RU2812173C2

RU2812173C2 - Advanced cell culture device

Info

Publication number: RU2812173C2
Application number: RU2020121582A
Authority: RU
Inventors: Антонин САНДОЗ; Давид БОВАР
Original assignee: Филип Моррис Продактс С.А.
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2024-01-24

Abstract

FIELD: laboratory equipment.

SUBSTANCE: group of inventions relates to a device for culturing cells and a method of its use. The cells are three-dimensional organotypic cells or tissues - spheroids. To obtain individual spheroid(s) on the discontinuous surface of the well, transfer the individual spheroid(s) to the well of the cell culture device. The well of the cell culture device contains a base and side walls extending from the base and delimiting the volume of the well. At the base or side walls of the well, there is an inlet port configured to transfer fluid into the well and an outlet port configured to transfer fluid from the well. The base of the well has a discontinuous surface configured to trap one or more individual spheroids within the discontinuous surface to reduce or prevent their agglomeration. The individual spheroid(s) are then brought into contact with a discontinuous surface and incubated in the well.

EFFECT: reduction or prevention of agglomeration of spheroids.

14 cl, 12 dwg

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ TECHNICAL FIELD

Настоящее изобретение относится к устройствам для культивирования клеток, способам и их применениям. Одним конкретным типом клеточной культуры для применения в настоящем изобретении являются трехмерные органотипические клетки или ткани, также известные как сфероиды. The present invention relates to cell culture devices, methods and applications thereof. One specific type of cell culture for use in the present invention is three-dimensional organotypic cells or tissues, also known as spheroids.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ BACKGROUND OF THE ART

Для изучения влияний одного или более веществ (например, лекарственных средств) на жизнестойкость и ферментативную активность клеток, и т.д. применяли токсикологические исследования с использованием 2-мерных систем клеточных культур. Хотя возможность выращивания клеток плоскими слоями на поверхностях пластмассовых материалов является несложной и позволяет изучать некоторые аспекты клеточной физиологии и реакции на раздражители, такие клеточные культуры не отражают реальную структуру и строение органа. В 2-мерных монослоях исследование внеклеточного матрикса, межклеточных взаимодействий и взаимодействий клеток с матриксом, которые являются существенными для дифференциации, пролиферации и клеточных функций, не представляется возможным.To study the effects of one or more substances (for example, drugs) on the viability and enzymatic activity of cells, etc. applied toxicological studies using 2-dimensional cell culture systems. Although the ability to grow cells in flat layers on the surfaces of plastic materials is straightforward and allows the study of some aspects of cellular physiology and response to stimuli, such cell cultures do not reflect the actual structure and structure of the organ. In 2-dimensional monolayers, the study of the extracellular matrix, cell-cell interactions and cell-matrix interactions, which are essential for differentiation, proliferation and cellular functions, is not possible.

В 3-мерных системах для культивирования может образовываться функциональная ткань с признаками, сходными с наблюдаемыми in vivo. По сравнению с 2-мерными системами культивирования 3-мерная клеточная культура обеспечивает взаимодействие клеток с окружающей их средой во всех трех измерениях и является физиологически более релевантной. Такие клеточные культуры могут демонстрировать лучшую жизнеспособность, пролиферацию, дифференциацию, морфологические характеристики, реакции на раздражители, метаболизм лекарственных веществ, экспрессию генов и синтез белка, и т.п. 3-мерная клеточная культура может образовывать специфические тканеподобные структуры, а также имитировать функции и реакции реальных тканей физиологически более релевантно, чем традиционные 2-мерные клеточные монослои. 3D culture systems can generate functional tissue with features similar to those observed in vivo . Compared to 2-dimensional culture systems, 3-dimensional cell culture allows cells to interact with their environment in all three dimensions and is physiologically more relevant. Such cell cultures can exhibit better viability, proliferation, differentiation, morphological characteristics, responses to stimuli, drug metabolism, gene expression and protein synthesis, and the like. 3D cell culture can form tissue-specific structures and mimic the functions and responses of real tissues in a physiologically more relevant manner than traditional 2D cell monolayers.

Для 2-мерных и 3-мерных клеточных культур были разработаны разные технологии. Способы выращивания 3-мерной клеточной культуры включают применение планшетов с «висячей каплей», магнитного подвешивания или клеточных каркасов из биоматериалов. Different technologies have been developed for 2D and 3D cell cultures. Methods for growing 3D cell culture include the use of hanging drop plates, magnetic suspension, or biomaterial cell scaffolds.

Согласно одному способу получения сфероидов клетки высевают в лунки, в которых им дают агломерироваться на дне лунки. Когда клетки образуют агломерат, они будут образовывать один или множество сфероидов в каждой лунке. Затем сфероиды могут быть использованы для любой требуемой цели, например, в экспериментах по оценке сфероидов, которые могут включать определение их жизнеспособности, морфологических характеристик или функциональных возможностей, и т.п. In one method of producing spheroids, cells are seeded into wells in which they are allowed to agglomerate at the bottom of the well. When cells form an agglomerate, they will form one or many spheroids in each well. The spheroids can then be used for any desired purpose, for example, in experiments to evaluate the spheroids, which may include determining their viability, morphological characteristics or functionality, and the like.

Настоящее изобретение выполнено с возможностью обеспечения улучшения 3-мерных клеточных культур. The present invention is capable of providing improvement to 3-dimensional cell cultures.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ DISCLOSURE OF THE INVENTION

Авторы настоящего изобретения исследовали процесс 3-мерного культивирования клеток. Неожиданно они обнаружили, что сфероиды могут иметь склонность к агломерированию или слиянию друг с другом в одном и том же месте во время 3-мерного культивирования клеток с образованием одного большого куска ткани. Это может быть проблематичным, поскольку сфероиды сливаются друг с другом, они образуют более крупный кусок ткани. Это означает, что практически невозможно определить точное число сфероидов, присутствующих в указанном более крупном куске ткани, а это означает, что ткань не может быть использована для других экспериментов, в которых важно знать точное число сфероидов. Без ограничения какой-либо теорией авторы настоящего изобретения заметили, что клетки в середине сфероида имеют меньший доступ к питательным веществам по сравнению с клетками, расположенными вблизи наружной части сфероида, так что клетки, расположенные вблизи середины сфероида, имеют склонность к гибели. Если сфероиды агломерируют (что может происходить спустя 5 часов культивирования клеток), то это становится проблематичным, поскольку большее количество клеток в сфероиде будет иметь меньший доступ к питательным веществам. Это также приводит к дополнительному увеличению количества погибших клеток в сфероиде. Это может быть проблематичным по ряду причин, включая следующие: (1) молекулы, высвобождаемые из погибших клеток, могут оказывать отрицательное влияние на другие клетки в сфероиде; (2) погибшие клетки не являются метаболически активными, поэтому метаболическая активность сфероида будет снижена; и (3) многие анализы требуют применения одного сфероида или известного количества сфероидов. Авторы настоящего изобретения попытались решить проблему агломерирования сфероидов в 3-мерных клеточных культурах. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эта проблема может быть легко решена за счет образования прерывистой поверхности на основании камеры для культивирования клеток, такой как лунка многолуночного планшета, таким образом, чтобы сфероиды, находящиеся на прерывистой поверхности в камере, захватывались прерывистой поверхностью. Это обеспечивает эффективное снижение степени агломерирования или слияния сфероидов или же предотвращает его. Положительным моментом является то, что авторы настоящего изобретения обнаружили, что сфероиды можно поддерживать в виде одиночных сфероидов отдельно от других сфероидов. The present inventors have investigated the process of 3D cell culture. Unexpectedly, they discovered that the spheroids can tend to agglomerate, or fuse together, at the same location during 3D cell culture to form one large piece of tissue. This can be problematic because as the spheroids fuse together, they form a larger piece of tissue. This means that it is virtually impossible to determine the exact number of spheroids present in a given larger piece of tissue, meaning that the tissue cannot be used for other experiments in which knowing the exact number of spheroids is important. Without being bound by any theory, the present inventors have observed that cells in the middle of the spheroid have less access to nutrients compared to cells located near the outside of the spheroid, such that cells located near the middle of the spheroid tend to die. If the spheroids agglomerate (which can happen after 5 hours of cell culture), then this becomes problematic since more cells in the spheroid will have less access to nutrients. This also leads to an additional increase in the number of dead cells in the spheroid. This may be problematic for a number of reasons, including the following: (1) molecules released from dead cells may have a negative effect on other cells in the spheroid; (2) dead cells are not metabolically active, so the metabolic activity of the spheroid will be reduced; and (3) many assays require the use of a single spheroid or a known number of spheroids. The authors of the present invention attempted to solve the problem of agglomeration of spheroids in 3-dimensional cell cultures. The inventors of the present invention have surprisingly discovered that this problem can be easily solved by forming a discontinuous surface on the base of a cell culture chamber, such as a well of a multiwell plate, such that spheroids located on the discontinuous surface in the chamber are captured by the discontinuous surface. This effectively reduces or prevents the degree of agglomeration or fusion of spheroids. On the positive side, the present inventors have discovered that spheroids can be maintained as single spheroids separate from other spheroids.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения раскрыт способ уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, включающий использование устройства для культивирования клеток, содержащего: камеру для культивирования клеток, содержащую основание и боковые стенки, проходящие от основания и ограничивающие объем камеры для культивирования клеток; впускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды в камеру; и выпускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды из камеры; причем основание камеры для культивирования клеток имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. In accordance with one aspect of the present invention, a method of reducing or preventing agglomeration of spheroids is disclosed, comprising the use of a cell culture device comprising: a cell culture chamber comprising a base and side walls extending from the base and defining a volume of the cell culture chamber; an inlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid into the chamber; and an outlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid from the chamber; wherein the base of the cell culture chamber has a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of the spheroids.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает (i) обеспечение наличия одного или более отдельных сфероидов; (ii) перенос отдельного сфероида (-ов) в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток; (iii) инкубирование отдельного сфероида (-ов) в устройстве для культивирования клеток; и (iv)получение отдельного сфероида (-ов) на прерывистой поверхности устройства для культивирования клеток.In one embodiment of the present invention, the method includes (i) providing one or more individual spheroids; (ii) transferring the individual spheroid(s) to the cell culture chamber of the cell culture device; (iii) incubating the individual spheroid(s) in a cell culture device; and (iv) obtaining individual spheroid(s) on the discontinuous surface of the cell culture device.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения известное количество отдельных сфероидов переносят на этапе (ii) и известное количество отдельных сфероидов затем получают на этапе (iv).In one embodiment of the present invention, a known number of individual spheroids are transferred in step (ii) and a known number of individual spheroids are then obtained in step (iv).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения прерывистая поверхность содержит множество канавок, причем глубина и ширина указанных канавок составляют от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, более предпочтительно от приблизительно 200 до приблизительно 600 мкм. In one embodiment of the present invention, the discontinuous surface includes a plurality of grooves, the depth and width of said grooves being from about 200 to about 1000 microns, more preferably from about 200 to about 600 microns.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения канавки образуют множество концентрических колец на основании камеры для культивирования клеток. In one embodiment of the present invention, the grooves form a plurality of concentric rings at the base of the cell culture chamber.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения прерывистая поверхность содержит множество отверстий, имеющих закрытое дно и открытую верхнюю часть, причем размеры отверстий, соответствующих по глубине и ширине, приблизительно на 10% больше, чем максимальный диаметр сфероида.In one embodiment of the present invention, the discontinuous surface includes a plurality of holes having a closed bottom and an open top, the holes having corresponding depth and width dimensions approximately 10% larger than the maximum diameter of the spheroid.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения камера для культивирования клеток изготовлена из полиэфирэфиркетона. In one embodiment of the present invention, the cell culture chamber is made of polyetheretherketone.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения камера для культивирования клеток имеет покрытие, причем предпочтительно это покрытие представляет собой покрытие из поли(п-ксилилен) полимера.In one embodiment of the present invention, the cell culture chamber has a coating, preferably the coating being a poly(p-xylylene) polymer coating.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток переносят от приблизительно 40 до приблизительно 100 сфероидов. In one embodiment of the present invention, from about 40 to about 100 spheroids are transferred into the cell culture chamber of the cell culture device.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения поток среды подают в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток, причем расход составляет от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мкл/мин. In one embodiment of the present invention, a flow of media is introduced into the cell culture chamber of the cell culture device at a flow rate of from about 10 to about 1000 μL/min.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения раскрыто применение устройства для культивирования клеток для уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, причем указанное устройство для культивирования клеток содержит: камеру для культивирования клеток, содержащую основание и боковые стенки, проходящие от основания и ограничивающие объем камеры для культивирования клеток; впускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды в камеру; и выпускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды из камеры; причем основание камеры для культивирования клеток имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. In accordance with another aspect of the present invention, the use of a cell culture device for reducing or preventing agglomeration of spheroids is disclosed, the cell culture device comprising: a cell culture chamber comprising a base and side walls extending from the base and delimiting the volume of the cell culture chamber; an inlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid into the chamber; and an outlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid from the chamber; wherein the base of the cell culture chamber has a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of the spheroids.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения раскрыт многолуночный планшет для культивирования клеток, причем по меньшей мере одна из лунок многолуночного планшета для культивирования клеток и/или вставка, содержащаяся по меньшей мере в одной из лунок многолуночного планшета для культивирования клеток, имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. In accordance with another aspect of the present invention, a multiwell cell culture plate is disclosed, wherein at least one of the wells of the multiwell cell culture plate and/or an insert contained in at least one of the wells of the multiwell cell culture plate has a discontinuous surface formed with the ability to reduce or prevent agglomeration of spheroids.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения раскрыта вставка для применения в многолуночном планшете для культивирования клеток, имеющая прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов.In accordance with another aspect of the present invention, there is disclosed an insert for use in a multiwell cell culture plate having a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of spheroids.

В одном варианте осуществления планшет и/или вставку изготавливают из полиэфирэфиркетона. In one embodiment, the tablet and/or insert is made from polyetheretherketone.

В одном варианте осуществления по меньшей мере одно из лунок или вставки имеет покрытие, причем предпочтительно указанное покрытие представляет собой покрытие из поли(п-ксилилен) полимера.In one embodiment, at least one of the wells or inserts is coated, preferably said coating being a poly(p-xylylene) polymer coating.

В одном варианте осуществления по меньшей мере одна лунка и/или вставка содержит отдельный одиночный сфероид.In one embodiment, at least one well and/or insert contains a separate single spheroid.

В одном варианте осуществления основание камеры для культивирования клеток имеет по существу круглую форму.In one embodiment, the base of the cell culture chamber is substantially circular in shape.

В одном варианте осуществления диаметр указанного основания составляет от приблизительно 6 мм ± 5% до приблизительно 22 мм ± 5%, предпочтительно диаметр основания составляет приблизительно 6 мм ± 5%, приблизительно 11 мм ± 5%, приблизительно 16 мм ± 5% или приблизительно 22 мм ± 5%. In one embodiment, the diameter of said base is from about 6 mm ± 5% to about 22 mm ± 5%, preferably the diameter of the base is about 6 mm ± 5%, about 11 mm ± 5%, about 16 mm ± 5%, or about 22 mm ± 5%.

В одном варианте осуществления прерывистая поверхность содержит множество канавок, причем глубина и ширина канавок соответствует максимальному диаметру сфероида ±10%. In one embodiment, the discontinuous surface contains a plurality of grooves, the depth and width of the grooves corresponding to a maximum diameter of the spheroid of ±10%.

В одном варианте осуществления глубина и ширина множества канавок составляет от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, предпочтительно от приблизительно 600 до приблизительно 1000 мкм. In one embodiment, the depth and width of the plurality of grooves is from about 200 to about 1000 microns, preferably from about 600 to about 1000 microns.

В одном варианте осуществления канавки образуют множество концентрических колец на основании камеры для культивирования клеток. In one embodiment, the grooves form a plurality of concentric rings at the base of the cell culture chamber.

В одном варианте осуществления прерывистая поверхность содержит множество отверстий, имеющих закрытое дно и открытую верхнюю часть, причем размеры отверстий, соответствующих по глубине и ширине, приблизительно на 10% больше, чем максимальный диаметр сфероида.In one embodiment, the discontinuous surface includes a plurality of holes having a closed bottom and an open top, the holes having corresponding depth and width dimensions approximately 10% larger than the maximum diameter of the spheroid.

В одном варианте осуществления камера для культивирования клеток содержит среду для культивирования клеток для культивирования сфероидов. In one embodiment, the cell culture chamber contains cell culture medium for culturing spheroids.

В одном варианте осуществления камера для культивирования клеток содержит отдельные сфероиды, захваченные прерывистой поверхностью камеры для культивирования клеток.In one embodiment, the cell culture chamber contains individual spheroids captured on the discontinuous surface of the cell culture chamber.

В одном варианте осуществления сфероиды представляют собой сфероиды из клеток легкого.In one embodiment, the spheroids are spheroids from lung cells.

В одном варианте осуществления поток текучей среды от впускного отверстия до выпускного отверстия камеры для культивирования клеток при присутствии в ней текучей среды составляет от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мкл/мин, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 500 мкл/мин, предпочтительно приблизительно 40 мкл/мин. In one embodiment, the fluid flow from the inlet to the outlet of the cell culture chamber when fluid is present therein is from about 10 to about 1000 μL/min, preferably from about 1 to about 500 μL/min, preferably about 40 μL/min. min.

В одном варианте осуществления напряжение сдвига в камере для культивирования клеток составляет менее приблизительно 0,1 дин/см², например, приблизительно 0,08 дин/см² или менее или же приблизительно 0,04 дин/см². In one embodiment, the shear stress in the cell culture chamber is less than about 0.1 dynes/cm ² , such as about 0.08 dynes/cm ² or less, or about 0.04 dynes/cm ² .

В одном варианте осуществления устройство для культивирования клеток представляет собой многолуночный планшет, а каждая камера многолуночного планшета представляет собой лунку, причем указанный многолуночный планшет содержит по меньшей мере две лунки.In one embodiment, the cell culture device is a multi-well plate, and each chamber of the multi-well plate is a well, wherein the multi-well plate contains at least two wells.

В одном варианте осуществления основание по меньшей мере одной из камер имеет плоскую поверхность, на которой отсутствуют разрывы непрерывности. In one embodiment, the base of at least one of the chambers has a flat surface that has no discontinuities.

В одном варианте осуществления по меньшей мере одна камера содержит вставку, расположенную выше основания камеры, причем предпочтительно вставка размещена на верхней части проницаемой мембраны, расположенной внутри указанной камеры, с образованием поверхности, которая способна обеспечивать культивирование клетки на границе раздела воздух/жидкость. In one embodiment, at least one chamber includes an insert positioned above the base of the chamber, preferably the insert being located on top of a permeable membrane located within said chamber to form a surface that is capable of culturing a cell at an air/liquid interface.

В одном варианте осуществления глубина по меньшей мере одной камеры, имеющей плоскую поверхность, на которой отсутствуют разрывы непрерывности, отличается от глубины по меньшей мере одной камеры, имеющей прерывистую поверхность, причем предпочтительно глубина по меньшей мере одной камеры, имеющей плоскую поверхность, на которой отсутствуют разрывы непрерывности, является меньшей, чем глубина по меньшей мере одной камеры, имеющей прерывистую поверхность. In one embodiment, the depth of the at least one chamber having a flat surface that does not have discontinuities is different from the depth of the at least one chamber having a discontinuous surface, preferably the depth of the at least one chamber having a flat surface that does not have discontinuities. discontinuities is less than the depth of at least one chamber having a discontinuous surface.

В одном варианте осуществления камера для культивирования клеток содержит среду для культивирования клеток для культивирования клетки на границе раздела воздух-жидкость. In one embodiment, the cell culture chamber contains a cell culture medium for culturing a cell at an air-liquid interface.

В одном варианте осуществления камера для культивирования клеток содержит клетки, расположенные на проницаемой мембране, причем указанные клетки способны расти на поверхности раздела воздух-жидкость.In one embodiment, the cell culture chamber contains cells located on a permeable membrane, which cells are capable of growing at an air-liquid interface.

В одном варианте осуществления клетки представляют собой клетки легкого. In one embodiment, the cells are lung cells.

В одном варианте осуществления по меньшей мере две лунки сообщаются по текучей среде друг с другом. In one embodiment, at least two wells are in fluid communication with each other.

Предпочтительно, прерывистая поверхность является такой, как определено в данном документе. Preferably, the discontinuous surface is as defined herein.

Предпочтительно, прерывистую поверхность обеспечивают на основании с использованием механической обработки на станке с числовым программным управлением или литья под давлением. Preferably, the discontinuous surface is provided on the base using CNC machining or injection molding.

Предпочтительно, устройство представляет собой многолуночный планшет. Preferably, the device is a multi-well plate.

Предпочтительно, камера представляет собой лунку. Preferably, the chamber is a well.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На фиг. 1 представлено поперечное сечение лунки с множеством концентрических канавок для захвата отдельных сфероидов (обозначенной как «см. деталь B» на фиг. 4). Размеры указаны в миллиметрах. In fig. 1 shows a cross-section of a well with a plurality of concentric grooves for capturing individual spheroids (labeled “see detail B” in FIG. 4). Dimensions are indicated in millimeters.

На фиг. 2 представлен вид сверху лунки с множеством концентрических канавок для захвата отдельных сфероидов (обозначенной как «см. деталь B» на фиг. 4). Размеры указаны в миллиметрах. In fig. 2 is a top view of a well with multiple concentric grooves for capturing individual spheroids (labeled “see detail B” in FIG. 4). Dimensions are indicated in millimeters.

На фиг. 3 представлен вид сверху лунки, содержащей микрожидкостный канал (обозначенной как «см. деталь С» на фиг. 4). Размеры указаны в миллиметрах. In fig. 3 is a top view of a well containing a microfluidic channel (indicated as “see detail C” in FIG. 4). Dimensions are indicated in millimeters.

На фиг. 4 представлен вид сверху многолуночного планшета, содержащего лунки с множеством концентрических канавок для захвата отдельных сфероидов (обозначенные как «см. деталь B») и лунки, содержащие вставку (обозначенные как «см. деталь С»). Лунки соединены посредством канала таким образом, что каждая из первой лунки («см. деталь B») и второй лунки («см. деталь C») сообщаются друг с другом по текучей среде. Размеры указаны в миллиметрах. In fig. 4 is a top view of a multi-well plate containing wells with a plurality of concentric grooves for capturing individual spheroids (labeled “see detail B”) and wells containing an insert (labeled “see detail C”). The wells are connected by a channel such that each of the first well (see detail B) and the second well (see detail C) are in fluid communication with each other. Dimensions are indicated in millimeters.

На фиг. 5 представлен вид в поперечном сечении по линии C-C на фиг. 4.In fig. 5 is a cross-sectional view taken along line CC in FIG. 4.

На фиг. 6 представлено поперечное сечение лунки с множеством отверстий на ее основании для обеспечения функции захвата отдельных сфероидов (обозначенной как «см. деталь B» на фиг. 8).In fig. 6 is a cross-sectional view of a well with a plurality of holes at its base to provide the function of capturing individual spheroids (indicated as “see detail B” in FIG. 8).

На фиг. 7 представлен вид сверху лунки с множеством отверстий для захвата отдельных сфероидов на ее основании, как показано на фиг. 6. Размеры указаны в миллиметрах. In fig. 7 is a top view of a well with multiple holes for capturing individual spheroids at its base, as shown in FIG. 6. Dimensions are in millimeters.

На фиг. 8 представлен вид сверху многолуночного планшета, содержащего лунки с множеством отверстий для захвата отдельных сфероидов (обозначенные как «см. деталь B») и лунки, содержащие вставку (обозначенные как «см. деталь С»). Лунки соединены посредством канала таким образом, что каждая из первой лунки («см. деталь B») и второй лунки («см. деталь C») сообщаются друг с другом по текучей среде. Размеры указаны в миллиметрах. In fig. 8 is a top view of a multi-well plate containing wells with multiple holes for capturing individual spheroids (labeled “see detail B”) and wells containing an insert (labeled “see detail C”). The wells are connected by a channel such that each of the first well (see detail B) and the second well (see detail C) are in fluid communication with each other. Dimensions are indicated in millimeters.

На фиг. 9 представлен вид в поперечном сечении по линии C-C на фиг. 8.In fig. 9 is a cross-sectional view taken along line CC in FIG. 8.

На фиг. 10 представлены результаты определения напряжения сдвига, вычисленного для каждой из двух разных лунок, показанных на фигуре, и параметры, используемые для вычисления напряжения сдвига.In fig. 10 shows the results of the shear stress calculated for each of the two different dimples shown in the figure and the parameters used to calculate the shear stress.

На фиг. 11(a) показаны агломерированные сфероиды. На фиг. 11(b) показаны расположенные отдельно неагломерированные сфероиды, полученные в соответствии с настоящим изобретением. In fig. 11(a) shows agglomerated spheroids. In fig. 11(b) shows individually located non-agglomerated spheroids obtained in accordance with the present invention.

На фиг. 12 показан график, на котором представлено сравнение количества никотина, оставшегося в планшете из полиэфирэфиркетона (PEEK) и планшете из полидиметилсилоксана (PDMS) после 8 часов инкубации при 4 °C. In fig. Figure 12 is a graph comparing the amount of nicotine remaining in a polyetheretherketone (PEEK) plate and a polydimethylsiloxane (PDMS) plate after 8 hours of incubation at 4°C.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ IMPLEMENTATION OF THE INVENTION

При осуществлении на практике настоящего изобретения применяют, если не указано иное, традиционные методики инженерии, микроинженерии, микробиологии, клеточной биологии и биохимии. Такие методики подробно описаны в литературе, такой как Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Молекулярное клонирование: инструкция по проведению лабораторных работ), второе издание (Самбрук (Sambrook) и др., 1989 г.) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (Олигонуклеотидный синтез) (М.Дж. Гейт (MJ. Gait), ред., 1984 г.); Methods in Molecular Biology (Методы в молекулярной биологии), Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (Клеточная биология: лабораторный журнал) (J. E. CeIMs, ред., 1998 г.) Academic Press; Animal Cell Culture (Клеточная культура животных) (Р.И. Фрешни (R.I. Freshney), ред., 1987 г.); Introduction to Cell and Tissue Culture (Введение в клеточную и тканевую культуру) (Дж. П. Мазер (J. P. Mather) и П.Э. Робертс (P.E. Roberts), 1998 г.) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (Клеточная и тканевая культура: лабораторные процедуры) (А. Дойл (A. Doyle), И.Б. Гриффитс (IB. Griffiths) и Д.Г. Ньювелл (D.G. Newell), ред., 1993-8 гг.) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Методы в энзимологии) (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (Современные протоколы в молекулярной биологии) (Ф.М. Аусубель (F.M. Ausubel) и др., ред., 1987 г.); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Полимеразная цепная реакция), (Маллис (Mullis) и др., ред., 1994 г.). Процедуры, в которых используют коммерчески доступные наборы и реагенты, как правило, применяют в соответствии с протоколами, определенными производителем, если не указано иное.In the practice of the present invention, unless otherwise indicated, conventional techniques of engineering, microengineering, microbiology, cell biology and biochemistry are used. Such techniques are described in detail in literature such as Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. CeIMs, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, I.B. Griffiths and D.G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Methods in Enzymology) (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (Modern protocols in molecular biology) (F.M. Ausubel et al., ed., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994). Procedures using commercially available kits and reagents are generally performed according to protocols specified by the manufacturer unless otherwise noted.

Используемые в данном документе технические термины и выражения имеют значение, которое они обычно имеют в соответствующей области молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и биохимии. Все нижеследующие определения терминов применимы ко всему содержанию настоящей заявки. Technical terms and expressions used herein have the meaning they commonly have in the relevant field of molecular biology, microbiology, cell biology and biochemistry. All of the following definitions of terms apply to the entire contents of this application.

Используемые в данном документе формы единственного числа включают формы единственного и множественного числа, если из контекста явно не следует иное. The singular forms used herein include the singular and plural unless the context clearly indicates otherwise.

Термин «и/или» означает (а) или (b) или же как (а), так и (b).The term “and/or” means (a) or (b) or both (a) and (b).

Термины «содержащий», «содержит» и «состоящий из», используемые в данном документе, являются синонимами терминов «включающий», «включает» или «содержащий в себе», «содержит в себе» и являются включающими или неограничивающими и не исключают дополнительные, не перечисленные детали, элементы или этапы способа. The terms “comprising,” “contains,” and “consisting of,” as used herein, are synonymous with the terms “comprising,” “includes,” or “comprising,” “comprises,” and are inclusive or non-limiting and do not exclude additional , parts, elements or method steps not listed.

Термин «состоящий из» означает, что дополнительные компоненты исключены и имеются только упомянутые элементы и ничего больше.The term "consisting of" means that additional components are excluded and only the mentioned elements are present and nothing more.

Перечисление числовых диапазонов с помощью конечных точек включает все числа и дробные значения, включенные в соответствующие диапазоны, а также перечисленные конечные точки.Enumerating numeric ranges using endpoints includes all numbers and fractional values included in the corresponding ranges, as well as the enumerated endpoints.

Предусматривается, что термин «приблизительно», используемый в данном документе в отношении измеряемого значения, такого как параметр, количество, продолжительность и т.п., охватывает изменение указанного значения и отклонения от него, в частности, изменение на +/-10% или менее, предпочтительно на +/-5% или менее, более предпочтительно на +/-1% или менее и еще более предпочтительно на +/-0,1% или менее от указанного значения, если такие изменения являются допустимыми при осуществлении настоящего изобретения. Следует понимать, что значение, к которому относится модификатор «приблизительно», также конкретно и предпочтительно раскрыто само по себе.The term "about" as used herein in relation to a measured value such as a parameter, quantity, duration, etc. is intended to cover change in and deviations from said value, particularly a change of +/-10% or less, preferably +/-5% or less, more preferably +/-1% or less, and even more preferably +/-0.1% or less of this value, if such changes are acceptable in the practice of the present invention. It should be understood that the meaning to which the modifier "about" refers is also specifically and preferably disclosed in itself.

Принимая во внимание, что термин «один или более», как, например, один или более членов из группы членов, является ясным сам по себе, с целью дополнительного пояснения термин охватывает, среди прочего, ссылку на любой из указанных членов или на любые два или более из указанных членов, как, например, любые ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 или ≥7 и т.д. из указанных членов и вплоть до всех указанных членов.Whereas the term "one or more", such as one or more members of a group of members, is clear in itself, for the purpose of further clarification the term covers, inter alia, reference to any of the specified members or to any two or more of these terms, such as any ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 or ≥7, etc. from the specified members and up to all specified members.

Культивирование клетокCell culture

Культивирование клеток в целом относится к извлечению клеток из ткани перед их выращиванием в искусственной среде. Клетки, подлежащие культивированию, могут быть извлечены непосредственно из ткани, содержащей клетки, подлежащие культивированию, и, необязательно, обработаны ферментными или механическими средствами перед культивированием. В качестве альтернативы, клетки, подлежащие культивированию, могут быть получены из ранее образованного штамма или линии клеток. Cell culture generally refers to the extraction of cells from tissue before growing them in an artificial environment. The cells to be cultured may be extracted directly from the tissue containing the cells to be cultured, and optionally treated by enzymatic or mechanical means prior to culture. Alternatively, the cells to be cultured may be obtained from a previously established strain or cell line.

Культивирование клеток in vitro позволяет получить материал для изучения различных аспектов клетки, в том числе физиологии; биохимии; влияния веществ, в том числе аэрозолей; скрининга и разработки или оптимизации веществ; изучения эффективности веществ; изучения поглощения веществ; скрининговых исследований токсичности; токсикологии; выявления мишеней; фармакокинетики; фармакодинамики и регенеративной медицины, необязательно в режиме реального времени. Cultivating cells in vitro makes it possible to obtain material for studying various aspects of the cell, including physiology; biochemistry; influence of substances, including aerosols; screening and development or optimization of substances; studying the effectiveness of substances; studying the absorption of substances; toxicity screening studies; toxicology; identifying targets; pharmacokinetics; pharmacodynamics and regenerative medicine, not necessarily in real time.

Клетки обычно выращивают в устройстве для культивирования клеток, содержащем камеру или емкость. Примеры таких устройств для культивирования клеток включают бутылки, чашки и планшеты, такие как микротитрационные планшеты или многолуночные планшеты или микропланшеты, колбы, такие как обычные колбы и многослойные колбы для выращивания для выращивания, сосуды и биореакторы. Клетки в культуре, как правило, будут прикрепляться к емкости и расти на дне емкости, погруженной в пригодную клеточную культуру или поддерживающую среду. Камера или емкость содержит отверстия для направления потока среды для культивирования клеток в камеру или емкость или же из камеры или емкости. Cells are typically grown in a cell culture device containing a chamber or container. Examples of such cell culture devices include bottles, dishes and plates such as microtiter plates or multiwell plates or microplates, flasks such as conventional flasks and multilayer culture flasks for growth, vessels and bioreactors. Cells in culture will typically adhere to the container and grow at the bottom of the container, submerged in a suitable cell culture or support medium. The chamber or container contains openings for directing the flow of cell culture medium into or out of the chamber or container.

Устройство для культивирования клеток согласно настоящему изобретению включает камеру для культивирования клеток, содержащую основание и боковые стенки, проходящие от основания и ограничивающие объем камеры для культивирования клеток. Отверстия для направления потока среды для культивирования клеток в камеру и из нее могут включать: (1) впускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды в камеру; и (2) выпускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды из камеры. Камера для культивирования клеток имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, как описано ниже. Предпочтительно, впускное отверстие и выпускное отверстие расположены над указанной прерывистой поверхностью. The cell culture apparatus of the present invention includes a cell culture chamber comprising a base and side walls extending from the base to define a volume of the cell culture chamber. The openings for directing the flow of cell culture medium into and out of the chamber may include: (1) an inlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid into the chamber; and (2) an outlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid from the chamber. The cell culture chamber has a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of spheroids, as described below. Preferably, the inlet and outlet are located above said discontinuous surface.

Устройство для культивирования клетокCell culture device

В одном варианте осуществления устройство для культивирования клеток представляет собой многолуночный планшет в форме плоского планшета, содержащего по меньшей мере две камеры в форме лунок (например, нескольких или множества лунок). В целом, весь планшет является прямоугольным и емкость лунки может составлять от нескольких мкл до нескольких мл, по необходимости. In one embodiment, the cell culture device is a multiwell plate in the form of a flat plate containing at least two well-shaped chambers (eg, multiple or multiple wells). In general, the entire plate is rectangular and the well capacity can be from a few µl to several ml, as required.

По меньшей мере в одной из по меньшей мере двух лунок основание лунки имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов.In at least one of the at least two wells, the base of the well has a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of the spheroids.

Многолуночный планшет может быть изготовлен в различных форматах, например, он может быть 24-, 48-, 96-, 384- или 1536-луночным/камерным и может быть легко выбран специалистом в данной области техники в зависимости от размера и выбора эксперимента, подлежащего проведению. Многолуночный планшет может представлять собой стандартный планшет, который коммерчески доступен и очень хорошо известен специалистам в данной области техники. A multiwell plate can be manufactured in a variety of formats, for example it can be 24-, 48-, 96-, 384- or 1536-well/chamber and can be easily selected by one skilled in the art depending on the size and choice of experiment to be performed. carrying out. The multiwell plate may be a standard plate that is commercially available and very well known to those skilled in the art.

Предпочтительно, если камера имеет форму лунки, ее основание имеет по существу круглую форму. Preferably, if the chamber is shaped like a well, its base is substantially circular.

Предпочтительно, диаметр указанного основания составляет от приблизительно 6 мм ± 5% до приблизительно 22 мм ± 5%, предпочтительно диаметр основания составляет приблизительно 6 мм ± 5%, приблизительно 11 мм ± 5%, приблизительно 16 мм ± 5% или приблизительно 22 мм ± 5%. Preferably, the diameter of said base is from about 6 mm ± 5% to about 22 mm ± 5%, preferably the diameter of the base is about 6 mm ± 5%, about 11 mm ± 5%, about 16 mm ± 5% or about 22 mm ± 5%.

Многолуночный планшет может содержать по меньшей мере две последовательно расположенных лунки. Многолуночный планшет может содержать по меньшей мере две линейно расположенных лунки. A multiwell plate may contain at least two successive wells. A multiwell plate may contain at least two linearly arranged wells.

Лунки в многолуночном планшет расположены в виде рядов. Например, 8-луночный планшет может быть выполнен в виде 2 линейных рядов из 4 смежных лунок в каждом ряду. В качестве другого примера, 24-луночный планшет может быть выполнен в виде 4 линейных рядов из 6 смежных лунок в каждом ряду. В качестве другого примера, 48-луночный планшет может быть выполнен в виде 6 линейных рядов из 8 смежных лунок в каждом ряду. В качестве другого примера, 96-луночный планшет может быть выполнен в виде 8 линейных рядов из 12 смежных лунок в каждом ряду. При необходимости, многолуночные планшеты даже могут быть изготовлены по индивидуальному заказу с требуемым количеством лунок в планшете. The wells in a multiwell plate are arranged in rows. For example, an 8-well plate can be configured as 2 linear rows of 4 adjacent wells in each row. As another example, a 24-well plate can be configured as 4 linear rows of 6 adjacent wells in each row. As another example, a 48-well plate can be configured as 6 linear rows of 8 adjacent wells in each row. As another example, a 96-well plate may be configured as 8 linear rows of 12 adjacent wells in each row. If required, multi-well plates can even be custom-made with the required number of wells per plate.

Устройство для культивирования клеток может быть оснащено крышкой на верхней части устройства, которая позволяет уменьшить испарение среды для культивирования клеток и уменьшить риск загрязнения. Крышку предпочтительно не герметизируют, чтобы воздух мог циркулировать внутри устройства, что может способствовать культивированию/поддержке клеток.The cell culture device may be equipped with a lid on the top of the device to reduce evaporation of the cell culture medium and reduce the risk of contamination. The lid is preferably not sealed to allow air to circulate within the device, which may aid cell culture/maintenance.

Структура устройства для культивирования клеток конкретно не ограничена при условии, что оно не является цитотоксичным и пригодно для культивирования клеток. Оно может быть изготовлено из акриловой смолы, полигликолевой кислоты, смолы стирольного типа, полимолочной кислоты, сополимерной смолы акрилового или стиролового типа, поликарбонатной смолы, смолы на основе поливинилового спирта, смолы на основе сложного полиэфира, сополимерной смолы этилена или винилового спирта, винилхлоридной смолы, термопластичного эластомера, силиконовой смолы или любой их комбинации. Оно может быть изготовлено из политетрафторэтилена (ПТФЭ), нержавеющей стали (например, 316L/1.4435), полиэфирэфиркетона (PEEK), полипропилена, полисульфона или комбинации двух или более из них. При необходимости, может быть применено покрытие, такое как покрытие из поли(п-ксилиленовых) полимеров или поли-2-гема. The structure of the cell culture device is not particularly limited as long as it is non-cytotoxic and suitable for cell culture. It can be made of acrylic resin, polyglycolic acid, styrene type resin, polylactic acid, acrylic or styrene type copolymer resin, polycarbonate resin, polyvinyl alcohol resin, polyester resin, ethylene or vinyl alcohol copolymer resin, vinyl chloride resin, thermoplastic elastomer, silicone resin or any combination thereof. It can be made from polytetrafluoroethylene (PTFE), stainless steel (eg 316L/1.4435), polyetheretherketone (PEEK), polypropylene, polysulfone, or a combination of two or more of these. If necessary, a coating may be applied, such as a coating of poly(p-xylylene) polymers or poly-2-heme.

В некоторых вариантах осуществления применение полиэфирэфиркетона является очень предпочтительным, поскольку он обладает тем преимуществом, что не поглощает малые молекулы, такие как молекулы никотина и NNK, как описано ниже. In some embodiments, the use of polyetheretherketone is highly preferred because it has the advantage of not absorbing small molecules such as nicotine and NNK molecules, as described below.

При необходимости, устройство для культивирования клеток может быть спроектировано с помощью системы автоматизированного проектирования (САПР) или, если устройство для культивирования клеток основано на стандартном многолуночном планшете, можно использовать коммерчески доступный стандартный многолуночный планшет. Спроектированные в САПР планшеты могут быть изготовлены путем микромеханической обработки с применением способов, которые хорошо известны из уровня техники.If necessary, the cell culture device can be designed using a computer-aided design (CAD) system or, if the cell culture device is based on a standard multiwell plate, a commercially available standard multiwell plate can be used. CAD designed tablets can be manufactured by micromachining using methods that are well known in the art.

Устройство для культивирования клеток, такое как многолуночный планшет, содержит впускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды в камеру, и выпускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды из камеры, в некоторых случаях в соседнюю лунку. Это позволяет обеспечить поток текучей среды, такой как среда для культивирования клеток, над сфероидами и их воздействие на поток текучей среды. В некоторых вариантах осуществления это может быть достигнуто, например, путем образования по меньшей мере одного отверстия в одной или более лунках планшета для культивирования клеток, а затем соединения одной или более лунок посредством отверстия(-й) с каналом (например, трубопроводом или трубкой). В одном варианте осуществления канал (каналы) непосредственно выточен или вдавлен в планшете для культивирования клеток для обеспечения соединения по меньшей мере двух лунок. Предпочтительно, канал (каналы) проходит под камерой для культивирования клеток. Канал может содержать проходы на каждом конце. Канал может представлять собой микрожидкостный канал. Как правило, по меньшей мере один конец прохода соединен с насосом. Каждый конец отверстия может заканчиваться в одном и том же насосе или другом насосе. A cell culture device, such as a multiwell plate, includes an inlet at the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid into the chamber, and an outlet at the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid. medium from the chamber, in some cases into an adjacent well. This allows fluid, such as cell culture medium, to flow over the spheroids and influence the fluid flow. In some embodiments, this may be achieved, for example, by forming at least one hole in one or more wells of a cell culture plate and then connecting one or more wells through the hole(s) to a channel (e.g., tubing or tubing) . In one embodiment, the channel(s) are directly machined or pressed into the cell culture plate to provide connection to at least two wells. Preferably, the channel(s) extend underneath the cell culture chamber. A channel may contain passages at each end. The channel may be a microfluidic channel. Typically, at least one end of the passage is connected to a pump. Each end of the hole may end in the same pump or a different pump.

Для соединения канала с первым насосом могут быть применены соединители разных видов. Один пример представляет собой люэровский соединитель, такой как люэровский соединитель с фиксатором или простой трубный соединитель. To connect the channel to the first pump, different types of connectors can be used. One example is a luer lock, such as a locking luer lock or a simple pipe connector.

Канал может быть выполнен с возможностью соединения с сообщением по текучей среде с первым рядом лунок и вторым рядом лунок, и, необязательно, с третьим рядом лунок и т.д., по необходимости. Канал может быть выполнен в виде U-образного изгиба для соединения разных рядов лунок. U-образный изгиб может быть расположен внутри или снаружи устройства для культивирования клеток. Если петля расположена снаружи устройства для культивирования клеток, то соединитель, такой как люэровский соединитель, или люэровский соединитель с фиксатором, или простой трубный соединитель, может быть применен для обеспечения герметичности и включения U-образного изгиба в устройство для культивирования клеток.The channel may be configured to be in fluid communication with the first row of wells and the second row of wells, and optionally with the third row of wells, etc., as needed. The channel can be made in the form of a U-shaped bend to connect different rows of holes. The U-bend may be located inside or outside the cell culture device. If the loop is located outside the cell culture device, then a connector such as a luer lock, or a luer lock with lock, or a simple tubing connector can be used to provide a seal and incorporate the U-bend into the cell culture device.

Для соединения разных каналов друг с другом может быть применена трубка, такая как силиконовая трубка или трубка PharMed^®.A tube, such as silicone tubing or ^PharMed® tubing, can be used to connect the different channels to each other.

При переносе текучей среды по каналу она может выходить из насоса, а затем возвращаться обратно в насос. При необходимости текучая среда может циркулировать через лунки по часовой или против часовой стрелки. При необходимости может быть использовано более одного насоса. As fluid is transferred through the channel, it may exit the pump and then return back to the pump. If necessary, the fluid can circulate through the wells clockwise or counterclockwise. If necessary, more than one pump can be used.

В некоторых вариантах осуществления поток текучей среды от впускного отверстия до выпускного отверстия камеры для культивирования клеток при присутствии в ней текучей среды составляет от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мкл/мин, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 500 мкл/мин, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 500 мкл/мин, предпочтительно приблизительно 40 мкл/мин или, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 60 мкл/мин. Как будет очевидно для специалиста в данной области техники, когда текучая среда протекает через сплошную границу, она будет создавать напряжение сдвига на этой границе, что может привести к нарушению спокойного состояния клеток, подверженных воздействию указанного напряжения сдвига. В контексте настоящего изобретения при перемещении текучей среды по устройству для культивирования клеток будет возникать напряжение сдвига. Требуется, чтобы напряжение сдвига в камере для культивирования клеток составляло менее приблизительно 0,1 дин/см², например, приблизительно 0,08 дин/см² или меньше, или 0,04 дин/см² или меньше, поскольку оно не вызывает нарушения спокойного состояния клеток, подвергающихся воздействию напряжения сдвига. Напряжение сдвига может отличаться в камерах для культивирования клеток различных типов. Например, камера для культивирования клеток с прерывистой поверхностью может характеризоваться напряжением сдвига, составляющим приблизительно 0,04 дин/см². Например, камера для культивирования клеток с плоской и неразрывной поверхностью может характеризоваться напряжением сдвига, составляющим приблизительно 0,08 дин/см². Предпочтительно, напряжение сдвига в камере для культивирования клеток с прерывистой поверхностью является более низким, чем в камере для культивирования клеток с плоской и неразрывной поверхностью. In some embodiments, the fluid flow from the inlet to the outlet of the cell culture chamber when fluid is present therein is from about 10 to about 1000 μL/min, preferably from about 1 to about 500 μL/min, preferably from about 10 to about 500 μl/min, preferably about 40 μl/min, or, preferably from about 1 to about 60 μl/min. As will be apparent to one skilled in the art, when fluid flows across a continuous boundary, it will create shear stress at the boundary, which may disrupt the quiescent state of cells exposed to said shear stress. In the context of the present invention, shear stress will be generated as fluid moves through the cell culture device. The shear stress in the cell culture chamber is required to be less than about 0.1 dyne/cm ² , for example, about 0.08 dyne/cm ² or less, or 0.04 dyne/cm ² or less, since it does not cause disruption quiescent state of cells exposed to shear stress. Shear stress may differ between cell culture chambers of different types. For example, a cell culture chamber with a discontinuous surface may have a shear stress of approximately 0.04 dynes/cm ² . For example, a cell culture chamber with a flat and continuous surface may have a shear stress of approximately 0.08 dynes/cm ² . Preferably, the shear stress in a cell culture chamber with a discontinuous surface is lower than in a cell culture chamber with a flat and continuous surface.

Чтобы для скрининга можно было применять оптический анализ, дно камеры, емкости или лунки может быть выполнено из материала, характеризующегося общим светопропусканием, равным 70%, 80%, 90% или более. To enable optical analysis to be used for screening, the bottom of the chamber, container or well may be made of a material having a total light transmittance of 70%, 80%, 90% or more.

В одном варианте осуществления в устройстве для культивирования клеток используют микрожидкостный планшет для культивирования клеток, который хорошо известен из уровня техники. Например, микрожидкостный планшет для культивирования клеток M04S, производимый компанией Cellasic (Калифорния, США), содержит 4 независимые лунки/камеры, причем диаметр каждой лунки/камеры составляет 2,8 мм при высоте 120 микрон. In one embodiment, the cell culture device uses a microfluidic cell culture plate that is well known in the art. For example, the M04S microfluidic cell culture plate manufactured by Cellasic (California, USA) contains 4 independent wells/chambers, with each well/chamber having a diameter of 2.8 mm and a height of 120 microns.

В одном аспекте устройство для культивирования клеток согласно настоящему изобретению выполнено в виде многолуночного планшета для культивирования клеток. По меньшей мере одна из лунок многолуночного планшета для культивирования клеток может иметь прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. Как будет очевидно для специалиста в данной области техники, устройство для культивирования клеток, такое как многолуночный планшет для культивирования клеток, может содержать различные составные части, которые могут быть соединены друг с другом с образованием полного устройства для культивирования клеток. В процессе эксплуатации не все эти составные части должны присутствовать в устройстве. Таким образом, например, некоторые клетки для использования в настоящем изобретении в некоторых случаях могут быть культивированы во вставках, которые могут быть размещены в лунках планшета для культивирования клеток, как описано ниже в данном документе. Таким образом, в другом аспекте также описана вставка для применения в устройстве для культивирования клеток, таком как многолуночный планшет для культивирования клеток, имеющая прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. Устройство для культивирования клеток и/или вставка могут быть изготовлены из полиэфирэфиркетона, как подробно описано в данном документе. Устройство для культивирования клеток и/или вставка могут иметь покрытие, как подробно описано в данном документе, причем предпочтительно указанное покрытие состоит из поли(п-ксилилен) полимера. Устройство для культивирования клеток и/или вставка могут содержать отдельный одиночный сфероид, как подробно описано в данном документе.In one aspect, the cell culture device of the present invention is configured as a multi-well cell culture plate. At least one of the wells of the multiwell cell culture plate may have a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of the spheroids. As will be apparent to one skilled in the art, a cell culture apparatus, such as a multiwell cell culture plate, may comprise various component parts that may be connected to each other to form a complete cell culture apparatus. During operation, not all of these components must be present in the device. Thus, for example, some cells for use in the present invention in some cases can be cultured in inserts that can be placed in the wells of a cell culture plate, as described below herein. Thus, another aspect also describes an insert for use in a cell culture device, such as a multiwell cell culture plate, having a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of spheroids. The cell culture device and/or insert can be made of polyetheretherketone, as described in detail herein. The cell culture device and/or insert may be coated as described in detail herein, preferably said coating consisting of a poly(p-xylylene) polymer. The cell culture device and/or insert may comprise a separate single spheroid, as described in detail herein.

НасосPump

Один или более насосов, применяемые в настоящем изобретении, могут представлять собой поршневые насосы прямого вытеснения, выполненные с возможностью обеспечения циркуляции текучей среды, такие как перистальтические насосы. Как известно из уровня техники, перистальтический насос представляет собой насос, применяемый для перемещения текучей среды. Текучая среда может содержаться в канале, описанном в данном документе, причем указанный канал может представлять собой гибкую трубу, установленную внутри корпуса насоса. В качестве альтернативы, если канал непосредственно выточен (например, вдавлен) в планшете, для соединения выточенного или вдавленного канала с насосом может быть использован переходник. Ротор, прикрепленный к его внешней окружности, сжимает гибкую трубку или канал. При повороте ротора часть трубы или канала при их сжатии сдавливаются и перекрываются, при этом происходит проталкивание текучей среды через трубу или канал. One or more pumps used in the present invention may be positive displacement piston pumps configured to circulate fluid, such as peristaltic pumps. As is known in the art, a peristaltic pump is a pump used to move a fluid. The fluid may be contained in a channel described herein, which channel may be a flexible pipe installed within the pump casing. Alternatively, if the channel is directly machined (eg pressed) into the tablet, an adapter can be used to connect the machined or pressed channel to the pump. A rotor attached to its outer circumference compresses the flexible tube or channel. When the rotor turns, part of the pipe or channel is compressed and blocked, and the fluid is pushed through the pipe or channel.

В одном варианте осуществления насос (насосы) содержит шаговый двигатель или бесщеточный двигатель, содержащий кодирующее устройство. In one embodiment, the pump(s) comprise a stepper motor or brushless motor containing an encoder.

Каждым двигателем можно управлять с помощью контроллера двигателя, функционированием и датчиками которого можно управлять с помощью микроконтроллера. Each motor can be controlled using a motor controller, the operation and sensors of which can be controlled using a microcontroller.

ВставкиInserts

Некоторые клетки для использования в настоящем изобретении могут быть культивированы во вставках, которые могут быть размещены в лунках устройства для культивирования клеток, по необходимости. Клетки, как правило, выращивают на проницаемой мембране, содержащейся во вставке. Как правило, клетки будут расти на верхней части проницаемой мембраны. Вставку помещают в лунку или камеру. Когда лунку или камеру заполняют текучей средой, такой как среда для культивирования клеток, то текучая среда будет проходить через проницаемую мембрану и вступать в контакт с клетками таким образом, что они могут быть культивированы во вставке. Во вставке можно культивировать клетки разных типов, как описано в данном документе. Вставки коммерчески доступны. В качестве примера могут быть использованы проницаемые вставки для культивирования клеток ThinCert^TM (USA Scientific, Флорида, США). Они доступны с различными размерами и различным внешним покрытием, и могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники для применения в настоящем изобретении. Каждая вставка может иметь самоустанавливающиеся крепления, которые обеспечивают устранение капиллярных эффектов и максимальный доступ микродозатора в лунку за счет расположения вставки с небольшим смещением относительно центра. Вставки для культивирования клеток ThinCert^TM совместимы со стандартными многолуночными планшетами. В качестве другого примера могут быть использованы проницаемые подложки Corning® HTS Transwell® (Sigma Aldrich, Дорсет, Великобритания). Проницаемые подложки Corning® HTS Transwell® содержат матрицу из 24 или 96 лунок с проницаемыми вставками, соединенными жестким желобом. В данном документе раскрыта вставка для применения в многолуночном планшете для культивирования клеток, имеющая прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. Some cells for use in the present invention can be cultured in inserts that can be placed in the wells of the cell culture device, as needed. Cells are typically grown on a permeable membrane contained in an insert. Typically, cells will grow on top of a permeable membrane. The insert is placed into the well or chamber. When a well or chamber is filled with a fluid, such as cell culture medium, the fluid will pass through the permeable membrane and come into contact with the cells so that they can be cultured in the insert. The insert can be used to culture different cell types as described herein. The inserts are commercially available. As an example, ThinCert ^TM permeable cell culture inserts (USA Scientific, Florida, USA) can be used. They are available in different sizes and different outer coatings, and can be easily selected by one skilled in the art for use in the present invention. Each insert can have self-aligning fasteners, which ensure the elimination of capillary effects and maximum access of the microdispenser into the well due to the location of the insert slightly offset from the center. ThinCert ^™ cell culture inserts are compatible with standard multiwell plates. As another example, Corning® HTS Transwell® permeable substrates (Sigma Aldrich, Dorset, UK) can be used. Corning® HTS Transwell® permeable substrates contain an array of 24 or 96 wells with permeable inserts connected by a rigid trough. Disclosed herein is an insert for use in a multiwell cell culture plate having a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of spheroids.

Прерывистая поверхность Intermittent surface

Согласно настоящему изобретению основание камеры для культивирования клеток, такое как основание лунки в многолуночном планшете, или вставка имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. Следует понимать, что не каждая камера, или лунка или вставка, которые могут содержаться в устройстве для культивирования клеток, должны иметь прерывистую поверхность, поскольку не все камеры или лунки могут быть использованы для культивирования сфероидов, а вставка может присутствовать не в каждой лунке. Например, некоторые лунки могут быть использованы для культивирования клеток других типов, которые не требуют применения прерывистой поверхности или вставки. Например, некоторые лунки могут быть использованы для культивирования клеток других типов, которые требуют или не требуют применения вставки для создания поверхности раздела воздух-жидкость. According to the present invention, the base of a cell culture chamber, such as the base of a well in a multiwell plate, or insert has a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of spheroids. It should be understood that not every chamber or well or insert that may be contained in a cell culture device must have a discontinuous surface because not all chambers or wells can be used for culturing spheroids and an insert may not be present in every well. For example, some wells can be used to culture other cell types that do not require the use of a discontinuous surface or insert. For example, some wells may be used to culture other cell types that may or may not require the use of an insert to create an air-liquid interface.

Предпочтительно, прерывистая поверхность удерживает сфероиды, обеспечивая уменьшение или предотвращение их агломерирования или слияния. Предпочтительно, прерывистая поверхность удерживает одиночные сфероиды, обеспечивая уменьшение или предотвращение их агломерирования или слияния. Preferably, the discontinuous surface retains the spheroids to reduce or prevent their agglomeration or coalescence. Preferably, the discontinuous surface retains single spheroids, thereby reducing or preventing their agglomeration or coalescence.

В некоторых вариантах осуществления прерывистая поверхность образована одной или более канавками. Канавки могут быть выполнены с возможностью удерживания сфероидов, уменьшая или предотвращая их агломерирование. Размер канавки(-ок) будет, как правило, соответствовать максимальному диаметру сфероида ±10%, так что сфероиды могут быть захвачены или могут удерживаться в канавке(-ах). Предпочтительно, канавка(-и) будет покрывать большую часть основания камеры для культивирования клеток или вставки, поскольку, если поверхность основания камеры для культивирования клеток или вставки будет плоской, может происходить агломерирование сфероидов, что может приводить к образованию больших клеточных агрегатов, что является нежелательным. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% основания камеры для культивирования клеток или вставки будет содержать прерывистую поверхность, такую как канавка(-и). In some embodiments, the discontinuous surface is formed by one or more grooves. The grooves may be configured to retain the spheroids, reducing or preventing their agglomeration. The size of the groove(s) will typically correspond to a maximum spheroid diameter of ±10% so that spheroids can be captured or retained in the groove(s). Preferably, the groove(s) will cover most of the base of the cell culture chamber or insert because if the base surface of the cell culture chamber or insert is flat, agglomeration of the spheroids may occur, which may result in the formation of large cell aggregates, which is undesirable . In some embodiments, at least 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, or 100% of the base of the cell culture chamber or insert will comprise a discontinuous surface, such as groove(s).

Предпочтительно, глубина и ширина прерывистой поверхности, такой как множество канавок, в основании камеры для культивирования клеток или вставки, составляют от приблизительно 200 мкм до приблизительно 1000 мкм, предпочтительно от приблизительно 200 мкм до приблизительно 600 мкм. Также раскрыты глубина и ширина от приблизительно 600 мкм до приблизительно 1000 мкм. Фактическая глубина и ширина будут определяться размером сфероидов, которые предполагается использовать и захватывать в камере для культивирования клеток или вставке. Таким образом, например, некоторые сфероиды имеют максимальный диаметр приблизительно 600 мкм и в этом случае глубина и ширина прерывистой поверхности, например, представляющей собой множество канавок, будет равна приблизительно 600 мкм ±10%. В некоторых вариантах осуществления требуется, чтобы глубина и ширина прерывистой поверхности, такой как множество канавок, были больше максимального диаметра сфероида, например, на 20%, 30%, 40%, 50% или 60% больше максимального диаметра сфероида. В одном варианте осуществления сфероид имеет максимальный диаметр, составляющий 600 мкм, а прерывистая поверхность, такая как множество канавок, имеет высоту приблизительно 1 мм и ширину приблизительно 1 мм или ширину приблизительно 2 мм. Preferably, the depth and width of the discontinuous surface, such as a plurality of grooves, at the base of the cell culture chamber or insert is from about 200 μm to about 1000 μm, preferably from about 200 μm to about 600 μm. Also disclosed are depths and widths from about 600 microns to about 1000 microns. The actual depth and width will be determined by the size of the spheroids that are intended to be used and captured in the cell culture chamber or insert. Thus, for example, some spheroids have a maximum diameter of approximately 600 µm in which case the depth and width of the discontinuous surface, for example representing a plurality of grooves, will be approximately 600 µm ±10%. In some embodiments, the depth and width of the discontinuous surface, such as a plurality of grooves, is required to be greater than the maximum diameter of the spheroid, such as 20%, 30%, 40%, 50%, or 60% greater than the maximum diameter of the spheroid. In one embodiment, the spheroid has a maximum diameter of 600 μm, and the discontinuous surface, such as a plurality of grooves, has a height of approximately 1 mm and a width of approximately 1 mm or a width of approximately 2 mm.

Как правило, что касается формы канавок, они могут иметь плоское дно, могут быть U-образными, V-образными или V-образными с плоским дном и т.п. В одном варианте осуществления канавки имеют V-образную форму и плоское дно. В одном варианте осуществления максимальная ширина прохода канавки составляет приблизительно 2,4 мм, глубина канавки составляет приблизительно 1 мм и ширина плоского дна в основании канавки составляет приблизительно 400 мкм. Угол между противоположными сторонами канавки в соответствии с данным вариантом осуществления составляет приблизительно 90 градусов. Generally, regarding the shape of the grooves, they may have a flat bottom, may be U-shaped, V-shaped, or V-shaped with a flat bottom, and the like. In one embodiment, the grooves are V-shaped and have a flat bottom. In one embodiment, the maximum width of the groove passage is approximately 2.4 mm, the depth of the groove is approximately 1 mm, and the width of the flat bottom at the base of the groove is approximately 400 μm. The angle between opposite sides of the groove according to this embodiment is approximately 90 degrees.

На фиг. 1 показано устройство 10 для культивирования клеток, содержащее камеру 12 для культивирования клеток с множеством канавок 16 на его основании, содержащем V-образные канавки, каждая из которых имеет плоское дно. Максимальная ширина прохода в канавках составляет приблизительно 2,4 мм, глубина канавок составляет приблизительно 1 мм и ширина плоского дна в основании канавок составляет приблизительно 400 мкм. Угол между противоположными сторонами канавок составляет приблизительно 90 градусов. Хотя множество канавок показано таким образом, что они имеют одинаковую форму, предполагается, что могут быть использованы канавки разной формы. Например, основание камеры для культивирования клеток или вставки может содержать множество канавок, причем форма одной или более канавок отличается. Таким образом, основание камеры для культивирования клеток или вставки может содержать множество канавок, имеющих два или более признаков из плоского дна, U-образной формы, V-образной формы или V-образной формы и плоского дна и т.п. In fig. 1 shows a cell culture device 10 comprising a cell culture chamber 12 with a plurality of grooves 16 on its base comprising V-shaped grooves, each of which has a flat bottom. The maximum passage width of the grooves is approximately 2.4 mm, the depth of the grooves is approximately 1 mm, and the width of the flat bottom at the base of the grooves is approximately 400 μm. The angle between opposite sides of the grooves is approximately 90 degrees. Although the plurality of grooves are shown to have the same shape, it is contemplated that grooves of different shapes may be used. For example, the base of the cell culture chamber or insert may include a plurality of grooves, wherein the shape of one or more of the grooves is different. Thus, the base of the cell culture chamber or insert may include a plurality of grooves having two or more of a flat bottom, a U-shape, a V-shape, or a V-shape and a flat bottom, and the like.

В некоторых вариантах осуществления канавки образуют множество концентрических колец на основании камеры для культивирования клеток или вставки. В одном варианте осуществления радиус концентрических колец составляет приблизительно 1,05 мм, приблизительно 3,45 и приблизительно 5,85 мм. На фиг. 2 показано основание камеры 12 для культивирования клеток с множеством концентрических колец 17, образованных канавками 16, причем радиус концентрических колец составляет приблизительно 1,05 мм, приблизительно 3,45 и приблизительно 5,85 мм. In some embodiments, the grooves form a plurality of concentric rings at the base of the cell culture chamber or insert. In one embodiment, the radius of the concentric rings is approximately 1.05 mm, approximately 3.45 and approximately 5.85 mm. In fig. 2 shows the base of a cell culture chamber 12 with a plurality of concentric rings 17 formed by grooves 16, the radii of the concentric rings being approximately 1.05 mm, approximately 3.45 and approximately 5.85 mm.

На фиг. 4 представлен вид сверху устройства 10 для культивирования клеток в виде многолуночного планшета. Устройство 10 для культивирования клеток содержит множество камер 12 для культивирования клеток в виде лунок, причем лунки содержат либо множество концентрических канавок 17, либо микрожидкостный канал 18. Лунки линейно расположены по рядам. Ряд может содержать по меньшей мере одну лунку, содержащую концентрические канавки 17. Ряд может содержать по меньшей мере одну лунку, содержащую концентрические канавки 17, и по меньшей мере одну лунку, содержащую микрожидкостный канал 18, как показано на фиг. 4. In fig. 4 is a top view of a cell culture device 10 in the form of a multi-well plate. The cell culture apparatus 10 comprises a plurality of cell culture chambers 12 in the form of wells, the wells comprising either a plurality of concentric grooves 17 or a microfluidic channel 18. The wells are linearly arranged in rows. The row may include at least one well containing concentric grooves 17. The row may include at least one well containing concentric grooves 17 and at least one well containing a microfluidic channel 18, as shown in FIG. 4.

Канал 19 соединяет лунку, содержащую множество концентрических канавок 17, и лунку, содержащую микрожидкостный канал 18. Каждая лунка имеет впускное отверстие и выпускное отверстие для обеспечения сообщения по текучей среде с возможностью переноса текучей среды в каждую лунку и из каждой лунки. Хотя на фиг. 4 показано, что каждая камера 12 для культивирования клеток в устройстве 10 для культивирования клеток содержит либо концентрические канавки 17, либо микрожидкостный канал 18, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что каждая камера 12 для культивирования клеток необязательно должна быть выполнена таким образом и что одна или более камер 12 для культивирования клеток могут не содержать концентрические канавки 17 и/или могут не содержать микрожидкостный канал 18. При необходимости некоторые из камер 12 для культивирования клеток могут быть пустыми и могут не использоваться. A channel 19 connects a well containing a plurality of concentric grooves 17 and a well containing a microfluidic channel 18. Each well has an inlet and an outlet for providing fluid communication to transfer fluid to and from each well. Although in FIG. 4 shows that each cell culture chamber 12 in the cell culture device 10 includes either concentric grooves 17 or a microfluidic channel 18, it will be apparent to one skilled in the art that each cell culture chamber 12 need not be configured in this manner and that one or more cell culture chambers 12 may not contain concentric grooves 17 and/or may not contain a microfluidic channel 18. If necessary, some of the cell culture chambers 12 may be empty and may not be used.

В некоторых вариантах осуществления прерывистая поверхность образована одной или более канавками, которые имеют форму волн, проходящих по всему основанию камеры для культивирования клеток или вставки. In some embodiments, the discontinuous surface is formed by one or more grooves that are shaped like waves extending across the entire base of the cell culture chamber or insert.

В некоторых вариантах осуществления прерывистая поверхность содержит множество отверстий. Как правило, эти отверстия имеют закрытое дно и открытую верхнюю часть. Указанные отверстия выполнены с возможностью удерживания отдельных сфероидов, уменьшая или предотвращая их агломерирование. Размер отверстий, как правило, будет соответствовать максимальному диаметру сфероида ±10%, так что сфероиды могут быть захвачены или могут удерживаться в отверстиях. Прерывистая поверхность может содержать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 или же более отверстий, распределенных по всему дну камеры для культивирования клеток. Прерывистая поверхность может содержать от 130 до 160 отверстий, распределенных по всему дну камеры для культивирования клеток. Прерывистая поверхность может содержать от 130 до 150 отверстий, распределенных по всему дну камеры для культивирования клеток. Прерывистая поверхность может содержать от 130 до 140 отверстий, распределенных по всему дну камеры для культивирования клеток. Как правило, что касается формы отверстий, они могут иметь плоское дно, могут быть U-образными, V-образными или V-образными с плоским дном и т.п. Форма отверстий, в частности, не ограничена при условии, что отверстия способны вместить сфероид с максимальным диаметром ±10% для возможности захвата отдельных сфероидов. В некоторых вариантах осуществления глубина и ширина отверстий составляет от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, предпочтительно от приблизительно 600 до приблизительно 1000 мкм. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 70%, 80% или 90% или более основания камеры для культивирования клеток будет занято отверстиями. In some embodiments, the discontinuous surface includes a plurality of holes. Typically, these holes have a closed bottom and an open top. Said openings are configured to hold individual spheroids, reducing or preventing their agglomeration. The size of the holes will generally correspond to a maximum spheroid diameter of ±10% so that spheroids can be captured or retained in the holes. The discontinuous surface may contain 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 or 200 or more holes distributed over the entire bottom of the cell culture chamber. The discontinuous surface may contain 130 to 160 holes distributed throughout the bottom of the cell culture chamber. The discontinuous surface may contain 130 to 150 holes distributed throughout the bottom of the cell culture chamber. The discontinuous surface may contain 130 to 140 holes distributed throughout the bottom of the cell culture chamber. Generally, regarding the shape of the holes, they may have a flat bottom, may be U-shaped, V-shaped, or V-shaped with a flat bottom, etc. The shape of the holes is not particularly limited as long as the holes are capable of accommodating a spheroid with a maximum diameter of ±10% to allow individual spheroids to be captured. In some embodiments, the depth and width of the holes are from about 200 to about 1000 microns, preferably from about 600 to about 1000 microns. In some embodiments, at least 70%, 80%, or 90% or more of the base of the cell culture chamber will be occupied by openings.

На фиг. 6 показано устройство 20 для культивирования клеток, содержащее камеру (лунку) 22 для культивирования клеток с множеством отверстий 26 на его основании. Указанные отверстия имеют закрытое дно и открытую верхнюю часть. Максимальная ширина каждого отверстия составляет приблизительно 0,8 мм, глубина канавок составляет приблизительно 0,5 мм. Угол между противоположными сторонами отверстий составляет приблизительно 118 градусов. Хотя множество отверстий показано таким образом, что они имеют одинаковую форму, предполагается, что могут быть использованы отверстия разной формы. Например, основание камеры для культивирования клеток или вставки может содержать множество отверстий, причем форма одного или более отверстий отличается. Таким образом, основание камеры для культивирования клеток или вставки может содержать множество отверстий, имеющих два или более признаков из плоского дна, U-образной формы, V-образной формы или V-образной формы и плоского дна и т.п. In fig. 6 shows a cell culture device 20 comprising a cell culture chamber 22 with a plurality of openings 26 at its base. These holes have a closed bottom and an open top. The maximum width of each hole is approximately 0.8 mm, the depth of the grooves is approximately 0.5 mm. The angle between the opposite sides of the holes is approximately 118 degrees. Although the plurality of holes are shown to have the same shape, it is contemplated that different shaped holes may be used. For example, the base of the cell culture chamber or insert may include a plurality of openings, wherein the shape of one or more of the openings is different. Thus, the base of the cell culture chamber or insert may include a plurality of openings having two or more of a flat bottom, a U-shape, a V-shape, or a V-shape and a flat bottom, and the like.

На фиг. 7 представлен вид сверху устройства 20 для культивирования клеток, показанного на фиг. 6. Радиус камеры 22 для культивирования клеток составляет приблизительно 8 мм. Радиус основания камеры 22, содержащей множество отверстий 26, составляет приблизительно 5,8 мм. Радиус каждого отверстия 26 составляет приблизительно 0,4 мм. In fig. 7 is a top view of the cell culture apparatus 20 shown in FIG. 6. The radius of the cell culture chamber 22 is approximately 8 mm. The radius of the base of the chamber 22 containing a plurality of holes 26 is approximately 5.8 mm. The radius of each hole 26 is approximately 0.4 mm.

На фиг. 8 представлен вид сверху устройства 20 для культивирования клеток в виде многолуночного планшета. Устройство 21 для культивирования клеток содержит множество камер 22 для культивирования клеток в виде лунок, причем лунки содержат либо множество отверстий 27, либо микрожидкостный канал 28. Лунки 22 линейно расположены по рядам. Ряд может содержать по меньшей мере одну лунку, содержащую множество отверстий 27. Ряд может содержать по меньшей мере одну лунку, содержащую множество отверстий 27, и по меньшей мере одну лунку, содержащую микрожидкостный канал 28. Канал 29 соединяет лунку, содержащую множество отверстий 27, и лунку, содержащую микрожидкостный канал 28. Каждая лунка имеет впускное отверстие и выпускное отверстие для обеспечения сообщения по текучей среде с возможностью переноса текучей среды в каждую лунку и из каждой лунки. In fig. 8 is a top view of a cell culture device 20 in the form of a multiwell plate. The cell culture apparatus 21 includes a plurality of cell culture chambers 22 in the form of wells, the wells comprising either a plurality of openings 27 or a microfluidic channel 28. The wells 22 are linearly arranged in rows. The row may include at least one well containing a plurality of holes 27. The row may contain at least one well containing a plurality of holes 27 and at least one well containing a microfluidic channel 28. A channel 29 connects a well containing a plurality of holes 27, and a well containing a microfluidic channel 28. Each well has an inlet and an outlet for providing fluid communication to transfer fluid to and from each well.

Хотя на фиг. 8 показано, что каждая камера 22 для культивирования клеток в устройстве 21 для культивирования клеток содержит либо отверстия 27, либо микрожидкостный канал 28, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что каждая камера 22 для культивирования клеток необязательно должна быть выполнена таким образом и что одна или более камер 22 для культивирования клеток могут не содержать отверстия 27 и/или могут не содержать микрожидкостный канал 28. При необходимости некоторые из камер 22 для культивирования клеток могут быть пустыми и могут не использоваться. Although in FIG. 8 shows that each cell culture chamber 22 in the cell culture device 21 includes either openings 27 or a microfluidic channel 28, it will be apparent to one skilled in the art that each cell culture chamber 22 need not be configured in this manner and that one or more cell culture chambers 22 may not contain an opening 27 and/or may not contain a microfluidic channel 28. If necessary, some of the cell culture chambers 22 may be empty and may not be used.

Глубина множества камер для культивирования клеток при использовании в соответствии с настоящим изобретением не обязательно должна быть одинаковой по всему устройству для культивирования клеток, и предполагается, что камеры для культивирования клеток, такие как лунки многолуночного планшета, могут иметь различную глубину. В одном варианте осуществления камера для культивирования клеток, имеющая прерывистую поверхность или отверстия, имеет глубину, которая больше, чем у камеры для культивирования клеток, содержащей вставку. Канал, соединяющий по меньшей мере две камеры для культивирования клеток, может быть расположен на одной и той же высоте, так что этот канал расположен на разных расстояниях от основания по меньшей мере двух камер для культивирования клеток. Благодаря такой конфигурации поток текучей среды, поступающий в камеру, не нарушает спокойного состояния сфероидов, удерживаемых на прерывистой поверхности, и в то же время текучая среда все еще может проходить через проницаемую мембрану вставки. The depth of the plurality of cell culture chambers when used in accordance with the present invention need not be the same throughout the cell culture apparatus, and it is contemplated that cell culture chambers, such as the wells of a multiwell plate, may have varying depths. In one embodiment, the cell culture chamber having a discontinuous surface or openings has a depth that is greater than that of the cell culture chamber containing the insert. The channel connecting the at least two cell culture chambers may be located at the same height, such that the channel is located at different distances from the base of the at least two cell culture chambers. Thanks to this configuration, the fluid flow entering the chamber does not disturb the quiescent state of the spheroids held on the discontinuous surface, and at the same time the fluid can still pass through the permeable membrane of the insert.

Данная конфигурация представлена на фиг. 5, на которой показано устройство 10 для культивирования клеток, содержащее первую камеру 12a для культивирования клеток, с множеством канавок 16 в ее основании и вторую камеру 12b для культивирования клеток с микрожидкостным каналом 18 в ней. Первая камера 12a для культивирования клеток имеет глубину, которая превышает глубину второй камеры 12b для культивирования клеток. Первая камера 12a для культивирования клеток имеет глубину приблизительно 20 мм, а вторая камера 12b для культивирования клеток имеет глубину приблизительно 18,3 мм. Канал 19 сообщается по текучей среде с каждой из камер 12a и 12b для культивирования клеток. Канал 19 расположен дальше от основания первой камеры 12a для культивирования клеток по сравнению со второй камерой 12b для культивирования клеток. This configuration is shown in Fig. 5, which shows a cell culture device 10 comprising a first cell culture chamber 12a with a plurality of grooves 16 at its base and a second cell culture chamber 12b with a microfluidic channel 18 therein. The first cell culture chamber 12a has a depth that is greater than the depth of the second cell culture chamber 12b. The first cell culture chamber 12a has a depth of approximately 20 mm, and the second cell culture chamber 12b has a depth of approximately 18.3 mm. Channel 19 is in fluid communication with each of the cell culture chambers 12a and 12b. The channel 19 is located further from the base of the first cell culture chamber 12a compared to the second cell culture chamber 12b.

Аналогичная конфигурация также представлена на фиг. 9, на которой показано устройство 20 для культивирования клеток, содержащее первую камеру 22a для культивирования клеток, с множеством отверстий 26 в ее основании и вторую камеру 22b для культивирования клеток с микрожидкостным каналом 28 в ней. Первая камера 22a для культивирования клеток имеет глубину, которая превышает глубину второй камеры 22b для культивирования клеток. Первая камера 22a для культивирования клеток имеет глубину приблизительно 20 мм, а вторая камера 12b для культивирования клеток имеет глубину приблизительно 18,3 мм. Канал 29 сообщается по текучей среде с каждой из камер 22a и 22b для культивирования клеток. Канал 29 расположен дальше от основания первой камеры 22a для культивирования клеток, чем от основания второй камеры 22b для культивирования клеток. A similar configuration is also shown in FIG. 9, which shows a cell culture device 20 comprising a first cell culture chamber 22a with a plurality of openings 26 at its base and a second cell culture chamber 22b with a microfluidic channel 28 therein. The first cell culture chamber 22a has a depth that is greater than the depth of the second cell culture chamber 22b. The first cell culture chamber 22a has a depth of approximately 20 mm, and the second cell culture chamber 12b has a depth of approximately 18.3 mm. Channel 29 is in fluid communication with each of the cell culture chambers 22a and 22b. The channel 29 is located further from the base of the first cell culture chamber 22a than from the base of the second cell culture chamber 22b.

Сфероиды могут быть использованы в различных экспериментах для оценки одного или более из их жизнеспособности, их морфологических характеристик или функциональных возможностей и т.п. В таких экспериментах может быть важно обеспечить, чтобы в каждом эксперименте было использовано одинаковое количество клеток (а значит и одинаковое количество сфероидов). В случае применения поверхности, отличной от прерывистой, в соответствии с настоящим изобретением несколько сфероидов могут сливаться друг с другом с образованием укрупненной ткани. Может быть сложно определить точное количество сфероидов, присутствующих в указанной укрупненной ткани, а это означает, что ткань не может быть использована для других экспериментов. Использование прерывистой поверхности позволяет увеличить расстояние между сфероидами и уменьшить или предотвратить их слияние, а это означает, что их можно использовать для других экспериментов, поскольку известно количество сфероидов. The spheroids can be used in various experiments to evaluate one or more of their viability, their morphological characteristics or functionality, and the like. In such experiments, it may be important to ensure that the same number of cells (and therefore the same number of spheroids) are used in each experiment. If a surface other than a discontinuous one is used in accordance with the present invention, multiple spheroids can merge with each other to form an enlarged tissue. It may be difficult to determine the exact number of spheroids present in a given enlarged tissue, meaning that the tissue cannot be used for other experiments. Using a discontinuous surface allows the distance between spheroids to be increased and the merging of spheroids to be reduced or prevented, meaning that they can be used for other experiments since the number of spheroids is known.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения раскрыт способ уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, включающий использование устройства для культивирования клеток, содержащего: камеру для культивирования клеток, содержащую основание и боковые стенки, проходящие от основания и ограничивающие объем камеры для культивирования клеток; впускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды в камеру; и выпускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды из камеры; причем основание камеры для культивирования клеток имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. Thus, in accordance with one aspect of the present invention, there is disclosed a method of reducing or preventing agglomeration of spheroids, comprising the use of a cell culture device comprising: a cell culture chamber comprising a base and side walls extending from the base and defining a volume of the cell culture chamber; an inlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid into the chamber; and an outlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid from the chamber; wherein the base of the cell culture chamber has a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of the spheroids.

В одном варианте осуществления способ включает: (i) обеспечение наличия одного или более отдельных сфероидов; (ii) перенос отдельного сфероида(-ов) в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток; (iii) инкубирование отдельного сфероида(-ов) в устройстве для культивирования клеток; и (iv) получение отдельного сфероида(-ов) на прерывистой поверхности устройства для культивирования клеток.In one embodiment, the method includes: (i) providing one or more individual spheroids; (ii) transferring the individual spheroid(s) to the cell culture chamber of the cell culture device; (iii) incubating the individual spheroid(s) in a cell culture device; and (iv) obtaining individual spheroid(s) on the discontinuous surface of the cell culture device.

Отдельные обеспечиваемые сфероиды могут быть перенесены из одного объекта, такого как лунка или планшет для культивирования клеток. Указанный объект может быть отделен от камеры для культивирования клеток устройства для культивирования клеток, в которую будут перенесены отдельные сфероиды. Другими словами, указанный объект может быть физически отделен от камеры для культивирования клеток устройства для культивирования клеток. После инкубации в течение некоторого периода времени в каждой лунке многолуночного планшета присутствует или образуется отдельный сфероид или множество отдельных сфероидов. Отсюда отдельные сфероиды можно перенести в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток, имеющую описанную в данном документе прерывистую поверхность, которая, необязательно, имеет покрытие. Предпочтительно, известное количество отдельных сфероидов может быть перенесено на этапе (ii) и известное количество отдельных сфероидов затем может быть получено на этапе (iv). В одном варианте осуществления в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток переносят от приблизительно 40 до приблизительно 100 сфероидов. Известное количество отдельных сфероидов, полученных на этапе (iv), могут инкубировать в течение некоторого периода времени. Известное количество отдельных сфероидов, полученных на этапе (iv), при необходимости могут подвергать дополнительному экспериментальному анализу. В одном примере настоящего изобретения клетки высевают в каждую лунку многолуночного планшета с необязательной незначительной обработкой для прикрепления и необязательным U-образным дном. Клеткам дают агломерироваться на дне лунки. Как только клетки образуют агломерат, затем они, например, в течение приблизительно 3 дней, будут образовывать сфероид. После инкубации в каждой лунке многолуночного планшета образуется один сфероид или множество сфероидов. Размер сфероида определяется количеством клеток, высеянных в каждую лунку. Отсюда отдельные сфероиды переносят в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток, имеющую описанную в данном документе прерывистую поверхность, которая, необязательно, имеет покрытие. Каждый отдельный сфероид независимо переносят из многолуночного планшета в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток. В одном варианте осуществления в камеру для культивирования клеток устройства для культивирования клеток переносят от приблизительно 40 до 100 отдельных сфероидов. Наконец, устройство для культивирования клеток присоединяют к насосу, который создает поток среды. Отдельные сфероиды, количество которых известно, могут оставаться в данном состоянии в течение от приблизительно 1 до приблизительно 28 дней перед использованием в других экспериментах. The individual spheroids provided can be transferred from a single object, such as a well or cell culture plate. Said object may be separated from the cell culture chamber of the cell culture device into which the individual spheroids will be transferred. In other words, said object may be physically separated from the cell culture chamber of the cell culture device. After incubation for a period of time, an individual spheroid or multiple individual spheroids are present or formed in each well of a multiwell plate. From here, the individual spheroids can be transferred to the cell culture chamber of a cell culture device having a discontinuous surface as described herein, which is optionally coated. Preferably, a known number of individual spheroids can be transferred in step (ii) and a known number of individual spheroids can then be obtained in step (iv). In one embodiment, from about 40 to about 100 spheroids are transferred into the cell culture chamber of the cell culture device. A known number of individual spheroids obtained in step (iv) may be incubated for a period of time. A known number of individual spheroids obtained in step (iv) can be subjected to further experimental analysis if necessary. In one example of the present invention, cells are seeded into each well of a multiwell plate with optional minor attachment treatment and an optional U-shaped bottom. The cells are allowed to agglomerate at the bottom of the well. Once the cells form an agglomerate, they will then, for example, over about 3 days, form a spheroid. After incubation, one spheroid or multiple spheroids are formed in each well of a multiwell plate. The size of the spheroid is determined by the number of cells seeded in each well. From here, the individual spheroids are transferred to a cell culture chamber of a cell culture device having a discontinuous surface as described herein, which is optionally coated. Each individual spheroid is independently transferred from the multiwell plate to the cell culture chamber of the cell culture device. In one embodiment, approximately 40 to 100 individual spheroids are transferred into the cell culture chamber of the cell culture device. Finally, the cell culture device is connected to a pump, which creates a flow of media. Individual spheroids, the number of which is known, can remain in this state for about 1 to about 28 days before being used in other experiments.

Источники клетокCell Sources

В настоящем изобретении используют разные источники клеток. В одном варианте осуществления настоящее изобретение не включает этап выделения или получения образца клеток из объекта. Клетки могут быть криоконсервированными. Клетки могут находиться в 3-мерной клеточной культуре. Клетки могут быть представлены в форме тканей. Клетки могут быть представлены в форме сфероидов. Клетки могут активно делиться. Клетки могут быть культивированы в устройстве для культивирования клеток в присутствии среды для культивирования клеток (например, содержащей питательные вещества (например, белки, пептиды, аминокислоты), источник энергии (например, углеводы), незаменимые металлы и минералы (например, кальций, магний, железо, фосфаты, сульфаты), буферные вещества (например, фосфаты, ацетаты), индикаторы изменения pH (например, феноловый красный, бромкрезоловый пурпурный), селективные вещества (например, химические вещества, противомикробные вещества), и т.д.). Среда для культивирования одиночных клеток может быть использована для выращивания клеток одного типа или разных типов. Для выращивания клеток разных типов могут быть использованы разные среды для культивирования клеток. При циркулировании сред для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением будет происходить смешивание разных сред для культивирования клеток. The present invention uses different cell sources. In one embodiment, the present invention does not include the step of isolating or obtaining a sample of cells from the object. Cells can be cryopreserved. Cells can be in a 3-dimensional cell culture. Cells can be presented in the form of tissues. Cells can be presented in the form of spheroids. Cells can actively divide. Cells may be cultured in a cell culture apparatus in the presence of a cell culture medium (e.g., containing nutrients (e.g., proteins, peptides, amino acids), an energy source (e.g., carbohydrates), essential metals and minerals (e.g., calcium, magnesium, iron, phosphates, sulfates), buffering agents (e.g. phosphates, acetates), pH change indicators (e.g. phenol red, bromocresol purple), selective agents (e.g. chemicals, antimicrobial agents), etc.). Single cell culture media can be used to grow the same cell type or different cell types. Different cell culture media can be used to grow different cell types. When circulating cell culture media in accordance with the present invention, mixing of different cell culture media will occur.

В некоторых вариантах осуществления в среду для культивирования клеток или среды для культивирования клеток добавляют одно или более веществ. Клетки могут быть выделены из ткани или текучей среды с применением способов, хорошо известных в данной области техники. Клетки могут быть отдифференцированы из стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, или непосредственно отдифференцированы из соматических клеток. Клетки могут представлять собой встречающиеся в природе клетки или измененные клетки (например, клетки, содержащие одно или более не встречающихся в природе генетических изменений). Клетка может представлять собой клетку с патологией или клетку с моделью патологии. Например, клетка может представлять собой раковую клетку или клетку, которая может быть индуцирована в гиперпролиферативное состояние (например, трансформированная клетка).In some embodiments, one or more substances are added to the cell culture medium or cell culture medium. Cells can be isolated from tissue or fluid using methods well known in the art. The cells can be differentiated from stem cells, such as embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, or directly differentiated from somatic cells. The cells may be naturally occurring cells or modified cells (eg, cells containing one or more non-naturally occurring genetic variations). The cell may be a cell with a pathology or a cell with a model of the pathology. For example, the cell may be a cancer cell or a cell that can be induced into a hyperproliferative state (eg, a transformed cell).

Клетки могут представлять собой клетки людей или животных или могут быть получены из клеток человека или животных, включая любой из множества видов млекопитающих, предпочтительно человека, но включая крыс, мышей, свиней, кроликов и нечеловекообразных приматов, и т.п. Клетки и линии клеток могут быть получены из коммерческих источников. Клетки могут быть получены из ткани или органа любого требуемого типа, в том числе, без ограничения, из надпочечных желез, мочевого пузыря, кровеносного сосуда, кости, костного мозга, головного мозга, хряща, шейки матки, роговицы, эндометрия, пищевода, желудочно-кишечного тракта, иммунной системы (например, T-лимфоциты, B-лимфоциты, лейкоциты, макрофаги и дендритные клетки), печени, легкого, лимфатической системы, мышцы (например, сердечной мышцы), нервной ткани, яичников, поджелудочной железы (например, островковые клетки), гипофиза, предстательной железы, почки, слюнной железы, кожи, сухожилия, яичка и щитовидной железы, или происходить из них. The cells may be human or animal cells or may be derived from human or animal cells, including any of a variety of mammalian species, preferably humans, but including rats, mice, pigs, rabbits and non-human primates, and the like. Cells and cell lines can be obtained from commercial sources. The cells may be obtained from any desired type of tissue or organ, including, without limitation, adrenal glands, bladder, blood vessel, bone, bone marrow, brain, cartilage, cervix, cornea, endometrium, esophagus, gastrointestinal tract, intestinal tract, immune system (eg, T lymphocytes, B lymphocytes, white blood cells, macrophages, and dendritic cells), liver, lung, lymphatic system, muscle (eg, heart muscle), nervous tissue, ovaries, pancreas (eg, islet cells), pituitary gland, prostate gland, kidney, salivary gland, skin, tendon, testicle and thyroid gland, or originate from them.

Одним типом клеток, представляющим особый интерес, являются клетки легкого, в том числе клетки легочного эпителия. Клетки бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей, в частности, являются применимыми для настоящего изобретения. Клетки бронхиального эпителия человека могут быть отобраны путем соскабливания с легких донора в ходе процедуры бронхоскопии. В одном варианте осуществления клетки легкого представляют собой нормальные клетки бронхиального эпителия человека (Normal Human Bronchial Epithelial, NHBE). Клетки легочного эпителия могут быть культивированы в виде монослоя недифференцированных клеток или из них можно дополнительно вырастить органотипическую ткань, подобную легочному эпителию, на поверхности раздела воздух-жидкость. Клетки легочного эпителия могут быть получены от исследуемых людей или животных с разными патологиями, в том числе от исследуемых людей, классифицированных как курящие или некурящие. One cell type of particular interest is lung cells, including pulmonary epithelial cells. Bronchial epithelial cells and/or respiratory tract epithelial cells are particularly useful for the present invention. Human bronchial epithelial cells can be collected by scraping from the donor's lungs during a bronchoscopy procedure. In one embodiment, the lung cells are normal human bronchial epithelial (NHBE) cells. Pulmonary epithelial cells can be cultured as a monolayer of undifferentiated cells or they can be further grown into organotypic tissue similar to pulmonary epithelium at the air-liquid interface. Pulmonary epithelial cells can be obtained from human subjects or animals with various pathologies, including from human subjects classified as smokers or nonsmokers.

Другим типом клеток, представляющим особый интерес, являются клетки печени. В одном варианте осуществления используемыми клетками являются гепатоциты. Гепатоциты представляют собой клетки печени, которые составляют 70-85% цитоплазматической массы печени. Функциональные возможности гепатоцитов сильно зависят от их способности образовывать фенотип полярности, который устанавливается только при 3-мерном культивировании. Одним из источников клеток печени являются первичные гепатоциты, которые представляют собой модель in vitro, широко используемую для исследования многочисленных аспектов физиологии и патологии печени. Способ, используемый для выделения гепатоцитов человека, может быть основан на двухэтапной перфузии донорской печени коллагеназой. Однако данные клетки не экспрессируют ферменты метаболизма в течение более чем 5 дней. Другим ограничением является их низкая жизнеспособность. Эти недостатки могут быть преодолены за счет применения альтернативных, долгоживущих линий клеток печени, таких как линии клеток-предшественников печени человека или животного. Одним таким примером линии клеток-предшественников печени человека является линия клеток HepaRG™ (ThermoFisher Scientific). Клетки HepaRG™ имеют многие характеристики первичных гепатоцитов человека. Они характеризуются более высокой экспрессией печеночноспецифических генов и генов метаболизма по сравнению с первичными гепатоцитами и большей продолжительностью жизни. Реорганизация клеток HepaRG™ в 3-мерные сфероиды дополнительно увеличивает как продолжительность их жизни, так и возможности, касающиеся метаболизма, что позволяет предположить, что сфероиды могут обеспечить лучшую альтернативную модель печени in vitro для токсикологического тестирования. Сфероиды из клеток печени также могут быть созданы из смеси первичных гепатоцитов и звездчатых клеток печени или первичных гепатоцитов и стволовых клеток, полученных из жировой ткани. Another cell type of particular interest is liver cells. In one embodiment, the cells used are hepatocytes. Hepatocytes are liver cells that make up 70-85% of the cytoplasmic mass of the liver. The functionality of hepatocytes is highly dependent on their ability to form a polarity phenotype, which is established only by 3-dimensional culture. One source of liver cells is primary hepatocytes, which are an in vitro model widely used to study numerous aspects of liver physiology and pathology. The method used to isolate human hepatocytes can be based on a two-step perfusion of the donor liver with collagenase. However, these cells do not express metabolic enzymes for more than 5 days. Another limitation is their low viability. These disadvantages can be overcome by the use of alternative, long-lived liver cell lines, such as human or animal liver progenitor cell lines. One such example of a human liver progenitor cell line is the HepaRG™ cell line (ThermoFisher Scientific). HepaRG™ cells have many of the characteristics of primary human hepatocytes. They are characterized by higher expression of liver-specific genes and metabolic genes compared to primary hepatocytes and a longer lifespan. Reorganization of HepaRG™ cells into 3-dimensional spheroids further increases both their lifespan and metabolic capabilities, suggesting that spheroids may provide a better alternative in vitro liver model for toxicology testing. Liver cell spheroids can also be created from a mixture of primary hepatocytes and liver stellate cells or primary hepatocytes and adipose tissue-derived stem cells.

В одном варианте осуществления клетка легкого представляет собой клетку легочного эпителия, такую как клетка бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей. In one embodiment, the lung cell is a pulmonary epithelial cell, such as a bronchial and/or airway epithelial cell.

В одном варианте осуществления клетка печени представляет собой клетку гепатоцита, предпочтительно клетку HepaRG. In one embodiment, the liver cell is a hepatocyte cell, preferably a HepaRG cell.

Комбинации клетокCell combinations

Также рассматривается применение комбинаций любых клеток, описанных в данном документе. Рассматривается применение комбинаций любых клеток, описанных в данном документе, в устройстве для культивирования клеток или же в системе или устройстве, содержащих указанное устройство для культивирования клеток. Одним примером комбинации клеток является комбинация клеток печени и клеток легкого. Рассматривается комбинация клетки легочного эпителия, такой как клетка бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей, и клетки печени, такой как клетка HepaRG™. При необходимости, вместе с указанной комбинацией могут быть использованы дополнительные клетки. The use of combinations of any of the cells described herein is also contemplated. The use of combinations of any of the cells described herein in a cell culture device or in a system or device containing the specified cell culture device is contemplated. One example of a combination of cells is a combination of liver cells and lung cells. A combination of a pulmonary epithelial cell, such as a bronchial and/or airway epithelial cell, and a liver cell, such as a HepaRG™ cell, is contemplated. If necessary, additional cells can be used along with the specified combination.

Разные клетки комбинации могут быть культивированы в отдельных лунках. Different cells of the combination can be cultured in separate wells.

3-мерное культивирование клеток 3D cell culture

Настоящее изобретение включает применение «3-мерного культивирования клеток», которое включает любой способ, обеспечивающий культивирование клетки в 3-х измерениях с применением или без применения матрикса или клеточного каркаса, такого как проницаемая мембрана во вставке. Был разработан ряд разных способов 3-мерного культивирования клеток, в том числе сфероидных культур и органотипических культур. 3-мерные клетки можно выращивать и/или поддерживать в устройстве для культивирования клеток, описанном в данном документе. The present invention includes the use of "3-dimensional cell culture", which includes any method that enables the culture of a cell in 3 dimensions, with or without the use of a matrix or cell scaffold, such as a permeable membrane in an insert. A number of different methods for 3D cell culture have been developed, including spheroid cultures and organotypic cultures. 3D cells can be grown and/or maintained in the cell culture apparatus described herein.

Термин «сфероид» предполагает значение, которое он обычно имеет в данной области техники, а именно он представляет собой либо одиночную клетку, делящуюся с образованием 3-мерной шарообразной структуры, либо 3-мерный агрегат из множества клеток, с применением или без применения матрикса или клеточного каркаса для поддержания 3-мерного роста клеток в пределах сфероида. 3-мерный сфероид может представлять собой адгезивный сфероид или сфероид, растущий в суспензии. The term "spheroid" implies the meaning it generally has in the art, namely, that it is either a single cell dividing to form a 3-dimensional spherical structure, or a 3-dimensional aggregate of many cells, with or without the use of a matrix or cell scaffold to support 3-dimensional cell growth within a spheroid. The 3-dimensional spheroid may be an adhesive spheroid or a spheroid growing in suspension.

В некоторых вариантах осуществления сфероид содержит клетки одного типа. В некоторых вариантах осуществления сфероид содержит клетки более чем одного типа. В некоторых вариантах осуществления, в которых выращивают более одного сфероида, каждый сфероид может принадлежать к одному и тому же типу, в то время как в других вариантах осуществления выращивают сфероиды двух или более разных типов. In some embodiments, the spheroid contains a single cell type. In some embodiments, the spheroid contains more than one type of cell. In some embodiments in which more than one spheroid is grown, each spheroid may be of the same type, while in other embodiments two or more different types of spheroids are grown.

3-мерные сфероиды в большей степени похожи на ткань in vivo в том, что касается их клеточной коммуникации и формирования внеклеточного матрикса. Указанный матрикс позволяет клеткам перемещаться в пределах сфероида подобно тому, как клетки перемещаются в живой ткани. Таким образом, сфероиды представляют собой значительно улучшенные модели дифференциации, выживаемости, миграции клеток, поляризации клеток, экспрессии генов и роста. 3D spheroids are more tissue-like in vivo in terms of their cellular communication and extracellular matrix formation. This matrix allows cells to move within the spheroid, similar to how cells move in living tissue. Thus, spheroids represent significantly improved models of differentiation, survival, cell migration, cell polarization, gene expression, and growth.

Сфероиды можно собирать и изучать с применением разных способов, хорошо известных в данной области техники, в том числе колориметрического, флуоресцентного и люминесцентного способов анализа с выполнением измерений с помощью планшет-ридера или их можно легко исследовать с применением микроскопии. Дополнительные способы включают вестерн-, нозерн- или саузерн-блоттинг, гистологические методики (например, иммуногистохимический анализ, гибридизацию in situ, иммунофлуоресценцию) и т.п. Также рассматривается применение способов оптической визуализации, таких как обращенная светлопольная микроскопия и флуоресцентная микроскопия. Spheroids can be collected and studied using a variety of techniques well known in the art, including colorimetric, fluorescent and luminescent assays using a plate reader, or can be easily examined using microscopy. Additional methods include Western, Northern or Southern blotting, histological techniques (eg, immunohistochemistry, in situ hybridization, immunofluorescence), and the like. The use of optical imaging techniques such as inverted bright-field microscopy and fluorescence microscopy is also considered.

Варианты применения 3-мерных сфероидов включают изучение пролиферации клеток и тканей in vitro в среде, которая наиболее приближена к существующей in vivo, скрининг соединений, токсикологические анализы, клеточную терапию, доставку клеток, доставку веществ, биохимическое замещение, получение биологически активных молекул, тканевую инженерию, получение биоматериалов и клинические испытания и т.п.Applications of 3D spheroids include studying cell and tissue proliferation in vitro in an environment that approximates in vivo , compound screening, toxicology assays, cell therapy, cell delivery, substance delivery, biochemical displacement, production of bioactive molecules, tissue engineering , obtaining biomaterials and clinical trials, etc.

Применение сфероидов в 3-мерном культивировании клеток в целом рассматривается в Expert Opin. Drug Discov. (2015) 10, 519-540.The application of spheroids in 3D cell culture is discussed generally in Expert Opin. Drug Discov . (2015) 10, 519-540.

3-мерные системы культивирования органов, в частности, в миниатюризированной форме, могут быть применены в настоящем изобретении, поскольку они позволяют изучать функционирование органов в микромасштабе. Может быть изучена реакция на определенные раздражители, реакция на одно или более веществ и фармакокинетическое поведение таких веществ. Миниатюризированные системы для 3-мерного культивирования клеток обеспечивают возможность комплексного изучения групп клеток или органов. Это позволяет воспроизводить вариабельность взаимодействия между разными тканями. 3-мерноекультивирование органов может быть органотипическим, т.е. оно направлено на воспроизведение основных функций органа или системы органов. Также рассматривается миниатюризированная жидкостная система, соединяющая лунки друг с другом. 3D organ culture systems, particularly in miniaturized form, can be used in the present invention as they allow the functioning of organs to be studied on a microscale. The response to certain stimuli, the response to one or more substances, and the pharmacokinetic behavior of such substances may be studied. Miniaturized 3D cell culture systems enable the comprehensive study of groups of cells or organs. This allows the variability of interactions between different tissues to be reproduced. 3D organ culture can be organotypic, i.e. it is aimed at reproducing the basic functions of an organ or organ system. A miniaturized fluidic system connecting the wells to each other is also being considered.

В одном аспекте предложено культивирование сфероидов, при котором сфероиды принимают форму отдельных одиночных сфероидов через 5 часов культивирования или через 5 дней культивирования. Другими словами, сфероиды не агломерируют или не сливаются друг с другом. In one aspect, spheroid culture is provided wherein the spheroids take the form of individual single spheroids after 5 hours of culture or after 5 days of culture. In other words, the spheroids do not agglomerate or merge with each other.

3-мерные культуры на основе клеток печени3-dimensional cultures based on liver cells

Печень играет основную роль в детоксикации, метаболизме углеводов, липидов и белков, а также в биотрансформации эндогенных и экзогенных веществ. Функциональные возможности печени тесно связаны с комплексом высокоспециализированных клеток, большинство из которых представляют собой гепатоциты, включенные в сложную 3-мерную структуру, состоящую из так называемых долек. В результате биотрансформации соединений обычно образуются нетоксичные и лучше растворимые метаболиты, однако иногда могут образовываться более токсичные метаболиты, вызывающие гепатотоксичность. The liver plays a major role in detoxification, metabolism of carbohydrates, lipids and proteins, as well as in the biotransformation of endogenous and exogenous substances. The functionality of the liver is closely related to a complex of highly specialized cells, most of which are hepatocytes, included in a complex 3-dimensional structure consisting of so-called lobules. The biotransformation of compounds usually produces non-toxic and better soluble metabolites, but sometimes more toxic metabolites can be formed that cause hepatotoxicity.

Гепатоциты можно поддерживать в виде 3-х мерных структур с применением различных способов, в том числе путем применения многослойной культуры, клеточного каркаса из твердых материалов, такого как полистирольные клеточные каркасы, гидрогелей, таких как коллаген I типа, или самосборки гепатоцитов в сфероиды. Hepatocytes can be maintained as 3-dimensional structures using a variety of techniques, including the use of multilayer culture, cell scaffolds made of solid materials such as polystyrene cell scaffolds, hydrogels such as type I collagen, or self-assembly of hepatocytes into spheroids.

Хотя свежевыделенные первичные гепатоциты человека могут представлять собой тип клеток печени, предпочтительный для использования, их доступность ограничена. Другие варианты линий клеток печени человека включают клетки HepG2 и Hep2/C3A. Наиболее подходящим источником клеток является линия клеток HepaRG™. Другими источниками гепатоцитов человека являются гепатоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), и гепатоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC).Although freshly isolated primary human hepatocytes may be the liver cell type of choice for use, their availability is limited. Other variants of human liver cell lines include HepG2 and Hep2/C3A cells. The most suitable cell source is the HepaRG™ cell line. Other sources of human hepatocytes are human embryonic stem cell (hESC)-derived hepatocytes and induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes.

В одном варианте осуществления сфероид представляет собой клетку печени или получен из нее с образованием 3-мерного сфероида из клеток печени. Такие сфероиды из клеток печени могут быть получены с использованием различных способов, известных из уровня техники и описанных, например, в ALTEX (2014) 31, 441-477 и Toxicol. Sci.(2013) 133, 67-78.In one embodiment, the spheroid is or is derived from a liver cell to form a 3-dimensional liver cell spheroid. Such spheroids from liver cells can be obtained using various methods known in the art and described, for example, in ALTEX (2014) 31, 441-477 and Toxicol. Sci. (2013) 133, 67-78.

3-мерные культуры на основе клеток легкого3-dimensional cultures based on lung cells

Поскольку морфологические характеристики дыхательного тракта изменяются от верхних к нижним дыхательным путям, было получено множество разных моделей клеточных культур с применением первичных клеток эпителия дыхательных путей или линий клеток, и их применение рассматривается в настоящем раскрытии. Выбор конкретной клетки или линии клеток для применения будет зависеть от участка дыхательного тракта, представляющего интерес для данного исследования.Because the morphological characteristics of the respiratory tract vary from the upper to the lower respiratory tract, many different cell culture models have been developed using primary airway epithelial cells or cell lines, and their use is discussed herein. The choice of the specific cell or cell line to use will depend on the region of the respiratory tract of interest for a given study.

Поскольку поверхность легкого подвергается воздействию воздуха, клеточную модель можно культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость с целью более реалистичной имитации легкого. Because the surface of the lung is exposed to air, the cellular model can be cultured at the air-liquid interface to more realistically simulate the lung.

В одном варианте осуществления 3-мерная культура легкого представляет собой клетку легкого или получена из нее с образованием 3-мерной органотипической ткани. Такие легочные ткани могут быть получены с использованием различных способов, известных из уровня техники и описанных, например, в ALTEX (2014) 31, 441-477 и Toxicol.(2013) 133, 67-78.In one embodiment, the 3-dimensional lung culture is or is derived from a lung cell to form 3-dimensional organotypic tissue. Such lung tissues can be obtained using various methods known in the art and described, for example, in ALTEX (2014) 31, 441-477 and Toxicol. (2013) 133, 67-78.

Скрининг Screening

Устройство для культивирования клеток согласно настоящему изобретению может быть использовано при отборе образцов или скрининге, в некоторых случаях в режиме реального времени. Влияние одного или более веществ на клетки, содержащиеся в устройстве для культивирования клеток, в некоторых случаях может быть определено в режиме реального времени. Планшет для культивирования клеток и/или устройство для отбора образцов можно использовать, например, в разработке средств/лекарственных средств, определении характеристик средств/лекарственных средств, исследовании эффективности и исследовании токсичность и т.п. Его можно использовать в качестве части устройства для отбора образцов или скрининга. Такое исследование включает, без ограничения, оценку фармакологического эффекта, оценку канцерогенности, оценку характеристик средств для медицинской визуализации, оценку периода полувыведения, оценку радиационной безопасности, исследование генотоксичности, исследование иммунотоксичности, исследование воздействия на репродуктивность и развитие, оценку взаимодействий лекарственных средств/веществ, оценку дозы, оценку поглощения, оценку распределения, оценку метаболизма, исследования удаления из организма и т.п. Для определенных исследований могут быть использованы определенные типы клеток (например, гепатоциты для исследования гепатотоксичности, клетки эпителия проксимальных почечных канальцев для исследования нефротоксичности, клетки сосудистого эндотелия для исследования ангитоксичности, нейроны и клетки глии для исследования нейротоксичности, кардиомиоциты для исследования кардиотоксичности). The cell culture device of the present invention can be used for sampling or screening, in some cases in real time. The effect of one or more substances on the cells contained in the cell culture device can in some cases be determined in real time. The cell culture plate and/or sampling device can be used, for example, in drug/drug development, drug/drug characterization, efficacy study and toxicity study, and the like. It can be used as part of a sampling or screening device. Such testing includes, but is not limited to, evaluation of pharmacological effect, evaluation of carcinogenicity, evaluation of performance of medical imaging agents, evaluation of half-life, evaluation of radiation safety, genotoxicity study, immunotoxicity study, reproductive and developmental effects study, evaluation of drug/substance interactions, evaluation of dose, absorption assessment, distribution assessment, metabolism assessment, elimination studies, etc. Specific cell types may be used for specific studies (eg, hepatocytes for hepatotoxicity studies, proximal tubular epithelial cells for nephrotoxicity studies, vascular endothelial cells for angiotoxicity studies, neurons and glial cells for neurotoxicity studies, cardiomyocytes for cardiotoxicity studies).

В одном аспекте описан способ in vitro оценки реакции клетки или ткани на определенное вещество, включающий: (i) приведение клетки или ткани, содержащейся в устройстве для культивирования клеток, описанном в данном документе, в контакт по меньшей мере с одним веществом; и (ii) измерение одной или более реакций после контакта по меньшей мере с одним веществом; причем различие в одной или более реакциях до и после контакта по меньшей мере с одним веществом указывает на то, что это вещество модулирует реакцию клетки или ткани. In one aspect, a method is described for in vitro assessing the response of a cell or tissue to a particular substance, comprising: (i) bringing a cell or tissue contained in a cell culture device described herein into contact with at least one substance; and (ii) measuring one or more reactions after contact with at least one substance; wherein a difference in one or more responses before and after contact with at least one substance indicates that the substance modulates the response of the cell or tissue.

В другом аспекте описан способ in vitro оценки реакции двух или более клеток, тканей или органов на некоторое вещество, включающий: (i) приведение по меньшей мере одного из клеток, тканей или органов, содержащихся в устройстве для культивирования клеток, описанном в данном документе, в контакт по меньшей мере с одним веществом; и (ii) измерение одной или более реакций в одном или более из клеток, тканях или органах после контакта по меньшей мере с одним средством; причем различие в одной или более реакциях в одной или более клетках до и после контакта по меньшей мере с одним веществом указывает на то, что это вещество модулирует реакцию по меньшей мере одной клетки, ткани или одного органа. In another aspect, a method is described for in vitro assessing the response of two or more cells, tissues or organs to a substance, comprising: (i) bringing at least one of the cells, tissues or organs contained in a cell culture device described herein, in contact with at least one substance; and (ii) measuring one or more reactions in one or more cells, tissues or organs after contact with at least one agent; wherein a difference in one or more responses in one or more cells before and after contact with at least one substance indicates that the substance modulates the response of at least one cell, tissue or organ.

Предпочтительно, измеряют или определяют влияние или проникновение по меньшей мере одного вещества в клетку или ткань. Предпочтительно, измеряют или определяют биоактивацию по меньшей мере одного вещества в клетке или ткани. Предпочтительно, измеряют или определяют метаболизм по меньшей мере одного вещества в клетке или ткани. Указанные этапы можно выполнять одновременно или последовательно относительно друг друга. Preferably, the effect or penetration of at least one substance into a cell or tissue is measured or determined. Preferably, the bioactivation of at least one substance in a cell or tissue is measured or determined. Preferably, the metabolism of at least one substance in a cell or tissue is measured or determined. These steps can be performed simultaneously or sequentially relative to each other.

Влияние одного или более веществ на проникновение некоторого вещества, такого как аэрозоль, в одну (один) или более клеток, тканей или органов, а также его биоактивацию или метаболизм в другой клетке или ткани может быть определено с использованием различных способов, хорошо известных в данной области техники. The effect of one or more substances on the penetration of a substance, such as an aerosol, into one or more cells, tissues or organs, as well as its bioactivation or metabolism in another cell or tissue, can be determined using various methods well known in the art. field of technology.

Вещество может быть добавлено в устройство для культивирования клеток и его влияние на культивированную клетку или ткань, содержащуюся в указанном устройстве, можно контролировать или определять. Примеры влияний, которые могут быть измерены, включают расход кислорода, выделение углекислого газа, жизнеспособность клеток, экспрессию белка, активность фермента, проникновение, проницаемость/барьерную функцию, выработку поверхностно-активного вещества, реакцию на цитокины, функцию переносителя, экспрессию цитохрома P450, секрецию альбумина и т.п. The substance can be added to a cell culture device and its effect on the cultured cell or tissue contained in the device can be monitored or determined. Examples of influences that may be measured include oxygen consumption, carbon dioxide production, cell viability, protein expression, enzyme activity, penetration, permeability/barrier function, surfactant production, response to cytokines, transporter function, cytochrome P450 expression, secretion albumin, etc.

Устройство для культивирования клеток могут подвергать воздействию аэрозоля и его влияние на культивируемую клетку или ткань, содержащуюся в нем, можно отслеживать или определять. Примеры влияний, которые могут быть измерены, включают расход кислорода, выделение углекислого газа, жизнеспособность клеток, экспрессию белка, активность фермента, проникновение, проницаемость/барьерную функцию, выработку поверхностно-активного вещества, реакцию на цитокины, функцию переносителя, экспрессию цитохрома P450, секрецию альбумина и т.п. The cell culture device may be exposed to an aerosol and its effect on the cultured cell or tissue contained therein may be monitored or determined. Examples of influences that may be measured include oxygen consumption, carbon dioxide production, cell viability, protein expression, enzyme activity, penetration, permeability/barrier function, surfactant production, response to cytokines, transporter function, cytochrome P450 expression, secretion albumin, etc.

Параллельно можно проводить множество анализов с разными концентрациями вещества с получением отличающейся реакции на разные концентрации. Как известно из уровня техники, в способе определения эффективной концентрации вещества, как правило, используют диапазон концентраций, получаемый в результате разбавления 1:10 или с применением другой степени разбавления в соответствии с логарифмической шкалой. В случае необходимости концентрации можно дополнительно скорректировать путем выполнения второй серии разведений. Как правило, одну из этих концентраций применяют для регулирования с понижением. Multiple assays can be performed in parallel with different concentrations of a substance, obtaining different responses to different concentrations. As is known in the art, the method for determining the effective concentration of a substance typically uses a concentration range resulting from a 1:10 dilution or other dilution rate according to a logarithmic scale. If necessary, concentrations can be further adjusted by performing a second series of dilutions. Typically, one of these concentrations is used for downregulation.

Вещество Substance

Вещество может представлять собой любое представляющее интерес соединение и включает низкомолекулярные органические соединения, полипептиды, пептиды, относительно высокомолекулярные углеводы, полинуклеотиды, жирные кислоты и липиды, наночастицы, аэрозоль или же один или более компонентов аэрозоля и т.п., лекарственное средство, токсин, патоген, антиген, антитело и малую молекулу и т.п. Вещества могут быть подвергнуты скринингу по отдельности или же в наборах или комбинаторных библиотеках соединений. Вещества могут быть получены из широкого спектра источников, включая библиотеки синтетических или природных соединений. Могут быть использованы библиотеки природных соединений в виде бактериальных, грибных, растительных и животных экстрактов. Природные или полученные синтетическим путем библиотеки и соединения, модифицированные с применением традиционных химических, физических и биохимических способов, могут быть использованы для получения комбинаторных библиотек. Известные фармакологические вещества могут быть подвергнуты направленным или случайным химическим модификациям, таким как ацилирование, алкилирование, этерификация, превращение в кислоту с получением структурных аналогов для скрининга. При скрининге с применением комбинаторной библиотеки скрининг может быть осуществлен в отношении большой библиотеки химически сходных или отличающихся веществ. При комбинаторном скрининге количество обнаруженных совпадений пропорционально количеству исследуемых веществ. В отношении большого количества соединений, которое может достигать нескольких тысяч исследуемых в день соединений, можно провести скрининг, в ходе которого может быть использована автоматизированная лабораторная система и робототехника. В уровне техники можно найти много примеров способов синтеза молекулярных библиотек. Низкомолекулярное органическое соединение включает соединение с молекулярной массой, которая меньше приблизительно 5000 дальтонов, обычно менее, чем приблизительно 2500, обычно менее, чем приблизительно 2000, еще чаще менее, чем приблизительно 1500, предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 1000 дальтонов. Низкомолекулярные органические соединения могут представлять собой биологические или синтетические органические соединения. Атомы, присутствующие в низкомолекулярном органическом соединении, как правило, входят в группу, состоящую из атомов углерода, водорода, кислорода и азота, и могут включать атомы галогенов, бора, фосфора, селена и серы, если они представлены в фармацевтически приемлемой форме. Как правило, кислород, азот, сера или фосфор, если они присутствуют, связаны с углеродом, или же с одним или более из них, или с водородом с образованием различных функциональных групп, таких как, например, карбоновые кислоты, спирты, тиолы, карбоксамиды, карбаматы, сложные эфиры карбоновых кислот, амиды, простые эфиры, тиоэфиры, сложные тиоэфиры, фосфаты, фосфонаты, олефины, кетоны, амины, альдегиды и т.п. Низкомолекулярные органические соединения в качестве термина, используемого в данном документе, также включают низкомолекулярные пептиды, низкомолекулярные олигонуклеотиды, низкомолекулярные полисахариды, жирные кислоты, липиды и т.п., имеющие молекулярную массу менее, чем приблизительно 5000 дальтонов.The substance may be any compound of interest and includes low molecular weight organic compounds, polypeptides, peptides, relatively high molecular weight carbohydrates, polynucleotides, fatty acids and lipids, nanoparticles, an aerosol or one or more aerosol components, etc., a drug, a toxin, pathogen, antigen, antibody and small molecule, etc. Compounds can be screened individually or in sets or combinatorial libraries of compounds. Substances can be obtained from a wide range of sources, including libraries of synthetic or natural compounds. Libraries of natural compounds in the form of bacterial, fungal, plant and animal extracts can be used. Natural or synthetically produced libraries and compounds modified using traditional chemical, physical and biochemical methods can be used to obtain combinatorial libraries. Known pharmacological substances can be subjected to targeted or random chemical modifications such as acylation, alkylation, esterification, and acidification to produce structural analogues for screening. In combinatorial library screening, screening can be performed against a large library of chemically similar or dissimilar substances. In combinatorial screening, the number of matches detected is proportional to the number of substances being tested. Large numbers of compounds, up to several thousand compounds tested per day, can be screened using automated laboratory systems and robotics. Many examples of methods for synthesizing molecular libraries can be found in the prior art. A low molecular weight organic compound includes a compound with a molecular weight that is less than about 5000 daltons, typically less than about 2500, typically less than about 2000, more commonly less than about 1500, preferably from about 100 to about 1000 daltons. Low molecular weight organic compounds may be biological or synthetic organic compounds. The atoms present in a low molecular weight organic compound typically fall within the group consisting of carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen atoms, and may include halogen, boron, phosphorus, selenium and sulfur atoms when present in a pharmaceutically acceptable form. Typically, oxygen, nitrogen, sulfur or phosphorus, if present, are associated with carbon, or with one or more of them, or with hydrogen to form various functional groups, such as, for example, carboxylic acids, alcohols, thiols, carboxamides , carbamates, carboxylic acid esters, amides, ethers, thioesters, thioesters, phosphates, phosphonates, olefins, ketones, amines, aldehydes, etc. Low molecular weight organic compounds as used herein also include low molecular weight peptides, low molecular weight oligonucleotides, low molecular weight polysaccharides, fatty acids, lipids, and the like having a molecular weight of less than about 5000 daltons.

Примеры фармацевтических веществ описаны в The Pharmacological Basis of Therapeutics (Фармакологическая основа терапии), Goodman and Gilman, McGraw-Hill, Нью-Йорк, N.Y., (1996 г.), девятое издание. Вещество может представлять собой токсин.Examples of pharmaceutical substances are described in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), ninth edition. The substance may be a toxin.

Анализу могут быть подвергнуты вещества в растворе и твердых образцах, которые могут быть растворены в пригодном растворителе. Вещества в газообразной форме также могут быть подвергнуты анализу путем воздействия на образцы газом в течение некоторого периода времени. Образцы, представляющие интерес, включают образцы окружающей среды, биологические образцы, производственные образцы, библиотеки соединений, а также синтетические и встречающиеся в природе соединения.Substances in solution and solid samples that can be dissolved in a suitable solvent can be analyzed. Substances in gaseous form can also be analyzed by exposing samples to the gas for a period of time. Samples of interest include environmental samples, biological samples, industrial samples, compound libraries, and synthetic and naturally occurring compounds.

Кроме того, скрининг может быть проведен в отношении полипептидов, которые имеют молекулярную массу, равную по меньшей мере приблизительно 5000 дальтонов, еще чаще по меньшей мере приблизительно 10 000 дальтонов. Исследуемые полипептиды, как правило, будут иметь молекулярную массу от приблизительно 5000 до приблизительно 5 000 000 дальтонов или больше, еще чаще будут иметь молекулярную массу от приблизительно 20 000 до приблизительно 1 000 000 дальтонов. Может быть проанализирован широкий спектр полипептидов, таких как, например, семейство полипептидов, имеющих сходные характерные структурные признаки, полипептидов, имеющих конкретные биологические функции, полипептидов, связанных с определенными микроорганизмами, в частности болезнетворными микроорганизмами. Такие полипептиды включают цитокины или интерлейкины, ферменты, протамины, гистоны, альбумины, иммуноглобулины, склерополипептиды, фосфополипептиды, мукополипептиды, хромополипептиды, липополипептиды, нуклеополипептиды, гликополипептиды, T-клеточные рецепторы, протеогликаны, соматотропин, пролактин, инсулин, пепcин, полипептиды, имеющиеся в плазме крови человека, факторы свертывания крови, факторы, определяющие группу крови, пептидные и полипептидные гормоны, раковые антигены, тканеспецифические антигены, маркеры алиментарного статуса, связанные с питанием маркеры и синтетические пептиды, которые могут быть или не быть гликированными. In addition, screening can be performed on polypeptides that have a molecular weight of at least about 5,000 daltons, more typically at least about 10,000 daltons. The polypeptides studied will typically have a molecular weight of from about 5,000 to about 5,000,000 daltons or greater, and more often will have a molecular weight of from about 20,000 to about 1,000,000 daltons. A wide range of polypeptides can be analyzed, such as, for example, a family of polypeptides having similar characteristic structural features, polypeptides having specific biological functions, polypeptides associated with certain microorganisms, in particular pathogens. Such polypeptides include cytokines or interleukins, enzymes, protamines, histones, albumins, immunoglobulins, scleropolypeptides, phosphopolypeptides, mucopolypeptides, chromopolypeptides, lipopolypeptides, nucleopolypeptides, glycopolypeptides, T-cell receptors, proteoglycans, somatotropin, prolactin, insulin, pepsin, polypeptides found in human plasma, coagulation factors, blood group determining factors, peptide and polypeptide hormones, cancer antigens, tissue-specific antigens, nutritional status markers, nutrition-related markers and synthetic peptides that may or may not be glycated.

Скрининг может быть проведен для полинуклеотидов. Исследуемый полинуклеотид может представлять собой природное соединение или синтетическое соединение. Полинуклеотиды включают олигонуклеотиды и состоят из природных нуклеотидов, таких как рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды, и их производных, хотя также рассматриваются неприродные миметики нуклеотидов, такие как 2'-модифицированные нуклеозиды, пептидные нуклеиновые кислоты и олигомерные нуклеозидфосфонаты. Полинуклеотиды с более высокой молекулярной массой могут иметь от приблизительно 20 до приблизительно 5 000 000 или более нуклеотидов. Screening can be performed for polynucleotides. The polynucleotide of interest may be a natural compound or a synthetic compound. Polynucleotides include oligonucleotides and are composed of naturally occurring nucleotides such as ribonucleotides and deoxyribonucleotides and their derivatives, although non-natural nucleotide mimetics such as 2'-modified nucleosides, peptide nucleic acids and oligomeric nucleoside phosphonates are also contemplated. Higher molecular weight polynucleotides may have from about 20 to about 5,000,000 or more nucleotides.

Одна или более переменных величин, которые могут быть измерены, включают поддающиеся количественному определению элементы клеток, субклеточный материал, субклеточные компоненты или клеточные продукты, в частности, элементы, которые могут быть точно измерены с применением высокопроизводительной аналитической системы или устройства. Выходные данные могут представлять собой признак, условие, состояние или функцию любой клетки, клеточного компонента или клеточного продукта, в том числе жизнеспособность, дыхание, метаболизм, детерминанту клеточной поверхности, рецептор, белок или его конформационную или посттрансляционную модификацию, липид, углевод, органическую или неорганическую молекулу, ДНК, РНК и т.п. или часть, полученную из такого клеточного компонента. Хотя переменная(-ые) величина(-ы) может (могут) обеспечивать количественные считываемые данные, в некоторых случаях может быть получен полуколичественный или качественный результат. Считываемые переменные величины могут включать, например, одиночное значение, или среднее значение, или медианное значение, или их дисперсию.The one or more variables that can be measured include quantifiable elements of cells, subcellular material, subcellular components or cellular products, in particular, elements that can be accurately measured using a high-throughput analytical system or device. The output may be a feature, condition, state or function of any cell, cellular component or cellular product, including viability, respiration, metabolism, cell surface determinant, receptor, protein or its conformational or post-translational modification, lipid, carbohydrate, organic or inorganic molecule, DNA, RNA, etc. or a part derived from such a cellular component. Although the variable(s) may provide a quantitative readout, in some cases a semi-quantitative or qualitative result may be obtained. The readout variables may include, for example, a single value, or an average value, or a median value, or a variance thereof.

Могут быть использованы разные способы измерения переменной(-ых) величины (величин) для определения реакции клетки, ткани или органа на вещество. Одним из способов измерения количества присутствующего вещества является мечение вещества поддающимся выявлению компонентом, который может быть флуоресцентным, люминесцентным, радиоактивным, ферментативно активным и т.п. Для мечения биомолекулы, структуры или типа клетки доступны флуоресцентные и люминесцентные компоненты. Иммунофлуоресцентные компоненты могут быть выполнены с возможностью связывания не только с конкретными белками, но и также с конкретными конформациями, продуктами расщепления или модификациями участка, такими как фосфорилирование. Отдельные пептиды и белки могут быть созданы для выполнения автофлуоресценции. Могут быть использованы способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ, радиоиммунологический анализ (radioimmunoassay, RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), а также связанные неферментативные способы. В этих способах используют определенные антитела в качестве репортерных молекул, которые, в частности, являются применимыми из-за их высокой степени специфичности прикрепления к одной молекулярной мишени. Клеточный твердофазный иммуноферментный анализ или соответствующие неферментативные или флуоресцентные способы обеспечивают измерение параметров клеточной поверхности.Various methods of measuring the variable(s) may be used to determine the response of a cell, tissue or organ to a substance. One way to measure the amount of a substance present is to label the substance with a detectable component, which may be fluorescent, luminescent, radioactive, enzymatically active, or the like. Fluorescent and luminescent components are available for labeling a biomolecule, structure or cell type. Immunofluorescent components can be configured to bind not only to specific proteins, but also to specific conformations, cleavage products, or site modifications, such as phosphorylation. Individual peptides and proteins can be engineered to perform autofluorescence. Immunoassay methods such as immunohistochemistry, radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), as well as related non-enzymatic methods, can be used. These methods use certain antibodies as reporter molecules, which are particularly useful because of their high degree of specificity for attachment to a single molecular target. Cellular enzyme-linked immunosorbent assays or corresponding non-enzymatic or fluorescent methods provide measurements of cell surface parameters.

Результаты скрининговых анализов могут быть сравнены с результатами, полученными для эталонных соединений, кривых изменения концентрации, контролей и т.п. Вещество может представлять собой аэрозоль, такой как дым или аэрозоль, полученный из дыма.The results of screening assays can be compared with results obtained for reference compounds, concentration curves, controls, etc. The substance may be an aerosol such as smoke or a smoke-derived aerosol.

Аэрозоль Aerosol

Варианты осуществления настоящего изобретения могут быть использованы для изучения влияния аэрозоля на клетки, органы или ткани или же проникновения аэрозоля в клетки, органы или ткани, когда они содержатся в устройстве для культивирования клеток согласно настоящему изобретению. Аэрозоль может быть получен или образован с помощью устройства, образующего аэрозоль. Курительные изделия и изделия для курения относятся к типам устройств, образующих аэрозоль. Примеры курительных изделий или изделий для курения включают без ограничения сигареты, сигариллы и сигары. В некоторых устройствах, образующих аэрозоль, табачную композицию или другой материал, образующий аэрозоль, вместо сжигания нагревают с помощью одного или более электрических нагревательных элементов для получения аэрозоля. В нагреваемом устройстве, образующем аэрозоль, другого типа аэрозоль образуется в результате передачи тепла от горючего топливного элемента или источника тепла к физически отделенному материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. Как правило, в нагреваемых курительных изделиях аэрозоль образуется в результате передачи тепла от источника тепла к физически отделенному субстрату или материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. При курении летучие соединения высвобождаются из материала, образующего аэрозоль, за счет передачи тепла от источника тепла и захватываются воздухом, втягиваемым через курительное изделие. По мере охлаждения высвобождаемых соединений, они конденсируются с образованием аэрозоля, который вдыхается пользователем. Используемый в данном документе термин «материал, образующий аэрозоль» используется для описания материала, способного при нагревании высвобождать летучие соединения, которые могут образовывать аэрозоль. Материал, образующий аэрозоль, может быть растительного происхождения. Примеры материалов, образующих аэрозоль, включают, без ограничения, табачные композиции, табаки, табачный экстракт, резаный табак, резаный наполнитель, сушеный табак, взорванный табак, гомогенизированный табак, восстановленный табак и табак для трубки. Материал, образующий аэрозоль, в качестве альтернативы может содержать материал нерастительного происхождения.Embodiments of the present invention can be used to study the effect of an aerosol on cells, organs or tissues or the penetration of an aerosol into cells, organs or tissues when contained in a cell culture device according to the present invention. The aerosol may be produced or generated by an aerosol generating device. Smoking products and smoking articles are types of aerosol-generating devices. Examples of smoking or smoking articles include, but are not limited to, cigarettes, cigarillos, and cigars. In some aerosol-forming devices, the tobacco composition or other aerosol-forming material is, instead of being burned, heated by one or more electrical heating elements to produce an aerosol. In another type of heated aerosol-generating device, the aerosol is generated by the transfer of heat from a combustible fuel element or heat source to a physically separate aerosol-forming material that may be located within, around, or downstream of the heat source. Typically, in heated smoking articles, an aerosol is generated by the transfer of heat from a heat source to a physically separate substrate or aerosol-forming material, which may be located within, around, or downstream of the heat source. During smoking, volatile compounds are released from the aerosol-forming material by heat transfer from the heat source and are entrained in air drawn through the smoking article. As the released compounds cool, they condense to form an aerosol that is inhaled by the user. As used herein, the term “aerosol-forming material” is used to describe a material that, when heated, can release volatile compounds that can form an aerosol. The aerosol-forming material may be of plant origin. Examples of aerosol-forming materials include, but are not limited to, tobacco compositions, tobaccos, tobacco extract, cut tobacco, cut filler, dried tobacco, blasted tobacco, homogenized tobacco, reconstituted tobacco, and pipe tobacco. The aerosol-forming material may alternatively comprise material of non-plant origin.

Аэрозоль может присутствовать в виде дыма. Используемый в данном документе термин «дым» используют для описания типа аэрозоля, получаемого при сгорании, например, при курении сигарет, или при сгорании материала, образующего аэрозоль. Дым содержит различные средства, которые в случае необходимости могут быть обеспечены в виде отдельных соединений для исследования. Примеры таких средств включают сухие твердые частицы, не содержащие никотин, монооксид углерода, формальдегид, ацетальдегид, ацетон, акролеин, пропионовый альдегид, кротоновый альдегид, метилэтилкетон, бутиральдегид, бензо[a]пирен, фенол, м-крезол, o-крезол, п-крезол, катехол, резорцин, гидрохинон, 1,3-бутадиен, изопрен, акрилонитрил, бензол, толуол, пиридин, хинолин, стирол, Н'-нитрозонорникотин (NNN), Н′-нитрозоанатабин (NAT), Н′-нитрозоанабазин (NAB), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK), 1-аминонафталин, 2-аминонафталин, 3-аминобифенил, 4-аминобифенил, оксид азота (NOx), цианистоводородную кислоту, аммиак, мышьяк, кадмий, хром, свинец, никель, селен и ртуть. The aerosol may be present in the form of smoke. As used herein, the term “smoke” is used to describe a type of aerosol produced by combustion, such as smoking a cigarette, or by burning a material that forms an aerosol. The smoke contains various agents which, if necessary, can be provided as separate compounds for testing. Examples of such agents include dry solids free of nicotine, carbon monoxide, formaldehyde, acetaldehyde, acetone, acrolein, propionaldehyde, crotonaldehyde, methyl ethyl ketone, butyraldehyde, benzo[a]pyrene, phenol, m-cresol, o-cresol, p -cresol, catechol, resorcinol, hydroquinone, 1,3-butadiene, isoprene, acrylonitrile, benzene, toluene, pyridine, quinoline, styrene, N'-nitrosonornicotine (NNN), N'-nitrosoanatabine (NAT), N'-nitrosoanabasine ( NAB), 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), 1-aminonaphthalene, 2-aminonaphthalene, 3-aminobiphenyl, 4-aminobiphenyl, nitric oxide (NOx), hydrocyanic acid, ammonia , arsenic, cadmium, chromium, lead, nickel, selenium and mercury.

Устройство для культивирования клеток, описанное в данном документе, могут подвергать воздействию дыма в течение разной продолжительности времени. Дым может быть доставлен с помощью модуля Vitrocell Exposure (см. Chem Cent J. (2014) 8(1):62). Может быть выполнено определенное количество затяжек одной сигареты и определенное количество затяжек за минуту воздействия, а количество сигарет может быть изменено для регулирования концентрации воздействия. Эталонные сигареты, такие как эталонные сигареты 3R4F, могут быть использованы в качестве источника дыма и могут быть выкурены на курящем роботе в базовом соответствии с режимом курения, установленным Международной организацией по стандартизации (ISO 2000). The cell culture apparatus described herein may be exposed to smoke for varying lengths of time. Smoke can be delivered using the Vitrocell Exposure module (see Chem Cent J. (2014) 8(1):62). A certain number of puffs per cigarette and a certain number of puffs per minute of exposure can be taken, and the number of cigarettes can be varied to adjust the exposure concentration. Reference cigarettes, such as 3R4F reference cigarettes, can be used as a smoke source and can be smoked on a smoking robot in basic accordance with the smoking regimen established by the International Organization for Standardization (ISO 2000).

ПроизводствоProduction

Устройство для культивирования клеток может быть изготовлено с использованием различных способов изготовления. Например, устройство может быть собрано с использованием деталей, изготовленных способом литья под давлением, или изготовлено в виде однокомпонентной детали. Прерывистая поверхность может быть изготовлена или нанесена с применением механической обработки на станке с числовым программным управлением или литья под давлением. Хотя это и не обязательно, для обеспечения оптической прозрачности предпочтительной является толщина не более 2 мм. Отдельные детали могут быть собраны с применением различных способов, включая, но без ограничения: адгезионное соединение или соединение растворителем, термосваривание или спаивание, обжим, ультразвуковую сварку, лазерную сварку и/или любой другой способ, обычно применяемый для обеспечения герметизации между деталями. The cell culture device can be manufactured using various manufacturing methods. For example, the device may be assembled using injection molded parts or manufactured as a single component part. The discontinuous surface can be manufactured or applied using CNC machining or injection molding. Although not required, a thickness of no more than 2 mm is preferred to ensure optical clarity. The individual parts may be assembled using a variety of methods, including, but not limited to: adhesive or solvent bonding, heat sealing or soldering, crimping, ultrasonic welding, laser welding, and/or any other method commonly used to provide a seal between the parts.

Полиэфирэфиркетон Polyetheretherketone

Как описано в данном документе, устройство для культивирования клеток может быть изготовлено из полиэфирэфиркетона, поскольку он обладает преимуществом, состоящим в том, что он не поглощает малые молекулы. Было исследовано, например, поглощение полиэфирэфиркетоном никотина и NNK, и было установлено, что указанные молекулы не захватываются этим материалом. Это может быть важно, поскольку в случае использования полиэфирэфиркетона не будет происходить захват малых гидрофобных молекул. Таким образом, такие устройства для культивирования клеток, в частности, пригодны для исследования действия лекарственных средств на клетки или ткани, помещенные в это устройство или другие подобные устройства, без какого-либо риска изменения концентрации лекарственного средства (или концентрации его метаболитов) материалом. Соответственно, раскрыто устройство для культивирования клеток или вставка для использования в устройстве для культивирования клеток, содержащем полиэфирэфиркетон или состоящем из него. As described herein, the cell culture device can be made of polyetheretherketone, since it has the advantage that it does not absorb small molecules. For example, the absorption of nicotine and NNK by polyetheretherketone has been studied and it has been found that these molecules are not captured by this material. This may be important because if PEEK is used, small hydrophobic molecules will not be trapped. Thus, such cell culture devices are particularly suitable for studying the effects of drugs on cells or tissues placed in the device or other similar devices, without any risk of altering the concentration of the drug (or the concentration of its metabolites) by the material. Accordingly, a cell culture device or insert for use in a cell culture device containing or consisting of polyetheretherketone is disclosed.

Соответственно, также раскрыто устройство для культивирования клеток, изготовленное (исключительно) из полиэфирэфиркетона. Accordingly, a cell culture device made (solely) of polyetheretherketone is also disclosed.

Также раскрыт планшет для культивирования клеток, содержащий полиэфирэфиркетон или состоящий из него. Also disclosed is a cell culture plate containing or consisting of polyetheretherketone.

Также раскрыт планшет для культивирования клеток, изготовленный (исключительно) из полиэфирэфиркетона. Also disclosed is a cell culture plate made (solely) of polyetheretherketone.

Также раскрыта лунка планшета для культивирования клеток, содержащая полиэфирэфиркетон или состоящая из него. Also disclosed is a well of a cell culture plate containing or consisting of polyetheretherketone.

Также раскрыта лунка планшета для культивирования клеток, изготовленная (исключительно) из полиэфирэфиркетона.Also disclosed is a cell culture plate well made (solely) of polyetheretherketone.

Также раскрыта вставка, содержащая полиэфирэфиркетон или состоящая из него. Also disclosed is an insert containing or consisting of polyetheretherketone.

Также раскрыта вставка, изготовленная (исключительно) из полиэфирэфиркетона. Also disclosed is an insert made (solely) of polyetheretherketone.

Также раскрыт многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащий полиэфирэфиркетон или состоящий из него. Also disclosed is a multiwell cell culture plate containing or consisting of polyetheretherketone.

Также раскрыт многолуночный планшет для культивирования клеток, изготовленный (исключительно) из полиэфирэфиркетона. Also disclosed is a multiwell cell culture plate made (solely) of polyetheretherketone.

Предпочтительно, устройство для культивирования клеток, планшет для культивирования клеток, лунка, многолуночный планшет для культивирования клеток или вставка содержат одну или более малых гидрофобных молекул, например, одно или более низкомолекулярных гидрофобных веществ. В одном варианте осуществления вещество содержит алкалоид табака или состоит из него.Preferably, the cell culture device, cell culture plate, well, multiwell cell culture plate, or insert contains one or more small hydrophobic molecules, for example, one or more low molecular weight hydrophobic substances. In one embodiment, the substance contains or consists of a tobacco alkaloid.

В одном варианте осуществления вещество имеет структуру согласно формуле 1:In one embodiment, the substance has the structure according to Formula 1:

или его фармацевтически приемлемую соль или их смеси; or a pharmaceutically acceptable salt thereof or mixtures thereof;

или, более предпочтительно, структуру согласно формуле 2:or, more preferably, the structure according to formula 2:

или его фармацевтически приемлемую соль или их смеси;or a pharmaceutically acceptable salt thereof or mixtures thereof;

причем:and:

z равно 0 или 1;z is 0 or 1;

R₁ представляет собой Н или C₁-C₇алкил;R ₁ represents H or C ₁ -C ₇ alkyl;

R₂представляет собой H, =O или C₁-C₇алкил;R ₂ represents H, =O or C ₁ -C ₇ alkyl;

R₃ представляет собой H, галоген или C₁-C₇алкил;R ₃ represents H, halogen or C ₁ -C ₇ alkyl;

а пунктирной линией обозначены либо and the dotted line indicates either

(a) одинарные связи;(a) single bonds;

(b) одна углерод-углеродная или углерод-азотная двойная связь и остальные одинарные связи; или(b) one carbon-carbon or carbon-nitrogen double bond and the remaining single bonds; or

(c) две конъюгированные двойные связи, независимо выбранные из углерод-азотной двойной связи и углерод-углеродной двойной связи, и остальные одинарные связи.(c) two conjugated double bonds, independently selected from a carbon-nitrogen double bond and a carbon-carbon double bond, and the remaining single bonds.

Предпочтительно, вещество согласно формуле 2 представляет собой:Preferably, the substance according to formula 2 is:

илиor

или его фармацевтически приемлемую соль или их смеси.or a pharmaceutically acceptable salt thereof or mixtures thereof.

илиor

Более предпочтительно средство согласно формуле 1 или формуле 2 представляет собой алкалоид табака. More preferably, the agent of Formula 1 or Formula 2 is a tobacco alkaloid.

Более предпочтительно вещество согласно формуле 1 или формуле 2 представляет собой никотин, анабазин, норникотин, анатабин, котинин, миосмин или их фармацевтически приемлемую соль, или их смеси.More preferably, the substance of Formula 1 or Formula 2 is nicotine, anabasine, nornicotine, anatabine, cotinine, myosmin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or mixtures thereof.

Термин «алкалоид табака» относится к алкалоиду, который происходит или получен из растения табака, а также может включать синтетический алкалоид табака. Термин «растение табака» относится к растению, принадлежащему к роду Nicotiana, в том числе N. rustica и N. tabacum (например, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают N. acaulis, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. x sanderae. Предпочтительно, растение табака представляет собой N. tabacum. The term "tobacco alkaloid" refers to an alkaloid that is derived from or derived from the tobacco plant, and may also include a synthetic tobacco alkaloid. The term "tobacco plant" refers to a plant belonging to the genus Nicotiana, including N. rustica and N. tabacum (for example, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 and Petico). Other species include N. acaulis, N. acuminata , N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii , N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis , N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides and N. x sanderae. Preferably, the tobacco plant is N. tabacum.

Термин «C₁-C₇алкил» относится к прямой цепи и разветвленным насыщенным углеводородным группам, как правило, имеющим от 1 до 7 атомов углерода; более предпочтительно к C₁-C₆алкилу; более предпочтительно C₁-C₃алкилу. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, втор-бутил, изо-бутил, т-бутил, пент-1-ил, пент-2-ил, пент-3-ил, 3-метилбут-1-ил, 3-метилбут-2-ил, 2-метилбут-2-ил, 2,2,2-триметилэт-1-ил, н-гексил, н-гептил и т.п. Предпочтительно, алкильной группой является метил.The term "C ₁ -C ₇ alkyl" refers to straight chain and branched saturated hydrocarbon groups typically having from 1 to 7 carbon atoms; more preferably C ₁ -C ₆ alkyl; more preferably C ₁ -C ₃ alkyl. Examples of alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, iso-butyl, t-butyl, pent-1-yl, pent-2-yl, pent-3-yl, 3-methylbut-1-yl, 3-methylbut-2-yl, 2-methylbut-2-yl, 2,2,2-trimethyleth-1-yl, n-hexyl, n-heptyl, etc. Preferably, the alkyl group is methyl.

Термин «галоген» относится к фтору F, хлору Cl, брому Br или йоду I. Подходящим галогеном является Cl.The term "halogen" refers to fluorine F, chlorine Cl, bromine Br or iodine I. A suitable halogen is Cl.

В другом варианте осуществления вещество представляет собой табак- специфический нитрозамин (TSNA), который представляет собой химическое соединение, образованное путем нитрозирования вторичных и третичных аминов алкалоидов табака, в том числе никотина, норникотина, анатабина и анабазина. TSNA встречаются в табаке и табачных продуктах. Предпочтительно TSNA представляет собой N-нитрозоникотин (NNN), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK), N-нитрозоанабазин (NAB), N-нитрозоанатабин (NAT), 4-(метилнитрозамино)4-(3-пиридил)бутаналь (NNA), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанол (NNAL), 4-(метилнитрозамино)4-(3-пиридил)-1-бутанол (изо-NNAL) или 4-(метилнитрозамино)-4-(3-пиридил)-1-масляную кислоту (изо-NNAC), или их фармацевтически приемлемые соли, или их смеси. Более предпочтительно TSNA представляет собой 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK) или его фармацевтически приемлемую соль.In another embodiment, the substance is a tobacco-specific nitrosamine (TSNA), which is a chemical compound formed by nitrosation of secondary and tertiary amines of tobacco alkaloids, including nicotine, nornicotine, anatabine and anabasine. TSNAs are found in tobacco and tobacco products. Preferably the TSNA is N-nitrosonicotine (NNN), 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), N-nitrosoanabasine (NAB), N-nitrosoanatabine (NAT), 4-(methylnitrosamino )4-(3-pyridyl)butanal (NNA), 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL), 4-(methylnitrosamino)4-(3-pyridyl)-1-butanol (iso-NNAL) or 4-(methylnitrosamino)-4-(3-pyridyl)-1-butyric acid (iso-NNAC), or pharmaceutically acceptable salts thereof, or mixtures thereof. More preferably, TSNA is 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Предпочтительно, органический растворитель выбран из насыщенных алифатических углеводородов (например, н-пентана, н-гексана, н-гептана, н-октана); ароматических углеводородов (например, бензола, толуола, ксилолов); алифатических спиртов (например, метанола, этанола, пропан-1-ола, пропан-2-ола, бутан-1-ола, 2-метилпропан-1-ола, бутан-2-ола, 2-метилпропан-2-ола, пентан-1-ола, 3-метилбутан-1-ола, гексан-1-ола, 2-метоксиэтанола, 2-этоксиэтанола, 2-бутоксиэтанола, 2-(2-метоксиэтокси)-этанола, 2-(2-этоксиэтокси)-этанола, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанола); простых эфиров, при условии, что простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан); кетонов (например, ацетона, метилэтилкетона); сложных эфиров (метилацетата, этилацетата); азотсодержащих растворителей (например, формамида, N, N-диметилформамида, ацетонитрила, N-метилпирролидона, пиридина, хинолина, нитробензола); серосодержащих растворителей, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид); и фосфорсодержащих растворителей (например, гексаметилфосфортриамида).Preferably, the organic solvent is selected from saturated aliphatic hydrocarbons (eg n-pentane, n-hexane, n-heptane, n-octane); aromatic hydrocarbons (eg benzene, toluene, xylenes); aliphatic alcohols (e.g. methanol, ethanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, 2-methylpropan-1-ol, butan-2-ol, 2-methylpropan-2-ol, pentane -1-ol, 3-methylbutan-1-ol, hexan-1-ol, 2-methoxyethanol, 2-ethoxyethanol, 2-butoxyethanol, 2-(2-methoxyethoxy)-ethanol, 2-(2-ethoxyethoxy)-ethanol , 2-(2-butoxyethoxy)-ethanol); ethers, provided that the ether is not tetrahydrofuran (e.g. diethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, 1,2-dimethoxyethane, 1,2-diethoxyethane, 1-methoxy-2-(2-methoxyethoxy )-ethane, 1-ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)-ethane, 1,4-dioxane); ketones (eg acetone, methyl ethyl ketone); esters (methyl acetate, ethyl acetate); nitrogen-containing solvents (for example, formamide, N, N-dimethylformamide, acetonitrile, N-methylpyrrolidone, pyridine, quinoline, nitrobenzene); sulfur-containing solvents, provided that the sulfur-containing solvent is not dimethyl sulfoxide (for example, carbon disulfide, tetrahydrothiophene-1,1-dioxide); and phosphorus-containing solvents (for example, hexamethylphosphortriamide).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой насыщенный алифатический углеводород (например, н-пентан, н-гексан, н-гептан, н-октан).In one embodiment, the organic solvent is a saturated aliphatic hydrocarbon (eg, n-pentane, n-hexane, n-heptane, n-octane).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой ароматический углеводород (например, бензол, толуол, ксилолы).In one embodiment, the organic solvent is an aromatic hydrocarbon (eg, benzene, toluene, xylenes).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой алифатический спирт (например, метанол, этанол, пропан-1-ол, пропан-2-ол, бутан-1-ол, 2-метилпропан-1-ол, бутан-2-ол, 2-метилпропан-2-ол, пентан-1-ол, 3-метилбутан-1-ол, гексан-1-ол, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, 2-бутоксиэтанол, 2-(2-метоксиэтокси)-этанол, 2-(2-этоксиэтокси)-этанол, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанол). In one embodiment, the organic solvent is an aliphatic alcohol (e.g., methanol, ethanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, 2-methylpropan-1-ol, butan-2-ol, 2 -methylpropan-2-ol, pentan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol, hexan-1-ol, 2-methoxyethanol, 2-ethoxyethanol, 2-butoxyethanol, 2-(2-methoxyethoxy)-ethanol, 2 -(2-ethoxyethoxy)-ethanol, 2-(2-butoxyethoxy)-ethanol).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой простой эфир при условии, что этот простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан). In one embodiment, the organic solvent is an ether, provided that the ether is not tetrahydrofuran (e.g., diethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, 1,2-dimethoxyethane, 1,2-diethoxyethane, 1- methoxy-2-(2-methoxyethoxy)-ethane, 1-ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)-ethane, 1,4-dioxane).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой кетон (например, ацетон, метилэтилкетон). In one embodiment, the organic solvent is a ketone (eg, acetone, methyl ethyl ketone).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой сложный эфир (метилацетат, этилацетат).In one embodiment, the organic solvent is an ester (methyl acetate, ethyl acetate).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой азотсодержащий растворитель (например, формамид, N, N-диметилформамид, ацетонитрил, N-метилпирролидон, пиридин, хинолин, нитробензол).In one embodiment, the organic solvent is a nitrogen-containing solvent (eg, formamide, N,N-dimethylformamide, acetonitrile, N-methylpyrrolidone, pyridine, quinoline, nitrobenzene).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой серосодержащий растворитель, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид).In one embodiment, the organic solvent is a sulfur-containing solvent, provided that the sulfur-containing solvent is not dimethyl sulfoxide (eg, carbon disulfide, tetrahydrothiophene-1,1-dioxide).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой фосфорсодержащий растворитель (например, гексаметилфосфорный триамид).In one embodiment, the organic solvent is a phosphorus-containing solvent (eg, hexamethylphosphoric triamide).

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой простой петролейный эфир. In one embodiment, the organic solvent is not petroleum ether.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой толуол.In one embodiment, the organic solvent is not toluene.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой ацетон.In one embodiment, the organic solvent is not acetone.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой этанол. В одном варианте осуществления средство представляет собой никотин или NNK или их комбинацию.In one embodiment, the organic solvent is not ethanol. In one embodiment, the agent is nicotine or NNK or a combination thereof.

Предпочтительно, способы, которые были обсуждены выше, включают дополнительный этап приведения клетки в устройстве для культивирования клеток в контакт с одной или более малыми гидрофобными молекулами или одним или более органическими растворителями, которые обсуждались выше. Preferably, the methods that have been discussed above include the additional step of bringing a cell in a cell culture device into contact with one or more small hydrophobic molecules or one or more organic solvents as discussed above.

Предпочтительно, устройство для культивирования клеток может содержать клетку, содержащуюся в среде для культивирования клеток, и, необязательно, одну или более малых гидрофобных молекул или же один или более органических растворителей, которые обсуждались выше.Preferably, the cell culture device may comprise a cell contained in a cell culture medium, and optionally one or more small hydrophobic molecules or one or more organic solvents as discussed above.

Также раскрыт способ определения влияния (например, реакции на воздействие) одного или более веществ на клетку, включающий: (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, описанным в данном документе, таким как планшет для культивирования клеток, или многолуночный планшет для культивирования клеток или вставка, содержащим полиэфирэфиркетон или состоящим из него; (ii) воздействие на клетку одной или более малыми гидрофобными молекулами или органическими растворителями, которые обсуждались выше; и (iii) определение влияния вещества (веществ) на клетку. Also disclosed is a method for determining the effect (e.g., response to exposure) of one or more substances on a cell, comprising: (i) contacting the cell with a cell culture device described herein, such as a cell culture plate, or a multiwell plate for cell culture or insert containing or consisting of polyetheretherketone; (ii) exposing the cell to one or more of the small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above; and (iii) determining the effect of the substance(s) on the cell.

Также раскрыт способ определения влияния (например, реакции на воздействие) одного или более веществ на клетку, включающий (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, описанным в данном документе, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток или вставка, изготовленным (исключительно) из полиэфирэфиркетона; (ii) воздействие на клетку одной или более малыми гидрофобными молекулами или органическими растворителями, которые обсуждались выше; и (iii) определение влияния; малых гидрофобных молекул или органических растворителей, которые обсуждались выше, на клетку. Also disclosed is a method for determining the effect (e.g., response to exposure) of one or more substances on a cell, comprising (i) contacting the cell with a cell culture device described herein, such as a cell culture plate or a multiwell cell culture plate or insert made (solely) of polyetheretherketone; (ii) exposing the cell to one or more of the small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above; and (iii) determining impact; small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above per cell.

Кроме того, раскрыт способ уменьшения или замедления поглощения одной или более малых гидрофобных молекул или органических растворителей, обсуждаемых выше, в устройстве для культивирования клеток, описанном в данном документе, включающий приведение вещества в контакт с устройством для культивирования клеток, содержащим полиэфирэфиркетон или состоящим из него. Настоящее изобретение также описано в примере ниже, который представлен для более подробного описания настоящего изобретения. Данный пример, в котором изложен вариант, рассматриваемый в настоящее время как предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, предназначен для иллюстрации, но не для ограничения настоящего изобретения.Also disclosed is a method of reducing or delaying the uptake of one or more small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above into a cell culture device described herein, comprising contacting the substance with a cell culture device containing or consisting of polyetheretherketone . The present invention is also described in the example below, which is provided to describe the present invention in more detail. This example, which sets forth what is currently considered a preferred embodiment of the present invention, is intended to illustrate, but not to limit, the present invention.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1Example 1

Для предотвращения агломерирования сфероидов лунка, разработанная для сфероидов из клеток печени, была выполнена таким образом, что она содержала концентрические канавки на дне лунки. Целью образования данных канавок было создание пространственного разделения между тканями для предотвращения их агломерирования или слияния друг с другом. Для демонстрации функции канавок 40 сфероидов, каждый из которых состоял из приблизительно 25 000 клеток, помещали либо в лунку с канавками, либо в лунку с плоской поверхностью (т.е. без канавок). Через 5 дней сфероиды, присутствующие в лунке с плоской поверхностью, начинали агломерировать друг с другом (см. фиг. 11A), образуя агрегаты. Этого не наблюдалось в лунке с канавками (см. фиг. 11B). Ткань, показанная на фиг. 11A (3 сфероида, агломерировавшиеся или слившиеся с образованием одного агрегата), была непригодной для использования для дальнейших экспериментов, обычно проводимых на сфероидах, таких как измерение содержания аденозинтрифосфата (АТФ), поскольку агломерирование или слияние нескольких сфероидов негативно влияли на получаемые результаты. В культивированной ткани, показанной на фиг. 11B, не происходило агломерирование или слияние и ее использовали для дальнейших экспериментов. To prevent agglomeration of the spheroids, the well designed for liver cell spheroids was designed to contain concentric grooves at the bottom of the well. The purpose of creating these grooves was to create spatial separation between the tissues to prevent them from agglomerating or merging with each other. To demonstrate the function of the grooves, 40 spheroids, each consisting of approximately 25,000 cells, were placed in either a well with grooves or a well with a flat surface (i.e., no grooves). After 5 days, the spheroids present in the flat surface well began to agglomerate with each other (see Fig. 11A), forming aggregates. This was not observed in the grooved well (see Fig. 11B). The fabric shown in FIG. 11A (3 spheroids agglomerated or fused to form one aggregate) was unsuitable for further experiments typically performed on spheroids, such as adenosine triphosphate (ATP) measurements, because agglomeration or fusion of multiple spheroids negatively affected the results obtained. In the cultured tissue shown in FIG. 11B, no agglomeration or fusion occurred and was used for further experiments.

Пример 2Example 2

Были протестированы различные материалы, используемые для изготовления устройства для культивирования клеток. Один из материалов, используемых для устройства для культивирования клеток, полиэфирэфиркетон, представляет собой прочный износостойкий пластмассовый полимер. Полиэфирэфиркетон является предпочтительным при тестировании лекарственных средств, поскольку он является непоглощающим в отличие, например, от широко используемого поли(диметилсилоксана) (PDMS), который, как известно, удерживает малые гидрофобные молекулы, такие как молекулы никотина. Было установлено, что полиэфирэфиркетон не удерживает никотин или NNK, а также другие малые гидрофобные молекулы. Таким образом, устройство для культивирования клеток пригодно для тестирования влияния лекарственных средств на ткани, помещенные в устройство для культивирования клеток, при этом отсутствует риск того, что концентрация лекарственного средства (или концентрация его метаболитов) будет изменена материалом. Various materials used to construct the cell culture device were tested. One of the materials used for the cell culture device, polyetheretherketone, is a tough, wear-resistant plastic polymer. Polyetheretherketone is preferred in drug testing because it is non-absorbent, unlike, for example, the commonly used poly(dimethylsiloxane) (PDMS), which is known to retain small hydrophobic molecules such as nicotine molecules. It was found that PEEK does not retain nicotine or NNK, as well as other small hydrophobic molecules. Thus, the cell culture device is suitable for testing the effects of drugs on tissues placed in the cell culture device without the risk that the concentration of the drug (or the concentration of its metabolites) will be altered by the material.

Биосовместимость устройства из полиэфирэфиркетона тестировали с органотипическими моделями легкого и печени.The biocompatibility of the polyetheretherketone device was tested with organotypic models of the lung and liver.

Модель легкого состоит из нормальных клеток бронхиального эпителия человека (NHBE), высеянных на вставку Transwell™ и дополнительно культивированных на поверхности раздела воздух-жидкость с целью обеспечения дифференциации клеток в бокаловидные или реснитчатые клетки. Используя указанные ткани можно показать, что ткани легкого могут оставаться живыми в течение 4 недель в планшете из полиэфирэфиркетона, что подтверждается нижеследующим.The lung model consists of normal human bronchial epithelial (NHBE) cells seeded onto a Transwell™ insert and further cultured at the air-liquid interface to allow the cells to differentiate into goblet or ciliated cells. Using these tissues, it can be shown that lung tissue can remain alive for 4 weeks in a polyetheretherketone plate, as evidenced by the following.

Присутствие реснитчатых и бокаловидных эпителиальных клеток в пропорции, аналогичной пропорции, наблюдаемой в контрольных тканях (из той же партии), поддерживаемых в 24-луночных поликарбонатных планшетах в течение того же периода времени. The presence of ciliated and goblet epithelial cells in a proportion similar to that observed in control tissues (from the same batch) maintained in 24-well polycarbonate plates for the same period of time.

Неизменившиеся морфологические характеристики. Гистологический анализ тканей, поддерживаемых в планшете, и тканей, поддерживаемых в 24-луночном планшете в течение 4 недель, подтвердил, что морфологические характеристики являются аналогичными. Толщина эпителия, состояние дифференциации и пропорция бокаловидных, базальных и реснитчатых клеток были аналогичными между тканями, поддерживаемыми в указанных двух условиях. Unchanged morphological characteristics. Histological analysis of tissues maintained in a plate and tissues maintained in a 24-well plate for 4 weeks confirmed that the morphological characteristics are similar. Epithelial thickness, differentiation state, and proportion of goblet, basal, and ciliated cells were similar between tissues maintained under the two conditions.

Стабильная концентрация аденозинтрифосфата (АТФ). Аденозинтрифосфат (АТФ) используют для ряда процессов в клетках и все метаболически активные клетки содержат АТФ, благодаря чему измерения содержания АТФ являются эффективным показателем состояния тканей. Ткани, поддерживаемые в планшете в течение 4 недель, характеризовались аналогичным содержанием АТФ (приблизительно на 10% меньшим содержанием АТФ) по сравнению с контрольными тканями. Stable concentration of adenosine triphosphate (ATP). Adenosine triphosphate (ATP) is used for a number of cellular processes and all metabolically active cells contain ATP, making ATP measurements an effective indicator of tissue health. Tissues maintained in the plate for 4 weeks had similar ATP content (approximately 10% less ATP) compared to control tissues.

Активное колебательное движение ресничек. Реснитчатые клетки не только присутствовали в той же самой пропорции, что и в контрольных тканях, но также они по-прежнему совершали активные колебательные движения ресничками с частотой, аналогичной частоте, наблюдаемой в контрольных тканях. Active oscillatory movement of cilia. Not only were the ciliated cells present in the same proportion as in the control tissues, but they also still performed active cilia oscillatory movements at a frequency similar to that observed in the control tissues.

Более высокое трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER). Трансэпителиальное электрическое сопротивление является мерой целостности плотных соединений в эпителиальных тканях и, таким образом, является надежным показателем целостности барьера. Ткани, поддерживаемые в планшете из полиэфирэфиркетона, характеризовались на 50% большим значением трансэпителиального электрического сопротивления, чем контрольные ткани. Higher transepithelial electrical resistance (TEER). Transepithelial electrical resistance is a measure of the integrity of tight junctions in epithelial tissues and is thus a reliable indicator of barrier integrity. Tissues supported in a polyetheretherketone plate had 50% greater transepithelial electrical resistance than control tissues.

Неизменившаяся метаболическая емкость. Способность к индуцированию цитохрома P450 (CYP), ключевого показателя метаболической емкости, исследовали путем воздействия на ткани специфическими индукторами ферментов CYP. Было установлено, что после 48-часовой индукции активность CYP1A1 повышалась в 100 раз, что указывало на неизменившуюся метаболическую емкость тканей, содержащихся в планшете.Unchanged metabolic capacity. The ability to induce cytochrome P450 (CYP), a key indicator of metabolic capacity, was examined by exposing tissues to specific CYP enzyme inducers. It was found that after 48-hour induction, CYP1A1 activity increased 100-fold, indicating that the metabolic capacity of the tissues contained in the plate was unchanged.

В качестве модели печени использовали сфероиды, состоящие из клеток HepaRG™. Первые результаты, полученные с использованием указанных сфероидов из клеток печени после 4 недель культивирования в планшете из полиэфирэфиркетона, показали следующее.Spheroids consisting of HepaRG™ cells were used as a liver model. The first results obtained using these spheroids from liver cells after 4 weeks of cultivation in a polyetheretherketone plate showed the following.

Стабильная секреция альбумина в циркулирующей среде. Альбумин является основным маркером функции печени. Было обнаружено, что секреция альбумина в планшете из полиэфирэфиркетона была стабильной в течение 4 недель с такой же концентрацией альбумина, что и в контрольных тканях.Stable secretion of albumin in the circulating environment. Albumin is the main marker of liver function. It was found that albumin secretion in the polyetheretherketone plate was stable over 4 weeks, with the same albumin concentration as in control tissues.

Неизменившаяся метаболическая емкость. Способность к индуцированию цитохрома P450 (CYP), ключевого показателя метаболической емкости, исследовали путем воздействия на ткани специфическими индукторами ферментов CYP. Было установлено, что после 48-часовой индукции активность CYP1A1 была аналогичной активности, наблюдаемой в контрольных тканях.Unchanged metabolic capacity. The ability to induce cytochrome P450 (CYP), a key indicator of metabolic capacity, was examined by exposing tissues to specific CYP enzyme inducers. It was found that after 48-hour induction, CYP1A1 activity was similar to that observed in control tissues.

Преимущество полиэфирэфиркетона заключается в том, что он не абсорбирует малые молекулы. Было исследовано поглощение полиэфирэфиркетоном никотина и NNK, и было установлено, что молекулы не захватывались указанным материалом. Это имеет важное значение, поскольку известно, что материалы, используемые для изготовления коммерчески доступных планшетов, такие как поли(диметилсилоксан) (PDMS), захватывают малые гидрофобные молекулы. На фиг. 12 в виде графика показаны результаты сравнения количества никотина, оставшегося в планшете из полиэфирэфиркетона и планшете из поли(диметилсилоксана) после 8 часов инкубации при 4°C. Как можно видеть, приблизительно 100% никотина осталось в планшете из политетрафторэтилена по сравнению лишь с приблизительно 35% в планшете из поли(диметилсилоксана). Таким образом, материалы, используемые для коммерчески доступных планшетов с использованием поли(диметилсилоксана), будут захватывать малые гидрофобные молекулы.The advantage of polyetheretherketone is that it does not absorb small molecules. The absorption of nicotine and NNK by PEEK was tested and it was found that the molecules were not captured by the material. This is important because materials used to make commercially available plates, such as poly(dimethylsiloxane) (PDMS), are known to trap small hydrophobic molecules. In fig. 12 shows a graph comparing the amount of nicotine remaining in a polyetheretherketone plate and a poly(dimethylsiloxane) plate after 8 hours of incubation at 4°C. As can be seen, approximately 100% of the nicotine remained in the polytetrafluoroethylene tablet compared to only approximately 35% in the poly(dimethylsiloxane) tablet. Thus, materials used for commercially available plates using poly(dimethylsiloxane) will trap small hydrophobic molecules.

Пример 3Example 3

Клетки HeparG® поставляются в криоконсервированных флаконах, содержащих приблизительно 10 миллионов клеток. Первым этапом получения сфероидов является размораживание криоконсервированных флаконов и высевание клеток (приблизительно 1000-50 000 клеток в одну лунку) в каждую лунку многолуночного планшета. В этом эксперименте лунки планшета покрыты оболочкой со сверхслабым прикреплением и лунки имеют U-образное дно для обеспечения того, чтобы клетки, высеянные в одну лунку, не прикреплялись к стенкам. Клеткам дают агломерироваться на дне лунки. Приблизительно через 3 дня они образуют один сфероид или множество сфероидов в каждой лунке многолуночного планшета, в зависимости от выбора лунки для использования. HeparG® cells are supplied in cryopreserved vials containing approximately 10 million cells. The first step in obtaining spheroids is to thaw cryopreserved vials and seed cells (approximately 1000-50,000 cells per well) into each well of a multiwell plate. In this experiment, the wells of the plate are coated with an ultra-low-attachment coating and the wells have a U-shaped bottom to ensure that cells plated in one well do not attach to the walls. The cells are allowed to agglomerate at the bottom of the well. After approximately 3 days, they form a single spheroid or multiple spheroids in each well of a multiwell plate, depending on the choice of well to use.

Камера для культивирования клеток устройства для культивирования клеток, в которой расположены сфероиды из клеток печени, имеет прерывистую поверхность, описанную в данном документе, которая в данном примере имеет покрытие. Каждый сфероид переносят независимо от многолуночного планшета в камеру для культивирования клеток. В каждое отделение переносят приблизительно от 40 до 100 сфероидов. Устройство для культивирования клеток присоединяют к насосу, который создает поток среды. Перед применением в других экспериментах сфероиды могут оставаться в устройстве для культивирования клеток на протяжении от 1 до 28 дней. The cell culture chamber of the cell culture device in which the liver cell spheroids are located has a discontinuous surface as described herein, which in this example is coated. Each spheroid is transferred independently of a multiwell plate into a cell culture chamber. Approximately 40 to 100 spheroids are transferred to each compartment. The cell culture device is connected to a pump, which creates a flow of medium. The spheroids may remain in the cell culture apparatus for 1 to 28 days before being used in other experiments.

Другие аспекты настоящего изобретения изложены в нижеследующих пронумерованных пунктах.Other aspects of the present invention are set forth in the following numbered paragraphs.

1. Устройство для культивирования клеток, содержащее:1. A cell culture device containing:

камеру для культивирования клеток, содержащую основание и боковые стенки, проходящие от основания и ограничивающие объем камеры для культивирования клеток,a cell culture chamber comprising a base and side walls extending from the base and delimiting the volume of the cell culture chamber,

впускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды в камеру; иan inlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid into the chamber; And

выпускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды из камеры;an outlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid from the chamber;

причем основание камеры для культивирования клеток имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. wherein the base of the cell culture chamber has a discontinuous surface configured to reduce or prevent agglomeration of the spheroids.

2. Устройство для культивирования клеток по п. 1, в котором основание камеры для культивирования клеток имеет по существу круглую форму, причем предпочтительно диаметр указанного основания составляет от приблизительно 6 мм ± 5% до приблизительно 22 мм ± 5%, предпочтительно диаметр основания составляет приблизительно 6 мм ± 5%, приблизительно 11 мм ± 5%, приблизительно 16 мм ± 5% или приблизительно 22 мм ± 5%. 2. The cell culture apparatus of claim 1, wherein the base of the cell culture chamber has a substantially circular shape, preferably the diameter of said base being from about 6 mm ± 5% to about 22 mm ± 5%, preferably the diameter of the base being about 6 mm ± 5%, approximately 11 mm ± 5%, approximately 16 mm ± 5% or approximately 22 mm ± 5%.

3. Устройство для культивирования клеток по п. 1 или 2, в котором прерывистая поверхность содержит множество канавок, в которых глубина и ширина канавок соответствует максимальному диаметру сфероида ±10%. 3. The cell culture device according to claim 1 or 2, wherein the discontinuous surface contains a plurality of grooves, in which the depth and width of the grooves correspond to a maximum diameter of the spheroid ±10%.

4. Устройство для культивирования клеток по п. 3, в котором глубина и ширина множества канавок составляет от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, предпочтительно от приблизительно 600 до приблизительно 1000 мкм. 4. The cell culture device of claim 3, wherein the depth and width of the plurality of grooves is from about 200 to about 1000 μm, preferably from about 600 to about 1000 μm.

5. Устройство для культивирования клеток по п. 3 или 4, в котором канавки образуют множество концентрических колец на основании камеры для культивирования клеток 5. The cell culture device according to claim 3 or 4, wherein the grooves form a plurality of concentric rings at the base of the cell culture chamber

6. Устройство для культивирования клеток по п. 1 или 2, в котором прерывистая поверхность содержит множество отверстий, имеющих закрытое дно и открытую верхнюю часть, причем размеры отверстий, соответствующих по глубине и ширине, приблизительно на 10% больше, чем максимальный диаметр сфероида.6. The cell culture device of claim 1 or 2, wherein the discontinuous surface comprises a plurality of holes having a closed bottom and an open top, the holes having corresponding depth and width dimensions approximately 10% larger than the maximum diameter of the spheroid.

7. Устройство для культивирования клеток по любому из предшествующих пунктов, в котором камера для культивирования клеток содержит среду для культивирования клеток для культивирования сфероидов. 7. The cell culture apparatus according to any one of the preceding claims, wherein the cell culture chamber contains a cell culture medium for culturing the spheroids.

8. Устройство для культивирования клеток по любому из предшествующих пунктов, в котором камера для культивирования клеток содержит отдельные сфероиды, захваченные прерывистой поверхностью камеры для культивирования клеток.8. The cell culture apparatus of any one of the preceding claims, wherein the cell culture chamber comprises individual spheroids captured by a discontinuous surface of the cell culture chamber.

9. Устройство для культивирования клеток по п. 8, в котором сфероиды представляют собой сфероиды из клеток легкого.9. Cell culture device according to claim 8, wherein the spheroids are spheroids from lung cells.

10. Устройство для культивирования клеток по любому из предшествующих пунктов, в котором поток текучей среды от впускного отверстия до выпускного отверстия камеры для культивирования клеток при присутствии в ней текучей среды составляет от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мкл/мин, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 500 мкл/мин, предпочтительно приблизительно 40 мкл/мин. 10. The cell culture apparatus of any one of the preceding claims, wherein the fluid flow from the inlet to the outlet of the cell culture chamber when the fluid is present therein is from about 10 to about 1000 μL/min, preferably from about 1 to about 500 µl/min, preferably approximately 40 µl/min.

11. Устройство для культивирования клеток по п. 10, в котором напряжение сдвига в камере для культивирования клеток составляет менее 0,1 дин/см². 11. The cell culture device according to claim 10, wherein the shear stress in the cell culture chamber is less than 0.1 dyne/cm ² .

12. Устройство для культивирования клеток по любому из предшествующих пунктов, в котором устройство для культивирования клеток представляет собой многолуночный планшет, а каждая камера многолуночного планшета представляет собой лунку, причем указанный многолуночный планшет содержит по меньшей мере две лунки.12. The cell culture device according to any one of the preceding claims, wherein the cell culture device is a multi-well plate, and each chamber of the multi-well plate is a well, wherein the multi-well plate contains at least two wells.

13. Устройство для культивирования клеток по любому из предшествующих пунктов, в котором основание по меньшей мере одной из камер имеет плоскую поверхность, на которой отсутствуют разрывы непрерывности. 13. The cell culture device according to any one of the preceding claims, wherein the base of at least one of the chambers has a flat surface on which there are no breaks in continuity.

14. Устройство для культивирования клеток по п. 13, в котором по меньшей мере одна камера содержит вставку, расположенную выше основания камеры, причем предпочтительно вставка расположена на верхней части проницаемой мембраны, расположенной внутри указанной камеры, с образованием поверхности, которая способна обеспечивать культивирование клетки на границе раздела воздух/жидкость. 14. The cell culture apparatus of claim 13, wherein at least one chamber comprises an insert located above the base of the chamber, preferably the insert being located on top of a permeable membrane located within said chamber to form a surface that is capable of allowing cell culture at the air/liquid interface.

15. Устройство для культивирования клеток по п. 13 или 14, в котором глубина по меньшей мере одной камеры, имеющей плоскую поверхность, на которой отсутствуют разрывы непрерывности, отличается от глубины по меньшей мере одной камеры, имеющей прерывистую поверхность, причем предпочтительно глубина по меньшей мере одной камеры, имеющей плоскую поверхность, на которой отсутствуют разрывы непрерывности, является меньшей, чем глубина по меньшей мере одной камеры, имеющей прерывистую поверхность. 15. The cell culture apparatus of claim 13 or 14, wherein the depth of the at least one chamber having a flat, non-discontinuity surface is different from the depth of the at least one chamber having a discontinuous surface, preferably a depth of at least the depth of at least one chamber having a flat surface, which has no discontinuities, is less than the depth of at least one chamber having a discontinuous surface.

16. Устройство для культивирования клеток по любому из пп. 13-15, в котором камера для культивирования клеток содержит среду для культивирования клеток для культивирования клетки на поверхности раздела воздух-жидкость. 16. Device for cell cultivation according to any one of paragraphs. 13-15, wherein the cell culture chamber contains a cell culture medium for culturing a cell at an air-liquid interface.

17. Устройство для культивирования клеток по п. 16, в котором камера для культивирования клеток содержит клетки, расположенные на проницаемой мембране, причем указанные клетки способны расти на поверхности раздела воздух-жидкость.17. The cell culture apparatus of claim 16, wherein the cell culture chamber comprises cells supported on a permeable membrane, said cells being capable of growing at an air-liquid interface.

18. Устройство для культивирования клеток по п. 17, в котором клетки представляют собой клетки легкого. 18. The cell culture device according to claim 17, wherein the cells are lung cells.

19. Устройство для культивирования клеток по любому из пп. 12-18, в котором по меньшей мере две лунки сообщаются по текучей среде друг с другом. 19. Device for culturing cells according to any one of paragraphs. 12-18, in which at least two wells are in fluid communication with each other.

20. Способ культивирования клетки, включающий:20. A method of culturing a cell, including:

обеспечение наличия устройства для культивирования клеток по любому из пп. 1-19;ensuring the presence of a device for culturing cells according to any one of claims. 1-19;

приведение в контакт устройства для культивирования клеток со средой для культивирования клеток и клеткой по меньшей мере одного типа; иcontacting the cell culture device with the cell culture medium and at least one type of cell; And

культивирование клетки. cell cultivation.

21. Способ изготовления устройства для культивирования клеток для культивирования сфероидов, включающий:21. A method for manufacturing a cell culture device for culturing spheroids, comprising:

(i) обеспечение наличия камеры для культивирования клеток, содержащей: (a) основание и боковые стенки, проходящие от основания и ограничивающие объем камеры для культивирования клеток; (b) впускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды в камеру; и (c) выпускное отверстие в основании или боковых стенках камеры для культивирования клеток, выполненное с возможностью передачи текучей среды из камеры; и (i) providing a cell culture chamber comprising: (a) a base and side walls extending from the base and defining a volume of the cell culture chamber; (b) an inlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid into the chamber; and (c) an outlet in the base or side walls of the cell culture chamber configured to transfer fluid from the chamber; And

(ii) создание прерывистой поверхности на основании камеры для культивирования клеток, причем прерывистая поверхность выполнена с возможностью уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов. (ii) providing a discontinuous surface at the base of the cell culture chamber, wherein the discontinuous surface is configured to reduce or prevent agglomeration of the spheroids.

22. Способ по п. 21, при котором прерывистая поверхность представляет собой прерывистую поверхность по любому из пп. 3-6. 22. The method according to claim 21, wherein the discontinuous surface is a discontinuous surface according to any one of claims. 3-6.

23. Способ по п. 21 или 22, согласно которому прерывистую поверхность выполняют на основании с использованием механической обработки на станке с числовым программным управлением или литья под давлением. 23. The method according to claim 21 or 22, wherein the discontinuous surface is formed on the base using CNC machining or injection molding.

24. Камера для культивирования клеток, содержащая основание, имеющее прерывистую поверхность, причем прерывистая поверхность содержит одиночные сфероиды, захваченные нею. 24. A cell culture chamber comprising a base having a discontinuous surface, the discontinuous surface containing single spheroids trapped therein.

25. Камера для культивирования клеток по п. 24, в которой прерывистая поверхность представляет собой прерывистую поверхность по любому из пп. 3-6. 25. The cell culture chamber of claim 24, wherein the discontinuous surface is the discontinuous surface of any one of claims. 3-6.

26. Устройство для культивирования клеток, содержащее камеру для культивирования клеток по п. 24 или 25. 26. A cell culture device comprising a cell culture chamber according to claim 24 or 25.

27. Устройство для культивирования клеток по любому из пп. 1-19 и 26, в котором устройство представляет собой многолуночный планшет. 27. Device for culturing cells according to any one of paragraphs. 1-19 and 26, in which the device is a multi-well plate.

28. Камера для культивирования клеток по п. 24 или 25, в которой камера представляет собой лунку. 28. Cell culture chamber according to claim 24 or 25, in which the chamber is a well.

29. Применение устройства для культивирования клеток по любому из пп. 1-19, 26 и 27 или камеры для культивирования клеток по любому из пп. 24, 25 или 28 для культивирования сфероида или для поддержания сфероидов отдельно от других сфероидов. 29. Use of a cell culture device according to any one of paragraphs. 1-19, 26 and 27 or cell culture chambers according to any one of paragraphs. 24, 25 or 28 for culturing the spheroid or for maintaining spheroids separately from other spheroids.

30. Культура сфероидов, в которой сфероиды являются одиночными сфероидами после 5 часов или 5 дней культивирования.30. Spheroid culture in which the spheroids are single spheroids after 5 hours or 5 days of culture.

Любая публикация, цитируемая или описанная в данном документе, предоставляет соответствующую информацию, раскрытую до даты подачи настоящей заявки. Заявления, сделанные в данном документе, не должны истолковываться как признание того, что авторы настоящего изобретения не имеют оснований для его противопоставления как более ранним таким раскрытиям. Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение описано применительно к конкретным предпочтительным вариантам осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. В действительности, предполагается, что разные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, очевидные специалистам в областях генной инженерии, клеточной биологии и молекулярной биологии или в смежных областях, находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.Any publication cited or described herein provides relevant information disclosed prior to the filing date of this application. Statements made herein should not be construed as an admission that the inventors of the present invention have no basis for contrasting it with prior such disclosures. All publications mentioned in the above description are incorporated herein by reference. Various modifications and variations of the present invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the present invention. Although the present invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the present invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, it is intended that various modifications of the described methods of carrying out the present invention obvious to those skilled in the fields of genetic engineering, cell biology and molecular biology or related fields are within the scope of the following claims.

Claims

1. Способ уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, включающий:1. A method for reducing or preventing agglomeration of spheroids, comprising:

(i) обеспечение одного или более отдельных сфероидов;(i) providing one or more individual spheroids;

(ii) перенос отдельного сфероида(ов) в лунку устройства для культивирования клеток, причем лунка устройства для культивирования клеток содержит основание и боковые стенки, проходящие от основания и ограничивающие объем лунки; при этом в основании или боковых стенках лунки имеется впускное отверстие, выполненное с возможностью передачи текучей среды в лунку, в основании или боковых стенках лунки имеется выпускное отверстие, выполненное с возможностью передачи текучей среды из лунки, и основание лунки имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью захвата одного или более отдельных сфероидов в прерывистую поверхность для уменьшения или предотвращения их агломерирования, причем прерывистая поверхность содержит множество канавок, при этом глубина и ширина указанных канавок составляют от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, причем канавки образуют множество концентрических колец на основании лунки;(ii) transferring the individual spheroid(s) into a well of the cell culture device, the well of the cell culture device comprising a base and side walls extending from the base and delimiting the volume of the well; wherein in the base or side walls of the well there is an inlet hole configured to transfer fluid into the well, in the base or side walls of the well there is an outlet hole configured to transfer fluid from the well, and the base of the well has a discontinuous surface configured to trapping one or more individual spheroids into a discontinuous surface to reduce or prevent their agglomeration, the discontinuous surface comprising a plurality of grooves, the depth and width of said grooves being from about 200 to about 1000 μm, the grooves forming a plurality of concentric rings at the base of the well;

(iii) приведение отдельного сфероида(ов) в контакт с прерывистой поверхностью и инкубирование отдельного сфероида(ов) в лунке; и(iii) bringing the individual spheroid(s) into contact with the discontinuous surface and incubating the individual spheroid(s) in the well; And

(iv) получение отдельного сфероида(ов) на прерывистой поверхности лунки.(iv) obtaining individual spheroid(s) on the discontinuous surface of the well.

2. Способ по п. 1, в котором известное количество отдельных сфероидов переносят на этапе (ii) и известное количество отдельных сфероидов получают на этапе (iv).2. The method of claim 1, wherein a known number of individual spheroids are transferred in step (ii) and a known number of individual spheroids are obtained in step (iv).

3. Способ по п. 1 или 2, в котором лунка содержит прерывистую поверхность, содержащую множество отверстий, имеющих закрытое дно и открытую верхнюю часть, причем размер отверстий, соответствующих по глубине и ширине, приблизительно, на 10% больше, чем максимальный диаметр сфероида.3. The method of claim 1 or 2, wherein the well comprises a discontinuous surface containing a plurality of holes having a closed bottom and an open top, the size of the holes corresponding in depth and width being approximately 10% larger than the maximum diameter of the spheroid .

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором лунка изготовлена из полиэфирэфиркетона.4. The method according to any of the preceding claims, wherein the well is made of polyetheretherketone.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором лунка имеет покрытие, причем, предпочтительно, это покрытие представляет собой покрытие из поли(п-ксилилен) полимера.5. A method according to any one of the preceding claims, wherein the well is coated, preferably the coating being a poly(p-xylylene) polymer coating.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором в лунку устройства для культивирования клеток переносят от приблизительно 40 до приблизительно 100 сфероидов.6. The method of any one of the preceding claims, wherein about 40 to about 100 spheroids are transferred to a well of the cell culture device.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором в лунку устройства для культивирования клеток подают поток среды, причем расход составляет от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мкл/мин.7. The method of any one of the preceding claims, wherein a flow of medium is supplied to the well of the cell culture device at a flow rate of from about 10 to about 1000 μl/min.

8. Применение устройства для культивирования клеток для уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, причем устройство для культивирования клеток содержит:8. Use of a cell culture device to reduce or prevent agglomeration of spheroids, wherein the cell culture device comprises:

лунку, содержащую основание и боковые стенки, проходящие от основания и ограничивающие объем лунки,a hole containing a base and side walls extending from the base and delimiting the volume of the hole,

впускное отверстие в основании или боковых стенках лунки, выполненное с возможностью передачи текучей среды в лунку; иan inlet hole in the base or side walls of the well configured to transfer fluid into the well; And

выпускное отверстие в основании или боковых стенках лунки, выполненное с возможностью передачи текучей среды из лунки;an outlet in the base or side walls of the well, configured to transfer fluid from the well;

при этом основание лунки имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью захвата одного или более сфероидов в прерывистую поверхность для уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, причем прерывистая поверхность содержит множество канавок, при этом глубина и ширина указанных канавок составляют от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, причем канавки образуют множество концентрических колец на основании лунки.wherein the base of the well has a discontinuous surface configured to trap one or more spheroids into the discontinuous surface to reduce or prevent agglomeration of the spheroids, wherein the discontinuous surface comprises a plurality of grooves, wherein the depth and width of said grooves range from about 200 to about 1000 microns, wherein the grooves form many concentric rings at the base of the socket.

9. Многолуночный планшет для культивирования клеток, в котором основание, по меньшей мере, одной из лунок многолуночного планшета для культивирования клеток и/или вставка, содержащаяся в указанной, по меньшей мере, одной из лунок многолуночного планшета для культивирования клеток, имеет прерывистую поверхность, выполненную с возможностью захвата одного или более отдельных сфероидов в прерывистую поверхность для уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, причем прерывистая поверхность содержит множество канавок, при этом глубина и ширина указанных канавок составляют от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, причем канавки образуют множество концентрических колец на основании лунки.9. A multi-well cell culture plate, wherein the base of at least one of the wells of the multi-well cell culture plate and/or the insert contained in said at least one of the wells of the multi-well cell culture plate has a discontinuous surface, configured to trap one or more individual spheroids into a discontinuous surface to reduce or prevent agglomeration of the spheroids, wherein the discontinuous surface includes a plurality of grooves, wherein the depth and width of said grooves range from about 200 to about 1000 μm, wherein the grooves form a plurality of concentric rings on the base holes.

10. Многолуночный планшет для культивирования клеток по п. 9, в котором планшет и/или вставка изготовлены из полиэфирэфиркетона; или, по меньшей мере, одно из лунок или вставки имеет покрытие, причем, предпочтительно, указанное покрытие представляет собой покрытие из поли(п-ксилилен) полимера.10. Multiwell plate for cell culture according to claim 9, in which the plate and/or insert are made of polyetheretherketone; or at least one of the wells or inserts is coated, preferably said coating being a poly(p-xylylene) polymer coating.

11. Многолуночный планшет для культивирования клеток по п. 9 или 10, в котором, по меньшей мере, одна лунка или вставка содержит отдельный одиночный сфероид.11. The multiwell cell culture plate of claim 9 or 10, wherein at least one well or insert contains a separate single spheroid.

12. Вставка для применения в многолуночном планшете для культивирования клеток, имеющая прерывистую поверхность, выполненную с возможностью захвата одного или более отдельных сфероидов в прерывистую поверхность для уменьшения или предотвращения агломерирования сфероидов, причем прерывистая поверхность содержит множество канавок, при этом глубина и ширина указанных канавок составляют от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, причем канавки образуют множество концентрических колец на основании лунки.12. An insert for use in a multiwell cell culture plate, having a discontinuous surface configured to trap one or more individual spheroids within the discontinuous surface to reduce or prevent agglomeration of the spheroids, wherein the discontinuous surface comprises a plurality of grooves, the depth and width of said grooves being from about 200 to about 1000 μm, with the grooves forming a plurality of concentric rings at the base of the well.

13. Вставка по п. 12, в которой планшет и/или вставка изготовлены из полиэфирэфиркетона; или, по меньшей мере, одно из лунок или вставки имеет покрытие, причем, предпочтительно, указанное покрытие представляет собой покрытие из поли(п-ксилилен) полимера.13. The insert according to claim 12, in which the tablet and/or insert are made of polyetheretherketone; or at least one of the wells or inserts is coated, preferably said coating being a poly(p-xylylene) polymer coating.

14. Вставка по п. 12 или 13, в которой, по меньшей мере, одна лунка или вставка содержит отдельный одиночный сфероид.14. The insert of claim 12 or 13, wherein at least one well or insert contains a separate single spheroid.