RU2810750C2

RU2810750C2 - IMMUNOCYTOKINE FOR ACTIVATION OF HUMAN IL-10Rα RECEPTOR AND ITS USE

Info

Publication number: RU2810750C2
Application number: RU2020140807A
Authority: RU
Inventors: Алексей Владимирович Кононов; Юлия Викторовна Евдокимовская; Яна Андреевна Смирнова; Станислав Рудольфович Евдокимов; Елена Сергеевна Колосова; Сергей Андреевич Агеев; Владимир Сергеевич Цымпилов; Валерий Владимирович Соловьев; Павел Андреевич Яковлев; Дмитрий Валентинович Морозов
Original assignee: Акционерное общество "БИОКАД"
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2023-12-28

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention can be used in medical practice. The invention discloses an immunocytokine for activation of the human interleukin 10 receptor (IL-10R). The invention also relates to nucleic acids encoding the specified immunocytokine, expression vectors, host cells and methods of their production, methods of producing the immunocytokine, as well as pharmaceutical compositions containing the above immunocytokine.

EFFECT: invention can be used in the treatment of various oncological diseases.

34 cl, 14 ex, 2 tbl, 15 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к иммуноцитокину для активации IL-10Rα рецептора человека. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанный иммуноцитокин, векторам экспрессии, клеткам-хозяевам и способам их получения, способам получения иммуноцитокина, фармацевтическим композициям, содержащим вышеуказанный иммуноцитокин, фармацевтическим композициям, содержащим вышеуказанный иммуноцитокин и другие терапевтически активные соединения, способам лечения онкологического заболевания и применениям иммуноцитокина или его фармацевтических композиций для лечения онкологического заболевания.The present invention relates to the field of biotechnology and medicine, namely to an immunocytokine for activating the human IL-10Rα receptor. The invention also relates to nucleic acids encoding the specified immunocytokine, expression vectors, host cells and methods for their production, methods for producing the immunocytokine, pharmaceutical compositions containing the above immunocytokine, pharmaceutical compositions containing the above immunocytokine and other therapeutically active compounds, methods for treating cancer and applications of immunocytokine or its pharmaceutical compositions for the treatment of cancer.

Уровень техникиState of the art

Интерлейкин 10 (или IL-10) является цитокином и до недавнего времени воспринимался как противовоспалительный цитокин. Это гомодимер с молекулярной массой приблизительно 37-39 кДа. Человеческий и мышиный интерлейкин 10 показывают высокую гомологию - порядка 80%.Interleukin 10 (or IL-10) is a cytokine and until recently was perceived as an anti-inflammatory cytokine. It is a homodimer with a molecular weight of approximately 37-39 kDa. Human and mouse interleukin 10 show high homology - about 80%.

IL-10 способен подавлять ангиогенез, метастазирование, а также оказывать прямой противоопухолевый эффект (Martin Oft, IL-10: Master Switch from Tumor-Promoting Inflammation to Antitumor Immunity, Cancer Immunology at the Crossroads: Experimental Immunotherapies, March 2014, Volume 2, Issue 3, 10.1158/2326-6066.CIR-13-0214).IL-10 is able to suppress angiogenesis, metastasis, and also have a direct antitumor effect (Martin Oft, IL-10: Master Switch from Tumor-Promoting Inflammation to Antitumor Immunity, Cancer Immunology at the Crossroads: Experimental Immunotherapies, March 2014, Volume 2, Issue 3, 10.1158/2326-6066.CIR-13-0214).

Было показано, что одним из вероятных противоопухолевых эффектов IL-10 является его активирующее влияние на CD8-лимфоциты, экспрессирующие PD-1. IL-10 приводит к усилению антиапоптотических внутриклеточных каскадов, что способствует выживанию цитотоксических лимфоцитов в опухолевом микроокружении (Martin Oft, Immune regulation and cytotoxic T cell activation of IL-10 agonists - Preclinical and clinical experience, Seminars in Immunology, Volume 44, August 2019, DOI: 10.1016/j.smim.2019.101325).It has been shown that one of the likely antitumor effects of IL-10 is its activating effect on CD8 lymphocytes expressing PD-1. IL-10 leads to increased anti-apoptotic intracellular cascades, which promotes the survival of cytotoxic lymphocytes in the tumor microenvironment (Martin Oft, Immune regulation and cytotoxic T cell activation of IL-10 agonists - Preclinical and clinical experience, Seminars in Immunology, Volume 44, August 2019, DOI: 10.1016/j.smim.2019.101325).

IL-10 характеризуется коротким временем полужизни в плазме из-за небольшого размера приблизительно 37-39 кДа, что приводит к быстрому почечному клиренсу, фактически время его полужизни в системном компартменте составляет 2,5 ч (Braat Н. и др., Interleukin-10-based therapy for inflammatory bowel disease, Expert Opin. Biol. Ther. 3(5), 2003, cc. 725-731). Для повышения времени нахождения в кровотоке, экспозиции, эффективности и для снижения поглощения почками некоторыми авторами применялось пегилирование этого цитокина (Mattos А. и др., PEGylation of interleukin-10 improves the pharmacokinetic profile and enhances the antifibrotic effectivity in CCl₄-induced fibrogenesis in mice, J. Control Release 162, 2012, cc. 84-91 и Mumm J.В. и др., IL-10 elicits IFNγ-dependent tumor immune surveillance, Cancer Cell 20(6), 2011, cc. 781-796). Однако, к недостаткам пэгилирования можно отнести такие потенциальные риски, как иммуногенность, снижение биологической активности пэгилированной молекулы и неоднородность пэгилирования, что может привести к получению терапевтических молекул с различными свойствами (размер, заряд и тд), а так же формирование гидрофильной оболочки вокруг терапевтической молекулы. Кроме того, использование данного подхода позволяет увеличить время полужизни препарата в кровотоке не более чем до 24 часов.IL-10 has a short plasma half-life due to its small size of approximately 37-39 kDa, resulting in rapid renal clearance, with an actual systemic half-life of 2.5 hours (Braat N. et al., Interleukin-10 -based therapy for inflammatory bowel disease, Expert Opin. Biol. Ther. 3(5), 2003, pp. 725-731). To increase the residence time in the bloodstream, exposure, efficiency and to reduce renal uptake, some authors have used PEGylation of this cytokine (Mattos A. et al., PEGylation of interleukin-10 improves the pharmacokinetic profile and enhances the antifibrotic effectivity in CCl ₄ -induced fibrogenesis in mice, J. Control Release 162, 2012, pp. 84-91 and Mumm J.V. et al., IL-10 elicits IFNγ-dependent tumor immune surveillance, Cancer Cell 20(6), 2011, pp. 781-796 ). However, the disadvantages of pegylation include such potential risks as immunogenicity, decreased biological activity of the pegylated molecule and heterogeneity of pegylation, which can lead to the production of therapeutic molecules with different properties (size, charge, etc.), as well as the formation of a hydrophilic shell around the therapeutic molecule . In addition, the use of this approach makes it possible to increase the half-life of the drug in the bloodstream to no more than 24 hours.

Другим способом увеличения времени полужизни IL-10 в плазме заключается в использовании слитых белков, содержащих антитело или его фрагмент и IL-10, для направленного переноса цитокина к воспаленным тканям и накопления в них цитокина.Another way to increase the half-life of IL-10 in plasma is to use fusion proteins containing the antibody or its fragment and IL-10 to target the cytokine to inflamed tissues and accumulate the cytokine there.

Из уровня техники известны статьи (Zheng, X.X. ET AL., A noncytolytic IL-10/Fc fusion protein prevents diabetes, blocks autoimmunity, and promotes suppressor phenomena in NOD mice. J. Immunol. 1997, 158, 4507-4513 и Zheng, X.X. ET AL., Administration of noncytolytic IL-10/Fc in murine models of lipopolysaccharide-induced septic shock and allogeneic islet transplantation. J. Immunol. 1995, 154, 5590-5600), которые описывают иммуноцитокин на основе IL-10 и Fc-фрагмента.Articles known from the prior art (Zheng, X.X. ET AL., A noncytolytic IL-10/Fc fusion protein prevents diabetes, blocks autoimmunity, and promotes suppressor phenomena in NOD mice. J. Immunol. 1997, 158, 4507-4513 and Zheng, X.X. ET AL., Administration of noncytolytic IL-10/Fc in murine models of lipopolysaccharide-induced septic shock and allogeneic islet transplantation. J. Immunol. 1995, 154, 5590-5600), which describe an immunocytokine based on IL-10 and Fc -fragment.

В международных заявках WO2012045334 и WO2014023673 также описывается слитый белок, включающий гетеродимерный комплекс на основе IL-10 и Fc-фрагмента.International applications WO2012045334 and WO2014023673 also describe a fusion protein comprising a heterodimeric complex based on IL-10 and an Fc fragment.

Международная заявка WO2015117930 описывает слитый белок, содержащий антитело IgG-класса и измененную молекулу IL-10, где слитый белок содержит два идентичных полипептида тяжелых цепей и два идентичных полипептида легких цепей и где измененная молекула IL-10 содержит аминокислотную замену, которая снижает аффинность связывания измененной молекулы IL-10 с рецептором IL-10 по сравнению с молекулой IL-10 дикого типа.International application WO2015117930 describes a fusion protein comprising an IgG antibody and an altered IL-10 molecule, wherein the fusion protein contains two identical heavy chain polypeptides and two identical light chain polypeptides, and wherein the altered IL-10 molecule contains an amino acid substitution that reduces the binding affinity of the altered IL-10 molecule. IL-10 molecule with IL-10 receptor compared with wild-type IL-10 molecule.

Вышеуказанные слитые белки (иммуноцитокины) на основе IL-10 и Fc-фрагмента обладают общим недостатком, а именно недостаточной стабильностью в крови, так как они подвержены расщеплению протеазами сыворотки крови.The above fusion proteins (immunocytokines) based on IL-10 and the Fc fragment have a common disadvantage, namely, insufficient stability in the blood, since they are susceptible to cleavage by serum proteases.

В связи с вышесказанным, актуальным является разработка слитых белков (иммуноцитокинов) на основе IL-10 и Fc-фрагмента, которые будут показывать увеличенное временя полужизни в плазме крови по сравнению с IL-10 и будут стабильны за счет устойчивости к расщеплению протеазами сыворотки крови.In connection with the above, it is relevant to develop fusion proteins (immunocytokines) based on IL-10 and the Fc fragment, which will show an increased half-life in blood plasma compared to IL-10 and will be stable due to resistance to cleavage by serum proteases.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Иммуноцитокин, включающий гомодимерный комплекс на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, предлагаемый в настоящем изобретении, как было установлено авторами, обладает увеличенным временем полужизни в плазме крови по сравнению с IL-10 и стабилен за счет устойчивости к расщеплению протеазами сыворотки крови из-за своей уникальной структуры.The immunocytokine, including a homodimeric complex based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1, proposed in the present invention, as found by the authors, has an increased half-life in blood plasma compared to IL-10 and is stable due to its resistance to degradation by serum proteases due to its unique structure.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к иммуноцитокину для активации IL-10Rα рецептора человека, который включает гомодимерный комплекс на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.In one aspect, the present invention relates to an immunocytokine for activation of the human IL-10Rα receptor, which includes a homodimeric complex based on IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, wherein the monomer based on IL-10 and a human IgG1 Fc fragment includes the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует вышеуказанный иммуноцитокин.In one aspect, the present invention relates to an isolated nucleic acid that encodes the above immunocytokine.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.In some embodiments, the isolated nucleic acid is DNA.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:3.In some embodiments, the isolated nucleic acid includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO:3.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:4.In some embodiments, the isolated nucleic acid includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO:4.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, который содержит любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот.In one aspect, the present invention relates to an expression vector that contains any of the above nucleic acids.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения вышеуказанного иммуноцитокина по изобретению, который включает трансформирование клетки вышеуказанным вектором.In one aspect, the present invention relates to a method of obtaining a host cell for producing the above immunocytokine of the invention, which includes transforming the cell with the above vector.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения вышеуказанного иммуноцитокина по изобретению, которая содержит любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот.In one aspect, the present invention relates to a host cell for producing the above immunocytokine of the invention, which contains any of the above nucleic acids.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения препарата, содержащего вышеуказанный иммуноцитокин по изобретению, который заключается в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного иммуноцитокина, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного иммуноцитокина по изобретению.In one aspect, the present invention relates to a method for producing a preparation containing the above immunocytokine of the invention, which consists of culturing said host cell in a culture medium under conditions sufficient to obtain said immunocytokine, if necessary, followed by isolating and purifying the resulting immunocytokine of the invention .

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для активации IL-10Rα рецептора человека, которая содержит вышеуказанный иммуноцитокин по изобретению и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for activating the human IL-10Rα receptor, which contains the above immunocytokine of the invention and one or more pharmaceutically acceptable excipients.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для активации IL-10Rα рецептора человека, которая содержит вышеуказанный иммуноцитокин по изобретению и по меньшей мере одно другое терапевтически активное соединение.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for activating the human IL-10Rα receptor, which contains the above immunocytokine of the invention and at least one other therapeutically active compound.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция используется для лечения онкологического заболевания.In some embodiments, the pharmaceutical composition is used to treat cancer.

В некоторых вариантах онкологическое заболевание выбирают из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, T- и B-клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак лёгкого, рефрактерная В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В-клеточной диффузная лимфома, рак поджелудочной железы, рак яичника, миелодиспластический синдром высокого риска.In some embodiments, the cancer is selected from the group: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer) , hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (Non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, colorectal cancer with high microsatellite instability, leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, multiple myeloma, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, sarcoma, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, Hodgkin lymphoma, T- and B-cell acute lymphoblastic leukemia, small cell lung cancer, refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma, follicular lymphoma, B-cell marginal zone lymphoma, large B-cell diffuse lymphoma, pancreatic cancer glands, ovarian cancer, high-risk myelodysplastic syndrome.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется другое терапевтически активное соединение, которое представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство или средство для гормональной терапии.In some embodiments of the pharmaceutical composition, another therapeutically active compound is used, which is an antibody, a chemotherapeutic agent, or a hormone therapy agent.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется другое терапевтически активное соединение, которое представляет собой ингибитор контрольных точек иммунитета.In some embodiments of the pharmaceutical composition, another therapeutically active compound is used that is an immune checkpoint inhibitor.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется ингибитор контрольных точек иммунитета, который выбран из ингибитора PD-1, ингибитора PD-L1 или ингибитора CTLA-4.In some embodiments of the pharmaceutical composition, an immune checkpoint inhibitor is used that is selected from a PD-1 inhibitor, a PD-L1 inhibitor, or a CTLA-4 inhibitor.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется ингибитор PD- L1, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-L1.Some embodiments of the pharmaceutical composition use a PD-L1 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to PD-L1.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется антитело, которое специфически связывается с PD-L1, выбрано из группы: дурвалумаб, авелумаб, атезолизумаб, манелимаб (manelimab).In some embodiments of the pharmaceutical composition, an antibody that specifically binds to PD-L1 is used, selected from the group: durvalumab, avelumab, atezolizumab, manelimab.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется ингибитор PD-1, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-1.Some embodiments of the pharmaceutical composition use a PD-1 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to PD-1.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется антитело, которое специфически связывается с PD-1, и выбрано из группы: пролголимаб, пембролизумаб, ниволумаб.In some embodiments of the pharmaceutical composition, an antibody is used that specifically binds to PD-1, and is selected from the group: prolgolimab, pembrolizumab, nivolumab.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется ингибитор CTLA-4, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с CTLA-4.Some embodiments of the pharmaceutical composition use a CTLA-4 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to CTLA-4.

В некоторых вариантах фармацевтической композиции используется антитело, которое специфически связывается с CTLA-4, и представляет собой ипилимумаб.Some embodiments of the pharmaceutical composition utilize an antibody that specifically binds to CTLA-4 and is ipilimumab.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации для активации IL-10Rα рецептора человека, которая содержит вышеуказанный иммуноцитокин по изобретению и по меньшей мере одно другое терапевтически активное соединение.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical combination for activating the human IL-10Rα receptor, which contains the above immunocytokine of the invention and at least one other therapeutically active compound.

В некоторых вариантах фармацевтическая комбинация используется для лечения онкологического заболевания.In some embodiments, the pharmaceutical combination is used to treat cancer.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется другое терапевтически активное соединение, которое представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство или средство для гормональной терапии.In some embodiments of the pharmaceutical combination, another therapeutically active compound is used, which is an antibody, a chemotherapeutic agent, or a hormone therapy agent.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется другое терапевтически активное соединение, которое представляет собой ингибитор контрольных точек иммунитета.In some embodiments of the pharmaceutical combination, another therapeutically active compound is used that is an immune checkpoint inhibitor.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется ингибитор контрольных точек иммунитета, который выбран из ингибитора PD-1, ингибитора PD-L1 или ингибитора CTLA-4.In some embodiments of the pharmaceutical combination, an immune checkpoint inhibitor is used that is selected from a PD-1 inhibitor, a PD-L1 inhibitor, or a CTLA-4 inhibitor.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется ингибитор PD- L1, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-L1.Some embodiments of the pharmaceutical combination use a PD-L1 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to PD-L1.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется антитело, которое специфически связывается с PD-L1, выбрано из группы: дурвалумаб, авелумаб, атезолизумаб, манелимаб (manelimab).Some embodiments of the pharmaceutical combination use an antibody that specifically binds to PD-L1, selected from the group: durvalumab, avelumab, atezolizumab, manelimab.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется ингибитор PD-1, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-1.Some embodiments of the pharmaceutical combination use a PD-1 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to PD-1.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется антитело, которое специфически связывается с PD-1, и выбрано из группы: пролголимаб, пембролизумаб, ниволумаб.Some embodiments of the pharmaceutical combination use an antibody that specifically binds to PD-1 and is selected from the group: prolgolimab, pembrolizumab, nivolumab.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется ингибитор CTLA-4, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с CTLA-4.Some embodiments of the pharmaceutical combination use a CTLA-4 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to CTLA-4.

В некоторых вариантах фармацевтической комбинации используется антитело, которое специфически связывается с CTLA-4, и представляет собой ипилимумаб.Some embodiments of the pharmaceutical combination use an antibody that specifically binds to CTLA-4, ipilimumab.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения онкологического заболевания, который включает введение субъекту вышеуказанного иммуноцитокина по изобретению или любой вышеуказанной фармацевтической композиции, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.In one aspect, the present invention relates to a method of treating cancer, which includes administering to a subject in need of such treatment, in a therapeutically effective amount, the above-mentioned immunocytokine of the invention or any of the above-mentioned pharmaceutical compositions.

В некоторых вариантах способа лечения онкологическое заболевание выбрано из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, T- и B-клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак лёгкого, рефрактерная В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В-клеточной диффузная лимфома, рак поджелудочной железы, рак яичника, миелодиспластический синдром высокого риска.In some embodiments of the treatment method, the oncological disease is selected from the group: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer). cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (Non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, colorectal cancer with high microsatellite instability, leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, multiple myeloma, breast cancer, prostate cancer, urinary cancer bladder, sarcoma, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, Hodgkin lymphoma, T- and B-cell acute lymphoblastic leukemia, small cell lung cancer, refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma, follicular lymphoma, B-cell marginal zone lymphoma, large B-cell diffuse lymphoma, pancreatic cancer, ovarian cancer, high-risk myelodysplastic syndrome.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу активации IL-10Rα рецептора человека у субъекта, нуждающегося в такой активации, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества вышеуказанного иммуноцитокина по изобретению или любой вышеуказанной фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве.In one aspect, the present invention provides a method of activating a human IL-10Rα receptor in a subject in need of such activation, which comprises administering to the subject in need of such treatment an effective amount of the above immunocytokine of the invention or any of the above pharmaceutical compositions in a therapeutically effective amount.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного иммуноцитокина по изобретению или любой вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения онкологического заболевания у субъекта, нуждающегося в таком лечении.In one aspect, the present invention relates to the use of the above immunocytokine of the invention or any of the above pharmaceutical compositions for the treatment of cancer in a subject in need of such treatment.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного иммуноцитокина по изобретению и по меньшей мере одного другого терапевтически активного соединения для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, онкологического заболевания.In one aspect, the present invention relates to the use of the above immunocytokine of the invention and at least one other therapeutically active compound for treating a cancer in a subject in need of such treatment.

В некоторых вариантах применения онкологическое заболевание выбрано из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, T- и B-клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак лёгкого, рефрактерная В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В-клеточной диффузная лимфома, рак поджелудочной железы, рак яичника, миелодиспластический синдром высокого риска.In some embodiments, the cancer is selected from the group of: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer ), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (Non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, colorectal cancer with high microsatellite instability, leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, multiple myeloma, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer , sarcoma, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, Hodgkin lymphoma, T- and B-cell acute lymphoblastic leukemia, small cell lung cancer, refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma, follicular lymphoma, B-cell marginal zone lymphoma, large B-cell diffuse lymphoma, cancer pancreas, ovarian cancer, high-risk myelodysplastic syndrome.

В некоторых вариантах применения используется другое терапевтически активное соединение, которое представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство или средство для гормональной терапии.In some applications, another therapeutically active compound is used, which is an antibody, a chemotherapeutic agent, or a hormone therapy agent.

В некоторых вариантах применения используется другое терапевтически активное соединение, которое представляет собой ингибитор контрольных точек иммунитета.In some applications, another therapeutically active compound is used that is an immune checkpoint inhibitor.

В некоторых вариантах применения используется ингибитор контрольных точек иммунитета, который выбран из ингибитора PD-1, ингибитора PD-L1 или ингибитора CTLA-4.In some applications, an immune checkpoint inhibitor is used that is selected from a PD-1 inhibitor, a PD-L1 inhibitor, or a CTLA-4 inhibitor.

В некоторых вариантах применения используется ингибитор PD-L1, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-L1.Some applications use a PD-L1 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to PD-L1.

В некоторых вариантах применения используется антитело, которое специфически связывается с PD-L1, выбрано из группы: дурвалумаб, авелумаб, атезолизумаб, манелимаб (manelimab).In some embodiments, an antibody that specifically binds to PD-L1 is used, selected from the group: durvalumab, avelumab, atezolizumab, manelimab.

В некоторых вариантах применения используется ингибитор PD-1, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-1.Some applications use a PD-1 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to PD-1.

В некоторых вариантах применения используется антитело, которое специфически связывается с PD-1, выбрано из группы: пролголимаб, пембролизумаб, ниволумаб.In some applications, an antibody that specifically binds to PD-1 is used, selected from the group: prolgolimab, pembrolizumab, nivolumab.

В некоторых вариантах применения используется ингибитор CTLA-4, который представляет собой антитело, которое специфически связывается с CTLA-4.Some applications use a CTLA-4 inhibitor, which is an antibody that specifically binds to CTLA-4.

В некоторых вариантах применения используется антитело, которое специфически связывается с CTLA-4, и представляет собой ипилимумаб.In some applications, an antibody that specifically binds to CTLA-4 is used, ipilimumab.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

Фигура 1 представляет собой карту плазмиды pIntA-IL-10Ra-exc-hum-EPEA, содержащей последовательность экстраклеточной части альфа субъединицы рецептора IL-10R человека с пришитым на С-конце EPEA тагом. Figure 1 is a map of the plasmid pIntA-IL-10Ra-exc-hum-EPEA containing the sequence of the extracellular portion of the alpha subunit of the human IL-10R receptor with an EPEA tag fused to the C-terminus.

AmpR - ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллинуAmpR is a gene that provides resistance to ampicillin

pUC - бактериальный ориджин репликацииpUC - bacterial origin of replication

cmv enhanser - энхансер цитомегаловирусаcmv enhancer - cytomegalovirus enhancer

hCMV promoter - эукариотический промотор цитомегаловируса человекаhCMV promoter - eukaryotic promoter of human cytomegalovirus

Intron A - последовательность интрона AIntron A - intron A sequence

Kozak - консенсусная последовательность Козак для инициации трансляции Kozak - Kozak consensus sequence for translation initiation

mIgK Leader - лидерный пептид mIgK Leader - leader peptide

SalI - сайт рестрикции SalISalI - SalI restriction site

IL-10Ra-exc-hum - экстраклеточная часть альфа субъединицы рецептора IL-10 человекаIL-10Ra-exc-hum - extracellular part of the alpha subunit of the human IL-10 receptor

EPEA-tag - последовательность EPEA-таг для очистки белкаEPEA-tag - EPEA-tag sequence for protein purification

KpnI - сайт рестрикции KpnIKpnI - KpnI restriction site

Stop - стоп-кодонStop - stop codon

SV40_PA term - терминатор транскрипции poly(A) SV40SV40_PA term - poly(A) SV40 transcription terminator

EBV ori - эукариотический ориджин репликацииEBV ori - eukaryotic origin of replication

Фигура 2 представляет собой карту плазмиды pIntA-N-Fc-LALA-link-hIL-10, содержащей последовательность N-концевого Fc-фрагмента IgG1 человека с мутациями LALA, del GK и cшитого через линкер c IL-10 человека.Figure 2 is a map of the pIntA-N-Fc-LALA-link-hIL-10 plasmid containing the sequence of the N-terminal Fc fragment of human IgG1 with LALA, del GK mutations and cross-linked with human IL-10.

hCMV promoter - эукариотический промотор цитомегаловируса человека hCMV promoter - eukaryotic promoter of human cytomegalovirus

mIgK Leader - лидерный пептид mIgK Leader - leader peptide

SalI - сайт рестрикции SalISalI - SalI restriction site

Fc-LALA-delGK - последовательность Fc-фрагмента IgG1 человека с LALA-мутацией (L19A, L20A по сквозной нумерации) и делетированными GK (G231, K232 по сквозной нумерации) на С-концеFc-LALA-delGK - sequence of the Fc fragment of human IgG1 with LALA mutation (L19A, L20A by continuous numbering) and deleted GK (G231, K232 by continuous numbering) at the C-terminus

Linker - последовательность линкераLinker - linker sequence

hIL-10 - последовательность IL-10 человекаhIL-10 - human IL-10 sequence

XbaI - сайт рестрикции XbaIXbaI - XbaI restriction site

Stop - стоп-кодонStop - stop codon

Фигура 3 представляет собой электрофорез в ПААГ полученных и выделенных из клеток CHO экстраклеточной части рецепторов IL-10 человека, яванской макаки и кролика.Figure 3 is a PAGE electrophoresis of the extracellular portion of human, cynomolgus and rabbit IL-10 receptors obtained and isolated from CHO cells.

1) Маркеры молекулярной массы белков1) Protein molecular weight markers

2) excIL-10Ra человека 2) human excIL-10Ra

3) excIL-10Ra яванской макаки 3) excIL-10Ra cynomolgus macaque

4) Маркеры молекулярной массы белков4) Protein molecular weight markers

5) excIL-10Ra кролика.5) rabbit excIL-10Ra.

Фигура 4 представляет собой электрофорез в ПААГ полученного и выделенного из клеток CHO рекомбинантного иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10-Fc).Figure 4 is a PAGE electrophoresis of a recombinant immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 according to the invention (IL-10-Fc) obtained and isolated from CHO cells.

1) Маркеры молекулярной массы белков 1) Protein molecular weight markers

2) IL10-Fc 4,5 мкг в редуцирующих условиях2) IL10-Fc 4.5 μg in reducing conditions

3) IL10-Fc 4,5 мкг в нередуцирующих условиях. 3) IL10-Fc 4.5 μg in non-reducing conditions.

Фигура 5 представляет собой график, где показана стабильность иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10+Fc) при хранении в сыворотке человека в течение длительного времени при +37С. По оси Х - время хранения, по оси Y - относительное содержание стабильных молекул в сыворотке (процент от исходного образца). Figure 5 is a graph showing the stability of the immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the human IgG1 Fc fragment of the invention (IL-10+Fc) when stored in human serum for a long time at +37C. The X axis is the storage time, the Y axis is the relative content of stable molecules in the serum (percentage of the original sample).

Фигура 6 представляет собой график, где показана способность иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10+Fc) проявлять пролиферативную активность в сравнение с IL-10. По оси Х - концентрация IL-10 (положительный контроль человеческий рекомбинантный IL-10 производства Peprotech), по оси Y - относительная флуоресценция, отражающая количество жизнеспособных клеток. Для контрольного образца полумаксимальная эффективная концентрация составила 91,7 пМ, для IL-10+Fc по изобретению - 53,3 пМ. Figure 6 is a graph showing the ability of the IL-10-human IgG1 Fc immunocytokine (fusion protein) of the invention (IL-10+Fc) to exhibit proliferative activity compared to IL-10. The X axis is the concentration of IL-10 (positive control human recombinant IL-10 produced by Peprotech), the Y axis is the relative fluorescence, reflecting the number of viable cells. For the control sample, the half-maximal effective concentration was 91.7 pM, for IL-10+Fc according to the invention - 53.3 pM.

Фигура 7 представляет собой график, где показана способность иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10+Fc) вызывать продукцию цитокина IFN-γ активированными цитотоксическими CD8+ Т клетками человека.Figure 7 is a graph showing the ability of the immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the human IgG1 Fc fragment of the invention (IL-10+Fc) to induce production of the cytokine IFN-γ by activated human cytotoxic CD8+ T cells.

Фигура 8 представляет собой график, где показано влияние иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10+Fc) на цитотоксичность CD8+ Т-клеток в отношении клеток-мишеней Raji в сравнении с рекомбинантный человеческим IL-10 производства Peprotech и контролем.Figure 8 is a graph showing the effect of the immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the human IgG1 Fc fragment of the invention (IL-10+Fc) on the cytotoxicity of CD8+ T cells against Raji target cells compared with recombinant human IL-10 from Peprotech and control.

Фигура 9 представляет собой график, где показано отсутствие CDC активности у исследуемого иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10+Fc) в тесте с клеточной линией Jurkat. Контрольное антитело Ритуксимаб вызывает комплемент-опосредованный лизис клеток-мишеней. Figure 9 is a graph showing the lack of CDC activity of the test immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the human IgG1 Fc fragment of the invention (IL-10+Fc) in a test with the Jurkat cell line. The control antibody Rituximab causes complement-mediated lysis of target cells.

Фигура 10 представляет собой график, где показано отсутствие антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC-активности) у исследуемого иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10+Fc) в тесте с клетками-мишенями Jurkat. В качестве положительного контроля использовали анти-PD1 антитело. Figure 10 is a graph showing the absence of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC activity) of a test immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the human IgG1 Fc fragment of the invention (IL-10+Fc) in a cell test - Jurkat targets. An anti-PD1 antibody was used as a positive control.

Фигура 11 представляет собой гистограмму, на которой показано отсутствие аутоцитотоксичности у иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10+Fc) в отношении субпопуляций клеток периферической крови человека в концентрациях 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл:Figure 11 is a bar graph showing the lack of autocytotoxicity of the IL-10-human IgG1 Fc immunocytokine (fusion protein) of the invention (IL-10+Fc) against subpopulations of human peripheral blood cells at concentrations of 0.01 μg /ml, 0.1 µg/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml:

Фигура 11 А) CD4+ T клеток,Figure 11 A) CD4+ T cells,

Фигура 11 Б) CD8+ T клеток,Figure 11 B) CD8+ T cells,

Фигура 11 В) T клеток,Figure 11 B) T cells,

Фигура 11 Г) NK клетки,Figure 11 D) NK cells,

Фигура 11 Д) B клеток.Figure 11 E) B cells.

В качестве положительного контроля использовали анти-CD20 антитело, вызывающее аутоцитотоксичность в отношении В клеток, и анти-CD47 антитело, вызывающее аутоцитотоксичность в отношении NK клеток. Anti-CD20 antibody, which causes autocytotoxicity against B cells, and anti-CD47 antibody, which causes autocytotoxicity against NK cells, were used as positive controls.

Фигура 12 представляет собой гистограмму, отражающую способность иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10-Fc) и комбинации IL-10-Fc по изобретению с анти-mPD1 антителом оказывать противоопухолевую активность у мышей Balb/c с привитой карциномой CT26. В качестве контроля использовали анти-mPD1 антитело.Figure 12 is a histogram showing the ability of the immunocytokine (fusion protein) based on the IL-10 and human IgG1 Fc fragment of the invention (IL-10-Fc) and the combination of the IL-10-Fc of the invention with an anti-mPD1 antibody to exert antitumor activity in Balb/c mice grafted with CT26 carcinoma. An anti-mPD1 antibody was used as a control.

Фигура 13 представляет собой гистограмму, отражающую способность иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10-Fc) и комбинации IL-10-Fc по изобретению с анти-mPD1 антителом оказывать противоопухолевую активность у мышей Balb/c с привитой карциномой CT26. В качестве контроля использовали анти-mPD1 антитело. По оси Y - индекс прироста опухоли (ИПО). Figure 13 is a histogram showing the ability of the immunocytokine (fusion protein) based on the IL-10 and human IgG1 Fc fragment of the invention (IL-10-Fc) and the combination of the IL-10-Fc of the invention with an anti-mPD1 antibody to exert antitumor activity in Balb/c mice grafted with CT26 carcinoma. An anti-mPD1 antibody was used as a control. The Y axis is the tumor growth index (TGI).

Фигура 14 представляет собой гистограмму, отражающую способность иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению (IL-10-Fc) и комбинации IL-10-Fc по изобретению с анти-mPD1 антителом оказывать противоопухолевую активность у мышей Balb/c с привитой карциномой CT26, на гистограмме представлен показатель торможения роста опухоли (ТРО). В качестве контроля использовали анти-mPD1 антитело.Figure 14 is a histogram depicting the ability of the immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 according to the invention (IL-10-Fc) and the combination of IL-10-Fc according to the invention with an anti-mPD1 antibody to exert antitumor activity in Balb/c mice engrafted with CT26 carcinoma, the histogram shows tumor growth inhibition (TGR). An anti-mPD1 antibody was used as a control.

Фигура 15 представляет собой схематичное изображение формата иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению. Figure 15 is a schematic representation of the immunocytokine (fusion protein) format based on IL-10 and human IgG1 Fc fragment according to the invention.

Описание изобретенияDescription of the invention

Определения и общие методыDefinitions and general methods

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области. Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention will have meanings that are commonly understood by those skilled in the art.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.In addition, unless the context otherwise requires, terms in the singular include plural terms, and plural terms include singular terms. In general, the classification and methods of cell culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, analytical chemistry, organic synthesis chemistry, medicinal and pharmaceutical chemistry, and hybridization and protein and nucleic acid chemistry described herein are well known to those skilled in the art. widely used in this field. Enzymatic reactions and purification methods are carried out in accordance with the manufacturer's instructions, as is typically carried out in the art, or as described herein.

«Аффинность связывания» обычно относится к силе совокупных нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, «аффинность связывания» относится к внутренней (характерной, истинной) аффинности связывания, которая отражает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы Х к своему партнеру Y обычно можно представить константой диссоциации (Kd). Желательно, чтобы величина Kd составляла, примерно, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 6 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее. Аффинность можно измерять обычными методами, известными в уровне техники, включая методы по данному описанию. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно быстрее связывают антиген и имеют тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В уровне техники известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из этих методов можно использовать для целей настоящего изобретения.“Binding affinity” generally refers to the strength of the aggregate non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). Unless otherwise specified, “binding affinity” refers to the intrinsic binding affinity that reflects the 1:1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). The affinity of a molecule X for its partner Y can usually be represented by the dissociation constant (Kd). It is desirable that the Kd value is about 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM or less. Affinity can be measured by conventional methods known in the art, including methods described herein. Low-affinity antibodies typically bind antigen slowly and tend to dissociate easily, whereas high-affinity antibodies typically bind antigen more quickly and tend to remain bound longer. Various methods for measuring binding affinity are known in the art, any of these methods can be used for the purposes of the present invention.

Термин «in vitro» относится к биологическому объекту, биологическому процессу или биологической реакции вне организма, смоделированному в искусственных условиях. Например, рост клеток in vitro должен пониматься как рост клеток в среде вне организма, например, в пробирке, культуральном флаконе или микропланшете.The term "in vitro" refers to a biological entity, biological process, or biological reaction outside the body, simulated under artificial conditions. For example, in vitro cell growth should be understood as the growth of cells in an environment outside the body, such as a test tube, culture flask, or microplate.

Термин «IC50» (50% ингибирующая концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемая активность или отклик, например, рост или пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%. Значение IC50 может оцениваться c помощью соответствующих кривых зависимости ответа от логарифма дозы, с использованием специальных статистических программ для обработки кривых. The term "IC50" (50% inhibitory concentration) refers to the concentration of a drug at which a measurable activity or response, such as the growth or proliferation of cells such as tumor cells, is inhibited by 50%. The IC50 value can be estimated using appropriate log dose response curves using special statistical curve processing programs.

Термин ED50 (EC50) (50% эффективная доза/концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемый биологический эффект достигается на 50% (может включать цитотоксичность).The term ED50 (EC50) (50% effective dose/concentration) refers to the drug concentrations at which 50% of the measured biological effect (may include cytotoxicity) is achieved.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.In the present specification and in the following claims, unless the context otherwise requires, the words “have”, “include” and “comprise” or variations thereof such as “has”, “having”, “includes”, “comprising”, “ contains" or "containing" shall be understood to mean the inclusion of the specified whole or group of wholes, but not the exclusion of any other whole or group of wholes.

ИммуноцитокинImmunocytokine

Иммуноцитокин, включающий гомодимерный комплекс на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, предлагаемый в настоящем изобретении, как было неожиданно установлено авторами, обладает увеличенным временем полужизни в плазме крови по сравнению с IL-10 и стабилен за счет устойчивости к расщеплению протеазами сыворотки крови из-за своей уникальной структуры.The immunocytokine, including a homodimeric complex based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1, proposed in the present invention, as was unexpectedly found by the authors, has an increased half-life in blood plasma compared to IL-10 and is stable due to its resistance to degradation by serum proteases blood due to its unique structure.

Формат вышеуказанного иммуноцитокина представлен на фигуре 15.The format of the above immunocytokine is shown in Figure 15.

Термин «иммуноцитокин» обозначает молекулу, содержащую антитело или его фрагменты, напрямую или опосредованно связанные при помощи ковалентной связи с цитокином или его производными. Указанное антитело и указанный цитокин могут быть связаны при помощи линкерного пептида.The term "immunocytokine" refers to a molecule containing an antibody or fragments thereof, directly or indirectly linked by covalent bond to a cytokine or derivatives thereof. Said antibody and said cytokine may be linked using a linker peptide.

Под иммуноцитокином по изобретению подразумевается выделенный иммуноцитокин.By immunocytokine according to the invention is meant an isolated immunocytokine.

Под иммуноцитокином по изобретению подразумевается слитый белок на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека.By immunocytokine according to the invention is meant a fusion protein based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1.

Определение «выделенный» («изолированный»), применяемое для описания различных иммуноцитокинов по данному описанию, означает иммуноцитокин, идентифицированный и выделенный и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой он экспрессируется. Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки.The term "isolated" as used to describe the various immunocytokines herein means an immunocytokine that has been identified and isolated and/or recovered from the cell or cell culture in which it is expressed. Impurities (contaminants) from the natural environment are materials that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and may include enzymes, hormones, and other protein or non-protein solutes. Typically, the isolated polypeptide is obtained through at least one purification step.

Иммуноцитокин по изобретению является рекомбинантным иммуноцитокином.The immunocytokine of the invention is a recombinant immunocytokine.

Термин «рекомбинантный иммуноцитокин» означает иммуноцитокин, который экспрессируется в клетке или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности), которая кодирует иммуноцитокин, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.The term “recombinant immunocytokine” means an immunocytokine that is expressed in a cell or cell line containing a nucleotide sequence(s) that encodes an immunocytokine, wherein the nucleotide sequence(s) are not naturally associated with the cell.

Кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (англ. fragment crystallizable region, Fc region, Fc-фрагмент) - это концевая часть молекулы иммуноглобулина, которая взаимодействует с Fc-рецептором на поверхности клетки и с некоторыми белками системы комплемента. Данное свойство позволяет антителам активировать иммунную систему. Fc-участок IgG, IgA и IgD изотипов состоит из двух одинаковых белковых фрагментов, соответственно, второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей; в случае изотипов IgM и IgE Fc содержит три константных домена тяжелых цепей (домены CH2, CH3 и CH4) в каждой полипептидной цепочке.The crystallizable fragment of immunoglobulin (English fragment crystallizable region, Fc region, Fc fragment) is the terminal part of the immunoglobulin molecule, which interacts with the Fc receptor on the cell surface and with some proteins of the complement system. This property allows antibodies to activate the immune system. The Fc region of IgG, IgA and IgD isotypes consists of two identical protein fragments, respectively, the second and third constant domains of two heavy chains; in the case of the IgM and IgE isotypes, Fc contains three heavy chain constant domains (CH2, CH3 and CH4 domains) in each polypeptide chain.

Рецептор для IL-10 представляет собой гетеротетрамерный комплекс, включающий две молекулы IL-10Rα, также называемые IL-10R1, кодируемые геном IL-10ra и две молекулы IL-10Rβ, также называемые IL-10R2, кодируемые геном IL-10rb. The receptor for IL-10 is a heterotetrameric complex comprising two IL-10Rα molecules, also called IL-10R1, encoded by the IL-10ra gene and two IL-10Rβ molecules, also called IL-10R2, encoded by the IL-10rb gene.

Под IL-10Rα рецептора человека (или CD210a или IL-10R1) подразумевается субъединица α рецептора интерлейкина 10. Молекулярная масса IL-10Rα составляет 90-120 кДа и служит лигандсвязывающей субъединицей рецепторного комплекса.By human IL-10Rα receptor (or CD210a or IL-10R1) is meant the α subunit of the interleukin 10 receptor. The molecular weight of IL-10Rα is 90-120 kDa and serves as the ligand-binding subunit of the receptor complex.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к иммуноцитокину для активации IL-10Rα рецептора человека, который включает гомодимерный комплекс на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, то есть димер, который включает два одинаковых мономера на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер включает аминокислотную последовательность EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSGGGPGSGGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:1).In one aspect, the present invention relates to an immunocytokine for activation of the human IL-10Rα receptor, which includes a homodimeric complex based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1, that is, a dimer that includes two identical monomers based on IL-10 and Fc- fragment of human IgG1, where the monomer includes the amino acid sequence EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSGGGPGSGGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQV KNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:1).

В одном из вариантов настоящее изобретение относится к иммуноцитокину для активации IL-10Rα рецептора человека, который включает гомодимерный комплекс на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, то есть димер, который включает два одинаковых мономера на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.In one embodiment, the present invention relates to an immunocytokine for activation of the human IL-10Rα receptor, which includes a homodimeric complex based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1, that is, a dimer that includes two identical monomers based on IL-10 and Fc- a human IgG1 fragment, wherein the monomer has the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.

Иммуноцитокин по изобретению включает мутации L234A и L235A (LALA) в Fc-фрагменте антитела IgG1 человека для обеспечения безэффекторных свойств иммуноцитокина. Данные мутации присутствуют в вышеуказанном иммуноцитокине, который включает аминокислотную последовательность с SEQ ID NO:1.The immunocytokine of the invention includes the L234A and L235A (LALA) mutations in the Fc portion of the human IgG1 antibody to provide effectorless properties of the immunocytokine. These mutations are present in the above immunocytokine, which includes the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.

В одном из вариантов изобретения иммуноцитокин по изобретению включает лидерный пептид.In one embodiment, the immunocytokine of the invention includes a leader peptide.

В одном из вариантов изобретения иммуноцитокин по изобретению с лидерным пептидом, включает гомодимерный комплекс на основе лидерного пептида, IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, то есть димер, который включает два одинаковых мономера на основе лидерного пептида, IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер имеет аминокислотную последовательность MMSFVSLLLVGILFHATQAEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSGGGPGSGGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:2).In one embodiment, the immunocytokine of the invention with a leader peptide includes a homodimer complex based on the leader peptide, IL-10 and the Fc fragment of human IgG1, that is, a dimer that includes two identical monomers based on the leader peptide, IL-10 and Fc- fragment of human IgG1, where the monomer has the amino acid sequence MMSFVSLLLVGILFHATQAEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSGGGPGSGGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRL RLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:2).

Обозначения «иммуноцитокин по изобретению», «иммуноцитокин на основе IL-10 и Fc», «слитый белок по изобретению», «IL-10-Fc» и «IL-10+Fc» используются в данном описании равнозначно и обозначают вышеуказанный иммуноцитокин по изобретению.The designations “immunocytokine of the invention,” “IL-10 and Fc-based immunocytokine,” “fusion protein of the invention,” “IL-10-Fc,” and “IL-10+Fc” are used interchangeably herein and refer to the above-mentioned immunocytokine of the invention. invention.

Нуклеиновая кислотаNucleic acid

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует вышеуказанный иммуноцитокин по изобретению.In one aspect, the present invention relates to an isolated nucleic acid that encodes the above immunocytokine of the invention.

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.The terms "nucleic acid", "nucleic sequence" or "nucleic acid sequence", "polynucleotide", "oligonucleotide", "polynucleotide sequence" and "nucleotide sequence", as used interchangeably herein, refer to a distinct sequence of nucleotides, modified or unmodified , defining a fragment or region of nucleic acid, containing or not containing unnatural nucleotides and being either double-stranded DNA or RNA, or single-stranded DNA or RNA, or transcription products of these DNAs.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.It should also be mentioned here that this invention does not relate to nucleotide sequences in their natural chromosomal environment, i.e. in its natural state. The sequences of the present invention have been isolated and/or purified, i.e. were taken directly or indirectly, for example by copying, and their environment was at least partially modified. Thus, it should also be understood here as isolated nucleic acids obtained by genetic recombination, for example by host cells, or obtained by chemical synthesis.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия иммуноцитокина, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.An "isolated" nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been identified and separated from at least one contaminant nucleic acid molecule with which it is typically associated in a natural source. The isolated nucleic acid molecule differs from the form or set in which it occurs naturally. Thus, the isolated nucleic acid molecule is different from the nucleic acid molecule that naturally exists in cells. However, the isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule found in cells that normally express the immunocytokine, for example, if the nucleic acid molecule has a chromosomal location that is different from its location in cells in natural conditions.

В одном из вариантов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует мономер слитого белка на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the present invention provides a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that encodes a fusion protein monomer of IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, wherein the monomer comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

В одном из вариантов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует мономер слитого белка на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the present invention provides a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that encodes a fusion protein monomer of IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, wherein the monomer has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

Специалисту в данной области будет очевидно, что слитый белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.One skilled in the art will appreciate that a fusion protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 can be encoded by a wide variety of different DNA sequences, subject to the degeneracy of the genetic code. It is well known to those skilled in the art to obtain such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.

Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.A reference to a nucleotide sequence covers its complement unless otherwise noted. Thus, reference to a nucleic acid having a specific sequence should be understood to include its complementary strand with its complementary sequence.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует мономер слитого белка на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:3.In some embodiments, an isolated nucleic acid that encodes a monomer of a fusion protein based on IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, where the monomer includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует мономер слитого белка на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, имеет нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:3.In some embodiments, an isolated nucleic acid that encodes a monomer of a fusion protein based on IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, where the monomer has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует мономер слитого белка на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:4.In some embodiments, an isolated nucleic acid that encodes a monomer of a fusion protein based on IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, where the monomer includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует мономер слитого белка на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, имеет нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:4.In some embodiments, an isolated nucleic acid that encodes a fusion protein monomer of IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, wherein the monomer has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, has the nucleotide sequence of SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах нуклеиновая кислота по изобретению кодирует мономер слитого белка на основе лидерного пептида, IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека.In some embodiments, the nucleic acid of the invention encodes a fusion protein monomer based on a leader peptide, IL-10, and a human IgG1 Fc fragment.

В некоторых вариантах нуклеиновая кислота, которая кодирует мономер слитого белка на основе лидерного пептида, IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, имеет нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:5.In some embodiments, the nucleic acid that encodes a monomer of a fusion protein based on a leader peptide, IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, where the monomer has the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, has a nucleotide sequence of SEQ ID NO:5.

В некоторых вариантах нуклеиновая кислота, которая кодирует мономер слитого белка на основе лидерного пептида, IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека, где мономер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, имеет нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO:6.In some embodiments, the nucleic acid that encodes a monomer of a fusion protein based on a leader peptide, IL-10 and a human IgG1 Fc fragment, where the monomer has the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, has a nucleotide sequence of SEQ ID NO:6.

Вышеуказанные молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии иммуноцитокина по изобретению.The above nucleic acid molecules can be used to express the immunocytokine of the invention.

Экспрессионный векторExpression vector

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, который содержит любую из вышеуказанных нуклеотидных последовательностей. Настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе. In one aspect, the present invention provides an expression vector that contains any of the above nucleotide sequences. The present invention provides a vector suitable for expressing any of the nucleotide sequences described herein.

Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы»). The term “vector” as used herein means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked. In some embodiments, the vector is a plasmid, i.e. a circular, double-stranded portion of DNA into which additional DNA segments can be ligated. In some embodiments, the vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome. In some embodiments, the vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and mammalian episomal vectors). In other embodiments, vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) can be integrated into the host cell genome upon introduction into the host cell, and thus replicate along with the host gene. Moreover, some vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply “expression vectors”).

Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотную последовательность иммуноцитокина (слитого белка) по изобретению, его частей (например, последовательностей IL-10 или последовательностей второго и третьего константного домена Fc-фрагмента) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноцитокин (слитый белок) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека по изобретению или его фрагментам.The present invention relates to vectors containing nucleic acid molecules that encode the amino acid sequence of the immunocytokine (fusion protein) of the invention, parts thereof (for example, IL-10 sequences or second and third Fc fragment constant domain sequences) as described herein. The present invention further relates to vectors containing nucleic acid molecules encoding the immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the human IgG1 Fc fragment of the invention or fragments thereof.

Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена иммуноцитокина и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses such as cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus, cosmid, YAC, EBV-derived episomes and the like. DNA molecules can be ligated into a vector such that the transcription and translation control sequences in the vector perform the intended function of regulating DNA transcription and translation. The expression vector and expression control sequences can be selected to be compatible with the expression host cell used. DNA molecules can be introduced into the expression vector by standard methods (for example, by ligating complementary restriction sites on the immunocytokine gene fragment and the vector, or by blunt-end ligation if restriction sites are missing).

Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.The expression "control sequences" refers to DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. Suitable control sequences for prokaryotes are, for example, a promoter, optionally an operator and a ribosome binding site. As is known, promoters, polyadenylation signals and enhancers are present in eukaryotic cells.

Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связан» обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными.A nucleic acid is "operably linked" if it is in a functional relationship with another nucleotide sequence. For example, the DNA of a presequence or secretory leader sequence is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects transcription of the sequence; a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is located in a manner that can facilitate translation. Generally, "operably linked" means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence, contiguous and in reading phase. However, enhancers do not have to be contiguous.

Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный (лидерный) пептид, который облегчает выработку иммуноцитокина клеткой-хозяином. Ген иммуноцитокина может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный (лидерный) пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноцитокина. Сигнальным (лидерным) пептидом может быть сигнальный (лидерный) пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный (лидерный) пептид белка не иммуноглобулиновой природы).The recombinant expression vector may also encode a signal (leader) peptide that facilitates the production of an immunocytokine by the host cell. The immunocytokine gene can be cloned into a vector such that the signal (leader) peptide is linked to the amino terminus of the immunocytokine chain. The signal (leader) peptide may be an immunoglobulin signal (leader) peptide or a heterologous signal peptide (ie, a signal (leader) peptide of a protein of a non-immunoglobulin nature).

Рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов иммуноцитокина в клетке-хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP)), вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.Recombinant expression vectors of the present invention may carry regulatory sequences that control the expression of immunocytokine genes in a host cell. Those skilled in the art will appreciate that the design of an expression vector, including the choice of regulatory sequences, may depend on factors such as the selection of the host cell for transformation, the level of expression of the desired protein, etc. Preferred regulatory sequences for a mammalian host expression cell include viral elements that provide high level expression of proteins in mammalian cells, such as promoters and/or enhancers derived from a retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (eg, CMV promoter/enhancer), simian virus 40 (SV40) (eg, SV40 promoter/enhancer), adenovirus (eg, adenovirus large late promoter (AdMLP)), polyoma virus, as well as strong mammalian promoters such as the native immunoglobulin promoter or the actin promoter. Methods for expressing polypeptides in bacterial or fungal cells, such as yeast cells, are also well known in the art.

В дополнение к генам иммуноцитокина и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор.In addition to the immunocytokine genes and regulatory sequences, the recombinant expression vectors of the invention may carry additional sequences, such as sequences that regulate the replication of the vector in host cells (eg, origins of replication) and selectable marker genes. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced.

Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.The term "expression control sequence" as used herein refers to polynucleotide sequences that are necessary to influence the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated. Expression control sequences include the corresponding transcription initiation, termination, promoter and enhancer sequences; efficient RNA processing signals such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (ie, the Kozak consensus sequence); sequences that increase protein stability; and, if desired, sequences that enhance protein secretion. The nature of such control sequences varies depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, such control sequences typically include promoters and transcription termination sequences. The term “control sequences” includes, at a minimum, all components whose presence is essential for expression and processing, and may also include additional components whose presence is beneficial, such as leader sequences and fusion sequences.

Клетки-хозяева и способ их полученияHost cells and method of obtaining them

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения иммуноцитокина по изобретению, который включает трансформирование клетки вышеуказанным вектором.In one aspect, the present invention relates to a method of obtaining a host cell for producing an immunocytokine according to the invention, which includes transforming the cell with the above vector.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения иммуноцитокина по изобретению, которая содержит любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот.In one aspect, the present invention provides a host cell for producing an immunocytokine of the invention that contains any of the above nucleic acids.

Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые включают, любую из нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноцитокин по данному изобретению. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.The term "recombinant host cell" (or simply "host cell") as used herein means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced. The present invention relates to host cells, which may include, for example, a vector in accordance with the present invention described above. The present invention also relates to host cells that include any of the nucleic acids encoding the immunocytokine of the present invention. It should be understood that “recombinant host cell” and “host cell” mean not only the specific cell claimed, but also the progeny of such cell. Since modifications may occur in subsequent generations due to mutation or environmental influences, such progeny may not, in fact, be identical to the parent cell, but such cells are still included within the scope of the term “host cell” as used herein.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие иммуноцитокин по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами.Nucleic acid molecules encoding the immunocytokine of the invention and vectors containing these nucleic acid molecules can be used to transfect a suitable mammal or cell thereof, a plant or cell thereof, or a bacterial or yeast host cell. The transformation can occur by any known method for introducing polynucleotides into the host cell. Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, nucleic acid-positively charged polymer complex transfection, nucleic acid-calcium phosphate precipitate transfection, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, transfection with liposome-encapsulated polynucleotides, and direct microinjection. DNA into nuclei. In addition, nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells by viral vectors.

Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (CHO), NS0 клетки, клетки SP2, HEK-293T клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (BHK), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), A549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие иммуноцитокин по изобретению, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, иммуноцитокин продуцируется путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии иммуноцитокина в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения иммуноцитокина в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Иммуноцитокин по изобретению может быть выделен из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.Mammalian cell lines used as hosts for transformation are well known in the art and include many immortalized cell lines available. These include, for example, Chinese hamster ovary (CHO) cells, NS0 cells, SP2 cells, HEK-293T cells, 293 Freestyle cells (Invitrogen), NIH-3T3 cells, HeLa cells, BHK cells, African kidney cells vervet monkey (COS), human hepatocellular carcinoma cells (eg Hep G2), A549 cells and a number of other cell lines. Cell lines are selected by determining which cell lines have high levels of expression and provide the desired characteristics of the protein produced. Other cell lines that can be used are insect cell lines such as Sf9 or Sf21 cells. When recombinant expression vectors encoding the immunocytokine of the invention are introduced into mammalian host cells, the immunocytokine is produced by culturing the host cells for a time sufficient to express the immunocytokine in the host cells or, preferably, releasing the immunocytokine into the growth medium in which the cells are grown -owners. The immunocytokine of the invention can be isolated from the culture medium using standard protein purification methods. Plant host cells, for example, include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potato, etc. Host bacterial cells include Escherichia and Streptomyces species. Yeast host cells include Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris.

Кроме того, уровень продукции иммуноцитокина по изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. In addition, the level of production of the immunocytokine of the invention from a producing cell line can be enhanced using a number of known methods. For example, the glutamine synthetase gene expression system (GS system) is common enough to enhance expression under certain conditions.

Вполне вероятно, что иммуноцитокин по изобретению различных клеточных линий или трансгенные животные будут отличаться друг от друга профилем гликозилирования. Однако иммуноцитокин по изобретению, кодируемый молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащий аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, являются частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций.It is likely that the immunocytokine of the invention of different cell lines or transgenic animals will differ from each other in their glycosylation profile. However, the immunocytokine of the invention encoded by the nucleic acid molecules described herein or containing the amino acid sequences described herein are part of the present invention, regardless of the glycosylation state of the binding molecules and generally, regardless of the presence or absence of post-translational modifications.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с использованием человеческих эмбрионов.The above host cell does not refer to a host cell obtained using human embryos.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.The above host cell does not refer to a host cell obtained by modifying the genetic integrity of human germline cells.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения препарата, содержащего иммуноцитокин по изобретению, который заключается в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного иммуноцитокина, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного иммуноцитокина.In one aspect, the present invention relates to a method for producing a preparation containing an immunocytokine according to the invention, which consists of culturing said host cell in a culture medium under conditions sufficient to produce said immunocytokine, if necessary, and then isolating and purifying the resulting immunocytokine.

Настоящее изобретение относится к способам получения иммуноцитокина по изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения иммуноцитокина, как определено в настоящем документе, содержащему получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать иммуноцитокин по изобретению, культивированию указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии продукции иммуноцитокина по изобретению, и выделение полученного иммуноцитокина. Иммуноцитокин, полученный такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках-хозяевах, упоминается в данном документе как «рекомбинантный иммуноцитокин». Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и иммуноцитокину, полученному аналогично.The present invention relates to methods for producing the immunocytokine of the invention. One embodiment of the invention relates to a method for producing an immunocytokine, as defined herein, comprising obtaining a recombinant host cell capable of expressing an immunocytokine of the invention, culturing said host cell under conditions suitable for expressing production of the immunocytokine of the invention, and isolating the resulting immunocytokine. The immunocytokine produced by such expression in such recombinant host cells is referred to herein as a “recombinant immunocytokine”. The invention also relates to the progeny cells of such host cells and the immunocytokine obtained in a similar manner.

Фармацевтическая композиция и фармацевтическая комбинацияPharmaceutical composition and pharmaceutical combination

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для активации IL-10Rα рецептора человека, которая содержит иммуноцитокин по изобретению и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for activating the human IL-10Rα receptor, which contains an immunocytokine of the invention and one or more pharmaceutically acceptable excipients.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя иммуноцитокин по изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, полиолы, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутриглазного, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения"Pharmaceutical composition" means a composition comprising an immunocytokine according to the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, solvents, diluents, carriers, auxiliary, distributing and receptive agents, agents delivery agents, such as preservatives, stabilizers, fillers, disintegrants, humectants, emulsifiers, suspending agents, thickeners, sweeteners, flavorings, flavorings, antibacterial agents, fungicides, lubricants, sustained delivery regulators, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage . Examples of suspending agents are ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene, sorbitol and sorbitol ether, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth, and mixtures of these substances. Protection against the action of microorganisms can be provided by a variety of antibacterial and antifungal agents, such as parabens, chlorobutanol, sorbic acid and the like. The composition may also include isotonic agents, for example, sugars, polyols, sodium chloride and the like. Prolonged action of the composition can be achieved using agents that slow down the absorption of the active principle, for example, aluminum monostearate and gelatin. Examples of suitable carriers, solvents, diluents and delivery vehicles include water, ethanol, polyalcohols, as well as mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil) and injectable organic esters (such as ethyl oleate). Examples of fillers are lactose, milk sugar, sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate and the like. Examples of grinders and distributing agents are starch, alginic acid and its salts, and silicates. Examples of lubricants are magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, talc, and high molecular weight polyethylene glycol. A pharmaceutical composition for oral, sublingual, transdermal, intraocular, intramuscular, intravenous, subcutaneous, topical or rectal administration of an active principle, alone or in combination with another active principle, can be administered to animals and humans in a standard form of administration as a mixture with traditional pharmaceutical carriers . Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, gelatin capsules, pills, powders, granules, chewing gums and oral solutions or suspensions, sublingual and buccal administration forms, aerosols, implants, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal or intraocular administration forms and rectal administration forms

Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от иммуноцитокина по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.The term "excipient" or "excipient" is used herein to describe any component other than the immunocytokine of this invention. These are substances of inorganic or organic origin, used in the production process of medicines to give them the necessary physical and chemical properties.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.The term "pharmaceutically acceptable" means one or more compatible liquid or solid components that are suitable for administration to a mammal, preferably a human.

Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату иммуноцитокина проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.The term “buffer”, “buffer composition”, “buffering agent” refers to a solution capable of maintaining the pH value due to the interaction of the acidic and alkaline components included in its composition, which allows the immunocytokine preparation to exhibit resistance to changes in pH. In general, pH values of the pharmaceutical composition from 4.0 to 8.0 are preferred. As buffering agents, for example, acetate, phosphate, citrate, histidine, succinate, etc. can be used. buffer solutions, but not limited to them.

Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата иммуноцитокина по изобретению. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг. В качестве изотонических агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.The terms “tonic agent,” “osmolytic,” or “osmotic agent,” as used herein, refer to an excipient that can adjust the osmotic pressure of the liquid immunocytokine preparation of the invention. An "isotonic" drug is a drug that has an osmotic pressure equivalent to that of human blood. Isotonic drugs typically have an osmotic pressure of approximately 250 to 350 mOsm/kg. Polyols, mono- and disaccharides, amino acids, metal salts such as sodium chloride, etc. can be used as isotonic agents, but are not limited to them.

Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно-активные вещества, например , полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner), Плуроник (Pluronic)), натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.By "stabilizer" is meant an excipient or a mixture of two or more excipients that provides physical and/or chemical stability to the active agent. Amino acids can be used as stabilizers, for example, but not limited to, arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline; surfactants, e.g. polysorbate 20 (trade name Tween 20), polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene-polypropylene glycol and its copolymers (trade names Poloxaner, Pluronic), sodium dodecyl sulfate (SDS) ), but not limited to them; antioxidants, for example, but not limited to, methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, sulfuric acid salts, etc.; chelating agents, for example, but not limited to, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), sodium citrate and the like.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для активации IL-10Rα рецептора человека, которая содержит иммуноцитокин по изобретению и по меньшей мере одно другое терапевтически активное соединение.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for activating the human IL-10Rα receptor, which contains an immunocytokine of the invention and at least one other therapeutically active compound.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция или фармацевтическая комбинация используется для лечения онкологического заболевания.In some embodiments, the pharmaceutical composition or pharmaceutical combination is used to treat cancer.

«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, чтобы «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию. “Treat,” “cure,” and “therapy” refer to a method of alleviating or eliminating a biological disorder and/or at least one of its associated symptoms. As used herein, to “alleviate” a disease, disease or condition means to reduce the severity and/or frequency of symptoms of the disease, disorder or condition. In addition, references to “treatment” contained herein include references to curative, palliative, and preventative therapies.

Термины «онкологическое заболевание», «рак» или «раковый» относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым(/-ой) ростом/пролиферацией клеток. Примеры онкологических заболеваний включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак органов ЖКТ, включая рак желудка, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия и матки, карциному слюнных желез, рак почки (почечноклеточную карциному), рак предстательной железы (рак простаты), рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, карциному анального канала, карциному пениса, меланому и различные типы рака головы и шеи.The terms “cancer,” “cancer,” or “cancerous” refer to or describe a physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth/proliferation. Examples of cancers include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma and leukemia. More specific examples of such cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell lung carcinoma, peritoneal cancer, hepatic cell carcinoma, gastrointestinal cancer including gastric cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer , ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial and uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer (renal cell carcinoma), prostate cancer (prostate cancer), cancer of the external female genitalia organs, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal carcinoma, penile carcinoma, melanoma and various types of head and neck cancer.

В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.In one aspect, the subject of treatment or patient is a mammal, preferably a human subject. The above subject may be male or female of any age.

Иммуноцитокин по изобретению в составе фармацевтической композиции или комбинации находится в терапевтически эффективном количестве.The immunocytokine of the invention is present in a pharmaceutical composition or combination in a therapeutically effective amount.

«Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.A “therapeutically effective amount” is defined as the amount of a therapeutic agent administered during treatment that will relieve, to a certain extent, one or more symptoms of the disease being treated.

Фармацевтические композиции или фармацевтические комбинации по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций или фармацевтических комбинаций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция или комбинация может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы. Пролонгированное действие композиции или комбинации может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного фармацевтического ингредиента, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, масла и инъекционные органические сложные эфиры. The pharmaceutical compositions or pharmaceutical combinations of the present invention and methods for their manufacture will be readily apparent to those skilled in the art. The production of pharmaceutical compositions or pharmaceutical combinations should preferably comply with GMP (good manufacturing practice) requirements. The composition or combination may include a buffer composition, tonic agents, stabilizers and solubilizers. Prolonged action of the composition or combination can be achieved by the use of agents that slow down the absorption of the active pharmaceutical ingredient, for example, aluminum monostearate and gelatin. Examples of suitable carriers, solvents, diluents and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, as well as mixtures thereof, oils and injectable organic esters.

Любой способ введения иммуноцитокина, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для иммуноцитокина по данному изобретению.Any method of administering an immunocytokine accepted in the art can be suitably used for the immunocytokine of this invention.

Фармацевтическая композиция или фармацевтическая комбинация является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.A pharmaceutical composition or pharmaceutical combination is “stable” if the active agent retains its physical stability and/or chemical stability and/or biological activity through its stated shelf life at storage temperature, for example, 2-8 °C. It is preferred that the active agent retains both physical and chemical stability as well as biological activity. The storage period is selected based on the results of stability studies during accelerated and natural storage.

Фармацевтическая композиция или фармацевтическая комбинация по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.The pharmaceutical composition or pharmaceutical combination of this invention may be manufactured, packaged or widely sold as a single unit dose or a plurality of unit dose units in a finished dosage form. As used herein, the term "unit unit dose" means a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a predetermined amount of the active ingredient. The amount of active ingredient is typically equal to the dosage of the active ingredient to be administered to the subject, or a convenient portion of such dosage, such as one-half or one-third of such dosage.

Фармацевтические композиции или фармацевтические комбинации по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения в виде стерильных лекарственных средств, предназначенных для введения в организм человека с нарушением целостности кожных покровов или слизистых оболочек, минуя желудочно-кишечный тракт путем инъекций, инфузий или имплантации. В частности, предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную, трансдермальную инъекцию или инфузию и почечные диализные инфузионные методики. Внутриопухолевая доставка, например, внутриопухолевая инъекция, также может быть применима. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути. Любой способ введения пептидов или белков, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для иммуноцитокина по данному изобретению.The pharmaceutical compositions or pharmaceutical combinations of the present invention are generally suitable for parenteral administration in the form of sterile medicinal products intended for introduction into the human body without breaking the integrity of the skin or mucous membranes, bypassing the gastrointestinal tract by injection, infusion or implantation. In particular, parenteral administration is intended to include, but is not limited to, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, intra-arterial, intrathecal, intraventricular, intraurethral, intracranial, intra-articular, transdermal injection or infusion, and renal dialysis infusion techniques. Intratumoral delivery, such as intratumoral injection, may also be applicable. Regional perfusion is also provided. Preferred embodiments of the invention include intravenous and subcutaneous routes. Any method of administering peptides or proteins accepted in the art can suitably be used for the immunocytokine of this invention.

Инъекционные лекарственные средства могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, флаконах, полимерных контейнерах, преднаполненных шприцах, устройствах для автоинжекции, но, не ограничиваясь ими. Лекарственные средства для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное.Injectable drugs may be manufactured, packaged or sold in unit dosage form, such as, but not limited to, ampoules, vials, polymer containers, pre-filled syringes, auto-injection devices. Drugs for parenteral administration include, but are not limited to, suspensions, solutions, emulsions in oily or aqueous bases, pastes and the like.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является лекарственное средство для парентерального введения, где фармацевтическая композиция или фармацевтическая комбинация предоставлена в сухой форме, то есть, порошка или гранул для растворения в подходящем растворителе (например, стерильной апирогенной воде) перед введением. Такое лекарственное средство может быть получено, например, с помощью лиофилизации, т.е. процесса, известного в данной области техники как сушка из замороженного состояния, включающая в себя замораживание препарата и последующее удаление растворителя из замороженного содержимого.Another embodiment of the invention is a medicament for parenteral administration, wherein the pharmaceutical composition or pharmaceutical combination is provided in dry form, that is, powder or granules for dissolution in a suitable solvent (eg, sterile pyrogen-free water) before administration. Such a medicinal product can be obtained, for example, by lyophilization, i.e. a process known in the art as freeze drying, which involves freezing the preparation and then removing the solvent from the frozen contents.

Иммуноцитокин по изобретению может также вводиться интраназально или ингаляционно, самостоятельно, в виде смеси с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем из ингалятора, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель или спрея. The immunocytokine of the invention may also be administered intranasally or by inhalation, alone, in the form of a mixture with a suitable pharmaceutically acceptable excipient from an inhaler, such as a pressurized aerosol container, pump, spray, nebulizer or nebulizer, which may or may not use a suitable propellant, or in the form nasal drops or spray.

Лекарственное средство для парентерального введения может быть немедленного или модифицированного высвобождения. Лекарственные средства с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.The drug for parenteral administration may be immediate or modified release. Modified release drugs include delayed, sustained, pulsatile, controlled, targeted and programmable release.

Способ лечения/Применение для леченияMethod of treatment/Use for treatment

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения онкологического заболевания, который включает введение субъекту иммуноцитокина по изобретению или любой вышеуказанной фармацевтической композиции по изобретению, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.In one aspect, the present invention relates to a method of treating cancer, which includes administering an immunocytokine of the invention or any of the above pharmaceutical compositions of the invention to a subject in need of such treatment in a therapeutically effective amount.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению иммуноцитокина по изобретению или любой вышеуказанной фармацевтической композиции по изобретению для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, онкологического заболевания.In one aspect, the present invention relates to the use of an immunocytokine of the invention or any of the above pharmaceutical compositions of the invention for treating a cancer in a subject in need of such treatment.

В случае опухоли (например, раковой опухоли) терапевтически эффективное количество иммуноцитокина по изобретению, может уменьшать число раковых клеток; уменьшать начальный размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковыми клетками окружающих органов; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, обусловленных заболеваем. Иммуноцитокин по изобретению может, до некоторой степени, предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может вызывать цитостатический и/или цитотоксический эффект. При терапии рака эффективность in vivo можно определять, например, оценивая продолжительность жизни, время до прогрессирования заболевания (выживаемость без прогрессирования), частоту ответа опухоли на лечение (ЧОО), продолжительность ответа и/или качество жизни.In the case of a tumor (eg, a cancerous tumor), a therapeutically effective amount of the immunocytokine of the invention may reduce the number of cancer cells; reduce the initial size of the tumor; inhibit (ie, slow down to some extent and preferably stop) the infiltration of cancer cells into surrounding organs; inhibit (ie, slow down to some extent and preferably stop) tumor metastasis; inhibit, to some extent, tumor growth; and/or alleviate, to some extent, one or more symptoms associated with the disease. The immunocytokine of the invention can, to some extent, prevent the growth and/or kill existing cancer cells, it can cause a cytostatic and/or cytotoxic effect. In cancer therapy, in vivo efficacy can be determined, for example, by assessing survival, time to disease progression (progression-free survival), tumor response rate (ORR), duration of response, and/or quality of life.

Иммуноцитокин по данному изобретению может назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение иммуноцитокином по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия). В некоторых вариантах осуществления изобретения, иммуноцитокин по изобретению может вводиться совместно или быть сформулирован с другим медикаментом/препаратом для лечения рака.The immunocytokine of this invention can be administered without additional therapeutic treatment, i.e. as an independent therapy. In addition, treatment with an immunocytokine according to this invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy). In some embodiments, the immunocytokine of the invention may be co-administered or formulated with another drug/drug for the treatment of cancer.

Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относятся к иммуноцитокину по изобретению, с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, сслылаются или включают: As used herein, the terms "co-administration", "co-prescribed" and "in combination with" refer to an immunocytokine of the invention with one or more other therapeutic agents intended to mean, refer to or include:

1) одновременное введение такой комбинации иммуноцитокина по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,1) simultaneous administration of such a combination of an immunocytokine of this invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated together in a single dosage form from which said components are released substantially simultaneously to said patient,

2) одновременное введение такой комбинации иммуноцитокина по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,2) the simultaneous administration of such a combination of an immunocytokine according to this invention and a therapeutic agent to a patient who needs treatment, when such components are formulated separately in different dosage forms, the administration of which occurs at substantially the same time to the specified patient, after which the specified components are released substantially simultaneously to the specified patient,

3) последовательное введение такой комбинации иммуноцитокина по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также 3) sequential administration of such a combination of an immunocytokine according to this invention and a therapeutic agent to a patient who needs treatment, when such components are formulated separately from each other in separate dosage forms that are taken in a sequential time specified by the patient with a significant time interval between each administration, after whereby said components are released at substantially different times to said patient; and

4) последовательное введение такой комбинации иммуноцитокина по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.4) sequential administration of such a combination of an immunocytokine according to this invention and a therapeutic agent to a patient who needs treatment, when such components are formulated together in a single dosage form from which the release of said components occurs in a controlled manner, after which they are simultaneously, sequentially or jointly released in one and the same time and/or different times to the specified patient, where each part can be administered by one or different routes.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению иммуноцитокина по изобретению и по меньшей мере одного другого терапевтически активного соединения для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, онкологического заболевания.In one aspect, the present invention relates to the use of an immunocytokine of the invention and at least one other therapeutically active compound for treating a cancer in a subject in need of such treatment.

Иммуноцитокин по данному изобретению могут комбинировать с терапевтическим агентом, который выбирают из группы, включающей: цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство, средство для гормональной терапии или другое терапевтическое антитело.The immunocytokine of this invention may be combined with a therapeutic agent that is selected from the group consisting of a cytotoxic agent, a chemotherapeutic agent, a hormonal therapy agent, or other therapeutic antibody.

Термин «цитотоксическое средство» в используемом в настоящем описании смысле относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты.The term "cytotoxic agent" as used herein refers to a substance that inhibits or prevents cell function and/or causes cell destruction. The term is intended to include radioactive isotopes (e.g. At ²¹¹ , I ¹³¹ , I ¹²⁵ , Y ⁹⁰ , Re ¹⁸⁶ , Re ¹⁸⁸ , Sm ¹⁵³ , Bi ²¹² , P ³² and Lu radioactive isotopes), chemotherapeutic agents and toxins such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins originating from bacteria, fungi, plants or animals, including fragments and/or variants thereof.

«Химиотерапевтическим средством» является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN^®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (например, буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL^®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN^®), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOSAR^®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (например, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин,например, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин A; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновые антибиотики, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMICIN^®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин, доксорубициноНСl в инъецируемых липосомах (DOXOL^®), липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET^®), пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX^®) и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR^®), тегафур (UFTORAL^®), капецитабин (XELODA^®), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK^® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2»-трихлортриэтиламин; трихотецены (например, токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («ara-C»); тиотепа; таксоид, например паклитаксел (TAXOL^®), препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANETM) и доцетаксел (TAXOTERE^®); хлорамбуцил; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; средства на основе платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка, которые предотвращают полимеризацию тубулина из образующихся микротрубочек, включая винбластин (VELBAN^®), винкристин (ONCOVIN^®), виндезин (ELDISINE^®, FILDESIN^®) и винорелбин (NAVELBINE^®); этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен (TARGRETIN^®); бифосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS^® или OSTAC^®), этидронат (DIDROCAL^®), NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат (ZOMETA^®), алендронат (FOSAMAX^®), памидронат (AREDIA^®), тилудронат (SKELID^®) или ризендронат (ACTONEL^®); троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды,например олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, таких как, например, PKC-альфа, Raf, H-Ras и рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE^® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN^®, вакцина LEUVECTIN^® и вакцина VAXID^®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN^®); rmRH (например, ABARELIX^®); BAY439006 (сорафениб; Bayer); SU-11248 (Pfizer); перифосин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб (VELCADE^®); CCI-779; типифарниб (811577); орафениб, ABT510; ингибитор Bcl-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE^®); пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже); ингибиторы тирозинкиназ (см. определение ниже); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-FU и лейковорином.A “chemotherapeutic agent” is a chemical compound useful for the treatment of a malignant tumor. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide ( ^CYTOXAN® ); alkylsulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquinone, meturedopa and uredopa; ethyleneimines and methylmelamines, including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide and trimethylmelamine; acetogenins (eg bullatacin and bullatacinone); delta-9-tetrahydrocannabinol (dronabinol, MARINOL ^® ); beta-lapachone; lapachol; colchicines; betulinic acid; camptothecin (including synthetic analogue topotecan ( ^HYCAMTIN® ), CPT-11 (irinotecan, ^CAMPTOSAR® ), acetylcamptothecin, scopolectin and 9-aminocamptothecin); bryostatin; kallistatin; CC-1065 (including its synthetic analogues adozelesin, carzelesin and bizelesin); podophyllotoxin; podophyllic acid; teniposide; cryptophycins (eg, cryptophycin 1 and cryptophycin 8); dolastatin; duocarmycin (including synthetic analogues KW-2189 and CB1-TM1); eleutherobin; pancratistatin; sarcodictyin; spongistatin; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornaphasine, holophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembiquine, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uramustine; nitrosoureas such as carmustine, chlorosotocin, fotemustine, lomustine, nimustine and ranimustine; antibiotics such as enediyne antibiotics (eg calicheamicin, e.g. calicheamicin gamma II and calicheamicin omega II (see, for example, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemycin, including dinemycin A; esperamycin; as well as the neocarcinostatin chromophore and related chromophores of chromoproteins - enediin antibiotics, aclacinomysins, actinomycin, outramycin, azaserin, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophyllin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-di azo-5-oxo -L-norleucine, doxorubicin (including ADRIAMICIN ^® , morpholinodoxorubicin, cyanomorpholinodoxorubicin, 2-pyrrolinodoxorubicin, doxorubicinHCl in injectable liposomes (DOXOL ^® ), TLC D-99 liposomal doxorubicin (MYOCET ^® ), PEGylated liposomal doxorubicin (CAELYX ^® ) and deoxydoxorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins such as mitomycin C, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rhodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolites such as methotrexate, gemcitabine ( ^GEMZAR® ), tegafur ( ^UFTORAL® ), capecitabine ( ^XELODA® ), epothilone, and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogs such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogues such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprin, thioguanine; pyrimidine analogues such as ancytabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocytabine, floxuridine; drugs that suppress adrenal function, such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; a folic acid compensator such as folinic acid; aceglatone; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; eniluracil; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraxate; defofamine; demecolcine; diazichon; elfornitine; elliptinium acetate; etoglucide; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainine; maytansinoids such as maytansine and ansamitocins; mitoguazone; mitoxantrone; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; phenomet; pirarubicin; losoxantrone; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK ^® polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxane; rhizoxin; sisofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquon; 2,2',2"-trichlorotriethylamine; trichothecenes (eg, T-2 toxin, verracurine A, roridin A and anguidine); urethane; dacarbazine; mannomustin; mitobronitol; mitolactol; pipobromance; gacytosine; arabinoside (“ara-C”); thiotepa; a taxoid such as paclitaxel ( ^TAXOL® ), an engineered albumin-associated nanoparticle formulation of paclitaxel (ABRAXANETM), and docetaxel ( ^TAXOTERE® ); chlorambucil; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum-based agents such as cisplatin, oxaliplatin and carboplatin; Vinca alkaloids, which prevent the polymerization of tubulin from nascent microtubules, including vinblastine (VELBAN ^® ), vincristine (ONCOVIN ^® ), vindesine (ELDISINE ^® , FILDESIN ^® ) and vinorelbine (NAVELBINE ^® ); etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; leucovorin; Novantrone; edatrexate; daunomycin; aminopterin; ibandronate; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO); retinoids such as retinoic acid, including bexarotene ( ^TARGRETIN® ); bisphosphonates such as clodronate (eg, BONEFOS ^® or OSTAC ^® ), etidronate (DIDROCAL ^® ), NE-58095, zoledronic acid/zoledronate (ZOMETA ^® ), alendronate (FOSAMAX ^® ), pamidronate (AREDIA ^® ), tiludronate (SKELID ^® ) or risendronate (ACTONEL ^® ); troxacitabine (1,3-dioxolane nucleoside analogue of cytosine); antisense oligonucleotides, for example oligonucleotides that inhibit gene expression in signaling pathways involved in aberrant cell proliferation, such as, for example, PKC-alpha, Raf, H-Ras and epidermal growth factor receptor (EGF-R); vaccines such as ^THERATOPE® vaccine and gene therapy vaccines such as ^ALLOVECTIN® vaccine, ^LEUVECTIN® vaccine and ^VAXID® vaccine; topoisomerase 1 inhibitor (eg ^LURTOTECAN® ); rmRH (eg ABARELIX ^® ); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (Pfizer); perifosine, COX-2 inhibitor (eg, celecoxib or etoricoxib), proteasome inhibitor (eg, PS341); bortezomib (VELCADE ^® ); CCI-779; tipifarnib (811577); orafenib, ABT510; a Bcl-2 inhibitor such as oblimersen sodium ( ^GENASENSE® ); pixantron; EGFR inhibitors (see definition below); tyrosine kinase inhibitors (see definition below); and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above; and combinations of two or more of the above, such as CHOP, short for combination therapy of cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisolone, and FOLFOX, short for oxaliplatin treatment regimen (ELOXATINTM) in combination with 5-FU and leucovorin.

Также в указанное определение включены средства для гормональной терапии, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены со смешанным профилем агонист/антагонист, включая тамоксифен (NOLVADEX^®), 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, торемифен (FARESTON^®); идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA^®), триоксифен, кеоксифен и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX^®) и EM800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецепторов эстрогена (ER), ингибировать связывание ДНК, усиливать метаболизм ER и/или снижать уровни ER); ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и эксеместан (AROMASIN^®), и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX^®), летрозол (FEMARA^®) и аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVISOR^®), ацетат мегестрола (MEGASE^®), фадрозол, имидазол; агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, включая лейпролид (LUPRON^® и ELIGARD^®), гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, включая прогестины, такие как ацетат мегестрола и ацетат медроксипрогестерона, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD); антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; тестолактон; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств.Also included in this definition are hormonal therapy agents that act by regulating or inhibiting the action of hormones on tumors, such as antiestrogens with a mixed agonist/antagonist profile, including tamoxifen ( ^NOLVADEX® ), 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, toremifene ( ^FARESTON® ); idoxifene, droloxifene, raloxifene ( ^EVISTA® ), trioxifene, keoxifene and selective estrogen receptor modulators (SERMs) such as SERM3; pure antiestrogens without agonist properties, such as fulvestrant (FASLODEX ^® ) and EM800 (such agents may block estrogen receptor (ER) dimerization, inhibit DNA binding, increase ER metabolism, and/or decrease ER levels); aromatase inhibitors, including steroidal aromatase inhibitors such as formestane and exemestane ( ^AROMASIN® ), and non-steroidal aromatase inhibitors such as anastrazole ( ^ARIMIDEX® ), letrozole ( ^FEMARA® ) and aminoglutethimide and other aromatase inhibitors, including vorozole ( ^RIVISOR® ), megestrol acetate (MEGASE ^® ), fadrozole, imidazole; luteinizing hormone releasing hormone agonists including leuprolide (LUPRON ^® and ELIGARD ^® ), goserelin, buserelin and tripterelin; sex steroids, including progestins such as megestrol acetate and medroxyprogesterone acetate, estrogens such as diethylstilbestrol and premarin and androgens/retinoids such as fluoxymesterone, all-trans retinoic acid and fenretinide; onapristone; antiprogesterones; estrogen receptor down-regulators (ERDs); antiandrogens such as flutamide, nilutamide and bicalutamide; testolactone; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above; as well as a combination of two or more of the above means.

Другим терапевтическим средством, которое может применяться в комбинации с иммуноцитокином по данному изобретению может быть терапевтическое антитело, которое выбирают из группы: антитела к PD-1 (например, пролголимаб, пембролизумаб или ниволумаб), антитела к PD-L1, антитела к CTLA4, антитела к анти 4-1BB, антитела к OX40, антитела к GITR, антитела к CD20 (например, ритуксимаб), антитела к HER2 (например, трастузумаб или пертузумаб), антитела к VEGF (например, бевацизумаб) или их комбинации.Another therapeutic agent that may be used in combination with an immunocytokine of this invention may be a therapeutic antibody that is selected from the group: anti-PD-1 antibodies (eg, prolgolimab, pembrolizumab, or nivolumab), anti-PD-L1 antibodies, anti-CTLA4 antibodies, anti-4-1BB, anti-OX40, anti-GITR, anti-CD20 (eg, rituximab), anti-HER2 (eg, trastuzumab or pertuzumab), anti-VEGF (eg, bevacizumab), or combinations thereof.

Термин ингибитор контрольной точки иммунитета (или «чекпойнт-ингибитор») относится к соединениям, которые подавляют активность контрольных точек иммунитета. Ингибирование включает снижение функции или полную блокаду. Примеры ингибиторных молекул контрольных точек включают B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, KIR, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, TIGIT и VISTA. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек является антителом, специфически распознающим белок иммунных контрольных точек. Известен ряд ингибиторов иммунных контрольных точек, и в ближайшем будущем могут быть разработаны альтернативные ингибиторы иммунных контрольных точек по аналогии с этими известными ингибиторами белков иммунных контрольных точек. Ингибиторы иммунных контрольных точек включают, в качестве неограничивающих примеров, пептиды, антитела, молекулы нуклеиновой кислоты и низкомолекулярные соединения.The term immune checkpoint inhibitor (or "checkpoint inhibitor") refers to compounds that inhibit the activity of immune checkpoints. Inhibition includes reduced function or complete blockade. Examples of checkpoint inhibitory molecules include B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, KIR, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, TIGIT, and VISTA. In some embodiments, the immune checkpoint inhibitor is an antibody that specifically recognizes an immune checkpoint protein. A number of immune checkpoint inhibitors are known, and alternative immune checkpoint inhibitors similar to these known immune checkpoint protein inhibitors may be developed in the near future. Immune checkpoint inhibitors include, but are not limited to, peptides, antibodies, nucleic acid molecules and small molecules.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу активации IL-10Rα рецептора человека у субъекта, нуждающегося в такой активации, который включает введение субъекту эффективного количества иммуноцитокина по изобретению или любой вышеуказанной фармацевтической композиции по изобретению, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.In one aspect, the present invention provides a method of activating a human IL-10Rα receptor in a subject in need of such activation, which comprises administering to a subject in need of such treatment an effective amount of an immunocytokine of the invention or any of the above pharmaceutical compositions of the invention in need of such treatment in a therapeutically effective amount.

Подразумевается, что иммуноцитокин по данному изобретению может использоваться в способах лечения, как описано выше, может использоваться в применении для лечения, как описано выше, и/или может использоваться в производстве медикаментов для лечения, как описано выше. It is intended that the immunocytokine of this invention may be used in methods of treatment as described above, may be used in a treatment application as described above, and/or may be used in the manufacture of medicaments for treatment as described above.

Дозы и пути введенияDoses and routes of administration

Иммуноцитокин по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение иммуноцитокина самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных препаратов или методов лечения.The immunocytokine of this invention will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i.e. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result. The therapeutically effective amount may vary depending on factors such as the specific condition being treated, the age, sex, and weight of the patient, and whether administration of the immunocytokine is a stand-alone treatment or is administered in combination with one or more additional drugs or treatments. .

Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (a) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (b) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов. Drug regimens can be adjusted to provide the optimal desired response. For example, a single bolus may be administered, multiple divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally decreased or increased depending on the acuity of the therapeutic situation. It is particularly advantageous to formulate parenteral compositions in unit dosage form for ease of administration and uniformity of dosage. Unit dosage form as used herein refers to physically discrete units suitable as unitary dosages for patients/subjects to be treated; each unit contains a predetermined amount of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect in combination with the required pharmaceutical carrier. The specification for unit dosage forms of the present invention is generally dictated by and directly depends on (a) the unique characteristics of the chemotherapeutic agent and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved, and (b) the limitations inherent in the technique of compounding such active compound for treating sensitivity in subjects.

Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.Thus, those skilled in the art will appreciate from the disclosure provided herein that dosages and dosage regimens will be adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field. This means that the maximum tolerated dose can be easily determined and the effective amount to provide a detectable therapeutic effect for the patient can also be determined, as well as the timing requirements for each agent to achieve a detectable therapeutic effect for the patient. Thus, although certain dosages and dosage regimens are given as examples herein, these examples are not intended to limit in any way the dosages and dosage regimens that may be needed for a patient to practice the present invention.

Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретный иммуноцитокин по изобретению. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.It should be noted that dosage values may vary depending on the type and severity of the condition to be alleviated, and may include one or more doses. In addition, it should be understood that for any particular patient, specific dosage regimens must be adjusted over time according to individual need and at the discretion of the healthcare professional administering or supervising the administration of the compositions, and that the concentration ranges given herein are provided only by way of example and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions. In addition, the dosage regimen of the compositions of this invention can be based on various factors, including the type of disease, age, weight, gender, health conditions of the patient, severity of the condition, route of administration and the specific immunocytokine of the invention. Thus, the dosage regimen may vary widely, but can be determined regularly using standard methods. For example, dosages may be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects such as toxic effects or laboratory values. Thus, the present invention covers individual dose escalation, which is determined by a qualified specialist. Determination of the required dosage and regimens are well known in the relevant art and will be apparent to one skilled in the art upon familiarization with the concepts disclosed herein.

Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.Examples of suitable routes of administration are provided above.

Предполагается, что подходящая доза иммуноцитокина по данному изобретению будет в диапазоне от 0,007-200 мг/кг, предпочтительно 0,007-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Иммуноцитокин по данному изобретению может быть введен, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и, например, вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.It is contemplated that a suitable dose of the immunocytokine of this invention will be in the range of 0.007-200 mg/kg, preferably 0.007-100 mg/kg, including about 0.5-50 mg/kg, for example about 1-20 mg/kg . The immunocytokine of this invention may be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg/kg, for example at least 0.5 mg/kg, including at least 1 mg/kg, for example at least 1 .5 mg/kg, for example, as well as at least 2 mg/kg, for example at least 3 mg/kg, including at least 4 mg/kg, for example at least 5 mg/kg; and, for example, up to a maximum of 50 mg/kg, including up to a maximum of 30 mg/kg, for example, up to a maximum of 20 mg/kg, including up to a maximum of 15 mg/kg. Administration will be repeated usually at suitable intervals, for example once a week, once every two weeks, once every three weeks or once every four weeks, and for as long as is considered appropriate by the responsible physician, which may in some cases increase or reduce dose if necessary.

Осуществление изобретенияCarrying out the invention

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.For a better understanding of the invention, the following examples are provided. These examples are provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any form.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.All publications, patents and patent applications referenced in this specification are incorporated herein by reference. Although the foregoing invention has been described in some detail by way of illustration and example in order to avoid ambiguity, those skilled in the art will appreciate from the teachings disclosed herein that certain changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the appended embodiments. implementation of the invention.

Материалы и общие методы Materials and general methods

Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у: Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы согласно нумерации EU (Edelman G.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, ее. 78- 85; Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).General information regarding the nucleotide sequences of the light and heavy chains of human immunoglobulin is presented in: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service Publishing, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Amino acid chains of antibodies are numbered according to EU numbering (Edelman G.M. et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, ee. 78-85; Kabat E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

Методы рекомбинантной ДНК Recombinant DNA Methods

Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.For DNA manipulation, standard methods were used as described in Sambrook J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Molecular biology reagents were used according to the manufacturers' instructions.

Синтез генов Gene synthesis

Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 т.п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.The required gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments ranging from 300 to 4000 kb in length, which are flanked by unique restriction sites, were assembled by annealing and ligation of oligonucleotides, including PCR amplification and subsequent cloning through the specified restriction sites. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing.

Определение последовательностей ДНК Determination of DNA sequences

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру.DNA sequences were determined by Sanger sequencing.

Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностяхDNA and protein sequence analysis and sequence data processing

Применяли пакет программ фирмы Infomax's Vector NT1 Advance suite, версия 8.0 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.Infomax's Vector NT1 Advance suite, version 8.0, was used to generate, map, analyze, annotate, and illustrate sequences.

Экспрессионные векторы Expression vectors

Для экспрессии описанных антител и антигенов применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для экспрессии в клетках прокариот (E.coli) кратковременной экспрессии в клетках эукариот (например, в клетках CHO). Помимо кассеты экспрессии антитела векторы содержали: сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в Е.coli, гены, придающие устойчивость в Е.coli к различным антибиотикам (например, к ампициллину и канамицину). To express the described antibodies and antigens, variants of expression plasmids intended for expression in prokaryotic cells (E. coli) and transient expression in eukaryotic cells (for example, in CHO cells) were used. In addition to the antibody expression cassette, the vectors contained: an origin of replication that ensures replication of the specified plasmid in E. coli, genes that confer resistance in E. coli to various antibiotics (for example, ampicillin and kanamycin).

Слияние генов, содержащих описанные цепи антитела, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза и сборки генов с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для кратковременных трансфекций создавали большие количества плазмид посредством получения плазмид из трансформированных культур E. coli.Fusion of genes containing the antibody chains described, as described below, was accomplished by PCR and/or gene synthesis and assembly using known recombination methods and procedures by joining appropriate nucleic acid segments, for example, using unique restriction sites in appropriate vectors. Subcloned nucleotide sequences were confirmed by DNA sequencing. For short-term transfections, large quantities of plasmids were generated by obtaining plasmids from transformed E. coli cultures.

Пример 1Example 1

Получение последовательностей генов human IL-10Ra, а также ортологичных генов IL-10Ra Macaca cynomolgus (fascicularis) и IL-10Ra Oryctolagus cuniculus (Rabbit). Obtaining sequences of human IL-10Ra genes, as well as orthologous IL-10Ra genes from Macaca cynomolgus (fascicularis) and IL-10Ra from Oryctolagus cuniculus (Rabbit).

Для клонирования последовательностей экстраклеточных частей рецепторов human IL-10Ra (https://www.uniprot.org/uniprot/Q13651) и IL-10Ra Macaca cynomolgus (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A2K5WJ66) синтезировали олигонуклеотиды по 60 нуклеотидов каждый, образующие полностью перекрывающуюся последовательность гена. Сборку каждого гена производили методом двухраундовой ПЦР, в результате чего получали фрагмент длиной 642 п.о. Далее клонировали экстрактраклеточную часть рецептора в вектор для транзиентной экспрессии pIntA c EPEA-тагом для аффинной очистки белка. To clone the sequences of the extracellular parts of the human IL-10Ra (https://www.uniprot.org/uniprot/Q13651) and Macaca cynomolgus IL-10Ra receptors (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A2K5WJ66), oligonucleotides of 60 nucleotides each, forming a completely overlapping gene sequence. Each gene was assembled using two-round PCR, resulting in a 642-bp fragment. Next, the extracted cell part of the receptor was cloned into the transient expression vector pIntA with an EPEA tag for affinity purification of the protein.

Для клонирования последовательности экстраклеточной части рецептора IL-10Ra Oryctolagus cuniculus из клеток периферической крови кролика была выделена суммарная РНК и наработана кДНК. Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции для получения гена рецептора, фланкированного сайтами рестрикции. Далее клонировали ген рецептора в вектор для транзиентной экспрессии pIntA c EPEA-тагом (фигура 1) для аффинной очистки белка. Клонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК.To clone the sequence of the extracellular part of the IL-10Ra receptor of Oryctolagus cuniculus, total RNA was isolated from rabbit peripheral blood cells and cDNA was generated. The reverse transcription products were used as a template in the polymerase chain reaction to obtain the receptor gene flanked by restriction sites. Next, the receptor gene was cloned into the transient expression vector pIntA with an EPEA tag (Figure 1) for affinity purification of the protein. The cloned nucleotide sequences were confirmed by DNA sequencing.

Пример 2Example 2

Получение последовательности слитого белка IL-10 человека и Fc-фрагмента, а также слитого белка IL-10 кролика и Fc-фрагмента.Obtaining the sequence of the human IL-10 fusion protein and Fc fragment, as well as the rabbit IL-10 fusion protein and Fc fragment.

Для клонирования гена, содержащего последовательность IL-10 человека/кролика и Fc-фрагмента IgG1 человека, осуществляли слияние генов с помощью ПЦР и/или синтеза и сборки генов с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием SOE-PCR (Splicing by overlap extension). Далее клонировали ген слитого белка в вектор для транзиентной экспрессии pIntA (фигура 2). Клонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК.To clone a gene containing the sequence of human/rabbit IL-10 and the Fc fragment of human IgG1, gene fusion was performed using PCR and/or gene synthesis and assembly using known recombination methods and procedures by joining the corresponding nucleic acid segments, e.g. SOE-PCR (Splicing by overlap extension). Next, the fusion protein gene was cloned into the transient expression vector pIntA (Figure 2). The cloned nucleotide sequences were confirmed by DNA sequencing.

Пример 3Example 3

Выделение и очистка рецепторов IL-10R человека, макаки и кролика из суспензионной культуры клеток млекопитающих.Isolation and purification of human, macaque and rabbit IL-10R receptors from mammalian cell suspension culture.

Рекомбинантные белки (рецепторы IL-10Rα кролика, человека и обезьяны, IL-10 кролика) нарабатывали в среде роста клеток CHO-C. После трансфекции клеток экспрессионными векторами проводили орбитальное feed-batch культивирование в бессывороточной среде в течение 5-10 дней. По окончанию культивирования среду центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии на хроматографической системе Akta Pure 25, используя колонку XK 16 (GE Healthcare) с 5 мл CaptureSelect C-tag Affinity Matrix (Thermo Scientific) и Superdex 200 Increase 10\300 GL (GE Healthcare). Культуральную жидкость наносили на колонку с CaptureSelect C-tag Affinity Matrix, после чего отмыли колонку 20mM TrisHCl pH7 c 150mM NaCl и элюировали белок 2M раствором MgCl2 в 20mM TrisHCl pH7 c 150mM NaCl. Далее белок переводили в 20mM TrisHCl pH7 c 150mM NaCl с помощью диализа, после чего концентрировали препарат до 1 мл и наносили на колонку GE Superdex 200 Increase 10\300 GL, уравновешенную раствором 20mM TrisHCl pH7 c 150mM NaCl. Собрали целевой пик и профильтровали полученный раствор (0,22 мкм). Препараты хранили при -70°С. Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза (фигура 3). Recombinant proteins (rabbit, human and monkey IL-10Rα receptors, rabbit IL-10) were produced in CHO-C cell growth medium. After transfection of cells with expression vectors, orbital feed-batch cultivation was carried out in a serum-free medium for 5-10 days. At the end of cultivation, the medium was centrifuged at 2000 g for 20 minutes and filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm. Target proteins were isolated from the culture liquid using affinity chromatography on an Akta Pure 25 chromatography system using an XK 16 column (GE Healthcare) with 5 ml CaptureSelect C-tag Affinity Matrix (Thermo Scientific) and Superdex 200 Increase 10\300 GL (GE Healthcare) . The culture liquid was applied to a column with CaptureSelect C-tag Affinity Matrix, after which the column was washed with 20mM TrisHCl pH7 with 150mM NaCl and the protein was eluted with a 2M solution of MgCl2 in 20mM TrisHCl pH7 with 150mM NaCl. Next, the protein was transferred to 20mM TrisHCl pH7 with 150mM NaCl using dialysis, after which the drug was concentrated to 1 ml and applied to a GE Superdex 200 Increase 10\300 GL column, equilibrated with a solution of 20mM TrisHCl pH7 with 150mM NaCl. The target peak was collected and the resulting solution was filtered (0.22 μm). The preparations were stored at -70°C. The purity of the resulting protein solution was assessed using SDS gel electrophoresis (Figure 3).

Пример 4Example 4

Выделение и очистка иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека (IL-10-Fc) из суспензионной культуры клеток млекопитающих. Isolation and purification of an immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 (IL-10-Fc) from a suspension culture of mammalian cells.

Рекомбинантный белок IL-10-Fc по изобретению нарабатывали в среде роста клеток CHO-C. После трансфекции клеток экспрессионным векторам проводили орбитальное feed-batch культивирование в бессывороточной среде в течение 5-10 дней. Контроль секреции исследуемого иммуноцитокина проводили с использованием системы анализа молекулярных взаимодействий Pall ForteBio Octet RED96 на биосенсорах proteinA.The recombinant IL-10-Fc protein according to the invention was produced in CHO-C cell growth medium. After transfection of cells with expression vectors, orbital feed-batch cultivation was performed in a serum-free medium for 5-10 days. The secretion of the immunocytokine under study was monitored using the Pall ForteBio Octet RED96 molecular interaction analysis system on proteinA biosensors.

По окончанию культивирования среду центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии на хроматографической системе Akta Pure 25, используя колонки HiTrap rProtein A FF, 5ml и HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR (GE Healthcare). Культуральную жидкость наносили на колонку HiTrap rProtein A FF, после чего отмыли колонку PBS и элюировали белок раствором 100мМ цитратного буфера pH 3, после чего нейтрализовали раствор белка добавлением 2M ацетатного буфера рН6 в отношении 1/10 v\V. Далее белок переводили в 20мМ ацетатный буфер рН6 с помощью диализа, после чего концентрировали препарат и наносили на колонку HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR, уравновешенную раствором 200мМ ацетатного буфера рН6. Собрали целевой пик и профильтровали полученный раствор (0,22 мкм). Препарат хранили при -70°С. Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза (фигура 4).At the end of cultivation, the medium was centrifuged at 2000 g for 20 minutes and filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm. Target proteins were isolated from the culture liquid using affinity chromatography on an Akta Pure 25 chromatography system using HiTrap rProtein A FF, 5ml and HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR columns (GE Healthcare). The culture liquid was applied to a HiTrap rProtein A FF column, after which the column was washed with PBS and the protein was eluted with a solution of 100 mM citrate buffer pH 3, after which the protein solution was neutralized by adding 2 M acetate buffer pH6 in a ratio of 1/10 v\V. Next, the protein was transferred to 20 mM acetate buffer pH6 using dialysis, after which the drug was concentrated and applied to a HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column equilibrated with a solution of 200 mM acetate buffer pH6. The target peak was collected and the resulting solution was filtered (0.22 μm). The drug was stored at -70°C. The purity of the resulting protein solution was assessed using SDS gel electrophoresis (Figure 4).

Пример 5Example 5

Кинетические исследования аффинности и специфичности взаимодействия иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека (IL-10-Fc) с рецепторами IL-10Rα человека, яванской макаки, мыши и кролика с помощью Forte Bio OctetRed96.Kinetic studies of the affinity and specificity of the interaction of an immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 (IL-10-Fc) with the human, cynomolgus, mouse and rabbit IL-10Rα receptors using Forte Bio OctetRed96.

Оценку связывания IL-10-Fc человека по изобретению с рецептором IL-10 человека, а также рецепторами IL-10Rα яванской макаки, мыши и кролика провели методом биослойной интерферометрии на приборе OctetRed96 (Pall). На сенсоры AR2G связали IL-10-Fc согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Затем сенсоры с иммобилизованным IL-10 погружали в лунки с рецептором IL-10Rα человека, макаки, мыши или кролика. После ассоциации интерлейкина и рецептора сенсоры погружались в рабочий раствор для последующей стадии диссоциации. Полученные сенсограммы с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Согласно полученным данным (Таблица 1) IL-10-Fc по изобретению связывается с IL-10 рецепторами человека, яванской макаки, мыши. The binding of human IL-10-Fc according to the invention to the human IL-10 receptor, as well as the cynomolgus macaque, mouse and rabbit IL-10Rα receptors, was assessed by biolayer interferometry using an OctetRed96 device (Pall). AR2G sensors were coupled with IL-10-Fc according to the manufacturer's instructions to prepare and immobilize AR2G sensors. IL-10-immobilized sensors were then immersed in human, macaque, mouse, or rabbit IL-10Rα receptor wells. After association of interleukin and receptor, the sensors were immersed in the working solution for the subsequent dissociation stage. The resulting baseline-subtracted sensorgrams were analyzed using the Octet Data Analysis program (version 8.0) according to the standard procedure using a 1:1 interaction model. According to the data obtained (Table 1), the IL-10-Fc according to the invention binds to IL-10 receptors in humans, cynomolgus monkeys, and mice.

Таблица 1. Константы аффинности взаимодействия IL-10-Fc по изобретению с рецепторами IL-10 человека, яванской макаки, мыши и кролика. Table 1. Affinity constants for the interaction of IL-10-Fc according to the invention with human, cynomolgus, mouse and rabbit IL-10 receptors.

Константа аффинности (KD), MAffinity constant (KD), M Рецептор IL-10 человека, МHuman IL-10 receptor, M Рецептор IL-10 яванской макаки, МCynomolgus monkey IL-10 receptor, M Рецептор IL-10 мыши, МMouse IL-10 receptor, M Рецептор IL-10 кролика, МRabbit IL-10 receptor, M IL-10-FcIL-10-Fc 5.1±0.3 E-095.1±0.3 E-09 3.7±0.4 E-093.7±0.4 E-09 2.1±0.2 E-092.1±0.2 E-09 2.03E-082.03E-08

Пример 6Example 6

Анализ термостабильности иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека (IL-10-Fc). Analysis of the thermostability of an immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 (IL-10-Fc).

Рекомбинантный белок IL10-Fc по изобретению в 20mM ацетатном буфере рН6 нагревали с помощью амплификатора в пластиковой пробирке при 50С в течение 48 часов с последующим переходом на +4С. После окончания программы анализировали пробы до и после прогрева с помощью аналитической гель-хроматографии на колонке TSK Gel G3000 SWxl. Сравнили площади целевых пиков образцов до и после прогрева. Изменение в 7% площади пика димера после нагрева в течение 48 часов свидетельствует о стабильности препарата и возможности длительного хранения (таблица 2).The recombinant IL10-Fc protein according to the invention in 20mM acetate buffer pH6 was heated using a thermocycler in a plastic tube at 50C for 48 hours, followed by a transition to +4C. After the end of the program, samples were analyzed before and after heating using analytical gel chromatography on a TSK Gel G3000 SWxl column. The areas of the target peaks of the samples before and after heating were compared. A change of 7% in the dimer peak area after heating for 48 hours indicates the stability of the drug and the possibility of long-term storage (Table 2).

Таблица 2. Сравнение соотношения площади пиков на хроматограммах препарата IL-10-Fc по изобретению до и после прогреваTable 2. Comparison of peak area ratios in chromatograms of the IL-10-Fc preparation according to the invention before and after heating

ОбразецSample % соотношение пиков% peak ratio Σагрегатов, %Σaggregates, % димер, % dimer, % Σфрагментов, %Σfragments, % До прогреваBefore warming up 1,801.80 97,2597.25 0,960.96 После прогреваAfter warming up 7,997.99 89,9789.97 2,052.05

Пример 7Example 7

Анализ стабильности иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека (IL-10-Fc) при длительном хранении в сыворотке человека при 37С.Analysis of the stability of an immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 (IL-10-Fc) during long-term storage in human serum at 37C.

IL-10 имеет относительно короткий период полувыведения из организма. Например, период полураспада у мышей, измеренный с помощью биоанализа in vitro или по эффективности в системе моделирования септического шока [см. Smith et al., Cellular Immunology 173: 207-214 (1996)], составляет примерно от 2 до 6 часов. В настоящем исследовании под стабильностью понимали снижение концентрации полноразмерных молекул кандидатов IL-10 после хранения в сыворотке человека при +37°С in vitro. Для определения стабильности иммуноцитокин IL-10-Fc разводили в сыворотке человека до концентрации 5 мкг/мл и хранили при +37°С в термостате от 24 ч до 14 дней. В аналогичных условиях хранились образцы чистой сыворотки человека для последующего определения фонового значения концентраций исследуемых образцов. После хранения концентрацию образцов определяли методом иммуноферментного анализа. Обсчёт данных и построение графиков выполняли с помощью программного пакета MS Excel (фигура 5). IL-10 has a relatively short half-life in the body. For example, half-life in mice as measured by an in vitro bioassay or by efficacy in a septic shock model system [see Smith et al., Cellular Immunology 173: 207-214 (1996)] is approximately 2 to 6 hours. In the present study, stability was defined as a decrease in the concentration of full-length IL-10 candidate molecules after storage in human serum at +37°C in vitro. To determine the stability of the immunocytokine IL-10-Fc, it was diluted in human serum to a concentration of 5 μg/ml and stored at +37°C in a thermostat from 24 hours to 14 days. Pure human serum samples were stored under similar conditions for subsequent determination of the background concentrations of the studied samples. After storage, the concentration of the samples was determined by enzyme immunoassay. Data calculation and plotting were performed using the MS Excel software package (Figure 5).

Таким образом, IL-10+Fc по изобретению обладает высокой стабильностью в сыворотке крови за счет устойчивости к расщеплению протеазами сыворотки, которая обеспечивается особенностью структуры данного слитого белка, указанной в SEQ ID NO: 1.Thus, the IL-10+Fc according to the invention has high stability in blood serum due to its resistance to degradation by serum proteases, which is provided by the structural feature of this fusion protein specified in SEQ ID NO: 1.

Пример 8Example 8

Определение пролиферативной активности иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека (IL-10-Fc) в клеточном тесте на MC/9 тучных клетках мыши.Determination of the proliferative activity of an immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 (IL-10-Fc) in a cell test on mouse MC/9 mast cells.

Необходимый этап реализации функции цитокина - это взаимодействие цитокина с его рецептором. Анализ активации рецептора IL-10Rα исследуемыми кандидатами проводили на клеточной линии MC/9 в стандартном пролиферативном тесте в присутствии костимулирующего цитокина IL4. В литературе показано, что IL-10 стимулирует пролиферацию мышиных тучных клеток MC/9 в присутствии IL4 (Thompson-Snipes L et al J Exp Med. 1991 doi: 10.1084/jem.173.2.507 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2118779/). Этот тест ис-пользуется как стандартный для оценки биологической активности коммерчески доступных препаратов рекомбинатного IL-10 человека. Контрольный препарат (IL-10 рекомбинантный человеческий) имеет активность ≤ 2.0 ng/ml в пролиферативном тесте на линии MC/9, заявленную производителем (Peprotech).A necessary step in the implementation of the function of a cytokine is the interaction of the cytokine with its receptor. Analysis of IL-10Rα receptor activation by the test candidates was performed on the MC/9 cell line in a standard proliferation assay in the presence of the co-stimulatory cytokine IL4. The literature has shown that IL-10 stimulates the proliferation of murine MC/9 mast cells in the presence of IL4 (Thompson-Snipes L et al J Exp Med. 1991 doi: 10.1084/jem.173.2.507 https://www.ncbi.nlm. nih.gov/pmc/articles/PMC2118779/). This test is used as a standard test for assessing the biological activity of commercially available recombinant human IL-10 preparations. The control drug (IL-10 recombinant human) has an activity of ≤ 2.0 ng/ml in the proliferation test on the MC/9 line, as declared by the manufacturer (Peprotech).

Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете для работы с суспензионными культурами клеток. Суспензия в каждой лунке содержала 10 000 клеток MC/9 и исследуемые кандидаты (IL-10 рекомбинантный человеческий Peprotech каталожный номер 200-10 и IL-10+Fc по изобретению) в указанной на графике концентрации. Конечный объем суспензии в лунке составлял 150 мкл. Все компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл гентамицина, 10% инактивированной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 10 пг/мл IL4. После добавления всех компонентов планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°С во влажной атмосфере в присутствии 5% CO_2. По окончанию инкубационного периода вносили в лунки 17 мкл красителя Alamar Blue и инкубировали планшет в течение 3-6 ч при 37°С во влажной атмосфере в присутствии 5% CO₂до развития розовой окраски. Измерение флуоресценции проводили при помощи планшетного ридера при длине волны 495/590 нм.The test was carried out in a 96-well culture plate for working with suspension cell cultures. The suspension in each well contained 10,000 MC/9 cells and test candidates (IL-10 recombinant human Peprotech catalog number 200-10 and IL-10+Fc according to the invention) at the concentration indicated on the graph. The final volume of suspension in the well was 150 μl. All suspension components were prepared in RPMI-1640 medium containing 2 mM glutamine, 10 μg/ml gentamicin, 10% inactivated fetal bovine serum (FBS), and 10 pg/ml IL4. After adding all components, the plate was incubated for 72 hours at 37°C in a humidified atmosphere in the presence of 5% CO _2. At the end of the incubation period, 17 μl of Alamar Blue dye was added to the wells and the plate was incubated for 3-6 hours at 37°C in humid atmosphere in the presence of 5% CO ₂ until a pink color develops. Fluorescence measurements were carried out using a plate reader at a wavelength of 495/590 nm.

Таким образом, IL-10-Fc по изобретению активирует рецептор IL-10Rα, что подтверждено в пролиферативном клеточном тесте на клетках линии MC/9 (фигура 6). Полумаксимальная эффективная концентрация (EC50) исследуемого иммуноцитокина IL-10+Fc по изобретению составила 53,3 пМ в данном клеточном тесте, тогда как EC50 контрольного образца рекомбинантного человеческого IL-10 производства Peprotech - 91,7 пМ. Полученные данные свидетельствует о более высокой активности IL-10+Fc по изобретению по сравнению с коммерчески доступным IL-10.Thus, IL-10-Fc according to the invention activates the IL-10Rα receptor, which was confirmed in a cell proliferative test on MC/9 cells (Figure 6). The half-maximal effective concentration (EC50) of the test immunocytokine IL-10+Fc according to the invention was 53.3 pM in this cell test, while the EC50 of the control sample of recombinant human IL-10 produced by Peprotech was 91.7 pM. The data obtained indicate a higher activity of IL-10+Fc according to the invention compared to commercially available IL-10.

Пример 9Example 9

Тест для определения функциональной активности иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека (IL-10-Fc) по выбросу IFN-γ СD8+ Т клетками человека.Test to determine the functional activity of an immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 (IL-10-Fc) by the release of IFN-γ CD8+ T cells by humans.

Антиген независимая активация TCR и CD28 на CD8+ Т лимфоцитах in vitro (через анти-CD3 и анти-CD28 антитела) вызывает экспрессию PD1 на поверхности клеток, что приводит к подавлению активности цитотоксических лимфоцитов и впоследствии к их истощению. Одновременно с этим происходит экспрессия на клеточной поверхности рецептора IL-10Rα, активация которого при взаимодействии с IL-10 оказывает антиапоптотический эффект, что способствует выживанию в микроокружении опухоли цитотоксических Т клеток, продуцирующих различные цитокины, в том числе IFN-γ.Antigen independent activation of TCR and CD28 on CD8+ T lymphocytes in vitro (via anti-CD3 and anti-CD28 antibodies) induces cell surface expression of PD1, leading to suppression of cytotoxic lymphocyte activity and subsequent depletion. At the same time, expression of the IL-10Rα receptor occurs on the cell surface, the activation of which, when interacting with IL-10, has an anti-apoptotic effect, which promotes the survival of cytotoxic T cells in the tumor microenvironment, producing various cytokines, including IFN-γ.

Периферические мононуклеарные клетки крови человека (PBMCs) были изолированы из цельной крови здорового донора путём центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Далее из суспензии клеток PBMCs выделяли CD8+ Т клетки на магнитной колонке с помощью коммерческого набора. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from healthy donor whole blood by Ficoll density gradient centrifugation. Next, CD8+ T cells were isolated from the PBMC cell suspension on a magnetic column using a commercial kit.

Тест проводили в 96-луночном планшете с предварительно иммобилизованными в лунках aнти-CD3 антителами (1 мкг/мл). Суспензия в каждой лунке содержала 30 000 CD8+ Т клеток, а также анти-CD28 антитело в концентрации 1 мкг/мл. Конечный объем клеточной суспензии и антител в лунке составлял 200 мкл, все компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS. Планшет инкубировали в течение 3 дней при 37°С, 5% CO₂. На 4-ый день инкубации клетки собирали и отмывали от анти-CD28 антитела центрифугированием. Полученный клеточный осадок суспендировали в среде RPMI-1640 с 10% FBS в концентрации 0,3*10⁶клеток/мл. В лунки нового заранее подготовленного 96-луночного планшета для ИФА с иммобилизованным на пластик анти-CD3 антителом (1 мкг/мл) вносили по 100 мкл отмытых клеток и 100 мкл антител-кандидатов в указанной на графике концентрации. Планшет инкубировали в течение 3-х дней при 37°С, 5% CO₂. На 4-ый день инкубации из лунок отбирали аликвоты культуральной жидкости и определяли концентрацию IFN-γ.The test was performed in a 96-well plate with anti-CD3 antibodies pre-immobilized in the wells (1 μg/ml). The suspension in each well contained 30,000 CD8+ T cells, as well as anti-CD28 antibody at a concentration of 1 μg/ml. The final volume of cell suspension and antibodies in the well was 200 μl; all components of the suspension were prepared in RPMI-1640 medium containing 10% FBS. The plate was incubated for 3 days at 37°C, 5% CO ₂ . On the 4th day of incubation, cells were collected and washed from anti-CD28 antibodies by centrifugation. The resulting cell sediment was suspended in RPMI-1640 medium with 10% FBS at a concentration of 0.3*10 ⁶ cells/ml. 100 μl of washed cells and 100 μl of candidate antibodies at the concentration indicated on the graph were added to the wells of a new pre-prepared 96-well ELISA plate with anti-CD3 antibody immobilized on plastic (1 μg/ml). The plate was incubated for 3 days at 37°C, 5% CO ₂ . On the 4th day of incubation, aliquots of the culture liquid were taken from the wells and the concentration of IFN-γ was determined.

Таким образом, IL-10+Fc по изобретению показывает способность вызывать продукцию цитокина IFN-γ активированными цитотоксическими CD8+ Т клетками человека. Полумаксимальная эффективная концентрация IL-10-Fc по изобретению в разработанном клеточном тесте на активированных CD8+ Т клетках человека составляет 0,2 нг/мл (фигура 7).Thus, the IL-10+Fc of the invention exhibits the ability to induce production of the cytokine IFN-γ by activated human cytotoxic CD8+ T cells. The half-maximal effective concentration of IL-10-Fc according to the invention in the developed cell test on activated human CD8+ T cells is 0.2 ng/ml (Figure 7).

Пример 10Example 10

Тест на определение влияния иммуноцитокина (слитого белка) на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека (IL-10-Fc) на цитотоксичность CD8+ T клеток человека в отношении клеток-мишеней Raji.Test to determine the effect of an immunocytokine (fusion protein) based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 (IL-10-Fc) on the cytotoxicity of human CD8+ T cells against Raji target cells.

Периферические мононуклеарные клетки крови человека (PBMCs) были изолированы из цельной крови здорового донора путём центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Далее из суспензии клеток PBMCs выделяли CD8+ Т клетки на магнитной колонке. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from healthy donor whole blood by Ficoll density gradient centrifugation. Next, CD8+ T cells were isolated from the PBMC cell suspension using a magnetic column.

В 96-луночный планшет с предварительно иммобилизованными в лунках aнти-CD3 антителами (1 мкг/мл) вносили 200 мкл суспензии, содержащей 30 000 CD8+ Т клеток и 1 мкг/мл анти-CD28 антитела, и инкубировали в течение 3 дней при 37°С, 5% CO₂. Далее клетки собирали, отмывали центрифугированием, суспендировали в среде RPMI-1640 с 10% FBS и вносили по 30 000 в лунки нового заранее подготовленного 96-луночного планшета для ИФА с иммобилизованным на пластик анти-CD3 антителом (1 мкг/мл) и растворов антител-кандидатов в указанной на графике концентрации. Планшет инкубировали в течение 3-х дней при 37°С, 5% CO₂. Далее из лунок планшета отбирали клетки, отмывали их центрифугированием и суспендировали осадки в среде RPMI-1640 10% в концентрации 0,3*10⁶клеток/мл. 200 μl of a suspension containing 30,000 CD8+ T cells and 1 μg/ml anti-CD28 antibody was added to a 96-well plate with anti-CD3 antibodies pre-immobilized in the wells (1 μg/ml) and incubated for 3 days at 37°C. C, 5% CO ₂ . Next, the cells were collected, washed by centrifugation, suspended in RPMI-1640 medium with 10% FBS, and 30,000 were added to the wells of a new pre-prepared 96-well ELISA plate with anti-CD3 antibody immobilized on plastic (1 μg/ml) and antibody solutions -candidates in the concentration indicated on the graph. The plate was incubated for 3 days at 37°C, 5% CO ₂ . Next, cells were selected from the wells of the plate, washed by centrifugation, and the sediments were suspended in RPMI-1640 10% medium at a concentration of 0.3*10 ⁶ cells/ml.

К 2*10⁶ клеток Raji внесли 6,5 мкл раствора Кальцеин-АМ. Инкубировали клетки с кальцеином 30 мин при 37°С в СО₂ инкубаторе. По окончании инкубации клетки дважды отмыли от кальцеина центрифугированием. Приготовили суспензию с концентрацией 0,3*106 клеток/мл.6.5 μl of Calcein-AM solution was added to 2*10 ⁶ Raji cells. Cells were incubated with calcein for 30 min at 37°C in a CO ₂ incubator. At the end of incubation, the cells were washed twice from calcein by centrifugation. A suspension was prepared with a concentration of 0.3*106 cells/ml.

Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете. Суспензия в каждой лунке содержала 30 000 CD8+ Т клеток, 30 000 клеток Raji, меченных кальцеином-АМ, а также анти-CD3/CD20 антитело в конечной концентрации 50 нг/мл. Планшет инкубировали 2,5 часа в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂.The test was carried out in a 96-well culture plate. The suspension in each well contained 30,000 CD8+ T cells, 30,000 calcein-AM-labeled Raji cells, and anti-CD3/CD20 antibody at a final concentration of 50 ng/ml. The plate was incubated for 2.5 hours in an incubator at 37°C, 5% CO ₂ .

За 30 минут до окончания инкубации в лунки с контролем максимального лизиса внесли раствор лизирующего буфера. Измеряли показания флуоресценции на планшетном ридере при 485/538 нм.30 minutes before the end of incubation, a solution of lysis buffer was added to the wells with maximum lysis control. Fluorescence readings were measured on a plate reader at 485/538 nm.

Показано, что культивирование CD8+ T лимфоцитов в присутствии IL-10+Fc по изобретению усиливает их цитотоксическую активность в отношении клеток-мишеней Raji в 7 раз по сравнению с контролем (фигура 8).It has been shown that culturing CD8+ T lymphocytes in the presence of IL-10+Fc according to the invention enhances their cytotoxic activity against Raji target cells by 7 times compared to the control (Figure 8).

Пример 11Example 11

Тест на определение CDC-активности.CDC activity test.

В тесте на определение CDC использовали клеточную линию Jurkat. Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете. Суспензия в каждой лунке содержала по 50 000 клеток Jurkat, а также IL-10+Fc по изобретению в указанной концентрации и комплемент сыворотки крови человека, разведенный 1:4. Конечный объем клеточной суспензии в лунке составлял 150 мкл, все компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 0,1% BSA. Далее планшет инкубировали в течение 4 ч при 37°С, 5% СО₂. В каждую лунку вносили по 15 мкл реактива аламар синий и инкубировали при 37°С, 5% СО₂ 16 ч. В качестве положительного контроля использовали антитело с CDC-активностью Ритуксимаб (СО83031118R) производства ЗАО “Биокад” и клетки-мишени Raji, в той же концентрации, что и клетки Jurkat. Величину флуоресценции оценивали при длине волны возбуждения 544 нм, длине волны испускания - 590 нм, используя планшетный ридер.The Jurkat cell line was used in the CDC detection test. The test was carried out in a 96-well culture plate. The suspension in each well contained 50,000 Jurkat cells, as well as IL-10+Fc according to the invention at the indicated concentration and human serum complement, diluted 1:4. The final volume of cell suspension in the well was 150 μl; all components of the suspension were prepared in RPMI-1640 medium containing 0.1% BSA. Next, the plate was incubated for 4 hours at 37°C, 5% CO ₂ . 15 μl of the Alamar blue reagent was added to each well and incubated at 37°C, 5% CO ₂ for 16 hours. An antibody with CDC activity Rituximab (CO83031118R) produced by Biocad CJSC and Raji target cells were used as a positive control. the same concentration as Jurkat cells. The fluorescence value was assessed at an excitation wavelength of 544 nm and an emission wavelength of 590 nm using a plate reader.

Показано, что IL-10+Fc по изобретению не вызывает опосредованный комплементом лизис (CDC) клеточной линии Jurkat (фигура 9).It was shown that the IL-10+Fc of the invention does not cause complement-mediated lysis (CDC) of the Jurkat cell line (Figure 9).

Пример 12Example 12

Тест на определение ADCC-активности. Test for determining ADCC activity.

В тесте использовали репортерную клеточную линию Jurkat-NFAT-Luc-CD16, созданную на основе клеточной линии Jurkat, стабильно экспрессирующую на поверхности СD16 и содержащую ген, кодирующий люциферазу светляка, под контролем NFAT-промотора; в качестве клеток мишеней использовали Jurkat-PD1 клон 43. Тест проводили с целью подтверждения отсутствия эффекторных свойств у исследуемого иммуноцитокина IL-10+Fc по изобретению.The test used the reporter cell line Jurkat-NFAT-Luc-CD16, created on the basis of the Jurkat cell line, stably expressing CD16 on the surface and containing the gene encoding firefly luciferase under the control of the NFAT promoter; Jurkat-PD1 clone 43 was used as target cells. The test was carried out to confirm the lack of effector properties of the immunocytokine IL-10+Fc under study according to the invention.

Тест проводили в белом культуральном 96-луночном планшете для работы с люминесценцией. Суспензия в каждой лунке содержала 25 000 клеток-эффекторов Jurkat-NFAT-Luc-CD16, 25 000 клеток мишеней Jurkat-PD1, а также IL-10-FC по изобретению в указанной на графике концентрации. В качестве положительного контроля использовали эффекторное антитело анти-PD1 производства ЗАО “Биокад”. Конечный объем клеточной суспензии и иммуноцитокина (IL-10+Fc по изобретению) в лунке составлял 75 мкл, все компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS. После добавления всех компонентов планшеты инкубировали в течение 5 ч при 37°С, 5% CO₂ и далее, с помощью набора для оценки люциферы One-Glo (Promega), измеряли интенсивность люминесценции в лунках. Люминесценцию измеряли на планшетном ридере.The test was carried out in a white 96-well culture plate for working with luminescence. The suspension in each well contained 25,000 Jurkat-NFAT-Luc-CD16 effector cells, 25,000 Jurkat-PD1 target cells, as well as IL-10-FC according to the invention at the concentration indicated in the graph. An anti-PD1 effector antibody produced by ZAO Biocad was used as a positive control. The final volume of cell suspension and immunocytokine (IL-10+Fc according to the invention) in the well was 75 μl, all components of the suspension were prepared in RPMI-1640 medium containing 10% FBS. After adding all components, the plates were incubated for 5 hours at 37°C, 5% CO ₂ and then, using the One-Glo Lucifera assessment kit (Promega), the luminescence intensity in the wells was measured. Luminescence was measured using a plate reader.

Показано, что IL-10+Fc по изобретению не обладает антителозависимой клеточной цитотоксичностью в тесте на репортерной клеточной линии Jurkat-NFAT-Luc-CD16-V176 (фигура 10).It was shown that IL-10+Fc according to the invention does not have antibody-dependent cellular cytotoxicity in a test on the reporter cell line Jurkat-NFAT-Luc-CD16-V176 (Figure 10).

Пример 13Example 13

Тест на определение аутоцитотоксичности.Autocytotoxicity test.

Тест позволяет in vitro оценить вызываемое антителом истощение основных субпопуляций лейкоцитов в крови, что в свою очередь позволяет еще до in vivo исследований оценить безопасность разрабатываемых терапевтических молекул.The test allows in vitro assessment of the antibody-induced depletion of the main subpopulations of leukocytes in the blood, which in turn allows the safety of the therapeutic molecules being developed to be assessed even before in vivo studies.

Тест проводили в культуральном 96-луночном планшете для работы с суспензионными культурами. Суспензия в каждой лунке содержала 300 000 свежевыделенных клеток PBMCs здоровых доноров и IL-10+Fc по изобретению в указанной концентрации, конечный объем клеточной суспензии в лунке составлял 150 мкл. В качестве положительного контроля использовали Obinutuzumab (aCD20) и анти-CD47 антитело. Все компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку. После смешивания PBMCs и антител планшет инкубировали в течение 16 ч при 37°С, 5% CO₂. Далее оценивали в суспензиях долю CD45+, CD56+, CD19+, CD3+, CD4+ и CD8+ субпопуляций PBMCs c помощью прямого окрашивания суспензий флуоресцентно-меченными антителами против соответствующих CD и последующего анализа клеток на проточном цитофлуориметре. Для CD56+, CD19+, CD3+ клеток на графиках приведена доля от CD45+ клеток анализируемой суспензии, для CD4+, CD8+ - доля от CD45+CD3+ клеток.The test was carried out in a 96-well culture plate for working with suspension cultures. The suspension in each well contained 300,000 freshly isolated PBMCs from healthy donors and IL-10+Fc according to the invention at the indicated concentration, the final volume of the cell suspension in the well was 150 μl. Obinutuzumab (aCD20) and anti-CD47 antibody were used as positive controls. All suspension components were prepared in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum. After mixing PBMCs and antibodies, the plate was incubated for 16 hours at 37°C, 5% CO ₂ . Next, the proportion of CD45+, CD56+, CD19+, CD3+, CD4+ and CD8+ subpopulations of PBMCs in the suspensions was assessed using direct staining of the suspensions with fluorescently labeled antibodies against the corresponding CDs and subsequent analysis of the cells on a flow cytometer. For CD56+, CD19+, CD3+ cells, the graphs show the proportion of CD45+ cells in the analyzed suspension, for CD4+, CD8+ - the proportion of CD45+CD3+ cells.

В in vitro тесте на аутоцитотоксичность IL-10+Fc по изобретению не вызывает существенного истощения популяций NK, B и T клеток PBMCs человека (фигуры 11 А, 11 Б, 11 В, 11 Г, 11 Д). При этом контрольное антитело Obinutuzumab (aCD20) показало практически полную деплецию популяции CD20+ B клеток, а анти-CD47 антитело - истощение NK клеток почти на 50%.In an in vitro autocytotoxicity test, the IL-10+Fc of the invention does not cause significant depletion of the NK, B and T cell populations of human PBMCs (Figures 11 A, 11 B, 11 C, 11 D, 11 E). At the same time, the control antibody Obinutuzumab (aCD20) showed almost complete depletion of the CD20+ B cell population, and the anti-CD47 antibody showed a depletion of NK cells by almost 50%.

Пример 14Example 14

Исследование противоопухолевой активности in vivo.Study of antitumor activity in vivo.

Исследование проводили на мышах Balb/c (самцы в возрасте 4-6 недель, с массой тела 18-24 г). Взвесь опухолевых клеток CT26 в объеме 0,1 мл вводили подкожно в правый бок мышей в количестве 2*10⁵ клеток. Когда опухоли достигли приблизительного объема (V=LW2/2) в 70 мм3, животные были распределены на группы, так чтобы средний объем опухоли в группах не отличался более чем на 10%. Введение всех препаратов проводили внутрибрюшинно (i.p.) дважды в неделю в течение 3 недель. Во всех случаях IL-10-Fc по изобретению вводили в дозе 0,1 мг/кг, amPD-1 вводили в дозе 10 мг/кг. Введение amPD-1 в группах с комбинацией IL-10-Fc по изобретению осуществляли на следующий день после введения IL-10-Fc по изобретению. Животным из группы «контроль роста опухоли» вводили буфер. Оценку линейных размеров опухолевого узла осуществляли дважды в неделю. ИПО (индекс прироста опухоли) рассчитывали как отношение объема опухоли в день измерения (1-19) к объему опухоли в день начала лечения.The study was conducted on Balb/c mice (males, 4-6 weeks old, weighing 18-24 g). A suspension of CT26 tumor cells in a volume of 0.1 ml was injected subcutaneously into the right side of mice in an amount of 2*10 ⁵ cells. When the tumors reached an approximate volume (V=LW2/2) of 70 mm3, the animals were divided into groups so that the average tumor volume between groups did not differ by more than 10%. All drugs were administered intraperitoneally (ip) twice a week for 3 weeks. In all cases, IL-10-Fc according to the invention was administered at a dose of 0.1 mg/kg, amPD-1 was administered at a dose of 10 mg/kg. The administration of amPD-1 in the IL-10-Fc combination groups of the invention was carried out the day after the administration of IL-10-Fc of the invention. Animals from the tumor growth control group were injected with buffer. The assessment of the linear dimensions of the tumor node was carried out twice a week. TPI (tumor growth index) was calculated as the ratio of the tumor volume on the day of measurement (1-19) to the tumor volume on the day of treatment.

Показано, что IL-10+Fc по изобретению обладает противоопухолевой активностью в монотерапии, при этом комбинация IL-10+Fc по изобретению с анти-PD1 антителом обладает выраженной синергией в противоопухолевой активности по сравнению с монотерапией как иммуноцитокина IL-10+Fc по изобретению, так и анти-PD-1 антителом (фигуры 12, 13, 14).It has been shown that IL-10+Fc according to the invention has antitumor activity in monotherapy, while the combination of IL-10+Fc according to the invention with an anti-PD1 antibody has a pronounced synergy in antitumor activity compared to monotherapy as an immunocytokine IL-10+Fc according to the invention , and anti-PD-1 antibody (Figures 12, 13, 14).

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> ЗАО "БИОКАД"<110> JSC "BIOCAD"

<120> Иммуноцитокин для активации IL-10Rα рецептора человека и его <120> Immunocytokine for activation of human IL-10Rα receptor and its

применениеapplication

<160> 6<160> 6

<170> BiSSAP 1.3.6<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1<210> 1

<211> 402<211> 402

<212> PRT<212>PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> мономер IL-10-Fc<223> IL-10-Fc monomer

<400> 1<400> 1

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro AlaGlu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 151 5 10 15

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys ProPro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val ValLys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45 35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr ValVal Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60 50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu GlnAsp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 8065 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His GlnTyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys AlaAsp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110 100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln ProLeu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125 115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met ThrArg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140 130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerLys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn TyrAsp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrLys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190 180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val PheSer Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205 195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln LysSer Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220 210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Gly SerSer Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ser

225 230 235 240225 230 235 240

Gly Gly Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr HisGly Gly Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

245 250 255 245 250 255

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala PhePhe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

260 265 270 260 265 270

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn LeuSer Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

275 280 285 275 280 285

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly CysLeu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

290 295 300 290 295 300

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met ProGln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

305 310 315 320305 310 315 320

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser LeuGln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

325 330 335 325 330 335

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His ArgGly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

340 345 350 340 345 350

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys AsnPhe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

355 360 365 355 360 365

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser GluAla Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

370 375 380 370 375 380

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys IlePhe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

385 390 395 400385 390 395 400

Arg AsnArg Asn

<210> 2<210> 2

<211> 421<211> 421

<212> PRT<212>PRT

<220><220>

<223> мономер IL-10-Fc с лидерным пептидом<223> IL-10-Fc monomer with leader peptide

<400> 2<400> 2

Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His AlaMet Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala

1 5 10 151 5 10 15

Thr Gln Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro ProThr Gln Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

20 25 30 20 25 30

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe ProCys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

35 40 45 35 40 45

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val ThrPro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

50 55 60 50 55 60

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe AsnCys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

65 70 75 8065 70 75 80

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro ArgTrp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

85 90 95 85 90 95

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr ValGlu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

100 105 110 100 105 110

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val SerLeu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

115 120 125 115 120 125

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala LysAsn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

130 135 140 130 135 140

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg GluGly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

145 150 155 160145 150 155 160

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly PheGlu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

165 170 175 165 170 175

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro GluTyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

180 185 190 180 185 190

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser PheAsn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

195 200 205 195 200 205

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln GlyPhe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

210 215 220 210 215 220

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His TyrAsn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

225 230 235 240225 230 235 240

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyThr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

245 250 255 245 250 255

Pro Gly Ser Gly Gly Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn SerPro Gly Ser Gly Gly Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser

260 265 270 260 265 270

Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu ArgCys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg

275 280 285 275 280 285

Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln LeuAsp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu

290 295 300 290 295 300

Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly TyrAsp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr

305 310 315 320305 310 315 320

Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu GluLeu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu

325 330 335 325 330 335

Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His ValVal Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val

340 345 350 340 345 350

Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg ArgAsn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg

355 360 365 355 360 365

Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu GlnCys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln

370 375 380 370 375 380

Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys AlaVal Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala

385 390 395 400385 390 395 400

Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met ThrMet Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr

405 410 415 405 410 415

Met Lys Ile Arg AsnMet Lys Ile Arg Asn

420 420

<210> 3<210> 3

<211> 1206<211> 1206

<212> DNA<212> DNA

<220><220>

<223> DNA IL-10-Fc<223> DNA IL-10-Fc

<400> 3<400> 3

gagcccaaat ctagtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgca gagcccaaat ctagtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgca

60 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg

120120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc

180180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggagggagcag

240240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat

300300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc

360360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg

420420

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc

480480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct

540540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc

600600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac

660660

tacacgcaga aaagcctctc cctgtccccg ggtggagggt caggaggtgg tccaggatcg tacacgcaga aaagcctctc cctgtccccg ggtggagggt caggaggtgg tccaggatcg

720720

ggtggctctc ctggacaggg aacccagtcc gagaactcct gcacccactt ccccggcaac ggtggctctc ctggacaggg aacccagtcc gagaactcct gcacccactt ccccggcaac

780780

ctgcccaaca tgctgcggga cctgagagat gccttctcca gagtgaaaac attcttccag ctgcccaaca tgctgcggga cctgagagat gccttctcca gagtgaaaac attcttccag

840840

atgaaggacc agctggacaa cctgctgctg aaagagtccc tgctggaaga tttcaagggc atgaaggacc agctggacaa cctgctgctg aaagagtccc tgctggaaga tttcaagggc

900900

tacctgggct gccaggccct gtccgagatg atccagttct acctggaaga agtgatgcct tacctgggct gccaggccct gtccgagatg atccagttct acctggaaga agtgatgcct

960960

caggccgaga accaggaccc cgacatcaag gcccacgtga actccctggg cgagaacctg caggccgaga accaggaccc cgacatcaag gcccacgtga actccctggg cgagaacctg

10201020

aaaaccctgc ggctgcggct gagaagatgc caccggtttc tgccctgcga gaacaagtcc aaaaccctgc ggctgcggct gagaagatgc caccggtttc tgccctgcga gaacaagtcc

10801080

aaggccgtgg aacaagtgaa gaacgccttc aacaagctgc aggaaaaggg catctacaag aaggccgtgg aacaagtgaa gaacgccttc aacaagctgc aggaaaaggg catctacaag

11401140

gccatgagcg agttcgacat cttcatcaac tacatcgagg cctacatgac catgaagatc gccatgagcg agttcgacat cttcatcaac tacatcgagg cctacatgac catgaagatc

12001200

cggaac cggaac

12061206

<210> 4<210> 4

<211> 1206<211> 1206

<212> DNA<212> DNA

<220><220>

<223> DNA IL-10-Fc<223>DNA IL-10-Fc

<400> 4<400> 4

60 60

120120

180180

240240

300300

360360

420420

480480

540540

600600

660660

720720

ggtggctcgc ccggtcaagg aactcagtct gagaactcat gtacacactt tccagggaat ggtggctcgc ccggtcaagg aactcagtct gagaactcat gtacacactt tccagggaat

780780

ctgcccaaca tgcttaggga tctccgggac gctttctcta gggtcaagac cttcttccag ctgcccaaca tgcttaggga tctccgggac gctttctcta gggtcaagac cttcttccag

840840

atgaaagacc aactggacaa tctgctgtta aaggaaagtt tgctcgaaga ttttaagggc atgaaagacc aactggacaa tctgctgtta aaggaaagtt tgctcgaaga ttttaagggc

900900

tatctcgggt gccaggccct ttccgaaatg attcagtttt acctggagga agtaatgcct tatctcgggt gccaggccct ttccgaaatg attcagtttt acctggagga agtaatgcct

960960

caagctgaaa accaggaccc cgatatcaag gcgcatgtga attcattggg cgagaacctg caagctgaaa accaggaccc cgatatcaag gcgcatgtga attcattggg cgagaacctg

10201020

aaaaccctcc gactcagact ccggcgttgc cacaggttcc tgccatgcga gaacaaatca aaaaccctcc gactcagact ccggcgttgc cacaggttcc tgccatgcga gaacaaatca

10801080

aaggccgtcg agcaggtgaa gaacgcattc aataagctgc aggagaaagg aatctacaaa aaggccgtcg agcaggtgaa gaacgcattc aataagctgc aggagaaagg aatctacaaa

11401140

gctatgtcgg agttcgacat cttcatcaac tatatcgagg cttacatgac tatgaaaatc gctatgtcgg agttcgacat cttcatcaac tatatcgagg cttacatgac tatgaaaatc

12001200

cgtaat cgtaat

12061206

<210> 5<210> 5

<211> 1263<211> 1263

<212> DNA<212> DNA

<220><220>

<223> DNA IL-10-Fc с лидерным пептидом<223> DNA IL-10-Fc with leader peptide

<400> 5<400> 5

atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctgt tccatgccac ccaggccgag atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctgt tccatgccac ccaggccgag

60 60

cccaaatcta gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcaggg cccaaatcta gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcaggg

120120

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc

180180

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac

240240

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac

300300

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc

360360

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag ccccatcga gaaaaccatc

420420

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag

480480

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac

540540

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc

600600

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg

660660

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac

720720

acgcagaaaa gcctctccct gtccccgggt ggagggtcag gaggtggtcc aggatcgggt acgcagaaaa gcctctccct gtccccgggt ggagggtcag gaggtggtcc aggatcgggt

780780

ggctctcctg gacagggaac ccagtccgag aactcctgca cccacttccc cggcaacctg ggctctcctg gacagggaac ccagtccgag aactcctgca cccacttccc cggcaacctg

840840

cccaacatgc tgcgggacct gagagatgcc ttctccagag tgaaaacatt cttccagatg cccaacatgc tgcgggacct gagagatgcc ttctccagag tgaaaacatt cttccagatg

900900

aaggaccagc tggacaacct gctgctgaaa gagtccctgc tggaagattt caagggctac aaggaccagc tggacaacct gctgctgaaa gagtccctgc tggaagattt caagggctac

960960

ctgggctgcc aggccctgtc cgagatgatc cagttctacc tggaagaagt gatgcctcag ctgggctgcc aggccctgtc cgagatgatc cagttctacc tggaagaagt gatgcctcag

10201020

gccgagaacc aggaccccga catcaaggcc cacgtgaact ccctgggcga gaacctgaaa gccgagaacc aggaccccga catcaaggcc cacgtgaact ccctgggcga gaacctgaaa

10801080

accctgcggc tgcggctgag aagatgccac cggtttctgc cctgcgagaa caagtccaag accctgcggc tgcggctgag aagatgccac cggtttctgc cctgcgagaa caagtccaag

11401140

gccgtggaac aagtgaagaa cgccttcaac aagctgcagg aaaagggcat ctacaaggcc gccgtggaac aagtgaagaa cgccttcaac aagctgcagg aaaagggcat ctacaaggcc

12001200

atgagcgagt tcgacatctt catcaactac atcgaggcct acatgaccat gaagatccgg atgagcgagt tcgacatctt catcaactac atcgaggcct acatgaccat gaagatccgg

12601260

aac aac

12631263

<210> 6<210> 6

<211> 1263<211> 1263

<212> DNA<212> DNA

<220><220>

<400> 6<400> 6

60 60

120120

180180

240240

300300

360360

420420

480480

540540

600600

660660

720720

780780

ggctcgcccg gtcaaggaac tcagtctgag aactcatgta cacactttcc agggaatctg ggctcgcccg gtcaaggaac tcagtctgag aactcatgta cacactttcc agggaatctg

840840

cccaacatgc ttagggatct ccgggacgct ttctctaggg tcaagacctt cttccagatg cccaacatgc ttagggatct ccgggacgct ttctctaggg tcaagacctt cttccagatg

900900

aaagaccaac tggacaatct gctgttaaag gaaagtttgc tcgaagattt taagggctat aaagaccaac tggacaatct gctgttaaag gaaagtttgc tcgaagattt taagggctat

960960

ctcgggtgcc aggccctttc cgaaatgatt cagttttacc tggaggaagt aatgcctcaa ctcgggtgcc aggccctttc cgaaatgatt cagttttacc tggaggaagt aatgcctcaa

10201020

gctgaaaacc aggaccccga tatcaaggcg catgtgaatt cattgggcga gaacctgaaa gctgaaaacc aggaccccga tatcaaggcg catgtgaatt cattgggcga gaacctgaaa

10801080

accctccgac tcagactccg gcgttgccac aggttcctgc catgcgagaa caaatcaaag accctccgac tcagactccg gcgttgccac aggttcctgc catgcgagaa caaatcaaag

11401140

gccgtcgagc aggtgaagaa cgcattcaat aagctgcagg agaaaggaat ctacaaagct gccgtcgagc aggtgaagaa cgcattcaat aagctgcagg agaaaggaat ctacaaagct

12001200

atgtcggagt tcgacatctt catcaactat atcgaggctt acatgactat gaaaatccgt atgtcggagt tcgacatctt catcaactat atcgaggctt acatgactat gaaaatccgt

12601260

aat aat

12631263

<---<---

Claims

1. Выделенный иммуноцитокин для активации рецептора интерлейкина 10 человека (IL-10R), включающий гомодимерный комплекс на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека,1. An isolated immunocytokine for activation of the human interleukin 10 receptor (IL-10R), including a homodimeric complex based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1,

где мономер на основе IL-10 и Fc-фрагмента IgG1 человека включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.wherein the monomer based on IL-10 and the Fc fragment of human IgG1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

2. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует иммуноцитокин по п. 1.2. Isolated nucleic acid that encodes the immunocytokine according to claim 1.

3. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 2, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.3. The isolated nucleic acid according to claim 2, where the nucleic acid is DNA.

4. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 2, где нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 3.4. The isolated nucleic acid according to claim 2, where the nucleic acid includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

5. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 2, где нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 4.5. The isolated nucleic acid according to claim 2, where the nucleic acid includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

6. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 2-5.6. An expression vector containing a nucleic acid according to any one of paragraphs. 2-5.

7. Способ получения клетки-хозяина для получения иммуноцитокина по п. 1, включающий трансформирование клетки вектором по п. 6.7. A method for obtaining a host cell for producing an immunocytokine according to claim 1, including transforming the cell with a vector according to claim 6.

8. Клетка-хозяин для получения иммуноцитокина по п. 1, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 2-5.8. A host cell for producing an immunocytokine according to claim 1, containing a nucleic acid according to any one of claims. 2-5.

9. Способ получения иммуноцитокина по п. 1, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 8 в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного иммуноцитокина, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного иммуноцитокина.9. The method for producing an immunocytokine according to claim 1, including cultivating the host cell according to claim 8 in a culture medium under conditions sufficient to obtain said immunocytokine, if necessary, followed by isolation and purification of the resulting immunocytokine.

10. Фармацевтическая композиция для активации рецептора интерлейкина 10 человека (IL-10R), содержащая иммуноцитокин по п. 1 и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.10. Pharmaceutical composition for activation of the human interleukin 10 receptor (IL-10R), containing the immunocytokine according to claim 1 and one or more pharmaceutically acceptable excipients.

11. Фармацевтическая композиция для активации рецептора интерлейкина 10 человека (IL-10R), содержащая иммуноцитокин по п. 1 и по меньшей мере одно другое терапевтически активное соединение.11. Pharmaceutical composition for activation of the human interleukin 10 receptor (IL-10R), containing the immunocytokine according to claim 1 and at least one other therapeutically active compound.

12. Фармацевтическая композиция по п. 11, где другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство или средство для гормональной терапии.12. The pharmaceutical composition according to claim 11, wherein the other therapeutically active compound is an antibody, a chemotherapeutic agent or a hormone therapy agent.

13. Фармацевтическая композиция по п. 11, где другое терапевтически активное соединение представляет собой ингибитор контрольных точек иммунитета.13. The pharmaceutical composition of claim 11, wherein the other therapeutically active compound is an immune checkpoint inhibitor.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, где ингибитор контрольных точек иммунитета выбран из ингибитора PD-1, ингибитора PD-L1 или ингибитора CTLA-4.14. The pharmaceutical composition according to claim 13, wherein the immune checkpoint inhibitor is selected from a PD-1 inhibitor, a PD-L1 inhibitor or a CTLA-4 inhibitor.

15. Фармацевтическая композиция по п. 14, где ингибитор PD-1 представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-1.15. The pharmaceutical composition according to claim 14, wherein the PD-1 inhibitor is an antibody that specifically binds to PD-1.

16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где антитело, которое специфически связывается с PD-1, выбрано из группы: пролголимаб, пембролизумаб, ниволумаб.16. The pharmaceutical composition according to claim 15, where the antibody that specifically binds to PD-1 is selected from the group: prolgolimab, pembrolizumab, nivolumab.

17. Фармацевтическая композиция по п. 14, где ингибитор CTLA-4 представляет собой антитело, которое специфически связывается с CTLA-4.17. The pharmaceutical composition according to claim 14, wherein the CTLA-4 inhibitor is an antibody that specifically binds to CTLA-4.

18. Фармацевтическая композиция по п. 17, где антитело, которое специфически связывается с CTLA-4, представляет собой ипилимумаб.18. The pharmaceutical composition according to claim 17, wherein the antibody that specifically binds to CTLA-4 is ipilimumab.

19. Способ лечения онкологического заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуноцитокина по п. 1 или фармацевтической композиции по любому из пп. 10-18 в терапевтически эффективном количестве.19. A method of treating an oncological disease, including administering to a subject in need of such treatment an immunocytokine according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 10-18 in a therapeutically effective amount.

20. Способ лечения по п. 19, где онкологическое заболевание выбирают из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, Т- и В-клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак легкого, рефрактерная В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В-клеточной диффузная лимфома, рак поджелудочной железы, рак яичника, миелодиспластический синдром высокого риска.20. The method of treatment according to claim 19, where the oncological disease is selected from the group: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer ), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (Non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, colorectal cancer with high microsatellite instability, leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, multiple myeloma, breast cancer, cancer prostate, bladder cancer, sarcoma, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, Hodgkin lymphoma, T- and B-cell acute lymphoblastic leukemia, small cell lung cancer, refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma, follicular lymphoma, B-cell marginal zone lymphoma, large B cell -cell diffuse lymphoma, pancreatic cancer, ovarian cancer, high-risk myelodysplastic syndrome.

21. Способ активации рецептора интерлейкина 10 человека (IL-10R) y субъекта, нуждающегося в такой активации, включающий введение субъекту эффективного количества иммуноцитокина по п. 1 или фармацевтической композиции по любому из пп. 10-18.21. A method of activating the human interleukin 10 receptor (IL-10R) in a subject in need of such activation, comprising administering to the subject an effective amount of an immunocytokine according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to any one of claims. 10-18.

22. Применение иммуноцитокина по п. 1 или фармацевтической композиции по любому из пп. 10-18 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, онкологического заболевания.22. The use of an immunocytokine according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 10-18 for treating a subject in need of such treatment with cancer.

23. Применение по п. 22, где онкологическое заболевание выбирают из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, Т- и В-клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак легкого, рефрактерная В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В-клеточной диффузная лимфома, рак поджелудочной железы, рак яичника, миелодиспластический синдром высокого риска.23. Use according to claim 22, where the oncological disease is selected from the group: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer) , CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (Non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, colorectal cancer with high microsatellite instability, leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, multiple myeloma, breast cancer, prostate cancer glands, bladder cancer, sarcoma, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, Hodgkin lymphoma, T- and B-cell acute lymphoblastic leukemia, small cell lung cancer, refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma, follicular lymphoma, B-cell marginal zone lymphoma, large B-cell cellular diffuse lymphoma, pancreatic cancer, ovarian cancer, high-risk myelodysplastic syndrome.

24. Применение иммуноцитокина по п. 1 и по меньшей мере одного другого терапевтически активного соединения для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, онкологического заболевания.24. The use of an immunocytokine according to claim 1 and at least one other therapeutically active compound for treating a cancer in a subject in need of such treatment.

25. Применение по п. 24, где онкологическое заболевание выбирают из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, лейкоз (острый или миелобластный), лимфома, множественная миелома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, глиобластома, лимфома Ходжкина, Т- и В-клеточном острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточный рак легкого, рефрактерная В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, крупноклеточная В-клеточной диффузная лимфома, рак поджелудочной железы, рак яичника, миелодиспластический синдром высокого риска.25. Use according to claim 24, where the oncological disease is selected from the group: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer) , CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (Non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, colorectal cancer with high microsatellite instability, leukemia (acute or myeloblastic), lymphoma, multiple myeloma, breast cancer, prostate cancer glands, bladder cancer, sarcoma, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, Hodgkin lymphoma, T- and B-cell acute lymphoblastic leukemia, small cell lung cancer, refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma, follicular lymphoma, B-cell marginal zone lymphoma, large B-cell cellular diffuse lymphoma, pancreatic cancer, ovarian cancer, high-risk myelodysplastic syndrome.

26. Применение по любому из пп. 24-25, где другое терапевтически активное соединение представляет собой антитело, химиотерапевтическое средство или средство для гормональной терапии.26. Application according to any one of paragraphs. 24-25, wherein the other therapeutically active compound is an antibody, a chemotherapeutic agent, or a hormone therapy agent.

27. Применение по любому из пп. 24-25, где другое терапевтически активное соединение представляет собой ингибитор контрольных точек иммунитета.27. Application according to any one of paragraphs. 24-25, wherein the other therapeutically active compound is an immune checkpoint inhibitor.

28. Применение по п. 27, где ингибитор контрольных точек иммунитета выбран из ингибитора PD-1, ингибитора PD-L1 или ингибитора CTLA-4.28. The use of claim 27, wherein the immune checkpoint inhibitor is selected from a PD-1 inhibitor, a PD-L1 inhibitor, or a CTLA-4 inhibitor.

29. Применение по п. 28, где ингибитор PD-1 представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-1.29. The use of claim 28, wherein the PD-1 inhibitor is an antibody that specifically binds to PD-1.

30. Применение по п. 29, где антитело, которое специфически связывается с PD-1, выбрано из группы: пролголимаб, пембролизумаб, ниволумаб.30. Use according to claim 29, where the antibody that specifically binds to PD-1 is selected from the group: prolgolimab, pembrolizumab, nivolumab.

31. Применение по п. 28, где ингибитор CTLA-4 представляет собой антитело, которое специфически связывается с CTLA-4.31. The use of claim 28, wherein the CTLA-4 inhibitor is an antibody that specifically binds to CTLA-4.

32. Применение по п. 31, где антитело, которое специфически связывается с CTLA-4, представляет собой ипилимумаб.32. The use of claim 31, wherein the antibody that specifically binds to CTLA-4 is ipilimumab.

33. Применение по п. 28, где ингибитор PD-L1 представляет собой антитело, которое специфически связывается с PD-L1.33. The use of claim 28, wherein the PD-L1 inhibitor is an antibody that specifically binds to PD-L1.

34. Применение по п. 33, где антитело, которое специфически связывается с PD-L1, выбрано из группы: дурвалумаб, авелумаб, атезолизумаб, манелимаб.34. Use according to claim 33, where the antibody that specifically binds to PD-L1 is selected from the group: durvalumab, avelumab, atezolizumab, manelimab.