RU2813653C1 - Способ ранней диагностики рецидивов рака прямой кишки при мониторинге течения заболевания - Google Patents
Способ ранней диагностики рецидивов рака прямой кишки при мониторинге течения заболевания Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813653C1 RU2813653C1 RU2023102661A RU2023102661A RU2813653C1 RU 2813653 C1 RU2813653 C1 RU 2813653C1 RU 2023102661 A RU2023102661 A RU 2023102661A RU 2023102661 A RU2023102661 A RU 2023102661A RU 2813653 C1 RU2813653 C1 RU 2813653C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- methylation
- level
- genes
- dna
- cancer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims description 9
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 title claims description 9
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 title claims description 9
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 49
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 21
- 101000599038 Homo sapiens DNA-binding protein Ikaros Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101000632056 Homo sapiens Septin-9 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102100028024 Septin-9 Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims abstract description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 abstract description 13
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 11
- 102100037799 DNA-binding protein Ikaros Human genes 0.000 abstract description 7
- 206010038111 Recurrent cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 6
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 4
- 208000035346 Margins of Excision Diseases 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- ZSTCHQOKNUXHLZ-PIRIXANTSA-L [(1r,2r)-2-azanidylcyclohexyl]azanide;oxalate;pentyl n-[1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-methyloxolan-2-yl]-5-fluoro-2-oxopyrimidin-4-yl]carbamate;platinum(4+) Chemical compound [Pt+4].[O-]C(=O)C([O-])=O.[NH-][C@@H]1CCCC[C@H]1[NH-].C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 ZSTCHQOKNUXHLZ-PIRIXANTSA-L 0.000 description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100026437 Branched-chain-amino-acid aminotransferase, cytosolic Human genes 0.000 description 2
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 2
- -1 EMBP1 Proteins 0.000 description 2
- 101000766268 Homo sapiens Branched-chain-amino-acid aminotransferase, cytosolic Proteins 0.000 description 2
- 101150016712 IKZF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000011470 radical surgery Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102100021627 BEN domain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100032145 Carbohydrate sulfotransferase 10 Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 102100025176 Cyclin-A1 Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000971217 Homo sapiens BEN domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000775595 Homo sapiens Carbohydrate sulfotransferase 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000934314 Homo sapiens Cyclin-A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001026914 Homo sapiens Protein KRBA1 Proteins 0.000 description 1
- 101001122742 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 16B Proteins 0.000 description 1
- 101000665140 Homo sapiens Scm-like with four MBT domains protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000693265 Homo sapiens Sphingosine 1-phosphate receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000692109 Homo sapiens Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000645402 Homo sapiens Transmembrane protein 163 Proteins 0.000 description 1
- 101000798552 Homo sapiens Transmembrane protein 240 Proteins 0.000 description 1
- 101000802337 Homo sapiens Zinc finger protein 543 Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102100037318 Protein KRBA1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028740 Protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 16B Human genes 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 101150042012 SEPTIN9 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038691 Scm-like with four MBT domains protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108050002584 Septin 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100025750 Sphingosine 1-phosphate receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150074794 TMEM240 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102100025764 Transmembrane protein 163 Human genes 0.000 description 1
- 102100032492 Transmembrane protein 240 Human genes 0.000 description 1
- 102100034658 Zinc finger protein 543 Human genes 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 108091092240 circulating cell-free DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002052 colonoscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011249 preoperative chemoradiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000007467 rectal resection Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000011521 systemic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для ранней диагностики рецидивов рака прямой кишки (РПК) при мониторинге течения заболевания. Определяют уровень метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и повторяющихся последовательностей LINE-1 во внеклеточных ДНК крови в ходе динамического наблюдения через 3, 6 и 9 месяцев, 1 и 2 года после проведенного лечения. При увеличении уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и снижении уровня метилирования последовательностей LINE-1 в 2 раза и более в сравнении с уровнем метилирования на 10-15 сутки после операции определяют рецидив РПК. Способ обеспечивает повышение точности и информативности ранней диагностики рецидивов РПК за счет проведения регулярного сравнительного анализа уровня метилирования однокопийных генов SEPTIN9, IKZF1 и повторяющихся последовательностей LINE-1 во внеклеточных ДНК крови на этапах динамического наблюдения. 1 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов ранней диагностики рецидивов рака прямой кишки.
В настоящее время рак прямой кишки (РПК) в России занимает лидирующие позиции в структуре онкологической заболеваемости и смертности (1).
Основным методом лечения местнораспространенного РПК является комбинированный, который включает пролонгированный курс предоперационной химиолучевой терапии и радикальную операцию, что позволяет снизить частоту местных рецидивов и повысить выживаемость больных (2, 3). Однако, несмотря на высокие онкологические результаты, применение данного лечебного подхода у больных с поражением верхнеампулярного отдела прямой кишки ограничено в связи с риском развития лучевых реакций и осложнений.
С указанных позиций в последние годы при раке верхнеампулярного отдела прямой кишки разрабатывается новая тактика лечения, основанная на проведении на предоперационном этапе только системной химиотерапии (без облучения), которая демонстрирует обнадеживающие результаты (4-6).
Вместе с тем, несмотря на определенные достижения в лечении РПК, проблема прогрессировала заболевания остается открытой. В связи с этим при выборе тактики лечения большое значение уделяется прогнозу и ранней диагностике рецидива заболевания.
Патогенез РПК в целом характеризуются последовательным накоплением молекулярно-генетических изменений и существенным изменением транскриптома, протеома клеток. Изменение статуса метилирования ДНК предшествует генетическим мутациям и, как правило, определяет развитие молекулярных событий при канцерогенезе (7, 8). Признаком злокачественной трансформации, связанным с нарушением правильного профиля метилирования, является как глобальное общее снижение уровня метилирования (гипометилирование повторяющихся последовательностей LINE-1, Alu и др.), так и локальное увеличение уровня метилирования отдельных районов (гиперметилирование генов опухолевой супрессии, гипометилирование онкогенов) (9). При изменениях уровня метилирования может наблюдаться активация (гипометилирование онкогенов) или подавление экспрессии генов (гиперметилирование генов опухолевой супрессии) (10).
Одним из последних достижений молекулярной онкологии является внедрение в практику онкодиагностики нового малоинвазивного метода «жидкой биопсии», который включает исследование образцов крови с целью выявления внеклеточных опухолевых ДНК, отражающих молекулярные изменения, характерные для опухоли (11, 12). В этом плане чрезвычайно актуальным представляется изучение молекулярно-генетических изменений в составе внеклеточных ДНК, которые специфичны для колоректального рака, и последующая разработка стратегии ранней диагностики рецидивов заболевания. Известно, что при онкопатологиях в составе как внеклеточной циркулирующей ДНК (цирДНК) плазмы крови, так и цирДНК, связанной с поверхностью клеток крови (скп-цирДНК), накапливаются фрагменты опухоле-специфичных метилированных ДНК, которые являются потенциальными онкомаркерами (13). Показано, что определение во внеклеточных ДНК крови уровня метилирования как однокопийных генов, так и повторяющихся последовательностей позволяет повысить чувствительность диагностического теста (13, 14).
Исследовательские группы под руководством Symonds E.L. et al (2018), Chang S.C. et al. (2020), Jin S. et al. (2021) проводили определение метилированных маркеров (панель, включающая гены ВСАТ1 и IKZF1; ген ТМЕМ240; панель, включающая гены SEPTIN9 и SDC2) в плазме крови больных колоректальным раком с целью мониторинга течения заболевания (15, 16, 17). Однако, они оценивали только уровень метилирования однокопийных генов и не определяли уровень метилирования повторяющихся последовательностей, что могло бы повысить чувствительность такой диагностической тест-системы. В настоящих работах использовались только две контрольные точки (до лечения и на 12 сутки после операции или до лечения и через 12 месяцев после операции), что не позволяет осуществлять регулярную и своевременную диагностику на протяжении первых 24-х месяцев наблюдения, которые являются самыми критичными с позиций риска развития прогрессирования заболевания.
Наиболее близким к предлагаемому (прототипом) является способ диагностики колоректального рака, основанный на определении метилированных маркеров во внеклеточных ДНК крови (генов ITGA4, ЕМВР1, ТМЕМ163, SFMBT2, ELMO, ZNF543, CHST10, CCNA1, BEND4, KRBA1, S1PR1, PPP1R16B) (18). Однако, для мониторинга РПК указанный способ имеет ряд недостатков:
1) не определена информативность данных метилированных маркеров конкретно для больных РПК;
2) данный способ может быть применим только для диагностики РПК, но не для мониторинга течения заболевания;
3) анализ профиля метилирования ДНК с использованием метода бисульфитного секвенирования позволяет проводить определение уровня метилирования одновременно нескольких генов (12 мишеней), но требует большого количества исходного генетического материала (от 500 нг до 1 мкг ДНК);
4) высокая стоимость проведения подобного исследования (от 500 тыс.руб.);
5) большая трудоемкость данного способа определения уровня метилирования генов.
Новый технический результат - повышение точности и информативности ранней диагностики рецидивов РПК за счет проведения регулярного сравнительного анализа уровня метилирования однокопийных генов (SEPTIN9, IKZF1) и повторяющихся последовательностей (LINE-1) во внеклеточных ДНК крови на этапах динамического наблюдения.
Для решения поставленной задачи в способе ранней диагностики рецидивов рака прямой кишки, путем исследования венозной крови пациентов, в которой определяют уровень метилированных маркеров во внеклеточных ДНК крови, определяют уровень метилированных генов SEPTIN9, IKZF1 и повторяющихся последовательностей LINE-1 и при увеличении уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и снижении уровня метилирования последовательностей LINE-1 у больных в ходе динамического наблюдения через 3, 6 и 9 месяцев, 1 и 2 года после проведенного лечения в 2 раза и более в сравнении с уровнем метилирования на 10-15 сутки после операции определяют рецидив РПК.
Изобретение соответствует критерию «новизна», так как для мониторинга РПК ранее не использовался комплексный анализ уровня метилирования однокопийных генов SEPTIN9, IKZF1 и повторяющихся последовательностей LINE-1 в составе внеклеточных ДНК плазмы крови и внеклеточных ДНК, связанных с поверхностью клеток крови. Кроме того, не проводилось определение данных метилированных маркеров на ближайших и отдаленных этапах мониторинга у больных РПК.
Благодаря наличию указанных признаков в данном способе, а также использованию их в совокупности и определенной последовательности действий можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа «изобретательскому уровню».
Изобретение соответствует критерию «промышленно применимо», так как оно может использоваться в клинической практике для ранней диагностики рецидивов РПК.
Способ осуществляют следующим образом.
1. Получение плазмы крови и выделение внеклеточных ДНК. Образцы венозной крови стабилизируют и фракционируют на плазму и клетки крови в течение 4 часов с момента ее забора. Образцы центрифугируют 20 мин при 400×g, затем переносят плазму в отдельные пробирки и центрифугируют повторно 20 мин при 1200×g. Полученный супернатант аликвотируют и хранят при температуре -80°С. Непосредственно перед проведением молекулярно-генетического анализа замороженные образцы плазмы крови размораживают и центрифугируют 5 мин при 3000×g для удаления криопреципитата. Полученный супернатант используют для выделения внеклеточных ДНК (внДНК). ВнДНК выделяют с использованием наборов фирмы QIAamp MinElute ccfDNA Kit (Qiagen, США). Далее проводят бисульфитную конверсию ДНК с помощью наборов «EZ DNA Methylation-Direct Kit» (Zymo Research, США).
2. Реакция количественной метил-специфичной ПЦР. Концентрацию метилированных фрагментов генов SEPTIN9, IKZF1 определяют с использованием TaqMan ПЦР. Каждую реакцию проводят в конечном объеме 25 мкл, содержащем 2,5 мкл ДНК, 60 нМ специфического праймера для каждого гена, 30 нМ флуоресцентной пробы для каждого гена, 1 U ДНК-полимеразы, 10Х ПЦР-буфер и 25 нМ dNTP, 50 нМ MgCl. Программа ПЦР включает следующие этапы: нагрев реакционной смеси при температуре 95°С в течение 3, затем амплификация в течение 40 циклов в следующем режиме: при температуре 95°С в течение 10 сек, отжиг и элонгация, регистрация флуоресцентного сигнала (при температуре 56°С - для гена SEPTIN 9; при температуре 60,4°С - для гена IKZF1) в течение 10 сек. Амплификацию осуществляют в приборе CFX96 (Bio-Rad, США). В качестве контроля используют препарат полностью метилированной ДНК (ZymoResearch, США). Делают 5 точек разведения - 70% - 35% - 18% - 9% - 4%. Относительно данной калибровочной кривой оценивают уровень метилирования генов в исследуемых образцах.
Концентрацию метилированных фрагментов LINE-1 определяют с использованием TaqMan ПЦР. Программа ПЦР включает следующие этапы: нагрев реакционной смеси при температуре 95°С в течение 3, затем амплификация в течение 40 циклов в следующем режиме: при температуре 95°С в течение 10 сек, отжиг и элонгация, регистрация флуоресцентного сигнала при температуре 52°С в течение 60 сек. Реакцию ПЦР ставят в конечном объеме 25 мкл, содержащем компоненты: 2,5 мкл ДНК, 50 мМ MgCl2, 10Х ПЦР-буфер, 25 мМ dNTP, 60 нМ специфического праймера, 30 нМ олигонуклеотидной пробы, 1 U Taq ДНК полимеразы.
Кроме того, оценивают концентрацию фрагментов LINE-1, не содержащих метилированные CpG-сайты с помощью ПЦР с использованием флуоресцентного красителя EvaGreen (Biotium, США). Программа ПЦР включает следующие этапы: нагрев реакционной смеси при температуре 95°С в течение 3, затем амплификация в течение 40 циклов в следующем режиме: при температуре 95°С в течение 10 сек, при температуре 60°С в течение 20 сек, отжиг и элонгация, регистрация флуоресцентного сигнала при температуре 72°С в течение 20 сек, при температуре 76,5°С в течение 15 сек. Реакцию ПЦР ставят в конечном объеме 25 мкл, содержащем компоненты: 2,5 мкл ДНК, 50 мМ MgCl2, 10Х ПЦР-буфер, 25 мМ dNTP, 60 нМ специфического праймера, 10Х красителя Eva Green, 1 U Taq ДНК полимеразы. Амплификацию осуществляют в приборе CFX96 (Bio-Rad, США). Количество метилированных фрагментов LINE-1 и фрагментов LINE-1, не содержащих CpG-сайты, оценивают в геном-эквивалентах на 1 мл крови. Далее вычисляют индекс метилирования (ИМ) по формуле ИМ %=100 × (число метилированных фрагментов/(число метилированных + число неметилированных фрагментов).
Последовательности праймеров и флуоресцентных проб представлены в Таблице:
В ходе динамического наблюдения больных через 3, 6 и 9 месяцев, 1 и 2 года после проведенного лечения при увеличении уровня метилирования генов (SEPTIN9, IKZF1) и снижении уровня метилирования последовательностей LINE-1 в 2 раза и более в сравнении с уровнем метилирования на 10-15 сутки после операции определяют рецидив РПК.
Обоснование способа: разработка методов, пригодных для выявления РПК на доклинической / ранней стадиях по анализу маркеров в крови и других биологических жидкостях, представляет собой важнейшее направление в современной онкологии. С указанных позиций наиболее перспективными кандидатами для мониторинга РПК являются молекулярно-генетические маркеры на основе циркулирующих в крови внеклеточных нуклеиновых кислот, представленных ДНК, РНК и микроРНК.
В последние годы в мировой науке стремительно увеличивается количество исследований по циркулирующим метилированным маркерам, которые проводятся с целью ранней диагностики колоректального рака, прогноза и оценки эффективности лечения (15-17, 19, 20, 21, 22, 23). Необходимо отметить, что менее всего освещены вопросы мониторинга колоректального рака, в частности РПК. Так, в доступной литературе отсутствует четкое мнение о том, какие аберрантно-метилированные гены необходимо исследовать и в какие использовать временные интервалы. Это может быть обусловлено рядом причин как технического, так и общего характера, а именно: различная чувствительность методик по определению метилированных маркеров, качество проведения бисульфитной конверсии ДНК, условия пробоподготовки и выделения внеклеточных ДНК, не корректное формирование групп больных (ввиду недоучета патогенетически значимых признаков) и др.
Отбор генов интереса для использования их в качестве маркеров в предлагаемом способе осуществлялся по следующим критериям:
1) доказано присутствие аберрантно-метилированных форм данных генов во внеклеточных ДНК плазмы крови;
2) уровень метилирования данных генов значимо отличается (увеличение уровня метилирования генов опухолевой супресии или снижение уровня метилирования онкогенов) у больных колоректальным раком по сравнению со здоровыми донорами (15, 17, 19, 21, 22).
Так, были выбраны следующие гены:
1) ген SEPTIN9 - ген, участвующий в регуляции клеточного цикла. При онкопатологии ген гиперметилирован (согласно базе данных GeneCards - http://www.genecards.org).
2) ген IKZF1 - ген, кодирующий транскрипционный фактор связывания ДНК. При онкопатологии ген гиперметилирован (согласно базе данных GeneCards -http://www.genecards.org).
3) LINE-1 - длинные диспергированные повторяющиеся последовательности ДНК в геноме эукариот. В норме гиперметилированы, при развитии онкопатологии -гипометилированы (http://www.pubmed.ncbi.nlm.nih.gov).
Анализ изменения уровня метилирования вышеуказанных генов в крови больных РПК на этапах динамического наблюдения - через 3, 6 и 9 месяцев, 1 и 2 года после проведенного лечения в 2 раза и более в сравнении с уровнем метилирования на 10-15 сутки после операции позволяет точно и своевременно диагностировать рецидив заболевания на доклинической / ранней стадиях, когда опухоль еще не определяется при проведении стандартного инструментального обследования и не имеет клинических проявлений. При выявлении маркерного рецидива РПК больным показано углубленное клинико-инструментальное обследование, на основании которого вырабатывается стратегия дальнейшего противоопухолевого лечения.
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Больной 1.
Больной Т., 57 лет, диагноз: Рак верхнеампулярного отдела прямой кишки, стадия pT4aN1M0. Гистологическое заключение №6148-67/20 - умереннодифференцированная аденокарцинома с инвазией всех слоев стенки кишки, с врастанием в окружающую клетчатку, с метастазами в 2 из 6 лимфоузлов, с врастанием в стенку сосуда, периневральный рост. Лечебный патоморфоз по Mandard 3 степени (TRG 3). Границы резекции, включая циркулярный край резекции, без опухолевых клеток.
В рамках комбинированного лечения проведено 3 курса предоперационной химиотерапии по схеме XELOX с эффектом частичная регрессия. Операция (28.02.2020 г.) - лапароскопическая низкая передняя резекция прямой кишки.
Через 9 месяцев после завершения лечения при молекулярно-генетическом исследовании выявлено увеличение уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и снижение уровня метилирования последовательностей LINE-1 в 2 раза в сравнении с уровнем на 10-15 сутки после операции. В последующем, через 3 месяца, в ходе динамического наблюдения пациента (февраль 2021 г.) на основании инструментальных методов обследовании было подтверждено прогрессирование опухолевого процесса в виде метастатического поражения печени.
Пример 2.
Больной Ю., 59 лет, диагноз: Рак верхнеампулярного отдела прямой кишки, стадия pT3N0M0. Гистологическое заключение №2585-6000/20 - умереннодифференцированная аденокарцинома с инвазией в серозный слой стенки кишки, без метастазов в 4 лимфоузлах. Лечебный патоморфоз по Mandard 4 степени (TRG 4). Границы резекции без опухолевых клеток.
Проведено комбинированное лечение: 3 курса предоперационной химиотерапии по схеме XELOX с эффектом частичная регрессия и хирургическое лечение (31.01.2020 г.) - лапароскопическая передняя резекция прямой кишки.
При молекулярно-генетическом исследовании не выявлено значимых изменений уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и уровня метилирования последовательностей LINE-1 в сравнении с уровнем на 10-15 сутки после операции. В ходе динамического наблюдения пациента в течение 24 месяцев после завершения лечения при инструментальном обследовании признаков прогрессирования заболевания нет.
Предлагаемый способ основан на анализе данных клинико-инструментальных обследований, амбулаторных и медицинских карт больных, проведении молекулярно-генетических исследований (анализ профиля метилирования).
Для реализации молекулярно-генетического этапа изучали биологический материал от 4 больных с диагнозом РПК. Возраст больных составил 58,6 (43-72) лет. Распространенность опухолевого процесса - mrT4aN0M0, mrT3-4aN1M0. Гистологический тип опухоли - аденокарцинома различной степени дифференцировки. Дистальный полюс опухоли находился на расстоянии >10 см от анокутанной линии.
До начала лечения всем больным выполнялось комплексное обследование, включающее магнитно-резонансную томографию (МРТ) органов малого таза, видеоколоноскопию с биопсией опухоли для гистологического исследования, компьютерную томографию органов грудной клетки и брюшной полости.
У всех больных проводилось комбинированное лечение, включающее 3 курса предоперационной химиотерапии по схеме XELOX и радикальную операцию в объеме лапароскопической передней резекции прямой кишки.
Для анализа уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и последовательностей LINE-1 во внеклеточных ДНК крови проводился забор венозной крови до лечения (при первичном обращении), после 3-х курсов предоперационной химиотерапии, на 10-15 сутки после хирургического лечения и далее через 3, 6 и 9 месяцев, 1 и 2 года после операции. У 2-х пациентов без прогрессирования заболевания не было выявлено значимого изменения уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и уровня метилирования последовательностей LINE-1 в сравнении с уровнем на 10-15 сутки после операции. У 2-х больных с признаками прогрессирования выявлено увеличение уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и снижение уровня метилирования последовательностей LINE-1 в 2 раза и более в сравнении с уровнем на 10-15 сутки после операции.
На фиг. 1 представлены результаты, отражающие характер изменения уровня метилирования исследуемых генов во внеклеточных ДНК крови у больных без прогрессирования заболевания и у больных с признаками прогрессирования РПК, а именно характер изменения уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и последовательностей LINE-1 во внеклеточных ДНК крови у больных с признаками прогрессирования заболевания (А) и без прогрессирования (Б). 1 - до лечения, 2 - после предоперационной химиотерапии, 3 - на 10-15 сутки после операции, 4 - в ходе динамического наблюдения пациента, через 9 месяцев, 5 - в ходе динамического наблюдения пациента, через 1 год.
Таким образом, использование данного способа позволяет достичь нового технического результата, а именно повысить точность и информативность ранней диагностики рецидивов РПК за счет проведения регулярного сравнительного анализа уровня метилирования однокопийных генов SEPTIN9, IKZF1 и повторяющихся последовательностей LINE-1 во внеклеточных ДНК крови на этапах динамического наблюдения.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:
1. Состояние онкологической помощи населению России в 2021 году / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2022. - 239 с.
2. McCarthy K., Pearson K., Fulton R., Hewitt J. Pre-operative chemoradiation for non-metastatic locally advanced rectal cancer // Cochrane Database Syst. Rev., 2012;12:CD008368. DOI: 10.1002/14651858.CD008368.pub2.
3. Ferrari L., Fichera A. Neoadjuvant chemoradiation therapy and pathological complete response in rectal cancer // Gastroenterol Rep. 2015;3(4):277-88. DOI: 10.1093/gastro/gov039
4. Koizumi M., Yamada Т., Shinji S. et al. Feasibility of Neoadjuvant FOLFOX Therapy Without Radiotherapy for Baseline Resectable Rectal Cancer // In Vivo. 2018 Jul-Aug; 32(4):937-943. doi: 10.21873/invivo.11332
5. Schrag D., Weiser M.R., Goodman K.A. et al. Neoadjuvant chemotherapy without routine use of radiation therapy for patients with locally advanced rectal cancer: a pilot trial // J Clin Oncol. 2014 Feb 20;32(6):513-8. doi: 10.1200/JCO.2013.51.7904
6. Cercek A., Weiser M.R., Goodman K.A. et al. Complete pathologic response in the primary of rectal or colon cancer treated with FOLFOX without radiation // Journal of Clinical Oncology. 2010;28:15 suppl, 3649-3649.
7. Edwards J. R., Yarychkivska O., Boulard M. et al. DNA methylation and DNA methyltransferases // Epigenetics & chromatin. - 2017. - T. 10. - №. 1. - C. 1-10.
8. Dai X. et al. Methylation multiplicity and its clinical values in cancer // Expert reviews in molecular medicine. - 2021. - T. 23.
9. Ehrlich M. DNA hypermethylation in disease: mechanisms and clinical relevance // Epigenetics. - 2019. - T. 14. - №. 12. - С. 1141-1163.
10. Silva C. P., Kamens H. M. Cigarette smoke-induced alterations in blood: A review of research on DNA methylation and gene expression // Experimental and clinical psychopharmacology. - 2021. - T. 29. - №. 1. - С. 116.
11. Thierry A.R., El Messaoudi S., Gahan P.B., Anker P., Stroun M. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. // Cancer Metastasis Rev. - 2016. - T. 3. - №3. - C. 347-376.
12. Pantel K., Alix-Panabieres C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer // Nat Rev Gastroenterol Hepatol. - 2017. - T. 14. - №2. -C. 73-74.
13. Rykova E.Y., Ponomaryova A.A., Zaporozhchenko I.A., et al. Circulating DNA-based lung cancer diagnostics and follow-up: looking for epigenetic markers // Transl Cancer Res. - 2018. - T. 7 (Приложение 2). - С. 153-170.
14. Ponomaryova A.A., Rykova E.Y., Azhikina T.L. et al. Long interspersed nuclear element-1 methylation status in the circulating DNA from blood of patients with mal ignant and chronic inflammatory lung diseases // Eur J Cancer Prev. - 2021. - T. 30, №. 2. - C. 127-131.
15. Symonds EX., Pedersen S.K., Murray D.H. et al. Circulating tumour DNA for monitoring colorectal cancer-a prospective cohort study to assess relationship to tissue methylation, cancer characteristics and surgical resection // Clin Epigenetics. - 2018. - T. 10. - C. 63.
16. Chang S.C., Liew P.L., Ansar M. et al. Hypermethylation and decreased expression of TMEM240 are potential early-onset biomarkers for colorectal cancer detection, poor prognosis, and early recurrence prediction // Clin Epigenetics. - 2020. - T. 12, №1. - C. 67.
17. Jin S., Zhu D., Shao F. et al. Efficient detection and post-surgical monitoring of colon cancer with a multi-marker DNA methylation liquid biopsy // Proc Natl Acad Sci USA. - 2021. -T. 118, №5. - C. e2017421118.
18. Патент USA, WO/2021/202351, «Methods and systems for detecting colorectal cancer via nucleic acid methylation analysis», опубликован 07.10.2021. Applicants: FREENOME HOLDINGS, INC. [US]/[US]. Inventors: St. John J., Kothen-Hill S.,Yang R., Drake A.
19. Pedersen SK, Symonds EL, Baker RT. et al. Evaluation of an assay for methylated BCAT1 and IKZF1 in plasma for detection of colorectal neoplasia // BMC Cancer. - 2015. - T. 15. - C. 654.
20. Matthaios D., Balgkouranidou I., Karayiannakis A. et al. Methylation status of the APC and RASSF1A promoter in cell-free circulating DNA and its prognostic role in patients with colorectal cancer // Oncol Lett. - 2016. - T. 12, №1. - C. 748-756.
21. Nagai Y.. Sunami E., Yamamoto Y. et al. LINE-1 hypomelhylation status of circulating cell-free DNA in plasma as a biomarker for colorectal cancer // Oncotarget. - 2017. - T. 8 C. 11906-11916.
22. Zhao, Guodong et al. "Multiplex methylated DNA testing in plasma with high sensitivity and specificity for colorectal cancer screening // Cancer Medicine. - 2019. - T. 8. - C. 5619-5628.
23. Wang Y.H., Chang S.C., Ansar M. et al. Epsl5 Homology Domain-Containing Protein 3 Hypermethylation as a Prognostic and Predictive Marker for Colorectal Cancer // Biomedicines. - 2021. - T. 9, №5. - C. 453.
Claims (1)
- Способ ранней диагностики рецидивов рака прямой кишки (РПК) при мониторинге течения заболевания, включающий определение метилированных маркеров во внеклеточных ДНК крови, отличающийся тем, что определяют уровень метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и повторяющихся последовательностей LINE-1 во внеклеточных ДНК крови в ходе динамического наблюдения через 3, 6 и 9 месяцев, 1 и 2 года после проведенного лечения и при увеличении уровня метилирования генов SEPTIN9, IKZF1 и снижении уровня метилирования последовательностей LINE-1 в 2 раза и более в сравнении с уровнем метилирования на 10-15 сутки после операции определяют рецидив рака прямой кишки.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2813653C1 true RU2813653C1 (ru) | 2024-02-14 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2611340C2 (ru) * | 2015-08-03 | 2017-02-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Способ мониторинга эффективности противоопухолевой терапии немелкоклеточного рака легкого |
| RU2771421C1 (ru) * | 2021-07-28 | 2022-05-04 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2611340C2 (ru) * | 2015-08-03 | 2017-02-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Способ мониторинга эффективности противоопухолевой терапии немелкоклеточного рака легкого |
| RU2771421C1 (ru) * | 2021-07-28 | 2022-05-04 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования клинического течения нейроэндокринных новообразований толстой кишки |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КУТИЛИН Д.С. Регуляция экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов у больных колоректальным раком. Молекулярная биология. 2020; 54(4): 580-595. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101437718B1 (ko) | 위암의 예후 예측용 마커 및 이를 이용하는 위암의 예후 예측 방법 | |
| Luo et al. | Differences in DNA methylation signatures reveal multiple pathways of progression from adenoma to colorectal cancer | |
| KR102354660B1 (ko) | 정량 pcr, 프라이머 및 키트에 의한 인간 대변 시료로부터의 대장암의 진단 방법 | |
| ES2605237T3 (es) | Novedosos marcadores para la detección del cáncer de vejiga | |
| ES2712798T3 (es) | Detección de neoplasias | |
| ES2691404T3 (es) | Diagnóstico no invasivo del cáncer | |
| ES2714582T3 (es) | Procedimiento de predicción de la respuesta a la quimioterapia en un paciente que padece o está en riesgo de desarrollar un cáncer de mama recurrente | |
| ES2973607T3 (es) | Métodos de análisis de la metilación del ADN y mutacional para la vigilancia del cáncer de vejiga | |
| ES2927505T3 (es) | Marcadores de metilación para cáncer pancreático | |
| AU2020265027A1 (en) | Microrna marker combination for diagnosing gastric cancer and diagnostic kit | |
| Vallböhmer et al. | Survivin, a potential biomarker in the development of Barrett's adenocarcinoma | |
| WO2022161076A1 (zh) | 用于肺结节良恶性检测的甲基化标记物或其组合及应用 | |
| US20220307091A1 (en) | Unbiased dna methylation markers define an extensive field defect in histologically normal prostate tissues associated with prostate cancer: new biomarkers for men with prostate cancer | |
| US20120135877A1 (en) | DNA Methylation Markers For Prostate Cancer Field Defect | |
| ES2828923T3 (es) | Prueba de metilación de ADN para detectar cáncer de próstata | |
| WO2021019944A1 (ja) | 食道癌バイオマーカー及びその用途 | |
| CN110283910B (zh) | 目标基因dna甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用 | |
| JP2024514960A (ja) | 結腸直腸癌検査用組成物、試薬キット及び応用 | |
| RU2813653C1 (ru) | Способ ранней диагностики рецидивов рака прямой кишки при мониторинге течения заболевания | |
| JP5602355B2 (ja) | 癌患者の外科的手術後の治療選択方法及び予後診断 | |
| US8568984B2 (en) | Methods of diagnosing non-urinary tract diseases by detecting aberrant methylation | |
| ES2820732T3 (es) | Marcadores de metilación de ADN no sesgados que definen un defecto de campo amplio en tejidos de próstata histológicamente normales asociados al cáncer de próstata: nuevos biomarcadores para hombres con cáncer de próstata | |
| JP7345860B2 (ja) | 胃癌バイオマーカー及びその用途 | |
| EA010571B1 (ru) | Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления | |
| CN116635537A (zh) | 评估晚期结直肠腺瘤和结直肠癌进展和风险的分层方法 |