RU2809326C1

RU2809326C1 - Variant of glutamate-cysteine ligase and method for obtaining glutathione with its application

Info

Publication number: RU2809326C1
Application number: RU2022123863A
Authority: RU
Inventors: Ын Бин ЯН; Чоль Ун ХА; Ёнсу КИМ; Ён Ын ИМ
Original assignee: СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2023-12-11

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: variant of glutamate cysteine ligase having glutamate cysteine ligase activity, in which the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, replaced by another amino acid. The invention also relates to a method for producing glutathione, comprising cultivating in a culture medium a microorganism containing a variant of glutamate-cysteine ligase according to the invention; a polynucleotide encoding this variant, and a vector containing this polynucleotide.

EFFECT: obtaining glutathione with a high degree of efficiency.

12 cl, 4 tbl, 4 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD

[0001] Данное изобретение относится к новому варианту глутамат-цистеинлигазы и к способу получения глутатиона с его применением.[0001] This invention relates to a new variant of glutamate cysteine ligase and to a method for producing glutathione using it.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND ART

[0002] Глутатион (GSH), органическое серосодержащее соединение, обычно встречающееся в большинстве клеток, представляет собой трипептид, состоящий из трех аминокислот: глицина, глутамата и цистеина. [0002] Glutathione (GSH), an organic sulfur-containing compound commonly found in most cells, is a tripeptide consisting of three amino acids: glycine, glutamate and cysteine.

[0003] Глутатион присутствует в живом организме в восстановленной форме глутатиона (GSH) и в окисленной форме глутатиона (GSSG). Восстановленная форма глутатиона (GSH), присутствующая в относительно высокой пропорции в нормальных обстоятельствах, в основном распределена в клетках печени и кожи человеческого организма и играет важную роль, выполняя антиоксидантную функцию путем разложения и удаления активных форм кислорода, детоксикационную функцию путем удаления ксенобиотических соединений, таких как токсичные вещества, и осветляющую функцию путем ингибирования образования меланина.[0003] Glutathione is present in living organisms in the reduced form of glutathione (GSH) and in the oxidized form of glutathione (GSSG). The reduced form of glutathione (GSH), present in a relatively high proportion under normal circumstances, is mainly distributed in the liver and skin cells of the human body and plays an important role by performing an antioxidant function by decomposing and removing reactive oxygen species, detoxification function by removing xenobiotic compounds such as as toxic substances, and lightening function by inhibiting the formation of melanin.

[0004] Поскольку продуцирование глутатиона постепенно снижается по мере старения, а понижение продуцирования глутатиона, играющего важную роль в антиоксидантной и детоксикационной функции, способствует накоплению активных форм кислорода, что является основной причиной старения, необходимо поступление глутатиона извне (Sipes IG et at., «The role of glutathione in the toxicity of xenobiotic compounds: metabolic activation of 1,2-dibromoethane by glutathione», Adv Exp Med Biol. 1986; 197:457-67).[0004] Since the production of glutathione gradually decreases with aging, and the decrease in the production of glutathione, which plays an important role in antioxidant and detoxification functions, promotes the accumulation of reactive oxygen species, which is the main cause of aging, an external supply of glutathione is necessary (Sipes IG et at., " The role of glutathione in the toxicity of xenobiotic compounds: metabolic activation of 1,2-dibromoethane by glutathione", Adv Exp Med Biol. 1986; 197:457-67).

[0005] Глутатион, обладающий разнообразными функциями, как описано выше, привлек внимание как вещество в различных областях, таких как фармацевтика, функциональные оздоровительные продукты и косметика, а также применяется в изготовлении вкусовых добавок и пищевых и кормовых добавок. Известно, что глутатион оказывает большое влияние на обогащение вкуса исходного ингредиента и поддержание богатых вкусовых оттенков и может быть использован сам по себе или в комбинации с другими веществами, как усилитель вкусоароматических свойств kokumi. В целом, известно, что вещества kokumi обладают более богатыми вкусоароматическими свойствами, чем вещества umami, такие как известные нуклеиновые кислоты и глутамат натрия (MSG), и образуются при распаде белков в ходе созревания.[0005] Glutathione, having a variety of functions as described above, has attracted attention as a substance in various fields such as pharmaceuticals, functional health products and cosmetics, and is also used in the manufacture of flavors and food and feed additives. Glutathione is known to have a great effect on enhancing the flavor of the original ingredient and maintaining rich flavor notes and can be used alone or in combination with other substances as a flavor enhancer for kokumi. In general, kokumi substances are known to have richer flavor properties than umami substances, such as the known nucleic acids and monosodium glutamate (MSG), and are formed by the breakdown of proteins during ripening.

[0006] Несмотря на наличие растущей потребности в глутатионе для применения в различных областях, его рынок не активизирован из-за высоких затрат на промышленное производство глутатиона, поскольку процессы синтеза ферментов для него не коммерциализованы по причине высоких производственных затрат и выходы в способах культивирования микроорганизмов и выделения из них глутатиона являются низкими.[0006] Although there is a growing demand for glutathione for applications in various fields, its market has not been activated due to the high costs of industrial production of glutathione, since enzyme synthesis processes for it have not been commercialized due to high production costs and yields in microorganism cultivation methods and the release of glutathione from them is low.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧАTECHNICAL PROBLEM

[0007] В результате напряженных усилий в решении вышеописанных проблем авторы данного изобретения разработали новый вариант глутамат-цистеинлигазы и обнаружили существенное увеличение способности продуцировать глутатион у штаммов, в которые введена новая глутамат-цистеинлигаза, тем самым завершив данное изобретение.[0007] As a result of strenuous efforts in solving the above problems, the inventors of the present invention developed a new variant of glutamate cysteine ligase and found a significant increase in the ability to produce glutathione in strains into which the new glutamate cysteine ligase was introduced, thereby completing the present invention.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕTECHNICAL SOLUTION

[0008] В данном изобретении предложен вариант глутамат-цистеинлигазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 86 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту.[0008] The present invention provides a variant of glutamate cysteine ligase in which the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid.

[0009] В данном изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор, включающий его.[0009] The present invention provides a polynucleotide encoding this variant and a vector comprising it.

[0010] В данном изобретении предложен микроорганизм, продуцирующий глутатион благодаря включению по меньшей мере одного из: указанный варианта; полинуклеотид а, кодирующего указанный вариант, и вектора, включающего такой полинуклеотид.[0010] This invention provides a microorganism that produces glutathione due to the inclusion of at least one of: the specified option; a polynucleotide a encoding the specified variant, and a vector including such a polynucleotide.

[0011] В данном изобретении предложен способ получения глутатиона, включающий культивирование микроорганизма.[0011] This invention provides a method for producing glutathione, which includes culturing a microorganism.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫBENEFITIVE EFFECTS

[0012] Новый вариант глутамат-цистеинлигазы по данному изобретению существенно повышает продуцирование глутатиона и таким образом, может применяться в продуцировании глутатиона с высоким выходом. Поскольку дрожжи, продуцирующие глутатион с высокими выходами, высушенные продукты, экстракты, их культуры и лизаты, а также произведенный глутатион обладают антиоксидантным, детоксикационным и усиливающим иммунитет действием, они могут эффективно применяться в косметических композициях, пищевых композициях, кормовых композициях и фармацевтических композициях, и их получении.[0012] The new glutamate cysteine ligase variant of the present invention significantly increases the production of glutathione and thus can be used in the production of glutathione with high yield. Since high-yield glutathione-producing yeasts, dried products, extracts, their cultures and lysates, and the produced glutathione have antioxidant, detoxifying and immune-enhancing effects, they can be effectively used in cosmetic compositions, food compositions, feed compositions and pharmaceutical compositions, and receiving them.

Лучший вариант осуществления изобретенияBest Mode for Carrying Out the Invention

[0013] Далее данное изобретение будет описано более подробно. При этом, каждое описание и воплощение, раскрытое в данном документе, также может быть применено к другим описаниям и воплощениям. Иными словами, все комбинации различных элементов, раскрытых в данном документе, входят в объем данного изобретения. Более того, объем данного изобретения не ограничивается описаниями, приведенными ниже.[0013] The present invention will be described in more detail below. However, each description and embodiment disclosed herein may also be applied to other descriptions and embodiments. In other words, all combinations of the various elements disclosed herein are within the scope of this invention. Moreover, the scope of the present invention is not limited to the descriptions given below.

[0014] Специалисты в данной области поймут или смогут обнаружить, проведя не более чем рутинные эксперименты, множество эквивалентов конкретных воплощений данного изобретения. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объем прилагаемой формулы изобретения.[0014] Those skilled in the art will understand, or be able to discover, with no more than routine experimentation, many equivalents to specific embodiments of the present invention. Such equivalents are intended to be within the scope of the appended claims.

[0015] В одном аспекте данного изобретения предложен вариант глутамат-цистеинлигазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 86 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту.[0015] In one aspect of the present invention, a variant of glutamate cysteine ligase is provided in which the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid.

[0016] Данный вариант может представлять собой вариант глутамат-цистеинлигазы, включающий по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, где замена включает замену аминокислоты, соответствующей положению 86 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, на другую аминокислоту.[0016] This variant may be a glutamate cysteine ligase variant comprising at least one amino acid substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the substitution includes a substitution of the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, to another amino acid.

[0017] В частности, вариант может представлять собой вариант белка, в котором аминокислота в положении 86 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту.[0017] In particular, the variant may be a protein variant in which the amino acid at position 86 from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid.

[0018] «Глутамат-цистеинлигаза (GCL)» по данному изобретению представляет собой фермент, также упоминаемый как «глутамат-цистеин-связывающий фермент» или «гамма-глутамилцистеин-синтетаза (GCS)». Известно, что глутамат-цистеинлигаза катализирует следующую реакцию:[0018] "Glutamate cysteine ligase (GCL)" of the present invention is an enzyme also referred to as "glutamate cysteine binding enzyme" or "gamma-glutamylcysteine synthetase (GCS)". Glutamate cysteine ligase is known to catalyze the following reaction:

[0019] L-глутамат + L-цистеин + АТФ ↔ гамма-глутамилцистеин + АДФ+Ф_н [0019] L-glutamate + L-cysteine + ATP ↔ gamma-glutamylcysteine + ADP+P _n

[0020] Кроме того, известно, что реакция, катализируемая глутамат-цистеинлигазой, является первой стадией синтеза глутатиона.[0020] In addition, it is known that the reaction catalyzed by glutamate cysteine ligase is the first step in the synthesis of glutathione.

[0021] Глутамат-цистеинлигаза, как последовательность дрожжевого происхождения, может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, без ограничения им.[0021] Glutamate cysteine ligase, as a yeast-derived sequence, may be a protein comprising, but not limited to, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

[0022] В данном изобретении аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1, представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую геном gsh1, и может также обозначаться как «белок GSH1» или «глутамат-цистеинлигаза». Аминокислотная последовательность, составляющая глутамат-цистеинлигазу по данному изобретению, может быть получена из известной базы данных GenBank NCBI. Например, аминокислотная последовательность иметь происхождение из Saccharomyces cerevisiae, но не ограничена таким происхождением, и может включать любую последовательность, обладающую такой же активностью, как указанная выше аминокислотная последовательность, без ограничения.[0022] In the present invention, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence encoded by the gsh1 gene, and may also be referred to as “GSH1 protein” or “glutamate cysteine ligase”. The amino acid sequence constituting the glutamate cysteine ligase of the present invention can be obtained from the known NCBI GenBank database. For example, the amino acid sequence is of Saccharomyces cerevisiae origin, but is not limited to such origin, and may include any sequence having the same activity as the above amino acid sequence, without limitation.

[0023] Кроме того, хотя глутамат-цистеинлигаза определяется как белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в данном изобретении, она не исключает мутацию, которая может возникнуть естественным образом, или в результате добавления нонсенс-последовательности в 5-' или 3'-направлении относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или мутации естественного происхождения, или молчащей мутации, и для специалиста в данной области техники очевидно, что любые белки, обладающие активностью, идентичной или эквивалентной активности белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, принадлежат глутамат-цистеинлигазе по данному изобретению.[0023] In addition, although glutamate cysteine ligase is defined as a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in this invention, it does not exclude a mutation that may occur naturally, or as a result of the addition of a nonsense sequence in 5-' or 3' direction relative to the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, or a naturally occurring mutation, or a silent mutation, and it will be apparent to one skilled in the art that any proteins having an activity identical or equivalent to that of a protein comprising the amino acid sequence SEQ ID NO : 1, belong to the glutamate cysteine ligase of this invention.

[0024] Например, глутамат-цистеинлигаза по данному изобретению может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, гомологичную или идентичную ей по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Также очевидно, что любой белок, имеющий аминокислотную последовательность, включающую делецию, модификацию, замену или добавление одной или более аминокислот, входит в объем данного изобретения при условии, что аминокислотная последовательность сохраняет вышеупомянутую гомологию или идентичность, эффект, эквивалентный эффекту этого белка.[0024] For example, the glutamate cysteine ligase of the present invention may be a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96% homology or identity thereto. , 97%, 98% or 99%. It is also apparent that any protein having an amino acid sequence including the deletion, modification, substitution or addition of one or more amino acids is within the scope of this invention, provided that the amino acid sequence retains the above-mentioned homology or identity, an effect equivalent to that of the protein.

[0025] Иными словами, хотя в данном изобретении используются выражения «белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность с заданной SEQ ID NO:» и «белок или полипептид, включающий аминокислотную последовательность с заданной SEQ ID NO:», очевидно, что в данном изобретении может применяться любой белок, имеющий аминокислотную последовательность, включающую делецию, модификацию замену или добавление одной или более аминокислот, при условии, что белок обладает активностью, идентичной или эквивалентной полипептиду, состоящему из заданной аминокислотной последовательности. Например, очевидно, что «полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1» принадлежит «полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1» при условии, что первый обладает такой же или эквивалентной активностью, как второй.[0025] In other words, although the present invention uses the expressions “a protein or polypeptide having the amino acid sequence given by SEQ ID NO:” and “a protein or polypeptide comprising the amino acid sequence given by SEQ ID NO:”, it is obvious that in this invention any protein having an amino acid sequence including deletion, modification, substitution, or addition of one or more amino acids may be used, provided that the protein has an activity identical or equivalent to a polypeptide consisting of the specified amino acid sequence. For example, it is clear that “a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1” belongs to “a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1” provided that the former has the same or equivalent activity as the latter.

[0026] В данном описании термин «вариант» относится к белку, полученному в результате консервативной замены и/или модификации по меньшей мере одной аминокислоты, отличной от аминокислоты приведенной последовательности, при этом сохраняющему функции или свойства белков, и может быть вариантом глутамат-цистеинлигазы, в котором аминокислота, соответствующая 86 положению от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, замещена аминокислотным остатком, отличным от цистеина, в свете задач данного изобретения. Вариант отличается от указанной последовательности заменой, делецией или добавлением нескольких аминокислот. Такие варианты, как правило, можно идентифицировать посредством модификации одной из вышеупомянутых аминокислотных последовательностей белка и оценки свойств модифицированного белка. Таким образом, активность варианта может быть усилена по сравнению с нативным белком. Кроме того, некоторые варианты могут включать варианты, из которых удалена по меньшей мере одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен. Другие варианты могут включать варианты, в которых удалена часть с N- и/или С-конца зрелого белка. Термин «вариант» может также использоваться взаимозаменяемо с другими терминами, такими как модификация, модифицированный белок, модифицированный полипептид, мутант, мутеин и дивергент, а также могут использоваться любые термины, обозначающие вариацию, без ограничения. В свете задач данного изобретения вариант может обладать усиленной активностью по сравнению с белками дикого типа или немодифицированными белками, без ограничения этим.[0026] As used herein, the term “variant” refers to a protein resulting from conservative substitution and/or modification of at least one amino acid different from the amino acid of the given sequence, while retaining the functions or properties of proteins, and may be a variant of glutamate cysteine ligase wherein the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus in the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by an amino acid residue other than cysteine in light of the objectives of the present invention. The variant differs from the specified sequence by substitution, deletion or addition of several amino acids. Such variants can generally be identified by modifying one of the aforementioned amino acid sequences of the protein and assessing the properties of the modified protein. Thus, the activity of the variant may be enhanced compared to the native protein. In addition, some variants may include variants from which at least one portion, such as an N-terminal leader sequence or transmembrane domain, has been removed. Other variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein. The term “variant” may also be used interchangeably with other terms such as modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, and divergent, and any terms denoting variation, without limitation, may be used. In light of the objectives of the present invention, the variant may have enhanced activity compared to wild-type or unmodified proteins, without limitation.

[0027] В данном описании термин «консервативная замена» относится к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую схожую структуру и/или химические свойства. Вариант может иметь по меньшей мере одну консервативную замену, при этом сохраняя по меньшей мере одну биологическую активность. Такие аминокислотные замены, как правило, могут происходить на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатка.[0027] As used herein, the term “conservative substitution” refers to the replacement of one amino acid with another amino acid having similar structure and/or chemical properties. The variant may have at least one conservative substitution while retaining at least one biological activity. Such amino acid substitutions generally can occur based on similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residue.

[0028] Варианты могут также включать делецию или добавление аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, полипептид может быть конъюгирован с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце белка, которая контролирует перенос белка одновременно с трансляцией или после ее завершения. Полипептид может также быть конъюгирован с другой последовательностью или линкером для обнаружения, очистки или синтеза полипептида.[0028] Variants may also include the deletion or addition of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide. For example, the polypeptide may be conjugated to a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein that controls protein transfer simultaneously with or after translation. The polypeptide may also be conjugated to another sequence or linker for detection, purification or synthesis of the polypeptide.

[0029] В данном изобретении «замена на другую аминокислоту» не ограничена конкретными заменами, при условии, что замещающая аминокислота отличается от замещаемой аминокислоты. Это означает, что замена цистеина, представляющего собой 86-ю аминокислоту от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, на другую аминокислоту может также выражаться как «замена 86-й аминокислоты на аминокислоту, отличную от цистеина». При этом, в данном изобретении очевидно, что выражение «замена на заданную аминокислоту» означает, что замещающая аминокислота отличается от замещаемой аминокислоты, за исключением случаев, когда указано выражение «замещена другой аминокислотой».[0029] In the present invention, “replacement with another amino acid” is not limited to specific substitutions, as long as the replacement amino acid is different from the amino acid being replaced. This means that replacing cysteine, which is the 86th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, with another amino acid may also be expressed as “replacing the 86th amino acid with an amino acid other than cysteine.” However, in the present invention, it is obvious that the expression “replacement with a given amino acid” means that the replacement amino acid is different from the amino acid being replaced, unless the expression “replaced with another amino acid” is indicated.

[0030] «Вариант глутамат-цистеинлигазы» по данному изобретению может также упоминаться как «(вариант) полипептида, обладающего активностью глутамат-цистеинлигазы» или «вариант GSH1», который может увеличивать продуцирование глутатиона по сравнению с белком до модификации, полипептидом дикого типа или немодифицированным полипептидом, без ограничения этим.[0030] A “glutamate cysteine ligase variant” of the present invention may also be referred to as a “(variant) polypeptide having glutamate cysteine ligase activity” or “GSH1 variant” which can increase glutathione production compared to the protein before the modification, the wild-type polypeptide, or unmodified polypeptide, without limitation.

[0031] В таком варианте по меньшей мере одна аминокислота в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 может быть замещена на другую аминокислоту. В частности, вариант может включать замену аминокислоты, соответствующей положению 86 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 на аминокислоту, отличную от цистеина. Другая аминокислота может быть выбрана из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, пролина, серина, треонина, тирозина, аспарагина, глутамата, глутамина, аспартата, лизина, аргинина и гистидина.[0031] In such an embodiment, at least one amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be replaced by another amino acid. In particular, the variant may include replacing the amino acid corresponding to position 86 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with an amino acid other than cysteine. The other amino acid may be selected from glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, tyrosine, asparagine, glutamate, glutamine, aspartate, lysine, arginine and histidine.

[0032] В данном изобретении очевидно, что «вариант, в котором 86-я аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 замещена другой аминокислотой» включает вариант, в котором аминокислота, соответствующая 86-му положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту, несмотря на то, что аминокислота находится в положении, отличном от положения 86 вследствие делеции/добавления/в ставки или тому подобного аминокислоты на N- или С-конце или в середине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.[0032] In the present invention, it is understood that "a variant in which the 86th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid" includes a variant in which the amino acid corresponding to the 86th position in the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, is substituted with another amino acid, despite the fact that the amino acid is at a position other than position 86 due to deletion/adding/stacking or the like of an amino acid at the N- or C-terminus or in the middle of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.

[0033] Также, хотя вариант, в котором 86-я аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 замещена другой аминокислотой, в данном описании раскрыт в качестве примера варианта глутамат-цистеинлигазы, вариант глутамат-цистеинлигазы по данному изобретению не ограничен вариантом аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и очевидно, что вариант, в котором «аминокислота, соответствующая 86-му положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1» замещена другой аминокислотой в любой аминокислотной последовательности, обладающей активностью глутамат-цистеинлигазы, также входит в объем варианта глутамат-цистеинлигазы по данному изобретению.[0033] Also, although a variant in which the 86th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid is disclosed herein as an example of a glutamate cysteine ligase variant, the glutamate cysteine ligase variant of the present invention is not limited variant of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and it is clear that a variant in which "the amino acid corresponding to the 86th position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1" is replaced by another amino acid in any amino acid sequence having glutamate cysteine ligase activity is also included within the scope of the glutamate cysteine ligase variant of the present invention.

[0034] В любой аминокислотной последовательности «аминокислота, соответствующая положению 86 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1» может быть идентифицирована при помощи различных способов выравнивания последовательностей, хорошо известных в данной области техники.[0034] In any amino acid sequence, the “amino acid corresponding to position 86 in amino acid sequence SEQ ID NO: 1” can be identified using various sequence alignment methods well known in the art.

[0035] Вариант глутамат-цистеинлигазы по данному изобретению, в котором аминокислота, соответствующая положению 86 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту, может быть белком, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, гомологичную или идентичную ей по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, где аминокислота, соответствующая 86-му положению в SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту.[0035] A variant of the glutamate cysteine ligase of the present invention in which the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid, may be a protein comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence , homologous or identical to it by at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, wherein the amino acid corresponding to the 86th position in SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid.

[0036] Вариант глутамат-цистеинлигазы, в котором 86-я аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена на аминокислоту, отличную от цистеина по данному изобретению, может включать одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 - 21. В частности, вариант может по существу состоять из одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 - 21, и более конкретно, он может состоять из одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 - 21, без ограничения ими.[0036] A glutamate cysteine ligase variant in which the 86th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by an amino acid other than cysteine of the present invention may include one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 - 21. In particular, a variant may consist essentially of one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 21, and more specifically, it may consist of, without limitation, one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 21.

[0037] Также, вариант может включать одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 - 21 или аминокислотную последовательность, включающую фиксированную 86-ю аминокислоту (то есть в аминокислотной последовательности варианта аминокислота, соответствующая 86-му положению SEQ ID NO: 3 - 21 идентична аминокислоте в 86-м положении SEQ ID NO: 3 - 21) и гомологична или идентична им по меньшей мере на 80%, без ограничения этим.[0037] Also, the variant may include one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 - 21 or an amino acid sequence comprising a fixed 86th amino acid (that is, in the amino acid sequence of the variant, the amino acid corresponding to the 86th position of SEQ ID NO: 3 - 21 identical to the amino acid at position 86 of SEQ ID NO: 3 to 21) and is at least 80% homologous or identical thereto, without limitation.

[0038] В частности, вариант по данному изобретению может включать полипептид, имеющий одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 - 21, и полипептид, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичный или идентичный одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 - 21. Также очевидно, что любой белок, имеющий аминокислотную последовательность, включающую делецию, модификацию, замену или добавление одной или более аминокислот в положении, отличном от положения 86, входит в объем данного изобретения при условии, что белок сохраняет вышеупомянутую гомологию или идентичность, а также эффект, эквивалентный эффекту варианта.[0038] In particular, a variant of the present invention may include a polypeptide having one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 to 21, and a polypeptide that is at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 % or 99% homologous or identical to one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 to 21. It is also understood that any protein having an amino acid sequence including the deletion, modification, substitution or addition of one or more amino acids at a position other than position 86, is within the scope of this invention provided that the protein retains the above-mentioned homology or identity as well as an effect equivalent to that of the variant.

[0039] В данном описании термин «гомология» или «идентичность» относится к степени соответствия двух заданных аминокислотных последовательностей или последовательностей оснований и может выражаться в процентах. Термины «гомология» и «идентичность» часто могут использоваться взаимозаменяемо.[0039] As used herein, the term “homology” or “identity” refers to the degree of agreement between two given amino acid or base sequences and may be expressed as a percentage. The terms homology and identity can often be used interchangeably.

[0040] Гомология или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотидов или полипептидов может быть установлена при помощи стандартного алгоритма выравнивания, при этом можно использовать значения штрафов за открытие гэпа, установленные в программе по умолчанию. По существу, гомологичные или идентичные последовательности могут гибридизоваться друг с другом в условиях умеренной или высокой жесткости на протяжение по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от всей последовательности или по всей длине последовательности. В гибридизованных полинуклеотидах также можно учитывать полинуклеотиды, включающие вместо кодона вырожденный кодон.[0040] Homology or sequence identity of conserved polynucleotides or polypeptides can be established using a standard alignment algorithm, and the program's default gap opening penalty values can be used. Substantially homologous or identical sequences may hybridize to each other under conditions of moderate or high stringency over at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire sequence or the entire length of the sequence. In hybridized polynucleotides, it is also possible to consider polynucleotides that include a degenerate codon instead of a codon.

[0041] Гомологию, сходство или идентичность между двумя заданными полипептидами или полинуклеотидами можно устанавливать с использованием любого известного компьютерного алгоритма, такого как программа FASTA с использованием параметров по умолчанию, как предложено, например, в Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. В альтернативном варианте для этого можно использовать алгоритм Нидлмана-Вунша (1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), выполняемый в программе Needleman пакета программ EMBOSS (The European Molecular Biology Open Software Suite) (Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая пакет программ GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al, JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно определять с использованием BLAST, базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации (the National Center for Biotechnology Information), или ClustalW.[0041] Homology, similarity or identity between two given polypeptides or polynucleotides can be established using any known computer algorithm, such as the FASTA program using default parameters, as proposed, for example, in Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. Alternatively, this can be done using the Needleman-Wunsch algorithm (1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), executed in the Needleman program of the EMBOSS (The European Molecular Biology Open Software Suite) program (Rice et al., 2000 , Trends Genet. 16:276-277) (version 5.0.0 or later) (including the GCG software package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA ( Atschul, S.F., et al., JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48 :1073) For example, homology, similarity or identity can be determined using BLAST, the National Center for Biotechnology Information database, or ClustalW.

[0042] Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять путем сравнения информации о последовательности с использованием компьютерной программы GAP, такой как программа, разработанная Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как описано в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В кратком изложении, программа GAP определяет сходство как количество выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, поделенное на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) бинарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичных и значение 0 для неидентичных символов) и взвешенную матрицу сравнения, предложенную в Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, описанную в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) (или подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)); (2) штраф 3,0 за каждый гэп и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом гэпе (или штраф за открытие гэпа 10 и штраф за продолжение гэпа 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевые гэпы.[0042] Homology, similarity or identity of polynucleotides or polypeptides can be determined by comparing sequence information using a GAP computer program, such as the program developed by Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, as described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Briefly, the GAP program defines similarity as the number of aligned characters (i.e., nucleotides or amino acids) that are the same, divided by the total number of characters in the shorter of the two sequences. Default parameters for the GAP program may include: (1) a binary comparison matrix (containing a value of 1 for identical and a value of 0 for non-identical characters) and a weighted comparison matrix as proposed in Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, described in Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) (or EDNAFULL substitution matrix (EMBOSS version NCBI NUC4.4)); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap (or a penalty for opening a gap of 10 and a penalty for extending a gap of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.

[0043] Кроме того, гомологию, сходство или идентичность последовательностей двух заданных полинуклеотидов или полипептидов можно устанавливать путем сравнения их последовательностей при помощи гибридизации по Саузерну в условиях определенной жесткости, и установленные жесткие условия гибридизации известны в уровне техники и могут быть установлены способом, хорошо известным специалисту в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et at., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).[0043] In addition, homology, similarity or sequence identity of two given polynucleotides or polypeptides can be established by comparing their sequences using Southern hybridization under certain stringency conditions, and the established stringency conditions of hybridization are known in the art and can be established in a manner well known one skilled in the art (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et at., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

[0044] В еще одном аспекте данного изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий такой вариант.[0044] In another aspect of the present invention, a polynucleotide encoding such a variant is provided.

[0045] В данном описании термин «полинуклеотид» относится к полимеру из нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры соединены друг с другом в длинную цепь ковалентными связями и обычно обозначает цепь ДНК или РНК, имеющую определенную минимальную длину, более конкретно, полинуклеотидный фрагмент, кодирующий указанный вариант.[0045] As used herein, the term "polynucleotide" refers to a polymer of nucleotides in which the nucleotide monomers are linked together in a long chain by covalent bonds and generally refers to a DNA or RNA chain having a certain minimum length, more specifically, a polynucleotide fragment encoding the specified option.

[0046] Полинуклеотид, кодирующий вариант белка по данному изобретению, может включать любую нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант глутамат-цистеинлигазы, обладающий усиленной активностью, без ограничения.[0046] The polynucleotide encoding a protein variant of the present invention may include any nucleotide sequence encoding a glutamate cysteine ligase variant having enhanced activity, without limitation.

[0047] Ген, кодирующий глутамат-цистеинлигазу по данному изобретению, может представлять собой ген gsh1. Ген может происходить из дрожжей. В частности, ген может происходить из микроорганизма, относящегося к роду Saccharomyces, более конкретно Saccharomyces cerevisiae. В частности, ген может представлять собой ген, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, более конкретно, последовательность, включающую последовательность оснований SEQ ID NO: 2, без ограничения ими.[0047] The gene encoding the glutamate cysteine ligase of the present invention may be the gsh1 gene. The gene may come from yeast. In particular, the gene may be derived from a microorganism belonging to the genus Saccharomyces, more particularly Saccharomyces cerevisiae. In particular, the gene may be a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, more particularly, a sequence including, but not limited to, the base sequence of SEQ ID NO: 2.

[0048] Полинуклеотид по данному изобретению может включать различные модификации, сделанные в кодирующей области, при условии, что они не изменяют аминокислотную последовательность полипептида, экспрессирующегося с кодирующей области вследствие вырожденности кодонов или с учетом предпочтения кодонов у живого организма, в котором экспрессируется полипептид. В частности, в изобретение может быть включена любая полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант белка, в котором аминокислота в положении, соответствующем 86-му положению в SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту, без ограничения. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению может иметь полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант белка по настоящему изобретению, в частности белок, включающий одну из аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 3-21, или полипептид, обладающий гомологией или идентичностью с ним, без ограничения. Гомология или идентичность являются такими, как описано выше.[0048] The polynucleotide of the present invention may include various modifications made to the coding region, provided that they do not change the amino acid sequence of the polypeptide expressed from the coding region due to codon degeneracy or codon preference of the living organism in which the polypeptide is expressed. In particular, any polynucleotide sequence encoding a protein variant in which the amino acid at the position corresponding to position 86 in SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid, without limitation, may be included in the invention. For example, a polynucleotide of the present invention may have a polynucleotide sequence encoding a variant of a protein of the present invention, particularly a protein comprising one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3-21, or a polypeptide having homology or identity thereto, without limitation. The homology or identity is as described above.

[0049] Кроме того, полинуклеотид может включать нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с зондом, сконструированным с использованием известной последовательности гена, например нуклеотидную последовательность, полностью или частично комплементарную нуклеотидной последовательности в условиях высокой жесткости, чтобы кодировать вариант белка, в котором аминокислота, соответствующая 86-му положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту, без ограничения.[0049] In addition, the polynucleotide may include a nucleotide sequence that hybridizes to a probe designed using a known gene sequence, such as a nucleotide sequence that is fully or partially complementary to the nucleotide sequence under high stringency conditions, to encode a protein variant in which the amino acid corresponding to 86 -th position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is replaced by another amino acid, without limitation.

[0050] Термин «жесткие условия» относится к условиям, позволяющим полинуклеотидам специфически гибридизоваться. Такие условия подробно раскрыты в известных документах (например J. Sambrook et at). Например, эти условия могут включать проведение гибридизации между генами, обладающими высокой гомологией, например 80% или более, в частности 90% или более, более конкретно 95% или более, еще более конкретно 97% или более, особенно 99% или более, при отсутствии гибридизации между генами, обладающими гомологией меньше указанных выше, или осуществление гибридизации однократно, в частности два или более раз, в условиях со стандартной отмывкой при гибридизации по Саузерну с концентрацией соли и температурой 60°С, 1X SSC (хлорида натрия/цитрата натрия) и 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности 60°С, 0,1Х SSC и 0,1% SDS, и более конкретно 68°С, 0,1X SSC и 0,1% SDS. Однако жесткие условия гибридизации не ограничиваются указанными и могут быть подходящим образом скорректированы специалистом в данной области техники в зависимости от намеченных целей.[0050] The term “stringent conditions” refers to conditions that allow polynucleotides to specifically hybridize. Such conditions are disclosed in detail in known documents (eg J. Sambrook et at). For example, these conditions may include hybridizing between genes having high homology, such as 80% or more, particularly 90% or more, more particularly 95% or more, even more particularly 97% or more, especially 99% or more, with absence of hybridization between genes having homology less than those indicated above, or performing hybridization once, in particular two or more times, under standard Southern hybridization wash conditions with salt concentration and temperature of 60°C, 1X SSC (sodium chloride/sodium citrate) and 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate), particularly 60°C, 0.1X SSC and 0.1% SDS, and more particularly 68°C, 0.1X SSC and 0.1% SDS. However, the stringent hybridization conditions are not limited to these and can be suitably adjusted by one skilled in the art depending on the intended purposes.

[0051] Для гибридизации необходимо, чтобы два полинуклеотид а имели комплементарные последовательности, хотя возможны несовпадения между основаниями, в зависимости от степени строгости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания взаимоотношения между нуклеотидными основаниями, способными гибридизоваться друг с другом. Например, в случае ДНК, аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, данное изобретение может охватывать не только по существу аналогичные нуклеиновокислотные последовательности, но и выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный полной последовательности.[0051] Hybridization requires that the two polynucleotides have complementary sequences, although mismatches between bases are possible, depending on the stringency of hybridization. The term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing with each other. For example, in the case of DNA, adenosine is complementary to thymine, and cytosine is complementary to guanine. Accordingly, the present invention may cover not only substantially similar nucleic acid sequences, but also an isolated nucleic acid fragment complementary to the complete sequence.

[0052] В частности, полинуклеотиды, обладающие гомологией или идентичностью, можно обнаруживать с использованием вышеописанных условий гибридизации, включая процесс гибридизации при значении T_m 55°С. Также, значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, без ограничения ими, и может быть соответствующим образом скорректировано специалистом в данной области техники в зависимости от задач.[0052] In particular, polynucleotides having homology or identity can be detected using the above-described hybridization conditions, including a hybridization process at a T _m value of 55°C. Also, the T _m value may be 60°C, 63°C, or 65°C, without limitation, and can be adjusted accordingly by one skilled in the art depending on the application.

[0053] Надлежащая степень строгости для гибридизации полинуклеотидов может зависеть от длин полинуклеотидов и степени комплементарности, и эти параметры хорошо известны в данной области техники.[0053] The appropriate degree of stringency for polynucleotide hybridization may depend on the lengths of the polynucleotides and the degree of complementarity, and these parameters are well known in the art.

[0054] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен вектор, включающий в себя полинуклеотид, кодирующий вариант белка.[0054] In yet another aspect of the present invention, a vector is provided that includes a polynucleotide encoding a protein variant.

[0055] В данном описании термин «вектор» относится к ДНК-конструкции, включающей в себя последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего целевой белок, функционально связанную с подходящей регуляторной последовательностью для экспрессии целевого белка в подходящей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность может включать промотор, обеспечивающий инициацию транскрипции, последовательность оператора для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы в составе мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После введения вектора в подходящую клетку-хозяина он может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина и может интегрироваться в сам геном.[0055] As used herein, the term “vector” refers to a DNA construct comprising a polynucleotide base sequence encoding a target protein operably linked to a suitable regulatory sequence for expression of the target protein in a suitable host cell. The regulatory sequence may include a promoter for initiating transcription, an operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable ribosome binding site within the mRNA, and a sequence regulating the termination of transcription and translation. Once the vector is introduced into a suitable host cell, it can replicate or function independently of the host genome and can be integrated into the genome itself.

[0056] Вектор, использованный в данном изобретении, не ограничен каким-либо конкретным вектором, и можно использовать любой известный в данной области техники вектор. В качестве вектора, экспрессируемого дрожжами, можно использовать как интегративную плазмиду дрожжей (YIp), так и внехромосомные плазмидные векторы. Внехромосомный плазмидный вектор может включать эписомные плазмиды дрожжей (YEp), репликативные плазмиды дрожжей (YRp) и центромерные плазмиды дрожжей (YCp). Также, в качестве вектора по данному изобретению можно использовать искусственные хромосомы дрожжей (YAC). В качестве конкретного примера, доступные векторы могут включать pESCHIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα С, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 В, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, вектор pYD1 для дрожжевого дисплея, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM, p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, микронную форму A дрожжей, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 и pYJ406, без ограничения ими.[0056] The vector used in this invention is not limited to any particular vector, and any vector known in the art can be used. Both the yeast integrative plasmid (YIp) and extrachromosomal plasmid vectors can be used as the yeast expression vector. The extrachromosomal plasmid vector may include yeast episomal plasmids (YEp), yeast replicative plasmids (YRp) and yeast centromeric plasmids (YCp). Also, yeast artificial chromosomes (YAC) can be used as a vector according to this invention. As a specific example, available vectors may include pESCHIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3. 5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 yeast display vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/ NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM, p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47 , pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, micron form A yeast, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 and pYJ406, without limitation.

[0057] Например, полинуклеотид, кодирующий целевой белок в хромосоме, может быть замещен мутантным полинуклеотидом с использованием вектора для встраивания в хромосому клеток. Встраивание полинуклеотид а в хромосому можно осуществлять любым известным в данной области техники методом, например посредством гомологичной рекомбинации, без ограничения ею. Для подтверждения встраивания в хромосому может быть дополнительно включен селективный маркер. Селективный маркер применяют для отбора клеток, трансформированных вектором, т.е. для подтверждения встраивания нужного полинуклеотида, и примеры селективного маркера могут включать маркеры, обеспечивающие селектируемый фенотип, такой как устойчивость к лекарственным средствам, потребность в питательных веществах, резистентность к цитотоксическим агентам или поверхностная экспрессия варианта полипептида. Только клетки, экспрессирующие селективный маркер, могут выживать или демонстрировать отличающиеся фенотипы в среде, обработанной селективным агентом, и таким образом можно осуществлять отбор трансформированных клеток.[0057] For example, a polynucleotide encoding a target protein on a chromosome can be replaced with a mutant polynucleotide using a vector for insertion into a cell chromosome. The insertion of polynucleotide a into the chromosome can be accomplished by any method known in the art, for example, through homologous recombination, without limitation. To confirm integration into the chromosome, a selectable marker can be additionally included. A selectable marker is used to select cells transformed by the vector, i.e. to confirm insertion of the desired polynucleotide, and examples of the selectable marker may include markers that provide a selectable phenotype, such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents, or surface expression of a polypeptide variant. Only cells expressing the selectable marker can survive or exhibit different phenotypes in the medium treated with the selection agent, and thus the transformed cells can be selected for.

[0058] В данном описании термин «трансформация» относится к процессу введения вектора, включающего в себя полинуклеотид, кодирующий вариант глутамат-цистеинлигазы, в клетку-хозяина, так чтобы белок, кодируемый полинуклеотидом, экспрессировался в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может быть либо в форме, встроенной он в хромосому клетки-хозяина, либо во внехромосомной форме, при условии, что белок экспрессируется в клетке-хозяине. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, которые кодируют вариант глутамат-цистеинлигазы. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в любой форме, при условии, что полинуклеотид введен в клетку-хозяина и в ней экспрессируется белок. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все существенные элементы, необходимые для саморепликации. Как правило, экспрессионная кассета может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме самореплицирующегося экспрессирующего вектора. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в его исходной форме и быть функционально связанным с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, без ограничения этим.[0058] As used herein, the term “transformation” refers to the process of introducing a vector including a polynucleotide encoding a variant of glutamate cysteine ligase into a host cell such that the protein encoded by the polynucleotide is expressed in the host cell. The transformed polynucleotide can be either in a form that is integrated into the chromosome of the host cell, or in an extrachromosomal form, provided that the protein is expressed in the host cell. In addition, the polynucleotide includes DNA and RNA that encode a variant of glutamate cysteine ligase. The polynucleotide may be introduced into a host cell in any form as long as the polynucleotide is introduced into the host cell and the protein is expressed therein. For example, the polynucleotide can be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct that includes all the essential elements necessary for self-replication. Typically, an expression cassette may include a promoter operably linked to a polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal. The expression cassette may be in the form of a self-replicating expression vector. In addition, the polynucleotide may be introduced into a host cell in its original form and be operably linked to a sequence required for expression in the host cell, without limitation.

[0059] В данном описании термин «функционально связан» означает функциональную связь между полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид по данному изобретению, и последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотидной последовательности. Способы трансформации по настоящему изобретению включают любые способы, позволяющие вводить вектор в клетку-хозяина и могут быть осуществлены подходящими стандартными методами, хорошо известными в данной области техники, выбранными в соответствии с клеткой-хозяином. Например, можно использовать электропорацию, преципитацию фосфатом кальция (CaPO₄), преципитацию хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекцию, метод с полиэтиленгликолем (PEG), метод с DEAE-декстраном, метод с катионными липосомами, метод с ацетатом лития-DMSO, однако данное изобретение не ограничивается ими.[0059] As used herein, the term “operably linked” means a functional relationship between a polynucleotide sequence encoding a polypeptide of the present invention and a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide sequence. The transformation methods of the present invention include any method that allows the vector to be introduced into a host cell and can be carried out by suitable standard methods well known in the art, selected according to the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate ( _CaPO4 ) precipitation, calcium chloride ( _CaCl2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, lithium acetate-DMSO method can be used, however the present invention is not limited to them.

[0060] В данном изобретении может быть предложен микроорганизм, продуцирующий глутатион благодаря включению по меньшей мере одного из: варианта; полинуклеотида, кодирующего вариант; и вектора, включающего полинуклеотид.[0060] The present invention may provide a glutathione-producing microorganism due to the inclusion of at least one of: an option; a polynucleotide encoding the variant; and a vector including a polynucleotide.

[0061] Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий вариант, или микроорганизм, в который введен вариант.[0061] The microorganism may be a microorganism expressing the variant or a microorganism into which the variant has been introduced.

[0062] В данном описании термин «микроорганизм, включающий вариант», «микроорганизм, в который введен вариант» или «микроорганизм, экспрессирующий вариант» может относиться к микроорганизму, полученному путем усиления способности продуцировать глутатион в микроорганизме, от природы обладающему слабой способностью продуцировать глутатион, или путем придания способности продуцировать глутатион родительскому штамму, не способному продуцировать глутатион. В частности, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий вариант глутамат-цистеинлигазы, включающий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и аминокислотная мутация может включать замену аминокислоты, соответствующей положению 86 от N-конца на другую аминокислоту. Кроме того, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий вариант глутамат-цистеинлигазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 86 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, замещена на другую аминокислоту, без ограничения этим.[0062] As used herein, the term “microorganism comprising the variant,” “microorganism into which the variant is introduced,” or “microorganism expressing the variant” may refer to a microorganism obtained by enhancing the ability to produce glutathione in a microorganism that naturally has a weak ability to produce glutathione , or by imparting the ability to produce glutathione to a parent strain that is not capable of producing glutathione. In particular, the microorganism may be a microorganism expressing a glutamate cysteine ligase variant comprising at least one amino acid mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the amino acid mutation may include replacing the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus with another amino acid. In addition, the microorganism may be a microorganism expressing a glutamate cysteine ligase variant in which the amino acid corresponding to position 86 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid, without limitation.

[0063] Глутамат-цистеинлигаза и ее варианты являются такими, как описано выше.[0063] Glutamate cysteine ligase and variants thereof are as described above.

[0064] В данном документе «экспрессируемый/экспрессирующийся» белок означает состояние, в котором целевой белок введен в микроорганизм или экспрессируется в микроорганизме. В случае, когда целевой белок присутствует в микроорганизме, активность белка усилена по сравнению с активностью эндогенного белка или белка до модификации. В свете задач данного изобретения «целевой белок» может представлять собой вышеупомянутый вариант глутамат-цистеинлигазы.[0064] As used herein, “expressed/expressed” protein means a state in which a target protein is introduced into a microorganism or is expressed in a microorganism. In the case where the target protein is present in the microorganism, the activity of the protein is enhanced compared to the activity of the endogenous protein or the protein before modification. In light of the objectives of the present invention, the "target protein" may be the above-mentioned variant of glutamate cysteine ligase.

[0065] В частности, термин «введение белка» относится к обеспечению активности конкретного белка в микроорганизме, который не обладает этим белком, или усиление активности белка по сравнению с собственной активностью белка или активностью до модификации. Например, введение белка может относиться к введению полинуклеотида, кодирующего конкретный белок, в хромосому или к введению фрагмента или вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, в микроорганизм, тем самым обеспечивая проявление активности белка. Кроме того, «усиление активности» может означать, что активность конкретного белка микроорганизма усиливается по сравнению с собственной активностью или активностью до модификации. Термин «собственная активность» относится к активности конкретного белка, которой обладал родительский штамм до трансформации, когда микроорганизм трансформирован вследствие естественной или искусственной генетической вариации.[0065] In particular, the term "introducing a protein" refers to providing the activity of a particular protein in a microorganism that does not possess that protein, or enhancing the activity of the protein compared to the protein's intrinsic activity or activity before modification. For example, protein introduction may refer to the introduction of a polynucleotide encoding a particular protein into a chromosome, or the introduction of a fragment or vector comprising a polynucleotide encoding a particular protein into a microorganism, thereby causing the protein to exhibit activity. In addition, “enhanced activity” may mean that the activity of a particular microorganism protein is enhanced relative to its own activity or activity before modification. The term "intrinsic activity" refers to the activity of a particular protein possessed by the parent strain prior to transformation when the microorganism is transformed due to natural or artificial genetic variation.

[0066] В частности, усиление активности по данному изобретению может осуществляться по меньшей мере одним из способов, включающим увеличение числа копий гена, кодирующего вариант белка, введение мутации в последовательность, регулирующую экспрессию гена, кодирующего вариант белка, замену последовательности, регулирующей экспрессию гена, кодирующего вариант белка, на последовательность, обладающую более сильной активностью, замену хромосомного гена, кодирующего белок дикого типа, геном, кодирующим вариант белка, дополнительное введение мутации в ген, кодирующий вариант белка, для усиления активности варианта белка и введение варианта белка в микроорганизм, без ограничения этим.[0066] In particular, enhancing the activity of this invention can be achieved by at least one of the methods, including increasing the copy number of the gene encoding the protein variant, introducing a mutation in the sequence that regulates the expression of the gene encoding the protein variant, replacing the sequence that regulates the expression of the gene, encoding the protein variant with a sequence having stronger activity, replacing the chromosomal gene encoding the wild-type protein with a gene encoding the protein variant, additionally introducing a mutation into the gene encoding the protein variant to enhance the activity of the protein variant, and introducing the protein variant into a microorganism without restrictions on this.

[0067] Увеличение числа копий гена осуществляют в форме функциональной связи с вектором или в форме встраивания в хромосому клетки-хозяина, без конкретного ограничения этим. В частности, данный способ можно осуществлять путем введения в клетку-хозяина вектора, который реплицируется и функционирует независимо от хозяина и функционально связан с полинуклеотидом, кодирующим белок по данному изобретению. В качестве альтернативы, число копий гена может быть увеличено путем введения в клетку-хозяина вектора, который встраивает полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина и который функционально связан с полинуклеотидом. Встраивание полинуклеотид а в хромосому можно осуществлять любым известным в данной области техники способом, например посредством гомологичной рекомбинации.[0067] Increasing the number of copies of a gene occurs in the form of functional association with a vector or in the form of insertion into the chromosome of a host cell, without being particularly limited to this. In particular, this method can be carried out by introducing into a host cell a vector that replicates and functions independently of the host and is operably linked to a polynucleotide encoding a protein of the present invention. Alternatively, the copy number of a gene can be increased by introducing into a host cell a vector that inserts the polynucleotide into the host cell chromosome and that is operably linked to the polynucleotide. The insertion of polynucleotide a into the chromosome can be accomplished by any method known in the art, for example through homologous recombination.

[0068] Кроме того, модификация последовательности, регулирующей экспрессию полинуклеотида, может осуществляться путем индукции вариации в нуклеиновокислотной последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной замены, консервативной замены или любой их комбинации для дальнейшего усиления активности последовательности, регулирующей экспрессию, или путем замены нуклеотидной последовательности нуклеотидной последовательностью, обладающей более сильной активностью, без ограничения этим. Выражение "последовательность, регулирующая экспрессию", может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность регуляции транскрипции и трансляции, без ограничения ими.[0068] In addition, modification of the expression control sequence of a polynucleotide can be accomplished by inducing a variation in the nucleic acid sequence by deletion, insertion, non-conservative substitution, conservative substitution, or any combination thereof to further enhance the activity of the expression control sequence, or by replacing the nucleotide sequence with a nucleotide sequence having stronger activity, without limitation. The expression "expression control sequence" may include, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a transcription and translation control sequence.

[0069] Более сильный промотор по сравнению с собственным промотором может быть присоединен в направлении против хода транскрипции от экспрессируемой полинуклеотидной единицы, без ограничения этим. Например, когда клетка-хозяин представляет собой дрожжи, доступный промотор может включать промотор TEF1, промотор TEF2, промотор GAL10, промотор GAL1, промотор ADH1, промотор ADH2, промотор РН05, промотор GAL1-10, промотор TDH3 (промотор GPD), промотор TDH2, промотор TDH1, промотор PGK1, промотор PYK2, промотор ENO1, промотор ENO2 и промотор ТРИ, без ограничения ими. Кроме того, описанная модификация полинуклеотидной последовательности на хромосоме может осуществляться путем индукции вариации в последовательности, регулирующей экспрессию, путем делеции, вставки, неконсервативной замены, консервативной замены или любой их комбинации для дальнейшего усиления активности полинуклеотидной последовательности или путем замены нуклеотидной последовательности нуклеотидной последовательностью, модифицированной так, чтобы обладать более сильной активностью, без ограничения этим.[0069] A promoter that is stronger than its own promoter may be attached upstream of the expressed polynucleotide unit, without limitation. For example, when the host cell is yeast, the available promoter may include TEF1 promoter, TEF2 promoter, GAL10 promoter, GAL1 promoter, ADH1 promoter, ADH2 promoter, PH05 promoter, GAL1-10 promoter, TDH3 promoter (GPD promoter), TDH2 promoter, TDH1 promoter, PGK1 promoter, PYK2 promoter, ENO1 promoter, ENO2 promoter and TRI promoter, without limitation. In addition, the described modification of a polynucleotide sequence on a chromosome can be accomplished by inducing a variation in an expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative substitution, conservative substitution, or any combination thereof to further enhance the activity of the polynucleotide sequence, or by replacing the nucleotide sequence with a nucleotide sequence so modified to have stronger activity, without being limited by this.

[0070] В целом, введение и усиление активности белка может увеличивать активность или концентрацию соответствующего белка на от 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% или 500%, до максимально 1000% или 2000%, относительно активности или концентрации штамма микроорганизма дикого типа или немодифицированного микроорганизма, без ограничения этим.[0070] In general, administering and enhancing the activity of a protein can increase the activity or concentration of the corresponding protein by 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, or 500%, up to a maximum of 1000% or 2000%, relative to the activity or concentration of a wild-type or unmodified microorganism strain, without limitation.

[0071] В данном описании термин «немодифицированный микроорганизм» не исключает штаммов, имеющих мутацию, которая может возникнуть в микроорганизмах естественным образом, и может представлять собой штамм дикого типа, микроорганизм, не включающий вариант белка, или микроорганизм, не трансформированный вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариант белка.[0071] As used herein, the term “unmodified microorganism” does not exclude strains having a mutation that may occur naturally in microorganisms, and may be a wild-type strain, a microorganism not including the protein variant, or a microorganism not transformed with a vector comprising a polynucleotide , encoding a protein variant.

[0072] В данном изобретении микроорганизм, включающий в себя вариант глутамат-цистеинлигазы или кодирующий ее полинуклеотид, может представлять собой, например, рекомбинантный микроорганизм, полученный путем трансформации микроорганизма вектором, содержащим полинуклеотид, без ограничения им. Рекомбинантный микроорганизм может представлять собой дрожжи, например микроорганизм, относящийся к роду Saccharomyces, в частности Saccharomyces cerevisiae. Например, микроорганизм может представлять собой штамм Saccharomyces cerevisiae с регистрационным номером KCCM12659P, без ограничения им.[0072] In the present invention, the microorganism including the glutamate cysteine ligase variant or the polynucleotide encoding it may be, for example, a recombinant microorganism obtained by transforming the microorganism with a vector containing the polynucleotide, but is not limited to it. The recombinant microorganism may be a yeast, for example a microorganism belonging to the genus Saccharomyces, in particular Saccharomyces cerevisiae. For example, the microorganism may be, but is not limited to, a strain of Saccharomyces cerevisiae with accession number KCCM12659P.

[0073] В данном описании термин «глутатион» может использоваться взаимозаменяемо с «GSH» и относится к трипептидному соединению, состоящему из трех аминокислот: глутамата, цистеина и глицина. Глутатион может быть использован в качестве исходного материала для фармацевтических средств, функциональной оздоровительной продукции, вкусовых добавок, пищевых и кормовых добавок, косметических средств и тому подобного, без ограничения ими.[0073] As used herein, the term “glutathione” may be used interchangeably with “GSH” and refers to a tripeptide compound consisting of three amino acids: glutamate, cysteine and glycine. Glutathione can be used as a starting material for pharmaceuticals, functional health products, flavorings, food and feed additives, cosmetics and the like, without limitation.

[0074] В данном описании термин «глутатион-продуцирующий микроорганизм» включает микроорганизмы, модифицированные посредством естественной или искусственной генетической модификации, и может относиться к микроорганизму, обладающему конкретным механизмом, который ослаблен или усилен в результате введения экзогенного гена или усиления или инактивации эндогенного гена посредством генетической модификации для продуцирования глутатиона. В свете задач настоящего изобретения микроорганизм, продуцирующий глутатион, может относиться к микроорганизму, содержащему глутамат-цистеинлигазу и способному продуцировать большое количество целевого глутатиона по сравнению с микроорганизмами дикого типа или немодифицированными микроорганизмами. «Глутатион-продуцирующий микроорганизм» может использоваться взаимозаменяемо с терминами «микроорганизм, продуцирующий глутатион», «микроорганизм, обладающий способностью продуцировать глутатион», «глутатион-продуцирующий штамм», «штамм, обладающий способностью продуцировать глутатион» или тому подобным.[0074] As used herein, the term “glutathione-producing microorganism” includes microorganisms modified by natural or artificial genetic modification, and may refer to a microorganism having a particular mechanism that is weakened or enhanced by the introduction of an exogenous gene or by the enhancement or inactivation of an endogenous gene by genetic modification to produce glutathione. In light of the objectives of the present invention, a glutathione-producing microorganism may refer to a microorganism containing glutamate cysteine ligase and capable of producing a large amount of the target glutathione compared to wild-type microorganisms or unmodified microorganisms. "Glutathione-producing microorganism" may be used interchangeably with the terms "glutathione-producing microorganism", "microorganism having the ability to produce glutathione", "glutathione-producing strain", "strain having the ability to produce glutathione" or the like.

[0075] Глутатион-продуцирующий микроорганизм может представлять собой рекомбинантный микроорганизм. Рекомбинантный микроорганизм является таким, как описано выше.[0075] The glutathione-producing microorganism may be a recombinant microorganism. The recombinant microorganism is as described above.

[0076] Глутатион-продуцирующий микроорганизм не ограничен каким-либо конкретным типом, при условии, что он продуцирует глутатион, но может представлять собой микроорганизм, относящийся к роду Saccharomyces, в частности Saccharomyces cerevisiae, без ограничения им.[0076] The glutathione-producing microorganism is not limited to any particular type as long as it produces glutathione, but may be a microorganism belonging to the genus Saccharomyces, in particular Saccharomyces cerevisiae, without limitation thereto.

[0077] Родительский штамм глутатион-продуцирующего микроорганизма, включающего вариант, конкретно не ограничен, при условии, что этот штамм обладает способностью продуцировать глутатион. Микроорганизм может включать модификацию для усиления биосинтетического пути для увеличения способности продуцировать глутатион, снятия ингибирования по принципу обратной связи и инактивации генов, которые ослабляют путь деградации или путь биосинтеза, и такая модификация не исключает модификацию, возникающую естественным образом. Однако, данное изобретение не ограничивается указанным.[0077] The parent strain of the glutathione-producing microorganism comprising the variant is not particularly limited as long as the strain has the ability to produce glutathione. The microorganism may include modification to enhance the biosynthetic pathway to increase the ability to produce glutathione, relieve feedback inhibition and inactivate genes that impair the degradation pathway or biosynthetic pathway, and such modification does not preclude naturally occurring modification. However, the present invention is not limited to this.

[0078] В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения глутатиона, включающий культивирование микроорганизма. Микроорганизм и глутатион являются такими, как описано выше. Глутатион может накапливаться в штамме при культивировании штаммов.[0078] In another aspect of the present invention, there is provided a method for producing glutathione, comprising culturing a microorganism. The microorganism and glutathione are as described above. Glutathione can accumulate in the strain during strain cultivation.

[0079] Применительно к культуральной среде или другим условиям культивирования для культивирования штамма по данному изобретению можно использовать любую среду для культивирования, обычно используемую для культивирования микроорганизмов, принадлежащих к роду Saccharomyces, без ограничения. В частности, штамм по данному изобретению можно культивировать в обычной среде, содержащей надлежащие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, в аэробных или анаэробных условиях при поддержании температуры, рН и тому подобного.[0079] In terms of culture medium or other culture conditions, any culture medium commonly used for cultivating microorganisms belonging to the genus Saccharomyces can be used for cultivating the strain of this invention, without limitation. In particular, the strain of the present invention can be cultivated in a conventional medium containing appropriate carbon sources, nitrogen sources, phosphorus sources, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins, under aerobic or anaerobic conditions while maintaining temperature, pH and the like.

[0080] В данном изобретении в качестве источников углерода можно использовать такие углеводы, как глюкоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; такие сахароспирты, как маннит и сорбит; такие органические кислоты, как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота, и такие аминокислоты, как глутамат, метионин и лизин, без ограничения ими. Кроме того, можно использовать такие органические питательные вещества, как гидролизаты крахмала, меласса, сырая меласса, рисовые отруби, маниок, тростниково-сахарная багасса и кукурузный экстракт, и такие углеводы, как глюкоза и стерилизованная обработанная меласса (т.е. меласса, в которой сахара конвертированы в восстанавливающие сахара) и, кроме того, можно использовать подходящие количества любых других источников углерода, без ограничения ими. Такие источники углерода можно использовать по отдельности или в виде комбинации по меньшей мере двух из них.[0080] In this invention, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and maltose can be used as carbon sources; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as, but not limited to, pyruvic acid, lactic acid and citric acid; and amino acids such as glutamate, methionine and lysine. In addition, organic nutrients such as starch hydrolysates, molasses, raw molasses, rice bran, cassava, sugarcane bagasse and corn extract, and carbohydrates such as glucose and sterilized processed molasses (i.e. molasses, in which sugars are converted to reducing sugars) and, in addition, suitable amounts of any other carbon sources can be used without limitation. Such carbon sources can be used individually or as a combination of at least two of them.

[0081] В качестве источников азота можно использовать источники неорганического азота, такие как аммоний, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония, и источники органического азота, такие как аминокислоты, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, мальтозный экстракт, кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее деструкции, и обезжиренный соевый жмых или продукты его деструкции. Такие источники углерода можно использовать по отдельности или в виде комбинации по меньшей мере двух из них.[0081] As nitrogen sources, inorganic nitrogen sources such as ammonium, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, and organic nitrogen sources such as amino acids, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, maltose extract, corn extract, casein hydrolysate, fish or its degradation products, and defatted soybean meal or its degradation products. Such carbon sources can be used individually or as a combination of at least two of them.

[0082] В качестве источников фосфора можно использовать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующие натрий-содержащие соли. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобные.[0082] Potassium dihydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, or corresponding sodium salts can be used as phosphorus sources. As inorganic compounds, sodium chloride, calcium chloride, ferric chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate and the like can be used.

[0083] Культуральная среда может дополнительно включать аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники. В частности, в среду для культивирования штамма можно добавлять L-аминокислоты или тому подобное. В частности, при необходимости, в культуральную среду можно добавлять глицин, глутамат и/или цистеин и дополнительно добавлять такие L-аминокислоты, как лизин, однако данное изобретение не ограничивается перечисленным.[0083] The culture medium may further include amino acids, vitamins and/or suitable precursors. In particular, L-amino acids or the like can be added to the strain culture medium. In particular, if necessary, glycine, glutamate and/or cysteine can be added to the culture medium and additionally L-amino acids such as lysine can be added, but the present invention is not limited to the above.

[0084] Культуральную среду и предшественники можно добавлять к культурам периодически или непрерывно, без ограничения этим.[0084] Culture medium and precursors can be added to cultures periodically or continuously, without limitation.

[0085] В данном изобретении для корректировки рН культуры в процессе культивирования штамма к культурам можно надлежащим образом добавлять такие соединения, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, для предупреждения образования пены в процессе культивирования можно добавлять пеногаситель, такой как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. Дополнительно, для поддержания культур в аэробных условиях можно инжектировать в культуры кислород или кислород-содержащий газ, и газообразный азот, водород или диоксид углерода можно инжектировать в культуры для поддержания культуры в анаэробных и микроаэробных условиях, без инжектирования каких-либо других газов.[0085] In the present invention, compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be suitably added to the cultures to adjust the pH of the culture during strain cultivation. In addition, an antifoam agent such as a polyglycol fatty acid ester may be added to prevent foam formation during the culture process. Additionally, oxygen or an oxygen-containing gas can be injected into the cultures to maintain cultures under aerobic conditions, and nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas can be injected into the cultures to maintain the culture under anaerobic and microaerobic conditions, without injecting any other gases.

[0086] Температуру культивирования можно поддерживать от 25°С до 40°С, и в частности от 28°С до 37°С, без ограничения этим. Культивирование можно продолжать до достижения нужного количества нужного вещества, в частности от 1 до 100 часов, без ограничения этим.[0086] The culture temperature can be maintained from 25°C to 40°C, and in particular from 28°C to 37°C, without limitation. The cultivation can be continued until the desired amount of the desired substance is reached, in particular from 1 to 100 hours, without limitation.

[0087] Способ получения глутатиона может дополнительно включать дополнительный процесс после стадии культивирования. Дополнительный процесс может быть надлежащим образом выбран в соответствии с целью применения глутатиона.[0087] The method for producing glutathione may further include an additional process after the cultivation step. The additional process can be suitably selected according to the purpose of glutathione application.

[0088] В частности, способ получения глутатиона может включать выделение глутатиона из по меньшей мере одного, выбранного из штамма, высушенного продукта, экстракта, культурального продукта и его лизата, после культивирования микроорганизма.[0088] In particular, a method for producing glutathione may include isolating glutathione from at least one selected from a strain, a dried product, an extract, a culture product, and a lysate thereof, after culturing the microorganism.

[0089] Способ может дополнительно включать лизирование штамма до или одновременно со стадией выделения. Лизирование штамма может осуществляться любым способом, обычно используемым в области техники, к которой относится данное изобретение, например путем обработки нагревом или путем использования лизирующего буферного раствора, ультразвукового гомогенизатора и френч-пресса. Также, стадия лизирования может включать ферментативную реакцию посредством литического фермента клеточной стенки, нуклеазы, транснуклеотидазы, протеазы или тому подобного, без ограничения ими.[0089] The method may further include lysing the strain before or simultaneously with the isolation step. Lysing of the strain can be accomplished by any method commonly used in the art to which this invention relates, for example by heat treatment or by the use of lysis buffer, ultrasonic homogenizer and French press. Also, the lysis step may include an enzymatic reaction through, but not limited to, a cell wall lytic enzyme, nuclease, transnucleotidase, protease, or the like.

[0090] В свете задач данного изобретения посредством способа получения глутатиона можно получать сухие дрожжи, экстракт дрожжей, порошкообразную смесь дрожжевого экстракта и чистый глутатион, каждый из которых имеет высокое содержание глутатиона. Однако данное изобретение не ограничивается перечисленным, и указанные продукты могут быть приготовлены соответствующим образом в соответствии с нужными продуктами.[0090] In view of the objects of the present invention, through the glutathione production method, it is possible to produce dry yeast, yeast extract, powdered mixture of yeast extract and pure glutathione, each of which has a high content of glutathione. However, the present invention is not limited to the above, and the above products can be prepared accordingly according to the desired products.

[0091] В данном изобретении "сухие дрожжи" могут использоваться взаимозаменяемо с «высушенным продуктом штамма». Сухие дрожжи могут быть получены путем сушки штамма дрожжей, в котором накоплен глутатион и, в частности, они могут входить в кормовую композицию, пищевую композицию и тому подобное, без ограничения ими.[0091] In the present invention, “dried yeast” may be used interchangeably with “dried strain product.” Dried yeast can be obtained by drying a yeast strain in which glutathione has been accumulated, and in particular, it can be included in a feed composition, food composition and the like, without being limited thereto.

[0092] В данном изобретении "дрожжевой экстракт» может использоваться взаимозаменяемо с таким термином как «экстракт штамма». Экстракт штамма может относиться к веществам, остающимся после отделения клеточных стенок от штаммов. В частности, экстракт штамма может относиться к остающимся компонентам, за исключением клеточных стенок, среди компонентов, полученных путем лизиса клеток. Экстракт штамма включает глутатион и один или более других компонентов, выбранных из белков, углеводов, нуклеиновых кислот и волокон, в дополнение к глутатиону, без ограничения ими.[0092] In this invention, "yeast extract" may be used interchangeably with the term "strain extract". Strain extract may refer to the substances remaining after the cell walls are separated from the strains. In particular, strain extract may refer to the remaining components other than cell walls, among the components obtained by cell lysis.The extract of the strain includes glutathione and one or more other components selected from proteins, carbohydrates, nucleic acids and fibers, in addition to glutathione, but not limited to them.

[0093] Стадия выделения может осуществляться любым подходящим способом, известным в данной области техники, и глутатион может быть выделен как целевое вещество.[0093] The isolation step can be carried out by any suitable method known in the art, and glutathione can be isolated as the target substance.

[0094] Стадия выделения может включать процесс очистки. Процесс очистки можно осуществлять путем выделения из штамма только глутатиона. При помощи процесса очистки можно получать глутатион.[0094] The isolation step may include a purification process. The purification process can be accomplished by isolating only glutathione from the strain. Glutathione can be obtained through a purification process.

[0095] При необходимости, способ получения глутатиона может дополнительно включать смешивание эксципиента с одним, выбранным из: штамма, его высушенного продукта, экстракта, культуры и лизата и выделенного из них глутатиона. Благодаря стадии смешивания можно получать порошкообразную смесь дрожжевого экстракта.[0095] If necessary, the method of producing glutathione may further include mixing an excipient with one selected from: a strain, a dried product thereof, an extract, a culture and a lysate, and the glutathione isolated therefrom. Thanks to the mixing step, a powdered mixture of yeast extract can be obtained.

[0096] Эксципиент может быть надлежащим образом выбран и использован согласно целевому назначению или форме и, например, может быть выбран из крахмала, глюкозы, целлюлозы, лактозы, гликогена, D-маннита, сорбита, лактита, мальтодекстрина, карбоната кальция, искусственного силиката алюминия, моногидрофосфата кальция, сульфата кальция, хлорида натрия, гидрокарбоната натрия, очищенного ланолина, декстрина, альгината натрия, метилцеллюлозы, коллоидного диоксида кремния, гидроксипропилкрахмала, гидроксипропилметил целлюлозы, пропиленгликоля, казеина, лактата кальция, примойела и гуммиарабика, и, в частности, он может включать по меньшей мере один компонент, выбранный из крахмала, глюкозы, целлюлозы, лактозы, декстрина, гликогена, D-маннита и мальтодекстрина, без ограничения ими.[0096] The excipient may be suitably selected and used according to the intended purpose or form and, for example, may be selected from starch, glucose, cellulose, lactose, glycogen, D-mannitol, sorbitol, lactitol, maltodextrin, calcium carbonate, artificial aluminum silicate , calcium monohydrogen phosphate, calcium sulfate, sodium chloride, sodium bicarbonate, purified lanolin, dextrin, sodium alginate, methylcellulose, colloidal silicon dioxide, hydroxypropyl starch, hydroxypropyl methyl cellulose, propylene glycol, casein, calcium lactate, primoyel and gum arabic, and in particular it can include at least one component selected from, but not limited to, starch, glucose, cellulose, lactose, dextrin, glycogen, D-mannitol and maltodextrin.

[0097] Эксципиент может включать, например, консервант, увлажняющее вещество, диспергирующее вещество, суспендирующее вещество, буфер, стабилизатор или изотоническое вещество, без ограничения ими.[0097] An excipient may include, for example, but is not limited to a preservative, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, buffer, stabilizer, or isotonic agent.

[0098] В другом аспекте данного изобретения предложено применение варианта глутамат-цистеинлигазы для получения глутатиона. В другом аспекте данного изобретения предложено применение микроорганизма для получения глутатиона. Вариант глутамат-цистеинлигазы, микроорганизм и глутатион являются такими, как описано выше.[0098] Another aspect of the present invention provides the use of a variant of glutamate cysteine ligase to produce glutathione. Another aspect of the present invention provides the use of a microorganism to produce glutathione. The glutamate cysteine ligase variant, microorganism and glutathione are as described above.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯOPTION FOR IMPLEMENTATION OF THE INVENTION

[0099] Далее данное изобретение будет описано более подробно со ссылкой на приведенные ниже примеры и экспериментальные примеры. Однако приведенные ниже примеры и экспериментальные примеры предназначены исключительно для иллюстрации данного изобретения и не ограничивают объем данного изобретения.[0099] Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples. However, the following examples and experimental examples are intended solely to illustrate the present invention and do not limit the scope of the present invention.

[00100] Пример 1. Выбор глутатион-продуцирующего штамма и подтверждение способности продуцировать глутатион[00100] Example 1: Selection of a glutathione-producing strain and confirmation of ability to produce glutathione

[00101] Штаммы получали из прессованных дрожжей, содержащих различные штаммы, и улучшали их характеристики для отбора штаммов, обладающих способностью продуцировать глутатион.[00101] Strains were obtained from compressed yeast containing various strains and their characteristics were improved to select strains having the ability to produce glutathione.

[00102] В частности, отбирали образцы зерен, таких как рис, ячмень, бобы мунг и овес из 20 областей, таких как Hwaseong, Pyeongtaek, Yongin и им подобные из провинции Gyeonggi-do, Республика Корея, измельчали, растирали, помещали в ткань, плотно спрессовывали для придания им формы, оборачивали соломой для ферментации в течение 10 суток и медленно сушили с получением прессованных дрожжей.[00102] Specifically, grains such as rice, barley, mung beans and oats from 20 areas such as Hwaseong, Pyeongtaek, Yongin and the like from Gyeonggi-do Province, Republic of Korea were sampled, crushed, ground, placed in a cloth , were pressed tightly to shape, wrapped in straw to ferment for 10 days, and slowly dried to produce compressed yeast.

[00103] Проводили следующий эксперимент для выделения различных штаммов из полученных прессованных дрожжей. К 5 г прессованных дрожжей добавляли 45 мл солевого раствора и измельчали при помощи миксера. Для выделения чистых штаммов дрожжей полученное разводили путем последовательных разведений, наносили на агар YPD (10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л бактопептона и 20 г/л глюкозы на 1 л дистиллированной воды) и культивировали при 30°С в течение 48 часов. Затем, руководствуясь морфологией колоний и верификацией под микроскопом, осуществляли посев штрихом колоний дрожжей на агар YPD. 25 мл среды YPD в конических колбах объемом 250 мл инокулировали выделенным чистым штаммом и культивировали в инкубаторе со встряхиванием в течение 48 часов при 30°С и 220 об/мин. Проводили скрининг штаммов, определяя продуцирование глутатиона.[00103] The following experiment was carried out to isolate different strains from the resulting compressed yeast. 45 ml of saline solution was added to 5 g of pressed yeast and crushed using a mixer. To isolate pure yeast strains, the resulting mixture was diluted by serial dilutions, applied to YPD agar (10 g/L yeast extract, 20 g/L bactopeptone and 20 g/L glucose per 1 L of distilled water) and cultured at 30°C for 48 hours . Then, guided by the morphology of the colonies and verification under a microscope, streak plating of yeast colonies was carried out on YPD agar. 25 ml of YPD medium in 250 ml conical flasks were inoculated with the isolated pure strain and cultured in a shaking incubator for 48 hours at 30°C and 220 rpm. The strains were screened to determine glutathione production.

[00104] Для улучшения первично выделенных штаммов, в выделенных штаммах индуцировали случайный мутагенез. В частности, из прессованных дрожжей выделяли штамм с подтвержденной способностью продуцировать глутатион и обозначали его как штамм CJ-37. Штамм CJ-37 культивировали на твердой среде и инокулировали в бульон с получением раствора его культуры и подвергали раствор культуры УФ-облучению с использованием УФ-лампы. После посева раствора культуры, подвергнутой воздействию УФ лучей, на среду в чашке выделяли только мутантный штамм, образовывавший колонии, и определяли продуцирование им глутатиона.[00104] To improve the initially isolated strains, random mutagenesis was induced in the isolated strains. In particular, a strain with a confirmed ability to produce glutathione was isolated from compressed yeast and designated as strain CJ-37. Strain CJ-37 was cultured on solid medium and inoculated into the broth to obtain its culture solution, and the culture solution was exposed to UV irradiation using a UV lamp. After inoculating the culture solution exposed to UV rays onto the medium in the dish, only the mutant strain that formed colonies was isolated and its production of glutathione was determined.

[00105] В результате среди мутантных штаммов отбирали штамм с наиболее высоким продуцированием глутатиона, в качестве глутатион-продуцирующего штамма, обозначали его как штамм CJ-5, депонировали 31 июля 2019 в Корейском Центре культур микроорганизмов (KCCM) в соответствии с Будапештским договором с присвоением регистрационного номера KCCM12568P.[00105] As a result, among the mutant strains, the strain with the highest production of glutathione was selected as the glutathione-producing strain, designated as strain CJ-5, deposited on July 31, 2019 at the Korean Center for Microbial Culture (KCCM) in accordance with the Budapest Treaty with assignment registration number KCCM12568P.

[00106] Пример 2. Эксперимент для дальнейшего улучшения глутатион-продуцирующей способности[00106] Example 2: Experiment to further improve glutathione-producing ability

[00107] Для дальнейшего улучшения способности штамма CJ-5 продуцировать глутатион индуцировали мутацию следующим образом.[00107] To further improve the ability of strain CJ-5 to produce glutathione, a mutation was induced as follows.

[00108] Штамм CJ-5 культивировали на твердой среде и инокулировали в бульон с получением раствора его культуры и подвергали раствор культуры УФ-облучению с использованием УФ-лампы. После посева раствора культуры, подверженной воздействию УФ-лучей, на среду в чашке выделяли только мутантный штамм, образовавший колонии. Выделяли штамм, демонстрирующий наибольшую продуцирование глутатиона, обозначали его как штамм СС02-2490, депонировали 17 января 2020 в Корейском Центре культур микроорганизмов (KCCM) в соответствии с Будапештским договором с присвоением регистрационного номера КССМ 12659Р. В результате анализа последовательности оснований gsh1, представляющего собой ген биосинтеза глутатиона, в отношении усиления глутатион-продуцирующей способности штамма, было подтверждено, что цистеин, который является 86^й аминокислотой белка GSH1, кодируемого геном gsh1, заменен на аргинин.[00108] Strain CJ-5 was cultured on a solid medium and inoculated into a broth to obtain its culture solution, and the culture solution was exposed to UV irradiation using a UV lamp. After inoculating the culture solution exposed to UV rays, only the mutant strain that formed colonies was isolated onto the medium in the dish. The strain demonstrating the highest production of glutathione was isolated, designated as strain CC02-2490, and deposited on January 17, 2020 at the Korean Center for Microbial Cultures (KCCM) in accordance with the Budapest Treaty with the assignment of registration number KCCM 12659R. As a result of the analysis of the base sequence of gsh1, which is a glutathione biosynthesis gene, in relation to enhancing the glutathione-producing ability of the strain, it was confirmed that cysteine, which is ^{the 86th} amino acid of the GSH1 protein encoded by the gsh1 gene, was replaced by arginine.

[00109] Пример 3. Эксперимент с мутацией остатка С86 GSH1[00109] Example 3. Experiment with mutation of residue C86 of GSH1

[00110] Учитывая на основании результатов Примера 2, что аминокислота в положении 86 белка GSH1 важна для продуцирования глутатиона, получали мутантные штаммы Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) CEN.PK2-1D и Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) CJ-5, экспрессирующие варианты белка, в которых цистеин в положении 86 белка GSH1 был заменен на другую аминокислоту, и определяли увеличение продуцирования глутатиона.[00110] Based on the results of Example 2, considering that the amino acid at position 86 of the GSH1 protein is important for the production of glutathione, mutant strains of Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) CEN.PK2-1D and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) CJ-5 were prepared expressing protein variants in which the cysteine at position 86 of the GSH1 protein was replaced by another amino acid, and an increase in glutathione production was determined.

[00111] Для получения штаммов, в которых цистеин в положении 86 белка GSH1 Saccharomyces cerevisiae был заменен на аргинин, использовали плазмиды pWAL100 и pWBR100 согласно публикации Lee ТН et al. (J. Microbiol. Biotechnol. (2006), 16(6), 979 982). В частности, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием в качестве матрицы геномной ДНК штамма CJ-5 следующим образом. Получали частичную последовательность N-конца белка GSH1, включающую N-концевую фланкирующую последовательность BamHI, инициирующий кодон ORF (открытой рамки считывания) GSH1 и последовательность, кодирующую мутацию C86R, осуществляя ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 22 и 23, и частичную последовательность С-конца белка GSH1, включающую С-концевую фланкирующую последовательность XhoI, терминирующий кодон ORF GSH1 и последовательность, кодирующую мутацию C86R, осуществляя ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 24 и 25. Затем, в результате осуществления перекрывающейся ПЦР с использованием в качестве матрицы двух последовательностей с праймерами SEQ ID NO: 22 и 25, получали фрагмент ORF GSH1, включающий последовательность, кодирующую модифицированный белок GSH1, в котором цистеин в положении 86 был заменен на аргинин, с N-концевой последовательностью, распознаваемой рестрикционным ферментом BamHI, и С-концевой последовательностью, распознаваемой рестрикционным ферментом XhoI. Фрагмент ORF обрабатывали BamHI и XhoI и затем клонировали в вектор pWALlOO, обработанный теми же ферментами, с получением вектора pWAL100-GSHl(C86R).[00111] To obtain strains in which the cysteine at position 86 of the Saccharomyces cerevisiae GSH1 protein was replaced by arginine, plasmids pWAL100 and pWBR100 were used according to the publication of Lee TH et al. (J. Microbiol. Biotechnol. (2006), 16(6), 979 982). In particular, polymerase chain reaction (PCR) was performed using genomic DNA of strain CJ-5 as a template as follows. The partial sequence of the N-terminus of the GSH1 protein, including the N-terminal flanking sequence BamHI, the start codon of the GSH1 ORF (open reading frame) and the sequence encoding the C86R mutation, was obtained by PCR using primers with SEQ ID NO: 22 and 23, and the partial sequence The C-terminus of the GSH1 protein, including the C-terminal flanking sequence of XhoI, the stop codon of the GSH1 ORF and the sequence encoding the C86R mutation, performing PCR using primers with SEQ ID NO: 24 and 25. Then, by performing an overlapping PCR using as templates of two sequences with primers SEQ ID NO: 22 and 25, obtained a fragment of the GSH1 ORF, including a sequence encoding a modified GSH1 protein, in which the cysteine at position 86 was replaced by arginine, with an N-terminal sequence recognized by the restriction enzyme BamHI, and C -terminal sequence recognized by the restriction enzyme XhoI. The ORF fragment was digested with BamHI and XhoI and then cloned into the pWALlOO vector treated with the same enzymes to obtain the pWAL100-GSHl(C86R) vector.

[00112] Также, получали 500 п. н. в направлении по ходу транскрипции относительно терминирующего кодона ORF GSH1, включающие N-концевую последовательность, распознаваемую рестрикционным ферментом SpeI, и С-концевую последовательность, распознаваемую рестрикционным ферментом NcoI, выполняя ПЦР с использованием геномной ДНК штамма CJ-5 в качестве матрицы и праймеров с SEQ ID NO: 26 и 27 и обрабатывали рестрикционными ферментами SpeI и NcoI. Затем полученное клонировали в pWBR100, обработанный теми же ферментами с получением вектора pWBR100-GSH1.[00112] Also, 500 bp were obtained. in a downstream direction relative to the stop codon of the GSH1 ORF, including an N-terminal sequence recognized by the restriction enzyme SpeI and a C-terminal sequence recognized by the restriction enzyme NcoI, performing PCR using genomic DNA of strain CJ-5 as a template and primers with SEQ ID NO: 26 and 27 and treated with restriction enzymes SpeI and NcoI. The result was then cloned into pWBR100, treated with the same enzymes to obtain the pWBR100-GSH1 vector.

[00113] Для получения итогового фрагмента ДНК для введения в дрожжи получали ПЦР-продукты, включающие последовательность, кодирующую аргининовую мутацию и часть KlURA3, с использованием в качестве матрицы вектора pWAL100-GSH1(C86R), полученного как описано выше, и праймеров с SEQ ID NO: 22 и 28, и получали ПЦР-продукты, включающие часть KlURA3 и 500 п. н. в направлении по ходу транскрипции относительно терминирующего кодона GSH1, с использованием в качестве матрицы вектора pWBR100-GSH1 и праймеров с SEQ ID NO: 29 и 27. Трансформировали S. cerevisiae CEN.PK2-1D и S. cerevisiae CJ-5 ПЦР-продуктами в одинаковом молярном отношении. Выполняли ПЦР посредством денатурации при 95°С в течение 5 минут, отжига при 53°С в течение 1 минуты и полимеризации в течение 1 минуты на т.о. при 72°С, и осуществляли трансформацию дрожжей согласно способу с ацетатом лития, модифицированному на основе способа, изложенного в публикации Geitz (Nucleic Acid Research, 20(6), 1425). В частности, клетки дрожжей с ОП (оптическая плотность) от 0,7 до 1,2 двукратно промывали ацетатом лития/буфером ТЕ (трис-ЭДТА) и смешивали с ПЦР-продуктами и одноцепочечной ДНК (Sigma D-7656). Культивировали клетки в условиях статической культуры в буфере ацетат лития/ТЕ/40% ПЭГ при 30°С в течение 30 минут и при 42°С в течение 15 минут. Затем клетки культивировали на чашке с агаром SC (2% глюкоза), не содержащим урацил, до появления видимых колоний с получением штамма, в который были введены последовательность, кодирующая GSH1 с мутацией C86R и ген KlURA3. Затем для удаления KlURA3 штаммы культивировали в 2 мл YPD в течение ночи, разбавляли в соотношении 1/100, высевали на чашку с агаром SC (с 2% глюкозой), содержащим 0,1% 5-FOA (5-фтороротовая кислота), с получением мутантного штамма S. cerevisiae CEN.PK2-1D GSH1 C86R и мутантного штамма S. cerevisiae CJ-5 GSH1 C86R, лишенных урацильного маркера. Также, штаммы, способные экспрессировать белки с модифицированным GSH1, в которых цистеин был замещен 18 типами аминокислот, отличных от аргинина, получали аналогичным образом, за исключением того, что использовали пару праймеров с SEQ ID NOS: 23 и 24, в которых последовательность, кодирующая 86й аргинин, была заменена последовательностью, кодирующей другую аминокислоту.[00113] To obtain the final DNA fragment for introduction into yeast, PCR products were obtained, including the sequence encoding the arginine mutation and part of KlURA3, using as a template the vector pWAL100-GSH1(C86R), obtained as described above, and primers with SEQ ID NO: 22 and 28, and PCR products were obtained including part of KlURA3 and 500 bp. in the direction downstream of the transcription codon of GSH1, using the pWBR100-GSH1 vector and primers with SEQ ID NOs: 29 and 27 as a template. S. cerevisiae CEN.PK2-1D and S. cerevisiae CJ-5 were transformed with PCR products into the same molar ratio. PCR was performed by denaturation at 95°C for 5 minutes, annealing at 53°C for 1 minute and polymerization for 1 minute at b.c. at 72°C, and yeast transformation was carried out according to the lithium acetate method, modified from the method described in Geitz (Nucleic Acid Research, 20(6), 1425). Specifically, yeast cells with an OD (optical density) of 0.7 to 1.2 were washed twice with lithium acetate/TE buffer (Tris-EDTA) and mixed with PCR products and ssDNA (Sigma D-7656). Cells were cultured under static culture conditions in lithium acetate/TE/40% PEG buffer at 30°C for 30 minutes and at 42°C for 15 minutes. The cells were then cultured on uracil-free SC agar plate (2% glucose) until visible colonies appeared to obtain a strain into which the sequence encoding GSH1 with the C86R mutation and the KlURA3 gene were introduced. Then, to remove KlURA3, the strains were cultured in 2 ml YPD overnight, diluted 1/100, plated on SC agar plate (with 2% glucose) containing 0.1% 5-FOA (5-fluoroorotic acid), with by obtaining the mutant strain S. cerevisiae CEN.PK2-1D GSH1 C86R and the mutant strain S. cerevisiae CJ-5 GSH1 C86R, lacking the uracil marker. Also, strains capable of expressing GSH1-modified proteins in which cysteine was replaced by 18 types of amino acids other than arginine were generated in a similar manner, except that a pair of primers with SEQ ID NOS: 23 and 24 were used, in which the coding sequence The 86th arginine was replaced by a sequence coding for a different amino acid.

[00115] После культивирования штаммов, полученных, как описано выше, в течение 26 часов измеряли концентрацию полученного глутатиона (GSH), которая приведена в Таблицах 2 и 3.[00115] After culturing the strains obtained as described above for 26 hours, the concentration of the resulting glutathione (GSH) was measured, which is shown in Tables 2 and 3.

[00118] На основании результатов эксперимента было подтверждено, что способность продуцировать глутатион, полученная в результате замены цистеина в положении 86 белка GSH1 на другую аминокислоту, повышалась вплоть до 27% по сравнению со способностью продуцировать глутатион, полученной у белка GSH1 дикого типа.[00118] Based on the experimental results, it was confirmed that the glutathione-producing ability obtained by replacing the cysteine at position 86 of the GSH1 protein with another amino acid was increased by up to 27% compared to the glutathione-producing ability obtained by the wild-type GSH1 protein.

[00119] На этом основании было подтверждено, что вариант GSH1, полученный путем замены цистеина в положении 86 белка GSH1 на другую аминокислоту, обладал значительно улучшенной способностью продуцировать глутатион.[00119] Based on this, it was confirmed that the GSH1 variant obtained by replacing the cysteine at position 86 of the GSH1 protein with a different amino acid had a significantly improved ability to produce glutathione.

[00120] Пример 4. Подтверждение влияния другого остатка Cys на продуцирование глутатиона[00120] Example 4 Confirmation of the effect of another Cys residue on glutathione production

[00121] В качестве сравнительного примера модифицировали другой остаток Cys белка GSH1 и исследовали глутатион-продуцирующую способность, полученную в результате модификации. Результаты приведены в Таблице 4 ниже.[00121] As a comparative example, another Cys residue of the GSH1 protein was modified and the glutathione-producing ability resulting from the modification was examined. The results are shown in Table 4 below.

[00123] На основании результатов эксперимента, остаток цистеина, отличный от цистеина в положении 86, не оказывал повышающего влияния на продуцирование глутатиона, а наоборот, снижал продуцирование глутатиона.[00123] Based on the experimental results, a cysteine residue other than the cysteine at position 86 did not have an increasing effect on glutathione production, but rather decreased glutathione production.

[00124] На этом основании было подтверждено, что не все остатки цистеина, присутствующие в белке, обладают повышающим эффектом на продуцирование глутатиона. Также было подтверждено, что новый вариант GSH1, разработанный в данном изобретении, повышал продуцирование глутатиона.[00124] Based on this, it has been confirmed that not all cysteine residues present in the protein have an enhancing effect on glutathione production. It was also confirmed that the new GSH1 variant developed in the present invention increased glutathione production.

[00125] Поскольку дрожжи, продуцирующие глутатион с высоким выходом, их высушенный продукт, экстракт, культура и лизат и произведенный глутатион обладают антиоксидантным, детоксикационным и усиливающим иммунитет влиянием, их можно эффективно применять для получения косметической композиции, пищевой композиции, кормовой композиции и фармацевтической композиции.[00125] Since high-yield glutathione-producing yeast, its dried product, extract, culture and lysate and produced glutathione have antioxidant, detoxifying and immune-enhancing effects, they can be effectively used to produce a cosmetic composition, food composition, feed composition and pharmaceutical composition .

[00126] Приведенное выше описание данного изобретения представлен для иллюстрации, и специалистам в данной области техники понятно, что возможны различные изменения и модификации, не изменяющие технической концепции и существенных признаков данного изобретения. Таким образом, очевидно, что описанные выше воплощения являются иллюстративными во всех аспектах и не ограничивают данное изобретение. Не следует считать исчерпывающими различные воплощения, изложенные в данном документе, истинный объем изобретения определяется формулой изобретения, приведенной ниже. Данное изобретение ограничивается исключительно признаками формулы изобретения, охватывая и весь объем эквивалентов, на которые распространяется такая формула изобретения.[00126] The above description of the present invention is presented for illustration purposes, and those skilled in the art will understand that various changes and modifications are possible without altering the technical concept and essential features of the present invention. It is therefore understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and are not limiting of the present invention. The various embodiments set forth herein are not to be considered exhaustive, but the true scope of the invention is defined by the claims set forth below. This invention is limited solely by the features of the claims, covering the entire scope of equivalents covered by such claims.

Claims

1. Вариант глутамат-цистеинлигазы, обладающий активностью глутамат-цистеинлигазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 86 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту.1. A glutamate cysteine ligase variant having glutamate cysteine ligase activity in which the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is replaced by another amino acid.

2. Вариант глутамат-цистеинлигазы по п. 1, в котором аминокислота, соответствующая положению 86, заменена на глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, серин, треонин, тирозин, аспарагин, глутамат, глутамин, аспартат, лизин, аргинин или гистидин.2. A variant of glutamate-cysteine ligase according to claim 1, in which the amino acid corresponding to position 86 is replaced by glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, tyrosine, asparagine, glutamate, glutamine , aspartate, lysine, arginine or histidine.

3. Вариант глутамат-цистеинлигазы, обладающий активностью глутамат-цистеинлигазы, и имеющий гомологию последовательности, равную или более 80% и менее 100%, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, в котором аминокислота, соответствующая положению 86 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту.3. A glutamate cysteine ligase variant having glutamate cysteine ligase activity and having sequence homology equal to or greater than 80% and less than 100% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, in which the amino acid corresponding to position 86 from the N-terminus of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, replaced with another amino acid.

4. Вариант глутамат-цистеинлигазы по п. 1, который состоит из одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3 - 21.4. A variant of glutamate cysteine ligase according to claim 1, which consists of one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 3 - 21.

5. Полинуклеотид, кодирующий вариант глутамат-цистеинлигазы по любому из пп. 1 - 4.5. A polynucleotide encoding a variant of glutamate cysteine ligase according to any one of claims. 14.

6. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 5.6. An expression vector containing a polynucleotide according to claim 5.

7. Микроорганизм, продуцирующий глутатион, содержащий по меньшей мере один из: варианта глутамат-цистеинлигазы по любому из пп. 1 - 4; полинуклеотида, кодирующего этот вариант, и вектора, содержащего этот полинуклеотид.7. A microorganism that produces glutathione, containing at least one of: a variant of glutamate-cysteine ligase according to any one of paragraphs. 14; a polynucleotide encoding this variant, and a vector containing this polynucleotide.

8. Микроорганизм по п. 7, который представляет собой микроорганизм, принадлежащий к роду Saccharomyces.8. The microorganism according to claim 7, which is a microorganism belonging to the genus Saccharomyces.

9. Микроорганизм по п. 7, который представляет собой Saccharomyces cerevisiae.9. The microorganism according to claim 7, which is Saccharomyces cerevisiae.

10. Микроорганизм по п. 7, который представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный под регистрационным номером KCCM12659P.10. The microorganism according to claim 7, which is a strain of Saccharomyces cerevisiae, deposited under registration number KCCM12659P.

11. Способ получения глутатиона, включающий культивирование в культуральной среде микроорганизма, содержащего по меньшей мере один из: варианта глутамат-цистеинлигазы по любому из пп. 1 - 4; полинуклеотида, кодирующего этот вариант, и вектора, содержащего этот полинуклеотид. 11. A method for producing glutathione, including cultivating in a culture medium a microorganism containing at least one of: a variant of glutamate-cysteine ligase according to any one of claims. 14; a polynucleotide encoding this variant, and a vector containing this polynucleotide.

12. Способ по п. 11, дополнительно включающий выделение глутатиона из по меньшей мере одного, выбранного из культивируемого микроорганизма, высушенного продукта этого микроорганизма, экстракта этого микроорганизма, культуры этого микроорганизма и лизата этого микроорганизма.12. The method of claim 11, further comprising isolating glutathione from at least one selected from a cultured microorganism, a dried product of the microorganism, an extract of the microorganism, a culture of the microorganism, and a lysate of the microorganism.