RU2809122C2

RU2809122C2 - Enzymatic production of carbohydrates by microbial cells using mixed raw materials

Info

Publication number: RU2809122C2
Application number: RU2021128531A
Authority: RU
Inventors: Штефан ЙЕННЕВАЙН; Дирк ВАРТЕНБЕРГ
Original assignee: Хр. Ханзен ХМО ГмбХ
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2023-12-07

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method for enzymatic production of 2'-fucosyllactose is proposed, which includes providing an E. coli cell genetically engineered to produce 2'-fucosyllactose, cultivating said genetically engineered E. coli cell in a culture medium allowing to produce 2'-fucosyllactose, where the main carbon source is a mixture of monosaccharides consisting of glucose and fructose, obtained by hydrolysis of sucrose; and isolation of 2'-fucosyllactose. In this case, the E. coli cell demonstrates the genotype pfkA ^–, lacZ ^–, fuclK ^–, wcaJ ^–, overexpresses the enzymes ManB, ManC, Gmd and WcaG for the de novo synthesis of GDP-fucose, the geneα-1,2-fucosyltransferase and sugar efflux transporter gene yberc0001_9420 from Yersinia bercovieri ATCC 43970.

EFFECT: increase in productivity of 2'-fucosyllactose.

6 cl, 13 dwg, 3 tbl, 4 ex

Description

Настоящее изобретение относится к ферментативному получению целевого сахарида. Раскрыты микробные клетки, способные продуцировать целевой сахарид, где указанные микробные клетки используют сырье из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии во время ферментации. Также описаны способы получения целевого сахарида посредством использования указанных микробных клеток.The present invention relates to the enzymatic production of the target saccharide. Disclosed are microbial cells capable of producing a target saccharide, wherein said microbial cells use a raw material of a mixture of monosaccharides as the main source of carbon and energy during fermentation. Methods for obtaining the target saccharide through the use of these microbial cells are also described.

Предшествующий уровень техникиPrior Art

Человеческое грудное молоко содержит сложную смесь углеводов, жиров, белков, витаминов, минеральных веществ и микроэлементов. Наиболее преобладающая фракция человеческого грудного молока состоит из углеводов. Фракция углеводов в человеческом грудном молоке может быть дополнительно подразделена на (i) лактозу и (ii) олигосахариды (олигосахариды грудного молока, ОГМ). В то время, как дисахарид лактоза (галактозо-β1,4-глюкоза) используется грудным ребенком в качестве источника энергии, олигосахариды не метаболизируются младенцем.Human breast milk contains a complex mixture of carbohydrates, fats, proteins, vitamins, minerals and trace elements. The most predominant fraction of human breast milk consists of carbohydrates. The carbohydrate fraction of human breast milk can be further subdivided into (i) lactose and (ii) oligosaccharides (human milk oligosaccharides, HMOs). While the disaccharide lactose (galactose-β1,4-glucose) is used by the infant as an energy source, oligosaccharides are not metabolized by the infant.

На долю фракции олигосахаридов приходится вплоть до одной десятой суммарной фракции углеводов, и она, вероятно, состоит из более чем 150 структурно разных олигосахаридов. Распространенность и концентрация данных сложных олигосахаридов являются специфичными для человека, и, таким образом, они не могут быть обнаружены в больших количествах в молоке других млекопитающих, включая молочных сельскохозяйственных животных.The oligosaccharide fraction accounts for up to one tenth of the total carbohydrate fraction and is likely composed of more than 150 structurally different oligosaccharides. The abundance and concentration of these complex oligosaccharides are specific to humans, and thus they may not be found in large quantities in the milk of other mammals, including dairy farm animals.

Наиболее распространенными олигосахаридами грудного молока являются 2'-фукозиллактоза (2-FL - от англ. 2-fucosyllactose) и 3'-фукозиллактоза (3-FL - от англ. 3-fucosyllactose), которые вместе могут составлять вплоть до 1/3 суммарной фракции ОГМ. Дополнительные распространенные ОГМ представляют собой лакто-N-тетраозу (LNT - от англ. lacto-N-tetraose), лакто-N-неотетраозу (LNnT - от англ. lacto-N-neotetraose) и лакто-N-фукопентаозу I (LNFP-I - от англ. lacto-N-fucopentaose I). Помимо данных нейтральных олигосахаридов, также в человеческом грудном молоке могут быть обнаружены кислые ОГМ, такие как 3'-сиалиллактоза (3'-SL - от англ. 3'-sialyllactose), 6'-сиалиллактоза (6'-SL - от англ. 6'-sialyllactose), 3-фукозил-3'-сиалиллактоза, сиалил-лакто-N-тетраоза и дисиалил-лакто-N-тетраоза.The most common oligosaccharides in breast milk are 2'-fucosyllactose (2-FL - from the English 2-fucosyllactose) and 3'-fucosyllactose (3-FL - from the English 3-fucosyllactose), which together can account for up to 1/3 of the total OGM factions. Additional common HGMs are lacto-N-tetraose (LNT), lacto-N-neotetraose (LNnT), and lacto-N-fucopentaose I (LNFP). I - from the English lacto-N-fucopentaose I). In addition to these neutral oligosaccharides, acidic HMOs, such as 3'-sialyllactose (3'-SL - from English 3'-sialyllactose), 6'-sialyllactose (6'-SL - from English. 6'-sialyllactose), 3-fucosyl-3'-sialyllactose, sialyl-lacto-N-tetraose and disialyl-lacto-N-tetraose.

Примечательно, что значительное большинство ОГМ содержат группировку галактозо-β1,4-глюкозы на своем восстанавливающем конце, которая удлиняется в результате добавления группировок моносахарида, как например, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и/или фукоза и/или галактоза и/или N-ацетилнейраминовая кислота (NeuNAc). Структуры ОГМ являются близкородственными с эпитопами гликоконъюгатов поверхности эпителиальных клеток, антигенами группы крови Lewis, такими как антиген Lewis × (LeX). Структурное сходство ОГМ с эпителиальными эпитопами обуславливает защитные свойства ОГМ против бактериальных патогенов.Notably, the vast majority of OGMs contain a galactose-β1,4-glucose moiety at their reducing end, which is extended by the addition of monosaccharide moieties such as N-acetylglucosamine (GlcNAc) and/or fucose and/or galactose and/or N- acetylneuraminic acid (NeuNAc). OGM structures are closely related to epithelial cell surface glycoconjugate epitopes of Lewis blood group antigens, such as Lewis × (LeX) antigen. The structural similarity of OGM with epithelial epitopes determines the protective properties of OGM against bacterial pathogens.

О наличии олигосахаридов в человеческом грудном молоке известно на протяжении длительного времени, и физиологические функции данных олигосахаридов подвергали медицинскому исследованию на протяжении многих десятилетий. Для некоторых из более распространенных олигосахаридов грудного молока уже идентифицированы конкретные функции.The presence of oligosaccharides in human breast milk has been known for a long time, and the physiological functions of these oligosaccharides have been the subject of medical research for many decades. Specific functions have already been identified for some of the more common human milk oligosaccharides.

Помимо оказания местного действия в кишечнике, как указано ранее в данном документе, ОГМ, как также было показано, оказывают системное действие у младенцев в результате поступления их в системный кровоток. Кроме того, влияние ОГМ на белок-углеводные взаимодействия, например, связывание селектина и лейкоцита может модулировать иммунные ответы и уменьшать воспалительные реакции. Кроме того, становится все более и более признанным, что ОГМ представляют ключевые субстраты для разработки микробиомов младенцев.In addition to exerting local effects in the intestine, as noted earlier in this document, OGMs have also been shown to have systemic effects in infants through entry into the systemic circulation. In addition, the effects of OGM on protein-carbohydrate interactions, such as selectin-leukocyte binding, may modulate immune responses and reduce inflammatory responses. In addition, it is increasingly recognized that OGMs represent key substrates for the development of infant microbiomes.

Ввиду хорошо изученных полезных свойств разных углеводов, в общем и в частности, пребиотических олигосахаридов, но из-за их ограниченной доступности из природных источников, эффективный и рентабельный способ получения моносахаридов (например, L-фукозы, N-ацетилнейраминовой кислоты), дисахаридов (например, лакто-N-биозы) и олигосахаридов (например, 2'-FL, LNnT) является весьма требуемым.In view of the well-studied beneficial properties of various carbohydrates, in general and in particular prebiotic oligosaccharides, but due to their limited availability from natural sources, an effective and cost-effective way to obtain monosaccharides (e.g. L-fucose, N-acetylneuraminic acid), disaccharides (e.g. , lacto-N-biose) and oligosaccharides (eg 2'-FL, LNnT) is highly required.

Пытаясь добиться крупномасштабного производства функциональных углеводов, разработали химические пути для некоторых из данных углеводов. Однако, такие способы включают применение нескольких вредных химических веществ, которые вызывают риск загрязнения конечного продукта. По меньшей мере крупномасштабные количества, а также качества функциональных углеводов, достаточные для их применения в качестве пищевого продукта, не могли быть обеспечены до сегодняшнего дня с помощью химического синтеза.In an attempt to achieve large-scale production of functional carbohydrates, chemical pathways for some of these carbohydrates have been developed. However, such methods involve the use of several harmful chemicals that pose the risk of contamination of the final product. At least large-scale quantities as well as qualities of functional carbohydrates sufficient for their use as a food product could not be achieved until now by chemical synthesis.

Для того, чтобы обойти недостатки, которые связаны с химическим синтезом олигосахаридов грудного молока, разработали несколько ферментативных способов и подходов к ферментации для их продукции. Способы ферментативного получения разработаны для нескольких углеводов, таких как L-фукоза, N-ацетилнейраминовая кислота, 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза, 3'-сиалил-лактоза и 6'-сиалиллактоза. В данных способах получения обычно используются генетически сконструированные бактериальные клетки, такие как рекомбинантные Escherichia coli.In order to overcome the disadvantages that are associated with the chemical synthesis of human milk oligosaccharides, several enzymatic processes and fermentation approaches have been developed for their products. Enzymatic production methods have been developed for several carbohydrates such as L-fucose, N-acetylneuraminic acid, 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, 3'-sialyl-lactose and 6'- sialyllactose. These production methods typically use genetically engineered bacterial cells, such as recombinant Escherichia coli.

Обычно, способы ферментативного получения, а также биокаталитические реакции для получения ОГМ основаны на добавляемой извне лактозе в качестве исходного акцепторного субстрата для получаемых ОГМ. В данных способах к лактозе добавляют один или более моносахаридов (США 7521212 В1; Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334(2) p 97-103). Добавление моносахаридов к лактозе может катализироваться или гликозилтрансферазами, или гликозидазами, с использованием подходящих активированных моносахаридных субстратов. Кроме того, к лактозе могут быть добавлены дополнительные моносахариды в результате реакций с трансгликозидазой.Typically, enzymatic production methods, as well as biocatalytic reactions for the production of OGM, are based on externally added lactose as the initial acceptor substrate for the resulting OHM. In these methods, one or more monosaccharides are added to lactose (US 7521212 B1; Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334(2) p 97-103). The addition of monosaccharides to lactose can be catalyzed by either glycosyltransferases or glycosidases using suitable activated monosaccharide substrates. In addition, additional monosaccharides may be added to lactose through reactions with transglycosidase.

В частности, ферментативное получение ОГМ оказалось эффективным, поскольку моносахариды, активированные нуклеотидами, которые требуются, но которые сложно синтезировать, предоставлены за счет метаболизма микробных клеток, которые используются. Путь биосинтеза моносахаридов, активированных нуклеотидами, обычно происходит от первичного метаболизма клетки-хозяина на уровне глюкозо-6-фосфата или фруктозо-6-фосфата. Путь биосинтеза в отношении УДФ (уридиндифосфат)-галактозы (УДФ-Gal) происходит от глюкозо-6-фосфата, в то время как биосинтез ГДФ (гуанозиндифосфат)-фукозы, УДФ-N-ацетилглюкозамина и СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты происходит от фукозы-6-фосфата.In particular, the enzymatic production of HGM has proven effective because the monosaccharides activated by the nucleotides that are required but difficult to synthesize are provided by the metabolism of the microbial cells that are used. The biosynthetic pathway for nucleotide-activated monosaccharides typically originates from the host cell's primary metabolism at the level of glucose-6-phosphate or fructose-6-phosphate. The biosynthetic pathway for UDP (uridine diphosphate)-galactose (UDP-Gal) is derived from glucose-6-phosphate, while the biosynthesis of GDP (guanosine diphosphate)-fucose, UDP-N-acetylglucosamine and CMP-N-acetylneuraminic acid is derived from fucose -6-phosphate.

Эффективный биосинтез моносахаридов, активированных нуклеотидами в микробной клетке-хозяине и, следовательно, получение требуемых углеводов посредством ферментативных способов явно основаны на непрерывной подаче сахарофосфатов, таких как глюкозо-6-фосфат и/или фруктозо-6-фосфат.The efficient biosynthesis of nucleotide-activated monosaccharides in the microbial host cell and hence the production of the required carbohydrates by enzymatic routes clearly relies on the continuous supply of sugar phosphates such as glucose-6-phosphate and/or fructose-6-phosphate.

Основной проблемой в указанных ферментативных способах, обычно основанных на потреблении простого и недорогого источника углерода и энергии (например, глицерина, глюкозы, сахарозы) микробной клеткой-хозяином, является ограниченная доступность таких фосфорилированных/активированных сахаридов в указанной клетке-хозяине (например, вследствие конкурирующих реакций), что сильно нарушает поток углевода пути биосинтеза продукта, таким образом, продуктивность данных процессов.A major problem in these enzymatic processes, which typically rely on the consumption of a simple and inexpensive carbon and energy source (e.g., glycerol, glucose, sucrose) by the microbial host cell, is the limited availability of such phosphorylated/activated saccharides in said host cell (e.g., due to competing reactions), which greatly disrupts the flow of carbohydrate in the biosynthetic pathway of the product, thus, the productivity of these processes.

Для преодоления упомянутых выше недостатков разработали улучшенные средства и способы получения ОГМ. Например, в WO 2012/007481 А2 раскрыт сконструированный организм, способный продуцировать сахарид, активированный сахарид, нуклеозид, гликозид, гликолипид и гликопротеин, где указанный сконструированный организм экспрессирует: i) ген, кодирующий гидролазу углевода в комбинации с геном, кодирующим киназу углевода, ii) ген, кодирующий синтазу углевода, или iii) ген, кодирующий фосфорилазу углевода, таким образом, что указанный организм способен расщеплять дисахарид, олигосахарид, полисахарид или их смесь до активированного сахарида и сахарида, и где указанный организм дополнительно генетически модифицирован, таким образом, что по меньшей мере один ген, отличный от любого из вводимых генов указанного организма, сделан менее функциональным или нефункциональным, и где указанный другой ген кодирует фермент, который превращает указанный активированный сахарид в биомассу, и/или биокаталитические ферменты. Указанный сконструированный организм способен образовывать требуемые углеводы, одновременно используя дисахарид, такой как сахароза, олигосахарид, полисахарид или их смесь.To overcome the above-mentioned disadvantages, improved means and methods for obtaining OGM have been developed. For example, WO 2012/007481 A2 discloses an engineered organism capable of producing a saccharide, an activated saccharide, a nucleoside, a glycoside, a glycolipid and a glycoprotein, wherein said engineered organism expresses: i) a gene encoding a carbohydrate hydrolase in combination with a gene encoding a carbohydrate kinase, ii) ) a gene encoding a carbohydrate synthase, or iii) a gene encoding a carbohydrate phosphorylase, such that said organism is capable of degrading a disaccharide, oligosaccharide, polysaccharide, or a mixture thereof into an activated saccharide and saccharide, and wherein said organism is further genetically modified such that at least one gene, different from any of the input genes of the specified organism, is made less functional or non-functional, and where the specified other gene encodes an enzyme that converts the specified activated saccharide into biomass, and/or biocatalytic enzymes. Said engineered organism is capable of producing the required carbohydrates while simultaneously using a disaccharide such as sucrose, oligosaccharide, polysaccharide or a mixture thereof.

Однако, продукция требуемого соединения указанным сконструированным организмом с использованием сахарозы в качестве единственного источника углерода и энергии, имеет большой недостаток, заключающийся в том, что сложно стерилизовать сахарозу. Наиболее требуемым способом стерилизации является тепловая стерилизация. Однако, тепловая стерилизация сахарозы приводит к значительной степени гидролизации, препятствуя применимости способа, описанного в WO 2012/007481 А2.However, production of the desired compound by said engineered organism using sucrose as the sole source of carbon and energy has the great disadvantage that it is difficult to sterilize the sucrose. The most required sterilization method is heat sterilization. However, heat sterilization of sucrose results in a significant degree of hydrolysis, preventing the applicability of the method described in WO 2012/007481 A2.

В качестве альтернативы тепловой стерилизации может быть использована стерильная фильтрация раствора сахарозы, но стерильная фильтрация имеет высокий риск загрязнения, приводящего к росту нетребуемых бактериальных клеток, в частности, при ферментации промышленного масштаба.As an alternative to heat sterilization, sterile filtration of the sucrose solution can be used, but sterile filtration has a high risk of contamination leading to the growth of undesired bacterial cells, particularly in industrial scale fermentations.

Тем не менее, сахароза представляет наиболее привлекательный источник углерода для биотехнологических применений из-за своей доступности и низкой стоимости.However, sucrose represents the most attractive carbon source for biotechnological applications due to its availability and low cost.

Следовательно, требуемо обеспечить микробные клетки для ферментативной продукции требуемого углевода, которые были бы способны продуцировать требуемый углевод при культивации в присутствии недорогого сырья в качестве основного источника углерода и энергии, где указанное сырье не должно быть гидролизовано микробной клеткой, используемого в метаболизме клетки, и способ получения целевого углевода посредством ферментации посредством культивирования указанной микробной клетки в присутствии указанного сырья в качестве главного источника углерода и энергии.Therefore, it is required to provide microbial cells for the enzymatic production of the desired carbohydrate, which would be capable of producing the desired carbohydrate when cultivated in the presence of inexpensive raw materials as the main source of carbon and energy, where said raw materials should not be hydrolyzed by the microbial cell used in the metabolism of the cell, and a method obtaining the target carbohydrate through fermentation by cultivating said microbial cell in the presence of said raw material as the main source of carbon and energy.

Цель достигается тем, что предложены генетически сконструированные микробные клетки, которые способны продуцировать требуемый углевод, при культивировании на сырье из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии, где указанное сырье из смеси моносахаридов состоит из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида, выбранного из группы, состоящей из фруктозы и галактозы, и где микробные клетки обладают повышенной внутриклеточной доступностью по меньшей мере одного сахарофосфата, и посредством предложения способа ферментативной продукции целевого углевода, который включает культивирование указанных генетически сконструированных микробных клеток в присутствии указанного сырья из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии.The goal is achieved by proposing genetically engineered microbial cells that are capable of producing the required carbohydrate when cultivated on a raw material from a mixture of monosaccharides as the main source of carbon and energy, where said raw material from a mixture of monosaccharides consists of glucose and at least one additional monosaccharide selected from the group consisting of fructose and galactose, and wherein the microbial cells have increased intracellular availability of at least one sugar phosphate, and by providing a method for the enzymatic production of a target carbohydrate, which includes culturing said genetically engineered microbial cells in the presence of said raw material from a mixture of monosaccharides as the main source of carbon and energy.

Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention

Согласно первому аспекту предложена генетически сконструированная микробная клетка для продукции целевого углевода, где указанная микробная клетка обладает повышенной внутриклеточной доступностью по меньшей мере одного сахарофосфата и способна продуцировать целевой углевод при культивации в присутствии сырья из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии, где указанное сырье из смеси моносахаридов состоит из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида, выбранного из группы, состоящей из фруктозы и галактозы.According to the first aspect, a genetically engineered microbial cell is provided for the production of a target carbohydrate, wherein said microbial cell has increased intracellular availability of at least one sugar phosphate and is capable of producing the target carbohydrate when cultivated in the presence of raw materials from a mixture of monosaccharides as the main source of carbon and energy, where said raw materials from a mixture of monosaccharides consists of glucose and at least one additional monosaccharide selected from the group consisting of fructose and galactose.

Согласно второму аспекту предложено применение генетически сконструированной микробной клетки, как описано в данном документе, для продукции целевого углевода, где указанную микробную клетку культивируют в присутствии смеси моносахаридов, состоящей из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида из группы фруктозы и галактозы.A second aspect provides the use of a genetically engineered microbial cell, as described herein, for the production of a target carbohydrate, wherein said microbial cell is cultured in the presence of a monosaccharide mixture consisting of glucose and at least one additional monosaccharide from the group of fructose and galactose.

Согласно третьему аспекту предложен способ ферментативного получения целевого углевода, включающий следующие стадии:According to the third aspect, a method is proposed for the enzymatic production of a target carbohydrate, including the following steps:

a) предоставление генетически сконструированной микробной клетки, которая способна продуцировать целевой углевод, где указанная микробная клетка обладает повышенной внутриклеточной доступностью по меньшей мере одного сахарофосфата;a) providing a genetically engineered microbial cell that is capable of producing a target carbohydrate, wherein said microbial cell has increased intracellular availability of at least one sugar phosphate;

b) культивирование указанной генетически сконструированной микробной клетки в культуральной среде, которая является пермиссивной в отношении продукции указанного целевого углевода, где культуральная среда содержит сырье из смеси моносахаридов в качестве главного источника углерода и энергии, где указанное сырье из смеси моносахаридов состоит из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида, выбранного из группы, состоящей из фруктозы и галактозы; иb) cultivating said genetically engineered microbial cell in a culture medium that is permissive for the production of said target carbohydrate, wherein the culture medium contains a mixture of monosaccharides as the main source of carbon and energy, wherein the mixture of monosaccharides consists of glucose and at least at least one additional monosaccharide selected from the group consisting of fructose and galactose; And

с) выделение указанного целевого углевода.c) isolating said target carbohydrate.

В четвертом аспекте предложено применение целевого углевода, который продуцирован генетически сконструированной микробной клеткой и/или способом, описанным в данном документе, для изготовления фармацевтической и/или пищевой композиции.The fourth aspect provides the use of a target carbohydrate that is produced by a genetically engineered microbial cell and/or a method described herein for the manufacture of a pharmaceutical and/or food composition.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

На Фиг. 1 показано схематическое представление иллюстративной микробной клетки дикого типа (например, Е. coli), иллюстрирующее встречающиеся в природе метаболические пути, приводящие к и происходящие от сахарофосфатов фруктозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат.In FIG. 1 is a schematic representation of an exemplary wild-type microbial cell (eg, E. coli) illustrating the naturally occurring metabolic pathways leading to and from the sugar phosphates fructose-1-phosphate and glucose-6-phosphate.

На Фиг. 2 показано схематическое представление иллюстративной генетически модифицированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата.In FIG. 2 is a schematic representation of an exemplary genetically modified microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose-6-phosphate.

На Фиг. 3 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата.In FIG. 3 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose-6-phosphate.

На Фиг. 4 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата.In FIG. 4 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose-6-phosphate.

На Фиг. 5 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.In FIG. 5 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose-6-phosphate and increased availability of intracellular fructose-6-phosphate.

На Фиг. 6 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.In FIG. 6 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose-6-phosphate and increased availability of intracellular fructose-6-phosphate.

На Фиг. 7 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.In FIG. 7 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose-6-phosphate and increased availability of intracellular fructose-6-phosphate.

На Фиг. 8 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.In FIG. 8 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose-6-phosphate and increased availability of intracellular fructose-6-phosphate.

На Фиг. 9 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.In FIG. 9 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose-6-phosphate and increased availability of intracellular fructose-6-phosphate.

На Фиг. 10 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточной глюкозы, глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата.In FIG. 10 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, showing genetic modifications resulting in increased availability of intracellular glucose, glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate.

На Фиг. 11 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточной маннозы и/или маннозо-6 фосфата.In FIG. 11 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, indicating genetic modifications resulting in increased availability of intracellular mannose and/or mannose-6 phosphate.

На Фиг. 12 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности галактозо-1-фосфата и фруктозо-6-фосфата.In FIG. 12 is a schematic representation of yet another illustrative embodiment of a genetically engineered microbial cell of the invention, showing genetic modifications resulting in increased availability of galactose-1-phosphate and fructose-6-phosphate.

На Фиг. 13 изображены характеристики роста штаммов Е. coli во время культивирования на глюкозе (А) или на сырье из смеси моносахаридов, состоящем из глюкозы и фруктозы (В) в качестве единственного источника углерода и энергии.In FIG. 13 depicts the growth characteristics of E. coli strains during cultivation on glucose (A) or on a monosaccharide mixture feedstock consisting of glucose and fructose (B) as the sole source of carbon and energy.

Подробное описаниеDetailed description

Согласно первому аспекту предложена генетически сконструированная микробная клетка, которая способна продуцировать целевой углевод. В дополнительном воплощении целевой углевод представляет собой углевод, который не встречается в природе в клетке-предшественнике дикого типа генетически сконструированной микробной клетки.According to the first aspect, a genetically engineered microbial cell is provided that is capable of producing a target carbohydrate. In a further embodiment, the target carbohydrate is a carbohydrate that does not naturally occur in a wild-type progenitor cell of the genetically engineered microbial cell.

Микробная клетка обладает повышенной внутриклеточной доступностью по меньшей мере одного сахарофосфата, по сравнению с внутриклеточной доступностью указанного по меньшей мере одного сахарофосфата в соответствующей клетке дикого типа. Генетически сконструированная микробная клетка способна продуцировать указанный целевой углевод и продуцирует указанный целевой углевод при культивировании в культуральной среде, содержащей сырье из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии для микробной клетки, где сырье из смеси моносахаридов состоит из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида, выбранного из группы, состоящей из фруктозы и галактозы.The microbial cell has increased intracellular availability of the at least one sugar phosphate compared to the intracellular availability of the at least one sugar phosphate in a corresponding wild-type cell. A genetically engineered microbial cell is capable of producing said target carbohydrate and produces said target carbohydrate when cultivated in a culture medium containing a monosaccharide mixture feedstock as the primary source of carbon and energy for the microbial cell, wherein the monosaccharide mixture feedstock consists of glucose and at least one additional a monosaccharide selected from the group consisting of fructose and galactose.

Генетически сконструированная микробная клетка способна продуцировать целевой углевод благодаря генетическому конструированию. Следовательно, генетически сконструированная микробная клетка экспрессирует один или более гетерологичных генов, где активность полипептида(ов),кодируемого(ых) указанным(и) гетерологичным(и) геном(ами), дает возможность микробной клетке синтезировать целевой углевод.A genetically engineered microbial cell is capable of producing a target carbohydrate due to genetic engineering. Therefore, the genetically engineered microbial cell expresses one or more heterologous genes, wherein the activity of the polypeptide(s) encoded by said heterologous gene(s) enables the microbial cell to synthesize the target carbohydrate.

Термин «функциональный ген», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок или полипептид, и которая также содержит регуляторные последовательности, функционально связанные с указанной нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, таким образом, что нуклеотидная последовательность, которая кодирует данный белок или полипептид, может экспрессироваться в микробной клетке/микробной клеткой, несущей указанный функциональный ген. Таким образом, при культивации в условиях, которые являются пермиссивными в отношении экспрессии функционального гена, указанный функциональный ген экспрессируется, и микробная клетка, экспрессирующая указанный функциональный ген, обычно содержит белок или полипептид, который кодируется областью, кодирующей белок, функционального гена. В том виде, в котором они используются в данном документе, термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» относятся к полимеру из дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов или в одно- или двухцепочечной форме и, если не ограничено иным образом, охватывают известные аналоги природных нуклеотидов, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами образом, похожим на нуклеотиды, встречающиеся в природе. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты включает ее комплементарную последовательность.The term "functional gene", as used herein, refers to a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence that encodes a protein or polypeptide, and which also contains regulatory sequences operably linked to said nucleotide sequence encoding the protein , such that the nucleotide sequence that encodes the protein or polypeptide can be expressed in the microbial cell/microbial cell carrying the specified functional gene. Thus, when cultured under conditions that are permissive for expression of a functional gene, the functional gene is expressed, and the microbial cell expressing the functional gene typically contains a protein or polypeptide that is encoded by the protein coding region of the functional gene. As used herein, the terms “nucleic acid” and “polynucleotide” refer to a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides, either in single- or double-stranded form and, unless otherwise limited, cover known analogues of naturally occurring nucleotides that hybridize with nucleic acids in a manner similar to nucleotides found in nature. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence includes its complementary sequence.

Термин «функционально связанный», в том виде, в котором он используется в данном документе, будет означать функциональную связь между нуклеотидной последовательностью контроля экспрессии (такой как промотор, сигнальная последовательность или ряд сайтов связывания транскрипционных факторов) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где последовательность контроля экспрессии влияет на транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности. Соответственно, термин «промотор» обозначает последовательности ДНК, которые обычно «предшествуют» гену в ДНК-полимере и обеспечивают сайт инициации транскрипции в мРНК. «Регуляторные» последовательности ДНК, также обычно расположенные «выше» (то есть, предшествуя) гена в данном ДНК-полимере, связывают белки, которые определяют частоту (или скорость) инициации транскрипции. В совокупности называемые «промоторной/регуляторной» ДНК-последовательностью или ДНК-последовательностью «контроля», данные последовательности, которые предшествуют выбранному гену (или серии генов) в функциональном ДНК-полимере способствуют определению того, будет ли происходить транскрипция (и в конечном итоге экспрессия) гена. Последовательности ДНК, которые «следуют за» геном в ДНК-полимере и обеспечивают сигнал для терминации транскрипции в мРНК, называются последовательностями, «терминирующими» транскрипцию.The term "operably linked", as used herein, will mean a functional relationship between an expression control nucleotide sequence (such as a promoter, a signal sequence, or a series of transcription factor binding sites) and a second nucleic acid sequence, where the control sequence expression affects the transcription and/or translation of a nucleic acid corresponding to the second sequence. Accordingly, the term “promoter” refers to DNA sequences that typically “precede” a gene in a DNA polymer and provide the transcription initiation site for mRNA. "Regulatory" DNA sequences, also usually located "upstream" (that is, preceding) the gene in a given DNA polymer, bind proteins that determine the frequency (or speed) of transcription initiation. Collectively referred to as a "promoter/regulatory" DNA sequence or a "control" DNA sequence, these sequences that precede a selected gene (or series of genes) in a functional DNA polymer help determine whether transcription (and ultimately expression) will occur ) gene. The DNA sequences that “follow” the gene in the DNA polymer and provide the signal to terminate transcription in the mRNA are called transcription termination sequences.

Термин «рекомбинантный», в том виде, в котором он используется в данном документе со ссылкой на бактериальную клетку-хозяина, указывает на то, что бактериальная клетка реплицирует гетерологичную нуклеиновую кислоту или экспрессирует пептид или белок, кодируемый гетерологичной нуклеиновой кислотой (а именно, последовательностью, которая является «чужеродной в отношении указанной клетки»). Рекомбинантные клетки могут содержать гены, которые не обнаружены в нативной (нерекомбинантной) форме клетки. Рекомбинантные клетки могут также содержать гены, обнаруженные в нативной форме клетки, где гены модифицированы и повторно введены в клетку искусственными средствами. Термин также охватывает клетки, которые содержат нуклеиновую кислоту, эндогенную в отношении клетки, которая была модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты изданной клетки; такие модификации включают модификации, полученные посредством замены генов, сайт-специфичной мутации и родственных методик. Соответственно, «рекомбинантный полипептид» представляет собой полипептид, который получен посредством рекомбинантной клетки. Термин «гетерологичная последовательность» или «гетерологичная нуклеиновая кислота», в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой последовательность или нуклеиновую кислоту, которая происходит из источника, чужеродного в отношении конкретной клетки-хозяина (например, из отличного вида), или, если из одного и того же источника, модифицирована, по сравнению со своей исходной формой. Таким образом, гетерологичная нуклеиновая кислота, функционально связанная с промотором, происходит из источника, отличного от источника, из которого происходит промотор, или, если из одного и того же источника, модифицирована, по сравнению со своей исходной формой. Гетерологичная последовательность может быть стабильно введена, например, посредством трансфекции, трансформации, конъюгации или трансдукции, в геном клетки микроорганизма - хозяина, где могут применяться методики, которые будут зависеть от клетки-хозяина, в которую должна быть введена данная последовательность. Разные методики известны специалисту в данной области и раскрыты, например, в Sambrook et a/., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).The term “recombinant,” as used herein with reference to a bacterial host cell, indicates that the bacterial cell replicates a heterologous nucleic acid or expresses a peptide or protein encoded by a heterologous nucleic acid (namely, a sequence , which is “foreign to the specified cell”). Recombinant cells may contain genes that are not found in the native (non-recombinant) form of the cell. Recombinant cells may also contain genes found in the native form of the cell, where the genes are modified and reintroduced into the cell by artificial means. The term also covers cells that contain a nucleic acid endogenous to the cell that has been modified without removing the nucleic acid from the cell; such modifications include modifications obtained through gene replacement, site-specific mutation and related techniques. Accordingly, a “recombinant polypeptide” is a polypeptide that is produced by a recombinant cell. The term "heterologous sequence" or "heterologous nucleic acid", as used herein, is a sequence or nucleic acid that is derived from a source foreign to a particular host cell (e.g., from a different species) , or, if from the same source, modified from its original form. Thus, the heterologous nucleic acid operably linked to a promoter comes from a source different from that of the promoter or, if from the same source, is modified from its original form. A heterologous sequence can be stably introduced, for example, by transfection, transformation, conjugation or transduction, into the genome of a host microbial cell, where techniques may be used that will depend on the host cell into which the sequence is to be introduced. Various techniques are known to one skilled in the art and are disclosed, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Соответственно, под «генетически сконструированной клеткой-хозяином» или «генетически сконструированной микробной клеткой» понимают бактериальную клетку или дрожжевую клетку, которая трансформирована или трансфицирована, или способна к трансформации или трансфекции экзогенной полинуклеотидной последовательностью.Accordingly, by “genetically engineered host cell” or “genetically engineered microbial cell” is meant a bacterial cell or yeast cell that is transformed or transfected, or capable of transformation or transfection, with an exogenous polynucleotide sequence.

Таким образом, последовательности нуклеиновых кислот, как использовано в настоящем изобретении, могут, например, содержаться в векторе, которым нужно стабильно трансформировать/трансфицировать клетки-хозяев а микроорганизма или который должен быть иным образом в них введен.Thus, nucleic acid sequences as used in the present invention may, for example, be contained in a vector that is to be stably transformed/transfected into or otherwise introduced into host cells of a microorganism.

Огромное многообразие экспрессионных систем может использоваться для получения полипептидов по изобретению. Такие векторы включают, среди прочих, хромосомные, эписомальные векторы и векторы, происходящие из вирусов, например, векторы, происходящие из бактериальных плазмид, из бактериофага, из транспозонов, из эписом дрожжей, из инсерционных элементов, из хромосомных элементов дрожжей, из вирусов, и векторы, происходящие из их комбинаций, такие как векторы, происходящие из генетических элементов плазмид и бактериофагов, как например, космиды и фагмиды. Конструкции экспрессионных систем могут содержать регуляторные области, которые осуществляют регуляцию, а также вызывают экспрессию. Обычно, любую систему или вектор, подходящий для сохранения, размножения или экспрессии полинуклеотидов и для синтеза полипептида в хозяине, можно использовать для экспрессии в данном отношении. Соответствующая последовательность ДНК может быть вставлена в экспрессионную систему любой из множества хорошо известных и рутинных методик, таких как, например, методики, изложенные в Sambrook et al., см. выше.A wide variety of expression systems can be used to produce the polypeptides of the invention. Such vectors include, but are not limited to, chromosomal, episomal, and viral-derived vectors, for example, vectors derived from bacterial plasmids, bacteriophage, transposons, yeast episomes, insertion elements, yeast chromosomal elements, viruses, and vectors derived from combinations thereof, such as vectors derived from genetic elements of plasmids and bacteriophages, such as cosmids and phagemids. Expression system constructs may contain regulatory regions that regulate as well as induce expression. Generally, any system or vector suitable for storing, propagating or expressing polynucleotides and for synthesizing the polypeptide in a host can be used for expression in this regard. The appropriate DNA sequence can be inserted into the expression system by any of a variety of well known and routine techniques, such as, for example, the techniques set forth in Sambrook et al., supra.

Данная область богата патентными и литературными публикациями, относящимся к методам «генной инженерии» для выделения, синтеза, очистки и амплификации генетического материала для применения в трансформации выбранных организмов-хозяев. Таким образом, общеизвестна трансформация организмов-хозяев «гибридной» вирусной или кольцевой плазмидной ДНК, которая включает выбранные экзогенные (то есть, чужеродные или «гетерологичные») ДНК-последовательности. Способы, известные в данной области, прежде всего, включают создание вектора трансформации посредством ферментативного расщепления кольцевой вирусной или плазмидной ДНК с образованием цепей линейной ДНК. Выбранные чужеродные цепи ДНК, обычно включающие последовательности, кодирующие требуемый белковый продукт, получают в линейной форме посредством использования одних и тех же/похожих ферментов. Линейную вирусную или плазмидную ДНК инкубируют с чужеродной ДНК в присутствии лигирующих ферментов, способных воздействовать на процесс восстановления, и образуются «гибридные» векторы, которые включают выбранный экзогенный сегмент ДНК, «сплайсированный» в вирусную или кольцевую ДНК-плазмиду.The field is rich in patents and literature related to “genetic engineering” techniques for isolating, synthesizing, purifying, and amplifying genetic material for use in the transformation of selected host organisms. Thus, it is common knowledge to transform host organisms with “hybrid” viral or circular plasmid DNA that includes selected exogenous (ie, foreign or “heterologous”) DNA sequences. Methods known in the art primarily involve creating a transformation vector by enzymatic cleavage of circular viral or plasmid DNA to form linear DNA strands. Selected foreign DNA strands, typically comprising sequences encoding the desired protein product, are produced in linear form through the use of the same/similar enzymes. Linear viral or plasmid DNA is incubated with foreign DNA in the presence of ligating enzymes that can affect the repair process, and “hybrid” vectors are formed that include a selected exogenous DNA segment “spliced” into the viral or circular DNA plasmid.

Термин «нуклеотидная последовательность, кодирующая...» обычно относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК, и обычно представляет часть гена, которая кодирует определенный полипептид или белок. Термин включает, без ограничения, одно- и двухцепочечную ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков или одно-, двух- и трехцепочечных участков, одно- и двухцепочечную РНК, и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцеп очечных участков, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут представлять собой одно цепочечные или более типично двухцепочечные или трехцепочечные участки, или смесь одно- и двухцепочечных участков. Термин также охватывает полинуклеотиды, которые включают один единственный непрерывный участок или прерывистые участки, кодирующие полипептид (например, прерывающиеся встроенным фагом или вставкой последовательности или редактированием), вместе с дополнительными участками, которые также могут содержать кодирующие и/или некодирующие последовательности.The term "nucleotide sequence encoding..." generally refers to any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, which may be unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA, and typically represents the portion of a gene that encodes a particular polypeptide or protein. The term includes, without limitation, single- and double-stranded DNA, DNA that is a mixture of single- and double-stranded regions or single-, double-, and triple-stranded regions, single- and double-stranded RNA, and RNA that is a mixture of single- and double-stranded regions. point regions, hybrid molecules containing DNA and RNA, which may be single-stranded or more typically double-stranded or triple-stranded regions, or a mixture of single- and double-stranded regions. The term also includes polynucleotides that include a single continuous region or discontinuous regions encoding a polypeptide (eg, interrupted by insertion of phage or sequence insertion or editing), together with additional regions that may also contain coding and/or non-coding sequences.

Термин «вариант(ы)», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полинуклеотиду или полипептиду, который отличается от референсного полинуклеотида или полипептида, соответственно, но сохраняет существенные (ферментативные) свойства референсного полинуклеотида или полипептида. Типичный вариант полинуклеотида отличается по нуклеотидной последовательности от другого, референсного полинуклеотида. Изменения в нуклеотидной последовательности варианта могут менять или могут не менять аминокислотную последовательность полипептида, кодируемого референсным полинуклеотидом. Изменения в нуклеотидах могут приводить к аминокислотным заменам, присоединениям, делециям, слияниям и усечениям в полипептиде, кодируемом референсной последовательностью, как обсуждается ниже. Типичный вариант полинуклеотида отличается по аминокислотной последовательности от другого, референсного полипептида. Обычно, различия ограничены таким образом, что последовательности референсного полипептида и варианта сильно похожи по всей длине и, во многих участках, идентичны. Вариант и референсный полипептид может отличаться в аминокислотной последовательности одной или более заменами, присоединениями, делециями в любой комбинации. Служащий заменой или вставленный остаток аминокислоты может представлять собой или может не представлять собой остаток аминокислоты, кодируемый генетическим кодом. Вариант полинуклеотида или полипептида может являться встречающимся в природе, таким как аллельный вариант, или он может представлять собой вариант, который не известно, чтобы встречался в природе. Варианты полинуклеотидов или полипептидов, не встречающиеся в природе, могут быть созданы методиками мутагенеза посредством прямого синтеза и другими методами генной инженерии, известными специалистам в данной области.The term “variant(s)”, as used herein, refers to a polynucleotide or polypeptide that is different from the reference polynucleotide or polypeptide, respectively, but retains the essential (enzymatic) properties of the reference polynucleotide or polypeptide. A typical polynucleotide variant differs in nucleotide sequence from another, reference polynucleotide. Changes in the nucleotide sequence of the variant may or may not change the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the reference polynucleotide. Changes in nucleotides can result in amino acid substitutions, additions, deletions, fusions and truncations in the polypeptide encoded by the reference sequence, as discussed below. A typical polynucleotide variant differs in amino acid sequence from another, reference polypeptide. Typically, differences are limited such that the sequences of the reference polypeptide and the variant are highly similar over their entire length and, in many regions, identical. The variant and reference polypeptide may differ in amino acid sequence by one or more substitutions, additions, deletions in any combination. The substituted or inserted amino acid residue may or may not be an amino acid residue encoded by the genetic code. A polynucleotide or polypeptide variant may be a naturally occurring variant, such as an allelic variant, or it may be a variant that is not known to occur in nature. Variants of polynucleotides or polypeptides not found in nature can be created by direct synthesis mutagenesis techniques and other genetic engineering techniques known to those skilled in the art.

В пределах объема настоящего изобретения, данными терминами также охвачены нуклеотидные/полинуклеотидные и полипептидные полиморфные варианты, аллели, мутанты и межвидовые гомологи, которые имеют аминокислотную последовательность, которая обладает более чем примерно 60%-ной идентичностью аминокислотных последовательностей, 65%-ной, 70%-ной, 75%-ной, 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, предпочтительно 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной или более высокой идентичностью аминокислотных последовательностей, предпочтительно, на протяжении участка из по меньшей мере примерно 25, 50, 100, 200, 500, 1000 или более аминокислот, с полипептидом, кодируемым белком дикого типа.Within the scope of the present invention, these terms also include nucleotide/polynucleotide and polypeptide polymorphic variants, alleles, mutants and interspecies homologs that have an amino acid sequence that has greater than about 60% amino acid sequence identity, 65%, 70% -th, 75%, 80%, 85%, 90%, preferably 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% or 99% or greater amino acid sequence identity, preferably over a region of at least about 25, 50, 100, 200, 500, 1000 or more amino acids, with the polypeptide encoded by the wild-type protein.

Соответственно, термин «функциональный вариант» любого из генов/белков, раскрытых в данном документе, предназначен для обозначения вариантов последовательностей генов/белков, все еще сохраняющих такую же или несколько меньшую активность гена или белка, из которого происходит соответствующий фрагмент.Accordingly, the term “functional variant” of any of the genes/proteins disclosed herein is intended to refer to gene/protein sequence variants that still retain the same or slightly less activity of the gene or protein from which the corresponding fragment is derived.

Генетически сконструированная микробная клетка обладает по меньшей мере одним транспортером моносахарида для транслокации по меньшей мере одного моносахарида из культуральной среды, в которой указанная микробная клетка культивируется, в ее цитоплазму. Указанный по меньшей мере один транспортер моносахарида транслоцирует моносахарид, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы и галактозы.A genetically engineered microbial cell has at least one monosaccharide transporter for translocation of at least one monosaccharide from the culture medium in which the microbial cell is cultured into its cytoplasm. Said at least one monosaccharide transporter translocates a monosaccharide selected from the group consisting of glucose, fructose and galactose.

Моносахарид, который транслоцирован через плазматическую мембрану, должен быть фосфорилирован для того, чтобы стать доступным для метаболизма клетки. В зависимости от транспортера моносахарида, который транслоцировал моносахарид через мембрану клетки, моносахарид(ы) или непосредственно фосфорилирован(ы), а именно, при переносе в клетку, или впоследствии фосфорилирован(ы) подходящей киназой. Транслокация моносахарида посредством транспорта, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (PEP-PTS - от англ. phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase) приводит к прямому фосфорилированию, тогда как транслокация моносахарида посредством транспорта, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS) требует последующего фосфорилирования моносахарида внутриклеточной киназой.A monosaccharide that is translocated across the plasma membrane must be phosphorylated in order to become available for cell metabolism. Depending on the monosaccharide transporter that translocated the monosaccharide across the cell membrane, the monosaccharide(s) are either directly phosphorylated, namely, upon transport into the cell, or subsequently phosphorylated(s) by a suitable kinase. Monosaccharide translocation via phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-dependent transport (PEP-PTS) results in direct phosphorylation, whereas monosaccharide translocation via phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent transport (PEP-PTS independent) requires subsequent phosphorylation monosaccharide intracellular kinase.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении микробная клетка содержит систему фосфотрансферазы, транслоцирующую глюкозу (PTsG - от англ. glucose-translocating phosphotransferase system). Система фосфотрансферазы, транслоцирующая глюкозу, катализирует фосфорилирование поступающей глюкозы одновременно с ее транслокацией через клеточную мембрану.In an additional and/or alternative embodiment, the microbial cell contains a phosphotransferase system that translocates glucose (PTsG - from the English glucose-translocating phosphotransferase system). The glucose translocating phosphotransferase system catalyzes the phosphorylation of incoming glucose simultaneously with its translocation across the cell membrane.

Общий механизм системы Pts заключается в следующем: фосфорильная группа от фосфоренолпирувата (PEP - от англ. phosphoenolpyruvate) переносится посредством пути передачи сигнала к ферменту I (EI - от англ. enzyme I), который, в свою очередь, переносит ее к переносчику фосфорила, белку, богатому гистидином (HPr от англ. histidine protein). Затем фосфо-HPr переносит фосфорильную группу к пермеазе, специфичной в отношении сахара, мембаносвязанному комплексу, известному как фермент 2 (EII - от англ. enzymes II), который транспортирует сахар к клетке. EII состоит по меньшей мере из трех структурно различных доменов IIA, IIB и IIC. Данные домены могут быть либо слиты вместе в одну единственную полипептидную цепь, либо существовать в виде двух или трех взаимосвязанных цепей, ранее называемых ферментами II (EII) и III (EIII).The general mechanism of the Pts system is as follows: the phosphoryl group from phosphoenolpyruvate (PEP) is transferred through the signal transduction pathway to enzyme I (EI), which in turn transfers it to the phosphoryl transporter, histidine-rich protein (HPr from English histidine protein). Phospho-HPr then transfers the phosphoryl group to a sugar-specific permease, a membrane-bound complex known as enzyme 2 (EII), which transports the sugar to the cell. EII consists of at least three structurally distinct domains IIA, IIB and IIC. These domains can either be fused together into one single polypeptide chain or exist as two or three interconnected chains, formerly called enzymes II (EII) and III (EIII).

Первый домен (IIA или EIIA) несет первый сайт фосфорилирования, специфичный в отношении пермеазы, гистидин, который фосфорилируется фосфо-HPr. Второй домен (IIB или EIIB) фосфорилируется фосфо-IIA на остатке цистеинила или гистидила, в зависимости от транспортируемого сахара. Наконец, фосфорильная группа переносится от домена IIB на субстрат-сахар, одновременно с поглощением сахара при участии домена IIC. Данный третий домен (IIC или EIIC) образует канал транслокации и специфичный сайт связывания субстрата.The first domain (IIA or EIIA) carries the first permease-specific phosphorylation site, histidine, which is phosphorylated by phospho-HPr. The second domain (IIB or EIIB) is phosphorylated by phospho-IIA on a cysteinyl or histidyl residue, depending on the sugar being transported. Finally, the phosphoryl group is transferred from domain IIB to the sugar substrate, simultaneously with the uptake of the sugar by domain IIC. This third domain (IIC or EIIC) forms a translocation channel and a specific substrate binding site.

Таким образом, система PtsG получает глюкозу извне и предоставляет глюкозо-6-фосфат в микробной клетке. Глюкозо-6-фосфат может утилизироваться в пути биосинтеза УДФ-галактозы и/или превращаться во фруктозо-6-фосфат, который, в свою очередь, может быть использован для образования высокоэнергетических трифосфатов в центральном метаболизме и/или, например, в биосинтезе сахаридов, активированных нуклеотидом, таких как ГДФ-фукоза.Thus, the PtsG system receives glucose from the outside and provides glucose-6-phosphate in the microbial cell. Glucose-6-phosphate can be utilized in the UDP-galactose biosynthesis pathway and/or converted to fructose-6-phosphate, which in turn can be used to form high-energy triphosphates in central metabolism and/or, for example, in saccharide biosynthesis, nucleotide-activated, such as GDP-fucose.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка содержит транспортер фруктозы для осуществления транслокации фруктозы (Fru - от англ. fructose) из культуральной среды в цитоплазму микробной клетки. Подходящий транспортер фруктозы для поглощения свободной фруктозы представляет собой изоформу (PtsG-F), как описано Kornberg et al. PNAS 97: 1808-1812 (2000)).In an additional and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell contains a fructose transporter to effect the translocation of fructose from the culture medium into the cytoplasm of the microbial cell. A suitable fructose transporter for free fructose uptake is the (PtsG-F) isoform as described by Kornberg et al. PNAS 97: 1808-1812 (2000)).

Поглощенная фруктоза может быть затем фосфорилирован а фруктокиназой (FrK - от англ. fructokinase) с обеспечением фруктозо-6-фосфата (Fru-6-P). Фруктозо-6-фосфат может быть утилизирован в пути биосинтеза УДФ-галактозы и/или в других метаболических путях, как например, образование высокоэнергетических трифосфатов в центральном метаболизме и/или, например, в биосинтезе сахаридов, активированных нуклеотидом, таких как ГДФ-фукоза.The absorbed fructose can then be phosphorylated by fructokinase (FrK) to provide fructose-6-phosphate (Fru-6-P). Fructose-6-phosphate can be utilized in the UDP-galactose biosynthesis pathway and/or in other metabolic pathways, such as the formation of high-energy triphosphates in central metabolism and/or, for example, in the biosynthesis of nucleotide-activated saccharides such as GDP-fucose.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка содержит фосфотрансферазную систему, транслоцирующую фруктозу (PtsF). Фосфотрансферазная система, транслоцирующая фруктозу, катализирует фосфорилирование поступающей фруктозы, одновременно с ее транслокацией через клеточную мембрану.In an additional and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell contains a fructose translocating phosphotransferase system (PtsF). The fructose translocating phosphotransferase system catalyzes the phosphorylation of incoming fructose, simultaneously with its translocation across the cell membrane.

Таким образом, система PtsF приобретает фруктозу извне и обеспечивает фруктозо-1-фосфат в микробной клетке. Система PtsF содержит трансмембранный белок FruA, 1-фосфофруктокиназу (FruK - от англ. phosphofructose kinase) и белок-переносчик дифосфорила FruB. Фруктоза транслоцируется посредством FruA и FruB с обеспечением фруктозо-1-фосфата в цитоплазме. Фруктозо-1-фосфат может быть дополнительно фосфорилирован фосфофруктокиназой (FruK) с получением фруктозо-1,6-бифосфата, который, в свою очередь, может быть использован микробной клеткой для образования высокоэнергетических трифосфатов в центральном метаболизме.Thus, the PtsF system acquires fructose from outside and provides fructose-1-phosphate in the microbial cell. The PtsF system contains the transmembrane protein FruA, 1-phosphofructokinase (FruK - from the English phosphofructose kinase) and the diphosphoryl transfer protein FruB. Fructose is translocated through FruA and FruB to provide fructose-1-phosphate in the cytoplasm. Fructose-1-phosphate can be further phosphorylated by phosphofructokinase (FruK) to produce fructose-1,6-bisphosphate, which in turn can be used by the microbial cell to form high-energy triphosphates in central metabolism.

Еще одна подходящая система PtsF содержит LevD, LevE, LevF и LevG. LevD представляет собой компонент фермента IIA - фосфотрансферазы, специфичной в отношении фруктозы. LevE представляет собой компонент фермента IIB -фосфотрансферазы, специфичной в отношении фруктозы. LevF представляет собой компонент фруктозопермеазы IIC, LevG представляет собой компонент фруктозопермеазы IID. Соответствующие гены levD, levE, levF и levG, как известно, происходят, например, из Bacillus subtilis (штамм 168). Указанная система PtsF обеспечивает фруктозо-1-фосфат в клетке.Another suitable PtsF system contains LevD, LevE, LevF and LevG. LevD is a component of enzyme IIA, a fructose-specific phosphotransferase. LevE is a component of the fructose-specific enzyme IIB-phosphotransferase. LevF is a component of fructose permease IIC, LevG is a component of fructose permease IID. The corresponding genes levD, levE, levF and levG are known to originate, for example, from Bacillus subtilis (strain 168). This PtsF system provides fructose-1-phosphate in the cell.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза УДФ-галактозы для внутриклеточного образования УДФ-галактозы (УДФ-Gal). УДФ-галактоза требуется в качестве субстрата для галактозилтрансфераз, где активность указанных галактозилтрансфераз может приводить к образованию галактозилированных дисахаридов или галактозилированных олигосахаридов.In an additional and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell has a UDP-galactose biosynthetic pathway to produce UDP-galactose (UDP-Gal) intracellularly. UDP-galactose is required as a substrate for galactosyltransferases, where the activity of these galactosyltransferases can lead to the formation of galactosylated disaccharides or galactosylated oligosaccharides.

УДФ-галактоза может обеспечиваться встречающимся в природе метаболизмом микробных клеток, а именно, активностью фосфоглюкомутазы, катализирующей взаимопревращение глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6-фосфата, УТФ (уридинтрифосфат)-глюкозо-1-фосфат-уридилтрансферазы, которая катализирует образование УДФ-глюкозы из глюкозо-1-фосфата и УТФ, и УДФ-глюкозо-4-эпимеразы, катализирующей обратимое превращение УДФ-глюкозы в УДФ-галактозу.UDP-galactose can be provided by naturally occurring metabolism of microbial cells, namely, the activity of phosphoglucomutase, which catalyzes the interconversion of glucose-1-phosphate and glucose-6-phosphate, UTP (uridine triphosphate)-glucose-1-phosphate-uridyltransferase, which catalyzes the formation of UDP- glucose from glucose-1-phosphate and UTP, and UDP-glucose-4-epimerase, which catalyzes the reversible conversion of UDP-glucose to UDP-galactose.

Внутриклеточная поставка УДФ-галактозы может быть улучшена посредством генной инженерии в том отношении, что один или более из генов, кодирующих фосфоглюкомутазу, УДФ-глюкозо-1-фосфат-уридилтрансферазу, УДФ-глюкозо-4-эпимеразу и их функциональные варианты, сверхэкспрессируются, и/или в том отношении, что одна или более дополнительных копий одного или более из генов, кодирующих фосфоглюкомутазу, УДФ-глюкозо-1-фосфат-уридилтранферазу, УДФ-глюкозо-4-эпимеразу и их функциональные варианты, экспрессируются в микробной клетке. Примером гена, кодирующего фосфоглюкомутазу, является ген pgm (№доступа NP_415214), обнаруженный в Е. coli K-12, примером гена, кодирующего УДФ-глюкозо-1-фосфат-уридилтранферазу, является ген Е, coli galU (№доступа NP_415752), обнаруженный в Е, coli K-12, и примером гена, кодирующего УДФ-глюкозо-4-эпимеразу, является ген Е, coli galE (NP_415280), обнаруженный в Е, coli K-12.The intracellular supply of UDP-galactose can be improved by genetic engineering in that one or more of the genes encoding phosphoglucomutase, UDP-glucose-1-phosphate-uridyltransferase, UDP-glucose-4-epimerase and functional variants thereof are overexpressed, and /or in that one or more additional copies of one or more of the genes encoding phosphoglucomutase, UDP-glucose-1-phosphate-uridyl transferase, UDP-glucose-4-epimerase and functional variants thereof are expressed in the microbial cell. An example of a gene encoding phosphoglucomutase is the pgm gene (accession no. NP_415214), found in E. coli K-12, an example of a gene encoding UDP-glucose-1-phosphate uridyl transferase is the E gene, coli galU (accession no. NP_415752), found in E, coli K-12, and an example of a gene encoding UDP-glucose-4-epimerase is the E, coli galE gene (NP_415280) found in E, coli K-12.

Термин «сверхэкспрессия» или «сверхэкспрессируемый», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к уровню экспрессии фермента или полипептида, который выше, чем уровень, который измеряют в клетке-предшественнике дикого типа, а именно клетке того же вида, как и генетически сконструированная микробная клетка и клетка, которая не была генетически изменена.The term "overexpressed" or "overexpressed", as used herein, refers to a level of expression of an enzyme or polypeptide that is higher than the level measured in a wild-type progenitor cell, namely a cell of the same species , as well as a genetically engineered microbial cell and a cell that has not been genetically modified.

Дополнительно и/или в качестве альтернативы, внутриклеточная поставка УДФ-галактозы может быть достигнута или улучшена подачей галактозы в микробные клетки посредством культуральной среды, в которой культивируют указанную микробную клетку. Подаваемая извне галактоза поглощается микробной клеткой и впоследствии фосфорилируется до галактозо-1-фосфата, который затем превращается в УДФ-галактозу. В данном пути биосинтеза ГДФ-галактозы гены, кодирующие ферменты, обладающие требуемыми ферментативными активностями, известны в литературе (Groissoird et al., «Characterization, Expression, and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes, Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway» (2003) J. Bacteriol. 185(3) 870-878). Ген galP (№доступа NP_417418) кодирует галактозный-протонный симпортер. Ген galM (№доступа NP_415277) кодирует альдозо-1-эпимеразу, ген galK (№доступа NP_415278) - галактокиназу, ген galT (№досптупа NP_415279) - галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазу и ген galE -УДФ-галактозо-4-эпимеразу.Additionally and/or alternatively, intracellular delivery of UDP-galactose can be achieved or improved by supplying galactose to microbial cells through the culture medium in which said microbial cell is cultured. Externally supplied galactose is taken up by the microbial cell and subsequently phosphorylated to galactose-1-phosphate, which is then converted to UDP-galactose. In this pathway of GDP-galactose biosynthesis, genes encoding enzymes having the required enzymatic activities are known in the literature (Groissoird et al., “Characterization, Expression, and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes, Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway” ( 2003) J Bacteriol 185(3) 870-878). The galP gene (accession no. NP_417418) encodes a galactose-proton symporter. The galM gene (accession number NP_415277) encodes aldose-1-epimerase, the galK gene (accession number NP_415278) - galactokinase, the galT gene (accession number NP_415279) - galactose-1-phosphate-uridyltransferase and the galE gene - UDP-galactose-4-epimerase .

Следовательно, биосинтез УДФ-галактозы может быть также восполнен в результате экспрессии генов, кодирующих галактозный-протонный симпортер, галактокиназу и галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазу в микробной клетке или улучшен в результате сверхэкспрессии генов, кодирующих галактозно-протонный симпортер, галактокиназу и галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазу в микробной клетке.Therefore, the biosynthesis of UDP-galactose can also be replenished by the expression of genes encoding the galactose-proton symporter, galactokinase and galactose-1-phosphate-uridyltransferase in the microbial cell or improved as a result of overexpression of the genes encoding the galactose-proton symporter, galactokinase and galactose-uridyltransferase. 1-phosphate uridyl transferase in a microbial cell.

В еще одном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза ГДФ-фукозы для внутриклеточного образования ГДФ-L-фукозы (ГДФ-Fuc). ГДФ-Fuc представляет собой субстрат фукозилтрансферазы, и ферментативная активность фукозилтранефераз может приводить к образованию фукозилированных дисахаридов или фукозилированных олигосахаридов.In yet another embodiment, the genetically engineered microbial cell has a GDP-fucose biosynthetic pathway to produce GDP-L-fucose (GDF-Fuc) intracellularly. GDP-Fuc is a fucosyltransferase substrate, and the enzymatic activity of fucosyltransferases can lead to the formation of fucosylated disaccharides or fucosylated oligosaccharides.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза ГДФ-L-фукозы, содержащий маннозо-6-фосфатизомеразу, фосфоманномутазу, манно-1-фосфат-гуанилилтрансферазу, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу и ГДФ-L-фукозосинтазу.In an additional and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell contains a GDP-L-fucose biosynthetic pathway comprising mannose-6-phosphate isomerase, phosphomannomutase, manno-1-phosphate guanylyltransferase, GDP-mannose-4,6-dehydratase and GDP- L-fucose synthase.

Внутриклеточная поставка ГДФ-L-фукозы может быть улучшена посредством генной инженерии в том отношении, что один или более генов, кодирующих моннозо-6-фосфатизомеразу, фосфоманномутазу, маннозо-1-фосфат-гуанилилтрансферазу, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу или ГДФ-1_-фукозосинтазу, сверхэкспрессируются и/или дополнительные копии одного или более генов, кодирующих маннозо-6-фосфатизомеразу, фосфоманномутазу, манно-1-фосфат-гуанилилтрансферазу, ГДФ-маннозо-4,6-дегидротазу и ГДФ-L-фукозосинтазу или их функциональные варианты, экспрессируются в микробной клетке. Примером гена, кодирующего маннозо-6-фосфатизомеразу, является ген Е. coli тапА (№доступа NP_416130), обнаруженный в Е. coli K-12, примером гена, кодирующего фосфоманномутазу, является ген Е. coli тапВ (№доступа NP_416552), обнаруженный в E.coli K-12, примером гена, кодирующего маннозо-1-фосфат-гуанилилтрансферазу, является ген E.coli тапС (№доступа NP_416553), обнаруженный в Е. coli K-12, примером гена, кодирующего ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу, является ген Е. coli gmd (№доступа NP_416557), обнаруженный в Е. coli K-12, и примером гена, кодирующего ГДФ-L-фукозосинтазу, является ген E.coli wcaG (№доступа NP_416556), обнаруженный в E.coli K-12.Intracellular delivery of GDP-L-fucose can be improved by genetic engineering in that one or more of the genes encoding monnose-6-phosphate isomerase, phosphomannomutase, mannose-1-phosphate-guanylyltransferase, GDP-mannose-4,6-dehydratase, or GDP-1_fucose synthase, overexpressed and/or additional copies of one or more genes encoding mannose-6-phosphate isomerase, phosphomannomutase, manno-1-phosphate-guanylyltransferase, GDP-mannose-4,6-dehydrotase and GDP-L-fucose synthase, or their functional variants are expressed in the microbial cell. An example of a gene encoding mannose-6-phosphate isomerase is the E. coli gene tapA (accession no. NP_416130), found in E. coli K-12, an example of a gene encoding phosphomannomutase is the E. coli gene tapB (accession no. NP_416552), discovered in E. coli K-12, an example of a gene encoding mannose-1-phosphate guanylyltransferase is the E. coli tanc gene (Accession No. NP_416553), found in E. coli K-12, an example of a gene encoding GDP-mannose-4 ,6-dehydratase is the E. coli gmd gene (Accession No. NP_416557) found in E. coli K-12, and an example of a gene encoding GDP-L-fucose synthase is the E. coli wcaG gene (Accession No. NP_416556) found in E. coli K-12.

Дополнительно и/или в качестве альтернативы, поставка ГДФ-L-фукозы может быть достигнута или улучшена посредством подачи L-фукозы в микробные клетки посредством культуральной среды, в которой культивируют указанную микробную клетку. Подаваемая извне L-фукоза поглощается микробной клеткой и сначала фосфорилируется до фукозо-1-фосфата под действием фермента фукозокиназа. Фукозо-1-фосфат впоследствии превращается в ГДФ-L-фукозу под действием ферментативной активности фермента фукозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза. Гены, кодирующие ферменты, обладающие требуемыми ферментативными активностями, известны специалисту в данной области. Иллюстративно, ген fkp (№доступа WP_010993080), кодирующий бифункциональную L-фукокиназу/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу Bacteroides fragilis, может сверхэкспрессироваться в генетически сконструированной клетке-хозяине.Additionally and/or alternatively, the delivery of GDP-L-fucose can be achieved or improved by supplying L-fucose to microbial cells through a culture medium in which said microbial cell is cultured. Externally supplied L-fucose is taken up by the microbial cell and is first phosphorylated to fucose-1-phosphate by the enzyme fucosokinase. Fucose-1-phosphate is subsequently converted to GDP-L-fucose by the enzymatic activity of the enzyme fucose-1-phosphate guanylyltransferase. Genes encoding enzymes having the required enzymatic activities are known to one skilled in the art. Illustratively, the fkp gene (Accession No. WP_010993080), encoding the bifunctional L-fucokinase/L-fucose-1-phosphate guanylyltransferase of Bacteroides fragilis, can be overexpressed in a genetically engineered host cell.

В еще одном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза УДФ-N-ацетилглюкозамина для внутриклеточного образования УДФ-N-ацетилглюкозамина (УДФ-GlcNAc), требуемого для реакций с N-ацетилглюкозаминилтрансферазой, приводящих к образованию N-ацетилглюкозаминилированных ди- или олигосахаридов.In yet another embodiment, a genetically engineered microbial cell has a UDP-N-acetylglucosamine biosynthetic pathway for intracellular formation of UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) required for reactions with N-acetylglucosaminyltransferase leading to the formation of N-acetylglucosaminylated di- or oligosaccharides.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза УДФ-N-ацетилглюкозамина, например, включающий L-глутамин:D-фуктозо-6-фосфатаминотрансферазу, фосфоглюкозаминмутазу и N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу/глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазу.In an additional and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell has a UDP-N-acetylglucosamine biosynthetic pathway, for example, comprising L-glutamine:D-fuctose-6-phosphate aminotransferase, phosphoglucosamine mutase, and N-acetylglucosamine-1-phosphate-uridyltransferase/glucosamine-1- phosphate acetyltransferase.

Внутриклеточная подача УДФ-N-ацетилглюкозамина может быть улучшена посредством генетических модификаций, таких как экспрессия или сверхэкспрессия одного или более генов, кодирующих полипептиды, демонстрирующие L-глутамин:D-фуктозо-6-фосфатаминотрансферазную активность (например, ген Е. coli K-12 glmS (№доступа NP_418185)), фосфоглюкозаминомутазную активность (например, ген Е. coli K-12 glmM (№доступа NP_417643)) и N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазную/глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазную активность (например, ген Е, coli K-12 glmU (номер доступа NP_418186)), или их варианты.Intracellular delivery of UDP-N-acetylglucosamine can be improved through genetic modifications, such as expression or overexpression of one or more genes encoding polypeptides exhibiting L-glutamine:D-fuctose-6-phosphate aminotransferase activity (eg, the E. coli K-12 gene glmS (Accession No. NP_418185)), phosphoglucosamine mutase activity (e.g., E. coli K-12 glmM gene (Accession No. NP_417643)), and N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase/glucosamine-1-phosphate acetyltransferase activity (e.g., E gene, coli K -12 glmU (accession number NP_418186)), or their variants.

В еще одном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты/СМР-сиаловой кислоты для внутриклеточного образования СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты (CMP-Neu5Ac), требуемой для реакций с сиалилтрансферазой, приводящих, например, к образованию сиалилированных ди- или олигосахаридов.In yet another embodiment, the genetically engineered microbial cell has a CMP-N-acetylneuraminic acid/CMP-sialic acid biosynthetic pathway for intracellular production of CMP-N-acetylneuraminic acid (CMP-Neu5Ac) required for reactions with sialyltransferase leading to, for example, the formation sialylated di- or oligosaccharides.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты, например, включающий L-глутамин:D-фуктозо-6-фосфатаминотрансферазу, фосфоглюкозаминмутазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу/глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазу, УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазу (предпочтительно, HAD-подобную сахарофосфатазу), N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, синтазу сиаловой кислоты и синтетазу СМР-сиаловой кислоты.In an additional and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell contains a CMP-N-acetylneuraminic acid biosynthetic pathway, for example, including L-glutamine:D-fuctose-6-phosphate aminotransferase, phosphoglucosamine mutase, N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyl transferase/glucosamine-1 -phosphate acetyltransferase, UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase, glucosamine-6-phosphate acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-phosphate phosphatase (preferably HAD-like sugar phosphatase), N-acetylglucosamine-2-epimerase, sialic acid synthase and CMP synthetase sialic acid.

Внутриклеточная подача СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты может быть улучшена посредством генетических модификаций, таких как экспрессия или сверхэкспрессия одного или более генов, кодирующих полипептиды, демонстрирующие L-глутамин:D-фуктозо-6-фосфатаминотрансферазную активность (например, ген Е. coli K-12 glmS), фосфоглюкозаминмутазную активность (например, ген Е. coli K-12 glmM), N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазную/ глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазную активность (например, ген E.coli K-12 glmU), УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразную активность (например, ген Campylobacter jejuni neuC (№доступа AF305571)), глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазную активность (например, ген Saccharomyces cerevisiae дпа1 (№доступа NP_116637)), N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазную активность (например, ген Е. coli K-12 yihX (№доступа NP_418321)), N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразную активность (например, ген Synechocystis sp.РСС6803 slr1975 (№доступа BAL35720)), активность синтазы сиаловой кислоты (например, ген Campylobacter jejuni пеиВ (№доступа AF305571)) и активность синтетазы СМР-сиаловой кислоты (например, ген neuA Campylobacter jejuni (№доступа AF305571)), или их варианты.Intracellular supply of CMP-N-acetylneuraminic acid can be improved through genetic modifications, such as expression or overexpression of one or more genes encoding polypeptides exhibiting L-glutamine:D-fuctose-6-phosphate aminotransferase activity (eg, the E. coli K- 12 glmS), phosphoglucosamine mutase activity (for example, E. coli K-12 glmM gene), N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase/glucosamine-1-phosphate acetyltransferase activity (for example, E. coli K-12 glmU gene), UDP-N- acetylglucosamine-2-epimerase activity (for example, Campylobacter jejuni neuC gene (Accession No. AF305571)), glucosamine-6-phosphate acetyltransferase activity (for example, Saccharomyces cerevisiae dpa1 gene (Accession No. NP_116637)), N-acetylglucosamine-6-phosphate phosphatase activity (for example , E. coli K-12 yihX gene (accession number NP_418321)), N-acetylglucosamine-2-epimerase activity (for example, Synechocystis sp.РСС6803 slr1975 gene (accession number BAL35720)), sialic acid synthase activity (for example, Campylobacter jejuni gene peiB (Accession No. AF305571)) and CMP-sialic acid synthetase activity (e.g., Campylobacter jejuni neuA gene (Accession No. AF305571)), or variants thereof.

Генетически сконструированная микробная клетка может дополнительно содержать гликозилтрансферазу. В предпочтительном воплощении по меньшей мере одна гликозилтрансфераза представляет собой фукозилтрансферазу, сиалилтрансферазу, глюкозаминилтрансферазу или галактозилтрансферазу, более предпочтительно, по меньшей мере одна гликозилтрансфераза демонстрирует (β-1,3-галактозилтрансферазную активность, (β-1,4-галактозилтрансферазную активность, β-1,6-галактозилтрансферазную активность, β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазную активность, α-2,3-сиалилтрансферазную активность, α-2,6-сиалилтрансферазную активность, α-1,2-фукозилтрансферазную активность, α-1,3-фукозилтрансферазную активность, α-1,4-фукозилтрансферазную активность. Подходящие гликозилтрансферазы известны специалисту в данной области или могут быть найдены в литературе.The genetically engineered microbial cell may additionally contain a glycosyltransferase. In a preferred embodiment, at least one glycosyltransferase is a fucosyltransferase, sialyltransferase, glucosaminyltransferase or galactosyltransferase, more preferably at least one glycosyltransferase exhibits (β-1,3-galactosyltransferase activity, (β-1,4-galactosyltransferase activity, β-1 ,6-galactosyltransferase activity, β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase activity, α-2,3-sialyltransferase activity, α-2,6-sialyltransferase activity, α-1,2-fucosyltransferase activity, α-1,3- fucosyltransferase activity, α-1,4-fucosyltransferase activity Suitable glycosyltransferases are known to one skilled in the art or can be found in the literature.

Обычно, и по всему объему настоящего раскрытия, термин «гликозилтрансферазная активность» или «гликозилтрансфераза» обозначает и охватывает ферменты, которые отвечают за биосинтез дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов, и они катализируют перенос группировок моносахарида от моносахарида/сахара, активированного нуклеотидом (например, УДФ-Glc, УДФ-Gal, ГДФ-Fuc, УДФ-GlcNAc, CMP-Neu5Ac), к молекуле - акцептору гликозила (например, моно-, ди- или олигосахаридам).Generally, and throughout the entirety of this disclosure, the term "glycosyltransferase activity" or "glycosyltransferase" refers to and covers enzymes that are responsible for the biosynthesis of disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides, and they catalyze the transfer of monosaccharide moieties from a nucleotide-activated monosaccharide/sugar (e.g., UDP -Glc, UDP-Gal, GDP-Fuc, UDP-GlcNAc, CMP-Neu5Ac), to a glycosyl acceptor molecule (for example, mono-, di- or oligosaccharides).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка синтезирует больше фосфоенолпирувата (PEP), чем клетка дикого типа. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка генетически сконструирована таким образом, чтобы иметь путь усиленного биосинтеза PEP. Например, генетически сконструированная микробная клетка генетически сконструирована таким образом, чтобы обладать повышенной фосфоенолпируваткарбоксикиназной активностью, например, посредством сверхэкспрессии гена pckA Е. coli K-12 (№доступа NP_417862) или его функционального варианта. Предпочтительно, генетически сконструированная клетка-хозяин генетически сконструирована таким образом, чтобы иметь повышенную фосфоенолпируватсинтазную активность, например, в том отношении, что ген ppsA Е. coli K-12 (№доступа NP_416217), кодирующий фосфоенолпируватсинтазу, сверхэкспрессируется, и/или в том отношении, что не встречающиеся в природе микроорганизмы содержат по меньшей мере одну дополнительную копию нуклеотидной последовательности, делающую возможной экспрессию фосфоенолпируватсинтазы, или ее функциональный вариант. Сверхэкспрессия pckA или ppsA усиливает внутриклеточный синтез PEP таким образом, что доступно больше PEP, например, для продукции сиаловой кислотыIn a further and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell synthesizes more phosphoenolpyruvate (PEP) than the wild type cell. In a further and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell is genetically engineered to have an enhanced PEP biosynthetic pathway. For example, a genetically engineered microbial cell is genetically engineered to have increased phosphoenolpyruvate carboxykinase activity, for example, through overexpression of the E. coli K-12 pckA gene (Accession No. NP_417862) or a functional variant thereof. Preferably, the genetically engineered host cell is genetically engineered to have increased phosphoenolpyruvate synthase activity, for example in that the E. coli K-12 ppsA gene (Accession No. NP_416217) encoding phosphoenolpyruvate synthase is overexpressed, and/or in that that non-naturally occurring microorganisms contain at least one additional copy of the nucleotide sequence allowing the expression of phosphoenolpyruvate synthase, or a functional variant thereof. Overexpression of pckA or ppsA enhances intracellular PEP synthesis such that more PEP is available, for example for sialic acid production

В дополнительном и/или альтернативном воплощении внутриклеточная РЕР-доступность генетически сконструированной клетки-хозяина может быть улучшена посредством уменьшения и/или ослабления активности импортера, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, требуемого для переноса определенного сахара (например, глюкозы), используемого в качестве источника углерода и энергии, из культуральной среды и клетку. Следовательно, для поддержания способности генетически сконструированной клетки-хозяина использовать указанный определенный сахар в качестве источника углерода и энергии, импортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, нуждается в экспрессии или сверхэкспрессии. В дополнительном и/или альтернативном воплощении требуется экспрессия или сверхэкспрессия киназы, способной фосфорилировать указанный определенный сахар, или уменьшается и/или ослабляется для осуществления метаболизма указанного сахара или его накопления в нефосфорилированной форме в клетке, соответственно.In an additional and/or alternative embodiment, the intracellular PEP accessibility of the genetically engineered host cell may be improved by reducing and/or attenuating the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-dependent importer activity required to transport a specific sugar (e.g., glucose) used as a carbon source. and energy from the culture medium and the cell. Therefore, to maintain the ability of a genetically engineered host cell to utilize said specific sugar as a source of carbon and energy, a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent importer needs to be expressed or overexpressed. In a further and/or alternative embodiment, a kinase capable of phosphorylating said specific sugar is required to be expressed or overexpressed, or reduced and/or attenuated to allow said sugar to be metabolized or accumulated in a non-phosphorylated form in the cell, respectively.

Импортер, зависимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, или его компоненты, чья экспрессия и/или активность могли быть уменьшены и/или ослаблены в генетически сконструированной микробной клетке (например, Е. coli K-12), содержат по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из генов глюкозо-PEP-PTS ptsG (№доступа NP_415619), malX (№доступа NP_416138), crr (№доступа NP_416912), bglF (№доступа NP_418178) и/или генов фруктозо-РЕР-PTS fruA (№доступа NP_416672), fruB (№доступа NP_416674), и/или генов маннозо-PEP-PTS тапХ (№доступа NP_416331), many (№доступа NP_416332), manZ (№доступа NP_416333) и/или гена N-ацетилглюкозамин-РЕР-PTS nagE (№доступа NP_415205).A phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-dependent importer, or components thereof, whose expression and/or activity could be reduced and/or attenuated in a genetically engineered microbial cell (e.g., E. coli K-12) comprises at least one selected from the group , consisting of the glucose-PEP-PTS genes ptsG (accession no. NP_415619), malX (accession no. NP_416138), crr (accession no. NP_416912), bglF (accession no. NP_418178) and/or fructose-PEP-PTS fruA genes (accession no. NP_416672 ), fruB (accession no. NP_416674), and/or the mannose-PEP-PTS tapX genes (accession no. NP_416331), many (accession no. NP_416332), manZ (accession no. NP_416333) and/or the N-acetylglucosamine-PEP-PTS nagE gene (accession number NP_415205).

Подходящий транспортер, независимый от PEP-PTS, или его варианты, способные переносить моносахариды (глюкозу и/или фруктозу и/или галактозу и/или N-ацетилглюкозамин и/или N-ацетилнейраминовую кислоту и/или фукозу) в микробную клетку, хорошо известны специалисту в данной области. Неограничивающими примерами генов, кодирующих указанный транспортер, независимый от PEP-PTS, являются galP Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 1), glf Zymomonas mobilis (SEQ ID NO. 2), cscB Escherichia coli W (SEQ ID NO. 3), fupL Leuconostoc pseudomesenteroides (SEQ ID NO. 4), lacY Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 5), fucP Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 6), nanT Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 7), nagP Xanthomonas campestris (SEQ ID NO. 8), glcP Bifidobacterium longum NCC2705 (SEQ ID NO. 9), glcP Bacillus subtilis (SEQ ID NO. 10), sgIS Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO. 11), xylE Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 12), araE Bacillus subtilis 168 (SEQ ID NO. 13). Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка-хозяин содержит и экспрессирует по меньшей мере один ген, содержащий белок-кодирующую область упомянутых выше генов или их функциональных вариантов.A suitable PEP-PTS independent transporter or variants thereof capable of transporting monosaccharides (glucose and/or fructose and/or galactose and/or N-acetylglucosamine and/or N-acetylneuraminic acid and/or fucose) into the microbial cell are well known a specialist in this field. Non-limiting examples of genes encoding this PEP-PTS independent transporter include Escherichia coli K-12 galP (SEQ ID NO. 1), Zymomonas mobilis glf (SEQ ID NO. 2), Escherichia coli W cscB (SEQ ID NO. 3 ), fupL Leuconostoc pseudomesenteroides (SEQ ID NO. 4), lacY Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 5), fucP Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 6), nanT Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 7), nagP Xanthomonas campestris (SEQ ID NO. 8), glcP Bifidobacterium longum NCC2705 (SEQ ID NO. 9), glcP Bacillus subtilis (SEQ ID NO. 10), sgIS Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO. 11), xylE Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 12), araE Bacillus subtilis 168 (SEQ ID NO. 13). Thus, in a further and/or alternative embodiment, the genetically engineered host cell contains and expresses at least one gene comprising a protein coding region of the above genes or functional variants thereof.

В предпочтительном воплощении подходящий транспортер глюкозы, не зависимый от PEP-PTS, представляет собой белок облегченной диффузии ссахара и/или пермеазу транслокации глюкозы. Подходящий белок облегченой диффузии глюкозы кодируется геном glf Zymomonas mobilis. Подходящая пермеаза транслокации глюкозы кодируется геном galP Е. coli K-12. Пермеаза транслокации глюкозы также известна как симпортер галактозы-протонов или пермеаза галактозы, но также импортирует глюкозу через клеточную мембрану.In a preferred embodiment, a suitable PEP-PTS independent glucose transporter is a sugar facilitated diffusion protein and/or a glucose translocation permease. A suitable facilitated glucose diffusion protein is encoded by the glf gene of Zymomonas mobilis. A suitable glucose translocation permease is encoded by the galP gene of E. coli K-12. Glucose translocation permease is also known as galactose-proton symporter or galactose permease, but also imports glucose across the cell membrane.

В еще одном предпочтительном воплощении подходящий транспортер фруктозы, независимый от PEP-PTS, представляет собой белок облегченной диффузии сахара и/или белок-переносчик фруктозы. Подходящий белок облегченной диффузии фруктозы кодируется геном glf Zymomonas mobilis. Подходящий белок-переносчик фруктозы кодируется геном fupL Leuconostoc pseudomesenteroides.In yet another preferred embodiment, a suitable PEP-PTS independent fructose transporter is a facilitated sugar diffusion protein and/or a fructose transport protein. A suitable fructose facilitated diffusion protein is encoded by the glf gene of Zymomonas mobilis. A suitable fructose transport protein is encoded by the fupL gene of Leuconostoc pseudomesenteroides.

Обычно, и на протяжении всего настоящего раскрытия, термины «повышенная внутриклеточная доступность сахарофосфата» или «повышенная/улучшенная поставка сахарофосфата» относятся к повышенной способности генетически модифицированной микробной клетки образовывать повышенные внутриклеточные количества указанного сахарофосфата, по сравнению с немодифицированной микробной клеткой, обеспечивающей повышенный поток углерода через путь биосинтеза требуемого углевода. Вследствие этого, повышенная продукция указанного требуемого углевода указанной генетически модифицированной микробной клеткой представляет собой прямой показатель повышенного внутриклеточного количества указанного сахарофосфата. Кроме того, способы, нацеленные на количественную оценку внутриклеточных метаболитов, и/или потока углерода клеток, могут быть найдены в литературе, известной специалисту в данной области (например, Lammerhofer and Weckwerth, «Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data», Wiley-VCH, Weinheim, Germany (2013)).Generally, and throughout this disclosure, the terms “increased intracellular availability of sugar phosphate” or “increased/improved supply of sugar phosphate” refer to the increased ability of a genetically modified microbial cell to produce increased intracellular amounts of said sugar phosphate, compared to an unmodified microbial cell providing increased carbon flux. through the biosynthesis pathway of the required carbohydrate. As a consequence, increased production of said desired carbohydrate by said genetically modified microbial cell is a direct indicator of increased intracellular amounts of said sugar phosphate. In addition, methods aimed at quantifying intracellular metabolites and/or cellular carbon flux can be found in the literature known to one skilled in the art (e.g., Lammerhofer and Weckwerth, “Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data ", Wiley-VCH, Weinheim, Germany (2013)).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении экспрессия и/или активность генов и/или белков, соответственно, конкурирующих с биосинтезом требуемого углевода, может быть снижена или ослаблена в генетически сконструированной клетке-хозяине. Неограничивающие примеры таких противодействующих белков/активностей белков включают по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из нижеследующего: р-галактозидаза (например, LacZ Е. coli K-12 (№доступа NP_414878)), УДФ-глюкозо:ундекапренилфосфатглюкозо-1-фосфаттрансфераза (например, WcaJ E.coli K-12 (№доступа NP_416551)), L-фукозоизомераза (например, Fucl Е. coli K-12), фукулокиназа (например, FucK Е. coli K-12 (№доступа NP_417282)), N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза (например, NagA Е. coli K-12 (№доступа NP_415203)), глюкозамин-6-фосфатдезаминаза (например, NagB E.coli K-12 (№доступа NP_415204)), N-ацетилманнозаминкиназа (например, NanK E.coli K-12 (№доступа NP_417689)), N-ацетилманнозамин-6-фосфатэпимераза (например, NanE Е. coli K-12 (№доступа NP_417690)), альдолаза N-ацетилнейраминовой кислоты (например, NanA Е. coli K-12 (№доступа NP_417692)), пермеаза сиаловой кислоты (например, NanT Е. coli K-12 (№доступа NP_417691)).In a further and/or alternative embodiment, the expression and/or activity of genes and/or proteins, respectively, that compete with the biosynthesis of the desired carbohydrate may be reduced or attenuated in the genetically engineered host cell. Non-limiting examples of such counteracting proteins/protein activities include at least one selected from the group consisting of the following: p-galactosidase (e.g. LacZ E. coli K-12 (Accession No. NP_414878)), UDP-glucose:undecaprenylphosphate-glucose-1- phosphate transferase (for example, WcaJ E. coli K-12 (accession no. NP_416551)), L-fucose isomerase (for example, Fucl E. coli K-12), fuculokinase (for example, FucK E. coli K-12 (accession no. NP_417282)) , N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase (e.g. NagA E. coli K-12 (Accession No. NP_415203)), glucosamine-6-phosphate deaminase (e.g. NagB E. coli K-12 (Accession No. NP_415204)), N-acetylmannosamine kinase (e.g. NanK E. coli K-12 (Accession No. NP_417689)), N-acetylmannosamine-6-phosphate epimerase (e.g. NanE E. coli K-12 (Accession No. NP_417690)), N-acetylneuraminic acid aldolase (e.g. NanA E. coli K-12 (Accession No. NP_417692)), sialic acid permease (for example, NanT E. coli K-12 (Accession No. NP_417691)).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка способна метаболизировать сахарозу, таким образом, содержа один или более генов, кодирующих: (i) гетерологичную PTS-зависимую транспортную систему утилизации сахарозы (например, гены Klebsiella pneumoniae scrYAB (SEQ ID NO. 14) или гены scrYAB Salmonella typhimurium (SEQ ID NO. 15), состоящие из порина сахарозы (scrY), субъединицы II PTS транспортера, специфичного в отношении сахарозы (scrA), и сахарозо-6-фосфатгидролазы (scrB), и/или (ii) гетерологичную PTS-зависимую систему транспорта сахарозы (например, гены scrYA Klebsiella pneumoniae или гены scrYA Salmonella typhimurium) в комбинации с геном сахарозофосфатсинтазы (например, ген spsA Anabaena sp.РСС7120 (№доступа AJ302071)) и/или (iii) гетерологичную PTS-независимую систему утилизации сахарозы (например, гены Е. coli W cscBKA (SEQ ID NO. 16), состоящую из фруктокиназы (cscK), сахарозогидролазы (cscA) и сахарозопермеазы (cscB), и/или (iv) гетерологичную систему утилизации сахарозы, состоящую из гена сахарозопермеазы (например, Е. coli W cscB) в комбинации с геном сахарозофосфорилазы (например, ген basP Bifidobacterium adolescentis (№доступа WP_011742626)) или геном сахарозосинтазы (например, ген susA Anabaena sp, (№доступа САА09297)).In a further and/or alternative embodiment, the genetically engineered microbial cell is capable of metabolizing sucrose, thereby containing one or more genes encoding: (i) a heterologous PTS-dependent sucrose utilization transport system (e.g., Klebsiella pneumoniae scrYAB genes (SEQ ID NO. 14 ) or Salmonella typhimurium scrYAB genes (SEQ ID NO. 15), consisting of sucrose porin (scrY), sucrose-specific PTS transporter subunit II (scrA), and sucrose-6-phosphate hydrolase (scrB), and/or (ii ) a heterologous PTS-dependent sucrose transport system (for example, scrYA genes of Klebsiella pneumoniae or scrYA genes of Salmonella typhimurium) in combination with a sucrose phosphate synthase gene (for example, the spsA gene of Anabaena sp. PCC7120 (accession no. AJ302071)) and/or (iii) a heterologous PTS- an independent sucrose utilization system (e.g., E. coli W cscBKA genes (SEQ ID NO. 16) consisting of fructokinase (cscK), sucrose hydrolase (cscA) and sucrose permease (cscB), and/or (iv) a heterologous sucrose utilization system consisting from a sucrose permease gene (for example, E. coli W cscB) in combination with a sucrose phosphorylase gene (for example, the basP gene of Bifidobacterium adolescentis (Accession No. WP_011742626)) or a sucrose synthase gene (for example, the susA gene of Anabaena sp, (Accession No. CAA09297)).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении микробная клетка содержит белок-экспортер или пермеазу, экспортирующую целевой углевод из клетки, предпочтительно, эффлюксный транспортер сахара.In an additional and/or alternative embodiment, the microbial cell contains an exporter protein or permease that exports the target carbohydrate from the cell, preferably a sugar efflux transporter.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка-хозяин представляет собой микробную клетку, предпочтительно, бактериальную клетку, выбранную из группы, состоящей из бактерий рода Escherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus и Clostridium, предпочтительно, бактериальную клетку, которая выбрана из группы бактериальных видов, состоящих из Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii и Lactococcus lactis. В еще одном воплощении микробная клетка представляет собой Escherichia coli. Специалисту в данной области будет известно о дополнительных бактериальных штаммах при чтении настоящего раскрытия.In a further and/or alternative embodiment, the host cell is a microbial cell, preferably a bacterial cell selected from the group consisting of bacteria of the genus Escherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus and Clostridium, preferably a bacterial cell that selected from a group of bacterial species consisting of Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus del brueckii and Lactococcus lactis. In yet another embodiment, the microbial cell is Escherichia coli. One skilled in the art will be aware of additional bacterial strains upon reading the present disclosure.

Согласно второму аспекту предложено применение генетически сконструированной клетки-хозяина, как описано в данном документе, для продукции требуемого углевода, где указанную клетку-хозяина культивируют в присутствии смеси моносахаридов, состоящей из глюкозы и по меньшей мере второго моносахарида группы фруктозы и галактозы. Указанная клетка генетически сконструирована таким образом, чтобы демонстрировать повышенную внутриклеточную доступность по меньшей мере одного сахарофосфата, релевантного в отношении продукции требуемого углевода. Указанный сахарофосфат может быть выбран из группы, состоящей из фосфоенолпирувата (PEP), дигидроксиацетонфосфата, фруктозо-6-фосфата, фруктозо-1-фосфата, фруктозо-1,6-бисфосфата, глюкозо-6-фосфата, глюкозо-1-фосфата, галактозо-1-фосфата, маннозо-1-фосфата, маннозо-6-фофата, глюкозамин-6-фосфата, глюкозамин-1-фосфата, N-ацетилглюкозамин-6-фосфата, N-ацетилглюкозамин-1-фосфата, N-ацетилманнозамин-6-фосфата, УДФ-глюкозы, УДФ-галактозы, СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты, ГДФ-маннозы, ГДФ-фукозы и УДФ-N-ацетилглюкозамина.A second aspect provides the use of a genetically engineered host cell, as described herein, to produce a desired carbohydrate, wherein said host cell is cultured in the presence of a monosaccharide mixture consisting of glucose and at least a second monosaccharide of fructose and galactose. Said cell is genetically engineered to exhibit increased intracellular availability of at least one sugar phosphate relevant for production of the desired carbohydrate. Said sugar phosphate may be selected from the group consisting of phosphoenolpyruvate (PEP), dihydroxyacetone phosphate, fructose-6-phosphate, fructose-1-phosphate, fructose-1,6-bisphosphate, glucose-6-phosphate, glucose-1-phosphate, galactose -1-phosphate, mannose-1-phosphate, mannose-6-phosphate, glucosamine-6-phosphate, glucosamine-1-phosphate, N-acetylglucosamine-6-phosphate, N-acetylglucosamine-1-phosphate, N-acetylmannosamine-6 -phosphate, UDP-glucose, UDP-galactose, CMP-N-acetylneuraminic acid, HDP-mannose, HDP-fucose and UDP-N-acetylglucosamine.

Согласно третьему аспекту предложен способ ферментативного получения требуемого углевода, включающий следующие стадии:According to a third aspect, a method is provided for enzymatically producing a desired carbohydrate, comprising the following steps:

a) предоставление генетически сконструированного микроорганизма, способного продуцировать требуемый углевод, где указанный микроорганизм демонстрирует повышенную внутриклеточную доступность по меньшей мере одного сахарофосфата за счет сниженной и/или ослабленной экспрессии и/или активности по меньшей мере одного белка, что приводит к потреблению указанного внутриклеточного сахарофосфата в указанном сконструированном микроорганизме;a) providing a genetically engineered microorganism capable of producing a desired carbohydrate, wherein said microorganism exhibits increased intracellular availability of at least one sugar phosphate due to reduced and/or attenuated expression and/or activity of at least one protein, resulting in consumption of said intracellular sugar phosphate in said engineered microorganism;

b) культивирование указанного генетически сконструированного микроорганизма в культуральной среде, пермиссивной в отношении продукции указанного требуемого углевода, где основной источник углерода представляет собой смесь моносахаридов, состоящую из глюкозы и по меньшей мере второго моносахарида группы из фруктозы и галактозы;b) cultivating said genetically engineered microorganism in a culture medium permissive for the production of said desired carbohydrate, where the main carbon source is a mixture of monosaccharides consisting of glucose and at least a second monosaccharide of the group of fructose and galactose;

c) выделение указанного требуемого сахарида из культурального бульона.c) isolating said desired saccharide from the culture broth.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении целевой углевод представляет собой олигосахарид грудного молока или его строительный блок. Список целевых углеводов, которые могут быть продуцированы посредством использования генетически модифицированной микробной клетки и/или способа, как описано в данном документе, раскрыт в таблице 1. Предпочтительно, требуемый углевод выбран из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-дифукозилгексозы I, лакто-N-дифукозилгексаозы II, лакто-N-сиалилпентаозы LSTa, LSTb, LSTc.In an additional and/or alternative embodiment, the target carbohydrate is a human milk oligosaccharide or a building block thereof. A list of target carbohydrates that can be produced through the use of a genetically modified microbial cell and/or method as described herein is disclosed in Table 1. Preferably, the desired carbohydrate is selected from the group consisting of 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2 ',3-difucosyllactose, 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, 3-fucosyl-3'-sialyllactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose II , lacto-N-fucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-difucosylhexose I, lacto-N-difucosylhexaose II, lacto-N-sialylpentaose LSTa, LSTb, LSTc.

Предпочтительно, смесь глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида представляет собой смешанное сырье из глюкозы и фруктозы, предпочтительно полученное в результате гидролиза сахарозы.Preferably, the mixture of glucose and at least one additional monosaccharide is a mixed feedstock of glucose and fructose, preferably obtained by hydrolysis of sucrose.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гидролиз сахарозы является неполным, таким образом, что существенные количества сахарозы остаются в сырье. Таким образом, количество сахарозы в гидролизованном и/или стерилизованном теплом сырье, больше чем 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или больше чем 80%.In a further and/or alternative embodiment, the hydrolysis of sucrose is incomplete such that significant amounts of sucrose remain in the raw material. Thus, the amount of sucrose in hydrolyzed and/or warm sterilized raw materials is greater than 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75% or more than 80%.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении микробная клетка культивируется без поставки извне акцепторного субстрата, например, N-ацетилглюкозамина или лактозы, в частности, при культивации для продукции целевого олигосахарида.In a further and/or alternative embodiment, the microbial cell is cultured without external supply of a acceptor substrate, for example N-acetylglucosamine or lactose, in particular when cultured to produce a target oligosaccharide.

Настоящее изобретение будет описано относительно конкретных воплощений и со ссылкой на графические материалы, но данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобное в описании и в формуле изобретения используются для проведения различия между похожими элементами и не обязательно для описания последовательности, во времени, в пространстве, по рангу или любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, способны работать в последовательностях, отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе.The present invention will be described with respect to specific embodiments and with reference to drawings, but the invention is not limited thereto, but only by the claims. In addition, the terms first, second, and the like in the specification and claims are used to distinguish between like elements and not necessarily to describe sequence, in time, space, rank, or any other manner. It should be understood that the terms used in this manner are interchangeable in appropriate circumstances, and that the embodiments of the invention described herein are capable of operating in sequences other than those described or illustrated herein.

Следует отметить, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует считать ограничивающимся средствами, перечисленными в дальнейшем; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, его следует считать определяющим наличие заявленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, на которые ссылаются, но он не исключает наличие или добавление одного или более других признаков, целых чисел, стадий или компонентов или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и В» не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Оно означает, что в отношении настоящего изобретения, единственными релевантными компонентами устройства являются А и В.It should be noted that the term “comprising” as used in the claims should not be considered limited to the means listed below; it does not exclude other elements or stages. Thus, it should be considered to determine the presence of the claimed features, integers, steps or components referred to, but it does not exclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps or components or groups thereof. Thus, the scope of the expression "device comprising means A and B" should not be limited to devices consisting only of components A and B. It means that for the purposes of the present invention, the only relevant components of the device are A and B.

Ссылка на всем протяжении данного описания изобретения на «одно воплощение» или «воплощение» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включены в по меньшей мере одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему объему данного описания изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же воплощению, но могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом, как будет очевидно среднему специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более воплощениях.Reference throughout this specification to “one embodiment” or “embodiment” means that the particular feature, structure, or characteristic described in connection with that embodiment is included in at least one embodiment of the present invention. Thus, appearances of the phrases “in one embodiment” or “in an embodiment” in different places throughout this specification do not necessarily all refer to the same embodiment, but may. Moreover, specific features, structures, or characteristics may be combined in any suitable manner, as will be apparent to one of ordinary skill in the art from this disclosure, in one or more embodiments.

Аналогично, следует понимать, что в описании иллюстративных воплощений изобретения разные признаки изобретения иногда сгруппированы вместе в одном единственном воплощении, фигуре или его описании в целях упрощения раскрытия и помощи в понимании одного или более из разных аспектов изобретения. Данный способ раскрытия, однако, не нужно считать отражающим мысль, что заявленное изобретение требует больше признаков, чем явным образом перечислены в каждом пункте. Скорее, как отражено в приведенной ниже формуле изобретения, аспекты изобретения заключаются меньше чем во всех признаках одного вышеизложенного раскрытого воплощения. Таким образом, формула изобретения после подробного описания явным образом включена тем самым в данное подробное описание, причем каждый пункт отдельно стоит в виде отдельного воплощения данного изобретения.Likewise, it should be understood that in the description of illustrative embodiments of the invention, various features of the invention are sometimes grouped together in one single embodiment, figure, or description thereof for the purpose of simplifying the disclosure and aiding in understanding one or more of the various aspects of the invention. This manner of disclosure, however, should not be taken to imply that the claimed invention requires more features than are expressly listed in each claim. Rather, as reflected in the claims below, aspects of the invention are comprised of less than all of the features of the one disclosed embodiment set forth above. Thus, the claims following the detailed description are hereby expressly incorporated into this detailed description, with each claim standing alone as a separate embodiment of the invention.

Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не все признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков разных воплощений находятся в объеме изобретения и образуют разные воплощения, как будет понятно специалистам в данной области. Например, в приведенной ниже формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.In addition, while some embodiments described herein include some, but not all, of the features included in other embodiments, it is understood that combinations of features of different embodiments are within the scope of the invention and form different embodiments, as will be appreciated by those skilled in the art. areas. For example, in the claims below, any of the claimed embodiments can be used in any combination.

Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данном документе как способ или комбинация элементов способа, которые могут быть реализованы посредством процессора компьютерной системы или с помощью других средств выполнения функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для осуществления такого способа или элемента способа образует средство осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения аппарата представляет собой пример средства осуществления функции, выполняемой элементом, с целью осуществления изобретения.In addition, some of the embodiments are described herein as a method or combination of method elements that may be implemented by a computer system processor or other means of performing a function. Thus, a processor with the necessary instructions for implementing such method or method element constitutes means for implementing the method or method element. In addition, the apparatus embodiment described herein is an example of a means of implementing the function performed by the apparatus for the purpose of carrying out the invention.

В описании и графических материалах, предоставленных в данном документе, изложены многочисленные конкретные подробности. Однако, понятно, что воплощения изобретения можно осуществлять на практике без данных конкретных подробностей. В других примерах хорошо известные способы, структуры и методики не были показаны подробно для того, чтобы не затруднять понимание данного описания.Numerous specific details are set forth in the descriptions and graphics provided herein. However, it will be understood that embodiments of the invention may be practiced without these specific details. In other examples, well-known methods, structures and techniques have not been shown in detail so as not to obscure the understanding of this description.

Сейчас изобретение будет описано посредством подробного описания нескольких воплощений изобретения. Ясно, что другие воплощения изобретения могут быть сконфигурированы в соответствии со знанием специалистов в данной области без отступления от истинной сущности или технической идеи изобретения, причем изобретение ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.The invention will now be described by way of detailed description of several embodiments of the invention. It is clear that other embodiments of the invention may be configured in accordance with the knowledge of those skilled in the art without departing from the true spirit or technical concept of the invention, the invention being limited only by the appended claims.

В одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nagABE^-, manXYZ^-метаболически сконструирован как эффективный продуцент N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, гетерологичная экспрессия гена, кодирующего глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, способную переносить ацетат с ацетил-СоА на глкозамин-6-фосфат, таким образом, образуя N-ацетилглюкзамин-6-фосфат, является необходимой. В предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически конструируют посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация делает возможной культивацию сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но повышая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат) для продукции N-ацетилглюкозамина. В дополнительном воплощении ген, кодирующий глутамин-фруктозо-6-фосфатаминотрансферазу (например, GlmS Е. coli), и/или ген, кодирующий HAD-подобную сахарофосфатазу (например, YihX Е. coli, YqaB Е. coli), способную дефосфорилировать N-ацетилглюкозамин-6-фосфат до N-ацетилглюкозамина, экспрессируется/сверхэкспрессируется для содействия синтезу GlcNAc.In one embodiment, an E. coli strain having the genotype nagABE ^- , manXYZ ^- is metabolically engineered to be an efficient producer of N-acetylglucosamine (GlcNAc) using a feedstock of a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy. Thus, heterologous expression of a gene encoding a glucosamine 6-phosphate acetyltransferase capable of transferring acetate from acetyl-CoA to glucosamine 6-phosphate, thereby forming N-acetylglucamine 6-phosphate, is necessary. In a preferred embodiment, the producer strain is further genetically engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf. This additional genetic modification makes it possible to cultivate the engineered producer strain on a raw material from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (fructose-6-phosphate) for N production -acetylglucosamine. In a further embodiment, a gene encoding a glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase (e.g., E. coli GlmS) and/or a gene encoding a HAD-like sugar phosphatase (e.g., E. coli YihX, E. coli YqaB) capable of dephosphorylating N- acetylglucosamine 6-phosphate to N-acetylglucosamine is expressed/overexpressed to promote GlcNAc synthesis.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, fucIK^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент L-фукозы с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима сверхэкспрессия по меньшей мере одного из генов Е. coli manA, manC, manB, gmd и wcaG, а также экспрессия гетерологичной α-1,2-фукозилтрансферазы, способной переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лактозу, с образованием, таким образом, 2'-фукозиллактозы, и α-1,2-фукозидазы, способной высвобождать свободную L-фукозу из 2'-фукозиллактозы. В одном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно конструируют посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация делает возможной культивацию сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но повышая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат) для продукции L-фукозы.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype lacY ⁺ , lacZ ^- , fucIK ^- , wcaJ ^- is metabolically engineered to be an efficient L-fucose producer using a feedstock of a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy , as well as lactose as an acceptor substrate. Thus, overexpression of at least one of the E. coli genes manA, manC, manB, gmd and wcaG is required, as well as the expression of a heterologous α-1,2-fucosyltransferase capable of transferring fucose from GDP-fucose to lactose, thus producing thus, 2'-fucosyllactose, and α-1,2-fucosidase, capable of releasing free L-fucose from 2'-fucosyllactose. In one embodiment, the producer strain is further engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf. This additional genetic modification makes it possible to cultivate the engineered producer strain on a raw material from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while simultaneously preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (fructose-6-phosphate) for the production of L -fucose.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nanKETA^-, nagAB^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, необходима сверхэкспрессия по меньшей мере одного из генов, кодирующих или (i) глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу и N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу и синтетазу N-ацетилнейраминовой кислоты или (ii) УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу и синтетазу N-ацетилнейраминовой кислоты. Поскольку синтез N-ацетилнейраминовой кислоты представляет собой процесс, зависимый от фосфоенолпирувата (PEP), предпочтительно избегать конкурирующих реакций, приводящих к потреблению PEP. Таким образом, в предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно конструируют посредством уменьшения и/или ослабления импортирования указанного(ых) источника(ов) углерода и энергии за счет механизма, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, например, посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии гена глюкозо-РЕР-пермеазы ptsG и/или гена фруктозо-РЕР-пермеазы fruA и/или генов маннозо-РЕР-пермеазы manXYZ. Наряду с экспрессией/сверхэкспрессией по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), обеспечивающий перенос моносахарида(ов) в сконструированную клетку, а также фруктокиназу (например, ген cscK Е. coli W) и глюкокиназу (например, ген glk Е, coli K-12), способную активировать фруктозу до фруктозо-6-фосфата и глюкозу до глюкозо-6-фосфата, соответственно, данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве главного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфата, фосфоенолпирувата) для продукции N-ацетилнейраминовой кислоты.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype nanKETA ^- , nagAB ^- is metabolically engineered to be an efficient producer of N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) using a feedstock of a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy. Thus, overexpression of at least one of the genes encoding either (i) glucosamine-6-phosphate acetyltransferase and N-acetylglucosamine-2-epimerase and N-acetylneuraminic acid synthetase or (ii) UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase and N-acetylneuraminic acid synthetase. Because N-acetylneuraminic acid synthesis is a phosphoenolpyruvate (PEP)-dependent process, it is preferable to avoid competing reactions that lead to PEP consumption. Thus, in a preferred embodiment, the producer strain is further engineered by reducing and/or attenuating the import of said carbon and energy source(s) through a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase dependent mechanism, for example by reducing and/or attenuating gene expression glucose-PEP permease ptsG and/or fructose-PEP permease gene fruA and/or mannose-PEP permease genes manXYZ. Along with the expression/overexpression of at least one gene encoding a transporter independent of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase (PEP-PTS independent), providing the transfer of monosaccharide(s) into the engineered cell, as well as fructokinase (for example, the cscK gene of E. coli W) and glucokinase (for example, glk E gene, coli K-12), capable of activating fructose to fructose-6-phosphate and glucose to glucose-6-phosphate, respectively, this additional genetic modification allows the cultivation of the constructed producer strain on raw materials from a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, simultaneously preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (fructose-6-phosphate, phosphoenolpyruvate) for the production of N-acetylneuraminic acid.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nagABE^-, manXYZ^-, lacZ^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент N-ацетиллактозамина (LacNAc) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также GlcNAc в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима экспрессия/сверхэкспрессия генов, кодирующих глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, способный переносить N-ацетил-глюкозамин в клетку, и β-1,4-галактозилтрансферазу, способную переносить галактозу из УДФ-Gal на свободный N-ацетилглюкозамин, с образованием, таким образом, N-ацетиллактозамина. В предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически конструируют посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатизомеразы pgi и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация обеспечивает культивирование сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (глюкозо-6-фосфат) для продукции N-ацетиллактозамина. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli pgm, galU и galE сверхэкспрессируется для содействия синтезу УДФ-Gal.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype nagABE ^- , manXYZ ^- , lacZ ^- is metabolically engineered to be an efficient producer of N-acetyllactosamine (LacNAc) using a feedstock of a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy , as well as GlcNAc as an acceptor substrate. Thus, expression/overexpression of genes encoding glucosamine-6-phosphate acetyltransferase, a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent transporter capable of transporting N-acetyl-glucosamine into the cell, and β-1,4-galactosyltransferase capable of transferring galactose from UDP-Gal is required to free N-acetylglucosamine, thus forming N-acetyllactosamine. In a preferred embodiment, the producer strain is further genetically engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate isomerase gene pgi and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf. This additional genetic modification ensures the cultivation of the constructed producer strain on raw materials from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (glucose-6-phosphate) for the production of N- acetyllactosamine. In a further embodiment, at least one of the E. coli pgm, galU and galE genes is overexpressed to promote UDP-Gal synthesis.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nagAB^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент лакто-N-биозы (LNB) посредством общей ферментации с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, необходима экспрессия/сверхэкспрессия генов, кодирующих глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, способную переносить ацетат с ацетил-КоА на глюкозамин-6-фосфат, таким образом, образуя N-ацетилглюкозамин-6-фосфат, HAD-подобную сахарофосфатазу, способную дефосфорилировать N-ацетилглюкозамин-6-фосфат, таким образом, образуя N-ацетилглюкозамин, и β-1,3-галактозилтрансферазу, способную переносить галактозу с УДФ-Gal на свободный N-ацетилглюкозамин, таким образом, образуя лакто-N-биозу. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на смешанном сырье из моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфата и глюкозо-6-фосфата) для продукции лакто-N-биозы. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli glmS, pgm, galU, galE сверхэкспрессируется для содействия синтезу GlcNAc и/или УДФ-Gal.In yet another embodiment, an E. coli strain having the nagAB ^- genotype is metabolically engineered to be an efficient producer of lacto-N-biose (LNB) through general fermentation using a feedstock of a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy. Thus, expression/overexpression of genes encoding glucosamine 6-phosphate acetyltransferase capable of transferring acetate from acetyl-CoA to glucosamine 6-phosphate, thereby generating N-acetylglucosamine 6-phosphate, a HAD-like sugar phosphatase capable of dephosphorylating N, is required -acetylglucosamine-6-phosphate, thus forming N-acetylglucosamine, and β-1,3-galactosyltransferase, capable of transferring galactose from UDP-Gal to free N-acetylglucosamine, thus forming lacto-N-biose. In one preferred embodiment, the producer strain is further genetically engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf. This additional genetic modification allows the engineered producer strain to be cultivated on mixed monosaccharide feedstock (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while simultaneously preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (fructose-6-phosphate and glucose-6- phosphate) for the production of lacto-N-biose. In a further embodiment, at least one of the E. coli genes glmS, pgm, galU, galE is overexpressed to promote the synthesis of GlcNAc and/or UDP-Gal.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, nanKETA^-, nagAB^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент 3'-сиалиллактозы с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, штамм-продуцент N-ацетилнейраминовой кислоты, как описано, генетически сконструирован посредством экспрессии гетерологичной синтетазы CMP-N-ацетилнейраминовой кислоты, синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты и α-2,3-сиалилтрансферазы, способной переносить N-ацетилнейраминовую кислоту с СМР-Neu5Ac на лактозу, образуя, таким образом, 3'-сиалиллактозу. Что касается синтеза N-ацетилнейраминовой кислоты, продукция 3'-SL представляет собой процесс, зависимый от фосфоенолпирувата (PEP). Таким образом, в предпочтительном воплощении указанный штамм-продуцент 3'-SL дополнительно сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления импортирования указанного(ых) источника(ов) углерода и энергии за счет механизма, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, например, посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии гена глюкозо-РЕР-пермеазы ptsG и/или гена фруктозо-РЕР-пермеазы fruA и/или генов маннозо-РЕР-пермеазы manXYZ. Наряду с экспрессией/сверхэкспрессией по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), обеспечивающий перенос моносахарида(ов) в сконструированную клетку, а также фруктокиназу (например, ген cscK Е. coli W) и глюкокиназу (например, ген glk Е. coli K-12), способную активировать фруктозу до фруктозо-6-фосфата и глюкозу до глюкозо-6-фосфата, соответственно, данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве главного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфата, фосфоенолпирувата) для продукции 3'-сиалиллактозы.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype lacY ⁺ , lacZ ^- , nanKETA ^- , nagAB ^- is metabolically engineered to be an efficient producer of 3'-sialyllactose using a feedstock of a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main carbon source and energy, as well as lactose as an acceptor substrate. Thus, the N-acetylneuraminic acid producing strain is, as described, genetically engineered through the expression of heterologous CMP-N-acetylneuraminic acid synthetase, N-acetylneuraminic acid synthase, and α-2,3-sialyltransferase capable of transferring N-acetylneuraminic acid from CMP- Neu5Ac on lactose, thus forming 3'-sialyllactose. Regarding N-acetylneuraminic acid synthesis, 3′-SL production is a phosphoenolpyruvate (PEP)-dependent process. Thus, in a preferred embodiment, said 3'-SL producing strain is further engineered by reducing and/or attenuating the import of said carbon and energy source(s) through a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase dependent mechanism, e.g. or weakening the expression of the glucose-PEP permease gene ptsG and/or the fructose-PEP permease gene fruA and/or the mannose-PEP permease genes manXYZ. Along with the expression/overexpression of at least one gene encoding a transporter independent of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase (PEP-PTS independent), providing the transfer of monosaccharide(s) into the engineered cell, as well as fructokinase (for example, the cscK gene of E. coli W) and glucokinase (for example, the glk gene of E. coli K-12), capable of activating fructose to fructose-6-phosphate and glucose to glucose-6-phosphate, respectively, this additional genetic modification allows the cultivation of the constructed producer strain on raw materials from a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (fructose-6-phosphate, phosphoenolpyruvate) for the production of 3'-sialyllactose.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип acY⁺, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент 3'-фукозиллактозы с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованная сахароза) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима сверхэкспрессия по меньшей мере одного из генов Е. coli manA, manC, manB, gmd и wcaG, а также экспрессия гетерологичной α-1,3-фукозилтрансферазы, способной переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лактозу, таким образом, с образованием 3-фукозиллактозы. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат) для продукции 3-фукозиллактозы.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype acY ⁺ , lacZ ^- , fuclK ^- , wcaJ ^- is metabolically engineered to be an efficient producer of 3'-fucosyllactose using a feedstock of a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main carbon source and energy, as well as lactose as an acceptor substrate. Thus, overexpression of at least one of the E. coli genes manA, manC, manB, gmd and wcaG is required, as well as expression of a heterologous α-1,3-fucosyltransferase capable of transferring fucose from GDP-fucose to lactose, thus formation of 3-fucosyllactose. In one preferred embodiment, the producer strain is further genetically engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf. This additional genetic modification allows the engineered producer strain to be cultivated on raw materials from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while simultaneously preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (fructose-6-phosphate) for the production of 3- fucosyllactose.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип acY⁺, lacZ^-, nagB, wcaJ^-, метаболически сконструирован для эффективной продукции лакто-N-триозы II (LNT-II) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима экспрессия гетерологичной β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, способной переносить N-ацетилглюкозамин с УДФ-GlcNAc на лактозу, таким образом, с образованием лакто-N-триозы II. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат) для продукции лакто-N-триозы II. В дополнительном воплощении один из генов Е. coli glmS, glmU и glmM сверхэкспрессируется для содействия синтезу УДФ-GlcNAc.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype acY ⁺ , lacZ ^- , nagB, wcaJ ^- is metabolically engineered to efficiently produce lacto-N-triose II (LNT-II) using a mixture of monosaccharides (e.g., hydrolyzed sucrose) feedstock. as the main source of carbon and energy, and lactose as an acceptor substrate. Thus, expression of a heterologous β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase capable of transferring N-acetylglucosamine from UDP-GlcNAc to lactose is required, thereby producing lacto-N-triose II. In one preferred embodiment, the producer strain is further genetically engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf. This additional genetic modification allows the engineered producer strain to be cultivated on raw materials from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while simultaneously preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (fructose-6-phosphate) for the production of lacto-6-phosphate. N-triose II. In a further embodiment, one of the E. coli genes glmS, glmU and glmM is overexpressed to promote UDP-GlcNAc synthesis.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, nagB^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован в качестве эффективного продуцента лакто-N-тетраозы (LNT) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима экспрессия гетерологичной β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, способной переносить N-ацетилглюкозамин с УДФ-GlcNAc на лактозу, и β-1,3-галактозилтрансферазы, способной переносить галактозу с УДФ-галактозы на лакто-N-триозу II, с образованием, таким образом, лакто-N-тетраозы. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf и/или гена глюкозо-6-фосфатизомеразы pgi. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфат) для продукции лакто-N-тетраозы. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli glmS, glmU, glmM, pgm, galU и galE сверхэкспрессируется для содействия синтезу УДФ-GlcNAc и/или УДФ-Gal.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype lacY ⁺ , lacZ ^- , nagB ^- , wcaJ ^- is metabolically engineered to be an efficient lacto-N-tetraose (LNT) producer using a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) feedstock in as the main source of carbon and energy, and lactose as an acceptor substrate. Thus, expression of a heterologous β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase capable of transferring N-acetylglucosamine from UDP-GlcNAc to lactose and a β-1,3-galactosyltransferase capable of transferring galactose from UDP-galactose to lacto-N-triose is required II, thus forming lacto-N-tetraose. In one preferred embodiment, the producer strain is further genetically engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf and/or the glucose-6-phosphate isomerase gene pgi. This additional genetic modification allows the engineered producer strain to be cultivated on raw materials from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while simultaneously preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (fructose-6-phosphate and glucose-6- phosphate) for the production of lacto-N-tetraose. In a further embodiment, at least one of the E. coli genes glmS, glmU, glmM, pgm, galU and galE is overexpressed to promote the synthesis of UDP-GlcNAc and/or UDP-Gal.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, nagB^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован для эффективной продукции лакто-N-неотетраозы (LNnT) посредством общей ферментации с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, штамм-продуцент LNnT генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления импортирования глюкозы за счет механизма, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, например, посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии гена глюкозо-РЕР-пермеазы ptsG при одновременной экспрессии по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), обеспечивающий перенос глюкозы в сконструированную клетку. Кроме того, уровень экспрессии гена глюкокиназы glk и/или гена глюкозодегидрогеназы gcd снижен и/или аннулирован. По существу, необходима гетерологичная экспрессия (β-1,4-галктозилтрансферазы, способной переносить галактозу с УДФ-галактозы на глюкозу, с образованием, таким образом, лактозы, и β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, способной переносить N-ацетилглюкозамин с УДФ-GlcNAc на лактозу, таким образом, с образованием лакто-N-триозы II, и β-1,4-галактозилтрансферазы, способной переносить галактозу с УДФ-галактозы на лакто-N-триозу II, с образованием, таким образом, лакто-N-неотетраозы. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf и/или гена глюкозо-6-фосфатизомеразы pgi. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (глюкоза и фруктозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфат) для продукции лакто-N-неотетраозы посредством общей ферментации. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli glmS, glmU, glmM, pgm, galU и galE сверхэкспрессируется для содействия синтезу УДФ-GlcNAc и/или УДФ-Gal.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype lacY ⁺ , lacZ ^- , nagB ^- , wcaJ ^- is metabolically engineered to efficiently produce lacto-N-neotetraose (LNnT) through general fermentation using a mixture of monosaccharide feedstocks (eg, hydrolyzed sucrose ) as a major source of carbon and energy. Thus, the LNnT producer strain is genetically engineered to reduce and/or attenuate glucose import through a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-dependent mechanism, for example, by reducing and/or attenuating the expression of the glucose-PEP permease gene ptsG while simultaneously expressing at least one a gene encoding a transporter independent of phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase (independent of PEP-PTS), which ensures the transfer of glucose into the engineered cell. In addition, the expression level of the glucokinase gene glk and/or the glucose dehydrogenase gene gcd is reduced and/or abolished. Essentially, heterologous expression of (β-1,4-galctosyltransferase, capable of transferring galactose from UDP-galactose to glucose, thereby producing lactose, and β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase, capable of transferring N-acetylglucosamine from UDP-GlcNAc to lactose, thus forming lacto-N-triose II, and β-1,4-galactosyltransferase, capable of transferring galactose from UDP-galactose to lacto-N-triose II, thus forming lacto- N-neotetraoses In one preferred embodiment, the producer strain is further genetically engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf and/or the glucose-6-phosphate isomerase gene pgi. This additional genetic modification allows the engineered producer strain to be cultivated on raw materials from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while simultaneously preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (glucose and fructose-6-phosphate and glucose-6-phosphate). 6-phosphate) to produce lacto-N-neotetraose through general fermentation. In a further embodiment, at least one of the E. coli genes glmS, glmU, glmM, pgm, galU and galE is overexpressed to promote the synthesis of UDP-GlcNAc and/or UDP-Gal.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY^-, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован для эффективной продукции 2'-фукозиллактозы посредством общей ферментации с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, уровень экспрессии гена глюкокиназы glk и/или гена глюкозодегидрогеназы gcd, а также активность механизма, зависимого от фосфоенолпируват:люкозофосфотрансферазы, снижен и/или аннулирован. Кроме того, ген транспортера, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), экспрессируется или сверхэкспрессируется в указанном штамме Е. coli. Кроме того, по меньшей мере один из генов Е. coli manA, manC, manB, gmd, wcaG, pgm, galU и gale, а также гетерологичная β-1,4-галактозилтранфераза, способная переносить галактозу с УДФ-галактозы на глюкозу, с образованием, таким образом, лактозы, и α-1,2-фукозилтрансфераза, способная переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лактозу, с образованием, таким образом, 2'-фукозиллактозы, экспрессируются/сверхэкспрессируются. В предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf и/или гена глюкозо-6-фосфатизомеразы pgi. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (глюкоза и фруктозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфат) для продукции 2'-фукозиллактозы посредством общей ферментации.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype lacY ^- , lacZ ^- , fuclK ^- , wcaJ ^- is metabolically engineered to efficiently produce 2'-fucosyllactose through general fermentation using a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as the main feedstock source of carbon and energy. Thus, the level of expression of the glucokinase gene glk and/or the glucose dehydrogenase gene gcd, as well as the activity of the phosphoenolpyruvate: glucose phosphotransferase-dependent mechanism, is reduced and/or abolished. In addition, a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase independent transporter gene (PEP-PTS independent) is expressed or overexpressed in the specified E. coli strain. In addition, at least one of the E. coli genes manA, manC, manB, gmd, wcaG, pgm, galU and gale, as well as a heterologous β-1,4-galactosyltransferase capable of transferring galactose from UDP-galactose to glucose, with thus producing lactose, and α-1,2-fucosyltransferase capable of transferring fucose from GDP-fucose to lactose, thereby producing 2'-fucosyllactose, are expressed/overexpressed. In a preferred embodiment, the producer strain is further engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB and/or the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene zwf and/or the glucose-6-phosphate isomerase gene pgi. This additional genetic modification allows the engineered producer strain to be cultivated on raw materials from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while simultaneously preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (glucose and fructose-6-phosphate and glucose-6-phosphate). 6-phosphate) to produce 2'-fucosyllactose through general fermentation.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^- manA^-, метаболически сконструирован в качестве эффективного продуцента 2'3-дифукозиллактозы с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима экспрессия генов, демонстрирующих фруктокиназную активность (например, ген так Е. coli K-12) и активность механизма, зависимого от фосфоенолпируват:фруктозофосфотрансферазы, снижена и/или аннулирована. Данная клетка дополнительно генетически сконструирована посредством экспрессии/сверхэкспрессии по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от фосфоенолпируват:фруктозофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), обеспечивающий перенос фруктозы в сконструированную клетку, маннозоизомеразу, способную превращать фруктозу в маннозу (например, yihS Е. coli BL21, manl Agrobacterium radiobacter М-1), маннокиназу (например, manK Prevotella bryantii В₁4, manK Arthrobacter sp.штамм KM), способную активировать маннозу до маннозо-6-фосфата, а также по меньшей мере одну гетерологичную фукозилтрансферазу, демонстрирующую α-1,2- и/или α-1,3-фукозилтрансферазную активность, способную переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лактозу и/или 2'-фукозиллактозу и/или 3-фукозиллактозу, таким образом, образуя 2'3-дифукозиллактозу. Данные дополнительные генетические модификации делают возможной культивацию сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (маннозу/маннозо-6-фосфата) для продукции 2'3-дифукозиллактозы. В дополнительном воплощении сверхэкспрессия по меньшей мере одного из генов Е. coli manC, manB, gmd и wcaG сверхэкспрессируется для содействия синтезу ГДФ-Fuc.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype lacY ⁺ , lacZ ^- , fuclK ^- , wcaJ ^- manA ^- is metabolically engineered to be an efficient producer of 2'3-difucosyllactose using a mixture of monosaccharides (eg, hydrolyzed sucrose) as feedstock. the main source of carbon and energy, as well as lactose as an acceptor substrate. Thus, expression of genes exhibiting fructokinase activity (eg, the E. coli K-12 gene) is required and the activity of the phosphoenolpyruvate:fructose phosphotransferase-dependent pathway is reduced and/or abolished. The cell is further genetically engineered through the expression/overexpression of at least one gene encoding a phosphoenolpyruvate:fructose phosphotransferase-independent transporter (PEP-PTS independent) that transports fructose into the engineered cell, mannose isomerase capable of converting fructose to mannose (e.g., yihS E coli BL21, manl Agrobacterium radiobacter M-1), mannokinase (for example, manK Prevotella bryantii B ₁ 4, manK Arthrobacter sp.strain KM), capable of activating mannose to mannose-6-phosphate, as well as at least one heterologous fucosyltransferase, exhibiting α-1,2- and/or α-1,3-fucosyltransferase activity capable of transferring fucose from GDP-fucose to lactose and/or 2'-fucosyllactose and/or 3-fucosyllactose, thereby forming 2'3- difucosyllactose. These additional genetic modifications make it possible to cultivate the engineered producer strain on a raw material from a mixture of monosaccharides (for example, hydrolyzed sucrose) as the main source of carbon and energy, while preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (mannose/mannose-6-phosphate) for production of 2'3-difucosyllactose. In a further embodiment, at least one of the E. coli genes manC, manB, gmd and wcaG is overexpressed to promote GDP-Fuc synthesis.

Неограничивающие примеры для подходящих белков, демонстрирующих маннозоизомеразную активность (Manl) или маннокиназную активность (ManK), могут быть обнаружены в литературе (Hirose et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar;65(3):658-61; Hirose et al., Biotechnol Lett. 2003 Feb;25(4):349-52; Patel et al., Appl Environ Microbiol. 2011 May;77(10):3343-50; Hu et al., Int J Biol Macromol. 2016 Aug;89:328-35; Huang et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Mar;102(5):2051-2062; Mukai et al., Appl Environ Microbiol. 2003 Jul;69(7):3849-57; Fields and Russel, Microbiology. 2001 Apr;147(Pt 4):1035-43; Kroschewski et al., Mol Biochem Parasitol. 2000 Jan 5;105(1):71-80.).Non-limiting examples for suitable proteins exhibiting mannose isomerase activity (Manl) or mannokinase activity (ManK) can be found in the literature (Hirose et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar;65(3):658-61; Hirose et al. , Biotechnol Lett. 2003 Feb;25(4):349-52; Patel et al., Appl Environ Microbiol. 2011 May;77(10):3343-50; Hu et al., Int J Biol Macromol. 2016 Aug; 89:328-35; Huang et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Mar;102(5):2051-2062; Mukai et al., Appl Environ Microbiol. 2003 Jul;69(7):3849-57; Fields and Russel, Microbiology. 2001 Apr;147(Pt 4):1035-43; Kroschewski et al., Mol Biochem Parasitol. 2000 Jan 5;105(1):71-80.).

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nagAB^-, fuclK^-, wcaJ, метаболически сконструирован в качестве эффективного продуцента Н-антигена I типа (НА-Т I) посредством общей ферментации с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, смеси гидролизованной сахарозы и гидролизованной лактозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, штамм-продуцент генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления импортирования глюкозы за счет механизма, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, одновременно с экспрессией/сверхэкспрессией по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от PEP-PTS, а также моносахаридкиназу, делающую возможным перенос глюкозы и/или галактозы в сконструированную клетку, а также активирующую данные моносахариды в фосфорилированную форму, соответственно. Кроме того, по меньшей мере экспрессируется/сверхэкспрессируется один ген, кодирующий глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, способную переносить ацетат с ацетил-КоА на глюкозамин-6-фосфат, с образованием, таким образом, N-ацетилглюкозамин-6-фосфата, HAD-подобную сахарофосфатазу, способную дефосфорилировать N-ацетилглюкозамин-6-фосфат, с образованием, таким образом, N-ацетилглюкозамина, гетерологичную β-1,3-галактозилтранферазу, способную переносить галактозу с УДФ-галактозы на N-ацетилглюкозамин, с образованием, таким образом, лакто-N-биозы, и α-1,2-фукозилтрансферазу, способную переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лакто-N-биозу, с образованием Н-антигена I типа. В предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически конструируют посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB. Данные генетические модификации обеспечивает культивирование сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, смесь гидролизованной сахарозы и гидролизованной лактозы) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (N-ацетилглюкозамин, фруктозо-6-фосфат и галактозо-1-фосфат) для продукции Н-антигена I типа. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli glmS, galT, galE, manC, manB, gmd и wcaG сверхэкспрессируется для содействия синтезу GlcNAc и/или УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc.In yet another embodiment, an E. coli strain having the genotype nagAB ^- , fuclK ^- , wcaJ is metabolically engineered to be an efficient producer of H antigen type I (HA-T I) through general fermentation using a mixture of monosaccharides feedstock (e.g., a mixture of hydrolyzed sucrose and hydrolyzed lactose) as the main source of carbon and energy. Thus, the producer strain is genetically engineered to reduce and/or attenuate glucose import through a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-dependent mechanism, concomitantly with the expression/overexpression of at least one gene encoding a PEP-PTS-independent transporter as well as a monosaccharide kinase, making it possible to transfer glucose and/or galactose into the engineered cell, as well as activating these monosaccharides into a phosphorylated form, respectively. In addition, at least one gene is expressed/overexpressed encoding a glucosamine-6-phosphate acetyltransferase capable of transferring acetate from acetyl-CoA to glucosamine-6-phosphate, thereby forming N-acetylglucosamine-6-phosphate, HAD-like a sugar phosphatase capable of dephosphorylating N-acetylglucosamine-6-phosphate, thus forming N-acetylglucosamine, a heterologous β-1,3-galactosyltransferase, capable of transferring galactose from UDP-galactose to N-acetylglucosamine, thus forming lacto -N-biose, and α-1,2-fucosyltransferase, capable of transferring fucose from GDP-fucose to lacto-N-biose, forming type I H-antigen. In a preferred embodiment, the producer strain is further genetically engineered by reducing and/or attenuating the expression of the phosphofructokinase genes pfkA and/or pfkB. These genetic modifications ensure the cultivation of the constructed producer strain on raw materials from a mixture of monosaccharides (for example, a mixture of hydrolyzed sucrose and hydrolyzed lactose) as the main source of carbon and energy, while preventing inhibition of the strain's metabolism, but increasing the supply of the precursor (N-acetylglucosamine, fructose-6 -phosphate and galactose-1-phosphate) for the production of type I H antigen. In a further embodiment, at least one of the E. coli genes glmS, galT, galE, manC, manB, gmd and wcaG is overexpressed to promote the synthesis of GlcNAc and/or UDP-Gal and/or GDP-Fuc.

В отношении Фиг. 1, схематично показана типичная природная микробная клетка. Указанная микробная клетка способна потреблять смешанное сырье, состоящее из глюкозы и фруктозы, что приводит к получению незначительного внутриклеточного пула глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата. Микробная клетка экспрессирует полинуклеотиды, кодирующие фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы для импортирования глюкозы и фруктозы (PTS) в клетку. Продукты реакции главным образом поступают в гликолиз.Referring to FIG. 1, a typical natural microbial cell is schematically shown. This microbial cell is capable of consuming mixed raw materials consisting of glucose and fructose, which leads to the production of a small intracellular pool of glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate. The microbial cell expresses polynucleotides encoding phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems for importing glucose and fructose (PTS) into the cell. The reaction products mainly enter glycolysis.

На Фиг. 2 схематично изображена типичная микробная клетка по изобретению, способная поставлять глюкозо-6-фосфат в высокой степени при культивировании на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы. Поскольку экспрессия глюкозо-6-фосфатизомеразы Pgi и/или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Zwf уменьшалась или снизилась в результате делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pgi и/или zwf, любой глюкозо-6-фосфат, образованный посредством импортирования глюкозы в клетку, может быть использован микробной клеткой для образования УДФ-Glc и/или УДФ-Gal. В одном варианте микробной клетки (Фиг. 3) фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазная(ые) система(ы) для фруктозы блокирована(ы), например, посредством делеции гена fruA. Вместо этого, фруктоза поступает в клетку посредством транспортера, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (не зависимый от PEP-PTS), становясь активированной под действием фруктокиназы (например, CscK E.coli W) до фруктозо-6-фосфата. В одном варианте микробной клетки (Фиг. 4) фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазная(ые) система(ы) клетки для глюкозы также блокирована(ы), например, в результате делеции гена ptsG. Вместо этого, глюкоза поступает в клетку через транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), активируясь под действием глюкокиназы (например, Glk Е. coli K-12) до глюкозо-6-фосфата.In FIG. 2 schematically depicts a typical microbial cell according to the invention, capable of supplying glucose-6-phosphate at a high rate when cultured on a mixed feedstock of glucose and fructose. Since the expression of glucose-6-phosphate isomerase Pgi and/or glucose-6-phosphate dehydrogenase Zwf was decreased or reduced as a result of deletion, functional inactivation or silencing of the pgi and/or zwf gene(s), any glucose-6-phosphate formed by glucose import into cell, can be used by the microbial cell to produce UDP-Glc and/or UDP-Gal. In one embodiment of the microbial cell (Figure 3), the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system(s) for fructose is blocked, for example, by deletion of the fruA gene. Instead, fructose enters the cell via a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent transporter (PEP-PTS independent), becoming activated by fructokinase (eg, E. coli W CscK) to fructose-6-phosphate. In one embodiment of the microbial cell (Figure 4), the cell's phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system(s) for glucose are also blocked, for example by deletion of the ptsG gene. Instead, glucose enters the cell through a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent transporter (PEP-PTS independent), being activated by a glucokinase (eg, E. coli Glk K-12) to glucose-6-phosphate.

На Фиг. 5 схематично изображена типичная микробная клетка по изобретению, способная поставлять глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат в более высокой степени, при культивировании на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы. Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазная(ые) система(ы) клетки для фруктозы блокирована(ы), например, в результате делеции гена fruA. Вместо этого, фруктоза поступает в клетку через транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (незавсимый от PEP-PTS), активируясь под действием фруктокиназы (например, CscK Е. coli W) до фруктозо-6-фосфата. В одном варианте микробной клетки (Фиг. 6), экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фосфатдегирогеназы Zwf уменьшена или ослаблена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или zwf, что приводит к повышенной доступности глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата, которые могут использоваться микробной клеткой для образования УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-GlcNAc и/или CMP-Neu5Ac. В одном варианте микробной клетки (Фиг. 7), клетка экспрессирует полинуклеотиды, кодирующие фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы для имортирования глюкозы и фруктозы (PTS) в клетку. Экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Zwf уменьшена или ослаблена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или zwf, что приводит к повышенной доступности глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата.In FIG. 5 schematically depicts a typical microbial cell according to the invention, capable of supplying glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate to a higher extent when cultured on a mixed feedstock of glucose and fructose. Phosphoenolpyruvate: The cell's sugar phosphotransferase system(s) for fructose is blocked, for example by deletion of the fruA gene. Instead, fructose enters the cell through a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent transporter (PEP-PTS independent), being activated by fructokinase (eg, CscK E. coli W) to fructose-6-phosphate. In one embodiment of the microbial cell (Fig. 6), the expression of phosphofructokinase(ases) Pfk and/or glucose-6-phosphate dehyrogenase Zwf is reduced or attenuated by deletion, functional inactivation or silencing of the pfkA and/or pfkB and/or zwf gene(s), which leads to increased availability of glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate, which can be used by the microbial cell to form UDP-Gal and/or GDP-Fuc and/or UDP-GlcNAc and/or CMP-Neu5Ac. In one embodiment of the microbial cell (Figure 7), the cell expresses polynucleotides encoding phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems for importing glucose and fructose (PTS) into the cell. Expression of phosphofructokinase(ases) Pfk and/or glucose-6-phosphate dehydrogenase Zwf is reduced or attenuated by deletion, functional inactivation or silencing of the pfkA and/or pfkB and/or zwf gene(s), resulting in increased availability of glucose-6-phosphate and fructose 6-phosphate.

На Фиг. 8 схематично изображена типичная микробная клетка по изобретению, способная поставлять глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат в более высокой степени при культивировании на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы. Клетка экспрессирует полинуклеотиды, кодирующие фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы для импортирования глюкозы и фруктозы (PTS) в клетку. Экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фосфатизомеразы Pgi и/или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Zwf уменьшена или ослаблена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или pgi и/или zwf. Вместе со сверхэкспрессией фруктозо-1,6-бисфосфатазы (например, glpX, fbp) образуется повышенная доступность глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата, и она может быть использована микробной клеткой для образования УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-GlcNAc и/или CMP-Neu5Ac.In FIG. 8 schematically depicts a typical microbial cell according to the invention, capable of supplying glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate to a higher extent when cultured on a mixed feedstock of glucose and fructose. The cell expresses polynucleotides encoding phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems for importing glucose and fructose (PTS) into the cell. The expression of phosphofructokinase(ases) Pfk and/or glucose-6-phosphate isomerase Pgi and/or glucose-6-phosphate dehydrogenase Zwf is reduced or attenuated by deletion, functional inactivation or silencing of the gene(s) pfkA and/or pfkB and/or pgi and/or zwf. Together with overexpression of fructose-1,6-bisphosphatase (e.g., glpX, fbp), increased availability of glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate is generated and can be used by the microbial cell to produce UDP-Gal and/or GDP-Fuc and/or UDP-GlcNAc and/or CMP-Neu5Ac.

На Фиг. 9 схематично изображена типичная микробная клетка по изобретению, способная генерировать высокую доступность глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата и фосфоенолпирувата при культивации на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы.In FIG. 9 schematically depicts a typical microbial cell of the invention capable of generating high availability of glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate and phosphoenolpyruvate when cultured on a mixed feedstock of glucose and fructose.

Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы клетки для глюкозы и фруктозы блокированы, например, посредством делеции генов ptsG и fruA, соответственно. Вместо этого, фруктоза и глюкоза поступают в клетку посредством транспортера, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (не зависимого от PEP-PTS), активируемые под действием фруктокиназы (например, CscK Е. coli W) и глюкокиназы (например, Glk Е. coli K12), до фруктозо-6-фосфата и глюкозо-6-фосфата, соответственно. Кроме того, обходят потребление PEP фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазными системами. Наряду со сниженной и/или ослабленной экспрессией фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Zwf, реализуемой посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или zwf, достигается повышенная доступность глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата и фосфоенолпирувата. Это может быть использовано микробной клеткой для образования УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-GlcNAc и/или CMP-Neu5Ac.The cell's phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems for glucose and fructose are blocked, for example, by deleting the ptsG and fruA genes, respectively. Instead, fructose and glucose enter the cell via a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent transporter (PEP-PTS independent), activated by fructokinase (e.g. CscK E. coli W) and glucokinase (e.g. Glk E. coli K12) , to fructose-6-phosphate and glucose-6-phosphate, respectively. In addition, the consumption of PEP by phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems is bypassed. Along with reduced and/or weakened expression of phosphofructokinase(ases) Pfk and/or glucose-6-phosphate dehydrogenase Zwf, realized through deletion, functional inactivation or silencing of the gene(s) pfkA and/or pfkB and/or zwf, increased availability of glucose-6-phosphate dehydrogenase is achieved. 6-phosphate and fructose 6-phosphate and phosphoenolpyruvate. This can be used by the microbial cell to produce UDP-Gal and/or GDP-Fuc and/or UDP-GlcNAc and/or CMP-Neu5Ac.

На Фиг. 10 схематично изображена еще одна типичная микробная клетка по изобретению, способная образовывать повышенную доступность свободной глюкозы и глюкозо-6-фофата и фруктозо-6-фосфата при культивации на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы.In FIG. 10 schematically depicts another typical microbial cell of the invention capable of producing increased availability of free glucose and glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate when cultured on a mixed feedstock of glucose and fructose.

Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы клетки для глюкозы и фруктозы блокированы, например, посредством делеции генов ptsG и fruA, соответственно. Вместо этого, фруктоза и глюкоза поступают в клетку посредством транспортера, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (не зависимого от PEP-PTS). Наряду с делецией гена glk, микробная клетка генетически сконструирована таким образом, что свободный мономер-глюкоза становится доступным в клетке. Вместо этого, фруктоза активируется фруктокиназой (например, CscK Е. coli W) до фруктозо-6-фосфата. Экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фософатдегидрогеназы Zwf уменьшена или снижена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или zwf. В итоге, это приводит к улучшенной внутриклеточной поставке свободной глюкозы и глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата. Глюкоза становится доступной в качестве субстрата для различных реакций гликозилирования, тогда как глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат могут быть использованы микробной клеткой для образования УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-GlcNAc и/или CMP-Neu5Ac. Кроме того, обходят потребление PEP фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазными системами.The cell's phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems for glucose and fructose are blocked, for example, by deleting the ptsG and fruA genes, respectively. Instead, fructose and glucose enter the cell via a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent transporter (PEP-PTS independent). Along with the deletion of the glk gene, the microbial cell is genetically engineered in such a way that free glucose monomer becomes available in the cell. Instead, fructose is activated by fructokinase (eg, CscK E. coli W) to fructose 6-phosphate. The expression of phosphofructokinase(ases) Pfk and/or glucose-6-phosphate dehydrogenase Zwf is reduced or reduced by deletion, functional inactivation or silencing of the pfkA and/or pfkB and/or zwf gene(s). Ultimately, this results in improved intracellular supply of free glucose and glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate. Glucose becomes available as a substrate for various glycosylation reactions, while glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate can be used by the microbial cell to form UDP-Gal and/or GDP-Fuc and/or UDP-GlcNAc and/or CMP -Neu5Ac. In addition, the consumption of PEP by phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems is bypassed.

На Фиг. 11 схематично изображена еще одна типичная микробная клетка по изобретению, способная достигать повышенную внутриклеточную доступность свободной маннозы и/или маннозо-6-фосфата при культивации на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы.In FIG. 11 schematically depicts another exemplary microbial cell of the invention capable of achieving increased intracellular availability of free mannose and/or mannose-6-phosphate when cultured on a mixed feedstock of glucose and fructose.

Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы клетки для фруктозы блокированы, например, в результате делеции гена fruA и/или генов manXYZ. Вместо этого, фруктоза поступает в клетку посредством сахаропермеазы и/или канала. Наряду с делецией генов, демонтсрирующих фруктокиназную активность (например, так) и/или маннозо-6-фосфатизомеразную активность (например, manA), а также экспрессией/сверхэкспрессией подходящей маннозоизомеразы (ManI) и маннокиназы (ManK), микробная клетка генетически сконструирована таким образом, что маннозо-6-фосфат становится доступным в клетке. Данный маннозо-6-фосфат может быть использован микробной клеткой для образования ГДФ-Мап и/или ГДФ-Fuc.The cell's phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems for fructose are blocked, for example, as a result of deletion of the fruA gene and/or the manXYZ genes. Instead, fructose enters the cell via a sugar permease and/or channel. Along with the deletion of genes demonstrating fructokinase activity (eg so) and/or mannose-6-phosphate isomerase activity (eg manA), as well as expression/overexpression of the appropriate mannose isomerase (ManI) and mannokinase (ManK), the microbial cell is genetically engineered in this way that mannose 6-phosphate becomes available in the cell. This mannose-6-phosphate can be used by the microbial cell to form GDP-Map and/or GDP-Fuc.

На Фиг. 12 схематично изображена еще одна типичная микробная клетка по изобретению, способная образовывать более высокую внутриклеточную доступность свободного фруктозо-6-фосфата и/или галактозо-1-фосфата при культивировании на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы и галактозы. Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы клетки для глюкозы блокированы, например, посредством делеции гена ptsG. Вместо этого, глюкоза поступает в клетку посредством транспортера, неависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимого от PEP-PTS). Экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk уменьшена или ослаблена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB. Наряду с экспрессией/сверхэкспрессией подходящего транспортера, независимого от PEP-PTS, а также моносахаридкиназы, что обеспечивает перенос галактозы в сконструированную клетку, а также ее активацию до галактозо-1-фосфата, соответственно, микробная клетка генетически сконструирована таким образом, что фруктозо-6-фосфат и галактозо-1-фосфат становятся доступными в клетке. Данные фруктозо-6-фосфат и галактозо-1-фосфат могут быть использованы микробной клеткой для образования GlcNAc и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-Gal и/или CMP-Neu5Ac.In FIG. 12 schematically depicts yet another exemplary microbial cell of the invention capable of producing higher intracellular availability of free fructose-6-phosphate and/or galactose-1-phosphate when cultured on a mixed feedstock of glucose and fructose and galactose. The cell's phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems for glucose are blocked, for example, by deletion of the ptsG gene. Instead, glucose enters the cell via a phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase-independent transporter (PEP-PTS independent). The expression of phosphofructokinase(ases) Pfk is reduced or attenuated by deletion, functional inactivation or silencing of the pfkA and/or pfkB gene(s). Along with the expression/overexpression of a suitable transporter independent of PEP-PTS, as well as a monosaccharide kinase, which ensures the transfer of galactose into the engineered cell, as well as its activation to galactose-1-phosphate, accordingly, the microbial cell is genetically engineered in such a way that fructose-6 -phosphate and galactose-1-phosphate become available in the cell. These fructose-6-phosphate and galactose-1-phosphate can be used by the microbial cell to form GlcNAc and/or GDP-Fuc and/or UDP-Gal and/or CMP-Neu5Ac.

Согласно четвертому аспекту предложено применение требуемых углеводов в фармацетивческой и/или пищевой композиции, где целевой углевод предпочтительно получают способом или посредством генетически сконструированной клетки-хозяина согласно изобретению.According to a fourth aspect, the use of the desired carbohydrates in a pharmaceutical and/or food composition is provided, wherein the desired carbohydrate is preferably produced by the method or by means of a genetically engineered host cell according to the invention.

ПримерыExamples

Пример 1 - Получение сырья из смеси моносахаридовExample 1 - Obtaining raw materials from a mixture of monosaccharides

50%-ный (масс./об.) раствор сахарозы готовили посредством растворения 500 г сахарозы в воде. Конечный объем раствора составлял 1 литр. При температуре 30°С-35°С рН регулировали посредством использования 96%-ной (об./об.) серной кислоты. Затем, раствор стерилизовали в вертикальном автоклаве (Systec VX-65, Linden, Германия) при 121°С в течение 45 минут. Образцы отбирали до и после тепловой стерилизации и хранили замороженными до анализа посредством высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ осуществляли с использованием рефрактометрического детектора RID-10A (Shimadzu, Германия) и колонки Waters XBridge Amide 3,5 мкм (250×4,6 мм) (Eschborn, Германия), соединенной с системой ВЭЖХ Shimadzu. Изократическое элюирование проводили с помощью 30%-ого растворителя А (50% (об./об.) ацетонитрил в бидистиллированной воде, 0,1%-ого (об./об.) NH₄OH) и 70%-ого растворителя В (80% (об./об.) ацетонитрил в бидистиллированной воде, 0,1% (об./об.) NH₄OH) при 35°С и при скорости потока 1,4 мл мин^-1. Образцы очищали посредством твердофазной экстракции на ионообменной матрице (Strata ABW, Phenomenex). Десять микролитров образца (разведение 1:5) наносили на колонку. Наконец, определяли относительное количество выявляемых сахаров. Как изображено в таблице 2, превращение сахарозы в моносахариды глюкозу и фруктозу увеличивалось со снижением значений рН растворов до тепловой обработки. Полное расщепление сахарозыкисление осуществ можно было наблюдать при значениях рН меньше или равных 3,50, когда подляли серной кислотой.A 50% (w/v) sucrose solution was prepared by dissolving 500 g of sucrose in water. The final volume of the solution was 1 liter. At a temperature of 30°C-35°C, the pH was adjusted by using 96% (v/v) sulfuric acid. Then, the solution was sterilized in a vertical autoclave (Systec VX-65, Linden, Germany) at 121°C for 45 minutes. Samples were collected before and after heat sterilization and kept frozen until analysis by high-performance liquid chromatography (HPLC). HPLC was performed using a RID-10A refractometric detector (Shimadzu, Germany) and a Waters XBridge Amide 3.5 μm (250 × 4.6 mm) column (Eschborn, Germany) coupled to a Shimadzu HPLC system. Isocratic elution was carried out using 30% solvent A (50% (v/v) acetonitrile in bidistilled water, 0.1% (v/v) NH ₄ OH) and 70% solvent B (80% (v/v) acetonitrile in bidistilled water, 0.1% (v/v) NH ₄ OH) at 35°C and at a flow rate of 1.4 ml min ^-1 . Samples were purified by solid-phase extraction on an ion exchange matrix (Strata ABW, Phenomenex). Ten microliters of sample (1:5 dilution) was applied to the column. Finally, the relative amount of detected sugars was determined. As shown in Table 2, the conversion of sucrose to the monosaccharides glucose and fructose increased with decreasing pH values of the solutions before heat treatment. Complete breakdown of sucrose acidification entities could be observed at pH values less than or equal to 3.50 when sulfuric acid was added.

Пример 2 - Зависимый от сырья рост разных штаммов с делецией геновExample 2 - Raw material-dependent growth of different gene deletion strains

Сравнивали поведение роста штамма Е. coli BL21(DE3) (дикий тип), а также мутированных штаммов Е. coli pfkA^- (ApfkA), Е. coli pfkB^- (ΔpfkB), E.coli pfkA^- pfkB^-(ΔpfkA ΔpfkA). Геномные делеции осуществляли в соответствии со способом Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Все штаммы культивировали при 30°C в встряхиваемых колбах, объемом 100 мл, с 20 мл среды на основе минеральных солей, содержащей 7 г⋅л^-1 NH₄H₂PO₄, 7 г⋅л^-1 K₂HPO₄, 2 г⋅л^-1KOH, 0,3 г⋅л^-1 лимонной кислоты, 2 г⋅л^-1 MgSO₄ × 7⋅H₂O и 0,015 г⋅л^-1 CaCI₂ × 6⋅H₂O, с добавлением 1 мл⋅л^-1 раствора микроэлементов (54,4 г⋅л^-1 цитрат железа (III)-аммония, 9,8 г⋅л^-1 MnCI₂ × 4⋅H₂O, 1,6 г⋅L^-1 CoCI₂ × 6⋅H₂O, 1 г⋅л^-1 CuCI₂ × 2⋅H₂O, 1,9 г⋅л^-1 Н_{3 B}O₃, 9 г⋅л^-1 ZnSO₄ × 7⋅H₂O, 1,1 г⋅л^-1 Na₂MoO₄ × 2⋅H₂O, 1,5 г⋅л^-1 Na₂SeO₃, 1,5 г⋅л^-1 NiSO₄ × 6⋅H₂O), и содержащей или 2% (масс./об.) глюкозы (А) или 1% (масс/об.) глюкозы/1% (масс/об.) фруктозы (В) в качестве источника углерода. Культуры инокулировали до OD (от англ. optical density - оптическая плотность) 0,1, и развитие роста отслеживали на протяжении 26 часов посредством измерения OD₆₀₀. Как показано на Фиг. 2, E.coli pfkA^-pfkB^- лишь незначительно демонстрировали рост, когда глюкозу предоставляли в качестве единственного источника углерода и энергии, тогда как их рост был неотличим от штамма дикого типа, а также мутантов с одной единственной делецией, когда было доступно сырье из смеси моносахаридов.The growth behavior of the E. coli strain BL21(DE3) (wild type), as well as the mutated strains E. coli pfkA ^- (ApfkA), E. coli pfkB ^- (ΔpfkB), E. coli pfkA ^- pfkB ^- (ΔpfkA ΔpfkA) were compared. Genomic deletions were performed according to the method of Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). All strains were cultivated at 30°C in shake flasks, volume 100 ml, with 20 ml of medium based on mineral salts containing 7 g⋅l ^-1 NH ₄ H ₂ PO ₄ , 7 g⋅l ^-1 K ₂ HPO ₄ , 2 g⋅l ^-1 KOH, 0.3 g⋅l ^-1 citric acid, 2 g⋅l ^-1 MgSO ₄ × 7⋅H ₂ O and 0.015 g⋅l ^-1 CaCI ₂ × 6⋅H ₂ O, with the addition 1 ml⋅l ^-1 solution of trace elements (54.4 g⋅l ^-1 iron (III)-ammonium citrate, 9.8 g⋅l ^-1 MnCI ₂ × 4⋅H ₂ O, 1.6 g⋅L ^-1 CoCI ₂ × 6⋅H ₂ O, 1 g⋅l ^-1 CuCI ₂ × 2⋅H ₂ O, 1.9 g⋅l ^-1 H _{3 BO} ₃ , 9 g⋅l ^-1 ZnSO ₄ × 7⋅H ₂ O, 1.1 g⋅l ^-1 Na ₂ MoO ₄ × 2⋅H ₂ O, 1.5 g⋅l ^-1 Na ₂ SeO ₃ , 1.5 g⋅l ^-1 NiSO ₄ × 6⋅H ₂ O), and containing either 2% (w/v) glucose (A) or 1% (w/v) glucose/1% (w/v) fructose (B) as a carbon source. Cultures were inoculated to an OD (optical density) of 0.1, and growth progress was monitored over 26 hours by measuring OD ₆₀₀ . As shown in FIG. 2, E. coli pfkA ^- pfkB ^- showed only marginal growth when glucose was provided as the sole source of carbon and energy, whereas their growth was indistinguishable from the wild type strain as well as single deletion mutants when feedstock from the mixture was available monosaccharides.

Пример 3 - Продукция 2'-фукозиллактозы посредством сконструированного штамма E.coliExample 3 - Production of 2'-fucosyllactose by an engineered E. coli strain

Штамм Е. coli BL21 (DE3), демонстрирующий генотип lacY⁺, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^-, pfkA^-, дополнительно генетически конструировали посредством сверхэкспрессии ферментов для синтеза de novo ГДФ-фукозы (ManB, ManC, Gmd, WcaG), гена 2'-фукозилтрансферазы wbgL из E.coli: O126, эффлюксного транспортера yberc0001_9420 из Yersinia bercovieri АТСС 43970 и кластера генов esc Е. coli W (№доступа СР002185.1), содержащего гены для сахаропермеазы, фруктокиназы, сахарогидролазы, а также транскрипционного репрессора (гены cscB, cscK, cscA, и cscR, соответственно), обеспечивающего рост штамма на сахарозе в качестве единственного источника углерода. Геномные делеции осуществляли в соответствии со способом Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Геномную интеграцию гетерологичных генов проводили посредством транспозиции. Любую транспозазу EZ-Tn5TM (Epicentre, США) использовали для интеграции фрагментов линейной ДНК, или гиперактивный С9-мутант транспозазы mariner Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, США 96:11428-11433) использовали для транспозиции. Гены подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в Е. coli и получали синтетически посредством кооперации GenScript. Полученный в результате штамм культивировали при 30°С во встряхиваемых колбах, объемом 100 мл, с 20 мл среды на основе минеральных солей, содержащей 3 г/л KH₂PO₄, 12 г/л K₂HPO₄, 5 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,3 г/л лимонной кислоты, 2 г/л MgSO₄ × 7H₂O, 0,1 г/л NaCI и 0,015 г/л CaCI₂ × 6H₂O с 1 мл/л раствора микроэлементов (54,4 г/л цитрата железа (III)-аммония, 9,8 г/л MnCI₂ × 4H₂O, 1,6 г/л CoCI₂ × 6H₂O, 1 г/л CuCI₂ × 2H₂O, 1,9 г/л Н_{3 В}О₃, 9 г/л ZnSO₄ × 7H₂O, 1,1 г/л Na₂MoO₄ 2H₂O, 1,5 г/л Na₂SeO₃, 1,5 г/л NiSO₄ × 6H₂O), и содержащей 2% (об./об.) глицерин, 2% (масс/об.) сахарозу, подвергающуюся стерильной фильтрации, или 2% гидролизат сахарозы в качестве источника углерода. Кроме того, добавляли 15 мМ лактозу, служащую в качестве акцепторного субстрата для продукции 2'-фукозиллактозы. Культуры инокулировали до OD 0,1, и культивацию останавливали, спустя 26 часов. Для количественной оценки 2'-FL в культуральном бульоне ВЭЖХ-анализ проводили, используя рефрактометрический детектор RID-10A (RID-10A) (Shimadzu, Германия) и колонку Waters XBridge Amide 3,5 мкм (250×4,6 мм) (Eschborn, Германия), соединенную с системой ВЭЖХ (Shimadzu, Германия). Элюирование проводили изократически с помощью 30%-ого А: 50% (об./об.) ACN в ddH₂O, 0,1% (об./об.) NH₄OH и 70%-ого В: 80% (об./об.) ACN в ddH₂O, 0,1% (об./об.) NH₄OH (об./об.) в качестве элюента при 35°С и при скорости потока 1,4 мл⋅мин^-1. Культуральный супернатант подвергали стерильной фильтрации (размер пор 0,22 мкм) и чистили посредством твердофазной экстракции на ионообменной матрице (Strata ABW, Phenomenex). 10 мкл образцов наносили на колонку, и концентрацию 2'-фукозиллактозы рассчитывали в соответствии со стандартной кривой. Продуктивность сконструированного штамма во время роста на глицерине имело значение 100%. Как изображено в таблице 3, продукция 2'-FL была самая высокая, когда гидролизат сахарозы был предоставлен в качестве источника углерода и энергии.E. coli strain BL21 (DE3), displaying the genotype lacY ⁺ , lacZ ^- , fuclK ^- , wcaJ ^- , pfkA ^- , was further genetically engineered through overexpression of enzymes for de novo synthesis of GDP-fucose (ManB, ManC, Gmd, WcaG), gene 2'-fucosyltransferase wbgL from E. coli: O126, efflux transporter yberc0001_9420 from Yersinia bercovieri ATCC 43970 and the esc gene cluster of E. coli W (accession no. CP002185.1), containing genes for sugar permease, fructokinase, sugar hydrolase, as well as transcriptional repress ora ( genes cscB, cscK, cscA, and cscR, respectively), ensuring the growth of the strain on sucrose as the sole carbon source. Genomic deletions were performed according to the method of Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Genomic integration of heterologous genes was carried out through transposition. Any transposase EZ-Tn5TM (Epicentre, USA) was used for integration of linear DNA fragments, or the hyperactive C9 mutant of mariner transposase Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96:11428-11433) was used for transposition. The genes were codon optimized for expression in E. coli and produced synthetically through the GenScript collaboration. The resulting strain was cultivated at 30°C in 100 ml shake flasks with 20 ml of a medium based on mineral salts containing 3 g/l KH ₂ PO ₄ , 12 g/l K ₂ HPO ₄ , 5 g/l ( NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.3 g/l citric acid, 2 g/l MgSO ₄ × 7H ₂ O, 0.1 g/l NaCI and 0.015 g/l CaCI ₂ × 6H ₂ O with 1 ml/l solution of trace elements (54.4 g/l iron (III)-ammonium citrate, 9.8 g/l MnCI ₂ × 4H ₂ O, 1.6 g/l CoCI ₂ × 6H ₂ O, 1 g/l CuCI ₂ × 2H ₂ O, 1.9 g/l H _{3 B} O ₃ , 9 g/l ZnSO ₄ × 7H ₂ O, 1.1 g/l Na ₂ MoO ₄ 2H ₂ O, 1.5 g/l Na ₂ SeO ₃ , 1.5 g/l NiSO ₄ × 6H ₂ O), and containing 2% (v/v) glycerol, 2% (w/v) sterile filtered sucrose, or 2% sucrose hydrolyzate as carbon source. In addition, 15 mM lactose was added to serve as a acceptor substrate for the production of 2'-fucosyllactose. Cultures were inoculated to an OD of 0.1 and culture was stopped after 26 hours. To quantify 2'-FL in the culture broth, HPLC analysis was performed using a RID-10A refractometric detector (RID-10A) (Shimadzu, Germany) and a Waters XBridge Amide 3.5 μm (250 × 4.6 mm) column (Eschborn , Germany) connected to an HPLC system (Shimadzu, Germany). Elution was carried out isocratically with 30% A: 50% (v/v) ACN in ddH ₂ O, 0.1% (v/v) NH ₄ OH and 70% B: 80% ( v/v) ACN in ddH ₂ O, 0.1% (v/v) NH ₄ OH (v/v) as eluent at 35°C and at a flow rate of 1.4 ml⋅min ^-1 . The culture supernatant was sterile filtered (0.22 μm pore size) and purified by solid phase extraction on an ion exchange matrix (Strata ABW, Phenomenex). 10 μL of samples were applied to the column, and the concentration of 2′-fucosyllactose was calculated according to the standard curve. The productivity of the constructed strain during growth on glycerol was 100%. As depicted in Table 3, 2'-FL production was highest when sucrose hydrolyzate was provided as a carbon and energy source.

Пример 4 - Общая ферментация 2'-фукозиллактозы сконструированным штаммом Е. coli во время роста на сырье из смеси моносахаридовExample 4 - General fermentation of 2'-fucosyllactose by an engineered E. coli strain during growth on a mixture of monosaccharides

Штамм Е. coli BL21 (DE3), демонстрирующий генотип pfkA^-, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^-, glk^-, gcd^-, ptsG^-, дополнительно генетически конструировали посредством сверхэкспрессии ферментов для синтеза de novo ГДФ-фукозы (ManB, ManC, Gmd, WcaG), гена 2'-фукозилтрансферазы wbgL из Е. coli: O126, гена эффлюксного транспортера сахара yberc0001_9420 из Yersinia bercovieri АТСС 43970, гена транспортера глюкозы glf из Zymomonas mobilis, гена β-1,4-галактозилтрансферазы ga1Tpm1141 из Pasteurella multocida (GenBank: АЕС04686), а также генов Е. coli galE и pgm, кодирующих УДФ-глюкозо-4-эпимеразу и фосфоглюкомутазу, соответственно. Геномные делеции осуществляли в соответствии со способом Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Геномную интеграцию гетерологичных генов проводили посредством транспозиции. Любую транспозазу EZ-Tn5TM (Epicentre, США) использовали для интеграции фрагментов линейной ДНК, или гиперактивный С9-мутант транспозазы mariner Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96:11428-11433) использовали для транспозиции. Гены подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в E.coli и получали синтетически посредством кооперации GenScript.E. coli strain BL21 (DE3), displaying the genotype pfkA ^- , lacZ ^- , fuclK ^- , wcaJ ^- , glk ^- , gcd ^- , ptsG ^- , was further genetically engineered by overexpressing enzymes for the de novo synthesis of GDP-fucose (ManB, ManC, Gmd, WcaG), 2'-fucosyltransferase gene wbgL from E. coli: O126, sugar efflux transporter gene yberc0001_9420 from Yersinia bercovieri ATCC 43970, glucose transporter gene glf from Zymomonas mobilis, β-1,4-galactosyltransferase gene ga1Tpm1141 from Pasteurella multoc ida ( GenBank: AEC04686), as well as the E. coli galE and pgm genes encoding UDP-glucose-4-epimerase and phosphoglucomutase, respectively. Genomic deletions were performed according to the method of Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Genomic integration of heterologous genes was carried out through transposition. Any transposase EZ-Tn5TM (Epicentre, USA) was used for the integration of linear DNA fragments, or the hyperactive C9 mutant of the mariner Himar1 transposase (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96:11428-11433) was used for transposition. The genes were codon optimized for expression in E. coli and produced synthetically through the GenScript collaboration.

Полученный штамм E.coli культивировали при 30°С в ферментере, объемом 3 л (New Brunswick, Edison, США), начиная с 1000 мл среды на основе минеральных солей, содержащей 7 г⋅л^-1 NH₄H₂PO₄, 7 г⋅л^-1 KHPO₄, 2 г⋅л^-1 KOH, 0,3 г⋅л^-1 лимонной кислоты, 2 г⋅л^-1 MgSO₄ × 7⋅H₂O и 0,015 г⋅л^-1 CaCI₂ × 6⋅H₂O с добавлением раствора микроэлементов 1 мл⋅л^-1 (54,4 г⋅л^-1 цитрата железа (III)-аммония, 9,8 г⋅л^-1 MnCI₂ × 4⋅H₂O, 1,6 г⋅л^-1 CoCI₂ × 6⋅H₂O, 1 г⋅л^-1 CuCI₂ × 2⋅H₂O, 1,9 г⋅л^-1 Н_{3 B}O₃, 9 г⋅л^-1 ZnSO₄ × 7⋅H₂O, 1,1 г⋅л^-1 Na₂MoO₄ × 2⋅H₂O, 1,5 г⋅л^-1 Na₂SeO₃, 1,5 г⋅л^-1 NiSO₄ × 6⋅H₂O) и содержащей 2% (масс/об.) гидролизованной сахарозы в качестве источника углерода. Культивирование начинали с добавления 2,5% (об./об.) инокулюма из предварительной культуры, растущей на той же среде. Конец фазы периодического процесса характеризовался подъемом уровня растворенного кислорода. Добавку углерода, состоящую из полностью гидролизованной сахарозы с добавлением 2 г⋅л^-1MgSO₄ × 7⋅H₂O, 0,015 г⋅л^-1 CaCI₂ × 6-H₂O и 1 мл⋅л^-1 раствора микроэлементов, применяли сразу после окончания фазы периодического процесса. Применяли скорость подпитки 12,0-15,0 мл⋅л^-1⋅ч^-1, относительно исходного объема. Аэрацию поддерживали на уровне 3 л⋅мин^-1. Растворенный кислород поддерживали на уровне 20-30% насыщения посредством осуществления контроля над скоростью перемешивания. рН поддерживали на уровне 6,7 посредством добавления 25%-го раствора аммония. Культивирование длилось на протяжении 86 часов и давало существенные количества 2'-FL в супернатанте культуры.The resulting E. coli strain was cultivated at 30°C in a 3-liter fermenter (New Brunswick, Edison, USA), starting with 1000 ml of a medium based on mineral salts containing 7 g⋅l ^-1 NH ₄ H ₂ PO ₄ , 7 g⋅l ^-1 KHPO ₄ , 2 g⋅l ^-1 KOH, 0.3 g⋅l ^-1 citric acid, 2 g⋅l ^-1 MgSO ₄ × 7⋅H ₂ O and 0.015 g⋅l ^-1 CaCI ₂ × 6⋅H ₂ O with the addition of a solution of trace elements 1 ml⋅l ^-1 (54.4 g⋅l ^-1 iron (III)-ammonium citrate, 9.8 g⋅l ^-1 MnCI ₂ × 4⋅H ₂ O, 1.6 g⋅l ^-1 CoCI ₂ × 6⋅H ₂ O, 1 g⋅l ^-1 CuCI ₂ × 2⋅H ₂ O, 1.9 g⋅l ^-1 H _{3 BO} ₃ , 9 g⋅l ^-1 ZnSO ₄ × 7⋅H ₂ O, 1.1 g⋅l ^-1 Na ₂ MoO ₄ × 2⋅H ₂ O, 1.5 g⋅l ^-1 Na ₂ SeO ₃ , 1.5 g⋅l ^{- 1} NiSO ₄ × 6⋅H ₂ O) and containing 2% (w/v) hydrolyzed sucrose as a carbon source. Cultivation was started by adding 2.5% (v/v) inoculum from a preculture growing on the same medium. The end of the periodic process phase was characterized by a rise in dissolved oxygen levels. A carbon supplement consisting of fully hydrolyzed sucrose with the addition of 2 g⋅L ^-1 MgSO ₄ × 7⋅H ₂ O, 0.015 g⋅L ^-1 CaCI ₂ × 6-H ₂ O and 1 ml⋅L ^-1 trace element solution was used immediately after the end of the batch process phase. A recharge rate of 12.0-15.0 ml⋅l ^-1 ⋅h ^-1 was used, relative to the initial volume. Aeration was maintained at 3 l⋅min ^-1 . Dissolved oxygen was maintained at 20-30% saturation by controlling the stirring rate. The pH was maintained at 6.7 by adding 25% ammonium solution. Culture lasted for 86 hours and produced significant amounts of 2'-FL in the culture supernatant.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES

<110> Jennewein Biotechnologie GmbH<110> Jennewein Biotechnologie GmbH

<120> ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ПРОДУКЦИЯ УГЛЕВОДОВ МИКРОБНЫМИ КЛЕТКАМИ С <120> ENZYMATIVE PRODUCTION OF CARBOHYDRATES BY MICROBIAL CELLS WITH

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СМЕШАННОГО СЫРЬЯUSING MIXED RAW MATERIALS

<130> P 1901 WO<130>P 1901 WO

<160> 16<160> 16

<170> PatentIn version 3.5<170> Patent In version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 1395<211> 1395

<212> ДНК<212> DNA

<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli

<400> 1<400> 1

atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa tgacgttttt cgtctgcttc atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa tgacgttttt cgtctgcttc

60 60

cttgccgctc tggcgggatt actctttggc ctggatatcg gtgtaattgc tggcgcactg cttgccgctc tggcgggatt actctttggc ctggatatcg gtgtaattgc tggcgcactg

120 120

ccgtttattg cagatgaatt ccagattact tcgcacacgc aagaatgggt cgtaagctcc ccgtttattg cagatgaatt ccagattact tcgcacacgc aagaatgggt cgtaagctcc

180 180

atgatgttcg gtgcggcagt cggtgcggtg ggcagcggct ggctctcctt taaactcggg atgatgttcg gtgcggcagt cggtgcggtg ggcagcggct ggctctcctt taaactcggg

240 240

cgcaaaaaga gcctgatgat cggcgcaatt ttgtttgttg ccggttcgct gttctctgcg cgcaaaaaga gcctgatgat cggcgcaatt ttgtttgttg ccggttcgct gttctctgcg

300 300

gctgcgccaa acgttgaagt actgattctt tcccgcgttc tactggggct ggcggtgggt gctgcgccaa acgttgaagt actgattctt tcccgcgttc tactggggct ggcggtgggt

360 360

gtggcctctt ataccgcacc gctgtacctc tctgaaattg cgccggaaaa aattcgtggc gtggcctctt ataccgcacc gctgtacctc tctgaaattg cgccggaaaa aattcgtggc

420 420

agtatgatct cgatgtatca gttgatgatc actatcggga tcctcggtgc ttatctttct agtatgatct cgatgtatca gttgatgatc actatcggga tcctcggtgc ttatctttct

480 480

gataccgcct tcagctacac cggtgcatgg cgctggatgc tgggtgtgat tatcatcccg gataccgcct tcagctacac cggtgcatgg cgctggatgc tgggtgtgat tatcatcccg

540 540

gcaattttgc tgctgattgg tgtcttcttc ctgccagaca gcccacgttg gtttgccgcc gcaattttgc tgctgattgg tgtcttcttc ctgccagaca gcccacgttg gtttgccgcc

600 600

aaacgccgtt ttgttgatgc cgaacgcgtg ctgctacgcc tgcgtgacac cagcgcggaa aaacgccgtt ttgttgatgc cgaacgcgtg ctgctacgcc tgcgtgacac cagcgcggaa

660 660

gcgaaacgcg aactggatga aatccgtgaa agtttgcagg ttaaacagag tggctgggcg gcgaaacgcg aactggatga aatccgtgaa agtttgcagg ttaaacagag tggctgggcg

720 720

ctgtttaaag agaacagcaa cttccgccgc gcggtgttcc ttggcgtact gttgcaggta ctgtttaaag agaacagcaa cttccgccgc gcggtgttcc ttggcgtact gttgcaggta

780 780

atgcagcaat tcaccgggat gaacgtcatc atgtattacg cgccgaaaat cttcgaactg atgcagcaat tcaccgggat gaacgtcatc atgtattacg cgccgaaaat cttcgaactg

840 840

gcgggttata ccaacactac cgagcaaatg tgggggaccg tgattgtcgg cctgaccaac gcgggttata ccaacactac cgagcaaatg tgggggaccg tgattgtcgg cctgaccaac

900 900

gtacttgcca cctttatcgc aatcggcctt gttgaccgct ggggacgtaa accaacgcta gtacttgcca cctttatcgc aatcggcctt gttgaccgct ggggacgtaa accaacgcta

960 960

acgctgggct tcctggtgat ggctgctggc atgggcgtac tcggtacaat gatgcatatc acgctgggct tcctggtgat ggctgctggc atgggcgtac tcggtacaat gatgcatatc

10201020

ggtattcact ctccgtcggc gcagtatttc gccatcgcca tgctgctgat gtttattgtc ggtattcact ctccgtcggc gcagtatttc gccatcgcca tgctgctgat gtttattgtc

10801080

ggttttgcca tgagtgccgg tccgctgatt tgggtactgt gctccgaaat tcagccgctg ggttttgcca tgagtgccgg tccgctgatt tgggtactgt gctccgaaat tcagccgctg

11401140

aaaggccgcg attttggcat cacctgctcc actgccacca actggattgc caacatgatc aaaggccgcg attttggcat cacctgctcc actgccacca actggattgc caacatgatc

12001200

gttggcgcaa cgttcctgac catgctcaac acgctgggta acgccaacac cttctgggtg gttggcgcaa cgttcctgac catgctcaac acgctgggta acgccaacac cttctgggtg

12601260

tatgcggctc tgaacgtact gtttatcctg ctgacattgt ggctggtacc ggaaaccaaa tatgcggctc tgaacgtact gtttatcctg ctgacattgt ggctggtacc ggaaaccaaa

13201320

cacgtttcgc tggaacatat tgaacgtaat ctgatgaaag gtcgtaaact gcgcgaaata cacgtttcgc tggaacatat tgaacgtaat ctgatgaaag gtcgtaaact gcgcgaaata

13801380

ggcgctcacg attaa ggcgctcacg attaa

13951395

<210> 2<210> 2

<211> 1422<211> 1422

<212> ДНК<212> DNA

<213> Zymomonas mobilis<213> Zymomonas mobilis

<400> 2<400> 2

atgagttctg aaagtagtca gggtctagtc acgcgactag ccctaatcgc tgctataggc atgagttctg aaagtagtca gggtctagtc acgcgactag ccctaatcgc tgctataggc

60 60

ggcttgcttt tcggttacga ttcagcggtt atcgctgcaa tcggtacacc ggttgatatc ggcttgcttt tcggttacga ttcagcggtt atcgctgcaa tcggtacacc ggttgatatc

120 120

cattttattg cccctcgtca cctgtctgct acggctgcgg cttccctttc tgggatggtc cattttattg cccctcgtca cctgtctgct acggctgcgg cttccctttc tgggatggtc

180 180

gttgttgctg ttttggtcgg ttgtgttacc ggttctttgc tgtctggctg gattggtatt gttgttgctg ttttggtcgg ttgtgttacc ggttctttgc tgtctggctg gattggtatt

240 240

cgcttcggtc gtcgcggcgg attgttgatg agttccattt gtttcgtcgc cgccggtttt cgcttcggtc gtcgcggcgg attgttgatg agttccatt gtttcgtcgc cgccggtttt

300 300

ggtgctgcgt taaccgaaaa attatttgga accggtggtt cggctttaca aattttttgc ggtgctgcgt taaccgaaaa attatttgga accggtggtt cggctttaca aattttttgc

360 360

tttttccggt ttcttgccgg tttaggtatc ggtgtcgttt caaccttgac cccaacctat tttttccggt ttcttgccgg tttaggtatc ggtgtcgttt caaccttgac cccaacctat

420 420

attgctgaaa ttcgtccgcc agacaaacgt ggtcagatgg tttctggtca gcagatggcc attgctgaaa ttcgtccgcc agacaaacgt ggtcagatgg tttctggtca gcagatggcc

480 480

attgtgacgg gtgctttaac cggttatatc tttacctggt tactggctca tttcggttct attgtgacgg gtgctttaac cggttatatc tttacctggt tactggctca tttcggttct

540 540

atcgattggg ttaatgccag tggttggtgc tggtctccgg cttcagaagg cctgatcggt atcgattggg ttaatgccag tggttggtgc tggtctccgg cttcagaagg cctgatcggt

600 600

attgccttct tattgctgct gttaaccgca ccggatacgc cgcattggtt ggtgatgaag attgccttct tattgctgct gttaaccgca ccggatacgc cgcattggtt ggtgatgaag

660 660

ggacgtcatt ccgaggctag caaaatcctt gctcgtctgg aaccgcaagc cgatcctaat ggacgtcatt ccgaggctag caaaatcctt gctcgtctgg aaccgcaagc cgatcctaat

720 720

ctgacgattc aaaagattaa agctggcttt gataaagcca tggacaaaag cagcgcaggt ctgacgattc aaaagattaa agctggcttt gataaagcca tggacaaaag cagcgcaggt

780 780

ttgtttgctt ttggtatcac cgttgttttt gccggtgtat ccgttgctgc cttccagcag ttgtttgctt ttggtatcac cgttgttttt gccggtgtat ccgttgctgc cttccagcag

840 840

ttagtcggta ttaacgccgt gctgtattat gcaccgcaga tgttccagaa tttaggtttt ttagtcggta ttaacgccgt gctgtattat gcaccgcaga tgttccagaa tttaggtttt

900 900

ggagctgata cggcattatt gcagaccatc tctatcggtg ttgtgaactt catcttcacc ggagctgata cggcattatt gcagaccatc tctatcggtg ttgtgaactt catcttcacc

960 960

atgattgctt cccgtgttgt tgaccgcttc ggccgtaaac ctctgcttat ttggggtgct atgattgctt cccgtgttgt tgaccgcttc ggccgtaaac ctctgcttat ttggggtgct

10201020

ctcggtatgg ctgcaatgat ggctgtttta ggctgctgtt tctggttcaa agtcggtggt ctcggtatgg ctgcaatgat ggctgtttta ggctgctgtt tctggttcaa agtcggtggt

10801080

gttttgcctt tggcttctgt gcttctttat attgcagtct ttggtatgtc atggggccct gttttgcctt tggcttctgt gcttctttat attgcagtct ttggtatgtc atggggccct

11401140

gtctgctggg ttgttctgtc agaaatgttc ccgagttcca tcaagggcgc agctatgcct gtctgctggg ttgttctgtc agaaatgttc ccgagttcca tcaagggcgc agctatgcct

12001200

atcgctgtta ccggacaatg gttagctaat atcttggtta acttcctgtt taaggttgcc atcgctgtta ccggacaatg gttagctaat atcttggtta acttcctgtt taaggttgcc

12601260

gatggttctc cagcattgaa tcagactttc aaccacggtt tctcctatct cgttttcgca gatggttctc cagcattgaa tcagactttc aaccacggtt tctcctatct cgttttcgca

13201320

gcattaagta tcttaggtgg cttgattgtt gctcgcttcg tgccggaaac caaaggtcgg gcattaagta tcttaggtgg cttgattgtt gctcgcttcg tgccggaaac caaaggtcgg

13801380

agcctggatg aaatcgagga gatgtggcgc tcccagaagt ag agcctggatg aaatcgagga gatgtggcgc tcccagaagt ag

14221422

<210> 3<210> 3

<211> 1248<211> 1248

<212> ДНК<212> DNA

<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli

<400> 3<400> 3

atggcactga atattccatt cagaaatgcg tactatcgtt ttgcatccag ttactcattt atggcactga atattccat cagaaatgcg tactatcgtt ttgcatccag ttactcattt

60 60

ctctttttta tttcctggtc gctgtggtgg tcgttatacg ctatttggct gaaaggacat ctctttttta tttcctggtc gctgtggtgg tcgttatacg ctatttggct gaaaggacat

120 120

ctagggttga cagggacgga attaggtaca ctttattcgg tcaaccagtt taccagcatt ctagggttga cagggacgga attaggtaca ctttattcgg tcaaccagtt taccagcatt

180 180

ctatttatga tgttctacgg catcgttcag gataaactcg gtctgaagaa accgctcatc ctatttatga tgttctacgg catcgttcag gataaactcg gtctgaagaa accgctcatc

240 240

tggtgtatga gtttcatcct ggtcttgacc ggaccgttta tgatttacgt ttatgaaccg tggtgtatga gtttcatcct ggtcttgacc ggaccgttta tgatttacgt ttatgaaccg

300 300

ttactgcaaa gcaatttttc tgtaggtcta attctggggg cgctattttt tggcttgggg ttactgcaaa gcaatttttc tgtaggtcta attctggggg cgctattttt tggcttgggg

360 360

tatctggcgg gatgcggttt gcttgatagc ttcaccgaaa aaatggcgcg aaattttcat tatctggcgg gatgcggttt gcttgatagc ttcaccgaaa aaatggcgcg aaattttcat

420 420

ttcgaatatg gaacagcgcg cgcctgggga tcttttggct atgctattgg cgcgttcttt ttcgaatatg gaacagcgcg cgcctgggga tcttttggct atgctattgg cgcgttcttt

480 480

gccggcatat tttttagtat cagtccccat atcaacttct ggttggtctc gctatttggc gccggcatat tttttagtat cagtccccat atcaacttct ggttggtctc gctatttggc

540 540

gctgtattta tgatgatcaa catgcgtttt aaagataagg atcaccagtg cgtagcggca gctgtattta tgatgatcaa catgcgtttt aaagataagg atcaccagtg cgtagcggca

600 600

gatgcgggag gggtaaaaaa agaggatttt atcgcagttt tcaaggatcg aaacttctgg gatgcgggag gggtaaaaaa agaggatttt atcgcagttt tcaaggatcg aaacttctgg

660 660

gttttcgtca tatttattgt ggggacgtgg tctttctata acatttttga tcaacaactt gttttcgtca tatttattgt ggggacgtgg tctttctata acatttttga tcaacaactt

720 720

tttcctgtct tttattcagg tttattcgaa tcacacgatg taggaacgcg cctgtatggt tttcctgtct tttattcagg tttattcgaa tcacacgatg taggaacgcg cctgtatggt

780 780

tatctcaact cattccaggt ggtactcgaa gcgctgtgca tggcgattat tcctttcttt tatctcaact cattccaggt ggtactcgaa gcgctgtgca tggcgattat tcctttcttt

840 840

gtgaatcggg tagggccaaa aaatgcatta cttatcggag ttgtgattat ggcgttgcgt gtgaatcggg tagggccaaa aaatgcatta cttatcggag ttgtgattat ggcgttgcgt

900 900

atcctttcct gcgcgctgtt cgttaacccc tggattattt cattagtgaa gttgttacat atcctttcct gcgcgctgtt cgttaacccc tggattattt cattagtgaa gttgttacat

960 960

gccattgagg ttccactttg tgtcatatcc gtcttcaaat acagcgtggc aaactttgat gccattgagg ttccactttg tgtcatatcc gtcttcaaat acagcgtggc aaactttgat

10201020

aagcgcctgt cgtcgacgat ctttctgatt ggttttcaaa ttgccagttc gcttgggatt aagcgcctgt cgtcgacgat ctttctgatt ggttttcaaa ttgccagttc gcttgggatt

10801080

gtgctgcttt caacgccgac tgggatactc tttgaccacg caggctacca gacagttttc gtgctgcttt caacgccgac tgggatactc tttgaccacg caggctacca gacagttttc

11401140

ttcgcaattt cgggtattgt ctgcctgatg ttgctatttg gcattttctt cttgagtaaa ttcgcaattt cgggtattgt ctgcctgatg ttgctatttg gcattttctt cttgagtaaa

12001200

aaacgcgagc aaatagttat ggaaacgcct gtaccttcag caatatag aaacgcgagc aaatagttat ggaaacgcct gtaccttcag caatatag

12481248

<210> 4<210> 4

<211> 735<211> 735

<212> ДНК<212> DNA

<213> Leuconostoc pseudomesenteroides<213> Leuconostoc pseudomesenteroides

<400> 4<400> 4

atggcacaaa acgcgcaaca tcataatccg cgaagcattt caatgagcaa atcacttatg atggcacaaa acgcgcaaca tcataatccg cgaagcattt caatgagcaa atcacttatg

60 60

ttttttgcca tctcattgat tttaaatgcg atgggaaatg ttttgacgct cgtcacagct ttttttgcca tctcattgat tttaaatgcg atgggaaatg ttttgacgct cgtcacagct

120 120

tcacatataa aacccgcttt tttgggatca gcttattgga ctgctgcaga ggctaatcta tcacatataa aacccgcttt tttgggatca gcttattgga ctgctgcaga ggctaatcta

180 180

ggtcaagctt tattaggaaa taattcactt gtcttgtttt gggcattttt agttcttggc ggtcaagctt tattaggaaa taattcactt gtcttgtttt gggcattttt agttcttggc

240 240

atgcttattt cattcctgaa tgcgttatta atgaaaaagt tagattggca tcgtatcatt atgcttattt cattcctgaa tgcgttatta atgaaaaagt tagattggca tcgtatcatt

300 300

ggtaatttct tgtttatgtt accattttca atttttattc aatggttttc aaatattttc ggtaatttct tgtttatgtt accattttca atttttattc aatggttttc aaatattttc

360 360

aatcaaatta tgccaaatgc taattcagtg gcagcaactg tgttatatac agtaattaat aatcaaatta tgccaaatgc taattcagtg gcagcaactg tgttatatac agtaattaat

420 420

tttattggtg ttggcttgat cgccgttgct atttcgattt atcaacgtgt gaatttagtg tttattggtg ttggcttgat cgccgttgct atttcgattt atcaacgtgt gaatttagtg

480 480

ttacaccctg ccgatgattt gatgcaaatt ttacgtttca aatattttca cgggtcggct ttacaccctg ccgatgattt gatgcaaatt ttacgtttca aatattttca cgggtcggct

540 540

ttcaaggcta tgtgggcgtc ctatattccg ccaacgattt ttgcaattat tgcctttgtg ttcaaggcta tgtgggcgtc ctatattccg ccaacgattt ttgcaattat tgcctttgtg

600 600

atcactttcc ctaatttgta taatttcggg ttaggaatta tttttgcatt cttattccag atcactttcc ctaatttgta taatttcggg ttaggaatta tttttgcatt cttattccag

660 660

ggtggcatca caggaatcgc ggacaagtac gtctttaaga atttaaagca tcaggcaata ggtggcatca caggaatcgc ggacaagtac gtctttaaga atttaaagca tcaggcaata

720 720

gatgttggta attaa gatgttggta attaa

735 735

<210> 5<210> 5

<211> 1254<211> 1254

<212> ДНК<212> DNA

<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli

<400> 5<400> 5

atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt

60 60

tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc

120 120

agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa

180 180

ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt

240 240

accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa

300 300

tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc

360 360

ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt

420 420

ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc

480 480

atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc

540 540

gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg

600 600

gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca

660 660

aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac

720 720

caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta

780 780

tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca

840 840

ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct

900 900

gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg

960 960

ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag

10201020

tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg

10801080

gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc

11401140

gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt

12001200

agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa

12541254

<210> 6<210> 6

<211> 1317<211> 1317

<212> ДНК<212> DNA

<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli

<400> 6<400> 6

atgggaaaca catcaataca aacgcagagt taccgtgcgg tagataaaga tgcagggcaa atgggaaaca catcaataca aacgcagagt taccgtgcgg tagataaaga tgcagggcaa

60 60

agcagaagtt acattattcc attcgcgctg ctgtgctcac tgttttttct ttgggcggta agcagaagtt acattattcc attcgcgctg ctgtgctcac tgttttttct ttgggcggta

120 120

gccaataacc ttaacgacat tttattacct caattccagc aggcttttac gctgacaaat gccaataacc ttaacgacat tttattacct caattccagc aggcttttac gctgacaaat

180 180

ttccaggctg gcctgatcca atcggccttt tactttggtt atttcattat cccaatccct ttccaggctg gcctgatcca atcggccttt tactttggtt atttcattat cccaatccct

240 240

gctgggatat tgatgaaaaa actcagttat aaagcaggga ttattaccgg gttattttta gctgggatat tgatgaaaaa actcagttat aaagcaggga ttattaccgg gttattttta

300 300

tatgccttgg gtgctgcatt attctggccc gccgcagaaa taatgaacta caccttgttt tatgccttgg gtgctgcatt attctggccc gccgcagaaa taatgaacta caccttgttt

360 360

ttagttggcc tatttattat tgcagccgga ttaggttgtc tggaaactgc cgcaaaccct ttagttggcc tatttattat tgcagccgga ttaggttgtc tggaaactgc cgcaaaccct

420 420

tttgttacgg tattagggcc ggaaagtagt ggtcacttcc gcttaaatct tgcgcaaaca tttgttacgg tattagggcc ggaaagtagt ggtcacttcc gcttaaatct tgcgcaaaca

480 480

tttaactcgt ttggcgcaat tatcgcggtt gtctttgggc aaagtcttat tttgtctaac tttaactcgt ttggcgcaat tatcgcggtt gtctttgggc aaagtcttat tttgtctaac

540 540

gtgccacatc aatcgcaaga cgttctcgat aaaatgtctc cagagcaatt gagtgcgtat gtgccacatc aatcgcaaga cgttctcgat aaaatgtctc cagagcaatt gagtgcgtat

600 600

aaacacagcc tggtattatc ggtacagaca ccttatatga tcatcgtggc tatcgtgtta aaacacagcc tggtattatc ggtacagaca ccttatatga tcatcgtggc tatcgtgtta

660 660

ctggtcgccc tgctgatcat gctgacgaaa ttcccggcat tgcagagtga taatcacagt ctggtcgccc tgctgatcat gctgacgaaa ttcccggcat tgcagagtga taatcacagt

720 720

gacgccaaac aaggatcgtt ctccgcatcg ctttctcgcc tggcgcgtat tcgccactgg gacgccaaac aaggatcgtt ctccgcatcg ctttctcgcc tggcgcgtat tcgccactgg

780 780

cgctgggcgg tattagcgca attctgctat gtcggcgcac aaacggcctg ctggagctat cgctgggcgg tattagcgca attctgctat gtcggcgcac aaacggcctg ctggagctat

840 840

ttgattcgct acgctgtaga agaaattcca ggtatgactg caggctttgc cgctaactat ttgattcgct acgctgtaga agaaattcca ggtatgactg caggctttgc cgctaactat

900 900

ttaaccggaa ccatggtgtg cttctttatt ggtcgtttca ccggtacctg gctcatcagt ttaaccggaa ccatggtgtg cttctttatt ggtcgtttca ccggtacctg gctcatcagt

960 960

cgcttcgcac cacacaaagt cctggccgcc tacgcattaa tcgctatggc actgtgcctg cgcttcgcac cacacaaagt cctggccgcc tacgcattaa tcgctatggc actgtgcctg

10201020

atctcagcct tcgctggcgg tcatgtgggc ttaatagccc tgactttatg cagcgccttt atctcagcct tcgctggcgg tcatgtgggc ttaatagccc tgactttatg cagcgccttt

10801080

atgtcgattc agtacccaac aatcttctcg ctgggcatta agaatctcgg ccaggacacc atgtcgattc agtacccaac aatcttctcg ctgggcatta agaatctcgg ccaggacacc

11401140

aaatatggtt cgtccttcat cgttatgacc attattggcg gcggtattgt cactccggtc aaatatggtt cgtccttcat cgttatgacc attattggcg gcggtattgt cactccggtc

12001200

atgggttttg tcagtgacgc ggcgggcaac atccccactg ctgaactgat ccccgcactc atgggttttg tcagtgacgc ggcgggcaac atccccactg ctgaactgat ccccgcactc

12601260

tgcttcgcgg tcatctttat ctttgcccgt ttccgttctc aaacggcaac taactga tgcttcgcgg tcatctttat ctttgcccgt ttccgttctc aaacggcaac taactga

13171317

<210> 7<210> 7

<211> 1491<211> 1491

<212> ДНК<212> DNA

<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli

<400> 7<400> 7

atgagtacta caacccagaa tatcccgtgg tatcgccatc tcaaccgtgc acaatggcgc atgagtacta caacccagaa tatcccgtgg tatcgccatc tcaaccgtgc acaatggcgc

60 60

gcattttccg ctgcctggtt gggatatctg cttgacggtt ttgatttcgt tttaatcgcc gcattttccg ctgcctggtt gggatatctg cttgacggtt ttgatttcgt tttaatcgcc

120 120

ctggtactca ccgaagtaca aggtgaattc gggctgacga cggtgcaggc ggcaagtctg ctggtactca ccgaagtaca aggtgaattc gggctgacga cggtgcaggc ggcaagtctg

180 180

atctctgcag cctttatctc tcgctggttc ggcggcctga tgctcggcgc tatgggtgac atctctgcag cctttatctc tcgctggttc ggcggcctga tgctcggcgc tatgggtgac

240 240

cgctacgggc gtcgtctggc aatggtcacc agcatcgttc tcttctcggc cgggacgctg cgctacgggc gtcgtctggc aatggtcacc agcatcgttc tcttctcggc cgggacgctg

300 300

gcctgcggct ttgcgccagg ctacatcacc atgtttatcg ctcgtctggt catcggcatg gcctgcggct ttgcgccagg ctacatcacc atgtttatcg ctcgtctggt catcggcatg

360 360

gggatggcgg gtgaatacgg ttccagcgcc acctatgtca ttgaaagctg gccaaaacat gggatggcgg gtgaatacgg ttccagcgcc acctatgtca ttgaaagctg gccaaaacat

420 420

ctgcgtaaca aagccagtgg ttttttgatt tcaggcttct ctgtgggggc cgtcgttgcc ctgcgtaaca aagccagtgg ttttttgatt tcaggcttct ctgtgggggc cgtcgttgcc

480 480

gctcaggtct atagcctggt ggttccggtc tggggctggc gtgcgctgtt ctttatcggc gctcaggtct atagcctggt ggttccggtc tggggctggc gtgcgctgtt ctttatcggc

540 540

attttgccaa tcatctttgc tctctggctg cgtaaaaaca tcccggaagc ggaagactgg attttgccaa tcatctttgc tctctggctg cgtaaaaaca tcccggaagc ggaagactgg

600 600

aaagagaaac acgcaggtaa agcaccagta cgcacaatgg tggatattct ctaccgtggt aaagagaaac acgcaggtaa agcaccagta cgcacaatgg tggatattct ctaccgtggt

660 660

gaacatcgca ttgccaatat cgtaatgaca ctggcggcgg ctactgcgct gtggttctgc gaacatcgca ttgccaatat cgtaatgaca ctggcggcgg ctactgcgct gtggttctgc

720 720

ttcgccggta acctgcaaaa tgccgcgatc gtcgctgttc ttgggctgtt atgcgccgca ttcgccggta acctgcaaaa tgccgcgatc gtcgctgttc ttgggctgtt atgcgccgca

780 780

atctttatca gctttatggt gcagagtgca ggcaaacgct ggccaacggg cgtaatgctg atctttatca gctttatggt gcagagtgca ggcaaacgct ggccaacggg cgtaatgctg

840 840

atggtggtcg tgttgtttgc tttcctctac tcatggccga ttcaggcgct gctgccaacg atggtggtcg tgttgtttgc tttcctctac tcatggccga ttcaggcgct gctgccaacg

900 900

tatctgaaaa ccgatctggc ttataacccg catactgtag ccaatgtgct gttctttagt tatctgaaaa ccgatctggc ttataacccg catactgtag ccaatgtgct gttctttagt

960 960

ggctttggcg cggcggtggg atgctgcgta ggtggcttcc tcggtgactg gctgggaacc ggctttggcg cggcggtggg atgctgcgta ggtggcttcc tcggtgactg gctgggaacc

10201020

cgcaaagcgt acgtttgtag cctgctggcc tcgcagctgc tgattattcc ggtatttgcg cgcaaagcgt acgtttgtag cctgctggcc tcgcagctgc tgattattcc ggtatttgcg

10801080

attggcggcg caaacgtctg ggtgctcggt ctgttactgt tcttccagca aatgcttgga attggcggcg caaacgtctg ggtgctcggt ctgttactgt tcttccagca aatgcttgga

11401140

caagggatcg ccgggatctt accaaaactg attggcggtt atttcgatac cgaccagcgt caagggatcg ccgggatctt accaaaactg attggcggtt atttcgatac cgaccagcgt

12001200

gcagcgggcc tgggctttac ctacaacgtt ggcgcattgg gcggtgcact ggccccaatc gcagcgggcc tgggctttac ctacaacgtt ggcgcattgg gcggtgcact ggccccaatc

12601260

atcggcgcgt tgatcgctca acgtctggat ctgggtactg cgctggcatc gctctcgttc atcggcgcgt tgatcgctca acgtctggat ctgggtactg cgctggcatc gctctcgttc

13201320

agtctgacgt tcgtggtgat cctgctgatt gggctggata tgccttctcg cgttcagcgt agtctgacgt tcgtggtgat cctgctgatt gggctggata tgccttctcg cgttcagcgt

13801380

tggttgcgcc cggaagcgtt gcgtactcat gacgctatcg acggtaaacc attcagcggt tggttgcgcc cggaagcgtt gcgtactcat gacgctatcg acggtaaacc attcagcggt

14401440

gccgtgccgt ttggcagcgc caaaaacgat ttagtcaaaa ccaaaagtta a gccgtgccgt ttggcagcgc caaaaacgat ttagtcaaaa ccaaaagtta a

14911491

<210> 8<210> 8

<211> 1278<211> 1278

<212> ДНК<212> DNA

<213> Xanthomonas campestris<213> Xanthomonas campestris

<400> 8<400> 8

atgactaccg ccaggcccgc aaatcccgtt gtctcgatcg ccatcgtcgg cgtgctgttt atgactaccg ccaggcccgc aaatcccgtt gtctcgatcg ccatcgtcgg cgtgctgttt

60 60

ttcatcatcg gctttttcac ctggatcaac gggccgctga tcaccttcgt gcggctggcg ttcatcatcg gctttttcac ctggatcaac gggccgctga tcaccttcgt gcggctggcg

120 120

ttcgacctca acgaggtcaa tgcgttcctg gtgctgatgg tgttctacct gtcgtacttc ttcgacctca acgaggtcaa tgcgttcctg gtgctgatgg tgttctacct gtcgtacttc

180 180

ttcctggcgc tgccctcgtc atggatcctc aagcgcaccg gcatgaaaaa aggcctggcg ttcctggcgc tgccctcgtc atggatcctc aagcgcaccg gcatgaaaaa aggcctggcg

240 240

ctgagtctgg tggtgatggc gctgggcgcc gcagcattcg ggcaattcgc tacgcaacgc ctgagtctgg tggtgatggc gctgggcgcc gcagcattcg ggcaattcgc tacgcaacgc

300 300

tggtatccgg gcgcactggc cggcatgttc gtgatcggta gcggcctggc gttgttgcag tggtatccgg gcgcactggc cggcatgttc gtgatcggta gcggcctggc gttgttgcag

360 360

accgcgatca acccatacat cagtattctc gggccaatcg aaagtgcggc gcggcgcatc accgcgatca acccatacat cagtattctc gggccaatcg aaagtgcggc gcggcgcatc

420 420

gcgctgatgg gcatctgtaa caagattgcc ggcatcctgg cgccgatcct gatcggctcg gcgctgatgg gcatctgtaa caagattgcc ggcatcctgg cgccgatcct gatcggctcg

480 480

ctggtgctgc atggcatcgg cgatctctcc acgcaggtgg ccgcggccga tgcggcgacc ctggtgctgc atggcatcgg cgatctctcc acgcaggtgg ccgcggccga tgcggcgacc

540 540

aagcagcaac tgctcaacgc gtttgccgcc aagatccatg caccatatct ggtgatgtcc aagcagcaac tgctcaacgc gtttgccgcc aagatccatg caccatatct ggtgatgtcc

600 600

ggcgtgttgc tggtgctggc ggtgggcgtg ttgttctcgc cgctgcccga actcaaggcc ggcgtgttgc tggtgctggc ggtgggcgtg ttgttctcgc cgctgcccga actcaaggcc

660 660

tccgaagcca atgccacgcc gggcagcggt ggcgcggcgc agaagtccag catcttccag tccgaagcca atgccacgcc gggcagcggt ggcgcggcgc agaagtccag catcttccag

720 720

ttcccgcatc tgtggctggg cgtgttgtgc ctgttcgtgt atgtcggtgt ggaagtgatg ttcccgcatc tgtggctggg cgtgttgtgc ctgttcgtgt atgtcggtgt ggaagtgatg

780 780

gccggcgatg ccatcggcac ttacggacac ggcttcaatt tgccgctgga cagcaccaag gccggcgatg ccatcggcac ttacggacac ggcttcaatt tgccgctgga cagcaccaag

840 840

ctgttcacct cctacacgct gggcgcaatg ttgctgggct atatcgccgg cctggtgctg ctgttcacct cctacacgct gggcgcaatg ttgctgggct atatcgccgg cctggtgctg

900 900

attccgcggg tgatttcgca ggcgcgctac ctgagcgtgt ctgcgctgct gggcgtgctg attccgcggg tgatttcgca ggcgcgctac ctgagcgtgt ctgcgctgct gggcgtgctg

960 960

ttctcgctgg gggcgctgtt cacccacggc tatgtgtcgg tggggttcgt ggccgcgctc ttctcgctgg gggcgctgtt caccacggc tatgtgtcgg tggggttcgt ggccgcgctc

10201020

ggttttgcca acgccatgat gtggccggcg atctttccgc tggccatccg cggcctgggc ggttttgcca acgccatgat gtggccggcg atctttccgc tggccatccg cggcctgggc

10801080

cggttcaccg agatcggttc ggcgttgctg gtgatgggca ttgccggcgg cgcgatcatt cggttcaccg agatcggttc ggcgttgctg gtgatgggca ttgccggcgg cgcgatcatt

11401140

ccgcagctgt tcgccattct gaaacagcat tacgacttcc aggtggtgtt cgccgcgctg ccgcagctgt tcgccattct gaaacagcat tacgacttcc aggtggtgtt cgccgcgctg

12001200

atggtgccgt gctacctgta catcctgttc tattcgctgc gcggccaccg tgtggggctg atggtgccgt gctacctgta catcctgttc tattcgctgc gcggccaccg tgtggggctg

12601260

ccggctcaac cgaaatga ccggctcaac cgaaatga

12781278

<210> 9<210> 9

<211> 1554<211> 1554

<212> ДНК<212> DNA

<213> Bifidobacterium longum<213> Bifidobacterium longum

<400> 9<400> 9

atgacgacga caacggcatc acccgtatcg aaacagacgg catccgcggc gcaggaaacc atgacgacga caacggcatc acccgtatcg aaacagacgg catccgcggc gcaggaaacc

60 60

agcgcaaccg gtgcggcggc caccgcaatc gaaaccatcg aaaccggcgt ggccggagtg agcgcaaccg gtgcggcggc caccgcaatc gaaaccatcg aaaccggcgt ggccggagtg

120 120

gcgggcgcgg ccacaaacgc ggcagccaac gcaatcgagg acctcgaagc cgccgaatcg gcgggcgcgg ccacaaacgc ggcagccaac gcaatcgagg acctcgaagc cgccgaatcg

180 180

cacggcttct ccacgcgctt cccgctcaac agcgcattca tcttcacctt cggcgcgctc cacggcttct ccacgcgctt cccgctcaac agcgcattca tcttcacctt cggcgcgctc

240 240

ggcggcatgc tgttcggttt cgacaccggc atcatctccg gcgcctcccc gcttatcgaa ggcggcatgc tgttcggttt cgacaccggc atcatctccg gcgcctcccc gcttatcgaa

300 300

tcggacttcg gcctgagcgt ctctcagacc ggcttcatca cctcctcggt gctgatcggc tcggacttcg gcctgagcgt ctctcagacc ggcttcatca cctcctcggt gctgatcggc

360 360

tcgtgcgcag gcgcgctgtc gatcggcgca ctgtctgacc ggttcggccg caagaagctg tcgtgcgcag gcgcgctgtc gatcggcgca ctgtctgacc ggttcggccg caagaagctg

420 420

ctcatcgtct ccgcgctgct gttcctgctc ggctcaggcc tgtgcgcctc ctccaccgga ctcatcgtct ccgcgctgct gttcctgctc ggctcaggcc tgtgcgcctc ctccaccgga

480 480

ttcgcgatga tggtgtgcgc ccgcatcatc ctgggtctcg ccgtcggcgc ggcctccgcc ttcgcgatga tggtgtgcgc ccgcatcatc ctgggtctcg ccgtcggcgc ggcctccgcc

540 540

ctgaccccgg cgtacttggc cgaactggcg ccgaaggagc gtcgcggctc actgtccacg ctgaccccgg cgtacttggc cgaactggcg ccgaaggagc gtcgcggctc actgtccacg

600 600

ctgttccagc tcatggtcac cttcggcatt ctgctggcct acgcctccaa cctcggattc ctgttccagc tcatggtcac cttcggcatt ctgctggcct acgcctccaa cctcggattc

660 660

ctgaaccaca acctcttcgg catccgcgac tggcgctgga tgctcggttc ggcgctggtg ctgaaccaca acctcttcgg catccgcgac tggcgctgga tgctcggttc ggcgctggtg

720 720

ccggccgcct tgttgctgct cggcggcctg ttgctgcccg aatccccgcg ttatctggtg ccggccgcct tgttgctgct cggcggcctg ttgctgcccg aatccccgcg ttatctggtg

780 780

aacaagggcg acacccgcaa cgccttcaaa gtgcttacgc tgattcgcaa ggacgtggat aacaagggcg acacccgcaa cgccttcaaa gtgcttacgc tgattcgcaa ggacgtggat

840 840

cagacccagg tgcagattga gctggacgaa atcaaggccg tggccgcaca ggacaccaag cagacccagg tgcagattga gctggacgaa atcaaggccg tggccgcaca ggacaccaag

900 900

ggtggtgtgc gcgaactgtt ccgtatcgct cgtccggcgc tggtggccgc catcggtatc ggtggtgtgc gcgaactgtt ccgtatcgct cgtccggcgc tggtggccgc catcggtatc

960 960

atgctgttcc agcagctcgt gggcatcaac tcggtgatct acttcctgcc gcaggtgttc atgctgttcc agcagctcgt gggcatcaac tcggtgatct acttcctgcc gcaggtgttc

10201020

atcaagggct tcggcttccc tgaaggcgac gcgatctggg tgtcggtggg catcggcgtg atcaagggct tcggcttccc tgaaggcgac gcgatctggg tgtcggtggg catcggcgtg

10801080

gtgaacttcg tgagcaccat cgtggccacg cttatcatgg atcgtttccc gcgcaagggc gtgaacttcg tgagcaccat cgtggccacg cttatcatgg atcgtttccc gcgcaagggc

11401140

atgctgatct tcggttccat cgtgatgacc gtttcgctcg cggtgctcgc cgtgatgaac atgctgatct tcggttccat cgtgatgacc gtttcgctcg cggtgctcgc cgtgatgaac

12001200

ttcgtgggcg acgtggccgt gctggcagtg ccgacgatga ttctcatcgc tttctatatc ttcgtgggcg acgtggccgt gctggcagtg ccgacgatga ttctcatcgc tttctatatc

12601260

ctcggctttg cggtctcgtg gggcccgatc gcctgggtgc ttatcggcga gatcttcccg ctcggctttg cggtctcgtg gggcccgatc gcctgggtgc ttatcggcga gatcttcccg

13201320

ctgagcgtgc gcggcatcgg ctcatccttc ggctcggcgg cgaactggct gggcaacttc ctgagcgtgc gcggcatcgg ctcatccttc ggctcggcgg cgaactggct gggcaacttc

13801380

atcgtctccc agttcttcct cgtgctgctc gatgcgttcg gcaacaatgt gggcggcccg atcgtctccc agttcttcct cgtgctgctc gatgcgttcg gcaacaatgt gggcggcccg

14401440

ttcgcgattt tcggcgtgtt ctcggccctg tccatcccgt tcgtgctgcg cttggtgccc ttcgcgattt tcggcgtgtt ctcggccctg tccatcccgt tcgtgctgcg cttggtgccc

15001500

gagaccaagg gcaagtcgct ggaggaaatc gagaaggaaa tgaccaagcg ctag gagaccaagg gcaagtcgct ggaggaaatc gagaaggaaa tgaccaagcg ctag

15541554

<210> 10<210> 10

<211> 1206<211> 1206

<212> ДНК<212> DNA

<213> Bacillus subtilis<213> Bacillus subtilis

<400> 10<400> 10

atgttaagag ggacatattt atttggatat gctttctttt ttacagtagg tattatccat atgttaagag ggacatattt atttggatat gctttctttt ttacagtagg tattatccat

60 60

atatcaacag ggagtttgac accattttta ttagaggctt ttaacaagac aacagatgat atatcaacag ggagtttgac accattttta ttagaggctt ttaacaagac aacagatgat

120 120

atttcggtca taatcttctt ccagtttacc ggatttctaa gcggagtatt aatcgcacct atttcggtca taatcttctt ccagtttacc ggatttctaa gcggagtatt aatcgcacct

180 180

ttaatgatta agaaatacag tcattttagg acacttactt tagctttgac aataatgctt ttaatgatta agaaatacag tcattttagg acacttactt tagctttgac aataatgctt

240 240

gtagcgttaa gtatcttttt tctaaccaag gattggtatt atattattgt aatggctttt gtagcgttaa gtatcttttt tctaaccaag gattggtatt atattattgt aatggctttt

300 300

ctcttaggat atggagcagg cacattagaa acgacagttg gttcatttgt tattgctaat ctcttaggat atggagcagg cacattagaa acgacagttg gttcatttgt tattgctaat

360 360

ttcgaaagta atgcagaaaa aatgagtaag ctggaagttc tctttggatt aggcgcttta ttcgaaagta atgcagaaaa aatgagtaag ctggaagttc tctttggatt aggcgcttta

420 420

tctttcccat tattaattaa ttccttcata gatatcaata actggttttt accatattac tctttcccat tattaattaa ttccttcata gatatcaata actggttttt accatattac

480 480

tgtatattca cctttttatt cgtcctattc gtagggtggt taattttctt gtctaagaac tgtatattca cctttttatt cgtcctattc gtagggtggt taattttctt gtctaagaac

540 540

cgagagtacg ctaagaatgc taaccaacaa gtgacctttc cagatggagg agcatttcaa cgagagtacg ctaagaatgc taaccaacaa gtgacctttc cagatggagg agcatttcaa

600 600

tactttatag gagatagaaa aaaatcaaag caattaggct tttttgtatt tttcgctttc tactttatag gagatagaaa aaaatcaaag caattaggct tttttgtatt tttcgctttc

660 660

ctatatgctg gaattgaaac aaattttgcc aactttttac cttcaatcat gataaaccaa ctatatgctg gaattgaaac aaattttgcc aactttttac cttcaatcat gataaaccaa

720 720

gacaatgaac aaattagtct tataagtgtc tcctttttct gggtagggat catcatagga gacaatgaac aaattagtct tataagtgtc tcctttttct gggtagggat catcatagga

780 780

agaatattga ttggtttcgt aagtagaagg cttgattttt ccaaatacct tctttttagc agaatattga ttggtttcgt aagtagaagg cttgattttt ccaaatacct tctttttagc

840 840

tgtagttgtt taattgtttt gttgattgcc ttctcttata taagtaaccc aatacttcaa tgtagttgtt taattgtttt gttgattgcc ttctcttata taagtaaccc aatacttcaa

900 900

ttgagtggta catttttgat tggcctaagt atagcgggga tatttcccat tgctttaaca ttgagtggta catttttgat tggcctaagt atagcgggga tatttcccat tgctttaaca

960 960

ctagcatcaa tcattattca gaagtacgtt gacgaagtta caagtttatt tattgcctcg ctagcatcaa tcattattca gaagtacgtt gacgaagtta caagtttatt tattgcctcg

10201020

gcaagtttcg gaggagcgat catctctttc ttaattggat ggagtttaaa ccaggatacg gcaagtttcg gaggagcgat catctctttc ttaattggat ggagtttaaa ccaggatacg

10801080

atcttattaa ccatgggaat atttacaact atggcggtca ttctagtagg tatttctgta atcttattaa ccatgggaat atttacaact atggcggtca ttctagtagg tatttctgta

11401140

aagattagga gaactaaaac agaagaccct atttcacttg aaaacaaagc atcaaaaaca aagattagga gaactaaaac agaagaccct atttcacttg aaaacaaagc atcaaaaaca

12001200

cagtag cagtag

12061206

<210> 11<210> 11

<211> 1593<211> 1593

<212> ДНК<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 11<400> 11

atggtcttcg ccatttatgt cgcaattatc attggggtcg gactttgggt atctcgtgat atggtcttcg ccatttatgt cgcaattatc attggggtcg gactttgggt atctcgtgat

60 60

aaaaaaggca ctcagaaaag tacggaagat tatttcttgg cgggaaaatc tttgccttgg aaaaaaggca ctcagaaaag tacggaagat tatttcttgg cgggaaaatc tttgccttgg

120 120

tgggctgtcg gtgcttcgct aattgctgca aatatttctg cggaacaatt tataggaatg tgggctgtcg gtgcttcgct aattgctgca aatatttctg cggaacaatt tataggaatg

180 180

tctggttcag gctattcaat tggcttggct atcgcatctt atgaatggat gtcggcaata tctggttcag gctattcaat tggcttggct atcgcatctt atgaatggat gtcggcaata

240 240

acattgatta ttgttggtaa gtactttcta cctattttca ttgaaaaagg aatctatacc acattgatta ttgttggtaa gtactttcta cctattttca ttgaaaaagg aatctatacc

300 300

attcctgaat ttgttgaaaa acgcttcaat aaaaaactaa aaacaatttt ggccgttttt attcctgaat ttgttgaaaa acgcttcaat aaaaaactaa aaacaatttt ggccgttttt

360 360

tggatttcct tgtacatttt tgtaaaccta acttcagtac tgtatttagg tggtttggct tggatttcct tgtacatttt tgtaaaccta acttcagtac tgtatttagg tggtttggct

420 420

ctcgaaacca ttttgggtat tccgttgatg tactcaattc taggtcttgc gctgtttgcg ctcgaaacca ttttgggtat tccgttgatg tactcaattc taggtcttgc gctgtttgcg

480 480

ttggtgtact caatttatgg tggtttatcg gcagtagtat ggaccgatgt catccaagtg ttggtgtact caatttatgg tggtttatcg gcagtagtat ggaccgatgt catccaagtg

540 540

ttcttcttag ttttgggtgg ttttatgact acctacatgg cagtgagctt tattggtggt ttcttcttag ttttgggtgg ttttatgact acctacatgg cagtgagctt tattggtggt

600 600

acggacggtt ggttcgctgg ggtgtctaaa atggtcgatg cagctcctgg ccactttgag acggacggtt ggttcgctgg ggtgtctaaa atggtcgatg cagctcctgg ccactttgag

660 660

atgatcttgg atcaaagtaa tccacaatac atgaaccttc ctggtattgc cgtattaatt atgatcttgg atcaaagtaa tccacaatac atgaaccttc ctggtattgc cgtattaatt

720 720

ggtggtcttt gggtagcaaa cttatattac tggggcttta accagtacat tattcaaaga ggtggtcttt gggtagcaaa cttatattac tggggcttta accagtacat tattcaaaga

780 780

acgcttgctg caaaatcagt atcggaagct cagaaaggta ttgtttttgc agcgtttttg acgcttgctg caaaatcagt atcggaagct cagaaaggta ttgtttttgc agcgtttttg

840 840

aaacttatcg ttccgtttct cgtggtattg ccaggtattg ccgcttacgt tattacttcg aaacttatcg ttccgtttct cgtggtattg ccaggtattg ccgcttacgt tattacttcg

900 900

gacccacaac taatggcaag ccttggtgat attgcagcaa caaaccttcc aagtgctgct gacccacaac taatggcaag ccttggtgat attgcagcaa caaaccttcc aagtgctgct

960 960

aatgcggata aagcataccc ttggctaact cagttcttgc ctgttggtgt taaaggtgtt aatgcggata aagcataccc ttggctaact cagttcttgc ctgttggtgt taaaggtgtt

10201020

gtttttgcgg ctcttgctgc tgcaattgtt tcttcactag catcaatgct taactcaaca gtttttgcgg ctcttgctgc tgcaattgtt tcttcactag catcaatgct taactcaaca

10801080

gccactatct tcactatgga tatttacaaa gagtatatct ctcctgactc aggtgaccac gccactatct tcactatgga tatttacaaa gagtatatct ctcctgactc aggtgaccac

11401140

aagttggtga atgttgggcg tactgcagct gtggtggcac taattattgc ttgcctaatt aagttggtga atgttgggcg tactgcagct gtggtggcac taattattgc ttgcctaatt

12001200

gccccaatgt taggtggtat tggccaagca ttccaataca tccaagaata tacaggttta gccccaatgt taggtggtat tggccaagca ttccaataca tccaagaata tacaggttta

12601260

gttagccctg gtattttggc tgtattctta cttggcttat tctggaagaa aacaaccagt gttagccctg gtattttggc tgtattctta cttggcttat tctggaagaa aacaaccagt

13201320

aaaggggcta ttattggtgt agtagcatca ataccatttg ccttgttctt gaaatttatg aaaggggcta ttattggtgt agtagcatca ataccatttg ccttgttctt gaaatttatg

13801380

ccactttcca tgccatttat ggatcaaatg ctatacacat tattgtttac aatggttgtt ccactttcca tgccatttat ggatcaaatg ctatacacat tattgtttac aatggttgtt

14401440

atcgcattta caagtttgag cacatcaatt aatgatgatg atcctaaagg tattagtgtt atcgcattta caagtttgag cacatcaatt aatgatgatg atcctaaagg tattagtgtt

15001500

acatcatcga tgtttgtaac agatcgaagc tttaatatcg ctgcttacgg cataatgatt acatcatcga tgtttgtaac agatcgaagc tttaatatcg ctgcttacgg cataatgatt

15601560

gttttggcag tgttatatac attgttctgg taa gttttggcag tgttatatac attgttctgg taa

15931593

<210> 12<210> 12

<211> 1476<211> 1476

<212> ДНК<212> DNA

<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli

<400> 12<400> 12

atgaataccc agtataattc cagttatata ttttcgatta ccttagtcgc tacattaggt atgaataccc agtataattc cagttatata ttttcgatta ccttagtcgc tacattaggt

60 60

ggtttattat ttggctacga caccgccgtt atttccggta ctgttgagtc actcaatacc ggtttattat ttggctacga caccgccgtt atttccggta ctgttgagtc actcaatacc

120 120

gtctttgttg ctccacaaaa cttaagtgaa tccgctgcca actccctgtt agggttttgc gtctttgttg ctccacaaaa cttaagtgaa tccgctgcca actccctgtt agggttttgc

180 180

gtggccagcg ctctgattgg ttgcatcatc ggcggtgccc tcggtggtta ttgcagtaac gtggccagcg ctctgattgg ttgcatcatc ggcggtgccc tcggtggtta ttgcagtaac

240 240

cgcttcggtc gtcgtgattc acttaagatt gctgctgtcc tgttttttat ttctggtgta cgcttcggtc gtcgtgattc acttaagatt gctgctgtcc tgttttttat ttctggtgta

300 300

ggttctgcct ggccagaact tggttttacc tctataaacc cggacaacac tgtgcctgtt ggttctgcct ggccagaact tggttttacc tctataaacc cggacaacac tgtgcctgtt

360 360

tatctggcag gttatgtccc ggaatttgtt atttatcgca ttattggcgg tattggcgtt tatctggcag gttatgtccc ggaatttgtt atttatcgca ttattggcgg tattggcgtt

420 420

ggtttagcct caatgctctc gccaatgtat attgcggaac tggctccagc tcatattcgc ggtttagcct caatgctctc gccaatgtat attgcggaac tggctccagc tcatattcgc

480 480

gggaaactgg tctcttttaa ccagtttgcg attattttcg ggcaactttt agtttactgc gggaaactgg tctcttttaa ccagtttgcg attattttcg ggcaactttt agtttactgc

540 540

gtaaactatt ttattgcccg ttccggtgat gccagctggc tgaatactga cggctggcgt gtaaactatt ttattgcccg ttccggtgat gccagctggc tgaatactga cggctggcgt

600 600

tatatgtttg cctcggaatg tatccctgca ctgctgttct taatgctgct gtataccgtg tatatgtttg cctcggaatg tatccctgca ctgctgttct taatgctgct gtataccgtg

660 660

ccagaaagtc ctcgctggct gatgtcgcgc ggcaagcaag aacaggcgga aggtatcctg ccagaaagtc ctcgctggct gatgtcgcgc ggcaagcaag aacaggcgga aggtatcctg

720 720

cgcaaaatta tgggcaacac gcttgcaact caggcagtac aggaaattaa acactccctg cgcaaaatta tgggcaacac gcttgcaact caggcagtac aggaaattaa acactccctg

780 780

gatcatggcc gcaaaaccgg tggtcgtctg ctgatgtttg gcgtgggcgt gattgtaatc gatcatggcc gcaaaaccgg tggtcgtctg ctgatgtttg gcgtgggcgt gattgtaatc

840 840

ggcgtaatgc tctccatctt ccagcaattt gtcggcatca atgtggtgct gtactacgcg ggcgtaatgc tctccatctt ccagcaattt gtcggcatca atgtggtgct gtactacgcg

900 900

ccggaagtgt tcaaaacgct gggggccagc acggatatcg cgctgttgca gaccattatt ccggaagtgt tcaaaacgct gggggccagc acggatatcg cgctgttgca gaccattatt

960 960

gtcggagtta tcaacctcac cttcaccgtt ctggcaatta tgacggtgga taaatttggt gtcggagtta tcaacctcac cttcaccgtt ctggcaatta tgacggtgga taaatttggt

10201020

cgtaagccac tgcaaattat cggcgcactc ggaatggcaa tcggtatgtt tagcctcggt cgtaagccac tgcaaattat cggcgcactc ggaatggcaa tcggtatgtt tagcctcggt

10801080

accgcgtttt acactcaggc accgggtatt gtggcgctac tgtcgatgct gttctatgtt accgcgtttt acactcaggc accgggtatt gtggcgctac tgtcgatgct gttctatgtt

11401140

gccgcctttg ccatgtcctg gggtccggta tgctgggtac tgctgtcgga aatcttcccg gccgcctttg ccatgtcctg gggtccggta tgctgggtac tgctgtcgga aatcttcccg

12001200

aatgctattc gtggtaaagc gctggcaatc gcggtggcgg cccagtggct ggcgaactac aatgctattc gtggtaaagc gctggcaatc gcggtggcgg cccagtggct ggcgaactac

12601260

ttcgtctcct ggaccttccc gatgatggac aaaaactcct ggctggtggc ccatttccac ttcgtctcct ggaccttccc gatgatggac aaaaactcct ggctggtggc ccatttccac

13201320

aacggtttct cctactggat ttacggttgt atgggcgttc tggcagcact gtttatgtgg aacggtttct cctactggat ttacggttgt atgggcgttc tggcagcact gtttatgtgg

13801380

aaatttgtcc cggaaaccaa aggtaaaacc cttgaggagc tggaagcgct ctgggaaccg aaatttgtcc cggaaaccaa aggtaaaacc cttgaggagc tggaagcgct ctgggaaccg

14401440

gaaacgaaga aaacacaaca aactgctacg ctgtaa gaaacgaaga aaacacaaca aactgctacg ctgtaa

14761476

<210> 13<210> 13

<211> 1395<211> 1395

<212> ДНК<212> DNA

<213> Bacillus subtilis<213> Bacillus subtilis

<400> 13<400> 13

atgaagaata ctccaactca attagaacca aatgttcctg taacaagaag ccattcaatg atgaagaata ctccaactca attagaacca aatgttcctg taacaagaag ccattcaatg

60 60

ggatttgtca ttttgatctc atgtgcggcg gggcttggcg gcttattgta tggctatgac ggatttgtca ttttgatctc atgtgcggcg gggcttggcg gcttattgta tggctatgac

120 120

acggcagtga tttctggcgc catcggtttt ctgaaagatt tatacagcct gagtccgttt acggcagtga tttctggcgc catcggtttt ctgaaagatt tatacagcct gagtccgttt

180 180

atggagggac ttgtcatttc aagcattatg attggaggag ttgtgggcgt cgggatatcc atggagggac ttgtcatttc aagcattatg attggaggag ttgtgggcgt cgggatatcc

240 240

ggatttttaa gtgacagatt cggccggaga aaaattttaa tgacagccgc tttgttattt ggatttttaa gtgacagatt cggccggaga aaaattttaa tgacagccgc tttgttattt

300 300

gcgatatcag caatcgtttc agcgctttct caagacgtgt ccaccttaat cattgcaagg gcgatatcag caatcgtttc agcgctttct caagacgtgt ccaccttaat cattgcaagg

360 360

attatcgggg ggctgggaat cgggatgggc tcatcgctct ctgttacgta tattacagaa attatcgggg ggctgggaat cgggatgggc tcatcgctct ctgttacgta tattacagaa

420 420

gcggcaccgc ccgctatacg cggaagttta tcttcgttat atcagctctt tacgatactg gcggcaccgc ccgctatacg cggaagttta tcttcgttat atcagctctt tacgatactg

480 480

ggtatttccg caacatactt tattaatcta gctgtgcagc ggtccggaac atacgaatgg ggtatttccg caacatactt tattaatcta gctgtgcagc ggtccggaac atacgaatgg

540 540

ggcgtgcaca ccggctggag atggatgctt gcttatggaa tggtgccatc cgtcattttt ggcgtgcaca ccggctggag atggatgctt gcttatggaa tggtgccatc cgtcattttt

600 600

ttccttgtcc tgctcgtcgt cccggaaagt ccgagatggc tggcgaaagc gggcaaaaca ttccttgtcc tgctcgtcgt cccggaaagt ccgagatggc tggcgaaagc gggcaaaaca

660 660

aatgaagctt taaagatcct gacacgtatt aatggagaaa ctgttgcaaa agaagaatta aatgaagctt taaagatcct gacacgtatt aatggagaaa ctgttgcaaa agaagaatta

720 720

aagaacattg agaactcttt aaaaatagaa caaatggggt cgctctccca gctgtttaag aagaacattg agaactcttt aaaaatagaa caaatggggt cgctctccca gctgtttaag

780 780

ccgggtctca gaaaggcgct tgtcattgga atcctgctgg cgctgtttaa ccaagtcatc ccgggtctca gaaaggcgct tgtcattgga atcctgctgg cgctgtttaa ccaagtcatc

840 840

ggcatgaacg cgattactta ctacgggccg gaaatcttta aaatgatggg attcgggcaa ggcatgaacg cgattactta ctacgggccg gaaatcttta aaatgatggg attcgggcaa

900 900

aacgccggat ttgtgacgac ttgtatcgtc ggggttgtag aagttatttt taccgttatt aacgccggat ttgtgacgac ttgtatcgtc ggggttgtag aagttatttt taccgttatt

960 960

gcggtgttgc tgattgataa agtcggacga aaaaaactga tgtccatcgg ttctgctttt gcggtgttgc tgattgataa agtcggacga aaaaaactga tgtccatcgg ttctgctttt

10201020

atggctattt ttatgatttt aatcgggacg tcgttttatt ttgagttaac aagcgggatc atggctattt ttatgatttt aatcgggacg tcgttttatt ttgagttaac aagcgggatc

10801080

atgatgatcg tccttatatt aggttttgtc gctgctttct gtgtctcggt cggaccgatc atgatgatcg tccttatatt aggttttgtc gctgctttct gtgtctcggt cggaccgatc

11401140

acatggatta tgatttctga aatcttcccg aaccatctgc gtgcgcgggc cgcgggcatt acatggatta tgatttctga aatcttcccg aaccatctgc gtgcgcgggc cgcgggcatt

12001200

gcgaccatct ttttatgggg agcaaactgg gcgatcggac agtttgtgcc aatgatgatc gcgaccatct ttttatgggg agcaaactgg gcgatcggac agtttgtgcc aatgatgatc

12601260

gattctttcg ggctcgccta tacattttgg atctttgcgg tgattaacat cctttgtttc gattctttcg ggctcgccta tacattttgg atctttgcgg tgattaacat cctttgtttc

13201320

ctgtttgtcg ttacgatctg tccagaaacg aagaacaaat cgctcgagga aattgaaaag ctgtttgtcg ttacgatctg tccagaaacg aagaacaaat cgctcgagga aattgaaaag

13801380

ctttggataa aatga ctttggataaaatga

13951395

<210> 14<210> 14

<211> 4393<211> 4393

<212> ДНК<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 14<400> 14

atgtataaaa aacggaagtt agccattctt attgctttgc taaccggcac cgccgccgcc atgtataaaa aacggaagtt agccattctt attgctttgc taaccggcac cgccgccgcc

60 60

catgggcaga cagacctgaa cagcattgaa gcgcgtctcg ccgccctgga aaaacgcctg catgggcaga cagacctgaa cagcattgaa gcgcgtctcg ccgccctgga aaaacgcctg

120 120

caggacgccg agacccgcgc cagcactgcc gaaagccgcg ccgcctcagc ggagcagaaa caggacgccg agacccgcgc cagcactgcc gaaagccgcg ccgcctcagc ggagcagaaa

180 180

gttcagcagt taacccagca gcagcagcaa acccaggcca ccacccagca ggtggccagg gttcagcagt taacccagca gcagcagcaa acccaggcca caccaccagca ggtggccagg

240 240

cgcaccactc aactggaaga aaaagccgaa cggcccggcg gctttgagtt ccatggctat cgcaccactc aactggaaga aaaagccgaa cggcccggcg gctttgagtt ccatggctat

300 300

gcgcgttccg gggtgatcat gaacgactcg gccgccagta ccaaatccgg cgcttatatg gcgcgttccg gggtgatcat gaacgactcg gccgccagta ccaaatccgg cgcttatatg

360 360

acccccgccg gggagaccgg cggcgccatt ggtcgcctgg gcaaccaggc cgacacctat acccccgccg gggagaccgg cggcgccatt ggtcgcctgg gcaaccaggc cgacacctat

420 420

gtggaaatga acctcgaaca taaacagacc ctggacaacg gggcgaccac ccgtttcaaa gtggaaatga acctcgaaca taaacagacc ctggacaacg gggcgaccac ccgtttcaaa

480 480

gtgatggtgg ccgacggaca gaccacctat aacgactgga cggcaagcag cagcgacctg gtgatggtgg ccgacggaca gaccacctat aacgactgga cggcaagcag cagcgacctg

540 540

aacgtacgcc aggcgttcgt cgagctgggc aatctgccga ccttcgaagg cccgttcaaa aacgtacgcc aggcgttcgt cgagctgggc aatctgccga ccttcgaagg cccgttcaaa

600 600

ggctcgaccc tgtgggccgg gaaacgcttt gaccgcgaca acttcgacat ccactggatt ggctcgaccc tgtgggccgg gaaacgcttt gaccgcgaca acttcgacat ccactggatt

660 660

gactcggatg tggtgttcct cgccgggacc ggcggcggga tctacgacgt gaaatggaac gactcggatg tggtgttcct cgccgggacc ggcggcggga tctacgacgt gaaatggaac

720 720

gacagcctgc gcagcaactt ctcgttatac ggccgcaact ttggcgatat cgccgacagc gacagcctgc gcagcaactt ctcgttatac ggccgcaact ttggcgatat cgccgacagc

780 780

agcaacagcg tgcagaacta tatcgtcagc atgaataact ttgccggccc ggtgcagatg agcaacagcg tgcagaacta tatcgtcagc atgaataact ttgccggccc ggtgcagatg

840 840

atggtcagcg ggatgcgggc gaaagataat gacgaccgcc aggacgcgaa cggcaatctg atggtcagcg ggatgcgggc gaaagataat gacgaccgcc aggacgcgaa cggcaatctg

900 900

gtgaaaggcg atgccgctaa caccggggtt catgccctgc tgggcctgca caatgagagc gtgaaaggcg atgccgctaa caccggggtt catgccctgc tgggcctgca caatgagagc

960 960

ttctatggcc tgcgcgacgg gaccagcaaa acggccctgc tgtacggcca cgggctgggc ttctatggcc tgcgcgacgg gaccagcaaa acggccctgc tgtacggcca cgggctgggc

10201020

gccgaggtta aaggcatcgg ctccgacggc gcgctgcgcc cgggggccaa tacctggcgc gccgaggtta aaggcatcgg ctccgacggc gcgctgcgcc cggggggccaa tacctggcgc

10801080

ttcgccagct atggcactac gccgctgagc gatcgctggt ttattgcccc ggccgtgctg ttcgccagct atggcactac gccgctgagc gatcgctggt ttattgcccc ggccgtgctg

11401140

gcgcagagca gtaaagatcg ttatgtcgat ggcgacagct atcagtgggc caccctcaac gcgcagagca gtaaagatcg ttatgtcgat ggcgacagct atcagtgggc caccctcaac

12001200

ctgcgtctga ttcaggaagt gacgcagaac ttcgccctcg cctgggaggg cagctatcag ctgcgtctga ttcaggaagt gacgcagaac ttcgccctcg cctgggaggg cagctatcag

12601260

tacatggatc tgcagcctga aggctacaac gatcgccatg cggtcaatgg cagcttctac tacatggatc tgcagcctga aggctacaac gatcgccatg cggtcaatgg cagcttctac

13201320

aagctgacct tcgccccgac cttcaaggtg ggcagcatcg gcgacttctt ctcgcggccg aagctgacct tcgccccgac cttcaaggtg ggcagcatcg gcgacttctt ctcgcggccg

13801380

gagatccgct tctatacatc gtggatggac tggagcaaaa aactggacaa ctacgccaac gagatccgct tctatacatc gtggatggac tggagcaaaa aactggacaa ctacgccaac

14401440

gatgacgcgt taggcagcaa cggattcaaa tcgggcggcg aatggtcgtt cggtatgcaa gatgacgcgt taggcagcaa cggattcaaa tcgggcggcg aatggtcgtt cggtatgcaa

15001500

atggagacct ggttctgacg gccaccgggg cgacagggta aataacacat aaatataagg atggagacct ggttctgacg gccaccgggg cgacagggta aataacacat aaatataagg

15601560

ttcgcggcgc ctgccacggc tggcgccgcc cacgccatat catcatgcat ttagagggta ttcgcggcgc ctgccacggc tggcgccgcc cacgccatat catcatgcat ttagagggta

16201620

ctatggattt tgaacagatt tcccgctcac tgcttcccct gctgggcggc aaggaaaata ctatggattt tgaacagatt tcccgctcac tgcttcccct gctgggcggc aaggaaaata

16801680

tcgccagcgc cgcgcactgc gccacccgcc tgcggctggt gctggtcgac gacgcgctcg tcgccagcgc cgcgcactgc gccacccgcc tgcggctggt gctggtcgac gacgcgctcg

17401740

ccgatcagca ggcgattggc aaaatcgacg gggtgaaagg ctgctttcgc aatgccggac ccgatcagca ggcgattggc aaaatcgacg gggtgaaagg ctgctttcgc aatgccggac

18001800

agatgcagat catcttcggc accggggtgg tcaataaagt ctatgccgcc tttatccagg agatgcagat catcttcggc accggggtgg tcaataaagt ctatgccgcc tttatccagg

18601860

ccgcaggcat cagcgaatcg agcaaatccg aagccgccga cctggcggcg aaaaagctga ccgcaggcat cagcgaatcg agcaaatccg aagccgccga cctggcggcg aaaaagctga

19201920

acccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctgt ccaacatctt cgtgccgatt attccggcca acccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctgt ccaacatctt cgtgccgatt attccggcca

19801980

tcgtcgcctc cggcctgctg atgggcctgc tggggatggt gaaaacctac ggttgggtcg tcgtcgcctc cggcctgctg atgggcctgc tggggatggt gaaaacctac ggttgggtcg

20402040

acccgagcaa cgctctctat atcatgctgg atatgtgcag ttcggcggcg tttatcattc acccgagcaa cgctctctat atcatgctgg atatgtgcag ttcggcggcg tttatcattc

21002100

tgccgatcct gatcggcttt accgccgccc gcgaatttgg cggtaacccc tatctgggcg tgccgatcct gatcggcttt accgccgccc gcgaatttgg cggtaacccc tatctgggcg

21602160

cgaccctcgg cgggatcctc acccacccgg cgctgaccaa cgcctggggc gtcgccgccg cgaccctcgg cgggatcctc acccacccgg cgctgaccaa cgcctggggc gtcgccgccg

22202220

gcttccacac catgaatttc ttcggcatcg aagtggcgat gatcggctac cagggcaccg gcttccacac catgaatttc ttcggcatcg aagtggcgat gatcggctac cagggcaccg

22802280

tcttcccggt gctgctggcg gtgtggttta tgagcatggt cgagaagcgg ctgcgccgcg tcttcccggt gctgctggcg gtgtggttta tgagcatggt cgagaagcgg ctgcgccgcg

23402340

tgatccctga cgcgctggac ctgatcctca ctccgttcct gacggtgatt atctccggct tgatccctga cgcgctggac ctgatcctca ctccgttcct gacggtgatt atctccggct

24002400

ttatcgccct gctgctgatc ggcccggccg gtcgcgcgct cggcgacggc atttcgttta ttatcgccct gctgctgatc ggcccggccg gtcgcgcgct cggcgacggc atttcgttta

24602460

tcctcagcac gcttatcagc catgccggct ggctggcggg cctgctgttc ggcggcctct tcctcagcac gcttatcagc catgccggct ggctggcggg cctgctgttc ggcggcctct

25202520

attcggtgat cgtcattacc ggtatccatc acagcttcca tgccatcgag gccggactgc attcggtgat cgtcattacc ggtatccatc acagcttcca tgccatcgag gccggactgc

25802580

tgggcaaccc atcgattggc gtcaacttcc tgctgccgat ctgggcgatg gccaacgtcg tgggcaaccc atcgattggc gtcaacttcc tgctgccgat ctgggcgatg gccaacgtcg

26402640

cccagggcgg cgcctgcttt gcggtgtggt ttaaaaccaa agatgccaaa ataaaagcca cccagggcgg cgcctgcttt gcggtgtggt ttaaaaccaa agatgccaaa ataaaagcca

27002700

tcaccctgcc gtcggcgttt tcggcgatgc tggggatcac cgaggcggca atcttcggga tcaccctgcc gtcggcgttt tcggcgatgc tggggatcac cgaggcggca atcttcggga

27602760

ttaacctgcg ctttgtgaaa ccgtttatcg ccgcgctggt gggcggtgcc gccggcggcg ttaacctgcg ctttgtgaaa ccgtttatcg ccgcgctggt gggcggtgcc gccggcggcg

28202820

cctgggtggt gtcgatgcac gtctacatga ccgcggtggg cctgacggcg atcccgggaa cctgggtggt gtcgatgcac gtctacatga ccgcggtggg cctgacggcg atcccgggaa

28802880

tggctatcgt gcaggccagc tcgctgctga actacattat cggaatggcg atcgccttcg tggctatcgt gcaggccagc tcgctgctga actacattat cggaatggcg atcgccttcg

29402940

ccgtggcctt cgcgctctct ctgacgctga aatacaaaac ggacgctgaa taatgtcatt ccgtggcctt cgcgctctct ctgacgctga aatacaaaac ggacgctgaa taatgtcatt

30003000

accgtcacgt ctgcctgcga tcctgcaggc cgttatgcag ggccagccgc aggcgctggc accgtcacgt ctgcctgcga tcctgcaggc cgttatgcag ggccagccgc aggcgctggc

30603060

cgacagccat tatccgcaat ggcatctggc gccggtcaac ggactgctga acgatcctaa cgacagccat tatccgcaat ggcatctggc gccggtcaac ggactgctga acgatcctaa

31203120

cggcttttgc caggtcgccg ggcgttacca cctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg cggcttttgc caggtcgccg ggcgttacca cctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg

31803180

cgaccatacc tataagtgct ggggacactg gagctctgcc gatctgctgc actggcggca cgaccatacc tataagtgct ggggacactg gagctctgcc gatctgctgc actggcggca

32403240

cgaacctatc gccctgatgc cggatgaaga gtatgaccgc aacggctgct actctggcag cgaacctatc gccctgatgc cggatgaaga gtatgaccgc aacggctgct actctggcag

33003300

cgcggtcgag ttcgagggtg ccctgactct gtgctacacc ggcaacgtga aattccccga cgcggtcgag ttcgagggtg ccctgactct gtgctacacc ggcaacgtga aattccccga

33603360

cggcgggcgc accgcctggc aatgtctggc gaccgagaat gccgatggca ccttccgcaa cggcgggcgc accgcctggc aatgtctggc gaccgagaat gccgatggca ccttccgcaa

34203420

gctggggccg gtgctgccgc tgccagaagg ctataccggc catgtgcgcg accctaaagt gctggggccg gtgctgccgc tgccagaagg ctataccggc catgtgcgcg accctaaagt

34803480

gtggcggcag gacgggcgct ggtacatggt tcttggggcg caggatgtgc aacagcgcgg gtggcggcag gacgggcgct ggtacatggt tcttggggcg caggatgtgc aacagcgcgg

35403540

caaagtgctg ctgtttaccg ccagcgacct gcgggagtgg cgcctggtgg gcgagatcgc caaagtgctg ctgtttaccg ccagcgacct gcgggagtgg cgcctggtgg gcgagatcgc

36003600

cgggcacgac gtgaacggcc tggcgaacgc cggctacatg tgggagtgcc cggatctctt cgggcacgac gtgaacggcc tggcgaacgc cggctacatg tgggagtgcc cggatctctt

36603660

tccgctggcg gacacccacc tgctgatctg ctgcccgcag gggctggccc gcgaagcgca tccgctggcg gacacccacc tgctgatctg ctgcccgcag gggctggccc gcgaagcgca

37203720

gcgctttctc aatacctatc cggcggtgtg gatggcaggc cgcttcgacg ccgaacgcgg gcgctttctc aatacctatc cggcggtgtg gatggcaggc cgcttcgacg ccgaacgcgg

37803780

gatcttcgac cacggcccgc tgcacgagct ggacagcgga tttgagttct acgcgccgca gatcttcgac cacggcccgc tgcacgagct ggacagcgga tttgagttct acgcgccgca

38403840

gaccatgcag gccgacgatg gccgccgcct gctggtcggc tggatgggcg tccccgacgg gaccatgcag gccgacgatg gccgccgcct gctggtcggc tggatgggcg tccccgacgg

39003900

ggacgagatg catcagccca cccgcgcgca gggctggatc catcagatga cctgcgtgcg ggacgagatg catcagccca cccgcgcgca gggctggatc catcagatga cctgcgtgcg

39603960

tgagctggag tggcaggctg gcactctgta tcagcgtccg ctgcgcgagc tggtcgccct tgagctggag tggcaggctg gcactctgta tcagcgtccg ctgcgcgagc tggtcgccct

40204020

gcgcggggaa gcccagggct ggtgcggaca gaccctgccc ctcgccccga tggagctggc gcgcggggaa gcccagggct ggtgcggaca gaccctgccc ctcgccccga tggagctggc

40804080

ctttgacctt tcccccgaca gcacgctggg gctggacttt gccggcgccc tgcagctcac ctttgacctt tcccccgaca gcacgctggg gctggacttt gccggcgccc tgcagctcac

41404140

cgtcaatcgc gacggcctac gtctgtcgcg ccgcggcctg cagacggcag agatgcatca cgtcaatcgc gacggcctac gtctgtcgcg ccgcggcctg cagacggcag agatgcatca

42004200

ccgctactgg cgcggcgagg cgcgacgcct gcggatcttt atcgaccgct ccagcgtgga ccgctactgg cgcggcgagg cgcgacgcct gcggatcttt atcgaccgct ccagcgtgga

42604260

gattttcatc aacgatggcg agggggtgat gagcagccgc ttctttccgg gctatccggg gattttcatc aacgatggcg agggggtgat gagcagccgc ttctttccgg gctatccggg

43204320

gcagctcatc ttcagcggtg cgacgccggt ggcattctgc cgctggctgc tgcggccatg gcagctcatc ttcagcggtg cgacgccggt ggcattctgc cgctggctgc tgcggccatg

43804380

catggtagaa taa catggtagaa taa

43934393

<210> 15<210> 15

<211> 4423<211> 4423

<212> ДНК<212> DNA

<213> Salmonella typhimurium<213> Salmonella typhimurium

<400> 15<400> 15

atgtacagaa aaagcacact tgcgatgctt atcgctttgc taaccagcgc tgcctcagcc atgtacagaa aaagcacact tgcgatgctt atcgctttgc taaccagcgc tgcctcagcc

60 60

catgcgcaaa cggatataag caccattgaa gcccgactca acgcgctgga aaaacgcctg catgcgcaaa cggatataag caccattgaa gcccgactca acgcgctgga aaaacgcctg

120 120

caggaggcag aaaacagggc gcaaacggcg gaaaaccgcg ccggggcggc ggagaaaaaa caggaggcag aaaacagggc gcaaacggcg gaaaaccgcg ccggggcggc ggagaaaaaa

180 180

gttcagcaac tcaccgcgca gcagcaaaaa aaccagaact cgactcagga agtggctcag gttcagcaac tcaccgcgca gcagcaaaaa aaccagaact cgactcagga agtggctcag

240 240

cgtaccgcca gacttgagaa aaaagccgat gacaaaagcg gatttgagtt tcacggttac cgtaccgcca gacttgagaa aaaagccgat gacaaaagcg gatttgagtt tcacggttac

300 300

gcccgctccg gcgtgataat gaatgattcc ggcgccagca ccaaatccgg agcctacata gcccgctccg gcgtgataat gaatgattcc ggcgccagca ccaaatccgg agcctacata

360 360

acgccggcag gtgaaaccgg cggagctatc ggccgtctgg gaaaccaggc cgatacctat acgccggcag gtgaaaccgg cggagctatc ggccgtctgg gaaaccaggc cgatacctat

420 420

gttgaaatga atcttgaaca taagcagacc ctggataatg gggccacgac ccgctttaag gttgaaatga atcttgaaca taagcagacc ctggataatg gggccacgac ccgctttaag

480 480

gtgatggtcg ccgacgggca aacctcttat aacgactgga ctgcaagcac cagcgatctg gtgatggtcg ccgacgggca aacctcttat aacgactgga ctgcaagcac cagcgatctg

540 540

aacgttcgtc aggcctttgt cgaattgggt aacctgccga cgttcgctgg gccatttaag aacgttcgtc aggcctttgt cgaattgggt aacctgccga cgttcgctgg gccatttaag

600 600

ggctccaccc tgtgggccgg gaaacgtttc gaccgcgaca atttcgatat tcactggatt ggctccaccc tgtgggccgg gaaacgtttc gaccgcgaca atttcgatat tcactggatt

660 660

gactctgatg tcgtgttcct cgccggtacc ggtggtggta tctatgacgt gaagtggaac gactctgatg tcgtgttcct cgccggtacc ggtggtggta tctatgacgt gaagtggaac

720 720

gacggcctgc ggagtaattt ctccctgtac gggcgtaact tcggcgacat tgatgattcc gacggcctgc ggagtaattt ctccctgtac gggcgtaact tcggcgacat tgatgattcc

780 780

agcaacagcg tgcagaacta tatcctcacc atgaatcact tcgcaggtcc gctgcagatg agcaacagcg tgcagaacta tatcctcacc atgaatcact tcgcaggtcc gctgcagatg

840 840

atggtcagcg gtctgcgggc gaaggataac gacgagcgta aagatagcaa cggcaatctg atggtcagcg gtctgcgggc gaaggataac gacgagcgta aagatagcaa cggcaatctg

900 900

gcaaaaggcg atgcggcaaa caccggcgtg catgcgctgc tcggcctgca taacgacagt gcaaaaggcg atgcggcaaa caccggcgtg catgcgctgc tcggcctgca taacgacagt

960 960

ttctacggcc tgcgcgacgg tagcagtaaa accgctctgc tttatggtca tggtctgggc ttctacggcc tgcgcgacgg tagcagtaaa accgctctgc tttatggtca tggtctgggc

10201020

gcagaggtta aaggtatcgg atctgatggc gcacttcgtc cgggagccga cacatggcgc gcagaggtta aaggtatcgg atctgatggc gcacttcgtc cgggagccga cacatggcgc

10801080

attgccagtt acggcaccac gccgctcagc gaaaactggt ctgttgcccc ggcaatgctg attgccagtt acggcaccac gccgctcagc gaaaactggt ctgttgcccc ggcaatgctg

11401140

gcgcaacgca gtaaagaccg ctatgccgat ggcgacagct atcagtgggc aacattcaac gcgcaacgca gtaaagaccg ctatgccgat ggcgacagct atcagtgggc aacattcaac

12001200

ctgcgtctga ttcaggcaat caatcagaat ttcgctctcg cctacgaagg cagctaccag ctgcgtctga ttcaggcaat caatcagaat ttcgctctcg cctacgaagg cagctaccag

12601260

tacatggatc ttaaacccga aggttataac gatcgtcagg cggtgaacgg tagcttctac tacatggatc ttaaacccga aggttataac gatcgtcagg cggtgaacgg tagcttctac

13201320

aagctcacct tcgccccgac atttaaggtc ggcagtatcg gtgatttctt cagtcgcccg aagctcacct tcgccccgac atttaaggtc ggcagtatcg gtgatttctt cagtcgcccg

13801380

gagattcgtt tctatacctc ctggatggac tggagcaaaa aactgaataa ttacgccagc gagattcgtt tctatacctc ctggatggac tggagcaaaa aactgaataa ttacgccagc

14401440

gacgacgccc tgggcagtga cggttttaac tcgggcggcg aatggtcttt cggtgtgcag gacgacgccc tgggcagtga cggttttaac tcgggcggcg aatggtcttt cggtgtgcag

15001500

atggaaacct ggttctgacg cttacgcctg atgacaggaa tagccggggg tcagagcatc atggaaacct ggttctgacg cttacgcctg atgacaggaa tagccggggg tcagagcatc

15601560

tttgtcaccc cggactcaac taagacgcag aaaaagcgct cccgtgaacg cgggacgaca tttgtcaccc cggactcaac taagacgcag aaaaagcgct cccgtgaacg cgggacgaca

16201620

acataaaaat gtttaagcct taagagggta ctatggattt tgaacagatt tcctgctcgc acataaaaat gtttaagcct taagagggta ctatggattt tgaacagatt tcctgctcgc

16801680

tgcttccgct tcttggaggc aaagaaaata tcgccagcgc cgcgcactgc gccacgcgcc tgcttccgct tcttggaggc aaagaaaata tcgccagcgc cgcgcactgc gccacgcgcc

17401740

tgcgcctggt gctggtcgat gattcgctgg ccgaccagca ggccatcggc aaagttgaag tgcgcctggt gctggtcgat gattcgctgg ccgaccagca ggccatcggc aaagttgaag

18001800

gggtgaaggg ctgttttcgt aatgccggac agatgcagat tattttcggc accggggtgg gggtgaaggg ctgttttcgt aatgccggac agatgcagat tattttcggc accggggtgg

18601860

taaataaggt ctacgctgcc tttactcagg cggcgggtat tagcgaatcc agcaaatcgg taaataaggt ctacgctgcc tttactcagg cggcgggtat tagcgaatcc agcaaatcgg

19201920

aagccgccga catcgcggca aaaaagctca atccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctat aagccgccga catcgcggca aaaaagctca atccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctat

19801980

caaacatctt cgtgccgata atccctgcca tcgtcgcctc tggtctgctg atgggcctgc caaacatctt cgtgccgata atccctgcca tcgtcgcctc tggtctgctg atgggcctgc

20402040

tgggaatggt caaaacatac ggctgggttg acccgggcaa cgccatctac atcatgctgg tgggaatggt caaaacatac ggctgggttg acccgggcaa cgccatctac atcatgctgg

21002100

atatgtgcag ctcggcggca tttatcattc tgccgattct gattggcttt accgccgccc atatgtgcag ctcggcggca tttatcattc tgccgattct gattggcttt accgccgccc

21602160

gcgaattcgg cggtaatcct tatctcggcg cgacgcttgg cggcattctg actcatccag gcgaattcgg cggtaatcct tatctcggcg cgacgcttgg cggcattctg actcatccag

22202220

cgctgactaa cgcctggggc gtggccgcgg gtttccacac catgaacttt ttcggcttcg cgctgactaa cgcctggggc gtggccgcgg gtttccacac catgaacttt ttcggcttcg

22802280

aaattgccat gatcggctat cagggtacgg tgttcccggt actgctggca gtatggttta aaattgccat gatcggctat cagggtacgg tgttcccggt actgctggca gtatggttta

23402340

tgagcatcgt tgagaagcag ttgcgtcgcg caatccccga tgccctggat ttgatcctga tgagcatcgt tgagaagcag ttgcgtcgcg caatccccga tgccctggat ttgatcctga

24002400

cgccgttcct gacggtgatt atatccggtt ttatcgccct gttgattatc ggcccggccg cgccgttcct gacggtgatt atatccggtt ttatcgccct gttgattatc ggcccggccg

24602460

gtcgcgcact gggcgacggt atctcgtttg tcctcagcac cctgattagc cacgccggct gtcgcgcact gggcgacggt atctcgtttg tcctcagcac cctgattagc cacgccggct

25202520

ggctcgccgg gttactgttt ggcggtctct attcagttat cgtcattacc ggtattcatc ggctcgccgg gttactgttt ggcggtctct attcagttat cgtcattacc ggtattcatc

25802580

acagcttcca tgcggttgaa gccgggttgc tgggcaatcc ctccatcggc gtcaacttcc acagcttcca tgcggttgaa gccgggttgc tgggcaatcc ctccatcggc gtcaacttcc

26402640

tgctgccgat ttgggcgatg gccaacgtcg ctcagggcgg agcctgtctg gcggtgtggt tgctgccgat ttgggcgatg gccaacgtcg ctcagggcgg agcctgtctg gcggtgtggt

27002700

tcaaaaccaa agatgcaaaa attaaagcca ttactctgcc ctcggcgttt tccgccatgc tcaaaaccaa agatgcaaaa attaaagcca ttactctgcc ctcggcgttt tccgccatgc

27602760

tgggcatcac cgaggcggcg atttttggta ttaacctgcg ctttgtgaag ccatttattg tgggcatcac cgaggcggcg atttttggta ttaacctgcg ctttgtgaag ccatttattg

28202820

cggcgctgat tggtggtgcg gcgggcggcg catgggtggt atctgtacac gtctacatga cggcgctgat tggtggtgcg gcgggcggcg catgggtggt atctgtacac gtctacatga

28802880

ccgcggtcgg cttgacagcg atccccggca tggccatcgt gcaggccagt tcgctgttga ccgcggtcgg cttgacagcg atccccggca tggccatcgt gcaggccagt tcgctgttga

29402940

actacattat cgggatggtt atcgcctttg gcgtcgcctt tacggtctcc ctggttttga actacattat cgggatggtt atcgcctttg gcgtcgcctt tacggtctcc ctggttttga

30003000

aatacaaaac ggacgctgaa taatgtctct tccatcacga ctgcctgcga ttttgcaggc aatacaaaac ggacgctgaa taatgtctct tccatcacga ctgcctgcga ttttgcaggc

30603060

cgtaatgcag ggccagccgc gcgcgctggc cgatagccac tatccgcgct ggcaccatgc cgtaatgcag ggccagccgc gcgcgctggc cgatagccac tatccgcgct ggcaccatgc

31203120

gccggtcacc gggctgatga acgaccccaa cggctttatc gaatttgccg gacgctatca gccggtcacc gggctgatga acgaccccaa cggctttatc gaatttgccg gacgctatca

31803180

tctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg cgatcatacg tttaagtgct gggcgcactg tctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg cgatcatacg tttaagtgct gggcgcactg

32403240

gagttccatc gatctgctgc actggcagca tgagcccatt gcgctgatgc cggacgaaga gagttccatc gatctgctgc actggcagca tgagcccatt gcgctgatgc cggacgaaga

33003300

gtatgaccgt aacggctgct actccggcag cgcggtggat aacaacggta cgcttaccct gtatgaccgt aacggctgct actccggcag cgcggtggat aacaacggta cgcttaccct

33603360

gtgctatacc ggcaacgtga agtttgccga gggagggcga accgcctggc aatgcctggc gtgctatacc ggcaacgtga agtttgccga gggagggcga accgcctggc aatgcctggc

34203420

aacggaaaac gctgacggca ccttccgcaa aatcggtccg gtcctgccgc tgccggaggg aacggaaaac gctgacggca ccttccgcaa aatcggtccg gtcctgccgc tgccggaggg

34803480

ctacaccggc cacgtgcgcg acccaaaagt ctggcgacac gaagacctgt ggtacatggt ctacaccggc cacgtgcgcg acccaaaagt ctggcgacac gaagacctgt ggtacatggt

35403540

gctgggcgcg caggatcggc aaaagcgcgg caaggtgctg ctgttcagct ctgcggatct gctgggcgcg caggatcggc aaaagcgcgg caaggtgctg ctgttcagct ctgcggatct

36003600

ccatcagtgg acgagtatgg gtgaaatcgc cggccacggc atcaatggcc tcgacgacgt ccatcagtgg acgagtatgg gtgaaatcgc cggccacggc atcaatggcc tcgacgacgt

36603660

cggctatatg tgggagtgcc cggatctttt tccactcggc gaccagcata ttctaatctg cggctatatg tgggagtgcc cggatctttt tccactcggc gaccagcata ttctaatctg

37203720

ctgtccgcag gggattgccc gtgaggaaga gtgctacctg aacacctacc cggcagtatg ctgtccgcag gggattgccc gtgaggaaga gtgctacctg aacacctacc cggcagtatg

37803780

gatggcgggc gagtttgatt acgctgctgg cgctttcaga cacggcgaac tgcacgaact gatggcgggc gagtttgatt acgctgctgg cgctttcaga cacggcgaac tgcacgaact

38403840

ggacgccggg tttgagttct acgccccgca aaccatgctt accagtgatg gccgtcgtct ggacgccggg tttgagttct acgccccgca aaccatgctt accagtgatg gccgtcgtct

39003900

gctggtcggc tggatgggcg tgccggaggg cgaagagatg cttcagccga ccctgaacaa gctggtcggc tggatgggcg tgccggaggg cgaagagatg cttcagccga ccctgaacaa

39603960

cggctggatc catcagatga cctgcctgcg tgagctggag tttatcaacg gtcagctcta cggctggatc catcagatga cctgcctgcg tgagctggag tttatcaacg gtcagctcta

40204020

tcagcgtccg ctacgggaac tgagcgccct gcgcggtgaa gcgaacggct ggtcggggaa tcagcgtccg ctacgggaac tgagcgccct gcgcggtgaa gcgaacggct ggtcggggaa

40804080

cgccctgccg ctggcaccga tggaaatcga tttgcaaacc cgcgggggcg atatgttgag cgccctgccg ctggcaccga tggaaatcga tttgcaaacc cgcgggggcg atatgttgag

41404140

cctcgatttt ggcggcgtat taacccttga gtgcgatgcc agcggactcc gcctggcccg cctcgatttt ggcggcgtat taacccttga gtgcgatgcc agcggactcc gcctggcccg

42004200

acgcagtctc gccagtgacg agatgcatta tcgttactgg cgcggaaacg tccgctcgct acgcagtctc gccagtgacg agatgcatta tcgttactgg cgcggaaacg tccgctcgct

42604260

gcgtgttttc atcgaccagt cgagcgtgga gattttcata aacggcggtg aaggggtgat gcgtgttttc atcgaccagt cgagcgtgga gattttcata aacggcggtg aaggggtgat

43204320

gagcagccgc tacttcccgg cctgctccgg tcagctaaca ttctccggca tcacgccgga gagcagccgc tacttcccgg cctgctccgg tcagctaaca ttctccggca tcacgccgga

43804380

cgcattctgc tactggccgc tgcgaacttg catggtagaa taa cgcattctgc tactggccgc tgcgaacttg catggtagaa taa

44234423

<210> 16<210> 16

<211> 3883<211> 3883

<212> ДНК<212> DNA

<213> Eastern equine encephalomyelitis virus<213>Eastern equine encephalomyelitis virus

<400> 16<400> 16

ctatattgct gaaggtacag gcgtttccat aactatttgc tcgcgttttt tactcaagaa ctatattgct gaaggtacag gcgtttccat aactatttgc tcgcgttttt tactcaagaa

60 60

gaaaatgcca aatagcaaca tcaggcagac aatacccgaa attgcgaaga aaactgtctg gaaaatgcca aatagcaaca tcaggcagac aatacccgaa attgcgaaga aaactgtctg

120 120

gtagcctgcg tggtcaaaga gtatcccagt cggcgttgaa agcagcacaa tcccaagcga gtagcctgcg tggtcaaaga gtatcccagt cggcgttgaa agcagcacaa tcccaagcga

180 180

actggcaatt tgaaaaccaa tcagaaagat cgtcgacgac aggcgcttat caaagtttgc actggcaatt tgaaaaccaa tcagaaagat cgtcgacgac aggcgcttat caaagtttgc

240 240

cacgctgtat ttgaagacgg atatgacaca aagtggaacc tcaatggcat gtaacaactt cacgctgtat ttgaagacgg atatgacaca aagtggaacc tcaatggcat gtaacaactt

300 300

cactaatgaa ataatccagg ggttaacgaa cagcgcgcag gaaaggatac gcaacgccat cactaatgaa ataatccagg ggttaacgaa cagcgcgcag gaaaggatac gcaacgccat

360 360

aatcacaact ccgataagta atgcattttt tggccctacc cgattcacaa agaaaggaat aatcacaact ccgataagta atgcattttt tggccctacc cgattcacaa agaaaggaat

420 420

aatcgccatg cacagcgctt cgagtaccac ctggaatgag ttgagataac catacaggcg aatcgccatg cacagcgctt cgagtaccac ctggaatgag ttgagataac catacaggcg

480 480

cgttcctaca tcgtgtgatt cgaataaacc tgaataaaag acaggaaaaa gttgttgatc cgttcctaca tcgtgtgatt cgaataaacc tgaataaaag acaggaaaaa gttgttgatc

540 540

aaaaatgtta tagaaagacc acgtccccac aataaatatg acgaaaaccc agaagtttcg aaaaatgtta tagaaagacc acgtccccac aataaatatg acgaaaaccc agaagtttcg

600 600

atccttgaaa actgcgataa aatcctcttt ttttacccct cccgcatctg ccgctacgca atccttgaaa actgcgataa aatcctcttt ttttacccct cccgcatctg ccgctacgca

660 660

ctggtgatcc ttatctttaa aacgcatgtt gatcatcata aatacagcgc caaatagcga ctggtgatcc ttatctttaa aacgcatgtt gatcatcata aatacagcgc caaatagcga

720 720

gaccaaccag aagttgatat ggggactgat actaaaaaat atgccggcaa agaacgcgcc gaccaaccag aagttgatat ggggactgat actaaaaaat atgccggcaa agaacgcgcc

780 780

aatagcatag ccaaaagatc cccaggcgcg cgctgttcca tattcgaaat gaaaatttcg aatagcatag ccaaaagatc cccaggcgcg cgctgttcca tattcgaaat gaaaatttcg

840 840

cgccattttt tcggtgaagc tatcaagcaa accgcatccc gccagatacc ccaagccaaa cgccattttt tcggtgaagc tatcaagcaa accgcatccc gccagatacc ccaagccaaa

900 900

aaatagcgcc cccagaatta gacctacaga aaaattgctt tgcagtaacg gttcataaac aaatagcgcc cccagaatta gacctacaga aaaattgctt tgcagtaacg gttcataaac

960 960

gtaaatcata aacggtccgg tcaagaccag gatgaaactc atacaccaga tgagcggttt gtaaatcata aacggtccgg tcaagaccag gatgaaactc atacaccaga tgagcggttt

10201020

cttcagaccg agtttatcct gaacgatgcc gtagaacatc ataaatagaa tgctggtaaa cttcagaccg agtttatcct gaacgatgcc gtagaacatc ataaatagaa tgctggtaaa

10801080

ctggttgacc gaataaagtg tacctaattc cgtccctgtc aaccctagat gtcctttcag ctggttgacc gaataaagtg tacctaattc cgtccctgtc aaccctagat gtcctttcag

11401140

ccaaatagcg tataacgacc accacagcga ccaggaaata aaaaagagaa atgagtaact ccaaatagcg tataacgacc accacagcga ccaggaaata aaaaagagaa atgagtaact

12001200

ggatgcaaaa cgatagtacg catttctgaa tggaatattc agtgccataa ttacctgcct ggatgcaaaa cgatagtacg catttctgaa tggaatattc agtgccataa ttacctgcct

12601260

gtcgttaaaa aattcacgtc ctatttagag ataagagcga cttcgccgtt tacttctcac gtcgttaaaa aattcacgtc ctatttagag ataagagcga cttcgccgtt tacttctcac

13201320

tattccagtt cttgtcgaca tggcagcgct gtcattgccc ctttcgccgt tactgcaagc tattccagtt cttgtcgaca tggcagcgct gtcattgccc ctttcgccgt tactgcaagc

13801380

gctccgcaac gttgagcgag atcgataatt cgtcgcattt ctctctcatc tgtagataat gctccgcaac gttgagcgag atcgataatt cgtcgcattt ctctctcatc tgtagataat

14401440

cccgtagagg acagacctgt gagtaacccg gcaacgaacg catctcccgc ccccgtgcta cccgtagagg acagacctgt gagtaacccg gcaacgaacg catctcccgc ccccgtgcta

15001500

tcgacacaat tcacagacat tccagcaaaa tggtgaactt gtcctcgata acagaccacc tcgacacaat tcacagacat tccagcaaaa tggtgaactt gtcctcgata acagaccacc

15601560

accccttctg cacctttagt caccaacagc atggcgatct catactcttt tgccagggcg accccttctg cacctttagt caccaacagc atggcgatct catactcttt tgccagggcg

16201620

catatatcct gatcgttctg tgtttttcca ctgataagtc gccattcttc ttccgagagc catatatcct gatcgttctg tgtttttcca ctgataagtc gccattcttc ttccgagagc

16801680

ttgacgacat ccgccagttg tagcgcctgc cgcaaacaca agcggagcaa atgctcgtct ttgacgacat ccgccagttg tagcgcctgc cgcaaacaca agcggagcaa atgctcgtct

17401740

tgccatagat cttcacgaat attaggatcg aagctgacaa aacctccggc atgccggatc tgccatagat cttcacgaat attaggatcg aagctgacaa aacctccggc atgccggatc

18001800

gccgtcatcg cagtaaatgc gctggtacgc gaaggctcgg cagacaacgc aattgaacag gccgtcatcg cagtaaatgc gctggtacgc gaaggctcgg cagacaacgc aattgaacag

18601860

agatgtaacc attcgccatg tcgccagcag ggcaagtctg tcgtctctaa aaaaagatcg agatgtaacc attcgccatg tcgccagcag ggcaagtctg tcgtctctaa aaaaagatcg

19201920

gcactggggc ggaccataaa cgtaaatgaa cgttcccctt gatcgttcag atcgacaagc gcactggggc ggaccataaa cgtaaatgaa cgttcccctt gatcgttcag atcgacaagc

19801980

accgtggatg tccggtgcca ttcatcttgc ttcagatacg tgatatcgac tccctcagtt accgtggatg tccggtgcca ttcatcttgc ttcagatacg tgatatcgac tccctcagtt

20402040

agcagcgttc tttgcattaa cgcaccaaaa ggatcatccc ccacccgacc tataaaccca agcagcgttc tttgcattaa cgcaccaaaa ggatcatccc ccacccgacc tataaaccca

21002100

cttgttccgc ctaatctggc gattcccacc gcaacgttag ctggcgcgcc gccaggacaa cttgttccgc ctaatctggc gattcccacc gcaacgttag ctggcgcgcc gccaggacaa

21602160

ggcagtaggc gcccgtctga ttctggcaag agatctacga ccgcatcccc taaaacccat ggcagtaggc gcccgtctga ttctggcaag agatctacga ccgcatcccc taaaacccat

22202220

actttggctg acattttttt cccttaaatt catctgagtt acgcatagtg ataaacctct actttggctg acattttttt cccttaaatt catctgagtt acgcatagtg ataaacctct

22802280

ttttcgcaaa atcgtcatgg atttactaaa acatgcatat tcgatcacaa aacgtcatag ttttcgcaaa atcgtcatgg atttactaaa acatgcatat tcgatcacaa aacgtcatag

23402340

ttaacgttaa catttgtgat attcatcgca tttatgaaag taagggactt tatttttata ttaacgttaa catttgtgat attcatcgca tttatgaaag taagggactt tatttttata

24002400

aaagttaacg ttaacaattc accaaatttg cttaaccagg atgattaaaa tgacgcaatc aaagttaacg ttaacaattc accaaatttg cttaaccagg atgattaaaa tgacgcaatc

24602460

tcgattgcat gcggcgcaaa acgccctagc aaaacttcat gagcaccggg gtaacacttt tcgattgcat gcggcgcaaa acgccctagc aaaacttcat gagcaccggg gtaacacttt

25202520

ctatccccat tttcacctcg cgcctcctgc cgggtggatg aacgatccaa acggcctgat ctatccccat tttcacctcg cgcctcctgc cgggtggatg aacgatccaa acggcctgat

25802580

ctggtttaac gatcgttatc acgcgtttta tcaacatcat ccgatgagcg aacactgggg ctggtttaac gatcgttatc acgcgtttta tcaacatcat ccgatgagcg aacactgggg

26402640

gccaatgcac tggggacatg ccaccagcga cgatatgatc cactggcagc atgagcctat gccaatgcac tggggacatg ccaccagcga cgatatgatc cactggcagc atgagcctat

27002700

tgcgctagcg ccaggagacg ataatgacaa agacgggtgt ttttcaggta gtgctgtcga tgcgctagcg ccaggagacg ataatgacaa agacgggtgt ttttcaggta gtgctgtcga

27602760

tgacaatggt gtcctctcac ttatctacac cggacacgtc tggctcgatg gtgcaggtaa tgacaatggt gtcctctcac ttatctacac cggacacgtc tggctcgatg gtgcaggtaa

28202820

tgacgatgca attcgcgaag tacaatgtct ggctaccagt cgggatggta ttcatttcga tgacgatgca attcgcgaag tacaatgtct ggctaccagt cgggatggta ttcatttcga

28802880

gaaacagggt gtgatcctca ctccaccaga aggaatcatg cacttccgcg atcctaaagt gaaacagggt gtgatcctca ctccaccaga aggaatcatg cacttccgcg atcctaaagt

29402940

gtggcgtgaa gccgacacat ggtggatggt agtcggggcg aaagatccag gcaacacggg gtggcgtgaa gccgacacat ggtggatggt agtcggggcg aaagatccag gcaacacggg

30003000

gcagatcctg ctttatcgcg gcagttcgtt gcgtgaatgg accttcgatc gcgtactggc gcagatcctg ctttatcgcg gcagttcgtt gcgtgaatgg accttcgatc gcgtactggc

30603060

ccacgctgat gcgggtgaaa gctatatgtg ggaatgtccg gactttttca gccttggcga ccacgctgat gcgggtgaaa gctatatgtg ggaatgtccg gactttttca gccttggcga

31203120

tcagcattat ctgatgtttt ccccgcaggg aatgaatgcc gagggataca gttaccgaaa tcagcattat ctgatgtttt ccccgcaggg aatgaatgcc gagggataca gttaccgaaa

31803180

tcgctttcaa agtggcgtaa tacccggaat gtggtcgcca ggacgacttt ttgcacaatc tcgctttcaa agtggcgtaa tacccggaat gtggtcgcca ggacgacttt ttgcacaatc

32403240

cgggcatttt actgaacttg ataacgggca tgacttttat gcaccacaaa gctttttagc cgggcatttt actgaacttg ataacgggca tgacttttat gcaccacaaa gctttttagc

33003300

gaaggatggt cggcgtattg ttatcggctg gatggatatg tgggaatcgc caatgccctc gaaggatggt cggcgtattg ttatcggctg gatggatatg tgggaatcgc caatgccctc

33603360

aaaacgtgaa ggatgggcag gctgcatgac gctggcgcgc gagctatcag agagcaatgg aaaacgtgaa ggatgggcag gctgcatgac gctggcgcgc gagctatcag agagcaatgg

34203420

caaacttcta caacgcccgg tacacgaagc tgagtcgtta cgccagcagc atcaatctgt caaacttcta caacgcccgg tacacgaagc tgagtcgtta cgccagcagc atcaatctgt

34803480

ctctccccgc acaatcagca ataaatatgt tttgcaggaa aacgcgcaag cagttgagat ctctccccgc acaatcagca ataaatatgt tttgcaggaa aacgcgcaag cagttgagat

35403540

tcagttgcag tgggcgctga agaacagtga tgccgaacat tacggattac agctcggcac tcagttgcag tgggcgctga agaacagtga tgccgaacat tacggattac agctcggcac

36003600

tggaatgcgg ctgtatattg ataaccaatc tgagcgactt gttttgtggc ggtattaccc tggaatgcgg ctgtatattg ataaccaatc tgagcgactt gttttgtggc ggtattaccc

36603660

acacgagaat ttagacggct accgtagtat tcccctcccg cagcgtgaca cgctcgccct acacgagaat ttagacggct accgtagtat tcccctcccg cagcgtgaca cgctcgccct

37203720

aaggatattt atcgatacat catccgtgga agtatttatt aacgacgggg aagcggtgat aaggatattt atcgatacat catccgtgga agtatttatt aacgacgggg aagcggtgat

37803780

gagtagtcga atctatccgc agccagaaga acgggaactg tcgctttatg cctcccacgg gagtagtcga atctatccgc agccagaaga acgggaactg tcgctttatg cctcccacgg

38403840

agtggctgtg ctgcaacatg gagcactctg gctactgggt taa agtggctgtg ctgcaacatg gagcactctg gctactgggt taa

38833883

<---<---

Claims

1. Способ ферментативного получения 2’-фукозиллактозы, включающий следующие стадии:1. A method for the enzymatic production of 2'-fucosyllactose, including the following steps:

а) предоставление клетки E. coli, генетически сконструированной для выработки 2’-фукозиллактозы, где клетка E. coli демонстрирует генотип pfkA ^–, lacZ ^–, fuclK ^–, wcaJ ^–, осуществляет сверхэкспрессию ферментов ManB, ManC, Gmd и WcaG для синтеза de novo ГДФ-фукозы, гена α-1,2-фукозилтрансферазы и гена эффлюксного транспортера сахара yberc0001_9420 из Yersinia bercovieri ATCC 43970;a) provision of an E. coli cell genetically engineered to produce 2'-fucosyllactose, where the E. coli cell exhibits the genotype pfkA ^- , lacZ ^- , fuclK ^- , wcaJ ^- , overexpresses the enzymes ManB, ManC, Gmd and WcaG for de novo synthesis GDP-fucose, α-1,2-fucosyltransferase gene and sugar efflux transporter gene yberc0001_9420 from Yersinia bercovieri ATCC 43970;

b) культивирование указанной генетически сконструированной клетки E. coli в культуральной среде, пермиссивной в отношении продукции 2’-фукозиллактозы, где основной источник углерода представляет собой смесь моносахаридов, состоящую из глюкозы и фруктозы, полученную гидролизом сахарозы; иb) cultivating said genetically engineered E. coli cell in a culture medium permissive for the production of 2'-fucosyllactose, where the main carbon source is a mixture of monosaccharides consisting of glucose and fructose obtained by hydrolysis of sucrose; And

c) выделение 2’-фукозиллактозы.c) isolation of 2'-fucosyllactose.

2. Способ по п. 1, где в указанной генетически сконструированной клетке E. coli дополнительно содержится путь биосинтеза УДФ-галактозы для внутриклеточного образования УДФ-галактозы, причем путь биосинтеза УДФ-галактозы включает в себя сверхэкспрессию гена galE E. coli, гена pgm E. coli и гена β-1,4-галактозилтрансферазы galTpm1141 из Pasteurella multocida.2. The method according to claim 1, wherein said genetically engineered E. coli cell additionally contains a UDP-galactose biosynthesis pathway for the intracellular formation of UDP-galactose, wherein the UDP-galactose biosynthesis pathway includes overexpression of the E. coli galE gene, the pgm E gene coli and the β-1,4-galactosyltransferase gene galTpm1141 from Pasteurella multocida .

3. Способ по п. 1 или 2, где указанная генетически сконструированная клетка E. coli дополнительно содержит по меньшей мере один транспортер моносахарида для транслокации моносахарида из среды в цитоплазму клетки E. coli, предпочтительно, кодируемый геном белка облегченной диффузии глюкозы glf из Zymomonas mobilis.3. The method according to claim 1 or 2, where the specified genetically engineered E. coli cell additionally contains at least one monosaccharide transporter for translocation of the monosaccharide from the environment into the cytoplasm of the E. coli cell, preferably encoded by the glf glucose facilitated diffusion protein gene from Zymomonas mobilis .

4. Способ по любому из пп. 1-3, где ген α-1,2-фукозилтрансферазы представляет собой ген 2'-фукозилтрансферазы wbgL из E. coli:O126.4. Method according to any one of paragraphs. 1-3, wherein the α-1,2-fucosyltransferase gene is the wbgL 2'-fucosyltransferase gene from E. coli:O126 .

5. Способ по п. 1, где генетически сконструированная E. coli содержит кластер генов csc E. coli W.5. The method according to claim 1, where the genetically engineered E. coli contains the csc gene cluster of E. coli W.

6. Способ по п. 1, где генетически сконструированная клетка E. coli дополнительно содержит генотип glk ^–, gcd ^–, ptsG ^–.6. The method according to claim 1, where the genetically engineered E. coli cell additionally contains the glk ^– , gcd ^– , ptsG ^– genotype.