RU2811309C2

RU2811309C2 - Adrenomedullin (adm) for diagnostics and/or prediction of dementia and antiadrenomedullin-binding agent for use in therapy or prevention of dementia

Info

Publication number: RU2811309C2
Application number: RU2020129154A
Authority: RU
Inventors: Олле МЕЛАНДЕР
Original assignee: Сфинготек Гмбх
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2019-02-07
Publication date: 2024-01-11

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the methods of determining the risk of developing dementia in a subject who does not suffer from dementia and to the use of antibodies to adrenomedullin (ADM) for the prevention and treatment of dementia. The following is determined: the level of mature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4 in a subject's body fluid sample or a marker ratio, which may be a mature ADM-NH2 level ratio according to SEQ ID No. 4 to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof, which is immature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4. The mature ADM-NH2 level or marker ratio is compared with a threshold level. The subject is at increased risk of developing dementia if the mature ADM-NH2 level of SEQ ID No. 4 or the mature ADM-NH2/pro-adrenomedullin marker ratio is below the threshold level/ratio.

EFFECT: group of inventions ensures the determination of the risk of developing dementia.

13 cl, 8 dwg, 5 tbl, 7 ex

Description

Объектом настоящего изобретения является способ:The object of the present invention is a method:

а) диагностики деменции, или a) diagnosis of dementia, or

b) определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией, илиb) determining the risk of developing dementia in a non-demented subject, or

c) мониторинга терапии или мониторинга или управления вмешательством у субъекта, страдающего деменцией, илиc) monitoring therapy or monitoring or managing an intervention in a subject suffering from dementia, or

d) мониторинга терапии или мониторинга или управления профилактическим вмешательством у субъекта с риском развития деменции,d) monitoring therapy or monitoring or managing a preventive intervention in a subject at risk of developing dementia,

в котором в образце физиологической жидкости субъекта определяют уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, и сравнивают указанный уровень зрелого ADM-NH₂ с пороговым уровнем,wherein the level of mature ADM-NH ₂ is determined in a sample of the subject's physiological fluid according to SEQ ID No. 4, and compare the indicated level of mature ADM-NH ₂ with the threshold level,

причемand

а) у указанного субъекта диагностируют деменцию, если уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 ниже указанного порогового уровня, или причемa) the subject is diagnosed with dementia if the level of mature ADM-NH _{is 2} according to SEQ ID No. 4 below the specified threshold level, or where

b) указанный субъект имеет повышенный риск развития деменции, если указанный уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 ниже указанного порогового уровня, или причемb) the specified subject has an increased risk of developing dementia if the specified level of mature ADM-NH _{is 2} according to SEQ ID No. 4 below the specified threshold level, or where

c) статус субъекта, страдающего деменцией или имеющего риск развития деменции, улучшается при терапии или вмешательстве, если указанный уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 увеличивается во время курса терапии или вмешательства, и/или при этом вмешательство может быть продолжено, если указанный уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 увеличивается выше указанного порогового уровня.c) the status of the subject suffering from dementia or at risk of developing dementia improves with therapy or intervention if the specified level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 increases during the course of therapy or intervention, and/or the intervention may be continued if the specified level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 increases above the specified threshold level.

Другим объектом настоящего изобретения является способ:Another object of the present invention is a method:

d) мониторинга профилактической терапии или мониторинга или управления профилактическим вмешательством у субъекта с риском развития деменции,d) monitoring preventive therapy or monitoring or managing a preventive intervention in a subject at risk of developing dementia,

в котором определяют отношение маркеров, которое может представлять собой отношение уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента (который является незрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенному в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и сравнивают указанное отношение маркеров с пороговым соотношением,wherein a marker ratio is determined, which may be a mature ADM-NH ₂ level ratio according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of the specified subject, to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is immature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) determined in the physiological fluid sample of the specified subject, and compare the specified ratio of markers with the threshold ratio ,

причемand

а) у указанного субъекта диагностируют деменцию, если отношение маркеров ADM-NH₂/про-адреномедуллин или его фрагмент ниже указанного порогового значения, или причемa) the specified subject is diagnosed with dementia if the ratio of markers ADM-NH ₂ /pro-adrenomedullin or a fragment thereof is below a specified threshold value, or wherein

b) указанный субъект имеет повышенный риск развития деменции, если отношение маркеров про-адреномедуллина или его фрагмента ниже указанного порогового значения, или причемb) the specified subject has an increased risk of developing dementia if the ratio of markers of pro-adrenomedullin or its fragment is below a specified threshold value, or wherein

c) статус субъекта, страдающего деменцией или имеющего риск развития деменции, улучшается при терапии или вмешательстве, если указанное отношение маркеров увеличивается во время курса терапии или вмешательства, и причем вмешательство может продолжаться, если указанный уровень отношения маркеров увеличивается выше указанного порогового отношения.c) the status of the subject suffering from dementia or at risk of developing dementia improves with the therapy or intervention if the specified marker ratio increases during the course of therapy or intervention, and wherein the intervention can continue if the specified level of the marker ratio increases above the specified threshold ratio.

Альтернативно, уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 определяют в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и уровень про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, объединяют в математическом алгоритме, причем результат указанного алгоритма используют для диагностики деменции или определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией, или мониторинга терапии или мониторинга или управления вмешательством у субъекта, страдающего деменцией, или мониторинга профилактической терапии или мониторинга или управления профилактическим вмешательством у субъекта с риском развития деменции.Alternatively, the level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 is determined in a sample of the physiological fluid of the specified subject, and the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) determined in the sample of the physiological fluid of the specified subject is combined in a mathematical algorithm, the result of the specified The algorithm is used to diagnose dementia or determine the risk of developing dementia in a subject not suffering from dementia, or monitoring therapy or monitoring or managing an intervention in a subject suffering from dementia, or monitoring preventive therapy or monitoring or managing a preventive intervention in a subject at risk of developing dementia.

Деменция является клиническим синдромом, характеризующимся совокупностью симптомов и признаков, проявляющихся в нарушениях памяти, нарушениях речи, психологических и психиатрических изменениях и нарушениях повседневной активности. Различными причинами (иногда называемыми подтипами) синдрома деменции являются: болезнь Альцгеймера (примерно 50% случаев), сосудистая деменция (примерно 25%), болезнь Альцгеймера, смешанная с сосудистой деменцией (включенная в вышеуказанные выше, 25%), деменция с тельцами Леви (15%) и другие (примерно 5% в совокупности), включая лобно-височную деменцию, очаговые деменции (такие как прогрессирующая афазия), субкортикальные деменции (такие как деменция при болезни Паркинсона) и вторичные причины синдрома деменции (такие как внутричерепные поражения).Dementia is a clinical syndrome characterized by a constellation of symptoms and signs manifested by memory impairment, language impairment, psychological and psychiatric changes, and impairment of daily activities. The various causes (sometimes called subtypes) of dementia syndrome are: Alzheimer's disease (approximately 50% of cases), vascular dementia (approximately 25%), Alzheimer's disease mixed with vascular dementia (included in the above, 25%), dementia with Lewy bodies ( 15%) and others (approximately 5% combined), including frontotemporal dementia, focal dementias (such as progressive aphasia), subcortical dementias (such as Parkinson's disease dementia), and secondary causes of dementia syndrome (such as intracranial lesions).

Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенной формой деменции. Частота встречаемости AD возрастает по мере старения мировой популяции, и все больше людей вступают в период основного риска этого возрастного расстройства. К 2050 году число жертв в США, увеличится с 5,3 миллиона граждан, страдающих деменцией в настоящее время, до 13 миллионов и более, а во всем мире общее число заболевших людей возрастет до ошеломляющих 100 миллионов (Alzheimer’s Association. 2015 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement 2015; 11:332-84). Ключевые молекулярные механизмы и гистопатологические признаки в мозге, пораженном AD, включают динамический каскад биохимических событий, включая патологическое амилоидогенный путь расщепления белка-предшественника амилоида (APP), образование различных видов бета-амилоида, включая димеры, тримеры, олигомеры бета-амилоидного пептида (Aβ_1-42) и последующую агрегацию и отложение амилоидов в бляшках, аномальное гиперфосфорилирование и агрегацию тау-белка, прогрессирующую внутриклеточную нейрофибриллярную дегенерациб, изменения во врожденной иммунной системе и воспаление.Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia. The incidence of AD is increasing as the global population ages and more people enter the prime risk period for this age-related disorder. By 2050, the death toll in the United States will increase from the 5.3 million citizens currently living with dementia to 13 million or more, and worldwide the total number of people affected will rise to a staggering 100 million (Alzheimer's Association. 2015 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement 2015;11:332-84). Key molecular mechanisms and histopathological features in the AD brain include a dynamic cascade of biochemical events, including the pathological amyloidogenic amyloid precursor protein (APP) cleavage pathway, the formation of various beta-amyloid species, including dimers, trimers, oligomers of amyloid beta peptide (Aβ _1-42 ) and subsequent aggregation and deposition of amyloid in plaques, abnormal hyperphosphorylation and aggregation of tau protein, progressive intracellular neurofibrillary degeneration, changes in the innate immune system, and inflammation.

Примерно у 5% пациентов симптомы развиваются до 65 лет, и их относят к пациентам с «болезнью Альцгеймера с ранним началом» (EOAD). Большинство из этих пациентов имеют спорадическую форму заболевания, но 10-15% страдают генетической формой, которая обычно наследуется по аутосомно-доминантному типу. Предполагается, что в развитии EOAD участвует три гена: презенилин 1 и 2 и ген белка-предшественника амилоида (APP). Также изучают другие гены-кандидаты. Генетические формы обычно начинают проявляться в возрасте 30 или 40 лет и имеют агрессивное течение, в то время как спорадические EOAD начинают развиваться после 50 лет и, как правило, имеют временный профиль, аналогичный «болезни Альцгеймера с поздним началом» (LOAD).About 5% of patients develop symptoms before age 65 and are classified as having “early-onset Alzheimer's disease” (EOAD). Most of these patients have a sporadic form of the disease, but 10-15% have a genetic form, which is usually inherited in an autosomal dominant manner. Three genes are thought to be involved in the development of EOAD: presenilin 1 and 2 and the amyloid precursor protein (APP) gene. Other candidate genes are also being studied. Genetic forms typically begin to appear at age 30 or 40 and have an aggressive course, while sporadic EOAD begins to develop after age 50 and typically has a temporal profile similar to “late-onset Alzheimer's disease” (LOAD).

Тестирование психического статуса позволяет оценить память, способность решать простые проблемы и другие мыслительные навыки. Такие тесты дают общее представление о том, осведомлен ли человек о симптомах, знает ли дату, время, место своего нахождения, может ли запомнить краткий список слов, следовать инструкциям и делать простые вычисления. Краткая шкала оценки психического состояния (MMSE) и тест Mini-Cog являются двумя наиболее часто используемыми тестами. Тест MMSE или тест Фольштейна (Folstein) представляет собой 30-бальную анкету, которая широко используется в клинических и исследовательских учреждениях для измерения когнитивных нарушений (Pangman, et al. 2000. Applied Nursing Research 13 (4):209-213; Folstein et al. 1975. Journal of Psychiatric Research. 12(3):189-98). В процессе MMSE медицинский работник задает пациенту несколько вопросов, предназначенных для проверки ряда повседневной умственной активности. Максимальная оценка MMSE - 30 баллов. Оценка от 20 до 24 баллов предполагает наличие легкой формы деменции, от 13 до 20 - умеренную форму деменции, а менее 12 - тяжелую форму деменции. В среднем, оценка MMSE у человека с болезнью Альцгеймера снижается примерно на два-четыре балла в год. Преимущества MMSE включают отсутствие необходимости в специальном оборудовании или обучении для применения, а также достоверность и надежность диагностики и продольной оценки болезни Альцгеймера. Во время теста mini-cog человека просят выполнить две задачи, запомнить и спустя несколько минут повторить названия трех общих объектов и нарисовать циферблат часов, показывающий все 12 цифр в нужных местах и время, определенное экзаменатором. Результаты этого краткого теста могут помочь врачу определить, нужна ли дальнейшая оценка. Также используются другие тесты, такие как сокращенный тест умственных способностей Ходкинсона (Hodkinson 1972. Age and ageing. 1(4):233-8), или компьютеризированные тесты по определению когнитивных способностей врачом общей практики, такие как CoP и система для получения профиля психических характеристик (Mental Attributes Profiling System), а также более длительные формальные тесты для более глубокого анализа определенных нарушений.Mental status testing evaluates memory, simple problem solving, and other thinking skills. Such tests give a general idea of whether a person is aware of symptoms, knows the date, time, location, can remember a short list of words, follow instructions and do simple calculations. The Mini-Mental State Examination (MMSE) and the Mini-Cog test are the two most commonly used tests. The MMSE or Folstein test is a 30-item questionnaire that is widely used in clinical and research settings to measure cognitive impairment (Pangman, et al. 2000. Applied Nursing Research 13(4):209-213; Folstein et al. 1975 Journal of Psychiatric Research 12(3):189-98). During the MMSE, the health care provider asks the patient several questions designed to test a range of daily mental activities. The maximum MMSE score is 30 points. A score of 20 to 24 indicates mild dementia, 13 to 20 indicates moderate dementia, and less than 12 indicates severe dementia. On average, a person with Alzheimer's disease's MMSE score decreases by about two to four points per year. Advantages of the MMSE include the lack of need for special equipment or training to administer and the validity and reliability of the diagnosis and longitudinal assessment of Alzheimer's disease. During the mini-cog test, a person is asked to complete two tasks, remember and after a few minutes repeat the names of three common objects, and draw a clock face showing all 12 digits in the correct places and the time determined by the examiner. The results of this short test can help the doctor determine whether further evaluation is needed. Other tests are also used, such as the Hodkinson Abbreviated Mental Ability Test (Hodkinson 1972. Age and aging. 1(4):233-8), or computerized tests of cognitive ability by a general practitioner, such as the CoP and the Mental Profiling System. characteristics (Mental Attributes Profiling System), as well as longer formal tests for a more in-depth analysis of certain disorders.

Легкое когнитивное нарушение (MCI) является гетерогенным клиническим состоянием, в основе которого лежит несколько причин. Тем не менее, значительная доля MCI представляет собой переходное состояние между здоровым старением и очень легкой формой AD (DeCarli 2003. Lancet Neurol. 2:15-21). Соответственно, исследования подтверждают, что у пациентов с MCI наблюдается тенденция к прогрессированию клинически вероятной AD со скоростью примерно 10-15% в год (Markesbery 2010. J Alzheimers Dis. 19:221-228).Mild cognitive impairment (MCI) is a heterogeneous clinical condition with multiple underlying causes. However, a significant proportion of MCI represents a transitional state between healthy aging and very mild AD (DeCarli 2003. Lancet Neurol. 2:15–21). Accordingly, research confirms that patients with MCI tend to progress to clinically probable AD at a rate of approximately 10-15% per year (Markesbery 2010. J Alzheimers Dis. 19:221-228).

Болезнь Альцгеймера обычно диагностируют на основе истории болезни человека, истории болезни родственников и наблюдений поведенческих реакций. Наличие характерных неврологических и нейропсихологических особенностей и отсутствие альтернативных условий является благоприятным. Для исключения наличия других патологий головного мозга или подтипов деменции может использоваться расширенная визуализация с помощью компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ), а также однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) или позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Более того, это позволяет предсказать переход от продромальных стадий (легкое когнитивное нарушение) к болезни Альцгеймера. Оценка интеллектуального функционирования, включая оценку памяти, позволяет дополнительно охарактеризовать состояние заболевания. Медицинские организации создали диагностические критерии, облегчающие практикующим врачам стандартизовать диагностический процесс. Диагноз может быть подтвержден с очень высокой точностью посмертно, когда доступен материал мозга, который может быть подвергнут гистологическому анализу.Alzheimer's disease is usually diagnosed based on a person's medical history, relatives' medical history, and observations of behavioral responses. The presence of characteristic neurological and neuropsychological features and the absence of alternative conditions is favorable. Advanced imaging with computed tomography (CT) or magnetic resonance imaging (MRI), single photon emission computed tomography (SPECT), or positron emission tomography (PET) may be used to rule out the presence of other brain pathologies or subtypes of dementia. Moreover, it predicts the transition from prodromal stages (mild cognitive impairment) to Alzheimer's disease. Assessment of intellectual functioning, including memory assessment, allows further characterization of the disease state. Medical organizations have created diagnostic criteria to make it easier for practitioners to standardize the diagnostic process. The diagnosis can be confirmed with very high accuracy postmortem when brain material is available that can be subjected to histological analysis.

На сегодняшний день существуют только симптоматические методы лечения этого заболевания, основанные на попытке восстановить баланс нейромедиаторов. В настоящее время доступны три ингибитора холинэстеразы, одобренные для лечения AD от легкой до умеренной степени. Другим терапевтическим вариантом, доступным для лечения умеренной и тяжелой AD, является мемантин, неконкурентный антагонист N-метил-D-аспартатного рецептора. Методы лечения, способные остановить или по меньшей мере эффективно изменить течение болезни Альцгеймера, именуемые «модифицирующими болезнь» лекарственными средствами, все еще находятся на стадии расширенных исследований.To date, there are only symptomatic treatments for this disease, based on an attempt to restore the balance of neurotransmitters. There are currently three cholinesterase inhibitors available that are approved for the treatment of mild to moderate AD. Another therapeutic option available for the treatment of moderate to severe AD is memantine, a noncompetitive N-methyl-D-aspartate receptor antagonist. Treatments that can stop or at least effectively reverse the course of Alzheimer's disease, called "disease-modifying" drugs, are still in advanced research.

Имеется высокая потребность в новых способах лечения больных пациентов, а также профилактики, отсрочки, замедления прогрессирования или облегчения симптомов AD. Подсчитано, что общая частота заболевания может быть снижена почти на 50% при возможности отсрочки начала заболевания на 5 лет. Симптоматическое лечение основано на лекарственных средствах, направленных на улучшение когнитивных функций или контроля психоневрологических симптомов, и обычно они действуют через нейротрансмиттерные механизмы; модифицирующая заболевание терапия или способы лечения (DMT) основаны на агентах, которые предотвращают, задерживают или замедляют прогрессирование заболевания и нацелены на основные патофизиологические механизмы AD. В настоящее время в конвейере разработки лекарственных средств для лечения AD находятся более 100 препаратов (Cummings et al. 2017. Alzheimer’s & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions 3:367-384).There is a high need for new ways to treat sick patients, as well as prevent, delay, slow the progression or alleviate symptoms of AD. It is estimated that the overall incidence of the disease can be reduced by almost 50% by delaying the onset of the disease by 5 years. Symptomatic treatment is based on drugs aimed at improving cognitive function or controlling neuropsychiatric symptoms, and they usually act through neurotransmitter mechanisms; Disease-modifying therapies or treatments (DMTs) are based on agents that prevent, delay, or slow disease progression and target the underlying pathophysiological mechanisms of AD. There are currently more than 100 drugs in the drug development pipeline for the treatment of AD (Cummings et al. 2017. Alzheimer's & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions 3:367–384).

Деменция с тельцами Леви (DLB) представляет собой тип деменции, которая со временем ухудшается. Дополнительные симптомы могут включать колебания внимания, зрительные галлюцинации, замедление движений, проблемы при ходьбе и ригидность. DLB является наиболее распространенной причиной деменции после болезни Альцгеймера и сосудистой деменции. Она обычно проявляется после 50 лет. Страдает примерно 0,1% населения, старше 65 лет. Похоже, что мужчины болеют чаще, чем женщины. Основной механизм включает образование телец Леви в нейронах, состоящих из белка, альфа-синуклеина. Подозрение на диагноз может быть основано на симптомах, при этом следует сделать анализ крови и медицинскую визуализацию для исключения других возможных причин. В настоящее время не существует лекарства от DLB. Лечение является поддерживающим для облегчения некоторых моторных и психологических симптомов, ассоциированных с заболеванием. Могут быть полезны некоторую ингибиторы ацетилхолинэстеразы, такие как донепезил. Некоторые двигательные проблемы можно уменьшить с помощью леводопы. Для обзора см. McKeith et al. 2017. Neurology 89:88-100.Dementia with Lewy bodies (DLB) is a type of dementia that gets worse over time. Additional symptoms may include fluctuations in attention, visual hallucinations, slow movement, trouble walking, and rigidity. DLB is the most common cause of dementia after Alzheimer's disease and vascular dementia. It usually appears after 50 years of age. Affects approximately 0.1% of the population over 65 years of age. Men seem to get sick more often than women. The underlying mechanism involves the formation of Lewy bodies in neurons composed of a protein, alpha-synuclein. The diagnosis may be suspected based on symptoms, and blood tests and medical imaging should be done to rule out other possible causes. There is currently no cure for DLB. Treatment is supportive to relieve some of the motor and psychological symptoms associated with the disease. Some acetylcholinesterase inhibitors such as donepezil may be helpful. Some movement problems can be improved with levodopa. For a review, see McKeith et al. 2017. Neurology 89:88-100.

Сосудистая деменция (VaD), также известная как мультиинфарктная деменция (MID), и сосудистые когнитивные нарушения (VCI) относятся к деменции, вызванной проблемами, связанными с кровоснабжением головного мозга, обычно после серии небольших инсультов, приводящих к усилению снижения когнитивных способностей. Термин относится к синдрому, состоящему из сложного взаимодействия цереброваскулярного заболевания и факторов риска, что приводит к изменениям в структурах мозга результате инсультов и поражений и, как следствие, к изменениям когнитивной функции. Для постановки диагноза необходимо наличие временной связи между инсультом и дефицитом когнитивных функций. Различные синдромы деменции могут быть трудно различимыми из-за часто совпадающих клинических признаков и родственной патологии, лежащей в основе заболеваний. В частности, деменция при болезни Альцгеймера часто сочетается с сосудистой деменцией. Люди с сосудистой деменцией имеют прогрессирующее когнитивное нарушение, острое или подострое, как и легкое когнитивное нарушение, часто развивающееся постепенно, после нескольких цереброваскулярных событий (инсультов). Для обзора см. Venkat et al. 2015. Exp Neurol 272:97-108.Vascular dementia (VaD), also known as multi-infarct dementia (MID), and vascular cognitive impairment (VCI) refer to dementia caused by problems related to the blood supply to the brain, usually after a series of small strokes leading to increasing cognitive decline. The term refers to a syndrome consisting of a complex interaction of cerebrovascular disease and risk factors that leads to changes in brain structures resulting from strokes and lesions and, as a result, changes in cognitive function. To make a diagnosis, there must be a temporal relationship between the stroke and cognitive deficits. The different dementia syndromes can be difficult to distinguish due to the often overlapping clinical features and related underlying pathology. In particular, dementia in Alzheimer's disease is often combined with vascular dementia. People with vascular dementia have progressive cognitive impairment, either acute or subacute, as well as mild cognitive impairment, often developing gradually after several cerebrovascular events (strokes). For a review, see Venkat et al. 2015. Exp Neurol 272:97–108.

Лобно-височная деменция (FTD) относится к клиническим проявлениям лобно-височной долевой дегенерации, которая характеризуется прогрессирующей потерей нейронов, затрагивающей преимущественно лобные или височные доли, и типичной потерей более 70% нейронов веретена, тогда как другие типы нейронов остаются незатронутыми. 20% FTD приходится на случаи деменции, проявляющиеся в молодом возрасте. Признаки и симптомы обычно проявляются в более позднем возрасте, чаще в возрасте от 55 до 65 лет, примерно одинаково затрагивая мужчин и женщин. К общим признакам и симптомам относятся значительные изменения в социальном и личностном поведении, апатия, притупление эмоций и дефицит экспрессивной и рецептивной речи. В настоящее время отсутствует какой-либо способ лечения FTD, но есть способы лечения, которые позволяющие облегчить симптомы. Для обзора см. Bott et al. 2014. Neurodegener Dis Manag 4(6):439-454.Frontotemporal dementia (FTD) refers to the clinical manifestations of frontotemporal lobar degeneration, which is characterized by progressive neuronal loss predominantly affecting the frontal or temporal lobes, and a typical loss of more than 70% of spindle neurons, while other types of neurons remain unaffected. 20% of FTD occurs in cases of dementia that appear at a young age. Signs and symptoms usually appear later in life, most often between ages 55 and 65, affecting men and women about equally. Common signs and symptoms include significant changes in social and personality behavior, apathy, blunted emotions, and deficits in expressive and receptive language. There is currently no cure for FTD, but there are treatments that can help relieve symptoms. For a review, see Bott et al. 2014. Neurodegener Dis Manag 4(6):439–454.

Пептид адреномедуллин (ADM) был впервые описан Kitamura et al. (Kitamura et al. 1993. Biochemical and Biophysical Research Communications 192(2):553-560) как новый гипотензивный пептид, содержащий 52 аминокислоты, который был выделен из клеточной линии феохромоцитомы человека. В том же году также были описаны кДНК, кодирующая пептид-предшественник, содержащий 185 аминокислот, и полная аминокислотная последовательность этого пептида-предшественника. Пептид-предшественник, который содержит, помимо прочего, сигнальную последовательность из 21 аминокислоты на N-конце, называют «пре-проадреномедуллином» (pre-proADM). Pre-proADM содержит 185 минокислот (SEQ ID No. 1). Зрелый ADM-NH₂ приведен в SEQ ID No. 4, а ADM-Gly приведен в SEQ No. 5.The peptide adrenomedullin (ADM) was first described by Kitamura et al. (Kitamura et al. 1993. Biochemical and Biophysical Research Communications 192(2):553-560) as a novel 52 amino acid antihypertensive peptide that was isolated from a human pheochromocytoma cell line. The same year, a cDNA encoding a 185 amino acid precursor peptide and the complete amino acid sequence of this precursor peptide were also described. The precursor peptide, which contains, among other things, a 21 amino acid signal sequence at the N-terminus, is called “pre-proadrenomedullin” (pre-proADM). Pre-proADM contains 185 amino acids (SEQ ID No. 1). Mature ADM-NH ₂ is given in SEQ ID No. 4 and ADM-Gly is given in SEQ No. 5.

Зрелый пептид адреномедуллина представляет собой амидированный пептид (ADM-NH₂), который содержит 52 аминокислоты (SEQ ID No: 4) и который содержит аминокислоты 95-146 pre-proADM, из которых он образуется в результате протеолитического расщепления. К настоящему времени, по существу, охарактеризованы лишь несколько пептидных фрагментов, образованных при расщеплении pre-proADM, в частности, физиологически активные пептиды адреномедуллина (ADM) и «PAMP», пептид, содержащий 20 аминокислот (22-41) (SEQ ID No. 2), который следует за 21 аминокислотой сигнального пептида в pre-proADM. Кроме того, обнаружены физиологически активные субфрагменты ADM и PAMP, которые исследованы более подробно. Открытие и изучение характеристик ADM в 1993 году вызвали интенсивную исследовательскую деятельность с потоком публикаций, результаты которых были недавно обобщены в различных обзорных статьях; в контексте настоящего описания, в частности, приведена ссылка на статьи Takahashi 2001. Peptides 22:1691; Eto et al. 2001. Peptides 22:1693-1711 and Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167.The mature adrenomedullin peptide is an amidated peptide (ADM-NH ₂ ) that contains 52 amino acids (SEQ ID No: 4) and which contains amino acids 95-146 of the pre-proADM from which it is formed by proteolytic cleavage. To date, only a few peptide fragments generated by cleavage of pre-proADM have been substantially characterized, particularly the physiologically active peptides adrenomedullin (ADM) and “PAMP,” a peptide containing 20 amino acids (22-41) (SEQ ID No. 2), which follows the 21 amino acid signal peptide in pre-proADM. In addition, physiologically active subfragments of ADM and PAMP were discovered, which were studied in more detail. The discovery and characterization of ADM in 1993 sparked intense research activity with a flurry of publications, the results of which have recently been summarized in various review articles; in the context of the present description, reference is made in particular to the articles of Takahashi 2001. Peptides 22:1691; Eto et al. 2001. Peptides 22:1693-1711 and Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167.

В научных исследованиях, проведенных к настоящему времени, помимо прочего, было обнаружено, что ADM можно рассматривать как полифункциональный регуляторный пептид. Он высвобождается в кровоток в неактивной форме, содержащей глицин (Kitamura et al. 1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244(2):551-555). Также имеется связывающий белок (Pio et al. 2001. Journal of Biological Chemistry 276(15):12292-12300), который является специфическим по отношению к ADM и, вероятно, также модулирует его действие.In scientific studies carried out to date, it has been discovered, among other things, that ADM can be considered as a multifunctional regulatory peptide. It is released into the bloodstream in an inactive form containing glycine (Kitamura et al. 1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244(2):551-555). There is also a binding protein (Pio et al. 2001. Journal of Biological Chemistry 276(15):12292-12300) that is specific for ADM and likely also modulates its action.

Физиологические эффекты ADM, а также PAMP, которым уделялось большое внимание в проводимых до настоящего времени исследованиях, являются эффектами, оказывающими влияние на кровяное давление. Таким образом, ADM является эффективным вазодилататором.The physiological effects of ADM, as well as PAMP, which have received much attention in studies to date, are effects on blood pressure. Thus, ADM is an effective vasodilator.

Кроме того, было обнаружено, что вышеупомянутый физиологически активный пептид PAMP, который образуется из pre-proADM, также проявляет гипотензивный эффект, несмотря на то, что его механизм действия, по-видимому, отличается от механизма действия ADM (Eto et al. 2001. Peptides 22:1693-1711; Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167; Kuwasako et al. 1997. FEBS Lett 414(1):105-110; Kuwasaki et al. 1999. Ann. Clin. Biochem. 36:622-628; Tsuruda et al. 2001. Life Sci. 69(2):239-245; Kangawa et al. EP 0622458).In addition, the aforementioned physiologically active peptide PAMP, which is derived from pre-proADM, was found to also exhibit an antihypertensive effect, although its mechanism of action appears to be different from that of ADM (Eto et al. 2001. Peptides 22:1693-1711; Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167; Kuwasako et al. 1997. FEBS Lett 414(1):105-110; Kuwasaki et al. 1999. Ann. Clin. Biochem 36:622-628; Tsuruda et al. 2001. Life Sci. 69(2):239-245; Kangawa et al. EP 0622458).

Кроме того, было обнаружено, что концентрации ADM, которые можно измерить в кровотоке и других биологических жидкостях, в ряде патологических состояний значительно превышают концентрации, характерные для здоровых контрольных субъектов. Таким образом, уровень ADM у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, заболеваниями почек, гипертоническими расстройствами, сахарным диабетом, пациентов в острой фазе шока и при сепсисе и септическом шоке значительно повышен, хотя и в разной степени. В случае некоторых из указанных патологических состояний концентрации PAMP также увеличиваются, однако уровни в плазме ниже по сравнению с таковыми для ADM (Eto 2001. Peptides 22:1693-1711).In addition, ADM concentrations that can be measured in the bloodstream and other body fluids have been found to be significantly higher than those found in healthy control subjects in a number of pathological conditions. Thus, ADM levels in patients with congestive heart failure, myocardial infarction, kidney disease, hypertensive disorders, diabetes mellitus, patients in the acute phase of shock and in sepsis and septic shock are significantly increased, although to varying degrees. In some of these pathological conditions, PAMP concentrations also increase, but plasma levels are lower compared to those for ADM (Eto 2001. Peptides 22:1693-1711).

Также известно, что необычно высокие концентрации ADM наблюдаются при сепсисе или септическом шоке (Eto et al. 2001. Peptides 22:1693-1711; Hirata et al. 1996. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4):1449-1453; Ehlenz et al.1997. Exp Clin Endocrinol Diabetes 105:156-162; Tomoda et al. 2001. Peptides 22:1783-1794; Ueda et al. 1999 Am. J. Respir. Crit. Care Med.160:132-136; Wang et al. 2001. Peptides 22:1835-1840). Полученные данные связаны с типичными изменениями гемодинамики, которые известны как явления, типично наблюдаемые у пациентов с сепсисом и другими тяжелыми синдромами, такими как, например, SIRS. Адреномедуллин играет ключевую роль в развитии сепсиса (Wang, Shock 1998, 10(5):383-384; Wang et al. 1998. Archives of surgery 133(12):1298-1304) и многочисленных острых и хронических заболеваний (Parlapiano et al. 1999. European Review for Medical and Pharmacological Sciences 3:53-61; Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167). It is also known that unusually high concentrations of ADM are observed in sepsis or septic shock (Eto et al. 2001. Peptides 22:1693-1711; Hirata et al. 1996. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4):1449-1453; Ehlenz et al 1997 Exp Clin Endocrinol Diabetes 105:156-162 Tomoda et al 2001 Peptides 22:1783-1794 Ueda et al 1999 Am J Respir Crit Care Med 160:132-136; Wang et al. 2001. Peptides 22:1835-1840). The findings are associated with typical hemodynamic changes, which are known to be events typically observed in patients with sepsis and other severe syndromes such as SIRS. Adrenomedullin plays a key role in the development of sepsis (Wang, Shock 1998, 10(5):383-384; Wang et al. 1998. Archives of surgery 133(12):1298-1304) and numerous acute and chronic diseases (Parlapiano et al 1999 European Review for Medical and Pharmacological Sciences 3:53-61 Hinson et al 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167

Описано несколько методов измерения уровней ADM в кровотоке: путем определения непосредственно ADM, либо опосредованно путем определения более стабильного фрагмента родственного ему пептида-предшественника. Недавно был опубликован метод, описывающий анализ измерения циркулирующего зрелого ADM (Weber et al. 2017. Journal of applied Labaratory Medicine, 2(2):222-233).Several methods have been described for measuring ADM levels in the bloodstream, either by measuring ADM directly or indirectly by measuring a more stable fragment of its cognate precursor peptide. A method describing an assay for measuring circulating mature ADM was recently published (Weber et al. 2017. Journal of applied Laboratory Medicine, 2(2):222–233).

Описаны и другие способы количественного определения фрагментов, полученных из предшественника ADM, например, измерение MR-proADM (Morgenthaler et al. 2005. Clin Chem 51(10):1823-9), PAMP (Washimine et al. 1994. Biochem Biophys Res Commun 202 (2):1081-7) и CT-proADM (EP 2111552). Измерение MR-proADM в плазме можно выполнить с помощью коммерчески доступного гомогенного флюороиммуноанализ с временным разрешением в полностью автоматизированной системе (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR; BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany) (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42(7-8):725-8). Поскольку эти пептиды образуются в стехиометрическом отношении из одного и того же предшественника, их уровни в плазме коррелируют до определенной степени.Other methods for quantifying fragments derived from the ADM precursor have been described, such as measuring MR-proADM (Morgenthaler et al. 2005. Clin Chem 51(10):1823-9), PAMP (Washimine et al. 1994. Biochem Biophys Res Commun 202 (2):1081-7) and CT-proADM (EP 2111552). Measurement of MR-proADM in plasma can be performed using a commercially available homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay in a fully automated system (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR; BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany) (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42(7-8) :725-8). Because these peptides are formed stoichiometrically from the same precursor, their plasma levels are correlated to a certain extent.

Роль MR-proADM в деменции и AD изучалась в нескольких исследованиях. Уровни MR-proADM в плазме, измеренные у пациентов с вероятной AD, были повышены по сравнению с пожилыми здоровыми контролями с нормальными когнитивными способностями (Buerger et al. 2009. Biological Psychiatry 2009; 65:979-984). Классификация по концентрации только одного MR-proADM в крови оказалась точной с чувствительностью 47% и специфичностью 81%, а при соотношении MR-proADM с другим биомаркером, CT-proET-1, чувствительность обнаружения AD составила 66% при специфичности 81%. Кроме того, концентрации MR-proADM в плазме имеют прогностическое значение в отношении прогрессирования от предшествующих деменции MCI до клинической AD (Buerger et al. 2010. J Clin Psychiatry 72 (4):556-563). MR-proADM также измеряли в популяционной когорте из более чем 5000 человек без преобладания деменции, и было показано, что его уровень является повышенным у участников, у которых впоследствии развилась деменция, но указывал на отсутствие повышенного фактора риска при этом после поправки на традиционные факторы риска (Holm et al. 2017. Journal of Internal Medicine 282:94-101). У пациентов, участвовавших в продольном исследовании артериосклероза, уровни MR-proADM значительно повышались по мере прогрессирования степени поражения глубокого белого вещества головного мозга (DWML) (Kuriyama et al. 2017. Journal of Alzheimer's Disease 56:1253-1262). Кроме того, значимая обратная корреляция наблюдалась между уровнями MR-proADM и результатами тестов на когнитивные способности.The role of MR-proADM in dementia and AD has been examined in several studies. Plasma MR-proADM levels measured in patients with probable AD were elevated compared with elderly healthy controls with normal cognitive abilities (Buerger et al. 2009. Biological Psychiatry 2009; 65:979–984). Classification based on the blood concentration of MR-proADM alone was found to be accurate with a sensitivity of 47% and a specificity of 81%, and when correlating MR-proADM with another biomarker, CT-proET-1, the sensitivity for detection of AD was 66% with a specificity of 81%. In addition, plasma MR-proADM concentrations have prognostic value for progression from pre-dementia MCI to clinical AD (Buerger et al. 2010. J Clin Psychiatry 72 (4):556–563). MR-proADM was also measured in a population-based cohort of over 5000 people without predominant dementia and was shown to be elevated in participants who subsequently developed dementia, but indicated no increased risk factor for this after adjustment for traditional risk factors (Holm et al. 2017. Journal of Internal Medicine 282:94-101). In patients participating in a longitudinal study of arteriosclerosis, MR-proADM levels increased significantly as the severity of deep white matter (DWML) lesions progressed (Kuriyama et al. 2017. Journal of Alzheimer's Disease 56:1253–1262). Additionally, a significant inverse correlation was observed between MR-proADM levels and cognitive test scores.

Было показано, что уровень адреномедуллина повышается в лобной коре у пациентов с AD по сравнению с группой контроля соответствующего возраста (Ferrero et al. 2017. Mol Neurobiol. Doi: 10.1007/s12035-017-0700-6, E-Pub электронная публикация до выхода в печать). Однако ничего не известно об уровнях ADM в плазме у пациентов, страдающих деменцией, особенно с болезнью Альцгеймера.Adrenomedullin levels have been shown to be increased in the frontal cortex of patients with AD compared to age-matched controls (Ferrero et al. 2017. Mol Neurobiol. doi: 10.1007/s12035-017-0700-6, E-Pub electronic publication ahead of release to print). However, nothing is known about plasma ADM levels in patients suffering from dementia, especially Alzheimer's disease.

Модель субкортикальной сосудистой деменции воспроизводили на мышах путем двустороннего размещения микроспиралей на общих сонных артериях. Используя мышей с увеличенным уровнем экспрессии циркулирующего ADM, оценивали влияние ADM на церебральную перфузию, церебральную ангиоархитектуру, окислительный стресс, изменение белого вещества, когнитивную функцию и уровни цАМФ в мозге, фактор роста эндотелия сосудов и основной фактор роста фибробластов. Эти данные показали, что ADM способствует артериогенезу и ангиогенезу, подавляет окислительный стресс, сохраняет целостность белого вещества и предотвращает снижение когнитивных функций после хронической гипоперфузии головного мозга. Таким образом, ADM может служить в качестве агента для борьбы с подкорковой сосудистой деменцией. (Maki et al. 2011. Stroke 42:1122-1128).A model of subcortical vascular dementia was reproduced in mice by bilaterally placing microcoils on the common carotid arteries. Using mice with increased levels of circulating ADM expression, the effects of ADM on cerebral perfusion, cerebral angioarchitecture, oxidative stress, white matter alteration, cognitive function, and levels of brain cAMP, vascular endothelial growth factor, and basic fibroblast growth factor were assessed. These data showed that ADM promotes arteriogenesis and angiogenesis, suppresses oxidative stress, preserves white matter integrity, and prevents cognitive decline after chronic cerebral hypoperfusion. Thus, ADM may serve as an agent to combat subcortical vascular dementia. (Maki et al. 2011. Stroke 42:1122-1128).

Удивительным открытием настоящего изобретения является то, что уровни зрелого ADM значительно снижены у здоровых пациентов, у которых впоследствии развивается деменция, в частности AD. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что уровни зрелого ADM значительно снижены, если субъект страдает деменцией, в частности деменцией при болезни Альцгеймера. Из примеров видно, что базовые уровни адреномедуллина, в частности ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, независимо позволяют предсказывать наличие деменции, в частности деменции при болезни Альцгеймера. A surprising finding of the present invention is that levels of mature ADM are significantly reduced in healthy patients who subsequently develop dementia, particularly AD. In addition, it has surprisingly been found that levels of mature ADM are significantly reduced if the subject suffers from dementia, in particular Alzheimer's disease dementia. From the examples it is clear that the baseline levels of adrenomedullin, in particular ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 independently predict the presence of dementia, in particular dementia in Alzheimer's disease.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что у субъекта диагностируют деменцию, в частности AD, если отношение маркеров ADM-NH₂/про-адреномедуллин или его фрагмент ниже определенного отношения уровней маркеров. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что субъект имеет повышенный риск развития деменции, если отношение уровней маркеров ADM-NH₂/про-адреномедуллин или его фрагмент ниже определенного порогового значения уровней маркеров. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что статус субъекта, страдающего деменцией, в частности AD, или подверженного риску развития деменции, в частности AD, улучшается при терапии или вмешательстве, если указанное отношение уровней маркеров увеличивается во время курса терапии или вмешательства, причем вмешательство может быть продолжено, если указанный уровень отношения маркеров поднимается выше указанного порогового отношения.Additionally, it has surprisingly been discovered that a subject is diagnosed with dementia, particularly AD, if the ADM-NH ₂ /pro-adrenomedullin or fragment thereof marker ratio is below a certain marker level ratio. In addition, it has surprisingly been discovered that a subject has an increased risk of developing dementia if the ratio of ADM-NH ₂ markers/pro-adrenomedullin or a fragment thereof is below a certain marker level threshold. In addition, it has surprisingly been found that the status of a subject suffering from dementia, particularly AD, or at risk of developing dementia, particularly AD, improves with therapy or intervention if the specified ratio of marker levels increases during the course of therapy or intervention, which intervention may be continued if the specified token ratio level rises above the specified threshold ratio.

Альтернативно, уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и уровень про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, объединяют в математической формуле или алгоритме, причем результат указанной формулы или алгоритма используют для диагностики деменции или определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией, или мониторинга терапии или мониторинга или управления вмешательством у субъекта, страдающего деменцией, или мониторинга профилактической терапии или мониторинга или управления профилактическим вмешательством у субъекта с риском развития деменции.Alternatively, the level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of the specified subject, and the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4), determined in the physiological fluid sample of the specified subject, are combined in a mathematical formula or algorithm, wherein the result of said formula or algorithm is used to diagnose dementia or determine the risk of developing dementia in a subject not suffering from dementia, or monitoring therapy or monitoring or managing an intervention in a subject suffering from dementia, or monitoring preventive therapy or monitoring or managing a preventive intervention in a subject at risk development of dementia.

Таким образом, неожиданным открытием изобретения является то, что уровень зрелого ADM (зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) в кровотоке снижается у субъекта, страдающего деменцией или имеющего риск развития деменции. Помимо этого, уровень про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) в кровотоке повышен у субъекта, страдающего деменцией или имеющего риск развития деменции. Известно, что зрелый ADM (зрелый ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) является гормоном, отвечающим за целостность сосудов и функцию эндотелия сосудов. Также известно, что дисфункция эндотелия сосудов связана с широким спектром самых страшных заболеваний человека, таких как заболевания периферических сосудов, инсульт, болезни сердца, диабет, хроническая почечная недостаточность, а также развитие метастазов и деменция (Rajendran et al. 2013. Int. J. Biol. Sci. 9 (19:1057-1069).Thus, a surprising finding of the invention is that the level of mature ADM (mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) in the bloodstream is reduced in a subject suffering from dementia or at risk of developing dementia. In addition, the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) in the bloodstream is increased in a subject suffering from dementia or at risk of developing dementia. It is known that mature ADM (mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) is a hormone responsible for vascular integrity and vascular endothelial function. Vascular endothelial dysfunction is also known to be associated with a wide range of the most devastating human diseases, such as peripheral vascular disease, stroke, heart disease, diabetes, chronic renal failure, as well as the development of metastases and dementia (Rajendran et al. 2013. Int. J. Biol Sci 9 (19:1057–1069).

Высокие уровни про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) в кровотоке, по-видимому, является показателем того, что организм нуждается в восстановлении функции эндотелия сосудов и поддержании целостности сосудов. Тем не менее, низкие уровни зрелого ADM (зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) указывают на то, что, несмотря на высокие уровни pro-ADM, по-видимому превращение ADM-Gly в зрелый ADM (зрелый ADM-NH₂ соответственно SEQ ID No. 4) нарушено.High levels of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ as defined in SEQ ID No. 4) in the bloodstream appear to be an indication that the body needs to restore vascular endothelial function and maintain vascular integrity. However, low levels of mature ADM (mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) indicate that, despite high levels of pro-ADM, conversion of ADM-Gly to mature ADM (mature ADM-NH ₂ respectively SEQ ID No. 4) is violated.

Известно, что концентрации MR-proADM в кровотоке повышены у пациентов с болезнью Альцгеймера, пациентов с MCI или субъектов, у которых может развиться AD, (Buerger et al. 2009. Biological Psychiatry 2009; 65:979-984; Buerger et al. 2010. J Clin Psychiatry 72(4):556-563; Holm et al. 2017. Journal of Internal Medicine 282:94-101). Это свидетельствует об активации пути синтеза ADM. Однако нет никаких сведений о концентрации биологически активного ADM. В настоящем изобретении продемонстрировано, что концентрация активного ADM (bio-ADM) в кровотоке на удивление ниже у пациентов с AD и пациентов с риском развития AD (пример 6). Более того, появляется все больше доказательств того, что нарушение микроциркуляции в головном мозге является фактором, участвующим в патофизиологии болезни Альцгеймера (Iadecola 2013. The pathobiology of vascular dementia. Neuron 2013;80(4):844-866). Результаты гистологической оценки и исследований образцов альбумина показывают, что повышенная проницаемость гематоэнцефалического барьера (BBB), вероятно, является ключевым механизмом (Benarroch 2007. Neurovascular unit dysfunction: a vascular component of Alzheimer disease? Neurology 68(20):1730-1732). В недавних исследованиях было продемонстрировано, что глобальная «утечка» BBB у пациентов с ранним AD ассоциирована со снижением когнитивных способностей (Nation et al. 2019. Nature Medicine https://doi.org/10.1038/s41591-018-0297-y; van de Haar et al. 2016 Radiology 281(2):527-535). Было показано, что N-концевые анти-ADM антитела стабилизируют адреномедуллин и приводят к увеличению активного ADM в кровотоке (Geven et al. 2018. Effects of humanized anti-adrenomedullin antibody Adrecizumab (HAM8101) on vascular barrier function and survival in rodent models of systemic inflammation and sepsis. Shock 50(6):648-654; Geven et al. 2018. Vascular effects of adrenomedullin and the anti-adrenomedullin antibody Adrecizumab in sepsis. Shock 50(2):132-140). Эффект индуцирования быстрого увеличения bio-ADM в крови здоровых пациентов показан в примере 7 и на фиг.8. Увеличение ADM в кровотоке приводит к благоприятному воздействию на эндотелиальные клетки, например, уменьшение капиллярной утечки. Например, на экспериментальных моделях системного воспаления и сепсиса было показано, что N-концевое анти-ADM антитело (HAM8101, Адрецизумаб) усиливает барьерную функцию эндотелия (Geven et al. 2018. Effects of humanized anti-adrenomedullin antibody Adrecizumab (HAM8101) on vascular barrier function and survival in rodent models of systemic inflammation and sepsis. Shock 50(6):648-654). Следовательно, N-концевое ADM-связующее вещество, более конкретно N-концевое анти-ADM антитело, может быть применено для увеличения концентрации bio-ADM в крови пациентов, страдающих деменцией или имеющих риск развития деменции, особенно у пациентов, страдающих деменцией при болезни Альцгеймера.Circulating concentrations of MR-proADM are known to be elevated in patients with Alzheimer's disease, patients with MCI, or subjects who may develop AD (Buerger et al. 2009. Biological Psychiatry 2009; 65:979-984; Buerger et al. 2010 J Clin Psychiatry 72(4):556–563; Holm et al. 2017. Journal of Internal Medicine 282:94–101). This indicates activation of the ADM synthesis pathway. However, there is no information on the concentration of biologically active ADM. The present invention demonstrates that the concentration of active ADM (bio-ADM) in the bloodstream is surprisingly lower in patients with AD and patients at risk of developing AD (Example 6). Moreover, there is growing evidence that impaired microcirculation in the brain is a factor involved in the pathophysiology of Alzheimer's disease (Iadecola 2013. The pathobiology of vascular dementia. Neuron 2013;80(4):844-866). Results from histological evaluation and studies of albumin samples indicate that increased permeability of the blood-brain barrier (BBB) is likely a key mechanism (Benarroch 2007. Neurovascular unit dysfunction: a vascular component of Alzheimer disease? Neurology 68(20):1730–1732). Recent studies have demonstrated that global BBB leakage in patients with early AD is associated with cognitive decline (Nation et al. 2019. Nature Medicine https://doi.org/10.1038/s41591-018-0297-y; van de Haar et al 2016 Radiology 281(2):527-535). N-terminal anti-ADM antibodies have been shown to stabilize adrenomedullin and lead to an increase in active ADM in the bloodstream (Geven et al. 2018. Effects of humanized anti-adrenomedullin antibody Adrecizumab (HAM8101) on vascular barrier function and survival in rodent models of systemic inflammation and sepsis. Shock 50(6):648–654; Geven et al. 2018. Vascular effects of adrenomedullin and the anti-adrenomedullin antibody Adrecizumab in sepsis. Shock 50(2):132–140). The effect of inducing a rapid increase in bio-ADM in the blood of healthy patients is shown in Example 7 and FIG. 8. Increased ADM in the bloodstream leads to beneficial effects on endothelial cells, such as decreased capillary leakage. For example, in experimental models of systemic inflammation and sepsis, the N-terminal anti-ADM antibody (HAM8101, Adrecizumab) was shown to enhance endothelial barrier function (Geven et al. 2018. Effects of humanized anti-adrenomedullin antibody Adrecizumab (HAM8101) on vascular barrier function and survival in rodent models of systemic inflammation and sepsis. Shock 50(6):648–654). Therefore, an N-terminal ADM binder, more specifically an N-terminal anti-ADM antibody, can be used to increase the concentration of bio-ADM in the blood of patients suffering from dementia or at risk of developing dementia, especially in patients suffering from Alzheimer's disease dementia .

Таким образом, в целом низкие уровни ADM в кровотоке, в частности биологически активного ADM, у пациента, организм которого нуждается в восстановлении функции эндотелия сосудов и поддержании целостности сосудов, могут указывать на нарушение процессинга ADM у указанного пациента. Пациент, организм которого нуждается в восстановлении функции сосудистого эндотелия и поддержании целостности сосудов, может быть охарактеризован и идентифицирован путем определения уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 в образце физиологической жидкости субъекта, причем указанный уровень зрелого ADM-NH₂ сравнивают с пороговым уровнем, как указано в способах по настоящему изобретению, или путем определения отношения маркеров, которое может представлять собой отношение уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенному в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и причем указанное отношение маркеров сравнивают с пороговым отношением, как указано в способах по настоящему изобретению.Thus, generally low circulating levels of ADM, particularly bioactive ADM, in a patient whose body is in need of restoring vascular endothelial function and maintaining vascular integrity may indicate impaired ADM processing in that patient. A patient whose body needs to restore vascular endothelial function and maintain vascular integrity can be characterized and identified by determining the level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 in a physiological fluid sample of the subject, wherein said mature ADM-NH ₂ level is compared to a threshold level as specified in the methods of the present invention, or by determining a marker ratio, which may be a mature ADM-NH ₂ level ratio according to SEQ ID No. 4 determined in a physiological fluid sample of said subject to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) determined in a physiological fluid sample of said subject, and wherein said ratio of markers is compared with threshold ratio as specified in the methods of the present invention.

Дополнительно или альтернативно, пациент, организм которого нуждается в восстановлении функции сосудистого эндотелия и поддержании целостности сосудов, может быть пациентом с глобальной утечкой BBB или нарушением целостности BBB. Глобальная утечка BBB или нарушение целостности BBB могут быть определены следующим образом: путем измерения отношения спинномозговая жидкость (CSF)/сывороточный альбумин или иммуноглобулин G (IgG) (Akaishi et al. 2015. Neurology and Clinical Neuroscience 3:94-100) или методами визуализации, например магнитно-резонансной томографией в режиме динамической восприимчивости контраста (DSC-MRI) или динамической контраст-усиленной МРТ (DCE-MRI) (Raja et al. 2018. Neuropharmacology 134: 259-271).Additionally or alternatively, a patient whose body is in need of restoring vascular endothelial function and maintaining vascular integrity may be a patient with global BBB leak or BBB disruption. Global BBB leakage or disruption of BBB integrity can be determined by measuring the cerebrospinal fluid (CSF)/serum albumin or immunoglobulin G (IgG) ratio (Akaishi et al. 2015. Neurology and Clinical Neuroscience 3:94-100) or imaging techniques , such as dynamic susceptibility contrast-enhanced magnetic resonance imaging (DSC-MRI) or dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) (Raja et al. 2018. Neuropharmacology 134: 259-271).

Таким образом, стратификация и идентификация пациентов, нуждающихся в повышении уровней bio-ADM для предотвращения или предупреждения прогрессирования когнитивной дисфункции у человека или для профилактики или лечения деменции, осуществляется любым из описанных выше способов.Thus, stratification and identification of patients in need of increasing bio-ADM levels to prevent or prevent the progression of cognitive dysfunction in an individual or to prevent or treat dementia is accomplished by any of the methods described above.

Было показано, что при введении N-концевого анти-ADM антитела происходит быстрое увеличение bio-ADM в крови здоровых пациентов, как показано в примере 7 и на фиг. 8, что может помочь восстановить «протекающий» или поврежденный гематоэнцефалический барьер. Поэтому имеется вероятность того, что введение N-концевого анти-ADM антитела окажется полезным в профилактике и лечении деменции у субъекта, идентифицированного и/или стратифицированного, как описано выше.Administration of an N-terminal anti-ADM antibody has been shown to rapidly increase bio-ADM in the blood of healthy patients, as shown in Example 7 and FIG. 8, which may help repair a leaky or damaged blood-brain barrier. It is therefore likely that administration of an N-terminal anti-ADM antibody will be useful in the prevention and treatment of dementia in a subject identified and/or stratified as described above.

Следовательно, еще одна цель заключается в предоставлении терапии субъектам с пониженными уровнями зрелого ADM (зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) и/или с пониженным отношением уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ. ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенному в образце физиологической жидкости организма. Указанную группу пациентов можно лечить антителом к адреномедуллину (ADM) или фрагментом антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркасом для использования в профилактике и терапии деменции у субъекта, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас связывается с N-концевой частью (аа 1-21) адреномедуллина:Therefore, another objective is to provide therapy to subjects with reduced levels of mature ADM (mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) and/or with a reduced level ratio of mature ADM-NH ₂ according to SEQ. ID No. 4 determined in a body fluid sample of the subject to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ as defined in SEQ ID No. 4) determined in a body fluid sample. Said group of patients can be treated with an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig scaffold for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein said anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM The non-Ig scaffold binds to the N-terminal part (aa 1-21) of adrenomedullin:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный субъект, подлежащий лечению, имеет дополнительно к вышеупомянутым критериям признаки умеренных когнитивных нарушений или признаки деменции.In another embodiment of the present invention, the subject to be treated has, in addition to the above criteria, signs of mild cognitive impairment or signs of dementia.

Известно, что введение антитела к адреномедуллину (ADM) или фрагмента антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркаса субъекту повышает концентрацию зрелого ADM (зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) в кровотоке субъекта и, таким образом, улучшает статус субъектов, страдающих деменцией или имеющих риск развития деменции.It is known that administration of an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework to a subject increases the concentration of mature ADM (mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) in the bloodstream of the subject and thereby improves status of subjects with dementia or at risk of developing dementia.

в котором определяют уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 в образце физиологической жидкости субъекта, и в котором сравнивают указанный уровень зрелого ADM-NH₂ с пороговым уровнем,in which the level of mature ADM-NH ₂ is determined according to SEQ ID No. 4 in a sample of the subject's physiological fluid, and in which the indicated level of mature ADM-NH ₂ is compared with a threshold level,

причемand

c) статус субъекта, страдающего деменцией или имеющего риск развития деменции, улучшается при терапии или вмешательстве, если указанный уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 увеличивается в ходе терапии или вмешательства, и/или причем вмешательство может быть продолжено, если указанный уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 увеличивается выше указанного порогового уровня.c) the status of the subject suffering from dementia or at risk of developing dementia improves with therapy or intervention if the specified level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 increases during the course of therapy or intervention, and/or wherein the intervention can be continued if the specified level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 increases above the specified threshold level.

В одном из вариантов осуществления объектом настоящего изобретения является способ:In one embodiment, the present invention provides a method for:

в котором определяют отношение маркеров, которое может представлять собой отношение уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента (который является незрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенному в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и в котором сравнивают указанное отношение маркеров с пороговым отношением,wherein a marker ratio is determined, which may be a mature ADM-NH ₂ level ratio according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of the specified subject, to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is immature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4), determined in the physiological fluid sample of the specified subject, and in which the specified ratio of markers is compared with threshold ratio,

причемand

b) указанный субъект имеет повышенный риск развития деменции, если отношение маркеров ADM-NH₂/про-адреномедуллин или его фрагмент ниже указанного порогового отношения, или причемb) the specified subject has an increased risk of developing dementia if the ratio of markers ADM-NH ₂ /pro-adrenomedullin or fragment thereof is below the specified threshold ratio, or wherein

c) статус субъекта, страдающего деменцией или имеющего риск развития деменции, улучшается при терапии или вмешательстве, если указанное отношение маркеров увеличивается в ходе терапии или вмешательства, и причем вмешательство может быть продолжено, если указанный уровень отношения маркеров увеличивается выше указанного порогового отношения.c) the status of the subject suffering from dementia or at risk of developing dementia improves with the therapy or intervention if the specified marker ratio increases during the therapy or intervention, and wherein the intervention can be continued if the specified level of the marker ratio increases above the specified threshold ratio.

Альтернативно, уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и уровень про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, может быть объединен в математической формуле или алгоритме, причем результат указанной формулы или алгоритма используют для диагностики деменции или определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией, или мониторинга терапии или мониторинга или управления вмешательством у субъекта, страдающего деменцией, или мониторинга профилактической терапии или мониторинга или управления профилактическим вмешательством у субъекта с риском развития деменции.Alternatively, the level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 determined in a physiological fluid sample of the specified subject, and the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) determined in the physiological fluid sample of the specified subject may be combined in a mathematical formula or algorithm, wherein the result of said formula or algorithm is used to diagnose dementia or determine the risk of developing dementia in a subject not suffering from dementia, or monitoring therapy or monitoring or managing an intervention in a subject suffering from dementia, or monitoring preventive therapy or monitoring or managing a preventive intervention in a subject with a risk of developing dementia.

В любом случае в одном из вариантов осуществления изобретения определяют уровень обоих маркеров: уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и уровень про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта. Оба уровня маркеров используют для проведения расчетов, которые могут представлять собой либо отношение обоих маркеров (например, отношение между зрелым ADM-NH₂ и pro-ADM или его фрагментом, либо отношение между proADM или его фрагментом и зрелым ADM-NH₂), либо математическую формулу, в которой используют оба маркера, или математический алгоритм, в котором используют оба маркера. Результатом такого отношения или математической формулы или математического алгоритма может быть значение, которое затем сравнивают с заданным пороговым значением, и это сравнение затем используют для диагностики деменции или определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией, или мониторинга терапии или мониторинга или управления вмешательством у субъекта, страдающего деменцией, или мониторинга профилактической терапии или мониторинга или управления профилактическим вмешательством у субъекта с риском развития деменции.In any case, in one embodiment of the invention, the level of both markers is determined: the level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4, determined in a sample of the physiological fluid of the specified subject, and the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) determined in the sample of the physiological fluid of the specified subject. Both levels of markers are used to make calculations, which can be either the ratio of both markers (eg, the ratio between mature ADM-NH ₂ and pro-ADM or a fragment thereof, or the ratio between proADM or a fragment thereof and mature ADM-NH ₂ ), or a mathematical formula that uses both markers, or a mathematical algorithm that uses both markers. The result of such a relationship or mathematical formula or mathematical algorithm may be a value that is then compared to a given threshold value, and this comparison is then used to diagnose dementia or determine the risk of developing dementia in a non-demented subject, or monitor therapy or monitor or guide intervention in a subject suffering from dementia, or monitoring a preventive therapy, or monitoring or managing a preventive intervention in a subject at risk of developing dementia.

В одном из вариантов осуществления объекта настоящего изобретения указанный фрагмент про-адреномедуллина выбирают из группы, содержащей PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) и CT-proADM (SEQ ID No. 6).In one embodiment of the present invention, said pro-adrenomedullin fragment is selected from the group consisting of PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) and CT -proADM (SEQ ID No. 6).

В одном из вариантов осуществления объекта настоящего изобретения пороговый уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 равен или ниже 15 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 10 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 5 пг/мл. In one embodiment of the subject matter of the present invention, the threshold level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 is equal to or below 15 pg/ml, preferably equal to or below 10 pg/ml, preferably equal to or below 5 pg/ml.

В одном из вариантов осуществления объекта настоящего изобретения пороговое отношение уровней маркеров находится в диапазоне от 0,2 до 0,75, предпочтительно от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,4 до 0,5.In one embodiment of an aspect of the present invention, the threshold ratio of marker levels is in the range of 0.2 to 0.75, preferably 0.3 to 0.6, preferably 0.4 to 0.5.

Для вычисления отношения концентрации двух маркеров предпочтительно должны быть выражены в одних и тех же единицах (например, пмоль/л).To calculate a ratio, the concentrations of the two markers should preferably be expressed in the same units (eg, pmol/L).

В одном из вариантов осуществления объекта настоящего изобретения образец физиологической жидкости выбирают из группы пациентов с легкими когнитивными нарушениями (MCI), болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией, болезнью Альцгеймера, смешанной с сосудистой деменцией, деменцией с тельцами Леви, лобно-височной деменцией, очаговыми типами деменции (такими как прогрессирующая афазия), подкорковой деменцией (такой как деменция при болезни Паркинсона) и вторичными причинами синдрома деменции (такими как внутричерепные поражения).In one embodiment of an aspect of the present invention, the body fluid sample is selected from a group of patients with mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's disease, vascular dementia, Alzheimer's disease mixed with vascular dementia, dementia with Lewy bodies, frontotemporal dementia, focal types of dementia (such as progressive aphasia), subcortical dementia (such as Parkinson's disease dementia) and secondary causes of dementia syndrome (such as intracranial lesions).

В одном из вариантов осуществления объекта настоящего изобретения образец физиологической жидкости берут у субъекта, у которого до момента взятия образца никогда не была диагностирована деменция или MCI.In one embodiment of an aspect of the present invention, a body fluid sample is collected from a subject who has never been diagnosed with dementia or MCI before the sample was collected.

В одном из вариантов осуществления объекта настоящего изобретения определяют по меньшей мере один дополнительный клинический параметр, выбранный из группы, содержащей возраст, расу, результаты тестирования психического статуса (например, по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE)), нейровизуализацию (CT, MRT, PET, SPECT), семейный анамнез, генотип ApoE4, β-амилоид 1-42 (Aβ_1-42), β-амилоид 1-40 (Aβ_1-40), общий Tau-белок, фосфорилированный Tau-белок (p-Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).In one embodiment of an aspect of the present invention, at least one additional clinical parameter selected from the group consisting of age, race, mental status testing (e.g., Mini Mental State Examination (MMSE)), neuroimaging (CT, MRT, PET, SPECT), family history, ApoE4 genotype, β-amyloid 1-42 (Aβ _1-42 ), β-amyloid 1-40 (Aβ _1-40 ), total Tau protein, phosphorylated Tau protein (p-Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).

В одном из вариантов осуществления объекта настоящего изобретения уровень указанного маркера определяют с помощью иммуноанализа.In one embodiment of the present invention, the level of said marker is determined using an immunoassay.

В одном из вариантов осуществления объекта настоящего изобретения указанный способ используют для стратификации пациентов для выбора пациента для лечения антителом к адреномедуллину (ADM) или фрагментом антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркасом для примения в профилактике и терапии деменции у субъекта, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас связывается с N-концевой частью (aa 1-21) адреномедуллина:In one embodiment of an aspect of the present invention, the method is used to stratify patients to select a patient for treatment with an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig scaffold for use in the prevention and treatment of dementia in the subject, wherein said anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold binds to the N-terminal portion (aa 1-21) of adrenomedullin:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас связывается с N-концевой частью (аа 1-21) адреномедуллина:An object of the present invention is an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein said anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM is not -Ig framework binds to the N-terminal part (aa 1-21) of adrenomedullin:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем указанный субъект имеет уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, ниже порогового уровня и/или имеет отношение маркеров, которое представляет собой отношение уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента, определенному в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и причем указанное отношение уровней маркеров ниже порогового отношения. An object of the present invention is an anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein said subject has a level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of the subject, is below the threshold level and/or has a marker ratio that is the ratio of the mature ADM-NH ₂ level according to SEQ ID No. 4 determined in a physiological fluid sample of said subject to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof determined in a physiological fluid sample of said subject, and wherein said ratio of marker levels is below a threshold ratio.

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем указанный фрагмент про-адреномедуллина выбирают из группы, содержащей PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) и CT-proADM (SEQ ID No. 6).An object of the present invention is an anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein said pro-adrenomedullin fragment is selected from the group consisting of PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) and CT-proADM (SEQ ID No. 6).

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем указанного субъекта выбирают с помощью способа, описанного выше.An object of the present invention is an anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein said subject is selected using the method described above.

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем пороговый уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 равен или ниже 15 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 10 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 5 пг/мл. An object of the present invention is an anti-adrenomedullin antibody (ADM), or an anti-adrenomedullin antibody fragment, or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein the threshold level of mature ADM-NH _{is 2} according to SEQ ID No. 4 is equal to or below 15 pg/ml, preferably equal to or below 10 pg/ml, preferably equal to or below 5 pg/ml.

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем отношение уровней маркеров находится в пределах от 0,2 до 0,75, предпочтительно от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,4 до 0,5.An object of the present invention is an anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein the marker level ratio is in the range of 0.2 to 0.75, preferably from 0.3 to 0.6, preferably from 0.4 to 0.5.

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем указанного субъекта выбирают с помощью способа, описанного выше, при этом образец физиологической жидкости выбирают из группы: крови, сыворотки, плазмы, мочи, спинномозговой жидкости (CSF) и слюны.An object of the present invention is an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein said subject is selected using the method described above, wherein a sample of physiological fluid is selected from the group: blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid (CSF) and saliva.

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем по меньшей мере один дополнительный клинический параметр выбирают из группы, содержащей возраст, расу, результаты тестирования психического статуса (например, по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE)), нейровизуализацию (CT, MRT, PET, SPECT), семейный анамнез, генотип ApoE4, β-амилоид 1-42 (Aβ_1-42), β-амилоид 1-40 (Aβ_1-40), общий Tau-белок, фосфорилированный Tau-белок (p-Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).An object of the present invention is an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein at least one additional clinical parameter is selected from the group consisting of age, race, mental status testing results (eg, Mini-Mental State Examination (MMSE)), neuroimaging (CT, MRT, PET, SPECT), family history, ApoE4 genotype, β-amyloid 1-42 (Aβ _1-42 ), β- amyloid 1-40 (Aβ _1-40 ), total Tau protein, phosphorylated Tau protein (p-Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).

Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и лечения деменции у субъекта, причем уровень указанного маркера определяют с помощью иммуноанализа.An object of the present invention is an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment, or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, the level of said marker being determined by an immunoassay.

Зрелый ADM, bio-ADM и ADM-NH₂ используются в настоящей заявке в качестве синонимов и представляют собой молекулу согласно SEQ ID No: 4.Mature ADM, bio-ADM and ADM-NH ₂ are used synonymously herein and represent the molecule of SEQ ID No: 4.

Используемый в настоящем описании термин «PAMP» включает обе присутствующие в кровотоке формы PAMP, а именно биологически неактивный PAMP, удлиненный C-терминальным глицином (PAMP-Gly), и биологически активный C-терминально амидированный PAMP (PAMP-амид). As used herein, the term “PAMP” includes both forms of PAMP present in the bloodstream, namely the biologically inactive C-terminal glycine-extended PAMP (PAMP-Gly) and the biologically active C-terminal amidated PAMP (PAMP-amide).

В конкретном варианте осуществления изобретения указанные proADM и/или его фрагменты, имеющие по меньшей мере 5 аминокислот и зрелый ADM, выбирают из группы, содержащей:In a specific embodiment of the invention, said proADM and/or fragments thereof having at least 5 amino acids and mature ADM are selected from the group consisting of:

SEQ ID No. 1 (пре-проадреномедуллин (pre-proADM)): аминокислоты 1-185SEQ ID No. 1 (pre-proadrenomedullin (pre-proADM)): amino acids 1-185

MKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFLMKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFL

SEQ ID No. 2 (N-20 терминальный пептид проадреномедуллина, PAMP): минокислоты 22-41 preproADM SEQ ID No. 2 (N-20 terminal proadrenomedullin peptide, PAMP): mino acids 22-41 preproADM

ARLDVASEF RKKWNKWALS RARLDVASEF RKKWNKWALS R

SEQ ID No. 3 (срединный проадреномедуллин, MR-proADM): минокислоты 45-92 preproADMSEQ ID No. 3 (median proadrenomedullin, MR-proADM): mino acids 45-92 preproADM

ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RVELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV

SEQ ID No. 4 (зрелый адреномедуллин (зрелый ADM); амидированный ADM; bio-ADM; hADM): аминокислоты 95-146-CONH₂ SEQ ID No. 4 (mature adrenomedullin (mature ADM); amidated ADM; bio-ADM; hADM): amino acids 95-146-CONH ₂

YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY - CONH₂ YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY - CONH ₂

SEQ ID No. 5 (адреномедуллин 1-52-Gly (ADM 1-52-Gly)): аминокислоты 95-147 preproADMSEQ ID No. 5 (adrenomedullin 1-52-Gly (ADM 1-52-Gly)): amino acids 95-147 preproADM

YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG

SEQ ID No. 6 (C-терминальный проадреномедуллин, CT-proADM): аминокислоты 148-185 preproADMSEQ ID No. 6 (C-terminal proadrenomedullin, CT-proADM): amino acids 148-185 preproADM

RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL

В конкретном варианте осуществления изобретения уровень зрелого ADM-NH₂ (SEQ ID No. 4) - иммунореактивность в физиологической жидкости указанного субъекта находится ниже порогового значения.In a specific embodiment of the invention, the level of mature ADM-NH ₂ (SEQ ID No. 4) immunoreactivity in the physiological fluid of the specified subject is below the threshold value.

В конкретном варианте осуществления изобретения уровень иммунореактивности PAMP (SEQ ID No. 2) или уровень иммунореактивности MR-proADM (SEQ ID No. 3), или уровень иммунореактивности CT-proADM (SEQ ID No. 6), или уровень иммунореактивности ADM 1-52-Gly (SEQ ID No. 5) в физиологической жидкости указанного субъекта превышает пороговое значение.In a specific embodiment, the PAMP immunoreactivity level (SEQ ID No. 2) or the MR-proADM immunoreactivity level (SEQ ID No. 3), or the CT-proADM immunoreactivity level (SEQ ID No. 6), or the ADM immunoreactivity level 1-52 -Gly (SEQ ID No. 5) in the physiological fluid of the specified subject exceeds the threshold value.

В конкретном варианте осуществления изобретения отношение уровня иммунореактивности зрелого ADM-NH₂ (SEQ ID No. 4) к уровню иммунореактивности MR-proADM (SEQ ID No. 3) в физиологической жидкости указанного субъекта ниже порогового значения.In a specific embodiment, the ratio of the level of mature ADM-NH ₂ immunoreactivity (SEQ ID No. 4) to the level of MR-proADM immunoreactivity (SEQ ID No. 3) in the physiological fluid of the subject is below a threshold value.

В конкретном варианте осуществления изобретения уровень зрелого ADM-NH₂ определяют с помощью по меньшей мере одного связующего агента, выбранного из группы: связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности зрелого ADM-NH₂ (SEQ ID No. 4), и второго связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности зрелого ADM-NH₂ (SEQ ID NO. 4).In a specific embodiment of the invention, the level of mature ADM-NH ₂ is determined using at least one coupling agent selected from the group: a coupling agent that binds to a region contained in the mature ADM-NH ₂ sequence (SEQ ID No. 4), and a second binding agent that binds to the region contained in the mature ADM-NH ₂ sequence (SEQ ID NO. 4).

В конкретном варианте осуществления изобретения уровень proADM и/или его фрагментов определяют с помощью по меньшей мере одного связующего агента, выбранного из группы: связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности MR-proADM (SEQ ID No. 3), и второго связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности MR-proADM (SEQ ID No. 3).In a specific embodiment of the invention, the level of proADM and/or fragments thereof is determined using at least one binding agent selected from the group: a binding agent that binds to a region contained in the sequence MR-proADM (SEQ ID No. 3), and a second a binding agent that binds to the region contained in the sequence MR-proADM (SEQ ID No. 3).

В конкретном варианте осуществления изобретения уровень pro-ADM и/или его фрагментов определяют с помощью по меньшей мере одного связующего агента, выбранного из группы: связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности CT-proADM (SEQ ID No. 6), и второго связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности CT-pro-ADM (SEQ ID No. 6).In a specific embodiment of the invention, the level of pro-ADM and/or fragments thereof is determined using at least one coupling agent selected from the group: a coupling agent that binds to a region contained in the sequence CT-proADM (SEQ ID No. 6), and a second binding agent that binds to a region contained in the sequence CT-pro-ADM (SEQ ID No. 6).

В конкретном варианте осуществления изобретения уровень pro-ADM и/или его фрагментов определяют с помощью по меньшей мере одного связующего агента, выбранного из группы: связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности РАМР (SEQ ID No. 2), и второго связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности РАМР (SEQ ID No. 2).In a specific embodiment of the invention, the level of pro-ADM and/or fragments thereof is determined using at least one coupling agent selected from the group: a coupling agent that binds to a region contained in the PAMP sequence (SEQ ID No. 2), and a second a binding agent that binds to the region contained in the PAMP sequence (SEQ ID No. 2).

В конкретном варианте осуществления изобретения уровень pro-ADM и/или его фрагментов определяют с помощью по меньшей мере одного связующего агента, выбранного из группы: связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности ADM 1-52-Gly (SEQ ID No. 5), и второго связующего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности ADM 1-52-Gly (SEQ ID No. 5).In a specific embodiment of the invention, the level of pro-ADM and/or fragments thereof is determined using at least one coupling agent selected from the group: a coupling agent that binds to the region contained in the ADM sequence 1-52-Gly (SEQ ID No. 5), and a second binding agent that binds to the region contained in the sequence ADM 1-52-Gly (SEQ ID No. 5).

Объектом настоящего изобретения является способ по настоящему изобретению, в котором связующий агент выбирают из группы, содержащей антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас, связывающий про-адреномедуллин или его фрагменты из по меньшей мере 5 аминокислот.An object of the present invention is a method of the present invention, wherein the binding agent is selected from the group consisting of an antibody, antibody fragment or non-Ig scaffold that binds pro-adrenomedullin or fragments thereof of at least 5 amino acids.

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором указанная физиологическая жидкость может быть выбрана из группы, содержащей кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (CSF) и слюну. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная физиологическая жидкость представляет собой образец крови. Образец крови может быть выбран из группы, содержащей цельную кровь, сыворотку и плазму. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный образец выбирают из группы, содержащей цитратную плазму человека, плазму с гепарином и плазму с EDTA.Another embodiment of the present application relates to the method according to the preceding embodiments, wherein said physiological fluid may be selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid (CSF) and saliva. In a more specific embodiment of the present invention, said physiological fluid is a blood sample. The blood sample may be selected from the group consisting of whole blood, serum and plasma. In a specific embodiment of the invention, said sample is selected from the group consisting of citrated human plasma, heparin plasma, and EDTA plasma.

Объектом настоящего изобретения является способ по настоящему изобретению, в котором указанное определение про-адреномедуллина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот у одного пациента выполняют более одного раза.The object of the present invention is a method according to the present invention, in which the specified determination of pro-adrenomedullin or fragments of at least 5 amino acids in one patient is performed more than once.

Объектом настоящего изобретения является способ по настоящему изобретению, в котором указанный мониторинг выполняют для оценки реакции указанного субъекта на предпринятые профилактические и/или терапевтические меры.An object of the present invention is the method of the present invention, wherein said monitoring is performed to assess the response of said subject to the preventive and/or therapeutic measures taken.

Объектом настоящего изобретения является способ по настоящему изобретению, который используется для стратификации указанных субъектов на группы риска.The object of the present invention is the method of the present invention, which is used to stratify these subjects into risk groups.

Используемый в настоящем изобретении термин «риск» относится к вероятности того, что субъект будет страдать от нежелательного события или эффекта (например, заболевания).As used herein, the term “risk” refers to the likelihood that a subject will suffer from an undesirable event or effect (eg, a disease).

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором снижение уровня зрелого ADM-NH₂ является прогностическим фактором повышенного риска развития деменции. Another embodiment of the present application relates to a method according to the preceding embodiments, in which a decrease in the level of mature ADM-NH ₂ is a predictor of an increased risk of developing dementia.

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором уменьшение отношения между зрелым ADM-NH₂ и proADM или его фрагментами, выбранное из группы, содержащей MR-proADM, CT-proADM, ADM-Gly и/или PAMP, является прогностическим фактором повышенного риска развития деменции.Another embodiment of the present application relates to a method according to the preceding embodiments, wherein reducing the ratio between mature ADM-NH ₂ and proADM or fragments thereof selected from the group consisting of MR-proADM, CT-proADM, ADM-Gly and/or PAMP, is a predictor of increased risk of developing dementia.

Объектом настоящего изобретения также является способ определения риска развития деменции, как определено в любом из предшествующих параграфов, причем указанный способ выполняют для стратификации указанных субъектов на группы риска, как дополнительно определено ниже. В конкретных вариантах осуществления изобретения способы используются для стратификации субъектов на группы риска, например субъектов с низким, средним или высоким риском развития деменции. Низкий риск развития деменции означает, что значение зрелого ADM-NH₂ существенно не снижен по сравнению с заданным значением у здоровых субъектов, не страдающих деменцией. Средний риск существует, когда уровень зрелого ADM-NH₂ снижен по сравнению с заданным значением у здоровых субъектов, не страдающих деменцией, и высокий риск существует, когда уровень зрелого ADM-NH₂ значительно снижен при начальном измерении и продолжает снижаться в последующем анализе.The present invention also provides a method for determining the risk of developing dementia, as defined in any of the preceding paragraphs, which method is performed to stratify said subjects into risk groups, as further defined below. In specific embodiments of the invention, the methods are used to stratify subjects into risk groups, such as subjects at low, moderate, or high risk of developing dementia. A low risk of dementia means that the mature ADM-NH ₂ value is not significantly reduced from the target value in healthy, non-demented subjects. A medium risk exists when the mature ADM-NH ₂ level is reduced from a preset value in healthy, non-demented subjects, and a high risk exists when the mature ADM-NH ₂ level is significantly reduced at the initial measurement and continues to decline in the subsequent analysis.

Риск развития деменции означает риск развития деменции в течение определенного периода времени. В конкретном варианте осуществления указанный период времени находится в пределах 10 лет или в пределах 7 лет, или в пределах 5 лет, или в пределах 2,5 лет.Dementia risk refers to the risk of developing dementia over a certain period of time. In a specific embodiment, said time period is within 10 years, or within 7 years, or within 5 years, or within 2.5 years.

Термин «повышенный уровень» означает уровень выше определенного порогового уровня.The term "elevated level" means a level above a certain threshold level.

Термин «пониженный уровень» означает уровень ниже определенного порогового уровня.The term "reduced level" means a level below a certain threshold level.

В конкретном варианте осуществления изобретения анализ используется для определения уровня зрелого ADM-NH₂, причем чувствительность указанного анализа составляет <15 пг/мл, предпочтительно <10 пг/мл, более предпочтительно <5 пг/мл.In a specific embodiment of the invention, the assay is used to determine the level of mature ADM-NH ₂ , the sensitivity of the assay being <15 pg/ml, preferably <10 pg/ml, more preferably <5 pg/ml.

В конкретном варианте осуществления изобретения анализ используется для определения уровня MR-proADM, причем чувствительность указанного анализа позволяет осуществлять количественное определение MR-proADM у здоровых субъектов и составляет <0,5 нмоль/мл, предпочтительно <0,4 нмоль/мл и более предпочтительно <0,2 нмоль/мл.In a specific embodiment, the assay is used to determine the level of MR-proADM, wherein the sensitivity of the assay is <0.5 nmol/mL, preferably <0.4 nmol/mL, and more preferably <0.4 nmol/mL for quantitation of MR-proADM in healthy subjects. 0.2 nmol/ml.

В конкретном варианте осуществления изобретения анализ используется для определения уровня CT-proADM, причем чувствительность указанного анализа позволяет осуществлять количественное определение CT-proADM у здоровых субъектов и составляет <100 пмоль/мл, предпочтительно <75 пмоль/мл и более предпочтительно <50 пмоль/мл.In a specific embodiment, the assay is used to determine the level of CT-proADM, wherein the sensitivity of the assay allows for quantification of CT-proADM in healthy subjects and is <100 pmol/ml, preferably <75 pmol/ml, and more preferably <50 pmol/ml .

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором анализ используется для определения PAMP-амида, причем чувствительность указанного анализа позволяет осуществлять количественное определение PAMP-амида у здоровых субъектов и составляет <0,3 пмоль/л, предпочтительно <0,2 пмоль/л и более предпочтительно <0,1 пмоль/л.Another embodiment of the present application relates to the method according to the previous embodiments, in which the assay is used to determine PAMP amide, and the sensitivity of the said assay allows for quantitative determination of PAMP amide in healthy subjects and is <0.3 pmol/L, preferably <0 .2 pmol/L and more preferably <0.1 pmol/L.

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором анализ используется для определения PAMP-глицина, причем чувствительность указанного анализа позволяет осуществлять количественное определение PAMP-глицина у здоровых субъектов и составляет <0,5 пмоль/л, предпочтительно <0,25 пмоль/л и более предпочтительно <0,1 пмоль/л.Another embodiment of the present application relates to a method according to the preceding embodiments, in which the assay is used to determine PAMP-glycine, and the sensitivity of the said assay allows for quantitative determination of PAMP-glycine in healthy subjects and is <0.5 pmol/L, preferably <0 .25 pmol/L and more preferably <0.1 pmol/L.

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором анализ используется для определения ADM-Gly, причем чувствительность указанного анализа позволяет осуществлять количественное определение ADM-Gly у здоровых субъектов и составляет 60 пмоль/л, предпочтительно 10 пмоль/л и более предпочтительно 2 пмоль/л.Another embodiment of the present application relates to the method according to the preceding embodiments, in which the assay is used to determine ADM-Gly, and the sensitivity of the said assay allows for quantitative determination of ADM-Gly in healthy subjects and is 60 pmol/L, preferably 10 pmol/L and more preferably 2 pmol/L.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанный связующий агент имеет сродство связывания со зрелым ADM-NH₂ или proADM и/или его фрагментами, равное по меньшей мере, 10⁷ М^-1, предпочтительно 10⁸ М^-1, предпочтительно сродство больше 10⁹ М^-1, наиболее предпочтительно больше 10¹⁰ М^-1. Специалисту в данной области известно, что более низкое сродство можно компенсировать путем применения более высокой дозы соединений, и эта мера не приведет к выходу за рамки изобретения.In a specific embodiment of the invention, said coupling agent has a binding affinity for mature ADM-NH ₂ or proADM and/or fragments thereof of at least 10 ⁷ M ^-1 , preferably 10 ⁸ M ^-1 , preferably greater than 10 ⁹ M ^{- 1} , most preferably greater than 10 ¹⁰ M ^-1 . One skilled in the art will know that lower affinity can be compensated for by using a higher dose of the compounds without departing from the scope of the invention.

Для определения сродства антител к адреномедуллину определяли кинетику связывания адреномедуллина с иммобилизованным антителом методом поверхностного плазмонного резонанса, не включающего метку, с использованием системы Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany). Для осуществления обратимой иммобилизации антител применяли антитело к мышиному Fc, ковалентно связанное с высокой плотностью с сенсорным чипом CM5 согласно инструкциям производителя (набор мышиных антител для иммобилизации; GE Healthcare), (Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1):165-173).To determine the affinity of antibodies to adrenomedullin, the binding kinetics of adrenomedullin to the immobilized antibody was determined by label-free surface plasmon resonance using the Biacore 2000 system (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany). To achieve reversible antibody immobilization, anti-mouse Fc antibody was used, covalently linked at high density to the CM5 sensor chip according to the manufacturer's instructions (Mouse Antibody Immobilization Kit; GE Healthcare), (Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1): 165-173).

В конкретном варианте осуществления изобретения указанный связующий агент выбирают из группы, содержащей антитело или фрагмент антитела или не-Ig каркас, связывающий зрелый ADM-NH₂ или proADM и/или его фрагменты.In a specific embodiment of the invention, said binding agent is selected from the group consisting of an antibody or antibody fragment or non-Ig scaffold that binds mature ADM-NH ₂ or proADM and/or fragments thereof.

В конкретном варианте осуществления изобретения анализ используют для определения уровня зрелого ADM-NH₂ и/или proADM или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот, причем такой анализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно полностью автоматизированный анализ.In a specific embodiment of the invention, the assay is used to determine the level of mature ADM-NH ₂ and/or proADM or at least 5 amino acid fragments thereof, the assay being a sandwich assay, preferably a fully automated assay.

В одном из вариантов осуществления изобретения это может быть так называемый POC-тест (в стационаре, «point-of-care»), который представляет собой технологию тестирования, позволяющую выполнять тестирование в течение менее 1 часа рядом с пациентом без необходимости использования системы полностью автоматизированного анализа. Одним из примеров этой технологии является технология иммунохроматографического анализа.In one embodiment of the invention, this may be a so-called POC test (point-of-care), which is a testing technology that allows testing to be performed in less than 1 hour near the patient without the need for a fully automated system. analysis. One example of this technology is immunochromatographic assay technology.

В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием любого метода обнаружения, включая, без ограничения, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, который предпочтительно является полностью автоматизированным. В одном из вариантов изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноферментный анализ. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, BiomerieuxVidas®, Alere Triage®, Ortho Clinical Diagnostics Vitros®.In one embodiment of the invention, such an assay is a sandwich immunoassay using any detection method, including, but not limited to, an enzyme label, a chemiluminescent label, an electrochemiluminescent label, which is preferably fully automated. In one embodiment of the invention, such an assay is a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Examples of automated or fully automated assays include assays that can be used with one of the following systems: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, BiomerieuxVidas®, Alere Triage®, Ortho Clinical Diagnostics Vitros®.

Известно множество различных видов иммуноанализа, которые могут быть использованы в анализах и способах по настоящему изобретению, к ним относятся: радиоиммуноанализ («RIA»), гомогенный иммуноферментный анализ («EMIT»), иммуноферментный анализ («ELISA»), иммуноанализ на основе реактивации апофермента («ARIS»), иммуноферментный экспресс-анализ и иммунохроматографический анализ.There are many different types of immunoassays that can be used in the assays and methods of the present invention, these include: radioimmunoassay (“RIA”), homogeneous enzyme-linked immunosorbent assay (“EMIT”), enzyme-linked immunosorbent assay (“ELISA”), reactivation-based immunoassay apoenzyme (“ARIS”), rapid enzyme immunoassay and immunochromatographic analysis.

В конкретном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из указанных двух связующих агентов является меченым для обеспечения возможности детектирования.In a specific embodiment of the invention, at least one of the two coupling agents is labeled to enable detection.

Предпочтительные способы детектирования включают иммуноанализы в различных форматах, таких как, например, радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализ, иммуноферментный анализ (ELISA), наборы сфер на основе Luminex, белковые микрочипы и форматы экспресс-тестов, такие как быстрый иммунохроматографический стрип-тест.Preferred detection methods include immunoassays in various formats, such as, for example, radioimmunoassay (RIA), chemiluminescent and fluorescent immunoassays, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Luminex-based bead arrays, protein microarrays, and rapid test formats such as rapid immunochromatographic strip. test.

В предпочтительном варианте осуществления указанную метку выбирают из группы, содержащей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку на основе радиоактивного йода.In a preferred embodiment, said label is selected from the group consisting of a chemiluminescent label, an enzyme label, a fluorescent label, a radioiodine label.

Анализы могут быть гомогенными или гетерогенными, конкурентными и неконкурентными. В одном из вариантов осуществления анализ выполняют в форме сэндвич-анализа, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, в котором молекула, подлежащая детектированию и/или количественному определению, связывается с первым антителом и со вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, сферой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или полоской, а второе антитело представляет собой антитело, которое является меченным, например красителем, радиоизотопом или реакционноспособным или каталитически активным фрагментом. Затем соответствующим методом измеряют количество меченого антитела, связанного с аналитом. Общий состав и процедуры, имеющие отношение к «сэндвич-анализам», хорошо определены и известны специалисту (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005); Hultschig et al. 2006. Curr Opin Chem Biol. 10(1):4-10).Assays can be homogeneous or heterogeneous, competitive or non-competitive. In one embodiment, the assay is performed in the form of a sandwich assay, which is a non-competitive immunoassay in which the molecule to be detected and/or quantified is bound to a first antibody and a second antibody. The first antibody may be bound to a solid phase, such as a sphere, the surface of a well or other container, a chip, or a strip, and the second antibody is an antibody that is labeled, such as a dye, a radioisotope, or a reactive or catalytically active moiety. The amount of labeled antibody bound to the analyte is then measured using an appropriate method. The general composition and procedures relevant to sandwich assays are well defined and known to those skilled in the art (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005); Hultschig et al. 2006. Curr Opin Chem Biol 10(1):4–10).

В другом варианте осуществления анализ включает две молекулы захвата, предпочтительно антитела, оба из которых присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, причем первый компонент мечения присоединен к первой молекуле захвата, причем указанный первый компонент мечения является частью системы мечения на основе гашения флуоресценции или хемилюминесценции или амплификации, и второй компонент мечения указанной системы мечения присоединен ко второй молекуле захвата, так что при связывании обеих молекул захвата с аналитом генерируется измеримый сигнал, который позволяет обнаружить образовавшиеся сэндвич-комплексы в растворе, содержащем образец.In another embodiment, the assay comprises two capture molecules, preferably antibodies, both of which are present as dispersions in a liquid reaction mixture, wherein a first labeling component is attached to the first capture molecule, wherein said first labeling component is part of a fluorescence quenching or chemiluminescence-based labeling system or amplification, and a second labeling component of said labeling system is attached to a second capture molecule such that the binding of both capture molecules to the analyte generates a measurable signal that allows detection of the resulting sandwich complexes in a solution containing the sample.

В другом варианте осуществления указанная система мечения включает криптаты редкоземельных элементов или хелаты редкоземельных элементов в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности красителем цианинового типа.In another embodiment, said labeling system comprises rare earth cryptates or rare earth chelates in combination with a fluorescent dye or chemiluminescent dye, in particular a cyanine type dye.

В контексте настоящего изобретения анализы на основе флуоресценции включают использование красителей, которые, например, могут быть выбраны из группы, содержащей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметодифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, орегон зеленый, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, этидийбромид, акридиниевые красители, карбазольные красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п. In the context of the present invention, fluorescence-based assays include the use of dyes which, for example, may be selected from the group consisting of FAM (5- or 6-carboxyfluorescein), VIC, NED, fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), IRD-700/800, cyanine dyes such as CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, xanthene, 6-carboxy-2',4',7',4,7-hexachlorofluorescein (HEX), TET, 6-carboxy-4 ',5'-dichloro-2',7'-dimethodifluorescein (JOE), N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), 5- carboxyrhodamine-6G (R6G5), 6-carboxyrhodamine-6G (RG6), rhodamine, rhodamine green, rhodamine red, rhodamine 110, BODIPY dyes such as BODIPY TMR, Oregon green, coumarins such as umbelliferone, benzimides such as Hoechst 33258 ; phenanthridines such as Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, ethidium bromide, acridinium dyes, carbazole dyes, phenoxazine dyes, porphyrin dyes, polymethine dyes and the like.

В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включают использование красителей, основанных на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в (Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed. 1993. John Wiley & Sons, Vol.15: 518-562, включенная в настоящее описание в качестве ссылки, включая ссылку на стр.551-562). Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются эфиры акридиния.In the context of the present invention, chemiluminescence-based assays include the use of dyes based on the physical principles described for chemiluminescent materials in (Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed. 1993. John Wiley & Sons, Vol. 15: 518-562, incorporated herein by reference, including the reference to pp. 551-562). Preferred chemiluminescent dyes are acridinium esters.

Как упомянуто в настоящем описании, «анализ» или «диагностический анализ» может быть любого типа, применяемый в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании анализируемого вещества с одним или более зондами захвата с определенным сродством. Что касается взаимодействия между молекулами захвата и целевыми молекулами или представляющими интерес молекулами, константа сродства предпочтительно превышает 10⁸ М^-1. As mentioned herein, the “assay” or “diagnostic assay” may be of any type used in the diagnostic field. Such an assay may be based on the binding of the analyte to one or more capture probes with a specific affinity. With regard to the interaction between capture molecules and target molecules or molecules of interest, the affinity constant is preferably greater than 10 ⁸ M ^-1 .

В контексте настоящего изобретения «связующие молекулы» представляют собой молекулы, которые можно использовать для связывания целевых молекул или молекул, представляющих интерес, т.е. аналитов (т.е. в контексте настоящего изобретения ADM-NH₂ и/или proADM и их фрагменты), из образца. Таким образом, для специфического связывания целевых молекул или представляющих интерес молекул молекулы связующего вещества должны иметь адекватную форму, как в терминах признаков, относящихся к пространственной форме, так и признаков, вязанных с поверхностью, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса. Следовательно, связывание может, например, быть опосредовано взаимодействиями на основе ионных, ван-дер-ваальсовых, пи-пи, сигма-пи, гидрофобных или водородных связей или комбинацией двух или более вышеупомянутых взаимодействий между молекулами захвата и целевыми молекулами или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения молекулы связующего вещества могут, например, быть выбраны из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу ПНК, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно, молекулы связующего вещества представляют собой антитела, включая их фрагменты с достаточным сродством по отношению к представляющей интерес мишени или молекуле, и включают рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученные из варианта цепи длиной не менее 12 аминокислот.In the context of the present invention, "binder molecules" are molecules that can be used to bind target molecules or molecules of interest, i.e. analytes (ie in the context of the present invention ADM-NH ₂ and/or proADM and fragments thereof) from the sample. Thus, to specifically bind target molecules or molecules of interest, the binder molecules must have adequate shape, both in terms of spatial shape-related features and surface-related features such as surface charge, hydrophobicity, hydrophilicity, presence or absence Lewis donors and/or acceptors. Therefore, binding may, for example, be mediated by interactions based on ionic, van der Waals, pi-pi, sigma-pi, hydrophobic or hydrogen bonds or a combination of two or more of the above interactions between capture molecules and target molecules or molecules of interest. In the context of the present invention, the binder molecules may, for example, be selected from the group consisting of a nucleic acid molecule, a carbohydrate molecule, a PNA molecule, a protein, an antibody, a peptide or a glycoprotein. Preferably, the binder molecules are antibodies, including fragments thereof, with sufficient affinity for the target or molecule of interest, and include recombinant antibodies or fragments of recombinant antibodies, as well as chemically and/or biochemically modified derivatives of said antibodies or fragments derived from a variant chains of at least 12 amino acids in length.

Хемилюминесцентная метка может представлять собой метку сложного эфира акридиния, метку стероида, включая метки изолюминола, и т.п.The chemiluminescent label may be an acridinium ester label, a steroid label, including isoluminol labels, and the like.

Метки на основе фермента могут представлять собой лактатдегидрогеназу (LDH), креатинкиназу (CPK), щелочную фосфатазу, аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), кислую фосфатазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и т.д. The enzyme-based tags may be lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CPK), alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), acid phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, etc.

В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одно из указанных двух связующих веществ связано с твердой фазой в виде магнитных частиц и полистирольных поверхностей.In one embodiment of the invention, at least one of the two binders is associated with a solid phase in the form of magnetic particles and polystyrene surfaces.

В конкретном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно из указанных двух связующих веществ связано с твердой фазой.In a specific embodiment of the invention, at least one of the two binders is associated with the solid phase.

В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение отношения уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенное в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) находится в диапазоне от 0,2 до 0,75, предпочтительно от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,4 до 0,5.In a specific embodiment of the invention, the threshold value of the mature ADM-NH ₂ level ratio according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of the specified subject, the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) is in the range of 0.2 to 0.75, preferably 0. 3 to 0.6, preferably 0.4 to 0.5.

Уровни ADM-NH₂ по настоящему изобретению или уровни proADM или его фрагменты, соответственно, определяли с помощью описанного анализа ADM-NH₂, проиллюстрированного в примерах (или анализов proADM или их фрагментов, соответственно). В других анализах упомянутые выше пороговые значения могут отличаться, если они были откалиброваны отличным от используемых в настоящем изобретении аналитических систем, способом. Следовательно, упомянутые выше пороговые значения должны применяться для таких по-другому откалиброванных анализов соответственно, с учетом отличий в калибровке. Одной из возможностей количественного определения разницы, возникающей при калибровке, является сравнительный анализ (корреляция) рассматриваемого анализа с соответствующим анализом биомаркеров, используемым в настоящем изобретении, путем измерения соответствующего биомаркера (например, bio-ADM) в образцах, используя оба метода. Другая возможность заключается в определении с помощью рассматриваемого анализа, учитывая, что данный тест имеет достаточную аналитическую чувствительность, среднего уровня биомаркеров в репрезентативной нормальной популяции, сравнении результатов со средними уровнями биомаркеров, описанными в литературе, и пересчете калибровки с учетом разницы, полученной в этом сравнении. С помощью калибровки, использованной в настоящем изобретении, были измерены образцы, полученные от нормальных (здоровых) субъектов: медианный уровень bio-ADM в плазме (зрелый ADM-NH₂) составил 13,7 пг/мл (межквартильный диапазон [IQR] 9,6-18,7 пг/мл) (Weber et al. 2017. JALM, 2(2):222-233). Levels of ADM-NH ₂ of the present invention or levels of proADM or fragments thereof, respectively, were determined using the described ADM-NH ₂ assay illustrated in the Examples (or proADM assays or fragments thereof, respectively). In other assays, the threshold values mentioned above may differ if they were calibrated in a manner different from the analytical systems used in the present invention. Therefore, the thresholds mentioned above should be applied for such differently calibrated assays accordingly, taking into account differences in calibration. One possibility to quantify the difference resulting from calibration is to compare the assay in question with the corresponding biomarker assay used in the present invention by measuring the corresponding biomarker (eg, bio-ADM) in the samples using both methods. Another possibility is to use the assay in question, given that the test has sufficient analytical sensitivity, to determine the average biomarker level in a representative normal population, compare the results with the average biomarker levels reported in the literature, and recalculate the calibration to account for the difference obtained in this comparison . Using the calibration used in the present invention, samples obtained from normal (healthy) subjects were measured: the median plasma bio-ADM level (ADM- _NH2 mature) was 13.7 pg/ml (interquartile range [IQR] 9. 6-18.7 pg/ml) (Weber et al. 2017. JALM, 2(2):222-233).

Средняя концентрация MR-proADM в плазме у нормальных (здоровых) субъектов составила 0,41 (межквартильный диапазон 0,23-0,64) нмоль/л (Smith et al. 2009. Clin Chem 55:1593-1595) согласно результатм автоматического сэндвич-флуоресцентного анализа для обнаружения MR-proADM, как описано в Caruhel et al. (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42:725-8).The median plasma concentration of MR-proADM in normal (healthy) subjects was 0.41 (interquartile range 0.23-0.64) nmol/L (Smith et al. 2009. Clin Chem 55:1593-1595) according to automated sandwich results. -fluorescence assay for detection of MR-proADM as described in Caruhel et al. (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42:725-8).

Средняя концентрация CT-proADM в плазме у нормальных здоровых субъектов (n=200) составила 77,6 пмоль/л (минимальная - 46,6 пмоль/л, максимальная - 136,2 пмоль/л), и 95%-ный процентиль составил 113,8 пмоль/л (EP 2111552 B1).The mean plasma CT-proADM concentration in normal healthy subjects (n=200) was 77.6 pmol/L (min 46.6 pmol/L, max 136.2 pmol/L), and the 95% percentile was 113.8 pmol/l (EP 2111552 B1).

Концентрация PAMP-амида в плазме у нормальных здоровых субъектов (n=51) составила 0,51±0,19 пмоль/л (среднее значение ± стандартное отклонение) (Hashida et al. 2004. Clin Biochem 37:14-21).Plasma PAMP amide concentration in normal healthy subjects (n=51) was 0.51±0.19 pmol/L (mean±standard deviation) (Hashida et al. 2004. Clin Biochem 37:14-21).

Концентрация PAMP-глицина в плазме у нормальных здоровых субъектов (n=51) составила 1,15±0,38 пмоль/л (среднее значение ± стандартное отклонение) (Hashida et al. 2004. Clin Biochem 37:14-21).Plasma PAMP-glycine concentration in normal healthy subjects (n=51) was 1.15±0.38 pmol/L (mean±standard deviation) (Hashida et al. 2004. Clin Biochem 37:14-21).

В одном из вариантов осуществления пороговое значение может быть предварительно определено следующим образом:In one embodiment, the threshold value may be predetermined as follows:

сравнением концентрации маркера в физиологической жидкости, полученной от указанного субъекта, со средним значением маркера в физиологической жидкости, полученной из ансамбля предварительно определенных образцов, полученных из случайно выбранной популяции субъектов, имеющих сопоставимые исходные условия, что и указанный субъект,comparing the concentration of a marker in a physiological fluid obtained from a specified subject with the average value of a marker in a physiological fluid obtained from an ensemble of predetermined samples obtained from a randomly selected population of subjects having comparable baseline conditions as the specified subject,

сравнением концентрации маркера в физиологической жидкости, полученной от указанного субъекта, с квантилем уровней маркера и/или его фрагментов в физиологической жидкости, полученной из ансамбля заранее определенных образцов из популяции субъектов, имеющих сопоставимые исходные условия, что и указанный субъект,comparing the concentration of a marker in a physiological fluid obtained from a specified subject with a quantile of levels of the marker and/or fragments thereof in a physiological fluid obtained from an ensemble of predetermined samples from a population of subjects having comparable baseline conditions as the specified subject,

путем вычисления, основанным на анализе пропорциональных рисков Кокса или путем вычислений индекса риска, таких как NRI (индекс чистой реклассификации) или IDI (интегрированный индекс дискриминации).by calculation based on Cox proportional hazards analysis or by risk index calculations such as NRI (Net Reclassification Index) or IDI (Integrated Discrimination Index).

Кроме того, может быть определен по меньшей мере один клинический параметр или биомаркер, выбранный из группы, содержащей: возраст, расу, результаты тестирования психического статуса (например, по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE)), нейровизуализацию (CT, MRT, PET, SPECT), семейный анамнез, генотип ApoE4, β-амилоид 1-42 (Aβ_1-42), β-милоид 1-40 (Aβ_1-40), общий Tau-белок, фосфорилированный Tau-белок (p-Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).In addition, at least one clinical parameter or biomarker may be determined, selected from the group consisting of: age, race, mental status testing (eg, Mini Mental State Examination (MMSE)), neuroimaging (CT, MRT, PET) , SPECT), family history, ApoE4 genotype, amyloid β 1-42 (Aβ _1-42 ), amyloid β 1-40 (Aβ _1-40 ), total Tau protein, phosphorylated Tau protein (p-Tau 181 , p-Tau 199, p-Tau 231).

В контексте настоящего изобретения термин «деменция» включает болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, смешанную с сосудистой деменцией, деменцию с тельцами Леви, лобно-височную деменцию, очаговые типы деменции (такие как прогрессирующая афазия), подкорковые деменции (такие как деменция при болезни Паркинсона) и вторичные причины синдрома деменции (такие как внутричерепные поражения).In the context of the present invention, the term "dementia" includes Alzheimer's disease, vascular dementia, Alzheimer's disease mixed with vascular dementia, dementia with Lewy bodies, frontotemporal dementia, focal types of dementia (such as progressive aphasia), subcortical dementias (such as dementia with Parkinson's disease) and secondary causes of dementia syndrome (such as intracranial lesions).

В более конкретном варианте осуществления изобретения указанную деменцию выбирают из группы: болезни Альцгеймера, сосудистой деменции и болезни Альцгеймера, смешанной с сосудистой деменцией.In a more specific embodiment of the invention, said dementia is selected from the group: Alzheimer's disease, vascular dementia, and Alzheimer's disease mixed with vascular dementia.

Наиболее предпочтительной упомянутой деменцией является болезнь Альцгеймера.The most preferred dementia mentioned is Alzheimer's disease.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая раскрытое в настоящем описании связующее вещество по изобретению, в частности, содержащее анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас для применения в профилактике или лечении деменции.Another object of the present invention is a pharmaceutical composition containing a binder of the invention disclosed herein, in particular containing an anti-ADM antibody or fragment of an anti-ADM antibody or an anti-ADM non-Ig scaffold for use in the prevention or treatment of dementia.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к применению раствор. In another embodiment of the present invention, said pharmaceutical composition is a solution, preferably a ready-to-use solution.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к применению раствор, содержащий PBS, рН 7,4. In another embodiment of the present invention, said pharmaceutical composition is a solution, preferably a ready-to-use solution, containing PBS, pH 7.4.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция находится в высушенном состоянии и требует восстановления перед использованием. In another embodiment of the present invention, said pharmaceutical composition is in a dried state and requires reconstitution before use.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция находится в лиофилизированном состоянии и требует восстановления перед использованием.In another embodiment of the present invention, said pharmaceutical composition is in a lyophilized state and requires reconstitution before use.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию, предназначенную для использования для профилактики и/или лечения деменции, вводят перорально, накожно, подкожно, внутрикожно, подъязычно, внутримышечно, внутриартериально, внутрицеребрально, внутрицеребровентрикулярно, интратекально, внутривенно или внутрибрюшинно. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию вводят через центральную нервную систему (ЦНС), например интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно и интратекально. In another embodiment of the present invention, said pharmaceutical composition for use in the prevention and/or treatment of dementia is administered orally, cutaneously, subcutaneously, intradermally, sublingually, intramuscularly, intraarterially, intracerebrally, intracerebroventricularly, intrathecally, intravenously or intraperitoneally. In a preferred embodiment of the present invention, said pharmaceutical composition is administered intravenously. In another preferred embodiment of the present invention, said pharmaceutical composition is administered through the central nervous system (CNS), for example intracerebrally, intracerebroventricularly and intrathecally.

Антитело по настоящему изобретению представляет собой белок, содержащий один или более полипептидов, по существу, кодируемых генами иммуноглобулина, которые специфически связываются с антигеном. Узнаваемые гены иммуноглобулина включают гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также множество генов вариабельной области иммуноглобулинов. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина обычно составляют в длину примерно 25 кДа или 214 аминокислот. Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулина обычно составляют в длину примерно 50 кДа или 446 аминокислот. Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH₂-конце (длиной примерно 110 аминокислот) и геном константной области каппа или лямбда на COOH-конце. Тяжелые цепи кодируются аналогично геном вариабельной области (длиной примерно 116 аминокислот) и одним из других генов константной области.The antibody of the present invention is a protein containing one or more polypeptides essentially encoded by immunoglobulin genes that specifically bind an antigen. Recognized immunoglobulin genes include the constant region genes kappa, lambda, alpha (IgA), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta (IgD), epsilon (IgE), and mu (IgM), as well as many immunoglobulin variable region genes. Full-length immunoglobulin light chains are typically approximately 25 kDa or 214 amino acids in length. Full-length immunoglobulin heavy chains are typically approximately 50 kDa or 446 amino acids in length. The light chains are encoded by a variable region gene at the NH ₂ -terminus (approximately 110 amino acids long) and a kappa or lambda constant region gene at the COOH-terminus. The heavy chains are encoded similarly by the variable region gene (approximately 116 amino acids long) and one of the other constant region genes.

Основной структурной единицей антитела обычно является тетрамер, который состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, каждая из которых имеет одну легкую и одну тяжелую цепи. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепей связываются с антигеном, а константные области обеспечивают эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют во множестве других форм, включая, например, Fv, Fab и (Fab')₂, а также бифункциональные гибридные антитела и единичные цепи (например, Lanzavecchia et al. 1987. Eur. J. Immunol. 17:105; Huston et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883; Bird et al. 1988, Science 242:423-426; Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed., 1984; Hunkapiller and Hood 1986. Nature 323:15-16). Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR) (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabatet al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Как отмечено выше, CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело или функциональный фрагмент антитела, специфически связанный с антигеном.The basic structural unit of an antibody is usually a tetramer, which consists of two identical pairs of immunoglobulin chains, each having one light and one heavy chain. In each pair, the variable regions of the light and heavy chains bind the antigen, and the constant regions provide effector functions. Immunoglobulins also exist in a variety of other forms, including, for example, Fv, Fab and (Fab') ₂ , as well as bifunctional hybrid antibodies and single chains (eg, Lanzavecchia et al. 1987. Eur. J. Immunol. 17:105; Huston et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883; Bird et al. 1988, Science 242:423-426; Hood et al., Immunology, Benjamin, NY, 2nd ed., 1984 ; Hunkapiller and Hood 1986. Nature 323:15-16). The variable region of an immunoglobulin light or heavy chain includes a framework region interrupted by three hypervariable regions, also called complementarity determining regions (CDRs) (see Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabatet al., US Department of Health and Human Services, 1983 ). As noted above, CDRs are primarily responsible for binding to an antigen epitope. An immune complex is an antibody, such as a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody, or a functional antibody fragment specifically associated with an antigen.

Химерные антитела являются антителами, у которых гены легкой и тяжелой цепей сконструированы как правило методами генной инженерии из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулинов, принадлежащих к разным видам. Например, вариабельные сегменты генов мышиного моноклонального антитела могут быть присоединены к человеческим константным сегментам, таким как каппа и гамма 1 или гамма 3. В одном из примеров терапевтическое химерное антитело является таким образом гибридным белком, состоящим из вариабельного или антигенсвязывающего домена мышиного антитела и константного или эффекторного домена человеческого антитела, хотя можно использовать другие виды млекопитающих, или вариабельную область можно получить методами молекулярной биологии. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области, например, см. патент США № 5,807,715). «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, включающий человеческую каркасную область и одну или более CDR нечеловеческого иммуноглобулина (апример, мыши, крысы или синтетический). Иммуноглобулин нечеловеческого происхождения, предоставляющий CDR, называют «донором», а человеческий иммуноглобулин, предоставляющий каркас, называют «акцептором». В одном из вариантов осуществления все CDR происходят из донорского иммуноглобулина в гуманизированном иммуноглобулине. Константные области не обязательно должны присутствовать, но если они имеются, они должны быть практически идентичными константным областям человеческого иммуноглобулина, т.е., идентичными на по меньшей мере примерно 85-90%, например, на примерно 95% или более. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, по существу идентичны соответствующим частям последовательностей природного человеческого иммуноглобулина. «Гуманизированное антитело» представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и иммуноглобулин с гуманизированной тяжелой цепью. Гуманизированное антитело связывается с таким же антигеном, что и донорское антитело, предоставляющее CDR. Акцепторный каркас гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество замен аминокислотами, взятыми из донорского каркаса. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые, по существу, не влияют на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Примерами консервативных замен являются такие, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины могут быть сконструированы методами генной инженерии (например, см. патент США № 5580089). Человеческое антитело представляет собой антитело, в котором гены легкой и тяжелой цепей имеют человеческое происхождение. Человеческие антитела могут быть получены способами, известными в данной области. Человеческие антитела могут быть получены путем иммортализации человеческой В-клетки, секретирующей представляющее интерес антитело. Иммортализация может быть достигнута, например, путем инфицирования EBV или путем слияния человеческой В-клетки с клеткой миеломы или гибридомы с получением клетки триомы. Человеческие антитела также могут быть получены методами фагового дисплея (см., например, Dower et al., публикация PCT WO91/17271; McCafferty et al., публикация PCT WO92/001047; и Winter, публикация PCT WO92/20791), или могут быть выбраны из библиотеки комбинаторных моноклональных человеческих антител (см. Веб-сайт Morphosys). Человеческие антитела также могут быть получены с использованием трансгенных животных, несущих ген человеческого иммуноглобулина (см., например, Lonberget al., публикацию PCT WO93/12227; и Kucherlapati, публикацию PCT WO91/10741).Chimeric antibodies are antibodies in which the genes of the light and heavy chains are constructed, usually using genetic engineering methods, from the genes of the variable and constant regions of immunoglobulins belonging to different species. For example, the variable gene segments of a murine monoclonal antibody may be fused to human constant segments, such as kappa and gamma 1 or gamma 3. In one example, a therapeutic chimeric antibody is thus a fusion protein consisting of a murine antibody variable or antigen binding domain and a constant or effector domain of a human antibody, although other mammalian species can be used, or the variable region can be obtained by molecular biology techniques. Methods for producing chimeric antibodies are well known in the art, for example, see US Pat. No. 5,807,715). A “humanized” immunoglobulin is an immunoglobulin comprising a human framework region and one or more non-human immunoglobulin CDRs (eg, mouse, rat, or synthetic). The non-human immunoglobulin that provides the CDR is called a “donor,” and the human immunoglobulin that provides the framework is called an “acceptor.” In one embodiment, all CDRs are derived from the donor immunoglobulin in the humanized immunoglobulin. The constant regions need not be present, but if present, they should be substantially identical to the human immunoglobulin constant regions, ie, at least about 85-90% identical, such as about 95% or more. Therefore, all portions of the humanized immunoglobulin, with the possible exception of the CDRs, are substantially identical to the corresponding portions of the natural human immunoglobulin sequences. A “humanized antibody” is an antibody comprising a humanized light chain and a humanized heavy chain immunoglobulin. The humanized antibody binds to the same antigen as the donor antibody providing the CDR. The acceptor scaffold of the humanized immunoglobulin or antibody may have a limited number of substitutions with amino acids taken from the donor scaffold. Humanized or other monoclonal antibodies may have additional conservative amino acid substitutions that do not substantially affect antigen binding or other immunoglobulin functions. Examples of conservative substitutions are gly, ala; val, ile, leu; asp,glu; asn,gln; ser, thr; lys, arg; and phe, tyr. Humanized immunoglobulins can be constructed by genetic engineering (eg, see US Pat. No. 5,580,089). A human antibody is an antibody in which the light and heavy chain genes are of human origin. Human antibodies can be produced by methods known in the art. Human antibodies can be produced by immortalizing a human B cell secreting the antibody of interest. Immortalization can be achieved, for example, by infection with EBV or by fusing a human B cell with a myeloma or hybridoma cell to produce a trioma cell. Human antibodies can also be produced by phage display methods (see, for example, Dower et al., PCT publication WO91/17271; McCafferty et al., PCT publication WO92/001047; and Winter, PCT publication WO92/20791), or can be selected from a library of combinatorial human monoclonal antibodies (see Morphosys website). Human antibodies can also be produced using transgenic animals carrying the human immunoglobulin gene (see, for example, Lonberget al., PCT publication WO93/12227; and Kucherlapati, PCT publication WO91/10741).

Таким образом, антитело может иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с привитыми CDR. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела, полученные рекомбинантным путем, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, например, химически связанные антитела (фрагмент, связывающий антиген), включая, без ограничения, Fab-фрагменты, включая Fab-минитела, одноцепочечные антитела Fab, моновалентное Fab-антитело с эпитопными метками, например, FAB-V5Sx2; бивалентный Fab (мини-антитело), димеризованный с доменом СН3; двухвалентный Fab или многовалентный Fab, например, образованный путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации доменов dHLX, например, FAB-dHLX-FSx2; F(ab‘)₂-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные, многовалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, бивалентные и/или биспецифические диатела, BITE® (биспецифический T-клеточный захватчик), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из класса, отличного от G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из иммуноглобулинов верблюда или рыбы, и многие другие.Thus, the antibody may be in formats known in the art. Examples are human antibodies, monoclonal antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, CDR grafted antibodies. In a preferred embodiment, the antibodies of the present invention are recombinantly produced antibodies, e.g., IgG, typical full-length immunoglobulin, or antibody fragments containing at least an F variable domain of the heavy and/or light chain, e.g., chemically linked antibodies (fragment binding antigen), including, but not limited to, Fab fragments, including Fab minibodies, single-chain Fab antibodies, monovalent epitope-tagged Fab antibody, for example, FAB-V5Sx2; bivalent Fab (mini-antibody) dimerized with a CH3 domain; divalent Fab or multivalent Fab, for example formed by multimerization with a heterologous domain, for example by dimerization of dHLX domains, for example FAB-dHLX-FSx2; F(ab') ₂ -fragments, scFv fragments, multimerized, multivalent and/or multispecific scFv fragments, bivalent and/or bispecific diabodies, BITE® (bispecific T cell invader), trifunctional antibodies, multivalent antibodies, e.g. class other than G; single-domain antibodies, for example, nanobodies derived from camel or fish immunoglobulins, and many others.

В дополнение к анти-ADM антителам в данной области техники хорошо известны другие биополимерные каркасы для получения комплексов молекулы-мишени, которые могут быть использованы для получения специфических для мишени биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины.In addition to anti-ADM antibodies, other biopolymer scaffolds for producing target molecule complexes are well known in the art, which can be used to produce target-specific biopolymers. Examples are aptamers, spiegelmers, anticalins and conotoxins.

В предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбирают из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент и scFv-Fc слитый белок. В другом предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбирают из группы, включающей scFab-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv-фрагмент и их конъюгаты, оптимизированные по биодоступности, такие как пегилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab.In a preferred embodiment, the antibody format is selected from the group consisting of Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, F(ab) ₂ fragment and scFv-Fc fusion protein. In another preferred embodiment, the antibody format is selected from the group consisting of scFab fragment, Fab fragment, scFv fragment, and bioavailability optimized conjugates thereof, such as PEGylated fragments. One of the most preferred formats is the scFab format.

Не-Ig каркасы могут быть белковыми каркасами и могут использоваться в качестве имитаторов антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Не-Ig каркасы могут быть выбраны из группы, состоящей из тетрактиновых не-Ig каркасов (например, описанных в US 2010/0028995), фибронектиновых каркасов (например, описанных в EP 1266025); липокалиновых каркасов (например, описанных в WO 2011/154420); убиквитиновых каркасов (например, описанных в WO 2011/073214), трансферриновых каркасов (например, описанных в US 2004/0023334), каркасов белка А (например, описанных в EP 2231860), каркасов на основе анкириновых повторов (например, описанных в WO 2010/060748), микропротеиновых каркасов (предпочтительно микропротеинов, образующих цистеиновый узел) (например, описанных в EP 2314308), каркасов на основе домена Fyn SH3 (например, описанных в WO 2011/023685), каркасов на основе EGFR-A домена (например, описанных в WO 2005/040229) и каркасов на основе домена Kunitz (например, описанных в EP 1941867). Non-Ig scaffolds can be protein scaffolds and can be used as antibody mimics because they are capable of binding to ligands or antigens. Non-Ig scaffolds can be selected from the group consisting of tetractin non-Ig scaffolds (eg, described in US 2010/0028995), fibronectin scaffolds (eg, described in EP 1266025); lipocalin scaffolds (for example, those described in WO 2011/154420); ubiquitin scaffolds (eg, described in WO 2011/073214), transferrin scaffolds (eg, described in US 2004/0023334), protein A scaffolds (eg, described in EP 2231860), ankyrin repeat scaffolds (eg, described in WO 2010 /060748), microprotein scaffolds (preferably cysteine knot microproteins) (for example, those described in EP 2314308), Fyn SH3 domain-based scaffolds (for example, described in WO 2011/023685), EGFR-A domain-based scaffolds (for example, described in WO 2005/040229) and Kunitz domain-based scaffolds (eg described in EP 1941867).

Кроме того, в одном из вариантов осуществления изобретения антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас является моноспецифическими.Additionally, in one embodiment, the anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or anti-ADM non-Ig framework is monospecific.

Моноспецифическое антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент моноспецифического антитела к адреномедуллину или моноспецифический анти-ADM не-Ig каркас означает, что указанное антитело или фрагмент антитела или не-Ig каркас связывается с одной конкретной областью, охватывающей по меньшей мере 5 аминокислот в целевом ADM. Моноспецифическое антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент моноспецифического антитела к адреномедуллину или моноспецифический анти-ADM не-Ig каркас представляют собой антитела к адреномедуллину (ADM) или фрагменты антител к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркасы, все из которых имеют сродство к одному и того же антигену.Monospecific adrenomedullin antibody (ADM) or monospecific anti-adrenomedullin antibody fragment or monospecific anti-ADM non-Ig scaffold means that the antibody or antibody fragment or non-Ig scaffold binds to one specific region spanning at least 5 amino acids in the target ADM . Anti-adrenomedullin monospecific antibody (ADM) or monospecific anti-adrenomedullin antibody fragment or monospecific anti-ADM non-Ig scaffold are anti-adrenomedullin antibodies (ADM) or anti-adrenomedullin antibody fragments or anti-ADM non-Ig scaffolds, all of which have an affinity for the same antigen.

В другом конкретном и предпочтительном варианте осуществления анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig-каркас, связывающий ADM, представляет собой моноспецифическое антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас, соответственно, причем моноспецифическое означает, что указанное антитело или фрагмент антитела или не-Ig каркас связывается с одной конкретной областью, охватывающей по меньшей мере 4 аминокислоты в целевом ADM. Моноспецифические антитела или фрагменты или не-Ig каркасы по изобретению представляют собой антитела или фрагменты или не-Ig каркасы, все из которых имеют сродство к одному и тому же антигену. Моноклональные антитела являются моноспецифическими, но моноспецифические антитела могут также продуцироваться другими способами, отличными от их продуцирования в обычной половой клетке. In another specific and preferred embodiment, the anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold binding ADM is a monospecific antibody, antibody fragment or non-Ig scaffold, respectively, wherein monospecific means that said antibody or antibody fragment or non-Ig framework binds to one specific region spanning at least 4 amino acids in the target ADM. Monospecific antibodies or fragments or non-Ig scaffolds of the invention are antibodies or fragments or non-Ig scaffolds that all have affinity for the same antigen. Monoclonal antibodies are monospecific, but monospecific antibodies can also be produced in ways other than their production in a normal germ cell.

Указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела, связывающий ADM, или не-Ig каркас, связывающий ADM, может представлять собой не-нейтрализующее антитело к ADM или фрагмент антитела, связывающего ADM, или не-Ig каркас, связывающий ADM.Said anti-ADM antibody or ADM-binding antibody fragment or ADM-binding non-Ig scaffold may be a non-neutralizing anti-ADM antibody or ADM-binding antibody fragment or ADM-binding non-Ig scaffold.

В конкретном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас представляет собой не-нейтрализующее антитело, фрагмент или не-Ig каркас. Нейтрализующее анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас способны блокировать биологическую активность ADM почти на 100%, по меньшей мере, более чем на 90%, предпочтительно, по меньшей мере, более чем на 95%. In a specific embodiment, said anti-ADM antibody, anti-ADM antibody fragment, or anti-ADM non-Ig scaffold is a non-neutralizing antibody, fragment, or non-Ig scaffold. A neutralizing anti-ADM antibody, anti-ADM antibody fragment, or anti-ADM non-Ig scaffold is capable of blocking the biological activity of ADM by nearly 100%, at least greater than 90%, preferably at least greater than 95% .

Напротив, не-нейтрализующее анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 100%, предпочтительно менее чем на 95%, предпочтительно менее чем на 90%, более предпочтительно менее чем на 80% и еще более предпочтительно менее чем на 50%. Это означает, что биологическая активность ADM снижается до менее чем 100%, до 95% или менее, но не более, до 90% или менее, но не более, до 80% или менее, но не более, до 50% или менее, но не более. Это означает, что остаточная биологическая активность ADM, связанного с не-нейтрализующим анти-ADM антителом или фрагментом анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркасом, будет составлять более 0%, предпочтительно более 5%, предпочтительно более 10%, более предпочтительно более 20%, более предпочтительно более 50%.In contrast, a non-neutralizing anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold blocks the biological activity of ADM by less than 100%, preferably less than 95%, preferably less than 90%, more preferably less less than 80% and even more preferably less than 50%. This means that the biological activity of ADM is reduced to less than 100%, to 95% or less but not more, to 90% or less but not more, to 80% or less but not more, to 50% or less, but not more. This means that the residual biological activity of ADM bound to a non-neutralizing anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold will be greater than 0%, preferably greater than 5%, preferably greater than 10%, greater than preferably more than 20%, more preferably more than 50%.

В этом контексте (а) молекула(ы), представляющая(ие) собой антитело или фрагмент антитела или не-Ig каркас с «не-нейтрализующей анти-ADM активностью», в совокупности обозначенные в настоящем описании для простоты как «не-нейтрализующее» анти-ADM-антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас, которые, например, блокируют биологическую активность ADM до менее чем 80%, определяется какIn this context, (a) molecule(s) that are an antibody or antibody fragment or non-Ig scaffold with "non-neutralizing anti-ADM activity", collectively referred to herein for simplicity as "non-neutralizing" anti-ADM antibody, antibody fragment or non-Ig scaffold that, for example, blocks the biological activity of ADM to less than 80%, is defined as

молекула или молекулы, связывающиеся с ADM, которая при добавлении к культуре эукариотической клеточной линии, экспрессирующей функциональный человеческий рекомбинантный рецептор ADM, состоящий из CRLR (рецептор, подобный кальцитониновому рецептору) и RAMP3 (белок 3, модифицирующий активность рецептора), уменьшает количество цАМФ, продуцируемого клеточной линией посредством действия параллельно добавленного синтетического ADM-пептида человека, причем указанный добавленный синтетический ADM человека добавляют в количестве, которое в отсутствие анализируемого не-нейтрализующего антитела приводит к полумаксимальной стимуляции синтеза цАМФ, при этом восстановление цАМФ, обусловленное связыванием указанной молекулы(молекул) с ADM, происходит в такой степени, которая составляет не более 80%, даже когда нейтрализующую молекулу(ы), связывающуюся(иеся) с анализируемым ADM, добавляют в количестве, в 10 раз превышающем количество, необходимое для достижения максимального снижения синтеза цАМФ, достигаемого с помощью анализируемого не-нейтрализующего антитела.an ADM-binding molecule or molecules that, when added to a culture of a eukaryotic cell line expressing a functional human recombinant ADM receptor consisting of CRLR (calcitonin receptor-like receptor) and RAMP3 (receptor activity-modifying protein 3), reduces the amount of cAMP produced cell line through the action of a parallel added synthetic human ADM peptide, wherein said added synthetic human ADM is added in an amount that, in the absence of the non-neutralizing antibody being analyzed, results in a half-maximal stimulation of cAMP synthesis, with the reduction of cAMP due to the binding of said molecule(s) to ADM occurs to an extent that is no more than 80%, even when the neutralizing molecule(s) binding to the ADM assay are added in an amount 10 times the amount required to achieve the maximum reduction in cAMP synthesis achieved with using a non-neutralizing antibody being analyzed.

Такое же определение применимо к другим диапазонам: 95%, 90%, 50% и т.д.The same definition applies to other ranges: 95%, 90%, 50%, etc.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig-каркас связывается с областью или эпитопом ADM, расположенным в N-концевой части (aa 1-21) адреномедуллина. In a preferred embodiment of the present invention, said anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold binds to the ADM region or epitope located in the N-terminal portion (aa 1-21) of adrenomedullin.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину или каркас анти-ADM не-Ig распознает и связывается с областью или эпитопом в пределах аминокислот 1-14 (SEQ ID No. 27) адреномедуллина; что указывает на N-концевую часть (аа 1-14) адреномедуллина. В другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину или каркас анти-ADM не-Ig распознает и связывается с областью или эпитопом в пределах аминокислот 1-10 адреномедуллина (SEQ ID No. 28); что указывает на N-концевую часть (аа 1-10) адреномедуллина.In another preferred embodiment, said anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold recognizes and binds to a region or epitope within amino acids 1-14 (SEQ ID No. 27) of adrenomedullin; which indicates the N-terminal part (aa 1-14) of adrenomedullin. In another preferred embodiment, said anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold recognizes and binds to a region or epitope within amino acids 1-10 of adrenomedullin (SEQ ID No. 28); which indicates the N-terminal part (aa 1-10) of adrenomedullin.

aa 1-14 ADM aa 1-14 ADM

YRQSMNNFQGLRSF (SEQ ID No. 27)YRQSMNNFQGLRSF (SEQ ID No. 27)

aa 1-10 ADMaa 1-10 ADM

YRQSMNNFQG (SEQ ID No. 28)YRQSMNNFQG (SEQ ID No. 28)

В другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину или каркас анти-ADM не-Ig распознает и связывается с областью или эпитопом в пределах аминокислот 1-6 адреномедуллина (SEQ ID No. 29); что указывает на N-концевую часть (аа 1-6) адреномедуллина. Как указано выше, указанная область или эпитоп предпочтительно содержит в длину по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислот.In another preferred embodiment, said anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold recognizes and binds to a region or epitope within amino acids 1-6 of adrenomedullin (SEQ ID No. 29); which indicates the N-terminal part (aa 1-6) of adrenomedullin. As stated above, said region or epitope preferably comprises at least 4 or at least 5 amino acids in length.

aa 1-6 ADM aa 1-6 ADM

YRQSMN (SEQ ID No. 29)YRQSMN (SEQ ID No. 29)

В другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас распознает и связывается с N-терминальным концом (aa1) адреномедуллина. N-терминальный конец означает аминокислоту 1, которая представляет собой «Y» в SEQ ID No. 4, 5, 21, 27, 28 or 29; и является обязательной для связывания антитела. Антитело или его фрагмент, или каркас не связывается ни с удлиненным N-концом, ни с модифицированным N-концом адреномедуллина, ни с деградированным N-концом адреномедуллина. Это означает, что в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас связывается только с областью в последовательности зрелого ADM, если N-конец ADM является свободным. В указанном варианте осуществления анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину, или не-Ig каркас не будет связываться с областью в последовательности зрелого ADM, если указанная последовательность, например, содержится в pro-ADM.In another preferred embodiment, said anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold recognizes and binds to the N-terminal end (aa1) of adrenomedullin. The N-terminal end denotes amino acid 1, which represents "Y" in SEQ ID No. 4, 5, 21, 27, 28 or 29; and is required for antibody binding. The antibody or fragment or scaffold thereof does not bind to either the extended N-terminus, the modified N-terminus of adrenomedullin, or the degraded N-terminus of adrenomedullin. This means that in another preferred embodiment of the invention, an anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig scaffold binds only to a region in the mature ADM sequence if the N-terminus of the ADM is free. In this embodiment, an anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or non-Ig scaffold will not bind to a region in the mature ADM sequence if said sequence is, for example, contained in a pro-ADM.

Для ясности, номера в скобках для конкретных областей ADM, таких как «N-концевая часть (aa 1-21)» следует понимать как то, что N-концевая часть ADM состоит из аминокислот 1-21 зрелой последовательности ADM.For clarity, numbers in parentheses for specific ADM regions such as “N-terminal portion (aa 1-21)” should be understood to mean that the N-terminal portion of ADM consists of amino acids 1-21 of the mature ADM sequence.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитела по настоящему изобретению могут быть получены следующим образом:In one embodiment, the antibodies of the present invention can be produced as follows:

Мышь Balb/c иммунизируют, используя 100 мкг конъюгата пептид ADM с BSA (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) в день 0 и день 14 и 50 мкг (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда) в день 21 и день 28. За три дня до проведения эксперимента по слиянию животным вводят 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора посредством одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции. The Balb/c mouse is immunized using 100 μg of ADM peptide-BSA conjugate (emulsified in 100 μl of Freund's complete adjuvant) on day 0 and day 14 and 50 μg (in 100 μl of Freund's incomplete adjuvant) on day 21 and day 28. Over three days Before the fusion experiment, animals are administered 50 μg of the conjugate dissolved in 100 μl of physiological solution through one intraperitoneal and one intravenous injection.

Спленоциты, взятые из организма иммунизированной мыши, и клетки миеломы линии SP2/0 сливают, используя 1 мл 50% полиэтиленгликоля, в течение 30 с при 37°С. После отмывки клетки высевают в 96-луночные планшеты для клеточной культуры. Гибридные клоны отбирают по признаку роста в среде HAT [культуральная среда RPMI 1640, дополненная 20% эмбриональной сывороткой теленка и дополненная HAT]. Через две недели HAT-среду заменяют средой HT, осуществляя три пассажа, а затем возвращают стандартную среду для культуры клеток.Splenocytes taken from the immunized mouse and SP2/0 myeloma cells were defused using 1 ml of 50% polyethylene glycol for 30 s at 37°C. After washing, cells are seeded into 96-well cell culture plates. Hybrid clones are selected for growth in HAT medium [RPMI 1640 culture medium supplemented with 20% fetal calf serum and supplemented with HAT]. After two weeks, the HAT medium is replaced with HT medium for three passages, and then the standard cell culture medium is returned.

Супернатанты клеточной культуры подвергают первичному скринингу в отношении антигенспецифических антител класса IgG через три недели после слияния. Положительные по данным теста микрокультуры переносят в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования выбранные культуры клонируют и повторно клонируют, используя метод серийных разведений, и определяют изотипы (см. также Lane 1985. J. Immunol. Meth. 81:223-228; Ziegler, B. et al. 1996 Horm. Metab. Res. 28:11-15). Cell culture supernatants are subjected to primary screening for antigen-specific IgG antibodies three weeks after confluence. Test-positive microcultures are transferred to 24-well plates for propagation. After repeated testing, selected cultures are cloned and recloned using the serial dilution method and isotypes determined (see also Lane 1985. J. Immunol. Meth. 81:223-228; Ziegler, B. et al. 1996 Horm. Metab. Res. 28:11-15).

Антитела также могут быть получены методом фагового дисплея согласно следующей процедуре:Antibodies can also be produced by phage display according to the following procedure:

Для выделения рекомбинантных одноцепочечных F-вариабельных доменов (scFv) к пептидам адреномедуллина применяют библиотеки человеческих наивных генов антител HAL7/8. Библиотеки генов антител подвергают скринингу, используя стратегию пэннинга, предусматривающую применение пептидов, которые содержат биотиновую метку, сцепленную через два разных спейсера с последовательностью пептида адреномедуллина. Для минимизации фона неспецифических связующих агентов используют комбинацию циклов пэннинга с использованием неспецифического связывания антигена и связанного со стрептавидином антигена. Фаги, элюированные после третьего цикла пэннинга, применяют для получения штаммов E.coli, экспрессирующих моноклональный scFv. Для оценки антигена с помощью ELISA используют непосредственно супернатанты, полученные после культивирования указанных клональных штаммов (см. Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152:159-170; Schütte et al. 2009. PLoS One 4, e6625).To isolate recombinant single-chain F variable domains (scFv) to adrenomedullin peptides, libraries of human naïve HAL7/8 antibody genes are used. Antibody gene libraries are screened using a panning strategy involving the use of peptides that contain a biotin tag linked through two different spacers to an adrenomedullin peptide sequence. To minimize the background of nonspecific binding agents, a combination of panning cycles using nonspecific antigen binding and streptavidin-linked antigen is used. Phages eluted after the third round of panning are used to obtain E. coli strains expressing the monoclonal scFv. For antigen assessment by ELISA, supernatants obtained from the cultivation of these clonal strains are used directly (see Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152:159-170; Schütte et al. 2009. PLoS One 4, e6625).

Гуманизацию мышиных антител можно выполнять в соответствии со следующей процедурой:Humanization of mouse antibodies can be performed according to the following procedure:

Для гуманизации антитела мышиного происхождения последовательность антитела анализируют в отношении структурных взаимодействий каркасных областей (FR) с определяющими комплементарность областями (CDR) и антигеном. На основе структурного моделирования выбирают соответствующий FR человеческого происхождения, и мышиные последовательности CDR трансплантируют на человеческий FR. Можно ввести вариации в аминокислотную последовательность CDR или FR-участков для восстановления структурных взаимодействий, которые были утеряны в результате видовой замены для FR-последовательностей. Для достижения указанного восстановления структурных взаимодействий можно применять неспецифический подход, основанный на использовании фаговых дисплейных библиотек или направленный подход, основанный на молекулярном моделировании (Almagro et al. 2008. Front Biosci. 2008; 13:1619-33).To humanize an antibody of murine origin, the antibody sequence is analyzed for structural interactions of framework regions (FRs) with complementarity determining regions (CDRs) and antigen. Based on structural modeling, an appropriate FR of human origin is selected, and murine CDR sequences are grafted onto the human FR. Variations can be introduced into the amino acid sequence of CDRs or FR regions to restore structural interactions that were lost as a result of species substitution for FR sequences. To achieve this restoration of structural interactions, a nonspecific approach based on the use of phage display libraries or a targeted approach based on molecular modeling can be used (Almagro et al. 2008. Front Biosci. 2008; 13:1619-33).

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующими вариантами осуществления, в котором анти-ADM антитело для лечения субъекта, которое связывается с N-концевой частью aa 1-21 адреномедуллина, представляет собой антитело с привитыми человеческими CDR, или фрагмент этого антитела, который связывается с ADM, причем антитело с привитыми человеческими CDR или фрагмент этого антитела содержит тяжелую цепь (Н-цепь) антитела, содержащую:Another embodiment of the present application provides a method according to the preceding embodiments, wherein the anti-ADM antibody for treating a subject that binds to the N-terminal portion of adrenomedullin aa 1-21 is a human CDR-grafted antibody, or a fragment thereof, that binds to ADM, wherein the antibody grafted with human CDRs or a fragment of this antibody contains a heavy chain (H chain) of the antibody containing:

GYTFSRYWGYTFSRYW

SEQ ID NO. 8:SEQ ID NO. 8:

ILPGSGSTILPGSGST

и/илиand/or

SEQ ID NO. 9:SEQ ID NO. 9:

TEGYEYDGFDYTEGYEYDGFDY

и/или дополнительно содержит легкую цепь (L цепь) антитела, содержащую:and/or additionally contains a light chain (L chain) of an antibody containing:

SEQ ID NO. 10:SEQ ID NO. 10:

QSIVYSNGNTYQSIVYSNGNTY

SEQ ID NO. 11: (не упоминается в списке последовательностей из-за длины из 3 аминокислот)SEQ ID NO. 11: (not mentioned in the sequence list due to length of 3 amino acids)

RVSRVS

и/илиand/or

SEQ ID NO. 12:SEQ ID NO. 12:

FQGSHIPYT.FQGSHIPYT.

В другом конкретном варианте осуществления настоящей заявки анти-ADM антитело для лечения субъекта представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, в котором тяжелая цепь содержит по меньшей мере одну CDR, выбранный из группы, содержащей:In another specific embodiment of the present application, the anti-ADM antibody for treating a subject is a human monoclonal antibody that binds to ADM, or a fragment thereof, wherein the heavy chain contains at least one CDR selected from the group consisting of:

SEQ ID NO. 7:SEQ ID NO. 7:

GYTFSRYWGYTFSRYW

SEQ ID NO. 8:SEQ ID NO. 8:

ILPGSGSTILPGSGST

SEQ ID NO. 9:SEQ ID NO. 9:

TEGYEYDGFDYTEGYEYDGFDY

и в котором легкая цепь содержит по меньшей мере одну CDR, выбранный из группы, содержащей:and wherein the light chain contains at least one CDR selected from the group consisting of:

SEQ ID NO. 10:SEQ ID NO. 10:

QSIVYSNGNTYQSIVYSNGNTY

RVSRVS

SEQ ID NO. 12:SEQ ID NO. 12:

FQGSHIPYT.FQGSHIPYT.

В другом варианте осуществления настоящей заявки анти-ADM антитело для лечения субъекта представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, в котором тяжелая цепь содержит последовательности In another embodiment of the present application, the anti-ADM antibody for treating a subject is a human monoclonal antibody that binds to ADM, or a fragment of this antibody, in which the heavy chain contains the sequences

SEQ ID NO. 7:SEQ ID NO. 7:

GYTFSRYWGYTFSRYW

SEQ ID NO. 8:SEQ ID NO. 8:

ILPGSGSTILPGSGST

SEQ ID NO. 9:SEQ ID NO. 9:

TEGYEYDGFDYTEGYEYDGFDY

и в котором легкая цепь содержит последовательностиand in which the light chain contains the sequences

SEQ ID NO. 10:SEQ ID NO. 10:

QSIVYSNGNTYQSIVYSNGNTY

RVSRVS

SEQ ID NO. 12:SEQ ID NO. 12:

FQGSHIPYT.FQGSHIPYT.

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующему варианту осуществления, где указанное антитело или фрагмент для лечения представляет собой человеческое моноклональное антитело или фрагмент, который связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, в котором тяжелая цепь содержит последовательностиAnother embodiment of the present application relates to the method according to the preceding embodiment, wherein said antibody or fragment for treatment is a human monoclonal antibody or fragment that binds to ADM, or a fragment of this antibody in which the heavy chain contains the sequences

CDR1: SEQ ID NO. 7:CDR1: SEQ ID NO. 7:

GYTFSRYWGYTFSRYW

CDR2: SEQ ID NO. 8:CDR2: SEQ ID NO. 8:

ILPGSGSTILPGSGST

CDR3: SEQ ID NO. 9:CDR3: SEQ ID NO. 9:

TEGYEYDGFDYTEGYEYDGFDY

CDR1: SEQ ID NO. 10:CDR1: SEQ ID NO. 10:

QSIVYSNGNTYQSIVYSNGNTY

CDR2: SEQ ID NO. 11: (не упоминается в списке последовательностей из-за длины из 3 аминокислот)CDR2: SEQ ID NO. 11: (not mentioned in the sequence list due to length of 3 amino acids)

RVSRVS

CDR3: SEQ ID NO. 12:CDR3: SEQ ID NO. 12:

FQGSHIPYT.FQGSHIPYT.

Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующему варианту осуществления, в котором указанное антитело или фрагмент для лечения содержит следующие последовательности в качестве области VH:Another embodiment of the present application relates to the method according to the preceding embodiment, wherein said antibody or fragment for treatment contains the following sequences as the VH region:

SEQ ID NO. 13 (AM-VH-C):SEQ ID NO. 13 (AM-VH-C):

QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILP

GSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFD

YWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR

VEPKHHHHHHVEPKHHHHHH

SEQ ID NO. 14 (AM-VH1):SEQ ID NO. 14 (AM-VH1):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRIL

PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD

YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

VEPKHHHHHHVEPKHHHHHH

SEQ ID NO. 15 (AM-VH2-E40):SEQ ID NO. 15 (AM-VH2-E40):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRIL

VEPKHHHHHHVEPKHHHHHH

SEQ ID NO. 16 (AM-VH3-T26-E55):SEQ ID NO. 16 (AM-VH3-T26-E55):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEIL

VEPKHHHHHH; илиVEPKHHHHHH; or

SEQ ID NO. 17 (AM-VH4-T26-E40-E55):SEQ ID NO. 17 (AM-VH4-T26-E40-E55):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEIL

VEPKHHHHHH;VEPKHHHHHH;

и содержит следующую последовательность в качестве области VL:and contains the following sequence as the VL region:

SEQ ID NO. 18 (AM-VL-C):SEQ ID NO. 18 (AM-VL-C):

DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRDVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYR

VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLE

IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS

QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE

CC

SEQ ID NO. 19 (AM-VL1):SEQ ID NO. 19 (AM-VL1):

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYR

VSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKL

EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN

SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG

ECE.C.

SEQ ID NO. 20 (AM-VL2-E40):SEQ ID NO. 20 (AM-VL2-E40):

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

Приведенные ниже варианты осуществления являются объектом настоящего изобретения:The following embodiments are the subject of the present invention:

1) Способ:1) Method:

причемand

2) Способ:2) Method:

в котором определяют отношение маркеров, которое может представлять собой отношение уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента (который является незрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4), определенному в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и причем указанное отношение маркеров сравнивают с пороговым отношением,wherein a marker ratio is determined, which may be a mature ADM-NH ₂ level ratio according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of the specified subject, to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is immature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) determined in the physiological fluid sample of the specified subject, and wherein the specified ratio of markers is compared with a threshold attitude,

причемand

а) у указанного субъекта диагностируют деменцию, если отношение маркеров зрелый ADM-NH₂/про-адреномедуллин или его фрагмент ниже указанного порогового значения, или причемa) the specified subject is diagnosed with dementia if the ratio of markers mature ADM-NH ₂ /pro-adrenomedullin or fragment thereof is below a specified threshold value, or wherein

b) указанный субъект имеет повышенный риск развития деменции, если отношение маркеров зрелый ADM-NH₂/про-адреномедуллин или его фрагмент ниже указанного порогового значения, или причемb) the specified subject has an increased risk of developing dementia if the ratio of markers mature ADM-NH ₂ /pro-adrenomedullin or fragment thereof is below a specified threshold value, or wherein

c) статус субъекта, страдающего деменцией или имеющего риск развития деменции, улучшается при терапии или вмешательстве, если указанное отношение маркеров увеличивается во время курса терапии или вмешательства,c) the status of the subject suffering from dementia or at risk of developing dementia improves with therapy or intervention if the specified marker ratio increases during the course of therapy or intervention,

или альтернативно к вышеуказанному отношению маркеров, уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 определяют в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и уровень про-адреномедуллина или его фрагмента (который не является зрелым ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4) определяют в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и оба определенных уровня объединяют в математическом алгоритме, причем результат указанного математического алгоритма используют для диагностики деменции или определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией, или мониторинга терапии или мониторинга или управления вмешательством у субъекта, страдающего деменцией, или мониторинга профилактической терапии или мониторинга или управления профилактическим вмешательством у субъекта с риском развития деменции.or alternatively to the above marker ratio, the level of mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4 is determined in a sample of the physiological fluid of the specified subject, and the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof (which is not mature ADM-NH ₂ according to SEQ ID No. 4) is determined in the sample of the physiological fluid of the specified subject, and both determined levels are combined in a mathematical algorithm, wherein the result of said mathematical algorithm is used to diagnose dementia or determine the risk of developing dementia in a subject not suffering from dementia, or monitoring therapy or monitoring or managing an intervention in a subject suffering from dementia, or monitoring preventive therapy or monitoring or managing a preventive intervention in a subject at risk of developing dementia.

3. Способ по п.2, в котором указанный фрагмент про-адреномедуллина выбирают из группы, содержащей PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID).No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) и CT-proADM (SEQ ID No. 6).3. The method according to claim 2, wherein said pro-adrenomedullin fragment is selected from the group consisting of PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID).No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) and CT-proADM (SEQ ID No. 6).

4. Способ по п.1, в котором пороговый уровень зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4 равен или ниже 15 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 10 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 5 пг/мл. 4. The method according to claim 1, wherein the threshold level of mature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4 is equal to or below 15 pg/ml, preferably equal to or below 10 pg/ml, preferably equal to or below 5 pg/ml.

5. Способ по п.2 или п.3, в котором пороговое отношение находится в диапазоне от 0,2 до 0,75, предпочтительно от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,4 до 0,5.5. The method according to claim 2 or claim 3, wherein the threshold ratio is in the range of 0.2 to 0.75, preferably 0.3 to 0.6, preferably 0.4 to 0.5.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный образец выбирают из группы: крови, сыворотки, плазмы, мочи, спинномозговой жидкости (CSF) и слюны.6. A method as claimed in any one of the preceding claims, wherein said sample is selected from the group of: blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid (CSF) and saliva.

7. Способ по пп.1-6, в котором образец физиологической жидкости берут у субъекта, у которого на момент взятия образца не была диагностирована деменции или MCI.7. The method of claims 1 to 6, wherein the body fluid sample is collected from a subject who has not been diagnosed with dementia or MCI at the time of sample collection.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере один дополнительный клинический параметр выбирают из группы, содержащей возраст, расу, результаты тестирования психического статуса (например, по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE)), нейровизуализацию (CT, MRT, PET, SPECT), семейный анамнез, генотип ApoE4, β-амилоид 1-42 (Aβ_1-42), β-амилоид 1-40 (Aβ_1-40), общий Tau-белок, фосфорилированный Tau-белок (p-Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).8. The method of any one of the preceding claims, wherein the at least one additional clinical parameter is selected from the group consisting of age, race, mental status testing (eg, Mini Mental State Examination (MMSE)), neuroimaging (CT, MRT) , PET, SPECT), family history, ApoE4 genotype, β-amyloid 1-42 (Aβ _1-42 ), β-amyloid 1-40 (Aβ _1-40 ), total Tau protein, phosphorylated Tau protein (p- Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором уровень указанного маркера определяют с помощью иммуноанализа.9. A method according to any one of the preceding claims, wherein the level of said marker is determined using an immunoassay.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, который используется для стратификации пациентов для выбора пациента для лечения антителом к адреномедуллину (ADM) или фрагментом антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркасом для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас связывается с N-концевой частью (aa 10-21) адреномедуллина:10. A method according to any of the preceding claims, which is used for stratifying patients to select a patient for treatment with an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in the subject, wherein said anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold binds to the N-terminal portion (aa 10-21) of adrenomedullin:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).

11. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас связывается с N-концевой частью (аа 1-21) адреномедуллина: 11. An anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject, wherein said anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig the framework binds to the N-terminal part (aa 1-21) of adrenomedullin:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No. 21).

12. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по п.11, причем указанный субъект имеет уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, ниже порогового уровня и/или имеет отношение маркеров, которое представляет собой отношение уровня зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента, определенному в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и причем указанное отношение уровней маркеров ниже порогового отношения.12. An anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claim 11, wherein said subject has a mature ADM-NH level of ₂ according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of the subject, is below the threshold level and/or has a marker ratio that is the ratio of the mature ADM-NH ₂ level according to SEQ ID No. 4 determined in a physiological fluid sample of said subject to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof determined in a physiological fluid sample of said subject, and wherein said ratio of marker levels is below a threshold ratio.

13. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по п.12, причем указанный фрагмент про-адреномедуллина выбирают из группы, содержащей PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) и CT-proADM (SEQ ID No. 6).13. An anti-adrenomedullin (ADM) antibody or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claim 12, wherein said pro-adrenomedullin fragment is selected from the group consisting of PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) and CT-proADM (SEQ ID No. 6).

14. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по пп.11-13, причем указанного пациента выбирают с помощью способа по п.10. 14. An anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment, or an anti-ADM non-Ig scaffold for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claims 11 to 13, wherein said patient is selected using the method of claim 10.

15. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по любому из пп.12-14, причем пороговый уровень зрелого ADM-NH₂ согласно SEQ ID No. 4 равен или ниже 15 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 10 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 5 пг/мл. 15. An anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment, or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to any one of claims 12 to 14, wherein the threshold level of mature ADM-NH _{is 2} according to SEQ ID No. 4 is equal to or below 15 pg/ml, preferably equal to or below 10 pg/ml, preferably equal to or below 5 pg/ml.

16. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по пп.12-14, причем отношение уровней маркеров находится в пределах от 0,2 до 0,75, предпочтительно от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,4 до 0,5.16. An anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claims 12 to 14, wherein the ratio of marker levels is in the range of 0.2 to 0 .75, preferably from 0.3 to 0.6, preferably from 0.4 to 0.5.

17. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по пп.11-16, причем указанного субъекта выбирают с помощью способа по п.10 и причем образец физиологической жидкости выбирают из группы: крови, сыворотки, плазмы, мочи, спинномозговой жидкости (CSF) и слюны.17. An anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claims 11 to 16, wherein said subject is selected using the method according to claim 10, and wherein the physiological fluid sample is selected from the group: blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid (CSF) and saliva.

18. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по пп.11-16, причем по меньшей мере один дополнительный клинический параметр выбирают из группы, содержащей возраст, расу, результаты тестирования психического статуса (например, по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE)), нейровизуализацию (CT, MRT, PET, SPECT), семейный анамнез, генотип ApoE4, β-амилоид 1-42 (Aβ_1-42), β-амилоид 1-40 (Aβ_1-40), общий Tau-белок, фосфорилированный Tau-белок (p-Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).18. An anti-adrenomedullin (ADM) antibody or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claims 11 to 16, wherein at least one additional clinical parameter is selected from the group consisting of: age, race, mental status testing (eg, Mini Mental State Examination (MMSE)), neuroimaging (CT, MRT, PET, SPECT), family history, ApoE4 genotype, amyloid β 1-42 (Aβ _1-42 ), β-amyloid 1-40 (Aβ _1-40 ), total Tau protein, phosphorylated Tau protein (p-Tau 181, p-Tau 199, p-Tau 231).

19. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по пп.12-18, причем уровень указанного маркера определяют с помощью иммуноанализа.19. An anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment, or an anti-ADM non-Ig framework for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claims 12 to 18, wherein the level of said marker is determined by an immunoassay.

20. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент анти-ADM антитела, связывающий адреномедуллин, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающий адреномедуллин, для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по пп.12-19, причем указанное антитело или его фрагмент или каркас имеют сродство связывания с ADM, составляющее по меньшей мере 10^-7 М.20. An anti-adrenomedullin (ADM) antibody or an anti-ADM antibody fragment that binds adrenomedullin, or an anti-ADM non-Ig scaffold that binds adrenomedullin, for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claims 12 to 19, wherein said antibody or its fragment or framework has a binding affinity for ADM of at least 10 ^-7 M.

21. Анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по пп.12-20, причем указанное антитело или фрагмент, или каркас распознает и связывается с N-терминальным концом (аа 1) адреномедуллина.21. An anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig scaffold for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claims 12-20, wherein said antibody or fragment or scaffold recognizes and binds to the N-terminal end (aa 1) of adrenomedullin.

22. Анти-ADM антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения для профилактики и терапии деменции у субъекта по пп.12-21, причем указанное антитело или фрагмент, или каркас блокирует биологическую активность ADM не более чем на 80%, предпочтительно не более чем на 50%.22. An anti-ADM antibody or anti-adrenomedullin antibody fragment, or an anti-ADM non-Ig scaffold for use in the prevention and treatment of dementia in a subject according to claims 12 to 21, wherein said antibody or fragment or scaffold blocks the biological activity of ADM no more than less than 80%, preferably no more than 50%.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙDESCRIPTION OF DRAWINGS

Фиг.1Fig.1

На фиг.1 показана типичная кривая зависимости доза bio-ADM/сигнал и кривая зависимости сигнала от дозы bio-ADM в присутствии 100 мкг/мл антитела NT-H.Figure 1 shows a typical bio-ADM dose/signal curve and a bio-ADM signal/dose curve in the presence of 100 μg/ml NT-H antibody.

Фиг.2Fig.2

На фиг. 2 показаны концентрации bio-ADM в когорте MPP и в независимой когорте с болезнью Альцгеймера.In fig. Figure 2 shows bio-ADM concentrations in the MPP cohort and an independent Alzheimer's disease cohort.

Фиг.3Fig.3

На фиг. 3 показан график Каплана-Мейера для концентраций bio-ADM в когорте MPP для прогнозирования болезни Альцгеймера. In fig. Figure 3 shows a Kaplan-Meier plot of bio-ADM concentrations in the MPP cohort to predict Alzheimer's disease.

Фиг.4Fig.4

На фиг.4 представлена блочная диаграмма концентраций bio-ADM в подгруппе когорты MPP (случай-контроль) для прогнозирования болезни Альцгеймера и в независимой когорте с AD. Figure 4 presents a boxplot of bio-ADM concentrations in a subset of the MPP cohort (case-control) for predicting Alzheimer's disease and in the independent AD cohort.

Фиг.5Fig.5

На фиг. 5 представлена блочная диаграмма концентраций MR-proADM в подгруппе когорты MPP (случай-контроль) для прогнозирования болезни Альцгеймера. In fig. Figure 5 shows a boxplot of MR-proADM concentrations in a subgroup of the MPP (case-control) cohort for predicting Alzheimer's disease.

Фиг.6Fig.6

На фиг. 6 показана блочная диаграмма отношения bio-ADM/MR-proADM в подгруппе когорты MPP (случай-контроль) для прогнозирования болезни Альцгеймера.In fig. Figure 6 shows a boxplot of the bio-ADM/MR-proADM ratio in a subgroup of the MPP (case-control) cohort for predicting Alzheimer's disease.

Фиг.7Fig.7

На фиг. 7 показан ROC-график bio-ADM (A) и отношения bio-ADM к MR-proADM (B) в подгруппе когорты MPP (случай-контроль) для прогнозирования болезни Альцгеймера.In fig. Figure 7 shows an ROC plot of bio-ADM (A) and the ratio of bio-ADM to MR-proADM (B) in a subset of the MPP (case-control) cohort for predicting Alzheimer's disease.

Фиг.8Fig.8

На фиг. 8 показаны значения bio-ADM у здоровых людей после введения NT-H антитела. In fig. 8 shows bio-ADM values in healthy subjects after administration of NT-H antibody.

ПримерыExamples

Пример 1Example 1

Создание антител и определение их констант сродства Creation of antibodies and determination of their affinity constants

Получали несколько человеческих и мышиных антител и определяли их константы сродства (см. Таблицу 1).Several human and mouse antibodies were prepared and their affinity constants were determined (see Table 1).

Пептиды/конъюгаты для иммунизации:Peptides/conjugates for immunization:

Синтезировали пептиды для иммунизации, см. Таблицу 1 (JPT Technologies, Berlin, Germany) с дополнительным N-концевым остатком цистеина (если цистеин отсутствовал в выбранной последовательности ADM) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA с использованием связующего геля Sulfolink (Perbio-Science, Bonn, Germany). Процедуру связывания выполняли в соответствии с руководством Perbio.Immunization peptides were synthesized, see Table 1 (JPT Technologies, Berlin, Germany) with an additional N-terminal cysteine residue (if cysteine was not present in the selected ADM sequence) for conjugation of the peptides to bovine serum albumin (BSA). Peptides were covalently linked to BSA using Sulfolink coupling gel (Perbio-Science, Bonn, Germany). The coupling procedure was performed according to the Perbio manual.

Мышиные антитела получали следующим способом:Mouse antibodies were obtained as follows:

Мышь Balb/c иммунизировали, используя 100 мкг конъюгата пептид-BSA (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) в день 0 и день 14 и 50 мкг (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда) в день 21 и день 28. За три дня до проведения эксперимента по слиянию животным вводили 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора посредством одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции. Balb/c mice were immunized using 100 μg of peptide-BSA conjugate (emulsified in 100 μl of Freund's complete adjuvant) on day 0 and day 14 and 50 μg (in 100 μl of Freund's incomplete adjuvant) on day 21 and day 28. Three days before During the fusion experiment, animals were injected with 50 μg of the conjugate dissolved in 100 μl of physiological solution through one intraperitoneal and one intravenous injection.

Спленоциты, взятые из организма иммунизированной мыши, и клетки миеломы линии SP2/0 сливали, используя 1 мл 50% полиэтиленгликоля, в течение 30 с при 37°С. После отмывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для клеточной культуры. Гибридные клоны отбирали по признаку роста в среде HAT [культуральная среда RPMI 1640, дополненная 20% эмбриональной сывороткой теленка и дополненная HAT]. Через две недели HAT-среду заменяли средой HT, осуществляя три пассажа, а затем возвращали стандартную среду для культуры клеток.Splenocytes taken from the immunized mouse and SP2/0 myeloma cells were defused using 1 ml of 50% polyethylene glycol for 30 s at 37°C. After washing, cells were seeded into 96-well cell culture plates. Hybrid clones were selected for growth in HAT medium [RPMI 1640 culture medium supplemented with 20% fetal calf serum and supplemented with HAT]. After two weeks, the HAT medium was replaced with HT medium for three passages, and then the standard cell culture medium was returned.

Супернатанты клеточной культуры подвергали первичному скринингу в отношении антигенспецифических антител класса IgG через три недели после слияния. Положительные по данным теста микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования выбранные культуры клонировали и повторно клонировали, используя метод серийных разведений, и определяли изотипы (см. также Lane 1985. J. Immunol. Meth. 81:223-228; Ziegler, B. et al. 1996 Horm. Metab. Res. 28:11-15). Cell culture supernatants were subjected to primary screening for antigen-specific IgG antibodies three weeks after confluence. Test-positive microcultures were transferred to 24-well plates for propagation. After repeated testing, selected cultures were cloned and recloned using the serial dilution method and isotypes determined (see also Lane 1985. J. Immunol. Meth. 81:223-228; Ziegler, B. et al. 1996 Horm. Metab. Res. 28:11-15).

Получение мышиных моноклональных антител:Preparation of mouse monoclonal antibodies:

Антитела получали стандартными методами получения антител (Marx et al., 1997. 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121) и очищали на белке А. Чистота антител составляла >95% по результатам анализа SDS-гель-электрофореза.Antibodies were prepared by standard antibody production methods (Marx et al., 1997. 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121) and purified on protein A. Antibody purity was >95% by SDS gel electrophoresis analysis.

Человеческие нтитела:Human antibodies:

Человеческие антитела получали с помощью фагового дисплея согласно следующей процедуре:Human antibodies were generated using phage display according to the following procedure:

Для выделения рекомбинантных одноцепочечных F-вариабельных доменов (scFv) к пептиду ADM применяли библиотеки человеческих наивных генов антитела HAL7/8. Библиотеки генов антител подвергали скринингу, используя стратегию пэннинга, предусматривающую применение пептидов, содержащих биотиновую метку, сцепленную через два разных спейсера с последовательностью пептида ADM. Для минимизации фона неспецифических связующих агентов применяли комбинацию циклов пэннинга с использованием неспецифически связанного антигена и связанного со стрептавидином антигена. Фаги, элюированные после третьего цикла пэннинга, применяли для получения штаммов E.coli, экспрессирующих моноклональные scFv. Для оценки антигена с помощью ELISA использовали непосредственно супернатант, полученные после культивирования указанных клональных штаммов (см. также Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte et al. 2009. PLoS One 4, e6625). To isolate recombinant single-chain F variable domains (scFv) to the ADM peptide, human naïve gene libraries of the HAL7/8 antibody were used. Antibody gene libraries were screened using a panning strategy involving the use of peptides containing a biotin tag linked through two different spacers to an ADM peptide sequence. A combination of panning cycles using nonspecifically bound antigen and streptavidin-bound antigen was used to minimize the background of nonspecific binding agents. Phages eluted after the third round of panning were used to generate E. coli strains expressing monoclonal scFvs. For antigen assessment by ELISA, the supernatant obtained after culturing the indicated clonal strains was used directly (see also Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte et al. 2009. PLoS One 4, e6625).

Положительные клоны отбирали на основе сигнала ELISA, положительного в отношении антигена и отрицательного в отношении сенсибилизированных стрептавидином титрационных микропланшетов. Для дальнейшей характеризации открытую рамку считывания scFv клонировали в экспрессиионной плазмиде pOPE107 (Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170), выделяли из супернатанта культуры с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов и очищали с помощью эксклюзионной хроматографии. Positive clones were selected based on ELISA signal positive for the antigen and negative for the streptavidin-sensitized microtiter plates. For further characterization, the scFv open reading frame was cloned into the expression plasmid pOPE107 (Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170), isolated from the culture supernatant by metal ion affinity chromatography, and purified by size exclusion chromatography.

Константы сродстваAffinity constants

Для определения сродства антител к ADM определяли кинетику связывания ADM с иммобилизованным антителом методом поверхностного плазмонного резонанса, не включающего метку, используя систему Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany). Для осуществления обратимой иммобилизации антител применяли антитело к мышиному Fc, ковалентно связанное с высокой плотностью с сенсорным чипом CM5 согласно инструкциям производителя (набор мышиных антител для иммобилизации; GE Healthcare), (Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1):165-173).To determine the affinity of antibodies to ADM, the binding kinetics of ADM to the immobilized antibody was determined by label-free surface plasmon resonance using the Biacore 2000 system (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany). To achieve reversible antibody immobilization, anti-mouse Fc antibody was used, covalently linked at high density to the CM5 sensor chip according to the manufacturer's instructions (Mouse Antibody Immobilization Kit; GE Healthcare), (Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1): 165-173).

Получали моноклональные антитела к указанным ниже областям человеческого ADM и мышиного ADM, соответственно. В приведенной ниже таблице представлен набор полученных антител, которые использовали в дальнейших экспериментах. Выбор был основан на области-мишени: Monoclonal antibodies were generated to the following regions of human ADM and mouse ADM, respectively. The table below shows the set of antibodies obtained that were used in further experiments. The selection was based on the target area:

Таблица 1:Table 1:

Номер последовательностиSequence number Антиген/ИммуногенAntigen/Immunogen Область ADM ADM area ОбозначениеDesignation Константы сродства
Kd (M)Affinity constants
Kd(M) SEQ ID: 21SEQ ID: 21 YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC 1-211-21 NT-HNT-H 5,9×10^-9 5.9×10 ^-9 SEQ ID: 22SEQ ID: 22 CTVQKLAHQIYQCTVQKLAHQIYQ 21-3221-32 MR-HMR-H 2×10^-9 2×10 ^-9 SEQ ID: 23SEQ ID: 23 CAPRSKISPQGY-NH₂ CAPRSKISPQGY-NH ₂ C-42-52C-42-52 CT-HCT-H 1,1×10^-9 1.1×10 ^-9 SEQ ID: 24SEQ ID: 24 YRQSMNQGSRSNGCRFGTCYRQSMNQGSRSNGCRFGTC 1-191-19 NT-M NT-M 3,9×10^-9 3.9×10 ^-9 SEQ ID: 25SEQ ID: 25 CTFQKLAHQIYQCTFQKLAHQIYQ 19-3119-31 MR-MMR-M 4,5×10^-10 4.5×10 ^-10 SEQ ID: 26SEQ ID: 26 CAPRNKISPQGY-NH₂ CAPRNKISPQGY-NH ₂ C-40-50C-40-50 CT-MCT-M 9×10^-9 9×10 ^-9

Создание фрагментов антител ферментативным расщеплением: Creation of antibody fragments by enzymatic cleavage:

Для получения фрагментов Fab и F(ab)₂ применяли ферментативное расщепление мышиного полноразмерного антитела NT-M. Антитело NT-M расщепляли, используя a) набор на основе пепсина для получения F(ab)₂ (Pierce 44988) и b) набор на основе папаина для получения Fab (Pierce 44985). Процедуры фрагментации выполняли согласно инструкциями производителя. В случае F(ab)₂-фрагментации процедуру расщепления осуществляли в течение 8 часов при 37°С. Расщепление с получением Fab-фрагментов осуществляли в течение 16 часов, соответственно.Enzymatic digestion of the mouse full-length NT-M antibody was used to obtain Fab and F(ab) ₂ fragments. Antibody NT-M was digested using a) a pepsin-based F(ab) ₂ kit (Pierce 44988) and b) a papain-based Fab kit (Pierce 44985). Fragmentation procedures were performed according to the manufacturer's instructions. In the case of F(ab) ₂ fragmentation, the digestion procedure was carried out for 8 hours at 37°C. Digestion to produce Fab fragments was carried out for 16 hours, respectively.

Процедура получения и очистка Fab Fab production procedure and purification

Иммобилизованный папаин уравновешивали путем отмывки смолы, используя 0,5 мл буфера для расщепления и путем центрифугирования на колонке при 5000 × g в течение 1 минуты. Затем буфер отбрасывали. Подготавливали обессоливающую колонку путем удаления раствора, в котором она хранилась, и отмывки ее буфером для расщепления с последующим центрифугированием каждый раз при 1000×g в течение 2 минут. В трубу вращающейся колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный папаин, добавляли по 0,5 мл полученного образца IgG. Расщепляемую реакционную смесь инкубировали в течение 16 часов на настольном шейкере при 37°С. Колонку центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты для отделения продуктов расщепления от иммобилизованного папаина. После этого смолу отмывали 0,5 мл PBS и центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты. Полученную при отмывке фракцию добавляли к расщепленному антителу, в результате общий объем образца составил 1,0 мл. Колонку, заполненную NAb-белком A, уравновешивали PBS и буфером для элюиции IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты для удаления раствора, в котором осуществляли хранение (содержащем 0,02% азида натрия), и уравновешивали, добавляя 2 мл PBS, снова центрифугировали в течение 1 минуты, и прошедший через колонку элюат отбрасывали. Образец вносили в колонку и ресуспендировали путем переворачивания. Инкубацию проводили при комнатной температуре при перемешивании в течение 10 минут. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты, получая элюат, содержащий Fab-фрагменты. (Ссылки: Coulter and Harris 1983. J. Immunol. Meth. 59, 199-203.; Lindner et al. 2010. Cancer Res. 70, 277-87; Kaufmann et al. 2010. PNAS. 107, 18950-5.; Chen et al. 2010. PNAS. 107, 14727-32; Uysal et al. 2009 J. Exp. Med. 206, 449-62; Thomas et al. 2009. J. Exp. Med. 206, 1913-27; Kong et al. 2009 J. Cell Biol. 185, 1275-840).Immobilized papain was equilibrated by washing the resin using 0.5 ml of digestion buffer and by column centrifugation at 5000 × g for 1 minute. The buffer was then discarded. The desalting column was prepared by removing the solution in which it was stored and washing it with digestion buffer, followed by centrifugation each time at 1000×g for 2 minutes. 0.5 ml of the resulting IgG sample was added to the rotating column tube containing equilibrated immobilized papain. The digestion reaction mixture was incubated for 16 hours on a tabletop shaker at 37°C. The column was centrifuged at 5000×g for 1 minute to separate the digestion products from the immobilized papain. After this, the resin was washed with 0.5 ml PBS and centrifuged at 5000 × g for 1 minute. The fraction obtained by washing was added to the digested antibody, resulting in a total sample volume of 1.0 ml. The column packed with NAb protein A was equilibrated with PBS and IgG elution buffer at room temperature. The column was centrifuged for 1 minute to remove the storage solution (containing 0.02% sodium azide) and equilibrated with 2 ml PBS, centrifuged again for 1 minute, and the eluate passed through the column was discarded. The sample was added to the column and resuspended by inversion. Incubation was carried out at room temperature with stirring for 10 minutes. The column was centrifuged for 1 minute to obtain an eluate containing Fab fragments. (References: Coulter and Harris 1983. J. Immunol. Meth. 59, 199-203.; Lindner et al. 2010. Cancer Res. 70, 277-87; Kaufmann et al. 2010. PNAS. 107, 18950-5. ;Chen et al. 2010. PNAS. 107, 14727-32; Uysal et al. 2009 J. Exp. Med. 206, 449-62; Thomas et al. 2009. J. Exp. Med. 206, 1913-27; Kong et al 2009 J Cell Biol 185, 1275-840).

Процедура получения и очистки F(ab’)Procedure for obtaining and purifying F(ab’) ₂₂ -фрагментов-fragments

Иммобилизованный пепсин уравновешивалипутем отмывки смолы, используя 0,5 мл буфера для расщепления, и центрифугировали на колонке при 5000×g в течение 1 минуты. Затем буфер отбрасывали. Подготавливали обессоливающую колонку путем удаления раствора, в котором она хранилась, и отмывки ее буфером для расщепления с последующим центрифугированием каждый раз при 1000×g в течение 2 минут. В трубу вращающейся колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный пепсин, добавляли 0,5 мл полученного образца IgG. Расщепляемую реакционную смесь инкубировали в течение 16 часов на настольном шейкере при 37°С. Колонку центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты для отделения продуктов расщепления от иммобилизованного папаина. После этого смолу отмывали, используя 0,5 мл PBS, и центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты. Полученную при отмывке фракцию добавляли к расщепленному антителу, в результате общий объем образца составил 1,0 мл. Колонку, заполненную NAb-белком A, уравновешивали PBS и буфером для элюции IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты для удаления раствора, в котором осуществляли хранение (содержащего 0,02% азида натрия), и уравновешивали путем добавления 2 мл PBS, снова центрифугировали в течение 1 минуты, и отбрасывали прошедший через колонку элюат. Образец вносили в колонку и ресуспендировали путем переворачивания. Инкубацию проводили при комнатной температуре при перемешивании в течение 10 минут. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты, получая элюат, содержащий Fab-фрагменты. (Ссылки: Mariani et al. 1991. Mol. Immunol. 28:69-77; Beale 1987. Exp Comp Immunol 11:287-96; Ellerson et al. 1972. FEBS Letters 24(3):318-22; Kerbel and Elliot 1983. Meth Enzymol 93:113-147; Kulkarni et al. 1985. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4; Lamoyi 1986. Meth Enzymol 121:652-663; Parham et al. 1982. J Immunol Meth 53:133-73; Raychaudhuri et al. 1985. Mol Immunol 22(9):1009-19; Rousseaux et al. 1980. Mol Immunol 17:469-82; Rousseaux et al. 1983. J Immunol Meth 64:141-6; Wilson et al. 1991. J Immunol Meth 138:111-9). The immobilized pepsin was equilibrated by washing the resin using 0.5 ml digestion buffer and centrifuged on the column at 5000×g for 1 minute. The buffer was then discarded. The desalting column was prepared by removing the solution in which it was stored and washing it with digestion buffer, followed by centrifugation each time at 1000×g for 2 minutes. 0.5 ml of the resulting IgG sample was added to the spinner tube containing equilibrated immobilized pepsin. The digestion reaction mixture was incubated for 16 hours on a tabletop shaker at 37°C. The column was centrifuged at 5000×g for 1 minute to separate the digestion products from the immobilized papain. The resin was then washed using 0.5 ml PBS and centrifuged at 5000×g for 1 minute. The fraction obtained by washing was added to the digested antibody, resulting in a total sample volume of 1.0 ml. The column packed with NAb protein A was equilibrated with PBS and IgG elution buffer at room temperature. The column was centrifuged for 1 minute to remove the storage solution (containing 0.02% sodium azide) and equilibrated by adding 2 ml PBS, centrifuged again for 1 minute, and the eluate passed through the column was discarded. The sample was added to the column and resuspended by inversion. Incubation was carried out at room temperature with stirring for 10 minutes. The column was centrifuged for 1 minute to obtain an eluate containing Fab fragments. (References: Mariani et al. 1991. Mol. Immunol. 28:69-77; Beale 1987. Exp Comp Immunol 11:287-96; Ellerson et al. 1972. FEBS Letters 24(3):318-22; Kerbel and Elliot 1983. Meth Enzymol 93:113-147;Kulkarni et al. 1985. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4;Lamoyi 1986. Meth Enzymol 121:652-663;Parham et al. 1982. J Immunol Meth 53:133- 73; Raychaudhuri et al. 1985. Mol Immunol 22(9):1009-19; Rousseaux et al. 1980. Mol Immunol 17:469-82; Rousseaux et al. 1983. J Immunol Meth 64:141-6; Wilson et al. al 1991 J Immunol Meth 138:111-9).

Гуманизация фрагмента антитела NT-H:Humanization of NT-H antibody fragment:

Фрагмент антитела гуманизировали методом трансплантации CDR (Jones et al. 1986. Nature 321, 522-525).The antibody fragment was humanized by CDR grafting (Jones et al. 1986. Nature 321, 522-525).

Для получения гуманизированной последовательности выполняли следующие этапы:To obtain the humanized sequence, the following steps were performed:

Экстракция общей РНК: Общую РНК экстрагировали из NT-H-гибридом, используя набор фирмы Qiagen.Total RNA Extraction: Total RNA was extracted from the NT-H hybridome using a Qiagen kit.

Первый цикл ОТ-ПЦР: Использовали набор QIAGEN® OneStep RT-PCR (номер по каталогу 210210). ОТ-ПЦР осуществляли с использованием наборов праймеров, специфических для тяжелых и легких цепей. Для каждого образца РНК осуществляли реакций ОТ-ПЦР для 12 индивидуальных тяжелой цепи и 11 легких цепей, используя смесь вырожденных прямых праймеров, перекрывающих лидерные последовательности вариабельных областей. Обратные праймеры локализоали в константных областях тяжелых и легких цепей. В праймеры не встраивали сайты рестрикции.First round of RT-PCR: QIAGEN® OneStep RT-PCR kit (cat. no. 210210) was used. RT-PCR was performed using primer sets specific for heavy and light chains. For each RNA sample, RT-PCR reactions were performed for 12 individual heavy chains and 11 light chains using a mixture of degenerate forward primers spanning the variable region leader sequences. Reverse primers were localized in the constant regions of the heavy and light chains. No restriction sites were included in the primers.

Параметры реакции: 5x буфер из набора QIAGEN® OneStep RT-PCR, 5,0 мкл, смесь dNTP (содержащая по 10 мМ каждого dNTP), 0,8 мкл; набор праймеров, 0,5 мкл; смесь ферментов из набора QIAGEN® OneStep RT-PCR, 0,8 мкл; матричная РНК, 2,0 мкл; не содержащая РНКазу вода до 20,0 мкл; общий объем 20,0 мкл.Reaction parameters: 5x QIAGEN® OneStep RT-PCR kit buffer, 5.0 µl, dNTP mix (containing 10 mM of each dNTP), 0.8 µl; primer set, 0.5 µl; enzyme mixture from QIAGEN® OneStep RT-PCR kit, 0.8 µl; messenger RNA, 2.0 µl; RNase-free water up to 20.0 µl; total volume 20.0 µl.

Условия осуществления ПЦР: обратная транскрипция: 50°С, 30 мин; начальная активация ПЦР: 95°С, 15 мин.PCR conditions: reverse transcription: 50°C, 30 min; initial activation of PCR: 95°C, 15 min.

Программа циклической реакции: 20 циклов при 94°С, 25 с; 54°С, 30 с; 72°С, 30 с; конечное удлинение: 72°С, 10 мин.Cyclic reaction program: 20 cycles at 94°C, 25 s; 54°C, 30 s; 72°C, 30 s; final extension: 72°C, 10 min.

Второй цикл с использованием полугнездовой ПЦР: ОТ-ПЦР продукты, полученные с помощью первого цикла реакций дополнительно амплифицировали во втором цикле ПЦР. Осуществляли ОТ-ПЦР реакции для 12 индивидуальных тяжелых цепей и 11 легких цепей с использованием наборов праймеров для полугнездовой ПЦР, специфических для вариабельных областей антител.Second round using semi-nested PCR: RT-PCR products obtained using the first round of reactions were further amplified in the second round of PCR. RT-PCR reactions were performed for 12 individual heavy chains and 11 light chains using semi-nested PCR primer sets specific for the variable regions of the antibodies.

Параметры реакции: 2x смесь для ПЦР, 10 мкл; набор праймеров, 2 мкл; продукт, полученный в первом цикле ПЦР, 8 мкл; общий объем, 20 мкл; отчет о клонировании полученных с использованием гибридомы антител.Reaction parameters: 2x PCR mixture, 10 µl; primer set, 2 µl; product obtained in the first PCR cycle, 8 μl; total volume, 20 µl; report on the cloning of antibodies obtained using a hybridoma.

Условия проведения ПЦР: начальная денатурация в течение 5 мин при 95°С; 25 циклов при 95°С в течение 25 с, 57°С в течение 30 с, 68°С в течение 30 с; окончательное удлинение в течение 10 мин 68°С.PCR conditions: initial denaturation for 5 min at 95°C; 25 cycles at 95°C for 25 s, 57°C for 30 s, 68°C for 30 s; final extension for 10 min 68°C.

После завершения ПЦР осуществляли анализ образцов, полученных с помощью ПЦР-реакций, в агарозном геле для визуализации амплифицированных фрагментов ДНК. После секвенирования более 15 клонированных ДНК-фрагментов, амплифицированных методом гнездовой ОТ-ПЦР, клонировали несколько тяжелых и легких цепей мышиных антител, которые оказались правильными. Путем выравнивания последовательности белка и с помощью анализа CDR идентифицировали одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Поскольку аминокислоты в положениях 26, 40 и 55 в вариабельной области тяжелой цепи и аминокислота в положении 40 в вариабельной области легкой цепи имеют решающее значение для способности к связыванию, их можно превращать вновь в исходные мышиные аминокислоты. Полученные кандидаты представлены ниже. (Padlan 1991. Mol. Immunol. 28, 489-498; Harris and Bajorath.1995. Protein Sci. 4, 306-310).After completion of PCR, samples obtained using PCR reactions were analyzed in an agarose gel to visualize the amplified DNA fragments. After sequencing more than 15 cloned DNA fragments amplified by nested RT-PCR, several mouse antibody heavy and light chains were cloned and found to be correct. One heavy chain and one light chain were identified by protein sequence alignment and CDR analysis. Since amino acids at positions 26, 40 and 55 in the heavy chain variable region and amino acid at position 40 in the light chain variable region are critical for binding ability, they can be converted back to the original murine amino acids. The received candidates are presented below. (Padlan 1991. Mol. Immunol. 28, 489-498; Harris and Bajorath. 1995. Protein Sci. 4, 306-310).

Аннотация к последовательностям фрагментов антител (SEQ ID No. 13-22): выделены жирным шрифтом и подчеркнуты CDR 1, 2, 3, расположенные в хронологическом порядке; курсивом обозначены константные области; шарнирные области выделены жирным шрифтом, а гистидиновая метка выделена жирным шрифтом и курсивом.Annotation of antibody fragment sequences (SEQ ID Nos. 13-22): CDRs 1, 2, 3 are in bold and underlined, arranged in chronological order; italics indicate constant regions; the hinge regions are in bold and the histidine tag is in bold and italics.

SEQ ID No. 13 (AM-VH-C)SEQ ID No. 13 (AM-VH-C)

QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAT GYTFSRYW IEWVKQRPGHGLEWIGE ILPGSGST QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAT GYTFSRYW IEWVKQRPGHGLEWIGE ILPGSGST

NYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYC TEGYEYDGFDY WGQGTTLTVSSA NYNEKFKGKATITADTSS NTAYMQLSSLTSEDSAVYYC TEGYEYDGFDY WGQGTTLTVSSA

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKEPK HHHHHHHHHHHH

SEQ ID No. 14 (AM-VH1)SEQ ID No. 14 (AM-VH1)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GYTFSRYW ISWVRQAPGQGLEWMGRQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GYTFSRYW ISWVRQAPGQGLEWMGR

ILPGSGST NYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC TEGYEYDGFDY ILPGSGST NYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC TEGYEYDGFDY

WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKEPK HHHHHHHHHHHH

SEQ ID No. 15 (AM-VH2-E40)SEQ ID No. 15 (AM-VH2-E40)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GYTFSRYW IEWVRQAPGQGLEWMGRQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GYTFSRYW IEWVRQAPGQGLEWMGR

SEQ ID No. 16 (AM-VH3-T26-E55)SEQ ID No. 16 (AM-VH3-T26-E55)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAT GYTFSRYW ISWVRQAPGQGLEWMGE ILPGSGST QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAT GYTFSRYW ISWVRQAPGQGLEWMGE ILPGSGST

NYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC TEGYEYDGFDY W NYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC TEGYEYDGFDY W

GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKEPK HHHHHHHHHHHH

SEQ ID No. 17 (AM-VH4-T26-E40-E55)SEQ ID No. 17 (AM-VH4-T26-E40-E55)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAT GYTFSRYW IEWVRQAPGQGLEWMGE ILPGSGST QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAT GYTFSRYW IEWVRQAPGQGLEWMGE ILPGSGST

NYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC TEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSA NYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC TEGYEYDGFDY WGQGTTVTVSSA

SEQ ID No. 18 (AM-VL-C)SEQ ID No. 18 (AM-VL-C)

DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSS QSIVYSNGNTY LEWYLQKPGQSPKLLIY RVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHIPYT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSS QSIVYSNGNTY LEWYLQKPGQSPKLLIY RVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHIPYT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID No. 19 (AM-VL1)SEQ ID No. 19 (AM-VL1)

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSIVYSNGNTY LNWFQQRPGQSPRRLIY RVS NRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSIVYSNGNTY LNWFQQRPGQSPRRLIY RVS NRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID No. 20 (AM-VL2-E40)SEQ ID No. 20 (AM-VL2-E40)

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSIVYSNGNTY LEWFQQRPGQSPRRLIY RVS NRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSIVYSNGNTY LEWFQQRPGQSPRRLIY RVS NRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Пример 2Example 2

Разработка иммуноанализаImmunoassay development

Иммуноанализ разрабатывали, используя полученные антитела к человеческим пептидам ADM (NT-H, MR-H и CT-H; см. Таблицу 1).An immunoassay was developed using derived antibodies to human ADM peptides (NT-H, MR-H, and CT-H; see Table 1).

Процедура мечения (индикатор (трейсер)): 100 мкг (100 мкл) антитела (1 мг/мл в PBS, pH 7,4) смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Германия) (EP 0353971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченое CT-H очищали гель-фильтрационной ВЭЖХ, используя устройство Bio-Sil® SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенное меченое антитело разбавляли (300 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-EDTA, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, рН 7,0). Конечная концентрация составила приблизительно 800000 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (приблизительно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию измеряли на приборе AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).Labeling procedure (tracer): 100 μg (100 μl) antibody (1 mg/ml in PBS, pH 7.4) mixed with 10 μl NHS acridinium ester (1 mg/ml in acetonitrile, InVent GmbH, Germany) (EP 0353971) and incubated for 20 min at room temperature. Labeled CT-H was purified by gel filtration HPLC using a Bio-Sil® SEC 400-5 device (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Purified labeled antibody was diluted (300 mmol/L potassium phosphate, 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Na-EDTA, 5 g/L bovine serum albumin, pH 7.0). The final concentration was approximately 800,000 relative light units (RLU) of labeled compound (approximately 20 ng of labeled antibody) per 200 μl. Chemiluminescence was measured using an AutoLumat LB 953 instrument (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Твердая фаза: Полистироловые пробирки (Greiner Bio-One International AG, Австрия) покрывали (18 ч при комнатной температуре) антителом (1,5 мкл антитела/0,3 мл 100 ммоль/л NaCl, 50 ммоль/л TRIS/HCl, рН 7,8). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином пробирки промывали PBS, pH 7,4, и сушили в вакууме.Solid phase: Polystyrene tubes (Greiner Bio-One International AG, Austria) were coated (18 h at room temperature) with antibody (1.5 μl antibody/0.3 ml 100 mmol/l NaCl, 50 mmol/l TRIS/HCl, pH 7.8). After blocking with 5% bovine serum albumin, the tubes were washed with PBS, pH 7.4, and dried under vacuum.

Калибровочные маркеры: Выполняли серийное разведение синтетического человеческого ADM (hADM) (Bachem, Швейцария), используя 50 мМ TRIS/HCl, 250 мМ NaCl, 0,2% Тритон Х-100, 0,5% BSA, 20 таблеток/л полного коктейля ингибиторов протеаз (Roche AG); рН 7,8. Калибровочные маркеры хранили при -20°С до использования.Calibration Markers: Serial dilution of synthetic human ADM (hADM) (Bachem, Switzerland) was performed using 50 mM TRIS/HCl, 250 mM NaCl, 0.2% Triton X-100, 0.5% BSA, 20 tablets/L complete cocktail protease inhibitors (Roche AG); pH 7.8. Calibration markers were stored at -20°C until use.

Иммуноанализ ADM: 50 мкл образца (или калибровочного маркера) вносили пипеткой в покрытые пробирки, после добавления меченого вторичного антитела (200 мкл) пробирки инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Несвязанную метку удаляли 5-кратной отмывкой (каждый раз по 1 мл) отмывочным раствором (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Тритон X-100). Связаннубю с пробиркой хемилюминесценцию измеряли на приборе LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co.KG). Антитела использовали в сэндвич-иммуноанализе в пробирках, покрытых меченным антителом, и объединяли в указанных ниже вариантах (см. Таблицу 2). Инкубацию выполняли, как описано в разделе Иммуноанализ hADM. Результаты приведены в отношении удельного сигнала (при 10 нг/мл ADM)/фоновый (образец без ADM) сигнал.ADM Immunoassay: 50 µl of sample (or calibration marker) was pipetted into coated tubes, after addition of labeled secondary antibody (200 µl), the tubes were incubated for 2 hours at room temperature. Unbound label was removed by washing 5 times (1 ml each time) with wash solution (20 mM PBS, pH 7.4, 0.1% Triton X-100). Tube-bound chemiluminescence was measured on an LB 953 instrument (Berthold Technologies GmbH & Co.KG). Antibodies were used in sandwich immunoassays in labeled antibody-coated tubes and pooled as follows (see Table 2). Incubation was performed as described in hADM Immunoassay. Results are given in terms of specific signal (at 10 ng/mL ADM)/background (sample without ADM) signal.

Таблица 2:Table 2:

Отношение сигнал/шумSignal to noise ratio Метка NT-ADM NT-ADM Label Метка MR-ADM MR-ADM label Метка CT-ADM CT-ADM label NT-ADMNT-ADM // 195195 241241 MR-ADMMR-ADM 204204 // 904904 CT-ADMCT-ADM 260260 871871 //

Неожиданно было обнаружено, что комбинация MR-ADM и CT-ADM является комбинацией с самым высоким отношением сигнал/шум. Впоследствии эту комбинацию антител использовали в дальнейших исследованиях для измерения bio-ADM. Анти-MR-ADM использовали в качестве твердофазного антитела и анти-CT-ADM в качестве меченого антитела. Типичная кривая доза/сигнал показана на фиг. 1.Surprisingly, the combination of MR-ADM and CT-ADM was found to be the combination with the highest signal-to-noise ratio. This antibody combination was subsequently used in further studies to measure bio-ADM. Anti-MR-ADM was used as the solid-phase antibody and anti-CT-ADM as the labeled antibody. A typical dose/signal curve is shown in FIG. 1.

Пример 3Example 3

Стабильность человеческого адреномедуллинаStability of human adrenomedullin

Человеческий ADM разбавляли в цитратной плазме человека (n=5, конечная концентрация 10 нг ADM/мл) и инкубировали при 24°C. В выбранные моменты времени отбирали аликвоты, которые замораживали при -20°C. Сразу после разморозки выполняли количественное определение hADM в образцах с помощью иммуноанализа hADM, описанного выше. Human ADM was diluted in human citrated plasma (n=5, final concentration 10 ng ADM/ml) and incubated at 24°C. Aliquots were removed at selected time points and frozen at -20°C. Immediately after thawing, hADM was quantified in the samples using the hADM immunoassay described above.

В таблице 3 показана стабильность hADM в плазме человека при 24°C.Table 3 shows the stability of hADM in human plasma at 24°C.

Время (ч)Time (h) Среднее значение восстановления ADM (N=5)Average ADM recovery (N=5) Относительная потеря иммунореактивностиRelative loss of immunoreactivity % потери иммунореактивности/ч% loss of immunoreactivity/hour 00 100100 // // 22 99,299.2 0,80.8 0,40.4 44 96,496.4 3,63.6 0,80.8 88 88,288.2 11,811.8 1,51.5 Среднее значение: 0,9%/чAverage: 0.9%/h

Неожиданно было обнаружено, что при использовании комбинаций антител MR-ADM и CT-ADM в сэндвич-иммунноанализе преаналитическая стабильность аналита оказалась высокой (только 0,9%/ч средней потери иммуннореактивности). Напротив, при использовании других методов анализа период полувыведения из плазмы составлял всего 22 минуты (Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167). Поскольку время от момента взятия образца до анализа в больничном отделении составляет менее 2 часов, используемый метод обнаружения ADM подходит для обычной диагностики. Примечательно то, что для достижения приемлемой стабильности ADM-иммунной реактивности отсутствует потребность в каких-либо нестандартных добавках к образцам (таким как апротинин (Ohta et al. 1999. Clin Chem 45(2):244-251)).Surprisingly, when using combinations of MR-ADM and CT-ADM antibodies in a sandwich immunoassay, the preanalytical stability of the analyte was found to be high (only 0.9%/h mean loss of immunoreactivity). In contrast, using other assays, the plasma half-life was only 22 minutes (Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138–167). Since the time from sample collection to analysis in a hospital department is less than 2 hours, the ADM detection method used is suitable for routine diagnosis. It is noteworthy that to achieve acceptable stability of ADM immune reactivity, there is no need for any non-standard additives to the samples (such as aprotinin (Ohta et al. 1999. Clin Chem 45(2):244-251)).

Пример 4Example 4

Воспроизводимость калибровочных маркеров-препаратов и интерпретация изменчивости калибровочных маркеровReproducibility of calibration marker preparations and interpretation of calibration marker variability

При приготовлении калибровочных маркеров для анализов ADM обнаружена высокая изменчивость результатов (среднее значение CV 8,5%, см. Таблицу 4). Это может быть связано с высокой адсорбцией hADM на пластиковых и стеклянных поверхностях (Lewis et al. 1998. Clinical Chemistry 44(3):571-577). При добавлении детергентов (до 1% тритон X100 или 1% Твин 20), белка (до 5% BSA) и в условиях высокой ионной силы (до 1М NaCl) или их комбинаций этот эффект уменьшался лишь в незначительной степени. Неожиданно было обнаружено, что при добавлении избытка анти-NT-ADM антитела (10 мкг/мл) в буфер для разведения калибровочного маркера, существенно улучшает восстановление и воспроизводимость препаратов-калибровочных маркеров для анализа ADM до CV<1% между препаратами (Таблица 4). Коэффициенты вариации получали для 5 независимых тестирований препаратов. Калибровочные маркеры измеряли с помощью ADM-анализа, описанного выше (s/n-r=отношение сигнал/шум). Во всех последующих исследованиях использовали анализ ADM, основанный на калибровочных маркерах, приготовленных в присутствии 10 мкг/мл антитела NT-ADM и 10 мкг/мл антитела NT-ADM в качестве добавки к буферу для маркеров.When preparing calibration markers for ADM assays, high variability was found (average CV 8.5%, see Table 4). This may be due to the high adsorption of hADM on plastic and glass surfaces (Lewis et al. 1998. Clinical Chemistry 44(3):571-577). With the addition of detergents (up to 1% Triton X100 or 1% Tween 20), protein (up to 5% BSA), and under high ionic strength conditions (up to 1 M NaCl) or combinations thereof, this effect was reduced only slightly. Surprisingly, it was found that adding excess anti-NT-ADM antibody (10 μg/ml) to the calibration marker dilution buffer significantly improved the recovery and reproducibility of calibration marker preparations for the ADM assay to a CV <1% between preparations (Table 4) . Coefficients of variation were obtained for 5 independent drug tests. Calibration markers were measured using the ADM analysis described above (s/n-r=signal to noise ratio). All subsequent studies used an ADM assay based on calibration markers prepared in the presence of 10 μg/ml NT-ADM antibody and 10 μg/ml NT-ADM antibody as marker buffer supplement.

К счастью, присутствие N-концевых антител не оказывало влияния на bio-ADM-сигнал, генерируемый комбинацией MR- и C-концевых антител (фиг. 1).Fortunately, the presence of N-terminal antibodies had no effect on the bio-ADM signal generated by the combination of MR and C-terminal antibodies (Fig. 1).

Таблица 4:Table 4:

В присутствии антитела NT-ADM (10 мкг/мл)In the presence of NT-ADM antibody (10 μg/ml) CV между препаратами (%)CV between drugs (%) Без антителаWithout antibody CV между препаратами (%)CV between drugs (%) Калибровочный маркерCalibration marker 100 нг/мл100 ng/ml 3453 s/n-r3453 s/n-r 0,90.9 2842 s/n-r2842 s/n-r 2,82.8 10 нг/мл10 ng/ml 1946 s/n-r1946 s/n-r 0,80.8 1050 s/n-r1050 s/n-r 7,97.9 1 нг/мл1 ng/ml 179 s/n-r179 s/n-r 1,11.1 77 s/n-r77 s/n-r 14,814.8 Среднее значение: 0,93Average: 0.93 Среднее значение: 8,5Average: 8.5

Пример 5Example 5

ЧувствительностьSensitivity

Цель анализа чувствительности заключалась в том, чтобы полностью охватить концентрацию ADM у здоровых субъектов и значительно более низкие концентрации.The goal of the sensitivity analysis was to fully capture ADM concentrations in healthy subjects and significantly lower concentrations.

Концентрация bio-ADM у здоровых людейBio-ADM concentration in healthy people

Измерение у здоровых субъектов (n=88, 57 женщин, 31 мужчина, средний возраст: 42,2 года) выполняли с помощью анализа bio-ADM (Weber et al. 2017. JALM, 2 (2):222-233). Средний межквартильный диапазон (IQR) составил 13,7 (9,6-18,7) пг/мл, а среднее значение (SD) составило 15,6 (9,2) пг/мл. Поскольку чувствительность анализа (предел обнаружения) составил 3 пг/мл, описанный анализ bio-ADM позволяет охватить 100% здоровых субъектов. Measurement in healthy subjects (n=88, 57 women, 31 men, mean age: 42.2 years) was performed using the bio-ADM assay (Weber et al. 2017. JALM, 2(2):222-233). The median interquartile range (IQR) was 13.7 (9.6–18.7) pg/mL and the median (SD) was 15.6 (9.2) pg/mL. Since the sensitivity of the assay (limit of detection) was 3 pg/mL, the described bio-ADM assay allows coverage of 100% of healthy subjects.

Пример 6Example 6

План исследования и популяция MPPStudy design and MPP population

Проект профилактических мероприятий Malmö (MPP) был профинансирован в середине 1970-х годов для изучения факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (CV) среди населения в целом, и охватил 33346 человек, проживающих в Malmö (Fedorowski et al. 2010. Eur Heart J 31:85-91). В период с 2002 по 2006 год в общей сложности на приглашение откликнулись 18240 первых участников (уровень участия 70,5%), которые прошли скрининг, включая всесторонний физический осмотр и сбор образцов крови (Fava et al. 2013. Hypertension 2013; 61:319-26). Повторное исследование MPP в настоящем исследовании принято в качестве базового уровня. Субъектов с диагнозом CVD на момент первичного осмотра исключали из участия в исследовании. Bio-ADM измеряли в плазме, собранной у 4364 пациентов во время первичной оценки. 34 пациента уже имели диагноз болезни Альцгеймера во время забора крови. В течение следующих 7 лет у 187 пациентов развилась AD (инцидентная AD). Все участники дали информированное согласие, и Этический комитет Лундского университета, Лунд, Швеция, утвердил протокол исследования.The Malmö Prevention Project (MPP) was funded in the mid-1970s to study risk factors for cardiovascular disease (CV) in the general population, and involved 33,346 people living in Malmö (Fedorowski et al. 2010. Eur Heart J 31:85-91). Between 2002 and 2006, a total of 18,240 early participants responded to the invitation (70.5% participation rate) and were screened, including a comprehensive physical examination and blood sample collection (Fava et al. 2013. Hypertension 2013;61:319 -26). The repeat MPP study is taken as the baseline in the present study. Subjects diagnosed with CVD at the time of initial examination were excluded from participation in the study. Bio-ADM was measured in plasma collected from 4364 patients at the time of initial evaluation. 34 patients were already diagnosed with Alzheimer's disease at the time of blood collection. Over the next 7 years, 187 patients developed AD (incident AD). All participants provided informed consent, and the Ethics Committee of Lund University, Lund, Sweden, approved the study protocol.

Информация о диагнозах деменции была запрошена из Шведского национального регистра пациентов (SNPR). Диагнозы в регистре собираны в соответствии с различными версиями кодов Международной классификации болезней (МКБ) 290, 293 (МКБ-8), 290, 331 (ICD-9) или F00, F01, F03, G30 (ICD-10). SNPR включает все случаи оказания стационарной помощи в Швеции с 1987 года и, помимо этого, содержит данные об амбулаторных посещениях, включая дневную хирургическую и психиатрическую помощь, оказанную как частными, так и государственными учреждениями, осуществляющими уход, зарегистрированные после 2000 года. Деменцию любой этиологии диагностировали в соответствии с критериями Диагностического и статистического руководства по психическим расстройствам (DSM)-III, пересмотренного издание, в то время как для диагностики болезни Альцгеймера и сосудистой деменции применяли критерии DSM-IV. Диагнозы подтверждали тщательным анализом медицинских карт, а также данных нейровизуализации, когда они были доступны. Врач-исследователь назначал окончательный диагноз каждому пациенту, и в спорных случаях консультировался с врачом-гериатром, специализирующимся на когнитивных расстройствах. Был отобран набор данных для исследования методом «случай-контроль», и в подгруппе MPP измеряли MR-proADM (n=250 контролей и n=150 субъектов с инцидентной AD). Кроме того, bio-ADM измеряли в независимой когорте пациентов, у которых уже была диагностирована болезнь Альцгеймера во время забора крови (= установленная AD; n=150).Information on dementia diagnoses was queried from the Swedish National Patient Register (SNPR). Diagnoses in the registry are collected according to different versions of the International Classification of Diseases (ICD) codes 290, 293 (ICD-8), 290, 331 (ICD-9) or F00, F01, F03, G30 (ICD-10). The SNPR includes all inpatient care in Sweden since 1987 and, in addition, contains data on outpatient visits, including day surgery and psychiatric care, provided by both private and public care providers recorded after 2000. Dementia of any etiology was diagnosed according to the criteria of the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM)-III, revised edition, while DSM-IV criteria were used for the diagnosis of Alzheimer's disease and vascular dementia. Diagnoses were confirmed by careful review of medical records as well as neuroimaging data when available. The study physician assigned a final diagnosis to each patient and, in cases of controversy, consulted a geriatrician specializing in cognitive disorders. A case-control study dataset was selected and MR-proADM was measured in the MPP subgroup (n=250 controls and n=150 subjects with incident AD). In addition, bio-ADM was measured in an independent cohort of patients who were already diagnosed with Alzheimer's disease at the time of blood draw (= established AD; n=150).

Для измерения MR-proADM в плазме использовали полностью автоматизированный гомогенный флюороиммуноанализ (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR; BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany) (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42(7-8):725-8).A fully automated homogeneous fluoroimmunoassay (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR; BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany) was used to measure MR-proADM in plasma (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42(7-8):725-8).

Статистический анализ: Значения выражены в виде средних и стандартных отклонений, медианы и межквартильных диапазонов (IQR) или, в зависимости от ситуации, в виде количества и процентов. Групповые сравнения непрерывных переменных выполняли с помощью критерия Крускала-Уоллиса. Данные по биомаркеру были логарифмически преобразованы. Регрессию пропорциональных рисков Кокса использовали для анализа влияния факторов риска на выживаемость в однофакторных и многомерных анализах. Предположения о пропорциональном риске проверяли для всех переменных. Для непрерывных переменных отношения риска (HR) были стандартизированы, чтобы описать HR для изменения биомаркера в пределах одного IQR. Для факторов риска задавали 95% доверительные интервалы (CI) и уровни значимости для хи-квадрат (критерий Вальда). Прогностическую ценность каждой модели оценивали с помощью критерия отношения правдоподобия, статистики хи-квадрат. Индекс соответствия (индекс C) использовали в качестве меры эффекта. Он эквивалентен концепции AUC, принятой для двоичного результата. Для многовариантных моделей дана версия индекса C, скорректированная методом бутстреп. Кривые выживания, построенные по методу Каплана-Мейера, использовали в иллюстративных целях. Для проверки независимости bio-ADM от клинических переменных, использовали критерий отношения правдоподобия хи-квадрат для вложенных моделей. Statistical analysis : Values are expressed as means and standard deviations, medians and interquartile ranges (IQR), or as counts and percentages as appropriate. Group comparisons of continuous variables were performed using the Kruskal-Wallis test. Biomarker data were logarithmically transformed. Cox proportional hazards regression was used to analyze the effect of risk factors on survival in univariate and multivariate analyses. Proportional hazard assumptions were tested for all variables. For continuous variables, hazard ratios (HRs) were standardized to describe the HRs for biomarker change within one IQR. For risk factors, 95% confidence intervals (CI) and significance levels for chi-square (Wald test) were specified. The predictive value of each model was assessed using the likelihood ratio test, chi-square statistics. The fit index (C index) was used as a measure of effect. It is equivalent to the AUC concept adopted for a binary outcome. For multivariate models, a bootstrap-adjusted version of the C index is given. Survival curves constructed using the Kaplan-Meier method were used for illustrative purposes. To test the independence of bio-ADM from clinical variables, the likelihood ratio chi-square test was used for nested models.

Все статистические тесты были двусторонними, и значение двустороннего уровня значимости p=0,05 считали достоверным. Статистический анализ выполняли, используя R версию 2.5.1 (http://www.r-project.org, Design Library, Hmisc, ROCR) и версию 22.0 статистического пакета для общественных наук (SPSS) (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). All statistical tests were two-sided, and a two-sided significance level of p=0.05 was considered significant. Statistical analyzes were performed using R version 2.5.1 (http://www.r-project.org, Design Library, Hmisc, ROCR) and Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Результаты: Results:

Исходные характеристики когорт показаны в таблице 5.Baseline characteristics of the cohorts are shown in Table 5.

ПеременнаяVariable n=4364n=4364 возрастage 69,4 (6,2)69.4 (6.2) Мужской полMale 3008 (68,9%)3008 (68.9%) Курит в настоящий моментCurrently smoking 835 (19,1%)835 (19.1%) AHT AHT 1476 (33,8%)1476 (33.8%) HDLHDL 1,4 (0,4)1.4 (0.4) LDLLDL 3,7 (1,0)3.7 (1.0) BMIBMI 27,1 (6,2)27.1 (6.2) SBPSBP 146,6 (20,3)146.6 (20.3) Установленный диабетEstablished diabetes 466 (10,7%)466 (10.7%) Инцидентная ADIncident AD 187 (4,3%)187 (4.3%) Установленная ADInstalled AD 34 (0,8%)34 (0.8%)

Концентрации bio-ADM в когорте MPP и в независимой когорте болезни Альцгеймера показаны на фиг. 2. Концентрации bio-ADM у пациентов, у которых развилась со временем AD (инцидентная AD), и у пациентов с AD на момент взятия образцов крови в независимой когорте (установленная AD) значительно ниже по сравнению с группой без AD (р=0,01 и <0,0001, соответственно). Группа с установленной AD из когорты MPP (n=34) также имела более низкие концентрации bio-ADM по сравнению с группой без AD, но эти различия не были статистически значимыми, что связано с небольшим размером выборки.Bio-ADM concentrations in the MPP cohort and the independent Alzheimer's disease cohort are shown in FIG. 2. Concentrations of bio-ADM in patients who developed AD over time (incident AD) and in patients with AD at the time of blood sampling in the independent cohort (established AD) were significantly lower compared to the group without AD (p=0. 01 and <0.0001, respectively). The established AD group from the MPP cohort (n=34) also had lower bio-ADM concentrations compared to the non-AD group, but these differences were not statistically significant due to the small sample size.

Низкая концентрация bio-ADM в плазме четко предсказывает болезнь Альцгеймера с коэффициентом риска (HR) 0,73 (CI 0,6-0,87; р<0,001). На фиг. 3 показан график Каплана-Мейера для прогнозирования болезни Альцгеймера с концентрациями bio-ADM (случаи установленной AD были исключены из анализа). Самый низкий квартиль связан с самым высоким риском развития AD.Low plasma bio-ADM concentration strongly predicted Alzheimer's disease with a hazard ratio (HR) of 0.73 (CI 0.6-0.87; p<0.001). In fig. Figure 3 shows a Kaplan-Meier plot for the prediction of Alzheimer's disease with bio-ADM concentrations (cases of established AD were excluded from the analysis). The lowest quartile is associated with the highest risk of developing AD.

Создан набор данных для метода случая-контроль путем выбора 400 пациентов из группы MPP (у которых не были диагностированы CVD и AD) с n=250 субъектами, у которых не развилась AD, и n=150 пациентами, у которых развилась AD в течение 7-ми летнего периода наблюдения. И в этом случае, концентрации bio-ADM были значительно ниже (p<0,0001 для всех сравнений) у пациентов с инцидентной AD и у пациентов с установленной AD (независимая когорта) по сравнению с группой без AD (фиг. 4). Кроме того, уровень MR-proADM измеряли у пациентов из группы MPP «случай-контроль», который оказался немного, не значительно, выше при инцидентной AD по сравнению с группой без AD (фиг. 5).Created a case-control dataset by selecting 400 MPP patients (who were not diagnosed with CVD and AD) with n=250 subjects who did not develop AD and n=150 subjects who developed AD within 7 -mi summer observation period. Again, bio-ADM concentrations were significantly lower (p<0.0001 for all comparisons) in patients with incident AD and in patients with established AD (independent cohort) compared with the non-AD group (Figure 4). In addition, MR-proADM levels were measured in the MPP case-control group and were found to be slightly, not significantly, higher in incident AD compared with the non-AD group (Figure 5).

На следующем этапе объединяли оба биомаркера, bio-ADM и MR-proADM. Для вычисления отношения концентрации обоих маркеров предпочтительно должны быть выражены в одних и тех же единицах (например, пмоль/л). Следовательно, для вычисления отношения концентрации bio-ADM рассчитывали в пмоль/л. Отношение между bio-ADM и MR-proADM значительно снижено у субъектов с инцидентной AD по сравнению с субъектами без AD (р<0,0001; фиг. 6). Уже один только уровень bio-ADM четко предсказывает болезнь Альцгеймера с коэффициентом шансов (OR) 0,44 (CI 0,33-0,58). Однако отношение между bio-ADM и MR-proADM оказалось лучше, чем один bio-ADM (р<0,001) с OR 0,32 (CI 0,23-0,44). Соответствующие рабочие характеристические кривые (графики ROC) для bio-ADM и отношения bio-ADM и MR-proADM показаны на фиг.7 A и B, соответственно, с AUC 0,67 (95% CI 0,61-0,72) для bio-ADM и 0,73 (95% CI 0,68-0,78) для отношения между bio-ADM и МР-proADM. Более того, как bio-ADM, так и отношение bio-ADM и MR-proADM не зависят от возраста и пола.In the next step, both biomarkers, bio-ADM and MR-proADM, were combined. To calculate the ratio, the concentrations of both markers should preferably be expressed in the same units (eg, pmol/L). Therefore, to calculate the ratio, bio-ADM concentrations were calculated in pmol/L. The ratio between bio-ADM and MR-proADM is significantly reduced in subjects with incident AD compared to subjects without AD (p < 0.0001; Fig. 6). Bio-ADM level alone strongly predicted Alzheimer's disease with an odds ratio (OR) of 0.44 (CI 0.33-0.58). However, the relationship between bio-ADM and MR-proADM was better than bio-ADM alone (p<0.001) with OR 0.32 (CI 0.23-0.44). The corresponding operating characteristic curves (ROC plots) for bio-ADM and the ratio of bio-ADM and MR-proADM are shown in Figure 7 A and B, respectively, with an AUC of 0.67 (95% CI 0.61-0.72) for bio-ADM and 0.73 (95% CI 0.68–0.78) for the relationship between bio-ADM and MP-proADM. Moreover, both bio-ADM and the ratio of bio-ADM to MR-proADM are independent of age and gender.

Пример 7 - Введение NT-H здоровым людямExample 7 - Administration of NT-H to Healthy Humans

Исследование проводили с участием здоровых мужчин в виде рандомизированного, двойного слепого, плацебо-контролируемого исследования с однократной эскалацией доз антитела NT-H, вводимых в виде внутривенной (iv) инфузии, в 3 последовательных группах по 8 здоровых мужчин в каждой (1-я группа 0,5 мг/кг, 2-я группа 2 мг/кг, 3-я группа 8 мг/кг) (n=6 активных, n=2 плацебо в каждой группе).The study was conducted in healthy men as a randomized, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of NT-H antibody administered as an intravenous (iv) infusion in 3 sequential groups of 8 healthy men each (Group 1 0.5 mg/kg, 2nd group 2 mg/kg, 3rd group 8 mg/kg) (n=6 active, n=2 placebo in each group).

Основными критериями включения были письменное информированное согласие, возраст 18-35 лет, согласие на использование надежного способа контрацепции и показатель BMI от 18 до 30 кг/м².The main inclusion criteria were written informed consent, age 18–35 years, consent to use a reliable method of contraception, and a BMI between 18 and 30 kg/m².

Испытуемые получали одну в/в дозу антитела NT-H (0,5 мг/кг; 2 мг/кг; 8 мг/кг) или плацебо путем медленной инфузии в течение 1-го часа в исследовательском отделении.Subjects received a single IV dose of NT-H antibody (0.5 mg/kg; 2 mg/kg; 8 mg/kg) or placebo by slow infusion over 1 hour in the study unit.

Базовые значения bio-ADM в 4 группах не различались. Медианные значения bio-ADM составляли 7,1 пг/мл в группе плацебо, 6,8 пг/мл в первой группе лечения (0,5 мг/кг), 5,5 пг/мл во второй группе лечения (2 мг/кг) и 7,1 пг/мл в третьей группе лечения (8 мг/мл).Baseline bio-ADM values did not differ between the 4 groups. Median bio-ADM values were 7.1 pg/ml in the placebo group, 6.8 pg/ml in the first treatment group (0.5 mg/kg), 5.5 pg/ml in the second treatment group (2 mg/kg ) and 7.1 pg/ml in the third treatment group (8 mg/ml).

Результаты показывают, что у здоровых людей значения bio-ADM быстро увеличивались в течение первых 1,5 часов после введения антитела NT-H, затем достигали плато и медленно снижались (фиг. 8).The results show that in healthy subjects, bio-ADM values increased rapidly during the first 1.5 hours after administration of the NT-H antibody, then reached a plateau and slowly decreased (Fig. 8).

Claims

1. Способ определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией, в котором определяют уровень зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4 в образце физиологической жидкости субъекта, и в котором указанный уровень зрелого ADM-NH2 сравнивают с пороговым уровнем, причем1. A method for determining the risk of developing dementia in a non-demented subject, wherein the level of mature ADM-NH2 is determined according to SEQ ID No. 4 in a body fluid sample of the subject, and wherein said mature ADM-NH2 level is compared to a threshold level, wherein

указанный субъект имеет повышенный риск развития деменции, если указанный уровень зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4 ниже указанного порогового уровня.the specified subject has an increased risk of developing dementia if the specified level of mature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4 below the specified threshold level.

2. Способ определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией, в котором определяют отношение маркеров, которое может представлять собой отношение уровня зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента, который является незрелым ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4, определенному в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и причем указанный фрагмент про-адреномедуллина выбирают из группы, содержащей PAMP: SEQ ID No. 2, MR-proADM: SEQ ID No. 3, ADM-Gly: SEQ ID No. 5 и CT-proADM: SEQ ID No. 6 и, причем указанное отношение маркеров сравнивают с пороговым отношением и, причем,2. A method for determining the risk of developing dementia in a non-demented subject, wherein a marker ratio is determined, which may be a mature ADM-NH2 level ratio according to SEQ ID No. 4, determined in a sample of the physiological fluid of the specified subject, to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof, which is immature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of said subject, and wherein said pro-adrenomedullin fragment is selected from the group consisting of PAMP: SEQ ID No. 2, MR-proADM: SEQ ID No. 3, ADM-Gly: SEQ ID No. 5 and CT-proADM: SEQ ID No. 6 and, moreover, the specified ratio of markers is compared with the threshold ratio and, moreover,

указанный субъект имеет повышенный риск развития деменции, если отношение маркеров зрелый ADM-NH2/про-адреномедуллин или его фрагмент ниже указанного порогового значенияthe specified subject has an increased risk of developing dementia if the ratio of the markers mature ADM-NH2/pro-adrenomedullin or its fragment is below the specified threshold value

или альтернативно к вышеуказанному отношению маркеров, уровень зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4 определяют в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и уровень про-адреномедуллина или его фрагмента, который не является зрелым ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4, определяют в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и оба определенных уровня объединяют в математическом алгоритме, причем результат указанного математического алгоритма используют для определения риска развития деменции у субъекта, не страдающего деменцией.or alternatively to the above marker ratio, the level of mature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4 is determined in a sample of the physiological fluid of the specified subject, and the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof that is not mature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4 is determined in a body fluid sample of said subject, and both determined levels are combined in a mathematical algorithm, the result of said mathematical algorithm being used to determine the risk of developing dementia in a non-demented subject.

3. Способ по п.1, в котором пороговый уровень зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4 равен или ниже 15 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 10 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 5 пг/мл. 3. The method according to claim 1, wherein the threshold level of mature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4 is equal to or below 15 pg/ml, preferably equal to or below 10 pg/ml, preferably equal to or below 5 pg/ml.

4. Способ по п.2, в котором отношение порогового значения находится в диапазоне от 0,2 до 0,75, предпочтительно от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,4 до 0,5.4. The method according to claim 2, wherein the threshold ratio is in the range of 0.2 to 0.75, preferably 0.3 to 0.6, preferably 0.4 to 0.5.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный образец выбирают из группы: крови, сыворотки, плазмы, мочи, спинномозговой жидкости (CSF) и слюны.5. A method as claimed in any one of the preceding claims, wherein said sample is selected from the group of: blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid (CSF) and saliva.

6. Способ по пп.1-5, в котором образец физиологической жидкости берут у субъекта, у которого до момента взятия образца не была диагностирована деменция или легкое когнитивное нарушение (MCI).6. The method of claims 1 to 5, wherein the body fluid sample is collected from a subject who has not been diagnosed with dementia or mild cognitive impairment (MCI) at the time of sample collection.

7. Способ по п.1 или 2, в котором указанный способ используют для стратификации пациентов для выбора пациента для лечения антителом к адреномедуллину (ADM) или фрагментом антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркасом для применения в профилактике или терапии деменции у субъекта, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас связывается с N-концевой частью aa 1-21 адреномедуллина:7. The method of claim 1 or 2, wherein said method is used to stratify patients to select a patient for treatment with an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig scaffold for use in the prevention or therapy of dementia in subject, wherein said anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold binds to the N-terminal portion of adrenomedullin aa 1-21:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC SEQ ID No. 21.YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC SEQ ID No. 21.

8. Применение антитела к адреномедуллину (ADM) или фрагмента антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркаса для профилактики или терапии деменции у субъекта, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас связывается с N-концевой частью аа 1-21 адреномедуллина: 8. Use of an anti-adrenomedullin antibody (ADM) or an anti-adrenomedullin antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework for the prevention or treatment of dementia in a subject, wherein said anti-ADM antibody or anti-ADM antibody fragment or an anti-ADM non-Ig framework binds to the N-terminal part of aa 1-21 adrenomedullin:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC SEQ ID No. 21, причем указанного субъекта выбирают способом по п.7.YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC SEQ ID No. 21, wherein said subject is selected by the method according to claim 7.

9. Применение по п.8, причем указанный субъект имеет уровень зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4, определенный в образце физиологической жидкости указанного субъекта, ниже порогового уровня и/или имеет отношение маркеров, которое представляет собой отношение уровня зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4, определенного в образце физиологической жидкости указанного субъекта, к уровню про-адреномедуллина или его фрагмента, определенному в образце физиологической жидкости указанного субъекта, и причем указанное отношение уровней маркеров ниже порогового отношения.9. Use according to claim 8, wherein said subject has a mature ADM-NH2 level according to SEQ ID No. 4, determined in a physiological fluid sample of the specified subject, is below the threshold level and/or has a marker ratio that is the ratio of the mature ADM-NH2 level according to SEQ ID No. 4 determined in a physiological fluid sample of said subject to the level of pro-adrenomedullin or a fragment thereof determined in a physiological fluid sample of said subject, and wherein said ratio of marker levels is below a threshold ratio.

10. Применение по п.9, причем указанный фрагмент про-адреномедуллина выбирают из группы, содержащей PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) и CT-proADM (SEQ ID No. 6).10. Use according to claim 9, wherein said pro-adrenomedullin fragment is selected from the group consisting of PAMP (SEQ ID No. 2), MR-proADM (SEQ ID No. 3), ADM-Gly (SEQ ID No. 5) and CT-proADM (SEQ ID No. 6).

11. Применение по п.9 или 10, причем пороговый уровень зрелого ADM-NH2 согласно SEQ ID No. 4 равен или ниже 15 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 10 пг/мл, предпочтительно равен или ниже 5 пг/мл. 11. Use according to claim 9 or 10, wherein the threshold level of mature ADM-NH2 according to SEQ ID No. 4 is equal to or below 15 pg/ml, preferably equal to or below 10 pg/ml, preferably equal to or below 5 pg/ml.

12. Применение по п.9 или 10, причем отношение уровней маркеров находится в пределах от 0,2 до 0,75, предпочтительно от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,4 до 0,5.12. Use according to claim 9 or 10, wherein the marker level ratio is in the range from 0.2 to 0.75, preferably from 0.3 to 0.6, preferably from 0.4 to 0.5.

13. Применение по п.8, причем образец физиологической жидкости выбирают из группы: крови, сыворотки, плазмы, мочи, спинномозговой жидкости (CSF) и слюны.13. Use according to claim 8, wherein the physiological fluid sample is selected from the group: blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid (CSF) and saliva.