RU2811436C1 - Рекомбинантная плазмида pETZ, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного белка A, и рекомбинантный белок A, используемый для иммунохимических анализов - Google Patents
Рекомбинантная плазмида pETZ, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного белка A, и рекомбинантный белок A, используемый для иммунохимических анализов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811436C1 RU2811436C1 RU2023126422A RU2023126422A RU2811436C1 RU 2811436 C1 RU2811436 C1 RU 2811436C1 RU 2023126422 A RU2023126422 A RU 2023126422A RU 2023126422 A RU2023126422 A RU 2023126422A RU 2811436 C1 RU2811436 C1 RU 2811436C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- recombinant
- recombinant protein
- petz
- plasmid
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 5
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 4
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 claims description 2
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229930183217 Genin Natural products 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102100035971 Molybdopterin molybdenumtransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710119577 Molybdopterin molybdenumtransferase Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220483565 Nuclear cap-binding protein subunit 1_N23T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 102220280196 rs1348090532 Human genes 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена рекомбинантная плазмида pETZ, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, размер 6348 пар нуклеотидов и содержащая в своем составе элементы в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг.2. Рекомбинантная плазмида pETZ обеспечивает синтез и секрецию рекомбинантного белка А в периплазматическое пространство клеток E. coli в растворимой форме. Рекомбинантный белок А имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 и молекулярную массу 35,8 кДа. Рекомбинантный белок А может быть использован для иммунохимических анализов. Изобретения обеспечивают синтез и секрецию белка А в клетках E. coli до 100 мг/л культуральной среды и упрощение технологии очистки указанного белка А. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 2 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к генетической конструкции (рекомбинантной плазмиде) pETZ, обеспечивающей синтез и секрецию инженерного рекомбинантного белка А в периплазматическое пространство клеток E. coli в растворимой форме, а также к рекомбинантному белку, синтез которого этой плазмидой обеспечивается и может быть использовано в биотехнологии и генетической инженерии.
Белок А - это многодоменный полипептид, одним из свойств которого, как природного, так и модифицированного, является способность связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов, в первую очередь класса G (IgG). Благодаря этому свойству белок А находит широкое применение в биологических и биохимических исследованиях, таких как аффинная хроматография, блоттинг и иммуноферментный анализ.
Уровень техники
Природный белок А был обнаружен на клеточной стенке Staphylococcus aureus. Этот белок выполняет функцию связывания антител хозяина в неправильной ориентации, тем самым нарушая опсонизацию и фагоцитоз, что повышает вирулентность и выживаемость бактерии [2]. Белок А представляет собой многодомный полипептид клеточной поверхности с двумя функциональными участками. С-концевой участок выполняет функцию прикрепления белка к пептидогликану клеточной стенки бактерии и содержит 15-22 гидрофобных аминокислот, за которым следует хвост из 5-12 в основном заряженных остатков [5]. N-концевая часть состоит из 5 доменов (E-D-A-B-C), каждый из которых схож наличием пучка из трех альфа-спиралей и содержит примерно 58 аминокислотных остатков. Все пять доменов обладают одновалентной связывающей активностью по отношению к Fc-фрагментам иммуноглобулинов, особенно класса G. [1].
Природный белок А имеет некоторые недостатки, которые затрудняют его получение и использование. Во-первых - это наличие С-концевого участка, отвечающего за прикрепление к клеточной стенке бактерии, что значительно усложняет процесс выделения и очистки белка А из биомассы. Во-вторых - это наличие 5 отличающихся друг от друга функциональных доменов (идентичность относительно домена А от 74 до 91%), за счет чего связывающая активность доменов различна, особенно домена Е, который проявляет наименьшее сродство с иммуноглобулинами [3].
Логичным устранением первого недостатка является удаление С-концевой последовательности. Вторая проблема решается использованием одного, наиболее оптимального домена для построения белка. В качестве такого домена был использован инженерный аналог домена В - домен Z, полученный путем введения мутации для замены остатка Gly в положении 29 на Ala и остатка Ala в положении 1 на Val. Замена Ala 1 на Val предназначена для облегчения генно-инженерной подготовки гена, кодирующего несколько связанных доменов, и не влияет на функции домена. Благодаря мутациям модифицированный Z домен более устойчив к щелочам, чем домен B, и его можно использовать повторно с помощью щелочной промывки. Также остаток Asn заменен другой аминокислотой, чтобы придать дальнейшую более высокую щелочную стойкость. Еще одной особенностью домена Z является его пониженная связывающая способность к Fab-области иммуноглобулинов. Эта особенность выгодно облегчает диссоциацию антитела, связывающегося с доменом Z, с помощью кислоты [4].
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК рММ 9, кодирующая синтез белка A STAPHYLOCOCCUS AUREUS, способ ее конструирования и штамм бактерий BACILLUS SUBTILIS - продуцент белка A STAPHYLOCOCCUS AUREUS (патент SU №1524485, МПК С12N15/31, опубл. 1991 г.). Целью изобретения является повышение уровня синтеза белка A St. aureus. Цель достигается за счет плазмиды pMM9, несущей ген белка A и стабильно поддерживающейся в различных грам-положительных микроорганизмах, способа получения этой плазмиды, включающего в качестве промежуточного этапа клонирование гена белка A в клетках E. coli, а также штамм B. subtilis IPM-12, секретирующего белок A во внеклеточную среду в количестве не менее, чем 100 мг/л культуральной среды. Однако белок, описанный в патенте SU1524485, идентичен природному, стафилококковому, из-за чего он существенно уступает рекомбинантному белку А в устойчивости к щелочам, поскольку не имеет аминокислотных замен, обуславливающих данную устойчивость. При использовании в хроматографии белка А проявляется его ограниченная стабильность в сильно щелочных условиях, которые обычно используются для процедур очистки хроматографических колонок на месте в биотехнологической промышленности. Наиболее часто для санации сорбентов используют щелочные растворы, в особенности, раствор NaOH с концентрацией от 0,1 до 1 М, в зависимости от степени и характера загрязнения. Эта процедура подразумевает воздействие на матрицу растворов со значениями рН выше 13. Для многих матриц, содержащих белковые лиганды, это приводит к снижению емкости из-за нестабильности лиганда в условиях высоких рН.
Известно изобретение, раскрывающее получение и применение рекомбинантного слитого белка и относится к технической области биоинженерии (патент Китая № CN 103184229, МПК С12N 15/62, опубл. 03.07.2013 г.). Способ включает стадии, на которых гены IgG-связывающего домена белка A Staphylococcus aureus и белка G-стрептококка соединяются последовательно и вставляются в носитель Escherichia coli типа термоиндукции pBV 220, так что конструируются носитель рекомбинантной экспрессии Escherichia coli, содержащий гены, и преобразованный рекомбинационный штамм Escherichia coli DH5alpha. Рекомбинантный белок A/G получают с использованием штамма. Растворимый рекомбинантный белок A/G, продуцируемый штаммом, превышает 40% от общего количества бактериального растворимого белка. Чистота рекомбинантного белка A/G может быть выше 95% за счет хелатирующей хроматографической очистки ионов никеля и анионообменной хроматографии. Белок обладает такими преимуществами, как высокое количество экспрессии, низкая стоимость, простота очистки и тому подобное. Кроме того, совместимая добавка, полученная рекомбинантным белком в качестве генина, обладает характеристиками комбинации белка А, белка G и IgG, может превосходно сочетаться с IgG большего количества видов млекопитающих и может широко использоваться для очистки IgG различных видов млекопитающих.
Однако и такой белок A/G существенно уступает рекомбинантному белку А в устойчивости к щелочам, поскольку не имеет аминокислотных замен, обуславливающих данную устойчивость. При использовании в хроматографии белка А проявляется его ограниченная стабильность в сильно щелочных условиях, которые обычно используются для процедур очистки хроматографических колонок на месте в биотехнологической промышленности.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является рекомбинантный белок А-mer и его применение (патент Китая № CN 105481954, МПК С12N 15/31, опубл. 13.04.2016 г.). Рекомбинантный белок A-mer представляет собой мультимер двух или более Z-фрагментов белка S. aureus A, и, по меньшей мере, один из каждого Z-фрагмента представляет собой Z-фрагмент мутантов со следующими аминокислотными мутациями: Asn3Asp, Asn6Leu и Asn23Thr. Изобретение включает полинуклеотид, кодирующий белок А-mer, плазмидный вектор pET30a-4Z, содержащий указанный полинуклеотид, и клетку-хозяина E. coli BL21 (DE3), в которую интегрирован вектор с полинуклеотидом. Плазмиду pET30a-4Z' трансформировали в E. coli BL21 (DE3) методом CaCl2. Запатентован также способ получения полимера рекомбинантного белка А-mer, включающий стадии: (a) культивирование клетки-хозяина для экспрессии полимера рекомбинантного белка А по.1; (b) выделение или очистка рекомбинантного белка A-mer из культуральной системы. Способ очистки, включает стадии: аффинную хроматографию с использованием аффинной хроматографической среды, содержащий рекомбинантного белка A-mer.
Недостатком прототипа является то, что в его описании не содержится информации о продуктивности штамма E.coli по белку А, полученного с использованием описываемой плазмидной конструкции. Продуктивность штамма является важной характеристикой, определяющей его технологическую и экономическую эффективность. Так же плазмидная конструкция, описываемая в прототипе, позволяет получать целевой белок А, содержащий на С-конце остаток цистеина. Это может осложнить очистку и сохранность препарата белка А, так как свободные остатки цистеина склонны при хранении к окислительному образованию дисульфидных связей. Такая архитектура белка требует использования специальных методов очистки.
Таким образом разработка стабильного штамма-продуцента, обеспечивающего продукцию белка А, сохраняющего характерные для вирусного белка свойства, остается актуальной задачей.
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемого изобретения является разработка получения экспрессионной генетической конструкции - рекомбинантной плазмиды pETZ, обеспечивающей синтез и секрецию рекомбинантного белка А в периплазматическое пространство клеток E. coli в растворимой форме без недостатков, содержащихся в прототипе.
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение высокопродуктивного плазмидного вектора, обеспечивающего синтез и секрецию белка А в клетках E.coli до 100 мг/л культуральной среды и упрощение технологии очистки указанного белка А за счет синтеза плазмидным вектором белка А, содержащего на С-конце остатков шести гистидинов, что позволяет использовать одностадийную металл-хелатную хроматографию.
Указанный технический результат достигается созданием рекомбинантной плазмиды pETZ, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, размер 6348 пар нуклеотидов и содержащей в своем составе в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 2, следующие элементы:
- AmpR promoter - участок связывания РНК-полимеразы (494-598 п. н.);
- участок, обеспечивающий экспрессию β-лактамазы - фактора резистентности к ампициллину (599-1459 п. н.);
- участок начала репликации ori (1630-2218 п. н.);
- lacI - участок, кодирующий белок, связывающийся с ДНК и ингибирующий экспрессию целевого белка до добавления изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) (3648-4730 п. н.);
- lacI promoter - участок связывания РНК-полимеразы (4731-4808 п. н.);
- T7 promoter - участок связывания РНК-полимеразы бактериофага Т7 (5117-5135 п. н.);
- lac operator - участок связывания белка lacI (5136-5160 п. н.);
- RBS - сайт связывания рибосомы (5191-5196);
- z-gene-optim - ген, кодирующий рекомбинантный белок А, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 и координаты с 5205 по 6164 п. н.;
- T7 terminator - терминатор транскрипции (6276-6323 п. н.);
- 6×His-метка, предназначенный для хроматографической очистки белка А, имеющий координаты с 6147 по 6164 п.н.
Указанный технический результат достигается также тем, что получен рекомбинантный белок А, продуцируемый плазмидой pETZ по п. 1, трансформированной в клетки E. coli, и используемый для иммунохимических анализов, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 и молекулярную массу 35,8 кДа.
Конечный продукт - рекомбинантный белок А, состоящий из 4-х Z-доменов (в отличие от природного белка А, состоящего из E-D-A-B-C доменов), также в белке имеется 6×His-метка. Z-домен - это инженерный аналог домена В, полученный путем замены трех аминокислотных остатков.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному белку А и его применениям, и, в частности, раскрывает новый рекомбинантный белок Staphylococcus aureus A, который имеет структуру, определенную в описании, где функция включает, но не ограничивается применением в качестве лиганд-специфического связывающего иммуноглобулина, а рекомбинантный белок А может быть использован в качестве специфического аффинного лиганда и обладает отличной стойкостью к щелочам. Изобретение также относится к способу конструирования мутантного белка.
Рекомбинантный инженерный белок А содержит четыре Z-домена, а также последовательность 6×His, обеспечивающая очистку целевого белка при помощи металл-хелатной хроматографии. Сравнение структур природного и рекомбинантного белков представлены на фигуре 1.
В качестве вектора экспрессии была выбрана плазмида pET21. Карта плазмиды представлена на фиг. 2. Данная плазмида содержит лактозный оперон (lac operon), который, будучи связанным с лактозным репрессором, ингибирует транскрипцию, в данном случае Z-gene-optim. Ингибирование может быть остановлено добавлением изопропил-1-тио-β-D-галактозида (ИПТГ). Таким образом появляется возможность контролировать экспрессию гена. В плазмиде также имеется фактор резистентности к ампициллину (AmpR), продуктом которой является β-лактамаза - фермент, направленный на борьбу с β-лактамазными антибиотиками. Бактерии, обладающие устойчивостью, могут выращиваться на питательных средах с добавлением антибиотиков. Нуклеотидная последовательность гена Z-gene-optim приведена на фигуре 3.
В качестве продуцента был выбран штамм Escherichia coli SHuffle express. При культивировании в лабораторных условиях штамм обеспечивает синтез на уровне 100 мг рекомбинантного белка А на 1 л питательной среды LB.
Осуществление изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приводится сравнение структур природного и рекомбинантного белка А. На фигуре 2 приведена физическая и генетическая карта плазмиды pETZ. На фигуре 3 представлена нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмиды pETZ. На фигуре 4 представлена нуклеотидная последовательность гена (z-gene-optim), кодирующего белок А. На фигуре 5 приведена аминокислотная последовательность рекомбинантного белка А. На фиг. 6 приведен результат белкового электрофореза. Бактерии выращивались на питательной среде LB. 2-5 - 0,1 мМоль ИПТГ; 7-10 - 0,5 мМоль ИПТГ. 1 - до ИПТГ; 2, 7 - биомасса; 3, 8 - культуральная жидкость; 4, 9 - растворимая фракция (периплазма); 5, 10 - тельца включения; 6 - маркер. На фиг. 7 представлен результат белкового электрофореза. Бактерии выращивались на питательной среде ТВ. 2-5 - 0,1 мМоль ИПТГ; 6-9 - 0,5 мМоль ИПТГ. 1 - до ИПТГ; 2, 6 - биомасса; 3, 7 - культуральная жидкость; 4, 8 - растворимая фракция (периплазма); 5, 9 - тельца включения; 10 - маркер. На фиг. 8 приведен результат белкового электрофореза. Концентрация ИПТГ - 1,0 мМоль. 1-4 - бактерии выращивались на питательной среде LB; 6-9 - ТВ. 1, 6 - биомасса; 2, 7 - культуральная жидкость; 3,8 - растворимая фракция (периплазма); 4, 9 - тельца включения; 5 - маркер.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже приведены примеры его осуществления.
Пример 1. Получение рекомбинантного штамма
E. coli.
Для получения штамма-продуцента рекомбинантного белка А была проведена трансформация клеток E. coli стандартным методом с использованием хлористого кальция. Ночную культуру E. coli SHuffle express (50 мкл) доращивали при 37°C и 200 об/мин до оптической плотности 0,6-0,8 в 5 мл питательной среды LB. Данную суспензию охлаждали на льду в течение 15 минут, далее центрифугировали 2 минуты (6000 g., 4°C). После удаления супернатанта осадок суспендировали в 700 мкл охлажденного CaCl2 и оставили на 15 минут во льду. Центрифугировали 2 минуты (6000 g, 4°C), удалили супернатант и суспендировали осадок в 100 мкл CaCl2. Добавили ДНК - 1 мкл (плазмида pETZ), перемешали и оставили во льду на 30 минут. Поместили в термостат на 5 минут при 37°C. Далее добавили 1 мл LB и культивировали 1 час при 37°C в термостате. Посеяли на чашку с нижним агаром и селективным антибиотиком (ампициллин). Культивировали в термостате в течение ночи при 37°C.
Пример 2. Наработка биомассы и выделение рекомбинантного белка А
Ночную культуру трансформированных бактерий выращивали на питательной среде Lysogeny medium broth (LB) при 37°С с добавлением ампициллина. Полученную ночную культуру в количестве 3 мл вносили в 6 колб Эрленмейера, содержащих по 300 мл питательной среды двух видов: Lysogeny medium broth (LB) и Terrific medium broth (TB) и растили при 37°С и 170 об./мин до плотности ОDλ600 = 0,6-0,8 о.е.. Транскрипцию индуцировали добавлением различных концентрации ИПТГ: 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1,0 мМ. Образцы продолжали культивировать при 16°С и 170 об./мин в течение ночи. Биомасса была отделена от культуральной жидкости центрифугированием при 6000 G, 4°С в течении 15 мин.
Для разрушения клеточных стенок был использован метод ультразвукового лизиса, как наиболее простой и эффективный способ. Последующим центрифугированием раствор был разделен на супернатант (растворимая фракция) и осадок, который был растворен в буфере А с мочевиной и вновь центрифугировали. Во втором случае в супернатанте содержались тельца включения. В течении всего этого процесса отбирали аликвоты различных фракций, с которыми был проведен белковый электрофорез на полиакриламидном геле (фиг. 5-7).
На электрофореграмме обнаруживаются две полосы близких к значению 35,8 кДа. Они обе являются рекомбинантным белком А. Небольшое отличие объясняется наличием лидерной последовательности, которая влияет на длину белка в зависимости от того, секретируется он или нет.
С помощью программы анализа электрофореграмм GelAnalyzer 19.1 удалось определить, что концентрация белка при культивировании в питательной среде ТВ примерно в 1,25 раз выше, чем при культивировании в LB. Влияние значения концентрации ИПТГ на наработку белка с помощью данного метода не выявлено, то есть целесообразно использовать наименьшую концентрацию (0,1 мМ).
Результаты данного исследования показали, что до добавления ИПТГ синтез белка практически отсутствует. В культуральную жидкость секреция белков не происходит - весь белок остается в биомассе. Рекомбинантный белок А локализуется в периплазме и тельцах включения. Причем в периплазме сосредоточена основная масса белка А, поэтому, для экономии и упрощения процесса рекомендуется получать белок именно из этой фракции.
Надосадочная жидкость была трижды диализована против фосфатного буфера (K2HPO4 8,1 мM; KH2PO4 1,9 мM; pH 7,5). Диализат с рекомбинантным белком А в фосфатном буфере был профильтрован для предотвращения засорения хроматографа. Также в диализат добавили NaCl до конечной концентрации 500 мМоль. Он был очищен с помощью металл-хелатной хроматографии, основанной на сродстве переходных металлов к His-метке, имеющейся в рекомбинантном белке А.
При культивировании в лабораторных условиях плазмидный вектор и штамм продуцент обеспечивают накопление целевого белка А до 100 мг/л культуральной среды, что обеспечивает превосходное соотношение выход продукта/затраты.
Источники научно-технической и патентной информации
1. Deis L. N., Pemble C.W.T., Qi Y., Hagarman A., Richardson D.C., Richardson J.S., Oas T.G. Multiscale conformational heterogeneity in staphylococcal protein a: possible determinant of functional plasticity // Structure, 2014. - Vol. 22 - P. 1467-1477.
2. Grov A, Myklestad B, Oeding P. Immunochemical studies on antigen preparations from Staphylococcusaureus. Isolation and chemical characterization of antigen A // Acta Pathol Microbiol Scand, 1964. - Vol. 61 - P. 588-596.
3. Moks T., Abrahmsen L., Nilsson B., Hellman U., Sjoquist J., Uhlen M. Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains // Eur J Biochem, 1986. - Vol. 156 - P. 637-643.
4. Nilsson B.A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal. protein A // Protein Eng, 1987. - Vol. 1 - P. 107-113.
5. Schneewind, O., Model P., Fischetti V.A. Sorting of protein A to the staphylococcal cell wall // Cell, 1992. - Vol. 70 - P. 267-281.
6. Патент SU №1524485, МПК С12N15/31, опубл. 1991 г.
7. Патент Китая №CN103184229, опубл. 03.07.2013 г.
8. Патент Китая №CN105481954, опубл. 13.04.2016 г. (прототип).
ПРИЛОЖЕНИЕ
--->
Перечень последовательностей, представленных по стандарту ВОИС ST26
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"
PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">
<ST26SequenceListing productionDate="2023-09-22"
softwareVersion="2.2.0" softwareName="WIPO Sequence"
fileName="Рекомбинантная плазмида pETZ, обеспечивающая синтез
рекомбинантного инженерного белка А.xml"
dtdVersion="V1_3"><ApplicationIdentification><IPOfficeCode>RU</IPOffic
eCode><ApplicationNumberText/><FilingDate>2023-09-22</FilingDate></App
licationIdentification><ApplicantFileReference>RU-pETZ</ApplicantFileR
eference><ApplicantName languageCode="ru">ООО
Алтай-Энзим</ApplicantName><ApplicantNameLatin>OOO
"Altai-Enzim"</ApplicantNameLatin><InventionTitle
languageCode="ru">pETZ</InventionTitle><SequenceTotalQuantity>3</Seque
nceTotalQuantity><SequenceData sequenceIDNumber="1"
(SEQIDNO:1)><INSDSeq><INSDSeq_length>6348</INSDSeq_length><INSDSeq_mol
type>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INS
DSeq_feature-table><INSDFeature><INSDFeature_key>source</INSDFeature_k
ey><INSDFeature_location>1..6348</INSDFeature_location><INSDFeature_qu
als><INSDQualifier><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><I
NSDQualifier_value>other
DNA</INSDQualifier_value></INSDQualifier><INSDQualifier
id="q2"><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifie
r_value>synthetic
construct</INSDQualifier_value></INSDQualifier></INSDFeature_quals></I
NSDFeature></INSDSeq_feature-table><INSDSeq_sequence>tggcgaatgggacgcgc
cctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgc
cctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagct
ctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatt
agggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccac
gttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgat
ttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcga
attttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctat
ttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaa
taatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcat
tttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgc
acgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgt
tttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaag
agcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagca
tcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggcc
aacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatg
taactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgat
gcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaa
caattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggct
ggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccaga
tggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaataga
cagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatac
tttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcat
gaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatct
tcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtgg
tttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagatacc
aaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatac
ctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggact
caagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagctt
ggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaa
gggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccag
ggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtg
atgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttt
tgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcct
ttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgga
agagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactc
tcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtc
atggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccg
cttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacg
cgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatcc
gcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgatacc
gatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgt
gagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgct
tcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataat
ggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgtt
gctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgct
aaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtgg
ggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggct
tgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagc
ggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagt
cataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaag
ggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccg
ctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggttt
gcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgc
ctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatg
gtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcac
caacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcat
cgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagac
gcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctc
cacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagt
taatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgct
tcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatt
tgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagtt
gttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgc
agaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgaca
tcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccatac
cgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcatta
ggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagat
ggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccg
aagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgc
cggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggaga
tatacatatgaaaaagaaaaacatctacagcattcgcaaacttggtgttggtattgcaagcgttaccctg
ggcaccctgctgattagcggtggtgttacaccggcagcaaatgcagcacagcatgatgaagcacagcaga
atgcagttgatgccaaatttgatgtggatgccaagttcgataaagaacagcagaacgccttttatgaaat
tctgcatctgccgaatctgaccgaagaacagcgtaatgcatttattcagagcctgaaagatgatccgagc
cagagcgcaaatctgctggccgaagctaaaaagctgaatgatgcacaggctccgaaacaggcaccgaaag
tggacgcaaaattcgatgtagacgcgaagtttgacaaagagcaacaaaacgcattctacgagattctgca
tttacctaacctgacagaggaacagcgcaacgcgtttatccagtcactgaaagacgacccgtcacagtca
gccaacctgctggcagaggccaaaaagttaaacgatgcccaggcacctaaacaagcccctaaagtagatg
ctaagtttgatgttgacgctaaatttgataaagaacaacagaatgctttctacgagatcttacatctgcc
gaacttaactgaagaacaacgcaatgccttcatccaatctttaaaggatgatccgtcacagagtgcaaat
ttactggcggaggcgaagaaactgaacgacgcgcaagcacctaagcaggctccaaaagtcgatgcgaaat
tcgacgttgatgcaaaattcgacaaagaacagcaaaatgcgttctatgaaatccttcacttacccaacct
tacggaagaacaaagaaacgcgttcatacagagcttaaaagatgacccttctcagtctgcgaatctgctt
gctgaggctaagaaacttaatgatgcccaagcgccaaaacatcatcaccatcaccattaatgaaagcttg
cggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctga
gttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggt
tttttgctgaaaggaggaactatatccggat</INSDSeq_sequence></INSDSeq></Sequence
Data><SequenceData
SequenceIDNumber="2"(SEQIDNO:2><INSDSeq><INSDSeq_length>960</INSDSeq_l
ength><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_division>PAT</INS
DSeq_division><INSDSeq_feature-table><INSDFeature><INSDFeature_key>sou
rce</INSDFeature_key><INSDFeature_location>1..960</INSDFeature_locatio
n><INSDFeature_quals><INSDQualifier><INSDQualifier_name>mol_type</INSD
Qualifier_name><INSDQualifier_value>other
DNA</INSDQualifier_value></INSDQualifier><INSDQualifier
id="q4"><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifie
r_value>synthetic
construct</INSDQualifier_value></INSDQualifier></INSDFeature_quals></I
NSDFeature></INSDSeq_feature-table><INSDSeq_sequence>atgaaaaagaaaaacat
ctacagcattcgcaaacttggtgttggtattgcaagcgttaccctgggcaccctgctgattagcggtggt
gttacaccggcagcaaatgcagcacagcatgatgaagcacagcagaatgcagttgatgccaaatttgatg
tggatgccaagttcgataaagaacagcagaacgccttttatgaaattctgcatctgccgaatctgaccga
agaacagcgtaatgcatttattcagagcctgaaagatgatccgagccagagcgcaaatctgctggccgaa
gctaaaaagctgaatgatgcacaggctccgaaacaggcaccgaaagtggacgcaaaattcgatgtagacg
cgaagtttgacaaagagcaacaaaacgcattctacgagattctgcatttacctaacctgacagaggaaca
gcgcaacgcgtttatccagtcactgaaagacgacccgtcacagtcagccaacctgctggcagaggccaaa
aagttaaacgatgcccaggcacctaaacaagcccctaaagtagatgctaagtttgatgttgacgctaaat
ttgataaagaacaacagaatgctttctacgagatcttacatctgccgaacttaactgaagaacaacgcaa
tgccttcatccaatctttaaaggatgatccgtcacagagtgcaaatttactggcggaggcgaagaaactg
aacgacgcgcaagcacctaagcaggctccaaaagtcgatgcgaaattcgacgttgatgcaaaattcgaca
aagaacagcaaaatgcgttctatgaaatccttcacttacccaaccttacggaagaacaaagaaacgcgtt
catacagagcttaaaagatgacccttctcagtctgcgaatctgcttgctgaggctaagaaacttaatgat
gcccaagcgccaaaacatcatcaccatcaccat</INSDSeq_sequence></INSDSeq></Sequen
ceData><SequenceData
SequenceIDNumber="3"(SEQIDNO:3)><INSDSeq><INSDSeq_length>320</INSDSeq_
length><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_division>PAT</INS
DSeq_division><INSDSeq_feature-table><INSDFeature><INSDFeature_key>sou
rce</INSDFeature_key><INSDFeature_location>1..320</INSDFeature_locatio
n><INSDFeature_quals><INSDQualifier><INSDQualifier_name>mol_type</INSD
Qualifier_name><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value></INS
DQualifier><INSDQualifier
id="q6"><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifie
r_value>synthetic
construct</INSDQualifier_value></INSDQualifier></INSDFeature_quals></I
NSDFeature></INSDSeq_feature-table><INSDSeq_sequence>MKKKNIYSIRKLGVGIA
SVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAVDAKFDVDAKFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLK
DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKQAPKVDAKFDVDAKFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDD
PSQSANLLAEAKKLNDAQAPKQAPKVDAKFDVDAKFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPS
QSANLLAEAKKLNDAQAPKQAPKVDAKFDVDAKFDKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQS
ANLLAEAKKLNDAQAPKHHHHHH</INSDSeq_sequence></INSDSeq></SequenceData></S
T26SequenceListing>
<---
Claims (13)
1. Рекомбинантная плазмида pETZ, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного белка А в периплазматическое пространство клеток E. coli в растворимой форме, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, размер 6348 пар нуклеотидов и содержащая в своем составе в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 2, следующие элементы:
- AmpR promoter - участок связывания РНК-полимеразы (494-598 п. н.);
- участок, обеспечивающий экспрессию β-лактамазы - фактора резистентности к ампициллину (599-1459 п. н.);
- участок начала репликации ori (1630-2218 п. н.);
- lacI - участок, кодирующий белок, связывающийся с ДНК и ингибирующий экспрессию целевого белка до добавления изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) (3648-4730 п. н.);
- lacI promoter - участок связывания РНК-полимеразы (4731-4808 п. н.);
- T7 promoter - участок связывания РНК-полимеразы бактериофага Т7 (5117-5135 п. н.);
- lac operator - участок связывания белка lacI (5136-5160 п. н.);
- RBS - сайт связывания рибосомы (5191-5196);
- z-gene-optim - ген, кодирующий рекомбинантный белок А, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 и координаты с 5205 по 6164 п. н.;
- T7 terminator - терминатор транскрипции (6276-6323 п. н.);
- 6×His-метка, предназначенная для хроматографической очистки белка А и имеющая координаты с 6147 по 6164 п.н.
2. Рекомбинантный белок А, продуцируемый плазмидой pETZ по п. 1, трансформированной в клетки E. coli, и используемый для иммунохимических анализов, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 и молекулярную массу 35,8 кДа.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2811436C1 true RU2811436C1 (ru) | 2024-01-11 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1524485A1 (ru) * | 1988-02-12 | 1995-11-20 | Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | Рекомбинантная плазмидная днк рмм 9, кодирующая синтез белка a staphylococcus aureus, способ ее конструирования и штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент белка a staphylococcus aureus |
| CN105481954A (zh) * | 2014-09-16 | 2016-04-13 | 浙江健能隆生物医药有限公司 | 一种重组蛋白a及其应用 |
| US9657055B2 (en) * | 2011-11-30 | 2017-05-23 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Affinity chromatography matrix |
| WO2019039602A1 (ja) * | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Jsr株式会社 | タンパク質、及び当該タンパク質を含む担体を用いる抗体又はその断片の単離方法 |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1524485A1 (ru) * | 1988-02-12 | 1995-11-20 | Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | Рекомбинантная плазмидная днк рмм 9, кодирующая синтез белка a staphylococcus aureus, способ ее конструирования и штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент белка a staphylococcus aureus |
| US9657055B2 (en) * | 2011-11-30 | 2017-05-23 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Affinity chromatography matrix |
| CN105481954A (zh) * | 2014-09-16 | 2016-04-13 | 浙江健能隆生物医药有限公司 | 一种重组蛋白a及其应用 |
| WO2019039602A1 (ja) * | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Jsr株式会社 | タンパク質、及び当該タンパク質を含む担体を用いる抗体又はその断片の単離方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| формула, Seq ID No.4. БД GenBank: MZ496307.1. Expression vector pET22b-SHP2-N-laterosporulin, complete sequence. 20.07.2021. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6184463B2 (ja) | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド | |
| US20210206815A1 (en) | Alkaline stable fc-binding proteins for affinity chromatography | |
| JP5933526B2 (ja) | 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド | |
| CA2991812C (en) | Immunoglobulin-binding proteins and their use in affinity purification | |
| JP4373461B2 (ja) | 細菌レセプター構造体 | |
| JP5522723B2 (ja) | 新規ポリペプチド，アフィニティークロマトグラフィー用材，及びイムノグロブリンの分離及び／又は精製方法 | |
| JPS60500480A (ja) | 蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法 | |
| JP2006517415A5 (ru) | ||
| JP6805831B2 (ja) | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質、およびそれを用いたアフィニティ分離剤、液体クロマトグラフィー用カラム | |
| EP3521304A1 (en) | Fc binding proteins with cysteine in the c-terminal helical region | |
| CN113512099B (zh) | 一种葡萄球菌蛋白a、纯化制备方法及其应用 | |
| JP2022519808A (ja) | アフィニティー精製用免疫グロブリン結合タンパク質 | |
| Ward et al. | Prokaryote multidrug efflux proteins of the major facilitator superfamily: amplified expression, purification and characterisation | |
| RU2811436C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pETZ, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного белка A, и рекомбинантный белок A, используемый для иммунохимических анализов | |
| EP1981978B1 (en) | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins | |
| CN112979770A (zh) | 一种蛋白a突变体、融合蛋白和应用 | |
| Mouratou et al. | Application of Affitins for Affinity Purification of Proteins | |
| JPWO2017022759A1 (ja) | 免疫グロブリン結合性改変型タンパク質 | |
| JPH0242990A (ja) | 組換え融合タンパク質および組換えベクター | |
| KR20170006828A (ko) | 융합 단백질 및 이를 이용한 표적항원 검출방법 | |
| JP2006320220A (ja) | プロテインａ融合ポリペプチドの製造に利用するｄｎａ配列、組換え発現ベクター、形質転換体、およびその融合ポリペプチドの製造方法 |