RU2812893C2 - Regulatory elements of plants and their use - Google Patents
Regulatory elements of plants and their use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812893C2 RU2812893C2 RU2020143971A RU2020143971A RU2812893C2 RU 2812893 C2 RU2812893 C2 RU 2812893C2 RU 2020143971 A RU2020143971 A RU 2020143971A RU 2020143971 A RU2020143971 A RU 2020143971A RU 2812893 C2 RU2812893 C2 RU 2812893C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- dna molecule
- sequence
- expression
- nno
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 116
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 202
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 191
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 156
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 63
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 94
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 17
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 claims description 11
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 6
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 6
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 38
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 159
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 117
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 91
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 72
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 58
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 45
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 37
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 36
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 34
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 33
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 33
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 32
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 30
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 28
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 28
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 26
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 26
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 23
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 16
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 13
- 101100123125 Arabidopsis thaliana GSTZ1 gene Proteins 0.000 description 13
- 101100338005 Caenorhabditis elegans gst-9 gene Proteins 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 4-methylumbelliferone beta-D-glucuronide Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 10
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 6
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 108700043045 nanoluc Proteins 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 101710196804 Non-specific lipid-transfer protein 4 Proteins 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 4
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010049994 Chloroplast Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 3
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 3
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 235000007230 Sorghum bicolor Nutrition 0.000 description 3
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 3
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 3
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 101100139878 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ran1 gene Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000027288 circadian rhythm Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007380 fibre production Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101150021974 Adh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 108010007108 Chloroplast Thioredoxins Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241001443980 Oplophoridae Species 0.000 description 1
- 241001443978 Oplophorus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000012152 algorithmic method Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- -1 tubA1 Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Description
ССЫЛКА НА СВЯЗАННУЮ ЗАЯВКУLINK TO RELATED APPLICATION
[01] В данной заявке заявляется приоритет предварительной заявки США №62/714228, поданной 3 августа 2018 г., которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.[01] This application claims priority to US Provisional Application No. 62/714228, filed August 3, 2018, which is incorporated herein by reference in its entirety.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙINCLUDE SEQUENCE LIST
[02] Перечень последовательностей, содержащийся в файле, названном «38-21-62691-0001_Seqlist_ST25.txt», составляет 31060 байт (согласно измерениям Microsoft Windows®), был создан 2 июля 2019 г., подан в электронном виде и включен в данный документ посредством ссылки.[02] The sequence listing contained in the file named "38-21-62691-0001_Seqlist_ST25.txt" is 31,060 bytes (as measured by Microsoft Windows®), was created on July 2, 2019, was filed electronically, and is included herein. document by reference.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯTECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
[03] Изобретение относится к области молекулярной биологии растений и генной инженерии растений. Более конкретно, изобретение относится к молекулам ДНК, используемым для модуляции экспрессии генов в растениях.[03] The invention relates to the field of molecular biology of plants and genetic engineering of plants. More specifically, the invention relates to DNA molecules used to modulate gene expression in plants.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ [04] Регуляторные элементы - это генетические элементы, которые регулируют активность генов, модулируя транскрипцию функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК. Такие элементы могут включать промоторы, лидерные последовательности, интроны и 3' нетранслируемые участки и применимы в области молекулярной биологии растений и генной инженерии растений.BACKGROUND [04] Regulatory elements are genetic elements that regulate gene activity by modulating the transcription of an operably linked transcribed DNA molecule. Such elements may include promoters, leader sequences, introns and 3' untranslated regions and are useful in the field of plant molecular biology and plant genetic engineering.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
[05] Изобретение относится к новым синтетическим регуляторным элементам генов для применения у растений. Изобретение также относится к конструкциям молекул рекомбинантной ДНК, содержащих регуляторные элементы. Данное изобретение также относится к трансгенным клеткам растений, растениям и семенам, содержащим регуляторные элементы. В одном варианте осуществления данного изобретения, регуляторные элементы функционально связаны с молекулой транскрибируемой ДНК. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, молекула транскрибируемой ДНК может быть гетерологичной по отношению к регуляторной последовательности. Таким образом, последовательность регуляторного элемента, относящаяся к изобретению, в конкретных вариантах осуществления данного изобретения может быть определена как функционально связанная с гетерологичной молекулой транскрибируемой ДНК. Данное изобретение также относится к способам применения регуляторных элементов и получения и применения молекул рекомбинантной ДНК, содержащих регуляторные элементы, и трансгенных клеток растений, растений и семян, содержащих регуляторные элементы, функционально связанные с молекулой транскрибируемой ДНК.[05] The invention relates to new synthetic gene regulatory elements for use in plants. The invention also relates to designs of recombinant DNA molecules containing regulatory elements. This invention also relates to transgenic plant cells, plants and seeds containing regulatory elements. In one embodiment of the present invention, the regulatory elements are operably linked to the transcribed DNA molecule. In some embodiments of the present invention, the transcribed DNA molecule may be heterologous with respect to the regulatory sequence. Thus, a regulatory element sequence relevant to the invention, in particular embodiments of the present invention, can be defined as operably linked to a heterologous transcribed DNA molecule. This invention also relates to methods of using regulatory elements and obtaining and using recombinant DNA molecules containing regulatory elements and transgenic plant cells, plants and seeds containing regulatory elements operably linked to a transcribed DNA molecule.
[06] Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к молекуле рекомбинантной ДНК, содержащей последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из: (а) последовательности, по меньшей мере на около 85 процентов идентичной любой последовательности из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26; и (с) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26, при этом этот фрагмент обладает ген-регуляторной активностью; при этом последовательность функционально связана с гетерологичной молекулой транскрибируемой ДНК. Под «гетерологичной молекулой транскрибируемой ДНК» подразумевается, что молекула транскрибируемой ДНК является гетерологичной по отношению к полинуклеотидной последовательности, с которой она функционально связана. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения, молекула рекомбинантной ДНК содержит последовательность ДНК, имеющую по меньшей мере около 85 процентов, по меньшей мере около 86 процентов, по меньшей мере около 87 процентов, по меньшей мере около 88 процентов, по меньшей мере около 89 процентов, по меньшей мере около 90 процентов, по меньшей мере 91 процент, по меньшей мере 92 процента, по меньшей мере 93 процента, по меньшей мере 94 процента, по меньшей мере 95 процентов, по меньшей мере 96 процентов, по меньшей мере 97 процентов, по меньшей мере 98 процентов или по меньшей мере 99 процентов идентичности последовательности с последовательностью ДНК любой из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения, последовательность ДНК содержит регуляторный элемент. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, регуляторный элемент содержит промотор. В других вариантах осуществления данного изобретения, регуляторный элемент содержит интрон. В других вариантах осуществления данного изобретения, регуляторный элемент содержит 3' UTR. В других вариантах осуществления данного изобретения, гетерологичная молекула транскрибируемой ДНК содержит ген, представляющий агрономический интерес, такой как ген, способный обеспечивать устойчивость растений к гербицидам, или ген, способный обеспечивать устойчивость растений к вредителям. В других вариантах осуществления данного изобретения, гетерологичная молекула транскрибируемой ДНК содержит последовательность, кодирующую малую РНК, такую как дцРНК, микроРНК или миРНК. В еще других вариантах осуществления данного изобретения, изобретение относится к конструкции, содержащей молекулу рекомбинантной ДНК, как предусмотрено в данном документе.[06] Thus, in one aspect, the invention provides a recombinant DNA molecule comprising a DNA sequence selected from the group consisting of: (a) a sequence that is at least about 85 percent identical to any sequence of SEQ ID NOs: 1-19 and SEQ ID NO: 26; (b) a sequence containing any of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26; and (c) a fragment of any of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26, wherein the fragment has gene regulatory activity; wherein the sequence is functionally linked to a heterologous transcribed DNA molecule. By "heterologous transcribed DNA molecule" is meant that the transcribed DNA molecule is heterologous with respect to the polynucleotide sequence to which it is operably linked. In specific embodiments of the present invention, the recombinant DNA molecule contains a DNA sequence having at least about 85 percent, at least about 86 percent, at least about 87 percent, at least about 88 percent, at least about 89 percent, at least about 90 percent, at least 91 percent, at least 92 percent, at least 93 percent, at least 94 percent, at least 95 percent, at least 96 percent, at least 97 percent, according to at least 98 percent or at least 99 percent sequence identity with the DNA sequence of any of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26. In certain embodiments of the present invention, the DNA sequence contains a regulatory element. In some embodiments of the present invention, the regulatory element comprises a promoter. In other embodiments of the present invention, the regulatory element contains an intron. In other embodiments of the present invention, the regulatory element comprises a 3' UTR. In other embodiments of the present invention, the heterologous transcribed DNA molecule contains a gene of agronomic interest, such as a gene capable of conferring plant resistance to herbicides or a gene capable of conferring plant pest resistance. In other embodiments of the present invention, the heterologous transcribed DNA molecule contains a sequence encoding a small RNA, such as dsRNA, microRNA, or miRNA. In still other embodiments of the present invention, the invention relates to a construct comprising a recombinant DNA molecule as provided herein.
[07] В другом аспекте в данном документе представлены трансгенные клетки растений, содержащие молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из:(а) последовательности, по меньшей мере на около 85 процентов идентичной любой последовательности из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26; и (с) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26, при этом этот фрагмент обладает ген-регуляторной активностью; при этом последовательность ДНК функционально связана с гетерологичной молекулой транскрибируемой ДНК. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, трансгенная клетка растения представляет собой клетку однодольного растения. В других вариантах осуществления данного изобретения, трансгенная клетка растения представляет собой клетку двудольного растения.[07] In another aspect, provided herein are transgenic plant cells comprising a recombinant DNA molecule comprising a DNA sequence selected from the group consisting of: (a) a sequence at least about 85 percent identical to any sequence of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26; (b) a sequence containing any of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26; and (c) a fragment of any of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26, wherein the fragment has gene regulatory activity; wherein the DNA sequence is functionally linked to a heterologous transcribed DNA molecule. In some embodiments of the present invention, the transgenic plant cell is a monocot plant cell. In other embodiments of the present invention, the transgenic plant cell is a dicot plant cell.
[08] В еще одном аспекте в данном документе дополнительно представлено трансгенное растение или его часть, содержащее молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из: а) последовательности, по меньшей мере на около 85 процентов идентичной любой последовательности из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26; b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26; и с) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26, при этом этот фрагмент обладает ген-регуляторной активностью; при этом последовательность функционально связана с гетерологичной молекулой транскрибируемой ДНК. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения, трансгенное растение представляет собой растение-потомка любого поколения, которое содержит молекулу рекомбинантной ДНК. В данном документе также представлено трансгенное семя, содержащее молекулу рекомбинантной ДНК, которое дает такое трансгенное растение при выращивании.[08] In another aspect, further provided herein is a transgenic plant or portion thereof comprising a recombinant DNA molecule comprising a DNA sequence selected from the group consisting of: a) a sequence that is at least about 85 percent identical to any sequence of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26; b) a sequence containing any of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26; and c) a fragment of any of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26, wherein the fragment has gene regulatory activity; wherein the sequence is functionally linked to a heterologous transcribed DNA molecule. In specific embodiments of the present invention, a transgenic plant is a descendant plant of any generation that contains a recombinant DNA molecule. Also provided herein is a transgenic seed containing a recombinant DNA molecule that produces such a transgenic plant when grown.
[09] В другом аспекте изобретение относится к способу получения товарного продукта, включающему получение трансгенного растения или его части, содержащего молекулу рекомбинантной ДНК по изобретению, и получение из него товарного продукта. В одном варианте осуществления данного изобретения, товарный продукт представляет собой семена, обработанные семена, концентрат белка, изолят белка, крахмал, зерна, части растений, масло семян, биомассу, муку и муку грубого помола.[09] In another aspect, the invention relates to a method for producing a commercial product, comprising obtaining a transgenic plant or part thereof containing a recombinant DNA molecule according to the invention, and obtaining a commercial product from it. In one embodiment of the present invention, the commercial product is seeds, processed seeds, protein concentrate, protein isolate, starch, grains, plant parts, seed oil, biomass, flour and wholemeal.
[10] В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения трансгенного растения, содержащего молекулу рекомбинантной ДНК по изобретению, включающему трансформацию клетки растения с помощью молекулы рекомбинантной ДНК по изобретению для получения трансформированной клетки растения и регенерацию трансгенного растения из трансформированной клетки растения.[10] In another aspect, the invention relates to a method for producing a transgenic plant containing a recombinant DNA molecule of the invention, comprising transforming a plant cell with the recombinant DNA molecule of the invention to obtain a transformed plant cell and regenerating a transgenic plant from the transformed plant cell.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙBRIEF DESCRIPTION OF SEQUENCES
[11] SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность ДНК группы синтетических регуляторных элементов экспрессии (EXP), EXP-Zm.GSP850, содержащую синтетический промотор (P-Zm.GSP850.nno:4), функционально связанный с 5'-концом синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP850.nno:3). [12] SEQ ID NO: 2 представляет собой последовательность ДНК синтетического промотора P-Zm.GSP850.nno:4.[11] SEQ ID NO: 1 is the DNA sequence of the synthetic expression regulatory element (EXP) group, EXP-Zm.GSP850, containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP850.nno:4) operably linked to the 5' end of the synthetic leader sequence (L-Zm.GSP850.nno:3). [12] SEQ ID NO: 2 is the DNA sequence of the synthetic promoter P-Zm.GSP850.nno:4.
[13] SEQ ID NO: 3 представляет собой последовательность ДНК синтетической лидерной последовательности L-Zm.GSP850.nno:3.[13] SEQ ID NO: 3 is the DNA sequence of the synthetic leader sequence L-Zm.GSP850.nno:3.
[14] SEQ ID NO: 4 представляет собой последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2, содержащего синтетический промотор (Р-Zm.GSP850.nno:4), функционально связанный с 5'-концом синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP850.nno:3), функционально связанной с 5'-концом синтетического интрона (I-Zm.GSI153.nno:1).[14] SEQ ID NO: 4 is the DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2, containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP850.nno:4) operably linked to 5 '-end of the synthetic leader sequence (L-Zm.GSP850.nno:3), operably linked to the 5'-end of the synthetic intron (I-Zm.GSI153.nno:1).
[15] SEQ ID NO: 5 представляет собой последовательность ДНК синтетического интрона, I-Zm.GSI153.nno:1.[15] SEQ ID NO: 5 is the DNA sequence of the synthetic intron, I-Zm.GSI153.nno:1.
[16] SEQ ID NO: 6 представляет собой последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP990, содержащую синтетический промотор (P-Zm.GSP990.nno:2), функционально связанный с 5'-концомсинтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP990.nno:1).[16] SEQ ID NO: 6 is the DNA sequence of the synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990, containing the synthetic promoter (P-Zm.GSP990.nno:2) operably linked to the 5' end of the synthetic leader sequence (L-Zm. GSP990.nno:1).
[17] SEQ ID NO: 7 представляет собой последовательность ДНК синтетического промотора P-Zm.GSP990.nno:2.[17] SEQ ID NO: 7 is the DNA sequence of the synthetic promoter P-Zm.GSP990.nno:2.
[18] SEQ ID NO: 8 представляет собой последовательность ДНК синтетической лидерной последовательности L-Zm.GSP990.nno:1.[18] SEQ ID NO: 8 is the DNA sequence of the synthetic leader sequence L-Zm.GSP990.nno:1.
[19] SEQ ID NO: 9 представляет собой последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2, содержащего синтетический промотор (Р-Zm.GSP990.nno:2), функционально связанный с 5'-концом синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP990.nno:1), функционально связанным с 5'-концом синтетического интрона (I-Zm.GSI197.nno:1).[19] SEQ ID NO: 9 is the DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2, containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP990.nno:2) operably linked to 5 '-end of the synthetic leader sequence (L-Zm.GSP990.nno:1), operably linked to the 5'-end of the synthetic intron (I-Zm.GSI197.nno:1).
[20] SEQ ID NO: 10 представляет собой последовательность ДНК синтетического интрона, I-Zm.GSI197.nno:1.[20] SEQ ID NO: 10 is the DNA sequence of the synthetic intron, I-Zm.GSI197.nno:1.
[21] SEQ ID NO: 11 представляет собой последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1, содержащего синтетический промотор (Р-Zm.GSP850.nno:4), функционально связанный с 5'-концом синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP850.nno:3), функционально связанной с 5'-концом синтетического интрона (I-Zm.GSI140.nno:1).[21] SEQ ID NO: 11 is the DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1, containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP850.nno:4) operably linked to 5 '-end of the synthetic leader sequence (L-Zm.GSP850.nno:3), operably linked to the 5'-end of the synthetic intron (I-Zm.GSI140.nno:1).
[22] SEQ ID NO: 12 представляет собой последовательность ДНК синтетического интрона, I-Zm.GSI140.nno:1.[22] SEQ ID NO: 12 is the DNA sequence of the synthetic intron, I-Zm.GSI140.nno:1.
[23] SEQ ID NO: 13 представляет собой последовательность ДНК синтетической 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2.[23] SEQ ID NO: 13 is the DNA sequence of the synthetic 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2.
[24] SEQ ID NO: 14 представляет собой последовательность ДНК синтетической 3' UTR, T-Zm.GST18.nno:2.[24] SEQ ID NO: 14 is the DNA sequence of the synthetic 3' UTR, T-Zm.GST18.nno:2.
[25] SEQ ID NO: 15 представляет собой последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1, содержащего синтетический промотор (Р-Zm.GSP850.nno:4), функционально связанный с 5'-концом синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP850.nno:3), функционально связанной с 5'-концом интрона (I-Zm.DnaK.:1).[25] SEQ ID NO: 15 is the DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1, containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP850.nno:4) operably linked to the 5'- the end of the synthetic leader sequence (L-Zm.GSP850.nno:3), operably linked to the 5' end of the intron (I-Zm.DnaK.:1).
[26] SEQ ID NO: 16 представляет собой последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:l, содержащего синтетический промотор (Р-Zm.GSP990.nno:2), функционально связанный с 5'-концом синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP990.nno:1), функционально связанной с 5'-концом интрона (I-Zm.DnaK:1).[26] SEQ ID NO: 16 is the DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:l, containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP990.nno:2) operably linked to the 5'- the end of the synthetic leader sequence (L-Zm.GSP990.nno:1), operably linked to the 5' end of the intron (I-Zm.DnaK:1).
[27] SEQ ID NO: 17 представляет собой последовательность ДНК синтетического энхансера E-Zm.GSP850, который получен из синтетического промотора Р-Zm.GSP850.nno:4.[27] SEQ ID NO: 17 is the DNA sequence of the synthetic enhancer E-Zm.GSP850, which is derived from the synthetic promoter P-Zm.GSP850.nno:4.
[28] SEQ ID NO: 18 представляет собой последовательность ДНК синтетического энхансера E-Zm.GSP990, который получен из синтетического промотора Р-Zm.GSP990.nno:2.[28] SEQ ID NO: 18 is the DNA sequence of the synthetic enhancer E-Zm.GSP990, which is derived from the synthetic promoter P-Zm.GSP990.nno:2.
[29] SEQ ID NO: 19 представляет собой последовательность ДНК 3' UTR, Т-Sb.Nltp4-1:1:2, полученную из гена NLTP4 (неспецифический белок-переносчик липидов 4) из Sorghum bicolor.[29] SEQ ID NO: 19 is the DNA sequence of the 3' UTR, T-Sb.Nltp4-1:1:2, derived from the NLTP4 (non-specific lipid transfer protein 4) gene from Sorghum bicolor.
[30] SEQ ID NO: 20 представляет собой синтетическую кодирующую последовательность, оптимизированную для экспрессии β-глюкуронидазы (GUS) в растении с процессируемым интроном, полученным из светоиндуцируемого тканеспецифичного гена ST-LS1 картофеля (Номер доступа в Genbank: Х04753).[30] SEQ ID NO: 20 is a synthetic coding sequence optimized for expression of β-glucuronidase (GUS) in plant with a processable intron derived from the light-inducible tissue-specific gene ST-LS1 of potato (Genbank Accession Number: X04753).
[31] SEQ ID NO: 21 представляет собой последовательность ДНК EXP, ЕХР-CaMV.35S, содержащую промотор 35S и лидерную последовательность, полученные из вируса мозаики цветной капусты.[31] SEQ ID NO: 21 is the DNA sequence of EXP, EXP-CaMV.35S, containing the 35S promoter and leader sequence derived from cauliflower mosaic virus.
[32] SEQ ID NO: 22 представляет собой последовательность ДНК интрона, I-Zm.DnaK:1, полученную из гена белка теплового шока 70 (Hsp70) (DnaK) из Zea mays.[32] SEQ ID NO: 22 is the intronic DNA sequence, I-Zm.DnaK:1, derived from the heat shock protein 70 (Hsp70) gene (DnaK) from Zea mays.
[33] SEQ ID NO: 23 представляет собой последовательность ДНК 3' UTR, T-Os.LTP:l полученную из гена белок-подобного переносчика липидов (LTP) из Oryza sativa.[33] SEQ ID NO: 23 is the DNA sequence of the 3' UTR, T-Os.LTP:l derived from the lipid transporter protein (LTP) gene from Oryza sativa.
[34] SEQ ID NO: 24 представляет собой кодирующую последовательность для β-глюкуронидазы (GUS) с процессируемым интроном, полученным из светоиндуцируемого тканеспецифичного гена ST-LS1 картофеля (Номер доступа в Genbank: Х04753).[34] SEQ ID NO: 24 is the coding sequence for β-glucuronidase (GUS) with a processable intron derived from the light-inducible tissue-specific gene ST-LS1 of potato (Genbank Accession Number: X04753).
[35] SEQ ID NO: 25 представляет собой кодирующую последовательность флуоресцентного белка люциферазы NanoLuc® (Promega, Мэдисон, WI 53711), Nluc который был сконструирован путем направленной эволюции из люциферазы глубоководных креветок (Oplophorus gacilirostris).[35] SEQ ID NO: 25 is the coding sequence of the NanoLuc® luciferase fluorescent protein (Promega, Madison, WI 53711), Nluc which was constructed by directed evolution from deep sea shrimp (Oplophorus gacilirostris) luciferase.
[36] SEQ ID NO: 26 представляет собой последовательность ДНК синтетического 3' UTR, T-Zm.GST43.nno:1.[36] SEQ ID NO: 26 is the DNA sequence of the synthetic 3' UTR, T-Zm.GST43.nno:1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[37] Изобретение относится к синтетическим регуляторным элементам, обладающим ген-регулирующей активностью у растений. Нуклеотидные последовательности этих синтетических регуляторных элементов представлены как SEQ ID NO: 1-18 и SEQ ID NO: 26. Эти синтетические регуляторные элементы способны влиять на экспрессию функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК в тканях растений и, следовательно, регулировать экспрессию гена функционально связанного трансгена в трансгенных растениях. Изобретение также относится к новым эндогенным регуляторным элементам, обладающим ген-регуляторной активностью у растений и представленным как SEQ ID NO: 19. Изобретение также относится к способам модификации, продуцирования и применения молекул рекомбинантной ДНК, которые содержат предложенные синтетические и эндогенные регуляторные элементы. Изобретение также относится к композициям, которые содержат трансгенные клетки растений, растения, части растений и семена, содержащие молекулы рекомбинантной ДНК по изобретению, и способы их получения и их применения.[37] The invention relates to synthetic regulatory elements having gene-regulating activity in plants. The nucleotide sequences of these synthetic regulatory elements are shown as SEQ ID NO: 1-18 and SEQ ID NO: 26. These synthetic regulatory elements are capable of influencing the expression of an operably linked transcribed DNA molecule in plant tissues and, therefore, regulating the expression of a operably linked transgene gene in transgenic plants. plants. The invention also relates to new endogenous regulatory elements having gene regulatory activity in plants and presented as SEQ ID NO: 19. The invention also relates to methods for modifying, producing and using recombinant DNA molecules that contain the proposed synthetic and endogenous regulatory elements. The invention also relates to compositions that contain transgenic plant cells, plants, plant parts and seeds containing recombinant DNA molecules according to the invention, and methods for their preparation and use.
[38] Следующие определения и способы предоставлены для лучшего определения данного изобретения и для руководства специалистами в данной области техники при практическом применении данного изобретения. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с их обычным использованием специалистами в соответствующей области техники. Молекулы ДНК[38] The following definitions and methods are provided to better define the present invention and to guide those skilled in the art in practicing the present invention. Unless otherwise indicated, terms are to be understood in accordance with their normal usage by those skilled in the relevant art. DNA molecules
[39] В контексте данного документа, термин «ДНК» или «молекула ДНК» относится к молекуле двухцепочечной ДНК геномного или синтетического происхождения, то есть, к полимеру дезоксирибонуклеотидных оснований или молекуле ДНК, считываемой от 5' (выше рамки считывания) конца до 3' (ниже рамки считывания) конца. В контексте данного документа, термин «последовательность ДНК» относится к нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. Используемая в данном документе номенклатура соответствует номенклатуре Раздела 37 Свода федеральных нормативных актов США, § 1.822, и изложена в таблицах стандарта WIPO ST.25 (1998), Приложение 2, Таблицы 1 и 3.[39] As used herein, the term "DNA" or "DNA molecule" refers to a double-stranded DNA molecule of genomic or synthetic origin, that is, a polymer of deoxyribonucleotide bases or a DNA molecule read from the 5' (upstream) end to the 3 ' (below the reading frame) end. As used herein, the term “DNA sequence” refers to the nucleotide sequence of a DNA molecule. The nomenclature used in this document conforms to that of 37 CFR § 1.822 and is set forth in the tables of WIPO ST.25 (1998), Appendix 2, Tables 1 and 3.
[40] В контексте данного документа, «молекула рекомбинантной ДНК» представляет собой молекулу ДНК, содержащую комбинацию молекул ДНК, которые не могли бы встречаться вместе в природе без вмешательства человека. Например, молекула рекомбинантной ДНК может представлять собой молекулу ДНК, которая состоит по меньшей мере из двух молекул ДНК, гетерологичных по отношению друг к другу, молекулу ДНК, которая содержит последовательность ДНК, которая отклоняется от последовательностей ДНК, существующих в природе, молекулу ДНК, которая содержит синтетическую последовательность ДНК или молекулу ДНК, которая была включена в ДНК клетки-хозяина путем генетической трансформации или редактирования гена.[40] As used herein, a “recombinant DNA molecule” is a DNA molecule containing a combination of DNA molecules that would not occur together in nature without human intervention. For example, a recombinant DNA molecule may be a DNA molecule that consists of at least two DNA molecules that are heterologous to each other, a DNA molecule that contains a DNA sequence that deviates from naturally occurring DNA sequences, a DNA molecule that contains a synthetic DNA sequence or DNA molecule that has been incorporated into the DNA of a host cell by genetic transformation or gene editing.
[41] В контексте данного документа, «синтетическая нуклеотидная последовательность» или «искусственная нуклеотидная последовательность» представляет собой нуклеотидную последовательность, которая, как известно, не встречается или не существует в природе. Ген-регуляторные элементы по данному изобретению содержат синтетические нуклеотидные последовательности. Предпочтительно синтетические нуклеотидные последовательности имеют небольшую гомологию или не расширенную гомологию с природными последовательностями. Расширенная гомология в этом контексте обычно относится к 100% идентичности последовательностей, выходящей за пределы около 25 нуклеотидов смежной последовательности.[41] As used herein, a “synthetic nucleotide sequence” or “artificial nucleotide sequence” is a nucleotide sequence that is not known to occur or exist in nature. The gene regulatory elements of this invention contain synthetic nucleotide sequences. Preferably, the synthetic nucleotide sequences have little or no extended homology to natural sequences. Extended homology in this context usually refers to 100% sequence identity beyond about 25 nucleotides of contiguous sequence.
[42] Ссылка в этой заявке на «изолированную молекулу ДНК» или эквивалентный термин или фразу предназначена для обозначения того, что молекула ДНК представляет собой молекулу, которая присутствует отдельно или в сочетании с другими композициями, но не в ее природном окружении. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, последовательность интрона, нетранслируемая лидерная последовательность, последовательность промотора, последовательность терминации транскрипции и т.п., которые обнаруживаются в природе в ДНК генома организма, не считаются «изолированными» до тех пор, пока элемент находится в геноме организма и в том месте внутри генома, в котором он обнаружен в природе. Однако каждый из этих элементов и части этих элементов будут «изолированы» в рамках данного описания, если элемент не находится в геноме организма и в том месте внутри генома, в котором он обнаружен в природе. Точно так же нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант этого белка, будет изолированной нуклеотидной последовательностью при условии, что нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой последовательность, кодирующая белок, обнаружена в природе. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность встречающегося в природе инсектицидного белка, будет считаться изолированной для целей этого описания. Для целей данного описания любая трансгенная нуклеотидная последовательность, то есть, нуклеотидная последовательность ДНК, вставленная в геном клеток растения или бактерии или присутствующая во внехромосомном векторе, будет считаться изолированной нуклеотидной последовательностью независимо от того, присутствует ли она в плазмиде или аналогичной структуре, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии, или присутствует в определяемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарных продуктах, полученных из растения или бактерии.[42] Reference in this application to an “isolated DNA molecule” or an equivalent term or phrase is intended to indicate that a DNA molecule is a molecule that is present alone or in combination with other compositions, but not in its natural environment. For example, nucleic acid elements, such as a coding sequence, an intron sequence, an untranslated leader sequence, a promoter sequence, a transcription termination sequence, etc., that are naturally found in the DNA of an organism's genome are not considered to be “isolated” until the element found in the genome of an organism and in the location within the genome in which it is found in nature. However, each of these elements and parts of these elements will be "isolated" for the purposes of this description if the element is not found in the organism's genome and in the location within the genome in which it is found in nature. Similarly, a nucleotide sequence encoding an insecticidal protein or any naturally occurring insecticidal variant of that protein will be an isolated nucleotide sequence provided that the nucleotide sequence is not found in the DNA of a bacterium in which the protein-encoding sequence is found in nature. A synthetic nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a naturally occurring insecticidal protein will be considered isolated for the purposes of this description. For the purposes of this description, any transgenic nucleotide sequence, that is, a DNA nucleotide sequence inserted into the genome of plant or bacterial cells or present in an extrachromosomal vector, will be considered an isolated nucleotide sequence regardless of whether it is present in a plasmid or similar structure used for transformation cells, in the genome of a plant or bacterium, or is present in detectable quantities in tissues, progeny, biological samples, or commercial products obtained from the plant or bacterium.
[43] В контексте данного документа, термин «идентичность последовательностей» относится к степени, в которой две оптимально выровненные полинуклеотидные последовательности или две оптимально выровненные полипептидные последовательности идентичны. Оптимальное выравнивание последовательностей создается путем ручного выравнивания двух последовательностей, например, эталонной последовательности и другой последовательности, чтобы максимизировать количество совпадений нуклеотидов при выравнивании последовательностей с соответствующими внутренними нуклеотидными вставками, делециями или гэпами. В контексте данного документа, термин «эталонная последовательность» относится к последовательности ДНК, представленной как SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26.[43] As used herein, the term “sequence identity” refers to the degree to which two optimally aligned polynucleotide sequences or two optimally aligned polypeptide sequences are identical. An optimal sequence alignment is created by manually aligning two sequences, such as a reference sequence and another sequence, to maximize the number of nucleotide matches when aligning sequences with corresponding internal nucleotide insertions, deletions, or gaps. As used herein, the term “reference sequence” refers to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26.
[44] В контексте данного документа, термин «процент идентичности последовательностей» или «процент идентичности» или «% идентичности» представляет собой долю идентичности, умноженную на 100. «Доля идентичности» для последовательности, оптимально выровненной с эталонной последовательностью, представляет собой количество совпадений нуклеотидов в оптимальном выравнивании, деленное на общее количество нуклеотидов в эталонной последовательности, например, общее количество нуклеотидов по всей длине всей эталонной последовательности. Таким образом, один вариант осуществления данного изобретения относится к молекуле ДНК, содержащей последовательность, которая при оптимальном выравнивании с эталонной последовательностью, представленной в данном документе как SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26, имеет по меньшей мере около 85 процентов идентичности, по меньшей мере около 86 процентов идентичности, по меньшей мере около 87 процентов идентичности, по меньшей мере около 88 процентов идентичности, по меньшей мере около 89 процентов идентичности, по меньшей мере около 90 процентов идентичности, по меньшей мере около 91 процентов идентичности, по меньшей мере около 92 процентов идентичности, по меньшей мере около 93 процентов идентичности, по меньшей мере около 94 процентов идентичности, по меньшей мере около 95 процентов идентичности, по меньшей мере около 96 процентов идентичности, по меньшей мере около 97 процентов идентичности, по меньшей мере около 98 процентов идентичности, по меньшей мере, около 99 процентов идентичности, или по меньшей мере около 100 процентов идентичности с эталонной последовательностью. Молекулы ДНК, имеющие процент идентичности последовательности с эталонной молекулой, могут проявлять активность эталонной последовательности.[44] As used herein, the term "percent sequence identity" or "percent identity" or "% identity" is the fraction of identity multiplied by 100. The "fraction of identity" for a sequence optimally aligned to a reference sequence is the number of matches nucleotides in the optimal alignment divided by the total number of nucleotides in the reference sequence, for example, the total number of nucleotides along the entire length of the entire reference sequence. Thus, one embodiment of the present invention provides a DNA molecule comprising a sequence that, when optimally aligned to the reference sequence set forth herein as SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26, has at least about 85 percent identity, at least about 86 percent identity, at least about 87 percent identity, at least about 88 percent identity, at least about 89 percent identity, at least about 90 percent identity, at least about 91 percent identity, at least about 92 percent identity, at least about 93 percent identity, at least about 94 percent identity, at least about 95 percent identity, at least about 96 percent identity, at least about 97 percent identity, at least at least about 98 percent identity, at least about 99 percent identity, or at least about 100 percent identity with the reference sequence. DNA molecules that have a percentage of sequence identity with a reference molecule can exhibit the activity of the reference sequence.
Регуляторный элементыRegulatory elements
[45] Регуляторные элементы такие как промоторы, лидерные последовательности (также известные как 5' UTR), энхансеры, интроны и участки терминации транскрипции (или 3' UTR) играют неотъемлемую роль в общей экспрессии генов в живых клетках. Термин «регуляторный элемент» в контексте данного документа относится к молекуле ДНК, обладающей ген-регуляторной активностью. Термин «ген-регуляторная активность» в контексте данного документа относится к способности влиять на экспрессию функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК, например, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК. Регуляторные элементы, такие как промоторы, лидерные последовательности, энхансеры, интроны и 3' UTR, которые функционируют в растениях, пригодны для модификации фенотипов растений с помощью генной инженерии.[45] Regulatory elements such as promoters, leader sequences (also known as 5' UTRs), enhancers, introns, and transcription termination sites (or 3' UTRs) play an integral role in overall gene expression in living cells. The term "regulatory element" as used herein refers to a DNA molecule having gene regulatory activity. The term “gene regulatory activity” as used herein refers to the ability to influence the expression of an operably linked transcribed DNA molecule, for example, by affecting the transcription and/or translation of an operably linked transcribed DNA molecule. Regulatory elements such as promoters, leader sequences, enhancers, introns and 3' UTRs that function in plants are useful for modifying plant phenotypes through genetic engineering.
[46] В контексте данного документа, термин «группа регуляторных элементов экспрессии» или последовательность «ЕХР» может относиться к группе функционально связанных регуляторных элементов, таких как энхансеры, промоторы, лидерные последовательности и интроны. Например, группа регуляторных элементов экспрессии может состоять, например, из промотора, функционально связанного с 5'-концом лидерной последовательности. ЕХР, применимые при практическом применении данного изобретения, содержат SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 и 16.[46] As used herein, the term "expression regulatory element group" or "EXP" sequence may refer to a group of operably linked regulatory elements such as enhancers, promoters, leader sequences and introns. For example, a group of expression control elements may consist of, for example, a promoter operably linked to the 5' end of a leader sequence. EXPs useful in the practice of this invention contain SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 and 16.
[47] Регуляторные элементы могут характеризоваться своим паттерном экспрессии генов, например, положительными и/или отрицательными эффектами, такими как конститутивная экспрессия или временная, пространственная, развивающаяся, тканевая, окружающей среды, физиологическая, патологическая, клеточного цикла и/или химически чувствительная экспрессия, и любая их комбинация, а также по количественным или качественным показателям. В контексте данного документа, «паттерн экспрессии гена» представляет собой любой паттерн транскрипции функционально связанной молекулы ДНК в транскрибируемую молекулу РНК. Транскрибируемая молекула РНК может транслироваться с образованием молекулы белка или может относится к антисмысловой или другой регуляторной молекуле РНК, такой как двухцепочечная РНК (дцРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомная РНК (рРНК), микроРНК (микроРНК), малая интерферирующая РНК (миРНК) и тому подобное.[47] Regulatory elements can be characterized by their pattern of gene expression, for example, positive and/or negative effects, such as constitutive expression or temporal, spatial, developmental, tissue, environmental, physiological, pathological, cell cycle and/or chemically sensitive expression, and any combination thereof, as well as by quantitative or qualitative indicators. As used herein, a “gene expression pattern” is any pattern of transcription of an operably linked DNA molecule into a transcribed RNA molecule. The transcribed RNA molecule may be translated to form a protein molecule or may be an antisense or other regulatory RNA molecule, such as double-stranded RNA (dsRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA). ) etc.
[48] В контексте данного документа термин «экспрессия белка» означает любой паттерн трансляции транскрибируемой молекулы РНК в молекулу белка. Экспрессия белка может быть охарактеризована его временными, пространственными, характеристиками развития или морфологическими характеристиками, а также количественными или качественными показателями.[48] As used herein, the term “protein expression” means any pattern of translation of a transcribed RNA molecule into a protein molecule. Protein expression can be characterized by its temporal, spatial, developmental or morphological characteristics, as well as quantitative or qualitative indicators.
[49] Промотор пригоден в качестве регуляторного элемента для модуляции экспрессии функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК. В контексте данного документа термин «промотор» обычно относится к молекуле ДНК, которая участвует в распознавании и связывании РНК-полимеразы II и других белков, таких как транс-действующие факторы транскрипции, чтобы инициировать транскрипцию. Промотор может быть первоначально выделен из 5' нетранслируемого участка (5' UTR) геномной копии гена. Альтернативно, промоторы могут быть синтезированы или подвергнуты манипуляции с молекулами ДНК. Промоторы также могут быть химерными. Химерные промоторы получают путем слияния двух или более гетерологичных молекул ДНК. Промоторы, применимые при практическом применении данного изобретения, содержат промоторные элементы, представленные как SEQ ID NO: 2 и 7, или содержащиеся в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 и 16, или их фрагменты или варианты. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения, заявленные молекулы ДНК и любые их варианты или производные, как описано в данном документе, дополнительно определены как имеющие промоторную активность, то есть, способны действовать как промотор в клетке-хозяине, например, в трансгенном растении. В других конкретных вариантах осуществления данного изобретения, фрагмент может быть определен как проявляющий промоторную активность, которой обладает исходная молекула промотора, из которой он получен, или фрагмент может содержать «минимальный промотор», который обеспечивает базовый уровень транскрипции и состоит из TATA бокса или эквивалентной последовательности ДНК для распознавания и связывания комплекса РНК-полимеразы II для инициации транскрипции.[49] A promoter is useful as a regulatory element for modulating the expression of a functionally related transcribed DNA molecule. As used herein, the term “promoter” generally refers to a DNA molecule that is involved in the recognition and binding of RNA polymerase II and other proteins such as trans-acting transcription factors to initiate transcription. The promoter may initially be isolated from the 5' untranslated region (5' UTR) of the genomic copy of the gene. Alternatively, promoters can be synthesized or manipulated by DNA molecules. Promoters can also be chimeric. Chimeric promoters are produced by fusing two or more heterologous DNA molecules. Promoters useful in the practice of this invention comprise the promoter elements represented by SEQ ID NOs: 2 and 7, or contained in any of SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 and 16, or fragments thereof or options. In specific embodiments of the present invention, the subject DNA molecules and any variants or derivatives thereof as described herein are further defined as having promoter activity, that is, capable of acting as a promoter in a host cell, for example, in a transgenic plant. In other specific embodiments of the present invention, the fragment may be defined as exhibiting the promoter activity possessed by the parent promoter molecule from which it is derived, or the fragment may comprise a "minimal promoter" that provides a basic level of transcription and consists of a TATA box or equivalent sequence DNA to recognize and bind the RNA polymerase II complex to initiate transcription.
[50] В одном варианте осуществления данного изобретения, представлены фрагменты последовательности ЕХР или промоторной последовательности, описанные в данном документе. Фрагменты промотора могут иметь промоторную активность, как описано выше, и могут быть применимы отдельно или в комбинации с другими промоторами и фрагментами промоторов, например, при конструировании химерных промоторов или в комбинации с другими элементами экспрессии и фрагментами элементов экспрессии. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения, представлены фрагменты промотора, содержащие по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 95, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 125, по меньшей мере около 150, по меньшей мере около 175, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 225, по меньшей мере около 250, по меньшей мере около 275, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 750, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, или по меньшей мере около 1000 смежных нуклеотидов молекулы ДНК, обладающей промоторной активностью, или более длинные, как описано в данном документе. Способы получения таких фрагментов из исходной молекулы промотора хорошо известны в данной области техники.[50] In one embodiment of the present invention, fragments of the EXP sequence or promoter sequence described herein are provided. Promoter fragments may have promoter activity as described above and may be used alone or in combination with other promoters and promoter fragments, for example, in the construction of chimeric promoters or in combination with other expression elements and expression element fragments. In specific embodiments of the present invention, there are provided promoter fragments containing at least about 50, at least about 75, at least about 95, at least about 100, at least about 125, at least about 150, at least at least about 175, at least about 200, at least about 225, at least about 250, at least about 275, at least about 300, at least about 500, at least about 600, at least about 700, at least about 750, at least about 800, at least about 900, or at least about 1000 contiguous nucleotides of a DNA molecule having promoter activity, or longer as described herein. Methods for obtaining such fragments from the original promoter molecule are well known in the art.
[51] В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения, представлены описанные в данном документе фрагменты энхансерных или интронных последовательностей. Фрагменты энхансера или интрона могут включать активность основной молекулы, из которой они были получены, и могут быть применимы отдельно или в комбинации с другими регуляторными элементами, включая промоторы, лидерные последовательности, другие энхансеры, другие интроны или их фрагменты. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения, представлены фрагменты энхансера или интрона, содержащие по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 95, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 125, по меньшей мере около 150, по меньшей мере около 175, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 225, по меньшей мере около 250, по меньшей мере около 275, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 750, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, или по меньшей мере около 1000 смежных нуклеотидов молекулы ДНК, обладающей энхансерной или интронной активностью, или более длинные, как описано в данном документе. Способы получения таких фрагментов из исходной молекулы хорошо известны в данной области техники.[51] In additional embodiments of the present invention, fragments of enhancer or intronic sequences described herein are provided. Enhancer or intron fragments may include the activity of the parent molecule from which they are derived and may be useful alone or in combination with other regulatory elements, including promoters, leader sequences, other enhancers, other introns, or fragments thereof. In specific embodiments of the present invention, provided are enhancer or intron fragments containing at least about 50, at least about 75, at least about 95, at least about 100, at least about 125, at least about 150, at least about 175, at least about 200, at least about 225, at least about 250, at least about 275, at least about 300, at least about 500, at least about 600, at least at least about 700, at least about 750, at least about 800, at least about 900, or at least about 1000 contiguous nucleotides of a DNA molecule having enhancer or intronic activity, or longer as described herein. Methods for preparing such fragments from the parent molecule are well known in the art.
[52] В других вариантах осуществления данного изобретения, представлены фрагменты последовательностей 3' UTR, описанных в данном документе. Фрагменты 3' UTR могут иметь активность основной молекулы 3' UTR, из которой они были получены, и могут быть применимы сами по себе или в комбинации с другими регуляторными элементами, включая промоторы, лидерные последовательности, интроны или их фрагменты. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения, представлены фрагменты интрона, содержащие по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 95, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 125, по меньшей мере около 150, по меньшей мере около 175, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 225, по меньшей мере около 250, по меньшей мере около 275, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 750, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, или по меньшей мере около 1000 смежных нуклеотидов молекул ДНК, обладающих активностью 3' UTR, или более длинные, как описано в данном документе. Способы получения таких фрагментов из исходной молекулы 3' UTR хорошо известны в данной области техники.[52] In other embodiments of the present invention, fragments of the 3' UTR sequences described herein are provided. 3' UTR fragments may have the activity of the underlying 3' UTR molecule from which they are derived and may be useful alone or in combination with other regulatory elements, including promoters, leader sequences, introns, or fragments thereof. In specific embodiments of the present invention, there are intron fragments containing at least about 50, at least about 75, at least about 95, at least about 100, at least about 125, at least about 150, at least at least about 175, at least about 200, at least about 225, at least about 250, at least about 275, at least about 300, at least about 500, at least about 600, at least about 700, at least about 750, at least about 800, at least about 900, or at least about 1000 contiguous nucleotides of DNA molecules having 3' UTR activity, or longer as described herein. Methods for obtaining such fragments from the original 3' UTR molecule are well known in the art.
[53] Композиции, полученные из любого из промоторных элементов, представленных как SEQ ID NO: 2 и 7, или содержащихся в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 и 16, таких как внутренние или 5'-концевые делеции, например, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области техники, для улучшения или изменения экспрессии, включая путем удаления элементов, которые имеют либо положительные, либо отрицательные эффекты на экспрессию; дублирование элементов, которые положительно или отрицательно влияют на экспрессию; и/или дублирование или удаление элементов, которые имеют тканеспецифический или клеточноспецифический эффект на экспрессию. Композиции, полученные из любого из промоторных элементов, представленных как SEQ ID NO: 2 и 7, или содержащихся в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 и 16, состоящие из 3'-концевых делеций, в которых элемент ТАТА-бокса или его эквивалентная последовательность и идущая за ней в 3' направлении последовательность удалена, могут использоваться, например, для создания энхансерных элементов. Дальнейшие делеции могут быть выполнены для удаления любых элементов, которые имеют положительное или отрицательное; тканеспецифичное; клеточноспецифичное; или зависящее от времени (например, циркадного ритма, но не ограничиваясь ими) влияние на экспрессию. Любой из промоторных элементов, представленных как SEQ ID NO: 2 и 7, или содержащихся в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 и 16, и фрагменты или энхансеры, полученные из них, можно использовать для создания композиций химерных регуляторных элементов транскрипции.[53] Compositions derived from any of the promoter elements shown as SEQ ID NOs: 2 and 7, or contained in any of SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 and 16, such as internal or 5 '-terminal deletions, for example, can be made using methods known in the art to improve or alter expression, including by removing elements that have either positive or negative effects on expression; duplication of elements that positively or negatively affect expression; and/or duplication or deletion of elements that have a tissue-specific or cell-specific effect on expression. Compositions derived from any of the promoter elements shown as SEQ ID NOs: 2 and 7, or contained in any of SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 and 16, consisting of 3' terminal deletions, in which the TATA box element or its equivalent sequence and the sequence following it in the 3' direction is deleted, can be used, for example, to create enhancer elements. Further deletions can be made to remove any elements that are positive or negative; tissue specific; cell specific; or time-dependent (eg, but not limited to, circadian rhythm) influence on expression. Any of the promoter elements set forth in SEQ ID NOs: 2 and 7, or contained in any of SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 and 16, and fragments or enhancers derived therefrom, can be used to creating compositions of chimeric transcription regulatory elements.
[54] В соответствии с изобретением промотор или фрагмент промотора можно анализировать на наличие известных промоторных элементов, то есть, характеристик последовательности ДНК, таких как ТАТА-бокс и другие известные мотивы сайта связывания фактора транскрипции. Идентификация таких известных промоторных элементов может быть использована специалистом в данной области техники для создания вариантов промотора, имеющих сходный паттерн экспрессии с исходным промотором.[54] In accordance with the invention, a promoter or promoter fragment can be analyzed for the presence of known promoter elements, that is, DNA sequence features such as TATA box and other known transcription factor binding site motifs. The identification of such known promoter elements can be used by one skilled in the art to generate promoter variants having a similar expression pattern to the original promoter.
[55] В контексте данного документа термин «лидерная последовательность» относится к молекуле ДНК, выделенной из нетранслируемого 5' участка (5' UTR) гена и определяемой, как правило, как нуклеотидный сегмент между сайтом начала транскрипции (TSS) и сайтом начала кодирующей последовательности белка. В качестве альтернативы лидерные последовательности могут быть элементами ДНК, произведеными синтетически или модифицированными. Лидерная последовательность может использоваться в качестве 5' регуляторного элемента для модуляции экспрессии функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК. Молекулы лидерной последовательности можно использовать с гетерологичным промотором или с их природным промотором. Лидерные последовательности, пригодные для практического применения данного изобретения, включают SEQ ID NO: 3 и 8; или любой из лидерных элементов, содержащихся в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 и 16, или их фрагменты или варианты. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения такие последовательности ДНК могут быть определены как способные действовать в качестве лидерных последовательностей в клетке-хозяине, включая, например, трансгенную клетку растения. В одном варианте осуществления данного изобретения, такие последовательности декодируются как содержащие лидерную активность.[55] As used herein, the term "leader sequence" refers to a DNA molecule isolated from the 5' untranslated region (5' UTR) of a gene and is generally defined as the nucleotide segment between the transcription start site (TSS) and the start site of the coding sequence squirrel. Alternatively, leader sequences may be synthetically produced or modified DNA elements. The leader sequence can be used as a 5' regulatory element to modulate the expression of an operably linked transcribed DNA molecule. Leader sequence molecules can be used with a heterologous promoter or with their natural promoter. Leader sequences useful for the practice of this invention include SEQ ID NOs: 3 and 8; or any of the leader elements contained in any of SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 and 16, or fragments or variants thereof. In specific embodiments of the present invention, such DNA sequences may be defined as being capable of acting as leader sequences in a host cell, including, for example, a transgenic plant cell. In one embodiment of the present invention, such sequences are decoded as containing leader activity.
[56] Лидерные последовательности (также упоминаемые как 5' UTR), представленные как SEQ ID NO: 3 и 8, или любой из лидерных элементов, содержащихся в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 и 16, могут состоять из регуляторных элементов или могут принимать вторичные структуры, которые могут влиять на транскрипцию или трансляцию функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК. Лидерные последовательности, представленные как SEQ ID NO: 3 и 8, или любой из лидерных элементов, содержащихся в любой из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, 11, 15 и 16, можно применять в соответствии с изобретением для получения химерных регуляторных элементов, которые влияют на транскрипцию или трансляцию функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК.[56] Leader sequences (also referred to as 5' UTRs) represented by SEQ ID NOs: 3 and 8, or any of the leader elements contained in any of SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 and 16 may consist of regulatory elements or may adopt secondary structures that can influence the transcription or translation of an operably linked transcribed DNA molecule. The leader sequences represented by SEQ ID NOs: 3 and 8, or any of the leader elements contained in any of SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 and 16, can be used in accordance with the invention to produce chimeric regulatory elements that affect the transcription or translation of a functionally related transcribed DNA molecule.
[57] В контексте данного документа, термин «интрон» относится к молекуле ДНК, которая может быть выделена или идентифицирована из гена и может быть определена в целом как участок, сплайсированный во время процессинга матричной РНК (мРНК) до трансляции. Альтернативно, интрон может быть элементом ДНК, синтетически произведенным или модифицированным. Интрон может содержать энхансерные элементы, которые влияют на транскрипцию функционально связанных генов. Интрон можно использовать в качестве регуляторного элемента для модуляции экспрессии функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК. Конструкция может содержать интрон, и интрон может быть или не быть гетерологичным по отношению к молекуле транскрибируемой ДНК. Примеры интронов в данной области техники включают интрон актина риса и интрон HSP70 кукурузы.[57] As used herein, the term "intron" refers to a DNA molecule that can be isolated or identified from a gene and can be defined generally as a region spliced during messenger RNA (mRNA) processing prior to translation. Alternatively, the intron may be a DNA element that is synthetically produced or modified. An intron may contain enhancer elements that influence the transcription of functionally related genes. An intron can be used as a regulatory element to modulate the expression of an operably linked transcribed DNA molecule. The construct may contain an intron, and the intron may or may not be heterologous to the DNA molecule being transcribed. Examples of introns in the art include the rice actin intron and the maize HSP70 intron.
[58] У растений включение некоторых интронов в генные конструкции приводит к увеличению накопления мРНК и белка по сравнению с конструкциями у которых нет интрона. Этот эффект получил название «интрон опосредованное усиление» (ГМЕ -англ.: intron mediated enhancement) экспрессии гена. Интроны, которые, как известно, стимулируют экспрессию в растениях, были идентифицированы в генах кукурузы (например, tubA1, Adh1, Sh1, и Ubi1), в генах риса (например, tpi) и в генах двудольных растений, таких как петунии (например, rbcS), картофеля (например, st-ls1) и Arabidopsis thaliana (например, ubq3 и pat1). Было показано, что делеции или мутации в сайтах сплайсинга интрона снижают экспрессию гена, указывая на то, что сплайсинг может быть необходим для ГМЕ. Однако ГМЕ у двудольных растений был продемонстрирован точечными мутациями в сайтах сплайсинга гена pat1 из A. thaliana. Было продемонстрирован, что многократное использование того же интрона в одном растении имеет недостатки. В этих случаях необходимо иметь набор основных контролирующих элементов для конструирования соответствующих рекомбинантных элементов ДНК. Типичные интроны, пригодные для использования в практике данного изобретения, представлены как SEQ ID NO: 5, 10 и 12.[58] In plants, the inclusion of certain introns in gene constructs leads to increased accumulation of mRNA and protein compared to constructs that do not have an intron. This effect is called “intron mediated enhancement” (GME) of gene expression. Introns known to drive expression in plants have been identified in maize genes (e.g., tubA1, Adh1, Sh1, and Ubi1), rice genes (e.g., tpi), and genes in dicots such as petunias (e.g., rbcS), potato (e.g. st-ls1) and Arabidopsis thaliana (e.g. ubq3 and pat1). Deletions or mutations in intronic splice sites have been shown to reduce gene expression, suggesting that splicing may be required for GME. However, GME in dicots has been demonstrated by point mutations in the splice sites of the pat1 gene from A. thaliana. It has been demonstrated that using the same intron multiple times in the same plant has disadvantages. In these cases, it is necessary to have a set of basic control elements for the construction of appropriate recombinant DNA elements. Exemplary introns useful in the practice of this invention are shown as SEQ ID NOs: 5, 10 and 12.
[59] В контексте данного документа, термины «3'-молекула терминации транскрипции», «3' нетранслируемый участок» или «3' UTR» относятся к молекуле ДНК, которая используется во время транскрипции на нетранслируемом участке 3' части молекулы мРНК. 3' нетранслируемый участок молекулы мРНК может быть получен путем специфического расщепления и 3' полиаденилирования, также известного как полиА-хвост. 3' UTR может быть функционально связан с молекулой транскрибируемой ДНК и располагаться ниже нее по рамке считывания и может включать сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на транскрипцию, процессинг мРНК или экспрессию гена. Считается, что полиА хвосты играют роль в стабильности мРНК и инициации трансляции. Примерами 3' молекул терминации транскрипции в данной области техники являются 3' участок нопалинсинтазы, 3' участок hsp17 пшеницы, 3' участок малой субъединицы рубиско гороха, 3' участок хлопка Е6 и 3' UTR коиксина.[59] As used herein, the terms "3' transcription termination molecule", "3' untranslated region" or "3' UTR" refer to the DNA molecule that is used during transcription at the 3' untranslated region of the mRNA molecule. The 3' untranslated region of an mRNA molecule can be produced by specific cleavage and 3' polyadenylation, also known as a polyA tail. The 3' UTR may be operably linked to and downstream of the transcribed DNA molecule and may include a polyadenylation signal and other regulatory signals that can influence transcription, mRNA processing, or gene expression. PolyA tails are thought to play a role in mRNA stability and translation initiation. Examples of 3' transcription termination molecules in the art are the nopaline synthase 3' region, the wheat hsp17 3' region, the pea small subunit rubisco 3' region, the cotton E6 3' region, and the coixin 3' UTR.
[60] 3' UTR обычно находят полезное применение для рекомбинантной экспрессии специфических молекул ДНК. Слабый 3' UTR может вызывать сквозное считывание, которое может влиять на экспрессию молекулы ДНК, расположенной в соседних экспрессионных кассетах. Соответствующий контроль терминации транскрипции может предотвратить сквозное считывание в последовательностях ДНК (например, других экспрессионных кассет), локализованных ниже, и может дополнительно обеспечить эффективную рециркуляцию РНК полимеразы для улучшения экспрессии генов. Эффективная терминация транскрипции (высвобождение РНК полимеразы II из ДНК) является необходимым условием для повторной инициации транскрипции и, таким образом, напрямую влияет на общий уровень транскрипции. После терминации транскрипции зрелая мРНК высвобождается из сайта синтеза, а матрица транспортируется в цитоплазму. Эукариотические мРНК накапливаются в виде поли(А) форм in vivo, что затрудняет обнаружение сайтов терминации транскрипции обычными способами. Однако предсказание функциональных и эффективных 3' UTR способами биоинформатики затруднено из-за отсутствия консервативных последовательностей ДНК, которые позволили бы легко предсказать эффективный 3' UTR.[60] 3′ UTRs generally find useful applications for the recombinant expression of specific DNA molecules. A weak 3' UTR can cause readthrough, which can affect the expression of a DNA molecule located in adjacent expression cassettes. Appropriate control of transcription termination can prevent read-through into DNA sequences (eg, other expression cassettes) located downstream, and can further ensure efficient recycling of RNA polymerase to improve gene expression. Efficient transcription termination (release of RNA polymerase II from DNA) is a prerequisite for transcription re-initiation and thus directly affects the overall level of transcription. After transcription termination, mature mRNA is released from the synthesis site, and the template is transported into the cytoplasm. Eukaryotic mRNAs accumulate as poly(A) forms in vivo, making it difficult to detect transcription termination sites by conventional methods. However, the prediction of functional and effective 3' UTRs by bioinformatics methods is difficult due to the lack of conserved DNA sequences that would allow easy prediction of the effective 3' UTR.
[61] С практической точки зрения обычно полезно, чтобы 3' UTR, используемый в экспрессионной кассете, обладал следующими характеристиками. Во-первых, 3' UTR должен быть способен производительно и эффективно прекращать транскрипцию трансгена и предотвращать сквозное считывание транскрипта в любой соседней последовательности ДНК, которая может состоять из другой экспрессионной кассеты, как в случае множественных экспрессионных кассет, находящихся в одной введенной ДНК (Т-ДНК) или соседней хромосомной ДНК, в которую вставлена Т-ДНК. Во-вторых, 3' UTR не должен вызывать снижение транскрипционной активности, передаваемой промотором, лидером, энхансерами и нитронами, которые используются для управления экспрессией молекулы ДНК. Наконец, в биотехнологии растений 3' UTR часто используется для праймирования реакций амплификации обратно транскрибируемой РНК, извлеченной из трансформированного растения, и используется для: (1) оценки транскрипционной активности или экспрессии экспрессионной кассеты оказавшейся интегрированной в хромосому растения; (2) оценки количества копий вставок в ДНК растения; и (3) оценки зиготности полученных семян после селекции. 3' UTR также используется в реакциях амплификации ДНК, выделенной из трансформированного растения, для характеристики целостности вставленной кассеты. 3' UTR, пригодные для практики данного изобретения, представлены как SEQ ID N0: 13, 14, 19 и 26.[61] From a practical point of view, it is generally useful for the 3' UTR used in an expression cassette to have the following characteristics. First, the 3' UTR must be able to efficiently and effectively terminate transcription of the transgene and prevent read-through of the transcript into any adjacent DNA sequence that may consist of a different expression cassette, as in the case of multiple expression cassettes found in a single input DNA (T- DNA) or adjacent chromosomal DNA into which the T-DNA is inserted. Secondly, the 3' UTR should not cause a decrease in transcriptional activity transmitted by the promoter, leader, enhancers and nitrones that are used to control the expression of the DNA molecule. Finally, in plant biotechnology, the 3' UTR is often used to prime amplification reactions of reverse transcribed RNA extracted from a transformed plant and is used to: (1) assess the transcriptional activity or expression of an expression cassette that is integrated into the plant chromosome; (2) estimating the copy number of insertions in plant DNA; and (3) assessing the zygosity of the resulting seeds after selection. The 3' UTR is also used in amplification reactions of DNA isolated from a transformed plant to characterize the integrity of the inserted cassette. 3' UTRs useful for the practice of this invention are provided as SEQ ID NO: 13, 14, 19 and 26.
[62] В контексте данного документа, термин «энхансер» или «энхансерный элемент» относится к цис-действующему регуляторному элементу, также известному как цис-элемент, который придает аспект общего паттерна экспрессии, но обычно недостаточен сам по себе, чтобы управлять транскрипцией, функционально связанной молекулы транскрибируемой ДНК. В отличие от промоторов, энхансерные элементы обычно не включают сайт начала транскрипции (TSS - transcription start site) или ТАТА-бокс или эквивалентную последовательность ДНК. Промотор или фрагмент промотора может природным образом содержать один или более энхансерных элементов, которые влияют на транскрипцию функционально связанной последовательности ДНК. Энхансерный элемент также может быть слит с промотором для получения цис-элемента химерного промотора, который придает аспект общей модуляции экспрессии гена.[62] As used herein, the term "enhancer" or "enhancer element" refers to a cis-acting regulatory element, also known as a cis element, that contributes an aspect of the overall expression pattern but is generally not sufficient on its own to drive transcription. a functionally linked molecule of transcribed DNA. Unlike promoters, enhancer elements generally do not include a transcription start site (TSS) or TATA box or equivalent DNA sequence. A promoter or promoter fragment may naturally contain one or more enhancer elements that influence the transcription of an operably linked DNA sequence. An enhancer element can also be fused to a promoter to produce a chimeric promoter cis element that imparts an overall modulation aspect of gene expression.
[63] Считается, что многие энхансерные элементы промотора связывают ДНК-связывающие белки и/или влияют на топологию ДНК, создавая локальные конформации, которые избирательно разрешают или ограничивают доступ РНК-полимеразы к матрице ДНК или которые способствуют селективному открытию двойной спирали в сайте инициации транскрипции. Энхансерный элемент может функционировать для связывания факторов транскрипции, которые регулируют транскрипцию. Некоторые энхансерные элементы связывают более одного фактора транскрипции, и факторы транскрипции могут взаимодействовать с разной аффинностью с более чем одним доменом энхансера. Энхансерные элементы можно идентифицировать с помощью ряда методов, включая анализ делеции, то есть, делецию одного или более нуклеотидов от 5' -конца или внутри промотора; анализ ДНК-связывающих белков с использованием футпринтинга ДНКазы I, интерференции метилирования, электрофорезные анализы сдвига подвижности, геномного следа, геномный футпринтинг in vivo с помощью лигирования-опосредованной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и других традиционных анализов или анализа сходства последовательностей ДНК с использованием известных методов сравнения мотивов цис-элементов или энхансерных элементов в качестве последовательности-мишени или мотива-мишени с последовательностью обычной ДНК, таких как BLAST. Тонкую структуру энхансерного домена можно дополнительно изучить с помощью мутагенеза (или замены) одного или более нуклеотидов или другими традиционными способами, известными в данной области техники. Энхансерные элементы могут быть получены путем химического синтеза или путем выделения из регуляторных элементов, которые включают такие элементы, и они могут быть синтезированы с дополнительными фланкирующими нуклеотидами, которые содержат полезные сайты рестрикционных ферментов для облегчения манипуляции с подпоследовательностями. Таким образом, создание, конструирование и использование энхансерных элементов в соответствии со способами, описанными в данном документе, для модуляции экспрессии функционально связанных молекул транскрибируемой ДНК, охвачены данным изобретением. Иллюстративные энхансеры, пригодные для практического применении по этому изобретения, представлены как SEQ ID NO: 17 и 18.[63] Many promoter enhancer elements are thought to bind DNA-binding proteins and/or influence DNA topology by creating local conformations that selectively allow or restrict RNA polymerase access to the DNA template or that promote selective opening of the double helix at the transcription start site . An enhancer element may function to bind transcription factors that regulate transcription. Some enhancer elements bind more than one transcription factor, and transcription factors can interact with different affinities with more than one enhancer domain. Enhancer elements can be identified using a number of methods, including deletion analysis, that is, deletion of one or more nucleotides from the 5' end or within the promoter; analysis of DNA binding proteins using DNase I footprinting, methylation interference, electrophoresis mobility shift assays, genomic footprinting, in vivo genomic footprinting using ligation-mediated polymerase chain reaction (PCR) and other conventional or DNA sequence similarity assays using known methods comparing cis-element motifs or enhancer elements as a target sequence or a target motif with a regular DNA sequence, such as BLAST. The fine structure of the enhancer domain can be further studied by mutagenesis (or substitution) of one or more nucleotides or other conventional methods known in the art. Enhancer elements can be obtained by chemical synthesis or by isolation from regulatory elements that include such elements, and they can be synthesized with additional flanking nucleotides that contain useful restriction enzyme sites to facilitate manipulation of the subsequences. Thus, the creation, construction and use of enhancer elements in accordance with the methods described herein to modulate the expression of functionally related transcribed DNA molecules are covered by this invention. Exemplary enhancers useful for the practice of this invention are provided as SEQ ID NOs: 17 and 18.
[64] В контексте данного документа термин «химерная» относится к одной молекуле ДНК, полученной путем слияния первой молекулы ДНК со второй молекулой ДНК, где ни первая, ни вторая молекула ДНК обычно не находятся в этой конфигурации, то есть слиты с другой. Таким образом, химерная молекула ДНК является новой молекулой ДНК, обычно не встречающейся в природе. В контексте данного документа, термин «химерный промотор» относится к промотору, полученному посредством таких манипуляций с молекулами ДНК. Химерный промотор может объединять два или более фрагмента ДНК, например, слияние промотора с энхансерным элементом. Таким образом, создание, конструирование и использование химерных промоторов в соответствии со способами, описанными в данном документе, для модуляции экспрессии функционально связанных молекул транскрибируемой ДНК, охвачены данным изобретением.[64] As used herein, the term “chimeric” refers to a single DNA molecule produced by fusing a first DNA molecule with a second DNA molecule, where neither the first nor the second DNA molecule is typically in that configuration, that is, fused to the other. Thus, a chimeric DNA molecule is a new DNA molecule not typically found in nature. As used herein, the term "chimeric promoter" refers to a promoter obtained through such manipulation of DNA molecules. A chimeric promoter may combine two or more DNA fragments, such as fusion of a promoter with an enhancer element. Thus, the creation, construction and use of chimeric promoters in accordance with the methods described herein to modulate the expression of functionally related transcribed DNA molecules are covered by this invention.
[65] Химерные регуляторные элементы могут быть сконструированы так, чтобы содержать различные составляющие элементы, которые могут быть оперативно связаны различными способами, известными в данной области техники, такими как расщепление рестрикционными ферментами и лигирование, независимое от лигирования клонирование, модульная сборка продуктов ПЦР во время амплификации или прямой химический синтез регуляторного элемент, а также другими способами, известные в данной области техники. Полученные в результате различные химерные регуляторные элементы могут состоять из одних и тех же или вариантов одних и тех же составляющих элементов, но отличаться последовательностью ДНК или последовательностями, которые содержат связывающую последовательность ДНК или последовательности ДНК, которые позволяют функционально соединять составляющие части. В изобретении последовательности ДНК, представленные как SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26, могут обеспечивать эталонные последовательности регуляторных элементов, при этом составляющие элементы, составляющие эталонную последовательность, могут быть соединены способами, известными в данной области техники, и могут содержать замены, делеции и/или вставки одного или более нуклеотидов или мутаций, которые природным образом возникают при трансформации бактериальных и растительных клеток.[65] Chimeric regulatory elements can be designed to contain various constituent elements that can be operatively linked by various methods known in the art, such as restriction enzyme digestion and ligation, ligation-independent cloning, modular assembly of PCR products during amplification or direct chemical synthesis of the regulatory element, as well as other methods known in the art. The resulting different chimeric regulatory elements may consist of the same or variants of the same constituent elements, but differ in the DNA sequence or sequences that contain a DNA binding sequence or DNA sequences that allow the constituent parts to be operably linked. In the invention, the DNA sequences represented by SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26 may provide reference sequences of regulatory elements, wherein the constituent elements comprising the reference sequence may be joined by methods known in the art and may contain substitutions, deletions and/or insertions of one or more nucleotides or mutations that naturally occur during the transformation of bacterial and plant cells.
[66] В контексте данного документа, термин «вариант» относится ко второй молекуле ДНК, такой как регуляторный элемент, которая по составу аналогична, но не идентична первой молекуле ДНК, и при этом вторая молекула ДНК все еще сохраняет общую функциональность, то есть такой же или подобный паттерн экспрессии, например, посредством более или менее эквивалентной транскрипционной активности первой молекулы ДНК. Вариант может быть более короткой или усеченной версией первой молекулы ДНК или измененной версией последовательности первой молекулы ДНК, такой как с другими сайтами рестрикционных ферментов и/или внутренними делециями, заменами или вставками. «Вариант» может также включать регуляторный элемент, имеющий нуклеотидную последовательность, содержащую замену, делецию или вставку одного или более нуклеотидов эталонной последовательности, при этом производный регуляторный элемент имеет более или менее или эквивалентную транскрипционную или трансляционную активность, чем соответствующая родительская регуляторная молекула. «Варианты» регуляторного элемента также будут охватывать варианты, возникающие в результате мутаций, которые природным образом возникают при трансформации бактериальных и растительных клеток. В данном изобретении полинуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26, может быть использована для создания вариантов, которые аналогичны по составу, но не идентичны последовательности ДНК исходного регуляторного элемента, при этом все еще сохраняя общую функциональность, то есть, тот же или подобный паттерн экспрессии исходного регуляторного элемента. Производство таких вариантов по изобретению находится в компетенции среднего специалиста в данной области техники в свете описания и входит в объем данного изобретения.[66] As used herein, the term "variant" refers to a second DNA molecule, such as a regulatory element, that is similar in composition, but not identical, to the first DNA molecule, and wherein the second DNA molecule still retains overall functionality, i.e. the same or similar pattern of expression, for example, through more or less equivalent transcriptional activity of the first DNA molecule. The variant may be a shorter or truncated version of the first DNA molecule or an altered version of the sequence of the first DNA molecule, such as with different restriction enzyme sites and/or internal deletions, substitutions or insertions. A “variant” may also include a regulatory element having a nucleotide sequence comprising a substitution, deletion, or insertion of one or more nucleotides of a reference sequence, wherein the derived regulatory element has more or less or equivalent transcriptional or translational activity than the corresponding parent regulatory molecule. “Variants” of a regulatory element will also include variants resulting from mutations that naturally occur during transformation of bacterial and plant cells. In this invention, the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26 can be used to create variants that are similar in composition, but not identical to the DNA sequence of the original regulatory element, while still retaining overall functionality , that is, the same or similar expression pattern of the original regulatory element. The manufacture of such embodiments of the invention is within the competence of one of ordinary skill in the art in light of the description and is within the scope of the present invention.
[67] Эффективность описанных в данном документе модификаций, дупликаций или делеций в отношении желаемых аспектов экспрессии конкретного трансгена может быть проверена эмпирически в анализах стабильных и транзиентных растений, таких как те, что описаны в рабочих примерах в данном документе, чтобы подтвердить результаты, которые могут варьироваться в зависимости от внесенных изменений и цели изменения исходной молекулы ДНК.[67] The effectiveness of modifications, duplications or deletions described herein on desired aspects of expression of a particular transgene can be tested empirically in stable and transient plant assays, such as those described in the worked examples herein, to confirm results that may vary depending on the changes made and the purpose of the change to the original DNA molecule.
КонструкцииConstructions
[68] В контексте данного документа, термин «конструкция» означает любую молекулу рекомбинантной ДНК такую как плазмида, космида, вирус, фаг, или линейная или кольцевая молекула ДНК или РНК, полученную из любого источника, способную к геномной интеграции или автономной репликации, содержащую молекулу ДНК в которой по меньшей мере одна молекула ДНК функционально связана с другой молекулой ДНК, то есть функционально связана. В контексте данного документа, термин «вектор» означает любую конструкцию, которая может быть использована с целью трансформации, то есть, введения гетерологичной ДНК или РНК в клетку-хозяин. Конструкция обычно включает одну или более экспрессионных кассет. В контексте данного документа, термин «экспрессионная кассета» относится к молекуле ДНК, содержащей по меньшей мере молекулу транскрибируемой ДНК, функционально связанную с одним или более регуляторными элементами, обычно по меньшей мере с промотором и 3' UTR.[68] As used herein, the term “construct” means any recombinant DNA molecule such as a plasmid, cosmid, virus, phage, or linear or circular DNA or RNA molecule, derived from any source, capable of genomic integration or autonomous replication, containing a DNA molecule in which at least one DNA molecule is operably linked to another DNA molecule, that is, functionally linked. As used herein, the term “vector” means any construct that can be used for the purpose of transformation, that is, the introduction of heterologous DNA or RNA into a host cell. The design typically includes one or more expression cassettes. As used herein, the term "expression cassette" refers to a DNA molecule containing at least a transcribed DNA molecule operably linked to one or more regulatory elements, typically at least a promoter and a 3' UTR.
[69] В контексте данного документа, термин "функционально связанный" относится к первой молекуле ДНК, присоединенной ко второй молекуле ДНК, при этом первая и вторая молекулы ДНК расположены таким образом, что первая молекула ДНК влияет на функцию второй молекулы ДНК. Две молекулы ДНК могут быть, а могут и не быть частью одной смежной молекулы ДНК и могут быть или не быть смежными. Например, промотор функционально связан с молекулой транскрибируемой ДНК, если промотор модулирует транскрипцию представляющей интерес молекулы транскрибируемой ДНК в клетке. Например, лидерная последовательность функционально связана с последовательностью ДНК, если она способна влиять на транскрипцию или трансляцию последовательности ДНК.[69] As used herein, the term "operably linked" refers to a first DNA molecule linked to a second DNA molecule, wherein the first and second DNA molecules are arranged such that the first DNA molecule influences the function of the second DNA molecule. Two DNA molecules may or may not be part of the same adjacent DNA molecule and may or may not be contiguous. For example, a promoter is operably linked to a transcribed DNA molecule if the promoter modulates the transcription of a transcribed DNA molecule of interest in a cell. For example, a leader sequence is operably linked to a DNA sequence if it is capable of influencing transcription or translation of the DNA sequence.
[70] В одном варианте осуществления данного изобретения конструкции по данному изобретению могут быть представлены в виде двойных опухоль-индуцирующих (Ti) плазмидных граничных конструкций, которые имеют правую границу (RB или AGRtu.RB) и левую границу (LB или AGRtu.LB) участков Ti-плазмиды, выделенной из Agrobacterium tumefaciens содержащей Т-ДНК, которая вместе с переносящими молекулами, обеспечиваемыми клетками A. tumefaciens, позволяет интегрировать Т-ДНК в геном растительной клетки (см., например, патент США 6603061). Конструкции также могут содержать сегменты ДНК плазмидного остова, которые обеспечивают функцию репликации и селекцию антибиотиками в бактериальных клетках, например, ориджин репликации Escherichia coli такой как ori322, ориджин репликации широкого диапазона хозяина, такой как oriV или oriRi, и кодирующую участок для селективного маркера, такого как Spec/Strp, который кодирует аминогликозид аденилтрансферазу Tn7 (aadA) придающую устойчивость к спектиномицину или стрептомицину, или ген селективного маркера гентамицина (Gm, Gent). Для трансформации растений бактериальным штаммом-хозяином часто является ABI, С58 или LBA4404 А. tumefaciens, однако другие штаммы, известные специалистам в данной области техники трансформации растений, могут функционировать в данном изобретении.[70] In one embodiment of the present invention, the constructs of the present invention may be provided as dual tumor-inducing (Ti) plasmid border constructs that have a right border (RB or AGRtu.RB) and a left border (LB or AGRtu.LB) sections of a Ti plasmid isolated from Agrobacterium tumefaciens containing T-DNA, which, together with transfer molecules provided by A. tumefaciens cells, allows the integration of T-DNA into the genome of a plant cell (see, for example, US patent 6,603,061). The constructs may also contain segments of plasmid backbone DNA that provide replication function and antibiotic selection in bacterial cells, for example, an Escherichia coli origin of replication such as ori322, a broad host range origin of replication such as oriV or oriRi, and a coding region for a selectable marker such as Spec/Strp, which encodes the Tn7 aminoglycoside adenyltransferase (aadA) conferring resistance to spectinomycin or streptomycin, or the gentamicin selectable marker gene (Gm, Gent). For plant transformation, the host bacterial strain is often ABI, C58 or LBA4404 of A. tumefaciens, however other strains known to those skilled in the art of plant transformation may function in the present invention.
[71] В данной области техники известны способы сборки и введения конструкций в клетку таким образом, чтобы транскрибируемая молекула ДНК транскрибировалась в функциональную молекулу мРНК, которая транслируется и экспрессируется как белок. Для практического применения изобретения традиционные композиции и способы получения и применения конструкций и клеток-хозяев хорошо известны специалистам в данной области техники. Типичные векторы, пригодные для экспрессии нуклеиновых кислот в высших растениях, хорошо известны в данной области техники и включают векторы, полученные из Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, и вектор контроля переноса pCaMVCN.[71] Methods are known in the art for assembling and introducing constructs into a cell such that a transcribed DNA molecule is transcribed into a functional mRNA molecule that is translated and expressed as a protein. For the practical application of the invention, conventional compositions and methods for preparing and using constructs and host cells are well known to those skilled in the art. Exemplary vectors useful for the expression of nucleic acids in higher plants are well known in the art and include vectors derived from the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid and the transfer control vector pCaMVCN.
[72] В конструкцию могут быть включены различные регуляторные элементы, включая любые из представленных в данном документе. Любые такие регуляторные элементы могут предоставляться в сочетании с другими регуляторными элементами. Такие комбинации могут быть разработаны или модифицированы для получения желаемых нормативных характеристик. В одном варианте осуществления данного изобретения, конструкции по данному изобретению содержат по меньшей мере один регуляторный элемент, функционально связанный с молекулой транскрибируемой ДНК, функционально связанной с 3' UTR.[72] Various control elements may be included in the design, including any of those presented herein. Any such regulatory elements may be provided in combination with other regulatory elements. Such combinations can be developed or modified to achieve the desired regulatory characteristics. In one embodiment of the present invention, the constructs of the present invention comprise at least one regulatory element operably linked to a transcribed DNA molecule operably linked to the 3' UTR.
[73] Конструкции по данному изобретению могут включать любой промотор или лидерную последовательность, представленные в данном документе или известные в данной области техники. Например, промотор по изобретению может быть функционально связан с гетерологичной нетранслируемой 5'-лидерной последовательностью, такой как лидерная последовательность, происходящая от гена белка теплового шока. Альтернативно, лидерная последовательность по данному изобретению может быть функционально связана с гетерологичным промотором, таким как промотор 35S транскрипта вируса мозаики цветной капусты.[73] The constructs of this invention may include any promoter or leader sequence provided herein or known in the art. For example, a promoter of the invention may be operably linked to a heterologous untranslated 5' leader sequence, such as a leader sequence derived from a heat shock protein gene. Alternatively, the leader sequence of the present invention may be operably linked to a heterologous promoter, such as the cauliflower mosaic virus 35S transcript promoter.
[74] Экспрессионные кассеты могут также включать последовательность, кодирующую транзитный пептид, которая кодирует пептид, который полезен для субклеточного нацеливания функционально связанного белка, в частности, на хлоропласт, лейкопласт или другую пластидную органеллу; митохондрии; пероксисому; вакуоль; или внеклеточную локацию. Многие локализованные в хлоропласте белки экспрессируются из ядерных генов в качестве предшественников и нацелены на хлоропласт с помощью транзитного пептида хлоропласта (СТР). Примеры таких изолированных белков хлоропластов включают белки, связанные с малой субъединицей (SSU) рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, ферредоксин, ферредоксин оксидоредуктазу, белок I и белок II светособирающего комплекса, тиоредоксин F и энолпирувилшикимат фосфатсинтазу (EPSPS), но не ограничиваются ими. Транзитные пептиды хлоропластов описаны, например, в патенте США №7193133. Было продемонстрировано, что белки, не относящиеся к хлоропластам, могут быть нацелены на хлоропласт посредством экспрессии гетерологичного СТР, функционально связанного с трансгеном, кодирующим нехлоропластные белки. Молекулы транскрибируемой ДНК[74] Expression cassettes may also include a transit peptide coding sequence that encodes a peptide that is useful for subcellular targeting of an operably linked protein, in particular to a chloroplast, leucoplast or other plastid organelle; mitochondria; peroxisome; vacuole; or extracellular location. Many chloroplast-localized proteins are expressed from nuclear genes as precursors and targeted to the chloroplast by chloroplast transit peptide (CTP). Examples of such isolated chloroplast proteins include, but are not limited to, ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit (SSU) associated proteins, ferredoxin, ferredoxin oxidoreductase, light harvesting complex protein I and protein II, thioredoxin F, and enolpyruvyl shikimate phosphate synthase (EPSPS). Chloroplast transit peptides are described, for example, in US patent No. 7193133. It has been demonstrated that non-chloroplast proteins can be targeted to the chloroplast through the expression of heterologous CTP functionally linked to a transgene encoding non-chloroplast proteins. Transcribed DNA molecules
[75] В контексте данного документа, термин «молекула транскрибируемой ДНК» относится к любой молекуле ДНК, способной транскрибироваться в молекулу РНК, включая молекулы, имеющие последовательности, кодирующие белок, и молекулы, продуцирующие молекулы РНК, имеющие последовательности, применимые для подавления генов, но не ограничиваясь ими. Тип молекулы ДНК может включать молекулу ДНК из того же растения, молекулу ДНК из другого растения, молекулу ДНК из другого организма или синтетическую молекулу ДНК, такую как молекула ДНК, содержащая антисмысловое сообщение гена, или молекула ДНК, кодирующая искусственную, синтетическую или иным образом модифицированную версию трансгена, но не ограничивается ими. Иллюстративные молекулы транскрибируемой ДНК для включения в конструкции по данному изобретению включают, например, молекулы ДНК или гены из видов, отличных от видов, в которые включена молекула ДНК, или гены, которые происходят от того же вида или присутствуют у него, но являются включенными в клетки-реципиенты способами генной инженерии, а не классическими методами разведения.[75] As used herein, the term "transcribed DNA molecule" refers to any DNA molecule capable of being transcribed into an RNA molecule, including molecules having protein-coding sequences and molecules producing RNA molecules having sequences useful for gene silencing, but not limited to them. The type of DNA molecule may include a DNA molecule from the same plant, a DNA molecule from another plant, a DNA molecule from another organism, or a synthetic DNA molecule, such as a DNA molecule containing an antisense gene message, or a DNA molecule encoding an artificial, synthetic, or otherwise modified version of the transgene, but is not limited to them. Exemplary transcribed DNA molecules for inclusion in constructs of the present invention include, for example, DNA molecules or genes from species other than the species in which the DNA molecule is included, or genes that are derived from or present in the same species but are included in recipient cells using genetic engineering methods, rather than classical breeding methods.
[76] «Трансген» относится к молекуле транскрибируемой ДНК, гетерологичной клетке-хозяину по меньшей мере в отношении ее местоположения в геноме клетки-хозяина и/или молекуле транскрибируемой ДНК, искусственно включенной в геном клетки-хозяина в текущем или любом предыдущем поколении клетки.[76] "Transgene" refers to a transcribed DNA molecule heterologous to a host cell at least with respect to its location in the genome of the host cell and/or a transcribed DNA molecule artificially incorporated into the genome of the host cell in the current or any previous generation of the cell.
[77] Регуляторный элемент, такой как промотор по данному изобретению, может быть функционально связан с молекулой транскрибируемой ДНК, которая является гетерологичной по отношению к регуляторному элементу. В контексте данного документа, термин «гетерологичный» относится к комбинации двух или более молекул ДНК, когда такая комбинация обычно не встречается в природе. Например, две молекулы ДНК могут быть получены из разных видов и/или две молекулы ДНК могут быть получены из разных генов, например, из разных генов одного вида или из одних и тех же генов из разных видов. Таким образом, регуляторный элемент является гетерологичным по отношению к функционально связанной молекуле транскрибируемой ДНК, если такая комбинация обычно не встречается в природе, то есть, молекула транскрибируемой ДНК не встречается в природе функционально связанной с регуляторным элементом.[77] A regulatory element, such as a promoter of the present invention, can be operably linked to a transcribed DNA molecule that is heterologous to the regulatory element. As used herein, the term “heterologous” refers to a combination of two or more DNA molecules when such a combination is not normally found in nature. For example, two DNA molecules can be obtained from different species and/or two DNA molecules can be obtained from different genes, for example, from different genes of the same species or from the same genes from different species. Thus, a regulatory element is heterologous with respect to an operably linked transcribed DNA molecule if such combination does not normally occur in nature, that is, the transcribed DNA molecule does not occur in nature operably associated with a regulatory element.
[78] Молекула транскрибируемой ДНК обычно может быть любой молекулой ДНК, для которой желательна экспрессия транскрипта. Такая экспрессия транскрипта может привести к трансляции образующейся молекулы мРНК, и, следовательно, к экспрессии белка. В качестве альтернативы, например, молекула транскрибируемой ДНК может быть сконструирована так, чтобы в конечном итоге вызвать снижение экспрессии конкретного гена или белка. В одном варианте осуществления данного изобретения, это может быть достигнуто с использованием молекулы транскрибируемой ДНК, которая ориентирована в антисмысловом направлении. Обычный специалист в данной области технике знаком с использованием такой антисмысловой технологии. Таким образом любой ген может быть негативно регулирован, и в одном варианте осуществления данного изобретения молекула транскрибируемой ДНК может быть сконструирована для подавления конкретного гена посредством экспрессии молекулы дцРНК, миРНК или микроРНК.[78] The transcribed DNA molecule can generally be any DNA molecule for which expression of a transcript is desired. Such expression of the transcript can lead to translation of the resulting mRNA molecule, and hence to protein expression. Alternatively, for example, the transcribed DNA molecule may be engineered to ultimately cause a decrease in the expression of a particular gene or protein. In one embodiment of the present invention, this can be achieved using a transcribed DNA molecule that is oriented in the antisense direction. One of ordinary skill in the art is familiar with the use of such antisense technology. Thus, any gene can be down-regulated, and in one embodiment of the present invention, a transcribed DNA molecule can be engineered to suppress a particular gene through the expression of a dsRNA, siRNA, or microRNA molecule.
[79] Таким образом, один вариант осуществления данного изобретения представляет собой молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую регуляторный элемент по изобретению, такой как те, которые представлены как SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26, функционально связанную с гетерологичной молекулой транскрибируемой ДНК, чтобы модулировать транскрипцию молекулы транскрибируемой ДНК на желаемом уровне или в желаемом паттерне, когда конструкция интегрируется в геном трансгенной клетки растения. В одном варианте осуществления данного изобретения, молекула транскрибируемой ДНК содержит белок-кодирующий участок гена, а в другом варианте осуществления данного изобретения молекула транскрибируемой ДНК содержит антисмысловой участок гена. Гены представляющие агрономический интерес[79] Thus, one embodiment of the present invention is a recombinant DNA molecule containing a regulatory element of the invention, such as those set forth in SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26, operably linked to a heterologous transcribed molecule DNA to modulate the transcription of a transcribed DNA molecule at a desired level or in a desired pattern when the construct is integrated into the genome of a transgenic plant cell. In one embodiment of the present invention, the transcribed DNA molecule contains a protein-coding region of a gene, and in another embodiment of the present invention, the transcribed DNA molecule contains an antisense region of the gene. Genes of agronomic interest
[80] Молекула транскрибируемой ДНК может представлять собой ген, представляющий агрономический интерес. В контексте данного документа, термин «ген, представляющий агрономический интерес» относится к молекуле транскрибируемой ДНК, которая при экспрессии в конкретной растительной ткани, клетке или типе клеток придает желаемую характеристику. Продукт гена, представляющего агрономический интерес, может действовать внутри растения, чтобы оказывать влияние на морфологию, физиологию, рост, развитие, урожайность, состав зерна, профиль питания, устойчивость к болезням или вредителям и/или устойчивость к окружающей среде или химическим веществам или может действовать как пестицидный агент в рационе вредителя, питающегося растением. В одном варианте осуществления данного изобретения, регуляторный элемент изобретения включен в конструкцию, так что регуляторный элемент функционально связан с молекулой транскрибируемой ДНК, которая представляет собой ген, представляющий агрономический интерес. В трансгенном растении, содержащем такую конструкцию, экспрессия гена, представляющего агрономический интерес, может придавать полезный агрономический признак. Полезный агрономический признак может включать, например, толерантность к гербицидам, контроль насекомых, модифицированный урожай, устойчивость к болезням, устойчивость к патогенам, изменение роста и развития растений, модифицированное содержание крахмала, модифицированное содержание масла, модифицированное содержание жирных кислот, модифицированное содержание протеина, модифицированное созревание плодов, улучшенное питание животных и человека, производство биополимеров, устойчивость к стрессам окружающей среды, фармацевтические пептиды, улучшенные технологические качества, улучшенный вкус, пригодность по производству гибридных семян, улучшенное производство волокна и желаемое производство биотоплива, но не ограничиваясь ими.[80] The transcribed DNA molecule may represent a gene of agronomic interest. As used herein, the term “gene of agronomic interest” refers to a transcribed DNA molecule that, when expressed in a particular plant tissue, cell, or cell type, confers a desired characteristic. The product of a gene of agronomic interest may act within the plant to influence or act on morphology, physiology, growth, development, yield, grain composition, nutritional profile, disease or pest resistance, and/or environmental or chemical tolerance as a pesticide agent in the diet of a pest feeding on a plant. In one embodiment of the present invention, a regulatory element of the invention is included in the construct such that the regulatory element is operably linked to a transcribed DNA molecule that represents a gene of agronomic interest. In a transgenic plant containing such a construct, expression of a gene of agronomic interest may confer a useful agronomic trait. An agronomic benefit trait may include, for example, herbicide tolerance, insect control, modified yield, disease resistance, pathogen resistance, modified plant growth and development, modified starch content, modified oil content, modified fatty acid content, modified protein content, modified fruit ripening, improved animal and human nutrition, biopolymer production, resistance to environmental stress, pharmaceutical peptides, improved processing properties, improved taste, suitability for hybrid seed production, improved fiber production and desirable biofuel production, but not limited to.
[81] Неограничивающие примеры генов, представляющих агрономический интерес, известных в данной области техники, включают гены устойчивости к гербицидам (Патенты США №6803501; 6448476; 6248876; 6225114; 6107549; 5866775; 5804425; 5633435; и 5463175), повышенной урожайности (Патенты США № USRE38446; 6716474; 6663906; 6476295; 6441277; 6423828; 6399330; 6372211; 6235971; 6222098; и 5716837), контроля насекомых (Патенты США №6809078; 6713063; 6686452; 6657046; 6645497; 6642030; 6639054; 6620988; 6593293; 6555655; 6538109; 6537756; 6521442; 6501009; 6468523; 6326351; 6313378; 6284949; 6281016; 6248536; 6242241; 6221649; 6177615; 6156573; 6153814; 6110464; 6093695; 6063756; 6063597; 6023013; 5959091; 5942664; 5942658, 5880275; 5763245; и 5763241), устойчивости к грибковым заболеваниям (Патенты США №6653280; 6573361; 6506962; 6316407; 6215048; 5516671; 5773696; 6121436; 6316407; и 6506962), устойчивости к вирусам (Патенты США №6617496; 6608241; 6015940; 6013864; 5850023; и 5304730), устойчивости к нематодам (Патент США №6228992), устойчивости к бактериальным заболеваниям (Патент США №5516671), роста и развития растений (Патенты США №6723897 и 6518488), производства крахмала (Патенты США №6538181; 6538179; 6538178; 5750876; 6476295), производства модифицированных масел (Патенты США №6444876; 6426447; и 6380462), высокого производства масла (Патенты США №6495739; 5608149; 6483008; и 6476295), модифицированного содержания жирных кислот (Патенты США №6828475; 6822141; 6770465; 6706950; 6660849; 6596538; 6589767; 6537750; 6489461; и 6459018), высокого производства белка (Патент США №6380466), созревания плодов (Патент США №5512466), улучшенного питания животных и человека (Патенты США №6723837; 6653530; 6541259; 5985605; и 6171640), биополимеров (Патенты США № USRE37543; 6228623; и 5958745, и 6946588), устойчивости к стрессам окружающей среды (Патент США №6072103), фармацевтических пептидов и секретируемых пептидов (Патенты США №6812379; 6774283; 6140075; и 6080560), улучшенных характеристик обработки (Патент США №6476295), улучшенной усвояемости (Патент США №6531648) низкого содержания рафинозы (Патент США №6166292), промышленного производства ферментов (Патент США №5543576), улучшенного аромата (Патент США №6011199), азотфиксации (Патент США №5229114), производства гибридных семян (Патент США №5689041), производства волокна (Патенты США №6576818; 6271443; 5981834; и 5869720) и производства биотоплива (Патент США №5998700).[81] Non-limiting examples of genes of agronomic interest known in the art include herbicide resistance genes (US Patent No. 6803501; 6448476; 6248876; 6225114; 6107549; 5866775; 5804425; 5633435; and 5463175), increased yield (Patents US No. USRE38446; 6716474; 6663906; 6476295; 6441277; 6423828; 6399330; 6372211; 6235971; 6222098; and 5716837), insect control (US Patents No. 6809078; 671306 3; 6686452; 6657046; 6645497; 6642030; 6639054; 6620988; 6593293; 6555655; 6538109; 6537756; 6521442; 6501009; 6468523; 6326351; 6313378; 6284949; 6281016; 6248536; 6242241; 6221649; 617761 5; 6156573; 6153814; 6110464; 6093695; 6063756; 6063597; 6023013; 5959091; 5942664; 5942658, 5880275; 5763245; and 5763241), resistance to fungal diseases (US Patents No. 6653280; 6573361; 6506962; 6316407; 6215048; 5516671; 5773696; 6121436; 6316407; and 6506962), resistance to viruses (US Patents No. 6617496; 6608241; 6015940; 6013864 ; 5850023; and 5304730), nematode resistance (U.S. Patent No. 6228992), bacterial disease resistance (U.S. Patent No. 5516671), plant growth and development (U.S. Patents No. 6723897 and 6518488), starch production (U.S. Patent No. 6538181; 6538179; 6538178; 5750876; 6476295), modified oil production (US Patents 6444876; 6426447; and 6380462), high oil production (US Patents 6495739; 5608149; 6483008; and 6476295), modified fatty acid content (US Patents 6828475; 6822141; 67 70465; 6706950 ; 6660849; 6596538; 6589767; 6537750; 6489461; and 6459018), high protein production (US Patent No. 6380466), fruit ripening (US Patent No. 5512466), improved animal and human nutrition (US Patents No. 6723837; 6653530; 6541 259;5985605 ; and 6171640), biopolymers (US Patent No. USRE37543; 6228623; and 5958745, and 6946588), environmental stress tolerance (US Patent No. 6072103), pharmaceutical peptides and secreted peptides (US Patent No. 6812379; 6774283; 6140075; and 6 080560 ), improved processing characteristics (US Patent #6476295), improved digestibility (US Patent #6531648), low raffinose content (US Patent #6166292), industrial enzyme production (US Patent #5543576), improved aroma (US Patent #6011199), nitrogen fixation (US Patent No. 5229114), hybrid seed production (US Patent No. 5689041), fiber production (US Patent No. 6576818; 6271443; 5981834; and 5869720) and biofuel production (US Patent No. 5998700).
[82] Альтернативно, ген представляющий агрономический интерес, может влиять на вышеупомянутые характеристики или фенотипы растений путем кодирования молекулы РНК, которая вызывает целевую модуляцию экспрессии гена эндогенного гена, например, с помощью антисмысловой (см., например, Патент США 5107065); ингибирующей РНК («РНКи», включая модуляцию экспрессии генов с помощью микроРНК-, миРНК-, транс-действующих миРНК- и фазированных механизмов, опосредованных мРНК, например, как описано в опубликованных заявках США 2006/0200878 и США 2008/0066206, и в заявке на патент США 11/974469); или механизмов, опосредованных косупрессией. РНК также может быть каталитической молекулой РНК (например, рибозимом или рибопереключателем; см., например, США 2006/0200878), сконструированной для расщепления желаемого эндогенного продукта мРНК. В данной области техники известны способы конструирования и введения конструкций в клетку таким образом, чтобы молекула транскрибируемой ДНК транскрибировалась в молекулу, которая способна вызывать подавление гена.[82] Alternatively, a gene of agronomic interest may influence the above-mentioned plant characteristics or phenotypes by encoding an RNA molecule that causes targeted modulation of endogenous gene expression, for example, by antisense (see, for example, US Pat. No. 5,107,065); inhibitory RNA (“RNAi”, including modulation of gene expression by microRNA-, miRNA-, trans-acting miRNA- and phase-dependent mRNA-mediated mechanisms, for example, as described in published applications US 2006/0200878 and US 2008/0066206, and in US patent application 11/974469); or mechanisms mediated by cosuppression. RNA may also be a catalytic RNA molecule (eg, a ribozyme or riboswitch; see, for example, US 2006/0200878) designed to cleave the desired endogenous mRNA product. Methods are known in the art for constructing and introducing constructs into a cell such that a transcribed DNA molecule is transcribed into a molecule that is capable of causing gene silencing.
Селективные маркерыSelective markers
[83] Селективные маркерные трансгены также можно использовать с регуляторными элементами по изобретению. В контексте данного документа, термин «селективный маркерный трансген селективного маркера» относится к любой молекуле транскрибируемой ДНК, экспрессия которой в трансгенном растении, ткани или клетке или ее отсутствие может быть проверена или оценена каким-либо образом. Селективные маркерные гены и связанные с ними методы отбора и скрининга для применения на практике изобретения известны в данной области техники и включают молекулы транскрибируемой ДНК, кодирующие β-глюкуронидазу (GUS), зеленый флуоресцентный белок (GFP), белки, придающие устойчивость к антибиотикам, и белки, придающие устойчивость к гербицидам, но не ограничиваются ими. Примеры селективных маркерных трансгенов представлены как SEQ ID NO: 20 и 24. Трансформация клеток[83] Selectable marker transgenes can also be used with the regulatory elements of the invention. As used herein, the term “selectable marker selectable marker transgene” refers to any transcribed DNA molecule whose expression in the transgenic plant, tissue or cell, or lack thereof, can be tested or assessed in any way. Selectable marker genes and associated selection and screening methods for practice of the invention are known in the art and include transcribed DNA molecules encoding β-glucuronidase (GUS), green fluorescent protein (GFP), antibiotic resistance proteins, and proteins conferring, but not limited to, herbicide resistance. Examples of selectable marker transgenes are provided as SEQ ID NO: 20 and 24. Cell transformation
[84] Изобретение также направлено на способ получения трансформированных клеток и растений, которые содержат один или более регуляторных элементов, функционально связанных с молекулой транскрибируемой ДНК.[84] The invention is also directed to a method for producing transformed cells and plants that contain one or more regulatory elements operably linked to a transcribed DNA molecule.
[85] Термин «трансформация» относится к введению молекулы ДНК хозяину-реципиенту. В контексте данного документа, термин «хозяин» относится к бактериям, грибам или растениям, включая любые клетки, ткани, органы или потомство бактерий, грибов или растений. Ткани и клетки растений, представляющие особый интерес, включают протопласты, каллус, корни, клубни, семена, стебли, листья, проростки, зародыши и пыльцу.[85] The term "transformation" refers to the introduction of a DNA molecule into a recipient host. As used herein, the term “host” refers to bacteria, fungi or plants, including any cells, tissues, organs or progeny of bacteria, fungi or plants. Plant tissues and cells of particular interest include protoplasts, callus, roots, tubers, seeds, stems, leaves, seedlings, embryos, and pollen.
[86] В контексте данного документа, термин «трансформированный» относится к клетке, ткани, органу или организму, в которые была введена чужеродная молекула ДНК, такая как конструкция. Введенная молекула ДНК может быть интегрирована в геномную ДНК реципиентной клетки, ткани, органа или организма, так что введенная молекула ДНК наследуется последующим потомством. «Трансгенная» или «трансформированная» клетка или организм может также включать потомство клетки или организма и потомство, полученное в результате программы скрещивания, в которой такой трансгенный организм используется в качестве родителя в скрещивании и проявляет измененный фенотип в результате присутствия чужеродной молекулы ДНК. Введенная молекула ДНК может также в течение короткого времени вводиться в реципиентную клетку, так что введенная молекула ДНК не наследуется последующим потомством. Термин «трансгенный» относится к бактерии, грибку или растению, содержащим одну или более гетерологичных молекул ДНК.[86] As used herein, the term “transformed” refers to a cell, tissue, organ or organism into which a foreign DNA molecule, such as a construct, has been introduced. The introduced DNA molecule may be integrated into the genomic DNA of the recipient cell, tissue, organ or organism such that the introduced DNA molecule is inherited by subsequent offspring. A "transgenic" or "transformed" cell or organism may also include progeny of the cell or organism and progeny resulting from a crossbreeding program in which such transgenic organism is used as a parent in the cross and exhibits an altered phenotype as a result of the presence of a foreign DNA molecule. The introduced DNA molecule can also be introduced into the recipient cell for a short time, so that the introduced DNA molecule is not inherited by subsequent offspring. The term "transgenic" refers to a bacterium, fungus or plant containing one or more heterologous DNA molecules.
[87] Существует много способов, хорошо известных специалистам в данной области техники для введения молекул ДНК в клетки растений. Процесс обычно включает этапы выбора подходящей клетки-хозяина, трансформации клетки-хозяина с помощью вектора и получения трансформированной клетки-хозяина. Способы и материалы для трансформации растительных клеток путем введения растительной конструкции в геном растения в практике данного изобретения могут включать любой из хорошо известных и продемонстрированных способов. Подходящие способы включают бактериальную инфекцию (например, Agrobacterium), бинарные векторы ВАС, прямую доставку ДНК (например, посредством ПЭГ-опосредованной трансформации, дессикации/опосредованного ингибированием захвата ДНК, электропорации, перемешивание с волокнами карбида кремния и ускорение частиц, покрытых ДНК), редактирование генов (например, системы CRISPR-Cas) и другие, но не ограничиваются ими.[87] There are many methods well known to those skilled in the art for introducing DNA molecules into plant cells. The process typically includes the steps of selecting a suitable host cell, transforming the host cell with a vector, and obtaining a transformed host cell. Methods and materials for transforming plant cells by introducing a plant construct into the plant genome in the practice of this invention may include any of the well known and demonstrated methods. Suitable methods include bacterial infection (eg, Agrobacterium), BAC binary vectors, direct DNA delivery (eg, via PEG-mediated transformation, desiccation/inhibition-mediated DNA uptake, electroporation, silicon carbide fiber mixing and acceleration of DNA-coated particles), editing genes (for example, CRISPR-Cas systems) and others, but are not limited to them.
[88] Клетки-хозяева могут быть любой клеткой или организмом, например, клеткой растения, клеткой водорослей, водорослями, клеткой грибов, грибами, бактериальной клеткой или клеткой насекомого. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения, клетки-хозяева и трансформированные клетки могут включать клетки культурных растений.[88] The host cells can be any cell or organism, such as a plant cell, an algal cell, an algae, a fungal cell, a fungus, a bacterial cell, or an insect cell. In specific embodiments of the present invention, host cells and transformed cells may include crop cells.
[89] Впоследствии трансгенное растение можно регенерировать из клетки трансгенного растения по изобретению. Используя обычные методы скрещивания или самоопыление, из этого трансгенного растения можно получить семена. Такие семена и полученное в результате растение-потомок, выращенное из таких семян, будут содержать молекулу рекомбинантной ДНК по изобретению и, следовательно, будут трансгенными.[89] Subsequently, the transgenic plant can be regenerated from the cell of the transgenic plant according to the invention. Using conventional crossing methods or selfing, seeds can be obtained from this transgenic plant. Such seeds and the resulting progeny plant grown from such seeds will contain a recombinant DNA molecule of the invention and will therefore be transgenic.
[90] Трансгенные растения по данному изобретению можно самоопылять для получения семян в случае гомозиготных трансгенных растений по изобретению (гомозиготных по молекуле рекомбинантной ДНК) или скрещивать с нетрансгенными растениями или различными трансгенными растениями для получения семян в случае гетерозиготных трансгенных растений по изобретению (гетерозиготный по молекуле рекомбинантной ДНК). И такие гомозиготные, и гетерозиготные трансгенные растения упоминаются в данном документе как «растения-потомки». Растения-потомки представляют собой трансгенные растения, происходящие от исходного трансгенного растения и содержащие молекулу рекомбинантной ДНК по изобретению. Семена, полученные с использованием трансгенного растения по изобретению, можно собирать и использовать для выращивания поколений трансгенных растений, то есть, растений потомков по изобретению, содержащих конструкцию по данному изобретению и экспрессирующих ген, представляющий агрономический интерес. Описание способов разведения, которые обычно используются для разных культур, можно найти в одном из нескольких справочников, см., например,, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory и Technique, (Vol. 1) и Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).[90] Transgenic plants of the present invention can be self-pollinated to produce seeds in the case of homozygous transgenic plants of the invention (homozygous for the recombinant DNA molecule) or crossed with non-transgenic plants or various transgenic plants to produce seeds in the case of heterozygous transgenic plants of the invention (heterozygous for the molecule recombinant DNA). Both such homozygous and heterozygous transgenic plants are referred to herein as “progeny plants.” Progeny plants are transgenic plants derived from the original transgenic plant and containing a recombinant DNA molecule of the invention. Seeds produced using a transgenic plant of the invention can be harvested and used to grow generations of transgenic plants, that is, progeny plants of the invention containing a construct of the invention and expressing a gene of agronomic interest. A description of the breeding methods commonly used for different crops can be found in one of several reference books, see, for example, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50- 98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).
[91] Трансформированные растения могут быть проанализированы на наличие гена или генов представляющих интерес, а также на уровень экспрессии и/или профиль, обеспечиваемый регуляторными элементами изобретения. Специалистам в данной области техники известны многочисленные способы, доступные для анализа трансформированных растений. Например, способы анализа растений включают Саузерн-блоттинг или Нозерн-блоттинг, подходы на основе ПЦР, биохимические анализы, методы фенотипического скрининга, полевые оценки и иммунодиагностические анализы, но не ограничиваются ими. Экспрессию молекулы транскрибируемой ДНК можно измерить с использованием реагентов TaqMan® (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния), способов, описанных производителем, и времени цикла ПЦР, определенного с использованием матрицы тестирования TaqMan®. Альтернативно для оценки экспрессии трансгена можно использовать реагенты и способы Invader® (Third Wave Technologies, Мэдисон, Висконсин), как описано производителем.[91] Transformed plants can be analyzed for the presence of the gene or genes of interest, as well as the expression level and/or profile provided by the regulatory elements of the invention. Those skilled in the art are aware of numerous methods available for analyzing transformed plants. For example, methods for analyzing plants include, but are not limited to, Southern blotting or Northern blotting, PCR-based approaches, biochemical assays, phenotypic screening methods, field assessments, and immunodiagnostic assays. Expression of a transcribed DNA molecule can be measured using TaqMan® reagents (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), methods described by the manufacturer, and PCR cycle times determined using a TaqMan® test matrix. Alternatively, Invader® reagents and methods (Third Wave Technologies, Madison, WI) can be used to assess transgene expression as described by the manufacturer.
[92] Изобретение также относится к частям растения по данному изобретению. Части растения включают листья, стебли, корни, клубни, семена, эндосперм, семяпочки и пыльцу, но не ограничиваются ими. Части растений по изобретению могут быть жизнеспособными, нежизнеспособными, регенерируемыми и/или невозобновляемыми. Изобретение также относится к и обеспечивает трансформированные растительные клетки, содержащие молекулу ДНК по изобретению. Трансформированные или трансгенные клетки растения по изобретению включают регенерируемые и/или нерегенерируемые клетки растения.[92] The invention also relates to plant parts according to the invention. Plant parts include, but are not limited to, leaves, stems, roots, tubers, seeds, endosperm, ovules, and pollen. The plant parts of the invention may be viable, non-viable, regenerable and/or non-renewable. The invention also relates to and provides transformed plant cells containing the DNA molecule of the invention. The transformed or transgenic plant cells of the invention include regenerable and/or non-regenerable plant cells.
[93] Изобретение также относится к товарному продукту, который получают из трансгенного растения или его части, содержащего молекулу рекомбинантной ДНК по изобретению. Товарные продукты по изобретению содержат определяемое количество ДНК, содержащей последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-19 и SEQ ID NO: 26. В контексте данного документа, термин «товарный продукт» относится к любой композиции или продукту, который состоит из материала, полученного из трансгенного растения, семени, клетки растения или части растения, содержащей молекулу рекомбинантной ДНК по изобретению. Товарные продукты включают обработанные семена, зерно, части растений и муку, но не ограничиваются ими. Товарный продукт по изобретению будет содержать определяемое количество ДНК, соответствующей молекуле рекомбинантной ДНК по изобретению. Обнаружение одной или более таких ДНК в образце можно использовать для определения содержания или источника товарного продукта. Можно использовать любой стандартный способ обнаружения молекул ДНК, включая описанные в данном документе способы обнаружения.[93] The invention also relates to a commercial product that is obtained from a transgenic plant or part thereof containing a recombinant DNA molecule according to the invention. The commercial products of the invention contain a detectable amount of DNA containing a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-19 and SEQ ID NO: 26. As used herein, the term “commercial product” refers to any composition or product that which consists of material obtained from a transgenic plant, seed, plant cell or plant part containing a recombinant DNA molecule of the invention. Commodity products include, but are not limited to, processed seeds, grains, plant parts and flour. The commercial product of the invention will contain a detectable amount of DNA corresponding to the recombinant DNA molecule of the invention. The detection of one or more such DNA in a sample can be used to determine the content or source of a commercial product. Any standard method for detecting DNA molecules can be used, including the detection methods described herein.
[94] Изобретение можно более легко понять, обратившись к нижеследующим примерам, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения, если не указано иное. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методы, описанные в следующих примерах, представляют собой методы, открытые изобретателями, чтобы хорошо функционировать при практическом применении изобретения. Однако специалисты в данной области техники должны, в свете данного описания, принять во внимание, что многие изменения могут быть внесены в конкретные описанные варианты осуществления данного изобретения, и по-прежнему можно получать подобный или аналогичный результат без отклонения от сущности и объема изобретения, поэтому все материалы, изложенные или показанные на прилагаемых графических материалах, следует интерпретировать как иллюстративные, а не в ограничивающем смысле.[94] The invention may be more readily understood by reference to the following examples, which are given by way of illustration and are not intended to limit the invention unless otherwise indicated. Those skilled in the art will appreciate that the methods described in the following examples are methods discovered by the inventors to function well in the practice of the invention. However, those skilled in the art should, in light of this description, appreciate that many changes may be made to the specific embodiments of the present invention described and it may still be possible to obtain a similar or similar result without departing from the spirit and scope of the invention, therefore All material set forth or shown in the accompanying graphics should be interpreted as illustrative and not in a limiting sense.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1Example 1
Создание, синтез и клонирование синтетических регуляторных элементовCreation, synthesis and cloning of synthetic regulatory elements
[95] Новые синтетические регуляторные элементы транскрипции представляют собой элементы синтетической экспрессии, разработанные с помощью алгоритмических способов. Эти разработанные с помощью вычислений регуляторные элементы были химически синтезированы и клонированы для создания синтетических групп регуляторных элементов экспрессии (ЕХР). Свыше 1000 синтетических регуляторных элементов были разработаны и исследованы в протопластах кукурузы и стабильно трансформированных растениях кукурузы для выявления тех синтетических регуляторных элементов, которые обеспечивают желаемые характеристики, такие как уровни экспрессии белка и паттерны экспрессии. Синтетические элементы по данному изобретению обеспечивают различные паттерны конститутивной экспрессии, пригодные для управления экспрессией многих различных кодирующих последовательностей и интерферирующих РНК, представляющих агрономический интерес.[95] Novel synthetic transcription regulatory elements are synthetic expression elements designed using algorithmic methods. These computationally designed regulatory elements were chemically synthesized and cloned to create synthetic groups of expression regulatory elements (EXRs). Over 1000 synthetic regulatory elements have been designed and screened in maize protoplasts and stably transformed maize plants to identify those synthetic regulatory elements that produce desired characteristics, such as protein expression levels and expression patterns. The synthetic elements of this invention provide a variety of constitutive expression patterns suitable for directing the expression of many different coding sequences and interfering RNAs of agronomic interest.
[96] Разработанные синтетические регуляторные элементы транскрипции не обладают расширенной гомологией с какими-либо известными последовательностями нуклеиновых кислот, которые существуют в природе, но влияют на транскрипцию функционально связанной кодирующей последовательности так же, как природные промоторы, лидеры, интроны и 3' UTR. Синтетические ЕХР и их соответствующие синтетические промоторы, лидеры и интроны, а также синтетические 3' UTR представлены в таблице 1. Синтетические ЕХР были клонированы с использованием способов, известных в данной области техники, в бинарные векторы трансформации растений, функционально связанные с β-глюкуронидазой (GUS), а также оценивали уровни и паттерны экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы.[96] The developed synthetic transcriptional regulatory elements do not have extensive homology to any known nucleic acid sequences that exist in nature, but affect the transcription of an operably linked coding sequence in the same way as natural promoters, leaders, introns and 3' UTRs. Synthetic EXPs and their corresponding synthetic promoters, leaders and introns, as well as synthetic 3' UTRs are presented in Table 1. Synthetic EXPs were cloned using methods known in the art into binary plant transformation vectors operably linked to β-glucuronidase ( GUS), and the levels and patterns of expression in stably transformed maize plants were assessed.
[97] Анализ регуляторного элемента TSS и сплайсинговых соединений интрон/экзона может быть выполнен с использованием трансформированной растительной ткани. Вкратце, растения трансформировали векторами экспрессии для растений, содержащими клонированные фрагменты ДНК, функционально связанные с гетерологичной молекулой транскрибируемой ДНК. Затем была использована система 5' RACE для быстрой амплификации концов кДНК, версия 2.0 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния 92008), для подтверждения TSS регуляторного элемента и сплайсинговых соединений интрон/экзон путем анализа последовательности ДНК полученных транскриптов мРНК. Синтетические 3' UTR были охарактеризованы по их влиянию на экспрессию генов, а также на правильную терминацию транскрипта.[97] Analysis of the TSS regulatory element and intron/exon splice junctions can be performed using transformed plant tissue. Briefly, plants were transformed with plant expression vectors containing cloned DNA fragments operably linked to a heterologous transcribed DNA molecule. The 5′ RACE Rapid Amplification of cDNA Ends System, version 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008) was then used to confirm the TSS of the regulatory element and intron/exon splice junctions by DNA sequence analysis of the resulting mRNA transcripts. Synthetic 3' UTRs have been characterized for their effects on gene expression as well as proper transcript termination.
[98] В дополнение к синтетическим экспрессионным элементам в данном документе представлен новый эндогенный 3' UTR, полученный из гена неспецифического белка-переносчика липидов 4 Sorghum bicolor, T-Sb.Nltp4-1:1:2, который предложен в данном документе и представлен как SEQ ID NO: 19. T-Sb.Nltp4-1:1:2 был охарактеризован аналогично синтетическому 3' UTR.[98] In addition to the synthetic expression elements, a novel endogenous 3' UTR derived from the Sorghum bicolor nonspecific lipid transfer protein 4 gene, T-Sb.Nltp4-1:1:2, is proposed herein and presented as SEQ ID NO: 19. T-Sb.Nltp4-1:1:2 was characterized similarly to the synthetic 3' UTR.
Пример 2Example 2
Анализ синтетических регуляторных элементов, управляющих GUS в протопластах листьев кукурузыAnalysis of synthetic regulatory elements that control GUS in maize leaf protoplasts
[99] Протопласты листьев кукурузы трансформировали векторами, в частности векторами экспрессии, содержащими тестируемый регуляторный элемент, управляющий экспрессией трансгена β-глюкуронидазы (GUS). Полученные трансформированные протопласты листьев кукурузы анализировали на экспрессию белка GUS, чтобы оценить влияние выбранных регуляторных элементов на экспрессию.[99] Maize leaf protoplasts were transformed with vectors, in particular expression vectors containing a test regulatory element driving the expression of a β-glucuronidase (GUS) transgene. The resulting transformed maize leaf protoplasts were analyzed for GUS protein expression to assess the influence of selected regulatory elements on expression.
[100] Протопласты кукурузы, полученные из ткани листа, трансформировали векторами экспрессии, содержащими синтетические экспрессионные элементы. Уровень и паттерн экспрессии этих синтетических векторов экспрессионных элементов в протопластах кукурузы сравнивали с уровнем и паттерном экспрессии экспрессионных элементов, известными в данной области техники. Отдельные эксперименты были проведены для оценки активности ЕХР, EXP-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 1) и EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6), интронов I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) и I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), и 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) и T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14). Экспрессионные элементы клонировали в векторы экспрессии и функционально связывали с последовательностью, кодирующей GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1 (SEQ ID NO: 24), которая содержала процессируеммый интрон. Контрольные векторы экспрессии содержали различные конфигурации известных экспрессионных элементов, которые варьировались в зависимости от типа оцениваемого элемента (ЕХР, интрон или 3' UTR). Плазмиду, используемую для совместной трансформации протопластов и нормализации данных, также конструировали с использованием способов, известных в данной области техники. Она содержала трансгенную кассету, состоящую из ЕХР, EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO: 21) функционально связанного с 5'-концом кодирующей последовательности, кодирующей флуоресцентный белок люциферазы NanoLuc® (Promega, Мэдисон, WI 53711), упоминаемый в данном документе Nluc (SEQ ID NO: 25), который был функционально связан с 5'-концом 3' UTR, T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO: 23).[100] Maize protoplasts obtained from leaf tissue were transformed with expression vectors containing synthetic expression elements. The level and pattern of expression of these synthetic expression element vectors in maize protoplasts was compared with the level and pattern of expression of expression elements known in the art. Separate experiments were performed to evaluate the activity of EXP, EXP-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 1) and EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6), introns I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) and I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), and 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) and T-Zm.GST18.nno: 2 (SEQ ID NO: 14). Expression elements were cloned into expression vectors and operably linked to the GUS coding sequence, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1 (SEQ ID NO: 24), which contained a processable intron. Control expression vectors contained different configurations of known expression elements, which varied depending on the type of element assessed (EXP, intron or 3' UTR). The plasmid used for protoplast co-transformation and data normalization was also constructed using methods known in the art. It contained a transgene cassette consisting of an EXP, EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO: 21) operably linked to the 5' end of the coding sequence encoding the NanoLuc® fluorescent luciferase protein (Promega, Madison, WI 53711) referred to herein Nluc (SEQ ID NO: 25), which was operably linked to the 5' end of the 3' UTR, T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO: 23).
[101] Протопласты листьев кукурузы трансформировали с использованием способа трансформации на основе ПЭГ, аналогичного способам, известным в данной области техники. Клетки протопластов трансформировали в формате девяноста шести (96) лунок. Двенадцать (12) микрограмм ДНК тестового вектора или ДНК контрольного вектора и шесть (6) микрограмм векторной ДНК NanoLuc® использовали для трансформации 3,2×105 протопластов на лунку. После трансформации протопласты инкубировали при 25°С в темноте от шестнадцати до двадцати часов. После инкубации протопласты лизировали, и лизат использовали для измерения экспрессии люциферазы и GUS. Чтобы лизировать клетки, клетки в планшете осаждали центрифугированием, промывали, ресуспендировали в меньшем объеме и переносили в лунки пробирок в виде полосок. Пробирки снова центрифугировали и супернатант аспирировали, оставляя осадок клеток протопластов. Осадок клеток ресуспендировали в буфере QB (100 мМ KPO4, рН 7,8; 1 мМ ЭДТА; 1% Тритон Х-100; 10% глицерин; 1 мМ DTT). Клетки лизировали, энергично пипетируя клетки несколько раз, встряхивая пробирки и давая пробиркам инкубироваться на льду в течение пяти минут. Затем лизат центрифугировали для осаждения клеточного дебриса. Затем полученный лизат переносили в чистый планшет.[101] Corn leaf protoplasts were transformed using a PEG-based transformation method similar to methods known in the art. Protoplast cells were transformed in a ninety-six (96) well format. Twelve (12) micrograms of test vector DNA or control vector DNA and six (6) micrograms of NanoLuc ® vector DNA were used to transform 3.2 x 10 5 protoplasts per well. After transformation, the protoplasts were incubated at 25°C in the dark for sixteen to twenty hours. After incubation, protoplasts were lysed and the lysate was used to measure luciferase and GUS expression. To lyse cells, cells in the plate were pelleted by centrifugation, washed, resuspended in a smaller volume, and transferred to the wells of strip tubes. The tubes were centrifuged again and the supernatant was aspirated, leaving a pellet of protoplast cells. The cell pellet was resuspended in QB buffer (100 mM KPO 4 , pH 7.8; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 10% glycerol; 1 mM DTT). Cells were lysed by vigorously pipetting the cells several times, shaking the tubes, and allowing the tubes to incubate on ice for five minutes. The lysate was then centrifuged to pellet cell debris. The resulting lysate was then transferred to a clean plate.
[102] Люциферазную активность анализировали с использованием субстрата для анализа люциферазы Nano-Glo® (Promega, Мэдисон, WI 53711) в буфере QB. Вкратце, небольшой объем лизата, буфер QB и раствор субстрата для анализа люциферазы Nano-Glo®/QB смешивали вместе в белых девяносто шести (96) луночных планшетах. Затем флуоресценцию измеряли с использованием планшет-ридера PHERAstar® (BMG LABTECH Inc., Cary, NC 27513).[102] Luciferase activity was assayed using Nano-Glo ® Luciferase Assay Substrate (Promega, Madison, WI 53711) in QB buffer. Briefly, a small volume of lysate, QB buffer, and Nano-Glo ® /QB luciferase assay substrate solution were mixed together in white ninety-six (96) well plates. Fluorescence was then measured using a PHERAstar ® plate reader (BMG LABTECH Inc., Cary, NC 27513).
[103] Активность GUS анализировали с использованием флуорогенного субстрата 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида (MUG) в общем реакционном объеме пятьдесят (50) микролитров. Продукт реакции, 4-метилумбеллиферон (4-MU), максимально флуоресцирует при высоком рН, когда гидроксильная группа ионизируется. Добавление щелочного раствора карбоната натрия одновременно останавливает анализ и регулирует рН для количественного определения флуоресцентного продукта. Аликвоту лизата смешивали с аликвотой MUG, растворенной в буфере QB, и инкубировали при 37°С. Небольшую аликвоту реакционной смеси лизат/MUG удаляли и добавляли в стоп-буфер в трех различных временных точках: (1) сразу после смешивания реакции лизат/MUG как «время ноль минут»; (2) двадцать минут; и (3) шестьдесят минут. Флуоресценцию измеряли при возбуждении при 355 нм, эмиссии при 460 нм, используя планшет-ридер PHERAstar® (BMG LABTECH Inc., Кэри, NC 27513). Уровень экспрессии выражается как «нМ гидролизованного MUG», что выводится из стандартной кривой для планшета.[103] GUS activity was assayed using the fluorogenic substrate 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) in a total reaction volume of fifty (50) microliters. The reaction product, 4-methylumbelliferone (4-MU), fluoresces maximally at high pH when the hydroxyl group is ionized. The addition of an alkaline sodium carbonate solution simultaneously stops the assay and adjusts the pH to quantify the fluorescent product. An aliquot of the lysate was mixed with an aliquot of MUG dissolved in QB buffer and incubated at 37°C. A small aliquot of the lysate/MUG reaction mixture was removed and added to stop buffer at three different time points: (1) immediately after mixing the lysate/MUG reaction as “time zero minutes”; (2) twenty minutes; and (3) sixty minutes. Fluorescence was measured at excitation at 355 nm, emission at 460 nm using a PHERAstar® plate reader (BMG LABTECH Inc., Cary, NC 27513). The expression level is expressed as “nM hydrolyzed MUG”, which is derived from the standard plate curve.
[104] Для каждого планшета каждую конструкцию трансформируют в четырех (4) -восьми (8) лунках. Из каждой трансформации брали аликвоту для анализа MUG, и «нМ гидролизованного MUG» получали из стандартной кривой для планшета. Аликвоту также отбирали из каждой трансформации для считывания NanoLuc® (NanoLuc® RLU). Среднее значение нМ гидролизованного MUG/NanoLuc® RLU для каждой конструкции, нормализовали по отношению к конструкции EXP-CaMV.35S/ I-Zm.DnaK:1/ T-Os.LTP:1, которая принята за 100%.[104] For each plate, each construct is transformed in four (4) to eight (8) wells. An aliquot was taken from each transformation for MUG analysis, and “nM hydrolyzed MUG” was obtained from the standard plate curve. An aliquot was also taken from each transformation for a NanoLuc® read (NanoLuc® RLU). The average nM value of hydrolyzed MUG/NanoLuc® RLU for each construct was normalized to the EXP-CaMV.35S/ I-Zm.DnaK:1/ T-Os.LTP:1 construct, which was set to 100%.
Анализ экспрессии GUS в протопластах листьев кукурузы, управляемой синтетическим ЕХР, EXP-Zm.GSP850.Analysis of GUS expression in synthetic EXP-driven maize leaf protoplasts, EXP-Zm.GSP850.
[105] Клетки протопластов листьев кукурузы трансформировали векторами экспрессии, которые были сконструированы с использованием способов, известных в данной области техники, содержащих экспрессионные элементы, управляющие экспрессией GUS. Два (2) тестовых вектора экспрессии содержали трансгенные кассеты, содержащие синтетический ЕХР, EXP-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 1). Синтетический EXP-Zm.GSP850 состоит из синтетического промотора Р-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), функционально связанного с 5' -концом синтетической лидерной последовательности L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3). Первый тестовый вектор содержал EXP-Zm.GSP850, функционально связанный 5'-концом с кодирующей последовательностью, кодирующей GUS (SEQ ID NO: 24), которая содержит процессируемый интрон, который функционально связан с 5' -концом 3' UTR, T-Os.LTP:l (SEQ ID NO: 23). Вторая трансгенная кассета содержала EXP-Zm.GSP850, функционально связанный с 5'-концом интрона I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22), функционально связанным с 5'-концом кодирующей последовательности GUS, которая функционально связана с 5'-концом 3' UTR, T-Os.LTP:1.[105] Corn leaf protoplast cells were transformed with expression vectors that were constructed using methods known in the art to contain expression elements that direct GUS expression. Two (2) test expression vectors contained transgene cassettes containing synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 1). Synthetic EXP-Zm.GSP850 consists of the synthetic promoter P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) operably linked to the 5' end of the synthetic leader sequence L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO : 3). The first test vector contained EXP-Zm.GSP850 operably linked at the 5' end to a coding sequence encoding GUS (SEQ ID NO: 24), which contains a processable intron that is operably linked to the 5' end of the 3' UTR, T-Os .LTP:l (SEQ ID NO: 23). The second transgene cassette contained EXP-Zm.GSP850 operably linked to the 5' end of the I-Zm.DnaK:1 intron (SEQ ID NO: 22) operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' -end of 3' UTR, T-Os.LTP:1.
[106] Также были сконструированы три (3) контрольных вектора экспрессии, которые использовали для трансформации протопластов листьев кукурузы. Первый контрольный вектор экспрессии содержал трансгенную кассету без промотора и состоял из интрона, I-Zm.DnaK:1, функционально связанного с 5'-концом кодирующей последовательности GUS, которая функционально связана с 5'-концом 3' UTR, Т-Os.LTP:1. Второй контрольный вектор содержал трансгенную кассету без интрона и состоял из ЕХР, EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO: 21), функционально связанного с 5'-концом кодирующей последовательности GUS, которая функционально связана с 5' -концом 3' UTR, T-Os.LTP:1. Третий контрольный вектор содержал трансгенную кассету, которая содержала ЕХР, EXP-CaMV.35S, функционально связанный с 5'-концом интрона I-Zm.DnaK:1, функционально связанным с 5'-концом кодирующей последовательностью GUS, которая функционально связана с 5' -концом 3' UTR, Т-Os.LTP:1.[106] Three (3) control expression vectors were also constructed and used to transform maize leaf protoplasts. The first control expression vector contained a promoterless transgene cassette and consisted of an intron, I-Zm.DnaK:1, operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' end of the 3' UTR, T-Os.LTP :1. The second control vector contained a transgene cassette without an intron and consisted of EXP, EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO: 21), operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' end of the 3' UTR, T -Os.LTP:1. The third control vector contained a transgene cassette that contained an EXP, EXP-CaMV.35S, operably linked to the 5' end of the I-Zm.DnaK:1 intron, operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' -end of the 3' UTR, T-Os.LTP:1.
[107] Протопласты листьев кукурузы трансформировали всеми пятью (5) векторами. Трансформацию и лизис клеток протопласта выполняли, как описано в данном документе. Экспрессию люциферазы и GUS анализировали, как описано в данном документе. В таблице 2 показана проанализированная средняя экспрессия GUS и которая выражена в виде процента экспрессии относительно третьего контрольного вектора экспрессии, который включает EXP-CaMV.35S и I-Zm.DnaK:1, управляющий GUS.[107] Maize leaf protoplasts were transformed with all five (5) vectors. Transformation and lysis of protoplast cells were performed as described herein. Luciferase and GUS expression were analyzed as described herein. Table 2 shows the average GUS expression analyzed and expressed as a percentage of expression relative to a third control expression vector that includes EXP-CaMV.35S and I-Zm.DnaK:1 driving GUS.
[108] Как видно из таблицы 2 выше, EXP-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 1) был способен управлять экспрессией трансгена GUS в протопластах листьев кукурузы по сравнению с клетками протопластов листьев кукурузы, трансформированных конструкцией без промотора.[108] As seen in Table 2 above, EXP-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 1) was able to drive GUS transgene expression in maize leaf protoplasts compared to maize leaf protoplast cells transformed with the promoterless construct.
Анализ экспрессии GUS в протопластах листьев кукурузы, управляемой синтетическим ЕХР, EXP-Zm.GSP990.Analysis of GUS expression in synthetic EXP-driven maize leaf protoplasts, EXP-Zm.GSP990.
[109] Клетки протопластов листьев кукурузы трансформировали векторами экспрессии, которые были сконструированы содержащими экспрессионные элементы, управляющие экспрессией GUS. Тестовый вектор экспрессии содержал трансгенную кассету, которая содержала синтетический ЕХР, EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6), функционально связанный с 5'-концом интрона I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22), функционально связанным с 5'-концом кодирующей последовательности, кодирующей GUS (SEQ ID NO: 20), которая функционально связана с 5'-концом 3' UTR, Т-Os.LTP:1. Синтетический EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6) состоит из синтетического промотора P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), функционально связанного с 5'-концом синтетической лидерной последовательности L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8). Три контрольных вектора экспрессии также трансформировали в протопласты листьев кукурузы и конструировали, как описано выше. В таблице 3 показан средний процент экспрессии относительно третьего контрольного вектора экспрессии, который содержит EXP-CaMV.35S и I-Zm.DnaK:1, управляющий GUS.[109] Maize leaf protoplast cells were transformed with expression vectors that were engineered to contain expression elements that drive GUS expression. The test expression vector contained a transgene cassette that contained a synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6), operably linked to the 5' end of the I-Zm.DnaK:1 intron (SEQ ID NO: 22), operably linked with the 5' end of the coding sequence encoding GUS (SEQ ID NO: 20), which is operably linked to the 5' end of the 3' UTR, T-Os.LTP:1. Synthetic EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6) consists of the synthetic promoter P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7) operably linked to the 5' end of the synthetic leader sequence L-Zm.GSP990. nno:1 (SEQ ID NO: 8). Three control expression vectors were also transformed into maize leaf protoplasts and constructed as described above. Table 3 shows the average percent expression relative to a third control expression vector that contains EXP-CaMV.35S and I-Zm.DnaK:1 driving GUS.
[110] Как видно из таблицы 3 выше, EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6) был способен управлять экспрессией трансгена GUS в протопластах листьев кукурузы по сравнению с клетками протопластов листьев кукурузы, трансформированных конструкцией без промотора.[110] As seen in Table 3 above, EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6) was able to drive GUS transgene expression in maize leaf protoplasts compared to maize leaf protoplast cells transformed with the promoterless construct.
Анализ усиления экспрессии GUS синтетическим интроном I-Zm.GSI153.nno:1Analysis of enhanced GUS expression by the synthetic intron I-Zm.GSI153.nno:1
[111] Клетки протопластов листьев кукурузы трансформировали векторами экспрессии, которые были сконструированы содержащими экспрессионные элементы, управляющие экспрессией GUS. Тестируемый вектор экспрессии использовали для анализа усиления экспрессии GUS синтетическим интроном I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), управляемым EXP-CaMV.35. Трансгенная кассета содержала ЕХР, ЕХР-CaMV.35, функционально связанный 5'-концом с синтетическим интроном, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), функционально связанным 5'-концом с кодирующей последовательностью, кодирующей GUS (SEQ ID NO: 24), которая была функционально связана 5'-концом с 3' UTR, T-Os.LTP:1. Также были сконструированы два контрольных вектора экспрессии, которые использовали для трансформации протопластов листьев кукурузы. Первый контрольный вектор экспрессии содержал трансгенную кассету без интрона и состоял из ЕХР, EXP-CaMV.35S, функционально связанного с 5'-концом кодирующей последовательности GUS, которая функционально связана с 5'-концом 3' UTR, T-Os.LTP:1. Второй контрольный вектор содержал трансгенную кассету, которая содержала ЕХР, EXP-CaMV.35S, функционально связанный с 5'-концом интрона I-Zm.DnaK:1, функционально связанным с 5'-концом кодирующей последовательности GUS, которая функционально связана с 5'-концом 3' UTR, T-Os.LTP:1. В таблице 4 показан средний процент экспрессии относительно второго контрольного вектора экспрессии, который содержит как EXP-CaMV.35S, так и I-Zm.DnaK:1, управляющий GUS.[111] Maize leaf protoplast cells were transformed with expression vectors that were engineered to contain expression elements that drive GUS expression. The tested expression vector was used to analyze the enhancement of GUS expression by the synthetic intron I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) driven by EXP-CaMV.35. The transgene cassette contained EXP, EXP-CaMV.35, operably linked at the 5' end to a synthetic intron, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), operably linked at the 5' end to the coding sequence encoding GUS (SEQ ID NO: 24), which was operably linked at the 5' end to the 3' UTR, T-Os.LTP:1. Two control expression vectors were also constructed and used to transform maize leaf protoplasts. The first control expression vector contained an intronless transgene cassette and consisted of an EXP, EXP-CaMV.35S, operably linked to the 5' end of a GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' end of a 3' UTR, T-Os.LTP:1 . The second control vector contained a transgene cassette that contained the EXP, EXP-CaMV.35S, operably linked to the 5' end of the I-Zm.DnaK:1 intron, operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' -end of 3' UTR, T-Os.LTP:1. Table 4 shows the average percent expression relative to a second control expression vector that contains both EXP-CaMV.35S and I-Zm.DnaK:1 driving GUS.
[112] Как можно увидеть из Таблицы 4, синтетический интрон, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), усиливал экспрессию трансгена GUS в протопластах листьев кукурузы, управляемую EXP-CaMV.35S, по сравнению с контрольным вектором экспрессии без интронов.[112] As can be seen from Table 4, the synthetic intron, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), enhanced the expression of the GUS transgene in maize leaf protoplasts driven by EXP-CaMV.35S compared to the control expression vector without introns.
Анализ усиления экспрессии GUS синтетическим интроном I-Zm.GSI197.nno:1Analysis of the enhancement of GUS expression by the synthetic intron I-Zm.GSI197.nno:1
[113] Клетки протопластов листьев кукурузы трансформировали векторами экспрессии, которые были сконструированы содержащими экспрессионные элементы, управляющие экспрессией GUS. Тестируемый вектор экспрессии использовали для анализа усиления экспрессии GUS синтетическим интроном I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), управляемым EXP-CaMV.35. Трансгенная кассета содержала ЕХР, ЕХР-CaMV.35, функционально связанный с 5-концом синтетического интрона, I-Zm.GSI197.nno:1, функционально связанным с 5'-концом кодирующей последовательности, кодирующей GUS (SEQ ID NO: 24), которая была функционально связана с 5'-концом 3' UTR, T-Os.LTP:1. Также были сконструированы три контрольных вектора экспрессии, которые использовали для трансформации протопластов листьев кукурузы. Первый контрольный вектор экспрессии содержал трансгенную кассету без промотора и состоял из интрона, I-Zm.DnaK:1, функционально связанного с 5'-концом кодирующей последовательности GUS, которая функционально связана с 5'-концом 3' UTR, T-Os.LTP:1. Второй контрольный вектор содержал трансгенную кассету без интронов и состоял из ЕХР, EXP-CaMV.35S, функционально связанного с 5'-концом кодирующей последовательности GUS, которая функционально связана с 5'-концом 3' UTR, T-Os.LTP:1. Третий контрольный вектор содержал трансгенную кассету, которая содержала ЕХР, EXP-CaMV.35S, функционально связанный с 5'-концом интрона I-Zm.DnaK:1, функционально связанным с 5'-концом кодирующей последовательности GUS, которая функционально связана с 5'-концом 3' UTR, T-Os.LTP:1. Таблица 5 показывает средний процент экспрессии относительно третьего контрольного вектора экспрессии, который включает как EXP-CaMV.35S, так и I-Zm.DnaK:1, управляющий GUS.[113] Maize leaf protoplast cells were transformed with expression vectors that were engineered to contain expression elements that drive GUS expression. The tested expression vector was used to analyze the enhancement of GUS expression by the synthetic intron I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10) driven by EXP-CaMV.35. The transgene cassette contained EXP, EXP-CaMV.35, operably linked to the 5-end of the synthetic intron, I-Zm.GSI197.nno:1, operably linked to the 5' end of the coding sequence encoding GUS (SEQ ID NO: 24), which was operably linked to the 5' end of the 3' UTR, T-Os.LTP:1. Three control expression vectors were also constructed and used to transform maize leaf protoplasts. The first control expression vector contained a promoterless transgene cassette and consisted of an intron, I-Zm.DnaK:1, operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' end of the 3' UTR, T-Os.LTP :1. The second control vector contained a transgene cassette without introns and consisted of an EXP, EXP-CaMV.35S, operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' end of the 3' UTR, T-Os.LTP:1. The third control vector contained a transgene cassette that contained the EXP, EXP-CaMV.35S, operably linked to the 5' end of the I-Zm.DnaK:1 intron, operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence, which is operably linked to the 5' -end of 3' UTR, T-Os.LTP:1. Table 5 shows the average percentage of expression relative to a third control expression vector that includes both EXP-CaMV.35S and I-Zm.DnaK:1 driving GUS.
[114] Как можно увидеть из Таблицы 5, синтетический интрон, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), усиливал экспрессию трансгена GUS в протопластах листьев кукурузы, управляемую EXP-CaMV.35S, по сравнению с контрольным вектором экспрессии без интронов. Усиление экспрессии было больше, чем придаваемое интроном, I-Zm.DnaK:1, по сравнению с третьим контрольным вектором экспрессии, который содержал ЕХР, EXP-CaMV.35S, функционально связанный с 5'-концом интрона I-Zm.DnaK:1.[114] As can be seen from Table 5, the synthetic intron, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), enhanced the expression of the GUS transgene in maize leaf protoplasts driven by EXP-CaMV.35S compared to the control expression vector without introns. The expression enhancement was greater than that conferred by the intron, I-Zm.DnaK:1, compared to a third control expression vector that contained an EXP, EXP-CaMV.35S, operably linked to the 5' end of the I-Zm.DnaK:1 intron. .
Анализ усиления экспрессии GUS синтетическими 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2 и Т-Zm.GST18.nno:2.Analysis of amplification of GUS expression by synthetic 3′ UTRs, T-Zm.GST9.nno:2 and T-Zm.GST18.nno:2.
[115] Клетки протопластов листьев кукурузы трансформировали векторами экспрессии, которые были сконструированы содержащими экспрессионные элементы, управляющие экспрессией GUS. Два тестовых вектора содержали трансгенную кассету, используемую для анализа усиления экспрессии GUS, придаваемого 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) и T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) и состояли из EXP-CaMV.35S, функционально связанного с 5'-концом интрона I-Zm.DnaK:1, функционально связанным с 5'-концом кодирующей последовательности, кодирующей GUS (SEQ ID NO: 24), которая функционально связана с 5'-концом либо 3' UTR, Т-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), либо 3' UTR, T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14). Также были сконструированы три контрольных вектора экспрессии, как описано выше, и их использовали для трансформации протопластов листьев кукурузы. В таблице 6 показан средний процент экспрессии относительно третьего контрольного вектора экспрессии, который содержит EXP-CaMV.35S и I-Zm.DnaK:1, управляющий GUS.[115] Maize leaf protoplast cells were transformed with expression vectors that were engineered to contain expression elements that drive GUS expression. Two test vectors contained a transgene cassette used to analyze the enhancement of GUS expression conferred by the 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) and T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) and consisted of EXP-CaMV.35S operably linked to the 5' end of the I-Zm.DnaK:1 intron operably linked to the 5' end of the GUS coding sequence (SEQ ID NO: 24), which is operably linked with the 5' end of either the 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) or the 3' UTR, T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14). Three control expression vectors were also constructed as described above and used to transform maize leaf protoplasts. Table 6 shows the average percentage of expression relative to the third control expression vector, which contains EXP-CaMV.35S and I-Zm.DnaK:1 driving GUS.
[116] Как можно увидеть из таблицы 6, 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) и T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) усиливали экспрессию GUS относительно к контролей в протопластах листа кукурузы.[116] As can be seen from Table 6, the 3' UTRs of T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) and T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) enhanced GUS expression relative to controls in maize leaf protoplasts.
Пример 3Example 3
Анализ экспрессии GUS под действием синтетических ЕХР, ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 и EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 в стабильно трансформированных растениях кукурузы сорта LH244Analysis of GUS expression under the influence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 and EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 in stably transformed maize plants of variety LH244
[117] Растения кукурузы трансформировали вектором, в частности вектором экспрессии для растений, содержащим тестируемые регуляторные элементы, управляющие экспрессией трансгена β-глюкуронидазы (GUS). Полученные растения анализировали на экспрессию белка GUS, чтобы оценить влияние выбранного регуляторного элемента на экспрессию.[117] Maize plants were transformed with a vector, in particular a plant expression vector containing test regulatory elements that control the expression of a β-glucuronidase (GUS) transgene. The resulting plants were analyzed for GUS protein expression to assess the effect of the selected regulatory element on expression.
[118] Растения кукурузы трансформировали экспрессирующими конструкциями GUS растений. Регуляторные элементы были клонированы в базовый вектор экспрессии для растений с использованием стандартных способов, известных в данной области техники. Полученные в результате векторы экспрессии для растений содержали левый граничный участок из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.левая граница), первую трансгенную селекционную кассету, использованную для селекции трансформированных клеток растений, которые придают устойчивость к гербициду глифосату; вторую трансгенную кассету для оценки активности синтетических регуляторных элементов, которая включала либо синтетический ЕХР, ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4), либо ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11) функционально связанный с 5'-концом синтетической кодирующей последовательности, разработанной для экспрессии в клетке растения, кодирующей β-глюкуронидазу (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 20), содержащей процессируемый интрон, полученный из светоиндуцируемого тканеспецифического гена картофеля ST-LS1 (Номер доступа Genbank: Х04753), функционально связанный с 5'-концом 3' участка терминации, Т-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19); и правый граничный участок из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu. правая граница). Синтетический ЕХР, ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4), состоит из синтетического промотора P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), функционально связанного с 5'-концом синтетической лидерной последовательности, L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3), которая функционально связана с 5'-концом синтетического интрона, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5). Синтетический ЕХР, ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11), состоит из синтетического промотора P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), функционально связанного с 5'-концом синтетической лидерной последовательности, L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3), которая функционально связана 5'-концом с синтетическим интроном, I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12).[118] Maize plants were transformed with plant GUS expression constructs. The regulatory elements were cloned into a basic plant expression vector using standard methods known in the art. The resulting plant expression vectors contained a left border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.left border), the first transgenic selection cassette used to select transformed plant cells that confer resistance to the herbicide glyphosate; a second transgene cassette to evaluate the activity of synthetic regulatory elements, which included either synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4), or EXP-Zm.GSP850.nno+Zm. GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11) operably linked to the 5' end of a synthetic coding sequence designed for expression in a plant cell encoding β-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1 , SEQ ID NO: 20), containing a processable intron derived from the light-inducible tissue-specific potato gene ST-LS1 (Genbank accession number: X04753), functionally linked to the 5' end of the 3' termination region, T-Sb.Nltp4-1:1 :2 (SEQ ID NO: 19); and the right border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu. right border). Synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4), consists of the synthetic promoter P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) operably linked to The 5' end of the synthetic leader sequence, L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3), which is operably linked to the 5' end of the synthetic intron, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5). Synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11), consists of the synthetic promoter P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) operably linked to The 5' end of the synthetic leader sequence, L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3), which is operably linked at the 5' end to the synthetic intron, I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12).
[119] Клетки растений кукурузы сорта LH244 трансформировали с использованием конструкции бинарного вектора трансформации, описанной выше, посредством трансформации, опосредованной Agrobacterium, хорошо известной в данной области техники. Полученные трансформированные клетки растений индуцировали с образованием целых растений кукурузы.[119] LH244 corn plant cells were transformed using the binary transformation vector construct described above through Agrobacterium-mediated transformation well known in the art. The resulting transformed plant cells were induced to form whole maize plants.
[120] Качественный и количественный анализ GUS использовали для оценки активности экспрессионных элементов в выбранных органах и тканях растений трансформированных растений. Для качественного анализа экспрессии GUS с помощью гистохимического окрашивания целиком монтированные или срезы ткани инкубировали с окрашивающим раствором GUS, содержащим 1 мг/мл X-Gluc (5-бром-4-хлор-3-индолил-b-глюкоронид) в течение 5 ч при 37°С и обесцвечивают 35% EtOH и 50% уксусной кислотой. Экспрессию GUS качественно определяли путем визуального осмотра выбранных органов или тканей растений на наличие синей окраски под препарирующим или составным микроскопом.[120] Qualitative and quantitative GUS analysis was used to evaluate the activity of expression elements in selected plant organs and tissues of transformed plants. For qualitative analysis of GUS expression by histochemical staining, whole mounted or tissue sections were incubated with GUS staining solution containing 1 mg/ml X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-glucuronide) for 5 h at 37°C and decolorized with 35% EtOH and 50% acetic acid. GUS expression was qualitatively determined by visually inspecting selected plant organs or tissues for the presence of blue color under a dissecting or compound microscope.
[121] Для количественного анализа экспрессии GUS с помощью ферментативных анализов общий белок экстрагировали из выбранных тканей трансформированных растений кукурузы. От одного до двух микрограммов общего белка инкубировали с флуорогенным субстратом, 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкоронидом (MUG) в концентрации 1 мМ в общем реакционном объеме 50 микролитров. После 1 ч инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 350 микролитров 200 мМ раствора бикарбоната натрия. Продукт реакции, 4-метилумбеллиферон (4-MU), максимально флуоресцирует при высоком рН, когда гидроксильная группа ионизируется. Добавление основного раствора карбоната натрия одновременно останавливает анализ и регулирует рН для количественного определения флуоресцентного продукта 4-MU. Количество образовавшегося 4-МЕ оценивали путем измерения его флуоресценции с использованием считывающего устройства для микропланшетов FLUOstar Omega (BMG LABTECH) (возбуждение при 355 нм, эмиссия при 460 нм). Значения активности GUS представлены в нмолях 4-МЕ/час/мг общего белка.[121] To quantify GUS expression using enzymatic assays, total protein was extracted from selected tissues of transformed maize plants. One to two micrograms of total protein was incubated with the fluorogenic substrate, 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) at a concentration of 1 mM in a total reaction volume of 50 microliters. After 1 h of incubation at 37°C, the reaction was stopped by adding 350 microliters of 200 mM sodium bicarbonate solution. The reaction product, 4-methylumbelliferone (4-MU), fluoresces maximally at high pH when the hydroxyl group is ionized. The addition of sodium carbonate stock solution simultaneously stops the assay and adjusts the pH to quantify the fluorescent product 4-MU. The amount of 4-ME produced was assessed by measuring its fluorescence using a FLUOstar Omega microplate reader (BMG LABTECH) (excitation at 355 nm, emission at 460 nm). GUS activity values are presented in nmol 4-IU/h/mg total protein.
[122] Следующие ткани были взяты для экспрессии GUS в поколении R0: стадия V4 Лист и Корень; стадия V7 Лист и Корень; стадия VT Лист, корень и цветок/пыльник; стадия R1 Початок/Шелк; и стадия R3 зародыша семени и эндосперма семени через 21 день после опыления (DAP). В таблице 7 показаны средние количественные значения экспрессии GUS для каждого из синтетических ЕХР.[122] The following tissues were sampled for GUS expression in the R0 generation: stage V4 Leaf and Root; stage V7 Leaf and Root; stage VT Leaf, root and flower/anther; stage R1 Ear/Silk; and R3 stage of seed embryo and seed endosperm 21 days after pollination (DAP). Table 7 shows the average quantitative GUS expression values for each of the synthetic EXPs.
[123] Как видно из таблицы 7, синтетический промотор и лидерная последовательность GSP850 (P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) и L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3)) приводили к конститутивной экспрессии GUS в стабильно трансформированных растениях кукурузы сорта LH244. Молекулярный анализ сайта начала транскрипции продемонстрировал постоянный TSS для промотора и лидерной последовательности GSP850. Синтетические интроны I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) и I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12) влияли на экспрессию различным образом в разных отобранных тканях. Молекулярный анализ сайтов сплайсинга интронов продемонстрировал последовательный процессинг синтетических интронов. Общее усиление экспрессии GUS было выше в большинстве образцов тканей растений, содержащих I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), за исключением стадии V4 листа, стадии V7 корня и R3 семенного зародыша, где уровни экспрессии GUS были относительно похожи. Усиление экспрессии, придаваемой I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) по сравнению с I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12), было примерно в 7,5 раз выше в V4 корня, 7,7 раз выше в VT листа, в 6,0 раза выше в VT корня, в 4,3 раза выше в VT цветка/пыльника, в 3,2 раза выше в R1 початка/шелка и в 2,3 раза выше в R3 эндосперма семян.[123] As can be seen from Table 7, the synthetic promoter and leader sequence of GSP850 (P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) and L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3)) led to constitutive expression of GUS in stably transformed maize plants of cultivar LH244. Molecular analysis of the transcription start site demonstrated a consistent TSS for the GSP850 promoter and leader sequence. Synthetic introns I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) and I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12) affected expression differently in different tissues sampled. Molecular analysis of intronic splice sites has demonstrated sequential processing of synthetic introns. The overall increase in GUS expression was higher in most plant tissue samples containing I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), with the exception of V4 leaf stage, V7 root stage and R3 seed embryo, where GUS expression levels were relatively similar. The increase in expression conferred by I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) compared to I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12) was approximately 7.5-fold higher in V4 root, 7.7 times higher in leaf VT, 6.0 times higher in root VT, 4.3 times higher in flower/anther VT, 3.2 times higher in spadix/silk R1, and 2.3 times higher in higher in R3 seed endosperm.
Пример 4Example 4
Анализ экспрессии GUS под действием синтетических ЕХР, ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 и ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 в стабильно трансформированных растениях кукурузы сорта 01DKD2Analysis of GUS expression under the influence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 and EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140. nno:1 in stably transformed maize plants of variety 01DKD2
[124] Растения кукурузы трансформировали вектором, в частности вектором экспрессии для растений, содержащим тестируемые регуляторные элементы, управляющие экспрессией трансгена β-глюкуронидазы (GUS). Полученные растения анализировали на экспрессию белка GUS, чтобы оценить влияние выбранного регуляторного элемента на экспрессию.[124] Maize plants were transformed with a vector, in particular a plant expression vector containing test regulatory elements that control the expression of a β-glucuronidase (GUS) transgene. The resulting plants were analyzed for GUS protein expression to assess the effect of the selected regulatory element on expression.
[125] Растения кукурузы трансформировали экспрессирующими конструкциями GUS растений. Регуляторные элементы были клонированы в базовый вектор экспрессии для растений с использованием стандартных способов, известных в данной области техники. Полученные в результате векторы экспрессии для растений содержали левый граничный участок из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.левая граница), первую трансгенную селекционную кассету, использованную для селекции трансформированных клеток растений, которые придают устойчивость к гербициду глифосату; вторую трансгенную кассету для оценки активности регуляторных элементов, которая содержала либо синтетический ЕХР, ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 15), EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4), либо EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11) функционально связанный с 5'-концом синтетической кодирующей последовательности, разработанной для экспрессии в клетке растения, кодирующей β-глюкуронидазу (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 20), содержащей процессируемый интрон, полученный из светоиндуцируемого тканеспецифического гена картофеля ST-LS1 (Номер доступа Genbank: Х04753), функционально связанный с 5'-концом 3' участка терминации, T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19); и правый граничный участок из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.правая граница). Синтетический ЕХР, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 15), состоит из синтетического промотора P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), функционально связаного с 5'-концом синтетической лидерной последовательности, L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3), которая функционально связана 5'-концом с интроном, I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22). Синтетические ЕХР, ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4) и ЕХР-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11) описаны в Примере 3. [126] Клетки растений кукурузы сорта 01DKD2 трансформировали с использованием конструкции бинарного вектора трансформации, описанной выше, посредством трансформации, опосредованной Agrobacterium, как хорошо известно в данной области техники. Полученные трансформированные клетки растений индуцировали с образованием целых растений кукурузы. Качественную и количественную экспрессию GUS анализировали, как описано в Примере 3. Таблица 8 показывает средние количественные значения экспрессии GUS для каждого из синтетических ЕХР.[125] Maize plants were transformed with plant GUS expression constructs. The regulatory elements were cloned into a basic plant expression vector using standard methods known in the art. The resulting plant expression vectors contained a left border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.left border), the first transgenic selection cassette used to select transformed plant cells that confer resistance to the herbicide glyphosate; a second transgenic cassette for assessing the activity of regulatory elements, which contained either synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 15), EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno: 2 (SEQ ID NO: 4), or EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11) operably linked to the 5' end of a synthetic coding sequence designed for expression in a plant cell, encoding β-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 20), containing a processable intron derived from the light-inducible tissue-specific potato gene ST-LS1 (Genbank accession number: X04753), functional associated with the 5' end of the 3' termination region, T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19); and the right border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.right border). Synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 15), consists of the synthetic promoter P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) operably linked to the 5' -end of the synthetic leader sequence, L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3), which is operably linked at the 5' end to the intron, I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22). Synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4) and EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11) are described in Example 3 [126] 01DKD2 corn plant cells were transformed using the binary transformation vector construct described above via Agrobacterium mediated transformation as is well known in the art. The resulting transformed plant cells were induced to form whole maize plants. Qualitative and quantitative GUS expression was analyzed as described in Example 3. Table 8 shows the average quantitative GUS expression values for each of the synthetic EXPs.
[127] Как видно из таблицы 8, синтетический промотор и лидерная последовательнось GSP850 (P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) и L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3)) приводили к конститутивной экспрессии GUS в стабильно трансформированных растениях кукурузы сорта LH244. Синтетические интроны, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) и I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12), усиливали экспрессию по сравнению с интроном I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22) во всех проанализированных тканях.[127] As can be seen from Table 8, the synthetic promoter and leader sequence of GSP850 (P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) and L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3)) led to constitutive expression of GUS in stably transformed maize plants of cultivar LH244. Synthetic introns, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) and I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12), increased expression compared to the I-Zm.DnaK:1 intron (SEQ ID NO: 22) in all tissues analyzed.
Пример 5Example 5
Анализ экспрессии GUS под действием синтетических ЕХР, ЕХР-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 и EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 в стабильно трансформированных растениях кукурузы сорта 01DKD2Analysis of GUS expression under the influence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 and EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 in stably transformed maize plants of variety 01DKD2
[128] Растения кукурузы трансформировали вектором, в частности вектором экспрессии для растений, содержащим тестируемые регуляторные элементы, управляющие экспрессией трансгена β-глюкуронидазы (GUS). Полученные растения анализировали на экспрессию белка GUS, чтобы оценить влияние выбранного регуляторного элемента на экспрессию.[128] Maize plants were transformed with a vector, in particular a plant expression vector containing test regulatory elements that control the expression of a β-glucuronidase (GUS) transgene. The resulting plants were analyzed for GUS protein expression to assess the effect of the selected regulatory element on expression.
[129] Растения кукурузы трансформировали экспрессирующими конструкциями GUS растений. Регуляторные элементы были клонированы в базовый вектор экспрессии для растений с использованием стандартных способов, известных в данной области техники. Полученные в результате векторы экспрессии для растений содержали левый граничный участок из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.левая граница), первую трансгенную селекционную кассету, использованную для селекции трансформированных клеток растений, которые придают устойчивость к гербициду глифосату; вторую трансгенную кассету для оценки активности регуляторных элементов, которая содержала либо синтетический ЕХР, ЕХР-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 16), либо ЕХР-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 (SEQ ID NO: 9) функционально связанный с 5'-концом синтетической кодирующей последовательности, разработанной для экспрессии в клетке растения, кодирующей β-глюкуронидазу (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 20), содержащей процессируемый интрон, полученный из светоиндуцируемого тканеспецифического гена картофеля ST-LS1 (Номер доступа Genbank: Х04753), функционально связанный с 5'-концом 3' участка терминации, T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19); и правый граничный участок из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.правая граница). Синтетический ЕХР, ЕХР-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 (SEQ ID NO: 9), состоит из синтетического промотора P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), функционально связаного с 5'-концом синтетической лидерной последовательности, L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8), которая функционально связана с 5'-концом синтетического интрона, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10). Синтетический ЕХР, ЕХР-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 16), состоит из синтетического промотора Р-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), функционально связаного с 5'-концом синтетической лидерной последовательности, L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8), которая функционально связана с 5'-концом интрона, I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22).[129] Maize plants were transformed with plant GUS expression constructs. The regulatory elements were cloned into a basic plant expression vector using standard methods known in the art. The resulting plant expression vectors contained a left border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.left border), the first transgenic selection cassette used to select transformed plant cells that confer resistance to the herbicide glyphosate; a second transgenic cassette to assess the activity of regulatory elements, which contained either synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 16), or EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno :2 (SEQ ID NO: 9) operably linked to the 5' end of a synthetic coding sequence designed for expression in a plant cell encoding β-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 20), containing a processable intron derived from the light-inducible tissue-specific potato gene ST-LS1 (Genbank accession number: X04753), functionally linked to the 5'-end of the 3' termination region, T-Sb.Nltp4-1:1:2 ( SEQ ID NO: 19); and the right border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.right border). Synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 (SEQ ID NO: 9), consists of the synthetic promoter P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7) operably linked to The 5' end of the synthetic leader sequence, L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8), which is operably linked to the 5' end of the synthetic intron, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10). Synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 16), consists of the synthetic promoter P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7) operably linked to the 5' -end of the synthetic leader sequence, L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8), which is operably linked to the 5' end of the intron, I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22).
[130] Клетки растений сорта кукурузы 01DKD2 трансформировали с использованием конструкции бинарного вектора трансформации, описанной выше, с помощью трансформации, опосредованной Agrobacterium, что хорошо известно в данной области техники. Полученные трансформированные клетки растений индуцировали с образованием целых растений кукурузы. Качественную и количественную экспрессию GUS анализировали, как описано ранее в примере 3. В таблице 9 показаны средние количественные значения экспрессии GUS для каждого из синтетических ЕХР, где «ND» означает, что значение не было определено.[130] Plant cells of corn cultivar 01DKD2 were transformed using the binary transformation vector construct described above using Agrobacterium-mediated transformation, which is well known in the art. The resulting transformed plant cells were induced to form whole maize plants. Qualitative and quantitative GUS expression was analyzed as previously described in Example 3. Table 9 shows the average quantitative GUS expression values for each of the synthetic EXPs, where “ND” indicates that the value was not determined.
[131] Как можно видеть, синтетический промотор и лидер GSP990 (Р-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7) и L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8)) управляли экспрессией GUS. Молекулярный анализ сайта начала транскрипции продемонстрировал постоянный TSS для промотора и лидера GSP990. Синтетический интрон, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10) ослаблял экспрессию в некоторых тканях, в то же время усиливая экспрессию в других тканях относительно интрона I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22). Например, экспрессия GUS была ослаблена в листе на стадии V4, V7 и VT. Экспрессия GUS была немного усилена в корнях V7 и VT по сравнению с I-Zm.DnaK:1. Экспрессия в цветке/пыльнике увеличивалась приблизительно в 2,7 раза с помощью I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10) по сравнению с I-Zm.DnaK:1. Различия в экспрессии, обеспечиваемой I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), по сравнению с I-Zm.DnaK:1, могут быть очень полезны там, где желательна более низкая экспрессия в листе и более высокая экспрессия в цветке/пыльнике. Молекулярный анализ сайтов сплайсинга интронов продемонстрировал согласованный процессинг синтетического интрона I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10).[131] As can be seen, the synthetic GSP990 promoter and leader (P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7) and L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8)) drove GUS expression . Molecular analysis of the transcription start site demonstrated a consistent TSS for the GSP990 promoter and leader. The synthetic intron, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10) attenuated expression in some tissues, while increasing expression in other tissues relative to the I-Zm.DnaK:1 intron (SEQ ID NO: 22) . For example, GUS expression was attenuated in the leaf at V4, V7 and VT stages. GUS expression was slightly upregulated in V7 and VT roots compared to I-Zm.DnaK:1. Flower/anther expression was increased approximately 2.7-fold by I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10) compared to I-Zm.DnaK:1. The differences in expression provided by I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10) compared to I-Zm.DnaK:1 can be very useful where lower leaf expression and higher expression are desired in the flower/anther. Molecular analysis of intronic splice sites demonstrated concerted processing of the synthetic intron I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10).
Пример 6Example 6
Анализ влияния на экспрессию GUS синтетических 3' UTR T-Zm.GST9.nno:2, Т-Zm.GST18.nno:2, и T-Zm.GST43.nno:1, и нативного T-Sb.Ntlp4-1:1:2 в стабильно трансформированных растениях кукурузы сорта 01DKD2.Analysis of the effect on GUS expression of synthetic 3' UTRs T-Zm.GST9.nno:2, T-Zm.GST18.nno:2, and T-Zm.GST43.nno:1, and native T-Sb.Ntlp4-1: 1:2 in stably transformed maize plants of variety 01DKD2.
[132] Растения кукурузы трансформировали вектором, в частности вектором экспрессии для растений, содержащим тестируемые регуляторные элементы, управляющие экспрессией трансгена β-глюкуронидазы (GUS). Полученные растения анализировали на экспрессию белка GUS, чтобы оценить влияние выбранного регуляторного элемента на экспрессию.[132] Maize plants were transformed with a vector, in particular a plant expression vector containing test regulatory elements that control the expression of a β-glucuronidase (GUS) transgene. The resulting plants were analyzed for GUS protein expression to assess the effect of the selected regulatory element on expression.
[133] Растения кукурузы трансформировали экспрессирующими конструкциями GUS растений. Регуляторные элементы были клонированы в базовый вектор экспрессии для растений с использованием стандартных способов, известных в данной области техники. Полученные в результате векторы экспрессии для растений содержали левый граничный участок из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.левая граница), первую трансгенную селекционную кассету, использованную для селекции трансформированных клеток растений, которые придают устойчивость к гербициду глифосату; вторую трансгенную кассету для оценки активности 3' UTR регуляторных элементов, которая содержала ЕХР, EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO: 21) функционально связанный с 5'-концом интрона, I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22), функционально связанным с 5'-концом синтетической кодирующей последовательности, разработанной для экспрессии в клетке растения, кодирующей В-глюкуронидазу (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LSl.nno:1, SEQ ID NO: 20), содержащей процессируемый интрон, полученный из светоиндуцируемого тканеспецифического гена картофеля ST-LS1 (Номер доступа Genbank: Х04753), функционально связанный с 5'-концом 3' участка терминации; и правый граничный участк из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.правая граница). Три тестовых экспрессионных вектора содержали 3' UTR T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) или T-Zm.GST43. nno:1 (SEQ ID NO: 26), функционально связанный с кодирующей последовательностью GUS. Дополнительный тестовый экспрессионный вектор содержал природный 3' UTR Т-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19), функционально связанный с кодирующей последовательностью GUS, и был использован для сравнения экспрессии между природными и синтетическими 3' UTR.[133] Maize plants were transformed with plant GUS expression constructs. The regulatory elements were cloned into a basic plant expression vector using standard methods known in the art. The resulting plant expression vectors contained a left border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.left border), the first transgenic selection cassette used to select transformed plant cells that confer resistance to the herbicide glyphosate; a second transgenic cassette to assess the activity of 3' UTR regulatory elements, which contained EXP, EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO: 21) operably linked to the 5' end of the intron, I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22 ), functionally linked to the 5' end of a synthetic coding sequence designed for expression in a plant cell encoding B-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LSl.nno:1, SEQ ID NO: 20) containing a processed an intron derived from the light-inducible tissue-specific potato gene ST-LS1 (Genbank accession number: X04753), operably linked to the 5' end of the 3' termination region; and right border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.right border). Three test expression vectors contained the 3' UTR of T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) or T-Zm.GST43. nno:1 (SEQ ID NO: 26), operably linked to the GUS coding sequence. An additional test expression vector contained the natural 3' UTR of T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19) operably linked to the GUS coding sequence and was used to compare expression between natural and synthetic 3' UTRs.
[134] Клетки растений кукурузы сорта 01DKD2 трансформировали с использованием конструкции бинарного вектора трансформации, описанной выше, посредством трансформации, опосредованной Agrobacterium, как хорошо известно в данной области техники. Полученные трансформированные клетки растений индуцировали с образованием целых растений кукурузы.[134] 01DKD2 corn plant cells were transformed using the binary transformation vector construct described above via Agrobacterium-mediated transformation, as is well known in the art. The resulting transformed plant cells were induced to form whole maize plants.
[135] Качественный и количественный GUS-анализ использовали для оценки активности элемента экспрессии в тканях листа и корня V4 трансформированных растений и выполняли, как описано выше в Примере 3. Эффект синтетических 3' UTR оценивали путем сравнения с эффектом экспрессии от 3' UTR T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19). Полученные транскрипты были проанализированы, чтобы определить, произошла ли надлежащая терминация и что транскрипт не был считан от начала до конца. Один из способов оценки того, было ли считываниеот начала до конца, заключался в использовании амплификации транскрипта кДНК с использованием праймера амплификации, соответствующего части граничной последовательности Т-ДНК, которая находится на 3'-конце 3' UTR. Средняя экспрессия GUS растений, трансформированных четырьмя конструкциями, содержащими T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14), T-Zm. GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) и T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19) представлены в таблице 10.[135] Qualitative and quantitative GUS analysis was used to assess element expression activity in leaf and root tissues of V4 transformed plants and was performed as described above in Example 3. The effect of the synthetic 3' UTR was assessed by comparison with the effect of expression from the 3' UTR T- Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19). The resulting transcripts were analyzed to determine whether proper termination had occurred and that the transcript was not read end-to-end. One way to assess whether readthrough was end-to-end was to use amplification of the cDNA transcript using an amplification primer corresponding to the portion of the T-DNA boundary sequence that is located at the 3′ end of the 3′ UTR. Average GUS expression of plants transformed with four constructs containing T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14), T-Zm. GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) and T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO: 19) are presented in Table 10.
[136] Как видно из Таблицы 10, как T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), так и Т-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) усиливали экспрессию GUS, управляемую ЕХР-CaMV.35S, функционально связанного с I-Zm.DnaK:1, относительно 3' UTR, Т-Sb.Nltp4-1:1:2. Экспрессия GUS в растениях, содержащих T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), была выше, чем в растениях, содержащих T-Zm.GST18.nno:2. Т-Zm.GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) усиливал экспрессию GUS в V4 корне по сравнению с T-Sb.Nltp4-1:1:2, но ослаблял экспрессию в V4 листе. Анализ транскриптов GUS из всех четырех конструкций продемонстрировал правильную терминацию транскрипта и отсутствие доказательств считывания от начала до конца в полученных транскриптах GUS. 3' UTR T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) и T-Zm.GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) действуют аналогично естественным 3' UTR и демонстрируют модуляцию экспрессии GUS по сравнению с природными 3' UTR Т-Sb.Nltp4-1:1:2. Все четыре синтетических 3' UTR и дополнительная нативная 3 'UTR Т-Sb.Nltp4-1:1:2 обеспечивают диапазон значений экспрессии, которые пригодны для точной настройки экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы.[136] As shown in Table 10, both T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) and T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) enhanced GUS-driven expression EXP-CaMV.35S, functionally associated with I-Zm.DnaK:1, relative to the 3' UTR, T-Sb.Nltp4-1:1:2. GUS expression in plants containing T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) was higher than in plants containing T-Zm.GST18.nno:2. T-Zm.GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) increased GUS expression in the V4 root compared to T-Sb.Nltp4-1:1:2, but attenuated expression in the V4 leaf. Analysis of GUS transcripts from all four constructs demonstrated correct transcript termination and no evidence of end-to-end readthrough in the resulting GUS transcripts. 3' UTR T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) and T-Zm.GST43.nno:1 (SEQ ID NO : 26) act similarly to natural 3' UTRs and demonstrate modulation of GUS expression compared to natural 3' UTRs of T-Sb.Nltp4-1:1:2. All four synthetic 3'UTRs and the additional native 3'UTR T-Sb.Nltp4-1:1:2 provide a range of expression values that are useful for fine-tuning expression in stably transformed maize plants.
Пример 7Example 7
Энхансерные элементы, полученные из регуляторных элементовEnhancer elements derived from regulatory elements
[137] Энхансеры получают из промоторных элементов, представленных как SEQ ID NO: 2 и 7. Энхансерные элементы могут состоять из одного или более цис регуляторных элементов, которые функционально связаны с 5'-концом или 3'-концом элемента промотора или функционально связаны с 5'-концом или 3'-концом дополнительного энхансерного элемента, которые функционально связаны с промотором, могут увеличивать или модулировать уровни экспрессии молекулы транскрибируемой ДНК или обеспечивать экспрессию молекулы транскрибируемой ДНК в конкретном типе клетки или органе растения, или в определенный момент времени в процессе развития или циркадного ритма. Энхансеры получают удалением ТАТА-бокса или функционально подобных элементов и любой нижеследующей последовательности из промоторов, которые позволяют инициировать транскрипцию с промоторов, представленных как SEQ ID NO: 2 и 7, или их фрагментов.[137] Enhancers are derived from promoter elements shown as SEQ ID NO: 2 and 7. Enhancer elements may consist of one or more cis regulatory elements that are operably linked to the 5' end or 3' end of the promoter element or operably linked to A 5'-end or 3'-end of an additional enhancer element that is operably linked to a promoter can increase or modulate expression levels of a transcribed DNA molecule or cause expression of a transcribed DNA molecule in a particular cell type or plant organ, or at a particular time point during development or circadian rhythm. Enhancers are obtained by removing the TATA box or functionally similar elements and any of the following sequence from promoters that allow initiation of transcription from the promoters shown as SEQ ID NO: 2 and 7, or fragments thereof.
[138] ТАТА-бокс в промоторах растений не так высоко консервативен, как у некоторых других эукариотических организмов. Следовательно, чтобы определить фрагмент как энхансер, нужно сначала идентифицировать сайт начала транскрипции (TSS) гена, в котором сначала транскрибируется 5' UTR. Энхансер, полученный из синтетического промотора, P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), может содержать нуклеотиды с 1 по 418 из SEQ ID NO: 2, что приводит к получению синтетического энхансера E-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 17). Энхансер, полученный из синтетического промотора, P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), может содержать нуклеотиды с 1 по 416 из SEQ ID NO: 7, что приводит к получению синтетического энхансера Е-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 18). Энхансеры, полученные от промоторов, могут содержать фрагменты SEQ ID NO: 17 и 18 или дупликации SEQ ID NO: 17 и 18 или их соответствующие фрагменты. Эффективность синтетических энхансеров, полученных из синтетических промоторов, определяется эмпирически путем создания химерного регуляторного элемента транскрипции, содержащего фрагменты, полученные от синтетических промоторов P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) или P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), которые функционально связаны с промотором и лидером, и используется для управления экспрессией молекулы транскрибируемой ДНК, такой как GUS, в анализе стабильных или переходных растений.[138] The TATA box in plant promoters is not as highly conserved as in some other eukaryotic organisms. Therefore, to identify a fragment as an enhancer, one must first identify the transcription start site (TSS) of the gene at which the 5' UTR is first transcribed. The enhancer derived from the synthetic promoter, P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), may contain nucleotides 1 to 418 of SEQ ID NO: 2, resulting in the synthetic enhancer E-Zm.GSP850 ( SEQ ID NO: 17). The enhancer derived from the synthetic promoter, P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), may contain nucleotides 1 to 416 of SEQ ID NO: 7, resulting in the synthetic enhancer E-Zm.GSP990 ( SEQ ID NO: 18). Enhancers derived from promoters may contain fragments of SEQ ID NOs: 17 and 18 or duplications of SEQ ID NOs: 17 and 18, or corresponding fragments thereof. The effectiveness of synthetic enhancers derived from synthetic promoters is determined empirically by creating a chimeric transcriptional regulatory element containing fragments derived from the synthetic promoters P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) or P-Zm.GSP990.nno: 2 (SEQ ID NO: 7), which are operably linked to a promoter and leader, and are used to drive the expression of a transcribed DNA molecule, such as GUS, in stable or transitional plant assays.
[139] Может потребоваться дальнейшее уточнение энхансерного элемента, что подтверждается эмпирически. Кроме того, положение энхансерного элемента относительно других элементов в химерном регуляторном элементе транскрипции также определяется эмпирически, поскольку порядок каждого элемента в химерном регуляторном элементе транскрипции может оказывать различные эффекты в зависимости от относительного положения каждого элемента. Некоторые промоторные элементы будут иметь множество ТАТА-боксов или элементов, подобных ТАТА-боксу, и потенциально множество сайтов старта транскрипции. В этих обстоятельствах может быть необходимо сначала определить, где расположен первый TSS, а затем начать конструирование энхансеров с использованием первого TSS, чтобы предотвратить потенциальную инициацию транскрипции внутри предполагаемого энхансерного элемента.[139] Further refinement of the enhancer element may be required, which is supported empirically. In addition, the position of the enhancer element relative to other elements in the chimeric transcription regulatory element is also determined empirically, since the order of each element in the chimeric transcription regulatory element can have different effects depending on the relative position of each element. Some promoter elements will have multiple TATA boxes or TATA box-like elements and potentially multiple transcription start sites. In these circumstances, it may be necessary to first determine where the first TSS is located and then begin constructing enhancers using the first TSS to prevent potential transcription initiation within the putative enhancer element.
[140] Энхансерные элементы, полученные из промоторных элементов, представленных как SEQ ID NO: 2 и 7, клонируются с использованием способов, известных в данной области техники, чтобы быть функционально связанными с 5'-концом или внутри промоторного элемента, или функционально связанными с 5'-концом или 3'-концом дополнительных энхансерных элементов, которые функционально связаны с промотором. Альтернативно, энхансерные элементы могут быть клонированы с использованием способов, известных в данной области техники, для получения большего энхансерного элемента, который состоит из двух или более копий энхансера, и клонирован с использованием способов, известных в данной области техники чтобы быть функционально связанным с 5'-концом или 3'-концом промоторного элемента или функционально связанным с 5'-концом или 3'-концом дополнительного энхансерного элемента, которые функционально связаны с промотором, продуцирующим химерный регуляторный элемент транскрипции. Энхансерные элементы, полученные из промоторов, полученных от генов организмов множества родов, могут быть функционально связаны с энхансерами, полученными из синтетических промоторов.[140] Enhancer elements derived from the promoter elements represented by SEQ ID NO: 2 and 7 are cloned using methods known in the art to be operably linked to the 5' end of or within the promoter element, or operably linked to The 5' end or 3' end of additional enhancer elements that are operably linked to the promoter. Alternatively, enhancer elements can be cloned using methods known in the art to produce a larger enhancer element that consists of two or more copies of the enhancer, and cloned using methods known in the art to be operably linked to the 5' - the end or 3' end of a promoter element or operably linked to the 5' end or 3' end of an additional enhancer element that is operably linked to the promoter producing the chimeric transcriptional regulatory element. Enhancer elements derived from promoters derived from genes of organisms of many genera can be operably linked to enhancers derived from synthetic promoters.
[141] Вектор трансформации растений для экспрессии GUS может быть сконструирован с использованием способов, известных в данной области техники, аналогичных конструкции, описанной в Примере 3, в которой полученные векторы экспрессии для растений содержат левый граничный участок из Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu. левая граница), первую трансгенную кассету селекции, используемую для селекции трансформированных клеток растений, придающих устойчивость к гербициду глифосату; и вторую трансгенную кассету для тестирования энхансерного элемента, состоящего из энхансерного элемента, функционально связанного с 5'-концом или 3'-концом промоторного элемента или функционально связанного с 5'-концом или 3'-концом дополнительного энхансерного элемента которые, в свою очередь, функционально связаны с промотором, который функционально связан с 5'-концом элемента лидерной последовательности, функционально связанным с 5'-концомэлемента интрона, функционально связанным с кодирующей последовательностью для β-глюкуронидазы (GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 20), содержащей процессируемый интрон, полученный из светоиндуцируемого тканеспецифического гена ST-LS1 картофеля (Номер доступа в Genbank: Х04753), функционально связанный с 3'-концевым участком из гена белка-подобного переносчика липидов Oryza sativa (T-Os.LTP:1, SEQ ID NO: 23); и правый граничный участок от A. tumefaciens (B-AGRtu.правая граница). Полученные плазмиды используют для трансформации растений кукурузы или других однодольных растений описанными выше способами. Альтернативно, клетки протопластов, полученные из кукурузы или других однодольных растений, трансформируют с использованием способов, известных в данной области техники, для проведения переходных анализов.[141] A plant transformation vector for GUS expression can be constructed using methods known in the art, similar to the design described in Example 3, in which the resulting plant expression vectors contain a left border region from Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu. left border), the first transgenic selection cassette used to select transformed plant cells that confer resistance to the herbicide glyphosate; and a second transgene cassette for testing an enhancer element consisting of an enhancer element operably linked to the 5' end or 3' end of a promoter element or operably linked to the 5' end or 3' end of an additional enhancer element which in turn operably linked to a promoter that is operably linked to the 5' end of a leader sequence element operably linked to the 5' end of an intron element operably linked to the coding sequence for β-glucuronidase (GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 20) containing a processable intron derived from the light-inducible tissue-specific gene ST-LS1 of potato (Genbank accession number: X04753), functionally linked to the 3'-terminal region from the Oryza sativa lipid transporter protein-like gene (T-Os .LTP:1, SEQ ID NO: 23); and the right border area from A. tumefaciens (B-AGRtu.right border). The resulting plasmids are used to transform maize plants or other monocots using the methods described above. Alternatively, protoplast cells derived from corn or other monocots are transformed using methods known in the art to perform transient assays.
[142] Экспрессия GUS, управляемая регуляторным элементом, содержащим один или более энхансеров, оценивается в анализах стабильных или переходных растений для определения влияния энхансерного элемента на экспрессию молекулы транскрибируемой ДНК. Модификации одного или более энхансерных элементов или дублирование одного или более энхансерных элементов могут быть выполнены на основе эмпирических экспериментов и результирующей регуляции экспрессии генов, которую наблюдают с использованием каждой композиции регуляторных элементов. Изменение относительных положений одного или более энхансеров в результирующих регуляторных или химерных регуляторных элементах может повлиять на транскрипционную активность или специфичность регуляторного или химерного регуляторного элемента и определяется эмпирически для определения лучших энхансеров для желаемого профиля экспрессии трансгена в растении кукурузы или растения другого рода.[142] GUS expression driven by a regulatory element containing one or more enhancers is assessed in stable or transitional plant assays to determine the effect of the enhancer element on the expression of the transcribed DNA molecule. Modifications of one or more enhancer elements or duplication of one or more enhancer elements can be made based on empirical experiments and the resulting regulation of gene expression that is observed using each regulatory element composition. Changing the relative positions of one or more enhancers in the resulting regulatory or chimeric regulatory elements can affect the transcriptional activity or specificity of the regulatory or chimeric regulatory element and is determined empirically to determine the best enhancers for the desired transgene expression profile in a maize or other plant genus.
[143] Проиллюстрировав и описав принципы данного изобретения, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что изобретение может быть модифицировано по компоновке и деталям без отклонения от таких принципов. Мы претендуем на все модификации, которые находятся в пределах сущности и объема формулы изобретения. Все публикации и опубликованные патентные документы, процитированные в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки.[143] Having illustrated and described the principles of the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the invention can be modified in arrangement and detail without deviating from such principles. We claim all modifications that fall within the spirit and scope of the claims. All publications and published patent documents cited herein are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication or patent application had been specifically and individually designated for inclusion by reference.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES
--->--->
<110> МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЛЛК<110> MONSANTO TECHNOLOGY LLC
<120> РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ РАСТЕНИЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ<120> REGULATORY ELEMENTS OF PLANTS AND THEIR APPLICATION
<130> 38-21(62691)0001/US<130> 38-21(62691)0001/US
<150> US 62/714 228<150> US 62/714 228
<151> 03.08.2018<151> 08/03/2018
<160> 26 <160> 26
<170> PatentIn версія 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 500<211> 500
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP850,<223> DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850,
содержащая синтетический промотор (P-Zm.GSP850.nno:4), containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP850.nno:4),
функционально связанный с 5'-концом синтетической лидерной functionally linked to the 5' end of the synthetic leader
последовательностью (L-Zm.GSP850.nno:3) sequence (L-Zm.GSP850.nno:3)
<400> 1<400> 1
agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60
cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120
aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180
caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240
aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300
gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360
cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420
tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt 480tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt 480
ccatcagaac cactcaccgg 500ccatcagaac cactcaccgg 500
<210> 2<210> 2
<211> 450<211> 450
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического промотора, P-Zm.GSP850.nno:4.<223> DNA sequence of the synthetic promoter, P-Zm.GSP850.nno:4.
<400> 2<400> 2
agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60
cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120
aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180
caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240
aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300
gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360
cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420
tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc 450tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc 450
<210> 3<210> 3
<211> 50<211> 50
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетической лидерной последовательности, P-Zm.GSP850.nno:3.<223> DNA sequence of the synthetic leader sequence, P-Zm.GSP850.nno:3.
<400> 3<400> 3
actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt ccatcagaac cactcaccgg 50actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt ccatcagaac cactcaccgg 50
<210> 4<210> 4
<211> 1117<211> 1117
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического EXP, <223> DNA sequence of synthetic EXP,
EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2, содержащая синтетический промотор EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2, containing a synthetic promoter
(P-Zm.GSP850.nno:4), синтетическую синтетической лидерную последовательность (L-Zm.GSP850.nno:3) и (P-Zm.GSP850.nno:4), synthetic leader sequence (L-Zm.GSP850.nno:3) and
синтетический интрон(I-Zm.GSI153.nno:1). synthetic intron(I-Zm.GSI153.nno:1).
<400> 4<400> 4
agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60
cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120
aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180
caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240
aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300
gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360
cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420
tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt 480tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt 480
ccatcagaac cactcaccgg cggaccgctc aggtgagaac ctcgctcgtc tcccgcggat 540ccatcagaac cactcaccgg cggaccgctc aggtgagaac ctcgctcgtc tcccgcggat 540
ctgcttctcg taacggttcg atctgtgctg ctatttcgga ttcggatcta ctgcggtgcg 600ctgcttctcg taacggttcg atctgtgctg ctatttcgga ttcggatcta ctgcggtgcg 600
gttgacgatt taggtttgtt agggatctgg tggtcatgct tgatcgatct ggtcgattag 660gttgacgatt taggtttgtt agggatctgg tggtcatgct tgatcgatct ggtcgattag 660
ggcccctcgc ggatctgcct tgttctgagt ttgggatctg gtgctcgaga tctcgatgcg 720ggcccctcgc ggatctgcct tgttctgagt ttgggatctg gtgctcgaga tctcgatgcg 720
gattcgagag atctgctgca tcgatccgga tccggggttt cccatttgag cttctcctgc 780gattcgagag atctgctgca tcgatccgga tccggggttt cccatttgag cttctcctgc 780
cgccgccgct gtcttgccac ctgactaggt agggtttccc cccgcgatct agcttcctgc 840cgccgccgct gtcttgccac ctgactaggt agggtttccc cccgcgatct agcttcctgc 840
tggtactctc gccgaccgtc atccaaactc aaatttggcg gatccgacgc acatcgatct 900tggtactctc gccgaccgtc atccaaactc aaatttggcg gatccgacgc acatcgatct 900
gttgttcaca ctacaatcgt tgagtcgatg aggttattgt aaatctgatc tgggccgctg 960gttgttcaca ctacaatcgt tgagtcgatg aggttattgt aaatctgatc tgggccgctg 960
cgattatccc tacctctctc ggaaacactg cgcgacgtgt aatatggtta aagtttgggc 1020cgattatccc tacctctctc ggaaacactg cgcgacgtgt aatatggtta aagtttgggc 1020
agttcgtagc gggttcggtc cctcggttct ggatttgagc tcccggtgga ttggtgtgtg 1080agttcgtagc gggttcggtc cctcggttct ggatttgagc tcccggtgga ttggtgtgtg 1080
tgctgttcta atgtattgat tcaatgttac aggttca 1117tgctgttcta atgtattgat tcaatgttac aggttca 1117
<210> 5<210> 5
<211> 610<211> 610
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического интрона, I-Zm.GSI153.nno:1.<223> DNA sequence of the synthetic intron, I-Zm.GSI153.nno:1.
<400> 5<400> 5
ctcaggtgag aacctcgctc gtctcccgcg gatctgcttc tcgtaacggt tcgatctgtg 60ctcaggtgag aacctcgctc gtctcccgcg gatctgcttc tcgtaacggt tcgatctgtg 60
ctgctatttc ggattcggat ctactgcggt gcggttgacg atttaggttt gttagggatc 120ctgctatttc ggattcggat ctactgcggt gcggttgacg atttaggttt gttagggatc 120
tggtggtcat gcttgatcga tctggtcgat tagggcccct cgcggatctg ccttgttctg 180tggtggtcat gcttgatcga tctggtcgat tagggcccct cgcggatctg ccttgttctg 180
agtttgggat ctggtgctcg agatctcgat gcggattcga gagatctgct gcatcgatcc 240agtttgggat ctggtgctcg agatctcgat gcggattcga gagatctgct gcatcgatcc 240
ggatccgggg tttcccattt gagcttctcc tgccgccgcc gctgtcttgc cacctgacta 300ggatccgggg tttcccattt gagcttctcc tgccgccgcc gctgtcttgc cacctgacta 300
ggtagggttt ccccccgcga tctagcttcc tgctggtact ctcgccgacc gtcatccaaa 360ggtagggttt ccccccgcga tctagcttcc tgctggtact ctcgccgacc gtcatccaaa 360
ctcaaatttg gcggatccga cgcacatcga tctgttgttc acactacaat cgttgagtcg 420ctcaaatttg gcggatccga cgcacatcga tctgttgttc acactacaat cgttgagtcg 420
atgaggttat tgtaaatctg atctgggccg ctgcgattat ccctacctct ctcggaaaca 480atgaggttat tgtaaatctg atctgggccg ctgcgattat ccctacctct ctcggaaaca 480
ctgcgcgacg tgtaatatgg ttaaagtttg ggcagttcgt agcgggttcg gtccctcggt 540ctgcgcgacg tgtaatatgg ttaaagtttg ggcagttcgt agcgggttcg gtccctcggt 540
tctggatttg agctcccggt ggattggtgt gtgtgctgtt ctaatgtatt gattcaatgt 600tctggatttg agctcccggt ggattggtgt gtgtgctgtt ctaatgtatt gattcaatgt 600
tacaggttca 610tacaggttca 610
<210> 6<210> 6
<211> 500<211> 500
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP990, содержащая <223> DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990, containing
синтетический промотор (P-Zm.GSP990.nno:2), функционально связанный с 5'-концом synthetic promoter (P-Zm.GSP990.nno:2) operably linked to the 5' end
синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP990.nno:1). synthetic leader sequence (L-Zm.GSP990.nno:1).
<400> 6<400> 6
gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60
ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120
atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180
atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240
tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300
cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360
atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcctata 420atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcctata 420
tatatccttt cccctctcct agtgccgctc aaagctaagc acaacctaag ctgatccact 480tatatccttt cccctctcct agtgccgctc aaagctaagc acaacctaag ctgatccact 480
gcaagcatcg tctcctacta 500gcaagcatcg tctcctacta 500
<210> 7<210> 7
<211> 450<211> 450
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического промотора, P-Zm.GSP990.nno:2.<223> DNA sequence of the synthetic promoter, P-Zm.GSP990.nno:2.
<400> 7<400> 7
gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60
ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120
atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180
atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240
tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300
cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360
atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcctata 420atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcctata 420
tatatccttt cccctctcct agtgccgctc 450tatatccttt cccctctcct agtgccgctc 450
<210> 8<210> 8
<211> 50<211> 50
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетической лидерной последовательности, P-Zm.GSP990.nno:1.<223> DNA sequence of the synthetic leader sequence, P-Zm.GSP990.nno:1.
<400> 8<400> 8
aaagctaagc acaacctaag ctgatccact gcaagcatcg tctcctacta 50aaagctaagc acaacctaag ctgatccact gcaagcatcg tctcctacta 50
<210> 9<210> 9
<211> 1117<211> 1117
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического EXP, <223> DNA sequence of synthetic EXP,
EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2, содержащая синтетический промотор EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2, containing a synthetic promoter
(P-Zm.GSP990.nno:2), синтетическую лидерную последовательность (L-Zm.GSP990.nno:1) и (P-Zm.GSP990.nno:2), synthetic leader sequence (L-Zm.GSP990.nno:1) and
синтетический интрон(I-Zm.GSI197.nno:1). synthetic intron(I-Zm.GSI197.nno:1).
<400> 9<400> 9
gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60
ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120
atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180
atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240
tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300
cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360
atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcctata 420atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcctata 420
tatatccttt cccctctcct agtgccgctc aaagctaagc acaacctaag ctgatccact 480tatatccttt cccctctcct agtgccgctc aaagctaagc acaacctaag ctgatccact 480
gcaagcatcg tctcctacta cggaccgtac aggtaagcga gcgccgctcg ctcccgccgt 540gcaagcatcg tctcctacta cggaccgtac aggtaagcga gcgccgctcg ctcccgccgt 540
ctcccttctc tgccggatct gccgtgctgc cgtcgtggcg tccatcctga tctccctccc 600ctcccttctc tgccggatct gccgtgctgc cgtcgtggcg tccatcctga tctccctccc 600
atcgacccct cggccgggcg gtttctgttt tatagggttt ccctcccacc tcgcgggcag 660atcgacccct cggccgggcg gtttctgttt tatagggttt ccctcccacc tcgcgggcag 660
tttgctgctg cctgctcaga tcccagctgg ttggatctgc ggattcgggt aggcggattc 720tttgctgctg cctgctcaga tcccagctgg ttggatctgc ggattcgggt aggcggattc 720
gccgggccga gttatataaa ccatttactg tagatgcgtt actaccttaa tgacgcacgg 780gccgggccga gttatataaa ccatttactg tagatgcgtt actaccttaa tgacgcacgg 780
atctgccgtc tcgccccccc ccgcgtcgga tccgactgtt agcttcctgc cacggatctg 840atctgccgtc tcgccccccc ccgcgtcgga tccgactgtt agcttcctgc cacggatctg 840
ctggactgtt ttcttgatcg ggtcttgcat ttggtggtgg cgggaatata ttattttaga 900ctggactgtt ttcttgatcg ggtcttgcat ttggtggtgg cgggaatata ttattttaga 900
tggtctgggt ctgcggatcc gtgcttattt tgttaccatg cccccacctg actataaact 960tggtctgggt ctgcggatcc gtgcttattt tgttaccatg cccccacctg actataaact 960
gtaaggtcga tctgatttgt ttgctatgcc cctcttgccg tctggatatg atggaaatat 1020gtaaggtcga tctgatttgt ttgctatgcc cctcttgccg tctggatatg atggaaatat 1020
atccgatcca gatgatgcta gtctctccct cgagcttctc gagggggtcg atctgaagtc 1080atccgatcca gatgatgcta gtctctccct cgagcttctc gagggggtcg atctgaagtc 1080
agttctaatt aatattttga tgctgattac aggtagc 1117agttctaatt aatattttga tgctgattac aggtagc 1117
<210> 10<210> 10
<211> 610<211> 610
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического интрона, I-Zm.GSI197.nno:1.<223> DNA sequence of the synthetic intron, I-Zm.GSI197.nno:1.
<400> 10<400> 10
tacaggtaag cgagcgccgc tcgctcccgc cgtctccctt ctctgccgga tctgccgtgc 60tacaggtaag cgagcgccgc tcgctcccgc cgtctccctt ctctgccgga tctgccgtgc 60
tgccgtcgtg gcgtccatcc tgatctccct cccatcgacc cctcggccgg gcggtttctg 120tgccgtcgtg gcgtccatcc tgatctccct cccatcgacc cctcggccgg gcggtttctg 120
ttttataggg tttccctccc acctcgcggg cagtttgctg ctgcctgctc agatcccagc 180ttttataggg tttccctccc acctcgcggg cagtttgctg ctgcctgctc agatcccagc 180
tggttggatc tgcggattcg ggtaggcgga ttcgccgggc cgagttatat aaaccattta 240tggttggatc tgcggattcg ggtaggcgga ttcgccgggc cgagttatat aaaccattta 240
ctgtagatgc gttactacct taatgacgca cggatctgcc gtctcgcccc cccccgcgtc 300ctgtagatgc gttactacct taatgacgca cggatctgcc gtctcgcccc cccccgcgtc 300
ggatccgact gttagcttcc tgccacggat ctgctggact gttttcttga tcgggtcttg 360ggatccgact gttagcttcc tgccacggat ctgctggact gttttcttga tcgggtcttg 360
catttggtgg tggcgggaat atattatttt agatggtctg ggtctgcgga tccgtgctta 420catttggtgg tggcgggaat atattatttt agatggtctg ggtctgcgga tccgtgctta 420
ttttgttacc atgcccccac ctgactataa actgtaaggt cgatctgatt tgtttgctat 480ttttgttacc atgcccccac ctgactataa actgtaaggt cgatctgatt tgtttgctat 480
gcccctcttg ccgtctggat atgatggaaa tatatccgat ccagatgatg ctagtctctc 540gcccctcttg ccgtctggat atgatggaaa tatatccgat ccagatgatg ctagtctctc 540
cctcgagctt ctcgaggggg tcgatctgaa gtcagttcta attaatattt tgatgctgat 600cctcgagctt ctcgagggg tcgatctgaa gtcagttcta attaatattt tgatgctgat 600
tacaggtagc 610tacaggtagc 610
<210> 11<210> 11
<211> 1117<211> 1117
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического EXP, <223> DNA sequence of synthetic EXP,
EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1, содержащая синтетический промотор EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1, containing a synthetic promoter
(P-Zm.GSP850.nno:4), синтетическую лидерную последовательность (L-Zm.GSP850.nno:3) и (P-Zm.GSP850.nno:4), synthetic leader sequence (L-Zm.GSP850.nno:3) and
синтетический интрон(I-Zm.GSI140.nno:1). synthetic intron(I-Zm.GSI140.nno:1).
<400> 11<400> 11
agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60
cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120
aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180
caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240
aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300
gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360
cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420
tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt 480tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt 480
ccatcagaac cactcaccgg cggaccggcc aggtacgcct cctcctccgc gccgctcttc 540ccatcagaac cactcaccgg cggaccggcc aggtacgcct cctcctccgc gccgctcttc 540
ctgcccaccc cgctcgatct gccacggatc cgctcggatc tggtcccctt cgattcggcc 600ctgcccaccc cgctcgatct gccacggatc cgctcggatc tggtcccctt cgattcggcc 600
acgatcggat ccgccgccgg gcgctcgcca tcggtggtgt ggtggctgta ggtttgcgtc 660acgatcggat ccgccgccgg gcgctcgcca tcggtggtgt ggtggctgta ggtttgcgtc 660
gtaagtttcc tgctccctcg ctggatgctt ccttctagcg gattcggcga cccatttctc 720gtaagtttcc tgctccctcg ctggatgctt ccttctagcg gattcggcga cccattctc 720
gcccgacggt cttccctctc tcttggctcg caaatcagga tgggtgttgt ttgatgctgt 780gcccgacggt cttccctctc tcttggctcg caaatcagga tgggtgttgt ttgatgctgt 780
catcgcccgt ttgatccgtc tcaaaattcg tctcccccgc gcacggatcg atctgctccc 840catcgcccgt ttgatccgtc tcaaaattcg tctcccccgc gcacggatcg atctgctccc 840
cctctctgct ccctgacccc gtctcacggc ggcgcgccgc tgctgctgct gtgccattcc 900cctctctgct ccctgacccc gtctcacggc ggcgcgccgc tgctgctgct gtgccattcc 900
atcagtcata caatcggagt aggcggaaat ataaaaatcg tccccttagc agcagatgga 960atcagtcata caatcggagt aggcggaaat ataaaaatcg tccccttagc agcagatgga 960
tccgtccatt tccggattcg agtcgattcg tgtgctcccc ccctctctct cgcccggatc 1020tccgtccatt tccggattcg agtcgattcg tgtgctcccc ccctctctct cgcccggatc 1020
tgattgcgac aacttgcttc tcccctccat ttcgatcccc atgtttacga tacttttccc 1080tgattgcgac aacttgcttc tcccctccat ttcgatcccc atgtttacga tacttttccc 1080
aactaatatt gatgtgggtg actgttttac aggtttc 1117aactaatatt gatgtgggtg actgttttac aggtttc 1117
<210> 12<210> 12
<211> 610<211> 610
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического интрона, I-Zm.GSI140.nno:1.<223> DNA sequence of the synthetic intron, I-Zm.GSI140.nno:1.
<400> 12<400> 12
gccaggtacg cctcctcctc cgcgccgctc ttcctgccca ccccgctcga tctgccacgg 60gccaggtacg cctcctcctc cgcgccgctc ttcctgccca ccccgctcga tctgccacgg 60
atccgctcgg atctggtccc cttcgattcg gccacgatcg gatccgccgc cgggcgctcg 120atccgctcgg atctggtccc cttcgattcg gccacgatcg gatccgccgc cgggcgctcg 120
ccatcggtgg tgtggtggct gtaggtttgc gtcgtaagtt tcctgctccc tcgctggatg 180ccatcggtgg tgtggtggct gtaggtttgc gtcgtaagtt tcctgctccc tcgctggatg 180
cttccttcta gcggattcgg cgacccattt ctcgcccgac ggtcttccct ctctcttggc 240cttccttcta gcggattcgg cgacccattt ctcgcccgac ggtcttccct ctctcttggc 240
tcgcaaatca ggatgggtgt tgtttgatgc tgtcatcgcc cgtttgatcc gtctcaaaat 300tcgcaaatca ggatgggtgt tgtttgatgc tgtcatcgcc cgtttgatcc gtctcaaaat 300
tcgtctcccc cgcgcacgga tcgatctgct ccccctctct gctccctgac cccgtctcac 360tcgtctcccc cgcgcacgga tcgatctgct ccccctctct gctccctgac cccgtctcac 360
ggcggcgcgc cgctgctgct gctgtgccat tccatcagtc atacaatcgg agtaggcgga 420ggcggcgcgc cgctgctgct gctgtgccat tccatcagtc atacaatcgg agtaggcgga 420
aatataaaaa tcgtcccctt agcagcagat ggatccgtcc atttccggat tcgagtcgat 480aatataaaaa tcgtcccctt agcagcagat ggatccgtcc atttccggat tcgagtcgat 480
tcgtgtgctc cccccctctc tctcgcccgg atctgattgc gacaacttgc ttctcccctc 540tcgtgtgctc cccccctctc tctcgcccgg atctgattgc gacaacttgc ttctcccctc 540
catttcgatc cccatgttta cgatactttt cccaactaat attgatgtgg gtgactgttt 600catttcgatc cccatgttta cgatactttt cccaactaat attgatgtgg gtgactgttt 600
tacaggtttc 610tacaggtttc 610
<210> 13<210> 13
<211> 300<211> 300
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2.<223> DNA sequence of the synthetic 3' UTR, T-Zm.GST9.nno:2.
<400> 13<400> 13
gtcgtcgtgg ttttttttgt ttttgtatct gaaggaggcc gccccatgtg tgttgttgta 60gtcgtcgtgg ttttttttgt ttttgtatct gaaggaggcc gccccatgtg tgttgttgta 60
gctagcagaa gaaggccacc gttcctgtac attttgttgt gctgctgctg cttgttcttc 120gctagcagaa gaaggccacc gttcctgtac attttgttgt gctgctgctg cttgttcttc 120
gtggatgtac atttgtatca tgtttttttg gttgtaaact ctatataaga aatgaataag 180gtggatgtac atttgtatca tgtttttttg gttgtaaact ctatataaga aatgaataag 180
taataaagaa gttgtttcat acccggtgct tccttgtttg ttgtgatatc ttttggctag 240taataaagaa gttgtttcat acccggtgct tccttgtttg ttgtgatatc ttttggctag 240
cttccttgtt aaccatgaaa tatatggccg tcggcatcat tttttgtttg tcttattttc 300cttccttgtt aaccatgaaa tatatggccg tcggcatcat tttttgtttg tcttattttc 300
<210> 14<210> 14
<211> 400<211> 400
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического 3' UTR, T-Zm.GST18.nno:2.<223> DNA sequence of the synthetic 3' UTR, T-Zm.GST18.nno:2.
<400> 14<400> 14
tgctctacca agtagttgtg tgtgctgtcg atccatcttg ctgctgctac atgcatgttt 60tgctctacca agtagttgtg tgtgctgtcg atccatcttg ctgctgctac atgcatgttt 60
ttgagcaggt ggtttctttt ggtttcgact ggttgttttg taaactatca ctatatatta 120ttgagcaggt ggtttctttt ggtttcgact ggttgttttg taaactatca ctatatatta 120
aataaatgga ataaagttgt tttttctcat accaagttcg tgctgtgttc tgatgccgcc 180aataaatgga ataaagttgt tttttctcat accaagttcg tgctgtgttc tgatgccgcc 180
gctgtttggt ttgctcatgc tgtgtggttg tttcttgatt tttttggttc ctgtgtagct 240gctgtttggt ttgctcatgc tgtgtggttg tttcttgatt tttttggttc ctgtgtagct 240
gcagtttgtt ttgaatctac ctagcatgtg tgatatgttt gctgcgtcgg caaccttgta 300gcagtttgtt ttgaatctac ctagcatgtg tgatatgttt gctgcgtcgg caaccttgta 300
aactttggtt tcacgatgaa ataaattaat aaatattttg gttttctcat accgtgcttg 360aactttggtt tcacgatgaa ataaattaat aaatattttg gttttctcat accgtgcttg 360
caaggatgtt tgtttgtttc ggtattcccc tgcatatttt 400caaggatgtt tgtttgtttc ggtattcccc tgcatatttt 400
<210> 15<210> 15
<211> 1311<211> 1311
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1, <223> DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1,
содержащая синтетический промотор (P-Zm.GSP850.nno:4), функционально containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP850.nno:4), functional
связанный с 5'-концом синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP850.nno:3), функционально linked to the 5' end of the synthetic leader sequence (L-Zm.GSP850.nno:3), functional
связанной с 5'-концом интрона (I-Zm.DnaK:1). associated with the 5' end of the intron (I-Zm.DnaK:1).
<400> 15<400> 15
agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60
cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120
aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180
caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240
aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300
gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360
cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgcta 420
tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt 480tataaagagg aggagccgcc gcccaccacc actcaccagc acacaaaccc tagctgtttt 480
ccatcagaac cactcaccgg cggaccgacc gtcttcggta cgcgctcact ccgccctctg 540ccatcagaac cactcaccgg cggaccgacc gtcttcggta cgcgctcact ccgccctctg 540
cctttgttac tgccacgttt ctctgaatgc tctcttgtgt ggtgattgct gagagtggtt 600cctttgttac tgccacgttt ctctgaatgc tctcttgtgt ggtgattgct gagagtggtt 600
tagctggatc tagaattaca ctctgaaatc gtgttctgcc tgtgctgatt acttgccgtc 660tagctggatc tagaattaca ctctgaaatc gtgttctgcc tgtgctgatt acttgccgtc 660
ctttgtagca gcaaaatata gggacatggt agtacgaaac gaagatagaa cctacacagc 720ctttgtagca gcaaaatata gggacatggt agtacgaaac gaagatagaa cctacacagc 720
aatacgagaa atgtgtaatt tggtgcttag cggtatttat ttaagcacat gttggtgtta 780aatacgagaa atgtgtaatt tggtgcttag cggtatttat ttaagcacat gttggtgtta 780
tagggcactt ggattcagaa gtttgctgtt aatttaggca caggcttcat actacatggg 840tagggcactt ggattcagaa gtttgctgtt aatttaggca caggcttcat actacatggg 840
tcaatagtat agggattcat attataggcg atactataat aatttgttcg tctgcagagc 900tcaatagtat agggattcat attataggcg atactataat aatttgttcg tctgcagagc 900
ttattatttg ccaaaattag atattcctat tctgtttttg tttgtgtgct gttaaattgt 960ttattatttg ccaaaattag atattcctat tctgtttttg tttgtgtgct gttaaattgt 960
taacgcctga aggaataaat ataaatgacg aaattttgat gtttatctct gctcctttat 1020taacgcctga aggaataaat ataaatgacg aaattttgat gtttatctct gctcctttat 1020
tgtgaccata agtcaagatc agatgcactt gttttaaata ttgttgtctg aagaaataag 1080tgtgaccata agtcaagatc agatgcactt gttttaaata ttgttgtctg aagaaataag 1080
tactgacagt attttgatgc attgatctgc ttgtttgttg taacaaaatt taaaaataaa 1140tactgacagt attttgatgc attgatctgc ttgtttgttg taacaaaatt taaaaataaa 1140
gagtttcctt tttgttgctc tccttacctc ctgatggtat ctagtatcta ccaactgaca 1200gagtttcctt tttgttgctc tccttacctc ctgatggtat ctagtatcta ccaactgaca 1200
ctatattgct tctctttaca tacgtatctt gctcgatgcc ttctccctag tgttgaccag 1260ctatattgct tctctttaca tacgtatctt gctcgatgcc ttctccctag tgttgaccag 1260
tgttactcac atagtctttg ctcatttcat tgtaatgcag ataccaagcg g 1311tgttactcac atagtctttg ctcatttcat tgtaatgcag ataccaagcg g 1311
<210> 16<210> 16
<211> 1311<211> 1311
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1, <223> DNA sequence of synthetic EXP, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1,
содержащая синтетический промотор (P-Zm.GSP990.nno:2), функционально containing a synthetic promoter (P-Zm.GSP990.nno:2), functional
связанный c 5'-концом синтетической лидерной последовательности (L-Zm.GSP990.nno:1), функционально linked to the 5' end of the synthetic leader sequence (L-Zm.GSP990.nno:1), functional
связанной с 5'-концом интрона (I-Zm.DnaK:1). associated with the 5' end of the intron (I-Zm.DnaK:1).
<400> 16<400> 16
gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60
ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120
atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180
atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240
tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300
cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360
atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcctata 420atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcctata 420
tatatccttt cccctctcct agtgccgctc aaagctaagc acaacctaag ctgatccact 480tatatccttt cccctctcct agtgccgctc aaagctaagc acaacctaag ctgatccact 480
gcaagcatcg tctcctacta cggaccgacc gtcttcggta cgcgctcact ccgccctctg 540gcaagcatcg tctcctacta cggaccgacc gtcttcggta cgcgctcact ccgccctctg 540
cctttgttac tgccacgttt ctctgaatgc tctcttgtgt ggtgattgct gagagtggtt 600cctttgttac tgccacgttt ctctgaatgc tctcttgtgt ggtgattgct gagagtggtt 600
tagctggatc tagaattaca ctctgaaatc gtgttctgcc tgtgctgatt acttgccgtc 660tagctggatc tagaattaca ctctgaaatc gtgttctgcc tgtgctgatt acttgccgtc 660
ctttgtagca gcaaaatata gggacatggt agtacgaaac gaagatagaa cctacacagc 720ctttgtagca gcaaaatata gggacatggt agtacgaaac gaagatagaa cctacacagc 720
aatacgagaa atgtgtaatt tggtgcttag cggtatttat ttaagcacat gttggtgtta 780aatacgagaa atgtgtaatt tggtgcttag cggtatttat ttaagcacat gttggtgtta 780
tagggcactt ggattcagaa gtttgctgtt aatttaggca caggcttcat actacatggg 840tagggcactt ggattcagaa gtttgctgtt aatttaggca caggcttcat actacatggg 840
tcaatagtat agggattcat attataggcg atactataat aatttgttcg tctgcagagc 900tcaatagtat agggattcat attataggcg atactataat aatttgttcg tctgcagagc 900
ttattatttg ccaaaattag atattcctat tctgtttttg tttgtgtgct gttaaattgt 960ttattatttg ccaaaattag atattcctat tctgtttttg tttgtgtgct gttaaattgt 960
taacgcctga aggaataaat ataaatgacg aaattttgat gtttatctct gctcctttat 1020taacgcctga aggaataaat ataaatgacg aaattttgat gtttatctct gctcctttat 1020
tgtgaccata agtcaagatc agatgcactt gttttaaata ttgttgtctg aagaaataag 1080tgtgaccata agtcaagatc agatgcactt gttttaaata ttgttgtctg aagaaataag 1080
tactgacagt attttgatgc attgatctgc ttgtttgttg taacaaaatt taaaaataaa 1140tactgacagt attttgatgc attgatctgc ttgtttgttg taacaaaatt taaaaataaa 1140
gagtttcctt tttgttgctc tccttacctc ctgatggtat ctagtatcta ccaactgaca 1200gagtttcctt tttgttgctc tccttacctc ctgatggtat ctagtatcta ccaactgaca 1200
ctatattgct tctctttaca tacgtatctt gctcgatgcc ttctccctag tgttgaccag 1260ctatattgct tctctttaca tacgtatctt gctcgatgcc ttctccctag tgttgaccag 1260
tgttactcac atagtctttg ctcatttcat tgtaatgcag ataccaagcg g 1311tgttactcac atagtctttg ctcatttcat tgtaatgcag ataccaagcg g 1311
<210> 17<210> 17
<211> 418<211> 418
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического энхансера, E-Zm.GSP85, который <223> DNA sequence of the synthetic enhancer, E-Zm.GSP85, which
получен из синтетического промотора, P-Zm.GSP850.nno:4. derived from a synthetic promoter, P-Zm.GSP850.nno:4.
<400> 17<400> 17
agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60agacggcagc acaacggcca tccggtcgct gtaggtacac gagtgccgca gtagatggcg 60
cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120cgcgtttttg tctgagtccg atggagcagc gcagcgcccc ccccccggcc accgccgctt 120
aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180aggcggacag atcatcacgc cggccgccgg cctcatcgcc caaactgtgt ggcccaaaac 180
caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240caccagacaa gcatattctg gcaggatgcc gttggcaaca aaaacacagg cgaccaaccc 240
aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300aaacaggccg cccggcccat aaggagctcc gcaggcccat ttctcatttg gccaggatag 300
gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360gccagccagg tggccacacg tgcaaaaccg ccacgtggcc aaggtggcgg atcccttatc 360
cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgc 418cacactggcc acacatgtgg cgccacacca caaccacaca ggcttatcta atagctgc 418
<210> 18<210> 18
<211> 416<211> 416
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического энхансера, E-Zm.GSP990, который <223> DNA sequence of the synthetic enhancer, E-Zm.GSP990, which
получен из синтетического промотора, P-Zm.GSP990.nno:2. derived from a synthetic promoter, P-Zm.GSP990.nno:2.
<400> 18<400> 18
gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60gagaatgtgg gaggaacttg cgacagtaac ctcattttgg tcacaaaaac cgatatttaa 60
ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120ggatcactag tcaccagacg aatctatttc atttgaacca tccaacgaga tgatctcaga 120
atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180atgatccacg tcacaccaaa tttctcgtcg aactcggcca gcagagccat ccaaacgggg 180
atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240atctccgcgc aacatctcca tccaccacct agagcagccc cggccttttc catggcaaaa 240
tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300tttacatccg atttggctga agaccaatgg gaaaaaggcg ccacgtggcc acgtggcgtc 300
cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360cacacgggcc aggcaggcag agaatggcca ccaatggggt ggataaggcc ggcgccaaaa 360
atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcc 416atatctgcca cgtggcgcct tgtggataag gcagcttgct atccctccgc caatcc 416
<210> 19<210> 19
<211> 487<211> 487
<212> ДНК<212> DNA
<213> Sorghum bicolor<213> Sorghum bicolor
<220><220>
<221> прочий_признак<221> other_sign
<222> (1)..(487)<222> (1)..(487)
<223> Последовательность ДНК 3' UTR, T-Sb.Nltp4-1:1:2, полученная из гена NLTP4<223> DNA sequence of 3' UTR, T-Sb.Nltp4-1:1:2, derived from the NLTP4 gene
(неспецифический белок-переносчик липидов 4) из Sorghum (nonspecific lipid transfer protein 4) from Sorghum
bicolor. bicolor.
<400> 19<400> 19
tgatcgatca taaggacatg catgaggcat gctcgttgga tggcgatcag catgcagtcg 60tgatcgatca taaggacatg catgaggcat gctcgttgga tggcgatcag catgcagtcg 60
tcgttgtttt accagatgtc gtccatgact ccctccatgg atgatgcatg caatgagata 120tcgttgtttt accagatgtc gtccatgact ccctccatgg atgatgcatg caatgagata 120
gatacataaa ttaaggagta gatcatgcat gcaccgtacc tgttagtgat cactccgttt 180gatacataaa ttaaggagta gatcatgcat gcaccgtacc tgttagtgat cactccgttt 180
aattagtatt tactgtttac taccttgagt ttacaccaac tctgtcgtcg ctgtggctgt 240aattagtatt tactgtttac taccttgagt ttacaccaac tctgtcgtcg ctgtggctgt 240
cgtcgtgtac ctcgatcgta cgtgtgtgtg tgtagcaggc tagcaaagca gcactcaacg 300cgtcgtgtac ctcgatcgta cgtgtgtgtg tgtagcaggc tagcaaagca gcactcaacg 300
tcgtccttgg gggtttgctt gcctttaacc ttgttgcttt agcacacagg tttctgaata 360tcgtccttgg gggtttgctt gcctttaacc ttgttgcttt agcacacagg tttctgaata 360
atgaatacta ctagcttttg tgtccattat atatatattg tactgtatgc atgatgtttt 420atgaatacta ctagcttttg tgtccattat atatatattg tactgtatgc atgatgtttt 420
ccatccatga gtcatgagag tgatgtgttc aagtaataag atatagtaac atatacacgc 480ccatccatga gtcatgagag tgatgtgttc aagtaataag atatagtaac atatacacgc 480
gacgtac 487gacgtac 487
<210> 20<210> 20
<211> 2001<211> 2001
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая кодирующая последовательность, оптимизированная для экспрессии <223> Synthetic coding sequence optimized for expression
?-глюкуронидазы (GUS) в растении с процессируемым интроном, полученным из β-glucuronidase (GUS) in a plant with a processable intron derived from
светоиндуцируемого тканеспецифичного гена ST-LS1 картофеля (Номер light-inducible tissue-specific gene ST-LS1 of potato (No.
доступа в Genbank: X04753). Genbank accession: X04753).
<400> 20<400> 20
atggtgaggc ccgttgagac cccgactagg gagatcaaga agctggacgg cctctgggcc 60atggtgaggc ccgttgagac cccgactagg gagatcaaga agctggacgg cctctgggcc 60
ttctccctcg accgtgagaa ctgcggcatc gaccagcgct ggtgggagtc cgccctccag 120ttctccctcg accgtgagaa ctgcggcatc gaccagcgct ggtgggagtc cgccctccag 120
gagtctaggg ccatcgccgt gcccggttcc ttcaacgacc agttcgccga cgccgacatc 180gagtctaggg ccatcgccgt gcccggttcc ttcaacgacc agttcgccga cgccgacatc 180
cgcaactacg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaggtgt tcatcccgaa gggctgggcg 240cgcaactacg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaggtgt tcatcccgaa gggctgggcg 240
ggccagcgca tcgtgctccg cttcgacgcc gtgacccact acggcaaggt ctgggtgaac 300ggccagcgca tcgtgctccg cttcgacgcc gtgacccact acggcaaggt ctgggtgaac 300
aatcaggagg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta 360aatcaggagg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta 360
gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt 420gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt 420
gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca 480gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca 480
aaatttgttg atgtgcaggt gatggagcac cagggcggtt acaccccgtt cgaggccgac 540aaatttgttg atgtgcaggt gatggagcac cagggcggtt acaccccgtt cgaggccgac 540
gtgacgccgt acgtgatcgc cgggaagtcc gtccgcatca ccgtctgcgt gaacaatgag 600gtgacgccgt acgtgatcgc cgggaagtcc gtccgcatca ccgtctgcgt gaacaatgag 600
ctgaactggc agaccatccc gcctggcatg gtcatcaccg acgagaacgg caagaagaag 660ctgaactggc agaccatccc gcctggcatg gtcatcaccg acgagaacgg caagaagaag 660
cagtcctact tccacgactt cttcaactac gctggcatcc accgctccgt gatgctctac 720cagtcctact tccacgactt cttcaactac gctggcatcc accgctccgt gatgctctac 720
accactccca acacctgggt ggacgacatc accgtggtca cccacgtggc ccaggactgc 780accactccca acacctgggt ggacgacatc accgtggtca cccacgtggc ccaggactgc 780
aaccacgcct ccgtggactg gcaagtcgtt gccaacggcg acgtcagcgt cgagctgcgc 840aaccacgcct ccgtggactg gcaagtcgtt gccaacggcg acgtcagcgt cgagctgcgc 840
gacgccgacc agcaagtcgt tgccaccggc cagggcacca gcggcaccct ccaagtcgtc 900gacgccgacc agcaagtcgt tgccaccggc cagggcacca gcggcaccct ccaagtcgtc 900
aaccctcacc tctggcagcc tggcgagggc tacctctacg agctgtgcgt caccgccaag 960aaccctcacc tctggcagcc tggcgagggc tacctctacg agctgtgcgt caccgccaag 960
agccagactg agtgcgacat ctaccctctc cgcgtcggca tcaggagcgt cgctgtcaag 1020agccagactg agtgcgacat ctaccctctc cgcgtcggca tcaggagcgt cgctgtcaag 1020
ggcgagcagt tcctcatcaa ccacaagcct ttctacttca ctggtttcgg ccgccacgag 1080ggcgagcagt tcctcatcaa ccacaagcct ttctacttca ctggtttcgg ccgccacgag 1080
gacgctgacc tgaggggcaa gggtttcgac aacgtcctga tggtccacga ccacgctctg 1140gacgctgacc tgaggggcaa gggtttcgac aacgtcctga tggtccacga ccacgctctg 1140
atggactgga tcggtgccaa cagctacagg accagtcact acccgtacgc tgaggagatg 1200atggactgga tcggtgccaa cagctacagg accagtcact acccgtacgc tgaggagatg 1200
ctggactggg ctgacgagca cggtatcgtc gtgatcgacg agactgctgc ggtcggtttc 1260ctggactggg ctgacgagca cggtatcgtc gtgatcgacg agactgctgc ggtcggtttc 1260
aacctgtctc tgggcattgg tttcgaggct gggaacaagc cgaaggagct gtactctgag 1320aacctgtctc tgggcattgg tttcgaggct gggaacaagc cgaaggagct gtactctgag 1320
gaagctgtca acggcgagac tcagcaagct catctccagg cgattaagga gctgattgcc 1380gaagctgtca acggcgagac tcagcaagct catctccagg cgattaagga gctgattgcc 1380
agggacaaga accatccgtc tgtcgtgatg tggtctattg cgaatgagcc ggacaccaga 1440agggacaaga accatccgtc tgtcgtgatg tggtctattg cgaatgagcc ggacaccaga 1440
ccgcaagggg cgcgtgaata cttcgcgccg ctggcggagg cgactcgcaa actggaccca 1500ccgcaagggg cgcgtgaata cttcgcgccg ctggcggagg cgactcgcaa actggaccca 1500
acccgtccaa tcacgtgcgt caatgtcatg ttctgcgacg cccatacgga tacgatctcg 1560acccgtccaa tcacgtgcgt caatgtcatg ttctgcgacg cccatacgga tacgatctcg 1560
gacctgttcg atgttctttg tctcaatcgg tactatgggt ggtatgttca gagcggggat 1620gacctgttcg atgttctttg tctcaatcgg tactatgggt ggtatgttca gagcggggat 1620
cttgagacgg cggagaaggt tcttgagaag gaactcctgg cgtggcaaga gaagctccat 1680cttgagacgg cggagaaggt tcttgagaag gaactcctgg cgtggcaaga gaagctccat 1680
cagccgatca ttatcacgga gtacggggtt gacacacttg cgggccttca cagtatgtac 1740cagccgatca ttatcacgga gtacggggtt gacacacttg cgggccttca cagtatgtac 1740
acagatatgt ggtcggagga ataccagtgt gcatggttgg atatgtacca tcgtgtcttc 1800acagatatgt ggtcggagga ataccagtgt gcatggttgg atatgtacca tcgtgtcttc 1800
gaccgggttt cagcggttgt cggcgaacaa gtctggaact tcgcagactt cgccacgagc 1860gaccgggttt cagcggttgt cggcgaacaa gtctggaact tcgcagactt cgccacgagc 1860
caagggatac tgcgggtagg agggaacaag aagggaatct tcacacggga tcggaagccc 1920caagggatac tgcgggtagg agggaacaag aagggaatct tcacacggga tcggaagccc 1920
aagtcagcag ccttcctgtt gcagaagcga tggacaggaa tgaacttcgg agaaaagcca 1980aagtcagcag ccttcctgtt gcagaagcga tggacaggaa tgaacttcgg agaaaagcca 1980
cagcaaggcg gaaagcagtg a 2001cagcaaggcg gaaagcagtg a 2001
<210> 21<210> 21
<211> 835<211> 835
<212> ДНК<212> DNA
<213> Вирус мозаики цветной капусты<213> Cauliflower mosaic virus
<220><220>
<221> прочий_признак<221> other_sign
<222> (1)..(835)<222> (1)..(835)
<223> Последовательность ДНК EXP, EXP-CaMV.35S, содержащая промотор 35S<223> EXP DNA sequence, EXP-CaMV.35S, containing the 35S promoter
и лидерную последовательность, полученные из вируса мозаики цветной капусты. and a leader sequence derived from cauliflower mosaic virus.
<400> 21<400> 21
agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60
cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccadgaaatc aaataccttc 120
ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180
aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240
acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300
aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360
aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420aacagttcat acaagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420
tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480
gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540
cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600
atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660
atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720
agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780
cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagagg acacg 835cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagagg acacg 835
<210> 22<210> 22
<211> 804<211> 804
<212> ДНК<212> DNA
<213> Zea mays<213> Zea mays
<220><220>
<221> прочий_признак<221> other_sign
<222> (1)..(804)<222> (1)..(804)
<223> Последовательность ДНК интрона, I-Zm.DnaK:1, полученная из гена белка теплового <223> Intron DNA sequence, I-Zm.DnaK:1, derived from the heat protein gene
шока 70 (Hsp70) (DnaK) из Zea mays. shock 70 (Hsp70) (DnaK) from Zea mays.
<400> 22<400> 22
accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa 60accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa 60
tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa 120tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa 120
atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat atagggacat 180atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat atagggacat 180
ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 240ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 240
tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 300tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 300
gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 360gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 360
gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 420gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 420
tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttaacgcc tgaaggaata aatataaatg 480tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttaacgcc tgaaggaata aatataaatg 480
acgaaatttt gatgtttatc tctgctcctt tattgtgacc ataagtcaag atcagatgca 540acgaaatttt gatgtttatc tctgctcctt tattgtgacc ataagtcaag atcagatgca 540
cttgttttaa atattgttgt ctgaagaaat aagtactgac agtattttga tgcattgatc 600cttgttttaa atattgttgt ctgaagaaat aagtactgac agtattttga tgcattgatc 600
tgcttgtttg ttgtaacaaa atttaaaaat aaagagtttc ctttttgttg ctctccttac 660tgcttgtttg ttgtaacaaa atttaaaaat aaagagtttc ctttttgttg ctctccttac 660
ctcctgatgg tatctagtat ctaccaactg acactatatt gcttctcttt acatacgtat 720ctcctgatgg tatctagtat ctaccaactg acactatatt gcttctcttt acatacgtat 720
cttgctcgat gccttctccc tagtgttgac cagtgttact cacatagtct ttgctcattt 780cttgctcgat gccttctccc tagtgttgac cagtgttact cacatagtct ttgctcattt 780
cattgtaatg cagataccaa gcgg 804cattgtaatg cagataccaa gcgg 804
<210> 23<210> 23
<211> 300<211> 300
<212> ДНК<212> DNA
<213> Oryza sativa<213> Oryza sativa
<220><220>
<221> прочий_признак<221> other_sign
<222> (1)..(300)<222> (1)..(300)
<223> Последовательность ДНК 3? UTR, T-Os.LTP:1, полученная из гена белок-подобного <223> DNA sequence 3? UTR, T-Os.LTP:1, derived from protein-like gene
переносчика липидов (LTP) из Oryza sativa. lipid transporter (LTP) from Oryza sativa.
<400> 23<400> 23
attaatcgat cctccgatcc cttaattacc ataccattac accatgcatc aatatccata 60attaatcgat cctccgatcc cttaattacc ataccattac accatgcatc aatatccata 60
tatatataaa ccctttcgca cgtacttata ctatgttttg tcatacatat atatgtgtcg 120tatatataaa ccctttcgca cgtacttata ctatgttttg tcatacatat atatgtgtcg 120
aacgatcgat ctatcactga tatgatatga ttgatccatc agcctgatct ctgtatcttg 180aacgatcgat ctatcactga tatgatatga ttgatccatc agcctgatct ctgtatcttg 180
ttatttgtat accgtcaaat aaaagtttct tccacttgtg ttaataatta gctactctca 240ttatttgtat accgtcaaat aaaagtttct tccacttgtg ttaataatta gctactctca 240
tctcatgaac cctatatata actagtttaa tttgctgtca attgaacatg atgatcgatg 300tctcatgaac cctatatata actagtttaa tttgctgtca attgaacatg atgatcgatg 300
<210> 24<210> 24
<211> 2001<211> 2001
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Кодирующая последовательность для ?-глюкуронидазы (GUS) с процессируемым <223> Coding sequence for ?-glucuronidase (GUS) with processable
интроном, полученным из светоиндуцируемого тканеспецифичного intron derived from a light-inducible tissue-specific
гена ST-LS1 картофеля (Номер доступа в Genbank: X04753). potato ST-LS1 gene (Genbank accession number: X04753).
<400> 24<400> 24
atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60
ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120
gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180
cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240
ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300
aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360
tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa 420tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa 420
taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat 480taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat 480
gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt 540gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt 540
ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa 600ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa 600
ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660
cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720
accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt 780accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt 780
aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt 840aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt 840
gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg 900gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg 900
aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa 960aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa 960
agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020
ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080
gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140
atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200
ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260
aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320
gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380
cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440
ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500
acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560
gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620
ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680
cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740
accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800
gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860
caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920
aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980
cagcagggag gcaaacaatg a 2001cagcaggggag gcaaacaatg a 2001
<210> 25<210> 25
<211> 516<211> 516
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Кодирующая последовательность Nluc, белка люциферазы, сконструированного <223> Coding sequence of Nluc, an engineered luciferase protein
путем направленной эволюции. through directed evolution.
<400> 25<400> 25
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516
<210> 26<210> 26
<211> 300<211> 300
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Последовательность ДНК синтетического 3' UTR, T-Zm.GST43.nno:1.<223> DNA sequence of the synthetic 3' UTR, T-Zm.GST43.nno:1.
<400> 26<400> 26
tccagggcgc ctgcttgttt gctgccaaga gagtgttttg tgtactgctg ctgccgagaa 60tccagggcgc ctgcttgttt gctgccaaga gagtgttttg tgtactgctg ctgccgagaa 60
atatatattt ttttctttca ccacctcgtg tgcagcagtt gttttttgtt tggatggata 120atatatattt ttttctttca ccacctcgtg tgcagcagtt gttttttgtt tggatggata 120
aatgtttcta gtactgtgga ggctgcatct gcatctgttt gtaaatggat gaaatatgaa 180aatgtttcta gtactgtgga ggctgcatct gcatctgttt gtaaatggat gaaatatgaa 180
taaaaagttt tgtttctcat accccatgtg tcttgtgttt gcatgcacgc cgtgctagtt 240taaaaagttt tgtttctcat accccatgtg tcttgtgttt gcatgcacgc cgtgctagtt 240
tggtttttgg tttctagaga aaacattttg tttgcttgtt tctctatagg atgtgaagaa 300tggtttttgg tttctagaga aaacattttg tttgcttgtt tctctatagg atgtgaagaa 300
<---<---
Claims (5)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/714,228 | 2018-08-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020143971A RU2020143971A (en) | 2022-09-05 |
| RU2812893C2 true RU2812893C2 (en) | 2024-02-05 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012158535A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| WO2014100009A2 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| WO2016022376A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Pioneer Hi Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| RU2644205C2 (en) * | 2011-03-25 | 2018-02-08 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Plant regulatory elements and their application |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2644205C2 (en) * | 2011-03-25 | 2018-02-08 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Plant regulatory elements and their application |
| WO2012158535A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| WO2014100009A2 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| WO2016022376A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Pioneer Hi Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11519002B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| US11851667B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| US20240093216A1 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| US10351866B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| RU2812893C2 (en) | Regulatory elements of plants and their use | |
| US11499159B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof |