RU2811518C1

RU2811518C1 - Il-5 binding molecule, method of its preparation and its use

Info

Publication number: RU2811518C1
Application number: RU2023100529A
Authority: RU
Inventors: Чжипэн СУ; Цзиньго МЭН; Юнь Чжан; Лэфэй ВАН; Яо Яо
Original assignee: Реджейнкор Биотех Ко., Лтд
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2024-01-12

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to recombinant IL-5-binding molecules, and can be used in medicine in the production of drugs targeting IL-5 for the treatment of leukemia. The following is proposed: an IL-5-binding molecule capable of specifically binding to interleukin-5 (IL-5) and containing a single immunoglobulin variable domain with a defined set of complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3.

EFFECT: invention makes it possible to obtain a molecule capable of specifically binding to IL-5 and effectively blocking cell proliferation induced by IL-5.

14 cl, 8 dwg, 10 tbl, 5 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

[0001] Настоящее изобретение относится к области биофармацевтических технологий, в частности к связывающей молекуле для IL-5 и ее способу получения и применению.[0001] The present invention relates to the field of biopharmaceutical technology, in particular to a binding molecule for IL-5 and its method of preparation and use.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[0002] Интерлейкин-5 человека, также называемый IL-5, наряду с IL-13 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) является цитокином, участвующим в гемопоэзе и воспалении. Все эти три цитокина могут стимулировать образование, функционирование и выживание эозинофилов, и поэтому они способны влиять на воспалительные заболевания. Например, эозинофилы главным образом функционируют в качестве эффекторов при астме, атопическом дерматите и аллергическом рините.[0002] Human interleukin-5, also called IL-5, along with IL-13 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), is a cytokine involved in hematopoiesis and inflammation. All three of these cytokines can stimulate the formation, function and survival of eosinophils and are therefore capable of influencing inflammatory diseases. For example, eosinophils primarily function as effectors in asthma, atopic dermatitis, and allergic rhinitis.

[0003] Внимание большинства исследователей было сосредоточено на IL-5 в качестве цитокина, специфично воздействующего на эозинофилы, при этом обнаружено повышение уровней мРНК и белка IL-5 в легочных тканях и жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL) у пациентов с симптоматической астмой. Исследователи также наблюдали, что существует корреляция между уровнями IL-5 и провокацией аллергенами и активностью заболевания. Однако, очевидно, что в дополнение к тому, что IL-5, GM-CSF и IL-3 функционируют для обеспечения образования и активации эозинофилов при астме, было продемонстрировано, что GM-CSF и IL-3 синтезируются в случае наличия аллергического воспаления. Экспрессия таких цитокинов может способствовать увеличению общего количества инфильтрирующих эозинофилов и степени активации эозинофилов. Также возможно, что эти цитокины функционируют для обеспечения эозинофильной инфильтрации на различных стадиях. Согласно недавним данным кинетического анализа от пациентов, получивших стимуляцию антигеном, было показано, что уровень IL-5 повышается от дня 2 до дня 7, а уровень GM-CSF достигает своего пика в день 2 и продолжает расти в день 16.[0003] Much research attention has focused on IL-5 as a cytokine that specifically targets eosinophils, and IL-5 mRNA and protein levels have been found to be elevated in lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid (BAL) from patients with symptomatic asthma. The researchers also observed that there was a correlation between IL-5 levels and allergen challenge and disease activity. However, it is clear that in addition to the fact that IL-5, GM-CSF and IL-3 function to mediate the formation and activation of eosinophils in asthma, it has been demonstrated that GM-CSF and IL-3 are synthesized in the presence of allergic inflammation. The expression of such cytokines may contribute to an increase in the total number of infiltrating eosinophils and the degree of eosinophil activation. It is also possible that these cytokines function to promote eosinophil infiltration at various stages. In recent kinetic analysis data from patients receiving antigen stimulation, IL-5 levels have been shown to increase from day 2 to day 7, and GM-CSF levels peak at day 2 and continue to rise at day 16.

[0004] IL-5, GM-CSF и IL-3, связываясь с рецепторами клеточной поверхности, стимулируют эозинофилы, а также другие нормальные и раковые клетки. Эти рецепторы клеточной поверхности содержат лиганд-специфическую α-цепь и цепь (βc), общую для трех рецепторов. Связывание с α-цепью каждого рецептора является начальной стадией активации рецептора. Однако, одного связывания с α-цепью недостаточно для активации. Затем лиганд привлекает βc, после чего следует стадия с двумя основными функциональными последствиями. Во-первых, это позволяет связыванию IL-5, GM-CSF и IL-3 становиться практически необратимым; и кроме того, это приводит к полной активации рецептора. В качестве основного компонента передачи сигнала в этих рецепторах βc приводит к активации JAK-2, STAT-5 и других сигнальных молекул и в конечном счете приводит к избыточной клеточной активности, в нормальных условиях ассоциированной с IL-5, стимуляцией GM-CSF и IL-3, такой как адгезия эозинофилов, что приводит к дегрануляции и цитотоксичности, а также к продлению жизнеспособности клеток.[0004] IL-5, GM-CSF and IL-3, by binding to cell surface receptors, stimulate eosinophils, as well as other normal and cancer cells. These cell surface receptors contain a ligand-specific α chain and a chain (βc) common to the three receptors. Binding to the α chain of each receptor is the initial step in receptor activation. However, binding to the α chain alone is not sufficient for activation. The ligand then recruits βc, followed by a step with two major functional consequences. First, it allows the binding of IL-5, GM-CSF, and IL-3 to become virtually irreversible; and in addition, this leads to complete activation of the receptor. As a major component of signal transduction in these receptors, βc leads to the activation of JAK-2, STAT-5 and other signaling molecules and ultimately leads to excess cellular activity normally associated with IL-5, GM-CSF stimulation and IL- 3, such as eosinophil adhesion, which leads to degranulation and cytotoxicity, as well as prolongation of cell viability.

[0005] Исследователями было опробовано три основных способа блокирования цитокинов, активирующих эозинофилы, или оказания антагонистического действия на них. Один из них предусматривает применение антител к вовлеченным цитокинам. Например, антитело к IL-5 применяется в животной модели аллерген-индуцированной астмы. Данный способ продемонстрировал относительно длительный эффект предупреждения сильного ответа вследствие притока эозинофилов в дыхательные пути и бронхиолы. Однако по-прежнему существует недостаток высокоаффинных IL-5-специфичных антител или лекарственных средств, нацеленных на IL-5. С учетом вышеизложенного представлено настоящее изобретение.[0005] Researchers have tried three main methods to block or antagonize eosinophil-activating cytokines. One of them involves the use of antibodies to the cytokines involved. For example, an anti-IL-5 antibody is used in an animal model of allergen-induced asthma. This method has demonstrated a relatively long-lasting effect in preventing a strong response due to the influx of eosinophils into the airways and bronchioles. However, there is still a lack of high-affinity IL-5-specific antibodies or drugs targeting IL-5. In view of the above, the present invention is presented.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[0006] Целью настоящего изобретения является обеспечение IL-5-связывающей молекулы, а также ее способа получения и применения.[0006] An object of the present invention is to provide an IL-5 binding molecule, as well as a method for its preparation and use.

[0007] Настоящее изобретение реализуется следующим образом.[0007] The present invention is implemented as follows.

[0008] В соответствии с первым аспектом в варианте осуществления настоящего изобретения предложена IL-5-связывающая молекула, способная специфично связываться с IL-5 и содержащая по меньшей мере один из одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, содержащих определяющие комплементарность области CDR1, CDR2 и CDR3.[0008] According to a first aspect, an embodiment of the present invention provides an IL-5 binding molecule capable of specifically binding to IL-5 and comprising at least one of single immunoglobulin variable domains comprising the complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3.

[0009] Аминокислотная последовательность CDR1 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 43-49; аминокислотная последовательность CDR2 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 50-56; и аминокислотная последовательность CDR3 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 57-62.[0009] The amino acid sequence of CDR1 is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 43-49; the amino acid sequence of CDR2 is selected from any of the sequences given under SEQ ID NO: 50-56; and the amino acid sequence of CDR3 is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 57-62.

[0010] В соответствии со вторым аспектом в варианте осуществления настоящего изобретения предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая IL-5-связывающую молекулу согласно предыдущему варианту осуществления.[0010] According to a second aspect, an embodiment of the present invention provides an isolated nucleic acid encoding an IL-5 binding molecule according to the previous embodiment.

[0011] В соответствии с третьим аспектом в варианте осуществления настоящего изобретения предложен рекомбинантный вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту согласно предыдущему варианту осуществления.[0011] According to a third aspect, an embodiment of the present invention provides a recombinant vector containing an isolated nucleic acid according to the previous embodiment.

[0012] В соответствии с четвертым аспектом в варианте осуществления настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный вектор согласно предыдущему варианту осуществления.[0012] According to a fourth aspect, an embodiment of the present invention provides a host cell containing a recombinant vector according to the previous embodiment.

[0013] В соответствии с пятым аспектом в варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения IL-5-связывающей молекулы, включающий культивирование клетки-хозяина согласно предыдущему варианту осуществления с получением IL-5-связывающей молекулы.[0013] According to a fifth aspect, an embodiment of the present invention provides a method for producing an IL-5 binding molecule, comprising culturing a host cell according to the previous embodiment to produce an IL-5 binding molecule.

[0014] В соответствии с шестым аспектом в варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат для связывания белка IL-5, содержащий конъюгирующий компонент и IL-5-связывающую молекулу согласно предыдущим вариантам осуществления, где[0014] According to a sixth aspect, an embodiment of the present invention provides an IL-5 protein binding conjugate comprising a conjugating moiety and an IL-5 binding molecule according to the previous embodiments, wherein

[0015] конъюгирующий компонент конъюгирован с IL-5-связывающей молекулой; и конъюгирующий компонент включает в себя маркер и/или соединение для выявления.[0015] the conjugating component is conjugated to an IL-5 binding molecule; and the conjugating component includes a marker and/or detection compound.

[0016] В соответствии с седьмым аспектом в варианте осуществления настоящего изобретения предложен набор для выявления IL-5, содержащий IL-5-связывающие молекулы согласно предыдущему варианту осуществления.[0016] According to a seventh aspect, an embodiment of the present invention provides an IL-5 detection kit containing IL-5 binding molecules according to the previous embodiment.

[0017] В соответствии с восьмым аспектом в варианте осуществления настоящего изобретения предложено применение IL-5-связывающей молекулы согласно вышеописанным вариантам осуществления при получении лекарственных средств, нацеленных на IL-5, для лечения заболевания.[0017] According to an eighth aspect, an embodiment of the present invention provides the use of an IL-5 binding molecule according to the above-described embodiments in the preparation of IL-5-targeting drugs for treating a disease.

[0018] Настоящее изобретение имеет следующие благоприятные эффекты.[0018] The present invention has the following beneficial effects.

[0019] В вариантах осуществления настоящего изобретения предложена IL-5-связывающая молекула, а также ее способ получения и применение. Данная связывающая молекула способна специфично связываться с IL-5 и содержит по меньшей мере один из одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, содержащих определяющие комплементарность области CDR1, CDR2 и CDR3. Аминокислотная последовательность CDR1 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 43-49; аминокислотная последовательность CDR2 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 50-56; и аминокислотная последовательность CDR3 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 57-62. Данная связывающая молекула способна специфично связываться с IL-5 и эффективно блокировать клеточную пролиферацию, индуцируемую IL-5, и ее можно применять при предупреждении, диагностике и/или лечении заболеваний, связанных с IL-5.[0019] Embodiments of the present invention provide an IL-5 binding molecule, as well as a method of preparation and use thereof. This binding molecule is capable of specifically binding to IL-5 and contains at least one of single immunoglobulin variable domains containing the complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3. The amino acid sequence of CDR1 is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 43-49; the amino acid sequence of CDR2 is selected from any of the sequences given under SEQ ID NO: 50-56; and the amino acid sequence of CDR3 is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 57-62. This binding molecule is capable of specifically binding to IL-5 and effectively blocking cell proliferation induced by IL-5, and can be used in the prevention, diagnosis and/or treatment of diseases associated with IL-5.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS

[0020] Для более четкого описания технических решений вариантов осуществления настоящего изобретения ниже приведено краткое описание сопутствующих графических материалов, необходимых для описания вариантов осуществления. Следует понимать, что на следующих сопутствующих графических материалах показаны только некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, которые не следует считать ограничивающими объем настоящего изобретения. Средний специалист в данной области все равно может вывести другие сопутствующие графические материалы на основе этих сопутствующих графических материалов без творческих усилий.[0020] To more clearly describe the technical solutions of the embodiments of the present invention, the following is a brief description of the accompanying drawings necessary to describe the embodiments. It should be understood that the following accompanying drawings show only some embodiments of the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention. An average person skilled in the art can still infer other related graphics from these related graphics without creative effort.

[0021] На фиг. 1 показаны результаты гель-электрофореза рекомбинантного белка IL-5 человека из примера 1;[0021] In FIG. 1 shows the results of gel electrophoresis of the recombinant human IL-5 protein from example 1;

[0022] на фиг. 2 показано обогащение рекомбинантным белком IL-5 после скрининга библиотеки наноантител из примера 1; P/N = число моноклональных бактерий, выросших после инфицирования бактерий TG1 фагами, элюированными из положительных лунок в ходе биопэннинга/число моноклональных бактерий, выросших после инфицирования бактерий TG1 фагами, элюированными из отрицательных лунок, где данный параметр постепенно увеличивается в ходе обогащения; I/E = общее количество бактериофагов, добавленных в положительные лунки в каждом цикле биопэннинга/общее количество фагов, элюированных из положительных лунок в ходе биопэннинга, где данный параметр постепенно приближается к 1 в ходе обогащения;[0022] in FIG. Figure 2 shows the enrichment of the recombinant IL-5 protein after screening the nanoantibody library from Example 1; P/N = number of monoclonal bacteria grown after infection of TG1 bacteria with phages eluted from positive wells during biopanning/number of monoclonal bacteria grown after infection of TG1 bacteria with phages eluted from negative wells, where this parameter gradually increases during enrichment; I/E = total number of bacteriophages added to positive wells in each biopanning cycle/total number of phages eluted from positive wells during biopanning, where this parameter gradually approaches 1 during enrichment;

[0023] на фиг. 3 показаны соответствующие результаты выравнивания гуманизированных вариантов антител клонов 1B3 и 2B3 из примера 2;[0023] in FIG. 3 shows the corresponding alignment results of the humanized antibody variants of clones 1B3 and 2B3 from Example 2;

[0024] на фиг. 4 показаны результаты анализа связывания 12 клонов антител, экспрессируемых в E. coli, полученных в примере 1, с IL-5 согласно проверочному примеру 1;[0024] in FIG. 4 shows the results of a binding assay of 12 E. coli-expressed antibody clones obtained in Example 1 with IL-5 according to Verification Example 1;

[0025] на фиг. 5 изображен график, на котором показана зависимость «доза-эффект» для связывания Tab1 и Tab2 с IL-5 из проверочного примера 2;[0025] in FIG. 5 is a graph showing the dose-response relationship for the binding of Tab1 and Tab2 to IL-5 from Test Example 2;

[0026] на фиг. 6 изображен график, на котором показана зависимость «доза-эффект» для индуцируемой IL-5 пролиферации клеток TF-1, нейтрализуемой контрольным антителом 1 (Tab1) и контрольным антителом 2 (Tab2) в проверочном примере 2;[0026] in FIG. 6 is a graph showing the dose-response relationship for IL-5-induced TF-1 cell proliferation neutralized by control antibody 1 (Tab1) and control antibody 2 (Tab2) in Test Example 2;

[0027] на фиг. 7 изображен график, на котором показана зависимость «доза-эффект» для индуцируемой IL-5 пролиферации TF-1, нейтрализуемой IL-5-специфичным слитым с Fc однодоменным антителом, полученным в примере 3, из проверочного примера 3; и[0027] in FIG. 7 is a graph showing the dose-response relationship for IL-5-induced TF-1 proliferation neutralized by the IL-5-specific Fc fusion single domain antibody produced in Example 3 from Verification Example 3; And

[0028] на фиг. 8 изображен график, на котором показана зависимость «доза-эффект» для индуцируемой IL-5 пролиферации TF-1, нейтрализуемой различными гуманизированными слитыми с Fc однодоменными антителами, полученными в примере 3, из проверочного примера 3.[0028] in FIG. 8 is a graph showing the dose-response relationship for IL-5-induced TF-1 proliferation neutralized by various humanized Fc-fusion single domain antibodies produced in Example 3 from Verification Example 3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF IMPLEMENTATION OPTIONS

[0029] Для более ясного понимания целей, технических решений и преимуществ вариантов осуществления настоящего изобретения далее приводится четкое и полное описание технических решений в вариантах осуществления настоящего изобретения. Если в примерах не приведены конкретные условия, то следуют общепринятым условиям или условиям, рекомендуемым производителем. Все используемые реагенты и приборы, для которых не указаны производители, являются широко распространенными продуктами, коммерчески доступными на рынке.[0029] For a clearer understanding of the objectives, technical solutions and advantages of the embodiments of the present invention, the following is a clear and complete description of the technical solutions in the embodiments of the present invention. If specific conditions are not given in the examples, then generally accepted conditions or conditions recommended by the manufacturer are followed. All reagents and instruments used, for which no manufacturer is indicated, are commonly available products commercially available on the market.

[0030] Определения терминов[0030] Definitions of terms

[0031] В данном документе «однодоменное антитело» (sdAb), также известное как наноантитело, означает антитело, в естественных условиях не имеющее легких цепей и содержащее только один вариабельный домен тяжелой цепи (VHH).[0031] As used herein, a “single domain antibody” (sdAb), also known as a nanoantibody, means an antibody that naturally lacks light chains and contains only one heavy chain variable domain (VHH).

[0032] В данном документе «гуманизированное антитело» относится к антителу, полученному путем слияния вариабельного домена тяжелой цепи целевого антитела (такого как антитело животного) с константным доменом антитела человека, либо антителу, полученному путем пересадки определяющей комплементарность области (последовательностей CDR 1-3) целевого антитела в вариабельную область антитела человека, либо антителу, полученному путем осуществления аминокислотной мутации в целевом антителе в соответствии с характеристиками каркасной области (FR1-4) антитела человека. Гуманизированное антитело может быть получено путем синтеза или сайт-направленного мутагенеза.[0032] As used herein, “humanized antibody” refers to an antibody produced by fusing the heavy chain variable domain of a target antibody (such as an animal antibody) with the constant domain of a human antibody, or an antibody produced by grafting the complementarity determining region (CDR sequences 1-3 ) of the target antibody into the variable region of a human antibody, or an antibody obtained by performing an amino acid mutation in the target antibody in accordance with the characteristics of the framework region (FR1-4) of the human antibody. The humanized antibody can be produced by synthesis or site-directed mutagenesis.

[0033] В данном документе «диатело» означает небольшой двухвалентный и биспецифический фрагмент антитела, способный одновременно распознавать два антигена. Hollinger и др. с помощью коротких пептидных молекул соединяли гены вариабельного домена легкой цепи антитела к антигену A (VLA) и вариабельного домена тяжелой цепи антитела к антигену B (VHB); а также соединяли VHA и VLB и вставляли две группы химерных генов в бицистронную экспрессионную плазмиду для конструирования плазмиды для экспрессии диатела. После экспрессии VLA-VHB сшивали с VHA-VLB с образованием биспецифического антитела. В настоящем изобретении одним из антигенов, которые способно распознавать двухвалентное антитело, является белок IL-5, а другой антиген, который способно распознавать двухвалентное антитело, может быть выбран из любого из существующих антигенов.[0033] As used herein, “diabody” means a small divalent and bispecific antibody fragment capable of simultaneously recognizing two antigens. Hollinger et al. used short peptide molecules to connect the antigen A light chain variable domain (VLA) and antigen B heavy chain variable domain (VHB) genes; and also combined VHA and VLB and inserted two groups of chimeric genes into a bicistronic expression plasmid to construct a diabody expression plasmid. Once expressed, VLA-VHB was cross-linked with VHA-VLB to form a bispecific antibody. In the present invention, one of the antigens that the divalent antibody can recognize is IL-5 protein, and the other antigen that the divalent antibody can recognize can be selected from any of the existing antigens.

[0034] В данном документе «поливалентное антитело», также называемое полиантителом, относится к антителу с модифицированной структурой (сходной с диателом), которое способно одновременно распознавать различные антигены (аналогично диателу). В настоящем изобретении одним из антигенов, которые способно распознавать поливалентное антитело, является белок IL-5.[0034] As used herein, a “multivalent antibody,” also referred to as a polyantibody, refers to an antibody with a modified structure (similar to a diabody) that is capable of simultaneously recognizing different antigens (similar to a diabody). In the present invention, one of the antigens that the multivalent antibody can recognize is IL-5 protein.

[0035] «CDR», упоминаемая в настоящем описании, означает определяющую комплементарность область антитела. Антитело обычно содержит две вариабельные области - вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи. Вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи обычно содержит три CDR.[0035] "CDR" as referred to herein means the complementarity determining region of an antibody. An antibody typically contains two variable regions, a heavy chain variable domain and a light chain variable domain. A heavy chain variable domain or a light chain variable domain typically contains three CDRs.

[0036] Варианты осуществления[0036] Embodiments

[0037] В варианте осуществления настоящего изобретения предложена IL-5-связывающая молекула. IL-5-связывающая молекула способна специфично связываться с IL-5 и содержит по меньшей мере один из одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, содержащих определяющие комплементарность области CDR1, CDR2 и CDR3;[0037] An embodiment of the present invention provides an IL-5 binding molecule. The IL-5 binding molecule is capable of specifically binding to IL-5 and contains at least one of single immunoglobulin variable domains containing complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3;

[0038] где аминокислотная последовательность CDR1 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 43-49; аминокислотная последовательность CDR2 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 50-56; и аминокислотная последовательность CDR3 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 57-62.[0038] wherein the amino acid sequence of CDR1 is selected from any of the sequences given under SEQ ID NO: 43-49; the amino acid sequence of CDR2 is selected from any of the sequences given under SEQ ID NO: 50-56; and the amino acid sequence of CDR3 is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 57-62.

[0039] Предпочтительно аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей CDR1, CDR2 и CDR3 приведены в любом из (1)-(13):[0039] Preferably, the amino acid sequences of the complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3 are given in any of (1)-(13):

[0040] (1) SEQ ID NO: 43, 56 и 58;[0040] (1) SEQ ID NO: 43, 56 and 58;

[0041] (2) SEQ ID NO: 49, 51 и 60;[0041] (2) SEQ ID NO: 49, 51 and 60;

[0042] (3) SEQ ID NO: 47, 56 и 57;[0042] (3) SEQ ID NO: 47, 56 and 57;

[0043] (4) SEQ ID NO: 45, 54 и 57;[0043] (4) SEQ ID NO: 45, 54 and 57;

[0044] (5) SEQ ID NO: 46, 50 и 61;[0044] (5) SEQ ID NO: 46, 50 and 61;

[0045] (6) SEQ ID NO: 47, 56 и 62;[0045] (6) SEQ ID NO: 47, 56 and 62;

[0046] (7) SEQ ID NO: 48, 56 и 57;[0046] (7) SEQ ID NO: 48, 56 and 57;

[0047] (8) SEQ ID NO: 45, 53 и 57;[0047] (8) SEQ ID NO: 45, 53 and 57;

[0048] (9) SEQ ID NO: 44, 55 и 57;[0048] (9) SEQ ID NO: 44, 55 and 57;

[0049] (10) SEQ ID NO: 43, 56 и 59;[0049] (10) SEQ ID NO: 43, 56 and 59;

[0050] (11) SEQ ID NO: 43, 52 и 59;[0050] (11) SEQ ID NO: 43, 52 and 59;

[0051] (12) SEQ ID NO: 47, 56 и 59; а также[0051] (12) SEQ ID NO: 47, 56 and 59; and

[0052] (13) SEQ ID NO: 47, 52 и 59.[0052] (13) SEQ ID NO: 47, 52 and 59.

[0053] В необязательном варианте осуществления одиночные вариабельные домены иммуноглобулина дополнительно содержат каркасную область, содержащую FR1, FR2, FR3 и FR4. Структура однодоменного антитела является следующей: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.[0053] In an optional embodiment, the single immunoglobulin variable domains further comprise a framework region comprising FR1, FR2, FR3 and FR4. The structure of a single domain antibody is as follows: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

[0054] Аминокислотная последовательность FR1 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 63-68; аминокислотная последовательность FR2 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 69-72; аминокислотная последовательность FR3 выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 73-86; а аминокислотная последовательность FR4 приведена под SEQ ID NO: 87.[0054] The amino acid sequence of FR1 is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 63-68; the amino acid sequence of FR2 is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 69-72; the amino acid sequence of FR3 is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 73-86; and the amino acid sequence of FR4 is given under SEQ ID NO: 87.

[0055] Предпочтительно каркасные области FR1, FR2 и FR3 одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина имеют последовательности, приведенные в любом из (14)-(28):[0055] Preferably, the framework regions FR1, FR2 and FR3 of the single immunoglobulin variable domains have the sequences shown in any of (14)-(28):

[0056] (14) SEQ ID NO: 65, 72 и 85;[0056] (14) SEQ ID NO: 65, 72 and 85;

[0057] (15) SEQ ID NO: 65, 72 и 82;[0057] (15) SEQ ID NO: 65, 72 and 82;

[0058] (16) SEQ ID NO: 64, 71 и 86;[0058] (16) SEQ ID NO: 64, 71 and 86;

[0059] (17) SEQ ID NO: 65, 72 и 73;[0059] (17) SEQ ID NO: 65, 72 and 73;

[0060] (18) SEQ ID NO: 65, 72 и 84;[0060] (18) SEQ ID NO: 65, 72 and 84;

[0061] (19) SEQ ID NO: 66, 69 и 83;[0061] (19) SEQ ID NO: 66, 69 and 83;

[0062] (20) SEQ ID NO: 68, 72 и 76;[0062] (20) SEQ ID NO: 68, 72 and 76;

[0063] (21) SEQ ID NO: 66, 69 и 79;[0063] (21) SEQ ID NO: 66, 69 and 79;

[0064] (22) SEQ ID NO: 63, 72 и 85;[0064] (22) SEQ ID NO: 63, 72 and 85;

[0065] (23) SEQ ID NO: 67, 70 и 80;[0065] (23) SEQ ID NO: 67, 70 and 80;

[0066] (24) SEQ ID NO: 65, 72 и 78;[0066] (24) SEQ ID NO: 65, 72 and 78;

[0067] (25) SEQ ID NO: 65, 72 и 77;[0067] (25) SEQ ID NO: 65, 72 and 77;

[0068] (26) SEQ ID NO: 67, 70 и 81;[0068] (26) SEQ ID NO: 67, 70 and 81;

[0069] (27) SEQ ID NO: 65, 72 и 74; а также[0069] (27) SEQ ID NO: 65, 72 and 74; and

[0070] (28) SEQ ID NO: 65, 72 и 75.[0070] (28) SEQ ID NO: 65, 72 and 75.

[0071] Предпочтительно одиночный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой VHH.[0071] Preferably, the single immunoglobulin variable domain is VHH.

[0072] Предпочтительно аминокислотная последовательность VHH выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 1-12.[0072] Preferably, the amino acid sequence of VHH is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 1-12.

[0073] Предпочтительно VHH представляет собой гуманизированный VHH.[0073] Preferably, the VHH is a humanized VHH.

[0074] Предпочтительно последовательность гуманизированного VHH выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 13-21.[0074] Preferably, the sequence of the humanized VHH is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 13-21.

[0075] Предпочтительно связывающая молекула дополнительно содержит Fc-область иммуноглобулина, соединенную с VHH.[0075] Preferably, the binding molecule further comprises an immunoglobulin Fc region linked to a VHH.

[0076] Предпочтительно Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область иммуноглобулина человека.[0076] Preferably, the immunoglobulin Fc region is a human immunoglobulin Fc region.

[0077] Предпочтительно Fc-область иммуноглобулина человека представляет собой Fc-область IgG4 человека.[0077] Preferably, the human immunoglobulin Fc region is a human IgG4 Fc region.

[0078] В варианте осуществления настоящего изобретения предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая IL-5-связывающую молекулу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления.[0078] An embodiment of the present invention provides an isolated nucleic acid encoding an IL-5 binding molecule according to any of the previous embodiments.

[0079] Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 22-42.[0079] Preferably, the nucleic acid sequence is selected from any of the sequences shown under SEQ ID NO: 22-42.

[0080] В варианте осуществления настоящего изобретения предложен рекомбинантный вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту согласно любому из предыдущих вариантов осуществления. В необязательном варианте осуществления рекомбинантный вектор может представлять собой плазмиду, бактериофаг или вирусный вектор.[0080] An embodiment of the present invention provides a recombinant vector containing an isolated nucleic acid according to any of the previous embodiments. In an optional embodiment, the recombinant vector may be a plasmid, bacteriophage, or viral vector.

[0081] В варианте осуществления настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный вектор согласно предыдущему варианту осуществления. В альтернативном варианте осуществления клетка-хозяин может являться прокариотической клеткой или эукариотической клеткой.[0081] An embodiment of the present invention provides a host cell containing a recombinant vector according to the previous embodiment. In an alternative embodiment, the host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.

[0082] В варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения IL-5-связывающей молекулы, включающий культивирование клетки-хозяина согласно предыдущему варианту осуществления с получением IL-5-связывающей молекулы.[0082] An embodiment of the present invention provides a method for producing an IL-5 binding molecule, comprising culturing a host cell according to the previous embodiment to produce an IL-5 binding molecule.

[0083] Следует отметить, что связывающая молекула, описанная в любом из приведенных выше вариантов осуществления, может быть получена путем искусственного синтеза или может быть получена путем вначале синтеза кодирующего ее гена, а затем осуществления биологической экспрессии.[0083] It should be noted that the binding molecule described in any of the above embodiments may be obtained by artificial synthesis or may be obtained by first synthesizing the gene encoding it and then performing biological expression.

[0084] В варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат для связывания белка IL-5, содержащий конъюгирующий компонент и IL-5-связывающую молекулу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления. Конъюгирующий компонент конъюгирован с IL-5-связывающей молекулой; и конъюгирующий компонент включает в себя маркер и/или соединение для выявления.[0084] An embodiment of the present invention provides an IL-5 protein binding conjugate comprising a conjugating moiety and an IL-5 binding molecule according to any of the preceding embodiments. The conjugating component is conjugated to an IL-5 binding molecule; and the conjugating component includes a marker and/or detection compound.

[0085] Предпочтительно маркер для выявления представляет собой радиоактивный элемент.[0085] Preferably, the detection marker is a radioactive element.

[0086] В варианте осуществления настоящего изобретения предложен набор для выявления IL-5, содержащий IL-5-связывающую молекулу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления.[0086] An embodiment of the present invention provides an IL-5 detection kit comprising an IL-5 binding molecule according to any of the previous embodiments.

[0087] В дополнение, в варианте осуществления настоящего изобретения предложено применение IL-5-связывающей молекулы при получении лекарственных средств, нацеленных на IL-5, для лечения заболевания.[0087] In addition, an embodiment of the present invention provides the use of an IL-5 binding molecule in the preparation of drugs targeting IL-5 for the treatment of a disease.

[0088] Предпочтительно заболевание выбрано из любого из астмы, аллергического дерматита, экземы, артрита, герпеса, хронической первичной крапивницы, склеродермии, гипертрофических рубцов, хронического обструктивного заболевания легких, атопического дерматита, идиопатического легочного фиброза, болезни Кавасаки, серповидноклеточной анемии, болезни Грейвса, синдрома Шегрена, аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, аутоиммунной гемолитической анемии, пищевода Барретта, аутоиммунного увеита, туберкулеза и заболевания почек.[0088] Preferably, the disease is selected from any of asthma, allergic dermatitis, eczema, arthritis, herpes, chronic primary urticaria, scleroderma, hypertrophic scars, chronic obstructive pulmonary disease, atopic dermatitis, idiopathic pulmonary fibrosis, Kawasaki disease, sickle cell disease, Graves' disease, Sjogren's syndrome, autoimmune lymphoproliferative syndrome, autoimmune hemolytic anemia, Barrett's esophagus, autoimmune uveitis, tuberculosis and kidney disease.

[0089] Ниже проводится дополнительное подробное описание признаков и характеристик настоящего изобретения со ссылкой на примеры.[0089] The following provides further detailed description of the features and characteristics of the present invention with reference to examples.

[0090] Пример 1[0090] Example 1

[0091] Получение однодоменного антитела к белку IL-5[0091] Production of a single domain antibody to the IL-5 protein

[0092] A. Конструирование вектора для экспрессии рекомбинантного белка IL-5 человека[0092] A. Construction of a vector for expression of recombinant human IL-5 protein

[0093] Последовательность, кодирующую IL-5, получали путем информационного поиска в NCBI, и ее номером доступа является NM_000879.2. Кодирование кодирующей последовательностью обеспечивало получение аминокислотной последовательности с номером доступа NP_000870.1. В аминокислотной последовательности, соответствующей NP_000870.1, на веб-сайтах ™HMM и SMART соответственно проводился анализ в отношении трансмембранных областей и внеклеточных концов. Результаты анализа продемонстрировали, что белок IL-5 является секреторным белком без трансмембранной области и имеет 134 аминокислоты в своей полной длине с сигнальным пептидом в положениях аминокислот с номерами 1-19. Посредством синтеза генов нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты с номерами 20-134 белка IL-5, клонировали в вектор pcDNA3.4. Сконструированный вектор подвергали секвенированию по Сэнгеру и выравнивали с исходной последовательностью. При успешном подтверждении рекомбинантные плазмиды экстрагировали партиями, чтобы удалить из них эндотоксины, и суспендированные клетки 293F трансфицировали для экспрессии и очистки целевого белка. Результаты анализа очищенного рекомбинантного белка IL-5 человека методом SDS-PAGE показаны на фиг. 1 (где маркер - градиент молекулярной массы стандартного белка; hrIL-5-cHis - рекомбинантный белок IL-5 человека с гистидиновой меткой на карбокси-конце).[0093] The IL-5 coding sequence was obtained through an NCBI information search and its accession number is NM_000879.2. Encoding by the coding sequence provided the amino acid sequence with accession number NP_000870.1. The amino acid sequence corresponding to NP_000870.1 was analyzed for transmembrane regions and extracellular ends on the ™HMM and SMART websites, respectively. The results of the analysis demonstrated that the IL-5 protein is a secretory protein without a transmembrane region and has 134 amino acids in its total length with a signal peptide at amino acid positions 1-19. Through gene synthesis, the nucleotide sequence encoding amino acids 20-134 of the IL-5 protein was cloned into the pcDNA3.4 vector. The constructed vector was subjected to Sanger sequencing and aligned with the original sequence. Once confirmed successfully, the recombinant plasmids were extracted in batches to remove endotoxins, and the suspended 293F cells were transfected for expression and purification of the target protein. The results of SDS-PAGE analysis of purified recombinant human IL-5 protein are shown in FIG. 1 (where the marker is the molecular weight gradient of the standard protein; hrIL-5-cHis is a recombinant human IL-5 protein with a histidine tag at the carboxy-terminus).

[0094] Как видно из фиг. 1, чистота экспрессированного и очищенного рекомбинантного белка IL-5 человека составляет приблизительно 90%. Полученный в данном примере белок IL-5 применяется для иммунизации верблюдов и скрининга антител.[0094] As can be seen from FIG. 1, the purity of the expressed and purified recombinant human IL-5 protein is approximately 90%. The IL-5 protein obtained in this example is used for camel immunization and antibody screening.

[0095] B. Конструирование библиотеки однодоменных антител к белку IL-5[0095] B. Construction of a library of single-domain antibodies to the IL-5 protein

[0096] 600 мкг очищенного рекомбинантного белка IL-5 человека, полученного на стадии A, смешивали с полным адъювантом Фрейнда в равном объеме для иммунизации алашаньского двугорбого верблюда из Внутренней Монголии один раз в неделю в общей сложности семь раз. За исключением первой иммунизации, остальные шесть иммунизаций проводили с использованием смеси 300 мкг рекомбинантного белка IL-5 и неполного адъюванта Фрейнда в равном объеме для продуцирования у верблюда антитела к IL-5.[0096] 600 μg of purified recombinant human IL-5 protein obtained in stage A was mixed with Freund's complete adjuvant in an equal volume to immunize an Alashan Bactrian camel from Inner Mongolia once a week for a total of seven times. With the exception of the first immunization, the remaining six immunizations were performed using a mixture of 300 μg of recombinant IL-5 protein and an equal volume of Freund's incomplete adjuvant to produce anti-IL-5 antibodies in the camel.

[0097] После иммунизации у верблюда отбирали 100 мл периферической крови, и из лимфоцитов экстрагировали РНК. Экстрагированную общую РНК использовали для синтеза кДНК, и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VHH) амплифицировали посредством вложенной ПЦР с кДНК в качестве матрицы. Затем вектор pMECS и амплифицированный VHH-фрагмент расщепляли соответственно с применением рестрикционной эндонуклеазы, и расщепленные фрагменты и вектор соединяли; соединенные фрагменты вводили путем трансформации в компетентные клетки TG1 для конструирования фаг-дисплейной библиотеки белка IL-5, и объем библиотеки (рекомбинантных клеток TG1) определяли как составляющий приблизительно 1×10⁹.[0097] After immunization, 100 ml of peripheral blood was collected from the camel, and RNA was extracted from the lymphocytes. The extracted total RNA was used for cDNA synthesis, and the antibody heavy chain variable region (VHH) was amplified by nested PCR with the cDNA as template. Then, the pMECS vector and the amplified VHH fragment were digested, respectively, using a restriction endonuclease, and the digested fragments and the vector were combined; the concatenated fragments were introduced by transformation into competent TG1 cells to construct a phage display library of IL-5 protein, and the volume of the library (recombinant TG1 cells) was determined to be approximately 1×10 ⁹ .

[0098] C. Скрининг однодоменного антитела к белку IL-5[0098] C. Screening for Single Domain Antibody to IL-5 Protein

[0099] 200 мкл рекомбинантных клеток TG1, полученных на стадии B, инокулировали в 2× среду TY для инкубирования. В ходе инкубирования добавляют 40 мкл фага-помощника VCSM13 для инфицирования клеток TG1, и их культивируют в течение ночи для амплификации фага. На следующий день фаг осаждали с помощью PEG/NaCl, и амплифицированный фаг собирали путем центрифугирования с получением библиотеки амплифицированных фагов.[0099] 200 μl of recombinant TG1 cells obtained from stage B were inoculated into 2× TY medium for incubation. During incubation, 40 μl of helper phage VCSM13 was added to infect TG1 cells, and they were cultured overnight for phage amplification. The next day, the phage was precipitated with PEG/NaCl, and the amplified phage was collected by centrifugation to obtain an amplified phage library.

[0100] 500 мкг белка IL-5, разбавленного в NaHCO₃ (100 мМ, pH 8,3), наносили на поверхность планшета для ELISA при 4°C на ночь. Также были представлены лунки отрицательного контроля. В день 2 добавляют 200 мкл 3% обезжиренного молока для блокирования при комнатной температуре в течение 2 ч. После блокирования добавляют 100 мкл библиотеки амплифицированных фагов (приблизительно 2×10¹¹ фаговых частиц) для воздействия при комнатной температуре в течение 1 ч. После 1 часа воздействия планшет промывают пять раз с помощью PBS и 0,05% Tween-20, чтобы смыть несвязавшиеся фаги. Фаг, специфично связывающийся с белком IL-5, подвергали диссоциации с помощью трипсина в конечной концентрации 2,5 мг/мл для инфицирования клеток TG1 E. coli в фазе логарифмического роста. Инфицированные клетки TG1 E. coli культивировали при 37°C в течение 1 ч. для продуцирования и сбора фагов для следующего скрининга. Тот же самый процесс скрининга повторяли в течение еще одного цикла для обеспечения постепенного обогащения. Для кратности обогащения, составляющей более 10x, эффект обогащения показан на фиг. 2 и в таблице 1.[0100] 500 μg of IL-5 protein diluted in NaHCO ₃ (100 mM, pH 8.3) was applied to the surface of an ELISA plate at 4°C overnight. Negative control wells were also provided. On day 2, add 200 µl of 3% skim milk to block at room temperature for 2 hours. After blocking, add 100 µl of amplified phage library (approximately 2 x 10 ¹¹ phage particles) to block at room temperature for 1 hour. After 1 hour exposure, the plate is washed five times with PBS and 0.05% Tween-20 to wash away unbound phages. Phage that specifically binds to the IL-5 protein was dissociated with trypsin at a final concentration of 2.5 mg/ml to infect TG1 cells with E. coli in logarithmic growth phase. Infected TG1 E. coli cells were cultured at 37°C for 1 h to produce and collect phages for the next screen. The same screening process was repeated for another round to ensure progressive enrichment. For enrichment folds greater than 10x, the effect of enrichment is shown in FIG. 2 and in table 1.

Таблица 1. Эффект обогащенияTable 1. Effect of enrichment Цикл 1Cycle 1 Цикл 2Cycle 2 Цикл 3Cycle 3 I/EI/E 80008000 35,7142857135.71428571 44 P/NP/N 3,1253.125 180,6451613180.6451613 25002500

[0101] Из результатов можно видеть, что для обогащения в цикле 3 P/N составляет 2500, а I/E составляет 4.[0101] From the results, it can be seen that for enrichment in cycle 3, the P/N is 2500 and the I/E is 4.

[0102] D. Скрининг конкретных положительных клонов против IL-5 методом ELISA бактериофагов.[0102] D. Screening for specific anti-IL-5 positive clones by bacteriophage ELISA.

[0103] Если кратность обогащения составляет более 10, из подвергнутых скринингу положительных клонов отбирают 400 отдельных колоний и инокулируют в среду TB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, в 96-луночном планшете с глубокими лунками. Также был представлен холостой контроль. Содержимое планшета культивировали при 37°C до логарифмической фазы, и затем добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для культивирования в течение ночи при 28°C.[0103] If the enrichment fold is greater than 10, 400 individual colonies are selected from the screened positive clones and inoculated into TB medium containing 100 μg/ml ampicillin in a 96-well deep well plate. A blank control was also presented. The contents of the plate were cultured at 37°C to logarithmic phase, and then IPTG was added at a final concentration of 1 mM for overnight culture at 28°C.

[0104] Неочищенный экстракт антитела получали путем осмотического взрыва. Рекомбинантный белок IL-5 человека разбавляли в NaHCO₃ (100 мМ pH 8,3), и 100 мкг рекомбинантного белка IL-5 наносили на поверхность планшета для ELISA при 4°C на ночь. 100 мкл полученного неочищенного экстракта антитела переносили на планшет для ELISA, в который был добавлен антиген (рекомбинантный белок IL-5), и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Несвязавшиеся антитела смывали с помощью PBST. Добавляли 100 мкл антител мыши к HA-метке (Thermo Fisher) в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Несвязавшиеся антитела смывали с помощью PBST. Добавляли 100 мкл антитела к иммуноглобулину кролика, конъюгированного с HRP (антитела козы к иммуноглобулину кролика, меченного пероксидазой хрена, Thermo Fisher), в разведении 1:20000, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Несвязавшиеся антитела смывали с помощью PBST. Добавляли раствор для проявления цвета пероксидазы хрена для осуществления реакции при 37°C в течение 15 мин., добавляли останавливающий раствор, и измеряли поглощение при длине волны 450 нм в микропланшет-ридере. Если оптическая плотность (OD) в лунках с образцом в более чем 5 раз превышает таковую в контрольных лунках, то лунки с образцом определяют как лунки с положительными клонами. Бактерии из лунок с положительными клонами переносили в среду LB, содержащую 100 мкг/мкл ампициллина, на шейкере для экстракции и секвенирования плазмид. Последовательности генов каждого клона анализировали согласно программному обеспечению для выравнивания последовательностей Vector NTI. Клоны с одинаковыми последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3 считаются одним и тем же клоном, а клоны с разными последовательностями считаются разными клонами, и в конечном счете получают однодоменное антитело, специфичное к белку IL-5. Однодоменное антитело имеет аминокислотную последовательность FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, которая образует целый VHH. Полученная рекомбинантная плазмида для экспрессии однодоменного антитела (положительная плазмида, целевая последовательность) может экспрессироваться в прокариотической системе с получением в конечном счете белкового однодоменного антитела.[0104] The crude antibody extract was prepared by osmotic explosion. Recombinant human IL-5 protein was diluted in NaHCO ₃ (100 mM pH 8.3), and 100 μg of recombinant IL-5 protein was applied to the surface of the ELISA plate at 4°C overnight. 100 μl of the resulting crude antibody extract was transferred to an ELISA plate to which antigen (IL-5 recombinant protein) had been added and incubated at room temperature for 1 hour. Unbound antibodies were washed off with PBST. 100 μl of mouse anti-HA tag antibodies (Thermo Fisher) at a dilution of 1:2000 were added and incubated at room temperature for 1 h. Unbound antibodies were washed away with PBST. 100 μl of HRP-conjugated anti-rabbit immunoglobulin antibody (horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit immunoglobulin antibody, Thermo Fisher) was added at a dilution of 1:20,000 and incubated at room temperature for 1 hour. Unbound antibodies were washed away with PBST. Horseradish peroxidase color development solution was added to react at 37°C for 15 minutes, a stopping solution was added, and the absorbance was measured at 450 nm in a microplate reader. If the optical density (OD) of the sample wells is greater than 5 times that of the control wells, then the sample wells are designated as clone-positive wells. Bacteria from wells with positive clones were transferred to LB medium containing 100 μg/μl ampicillin on a shaker for plasmid extraction and sequencing. The gene sequences of each clone were analyzed according to Vector NTI sequence alignment software. Clones with the same CDR1, CDR2, and CDR3 sequences are considered the same clone, and clones with different sequences are considered different clones, ultimately resulting in a single domain antibody specific for the IL-5 protein. The single domain antibody has the amino acid sequence FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, which forms the entire VHH. The resulting recombinant single domain antibody expression plasmid (positive plasmid, target sequence) can be expressed in a prokaryotic system to ultimately produce a protein single domain antibody.

[0105] E. Очистка и экспрессия однодоменного антитела, специфичного к белку IL-5, в клетках-хозяевах E. coli.[0105] E. Purification and expression of a single domain antibody specific for the IL-5 protein in E. coli host cells.

[0106] Положительные плазмиды (pMECS-VHH) различных клонов, полученные посредством анализа методом секвенирования на стадии D, подвергали электропорации в HB2151 E. coli, распределяли по культуральной чашке с LB+ампициллин+глюкоза (т.е. содержащей ампициллин и глюкозу) и инкубировали при 37°C в течение ночи. Отдельную колонию отбирали и инокулировали в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин, и инкубировали в шейкере при 37°C в течение ночи. 1 мл суточной культуры инокулировали в 330 мл среды TB и инкубировали в шейкере при 37°C. Поглощение измеряли при длине волны 600 нм с помощью спектрометра и регистрировали как OD600. Если измеряемое значение OD600 находилось в диапазоне 0,6-0,9, то добавляли 1M IPTG для инкубирования в шейкере при 28°C в течение ночи. E. coli собирали путем центрифугирования. Неочищенный экстракт антитела получали путем осмотического взрыва. Антитело очищали посредством аффинной хроматографии на колонке с Ni. Очищенные однодоменные антитела показаны в таблице 2.[0106] Positive plasmids (pMECS-VHH) of various clones obtained through stage D sequencing analysis were electroporated into E. coli HB2151, distributed onto a culture plate with LB+ampicillin+glucose (i.e. containing ampicillin and glucose) and incubated at 37°C overnight. A single colony was picked and inoculated into 5 ml of LB medium containing ampicillin and incubated on a shaker at 37°C overnight. 1 ml of the daily culture was inoculated into 330 ml of TB medium and incubated in a shaker at 37°C. Absorbance was measured at 600 nm using a spectrometer and recorded as OD600. If the measured OD600 value was in the range of 0.6-0.9, then 1M IPTG was added for incubation in a shaker at 28°C overnight. E. coli was collected by centrifugation. The crude antibody extract was obtained by osmotic explosion. The antibody was purified by affinity chromatography on a Ni column. Purified single domain antibodies are shown in Table 2.

Таблица 2. Информация об однодоменных антителахTable 2. Information about single domain antibodies Номер антителаAntibody number Название антителаAntibody name FR1FR1 CDR1CDR1 FR2FR2 CDR2CDR2 FR3FR3 CDR3CDR3 FR4FR4 Полноразмерная аминокислотная последовательностьFull-length amino acid sequence Соответствующая кодирующая нуклеотидная последовательностьCorresponding coding nucleotide sequence 11 1B31B3 6565 4343 7272 5656 8585 5858 8787 11 2222 22 1B81B8 6565 4343 7272 5656 8282 5858 22 2323 33 1F41F4 6464 4949 7171 5151 8686 6060 33 2424 44 2B32B3 6565 4747 7272 5656 7373 5757 44 2525 55 2F72F7 6565 4343 7272 5656 8484 5858 55 2626 66 2G62G6 6565 4545 7272 5454 8585 5757 66 2727 77 3G123G12 6666 4646 6969 5050 8383 6161 77 2828 88 4B124B12 6868 4747 7272 5656 7676 6262 88 2929 99 4C34C3 6666 4646 6969 5050 7979 6161 99 30thirty 1010 4D54D5 6565 4848 7272 5656 7373 5757 1010 3131 11eleven 4G84G8 6565 4545 7272 5353 8585 5757 11eleven 3232 1212 4H24H2 6363 4444 7272 5555 8585 5757 1212 3333 1313 1B3-V11B3-V1 6767 4343 7070 5656 8080 5959 1313 3434 1414 1B3-V21B3-V2 6565 4343 7272 5252 7878 5959 1414 3535 1515 1B3-V31B3-V3 6565 4343 7272 5252 8585 5959 1515 3636 1616 1B3-V41B3-V4 6565 4343 7272 5252 7777 5959 1616 3737 1717 1B3-V51B3-V5 6565 4343 7272 5656 7878 5959 1717 3838 1818 2B3-V12B3-V1 6767 4747 7070 5656 8181 5959 1818 3939 1919 2B3-V22B3-V2 6565 4747 7272 5252 7474 5959 1919 4040 2020 2B3-V32B3-V3 6565 4747 7272 5252 7373 5959 2020 4141 2121 2B3-V42B3-V4 6565 4747 7272 5252 7575 5959 2121 4242

[0107] Примечание: в таблице 2 числа, соответствующие CDR 1-3 и FR 1-4, являются их SEQ ID NO.[0107] Note: In Table 2, the numbers corresponding to CDR 1-3 and FR 1-4 are their SEQ ID NO.

[0108] Пример 2[0108] Example 2

[0109] Гуманизация однодоменного антитела к IL-5[0109] Humanization of single-domain anti-IL-5 antibody

[0110] Гуманизацию осуществляли путем гуманизации аминокислот на поверхности белка и пересадки универсальной каркасной области для гуманизации однодоменных антител.[0110] Humanization was accomplished by humanizing amino acids on the surface of the protein and grafting a universal framework region to humanize single domain antibodies.

[0111] Гуманизацию аминокислот на поверхности белка проводили в следующих стадиях. Гомологичное моделирование проводили для клонов антител 1B3 и 2B3 с использованием программного обеспечения для моделирования Discovery Studio с антителом NbBcII10 (номер в PDB: 3DWT), имеющим гомологичную последовательность, в качестве эталона, и относительную доступность аминокислот для растворителя рассчитывали согласно трехмерной структуре белка.[0111] Humanization of amino acids on the protein surface was carried out in the following steps. Homology modeling was performed for antibody clones 1B3 and 2B3 using Discovery Studio modeling software with antibody NbBcII10 (PDB number: 3DWT) having a homologous sequence as a reference, and the relative solvent accessibility of amino acids was calculated according to the three-dimensional structure of the protein.

[0112] Пересадку универсальной каркасной области для гуманизации VHH проводили в следующих конкретных стадиях. Вначале разрабатывали и получали универсальную каркасную область h-NbBcII10FGLA (№ доступа в PDB: 3EAK) для гуманизации VHH в соответствии с гомологией последовательностей и на основе наноантитела NbBcII10 (№ доступа в PDB: 3DWT) путем гуманизации аминокислот на поверхности белка со ссылкой на гуманизированное антитело DP-47 и модификации некоторых аминокислот каркасной области 2 VHH как FGLA. В качестве каркасной области непосредственно используется h-NbBcII10FGLA, в котором CDR заменяются на CDR клонов антител 1B3 и 2B3 соответственно с достижением гуманизации антитела.[0112] Transplantation of the universal framework region for humanizing VHH was carried out in the following specific steps. First, a universal framework region h-NbBcII10FGLA (PDB accession no.: 3EAK) was designed and prepared to humanize VHH according to sequence homology and based on the nanoantibody NbBcII10 (PDB accession no.: 3DWT) by humanizing amino acids on the protein surface with reference to the humanized antibody DP-47 and modifications of some amino acids of the VHH framework region 2 as FGLA. h-NbBcII10FGLA is directly used as a framework region, in which the CDRs are replaced with the CDRs of antibody clones 1B3 and 2B3, respectively, to achieve humanization of the antibody.

[0113] Клоны антител 1B3 и 2B3 были гуманизированы с получением пяти вариантов гуманизированных клонов антител. В таблице 3 и таблице 4 показаны номера последовательностей и изменения аминокислот для этих гуманизированных вариантов. Аминокислотные остатки были пронумерованы в соответствии с системой нумерации по Kabat. Знаком «» в таблице 3 и таблице 4 указано, что в данном положении в клоне наноантитела имеется мутация (замена). В частности, например, «S11L» означает, что в положении 11 S (серин) заменен на L (лейцин); и «S66T» означает, что в положении 66 S (серин) заменен на T (треонин). На фиг. 3 показаны результаты выравнивания гуманизированных последовательностей.[0113] Antibody clones 1B3 and 2B3 were humanized to produce five humanized antibody clone variants. Table 3 and Table 4 show the sequence numbers and amino acid changes for these humanized variants. Amino acid residues were numbered according to the Kabat numbering system. Sign " "Table 3 and Table 4 indicate that there is a mutation (substitution) at this position in the nanoantibody clone. In particular, for example, "S11L" means that at position 11 S (serine) is replaced by L (leucine); and "S66T" means that at position 66, S (serine) is replaced by T (threonine). In fig. Figure 3 shows the alignment results of the humanized sequences.

Таблица 3. Номера последовательностей гуманизированных вариантов клонов 1B3, 2B3 и изменения аминокислот в некоторых вариантахTable 3. Sequence numbers of humanized variants of clones 1B3, 2B3 and amino acid changes in some variants S11LS11L A14PA14P S45AS45A E49GE49G R50LR50L G52AG52A S53VS53V L54AL54A S63AS63A 1B3-V11B3-V1 1B3-V21B3-V2 1B3-V31B3-V3 1B3-V41B3-V4 1B3-V51B3-V5 2B3-V12B3-V1 2B3-V22B3-V2 2B3-V32B3-V3 2B3-V42B3-V4 Таблица 4. Номера последовательностей гуманизированных вариантов клонов 1B3, 2B3 и изменения аминокислот в некоторых вариантахTable 4. Sequence numbers of humanized variants of clones 1B3, 2B3 and amino acid changes in some variants S66TS66T V80RV80R A83SA83S I86TI86T L93SL93S K95RK95R P96AP96A M10IVM10IV K108RK108R 1B3-V11B3-V1 1B3-V21B3-V2 1B3-V31B3-V3 1B3-V41B3-V4 1B3-V51B3-V5 2B3-V12B3-V1 2B3-V22B3-V2 2B3-V32B3-V3 2B3-V42B3-V4

[0114] Пример 3[0114] Example 3

[0115] F. Конструирование вектора экспрессии в эукариотических клетках для слитого белка на основе Fc и однодоменного антитела к белку IL-5[0115] F. Construction of an expression vector in eukaryotic cells for an Fc-based fusion protein and a single domain antibody to the IL-5 protein

[0116] Нуклеотидную последовательность однодоменного антитела, подвергнутого скринингу на стадии D в примере 1, получали путем секвенирования по Сэнгеру. Вышеуказанную нуклеотидную последовательность, подвергнутую оптимизации кодонов посредством синтеза последовательности, вставляли в модифицированный вектор RJK-V4-hFC.[0116] The nucleotide sequence of the single domain antibody screened in Step D in Example 1 was obtained by Sanger sequencing. The above nucleotide sequence, subjected to codon optimization through sequence synthesis, was inserted into the modified RJK-V4-hFC vector.

[0117] RJK-V4-hFC представляет собой универсальный целевой вектор для экспрессии наноантитела, полученный путем слияния Fc-фрагмента последовательности, кодирующей тяжелую цепь (номер доступа в NCBI: AB776838.1) IgG человека, с коммерческим вектором pCDNA3.4 (информация о векторе доступна по адресу https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf) от Invitrogen. Данный вектор содержит шарнирные области, CH2 и CH3 тяжелой цепи IgG. Ниже показана специфическая модификация.[0117] RJK-V4-hFC is a universal targeted nanoantibody expression vector prepared by fusion of the Fc fragment of the heavy chain coding sequence (NCBI accession number: AB776838.1) of human IgG with the commercial vector pCDNA3.4 (information on vector available at https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf) from Invitrogen. This vector contains the hinge regions, CH2 and CH3 of the IgG heavy chain. The specific modification is shown below.

[0118] В pcDNA3.4 были выбраны сайты разрезания рестрикционными ферментами XbaI и AgeI. Сайт множественного клонирования (MCS) и 6×His-метку вводили соответственно на 5’- и 3’-концы последовательности, кодирующей Fc-фрагмент, посредством ПЦР с перекрывающимися праймерами. Вышеописанный фрагмент амплифицировали посредством ПЦР с использованием пары праймеров с сайтами разрезания ферментами XbaI и AgeI соответственно. pcDNA3.4 и амплифицированный фрагмент с сайтами разрезания ферментами XbaI и AgeI из праймеров расщепляли соответственно с применением рестрикционных эндонуклеаз XbaI и AgeI. Расщепленный вектор и вставленный фрагмент соединяли с помощью лигазы T4, после чего продукт, полученный в результате такого соединения, вводили путем трансформации в E. coli, амплифицировали и подтверждали путем секвенирования с получением рекомбинантного вектора экспрессии в эукариотических клетках.[0118] In pcDNA3.4, cut sites for the restriction enzymes XbaI and AgeI were selected. A multiple cloning site (MCS) and a 6×His tag were introduced at the 5′ and 3′ ends of the Fc fragment coding sequence, respectively, by PCR with overlapping primers. The above fragment was amplified by PCR using a pair of primers with cutting sites for the enzymes XbaI and AgeI, respectively. pcDNA3.4 and the amplified fragment with XbaI and AgeI cutting sites from the primers were digested using XbaI and AgeI restriction endonucleases, respectively. The digested vector and inserted fragment were joined by T4 ligase, and the resulting product was transformed into E. coli, amplified, and confirmed by sequencing to produce a recombinant expression vector in eukaryotic cells.

[0119] Сконструированный рекомбинантный вектор экспрессии в эукариотических клетках вводили путем трансформации в DH5α E. coli и инкубировали для экстракции плазмид в максимасштабе и удаления эндотоксинов. Плазмиду, экстрагированную в максимасштабе, секвенировали для идентификации. Подтвержденный рекомбинантный вектор использовали для последующей трансфекции и экспрессии в эукариотических клетках.[0119] The constructed recombinant eukaryotic cell expression vector was introduced by transformation into E. coli DH5α and incubated for maxi-scale plasmid extraction and endotoxin removal. The maxi-scale extracted plasmid was sequenced for identification. The validated recombinant vector was used for subsequent transfection and expression in eukaryotic cells.

[0120] G. Экспрессия слитого белка на основе Fc и однодоменного антитела, специфичного к белку IL-5, в суспендированных клетках ExpiCHO-S.[0120] G. Expression of an Fc-based fusion protein and a single domain antibody specific for the IL-5 protein in suspended ExpiCHO-S cells.

[0121] За 3 дня до трансфекции пассировали и размножали клетки ExpiCHO-S™ в концентрации 2,5×10⁵/мл. Клетки в рассчитанном требуемом объеме переносили во встряхиваемую колбу на 500 мл, содержащую 120 мл (конечный объем) среды для экспрессии ExpiCHO™. Клетки инкубировали до концентрации, составляющей приблизительно от 4×10⁶ до 6×10⁶ живых клеток/мл. За день до трансфекции клетки ExpiCHO-S™ разбавляли до 3,5×10⁶ живых клеток/мл и культивировали в течение ночи. В день трансфекции определяли плотность клеток и процентную долю живых клеток. Перед трансфекцией плотность клеток должна достигать приблизительно от 7×10⁶ до 10×10⁶ живых клеток/мл. Клетки разбавляли до 6×10⁶ живых клеток/мл в свежей среде для экспрессии ExpiCHO™, предварительно нагретой до 37°C. Клетки в рассчитанном требуемом объеме переносили во встряхиваемую колбу на 500 мл, содержащую 100 мл (конечный объем) свежей предварительно нагретой среды для экспрессии ExpiCHO™. Реагент ExpiFectamine™CHO равномерно перемешивали путем осторожного переворачивания вверх дном и разбавляли в 3,7 мл среды OptiPRO™, встряхиваемой или перемешиваемой равномерно. Плазмидную ДНК (полученную на стадии F) разбавляли в 4 мл охлажденной среды OptiPRO™, встряхивали и перемешивали равномерно. Смесь ExpiFectamine CHO/плазмидная ДНК инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин., а затем осторожно добавляли к полученной суспензии клеток, в ходе чего встряхиваемую колбу осторожно встряхивали. Клетки культивировали со встряхиванием на увлаженном воздухе с 8% CO₂ при 37°C. В день 1 после трансфекции (спустя 18-22 часа) добавляли 600 мкл усилителя ExpiFectamine™CHO и 24 мл подпитки ExpiCHO. Через приблизительно 8 дней после трансфекции (когда жизнеспособность клеток составляла менее 70%) собирали надосадочную жидкость.[0121] 3 days before transfection, ExpiCHO-S™ cells were passaged and expanded at a concentration of 2.5×10 ⁵ /ml. Cells in the calculated required volume were transferred to a 500 ml shake flask containing 120 ml (final volume) of ExpiCHO™ expression medium. The cells were incubated to a concentration of approximately 4×10 ⁶ to 6×10 ⁶ live cells/ml. The day before transfection, ExpiCHO-S™ cells were diluted to 3.5 x 10 ⁶ live cells/ml and cultured overnight. On the day of transfection, cell density and percentage of living cells were determined. Before transfection, the cell density should reach approximately 7 x 10 ⁶ to 10 x 10 ⁶ live cells/ml. Cells were diluted to 6x10 ⁶ live cells/ml in fresh ExpiCHO™ expression medium prewarmed to 37°C. Cells in the calculated required volume were transferred to a 500 ml shake flask containing 100 ml (final volume) of fresh pre-warmed ExpiCHO™ expression medium. ExpiFectamine™CHO reagent was mixed evenly by gently turning upside down and diluted in 3.7 ml of OptiPRO™ medium, shaken or stirred evenly. Plasmid DNA (obtained in step F) was diluted in 4 ml of cooled OptiPRO™ media, vortexed and mixed evenly. The ExpiFectamine CHO/plasmid DNA mixture was incubated at room temperature for 3 min and then carefully added to the resulting cell suspension while the shake flask was gently shaken. Cells were cultured with shaking in humidified air with 8% CO ₂ at 37°C. On day 1 post-transfection (18-22 hours later), 600 µl of ExpiFectamine™CHO enhancer and 24 ml of ExpiCHO feed were added. Approximately 8 days after transfection (when cell viability was less than 70%), the supernatant was collected.

[0122] H. Экспрессия слитого белка на основе Fc и однодоменного антитела к белку IL-5 в суспендированных клетках 293F.[0122] H. Expression of an Fc-based fusion protein and a single domain antibody to the IL-5 protein in suspended 293F cells.

[0123] За 3 дня до трансфекции пассировали и размножали клетки 293F в концентрации 2,5×10⁵/мл. Клетки в рассчитанном требуемом объеме переносили во встряхиваемую колбу на 500 мл, содержащую 120 мл (конечный объем) свежей предварительно нагретой среды OPM-293 CD05. Клетки инкубировали до концентрации, составляющей приблизительно от 2×10⁶ до 3×10⁶ живых клеток/мл. В день трансфекции определяли плотность клеток и процентную долю живых клеток. Перед трансфекцией плотность клеток должна достигать приблизительно от 2×10⁶ до 3×10⁶ живых клеток/мл. Клетки разбавляли до концентрации 1×10⁶ живых клеток/мл в предварительно нагретой среде OPM-293 CD05. Клетки в рассчитанном требуемом объеме переносили во встряхиваемую колбу на 500 мл, содержащую 100 мл (конечный объем) свежей предварительно нагретой среды. Реагент PEI (1 мг/мл) разбавляли в 4 мл среды Opti-MEM и встряхивали или перемешивали равномерно путем пипетирования. Плазмидную ДНК (полученную на стадии F) разбавляли в 4 мл среды Opti-MEM, встряхивали и перемешивали равномерно, фильтровали с помощью головки фильтра с размером пор 0,22 мкм и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Разбавленный реагент PEI добавляли к разбавленной ДНК и переворачивали вверх дном для равномерного перемешивания. Смесь PEI/плазмидная ДНК инкубировали при комнатной температуре в течение 15-20 мин., а затем осторожно добавляли к полученной суспензии клеток, в ходе чего встряхиваемую колбу осторожно встряхивали. Клетки культивировали со встряхиванием при 37°C в 5% CO₂ при 120 об./мин. Через 24 ч. и 72 ч. после трансфекции добавляли 5 мл подпитки OPM-CHO PFF05. Через приблизительно 7 дней после трансфекции (когда жизнеспособность клеток составляла менее 70%) собирали надосадочную жидкость.[0123] 3 days before transfection, 293F cells were passaged and expanded at a concentration of 2.5×10 ⁵ /ml. Cells in the calculated required volume were transferred to a 500 mL shake flask containing 120 mL (final volume) of fresh prewarmed OPM-293 CD05 medium. The cells were incubated to a concentration of approximately 2×10 ⁶ to 3×10 ⁶ live cells/ml. On the day of transfection, cell density and percentage of living cells were determined. Before transfection, the cell density should reach approximately 2 x 10 ⁶ to 3 x 10 ⁶ live cells/ml. Cells were diluted to a concentration of 1×10 ⁶ live cells/ml in pre-warmed OPM-293 CD05 medium. Cells in the calculated required volume were transferred to a 500 mL shake flask containing 100 mL (final volume) of fresh prewarmed medium. PEI reagent (1 mg/mL) was diluted in 4 mL of Opti-MEM medium and vortexed or mixed evenly by pipetting. Plasmid DNA (obtained in step F) was diluted in 4 ml of Opti-MEM medium, vortexed and mixed evenly, filtered using a 0.22 μm filter head and incubated at room temperature for 5 min. The diluted PEI reagent was added to the diluted DNA and turned upside down to ensure uniform mixing. The PEI/plasmid DNA mixture was incubated at room temperature for 15–20 min and then carefully added to the resulting cell suspension while the shake flask was gently shaken. Cells were cultured with shaking at 37°C in 5% CO ₂ at 120 rpm. At 24 h and 72 h posttransfection, 5 ml of OPM-CHO PFF05 feed was added. Approximately 7 days after transfection (when cell viability was less than 70%), the supernatant was collected.

[0124] F. Очистка слитого белка на основе Fc и однодоменного антитела к белку IL-5[0124] F. Purification of an Fc-based fusion protein and a single domain antibody to the IL-5 protein

[0125] Полученную на стадии G или H надосадочную жидкость с экспрессируемым слитым белком на основе Fc фильтровали с помощью одноразовой головки фильтра с размером пор 0,45 мкм для удаления нерастворимых примесей. Фильтрат очищали посредством аффинной хроматографии с использованием устройства для очистки белков с агарозным наполнителем, конъюгированным с белком A, по принципу связывания слитого белка на основе Fc человека с белком A. Фильтрату позволяли проходить через предварительно упакованную колонку с белком A при скорости потока 1 мл/мин. На данной стадии целевой белок в фильтрате связывается с наполнителем. Примесные белки, связывающиеся с колонкой, смывали с помощью низкосолевых и высокосолевых буферных растворов. Целевой белок, связывающийся с колонкой, элюировали буферным раствором с низким pH. Элюированный раствор быстро добавляли в раствор Tris-HCl с pH 9,0 для нейтрализации.[0125] The expressed Fc fusion protein supernatant from Step G or H was filtered using a disposable 0.45 μm filter head to remove insoluble impurities. The filtrate was purified by affinity chromatography using a Protein A agarose-loaded protein purification device based on the principle of human Fc fusion protein binding to Protein A. The filtrate was allowed to pass through a prepacked Protein A column at a flow rate of 1 ml/min . At this stage, the target protein in the filtrate binds to the excipient. Contaminant proteins bound to the column were washed away using low-salt and high-salt buffer solutions. The target protein binding to the column was eluted with a low pH buffer solution. The eluted solution was quickly added to Tris-HCl pH 9.0 solution for neutralization.

[0126] Нейтрализованный раствор белка подвергали диализу и затем подвергали анализу методом SDS-PAGE. Белок, имеющий чистоту 95% или больше и концентрацию 0,5 мг/мл или больше, был криоконсервирован и готов к применению.[0126] The neutralized protein solution was dialyzed and then subjected to SDS-PAGE analysis. Protein having a purity of 95% or greater and a concentration of 0.5 mg/ml or greater was cryopreserved and ready for use.

[0127] Проверочный пример 1[0127] Test case 1

[0128] Определение зависимости «доза-эффект» для связывания однодоменного антитела, специфичного к белку IL-5, представленного в примере 1[0128] Determination of the dose-response relationship for binding of the IL-5 protein-specific single domain antibody shown in Example 1

[0129] 50 мкл 1 мкг/мл белка IL-5 наносили на поверхность планшета для ELISA при 4°C на ночь. Планшет промывали. 200 мкл 5% молока добавляли для блокирования при 37°C в течение 1 ч. Однодоменное антитело (VHH), специфичное к белку IL-5, полученное в примере 1, разбавляли до 2 мкг/мл, а затем разбавляли с 5-кратным градиентом в общей сложности в 8 градиентах концентрации. Планшет промывали. 50 мкл антитела добавляли в дублирующие лунки и затем инкубировали при 37°C в течение 1 ч. Планшет промывали. Добавляли 50 мкл вторичного антитела мыши к HA-метке, конъюгированного с HRP, и затем инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Планшет промывали (несколько раз). 50 мкл ™B, который был возвращен к комнатной температуре, добавляли для осуществления реакции при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин. Добавляли 50 мкл останавливающего раствора (1 н. HCl). Результаты измеряли с помощью микропланшет-ридера и затем регистрировали. Кривую откладывали на графике. Концентрация для 50% от максимального эффекта (EC50), которая является концентрацией, вызывающей 50% от максимального эффекта, была рассчитана и показана на фиг. 4 и в таблице 5.[0129] 50 μl of 1 μg/ml IL-5 protein was applied to the surface of an ELISA plate at 4°C overnight. The tablet was washed. 200 μl of 5% milk was added to block at 37°C for 1 hour. The single domain antibody (VHH) specific for the IL-5 protein obtained in Example 1 was diluted to 2 μg/ml and then diluted with a 5-fold gradient in a total of 8 concentration gradients. The tablet was washed. 50 μl of antibody was added to duplicate wells and then incubated at 37°C for 1 hour. The plate was washed. 50 μl of mouse anti-HA tag secondary antibody conjugated to HRP was added and then incubated at 37°C for 30 min. The plate was washed (several times). 50 µl of ™B, which had been returned to room temperature, was added to react at room temperature in the dark for 15 minutes. 50 μl of stopping solution (1 N HCl) was added. The results were measured using a microplate reader and then recorded. The curve was plotted on the graph. The concentration for 50% of the maximum effect (EC50), which is the concentration causing 50% of the maximum effect, was calculated and shown in FIG. 4 and in table 5.

Таблица 5. Результаты определения EC50Table 5. Results of EC50 determination 4C34C3 4D54D5 4G84G8 3G123G12 4H24H2 4B124B12 1F41F4 2B32B3 1B31B3 1B81B8 2F72F7 2G62G6 EC50EC50 53,0253.02 88,6788.67 ~479939~479939 11,2311.23 48,1948.19 ~175524~175524 ~21637~21637 ~3445962~3445962 5,5825,582 3,763.76 44,8344.83 19,8419.84

[0130] Проверочный пример 2[0130] Test case 2

[0131] Экспрессия и очистка антитела Tool (Tab), нацеливающегося на белок IL-5 человека[0131] Expression and purification of a Tool antibody (Tab) targeting human IL-5 protein

[0132] Были получены Tab1 (контрольное антитело 1) и Tab2 (контрольное антитело 2). Tab1 представляет собой меполизумаб, имеющий последовательность, приведенную в патенте US7982005B2. Tab2 представляет собой реслизумаб, имеющий последовательность, приведенную в патенте US6056957.[0132] Tab1 (control antibody 1) and Tab2 (control antibody 2) were prepared. Tab1 is mepolizumab having the sequence shown in US7982005B2. Tab2 is reslizumab having the sequence shown in US6056957.

[0133] Искомые последовательности Tab1 и Tab2 были переданы в General Biol (Anhui) Co., Ltd. для оптимизации кодонов в системе экспрессии в клетках млекопитающих и клонированы в вектор pcDNA3.1 соответственно.[0133] The target sequences of Tab1 and Tab2 were submitted to General Biol (Anhui) Co., Ltd. for codon optimization in the expression system in mammalian cells and cloned into the pcDNA3.1 vector, respectively.

[0134] Бактерии, положительные по плазмидам и отсеянные при скрининге в отношении устойчивости, амплифицировали, и плазмиды экстрагировали с применением набора для экстракции плазмид в среднем масштабе (Macherey Nagel, № по кат. 740412.50). На каждые 100 мл клеток добавляли 100 мкг плазмид (50 мкг тяжелых цепей и 50 мкг легких цепей), которые подвергали транзиентной трансфекции и экспрессировали в клетках 293F (среда для экспрессии: FreeStyle 293, Thermo, № по кат. 12338026+F-68, Thermo, № по кат. 24040032) с использованием PEI. Через 6-24 ч. после трансфекции добавляли 5% объем 10% пептона (Sigma, № по кат. P0521-100G) и культивировали в 8% CO₂ при 130 об./мин. в течение приблизительно 7-8 дней. Когда жизнеспособность клеток падала до 50%, надосадочную жидкость с экспрессируемым белком собирали и очищали с помощью гравитационной колонки с белком A (GE, № по кат. 17-5438-02). После диализа против PBS определяли концентрацию с помощью NanoDrop, идентифицировали чистоту с помощью SEC и подтверждали связывание с помощью непрямого ELISA. Антитела Tab, полученные посредством данного способа, имеют концентрацию не менее 2 мг/мл и чистоту более 94%. EC50 для связывания с белком IL-5 (Novoprotein, № по кат. CS 33) показана на фиг. 5 и в таблице 6.[0134] Bacteria positive for plasmids and screened for resistance were amplified and plasmids were extracted using a medium scale plasmid extraction kit (Macherey Nagel, cat. no. 740412.50). For every 100 ml of cells, 100 μg of plasmids (50 μg heavy chains and 50 μg light chains) were added, which were transiently transfected and expressed in 293F cells (expression medium: FreeStyle 293, Thermo, cat. no. 12338026+F-68, Thermo, cat. no. 24040032) using PEI. 6-24 hours after transfection, a 5% volume of 10% peptone (Sigma, cat. no. P0521-100G) was added and cultured in 8% CO ₂ at 130 rpm. within approximately 7-8 days. When cell viability dropped to 50%, the expressed protein supernatant was collected and purified using a Protein A gravity column (GE, cat. no. 17-5438-02). After dialysis against PBS, concentration was determined by NanoDrop, purity was identified by SEC, and binding was confirmed by indirect ELISA. Tab antibodies obtained through this method have a concentration of at least 2 mg/ml and a purity of more than 94%. The EC50 for binding to IL-5 protein (Novoprotein, Cat. No. CS 33) is shown in FIG. 5 and in table 6.

Таблица 6. Результаты определения EC50Table 6. Results of EC50 determination Tab1Tab1 Tab2Tab2 HIgGHIgG EC50EC50 1,3211.321 0,75740.7574 ~ 4,591~4,591

[0135] Эксперимент по пролиферации клеток TF1, индуцируемой рекомбинантным белком IL-5 человека и нейтрализуемой антителом Tool (Tab)[0135] TF1 Cell Proliferation Experiment Induced by Recombinant Human IL-5 Protein and Neutralized by Tool Antibody (Tab)

[0136] Эксперимент по пролиферации клеток TF1, индуцируемой рекомбинантным белком IL-5 человека. Клетки TF-1, пассированные в течение 3-4 пассажей после реанимации, инокулировали в 96-луночный планшет при 10000 клеток/лунка. Белок IL-5 человека составляли в виде раствора с максимальной концентрацией 500 нг/мл и разбавляли с 5-кратным градиентом. Разбавленный с градиентом раствор белка IL-5 добавляли в лунки для культивирования клеток в объеме, равном объему среды для культивирования клеток. После инкубирования в течение 72 ч. выявляли жизнеспособность клеток с помощью набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток. EC80 для пролиферации клеток TF-1, индуцируемой IL-5, была рассчитана согласно результатам выявления. EC80 (концентрация для 80% от максимального эффекта) является концентрацией, вызывающей 80% от максимального эффекта.[0136] Experiment on the proliferation of TF1 cells induced by recombinant human IL-5 protein. TF-1 cells, passaged for 3-4 passages after resuscitation, were inoculated into a 96-well plate at 10,000 cells/well. Human IL-5 protein was formulated at a maximum concentration of 500 ng/ml and diluted in a 5-fold gradient. A gradient diluted IL-5 protein solution was added to cell culture wells in a volume equal to the volume of cell culture medium. After incubation for 72 h, cell viability was detected using a luminescent cell viability assay kit. The EC80 for IL-5-induced TF-1 cell proliferation was calculated according to the detection results. EC80 (concentration at 80% of maximum effect) is the concentration that causes 80% of maximum effect.

[0137] Эксперимент по пролиферации клеток TF1, индуцируемой IL-5 человека и нейтрализуемой Tab. Клетки TF-1, пассированные в течение 3-4 пассажей после реанимации, инокулировали в 96-луночный планшет при 10000 клеток/лунка. Tab1 и Tab2 составляли в виде 10 мкг/мл раствора и разбавляли с 5-кратным градиентом. Разбавленное с градиентом Tab смешивали с IL-5 при концентрации EC80, полученной в эксперименте по пролиферации, в соотношении 1:1 с получением смешанного раствора. Смешанный раствор добавляли в лунки для культивирования клеток в объеме, равном объему среды для культивирования клеток. После инкубирования в течение 72 ч. выявляли жизнеспособность клеток с помощью набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток. EC50 Tab1 и Tab2 для нейтрализации пролиферации клеток TF-1, индуцируемой IL-5, была рассчитана согласно результатам выявления и показана на фиг. 6 и в таблице 7.[0137] Experiment on TF1 cell proliferation induced by human IL-5 and neutralized by Tab. TF-1 cells, passaged for 3-4 passages after resuscitation, were inoculated into a 96-well plate at 10,000 cells/well. Tab1 and Tab2 were formulated as a 10 μg/ml solution and diluted with a 5-fold gradient. The gradient diluted Tab was mixed with IL-5 at the EC80 concentration obtained in the proliferation experiment in a 1:1 ratio to obtain a mixed solution. The mixed solution was added to cell culture wells in a volume equal to the volume of cell culture medium. After incubation for 72 h, cell viability was detected using a luminescent cell viability assay kit. The EC50 of Tab1 and Tab2 to neutralize IL-5-induced TF-1 cell proliferation was calculated according to the detection results and shown in FIG. 6 and in table 7.

Таблица 7. Результаты определения EC50Table 7. Results of EC50 determination Tab1Tab1 Tab2Tab2 HIgGHIgG EC50EC50 0,23380.2338 0,066390.06639 ~ 0,1323~0.1323

[0138] Выявление нейтрализации пролиферации клеток TF-1, индуцируемой IL-5, под действием слитого белка на основе Fc и однодоменного антитела к белку IL-5[0138] Detection of neutralization of IL-5-induced TF-1 cell proliferation by Fc-based fusion protein and single-domain anti-IL-5 protein antibody

[0139] Клетки TF-1, пассированные в течение 3-4 пассажей после реанимации, инокулировали в 96-луночный планшет при 10000 клеток/лунка. Tab1, Tab2 и слитый белок на основе Fc и однодоменного антитела, представленные в примере 3-I, составляли в виде 10 мкг/мл раствора и разбавляли с 5-кратным градиентом. Разбавленное с градиентом Tab и однодоменное антитело смешивали соответственно с белком IL-5 при концентрации EC80, полученной в эксперименте по пролиферации, в соотношении 1:1 с получением смешанного раствора. Смешанный раствор добавляли в лунки для культивирования клеток в объеме, равном объему среды для культивирования клеток. После инкубирования в течение 72 ч. выявляли жизнеспособность клеток с помощью набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток. EC50 различных однодоменных антител для нейтрализации пролиферации клеток TF-1, индуцируемой IL-5, была рассчитана согласно результатам выявления и показана на фиг. 7-8 и в таблицах 8-9.[0139] TF-1 cells passaged for 3-4 passages after resuscitation were inoculated into a 96-well plate at 10,000 cells/well. Tab1, Tab2 and the Fc-single domain antibody fusion protein shown in Example 3-I were formulated as a 10 μg/ml solution and diluted in a 5-fold gradient. The Tab gradient dilution and single domain antibody were respectively mixed with IL-5 protein at the EC80 concentration obtained in the proliferation experiment in a 1:1 ratio to obtain a mixed solution. The mixed solution was added to cell culture wells in a volume equal to the volume of cell culture medium. After incubation for 72 h, cell viability was detected using a luminescent cell viability assay kit. The EC50 of various single domain antibodies to neutralize IL-5-induced TF-1 cell proliferation was calculated according to the detection results and is shown in FIG. 7-8 and in tables 8-9.

Таблица 8. Результаты определения EC50Table 8. Results of EC50 determination 1B31B3 1B81B8 1F41F4 2B32B3 2F72F7 2G62G6 3G123G12 4B124B12 4C34C3 4D54D5 4G84G8 4H24H2 EC50EC50 0,095560.09556 0,17520.1752 0,099990.09999 0,15570.1557 0,14960.1496 ~0,1881~0.1881 2,0892,089 ~0,1961~0.1961 4,3974,397 0,42750.4275 ~0,1757~0.1757 ~0,1894~0.1894 Таблица 9. Результаты определения EC50Table 9. Results of EC50 determination 1B31B3 1B3-V11B3-V1 1B3-V21B3-V2 1B3-V31B3-V3 1B3-V41B3-V4 1B3-V51B3-V5 2B3-V12B3-V1 2B3-V22B3-V2 2B3-V32B3-V3 2B3-V42B3-V4 EC50EC50 0,20190.2019 2,8172.817 0,20210.2021 0,21920.2192 0,23740.2374 0,27430.2743 ~6,737e+029~6.737e+029 0,28990.2899 0,34870.3487 0,27010.2701

[0140] Выявление кинетики аффинности IL-5-связывающей молекулы[0140] Determining the affinity kinetics of an IL-5 binding molecule

Составление буферного раствора SD. Надлежащее количество бычьего сывороточного альбумина и Tween-20 растворяли в 1×PBS (pH 7,4), так чтобы массовые (или объемные) фракции бычьего сывороточного альбумина и Tween-20 составляли 0,1% и 0,02% соответственно. IL-5-связывающую молекулу составляли в буферном растворе SD до концентрации 10 мкг/мл. Составление рабочего раствора антигена: антиген составляли в буферном растворе SD до 200 нМ, а затем разбавляли с 2-кратным градиентом в общей сложности в 5 градиентах концентрации. В дополнение также был представлен холостой раствор в виде буферного раствора SD. Надлежащее количество 0,1 M исходного раствора глицина растворяли в 10 раз в деионизированной воде и равномерно перемешивали с получением регенерирующего раствора. Запускали Octet 96 и программное обеспечение для сбора данных на компьютере, поддерживающем работу с ними. Донную и боковые поверхности зонда для сбора данных очищали с помощью протирочной ткани для оптических стекол с надлежащим количеством 75% этанола. Прибор предварительно нагревали в течение 15 мин. или больше. Предварительное увлажнение датчика: датчик погружали в буферный раствор SD на 10 мин. или дольше перед анализом. Затем машинную процедуру настраивали в соответствии со следующим порядком: исходный уровень → антитело → исходный уровень → связывание антигена → диссоциация антигена → регенерация датчика для проведения анализа.Preparation of SD buffer solution. The appropriate amount of bovine serum albumin and Tween-20 were dissolved in 1× PBS (pH 7.4) such that the mass (or volume) fractions of bovine serum albumin and Tween-20 were 0.1% and 0.02%, respectively. IL-5 binding molecule was formulated in SD buffer solution to a concentration of 10 μg/ml. Formulation of working antigen solution: antigen was formulated in SD buffer solution to 200 nM and then diluted with a 2-fold gradient for a total of 5 concentration gradients. In addition, a blank solution in the form of SD buffer solution was also provided. An appropriate amount of 0.1 M glycine stock solution was dissolved 10 times in deionized water and stirred uniformly to obtain a regenerating solution. We ran Octet 96 and the data acquisition software on a computer that supported working with them. The bottom and sides of the acquisition probe were cleaned using an optical glass cleaning cloth with an appropriate amount of 75% ethanol. The device was preheated for 15 minutes. or more. Pre-wetting the sensor: the sensor was immersed in SD buffer solution for 10 min. or longer before analysis. The machine procedure was then set up according to the following order: baseline → antibody → baseline → antigen binding → antigen dissociation → probe regeneration for analysis.

[0141] Специально тестируемые параметры кинетики аффинности IL-5-связывающей молекулы показаны в таблице 10.[0141] The IL-5 binding molecule affinity kinetics parameters specifically tested are shown in Table 10.

Таблица 10. Результаты определения кинетики аффинности связывания с IL-5 у клонов 1B3 и 2B3 и их гуманизированных вариантовTable 10. Results of determining the kinetics of binding affinity to IL-5 in clones 1B3 and 2B3 and their humanized variants Название клонаClone name KD (M)KD(M) Погрешность KDKD error Ka (1/М⋅с)Ka (1/M⋅s) Погрешность KaUncertainty Ka Kd (1/с)Kd (1/s) Погрешность KdError Kd X² X ² R² R ² Tab1Tab1 0,99E-090.99E-09 6,49E-116.49E-11 8,26E+048.26E+04 4,50E+024.50E+02 8,22E-058.22E-05 5,34E-065.34E-06 0,19170.1917 0,99780.9978 2B3-V22B3-V2 2,06E-092.06E-09 4,60E-114.60E-11 1,97E+051.97E+05 1,71E+031.71E+03 4,06E-044.06E-04 8,35E-068.35E-06 0,1020.102 0,98380.9838 2B32B3 1,60E-091.60E-09 4,03E-114.03E-11 1,84E+051.84E+05 1,35E+031.35E+03 2,95E-042.95E-04 7,11E-067.11E-06 0,16180.1618 0,98920.9892 1B3-V21B3-V2 1,02E-091.02E-09 2,78E-112.78E-11 1,80E+051.80E+05 9,48E+029.48E+02 1,84E-041.84E-04 4,91E-064.91E-06 0,09880.0988 0,99410.9941 1B31B3 0,88E-090.88E-09 3,38E-113.38E-11 1,49E+051.49E+05 7,81E+027.81E+02 1,32E-041.32E-04 5,00E-065.00E-06 0,19790.1979 0,99540.9954

[0142] KD - константа аффинности, выраженная в молях (M).[0142] KD is the affinity constant expressed in moles (M).

[0143] Ka - константа скорости ассоциации, выраженная величиной, обратной молям на секунду (1/М⋅с).[0143] Ka is the rate constant of association, expressed as the reciprocal of moles per second (1/M⋅s).

[0144] Kd - константа скорости диссоциации, выраженная величиной, обратной времени.[0144] Kd is the dissociation rate constant, expressed as the reciprocal of time.

[0145] R² - степень соответствия, иными словами, степень соответствия между кривой, построенной по результатам измерений, и аппроксимированной кривой. R² ближе к 1 указывает на то, что подобранное значение ближе к измеренному значению, и в такой системе R² должна составлять по меньшей мере > 0,95.[0145] R ² is the degree of agreement, in other words, the degree of agreement between the curve constructed from the measurement results and the approximated curve. An R ² closer to 1 indicates that the fitted value is closer to the measured value, and in such a system the R ² should be at least > 0.95.

[0146] X² - характеристика статистического параметра значений, измеренных в системе, которая должна составлять < 3, и меньшее измеренное значение является более надежным.[0146] X ² is a characteristic of a statistical parameter of the values measured in the system, which should be < 3, and a smaller measured value is more reliable.

[0147] Другие значения погрешностей являются значениями погрешностей соответствующих параметров, которые должны быть более чем на порядок величины (в 10 раз) меньше параметров, которым они соответствуют.[0147] Other error values are the error values of the corresponding parameters, which must be more than an order of magnitude (10 times) smaller than the parameters to which they correspond.

[0148] Результаты продемонстрировали, что по сравнению с антителом Tool клон 1B3 обладает незначительно меньшей кинетической константой аффинности, а остальные клоны обладают незначительно большей кинетической константой аффинности, но среди тестируемых образцов не наблюдается значимое различие кинетических констант аффинности и отсутствует статистически значимое различие.[0148] The results demonstrated that, compared to the Tool antibody, clone 1B3 had a slightly lower affinity kinetic constant, and the remaining clones had a slightly higher affinity kinetic constant, but there was no significant difference in the affinity kinetic constants among the samples tested, and there was no statistically significant difference.

[0149] В вышеприведенном описании представлены лишь предпочтительные примеры согласно настоящему изобретению, которые не предполагаются как ограничивающие настоящее изобретение. Специалист в данной области может производить различные изменения и вариации настоящего изобретения. Любые модификации, эквивалентные замены или улучшения, выполненные в рамках сущности и принципа настоящего изобретения, должны находиться в пределах объема правовой охраны настоящего изобретения.[0149] The foregoing description provides only preferred examples according to the present invention and is not intended to limit the present invention. Various changes and variations of the present invention can be made by one skilled in the art. Any modifications, equivalent substitutions or improvements made within the spirit and principle of the present invention shall be within the scope of legal protection of the present invention.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> РЕГЕНЕКОР БИОТЕХ КО., ЛТД<110> REGENECOR BIOTECH CO., LTD

<120> IL-5-СВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ<120> IL-5 BINDING MOLECULE, METHOD OF ITS PREPARATION AND ITS APPLICATION

<130> PCT/CN2021/077650<130> PCT/CN2021/077650

<150> 2020108435011<150> 2020108435011

<151> 2020-08-20<151> 2020-08-20

<160> 87 <160> 87

<170> PatentIn, версия 3.5<170> PatentIn, version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> искусственная последовательность<213> artificial sequence

<220><220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи<223> heavy chain variable domain

<400> 1<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser

20 25 30 20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ser Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ser

35 40 45 35 40 45

Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Gly Gln Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Gly Gln

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 2<210> 2

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 2<400> 2

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Gly Gln Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gly Gln Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 3<210> 3

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 3<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Leu Asp Leu Met Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Leu Asp Leu Met

20 25 30 20 25 30

Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Gly Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Gly

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Ile Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

50 55 60 50 55 60

Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met

65 70 75 80 65 70 75 80

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys

85 90 95 85 90 95

Val Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Tyr Gln Ser Glu Thr Tyr Glu Tyr Trp Val Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Tyr Gln Ser Glu Thr Tyr Glu Tyr Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 4<210> 4

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 4<400> 4

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser

20 25 30 20 25 30

Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45 35 40 45

Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Gly Ser

50 55 60 50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

85 90 95 85 90 95

Cys Ala Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp Cys Ala Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 5<210> 5

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 5<400> 5

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 6<210> 6

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 6<400> 6

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ser

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Asn Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Asn Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp Gly Gln Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp Gly Gln

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 7<210> 7

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 7<400> 7

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asn Asp Val Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asn Asp Val

20 25 30 20 25 30

Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val

35 40 45 35 40 45

Ala Gly Ile Asp Ile Asp Gly Leu Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Gly Ile Asp Ile Asp Gly Leu Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Ala Val Arg Leu Tyr Phe Ser Ser Ser Arg Asn Gln Tyr Lys Tyr Glu Ala Val Arg Leu Tyr Phe Ser Ser Ser Arg Asn Gln Tyr Lys Tyr Glu

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 8<210> 8

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 8<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Cys Ala Ser Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp Cys Ala Ser Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 9<210> 9

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 9<400> 9

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Ala Gly Ile Asp Ile Asp Gly Leu Ile Ser Tyr Ala Asp Pro Val Lys Ala Gly Ile Asp Ile Asp Gly Leu Ile Ser Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Gln Asn Thr Met Tyr Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Gln Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 10<210> 10

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 10<400> 10

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Thr Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Thr Ser

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 11<210> 11

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 11<400> 11

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ala Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ala Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 12<210> 12

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 12<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ala Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ala

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 13<210> 13

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 13<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val

35 40 45 35 40 45

Ala Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Gly Gln Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Gly Gln

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 14<210> 14

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 14<400> 14

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 15<210> 15

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 15<400> 15

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 16<210> 16

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 16<400> 16

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 17<210> 17

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 17<400> 17

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 18<210> 18

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 18<400> 18

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45 35 40 45

Ala Val Ala Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ala Val Ala Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser

50 55 60 50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95 85 90 95

Cys Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Cys Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 19<210> 19

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 19<400> 19

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Gly Ser

50 55 60 50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ile Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 20<210> 20

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 20<400> 20

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 21<210> 21

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> гуманизированный VHH<223> humanized VHH

<400> 21<400> 21

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 22<210> 22

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<213> искусственная последовательность <213> artificial sequence

<220><220>

<223> нуклеиновая кислота, кодирующая IL-5-связывающую молекулу<223> nucleic acid encoding an IL-5 binding molecule

<400> 22<400> 22

caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cgagcggcat taccgcgagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120agctgcgcgg cgagcggcat taccgcgagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120

ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcagcac cagctatgcg 180ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcagcac cagctatgcg 180

gatagcgtga aaggccgttt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240gatagcgtga aaggccgttt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240

cagatgaaca acctgaaacc ggaagatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgaaatat 300cagatgaaca acctgaaacc ggaagatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgaaatat 300

tgcatgtttt ggagccatcc gagctattgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360tgcatgtttt ggagccatcc gagctattgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360

<210> 23<210> 23

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 23<400> 23

gatagcgtga aaggccagtt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240gatagcgtga aaggccagtt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240

<210> 24<210> 24

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 24<400> 24

caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgcgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgcgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cgagcggcaa caccctggat ctgatggcgt ggtttcgtca ggcgccgggc 120agctgcgcgg cgagcggcaa caccctggat ctgatggcgt ggtttcgtca ggcgccgggc 120

aaagaacgtg aaggcgtggc gggcatttat agcagcggca ccacctatta tgcggatagc 180aaagaacgtg aaggcgtggc gggcatttat agcagcggca ccacctatta tgcggatagc 180

gtgaaaggcc gttttaccgt gagccgtgat aacgcgaaaa acaccgtgta tctgcagatg 240gtgaaaggcc gttttaccgt gagccgtgat aacgcgaaaa acaccgtgta tctgcagatg 240

aacagcctga aaccggaaga tgcggcgatg tattattgcg cggcgaaagt gagctggtat 300aacagcctga aaccggaaga tgcggcgatg tattattgcg cggcgaaagt gagctggtat 300

ggccgttggt atcagagcga aacctatgaa tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360ggccgttggt atcagagcga aacctatgaa tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360

agcagc 366agcagc 366

<210> 25<210> 25

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 25<400> 25

agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc tttagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc tttagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120

cagagcccgg gcaaagaacg tgaaggcagc ctggcgacca tttatgatgg cagcaccgcg 180cagagcccgg gcaaagaacg tgaaggcagc ctggcgacca tttatgatgg cagcaccgcg 180

tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagcgtgg ataacgcgaa aaacattctg 240tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagcgtgg ataacgcgaa aaacattctg 240

tatctgcaga tgaacaacct gaaaccggaa gataccgcga tgtattattg cgcggcggcg 300tatctgcaga tgaacaacct gaaaccggaa gataccgcga tgtattattg cgcggcggcg 300

aaatattgca tgttttggag cgatccgagc tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360aaatattgca tgttttggag cgatccgagc tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360

agcagc 366agcagc 366

<210> 26<210> 26

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 26<400> 26

cagatgaaca acctgaaacc ggcggatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgaaatat 300cagatgaaca acctgaaacc ggcggatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgaaatat 300

<210> 27<210> 27

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 27<400> 27

agctgcgcgg cgagcggcat taccagcagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120agctgcgcgg cgagcggcat taccagcagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120

ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcaacat tagctatgcg 180ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcaacat tagctatgcg 180

tgcatgtttt ggagcgatcc gagctattgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360tgcatgtttt ggagcgatcc gagctattgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360

<210> 28<210> 28

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 28<400> 28

agctgcgtgg cgagcggcct gaccctgaac gatgtgagca tggcgtggtt tcgtcaggcg 120agctgcgtgg cgagcggcct gaccctgaac gatgtgagca tggcgtggtt tcgtcaggcg 120

ccgggcaaag aacgtgaaga agtggcgggc attgatattg atggcctgat tagctatgcg 180ccgggcaaag aacgtgaaga agtggcgggc attgatattg atggcctgat tagctatgcg 180

gatagcgtga aaggccgttt taccattagc aaagataacg cgcagaacac cctgtatctg 240gatagcgtga aaggccgttt taccattagc aaagataacg cgcagaacac cctgtatctg 240

cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcgatgtata gctgcgcggc ggtgcgtctg 300cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcgatgtata gctgcgcggc ggtgcgtctg 300

tattttagca gcagccgtaa ccagtataaa tatgaaggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360tattttagca gcagccgtaa ccagtataaa tatgaaggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360

agcagc 366agcagc 366

<210> 29<210> 29

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 29<400> 29

caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagc cgggcggcag cctgcgtctg 60caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagc cgggcggcag cctgcgtctg 60

tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc gtgagcgtgg ataacgcgaa aaacattctg 240tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc gtgagcgtgg ataacgcgaa aaacattctg 240

tatctgcaga tgaacaacct gaaaccggaa gataccgcga tgtattattg cgcgagcgcg 300tatctgcaga tgaacaacct gaaaccggaa gataccgcga tgtattattg cgcgagcgcg 300

agcagc 366agcagc 366

<210> 30<210> 30

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 30<400> 30

gatccggtga aaggccgttt taccattagc aaagataacg cgcagaacac catgtatctg 240gatccggtga aaggccgttt taccattagc aaagataacg cgcagaacac catgtatctg 240

agcagc 366agcagc 366

<210> 31<210> 31

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 31<400> 31

agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc accagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc accagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120

agcagc 366agcagc 366

<210> 32<210> 32

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 32<400> 32

ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcgcgat tagctatgcg 180ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcgcgat tagctatgcg 180

<210> 33<210> 33

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 33<400> 33

caggtgcagc tggtggaaag cgaaggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60caggtgcagc tggtggaaag cgaaggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg tgagcggcat taccagcagc accgcgtgca tgggctggtt tcgtcagagc 120agctgcgcgg tgagcggcat taccagcagc accgcgtgca tgggctggtt tcgtcagagc 120

ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcagcat tagctatgcg 180ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcagcat tagctatgcg 180

<210> 34<210> 34

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 34<400> 34

caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgtctg 60caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cgagcggcat taccgcgagc accagctgca tgggctggtt tcgtcaggcg 120agctgcgcgg cgagcggcat taccgcgagc accagctgca tgggctggtt tcgtcaggcg 120

ccgggcaaag gcctggaagc ggtggcggcg accatttatg atggcagcac ctattatgcg 180ccgggcaaag gcctggaagc ggtggcggcg accatttatg atggcagcac ctattatgcg 180

gatagcgtga aaggccgttt taccattagc cgtgataaca gcaaaaacac cctgtatctg 240gatagcgtga aaggccgttt taccattagc cgtgataaca gcaaaaacac cctgtatctg 240

cagatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacc gcggtgtatt attgcgcggc ggcgcgttat 300cagatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacc gcggtgtatt attgcgcggc ggcgcgttat 300

tgcatgtttt ggagccatcc gagctattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360tgcatgtttt ggagccatcc gagctattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360

<210> 35<210> 35

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 35<400> 35

ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atgcgagcac cagctatgcg 180ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atgcgagcac cagctatgcg 180

gatagcgtga aaggccgttt taccattagc cgtgataaca gcaaaaacat tctgtatctg 240gatagcgtga aaggccgttt taccattagc cgtgataaca gcaaaaacat tctgtatctg 240

cagatgaaca acctgcgtgc ggaagatacc gcggtgtatt attgcgcggc ggcgcgttat 300cagatgaaca acctgcgtgc ggaagatacc gcggtgtatt attgcgcggc ggcgcgttat 300

<210> 36<210> 36

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 36<400> 36

cagatgaaca acctgaaacc ggaagatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgcgttat 300cagatgaaca acctgaaacc ggaagatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgcgttat 300

<210> 37<210> 37

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 37<400> 37

gatagcgtga aaggccgttt taccattagc cgtgataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240gatagcgtga aaggccgttt taccattagc cgtgataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240

<210> 38<210> 38

<211> 360<211> 360

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 38<400> 38

<210> 39<210> 39

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 39<400> 39

caggcgccgg gcaaaggcct ggaagcggtg gcggcgacca tttatgatgg cagcacctat 180caggcgccgg gcaaaggcct ggaagcggtg gcggcgacca tttatgatgg cagcacctat 180

tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagccgtg ataacagcaa aaacaccctg 240tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagccgtg ataacagcaa aaacaccctg 240

tatctgcaga tgaacagcct gcgtgcggaa gataccgcgg tgtattattg cgcggcggcg 300tatctgcaga tgaacagcct gcgtgcggaa gataccgcgg tgtattattg cgcggcggcg 300

cgttattgca tgttttggag ccatccgagc tattggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360cgttattgca tgttttggag ccatccgagc tattggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360

agcagc 366agcagc 366

<210> 40<210> 40

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 40<400> 40

cagagcccgg gcaaagaacg tgaaggcagc ctggcgacca tttatgatgc gagcaccgcg 180cagagcccgg gcaaagaacg tgaaggcagc ctggcgacca tttatgatgc gagcaccgcg 180

tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagccgtg ataacagcaa aaacattctg 240tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagccgtg ataacagcaa aaacattctg 240

tatctgcaga tgaacaacct gcgtgcggaa gataccgcgg tgtattattg cgcggcggcg 300tatctgcaga tgaacaacct gcgtgcggaa gataccgcgg tgtattattg cgcggcggcg 300

cgttattgca tgttttggag ccatccgagc tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360cgttattgca tgttttggag ccatccgagc tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360

agcagc 366agcagc 366

<210> 41<210> 41

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 41<400> 41

agcagc 366agcagc 366

<210> 42<210> 42

<211> 366<211> 366

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<400> 42<400> 42

tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagccgtg ataacgcgaa aaacattctg 240tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagccgtg ataacgcgaa aaacattctg 240

agcagc 366agcagc 366

<210> 43<210> 43

<211> 8<211> 8

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> определяющая комплементарность область CDR1<223> complementarity determining region CDR1

<400> 43<400> 43

Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser Cys Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser Cys

1 5 15

<210> 44<210> 44

<211> 8<211> 8

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 44<400> 44

Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ala Cys Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ala Cys

1 5 15

<210> 45<210> 45

<211> 8<211> 8

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 45<400> 45

Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ser Cys Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ser Cys

1 5 15

<210> 46<210> 46

<211> 8<211> 8

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 46<400> 46

Gly Leu Thr Leu Asn Asp Val Ser Gly Leu Thr Leu Asn Asp Val Ser

1 5 15

<210> 47<210> 47

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 47<400> 47

Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Cys Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Cys

1 5 10 1 5 10

<210> 48<210> 48

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 48<400> 48

Gly Asn Thr Phe Ser Thr Ser Thr Tyr Cys Gly Asn Thr Phe Ser Thr Ser Thr Tyr Cys

1 5 10 1 5 10

<210> 49<210> 49

<211> 6<211> 6

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 49<400> 49

Gly Asn Thr Leu Asp Leu Gly Asn Thr Leu Asp Leu

1 5 15

<210> 50<210> 50

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> определяющая комплементарность область CDR2<223> complementarity determining region CDR2

<400> 50<400> 50

Ile Asp Ile Asp Gly Leu Ile Ile Asp Ile Asp Gly Leu Ile

1 5 15

<210> 51<210> 51

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 51<400> 51

Ile Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Ile Tyr Ser Ser Gly Thr Thr

1 5 15

<210> 52<210> 52

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 52<400> 52

Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr

1 5 15

<210> 53<210> 53

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 53<400> 53

Thr Ile Tyr Asp Gly Ala Ile Thr Ile Tyr Asp Gly Ala Ile

1 5 15

<210> 54<210> 54

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 54<400> 54

Thr Ile Tyr Asp Gly Asn Ile Thr Ile Tyr Asp Gly Asn Ile

1 5 15

<210> 55<210> 55

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 55<400> 55

Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Ile Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Ile

1 5 15

<210> 56<210> 56

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 56<400> 56

Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr

1 5 15

<210> 57<210> 57

<211> 15<211> 15

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> определяющая комплементарность область CDR3<223> complementarity determining region CDR3

<400> 57<400> 57

Ala Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp Ala Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 58<210> 58

<211> 15<211> 15

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 58<400> 58

Ala Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Ala Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 59<210> 59

<211> 15<211> 15

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 59<400> 59

Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 60<210> 60

<211> 19<211> 19

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 60<400> 60

Ala Ala Lys Val Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Tyr Gln Ser Glu Thr Tyr Ala Ala Lys Val Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Tyr Gln Ser Glu Thr Tyr

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Tyr Trp Glu Tyr Trp

<210> 61<210> 61

<211> 17<211> 17

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 61<400> 61

Ala Ala Val Arg Leu Tyr Phe Ser Ser Ser Arg Asn Gln Tyr Lys Tyr Ala Ala Val Arg Leu Tyr Phe Ser Ser Ser Arg Asn Gln Tyr Lys Tyr

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Glu

<210> 62<210> 62

<211> 15<211> 15

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<400> 62<400> 62

Ala Ser Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp Ala Ser Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 63<210> 63

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR1<223> frame region FR1

<400> 63<400> 63

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser

20 25 20 25

<210> 64<210> 64

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR1<223> frame region FR1

<400> 64<400> 64

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25 20 25

<210> 65<210> 65

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR1<223> frame region FR1

<400> 65<400> 65

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25 20 25

<210> 66<210> 66

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR1<223> frame region FR1

<400> 66<400> 66

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser

20 25 20 25

<210> 67<210> 67

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR1<223> frame region FR1

<400> 67<400> 67

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25 20 25

<210> 68<210> 68

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR1<223> frame region FR1

<400> 68<400> 68

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25 20 25

<210> 69<210> 69

<211> 17<211> 17

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR2<223> frame region FR2

<400> 69<400> 69

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Gly

<210> 70<210> 70

<211> 17<211> 17

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR2<223> frame region FR2

<400> 70<400> 70

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Ala

<210> 71<210> 71

<211> 17<211> 17

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR2<223> frame region FR2

<400> 71<400> 71

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Gly

<210> 72<210> 72

<211> 17<211> 17

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR2<223> frame region FR2

<400> 72<400> 72

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ser Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ser Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Ala

<210> 73<210> 73

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 73<400> 73

Ala Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 74<210> 74

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 74<400> 74

Ala Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Ser Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 75<210> 75

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 75<400> 75

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 76<210> 76

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 76<400> 76

Ala Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Val Asp Asn Ala Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Val Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 77<210> 77

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 77<400> 77

Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 78<210> 78

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 78<400> 78

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 79<210> 79

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 79<400> 79

Ser Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Gln Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Gln Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Met Tyr Ser Cys Thr Ala Met Tyr Ser Cys

35 35

<210> 80<210> 80

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 80<400> 80

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 81<210> 81

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 81<400> 81

Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 82<210> 82

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 82<400> 82

Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 83<210> 83

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 83<400> 83

Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Gln Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Gln Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Met Tyr Ser Cys Thr Ala Met Tyr Ser Cys

35 35

<210> 84<210> 84

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 84<400> 84

Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Ala Asp Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Ala Asp

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 85<210> 85

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 85<400> 85

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 86<210> 86

<211> 38<211> 38

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR3<223> frame region FR3

<400> 86<400> 86

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30 20 25 30

Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Met Tyr Tyr Cys

35 35

<210> 87<210> 87

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> каркасная область FR4<223> frame area FR4

<400> 87<400> 87

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10 1 5 10

<---<---

Claims

1. IL-5-связывающая молекула, способная специфично связываться с IL-5 и содержащая одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, содержащий определяющие комплементарность области CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности, приведенные в любом из (1)-(13):1. An IL-5-binding molecule capable of specifically binding to IL-5 and containing a single immunoglobulin variable domain containing complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3 having the amino acid sequences shown in any of (1)-(13):

(1) SEQ ID NO: 43, 56 и 58;(1) SEQ ID NO: 43, 56 and 58;

(2) SEQ ID NO: 49, 51 и 60;(2) SEQ ID NO: 49, 51 and 60;

(3) SEQ ID NO: 47, 56 и 57;(3) SEQ ID NO: 47, 56 and 57;

(4) SEQ ID NO: 45, 54 и 57;(4) SEQ ID NO: 45, 54 and 57;

(5) SEQ ID NO: 46, 50 и 61;(5) SEQ ID NO: 46, 50 and 61;

(6) SEQ ID NO: 47, 56 и 62;(6) SEQ ID NO: 47, 56 and 62;

(7) SEQ ID NO: 48, 56 и 57;(7) SEQ ID NO: 48, 56 and 57;

(8) SEQ ID NO: 45, 53 и 57;(8) SEQ ID NO: 45, 53 and 57;

(9) SEQ ID NO: 44, 55 и 57;(9) SEQ ID NO: 44, 55 and 57;

(10) SEQ ID NO: 43, 56 и 59;(10) SEQ ID NO: 43, 56 and 59;

(11) SEQ ID NO: 43, 52 и 59;(11) SEQ ID NO: 43, 52 and 59;

(12) SEQ ID NO: 47, 56 и 59; а также(12) SEQ ID NO: 47, 56 and 59; and

(13) SEQ ID NO: 47, 52 и 59.(13) SEQ ID NO: 47, 52 and 59.

2. IL-5-связывающая молекула по п. 1, где одиночный вариабельный домен иммуноглобулина дополнительно содержит каркасную область, содержащую FR1, FR2, FR3 и FR4, имеющие аминокислотные последовательности, приведенные в любом из (14)-(28):2. The IL-5 binding molecule according to claim 1, wherein the single immunoglobulin variable domain further comprises a framework region comprising FR1, FR2, FR3 and FR4 having the amino acid sequences given in any of (14)-(28):

(14) SEQ ID NO: 65, 72 и 85;(14) SEQ ID NO: 65, 72 and 85;

(15) SEQ ID NO: 65, 72 и 82;(15) SEQ ID NO: 65, 72 and 82;

(16) SEQ ID NO: 64, 71 и 86;(16) SEQ ID NO: 64, 71 and 86;

(17) SEQ ID NO: 65, 72 и 73;(17) SEQ ID NO: 65, 72 and 73;

(18) SEQ ID NO: 65, 72 и 84;(18) SEQ ID NO: 65, 72 and 84;

(19) SEQ ID NO: 66, 69 и 83;(19) SEQ ID NO: 66, 69 and 83;

(20) SEQ ID NO: 68, 72 и 76;(20) SEQ ID NO: 68, 72 and 76;

(21) SEQ ID NO: 66, 69 и 79;(21) SEQ ID NO: 66, 69 and 79;

(22) SEQ ID NO: 63, 72 и 85;(22) SEQ ID NO: 63, 72 and 85;

(23) SEQ ID NO: 67, 70 и 80;(23) SEQ ID NO: 67, 70 and 80;

(24) SEQ ID NO: 65, 72 и 78;(24) SEQ ID NO: 65, 72 and 78;

(25) SEQ ID NO: 65, 72 и 77;(25) SEQ ID NO: 65, 72 and 77;

(26) SEQ ID NO: 67, 70 и 81;(26) SEQ ID NO: 67, 70 and 81;

(27) SEQ ID NO: 65, 72 и 74; а также(27) SEQ ID NO: 65, 72 and 74; and

(28) SEQ ID NO: 65, 72 и 75.(28) SEQ ID NO: 65, 72 and 75.

3. IL-5-связывающая молекула по п. 2, где одиночный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой VHH.3. The IL-5 binding molecule according to claim 2, wherein the single immunoglobulin variable domain is VHH.

4. IL-5-связывающая молекула по п. 3, где VHH имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 1-12.4. The IL-5 binding molecule of claim 3, wherein VHH has an amino acid sequence selected from any of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-12.

5. IL-5-связывающая молекула по п. 3, где VHH представляет собой гуманизированный VHH.5. The IL-5 binding molecule according to claim 3, wherein VHH is humanized VHH.

6. IL-5-связывающая молекула по п. 5, где гуманизированный VHH имеет последовательность, выбранную из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 13-21.6. The IL-5 binding molecule of claim 5, wherein the humanized VHH has a sequence selected from any of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 13-21.

7. IL-5-связывающая молекула по п. 3, дополнительно содержащая Fc-область иммуноглобулина, соединенную с VHH.7. The IL-5 binding molecule of claim 3, further comprising an immunoglobulin Fc region linked to VHH.

8. IL-5-связывающая молекула по п. 7, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область иммуноглобулина человека.8. The IL-5 binding molecule of claim 7, wherein the immunoglobulin Fc region is a human immunoglobulin Fc region.

9. IL-5-связывающая молекула по п. 8, где Fc-область иммуноглобулина человека представляет собой Fc-область IgG4 человека.9. The IL-5 binding molecule of claim 8, wherein the human immunoglobulin Fc region is a human IgG4 Fc region.

10. Выделенная нуклеиновая кислота для кодирования IL-5-связывающей молекулы по любому из пп. 1-9;10. An isolated nucleic acid for encoding an IL-5 binding molecule according to any one of paragraphs. 1-9;

при этом нуклеиновая кислота имеет последовательность, выбранную из любой из последовательностей, приведенных под SEQ ID NO: 22-42.wherein the nucleic acid has a sequence selected from any of the sequences listed under SEQ ID NO: 22-42.

11. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п. 10.11. Recombinant expression vector containing the isolated nucleic acid according to claim 10.

12. Клетка-хозяин для экспрессии IL-5-связывающей молекулы по любому из пп. 1-9, содержащая рекомбинантный вектор экспрессии по п. 11.12. A host cell for expressing the IL-5 binding molecule according to any one of claims. 1-9, containing the recombinant expression vector according to claim 11.

13. Способ получения IL-5-связывающей молекулы, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 12 в среде для получения IL-5-связывающей молекулы и выделение IL-5-связывающей молекулы из среды.13. A method for producing an IL-5 binding molecule, comprising culturing a host cell according to claim 12 in a medium to obtain an IL-5 binding molecule and isolating the IL-5 binding molecule from the medium.

14. Применение IL-5-связывающей молекулы по любому из пп. 1-5 при получении лекарственных средств, нацеленных на IL-5, для лечения лейкемии. 14. Use of an IL-5 binding molecule according to any one of paragraphs. 1-5 in the production of drugs targeting IL-5 for the treatment of leukemia.