фильтрации осадка для получения надосадочной жидкости; адсорбция надосадочной жидкости выдержанным гелем; и обработка надосадочной жидкости, полученной после гель-адсорбции, на технологических этапах, таких как инактивация вирусов, хроматография, ультрафильтрация и стерилизация, и, для окончательного получения готового продукта FVIII, выполнение таких операций, как дозирование, промежуточная упаковка, сублимационная сушка и инактивация вирусов сухим жаром.[0048] To implement the present invention, the basic technological route for obtaining the FVIII drug is as follows: preparation of plasma cryoprecipitate; dissolving plasma cryoprecipitate to obtain a dissolution solution; performing pre-precipitation of the solvent solution by adjusting the pH and filtering the precipitate to obtain a supernatant; adsorption of supernatant liquid by aged gel; and processing the supernatant obtained from gel adsorption through processing steps such as virus inactivation, chromatography, ultrafiltration and sterilization, and, to ultimately obtain the finished FVIII product, performing operations such as dosing, intermediate packaging, freeze drying and virus inactivation dry heat.
[0049] Для реализации настоящего изобретения возможный базовый технологический маршрут получения препарата FVIII является следующим: приготовление криопреципитата плазмы; растворение криопреципитата плазмы для получения растворяющего раствора; выполнение предварительного осаждения растворяющего раствора путем регулирования pH и фильтрации осадка для получения надосадочной жидкости; адсорбция надосадочной жидкости выдержанным гелем; и обработка надосадочной жидкости, полученной после гель-адсорбции, на технологических этапах, таких как инактивация вирусов, хроматография, ультрафильтрация и стерилизация, и, для окончательного получения готового продукта FVIII, выполнение таких операций, как дозирование, промежуточная упаковка, сублимационная сушка и инактивация вирусов сухим жаром.[0049] To implement the present invention, a possible basic technological route for obtaining the FVIII drug is as follows: preparation of plasma cryoprecipitate; dissolving plasma cryoprecipitate to obtain a dissolution solution; performing pre-precipitation of the solvent solution by adjusting the pH and filtering the precipitate to obtain a supernatant; adsorption of supernatant liquid by aged gel; and processing the supernatant obtained from gel adsorption through processing steps such as virus inactivation, chromatography, ultrafiltration and sterilization, and, to ultimately obtain the finished FVIII product, performing operations such as dosing, intermediate packaging, freeze drying and virus inactivation dry heat.
[0050] Для реализации настоящего изобретения возможный базовый технологический маршрут получения препарата FVIII является следующим: приготовление криопреципитата плазмы; растворение криопреципитата плазмы в трис-буфере; после осаждения полиэтиленгликолем для инактивации вирусов с липидной оболочкой обрабатывают 0,3% трибутилфосфатом и 1% Tween 80 в течение 6 часов; и затем проводят хроматографическую очистку с помощью материала DEAE 650M. Большинство различных белков, трибутилфосфат и Tween 80 могут проходить непосредственно с проточным раствором, а элюент представляет собой промежуточный продукт фактора VIII свертывания крови человека (со ссылкой на опубликованный документ «Feasibility Study on Production Process Amplification of Human Blood Coagulation Factor VIII Stock Solution»).[0050] To implement the present invention, a possible basic technological route for obtaining the FVIII drug is as follows: preparation of plasma cryoprecipitate; dissolving plasma cryoprecipitate in Tris buffer; after precipitation with polyethylene glycol to inactivate lipid enveloped viruses, treat with 0.3% tributyl phosphate and 1% Tween 80 for 6 hours; and then chromatographic purification using DEAE 650M material. Most of the various proteins, tributyl phosphate and Tween 80 can pass directly into the flow solution, and the eluent is an intermediate of human blood coagulation factor VIII (with reference to the published document "Feasibility Study on Production Process Amplification of Human Blood Coagulation Factor VIII Stock Solution").
[0051] Если не указано иное, как показано на ФИГ. 1, так называемый «промежуточный продукт FVIII» в настоящем изобретении относится к концентрированному раствору FVIII перед приготовлением маточного раствора, или перед концентрированием путем ультрафильтрации, или после концентрирования путем ультрафильтрации, или к хроматографическому элюенту FVIII.[0051] Unless otherwise indicated, as shown in FIG. 1, the so-called “FVIII intermediate” in the present invention refers to a concentrated FVIII solution before preparing a mother liquor, or before concentration by ultrafiltration, or after concentration by ultrafiltration, or a chromatographic eluent of FVIII.
[0052] Когда так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению конкретно относится к хроматографическому элюенту FVIII, он необязательно представляет собой хроматографический элюент FVIII, обладающий аффинностью к гепарину, или анионный хроматографический элюент FVIII. Предпочтительно, промежуточный продукт FVIII представляет собой анионный хроматографический элюент FVIII. Изоэлектрическая точка комплекса FVIII-vWF составляет от 5,5 до 6,0, а при pH от 6,5 до 7,5 комплекс имеет отрицательный заряд. В то же время нейтральные условия способствуют защите активности FVIII. Следовательно, более предпочтительной является очистка FVIII с помощью анионной хроматографии. Распространенные возможные среды для анионной хроматографии включают в себя, не ограничиваясь ими, материалы DEAE Sephadex A-50, TOYOPEARL DEAE-650M, DEAE 650, Q-sepharose-FF, DEAE-SAPHROSEFF, DEAE-FractogelTSK650M, DEAE SepharoseTSK650M, DEAESepharoseFF, CaptoDEAE, QsepharoseFF, CaptoQ и QSepharoseHP и т. д. При необходимости вместо матрицы для анионообменной хроматографии можно использовать анионообменную хроматографическую мембрану. Имеющиеся в коммерческом доступе анионообменные мембраны включают в себя, не ограничиваясь ими, SartobindTM Q (Sartorius), MustangTM Q (Pall Technologies) и InterceptTM Q (Millipore).[0052] When the so-called "FVIII intermediate" of the present invention specifically refers to a FVIII chromatography eluent, it is not necessarily a heparin-affinity FVIII chromatography eluent or an anionic FVIII chromatography eluent. Preferably, the FVIII intermediate is an anionic FVIII chromatographic eluent. The isoelectric point of the FVIII-vWF complex is 5.5 to 6.0, and at pH 6.5 to 7.5 the complex has a negative charge. At the same time, neutral conditions help protect FVIII activity. Therefore, purification of FVIII by anion chromatography is more preferred. Common possible anion chromatography media include, but are not limited to, DEAE Sephadex A-50, TOYOPEARL DEAE-650M, DEAE 650, Q-sepharose-FF, DEAE-SAPHROSEFF, DEAE-FractogelTSK650M, DEAE SepharoseTSK650M, DEAESepharoseFF, CaptoDEAE, QsepharoseFF, CaptoQ and QSepharoseHP, etc. If necessary, an anion exchange chromatography membrane can be used instead of an anion exchange chromatography matrix. Commercially available anion exchange membranes include, but are not limited to, SartobindTM Q (Sartorius), MustangTM Q (Pall Technologies), and InterceptTM Q (Millipore).
[0053] Когда так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению конкретно относится к концентрированному раствору FVIII перед приготовлением маточного раствора, он, предпочтительно, представляет собой концентрированный раствор FVIII до стерилизации и фильтрации и перед приготовлением маточного раствора; предпочтительно концентрированный раствор FVIII до наномембранной фильтрации и перед приготовлением маточного раствора.[0053] When the so-called "FVIII intermediate" of the present invention specifically refers to a concentrated FVIII solution before preparing the mother liquor, it is preferably a concentrated FVIII solution before sterilization and filtration and before preparing the mother liquor; preferably a concentrated solution of FVIII before nanomembrane filtration and before preparing the mother liquor.
[0054] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем криопреципитации плазмы и гель-адсорбции с помощью Al(OH)3; удаления нерастворимого вещества путем центрифугирования; и очистки надосадочной жидкости с помощью геля DEAE Sephadex A-50.[0054] In one embodiment, the FVIII intermediate may be a FVIII chromatographic eluent that is prepared by plasma cryoprecipitation and gel adsorption with Al(OH)3; removing insoluble matter by centrifugation; and purification of the supernatant using DEAE Sephadex A-50 gel.
[0055] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем криопреципитации плазмы, кислотного осаждения и гель-адсорбции с помощью материала DEAE Sephadex A-50; удаления нерастворимого вещества путем центрифугирования; и очистки надосадочной жидкости путем гель-адсорбции с помощью геля TOYOPEARL DEAE-650M.[0055] In one embodiment, the FVIII intermediate may be a FVIII chromatographic eluent that is prepared by plasma cryoprecipitation, acid precipitation and gel adsorption using DEAE Sephadex A-50 material; removing insoluble matter by centrifugation; and purification of the supernatant by gel adsorption using TOYOPEARL DEAE-650M gel.
[0056] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем выполнения криопреципитации плазмы и гель-адсорбции с помощью Al(OH)3; удаления нерастворимого вещества путем центрифугирования; и очистки надосадочной жидкости путем инактивации вирусов способом «растворитель-детергент» и гель-адсорбции с помощью материала DEAE Sephadex A-50.[0056] In one embodiment, the FVIII intermediate may be a FVIII chromatographic eluent that is prepared by performing plasma cryoprecipitation and gel adsorption with Al(OH)3; removing insoluble matter by centrifugation; and purification of the supernatant by solvent-detergent virus inactivation and gel adsorption using DEAE Sephadex A-50.
[0057] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем выполнения криопреципитации плазмы; растворения с помощью буфера с нейтральным pH с последующей гель-адсорбцией с помощью Al(OH)3; удаления нерастворимого вещества путем центрифугирования; обработки надосадочной жидкости способом «растворитель-детергент», а затем очистки надосадочной жидкости с помощью анионной гель-адсорбции (Fractogel TMAE 650); нагрева элюента до 63 °C в течение 10 часов под защитой сахара и аминокислот; и удаление стабилизатора с помощью второй анионной колоночной гель-хроматографии.[0057] In one embodiment, the FVIII intermediate may be a chromatographic FVIII eluent that is obtained by performing plasma cryoprecipitation; dissolution with neutral pH buffer followed by gel adsorption with Al(OH)3; removing insoluble matter by centrifugation; treating the supernatant using a solvent-detergent method and then purifying the supernatant using anionic gel adsorption (Fractogel TMAE 650); heating the eluent to 63 °C for 10 hours under the protection of sugar and amino acids; and removing the stabilizer using a second anion column size exclusion chromatography.
[0058] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой раствор образца, который получен путем последовательного выполнения криопреципитации плазмы, гель-адсорбции с помощью Al(OH)3; осаждения глицином, осаждения NaCl и регулирования концентрации буфером перед получением маточного раствора.[0058] In one embodiment, the FVIII intermediate may be a sample solution that is prepared by sequentially performing plasma cryoprecipitation, Al(OH)3 gel adsorption; glycine precipitation, NaCl precipitation and adjusting the concentration with buffer before obtaining a mother liquor.
[0059] В одном варианте осуществления промежуточный продукт FVIII может представлять собой хроматографический элюент FVIII, который получают путем последовательного выполнения криопреципитации плазмы, фракционного осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) и адсорбционной очистки с помощью аффинного гепаринового геля (такого как Heparin Sepharose® 6 FF).[0059] In one embodiment, the FVIII intermediate may be a FVIII chromatographic eluent that is prepared by sequentially performing plasma cryoprecipitation, fractional polyethylene glycol (PEG) precipitation, and adsorption purification using a heparin affinity gel (such as Heparin Sepharose® 6 FF).
[0060] Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой концентрированный раствор FVIII, полученный после того, как концентрация вышеупомянутого хроматографического элюента FVIII скорректирована с помощью диализа и/или буфера. Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой раствор FVIII, концентрированный с помощью ультрафильтрации, полученный путем проведения ультрафильтрации вышеупомянутого концентрированного раствора FVIII. Кроме того, так называемый «промежуточный продукт FVIII» по настоящему изобретению также может представлять собой раствор образца до приготовления маточного раствора, полученный после того, как концентрация вышеупомянутого раствора FVIII, концентрированного путем ультрафильтрации, скорректирована с помощью буфера.[0060] In addition, the so-called “FVIII intermediate” of the present invention can also be a concentrated FVIII solution obtained after the concentration of the above-mentioned FVIII chromatographic eluent is adjusted by dialysis and/or buffer. In addition, the so-called “FVIII intermediate” of the present invention may also be an ultrafiltration concentrated FVIII solution obtained by ultrafiltrating the above-mentioned concentrated FVIII solution. In addition, the so-called “FVIII intermediate” of the present invention can also be a sample solution before preparation of the mother liquor obtained after the concentration of the above-mentioned FVIII solution concentrated by ultrafiltration is adjusted with a buffer.
[0061] «Вариант промежуточного продукта FVIII» по настоящему изобретению может представлять собой концентрированный раствор FVIII, полученный путем инактивации вирусов в хроматографическом элюенте FVIII. Вариант промежуточного продукта FVIII также может представлять собой хроматографический элюент, в который добавлен активный защитный агент FVIII. Активный защитный агент FVIII может быть выбран из сахаридов и аминокислот.[0061] The "FVIII intermediate variant" of the present invention may be a concentrated solution of FVIII obtained by inactivating viruses in an FVIII chromatographic eluent. A variant of the FVIII intermediate may also be a chromatographic eluent to which the active FVIII protecting agent has been added. The active FVIII protecting agent may be selected from saccharides and amino acids.
[0062] «Промежуточный продукт FVIII» в варианте осуществления также может представлять собой другой концентрированный раствор FVIII или хроматографический элюент FVIII, полученный до приготовления маточного раствора или до концентрирования с помощью ультрафильтрации, или после концентрирования с помощью ультрафильтрации в других технологических маршрутах для получения препарата FVIII, которые не описаны исчерпывающим образом в настоящем документе.[0062] The "FVIII intermediate" in an embodiment may also be another concentrated FVIII solution or FVIII chromatographic eluent obtained before preparation of the mother liquor or before concentration by ultrafiltration, or after concentration by ultrafiltration in other process routes to obtain the FVIII preparation that are not fully described in this document.
[0063] Способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII описан ниже в сочетании с конкретными примерами.[0063] A method for cryopreserving an FVIII intermediate is described below in conjunction with specific examples.
[0064] Пример 1[0064] Example 1
[0065] Сначала заявитель исследовал изменение показателя FVIII: скорость восстановления активности C перед тем, как хроматографический элюент FVIII был заморожен в жидком азоте и сохранен при низкой температуре (от -196 °C до -15 °C), и после этого.[0065] First, the applicant examined the change in FVIII index: the rate of recovery of C activity before and after the FVIII chromatographic eluent was frozen in liquid nitrogen and stored at low temperature (-196 °C to -15 °C).
[0066] Приготовление хроматографического элюента FVIII: в качестве сырья применяли криопреципитат плазмы, после растворения его подвергали кислотному осаждению, гель-адсорбции с помощью DEAE Sephadex A-50, инактивации вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовке к колоночной гель-хроматографии с помощью TOYOPEARL DEAE-650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Был определен показатель FVIII: скорость восстановления активности C хроматографического элюента FVIII.[0066] Preparation of FVIII chromatographic eluent: plasma cryoprecipitate was used as a raw material, after dissolution it was subjected to acid precipitation, gel adsorption using DEAE Sephadex A-50, inactivation of viruses by solvent-detergent (S/D) and preparation for column size exclusion chromatography using TOYOPEARL DEAE-650M to obtain the FVIII chromatographic eluent. The FVIII index was determined: the rate of recovery of activity C of the FVIII chromatographic eluent.
[0067] Подготовленный хроматографический элюент FVIII разделяли на множество параллельных образцов, замораживали в жидком азоте и хранили, соответственно, при -196 °C, -80 °C, -60 °C, -40 °C, -20 °C и -15 °С в течение 12 месяцев. Затем образец оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, определяли показатель FVIII: активность С и рассчитывали скорость восстановления активности.[0067] The prepared FVIII chromatographic eluent was divided into multiple parallel samples, frozen in liquid nitrogen and stored at -196 °C, -80 °C, -60 °C, -40 °C, -20 °C and -15, respectively °C for 12 months. Then the sample was thawed at room temperature in a water bath, the FVIII: activity C index was determined, and the rate of activity recovery was calculated.
[0068] Результаты теста FVIII: скорость восстановления активности C приведены в Таблице 1 и показывают, что хроматографический элюент FVIII, замороженный в жидком азоте и сохраненный при низкой температуре (от -196 °C до -15 °C) в течение 12 месяцев, не продемонстрировал какой-либо потери активности.[0068] The results of the FVIII test: C activity recovery rate are shown in Table 1 and show that FVIII chromatographic eluent frozen in liquid nitrogen and stored at low temperature (-196 °C to -15 °C) for 12 months did not demonstrated any loss of activity.
[0069] [0069]
[0070] Заявитель разморозил при комнатной температуре на водяной бане упомянутые выше 6 криоконсервированных образцов элюента для очистки FVIII, а затем подверг их ультрафильтрации. После того, как образцы были выдержаны при комнатной температуре 2 часа, при визуальном осмотре неожиданно было обнаружено, что не были осаждены видимые посторонние вещества (способ проверки на наличие видимых посторонних веществ осуществлен со ссылкой на версию «Китайской фармакопеи» 2015 г. ). Ранее заявитель неоднократно обнаруживал, что если образец хроматографического элюента FVIII без криоконсервации поместить при комнатной температуре на 2 часа после ультрафильтрации, то осаждение постороннего вещества можно было наблюдать невооруженным глазом.[0070] The Applicant thawed the above-mentioned 6 cryopreserved samples of the FVIII purification eluent at room temperature in a water bath and then subjected them to ultrafiltration. After the samples were kept at room temperature for 2 hours, it was unexpectedly found by visual inspection that no visible foreign substances had been deposited (the method of checking for the presence of visible foreign substances was carried out with reference to the 2015 version of the Chinese Pharmacopoeia). Previously, the applicant had repeatedly discovered that if a sample of the FVIII chromatographic eluent without cryopreservation was placed at room temperature for 2 hours after ultrafiltration, precipitation of foreign matter could be observed with the naked eye.
[0071] Кроме того, заявитель продолжил хранение вышеуказанных образцов при комнатной температуре в течение 24 часов и определял показатель FVIII: активность C, чтобы исследовать изменение показателя FVIII: скорость восстановления активности С.[0071] In addition, the applicant continued to store the above samples at room temperature for 24 hours and determined the FVIII:C activity index to examine the change in the FVIII:C activity recovery rate.
[0072] Результаты испытаний, представленные в Таблице 2, показывают, что по сравнению с образцом без замораживания жидким азотом и хранения при низкой температуре, у элюента для очистки FVIII, подвергнутого криоконсервации, значительно уменьшена потеря активности при комнатной температуре в течение 24 часов, то есть, улучшена стабильность.[0072] The test results presented in Table 2 show that, compared to a sample without liquid nitrogen freezing and low temperature storage, the cryopreserved FVIII purification eluent had a significantly reduced loss of activity at room temperature over 24 hours, then yes, stability has been improved.
[0073] [0073]
[0074] Кроме того, заявитель исследовал влияние различных условий замораживания на скорость восстановления активности элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, стабильность в условиях комнатной температуры и влияние на качество готового продукта FVIII.[0074] In addition, the applicant investigated the effect of various freezing conditions on the rate of recovery of FVIII purification eluent/ultrafiltration concentrated FVIII solution, stability under room temperature conditions, and the effect on the quality of the finished FVIII product.
[0075] Пример 2[0075] Example 2
[0076] Приготовление хроматографического элюента FVIII: в качестве исходного материала применяли криопреципитат плазмы, его растворяли и подвергали кислотному осаждению, гель-адсорбции с помощью DEAE Sephadex A-50, инактивации вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовке к колоночной гель-хроматографии с помощью TOYOPEARL DEAE-650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Определяли содержание белка и показатель FVIII: активность C хроматографического элюента FVIII, а удельную активность хроматографического элюента FVIII рассчитывали как (МЕ/мг) = 257 МЕ/мг.[0076] Preparation of FVIII chromatographic eluent: Plasma cryoprecipitate was used as starting material, dissolved and subjected to acid precipitation, gel adsorption using DEAE Sephadex A-50, solvent-detergent (S/D) virus inactivation and preparation for size exclusion column chromatography using TOYOPEARL DEAE-650M to obtain the FVIII chromatographic eluent. The protein content and FVIII index were determined: activity C of the FVIII chromatographic eluent, and the specific activity of the FVIII chromatographic eluent was calculated as (IU/mg) = 257 IU/mg.
[0077] Криоконсервация хроматографического элюента FVIII: его замораживали со скоростью 1 °С/мин и хранили при температуре от -30 °С до -45 °С в течение 12 месяцев.[0077] Cryopreservation of FVIII chromatographic eluent: it was frozen at a rate of 1 °C/min and stored at -30 °C to -45 °C for 12 months.
[0078] Приготовление готового продукта FVIII: криоконсервированный хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, оттаявший хроматографический элюент FVIII подвергали ультрафильтрации, стерилизации и фильтрации. После стерилизации и фильтрации готовый продукт готовили в соответствии со стандартами готовой продукции и добавляли стабилизатор в виде 100 ммоль/л глицина. Далее его помещали в промежуточную упаковку, проводили сублимационную сушку и запечатывали в шкафу. Далее продукт, прошедший сублимационную сушку, инактивировали с помощью сухого жара (100 °C×30 мин или 80 °C×72 ч) и упаковывали для получения готового продукта FVIII.[0078] Preparation of the finished FVIII product: the cryopreserved FVIII chromatography eluent was thawed at room temperature in a water bath, the thawed FVIII chromatography eluent was subjected to ultrafiltration, sterilization and filtration. After sterilization and filtration, the finished product was prepared according to finished product standards and a stabilizer of 100 mmol/L glycine was added. Next, it was placed in an intermediate package, freeze-dried and sealed in a cabinet. The freeze-dried product was then inactivated using dry heat (100°C x 30 min or 80°C x 72 h) and packaged to form the final FVIII product.
[0079] Диализат ультрафильтрации: 50 ммоль/л хлорида натрия, 20 ммоль/л цитрата натрия, 1 ммоль/л хлорида кальция, 7 г/л альбумина и 35 г/л аргинина гидрохлорида; рН 7,0.[0079] Ultrafiltration dialysate: 50 mmol/L sodium chloride, 20 mmol/L sodium citrate, 1 mmol/L calcium chloride, 7 g/L albumin and 35 g/L arginine hydrochloride; pH 7.0.
[0080] Пример 3[0080] Example 3
[0081] Приготовление хроматографического элюента FVIII: криопреципитат плазмы в качестве исходного материала растворяли с помощью раствора трометамина и подвергали осаждению полиэтиленгликолем (ПЭГ), выполняли инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовку к колоночной гель-хроматографии с помощью ToyopearlDEAE 650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Определяли содержание белка и показатель FVIII: активность C хроматографического элюента FVIII, а удельную активность хроматографического элюента FVIII рассчитывали как (МЕ/мг) = 151 МЕ/мг.[0081] Preparation of FVIII chromatographic eluent: plasma cryoprecipitate as starting material was dissolved with tromethamine solution and subjected to polyethylene glycol (PEG) precipitation, solvent-detergent (S/D) inactivation of viruses was performed and preparation for gel column chromatography using ToyopearlDEAE 650M to obtain FVIII chromatographic eluent. The protein content and FVIII index were determined: activity C of the FVIII chromatographic eluent, and the specific activity of the FVIII chromatographic eluent was calculated as (IU/mg) = 151 IU/mg.
[0082] Криоконсервация хроматографического элюента FVIII: его замораживали со скоростью 10 °С/мин и криоконсервировали при температуре от -60 °С до -45 °С в течение 12 месяцев.[0082] Cryopreservation of FVIII chromatographic eluent: it was frozen at a rate of 10 °C/min and cryopreserved at a temperature of -60 °C to -45 °C for 12 months.
[0083] Приготовление готового продукта FVIII: криоконсервированный хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, оттаявший хроматографический элюент FVIII подвергали ультрафильтрации, стерилизации и фильтрации. После стерилизации и фильтрации готовый продукт готовили в соответствии со стандартами готовой продукции и добавляли стабилизатор в виде 10 ммоль/л глицина. Далее его помещали в промежуточную упаковку, проводили сублимационную сушку и запечатывали в шкафу. Далее продукт, прошедший сублимационную сушку, инактивировали с помощью сухого жара (100 °C×30 мин или 80 °C×72 ч) и упаковывали для получения готового продукта FVIII.[0083] Preparation of the finished FVIII product: the cryopreserved FVIII chromatography eluent was thawed at room temperature in a water bath, the thawed FVIII chromatography eluent was subjected to ultrafiltration, sterilization and filtration. After sterilization and filtration, the finished product was prepared according to finished product standards and a stabilizer of 10 mmol/L glycine was added. Next, it was placed in an intermediate package, freeze-dried and sealed in a cabinet. The freeze-dried product was then inactivated using dry heat (100°C x 30 min or 80°C x 72 h) and packaged to form the final FVIII product.
[0084] Диализат ультрафильтрации: 50 ммоль/л хлорида натрия, 6 ммоль/л цитрата натрия, 1 ммоль/л хлорида кальция, 6,7 г/л альбумина и 35 г/л аргинина гидрохлорида; рН 6,5.[0084] Ultrafiltration dialysate: 50 mmol/L sodium chloride, 6 mmol/L sodium citrate, 1 mmol/L calcium chloride, 6.7 g/L albumin and 35 g/L arginine hydrochloride; pH 6.5.
[0085] Пример 4[0085] Example 4
[0086] Приготовление хроматографического элюента FVIII: криопреципитат плазмы в качестве исходного материала растворяли и подвергали осаждению полиэтиленгликолем (ПЭГ), выполняли инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовку к колоночной гель-хроматографии с помощью ToyopearlDEAE 650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Определяли содержание белка и показатель FVIII: активность C хроматографического элюента FVIII, а удельную активность хроматографического элюента FVIII рассчитывали как (МЕ/мг) = 85 МЕ/мг.[0086] Preparation of FVIII chromatographic eluent: plasma cryoprecipitate as starting material was dissolved and subjected to polyethylene glycol (PEG) precipitation, solvent-detergent (S/D) inactivation of viruses was performed and preparation for gel column chromatography using ToyopearlDEAE 650M to obtain chromatographic eluent FVIII. The protein content and FVIII index were determined: activity C of the FVIII chromatographic eluent, and the specific activity of the FVIII chromatographic eluent was calculated as (IU/mg) = 85 IU/mg.
[0087] Криоконсервация хроматографического элюента FVIII: его замораживали со скоростью 1,5 °С/мин и криоконсервировали с помощью сухого льда в течение 12 месяцев.[0087] Cryopreservation of FVIII chromatographic eluent: it was frozen at a rate of 1.5 °C/min and cryopreserved with dry ice for 12 months.
[0088] Приготовление готового продукта FVIII: криоконсервированный хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, оттаявший хроматографический элюент FVIII подвергали ультрафильтрации, стерилизации и фильтрации. После стерилизации и фильтрации готовый продукт готовили в соответствии со стандартами готовой продукции и добавляли стабилизатор в виде 20 ммоль/л глицина. Далее его помещали в промежуточную упаковку, проводили сублимационную сушку и запечатывали в шкафу. Далее продукт, прошедший сублимационную сушку, инактивировали с помощью сухого жара (100 °C×30 мин или 80 °C×72 ч) и упаковывали для получения готового продукта FVIII.[0088] Preparation of the finished FVIII product: the cryopreserved FVIII chromatography eluent was thawed at room temperature in a water bath, the thawed FVIII chromatography eluent was subjected to ultrafiltration, sterilization and filtration. After sterilization and filtration, the finished product was prepared according to finished product standards and a stabilizer of 20 mmol/L glycine was added. Next, it was placed in an intermediate package, freeze-dried and sealed in a cabinet. The freeze-dried product was then inactivated using dry heat (100°C x 30 min or 80°C x 72 h) and packaged to form the final FVIII product.
[0089] Диализат ультрафильтрации: 50 ммоль/л хлорида натрия, 20 ммоль/л цитрата натрия, 1 ммоль/л хлорида кальция, 7 г/л альбумина и 35 г/л аргинина гидрохлорида; рН 7,2.[0089] Ultrafiltration dialysate: 50 mmol/L sodium chloride, 20 mmol/L sodium citrate, 1 mmol/L calcium chloride, 7 g/L albumin and 35 g/L arginine hydrochloride; pH 7.2.
[0090] Пример 5[0090] Example 5
[0091] Приготовление хроматографического элюента FVIII: криопреципитат плазмы в качестве исходного материала растворяли и подвергали гель-адсорбции с помощью DEAE Sephadex A-50, выполняли инактивацию вирусов способом «растворитель-детергент» (S/D) и подготовку к колоночной гель-хроматографии с помощью TOYOPEARL DEAE-650M, чтобы получить хроматографический элюент FVIII. Определяли содержание белка и показатель FVIII: активность C хроматографического элюента FVIII, а удельную активность хроматографического элюента FVIII рассчитывали как (МЕ/мг) = 54 МЕ/мг.[0091] Preparation of FVIII chromatographic eluent: plasma cryoprecipitate as starting material was dissolved and subjected to gel adsorption with DEAE Sephadex A-50, solvent-detergent (S/D) inactivation of viruses was performed and preparation for gel column chromatography with using TOYOPEARL DEAE-650M to obtain FVIII chromatographic eluent. The protein content and FVIII index were determined: activity C of the FVIII chromatographic eluent, and the specific activity of the FVIII chromatographic eluent was calculated as (IU/mg) = 54 IU/mg.
[0092] Криоконсервация хроматографического элюента FVIII: его замораживали со скоростью 3 °С/мин и криоконсервировали при температуре от -20 °С до -30 °С в течение 12 месяцев, а затем хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водной бане.[0092] Cryopreservation of the FVIII chromatography eluent: it was frozen at a rate of 3 °C/min and cryopreserved at a temperature of -20 °C to -30 °C for 12 months, and then the FVIII chromatography eluent was thawed at room temperature in a water bath.
[0093] Приготовление готового продукта FVIII: криоконсервированный хроматографический элюент FVIII оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, оттаявший хроматографический элюент FVIII подвергали ультрафильтрации, стерилизации и фильтрации. После стерилизации и фильтрации готовый продукт готовили в соответствии со стандартами готовой продукции и добавляли стабилизатор в виде 200 ммоль/л глицина. Далее его помещали в промежуточную упаковку, проводили сублимационную сушку и запечатывали в шкафу. Далее продукт, прошедший сублимационную сушку, инактивировали с помощью сухого жара (100 °C×30 мин или 80 °C×72 ч) и упаковывали для получения готового продукта FVIII.[0093] Preparation of the finished FVIII product: the cryopreserved FVIII chromatography eluent was thawed at room temperature in a water bath, the thawed FVIII chromatography eluent was subjected to ultrafiltration, sterilization and filtration. After sterilization and filtration, the finished product was prepared according to finished product standards and a stabilizer of 200 mmol/L glycine was added. Next, it was placed in an intermediate package, freeze-dried and sealed in a cabinet. The freeze-dried product was then inactivated using dry heat (100°C x 30 min or 80°C x 72 h) and packaged to form the final FVIII product.
[0094] Диализат ультрафильтрации: 50 ммоль/л хлорида натрия, 20 ммоль/л цитрата натрия, 1 ммоль/л хлорида кальция, 7 г/л альбумина и 35 г/л аргинина гидрохлорида; рН 7,0.[0094] Ultrafiltration dialysate: 50 mmol/L sodium chloride, 20 mmol/L sodium citrate, 1 mmol/L calcium chloride, 7 g/L albumin and 35 g/L arginine hydrochloride; pH 7.0.
[0095] Пример 6 - Пример 9[0095] Example 6 - Example 9
[0096] Криоконсервированные образцы, задействованные в Примерах с 6 по 9, были взяты, соответственно, из растворов элюентов для очистки FVIII, концентрированных ультрафильтрацией, по Примерам с 1 по 4. Раствор, концентрированный ультрафильтрацией, готовили следующим способом: диализ и концентрирование элюента для очистки FVIII с помощью ультрафильтрационной мембраны с пороговой молекулярной массой от 10 до 30 кДа с получением раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией.[0096] The cryopreserved samples used in Examples 6 to 9 were respectively taken from the ultrafiltration-concentrated FVIII purification eluent solutions of Examples 1 to 4. The ultrafiltration-concentrated solution was prepared as follows: dialysis and concentration of the eluent for purification of FVIII using an ultrafiltration membrane with a threshold molecular weight of 10 to 30 kDa to obtain a FVIII solution concentrated by ultrafiltration.
[0097] Условия криоконсервации были такими же, как в Примерах с 2 по 5, а этапы диализного концентрирования, стерилизации, приготовления полуфабриката, промежуточной упаковки, сублимационной сушки и инактивации сухим жаром после объединения партий были такими же, как и аналогичные операции в Примерах 2-5.[0097] The cryopreservation conditions were the same as in Examples 2 to 5, and the steps of dialysis concentration, sterilization, preparation of the semi-finished product, intermediate packaging, freeze drying and dry heat inactivation after combining batches were the same as the similar operations in Examples 2 -5.
[0098] Показатели FVIII: значение C для концентрированных ультрафильтрацией промежуточных продуктов FVIII составляют:[0098] FVIII values: The C values for ultrafiltration-concentrated FVIII intermediates are:
[0099] При условиях криоконсервации по Примеру 6: криоконсервация раствора FVIII: C = 111 МЕ/мл.[0099] Under cryopreservation conditions according to Example 6: cryopreservation of FVIII solution: C = 111 IU/ml.
[00100] При условиях криоконсервации по Примеру 7: криоконсервация раствора FVIII: C = 98 МЕ/мл.[00100] Under cryopreservation conditions according to Example 7: cryopreservation of FVIII solution: C = 98 IU/ml.
[00101] При условиях криоконсервации по Примеру 8: криоконсервация раствора FVIII: C = 73 МЕ/мл.[00101] Under cryopreservation conditions according to Example 8: cryopreservation of FVIII solution: C = 73 IU/ml.
[00102] При условиях криоконсервации по Примеру 9: криоконсервация раствора FVIII: C = 52 МЕ/мл.[00102] Under cryopreservation conditions according to Example 9: cryopreservation of FVIII solution: C = 52 IU/ml.
[00103] Сравнительный пример 1[00103] Comparative Example 1
[00104] Сравнительный пример 1 отличается от Примера 2 тем, что хроматографический элюент FVIII, полученный с помощью гель-колоночной хроматографии с применением материала TOYOPEARL DEAE-650M, непосредственно подавали на этап получения готового продукта FVIII, без проведения этапа криоконсервации хроматографического элюента FVIII.[00104] Comparative Example 1 differs from Example 2 in that the FVIII chromatography eluent obtained by gel column chromatography using TOYOPEARL DEAE-650M material was directly fed to the FVIII finished product step, without undergoing a cryopreservation step of the FVIII chromatography eluent.
[00105] Другие технологические процессы для получения готового продукта FVIII, такие как процесс очистки FVIII и процесс получения готового продукта, могут относиться к Примеру 2.[00105] Other processes for obtaining the finished FVIII product, such as the FVIII purification process and the process for obtaining the finished product, may refer to Example 2.
[00106] Различные показатели промежуточных продуктов FVIII по Примерам 2-9 до криоконсервации и после нее, а также показатели готового продукта сравнивают, как показано ниже.[00106] Various performances of the FVIII intermediates of Examples 2-9 before and after cryopreservation, as well as the performance of the finished product, are compared as shown below.
[00107] 1. Влияние различных условий замораживания на скорость восстановления активности элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией[00107] 1. Effect of different freezing conditions on the rate of activity recovery of FVIII purification eluent/FVIII solution concentrated by ultrafiltration
[00108] Определяли концентрацию белка и показатель FVIII: активность C элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, по Примерам 2-9 до криоконсервации и после нее, скорость восстановления активности и рассчитывали скорость восстановления удельной активности. Результаты приведены в Таблице 3.[00108] The protein concentration and FVIII index were determined: the activity C of the eluent for purifying FVIII/FVIII solution concentrated by ultrafiltration according to Examples 2-9 before and after cryopreservation, the rate of activity recovery, and the rate of specific activity recovery was calculated. The results are shown in Table 3.
[00109] Результаты показали, что:[00109] The results showed that:
[00110] После того, как промежуточные продукты фактора VIII свертывания крови из Примеров 2-9 были заморожены со скоростью, превышающей или равной 1 °C/мин, и подвергнуты криоконсервации при температуре от -20 °C до -60 °C в течение 12 месяцев, скорость восстановления активности не была снижена, а показатель FVIII: активность C был сохранен на должном уровне.[00110] After the factor VIII intermediates from Examples 2-9 were frozen at a rate greater than or equal to 1 °C/min and cryopreserved at -20 °C to -60 °C for 12 months, the rate of activity recovery was not reduced, and the FVIII:C activity indicator was maintained at the proper level.
[00111] После того, как промежуточные продукты фактора VIII свертывания крови из Примеров 2-9 были заморожены со скоростью, превышающей или равной 1 °C/мин, и подвергнуты криоконсервации при температуре от -20 °C до -60 °C в течение 12 месяцев, скорость восстановления удельной активности не была снижена, а показатель FVIII: удельная активность C был улучшен.[00111] After the factor VIII intermediates from Examples 2-9 were frozen at a rate greater than or equal to 1 °C/min and cryopreserved at -20 °C to -60 °C for 12 months, the recovery rate of specific activity was not reduced, and the FVIII:specific activity C index was improved.
[00112] Результаты вышеуказанных тестов показали, что способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII по настоящему изобретению практически не оказывает влияния на показатели FVIII: скорость восстановления активности С и скорость восстановления удельной активности, обеспечивая сохранение активности FVIII и улучшение удельной активности.[00112] The results of the above tests showed that the method of cryopreservation of the FVIII intermediate of the present invention has virtually no effect on the FVIII indicators: the rate of recovery of activity C and the rate of recovery of specific activity, ensuring the preservation of FVIII activity and improvement of specific activity.
[00113] [00113]
[00114] 2. Влияние различных условий замораживания на стабильность элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, при комнатной температуре[00114] 2. Effect of different freezing conditions on the stability of FVIII purification eluent/ultrafiltration concentrated FVIII solution at room temperature
[00115] Образцы элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, по Примерам 2-9 оттаивали при комнатной температуре на водяной бане, затем указанные образцы подвергали ультрафильтрации и оставляли при комнатной температуре на 24 часа для определения их показателя FVIII: активность C. В то же время элюент для очистки FVIII/раствор FVIII, концентрированный ультрафильтрацией, по Примерам 2-9, которые не проходили криоконсервацию, подвергали ультрафильтрации и оставляли при комнатной температуре на 24 часа для определения их показателя FVIII: активность C. Результаты тестов двух групп сравнивали и заносили в Таблицу 4.[00115] Samples of the FVIII purification eluent/ultrafiltration concentrated FVIII solution of Examples 2-9 were thawed at room temperature in a water bath, then the samples were ultrafiltrated and left at room temperature for 24 hours to determine their FVIII:C activity. At the same time, the FVIII purification eluent/ultrafiltration concentrated FVIII solution of Examples 2-9, which were not cryopreserved, were ultrafiltrated and left at room temperature for 24 hours to determine their FVIII: activity C. The test results of the two groups were compared and entered into Table 4.
[00116] Результаты тестов показали, что: после того, как элюент для очистки FVIII/раствор FVIII, концентрированный ультрафильтрацией, были подвергнуты криоконсервации по способу из Примеров 2-9, была существенно снижена потеря активности в условиях выдержки при комнатной температуре в течение 24 часов, а также была улучшена стабильность при хранении в условиях комнатной температуры.[00116] The test results showed that: after the FVIII purification eluent/UF concentrated FVIII solution was cryopreserved using the method of Examples 2-9, the loss of activity when held at room temperature for 24 hours was significantly reduced , and storage stability at room temperature has also been improved.
[00117][00117]
[00118] 3. Влияние различных условий замораживания на качество готового продукта FVIII, окончательно полученного из элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией[00118] 3. Effect of different freezing conditions on the quality of the finished FVIII product finally obtained from the FVIII purification eluent/FVIII solution concentrated by ultrafiltration
[00119] Согласно положениям «Китайской фармакопеи» (редакция 2015 г. ) были определены все показатели готовых продуктов FVIII, полученных в Примерах 2-9, и, в частности, было выполнено выявление видимых посторонних материалов. Результаты приведены в Таблице 5.[00119] According to the provisions of the Chinese Pharmacopoeia (2015 edition), all indicators of the finished FVIII products obtained in Examples 2-9 were determined, and, in particular, the detection of visible foreign materials was performed. The results are shown in Table 5.
[00120] Результаты тестов показали, что:[00120] Test results showed that:
[00121] готовый продукт FVIII, полученный в Примерах 2-9, в частности, результаты выявления видимых посторонних материалов, соответствуют требованиям «Китайской фармакопеи» (редакция 2015 г. ) для препарата FVIII. Результаты определения качества готовых продуктов FVIII, полученных в Примерах 2-9, не отличаются от готового продукта, полученного в Сравнительном примере 1.[00121] The finished FVIII product obtained in Examples 2-9, in particular, the results of detection of visible foreign materials, meet the requirements of the "Chinese Pharmacopoeia" (2015 edition) for the FVIII drug. The results of determining the quality of the finished FVIII products obtained in Examples 2-9 do not differ from the finished product obtained in Comparative Example 1.
[00122] Приведенные выше результаты определения дополнительно подтверждают, что: элюент для очистки FVIII/раствор FVIII, концентрированный ультрафильтрацией, обработанный способом криоконсервации по настоящему изобретению, может быть применен в качестве маточного раствора для последующего процесса производства FVIII и как исходный материал для получения готового продукта.[00122] The above determination results further confirm that: FVIII purification eluent/FVIII solution concentrated by ultrafiltration processed by the cryopreservation method of the present invention can be used as a mother liquor for the subsequent FVIII production process and as a starting material for obtaining the finished product .
[00123][00123]
[00124] 4. Исследование долговременной стабильности готового продукта FVIII, полученного в Примерах 2-9[00124] 4. Long-term stability study of the finished FVIII product obtained in Examples 2-9
[00125] Готовые продукты FVIII, полученные в Примерах 2-9, хранили в холодильнике в течение 48 месяцев при температуре от 2 °C до 8 °C, при этом полностью контролировали все показатели готовых продуктов FVIII в соответствии с регламентом «Китайской фармакопеи» (редакция 2015 г. ). Результаты теста приведены в Таблице 6.[00125] The finished FVIII products obtained in Examples 2-9 were stored in a refrigerator for 48 months at a temperature of 2 °C to 8 °C, while all the indicators of the finished FVIII products were fully controlled in accordance with the regulations of the Chinese Pharmacopoeia ( edition 2015). The test results are shown in Table 6.
[00126] Результаты тестов показали, что: готовый продукт FVIII, полученный с применением криоконсервированного элюента для очистки FVIII/раствора FVIII, концентрированного ультрафильтрацией, обладал стабильными свойствами в течение 48 месяцев в условиях хранения в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C. Оценка готовых продуктов FVIII, полученных в Примерах 2-9, с точки зрения видимых посторонних материалов, оказалась более высокой, чем в Сравнительном примере 1.[00126] Test results showed that: the finished FVIII product obtained using cryopreserved FVIII purification eluent/FVIII concentrated ultrafiltration solution was stable for 48 months when stored in a refrigerator at 2°C to 8°C . The finished FVIII products produced in Examples 2-9 scored higher in terms of visible foreign materials than Comparative Example 1.
[00127] Результаты определения качества готовых продуктов FVIII, полученных в Примерах 2-9, не имеют отличий по сравнению с готовым продуктом, полученным в Сравнительном примере 1.[00127] The results of determining the quality of the finished FVIII products obtained in Examples 2-9 are no different compared to the finished product obtained in Comparative Example 1.
[00128][00128]
[00129] Результаты вышеуказанных тестов показали, что:[00129] The results of the above tests showed that:
[00130] Промежуточные продукты FVIII, криоконсервированные способом по настоящему изобретению, имеют активность FVIII, сохраненную на прежнем уровне, и улучшенную удельную активность. В то же время, способ криоконсервации промежуточного продукта FVIII по настоящему изобретению может улучшить, в определенной степени, стабильность промежуточного продукта FVIII при комнатной температуре.[00130] FVIII intermediates cryopreserved by the method of the present invention have maintained FVIII activity and improved specific activity. At the same time, the cryopreservation method of the FVIII intermediate of the present invention can improve, to a certain extent, the stability of the FVIII intermediate at room temperature.
[00131] Промежуточный продукт препарата фактора VIII свертывания крови, криоконсервированный с помощью способа криоконсервации по настоящему изобретению, может быть применен для получения готового продукта FVIII надлежащего качества. Данные исследования стабильности подтверждают, что готовый продукт FVIII, полученный из криоконсервированного промежуточного продукта FVIII, может иметь стабильные характеристики в течение 48 месяцев после хранения в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C.[00131] The coagulation factor VIII drug intermediate cryopreserved by the cryopreservation method of the present invention can be used to obtain a finished FVIII product of adequate quality. Stability study data confirms that a finished FVIII product prepared from a cryopreserved FVIII intermediate can be stable for 48 months after refrigerated storage at 2°C to 8°C.
[00132] Приведенное выше описание представляет собой только предпочтительные примеры реализации настоящего изобретения. Основываясь на концепции настоящего изобретения, специалисты в данной области техники могут вносить различные изменения в конкретные варианты осуществления и область их применения. Данное описание не следует рассматривать как налагающее ограничения на настоящее изобретение.[00132] The above description represents only preferred examples of implementation of the present invention. Based on the concept of the present invention, those skilled in the art can make various changes to the specific embodiments and their scope. This description should not be construed as limiting the present invention.
Claims (14)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2814332C1 true RU2814332C1 (en) | 2024-02-28 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105294858A (en) * | 2015-12-05 | 2016-02-03 | 上海洲跃生物科技有限公司 | Method for preparing freeze-dried human blood coagulation factor VIII |
| CN105348382A (en) * | 2015-12-05 | 2016-02-24 | 上海洲跃生物科技有限公司 | Method for preparing high-purity human coagulation factor VIII |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105294858A (en) * | 2015-12-05 | 2016-02-03 | 上海洲跃生物科技有限公司 | Method for preparing freeze-dried human blood coagulation factor VIII |
| CN105348382A (en) * | 2015-12-05 | 2016-02-24 | 上海洲跃生物科技有限公司 | Method for preparing high-purity human coagulation factor VIII |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| TSVETKOVA N.M. et al. Cryopreservation of recombinant antihemophilic Factor VIII. Effect of biopolymers/Cryobiology, 55(3), 2007, стр. 376. * |
| ВЕТОШКИН К.А. Результаты криоконсервирования донорских тромбоцитных концентратов при низких и ультранизких температурах/Трансфузиология, том 16, N2//Компоненты крови, 2015, см. стр. 23, абзац 3 и абзац 4, см. стр. 24, абзац под таблицей 1, см. таблицу 1. ЗУБАИРОВ Р.Р. Криоконсервация и криохранение гемопоэтических стволовых клеток/ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии, том 3, N2, 2011, стр. 39-40. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5854403A (en) | Method for isolation of highly pure von Willebrand Factor | |
| JP2887329B2 (en) | Topical fibrinogen complex | |
| JP6411360B2 (en) | Method for purification of therapeutic proteins | |
| US3682881A (en) | Fractionation of plasma using glycine and polyethylene glycol | |
| US5099003A (en) | Method of preparing a sterile plasma-protein solution containing fibrinogen and factor xiii | |
| RU2266914C2 (en) | Method for preparing igg | |
| JPS597693B2 (en) | Antithrombin preparation and its manufacturing method | |
| DK141274B (en) | Method for isolating the blood coagulation factors. | |
| NL8601355A (en) | NEW COMPOSITION. | |
| NO324659B1 (en) | Recovery of the von Willebrand factor by cation exchange chromatography and preparations containing such factor and its use. | |
| CN114642729B (en) | Coagulation factor X activator composition | |
| JPS63192724A (en) | Liquid pharmaceutical of gamma-globulin | |
| JP5261478B2 (en) | Method for preparing factor X, activated factor X, inactive factor X and inactivated factor Xa, and pharmaceutical composition containing said factor | |
| JPH0424360B2 (en) | ||
| RU2142806C1 (en) | Method of purification and storage of, aqueous solution of purified factor ix, composition containing factor ix, and method of treatment | |
| CN109071596B (en) | Method for purifying fibrinogen | |
| RU2814332C1 (en) | Method for cryopreservation of intermediate product of blood coagulation factor viii | |
| CN110087689B (en) | Liquid human fibrinogen compositions | |
| CN114787185B (en) | Freezing method of blood coagulation factor VIII intermediate | |
| US10806755B2 (en) | Plasma-supplemented formulation | |
| Dike et al. | A factor VII concentrate for therapeutic use | |
| CN116322920A (en) | Purification of FVIII from plasma using silica adsorption | |
| CN114106145B (en) | Process for producing blood-source human blood coagulation factor VIII/von Willebrand factor complex | |
| ES2268718T3 (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF A COMPOSITION CONTAINING FACTOR VIII. | |
| CN113577295B (en) | Human fibrinogen dry heat treatment stabilizer and application thereof |