RU2809389C2 - Aav mutant with ability to target brain - Google Patents
Aav mutant with ability to target brain Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809389C2 RU2809389C2 RU2021133906A RU2021133906A RU2809389C2 RU 2809389 C2 RU2809389 C2 RU 2809389C2 RU 2021133906 A RU2021133906 A RU 2021133906A RU 2021133906 A RU2021133906 A RU 2021133906A RU 2809389 C2 RU2809389 C2 RU 2809389C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aav
- seq
- capsid protein
- peptide
- amino acid
- Prior art date
Links
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 196
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 167
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims abstract description 167
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000010415 tropism Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 108
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 79
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical class 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 17
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 4
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000425548 Adeno-associated virus 3A Species 0.000 description 1
- 241000958487 Adeno-associated virus 3B Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- -1 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
[0001] Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей мутант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), который обладает тропизмом в отношении головного мозга; к частице AAV, содержащей вариант капсидного белка; и к способу получения клетки, трансдуцированной геном, с использованием этой частицы.[0001] The present invention relates to a nucleic acid encoding a mutant of the capsid protein of an adeno-associated virus (AAV) that has tropism for the brain; to an AAV particle containing a variant capsid protein; and a method for producing a gene transduced cell using the particle.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for creating the invention
[0002] AAV представляет собой вирус, имеющий геном линейной одноцепочечной ДНК размером 4,7 т.п.о., содержащий открытые рамки считывания двух генов rep и cap. Ген rep кодирует четыре белка, необходимых для репликации генома (Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Ген cap экспрессирует три капсидных белка, которые подвергаются сборке с образованием вирусного капсида (VP1, VP2, VP3) и белка, активирующего сборку (AAP). Репликация AAV в природе зависит от присутствия вируса-помощника, такого как аденовирус или герпесвирус. В отсутствии вируса-помощника, геном AAV сохраняется в эписоме или интегрируется в хромосому хозяина, а поэтому AAV присутствует в латентном состоянии. В настоящее время идентифицировано более ста серотипов и кладотипов AAV (непатентная литература 1). В частности, продвигается разработка векторов для доставки генов на основе AAV2.[0002] AAV is a virus that has a 4.7 kb linear single-stranded DNA genome containing the open reading frames of two genes, rep and cap. The rep gene encodes four proteins required for genome replication (Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40). The cap gene expresses three capsid proteins that undergo assembly to form the viral capsid (VP1, VP2, VP3) and assembly activating protein (AAP). AAV replication in nature depends on the presence of a helper virus such as adenovirus or herpesvirus. In the absence of a helper virus, the AAV genome is retained in the episome or integrated into the host chromosome, and therefore AAV is present in a latent state. Currently, more than one hundred serotypes and cladotypes of AAV have been identified (non-patent literature 1). In particular, the development of AAV2-based gene delivery vectors is advancing.
[0003] В 1989 г. впервые была разработана система векторов для доставки генов на основе AAV2. Было обнаружено, что векторы на основе AAV имеют много преимуществ. Поскольку AAV дикого типа не являются патогенными и не имеют этиологической связи с какими-либо известными заболеваниями, то векторы на основе AAV считаются довольно безопасными. Кроме того, AAV обладает высокой эффективностью в отношении трансдукции генов.[0003] In 1989, an AAV2-based gene delivery vector system was first developed. AAV-based vectors have been found to have many advantages. Since wild-type AAVs are non-pathogenic and have no etiological link to any known diseases, AAV-based vectors are considered fairly safe. In addition, AAV is highly efficient at gene transduction.
[0004] Введение частиц AAV обеспечивает длительную и стабильную трансдукцию гена в различные органы-мишени и клетки-мишени. В настоящее время уже сообщалось о трансдукции генов с высокой эффективностью в скелетные мышцы, в печень (клетки печени), в сердце (клетки сердечной мышцы), в нервные клетки, в клетки поджелудочной железы и в клетки панкреатических островков. Кроме того, AAV использовали в клинических испытаниях с участием человека. С другой стороны, была предпринята попытка изменить клеточный тропизм AAV путем модификации капсидных белков AAV и попытка избежать удаления частиц AAV нейтрализующими антителами. Так, например, были получены капсиды AAV с тропизмом в отношении конкретных органов и клеток, таких как нейроглиальные клетки, эпителиальные клетки дыхательных путей, эндотелиальные клетки сосудов коронарных артерий и легкие, и были созданы капсиды AAV с тропизмом в отношении опухолевых клеток, таких как клетки глиобластомы, клетки меланомы, клетки рака легких, и клетки рака молочной железы (непатентная литература 2).[0004] Administration of AAV particles provides long-lasting and stable gene transduction into various target organs and target cells. Gene transduction has now been reported with high efficiency in skeletal muscle, liver (liver cells), heart (cardiac muscle cells), nerve cells, pancreatic cells and pancreatic islet cells. In addition, AAV has been used in human clinical trials. On the other hand, an attempt has been made to alter the cellular tropism of AAV by modifying AAV capsid proteins and attempting to avoid removal of AAV particles by neutralizing antibodies. For example, AAV capsids with tropism for specific organs and cells, such as neuroglial cells, airway epithelial cells, coronary vascular endothelial cells and lungs, have been generated, and AAV capsids with tropism for tumor cells, such as glioblastoma cells, melanoma cells, lung cancer cells, and breast cancer cells (Non-Patent Literature 2).
Список цитируемой литературыList of cited literature
Непатентная литератураNon-patent literature
[0005] Непатентная литература 1: Gao et al., J. Virology, Vol. 78, рр. 6381-6388, 2004.[0005] Non-Patent Literature 1: Gao et al., J. Virology, Vol. 78, pp. 6381-6388, 2004.
Непатентная литература 2: Adachi K. et al., Genen Ther. Regul., Vol. 5. рр. 31-55, 2010.Non-Patent Literature 2: Adachi K. et al., Genen Ther. Regul., Vol. 5. pp. 31-55, 2010.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Проблема, которая может быть решена с помощью настоящего изобретенияProblem that can be solved by the present invention
[0006] Целями настоящего изобретения являются получение мутанта капсидного белка AAV с тропизмом в отношении головного мозга и разработка способа эффективного введения гена в головной мозг.[0006] The objects of the present invention are to provide a brain-tropic mutant of the AAV capsid protein and to develop a method for efficiently introducing the gene into the brain.
Решение проблемProblem solving
[0007] Авторами настоящего изобретения были предприняты усиленные попытки решить вышеописанные проблемы, в результате чего была создана нужная частица AAV, где указанная частица AAV включает капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62. Таким образом было осуществлено настоящее изобретение.[0007] The inventors of the present invention have made strenuous attempts to solve the above problems, resulting in the creation of the desired AAV particle, wherein the AAV particle includes a capsid protein containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15-62. Thus the present invention was accomplished.
[0008] В общих чертах, настоящее изобретение относится:[0008] In general terms, the present invention relates to:
[1] к нуклеиновой кислоте, кодирующей мутант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), включающий пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62, или пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением одной или нескольких аминокислот;[1] to a nucleic acid encoding a mutant of an adeno-associated virus (AAV) capsid protein, comprising a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15-62, or a peptide containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence , selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15-62, substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acids;
[2] к нуклеиновой кислоте согласно [1], где капсидный белок AAV происходит от AAV2;[2] to a nucleic acid according to [1], where the AAV capsid protein is derived from AAV2;
[3] к нуклеиновой кислоте согласно [2], где пептид находится в положении между аминокислотой 588 и аминокислотой 589 в VP1 AAV2;[3] to a nucleic acid according to [2], where the peptide is located at a position between amino acid 588 and amino acid 589 in VP1 of AAV2;
[4] к рекомбинантной ДНК, содержащей нуклеиновую кислоту согласно любому из [1] - [3];[4] to recombinant DNA containing a nucleic acid according to any of [1] - [3];
[5] к клетке, содержащей нуклеиновую кислоту согласно любому из [1] - [3] или рекомбинантную ДНК согласно [4];[5] to a cell containing a nucleic acid according to any of [1] - [3] or recombinant DNA according to [4];
[6] к частице AAV, содержащей мутант капсидного белка AAV, который включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62, или пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением одной или нескольких аминокислот;[6] to an AAV particle containing a mutant of the AAV capsid protein that includes a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15-62, or a peptide containing an amino acid sequence that differs from an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15-62, substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acids;
[7] к частице AAV согласно [6], где капсидный белок AAV происходит от AAV2;[7] to the AAV particle according to [6], where the AAV capsid protein is derived from AAV2;
[8] к частице AAV согласно [7], где пептид находится в положении между аминокислотой 588 и аминокислотой 589 в VP1 AAV2;[8] to the AAV particle according to [7], where the peptide is located at a position between amino acid 588 and amino acid 589 in VP1 of AAV2;
[9] к способу получения клетки, трансдуцированной геном, где указанный способ включает стадию контактирования частицы AAV, содержащей мутант капсидного белка AAV, который включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62, или пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением одной или нескольких аминокислот, с клеткой;[9] to a method of producing a cell transduced with a gene, wherein the method includes the step of contacting an AAV particle containing a mutant of the AAV capsid protein that includes a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15-62, or a peptide containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15-62, by substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acids, with a cell;
[10] к способу согласно [9], где капсидный белок AAV происходит от AAV2; и[10] to the method according to [9], where the AAV capsid protein is derived from AAV2; And
[11] к способу согласно [10], где пептид находится в положении между аминокислотой 588 и аминокислотой 589 в VP1 AAV2. [11] to the method according to [10], where the peptide is located at a position between amino acid 588 and amino acid 589 in VP1 of AAV2.
Эффекты изобретенияEffects of the invention
[0009] В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к системе трансдукции генов, подходящей для переноса генов в головной мозг. Частица AAV согласно изобретению обладает высоким клеточным тропизмом в отношении головного мозга, и ген, трансдуцированный частицей AAV, может экспрессироваться на высоком уровне.[0009] Accordingly, the present invention relates to a gene transduction system suitable for transferring genes into the brain. The AAV particle of the invention has a high cellular tropism for the brain, and the gene transduced by the AAV particle can be expressed at a high level.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
[0010] [Фиг.1] На Фигуре 1 проиллюстрирован способ получения конструкции нуклеиновой кислоты, позволяющей капсидному белку включать неспецифический пептид.[0010] [Figure 1] Figure 1 illustrates a method for producing a nucleic acid construct that allows a capsid protein to incorporate a nonspecific peptide.
[фиг. 2] На Фигуре 2 представлены результаты оценки тропизма мутантов капсидного белка AAV согласно изобретению.[fig. 2] Figure 2 presents the results of assessing the tropism of AAV capsid protein mutants according to the invention.
Способ осуществления изобретенияMethod for carrying out the invention
[0011] Используемый здесь термин «аденоассоциированный вирус» означает небольшой вирус, принадлежащий к роду Dependovirus, который принадлежит семейству Parvoviridae и способен инфицировать приматов, включая человека и других млекопитающих. Далее, аденоассоциированный вирус будет обозначаться AAV. AAV имеет капсулу без оболочки (капсид) в виде правильного икосаэдра и линейную одноцепочечную ДНК внутри этой капсулы. Используемый здесь термин «AAV» включает вирус дикого типа и его производные, а также все серотипы и кладотипы AAV, если это не оговорено особо.[0011] As used herein, the term "adeno-associated virus" means a small virus belonging to the genus Dependovirus , which belongs to the family Parvoviridae and is capable of infecting primates, including humans and other mammals. Hereafter, adeno-associated virus will be referred to as AAV. AAV has an unenveloped capsule (capsid) in the form of a regular icosahedron and linear single-stranded DNA inside this capsule. As used herein, the term “AAV” includes wild-type virus and its derivatives and all serotypes and cladotypes of AAV unless otherwise noted.
[0012] Используемый здесь термин «вектор» означает молекулу или ассоциированную молекулу, которая используется для опосредуемой доставки полинуклеотида в клетку, и которая содержит полинуклеотид или ассоциируется с полинуклеотидом. Примерами вектора являются векторные ДНК, такие как плазмидные векторы и фаговые векторы, частицы вирусного вектора, липосомы и другие носители для доставки генов, если это не оговорено особо.[0012] As used herein, the term “vector” means a molecule or associated molecule that is used to indirectly deliver a polynucleotide into a cell and that contains or is associated with a polynucleotide. Examples of a vector include DNA vectors such as plasmid vectors and phage vectors, viral vector particles, liposomes and other gene delivery vehicles unless otherwise noted.
[0013] Используемый здесь термин «капсидный белок» означает белок, который кодируется геном cap, присутствующим в геноме AAV, и составляет капсид AAV. Геном AAV дикого типа кодирует три капсидных белка, а именно, VP1, VP2 и VP3. Используемый здесь термин капсидный белок включает VP1, VP2 и VP3.[0013] As used herein, the term “capsid protein” means a protein that is encoded by the cap gene present in the AAV genome and constitutes the AAV capsid. The wild-type AAV genome encodes three capsid proteins, namely, VP1, VP2, and VP3. As used herein, the term capsid protein includes VP1, VP2 and VP3.
[0014] Используемый здесь термин «несколько», если он относится к замене, делеции, инсерции и/или к добавлению аминокислот означает, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 аминокислот в зависимости от длины эталонной аминокислотной последовательности.[0014] As used herein, the term "multiple" when referring to the substitution, deletion, insertion and/or addition of amino acids means, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 amino acids depending on the length of the reference amino acid sequence.
[0015] (1) Нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный капсидный белок AAV [0015] (1) Nucleic acid encoding a mutant AAV capsid protein
Нуклеиновая кислота согласно изобретению кодирует мутант капсидного белка AAV, который включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62, или пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-62, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением одной или нескольких аминокислот. Предпочтительно, нуклеиновая кислота согласно изобретению кодирует мутант капсидного белка AAV, который включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 - SEQ ID NO: 62. Более предпочтительно, нуклеиновая кислота согласно изобретению кодирует мутант капсидного белка AAV, который включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, или пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20 заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением одной или нескольких аминокислот. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, представленной вышеупомяными SEQ ID NO, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением одной или нескольких аминокислот, если они содержатся в капсидном белке AAV, сохраняет клеточный тропизм мутанта капсидного белка AAV, который включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную вышеупомянутыми SEQ ID NO. Другими словами, количество аминокислот, которые должны быть заменены, делетированы, встроены и/или добавлены в аминокислотную последовательность, представленную вышеупомянутыми SEQ ID NO, не имеет конкретных ограничения, при условии, что будет сохраняться клеточный тропизм, то есть, пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную вышеупомянутыми SEQ ID NO, будет передаваться мутантному капсидному белку AAV, содержащему этот пептид. Так, например, могут быть заменены, делетированы и/или встроены от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, более предпочтительно 1, 2 или 3 аминокислоты. Так, например, могут быть добавлены от 1 до 9, предпочтительно от 1 до 8, более предпочтительно от 1 до 7, еще более предпочтительно от 1 до 6, еще более предпочтительно от 1 до 5, а еще более предпочтительно 1, 2, 3 или 4 аминокислоты.The nucleic acid of the invention encodes a mutant of the AAV capsid protein that includes a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15-62, or a peptide containing an amino acid sequence that differs from an amino acid sequence selected from the group consisting of from SEQ ID NO: 15-62, substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acids. Preferably, the nucleic acid of the invention encodes a mutant of the AAV capsid protein that includes a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62. More preferably, the nucleic acid of the invention encodes a mutant of the AAV capsid protein which comprises a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 , or a peptide containing an amino acid sequence that differs from an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 by substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acids. A peptide containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NOs by substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acids, if contained in the AAV capsid protein, retains the cellular tropism of an AAV capsid protein mutant that includes a peptide containing the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NOs. In other words, the number of amino acids to be replaced, deleted, inserted and/or added to the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NOs is not particularly limited, provided that the cellular tropism, that is, the peptide containing the amino acid sequence, is maintained , represented by the above SEQ ID NOs, will be transferred to the mutant AAV capsid protein containing this peptide. Thus, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1, 2 or 3 amino acids can be replaced, deleted and/or inserted. Thus, for example, from 1 to 9, preferably from 1 to 8, more preferably from 1 to 7, even more preferably from 1 to 6, even more preferably from 1 to 5, and even more preferably from 1, 2, 3 can be added or 4 amino acids.
[0016] Так, например, пептид, который должен быть включен в мутант капсидного белка AAV, может представлять собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 - SEQ ID NO: 62. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной вышеупомянутыми SEQ ID NO, если они содержатся в капсидном белке AAV, сохраняет клеточный тропизм мутанта капсидного белка AAV, включающего пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную вышеупомянутыми SEQ ID NO.[0016] Thus, for example, a peptide to be included in an AAV capsid protein mutant may be a peptide comprising an amino acid sequence that is at least 70%, at least 75%, at least 80%, is at least 85% or at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62. A peptide containing an amino acid sequence that is at least 70% identical to at least 75%, at least 80%, at least 85%, or at least 90% identical to the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NOs, if contained in the AAV capsid protein, retains the cellular tropism of the capsid protein mutant AAV comprising a peptide containing the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NO.
[0017] Так, например, пептид, который должен входить в состав мутантного капсидного белка AAV, может представлять собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную:[0017] Thus, for example, the peptide that should be part of the mutant AAV capsid protein may be a peptide containing the amino acid sequence represented by:
формулой I: X1X2GX3GWV;formula I: X 1 X 2 GX 3 GWV;
формулой II: X4X5X6X7GWV;formula II: X 4 X 5 X 6 X 7 GWV;
формулой III: X8X9GX10X11WV;formula III: X 8 X 9 GX 10 X 11 WV;
формулой IV: X12X13GX14GX15V;formula IV: X 12 X 13 GX 14 GX 15 V;
формулой V: X16X17GX18GWX19; илиformula V: X 16 X 17 GX 18 GWX 19 ; or
формулой VI: X20X21GX22REX23 formula VI: X 20 X 21 GX 22 REX 23
где каждый из X1-X23 представляет собой любой аминокислотный остаток, G представляет собой глицин, W представляет собой триптофан, V представляет собой валин, R представляет собой аргинин и E представляет собой глутаминовую кислоту. Предпочтительно, в формуле I (X1X2GX3GWV), X1 представляет собой E (глутаминовую кислоту), G (глицин) или T (треонин), а X2 представляет собой R (аргинин), T (треонин), S (серин), N (аспарагин), E (глутаминовую кислоту) или D (аспарагиновую кислоту), а X3 представляет собой V (валин), H (гистидин), R, M (метионин) или L (лейцин). Предпочтительно, в формуле II (X4X5X6X7GWV), X4 представляет собой A (аланин) или E, X5 представляет собой D, G или A, X6 представляет собой K (лизин), Q (глутамин) или N, а X7 представляет собой V или L. Предпочтительно, в формуле III (X8X9GX10X11WV), X8 представляет собой A, E или G, X9 представляет собой S, D, G или R, X10 представляет собой T, M, D или V, а X11 представляет собой R, V, S или T. Предпочтительно, в формуле IV (X12X13GX14GX15V), X12 представляет собой D, E, G или R, X13 представляет собой A, G, D или V, X14 представляет собой I, H, D, F (фенилаланин), G или L, а X15 представляет собой Y (тирозин), F, R, G или V. Предпочтительно, в формуле V (X16X17GX18GWX19), X16 представляет собой A, E или G, X17 представляет собой G, R или S, X18 представляет собой V, H или D, а X19 представляет собой T, G, K, I (изолейцин) или A. Предпочтительно, в формуле VI (X20X21GX22REX23), X20 представляет собой E или A, X21 представляет собой Y или H, X22 представляет собой F или Y, а X23 представляет собой G или P (пролин).where each of X 1 -X 23 represents any amino acid residue, G represents glycine, W represents tryptophan, V represents valine, R represents arginine and E represents glutamic acid. Preferably, in formula I (X 1 X 2 GX 3 GWV), X 1 represents E (glutamic acid), G (glycine) or T (threonine), and X 2 represents R (arginine), T (threonine), S (serine), N (asparagine), E (glutamic acid) or D (aspartic acid), and X 3 is V (valine), H (histidine), R, M (methionine) or L (leucine). Preferably, in formula II (X 4 X 5 X 6 X 7 GWV), X 4 is A (alanine) or E, X 5 is D, G or A, X 6 is K (lysine), Q (glutamine ) or N, and X 7 is V or L. Preferably, in formula III (X 8 X 9 GX 10 X 11 WV), X 8 is A, E or G, X 9 is S, D, G or R, X 10 is T, M, D or V, and X 11 is R, V, S or T. Preferably, in formula IV (X 12 X 13 GX 14 GX 15 V), X 12 is D, E, G or R, X 13 is A, G, D or V, X 14 is I, H, D, F (phenylalanine), G or L and X 15 is Y (tyrosine), F, R , G or V. Preferably, in formula V (X 16 X 17 GX 18 GWX 19 ), X 16 is A, E or G, X 17 is G, R or S, X 18 is V, H or D and X 19 is T, G, K, I (isoleucine) or A. Preferably, in formula VI (X 20 X 21 GX 22 REX 23 ), X 20 is E or A, X 21 is Y or H , X 22 represents F or Y, and X 23 represents G or P (proline).
[0018] Примерами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную формулой I, являются, но не ограничиваются ими, пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 20, 21, 22, 46, 55, 59 и 60, и пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 20, 21, 22, 46, 55, 59 и 60, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением от 1 до 3 аминокислот. Примерами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную формулой II, являются, но не ограничиваются ими, пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 29 и 32, и пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 29 и 32, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением от 1 до 4 аминокислот. Примерами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную формулой III, являются, но не ограничиваются ими, пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 24, 38, 48 и 54, и пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 24, 38, 48 и 54, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением от 1 до 4 аминокислот. Примерами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную формулой IV, являются, но не ограничиваются ими, пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 31, 35, 44, 56 и 58, и пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 31, 35, 44, 56 и 58, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением от 1 до 4 аминокислот. Примерами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную формулой V, являются, но не ограничиваются ими, пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, 39, 42, 43, 47 и 50, и пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, 39, 42, 43, 47 и 50, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением от 1 до 4 аминокислот. Примерами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную формулой VI, являются, но не ограничиваются ими, пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16 или 17, и пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16 или 17, заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением от 1 до 4 аминокислот.[0018] Examples of a peptide containing the amino acid sequence represented by Formula I include, but are not limited to, a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, 20, 21, 22, 46, 55, 59 and 60, and a peptide containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, 20, 21, 22, 46, 55, 59 and 60, by substitution, deletion, insertion and/or adding 1 to 3 amino acids. Examples of a peptide containing the amino acid sequence represented by Formula II include, but are not limited to, a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 25, 29 and 32, and a peptide containing an amino acid sequence that is different from an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 25, 29 and 32 by substitution, deletion, insertion and/or addition of 1 to 4 amino acids. Examples of a peptide containing the amino acid sequence represented by Formula III include, but are not limited to, a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, 24, 38, 48 and 54, and a peptide containing the amino acid sequence which differs from an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15, 24, 38, 48 and 54 by a substitution, deletion, insertion and/or addition of 1 to 4 amino acids. Examples of a peptide containing the amino acid sequence represented by Formula IV include, but are not limited to, a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, 31, 35, 44, 56 and 58, and a peptide containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19, 31, 35, 44, 56 and 58 by substitution, deletion, insertion and/or addition of 1 to 4 amino acids. Examples of a peptide containing the amino acid sequence represented by Formula V include, but are not limited to, a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 26, 39, 42, 43, 47 and 50, and a peptide containing an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 26, 39, 42, 43, 47 and 50 by substitution, deletion, insertion and/or addition of 1 to 4 amino acids. Examples of a peptide containing the amino acid sequence represented by Formula VI include, but are not limited to, a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or 17, and a peptide containing an amino acid sequence that is different from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: : 16 or 17, substitution, deletion, insertion and/or addition of 1 to 4 amino acids.
[0019] Мутантный капсидный белок AAV, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению, может быть получен путем встраивания пептида в капсидный белок AAV любого AAV дикого типа, такого как AAV типа 1 (AAV1), AAV типа 2 (AAV2), AAV типа 3 (AAV3A, AAV3B и т.п.), AAV типа 4 (AAV4), AAV типа 5 (AAV5), AAV типа 6 (AAV6), AAV типа 7 (AAV7), AAV типа 8 (AAV8), AAV типа 9 (AAV9), AAV типа 10 (AAV10), AAV типа 11 (AAV11), птичий AAV, бычий AAV, собачий AAV, лошадиный AAV или овечий AAV, или путем замены части аминокислотной последовательности капсидного белка AAV пептидом (другими словами, путем получения капсидного белка AAV, содержащего пептид). В настоящем изобретении, предпочтительно используется капсидный белок AAV2.[0019] The mutant AAV capsid protein encoded by the nucleic acid of the invention can be obtained by inserting the peptide into the AAV capsid protein of any wild type AAV, such as AAV type 1 (AAV1), AAV type 2 (AAV2), AAV type 3 (AAV3A , AAV3B, etc.), AAV type 4 (AAV4), AAV type 5 (AAV5), AAV type 6 (AAV6), AAV type 7 (AAV7), AAV type 8 (AAV8), AAV type 9 (AAV9) , AAV type 10 (AAV10), AAV type 11 (AAV11), avian AAV, bovine AAV, canine AAV, equine AAV, or ovine AAV, or by replacing part of the amino acid sequence of the AAV capsid protein with a peptide (in other words, by producing an AAV capsid protein, containing a peptide). In the present invention, AAV2 capsid protein is preferably used.
[0020] Мутантный капсидный белок AAV, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению, может представлять собой белок, содержащий замену, делецию, инсерцию и/или добавление одной или более или нескольких аминокислот, а также вышеупомянутый пептид в капсидном белке AAV дикого типа. «Белок, содержащий замену, делецию, инсерцию и/или добавление одной или более или нескольких аминокислот, а также вышеупомянутый пептид» сохраняет свойства исходного белка, например, клеточный тропизм мутантного капсидного белка AAV, сообщаемый вышеупомянутым пептидом, способность образовывать капсид, функцию капсидного белка (например, защиту вирусного генома, удаление оболочки после проникновения в клетки-хозяева) и т.п.[0020] The mutant AAV capsid protein encoded by the nucleic acid of the invention may be a protein containing a substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more or more amino acids, as well as the above-mentioned peptide in a wild-type AAV capsid protein. "A protein containing a substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more or more amino acids, as well as the above-mentioned peptide" retains the properties of the original protein, e.g., the cellular tropism of the mutant AAV capsid protein conferred by the above-mentioned peptide, the ability to form a capsid, the function of the capsid protein (for example, protection of the viral genome, removal of the envelope after penetration into host cells), etc.
[0021] Кроме того, к N-концу и/или C-концу пептида, который должен входить в состав капсидного белка AAV, может быть присоеднена спейсерная последовательность. Спейсерная последовательность предпочтительно состоит из 1-5 аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки, составляющие спейсерную последовательность, имеют конкретные ограничения. Так, например, спейсерная последовательность может содержать аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина и серина.[0021] In addition, a spacer sequence may be attached to the N-terminus and/or C-terminus of the peptide that is to be part of the AAV capsid protein. The spacer sequence preferably consists of 1-5 amino acid residues. The amino acid residues that make up the spacer sequence have specific restrictions. For example, the spacer sequence may comprise an amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine and serine.
[0022] В качестве капсидного белка AAV для включения пептида могут быть использованы AAV VP1, VP2 или VP3. Только один из VP1, VP2 и VP3 может быть получен так, чтобы он содержал пептид, либо все VP1, VP2 и VP3 могут быть получены так, чтобы они содержали пептид. Кроме того, два капсидных белка, такие как VP1 и VP2, VP2 и VP3 или VP1 и VP3 могут быть получены так, чтобы они содержали пептид. VP1-VP3 кодируются областью гена cap в геноме AAV. В одном варианте осуществления изобретения, область, охватываемая VP1-VP3, создана так, чтобы она содержала пептид, и так, чтобы мутация могла быть введена во все VP1-VP3. В другом варианте осуществления изобретения, ген, кодирующий VP1, VP2 или VP3, получают отдельно от области гена cap AAV, и в этот ген вводят мутацию. В этом случае, может быть осуществлена обработка, которая ингибирует капсидный белок дикого типа, соответствующий капсидному белку, кодируемому геном, в который была введена мутация посредством экспрессии в области гена cap AAV.[0022] As the AAV capsid protein for incorporating the peptide, AAV VP1, VP2 or VP3 can be used. Only one of VP1, VP2 and VP3 may be prepared to contain the peptide, or all VP1, VP2 and VP3 may be prepared to contain the peptide. In addition, two capsid proteins such as VP1 and VP2, VP2 and VP3, or VP1 and VP3 can be prepared to contain a peptide. VP1-VP3 are encoded by the cap gene region of the AAV genome. In one embodiment of the invention, the region covered by VP1-VP3 is designed to contain the peptide and so that the mutation can be introduced into all VP1-VP3. In another embodiment of the invention, the gene encoding VP1, VP2 or VP3 is obtained separately from the cap gene region of AAV, and a mutation is introduced into this gene. In this case, a treatment can be carried out that inhibits the wild-type capsid protein corresponding to the capsid protein encoded by the gene in which the mutation has been introduced through expression in the AAV cap gene region.
[0023] В случае использования VP1 AAV2, мутант капсидного белка AAV, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению, предпочтительно содержит пептид в положении между аминокислотой 588 и аминокислотой 589. Аминокислота 588 в VP1 AAV2 представляет собой аргинин. Аминокислота 589 в VP1 AAV2 представляет собой глутамин. Аминокислота 588 VP1 AAV2 соответствует аминокислоте 451 VP2 AAV2 и аминокислоте 386 VP3 AAV2. В случае, когда в качестве капсидного белка AAV используют капсидный белок AAV, серотипы и кладотипы которого отличаются от AAV2, то капсидный белок AAV получают так, чтобы он содержал пептид между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 588 и 589 VP1 AAV2. Специалист в данной области может легко идентифицировать аминокислоту капсидного белка серотипов и кладотипов AAV, отличающихся от AAV2, которая соответствует аминокислоте 588 VP1 AAV2. Так, например, см. выравнивание аминокислотных последовательностей VP1, представленное Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.99, No. 18, pp. 11854-11859, 2002. Так, например, аминокислота 588 VP1 AAV2 соответствует аминокислоте 589 AAV1, аминокислоте 590 AAV7 и аминокислоте 591 AAV8.[0023] When AAV2 VP1 is used, the AAV capsid protein mutant encoded by the nucleic acid of the invention preferably contains a peptide at a position between amino acid 588 and amino acid 589. Amino acid 588 in AAV2 VP1 is arginine. Amino acid 589 in VP1 of AAV2 is glutamine. Amino acid 588 of AAV2 VP1 corresponds to amino acid 451 of AAV2 VP2 and amino acid 386 of AAV2 VP3. In the case where an AAV capsid protein whose serotypes and cladotypes are different from AAV2 is used as the AAV capsid protein, the AAV capsid protein is prepared to contain a peptide between amino acids corresponding to amino acids 588 and 589 of AAV2 VP1. One skilled in the art can readily identify the capsid protein amino acid of AAV serotypes and cladotypes other than AAV2, which corresponds to amino acid 588 of AAV2 VP1. For example, see the amino acid sequence alignment of VP1 presented by Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.99, No. 18, pp. 11854-11859, 2002. For example, amino acid 588 VP1 of AAV2 corresponds to amino acid 589 of AAV1, amino acid 590 of AAV7 and amino acid 591 of AAV8.
[0024] Нуклеиновая кислота согласно изобретению может быть функционально связана с подходящей регуляторной последовательностью. Примерами регуляторной последовательности являются промоторная последовательность, сигнал полиаденилирования, последовательность терминации транскрипции, вышерасположенный регуляторный домен, ориджин репликации, внутренний сайт связывания с рибосомой (IRES) и энхансер. Примерами промоторных последовательностей являются индуцибельная промоторная последовательность и конститутивная промоторная последовательность. Регуляторная последовательность может представлять собой эндогенную или экзогенную последовательность AAV, от которой происходит капсидный белок, нативную последовательность или синтезированную последовательность. Настоящее изобретение также включает такую рекомбинантную ДНК, способную экспрессировать мутантный капсидный белок AAV.[0024] The nucleic acid of the invention may be operably linked to a suitable regulatory sequence. Examples of a regulatory sequence are a promoter sequence, a polyadenylation signal, a transcription termination sequence, an upstream regulatory domain, an origin of replication, an internal ribosome binding site (IRES), and an enhancer. Examples of promoter sequences are an inducible promoter sequence and a constitutive promoter sequence. The regulatory sequence may be an endogenous or exogenous AAV sequence from which the capsid protein is derived, a native sequence, or a synthesized sequence. The present invention also includes such recombinant DNA capable of expressing mutant AAV capsid protein.
[0025] Рекомбинантная ДНК согласно изобретению является подходящей для доставки нуклеиновой кислоты согласно изобретению в клетки in vitro, ex vivo или in vivo и сообщения клеткам способности экспрессировать мутантный капсидный белок AAV. Затем, клетка, в которую доставляется нуклеиновая кислота согласно изобретению, может быть использована для получения частиц AAV. Рекомбинантная ДНК может быть, в частности, использована для доставки или введения нуклеиновой кислоты согласно изобретению в клетки животных, а предпочтительно в клетки млекопитающих.[0025] The recombinant DNA of the invention is suitable for delivering the nucleic acid of the invention to cells in vitro, ex vivo or in vivo and imparting to the cells the ability to express the mutant AAV capsid protein. The cell into which the nucleic acid of the invention is delivered can then be used to produce AAV particles. Recombinant DNA can in particular be used to deliver or introduce the nucleic acid according to the invention into animal cells, and preferably into mammalian cells.
[0026] В настоящем изобретении, рекомбинантная ДНК согласно изобретению может быть получена путем создания ДНК, используемой в качестве вектора для сохранения нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Так, например, могут быть использованы плазмидная ДНК, фаговая ДНК, транспозон, космидная ДНК, эписомная ДНК или вирусный геном.[0026] In the present invention, recombinant DNA according to the invention can be obtained by creating DNA used as a vector for storing the nucleic acid according to the invention. Thus, for example, plasmid DNA, phage DNA, transposon, cosmid DNA, episomal DNA or a viral genome can be used.
[0027] (2) Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту согласно изобретению[0027] (2) A cell containing a nucleic acid according to the invention
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, например, к выделенной клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту согласно изобретению, а в частности, рекомбинантную ДНК, как описано выше в (1). Выделенная клетка представляет собой, например, клеточную линию, поддерживаемую in vitro. Клетка-хозяин согласно изобретению является подходящей для получения частицы AAV согласно изобретению, как объясняется ниже. Если клетка-хозяин согласно изобретению используется для продуцирования частиц AAV, то такая клетка-хозяин может называться «упаковывающей клеткой» или «клеткой-продуцентом». Клетка-хозяин согласно изобретению может содержать рекомбинантную ДНК согласно изобретению, описанную выше в (1) и интегрированную в геном, или сохранять рекомбинантную ДНК в клетке, так, чтобы она временно экспрессировала мутант капсидного белка AAV.The present invention also relates to a host cell, for example, an isolated host cell containing a nucleic acid according to the invention, and in particular, recombinant DNA, as described above in (1). The isolated cell is, for example, a cell line maintained in vitro . The host cell of the invention is suitable for producing the AAV particle of the invention, as explained below. If a host cell according to the invention is used to produce AAV particles, then the host cell may be referred to as a "packaging cell" or a "producer cell". The host cell of the invention may contain the recombinant DNA of the invention described in (1) above and integrated into the genome, or maintain the recombinant DNA in the cell so that it transiently expresses a mutant of the AAV capsid protein.
[0028] Введение рекомбинантной ДНК согласно изобретению в клетку-хозяина может быть осуществлено известным способом. Так, например, могут быть осуществлены электропорация, осаждение фосфатом кальция, прямая микроинъекция в клетки, опосредуемая липосомами трансфекция генов, или доставка нуклеиновой кислоты с использованием «дробовика» для высокоскоростной подачи частиц. При использовании вирусного вектора может быть выбран способ инфицирования, подходящий для этого вектора. При применении такого разработанного метода, рекомбинантную ДНК согласно изобретению стабильно вводят в хромосому клетки-хозяина или временно в цитоплазму клетки-хозяина. Для стабильной трансформации, селективный маркер, например, хорошо известный селективный маркер, такой как ген резистентности к неомицину (кодирующий неомицинфосфотрансферазу) или ген резистентности к гигромицину B (кодирующий аминогликозид-фосфотрансферазу (APH)), может быть связан с рекомбинантной ДНК согласно изобретению.[0028] Introduction of recombinant DNA according to the invention into a host cell can be carried out in a known manner. For example, electroporation, calcium phosphate precipitation, direct microinjection into cells, liposome-mediated gene transfection, or nucleic acid delivery using a high-speed particle delivery shotgun can be performed. When using a viral vector, an infection method suitable for the vector may be selected. When using such a developed method, the recombinant DNA according to the invention is stably introduced into the chromosome of the host cell or temporarily into the cytoplasm of the host cell. For stable transformation, a selectable marker, for example a well-known selectable marker such as a neomycin resistance gene (encoding neomycin phosphotransferase) or a hygromycin B resistance gene (encoding aminoglycoside phosphotransferase (APH)), can be linked to the recombinant DNA of the invention.
[0029] В качестве клетки-хозяина могут быть использованы различные клетки, например, клетки млекопитающих, включая клетки мышей и клетки приматов (например, человеческие клетки) или клетки насекомых. Подходящими примерами клеток млекопитающих являются, но не ограничиваются ими, первичные клетки и клеточные линии. Примерами подходящих клеточных линий являются клетки 293, клетки COS, клетки HeLa, клетки Vero, мышиные фибробласты 3T3, фибробласты C3H10T1/2, клетки CHO и клетки, полученные из этих клеток.[0029] Various cells can be used as the host cell, such as mammalian cells, including mouse cells and primate cells (eg, human cells) or insect cells. Suitable examples of mammalian cells include, but are not limited to, primary cells and cell lines. Examples of suitable cell lines are 293 cells, COS cells, HeLa cells, Vero cells, mouse 3T3 fibroblasts, C3H10T1/2 fibroblasts, CHO cells and cells derived from these cells.
[0030] (3) Частица AAV, включающая капсидный белок AAV, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой согласно изобретению.[0030] (3) An AAV particle comprising an AAV capsid protein containing the amino acid sequence encoded by the nucleic acid of the invention.
Частица AAV согласно изобретению представляет собой частицу AAV, включающую мутант капсидного белка AAV, содержащий пептид, описанный выше в (1). Частица AAV согласно изобретению может быть получена из клетки-хозяина, описанной выше в (2). Частица AAV согласно изобретению обладает тропизмом в отношении головного мозга и может быть использована для введения гена в головной мозг. Головной мозг включает клетки головного мозга, такие как нейроны и глиальные клетки (микроглиальные клетки, олигодендроциты, астроциты). Ген, вводимый частицей AAV согласно изобретению, в высокой степени экспрессируется в вышеупомянутых тканях, органах и клетках.The AAV particle of the invention is an AAV particle comprising a mutant of the AAV capsid protein containing the peptide described in (1) above. The AAV particle of the invention can be obtained from the host cell described in (2) above. The AAV particle of the invention has brain tropism and can be used to introduce a gene into the brain. The brain includes brain cells such as neurons and glial cells (microglial cells, oligodendrocytes, astrocytes). The gene introduced by the AAV particle according to the invention is highly expressed in the above-mentioned tissues, organs and cells.
[0031] Для продуцирования частиц AAV, клетка, содержащая некоторые элементы, необходимые для продуцирования частиц AAV, может быть использована в качестве упаковывающей клетки. Первый элемент представляет собой векторный геном (также называемый экспрессионным вектором) для рекомбинантного AAV, который может реплицироваться в клетке-хозяине и упаковываться в частицу AAV. Геном рекомбинантного вектора AAV содержит представляющий интерес гетерологичный полинуклеотид и последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, расположенные на каждой стороне, то есть, на 5'- и 3'-сторонах представляющего интерес гетерологичного полинуклеотида. Представляющий интерес гетерологичный полинуклеотид может иметь последовательность регуляции экспрессии. Нуклеотидные последовательности ITR являются известными. Так, например, последовательности AAV2-ITR можно найти в публикации Human Gene Therapy, Vol.5, pp. 793-801, 1994. Что касается последовательностей ITR AAV, то могут быть использованы последовательности ITR, происходящие от AAV любых различных серотипов, включая AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 и т.п. Последовательности ITR, используемые в настоящем изобретении, могут происходить от AAV дикого типа или могут быть модифицированы путем инсерции, делеции или замены нуклеотида(ов). Последовательности ITR позволяют осуществлять репликацию генома рекомбинантного вектора AAV в присутствии белка Rep и обеспечивают включение генома рекомбинантного вектора AAV в капсидную часть при продуцировании частиц AAV.[0031] For the production of AAV particles, a cell containing some of the elements necessary for the production of AAV particles can be used as a packaging cell. The first element is a vector genome (also called an expression vector) for a recombinant AAV that can replicate in a host cell and be packaged into an AAV particle. The recombinant AAV vector genome contains the heterologous polynucleotide of interest and AAV inverted terminal repeat (ITR) sequences located on each side, that is, on the 5' and 3' sides of the heterologous polynucleotide of interest. The heterologous polynucleotide of interest may have an expression regulation sequence. The ITR nucleotide sequences are known. For example, AAV2-ITR sequences can be found in Human Gene Therapy, Vol.5, pp. 793-801, 1994. With respect to AAV ITR sequences, ITR sequences derived from any of the different AAV serotypes, including AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, and the like, may be used. The ITR sequences used in the present invention may be derived from wild-type AAV or may be modified by insertion, deletion or substitution of nucleotide(s). The ITR sequences allow replication of the recombinant AAV vector genome in the presence of the Rep protein and ensure incorporation of the recombinant AAV vector genome into the capsid portion during production of AAV particles.
[0032] Размер представляющего интерес гетерологичного полинуклеотида, который может находиться внутри частиц AAV согласно изобретению, обычно составляет приблизительно менее, чем 5 тысяч пар оснований (т.п.о.). Представляющий интерес гетерологичный полинуклеотид может представлять собой, например, ген, кодирующий представляющий интерес белок, который у реципиента либо отсутствует, либо удаляется; ген, кодирующий белок, обладающий нужной биологической или терапевтической активностью (например, антимикробной, противовирусной или противоопухолевой активностью); нужную нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК, которая ингибирует или снижает уровень продуцирования вредного или нежелательного белка; или нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный белок. Представляющий интерес гетерологичный полинуклеотид может быть соответствующим образом выбран в зависимости от целей его применения.[0032] The size of the heterologous polynucleotide of interest that may be present within the AAV particles of the invention is typically less than about 5 kilobase pairs (kb). The heterologous polynucleotide of interest may be, for example, a gene encoding a protein of interest that is either absent or deleted in the recipient; a gene encoding a protein having a desired biological or therapeutic activity (eg, antimicrobial, antiviral or antitumor activity); a desired nucleotide sequence encoding an RNA that inhibits or reduces the production of a harmful or unwanted protein; or a nucleotide sequence encoding an antigenic protein. The heterologous polynucleotide of interest may be suitably selected depending on its intended use.
[0033] В одном варианте осуществления изобретения, в геноме рекомбинантного вектора AAV отсутствует область гена cap и/или область гена rep. В этом варианте осуществления изобретения, частица AAV, в которой упакован геном рекомбинантного вектора AAV, не реплицируется отдельно, и в инфицированной клетке, частица AAV повторно не образуется.[0033] In one embodiment of the invention, the genome of the recombinant AAV vector lacks the cap gene region and/or the rep gene region. In this embodiment of the invention, the AAV particle in which the genome of the recombinant AAV vector is packaged is not replicated separately, and in the infected cell, the AAV particle is not regenerated.
[0034] Второй элемент, необходимый для продуцирования частиц AAV, представляет собой конструкцию, которая обеспечивает белки, кодируемые AAV дикого типа. Эта конструкция кодирует гены, происходящие от AAV и обеспечивающие продукты генов AAV, необходимые для образования частиц AAV. Другими словами, эта конструкция содержит одну или две основных ОРС AAV, кодирующих области гена rep и гена cap. Для получения частиц AAV согласно изобретению, в качестве ген cap используется по меньшей мере нуклеиновая кислота, кодирующая мутант капсидного белка AAV, включающий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 - SEQ ID NO: 62. Клетка-хозяин согласно изобретению, описанная выше в (2) и способная экспрессировать мутант, может быть использована для продуцирования частиц AAV. Частица AAV имеет капсулу, состоящую из множества капсидных белков. Все капсидные белки могут быть мутантами, либо часть капсидных белков могут быть мутантами, а другие могут представлять собой белки капсида дикого типа. Частица AAV согласно изобретению может содержать мутант капсидных белков одного вида или мутанты капсидных белков нескольких видов.[0034] The second element required for the production of AAV particles is a construct that provides proteins encoded by wild-type AAV. This construct encodes AAV-derived genes that provide the AAV gene products required for the formation of AAV particles. In other words, this construct contains one or two major AAV ORFs encoding regions of the rep gene and the cap gene. To produce AAV particles according to the invention, the cap gene is at least a nucleic acid encoding a mutant of the AAV capsid protein comprising a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62. Cell -host according to the invention described in (2) above and capable of expressing the mutant can be used to produce AAV particles. The AAV particle has a capsule consisting of many capsid proteins. All capsid proteins may be mutants, or some capsid proteins may be mutants and others may be wild-type capsid proteins. The AAV particle of the invention may contain a mutant of one type of capsid proteins or mutants of several types of capsid proteins.
[0035] Ген rep AAV содержится в кодирующих областях гена rep и включает гены, кодирующие белки репликации Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40. Было показано, что эти продукты экспрессии Rep обладают многими функциями, включая распознавание, связывание и образование одноцепочесного разрыва ориджина репликации геномной ДНК AAV, ДНК-геликазную активность и модуляцию транскрипции из промоторов, происходящих от AAV.[0035] The AAV rep gene is contained in the coding regions of the rep gene and includes genes encoding the replication proteins Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40. These Rep expression products have been shown to have many functions, including recognition, binding and single-strand break formation of the AAV genomic DNA origin of replication, DNA helicase activity, and modulation of transcription from AAV-derived promoters.
[0036] Третий элемент, необходимый для продуцирования частиц AAV, представляет собой функциональный вирус-помощник (также называемый вспомогательным функциональным вирусом) для репликации AAV. Для сообщения хелперных функций обычно используется аденовирус. Однако, могут быть также использованы и другие вирусы, такие как вирус простого герпеса типа 1 или типа 2 и вирус осповакцины. При использовании вируса, клетку-хозяина инфицируют вирусом в качестве вируса-помощника. Так, например, поскольку экспрессия ранних генов аденовируса необходима только для упаковки частиц AAV, то может быть использован аденовирус, который не обнаруживает экспрессию поздних генов. Также может быть использован мутант аденовируса, который не экспрессирует поздние гены (например, вариант аденовируса ts100K или ts149). Конструкция нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает функции вируса-помощника, может быть также получена с использованием нуклеиновых кислот, необходимых для функционирования вируса-помощника и выделенных из вируса-помощника, а затем она может быть введена в клетку-хозяина. Конструкция, которая обеспечивает функции вируса-помощника, содержит нуклеотидную последовательность, обеспечивающую одну или несколько функций вируса-помощника, и презентируется клетке-хозяину в форме плазмиды, фага, транспозона, космиды или других вирусов.[0036] The third element required for the production of AAV particles is a functional helper virus (also called a helper functional virus) for AAV replication. An adenovirus is usually used to communicate helper functions. However, other viruses may also be used, such as herpes simplex virus type 1 or type 2 and vaccinia virus. When using a virus, a host cell is infected with the virus as a helper virus. For example, since adenovirus early gene expression is only required for packaging of AAV particles, an adenovirus that does not exhibit late gene expression can be used. An adenovirus mutant that does not express late genes (eg, ts100K or ts149 adenovirus variant) can also be used. The nucleic acid construct that provides the functions of the helper virus can also be produced using nucleic acids required for the function of the helper virus and isolated from the helper virus, and then it can be introduced into a host cell. The construct that provides the functions of the helper virus contains a nucleotide sequence that provides one or more functions of the helper virus, and is presented to the host cell in the form of a plasmid, phage, transposon, cosmid or other viruses.
[0037] Для получения частиц AAV осуществляют: (а) стадию введения первого элемента, генома рекомбинантного вектора AAV в клетку-хозяина, (b) стадию введения второго элемента, то есть, конструкции, которая сообщает хелперные функции AAV клетке-хозяину, и (c) стадию введения третьего элемента, то есть, вируса-помощника в клетку-хозяина. Эти стадии могут быть осуществлены одновременно или по порядку. Порядок проведения стадий (а) - (с) может быть любым. Если в клетку-хозяина вводят элементы с первого по третий, то продукты экспрессии гена rep вырезаются и реплицируется геном рекомбинантного вектора. Экспрессированные капсидные белки образуют капсид, и геном рекомбинантного вектора упаковывается в капсид с образованием частицы AAV. Если клетка-хозяин экспрессирует мутантный капсидный белок AAV, то оболочка полученной частицы AAV включает мутантный капсидный белок AAV.[0037] To produce AAV particles, the following steps are performed: (a) the step of introducing a first element, the genome of the recombinant AAV vector, into the host cell, (b) the step of introducing a second element, that is, a construct that imparts AAV helper functions to the host cell, and ( c) the step of introducing the third element, that is, the helper virus, into the host cell. These steps can be carried out simultaneously or in order. The order of stages (a) - (c) can be any. If elements one through three are introduced into a host cell, the expression products of the rep gene are excised and replicated by the recombinant vector gene. The expressed capsid proteins form a capsid, and the recombinant vector genome is packaged into the capsid to form the AAV particle. If the host cell expresses the mutant AAV capsid protein, then the envelope of the resulting AAV particle includes the mutant AAV capsid protein.
[0038] Частица AAV может быть выделена и очищена из супернатанта культуры или лизата клетки-хозяина с применением различных методов очистки, таких как центрифугирование в градиенте плотности CaCl. Если вирус используется в вышеописанной стадии (c), то, например, может быть дополнительно проведена стадия отделения частицы AAV от вируса-помощника исходя из их размера. Частица AAV также может быть отделена от вируса-помощника исходя из различий в аффинности к гепарину. Кроме того, оставшиеся вирусы-помощники могут быть инактивированы известными методами. Так, например, аденовирусы могут быть инактивированы путем нагревания приблизительно при 60ºC, например, в течение 20 минут или более. Поскольку частицы AAV очень устойчивы к нагреванию, то описанная выше обработка является эффективной для селективного удаления аденовирусов, используемых в качестве вирусов-помощников.[0038] The AAV particle can be isolated and purified from culture supernatant or host cell lysate using various purification methods, such as CaCl density gradient centrifugation. If the virus is used in step (c) above, then, for example, the additional step of separating the AAV particle from the helper virus based on their size can be carried out. The AAV particle can also be separated from the helper virus based on differences in affinity for heparin. In addition, the remaining helper viruses can be inactivated by known methods. Thus, for example, adenoviruses can be inactivated by heating at approximately 60ºC, for example, for 20 minutes or more. Because AAV particles are very heat resistant, the above treatment is effective for selectively removing adenoviruses used as helper viruses.
[0039] (4) Способ получения клетки согласно изобретению, трансдуцированной геном[0039] (4) Method for producing a cell according to the invention transduced with a gene
Частицу AAV согласно изобретению, полученную как описано выше в (3), используют для доставки представляющего интерес гетерологичного полинуклеотида в клетку в целях проведения генотерапии или в других целях. Частицу AAV обычно вводят в клетку in vivo или in vitro. Для введения in vitro, частицу AAV подвергают контактированию с клеткой, полученной из живого организма. Затем клетка может быть также трансплантирована в живой организм. Для введения клетки в живой организм, клетка может быть получена в виде фармацевтической композиции, которая может быть введена различными методами, такими как внутримышечное, внутривенное, подкожное и внутрибрюшинное введение. Для трансдукции in vivo, частицу AAV получают в виде фармацевтической композиции и, обычно вводят парентерально (например, внутримышечно, подкожно, вовнутрь опухоли, трансдермально или интраспинально). Фармацевтическая композиция, включающая частицу AAV, может содержать фармацевтически приемлемый носитель и, при необходимости, другой агент, лекарственное средство, стабилизатор, носитель, адъювант, разбавитель и т.п.The AAV particle of the invention, prepared as described in (3) above, is used to deliver a heterologous polynucleotide of interest into a cell for gene therapy or other purposes. The AAV particle is usually introduced into a cell in vivo or in vitro . For in vitro administration, the AAV particle is contacted with a cell derived from a living organism. The cell can then also be transplanted into a living organism. To introduce a cell into a living body, the cell can be prepared in the form of a pharmaceutical composition, which can be administered by various methods, such as intramuscular, intravenous, subcutaneous and intraperitoneal administration. For in vivo transduction, the AAV particle is prepared as a pharmaceutical composition and is typically administered parenterally (eg, intramuscularly, subcutaneously, intratumorally, transdermally, or intraspinal). A pharmaceutical composition comprising an AAV particle may contain a pharmaceutically acceptable carrier and, if necessary, another agent, drug, stabilizer, carrier, adjuvant, diluent, and the like.
ПримерыExamples
[0040] Настоящее изобретение более подробно описано со ссылкой на нижеследующие Примеры, которые не рассматриваются как ограничение объема изобретения.[0040] The present invention is described in more detail with reference to the following Examples, which are not intended to limit the scope of the invention.
[0041] Пример 1. Получение библиотеки плазмид неспецифических пептидов AAV2[0041] Example 1: Preparation of a library of AAV2 non-specific peptide plasmids
Плазмидный вектор pAV1 (АТСС: № 37215), несущий геном AAV2, экстрагировали из широко распространенного хозяина Escherichia coli HB101. Из экстрагированной плазмиды вырезали геномную ДНК AAV2 (приблизительно 4,7 т.п.о.) под действием рестриктирующего фермента BgIII (производимого TAKARA BIO Inc.). Эту геномную ДНК встраивали в pUC118 BamHI/BAP (производимую TAKARA BIO Inc.). Полученная таким образом плазмидная ДНК была названа AAV2WG/pUC118.Plasmid vector pAV1 (ATCC: no. 37215), carrying the AAV2 genome, was extracted from the widespread host Escherichia coli HB101. AAV2 genomic DNA (approximately 4.7 kb) was excised from the extracted plasmid using the restriction enzyme BgIII (manufactured by TAKARA BIO Inc.). This genomic DNA was inserted into pUC118 BamHI/BAP (manufactured by TAKARA BIO Inc.). The plasmid DNA thus obtained was named AAV2WG/pUC118.
[0042] AAV2WG/pUC118 расщепляли рестриктирующим ферментом ScaI (производства TAKARA BIO Inc.) с получением фрагмента размером приблизительно 0,8 т.п.о., содержащего нуклеотиды 1190-2017 гена cap. Этот фрагмент был встроен в pUC118 HincII/BAP (производства TAKARA BIO Inc.). Полученная таким образом плазмидная ДНК была названа Cap-ScaI/pUC118. Затем Cap-ScaI/pUC118 подвергали ПЦР для проведения серии модификаций, где нуклеотидную последовательность AAC(587N), состоящую из нуклеотидов 1759-1761 гена Cap в Cap-ScaI/pUC118, конвертировали в CAG (587Q), где 10 нуклеотидов, состоящих из GGC в качестве спейсера, CAAG в качестве остова и GCC в качестве спейсера, были встроены между нуклеотидом 1764 и нуклеотидом 1765, а нуклеотидная последовательность CAA(589Q)GCA(590A)GCT(591A), состоящая из нуклеотидов 1765-1773, была конвертирована в CAG(589Q GCG(590A)GCC(591A), где буквы в скобках означают номера аминокислот и кодируемые аминокислоты. Таким образом, были встроены два сайта распознавания рестриктирующего фермента SfiI, и между ними были встроены спейсер, остов и спейсер. На фигуре 1 показаны нуклеотидные последовательности до и после конверсии нуклеотидов 1756-1773 гена Cap. Нуклеотидная последовательность до конверсии представлена SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. Нуклеотидная последовательность после конверсии представлена SEQ ID NO: 2. Плазмидная ДНК, содержащая конвертированную нуклеотидную последовательность, была названа Cap-ScaI-S4/pUC118. Для клонирования методом слияния, часть гена Cap в Cap-ScaI-S4/pUC118 амплифицировали с помощью ПЦР с получением фрагмента размером приблизительно 0,8 т.п.о. Этот фрагмент использовали в качестве ДНК-вставки.[0042] AAV2WG/pUC118 was digested with the restriction enzyme ScaI (manufactured by TAKARA BIO Inc.) to obtain a fragment of approximately 0.8 kb containing nucleotides 1190-2017 of the cap gene. This fragment was inserted into pUC118 HincII/BAP (manufactured by TAKARA BIO Inc.). The plasmid DNA thus obtained was named Cap-ScaI/pUC118. Cap-ScaI/pUC118 was then subjected to PCR to perform a series of modifications, where the nucleotide sequence AAC(587N), consisting of nucleotides 1759-1761 of the Cap gene in Cap-ScaI/pUC118, was converted to CAG (587Q), where 10 nucleotides consisting of GGC as a spacer, CAAG as a backbone and GCC as a spacer were inserted between nucleotide 1764 and
[0043] AAV2WG/pUC118 был подвергнут ПЦР, так, чтобы мутация была введена в сайт распознавания рестриктирующего фермента ScaI в гене резистентности к ампициллину и в сайт распознавания рестриктирующего фермента SfiI в гене Rep, так, чтобы эти сайты распознавания были конвертированы в последовательности, которые не распознаются рестриктирующими ферментами. Для сайта распознавания ScaI, нуклеотидная последовательность GAG (E), состоящая из нуклеотидов 304-306 гена резистентности к ампициллину, была конвертирована в GAA(E). Последовательность до конверсии представлена SEQ ID NO: 3, а последовательность после конверсии представлена SEQ ID NO: 4. Для сайта распознавания SfiI, нуклеотидная последовательность GCC(A), состоящая из нуклеотидов 217-219 гена Rep, была конвертирована в GCA(A). Последовательность до конверсии представлена SEQ ID NO: 5, а последовательность после конверсии представлена SEQ ID NO: 6. Полученная таким образом плазмидная ДНК была расщеплена ферментом ScaI (производства TAKARA BIO Inc.) с получением линейного вектора, не содержащего приблизительно 0,8 т.п.о., которые были частью гена Cap. Этот вектор был использован в качестве линейного вектора для клонирования методом слияния.[0043] AAV2WG/pUC118 was subjected to PCR so that a mutation was introduced into the ScaI restriction enzyme recognition site in the ampicillin resistance gene and into the SfiI restriction enzyme recognition site in the Rep gene, so that these recognition sites were converted into sequences that are not recognized by restriction enzymes. For the ScaI recognition site, the nucleotide sequence GAG(E), consisting of nucleotides 304-306 of the ampicillin resistance gene, was converted to GAA(E). The pre-conversion sequence is shown by SEQ ID NO: 3, and the post-conversion sequence is shown by SEQ ID NO: 4. For the SfiI recognition site, the nucleotide sequence GCC(A), consisting of nucleotides 217-219 of the Rep gene, was converted to GCA(A). The pre-conversion sequence is shown as SEQ ID NO: 5, and the post-conversion sequence is shown as SEQ ID NO: 6. The plasmid DNA thus obtained was digested with ScaI enzyme (manufactured by TAKARA BIO Inc.) to obtain a linear vector lacking approximately 0.8 kb. bp that were part of the Cap gene. This vector was used as a linear vector for fusion cloning.
[0044] С использованием набора для клонирования HD методом слияния (зарегистрированный товарный знак) (производимого Clontech Laboratories, Inc.) и усилителя клонирования (производимого Сlontech Laboratories, Inc.), ДНК-вставку встраивали в линейный вектор, и тем самым осуществляли направленное клонирование. Полученная таким образом плазмидная ДНК была названа AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx.[0044] Using an HD fusion cloning kit (registered trademark) (manufactured by Clontech Laboratories, Inc.) and a cloning enhancer (manufactured by Clontech Laboratories, Inc.), the DNA insert was inserted into a linear vector, and thereby directional cloning was carried out . The plasmid DNA thus obtained was named AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx.
[0045] Олиго-ДНК (SEQ ID NO: 7), содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую неспецифический пептид из 7 аминокислот, была получена путем искусственного синтеза. Двухцепочечную ДНК получали из олиго-ДНК посредством реакции взаимодействия с праймером (SEQ ID NO: 8) и фрагментом Кленова (производимым TAKARA BIO Inc.) при 37°C в течение 3 часов. Двухцепочечную ДНК очищали с использованием набора для удаления нуклеотидов (производимого QIAGEN), а затем расщепляли рестриктирующим ферментом BglI (производимым TAKARA BIO Inc.). Эту ДНК встраивали в AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx, расщепленную SfiI, с использованием набора для лигирования ДНК <Mighty Mix> (производимого TAKARA BIO Inc.). Полученная таким образом плазмида была названа AAV2WG-RPL/pUC118Sx и использовалась в качестве библиотеки плазмид неспецифических пептидов AAV2.[0045] Oligo-DNA (SEQ ID NO: 7) containing a nucleotide sequence encoding a non-specific peptide of 7 amino acids was obtained by artificial synthesis. Double-stranded DNA was prepared from oligo-DNA by reacting with a primer (SEQ ID NO: 8) and a Klenow fragment (manufactured by TAKARA BIO Inc.) at 37°C for 3 hours. Double-stranded DNA was purified using a nucleotide removal kit (manufactured by QIAGEN) and then digested with the restriction enzyme BglI (manufactured by TAKARA BIO Inc.). This DNA was inserted into SfiI-digested AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx using the <Mighty Mix> DNA ligation kit (manufactured by TAKARA BIO Inc.). The plasmid thus obtained was named AAV2WG-RPL/pUC118Sx and was used as a library of AAV2 nonspecific peptide plasmids.
[0046] Пример 2: Получение вирусной библиотеки неспецифических пептидов AAV2[0046] Example 2: Preparation of AAV2 Nonspecific Peptide Viral Library
(1) Посев клеток AAV293(1) Seeding of AAV293 cells
Культивируемые клетки AAV293 (производимые Stratagene Corp.) собирали, а затем суспендировали в среде DMEM (производимой Sigma), содержащей 10% FBS и 2 мМ L-глутамата натрия в концентрации 5 × 104 клеток/мл. В колбу T225 см2 для культивирования клеток (изготовленную Corning Incorporated) помещали 40 мл суспензии, содержащей клетки AAV293, а затем культивировали при 37°C в течение 72 часов в инкубаторе с CO2.Cultured AAV293 cells (manufactured by Stratagene Corp.) were collected and then suspended in DMEM (manufactured by Sigma) containing 10% FBS and 2 mM MSG at a concentration of 5 × 10 4 cells/ml. A T225 cm 2 cell culture flask (manufactured by Corning Incorporated) was filled with 40 ml of suspension containing AAV293 cells and then cultured at 37°C for 72 hours in a CO 2 incubator.
[0047] (2) Введение плазмиды в клетку AAV293.[0047] (2) Introducing the plasmid into an AAV293 cell.
Клетки AAV293 трансфицировали 400 нг AAV2WG-RPL/pUC118Sx, полученной как описано в Примере 1, и 40 мкг pHELP (производимого CELL BIOLABS, Inc.) обычным методом с использованием фосфата кальция. Через шесть часов после трансфекции, среду полностью удаляли. После добавления 40 мл среды DMEM, содержащей 2% FBS и 2 мМ L-глутамата натрия, клетки культивировали при 37ºC в течение 48 часов в CO2-инкубаторе.AAV293 cells were transfected with 400 ng of AAV2WG-RPL/pUC118Sx prepared as described in Example 1 and 40 μg of pHELP (manufactured by CELL BIOLABS, Inc.) by the conventional calcium phosphate method. Six hours after transfection, the medium was completely removed. After adding 40 ml of DMEM containing 2% FBS and 2 mM MSG, cells were cultured at 37ºC for 48 hours in a CO 2 incubator.
[0048] (3) Сбор вирусной библиотеки неспецифических пептидов AAV2.[0048] (3) Collection of a viral library of non-specific AAV2 peptides.
В инкубируемую колбу T225 см2 добавляли 0,5 мл 0,5 М EDTA с последующим выдерживанием в течение нескольких минут. Затем клетки AAV293 слущивали и собирали в 50 мл-пробирку с помощью пипетки и центрифугировали при 300× g в течение 10 минут. Затем удаляли супернатант. Клетки ресуспендировали в 2 мл TBS (трис-забуференного солевого раствора) на колбу, а затем трижды подвергали последовательной обработке, состоящей из замораживания смесью этанола/сухого льда в течение 15 минут, оттаивания на водяной бане при 37°C в течение 15 минут и встряхивания в течение 1 минуты для сбора клеточного лизата, содержащего библиотеку вирусов AAV-неспецифических пептидов. К этому клеточному лизату добавляли 5 мкл 1M MgCl2 на 1 мл TBS и нуклеазу Бензоназа (зарегистрированный торговый знак) (производства Merck KGaA) в конечной концентрации 200 ед./мл с последующим проведением реакции при 37ºC в течение 30 минут. Затем реакцию прекращали добавлением 6,5 мкл 0,5 М EDTA на 1 мл TBS. Клеточный лизат центрифугировали при 10000 об/мин и при 4°C в течение 10 минут, а затем собирали супернатант в виде раствора вектора AAV.0.5 ml of 0.5 M EDTA was added to a T225 cm 2 incubation flask, followed by incubation for several minutes. AAV293 cells were then desquamated and collected into a 50 ml tube using a pipette and centrifuged at 300×g for 10 minutes. The supernatant was then removed. Cells were resuspended in 2 ml of TBS (Tris-buffered saline) per flask and then subjected to three sequential treatments consisting of ethanol/dry ice freezing for 15 minutes, thawing in a 37°C water bath for 15 minutes, and shaking for 1 minute to collect the cell lysate containing the AAV-nonspecific peptide library. To this cell lysate was added 5 μl of 1M MgCl 2 per 1 ml of TBS and Benzonase (registered trademark) nuclease (manufactured by Merck KGaA) at a final concentration of 200 units/ml, followed by reaction at 37ºC for 30 minutes. The reaction was then stopped by adding 6.5 μl of 0.5 M EDTA per 1 ml of TBS. The cell lysate was centrifuged at 10,000 rpm and 4°C for 10 minutes, and then the supernatant was collected as an AAV vector solution.
[0049] (4) Количественная оценка титра раствора вектора AAV с помощью ПЦР в реальном времени[0049] (4) Quantification of AAV vector solution titer by real-time PCR
В 2 мкл раствора вектора AAV добавляли 2 мкл 10 × буфера ДНКазы I, 15,2 мкл воды для инъекций (производства Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) и 0,8 мкл ДНКазы I (производства TAKARA BIO Inc.), и смесь инкубировали при 37°C в течение 1 часа для удаления свободных геномных ДНК и плазмидных ДНК. Для инактивации ДНКазы I, смесь нагревали при 99ºC в течение 10 минут. Затем добавляли 15 мкл воды для инъекций, 4 мкл буфера 10 × ProK [0,1 M трис-HCl (pH 7,8), 0,1 M EDTA, 5% ДСН] и 1 мкл протеиназы K (производства TAKARA BIO Inc.), и смесь инкубировали при 55ºC в течение 1 часа. Затем для инактивации протеиназы K, смесь нагревали при 95ºC в течение 10 минут. Этот образец подвергали количественной оценке титра AAV с использованием SYBR (зарегистрированный торговый знак) Premix ExTaq2 (производства TAKARA BIO Inc.) и праймеров (SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору. Образец 50-кратно разводили водой для инъекций, и 2 мкл разведенного раствора использовали для количественной оценки титра. В качестве стандарта использовали линейную ДНК, полученную путем гидролиза pAV1 рестриктирующим ферментом.To 2 μL of AAV vector solution, 2 μL of 10× DNase I buffer, 15.2 μL of water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) and 0.8 μL of DNase I (manufactured by TAKARA BIO Inc.) were added, and the mixture was incubated at 37°C for 1 hour to remove free genomic DNA and plasmid DNA. To inactivate DNase I, the mixture was heated at 99ºC for 10 minutes. Then 15 μl of water for injection, 4 μl of 10 × ProK buffer [0.1 M Tris-HCl (pH 7.8), 0.1 M EDTA, 5% SDS] and 1 μl of proteinase K (manufactured by TAKARA BIO Inc.) were added. ), and the mixture was incubated at 55ºC for 1 hour. The mixture was then heated at 95ºC for 10 minutes to inactivate proteinase K. This sample was subjected to AAV titer quantification using SYBR (registered trademark) Premix ExTaq2 (manufactured by TAKARA BIO Inc.) and primers (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) according to the instructions included with the kit. The sample was diluted 50-fold with water for injection, and 2 μl of the diluted solution was used to quantify the titer. Linear DNA obtained by hydrolysis of pAV1 with a restriction enzyme was used as a standard.
[0050] Пример 3: Очистка вирусной библиотеки неспецифических пептидов AAV[0050] Example 3: Purification of AAV Nonspecific Peptide Viral Library
(1) Очистка 1 путем центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия.(1) Purification 1 by cesium chloride density gradient centrifugation.
В пробирку 40PA для ультрацентрифугирования (производства HITACHI-KOKI Co., Ltd.) последовательно, в указанном порядке, начиная снизу слоями добавляли 4 мл раствора хлорида цезия, доведенного до плотности 1,5; 4 мл раствора хлорида цезия, доведенного до плотности 1,25; и 28 мл раствора вектора AAV, приготовленного как описано в Примере 2-(4). Пробирку центрифугировали при 25000 об/мин и при 16°C в течение 3 часов на ультрацентрифуге HIMAC (производства HITACHI-KOKI Co., Ltd.). После центрифугирования, 28 мл раствора удаляли из верхней части пробирки, а затем аликвоту 0,7 мл раствора собирали из верхней части в 1,5-мл пробирку. Таким же образом, как и в Примере 2-(4), определяли титр вектора AAV, содержащегося в каждом собранном растворе.In a 40PA ultracentrifugation tube (manufactured by HITACHI-KOKI Co., Ltd.), 4 ml of cesium chloride solution adjusted to a density of 1.5 was added sequentially, in the order indicated, starting from the bottom in layers; 4 ml of cesium chloride solution, adjusted to a density of 1.25; and 28 ml of AAV vector solution prepared as described in Example 2-(4). The tube was centrifuged at 25,000 rpm and 16°C for 3 hours in a HIMAC ultracentrifuge (manufactured by HITACHI-KOKI Co., Ltd.). After centrifugation, 28 ml of solution was removed from the top of the tube, and then an aliquot of 0.7 ml of solution was collected from the top into a 1.5 ml tube. In the same manner as in Example 2-(4), the titer of the AAV vector contained in each collected solution was determined.
[0051] (2) Очистка 2 путем центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия.[0051] (2) Purification 2 by cesium chloride density gradient centrifugation.
В нескольких фракциях, которые, как было показано в Примере 3-(1), имеют высокий титр, добавляли раствор хлорида цезия, доведенный до плотности 1,39, для достижения общего объема 10,5 мл. Полученный таким образом раствор помещали в пробирку 13РА для ультрацентрифугирования (изготовленную HITACHI-KOKI Co., Ltd.), а затем центрифугировали при 38000 об/мин и при 18°C в течение 16 часов. После центрифугирования, аликвоту 0,7 мл раствора отбирали из верхней части пробирки. Таким же образом, как и в Примере 2-(4), определяли титр вектора AAV, содержащегося в каждом собранном растворе.In several fractions that were shown to have a high titer in Example 3-(1), cesium chloride solution adjusted to a density of 1.39 was added to achieve a total volume of 10.5 ml. The solution thus obtained was placed into a 13PA ultracentrifugation tube (manufactured by HITACHI-KOKI Co., Ltd.), and then centrifuged at 38,000 rpm and 18°C for 16 hours. After centrifugation, an aliquot of 0.7 ml of solution was taken from the top of the tube. In the same manner as in Example 2-(4), the titer of the AAV vector contained in each collected solution was determined.
[0052] (3) Обессоливание путем диализа[0052] (3) Desalting by dialysis
Несколько фракций, которые, как было показано в Примере 3-(2), имели высокий титр, смешивали, а затем добавляли в кассету для диализа Slide-A-lyzer (производства Pierce). Очищенный раствор AAV дважды обессоливали путем диализа 1 л забуференного фосфатом физиологическиого раствора (PBS) при 4ºC в течение 3 часов и путем диализа 500 мл раствора PBS/5% сорбита при 4ºC в течение ночи. Затем раствор собирали, стерилизовали на 0,22 мкм-фильтре (производства Millipore) и хранили при -80°C непосредственно перед использованием. Отдельно, титр очищенных частиц AAV определяли количественно таким же образом, как и в Примере 2-(4).Several fractions that were shown to have a high titer in Example 3-(2) were mixed and then added to a Slide-A-lyzer dialysis cassette (manufactured by Pierce). The purified AAV solution was desalted twice by dialyzing 1 L of phosphate buffered saline (PBS) at 4ºC for 3 hours and by dialyzing 500 ml of PBS/5% sorbitol solution at 4ºC overnight. The solution was then collected, sterilized on a 0.22 μm filter (manufactured by Millipore) and stored at -80°C immediately before use. Separately, the titer of purified AAV particles was quantified in the same manner as in Example 2-(4).
[0053] Пример 4: Скрининг библиотеки неспецифических пептидов AAV2[0053] Example 4: Screening of AAV2 Non-Specific Peptide Library
(1) Введение в хвостовую вену мышей(1) Mice tail vein injection
Очищенные частицы AAV, полученные как описано в Примере 3-(3), вводили мышам BALB/c в хвостовую вену при 1,5 × 1014 вирусного генома (VG)/кг. Через 72 часа после введения, головной мозг собирали, и геномные ДНК экстрагировали с использованием ткани NucleoSpin (торговую марку) (производства MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) (Раунд 1).Purified AAV particles prepared as described in Example 3-(3) were injected into BALB/c mice via the tail vein at 1.5 x 10 14 viral genome (VG)/kg. 72 hours after administration, brains were collected and genomic DNAs were extracted using NucleoSpin (trade mark) tissue (manufactured by MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) (Round 1).
[0054] (2) Повторное клонирование неспецифической пептидной последовательности с помощью ПЦР.[0054] (2) Re-cloning of a non-specific peptide sequence using PCR.
ДНК, кодирующую неспецифическую пептидную последовательность, амплифицировали с использованием геномной ДНК, экстрагированной как описано в Примере 4-(1), в качестве матрицы, и ДНК-полимеразы GXL PrimeSTAR (зарегистрированный торговый знак) (производства TAKARA BIO Inc.). В качестве праймеров использовали прямой праймер 1 (SEQ ID NO: 11) и обратный праймер 1 (SEQ ID NO: 12). ПЦР осуществляли путем повторения 30 циклов, и каждый цикл ПЦР состоял из нагревания при 98°C в течение 10 секунд, при 55°C в течение 15 секунд и при 68°C в течение 40 секунд. Затем двадцать пятую часть реакционного раствора ПЦР, прямой праймер 2 (SEQ ID NO: 13) и обратный праймер 2 (SEQ ID NO: 14) использовади для приготовления реакционной смеси в том же количестве, как и ранее. Реакционную смесь подвергали ПЦР с 30 циклами, где каждый цикл состоял из нагревания при 98°C в течение 10 секунд, при 55°C в течение 15 секунд и при 68°C в течение 15 секунд. Из полученного таким образом реакционного раствора, ДНК очищали с использованием экстракта NucleoSpin II (производства MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) и расщепляли рестриктирующим ферментом BglI. После электрофореза, расщепленный продукт очищали с использованием экстракта NucleoSpin II и повторно клонировали в AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx, полученную как описано в Примере 1, с использованием набора для лигирования ДНК <Mighty Mix>.DNA encoding a nonspecific peptide sequence was amplified using genomic DNA extracted as described in Example 4-(1) as a template and GXL PrimeSTAR (registered trademark) DNA polymerase (manufactured by TAKARA BIO Inc.). Forward primer 1 (SEQ ID NO: 11) and reverse primer 1 (SEQ ID NO: 12) were used as primers. PCR was performed by repeating 30 cycles, and each PCR cycle consisted of heating at 98°C for 10 seconds, 55°C for 15 seconds, and 68°C for 40 seconds. Then, twenty-fifth of the PCR reaction solution, forward primer 2 (SEQ ID NO: 13) and reverse primer 2 (SEQ ID NO: 14) were used to prepare the reaction mixture in the same amount as before. The reaction mixture was subjected to PCR with 30 cycles, where each cycle consisted of heating at 98°C for 10 seconds, at 55°C for 15 seconds and at 68°C for 15 seconds. From the reaction solution thus obtained, the DNA was purified using NucleoSpin II extract (manufactured by MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) and digested with the restriction enzyme BglI. After electrophoresis, the digest was purified using NucleoSpin II extract and recloned into AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx prepared as described in Example 1 using the <Mighty Mix> DNA ligation kit.
[0055] (3) Получение и очистка вирусной библиотеки неспецифических пептидов AAV2.[0055] (3) Preparation and purification of a viral library of nonspecific AAV2 peptides.
Получение вирусной библиотеки неспецифических пептидов вируса AAV2 и очистку частиц AAV осуществляли с использованием плазмиды, полученной как описано в Примере 4-(2), такими же методами, которые были описаны в Примере 2 и в Примере 3.Preparation of a viral library of non-specific AAV2 virus peptides and purification of AAV particles was carried out using the plasmid obtained as described in Example 4-(2) by the same methods as described in Example 2 and Example 3.
[0056] (4) Скрининг[0056] (4) Screening
Таким же образом, как и в Примере 4-(1) был проведен скрининг (введение частиц AAV мышам и сбор головного мозга) и были экстрагированы геномные ДНК (раунд 2). Кроме того, с использованием экстрагированной геномной ДНК были повторно проведены клонирование, получение и очистка библиотеки, а также были экстрагированы геномные ДНК (раунд 3).In the same manner as in Example 4-(1), screening was carried out (injection of AAV particles into mice and collection of brains) and genomic DNAs were extracted (round 2). In addition, cloning, library preparation and purification were repeated using the extracted genomic DNA, and genomic DNA was extracted (Round 3).
[0057] (5) Секвенирование неспецифического пептида.[0057] (5) Sequencing a non-specific peptide.
На каждой стадии скрининга (от раунда 1 до раунда 3) проводили секвенирование плазмидной библиотеки неспецифических пептидов AAV. Пептидные последовательности, кодируемые клонами, которые аккумулировались в головном мозге во 2-м и 3-м раундах, и частота их появления представлены в Таблице 1 и в Таблице 2.At each stage of screening (from round 1 to round 3), a plasmid library of nonspecific AAV peptides was sequenced. The peptide sequences encoded by the clones that accumulated in the brain in rounds 2 and 3 and their frequency of occurrence are presented in Table 1 and Table 2.
[0058] [Таблица 1][0058] [Table 1]
[0059][0059]
[Таблица 2][Table 2]
[0060] [0060]
Как показано в Таблице 1 и Таблице 2, AAV имеет капсиды, содержащие специфические пептидные последовательности, накопленные в головном мозге. В частности, предполагается, что пептидные последовательности GSGVTWV (SEQ ID NO: 15), AHGYREP (SEQ ID NO: 16), EYGFREG (SEQ ID NO: 17) и ETGHGWV (SEQ ID NO: 18), которые наблюдались в третьем раунде, имеют тенденцию инфицировать головной мозг.As shown in Table 1 and Table 2, AAV has capsids containing specific peptide sequences accumulated in the brain. In particular, the peptide sequences GSGVTWV (SEQ ID NO: 15), AHGYREP (SEQ ID NO: 16), EYGFREG (SEQ ID NO: 17) and ETGHGWV (SEQ ID NO: 18), which were observed in the third round, are predicted to be tend to infect the brain.
[0061] Кроме того, предполагается, что пептидные последовательности от SEQ ID NO: 63 до SEQ ID NO: 110, которые представляют собой последовательности, содержащие последовательности, наблюдаемые во втором раунде, и спейсер, имеют тенденцию инфицировать головной мозг. В частности, GGSGVTWVA (SEQ ID NO: 63), GAHGYREPA (SEQ ID NO: 64), GEYGFREGA (SEQ ID NO: 65) и GETGHGWVA (SEQ ID NO: 66), которые представляют собой последовательности, содержащие последовательности, наблюдаемые в третьем раунде 3 и спейсер, обычно инфицируют головной мозг. [0061] In addition, it is believed that the peptide sequences SEQ ID NO: 63 to SEQ ID NO: 110, which are sequences containing the sequences observed in the second round and a spacer, tend to infect the brain. Specifically, GGSGVTWVA (SEQ ID NO: 63), GAHGYREPA (SEQ ID NO: 64), GEYGFREGA (SEQ ID NO: 65) and GETGHGWVA (SEQ ID NO: 66), which are sequences containing sequences observed in the third round 3 and spacer, usually infect the brain.
[0062] Пример 5: Оценка тропизма вектора AAV, имеющего приобретенную пептидную последовательность[0062] Example 5: Assessing the Tropism of an AAV Vector Having an Acquired Peptide Sequence
(1) Конструирование pRC-GDDGTRG, имеющего приобретенную пептидную последовательность.(1) Construction of pRC-GDDGTRG having an acquired peptide sequence.
Клоны AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx, имеющие пептидные последовательности (SEQ ID NO: 15-20) и полученные как описано в Примере 4-(5), расщепляли рестриктирующими ферментами SnaBI (производства TAKARA BIO Inc.) и HindIII (производства TAKARA BIO Inc.) с получением фрагмента. Этот фрагмент лигировали с фрагментом вектора, полученным путем расщепления вектора pAAVRC2 (производства CELL BIOLABS, Inc.) ферментами SnaBI и HindIII с помощью набора для лигирования ДНК <Mighty Mix> (производства TAKARA BIO Inc.), с получением хелперных плазмид pRC-GSGVTWV, pRC-AHGYREP, pRC-EYGFREG, pRC-ETGHGWV, pRC-GGGIGYV и pRC-ERGVGWV.Clones AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx having peptide sequences (SEQ ID NO: 15-20) and obtained as described in Example 4-(5) were digested with restriction enzymes SnaBI (manufactured by TAKARA BIO Inc.) and HindIII (manufactured by TAKARA BIO Inc.) to obtain a fragment. This fragment was ligated with a vector fragment obtained by digesting the pAAVRC2 vector (manufactured by CELL BIOLABS, Inc.) with SnaBI and HindIII enzymes using the <Mighty Mix> DNA ligation kit (manufactured by TAKARA BIO Inc.), to obtain the helper plasmids pRC-GSGVTWV, pRC-AHGYREP, pRC-EYGFREG, pRC-ETGHGWV, pRC-GGGYV and pRC-ERGVGWV.
[0063] (2) Получение и очистка мутанта капсида AAV2-LacZ[0063] (2) Preparation and purification of the AAV2-LacZ capsid mutant
С использованием PEIpro (производства Polyplus Transfection), Т-клетки 293, засеянные в колбу T225 см2, трансфецировали pAAV-LacZ (произведено TAKARA BIO Inc.), pHELP и хелперной плазмидой pRC (pRC-GSGVTWV, pRC-AHGYREP, pRC-EYGFREG, pRC-ETGHGWV, pRC-GGGIGYV или pRC-ERGVGWV), полученными как описано в Примере 5-(1). В качестве контроля осуществляли трансфекцию вектором pRC2, несущим капсид дикого типа, вместо хелперной плазмиды pRC, имеющей пептидную последовательность. Трансфецированные Т-клетки 293 культивировали при 37°C в течение 72 часов в CO2-инкубаторе. Супернатант, содержащий AAV, собирали из колбы T225 см2, а затем подвергали аффинной очистке с использованием сефарозы AVB (производства GE healthcare). Затем AAV концентрировали и очищали путем ультрафильтрации с получением очищенного раствора AAV. Затем титр векторов AAV количественно определяли методом, описанным в Примере 2-(4).Using PEIpro (manufactured by Polyplus Transfection), 293 T cells seeded in a T225 cm 2 flask were transfected with pAAV-LacZ (manufactured by TAKARA BIO Inc.), pHELP and pRC helper plasmid (pRC-GSGVTWV, pRC-AHGYREP, pRC-EYGFREG , pRC-ETGHGWV, pRC-GGGIGYV or pRC-ERGVGWV) obtained as described in Example 5-(1). As a control, transfection was carried out with the pRC2 vector carrying the wild-type capsid instead of the pRC helper plasmid having the peptide sequence. Transfected 293 T cells were cultured at 37°C for 72 hours in a CO 2 incubator. The supernatant containing AAV was collected from a T225 cm 2 flask and then affinity purified using AVB Sepharose (manufactured by GE healthcare). The AAV was then concentrated and purified by ultrafiltration to obtain a purified AAV solution. The titer of the AAV vectors was then quantified by the method described in Example 2-(4).
[0064] (3) Введение очищенного раствора AAV мышам[0064] (3) Administration of purified AAV solution to mice
Очищенный раствор AAV, полученный как описано в Примере 5-(2), фильтровали с использованием 0,22 мкм-фильтра, а и затем вводили мышам в хвостовую вену при 0,5 × 1011 VG/мышь.The purified AAV solution prepared as described in Example 5-(2) was filtered using a 0.22 μm filter, and then injected into the mice via the tail vein at 0.5 x 10 11 VG/mouse.
[0065] (4) Получение геномной ДНК из головного мозга и других тканей и количественное определение генома AAV[0065] (4) Obtaining genomic DNA from brain and other tissues and quantifying the AAV genome
Мышей, которым вводили AAV как описано в Примере 5-(3), подвергали эвтаназии через 4 недели после введения и собирали каждую ткань. Геномную ДНК экстрагировали из каждой ткани с использованием ткани NucleoSpin (производства MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG). Экстрагированную геномную ДНК в качестве образца подвергали ПЦР в реальном времени для определения количества генома вектора AAV, содержащегося в каждой ткани. На фигуре 2 указано количество молекул геномной ДНК AAV на 1 мкг общей геномной ДНК в каждой ткани.Mice administered AAV as described in Example 5-(3) were euthanized 4 weeks after administration and each tissue was collected. Genomic DNA was extracted from each tissue using NucleoSpin tissue (manufactured by MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG). Extracted sample genomic DNA was subjected to real-time PCR to determine the amount of AAV vector genome contained in each tissue. Figure 2 shows the number of AAV genomic DNA molecules per 1 μg of total genomic DNA in each tissue.
[0066] Как видно на фигуре 2, векторы AAV, содержащие капсиды с пептидными последовательностями GSGVTWV, AHGYREP, EYGFREG, ETGHGWV, GGGIGYV и ERGVGWV, имели тенденцию переноситься в головной мозг. Кроме того, некоторые из векторов AAV обладали тропизмом как в отношении легких, так и в отношении головного мозга.[0066] As seen in Figure 2, AAV vectors containing capsids with the peptide sequences GSGVTWV, AHGYREP, EYGFREG, ETGHGWV, GGGIGYV and ERGVGWV tended to transfer to the brain. In addition, some of the AAV vectors had tropism for both the lung and the brain.
[0067] Промышленное применение[0067] Industrial Application
В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к мутантам капсидного белка AAV, обладающим тропизмом по отношению к головному мозгу при системном введении, и к их аминокислотным последовательностям, и, таким образом, к способу эффективного введения гена в головной мозг.Accordingly, the present invention relates to AAV capsid protein mutants having tropism for the brain when administered systemically and their amino acid sequences, and thus to a method for effectively introducing the gene into the brain.
Список последовательностей в свободном форматеList of sequences in free format
[0068][0068]
SEQ ID NO: 1: Кодирующая последовательность капсида AAV2 586-591SEQ ID NO: 1: AAV2 capsid coding sequence 586-591
SEQ ID NO: 2: Конвертированная кодирующая последовательность капсида AAV2SEQ ID NO: 2: Converted AAV2 capsid coding sequence
SEQ ID NO: 3: Ген резистентности к ампициллину перед конверсиейSEQ ID NO: 3: Ampicillin resistance gene before conversion
SEQ ID NO: 4: ген резистентности к ампициллину после конверсииSEQ ID NO: 4: ampicillin resistance gene after conversion
SEQ ID NO: 5: Ген rep AAV2 до конверсииSEQ ID NO: 5: AAV2 rep gene before conversion
SEQ ID NO: 6: Ген rep AAV2 после конверсииSEQ ID NO: 6: Rep AAV2 gene after conversion
SEQ ID NO: 7: Последовательность ДНК, кодирующая неспецифический пептидSEQ ID NO: 7: DNA sequence encoding a non-specific peptide
SEQ ID NO: 8: Праймер для синтеза двухцепочечной ДНКSEQ ID NO: 8: Primer for double-stranded DNA synthesis
SEQ ID NO: 9: Прямой праймер для количественного определения титра AAVSEQ ID NO: 9: Forward primer for quantitative determination of AAV titer
SEQ ID NO: 10: Обратный праймер для количественного определения титра AAVSEQ ID NO: 10: Reverse primer for AAV titer quantitation
SEQ ID NO: 11: Прямой праймер 1 для амплификации области, кодирующей неспецифический пептидSEQ ID NO: 11: Forward primer 1 to amplify the nonspecific peptide coding region
SEQ ID NO: 12: Обратный праймер 1 для амплификации области, кодирующей неспецифический пептидSEQ ID NO: 12: Reverse primer 1 to amplify the nonspecific peptide coding region
SEQ ID NO: 13: Прямой праймер 2 для амплификации области, кодирующей неспецифический пептидSEQ ID NO: 13: Forward primer 2 to amplify the nonspecific peptide coding region
SEQ ID NO: 14: Обратный праймер 2 для амплификации области, кодирующей неспецифический пептидSEQ ID NO: 14: Reverse primer 2 to amplify the nonspecific peptide coding region
SEQ ID NO: 15: Пептидная последовательность GSGVTWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 15: GSGVTWV peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 16: Пептидная последовательность AHGYREP для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 16: Peptide sequence AHGYREP for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 17: Пептидная последовательность EYGFREG для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 17: Peptide sequence EYGFREG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 18: Пептидная последовательность ETGHGWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 18: Peptide sequence ETGHGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 19: Пептидная последовательность GGGIGYV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 19: Peptide sequence GGGIGYV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 20: Пептидная последовательность ERGVGWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 20: Peptide sequence ERGVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 21: Пептидная последовательность ENGVGWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 21: Peptide sequence ENGVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 22: Пептидная последовательность GSGVGWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 22: Peptide sequence GSGVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 23: Пептидная последовательность ADGITWG для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 23: Peptide sequence ADGITWG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 24: Пептидная последовательность ADGTRWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 24: Peptide sequence ADGTRWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 25: Пептидная последовательность ADKVGWV для мутанта капсидногобелка AAVSEQ ID NO: 25: Peptide sequence ADKVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 26: Пептидная последовательность AGGVGWT для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 26: Peptide sequence AGGVGWT for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 27: Пептидная последовательность AGGVTGV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 27: AGGVTGV peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 28: Пептидная последовательность AGNAGGM для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 28: Peptide sequence AGNAGGM for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 29: Пептидная последовательность AGQLGWV для мутанта капсидного протеина AAVSEQ ID NO: 29: Peptide sequence AGQLGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 30: Пептидная последовательность ARGTEWE для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 30: ARGTEWE peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 31: Пептидная последовательность DAGHGFV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 31: DAGHGFV peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 32: Пептидная последовательность EANVGWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 32: Peptide sequence EANVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 33: Пептидная последовательность ECGLGEG для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 33: Peptide sequence ECGLGEG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 34: Пептидная последовательность EGEVTWL для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 34: Peptide sequence EGEVTWL for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 35: Пептидная последовательность EGGDGRV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 35: EGGDGRV peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 36: Пептидная последовательность EGGFGEA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 36: Peptide sequence EGGFGEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 37: Пептидная последовательность EGGG для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 37: Peptide sequence EGGG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 38: Пептидная последовательность EGGMVWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 38: Peptide sequence EGGMVWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 39: Пептидная последовательность EGGVGWT для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 39: Peptide sequence EGGVGWT for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 40: Пептидная последовательность EGGVMWL для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 40: Peptide sequence EGGVMWL for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 41: Пептидная последовательность EGQVTWL для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 41: Peptide sequence EGQVTWL for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 42: Пептидная последовательность ERGHGWG для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 42: Peptide sequence ERGHGWG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 43: Пептидная последовательность ESGVGWK для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 43: Peptide sequence ESGVGWK for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 44: Пептидная оследовательность GDGFGGV для мутантного белка цапсид AAVSEQ ID NO: 44: Peptide sequence GDGFGGV for AAV capsid mutant protein
SEQ ID NO: 45: Пептидная последовательность GDGVTWA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 45: Peptide sequence GDGVTWA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 46: Пептидная последовательность GEGRGWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 46: Peptide sequence GEGRGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 47: Пептидная последовательность GGGDGWI для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 47: Peptide sequence GGGDGWI for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 48: Пептидная последовательность GGGDSWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 48: Peptide sequence GGGDSWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 49: Пептидная последовательность GGGIAWVAQAAL для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 49: Peptide sequence GGGIAWVAQAAL for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 50: Пептидная последовательность GGGVGWA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 50: Peptide sequence GGGVGWA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 51: Пептидная последовательность GKGQVME для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 51: Peptide sequence GKGQVME for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 52: Пептидная последовательность GNGTGGG для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 52: Peptide sequence GNGTGGG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 53: Пептидная последовательность GQGGHME для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 53: Peptide sequence GQGGHME for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 54: Пептидная последовательность GRGVTWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 54: Peptide sequence GRGVTWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 55: Пептидная последовательность GSGMGWV для мутантного белка капсида AAVSEQ ID NO: 55: Peptide sequence GSGMGWV for mutant AAV capsid protein
SEQ ID NO: 56: Пептидная последовательность GVGGGVV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 56: Peptide sequence GVGGGVV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 57: Пептидная последовательность NDVRGRV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 57: NDVRGRV peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 58: Пептидная последовательность RDGLGFV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 58: RDGLGFV peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 59: Пептидная последовательность TDGLGWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 59: Peptide sequence TDGLGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 60: Пептидная последовательность TEGHGWV для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 60: Peptide sequence TEGHGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 61: Пептидная последовательность VAERLYG для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 61: VAERLYG peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 62: Пептидная последовательность VARGAGE для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 62: VARGAGE peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 63: Пептидная последовательность GGSGVTWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 63: Peptide sequence GGSGVTWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 64: Пептидная последовательность GAHGYREPA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 64: Peptide sequence GAHGYREPA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 65: Пептидная последовательность GEYGFREGA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 65: GEYGFREGA peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 66: Пептидная последовательность GETGHGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 66: Peptide sequence GETGHGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 67: Пептидная последовательность GGGGIGYVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 67: Peptide sequence GGGGIGYVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 68: Пептидная последовательность GERGVGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 68: Peptide sequence GERGVGWVA for the AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 69: Пептидная последовательность GENGVGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 69: Peptide sequence GENGVGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 70: Пептидная последовательность GGSGVGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 70: Peptide sequence GGSGVGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 71: Пептидная последовательность GADGITWGA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 71: Peptide sequence GADGITWGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 72: Пептидная последовательность GADGTRWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 72: Peptide sequence GADGTRWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 73: Пептидная последовательность GADKVGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 73: Peptide sequence GADKVGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 74: Пептидная последовательность GAGGVGWTA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 74: Peptide sequence GAGGVGWTA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 75: Пептидная последовательность GAGGVTGVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 75: Peptide sequence GAGGVTGVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 76: Пептидная последовательность GAGNAGGMA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 76: GAGNAGGMA peptide sequence for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 77: Пептидная последовательность GAGQLGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 77: Peptide sequence GAGQLGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 78: Пептидная последовательность GARGTEWEA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 78: Peptide sequence GARGTEWEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 79: Пептидная последовательность GDAGHGFVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 79: Peptide sequence GDAGHGFVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 80: Пептидная последовательность GEANVGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 80: Peptide sequence GEANVGWVA for the AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 81: Пептидная последовательность GECGLGEGA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 81: Peptide sequence GECGLGEGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 82: Пептидная последовательность GEGEVTWLA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 82: Peptide sequence GEGEVTWLA for the AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 83: Пептидная последовательность GEGGDGRVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 83: Peptide sequence GEGGDGRVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 84: Пептидная последовательность GEGGFGEAA для мутантного AV капсидного белкаSEQ ID NO: 84: Peptide sequence GEGGFGEAA for mutant AV capsid protein
SEQ ID NO: 85: Пептидная последовательность GEGGGA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 85: Peptide sequence GEGGGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 86: Пептидная последовательность GEGGMVWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 86: Peptide sequence GEGGMVWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 87: Пептидная последовательность GEGGVGWTA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 87: Peptide sequence GEGGVGWTA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 88: Пептидная последовательность GEGGVMWLA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 88: Peptide sequence GEGGVMWLA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 89: Пептидная последовательность GEGQVTWLA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 89: Peptide sequence GEGQVTWLA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 90: Пептидная последовательность GERGHGWGA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 90: Peptide sequence GERGHGWGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 91: Пептидная последовательность GESGVGWKA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 91: Peptide sequence GESGVGWKA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 92: Пептидная последовательность GGDGFGGVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 92: Peptide sequence GGDGFGGVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 93: Пептидная последовательность GGDGVTWAA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 93: Peptide sequence GGDGVTTWAA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 94: Пептидная последовательность GGEGRGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 94: Peptide sequence GGEGRGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 95: Пептидная последовательность GGGGDGWIA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 95: Peptide sequence GGGGDGWIA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 96: Пептидная последовательность GGGGDSWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 96: Peptide sequence GGGGDSWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 97: Пептидная последовательность GGGGIAWVAQAALA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 97: Peptide sequence GGGGIAWVAQAALA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 98: Пептидная последовательность GGGGVGWAA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 98: Peptide sequence GGGGVGWAA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 99: Пептидная последовательность GGKGQVMEA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 99: Peptide sequence GGKGQVMEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 100: Пептидная последовательность GGNGTGGGA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 100: Peptide sequence GGNGTGGGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 101: Пептидная последовательность GGQGGHMEA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 101: Peptide sequence GGQGGHMEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 102: Пептидная последовательность GGRGVTWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 102: Peptide sequence GGRGVTWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 103: Пептидная последовательность GGSGMGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 103: Peptide sequence GGSGMGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 104: Пептидная последовательность GGVGGGVVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 104: Peptide sequence GGVGGGVVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 105: Пептидная последовательность GNDVRGRVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 105: Peptide sequence GNDVRGRVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 106: Пептидная последовательность GRDGLGFVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 106: Peptide sequence GRDGLGFVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 107: Пептидная последовательность GTDGLGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 107: Peptide sequence GTDGLGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 108: Пептидная последовательность GTEGHGWVA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 108: Peptide sequence GTEGHGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 109: Пептидная последовательность GVAERLYGA для мутантного белка CAPSID AAVSEQ ID NO: 109: GVAERLYGA peptide sequence for AAV CAPSID mutant protein
SEQ ID NO: 110: Пептидная последовательность GVARGAGEA для мутанта капсидного белка AAVSEQ ID NO: 110: GVARGAGEA peptide sequence for the AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO: 111: Пептидная последовательность, представленная формулой ISEQ ID NO: 111: Peptide sequence represented by Formula I
SEQ ID NO: 112: Пептидная последовательность, представленная формулой IISEQ ID NO: 112: Peptide sequence represented by Formula II
SEQ ID NO: 113: Пептидная последовательность, представленная формулой IIISEQ ID NO: 113: Peptide sequence represented by Formula III
SEQ ID NO: 114: Пептидная последовательность, представленная формулой IVSEQ ID NO: 114: Peptide sequence represented by Formula IV
SEQ ID NO: 115: Пептидная последовательность, представленная формулой VSEQ ID NO: 115: Peptide sequence represented by Formula V
SEQ ID NO: 116: Пептидная последовательность, представленная формулой VI.SEQ ID NO: 116: Peptide sequence represented by Formula VI.
Claims (12)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019-082417 | 2019-04-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021133906A RU2021133906A (en) | 2023-05-24 |
| RU2809389C2 true RU2809389C2 (en) | 2023-12-11 |
Family
ID=
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013014764A1 (en) * | 2011-07-27 | 2013-01-31 | 三菱電機株式会社 | Communication system, communication apparatus and communication method |
| WO2014103957A1 (en) * | 2012-12-25 | 2014-07-03 | タカラバイオ株式会社 | Aav variant |
| RU2611202C2 (en) * | 2011-04-22 | 2017-02-21 | Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния | Virions of adeno-associated virus with optional capsid and methods of their use |
| JP2017513486A (en) * | 2014-04-17 | 2017-06-01 | ウニヴェルズィテーツクリニクム ハンブルク−エッペンドルフＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｋｌｉｎｉｋｕｍ Ｈａｍｂｕｒｇ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ | Viral vectors for targeted gene transfer into the brain and spinal cord |
| RU2016104614A (en) * | 2013-07-12 | 2017-08-18 | Дзе Чилдрен'З Хоспитал Оф Филадельфия | AAV VECTOR AND ANALYSIS ON NEUTRALIZING ANTIBODIES AGAINST AAV (ADENO-ASSOCIATED VIRUS) |
| RU2016133623A (en) * | 2014-02-17 | 2018-03-22 | Кинг'З Колледж Лондон | VECTOR OF Adeno-ASSOCIATED VIRUS |
| WO2020114143A1 (en) * | 2018-12-04 | 2020-06-11 | 宁波舜宇光电信息有限公司 | Photosensitive assembly, photographic module, manufacturing method for photographic assembly, and electronic device |
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2611202C2 (en) * | 2011-04-22 | 2017-02-21 | Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния | Virions of adeno-associated virus with optional capsid and methods of their use |
| WO2013014764A1 (en) * | 2011-07-27 | 2013-01-31 | 三菱電機株式会社 | Communication system, communication apparatus and communication method |
| WO2014103957A1 (en) * | 2012-12-25 | 2014-07-03 | タカラバイオ株式会社 | Aav variant |
| RU2016104614A (en) * | 2013-07-12 | 2017-08-18 | Дзе Чилдрен'З Хоспитал Оф Филадельфия | AAV VECTOR AND ANALYSIS ON NEUTRALIZING ANTIBODIES AGAINST AAV (ADENO-ASSOCIATED VIRUS) |
| RU2016133623A (en) * | 2014-02-17 | 2018-03-22 | Кинг'З Колледж Лондон | VECTOR OF Adeno-ASSOCIATED VIRUS |
| JP2017513486A (en) * | 2014-04-17 | 2017-06-01 | ウニヴェルズィテーツクリニクム ハンブルク−エッペンドルフＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｋｌｉｎｉｋｕｍ Ｈａｍｂｕｒｇ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ | Viral vectors for targeted gene transfer into the brain and spinal cord |
| WO2020114143A1 (en) * | 2018-12-04 | 2020-06-11 | 宁波舜宇光电信息有限公司 | Photosensitive assembly, photographic module, manufacturing method for photographic assembly, and electronic device |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6363958B2 (en) | AAV variant | |
| US20230295659A1 (en) | TARGETING PEPTIDES FOR DIRECTING ADENO-ASSOCIATED VIRUSES (AAVs) | |
| US9957303B2 (en) | Selective recovery | |
| US8361457B2 (en) | Duplexed parvovirus vectors | |
| US20220162637A1 (en) | Aav mutant having brain-targeting property | |
| CA3023592A1 (en) | Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof | |
| CN114480440A (en) | AAV vectors targeting the central nervous system | |
| WO2018139634A1 (en) | Mutant of adeno-associated virus (aav) capsid protein | |
| KR20210008561A (en) | Synthetic liver-trophic adeno-associated virus capsid and use thereof | |
| KR20230034211A (en) | Modified adeno-associated virus 5 capsid and uses thereof | |
| JP2022505816A (en) | Miniaturized dystrophins and their use | |
| CN106701691B (en) | AAV capable of efficiently infecting immune cells, preparation method and application thereof | |
| EP4159863A1 (en) | Codon-optimized nucleic acid encoding smn1 protein | |
| RU2809389C2 (en) | Aav mutant with ability to target brain | |
| WO2019227168A1 (en) | Aav polynucleotides, polypeptides and virions | |
| CN117886897A (en) | Adeno-associated virus variant and application thereof | |
| OA21075A (en) | Codon-optimized nucleic acid that encodes SMN1 protein, and use thereof | |
| CN117886898A (en) | Adeno-associated virus variants and uses thereof | |
| EA046419B1 (en) | MINIATURIZED DYSTROPHINS AND THEIR APPLICATIONS | |
| US20160237141A1 (en) | Methods of treating alzheimer's disease with apo a-1 milano |