RU2809113C2 - Universal antigen presenting cells and their use - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: antigen presenting cell (APC) modified to express and contain CD48, membrane-bound interleukin-21 (mbIL-21) and 41BB ligand (41BBL) is described. Also the following is described: APC modified to express and contain CS1 (CD319), mbIL-21 and 41BB ligand (41BBL) and APC modified to express and contain CD48, CS1 (CD319), mbIL-21 and 41BB ligand (41BBL). The following is presented: a method of propagating immunocytes which includes culturing immunocytes in the presence of an effective amount of any of the specified APCs. A population of expanded immunocytes is presented, where the population of cells has improved tumor killing; and, where cells secrete type I cytokines such as interferon-γ, tumor necrosis factor-α and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). The following is described: a method of treating a disease or disorder in a subject, comprising administering a therapeutically effective number of expanded immunocytes, wherein the therapeutically effective number of expanded immunocytes is between about 10⁵ and about 10¹⁰ cells per dose in a series of dosing cycles.

EFFECT: invention expands the arsenal of means for treating diseases or conditions associated with the presence of a tumor.

58 cl, 4 dwg, 1 tbl, 1 ex

Description

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной патентной заявки США No. 62/633587, поданной 21 февраля 2018 г., полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки. [0001] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 62/633587, filed February 21, 2018, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[0002] Список последовательностей, содержащийся в файле, названном «UTFCP1355WO_ST25.txt», который имеет размер кБ (как измерено в Microsoft Windows) и создан 21 февраля 2019 г., подан с настоящим описанием посредством электронной подачи, и его содержание приведено в настоящем описании в качестве ссылки. [0002] The sequence listing contained in the file named "UTFCP1355WO_ST25.txt", which is KB in size (as measured in Microsoft Windows) and created on February 21, 2019, is filed herewith by electronic filing, and its contents are set forth herein description as a reference.

1. Область техники1. Technical field

[0003] Настоящее изобретение относится, главным образом, к области медицины и иммунологии. Более конкретно, оно относится к антигенпрезентирующим клеткам и их применениям, таким как размножение клеток естественных киллеров (NK). [0003] The present invention relates primarily to the field of medicine and immunology. More specifically, it relates to antigen presenting cells and their applications, such as the proliferation of natural killer (NK) cells.

2. Описание предшествующего уровня техники2. Description of the prior art

[0004] Клетки естественные киллеры (NK) не нуждаются в предварительном воздействии антигенов для активации, в отличие от T-клеток, что делает их высоко эффективными в иммунологическом надзоре над опухолями. В то время как предварительная активация не является необходимой, огромная активность уничтожения клеток NK требует строго контроля, чтобы препятствовать непреднамеренной цитотоксичности и аутоиммунитету. Получение клинически достаточных количеств и оптимально функционирующих клеток NK является другим затруднением. Таким образом, существует необходимость сфокусироваться на молекулярном аппарате, управляющим биологией клетки NK для установления отличий «устойчивых» от «чувствительных» клеток-мишеней для конструирования клеток-помощников для улучшения опосредованной клетками NK иммунотерапии злокачественных опухолей. [0004]Cells natural killer (NK) cells do not require prior exposure to antigens to activate, unlike T cells, making them highly effective in tumor immunosurveillance. While pre-activation is not necessary, the enormous NK cell killing activity requires strict control to prevent unintended cytotoxicity and autoimmunity. Obtaining clinically sufficient quantities and optimally functioning NK cells is another challenge. Thus, there is a need to focus on the molecular machinery governing NK cell biology to differentiate “resistant” from “sensitive” target cells to design helper cells to improve NK cell-mediated immunotherapy of malignancies.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[0005] Соответственно, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам и композициям, относящимся к получению, размножению, контролю качества и функциональной характеризации клеток NK клинической квалификации, предназначенных для клеточной и иммунотерапии. [0005] Accordingly, specific embodiments of the present invention relate to methods and compositions related to the production, expansion, quality control and functional characterization of clinical grade NK cells intended for cellular and immunotherapy.

[0006] В первом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к универсальной антигенпрезентирующей клетке (UAPC), модифицированной для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) связанного с мембраной интерлейкина-21 (mbIL-21) и (3) лиганда 41BB (41BBL). В некоторых аспектах, UAPC экспрессирует CD48. В других аспектах, UAPC экспрессирует CS1. В конкретных аспектах, UAPC экспрессирует CD48 и CS1. [0006] In a first embodiment, the present invention provides a universal antigen presenting cell (UAPC) modified to express (1) CD48 and/or CS1 (CD319), (2) membrane-bound interleukin-21 (mbIL-21) and ( 3) ligand 41BB (41BBL). In some aspects, UAPC expresses CD48. In other aspects, UAPC expresses CS1. In specific aspects, UAPC expresses CD48 and CS1.

[0007] В некоторых аспектах, UAPC по существу не имеет экспрессии эндогенных молекул HLA класса I, II или CD1d. В конкретных аспектах, UAPC экспрессирует ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58). [0007] In some aspects, UAPC is substantially free of expression of endogenous HLA class I, II, or CD1d molecules. In specific aspects, UAPC expresses ICAM-1 (CD54) and LFA-3 (CD58).

[0008] В конкретных аспектах, UAPC дополнительно определяют как происходящую из клетки лейкоза aAPC. В некоторых аспектах, происходящую из клетки лейкоза UAPC дополнительно определяют как клетку K562. [0008] In specific aspects, UAPC is further defined as leukemia cell-derived aAPC. In some aspects, a leukemia cell-derived UAPC is further defined as a K562 cell.

[0009] В некоторых аспектах, модификацию дополнительно определяют как ретровирусную трансдукцию. В некоторых аспектах, ретровирусную трансдукцию дополнительно определяют как трансдукцию вирусной конструкцией из SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2. В конкретных аспектах, UAPC является облученной. [0009] In some aspects, modification is further defined as retroviral transduction. In some aspects, retroviral transduction is further defined as transduction with a viral construct from SEQ ID NO:1 and/or SEQ ID NO:2. In certain aspects, UAPC is irradiated.

[0010] В следующем варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу размножения иммуноцитов, включающему культивирование иммуноцитов в присутствии эффективного количества UAPC из вариантов осуществления (например, универсальной антигенпрезентирующей клетки (UAPC), модифицированной для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) связанного с мембраной интерлейкина-21 (mbIL-21) и (3) лиганда 41BB (41BBL). В некоторых аспектах, иммуноциты и UAPC культивируют в соотношении от 3:1 до 1:3, например, 3:1, 3:2, 1:1, 1:2 или 1:3. В конкретных аспектах, иммуноциты и UAPC культивируют в соотношении 1:2. [0010]In a further embodiment, the present invention relates to a method of propagating immunocytes, comprising culturing immunocytes in the presence of an effective amount of UAPC from embodiments (eg, universal antigen presenting cell (UAPC) modified to express (1) CD48 and/or CS1 (CD319), (2) membrane-bound interleukin-21 (mbIL-21), and (3) 41BB ligand (41BBL). In some aspects, immunocytes and UAPCs are cultured in a ratio of 3:1 to 1:3, such as 3:1, 3:2, 1:1, 1:2, or 1:3. In specific aspects, immunocytes and UAPCs are cultured in a 1:2 ratio.

[0011] В некоторых аспектах, размножение проводят в присутствии IL-2. В конкретных аспектах, IL-2 присутствует в концентрации 10-500 ед./мл, например, 10-25, 25-50, 50-75, 75-10, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400 или 400-500 ед./мл. В конкретных аспектах, IL-2 присутствует в концентрации 100-300 ед./мл. В конкретных аспектах, IL-2 присутствует в концентрации 200 ед./мл. В некоторых аспектах, IL-2 представляет собой рекомбинантный человеческий IL-2. В конкретных аспектах, IL-2 восполняют каждые 2-3 суток, например, каждые 2 суток или 3 суток. [0011] In some aspects, propagation is carried out in the presence of IL-2. In particular aspects, IL-2 is present at a concentration of 10-500 units/ml, for example, 10-25, 25-50, 50-75, 75-10, 100-150, 150-200, 200-250, 250- 300, 300-350, 350-400 or 400-500 units/ml. In specific aspects, IL-2 is present at a concentration of 100-300 units/ml. In specific aspects, IL-2 is present at a concentration of 200 units/ml. In some aspects, the IL-2 is recombinant human IL-2. In particular aspects, IL-2 is replenished every 2-3 days, for example, every 2 days or 3 days.

[0012] В конкретных аспектах, UAPC добавляют по меньшей мере второй раз. В некоторых аспектах, иммуноциты представляют собой клетки NK или T-клетки. В конкретных аспектах, иммуноциты представляют собой клетки NK. [0012] In certain aspects, the UAPC is added at least a second time. In some aspects, the immunocytes are NK cells or T cells. In specific aspects, immunocytes are NK cells.

[0013] В конкретных аспектах, иммуноциты происходят из пуповинной крови (CB), периферической крови (PB), стволовых клеток или костного мозга. В конкретных аспектах, стволовые клетки представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. В некоторых аспектах, иммуноциты получены из CB. В конкретных аспектах, CB пулирована из 2 или более индивидуальных доз пуповинной крови. В конкретных аспектах, CB пулирована из 3, 5 4, 5, 6, 7 или 8 индивидуальных доз пуповинной крови. [0013] In particular aspects, immunocytes are derived from umbilical cord blood (CB), peripheral blood (PB), stem cells, or bone marrow. In particular aspects, the stem cells are induced pluripotent stem cells. In some aspects, immunocytes are derived from CB. In specific aspects, CB is pooled from 2 or more individual units of umbilical cord blood. In specific aspects, CB is pooled from 3, 5, 4, 5, 6, 7, or 8 individual units of umbilical cord blood.

[0014] В некоторых аспектах, клетки NK представляют собой мононуклеарные клетки CB (CBMC). В конкретных аспектах, клетки NK дополнительно определяют как CD56⁺ клетки NK. [0014] In some aspects, NK cells are CB mononuclear cells (CBMC). In specific aspects, NK cells are further defined as CD56 ⁺ NK cells.

[0015] В конкретных аспектах, способ осуществляют в бессыровоточной среде. [0015] In particular aspects, the method is carried out in a serum-free environment.

[0016] В дополнительных аспектах, иммуноциты модифицируют для экспрессии химерного рецептора антигена (CAR). В некоторых аспектах, CAR содержит антигенсвязывающий домен для CD19, CD123, мезотелина, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 или BCMA. В некоторых аспектах, CAR представляет собой гуманизированный CAR. В некоторых аспектах, CAR содержит IL-15. В конкретных аспектах, CAR содержит ген самоубийства. В некоторых аспектах, ген самоубийства представляет собой CD20, CD52, EGFRv3 или индуцируемую каспазу 9. [0016] In additional aspects, immunocytes are modified to express a chimeric antigen receptor (CAR). In some aspects, the CAR contains an antigen binding domain for CD19, CD123, mesothelin, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1, or BCMA. In some aspects, the CAR is a humanized CAR. In some aspects, the CAR contains IL-15. In specific aspects, the CAR contains a suicide gene. In some aspects, the suicide gene is CD20, CD52, EGFRv3, or inducible caspase 9.

[0017] Настоящее изобретение, кроме того, относится к популяции размноженных иммуноцитов, полученной в соответствии с вариантами осуществления (например, культивированием иммуноцитов в присутствии эффективного количества UAPC из вариантов осуществления (например, универсальной антигенпрезентирующей клетки (UAPC), модифицированной для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) связанного с мембраной интерлейкина-21 (mblL-21) и (3) лиганда 41BB (41BBL)). [0017]The present invention further relates to a population of expanded immunocytes obtained in accordance with embodiments (for example, by culturing immunocytes in the presence of an effective amount of UAPC from embodiments (e.g. universal antigen presenting cell (UAPC) modified to express (1) CD48 and/or CS1 (CD319), (2) membrane-bound interleukin-21 (mblL-21), and (3) 41BB ligand (41BBL)).

[0018] В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию размноженных иммуноцитов из вариантов осуществления и фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей эффективное количество размноженных иммуноцитов из вариантов осуществления для использования в лечении заболевания или нарушения у субъекта. [0018] In another embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a population of expanded immunocytes from the embodiments and a pharmaceutically acceptable carrier. In addition, the present invention provides a composition containing an effective amount of expanded immunocytes of embodiments for use in treating a disease or disorder in a subject.

[0019] Дополнительный вариант осуществления относится к способу лечения заболевания или нарушения у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества размноженных иммуноцитов из вариантов осуществления субъекту. [0019] A further embodiment provides a method of treating a disease or disorder in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of expanded immunocytes from the embodiments to the subject.

[0020] В некоторых аспектах, заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль, воспаление, реакцию трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата, аутоиммунное нарушение, иммунодефицитное заболевание, В-клеточное злокачественное новообразование или инфекцию. В конкретных аспектах, злокачественная опухоль представляет собой лейкоз. В некоторых аспектах, лейкоз представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML) или хронический миелогенный лейкоз (CML). В конкретных аспектах, нарушение представляет собой реакцию трансплантат против хозяина (GVHD). В некоторых аспектах, нарушение представляет собой рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, диабет типа I, системную красную волчанку, контактную гиперчувствительность, астму или синдром Шегрена. В некоторых аспектах, субъект представляет собой человека. [0020] In some aspects, the disease or disorder is a malignancy, inflammation, graft-versus-host disease, graft rejection, an autoimmune disorder, an immunodeficiency disease, a B-cell malignancy, or an infection. In specific aspects, the cancer is leukemia. In some aspects, the leukemia is acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), acute myelogenous leukemia (AML), or chronic myelogenous leukemia (CML). In specific aspects, the disorder is graft-versus-host disease (GVHD). In some aspects, the disorder is multiple sclerosis, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, type I diabetes, systemic lupus erythematosus, contact hypersensitivity, asthma, or Sjögren's syndrome. In some aspects, the subject is a person.

[0021] В конкретных аспектах, иммуноциты являются аллогенными. В некоторых аспектах, иммуноциты являются аутологичными. В некоторых аспектах, иммуноциты представляют собой клетки NK или T-клетки. [0021] In certain aspects, the immunocytes are allogeneic. In some aspects, immunocytes are autologous. In some aspects, the immunocytes are NK cells or T cells.

[0022] В дополнительных аспектах, способ дополнительно включает введение по меньшей мере второго лекарственного средства. В некоторых аспектах, по меньшей мере второе лекарственное средство представляет собой терапевтически эффективное количество противоракового средства, иммуномодулирующего средства или иммуносупрессивного средства. В конкретных аспектах, противораковое средство представляет собой химиотерапию, радиотерапию, генотерапию, хирургию, гормонотерапию, антиангиогенную терапию или иммунотерапию. [0022] In additional aspects, the method further includes administering at least a second drug. In some aspects, at least the second drug is a therapeutically effective amount of an anticancer agent, an immunomodulatory agent, or an immunosuppressive agent. In specific aspects, the anticancer agent is chemotherapy, radiotherapy, gene therapy, surgery, hormonal therapy, antiangiogenic therapy, or immunotherapy.

[0023] В некоторых аспектах, иммуносупрессивное средство представляет собой ингибитор кальциневрина, ингибитор mTOR, антитело, химиотерапевтическое средство, облучение, хемокин, интерлейкины или ингибитор хемокина или интерлейкина. [0023] In some aspects, the immunosuppressive agent is a calcineurin inhibitor, mTOR inhibitor, antibody, chemotherapeutic agent, radiation, chemokine, interleukin, or chemokine or interleukin inhibitor.

[0024] В следующих аспектах, иммуноциты и/или по меньшей мере второе лекарственное средство вводят внутривенно, внутрибрюшинно, интратрахеально, внутрь опухоли, внутримышечно, эндоскопически, внутрь очага, чрескожно, подкожно, местно, или посредством прямой инъекции или перфузии. В некоторых аспектах, второе лекарственное средство представляет собой антитело. В конкретных аспектах, антитело представляет собой моноклональное, биспецифическое или триспецифическое антитело. В некоторых аспектах, антитело представляет собой ритуксимаб. [0024] In further aspects, the immunocytes and/or at least the second drug are administered intravenously, intraperitoneally, intratracheally, intratumorally, intramuscularly, endoscopically, intralesively, percutaneously, subcutaneously, locally, or by direct injection or perfusion. In some aspects, the second drug is an antibody. In particular aspects, the antibody is a monoclonal, bispecific, or trispecific antibody. In some aspects, the antibody is rituximab.

[0025] Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, в то время как показывают предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах содержания и объема изобретения станут очевидными специалисту в данной области из этого подробного описания. [0025] Other objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. It should be understood, however, that the detailed description and specific examples, while showing preferred embodiments of the invention, are provided by way of illustration only, as various changes and modifications within the scope and scope of the invention will become apparent to one skilled in the art from this detailed description.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0026] Следующие чертежи составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации конкретных аспектов настоящего описания. Настоящее описание можно лучше понять со ссылкой на один или несколько из этих чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем описании. [0026] The following drawings form a part of the present description and are included to further demonstrate specific aspects of the present description. The present description may be better understood by reference to one or more of these drawings in conjunction with the detailed description of the specific embodiments presented herein.

[0027] ФИГ. 1: Модель молнии для взаимодействия рецепторов клетки естественного киллера человека и лиганда клетки-мишени. Клетки NK человека взаимодействуют с клетками-мишенями посредством множества рецепторов, включая иммуноглобулиновые рецепторы киллеров (KIR), рецепторы естественной цитотоксичности (NCR), семейство рецепторов NKG2, связывающие нектин рецепторы, рецепторы семейства SLAM и другие. Рецепторы на клетках NK являются активирующими (KIR2DL4, KIR3DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, CD94-NKG2C, DAP10, NKG2D, DAP10, CRTAM, DNAM, 2B4, NTB-A, CD3-дзета, CD100, CD160) или ингибирующими (KIR2DL1/2/3/5A/5B, KIR3DL1/2/3, CD94-NKG2A, TIGIT, CD96, CEACAM-1, ILT2/LILRB1, KLRG1, LAIR1, CD161, Siglec-3/7/9) [0027] FIG. 1: Zipper model for the interaction of human natural killer cell receptors and target cell ligand. Human NK cells interact with target cells through a variety of receptors, including killer immunoglobulin receptors (KIRs), natural cytotoxicity receptors (NCRs), the NKG2 family of receptors, nectin-binding receptors, SLAM family receptors, and others. Receptors on NK cells are activating (KIR2DL4, KIR3DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, CD94-NKG2C, DAP10, NKG2D, DAP10, CRTAM, DNAM, 2B4, NTB-A, CD3-zeta, CD100, CD160) or inhibitory ( KIR2DL1/2/3/5A/5B, KIR3DL1/2/3, CD94-NKG2A, TIGIT, CD96, CEACAM-1, ILT2/LILRB1, KLRG1, LAIR1, CD161, Siglec-3/7/9)

[0028] ФИГ. 2A-2E: (ФИГ. 2A-2B) Кратность размножения свежих или замороженных клеток NK с использованием IL-2 или APC. (ФИГ. 2C) Проточная цитометрия на сутки 0, сутки 7 или сутки 14 для экспрессии CD3 и CD56 в клетках NK. (ФИГ. 2D) Количество клеток NT-NK или клеток SG4-NK, стимулированных с использованием APC. (ФИГ. 2E) Кинетика роста клеток NK, стимулированных с использованием клона 9 APC или UAPC. [0028] FIG. 2A-2E: (FIG. 2A-2B) Fold expansion of fresh or frozen NK cells using IL-2 or APC. (FIG. 2C) Flow cytometry at day 0, day 7, or day 14 for CD3 and CD56 expression in NK cells. (FIG. 2D) Number of NT-NK cells or SG4-NK cells stimulated using APC. (FIG. 2E) Growth kinetics of NK cells stimulated with APC or UAPC clone 9.

[0029] ФИГ. 3A-3D: (ФИГ. ЗА) Проточная цитометрия исходных клеток K562 для указанных маркеров. Не наблюдали экспрессии mb-IL21, 41BBL, CD48 и SLAMF7 (CS1). (ФИГ. 3B) Анализ проточной цитометрии APC после трансдукции клона 46 (mbIL-21, 41BBL). (ФИГ. 3C) Анализ проточной цитометрии APC после трансдукции конструкции uAPC для экспрессии CD48 25 (nmIL-21, 41BBL и CD48). (ФИГ. 3D) Анализ проточной цитометрии APC после трансдукции конструкции uAPC2 для экспрессии CS1 (mbIL-21, 41BBL и CS1). [0029] FIG. 3A-3D: (FIG. FOR)Flow cytometry of parental K562 cells for the indicated markers. No expression of mb-IL21, 41BBL, CD48 and SLAMF7 (CS1) was observed.(FIG. 3B)Analysis flow cytometry of APC after transduction of clone 46 (mbIL-21, 41BBL).(FIG. 3C)Flow cytometry analysis of APCs after transduction of the uAPC construct to express CD48 25 (nmIL-21, 41BBL and CD48).(FIG. 3D)Flow cytometry analysis of APCs after transduction of the uAPC2 construct to express CS1 (mbIL-21, 41BBL and CS1).

[0030] ФИГ. 4A-4D: Карты и аннотации конструкций для MMLV-ретровирусного переноса. (ФИГ. 4A) Векторы для ретровирусного переноса для mb-IL21. (ФИГ. 4B) Векторы для ретровирусного переноса для 41BBL. (ФИГ. 4C) Векторы для ретровирусного переноса для CD48-Katushka. (ФИГ. 4D) Векторы для ретровирусного переноса для CS1-EGFP. [0030] FIG. 4A-4D:Design maps and annotations for MMLV retroviral transmission.(FIG. 4A)Retroviral transfer vectors for mb-IL21.(FIG. 4B)Retroviral transfer vectors for 41BBL.(FIG. 4C)Retroviral transfer vectors for CD48-Katushka.(FIG. 4D)Retroviral transfer vectors for CS1-EGFP.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDESCRIPTION OF ILLUSTRATIVE EMBODIMENTS

[0031] В настоящих исследованиях, клетки NK первоначально охарактеризованы по их противоопухолевым и антиаллогенным цитолитическим функциям, отличным от других компонентов врожденного иммунного компартмента. Множество иммунорецепторов, управляющих поведением клеток NK проиллюстрированы как график типа «молния» на ФИГ. 1. Массив передающих сигналы молекул можно широко категоризировать на 2 большие группы, а именно, активирующие против ингибирующих. По структурным и сигнальным модальностям далее фракционируют категории на родственные семейства иммунорецепторов. Несмотря на то, что мембранный протеом клеток NK еще предстоит полностью выяснить, функциональная избыточность внутри «молнии» клетки NK вносит большой вклад в модуляцию цитолитических функций, в то же время сохраняя комплексный и динамический баланс между комплементарными и антагонистическими путями. [0031] In the present studies, NK cells are initially characterized for their antitumor and antiallogeneic cytolytic functions, distinct from other components of the innate immune compartment. The variety of immunoreceptors that control NK cell behavior are illustrated as a lightning bolt graph in FIG. 1. The array of signal transducing molecules can be broadly categorized into 2 broad groups, namely activating versus inhibitory. Structural and signaling modalities further fractionate the categories into related immunoreceptor families. Although the membrane proteome of NK cells remains to be fully elucidated, functional redundancy within the NK cell zipper greatly contributes to the modulation of cytolytic functions while maintaining a complex and dynamic balance between complementary and antagonistic pathways.

[0032] Соответственно, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам и композициям, относящимся к получению, размножению, контролю качества и функциональной характеризации клеток NK клинической квалификации, предназначенных для клеточной и иммунотерапии. Выращивание и формирование структур клинически значимых количеств клеток NK для инфузии пациентам, в то же время удовлетворяя временным рамкам, являются проблематичными, даже в наилучших условиях. В конкретных аспектах, описанные способы и композиции детализируют технические способы получения клетки NK, детали и кинетику достижимого размножения клетки NK, и молекулярную характеризацию для подтверждения успешного формирования клеточных структур. [0032] Accordingly, specific embodiments of the present invention relate to methods and compositions related to the production, expansion, quality control and functional characterization of clinical grade NK cells intended for cellular and immunotherapy. Growing and structuring clinically relevant quantities of NK cells for infusion into patients while meeting time constraints is challenging, even under the best conditions. In specific aspects, the described methods and compositions detail technical methods for producing NK cells, details and kinetics of achievable NK cell expansion, and molecular characterization to confirm successful formation of cellular structures.

[0033] В следующих вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к технологии надежной платформы, воплощенной как универсальные антигенпрезентирующие клетки (UAPC), для кондиционирования, формирования структур и использования клеток естественных киллеров (NK) человека в качестве оружия против опухолей. «UAPC» обозначает в настоящем описании антигенпрезентирующие клетки, сконструированные для оптимизированного размножения иммуноцитов, таких как клетки NK. Настоящие UAPC получены посредством уникальной комбинации костимулирующих молекул для преодоления ингибирующих сигналов и индукции оптимальной и специфической функции уничтожения клетки NK. Обширное тестирование показало для UAPC тонкую регулировку клеточного аппарата NK и улучшение уничтожения опухолей. Настоящие UAPC можно использовать для опосредованной клетками NK иммунотерапии злокачественных опухолей. [0033] In further embodiments, the present invention relates to a technology for a robust platform, embodied as universal antigen presenting cells (UAPC), for conditioning, patterning, and using human natural killer (NK) cells as weapons against tumors. "UAPC" as used herein refers to antigen presenting cells engineered for optimized proliferation of immunocytes such as NK cells. True UAPCs are generated through a unique combination of co-stimulatory molecules to overcome inhibitory signals and induce optimal and specific NK cell killing function. Extensive testing has shown UAPC to fine-tune the NK cell machinery and improve tumor killing. The present UAPCs can be used for NK cell-mediated immunotherapy of malignant tumors.

[0034] Иллюстративные APC получают посредством вынужденной экспрессии связанного с мембраной интерлейкина 21 (mbIL-21) и лиганда 4-IBB в чувствительной к клеткам NK линии антигенпрезентирующих клеток (APC) K562 (обозначенной как клон 46). В другом варианте осуществления, UAPC получены посредством вынужденной экспрессии mbIL-21, лиганда 4-1BB и CD48 в клетках K562 (названы универсальными APC (UAPC)). В другом варианте осуществления, UAPC получены посредством вынужденной экспрессии mbIL-21, лиганда 4-IBB и CS1 в клетках K562 (названы UAPC2). UAPC могут быть получены для экспрессии mblL-21, 41BBL и специфического для клетки NK антигена, такого как антиген семейства SLAM (таблица 1). [0034] Exemplary APCs are generated by forced expression of membrane-bound interleukin 21 (mbIL-21) and 4-IBB ligand in the NK cell-sensitive antigen presenting cell (APC) line K562 (designated clone 46). In another embodiment, UAPCs are generated by forced expression of mbIL-21, 4-1BB ligand and CD48 in K562 cells (termed universal APCs (UAPCs)). In another embodiment, UAPCs are generated by forced expression of mbIL-21, 4-IBB ligand and CS1 in K562 cells (termed UAPC2). UAPCs can be produced to express mblL-21, 41BBL and NK cell-specific antigen such as the SLAM family antigen (Table 1).

[0035] Платформу UAPC можно также использовать для размножения других иммунных эффекторов, включая T-клетки (например, альфа-бета и гамма-дельта T-клетки). Иммуноциты, такие как клетки NK и T-клетки, могут происходить из периферической крови, пуповинной крови, костного мозга или стволовых клеток (включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки). Эти иммуноциты можно подвергать размножению ex vivo и активации с использованием настоящих UAPC, что является необходимым для культивирования для достижения разумных количеств для клинически значимых применений, таких как иммунотерапия злокачественных опухолей. [0035]The UAPC platform can also be used to expand other immune effectors including T cells (e.g. alpha beta and gamma delta T cells). Immunocytes, such as NK cells and T cells, can be derived from peripheral blood, umbilical cord blood, bone marrow, or stem cells (including induced pluripotent stem cells). These immunocytes can be multipliedex vivoand activation using true UAPCs, which is necessary for cultivation to achieve reasonable quantities for clinically relevant applications such as immunotherapy of malignant tumors.

[0036] Таким образом, настоящее описание относится к сериям линий клеток-помощников, сконструированных и полученных для кондиционирования, модуляции, примирования и размножения иммуноцитов человека, таких как клетки NK, для иммунотерапии злокачественных опухолей. [0036] Thus, the present disclosure relates to a series of helper cell lines designed and produced to condition, modulate, prime and expand human immunocytes, such as NK cells, for the immunotherapy of malignant tumors.

I. ОпределенияI. Definitions

[0037] В рамках изобретения, «в основном свободный», в отношении указанного компонента, используют в настоящем описании для обозначения того, что никакое количество указанного компонента намеренно не включено в состав композиции и/или присутствует только в качестве контаминанта или в следовых количествах. Общее количество компонента, образованное в результате любой непреднамеренной контаминации композиции, таким образом, составляет намного ниже 0,05%, предпочтительно, ниже 0,01%. Наиболее предпочтительной является композиция, в которой никакое количество указанного компонента невозможно детектировать с использованием стандартных аналитических способов. [0037] As used herein, "substantially free" with respect to a specified component is used herein to mean that no amount of the specified component is intentionally included in the composition and/or is present only as a contaminant or in trace amounts. The total amount of component resulting from any unintentional contamination of the composition is thus well below 0.05%, preferably below 0.01%. Most preferred is a composition in which no amount of said component is detectable using standard analytical methods.

[0038] В рамках изобретения, описание единственного числа может означать один или несколько. В рамках изобретения, в пункте(пунктах) формулы изобретения, при использовании в сочетании со словом «содержащий», слово единственного числа может обозначать один или более одного. [0038] Within the scope of the invention, the description of the singular may mean one or more. For the purposes of the invention, in the claim(s), when used in conjunction with the word “comprising,” the singular word may mean one or more than one.

[0039] Использование термина «или» в пунктах формулы изобретения осуществляют для обозначения «и/или», если явно не указано, что он относится только к альтернативам, или альтернативы не являются взаимоисключающими, хотя описание поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и к «и/или». В рамках изобретения, «другой» может обозначать по меньшей мере второй или более. Термины «около», «в основном» и «приблизительно» обозначают, как правило, указанное значение плюс или минус 5%. [0039] The use of the term “or” in claims is intended to mean “and/or” unless it is explicitly stated that it refers only to alternatives or the alternatives are not mutually exclusive, although the description supports a definition that refers only to alternatives and to "and/or". Within the scope of the invention, "other" may mean at least a second or more. The terms "about", "substantially" and "approximately" generally mean the stated value plus or minus 5%.

[0040] «Иммунное нарушение», «связанное с иммунитетом нарушение» или «иммуноопосредованное нарушение» относится к нарушению, при котором иммунный ответ играет ключевую роль в развитии или прогрессирования заболевания. Иммуноопосредованные нарушения включают аутоиммунные нарушения, отторжение аллотрансплантата, реакцию трансплантат против хозяина и воспалительные и аллергические состояния. [0040] “Immune disorder,” “immune-related disorder,” or “immune-mediated disorder” refers to a disorder in which the immune response plays a key role in the development or progression of disease. Immune-mediated disorders include autoimmune disorders, allograft rejection, graft-versus-host disease, and inflammatory and allergic conditions.

[0041] «Иммунный ответ» представляет собой ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка или T-клетка, или врожденный иммуноцит, на стимул. В одном варианте осуществления, ответ является специфическим для конкретного антигена («антигенспецифический ответ»). [0041] An "immune response" is the response of an immune system cell, such as a B cell or T cell, or an innate immunocyte, to a stimulus. In one embodiment, the response is specific for a particular antigen (“antigen-specific response”).

[0042] «Аутоиммунное заболевание» относится к заболеванию, при котором иммунная система образует иммунный ответ (например, ответ В-клетки или T-клетки) против антигена, являющегося частью нормального хозяина (то есть, аутоантигена), с последующим повреждением тканей. Аутоантиген может происходить из клетки-хозяина, или может происходить из условно-патогенного организма, такого как микроорганизмы (известные как условно-патогенные организмы), в норме колонизирующие поверхности слизистых оболочек. [0042] "Autoimmune disease" refers to a disease in which the immune system mounts an immune response (eg, a B cell or T cell response) against an antigen that is part of a normal host (ie, an autoantigen), with subsequent tissue damage. The autoantigen may be derived from a host cell, or may be derived from an opportunistic organism, such as microorganisms (known as opportunistic organisms) that normally colonize mucosal surfaces.

[0043] «Проведение лечения» или лечение заболевания или состояния относится к исполнению протокола, который может включать введение одного или нескольких лекарственных средств пациенту, в попытке облегчения признаков или симптомов заболевания. Желательные эффекты лечения включают уменьшение скорости прогрессирования заболевания, облегчение или смягчение состояния заболевания, и ремиссию или улучшенный прогноз. Облегчение может происходить до появления признаков или симптомов заболевания или состояния, так же как после их появления. Таким образом, «проведение лечения» или «лечение» может включать «осуществление предотвращения» или «предотвращение» заболевания или нежелательного состояния. Кроме того, «проведение лечения» или «лечение» не требует полного облегчения признаков или симптомов, не требует излечения, и конкретно включает протоколы, оказывающие только незначительный эффект на пациента. [0043] "Administering treatment" or treating a disease or condition refers to the execution of a protocol, which may include administering one or more medications to a patient, in an attempt to alleviate the signs or symptoms of the disease. Desirable effects of treatment include a reduction in the rate of disease progression, alleviation or mitigation of the disease state, and remission or improved prognosis. Relief can occur before signs or symptoms of a disease or condition appear, as well as after they appear. Thus, “treating” or “treating” may include “prophylactic” or “preventing” a disease or unwanted condition. In addition, “providing treatment” or “treatment” does not require complete relief of signs or symptoms, does not require a cure, and specifically includes protocols that have only a minor effect on the patient.

[0044] Термин «терапевтическое преимущество» или «терапевтически эффективный», как используют на протяжении этой заявки, относится к чему-либо, что стимулирует или улучшает хорошее самочувствие субъекта, применительно к медицинскому лечению этого состояния. Это включает, но без ограничения, уменьшение частоты или тяжести признаков или симптомов заболевания. Например, лечение злокачественной опухоли может включать, например, уменьшение размера опухоли, уменьшение инвазивности опухоли, уменьшение скорости роста злокачественной опухоли или предотвращение метастазирования. Лечение злокачественной опухоли может также относится к продлению выживаемости субъекта с злокачественной опухолью. [0044] The term "therapeutic benefit" or "therapeutically effective" as used throughout this application refers to anything that promotes or improves the well-being of a subject, in relation to the medical treatment of that condition. This includes, but is not limited to, reducing the frequency or severity of signs or symptoms of a disease. For example, treating a cancer may include, for example, reducing the size of the tumor, reducing the invasiveness of the tumor, reducing the growth rate of the cancer, or preventing metastasis. Treating a cancer may also refer to prolonging the survival of a subject with a cancer.

[0045] «Субъект» и «пациент» либо относятся к человеку, либо не относятся к человеку, например, приматы, млекопитающие и позвоночные. В конкретных вариантах осуществления, субъект представляет собой человека. [0045] “Subject” and “patient” either refer to human or non-human, such as primates, mammals and vertebrates. In specific embodiments, the subject is a human.

[0046] Фразы «фармацевтически или фармакологически приемлемый» относится к молекулярным сущностям и композициям, не вызывающим неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении животному, такому как человек, по необходимости. Получение фармацевтической композиции, содержащий антитело или дополнительный активный ингредиент, станет известно специалисту в данной области в свете настоящего описания. Кроме того, понятно, что для введения животному (например, человеку), препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, как требует Департамент FDA по биологическим стандартам. [0046]The phrases “pharmaceutically or pharmacologically acceptable” refer to molecular entities and compositions that do not cause an adverse, allergic or other undesirable reaction when administered to an animal, such as a human, as appropriate. The preparation of a pharmaceutical composition containing an antibody or additional active ingredient will become known to one skilled in the art in light of the present disclosure. In addition, it is understood that for administration to an animal (e.g. humans), drugs must meet the standards of sterility, pyrogenicity, general safety, and purity as required by the FDA's Office of Biological Standards.

[0047] В рамках изобретения, «фармацевтически приемлемый носитель» включает все без исключения водные растворители (например, воду, спиртовые/водные растворы, солевые растворы, парентеральные носители, такие как хлорид натрия, декстроза Рингера и т.д.), неводные растворители (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат), диспергирующие среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные или противогрибковые средства, антиокислители, хелатирующие агенты, и инертные газы), изотонические средства, замедляющие абсорбцию средства, соли, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, гели, связующие средства, наполнители, дезинтегрирующие средства, смазывающие средства, подстластители, вкусоароматические средства, красители, восполняющие жидкость и питательные вещества средства, такие как подобные материалы и их комбинации, как известно специалисту в данной области. pH и точную концентрацию различных компонентов в фармацевтической композиции корректируют в соответствии с хорошо известными параметрами. [0047]For the purposes of the invention, a “pharmaceutically acceptable carrier” includes any and all aqueous solvents (e.g. water, alcohol/aqueous solutions, saline solutions, parenteral vehicles such as sodium chloride, Ringer's dextrose, etc., non-aqueous solvents (e.g. propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil and injectable organic esters such as ethyl oleate), dispersing media, coatings, surfactants, antioxidants, preservatives (e.g. antibacterial or antifungal agents, antioxidants, chelating agents, and inert gases), isotonic agents, absorption retardants, salts, drugs, drug stabilizers, gels, binders, fillers, disintegrants, lubricants, sweeteners, flavorings, coloring agents , fluid and nutrient replenishing agents, such as similar materials and combinations thereof, as is known to one skilled in the art. The pH and precise concentration of the various components in the pharmaceutical composition are adjusted according to well known parameters.

[0048] Термин «гаплотипирование или тканевое типирование» относится к способу, используемому для идентификации гаплотипа или тканевых типов субъекта, например, посредством определения того, какой локус (или локусы) HLA экспрессирован на лимфоцитах конкретного субъекта. Гены HLA локализованы в главном комплексе гистосовместимости (MHC), области на коротком плече хромосомы 6, и вовлечены в межклеточное взаимодействие, иммунный ответ, трансплантацию органов, развитие злокачественных опухолей и чувствительность к заболеванию. Существует шесть генетических локусов, важных для трансплантации, обозначенных HLA-A, HLA-B, HLA-C и HLA-DR, HLA-DP и HLA-DQ. В каждом локусе может присутствовать любой из нескольких различных аллелей. [0048] The term “haplotyping or tissue typing” refers to a method used to identify the haplotype or tissue types of a subject, for example, by determining which HLA locus (or loci) are expressed on lymphocytes of a particular subject. HLA genes are located in the major histocompatibility complex (MHC), a region on the short arm of chromosome 6, and are involved in cell-cell communication, immune response, organ transplantation, the development of malignancies, and disease susceptibility. There are six genetic loci important for transplantation, designated HLA-A, HLA-B, HLA-C and HLA-DR, HLA-DP and HLA-DQ. Any of several different alleles may be present at each locus.

[0049] В широко используемом способе гаплотипирования используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для сравнения ДНК субъекта с известными фрагментами генов, кодирующих антигены MHC. Вариабельность этих областей генов определяет тканевой тип или гаплотип субъекта. Серологические способы также используют для детекции серологически определенных антигенов на поверхностях клеток. Детерминанты HLA-A, -B и -C можно измерять известными серологическими способами. Кратко, лимфоциты от субъекта (выделенные из свежей периферической крови) инкубируют с антисыворотками, узнающими все известные антигены HLA. Клетки распределяют в планшете с микроскопическими лунками, содержащими различные виды антисыворотки. Клетки инкубируют в течение 30 минут, с последующей дополнительной 60-минутной инкубацией с комплементом. Если лимфоциты имеют на своей поверхности антигены, узнаваемые антителами в антисыворотке, лимфоциты подвергаются лизису. Можно добавлять краситель, чтобы показать изменения проницаемости клеточной мембраны и гибель клеток. Паттерн клеток, разрушенных посредством лизиса, указывает на степень гистологической несовместимости. Если, например, лимфоциты от индивидуума, тестируемого по HLA-A3, разрушаются в лунке, содержащей антисыворотку для HLA-A3, тест является положительным для этой группы антигенов. [0049] A commonly used haplotyping technique uses polymerase chain reaction (PCR) to compare a subject's DNA to known gene fragments encoding MHC antigens. Variability in these gene regions determines the tissue type or haplotype of the subject. Serological methods are also used to detect serologically defined antigens on cell surfaces. HLA-A, -B and -C determinants can be measured by known serological methods. Briefly, lymphocytes from the subject (isolated from fresh peripheral blood) are incubated with antisera recognizing all known HLA antigens. The cells are spread into a microscopic well plate containing different types of antiserum. Cells are incubated for 30 minutes, followed by an additional 60 minute incubation with complement. If lymphocytes have antigens on their surface that are recognized by the antibodies in the antiserum, the lymphocytes undergo lysis. Dye can be added to show changes in cell membrane permeability and cell death. The pattern of cells destroyed by lysis indicates the degree of histological incompatibility. If, for example, lymphocytes from an individual tested for HLA-A3 are destroyed in a well containing antiserum for HLA-A3, the test is positive for that group of antigens.

[0050] Термин «антигенпрезентирующие клетки (APC)» относится к классу клеток, способному представлять один или несколько антигенов в форме комплекса пептид-МНС, поддающегося узнаванию специфическими эффекторными клетками иммунной системы, и таким образом, индукции эффективного клеточного иммунного ответа против представляемого антигена или антигенов. Термин «APC» включает интактные цельные клетки, такие как макрофаги, В-клетки, эндотелиальные клетки, активированные T-клетки и дендритные клетки, или молекулы, природные или синтетические, способные представлять антиген, такие как очищенные молекулы MHC класса I в комплексе с β2-микроглобулином. [0050] The term "antigen presenting cells (APC)" refers to a class of cells capable of presenting one or more antigens in the form of a peptide-MHC complex, amenable to recognition by specific effector cells of the immune system, and thereby inducing an effective cellular immune response against the presented antigen or antigens. The term "APC" includes intact whole cells, such as macrophages, B cells, endothelial cells, activated T cells and dendritic cells, or molecules, natural or synthetic, capable of presenting antigen, such as purified MHC class I molecules complexed with β2 - microglobulin.

II. Универсальные антигенпрезентирующие клеткиII. Universal antigen presenting cells

[0051] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к получению и применению универсальных антигенпрезентирующих клеток (UAPC). UAPC можно использовать для размножения иммуноцитов, таких как клетки NK и T-клетки. UAPC можно модифицировать для экспрессии связанного с мембраной IL-21 (mbIL-21) и 41BBL (лиганда CD137). [0051] Some embodiments of the present invention relate to the production and use of universal antigen presenting cells (UAPC). UAPC can be used to propagate immunocytes such as NK cells and T cells. UAPC can be modified to express membrane-bound IL-21 (mbIL-21) and 41BBL (CD137 ligand).

[0052] UAPC можно модифицировать для экспрессии лиганда CD137 и/или связанного с мембраной цитокина. Связанный с мембраной цитокин может представляет собой mIL-21 или mIL-15. В конкретных вариантах осуществления, UAPC модифицируют для экспрессии лиганда CD137 и mIL-21. APC могут происходить из клеток злокачественных опухолей, таких как клетки лейкоза. APC могут не иметь никакой экспрессии эндогенных молекул HLA класса I, II или CDld. APC могут экспрессировать ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58). В частности, APC могут представлять собой клетки K562, такие как клетки K562, модифицированные для экспрессии лиганда CD137 и mIL-21. APC могут являться облученными. Конструирование можно осуществлять любым способом, известным в данной области, таким как ретровирусная трансдукция. [0052] UAPC can be modified to express CD137 ligand and/or membrane-associated cytokine. The membrane-bound cytokine may be mIL-21 or mIL-15. In specific embodiments, UAPC is modified to express CD137 ligand and mIL-21. APCs can originate from malignant tumor cells such as leukemia cells. APCs may not have any expression of endogenous HLA class I, II or CDld molecules. APCs can express ICAM-1 (CD54) and LFA-3 (CD58). In particular, APCs may be K562 cells, such as K562 cells modified to express CD137 ligand and mIL-21. APCs may be irradiated. Construction can be accomplished by any method known in the art, such as retroviral transduction.

[0053] Цитокины осуществляют очень сильный контроль над целыми классами иммуноцитов (включая клетки NK), влияя на судьбу клеток, активность и эффективность ответов клеток. Мощность цитокиновой стимуляции для активации клеток NK подтверждает, что их «естественные» эффекторные функции являются высоко чувствительными к внешнему воздействию, и что примирование может регулировать поведение клетки NK in vivo. [0053] Cytokines exert very strong control over entire classes of immunocytes (including NK cells), influencing cell fate, activity and efficiency of cell responses. The potency of cytokine stimulation to activate NK cells suggests that their “natural” effector functions are highly sensitive to external influences and that priming can regulate NK cell behavior in vivo.

[0054] Для решения проблемы получения клинически значимых количеств клеток NK, в настоящих способах можно использовать интерлейкин (IL-21) в качестве средства, управляющего размножением клеток NK в настоящей технологии платформы UAPC. У человека, стимуляция клетки NK с использованием IL-10 и IL-21 индуцирует экспрессию NKG2D зависимым от STAT3 способом. В то время как рецепторы цитокинов разделяют сходные компоненты передачи клеточных сигналов во множестве иммуноцитов, специфическая для клетки NK передача сигналов зависит от связи рецептор IL-21-STAT3 для пролиферации. [0054] To solve the problem of obtaining clinically significant quantities of NK cells, the present methods can use interleukin (IL-21) as a means of driving the proliferation of NK cells in the present UAPC platform technology. In humans, NK cell stimulation using IL-10 and IL-21 induces NKG2D expression in a STAT3-dependent manner. While cytokine receptors share similar cell signaling components in a variety of immunocytes, NK cell-specific signaling depends on the IL-21 receptor-STAT3 association for proliferation.

[0055] Передача сигналов цитокинов является важной для поддержания выживаемости и пролиферации лимфоцитов. In vivo, введение IL-2 является единственным одобренным FDA способом размножения клеток NK. IL-15, другой активный активатор клетки NK, подвергают клиническим исследованиям фазы I в качестве возможной альтернативы IL-2, но может иметь значительную токсичность после системного введения. Помимо значительной токсичности, эти цитокины также индуцируют пролиферацию T-клеток, в то же время ограничивая персистенцию клеток NK. Несмотря на то, что они разделяют один и тот же рецептор для передачи сигнала, рецепторы IL-2, IL-4, IL-25 7, IL-9, IL-15 и IL-21 оказывают различные и специфические эффекты на разнообразные клетки. [0055]Cytokine signaling is important for maintaining lymphocyte survival and proliferation.In vivointroduction IL-2 is the only FDA-approved way to propagate NK cells. IL-15, another active NK cell activator, is being evaluated in phase I clinical trials as a possible alternative to IL-2, but may have significant toxicity following systemic administration. In addition to significant toxicity, these cytokines also induce T cell proliferation while limiting NK cell persistence. Although they share the same receptor for signal transduction, IL-2, IL-4, IL-25 7, IL-9, IL-15 and IL-21 receptors have different and specific effects on a variety of cells.

A. Связанный с мембраной IL-21A. Membrane-bound IL-21

[0056] В конкретных вариантах осуществления, для специфической модификации клеток NK, IL-21 можно использовать для получения настоящих UAPC. Рецептор IL-21 (IL21R), близко родственный бета-цепи рецептора IL-2, способный передавать сигналы посредством своей димеризации с общей гамма-цепью (гамма(c) рецепторов цитокинов, подвергается повышающей регуляции в активированных клетках NK человека (клетках, готовых к стимуляции). В то время как IL-21, цитокин типа I, может модулировать функции клетки T-, B- и NK, в настоящих исследованиях обнаружено, что только клетки NK человека подвергаются значительному размножению посредством активации пути передачи сигнала рецептора IL21 (т.е., в 1000 раз в течение 21 суток). И наоборот, IL21 играет важную роль в сокращении количества CD8⁺ T-клеток. [0056] In specific embodiments, to specifically modify NK cells, IL-21 can be used to generate true UAPCs. The IL-21 receptor (IL21R), closely related to the beta chain of the IL-2 receptor, capable of signaling through its dimerization with the common gamma chain (gamma(c) cytokine receptors, is up-regulated in activated human NK cells (ready cells). While IL-21, a type I cytokine, can modulate T, B and NK cell functions, the present studies found that only human NK cells undergo significant expansion through activation of the IL21 receptor signaling pathway (i.e. e., 1000 times within 21 days).Conversely, IL21 plays an important role in reducing the number of CD8 ⁺ T cells.

[0057] Передачу сигналов IL21R в основном усиливает STAT3, высоко активный активатор клеточной пролиферации. Связью IL21R-STAT3 управляет индуцированное IL-21 связывание STAT3 с ДНК с GAS и цис-индуцируемыми элементами, как подтверждено посредством иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга с использованием антитела против фосфотирозина. Молекулярную основу опосредованной IL21 пролиферации можно специфически проследить до тирозина 510 (Y510) на IL21R, который опосредует индуцированное IL-21 фосфорилирование STAT1 и STAT33. Этот механизм подчеркивается посредством ослабления ответов IL-21 у мышей с двойным нокаутом Statl/Stat3. [0057] IL21R signaling is primarily enhanced by STAT3, a highly active activator of cell proliferation. The IL21R-STAT3 association is driven by IL-21-induced STAT3 DNA binding to GAS and cis -inducible elements, as confirmed by immunoprecipitation and Western blotting using an anti-phosphotyrosine antibody. The molecular basis of IL21-mediated proliferation can be specifically traced to tyrosine 510 (Y510) on IL21R, which mediates IL-21-induced phosphorylation of STAT1 and STAT33. This mechanism is highlighted by attenuated IL-21 responses in Statl/Stat3 double knockout mice.

[0058] Передача сигналов IL21R является важной для цитотоксичности NK. Недостаточность IL21R у человека связана с нарушенным цитолизом меченных 51Cr клеток-мишеней K562, в то время как антителозависимая клеточная цитотоксичность является не затронутой. Моногенный не летальный для эмбрионов дефект (мутация с потерей функции в IL21R) представляет отличную возможность для установления границ, и таким образом, является полезным для моделирования, усиления и формирования врожденных цитолитических ответов NK. [0058] IL21R signaling is important for NK cytotoxicity. IL21R deficiency in humans is associated with impaired cytolysis of 51Cr-labeled K562 target cells, while antibody-dependent cellular cytotoxicity is unaffected. A monogenic non-embryo-lethal defect (loss-of-function mutation in IL21R) represents an excellent opportunity for delineation, and thus is useful for modeling, enhancing and shaping innate cytolytic NK responses.

[0059] Передача сигналов IL-21 избирательно формирует подгруппы клеток NK, даже несмотря на то, что обе популяции клеток CD56^{тусклый} и CD56^яркий несут сходные количества поверхностного IL21R. Индукция посредством IL-21 фосфорилирования STAT1 и STAT3 выше в клетках NK CD56^яркий по сравнению с CD56^{тусклый}. В отличие от этого, IL-21 не оказывает эффекта на активацию STAT5, путь активации IL-2, который также управляет размножением T-клеток. В дополнение к активации STAT3, передача сигналов IL-21 также включает пути МАРК и PI3K, и индуцирует экспрессию генов врожденного иммунного ответа, включая IFN-гамма, T-bet, IL-12Rбета2 и IL-18R, в клетках NK, примируя их для уничтожения клеток опухолей. [0059] IL-21 signaling selectively shapes subsets of NK cells, even though both CD56 ^dim and CD56 ^bright cell populations carry similar amounts of surface IL21R. Induction by IL-21 of STAT1 and STAT3 phosphorylation is higher in NK cells CD56 ^bright compared to CD56 ^dim . In contrast, IL-21 had no effect on activation of STAT5, a pathway of IL-2 activation that also drives T cell proliferation. In addition to STAT3 activation, IL-21 signaling also involves the MAPK and PI3K pathways, and induces the expression of innate immune response genes, including IFN-gamma, T-bet, IL-12Rbeta2, and IL-18R, in NK cells, priming them for destruction of tumor cells.

[0060] Для эффективного использования IL-21, экспрессию mbIL-21 (ФИГ. 4A) можно использовать для концентрирования и локализации транс-взаимодействия с IL21R на клетках NK. Близость mbIL21 к мембране обеспечивает легкую доступность, когда он необходим, таким образом, он может подкреплять оптимальную пролиферацию клеток без больших количеств и концентраций экзогенно доставляемого IL-21. Совместные культуры с облученными K562-mbl5-41BBL индуцировали размножение с медианной 21,6 кратностью CD56+CD3- клеток NK из периферической крови. Это размножение является более высоким, по сравнению со стимуляцией только растворимыми цитокинами из разделяющего γc семейства, включая IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, отдельно или в комбинациях. По сравнению с этим, настоящие UAPC могут размножать клетки NK по меньшей мере в 1000 раз (3-log) в течение 14-21 суток. Экспрессия mbIL21 на UAPC может также устранять необходимость в экзогенном цитокине клинической квалификации. [0060] To effectively utilize IL-21, expression of mbIL-21 (FIG. 4A) can be used to concentrate and localize trans interaction with IL21R on NK cells. The proximity of mbIL21 to the membrane ensures easy availability when it is needed, thus it can support optimal cell proliferation without large amounts and concentrations of exogenously delivered IL-21. Co-cultures with irradiated K562-mbl5-41BBL induced a median 21.6-fold expansion of CD56+CD3− NK cells from peripheral blood. This expansion is superior to stimulation with soluble γc family cytokines alone, including IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, alone or in combinations. In comparison, true UAPCs can proliferate NK cells at least 1000-fold (3-log) within 14-21 days. Expression of mbIL21 on UAPC may also obviate the need for a clinically graded exogenous cytokine.

B. 4-1BBL (лиганд 4-1BB, лиганд CD137, CD137L, TNFSF9)B. 4-1BBL (ligand 4-1BB, ligand CD137, CD137L, TNFSF9)

[0061] В дополнение к пониманию примирования цитокином функции клетки NK, непосредственные физические взаимодействия с активирующими молекулами в клетках NK приводят к усиленным клеточным пролиферативным ответам. CD137 (4-1BB) является членом семейства генов рецепторов факторов некроза опухолей (TNF-R), опосредующего пролиферацию, дифференцировку клеток и программированную гибель клеток (апоптоз). Сначала охарактеризован мышиный рецептор, затем человеческий гомолог, разделяющий 60% идентичность на уровне аминокислот, со значительной консервативностью цитоплазматического домена/домена передачи сигналов. CD137, главным образом, экспрессируется в активированных T-клетках и клетках NK, с различными уровнями, поддающимися детекции в тимоцитах, миелоидных клетках и эндотелиальных клетках в участках воспаления. Физиологическая передача сигналов CD137 опосредована через 1) NF-кВ, который способствует выживаемости посредством активации Bcl-XL, и 2) путь PI3K/ERK1/2, который специфически управляет прохождением клеточного цикла. [0061] In addition to understanding cytokine priming of NK cell function, direct physical interactions with activating molecules in NK cells result in enhanced cellular proliferative responses. CD137 (4-1BB) is a member of the tumor necrosis factor receptor (TNF-R) gene family that mediates cell proliferation, differentiation, and programmed cell death (apoptosis). The mouse receptor was first characterized, followed by a human homolog sharing 60% identity at the amino acid level, with significant conservation in the cytoplasmic/signaling domain. CD137 is primarily expressed in activated T cells and NK cells, with varying levels detectable in thymocytes, myeloid cells, and endothelial cells at sites of inflammation. Physiological CD137 signaling is mediated through 1) NF-κB, which promotes survival through activation of Bcl-XL, and 2) the PI3K/ERK1/2 pathway, which specifically drives cell cycle progression.

[0062] В активированных клетках NK, CD137 представляет собой индуцируемую цитокинами костимулирующую молекулу, которая, в свою очередь, управляет противоопухолевыми ответами в клетках NK посредством увеличения клеточной пролиферации и секреции IFN-γ. Исследования с использованием мышей с нокаутом CD137L-/- выявили важность передачи сигналов CD137/CD137L в развитии противоопухолевых иммуноцитов. Мыши с нокаутом CD137-/- имели в 4 раза более высокую частоту метастазирования опухолей, по сравнению с контрольными мышами. [0062] In activated NK cells, CD137 is a cytokine-inducible co-stimulatory molecule, which in turn drives antitumor responses in NK cells by increasing cell proliferation and IFN-γ secretion. Studies using CD137L −/− knockout mice have revealed the importance of CD137/CD137L signaling in the development of antitumor immunocytes. CD137-/- knockout mice had a 4-fold higher incidence of tumor metastasis compared to control mice.

[0063] Лиганд CD137 (CD137L, лиганд 4-1BB), 34 кДа гликопротеиновый член суперсемейства TNF, детектирован главным образом на активированных антигенпрезентирующих клетках (APC), включая В-клетки, макрофаги и дендритные клетки, так же как временно экспрессирован на низких уровнях на активированных T-клетках. CD137L человека является только на 36% гомологичным, по сравнению с мышиным аналогом. В соответствии с противоопухолевой эффективностью агонистических антител против CD137, показано, что связывание CD137L вызывает активность CTL и противоопухолевую активность. [0063] CD137 ligand (CD137L, 4-1BB ligand), a 34 kDa glycoprotein member of the TNF superfamily, is detected primarily on activated antigen presenting cells (APCs), including B cells, macrophages and dendritic cells, as well as being transiently expressed at low levels on activated T cells. Human CD137L is only 36% homologous to its mouse counterpart. Consistent with the antitumor efficacy of CD137 agonistic antibodies, CD137L binding has been shown to induce CTL activity and antitumor activity.

[0064] Соответственно, настоящие UAPC можно модифицировать для экспрессии лиганда 4-IBB, физиологического контр-рецептора для CD137, для стимуляции. [0064] Accordingly, the present UAPCs can be modified to express ligand 4-IBB, a physiological counter-receptor for CD137, for stimulation.

С. SLAM/CD48S.SLAM/CD48

[0065] Помимо цитокинового кондиционирования и костимуляции 4-1BBL, непосредственные физические взаимодействия между NK и клетками-мишенями также влияют на клеточные ответы, т.е. уничтожение клеток-мишеней. Передающие сигналы активирующие лимфоциты молекулы (SLAM, ранее известные также как суперсемейство CD2) семейства гомологичных иммуноглобулинам рецепторов, которые широко экспрессируются и играют критические роли в иммунной системе, являются особенно важными в отношении межклеточных взаимодействий. [0065]In addition to cytokine conditioning and 4-1BBL costimulation, direct physical interactions between NK and target cells also influence cellular responses, e.g. destruction of target cells. The signaling lymphocyte-activating molecules (SLAMs, formerly also known as the CD2 superfamily), a family of immunoglobulin-homologous receptors that are widely expressed and play critical roles in the immune system, are particularly important in relation to cell-cell interactions.

[0066] Соответственно, UAPC по настоящему описанию могут экспрессировать один или несколько антигенов семейства SLAM. Члены семейства SLAM включают CD2, CD48, CD58 (LFA-3), CD244 (2B4), CD229 (Ly9), CD319 (CS1 (CD2 подгруппа 1); CRACC (CD2-подобный рецептор, активирующий цитотоксические клетки)) и CD352 (NTB-A (антиген NK-T-B)). В конкретных аспектах, UAPC экспрессируют CD48 и/или CS1. Клетки NK экспрессируют по меньшей мере три члена семейства SLAM (SLAMF). Они представляют собой 2B4, NK, T- и B-клеточный антиген (NTB-A), и CD2-подобный рецептор, активирующий цитотоксические клетки (CRACC), узнающие их соответствующие лиганды CD48, NTB-A и CRACC на клетках-мишенях и, возможно, на других клетках NK. В то время как SLAMF1, 3, 5, 6, 7, 8 и 9 представляют собой гомофильные рецепторы (собственный лиганд), SLAMF2 и SLAMF4 являются контр-рецепторами (гетерофильными) друг для друга. Широкий диапазон (три порядка величины) для известной гомофильной аффинности (константа диссоциации, Kd, от <1 мкМ до 200 мкМ) указывает на механистическое основание для перекрывающихся, но отдельных, механизмов передачи сигналов для гликопротеинов SLAM. [0066] Accordingly, UAPCs as described herein may express one or more SLAM family antigens. SLAM family members include CD2, CD48, CD58 (LFA-3), CD244 (2B4), CD229 (Ly9), CD319 (CS1 (CD2 subgroup 1); CRACC (CD2-like receptor activating cytotoxic cells)) and CD352 (NTB -A (NK-TB antigen)). In particular aspects, UAPCs express CD48 and/or CS1. NK cells express at least three members of the SLAM family (SLAMF). They are 2B4, NK, T and B cell antigen (NTB-A), and CD2-like receptor activating cytotoxic cells (CRACC) recognizing their respective ligands CD48, NTB-A and CRACC on target cells and, possibly on other NK cells. While SLAMF1, 3, 5, 6, 7, 8 and 9 are homophilic receptors (self-ligand), SLAMF2 and SLAMF4 are counter-receptors (heterophilic) to each other. The wide range (three orders of magnitude) for known homophilic affinity (dissociation constant, Kd, from <1 μM to 200 μM) suggests a mechanistic basis for overlapping, but distinct, signaling mechanisms for SLAM glycoproteins.

[0067] Таблица 1: Аффинность связывания членов семейства SLAM. [0067] Table 1: Binding affinities of SLAM family members.

SLAMFSLAMF CDCD НаименоваениеName Альтернативные наименованияAlternative names ВзаимодействиеInteraction Контр-рецепторCounter receptor АффинностьAffinity 11 150150 SLAMSLAM SLAMFl,
CD 150,
CDwl50SLAMFl,
CD 150,
CDwl50 гомофильноеhomophilous 200200 22 4848 CD48CD48 BCM1,
BLAST,
BLASTl,
MEM-102BCM1,
BLAST
BLASTl,
MEM-102 гетерофильноеheterophilic CD2 (грызуны)CD2 (rodents) >500>500 гетерофильноеheterophilic 2B42B4 88 33 229229 LY9LY9 hly9,
м-лимфоцитарный антиген 9hly9,
m-lymphocyte antigen 9 гомофильноеhomophilous 44 244244 2B42B4 NAIL,
NKR2B4,
NmrkNAIL,
NKR2B4,
Nmrk гетерофильноеheterophilic CD48CD48 88 55 8484 CD84CD84 LY9BLY9B гомофильноеhomophilous <1<1 66 352352 NTB-ANTB-A KALI, KALIb,
Lyl08,
NTBA,
SF2000KALI, KALIb,
Lyl08,
NTBA,
SF2000 гомофильноеhomophilous 22 77 319319 CRACCCRACC CS1, 19ACS1, 19A гомофильноеhomophilous 88 353353 BLAME,
SBBI42BLAME
SBBI42 гомофильноеhomophilous 99 CD2F10,
CD84H1,
SF2001,
CD2F-10,
CD84-H1CD2F10,
CD84H1,
SF2001,
CD2F-10,
CD84-H1 гомофильноеhomophilous

[0068] В конкретных вариантах осуществления, настоящие UAPC модифицируют для экспрессии CD48 для подкрепления межклеточного взаимодействия для усиления ответов клеток NK. CD48 представляет собой заяколренный гликозилфосфатидилинозитолом белок (GPI-AP), обнаруженный на поверхности клеток NK, T-клеток, моноцитов и базофилов, и участвующий в путях адгезии и активации в этих клетках. Несмотря на отсутствие у него внутриклеточного домена, стимуляция CD48 индуцирует переаранжировку факторов передачи сигналов в липидных рафтах, активность Lck-киназы и фосфорилирование тирозина. В качестве молекулы адгезии и костимулирующей молекулы, CD48 индуцирует многочисленные эффекты в В- и T-лимфоцитах, клетках NK, тучных клетках и эозинофилах. В клетках NK человека, CD48 является контр-рецептором для 2B426, важного активатора клеток NK. Считают, что гетерофильное взаимодействие конкурирует за взаимодействие с CD244 с MHC-I. Взаимодействие 2B4/CD48, таким образом, индуцирует сигналы активации в человеческих клетках NK, в то время как в мышиных клетках NK оно посылает ингибирующие сигналы. [0068] In specific embodiments, the present UAPCs are modified to express CD48 to promote cell-cell communication to enhance NK cell responses. CD48 is a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein (GPI-AP) found on the surface of NK cells, T cells, monocytes and basophils, and is involved in adhesion and activation pathways in these cells. Despite its lack of an intracellular domain, stimulation of CD48 induces rearrangement of signaling factors in lipid rafts, Lck kinase activity, and tyrosine phosphorylation. As an adhesion and co-stimulatory molecule, CD48 induces multiple effects in B and T lymphocytes, NK cells, mast cells and eosinophils. In human NK cells, CD48 is a counter-receptor for 2B426, an important activator of NK cells. The heterophilic interaction is thought to compete for the interaction of CD244 with MHC-I. The 2B4/CD48 interaction thus induces activation signals in human NK cells, while in murine NK cells it sends inhibitory signals.

[0069] В то время как взаимодействия 2B4-CD48 между клетками из одной и той же популяции, т.е., взаимодействия клетка NK-клетка NK или взаимодействия T-клетка-T-клетка, приводят к усиленной активации, посредством экспрессии CD48 на APC, таких как линия миелоидных клеток K562, в норме лишенных CD48, в UAPC можно запускать активный путь передачи сигнала 2B4 на клетках NK в транс. [0069]While 2B4-CD48 interactions between cells from the same population, i.e. NK cell-NK cell interactions or T cell-T cell interactions lead to enhanced activation, through the expression of CD48 on APCs such as the myeloid cell line K562, which normally lack CD48, UAPCs can trigger an active 2B4 signaling pathway on the cells NK in trans.

D.D. SLAM/CS1SLAM/CS1

[0070] В некоторых вариантах осуществления, настоящие UAPC модифицируют для экспрессии CS1, другого члена семейства SLAM, в качестве костимулирующей молекулы для включения уничтожающей активности уничтожения клеток NK. В отличие от CD48, имеющего контр-связывание с 2B4, взаимодействия CS1 являются гомофильными, и могут быть охарактеризованы в контексте цис- против транс- взаимодействий. Клетки K562, которые в норме являются свободными от CS1, можно модифицировать для экспрессии CS1. [0070] In some embodiments, the present UAPCs are modified to express CS1, another member of the SLAM family, as a co-stimulatory molecule to enable NK cell killing activity. Unlike CD48, which has counter-binding to 2B4, CS1 interactions are homophilic, and can be characterized in the context of cis versus trans interactions. K562 cells, which are normally free of CS1, can be modified to express CS1.

E.E. Доставка нуклеиновых кислотNucleic acid delivery

[0071] mbIL-21, 41BBL и костимулирующий антиген можно конструировать любым из способов, известных в данной области. Нуклеиновую кислоту, как правило, вводят в форме экспрессирующего вектора, такого как вирусный экспрессирующий вектор. В некоторых аспектах, экспрессирующий вектор представляет собой ретровирусный экспрессирующий вектор, аденовирусный экспрессирующий вектор, плазмидный экспрессирующий ДНК-вектор или экспрессирующий вектор AAV. В некоторых аспектах, доставку осуществляют посредством доставки одного или нескольких векторов, одного или нескольких их транскриптов, и/или один или несколько транскибированных с них белков доставляют в клетку. [0071] mbIL-21, 41BBL and co-stimulatory antigen can be constructed by any of the methods known in the art. The nucleic acid is typically administered in the form of an expression vector, such as a viral expression vector. In some aspects, the expression vector is a retroviral expression vector, an adenoviral expression vector, a plasmid DNA expression vector, or an AAV expression vector. In some aspects, delivery is accomplished by delivering one or more vectors, one or more transcripts thereof, and/or one or more proteins transcribed therefrom into a cell.

[0072] Способы введения полинуклеотидной конструкции в клетки животных известны и включают, в качестве неограничивающих примеров, способы стабильной трансформации, где полинуклеотидную конструкцию интегрируют в геном клетки, способы временной трансформации, где полинуклеотидную конструкцию не интегрируют в геном клетки, и опосредованные вирусом способы. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды можно вводить в клетку, например, посредством рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, аденовирусов), липосомы и т.п. Например, в некоторых аспектах, способы временной трансформации включают микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды можно включать в векторы, более конкретно, плазмиды или вирус, с точки зрения экспрессии в клетках. [0072]Methods for introducing a polynucleotide construct into animal cells are known and include, but are not limited to, stable transformation methods where the polynucleotide construct is integrated into the cell's genome, transient transformation methods where the polynucleotide construct is not integrated into the cell's genome, and virus-mediated methods. In some embodiments, polynucleotides can be introduced into a cell, for example, through recombinant viral vectors (e.g. retroviruses, adenoviruses), liposomes, etc. For example, in some aspects, transient transformation methods include microinjection, electroporation, or particle bombardment. In some embodiments, polynucleotides can be included in vectors, more specifically plasmids or a virus, for expression in cells.

[0073] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включаютю липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, биолистику, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, конъюгаты поликатион или липид:нуклеиновая кислота, голую ДНК, искусственные вирионы и усиленное агентами поглощение ДНК. Липофекция описана (например, в Патентах США No. 5049386, 4946787; и 4897355) и реагенты для липофекции поставляют коммерчески (например, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, пригодные для эффективной липофекции полинуклеотидов с узнаванием рецепторов, включают липиды из Feigner, WO 91117424; WO 91116024. Доставку можно осуществлять в клетки (например, введение in vitro или ex vivo) или ткани-мишени (например, введение in vivo). [0073]Methods for non-viral delivery of nucleic acids include lipofection, nucleofection, microinjection, biolistics, virosomes, liposomes, immunoliposomes, polycation or lipid:nucleic acid conjugates, naked DNA, artificial virions, and agent-enhanced DNA uptake. Lipofection has been described (eg in US Patent No. 5049386, 4946787; and 4897355) and lipofection reagents are commercially available (e.g. Transfectam™ and Lipofectin™). Cationic and neutral lipids useful for efficient lipofection of polynucleotides with receptor recognition include those from Feigner, WO 91117424; WO 91116024. Delivery can be carried out into cells (for example, introductionin vitroorex vivo) or target tissue (e.g. introductionin vivo).

[0074] В некоторых вариантах осуществления, доставку осуществляет посредством использования систем на основе РНК- или ДНК-вирусов для доставки нуклеиновых кислот. Вирусные векторы в некоторых аспектах можно вводить непосредственно пациентам (in vivo) или их можно использовать для обработки клеток in vitro или ex vivo, и затем вводить пациентам. Системы на основе вирусов, в некоторых вариантах осуществления, включают ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные векторы и векторы на основе вируса простого герпеса для переноса генов. [0074] In some embodiments, delivery is accomplished through the use of RNA or DNA virus-based systems to deliver nucleic acids. Viral vectors, in some aspects, can be administered directly to patients (in vivo) or they can be used to treat cells in vitro or ex vivo and then administered to patients. Virus-based systems, in some embodiments, include retroviral, lentiviral, adenoviral, adeno-associated, and herpes simplex virus vectors for gene transfer.

III. ИммуноцитыIII. Immunocytes

[0075] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к выделению и размножению иммуноцитов, таких как клетки NK или T-клетки, например, для иммунотерапии злокачественных опухолей. [0075] Some embodiments of the present invention relate to the isolation and expansion of immunocytes, such as NK cells or T cells, for example, for immunotherapy of malignant tumors.

[0076] В конкретных вариантах осуществления, иммуноциты получают из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека, нестимулированных продуктов лейкафереза (PBSC), эмбриональных стволовых клеток (hESC) человека, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), костного мозга или пуповинной крови способами, хорошо известными в данной области. Конкретно, иммуноциты можно выделять из пуповинной крови (CB), периферической крови (PB), костного мозга или стволовых клеток. В конкретных вариантах осуществления, иммуноциты выделяют из пулированной CB. CB можно пулировать из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 или более единиц. Иммуноциты могут являться аутологичными или аллогенными. Выделенные иммуноциты можно подбирать по совпадению по гаплотипу с субъектом, подлежащим проведению клеточной терапии. Клетки NK можно детектировать посредством специфических поверхностных маркеров, таких как CD16, CD56 и CD8, у человека. [0076] In specific embodiments, immunocytes are obtained from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), unstimulated leukapheresis products (PBSCs), human embryonic stem cells (hESCs), induced pluripotent stem cells (iPSCs), bone marrow, or umbilical cord blood by methods, well known in this field. Specifically, immunocytes can be isolated from umbilical cord blood (CB), peripheral blood (PB), bone marrow or stem cells. In specific embodiments, immunocytes are isolated from pooled CB. CB can be pooled from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 or more units. Immunocytes can be autologous or allogeneic. Isolated immunocytes can be matched by haplotype to the subject being treated with cell therapy. NK cells can be detected by specific surface markers such as CD16, CD56 and CD8 in humans.

[0077] В конкретных аспектах, клетки NK выделяют описанным ранее способом размножения ex vivo клеток NK (Spanholtz et al., 2011; Shah et al., 2013). По этому способу, мононуклеарные клетки CB выделяют посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Культуру клеток можно истощать по любым клеткам, экспрессирующим CD3, и можно характеризовать для определения процента CD56⁺/CD3^- клеток или клеток NK. В других способах, пуповинную CB используют для получения клеток NK посредством выделения CD34⁺ клеток. Способ может включать истощение положительных по CD3, CD14 и/или CD19 клеток. [0077] In specific aspects, NK cells are isolated by a previously described ex vivo NK cell propagation method (Spanholtz et al., 2011; Shah et al., 2013). In this method, CB mononuclear cells are isolated by Ficoll density gradient centrifugation. The cell culture can be depleted of any cells expressing CD3 and can be characterized to determine the percentage of CD56 ⁺ /CD3 ⁻ cells or NK cells. In other methods, cord CB is used to obtain NK cells by isolating CD34 ⁺ cells. The method may include depleting CD3, CD14 and/or CD19 positive cells.

[0078] Выделенные иммуноциты можно размножать в присутствии настоящих UAPC. Размножение может происходить в течение приблизительно 2-30 суток, например, 3-20 суток, в частности, 12-16 суток, например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 суток, конкретно, приблизительно 14 суток. Иммуноциты и UAPCS могут присутствовать в соотношении приблизительно 3:1-1:3, например, 2:1, 1:1, 1:2, конкретно, приблизительно 1:2. Размножение культуры может дополнительно включать цитокины для стимуляции размножения, такие как IL-2. IL-2 может присутствовать в концентрации приблизительно 10-500 ед./мл, например, 100-300 ед./мл, конкретно, приблизительно 200 ед./мл. IL-2 можно восполнять в культуре для размножения, например, каждые 2-3 суток. UAPC можно добавлять в культуру по меньшей мере второй раз, например, через приблизительно 7 суток размножения. [0078] Isolated immunocytes can be expanded in the presence of real UAPCs. Reproduction may occur over a period of approximately 2-30 days, for example 3-20 days, in particular 12-16 days, for example 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 19 days, specifically approximately 14 days . Immunocytes and UAPCS may be present in a ratio of approximately 3:1-1:3, for example, 2:1, 1:1, 1:2, specifically approximately 1:2. Culture propagation may further include cytokines to stimulate propagation, such as IL-2. IL-2 may be present at a concentration of about 10-500 units/ml, such as 100-300 units/ml, specifically about 200 units/ml. IL-2 can be replenished in the propagation culture, for example, every 2-3 days. UAPC can be added to the culture at least a second time, for example after approximately 7 days of propagation.

[0079] После размножения, иммуноциты можно немедленно вводить посредством инфузии или можно хранить, например, посредством криоконсервации. В конкретных аспектах, клетки можно размножать в течение нескольких суток, недель или месяцев ex vivo, в качестве общей популяции, в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 суток. [0079]After expansion, immunocytes can be immediately administered by infusion or can be stored, for example, by cryopreservation. In certain aspects, cells can be propagated over a period of days, weeks or monthsex vivo, as a general population, for approximately 1, 2, 3, 4, 5 days.

[0080] Размноженные клетки NK могут секретировать цитокины I типа, такие как интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), которые активируют как врожденные, так и адаптивные иммуноциты так же как другие цитокины и хемокины. Измерение этих цитокинов можно использовать для определения статуса активации клеток NK. Кроме того, другие способы, известные в данной области для определения активации клетки NK, можно использовать для характеризации клеток NK по настоящему описанию. [0080] Expanded NK cells can secrete type I cytokines, such as interferon-γ, tumor necrosis factor-α, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), which activate both innate and adaptive immune cells as well as other cytokines and chemokines. Measurement of these cytokines can be used to determine the activation status of NK cells. Additionally, other methods known in the art for determining NK cell activation can be used to characterize NK cells as described herein.

IV. Химерные рецепторы антигеновIV. Chimeric antigen receptors

[0081] В конкретных вариантах осуществления, настоящие иммуноциты, такие как T-клетки или клетки NK, генетически модифицируют для экспрессии химерного рецептора антигена (CAR). В некоторых вариантах осуществления, CAR содержит: a) внутриклеточный домен передачи сигналов, b) трансмембранный домен и c) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающую область. [0081] In specific embodiments, actual immunocytes, such as T cells or NK cells, are genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR). In some embodiments, the CAR comprises: a) an intracellular signaling domain, b) a transmembrane domain, and c) an extracellular domain containing an antigen binding region.

[0082] CAR узнает опухолеассоциированный антиген поверхности клеток, независимо от человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) и использует одну или несколько молекул передачи сигналов для активации генетически модифицированных клеток NK для уничтожения, пролиферации и продукции цитокинов. В конкретных вариантах осуществления, настоящие клетки NK можно генетически модифицировать способами, включающими (i) невирусный перенос генов с использованием устройства для электропорации (например, нуклеофектора), (ii) CAR, передающие сигналы через эндодомены (например, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ или другие комбинации), (iii) CAR с вариабельной длиной внеклеточных доменов, соединяющих узнающий антиген домен с поверхностью клетки, и, в некоторых случаях, (iv) искусственные антигенпрезентирующие клетки (aAPC), полученные из K562, чтобы иметь способность надежно и количественно размножать CAR⁺ клетки NK (Singh et al., 2011). [0082]CAR recognizes tumor-associated cell surface antigen, independent of human leukocyte antigen (HLA), and uses one or more signaling molecules to activate genetically modified NK cells to kill, proliferate, and produce cytokines. In specific embodiments, present NK cells can be genetically modified by methods including (i) non-viral gene transfer using an electroporation device (e.g. nucleofector), (ii) CARs signaling through endodomains (e.g. CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ or other combinations), (iii) CARs with variable length extracellular domains connecting the antigen recognition domain to the cell surface, and, in some cases, (iv) artificial antigen presenting cells (aAPC), derived from K562 to have the ability to reliably and quantitatively propagate CARs⁺ NK cells (Singhet al.,2011).

[0083] Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к использованию нуклеиновых кислот, включая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид антигенспецифического CAR, включая CAR, гуманизированный для уменьшения иммуногенности (hCAR), содержащий внутриклеточный домен передачи сигналов, трансмембранный домен и внеклеточный домен, содержащий один или несколько мотивов передачи сигналов. В конкретных вариантах осуществления, CAR может узнавать эпитоп, содержащий общее пространство между одним или несколькими антигенами. В конкретных вариантах осуществления, связывающая область может содержать определяющие комплементарность области моноклонального антитела, вариабельные области моноклонального антитела и/или их антигенсвязывающие фрагменты. В другом варианте осуществления, эта специфичность происходит из пептида (например, цитокина), связывающегося с рецептором. [0083]Embodiments of the present invention relate to the use of nucleic acids, including nucleic acids encoding an antigen-specific CAR polypeptide, including a CAR humanized to reduce immunogenicity (hCAR), containing an intracellular signaling domain, a transmembrane domain, and an extracellular domain containing one or more signaling motifs. In specific embodiments, the CAR may recognize an epitope containing a common space between one or more antigens. In specific embodiments, the binding region may comprise complementarity determining regions of a monoclonal antibody, variable regions of a monoclonal antibody, and/or antigen binding fragments thereof. In another embodiment, this specificity is derived from a peptide (eg cytokine) that binds to the receptor.

[0084] Предусматривают, что нуклеиновые кислоты человеческого CAR могут представлять собой человеческие гены, используемые для улучшения клеточной иммунотерапии для пациентов-людей. В конкретном варианте осуществления, в настоящих способах используют полноразмерную кДНК CAR или кодирующую область. Антигенсвязывающие области или домен могут содержать фрагмент цепей Vh и Vl одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), происходящих из конкретного человеческого моноклонального антитела, таких как описанные в Патенте США 7109304, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Фрагмент может также представлять собой любое количество различных антигенсвязывающих доменов человеческого антигенспецифического антитела. В более конкретном варианте осуществления, фрагмент представляет собой антигенспецифический scFv, кодируемый последовательностью, оптимизированной для человеческого использования кодонов для экспрессии в клетках человека. [0084] It is contemplated that human CAR nucleic acids may be human genes used to improve cellular immunotherapy for human patients. In a specific embodiment, the present methods use the full-length CAR cDNA or coding region. The antigen binding regions or domain may comprise a portion of the Vh and Vl chains of a single chain fragment variable (scFv) derived from a particular human monoclonal antibody, such as those described in US Pat. No. 7,109,304, the contents of which are incorporated herein by reference. The fragment may also be any number of different antigen binding domains of a human antigen-specific antibody. In a more specific embodiment, the fragment is an antigen-specific scFv encoded by a sequence optimized for human codon usage for expression in human cells.

[0085] Аранжировка может являться мультимерной, например, диатело или мультимеры. Мультимеры, наиболее вероятно, формируются посредством перекрестного спаривания вариабельной части легких и тяжелых цепей в диатело. Шарнирная часть конструкции может иметь множество альтернатив, от полной делеции до наличия сохраненного первого цистеина, до замены пролина вместо серина, до укорочения вплоть до первого цистеина. Часть Fc может являться делетированной. Любой белок, который является стабильным и/или димеризуется, может служить этой цели. Можно использовать один из доменов Fc, например, либо CH2, либо CH3 домен из человеческого иммуноглобулина. Можно использовать шарнирную область, область CH2 и CH3 человеческого иммуноглобулина, модифицированные для улучшения димеризации. в других аспектах, можно использовать только шарнирную часть иммуноглобулина или части CD8a. [0085]The arrangement may be multimeric, for example diabodies or multimers. Multimers are most likely formed through cross-pairing of the variable portion of the light and heavy chains in the diabody. The hinge portion of the construct can have many alternatives, from complete deletion to retaining the first cysteine, to substitution of proline instead of serine, to truncation all the way back to the first cysteine. The Fc portion may be deleted. Any protein that is stable and/or dimerizes can serve this purpose. One of the Fc domains can be used, e.g. either the CH2 or CH3 domain from human immunoglobulin. The hinge region, CH2 and CH3 region of human immunoglobulin modified to improve dimerization can be used. in other aspects, only the hinge portion of the immunoglobulin or the CD8a portion may be used.

[0086] В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота CAR содержит последовательность, кодирующую другие костимулирующие рецепторы, такие как трансмембранный домен и модифицированный внутриклеточный домен передачи сигналов CD28. Другие костимулирующие рецепторы включают, но без ограничения, один или несколько из CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 и 4-1BB (CD137). В дополнение к первичному сигналу, инициированному посредством CD3ζ, дополнительный сигнал, подаваемый человеческим костимулирующим рецептором, вставленным в человеческий CAR, является важным для полной активации клеток NK и может помочь улучшать персистенцию in vivo и терапевтический успех адоптивной иммунотерапии. [0086] In some embodiments, the CAR nucleic acid contains a sequence encoding other co-stimulatory receptors, such as a transmembrane domain and a modified CD28 intracellular signaling domain. Other costimulatory receptors include, but are not limited to, one or more of CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, and 4-1BB (CD137). In addition to the primary signal initiated through CD3ζ , an additional signal provided by the human co-stimulatory receptor inserted into the human CAR is essential for full activation of NK cells and may help improve in vivo persistence and therapeutic success of adoptive immunotherapy.

[0087] Внутриклеточный домен передачи сигналов химерного рецептор антигена является ответственным за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммуноцита, в который помещен химерный рецептор антигена. Эффекторная функция представляет собой специализированную функцию дифференцированной клетки, такой как клетка NK. В конкретных вариантах осуществления, внутриклеточные домены передачи сигналов рецептора в CAR включают домены из комплекса T-клеточного рецептора антигена, такие как дзета-цепь CD3, также домены передачи костимулирующих сигналов FcγRIII, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, отдельно или в сериях, например, с CD3-дзета. В конкретных вариантах осуществления, внутриклеточный домен (который может быть обозначен как цитоплазматический домен), содержащий, частично или полностью, один или несколько из дзета-цепи TCR, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2R-бета/CD122, IL-2R-альфа/CD132, DAP10, DAP12 и CD40. Любую часть эндогенного комплекса T-клеточного рецептора можно использовать в внутриклеточном домене. Можно использовать один или несколько цитоплазматических доменов, поскольку так называемые CAR третьего поколения имеют по меньшей мере два или три домена передачи сигналов, например, слитые вместе для аддитивного или синергического эффекта. [0087] The intracellular signaling domain of the chimeric antigen receptor is responsible for activating at least one of the normal effector functions of the immunocyte into which the chimeric antigen receptor is placed. An effector function is a specialized function of a differentiated cell, such as an NK cell. In specific embodiments, intracellular receptor signaling domains in CAR include domains from the T cell antigen receptor complex, such as CD3 zeta chain, as well as costimulatory signaling domains FcγRIII, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, alone, or in series, for example, with CD3-zeta. In specific embodiments, an intracellular domain (which may be referred to as a cytoplasmic domain) containing, in part or in whole, one or more of TCR zeta chain, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/ CD278, IL-2R-beta/CD122, IL-2R-alpha/CD132, DAP10, DAP12 and CD40. Any part of the endogenous T-cell receptor complex can be used in the intracellular domain. One or more cytoplasmic domains can be used, since so-called third generation CARs have at least two or three signaling domains, for example, fused together for an additive or synergistic effect.

[0088] В конкретных вариантах осуществления CAR, антигенспецифическая часть рецептора (которая может быть обозначена как внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающую область) содержит домен, связывающий опухолеассоциированный антиген или патоген-специфический антиген. Антигены включают углеводные антигены, узнаваемые узнающими паттерн рецепторами, такие как дектин-1. Опухолеассоциированный антиген может принадлежать к любому виду, при условии, что он экспрессируется на клеточной поверхности клеток опухолей. Связывающий антиген опухоли домен может быть предназначен, но без ограничения, для CD19, CD20, карциноэмбрионального антигена, альфафетопротеина, CA-125, MUC-1, эпителиального опухолевого антигена, ассоциированного с меланомой антигена, мутантного p53, мутантного ras, HER2/Neu, ERBB2, связывающего фолат белка, оболочечного гликопротеина gp120 HIV-1, оболочечного гликопротеина gp41 HIV-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, мезотелина, GD3, HERV-K, IL-11R-альфа, каппа-цепи, лямбда-цепи, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII или VEGFR2. CAR может содержать гуманизированный scFv, такой как гуманизированный scFv для CD19 или CD123. [0088] In particular embodiments of the CAR, the antigen-specific portion of the receptor (which may be referred to as an extracellular domain containing an antigen-binding region) comprises a tumor-associated antigen or pathogen-specific antigen binding domain. Antigens include carbohydrate antigens recognized by pattern recognition receptors, such as Dectin-1. The tumor-associated antigen can be of any type, provided that it is expressed on the cell surface of tumor cells. The tumor antigen binding domain may be for, but not limited to, CD19, CD20, carcinoembryonic antigen, alphafetoprotein, CA-125, MUC-1, epithelial tumor antigen, melanoma associated antigen, mutant p53, mutant ras, HER2/Neu, ERBB2 , folate binding protein, HIV-1 gp120 envelope glycoprotein, HIV-1 gp41 envelope glycoprotein, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesothelin, GD3, HERV-K, IL-11R-alpha, kappa chain , lambda chains, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII or VEGFR2. The CAR may contain a humanized scFv, such as a humanized scFv for CD19 or CD123.

[0089] В конкретных вариантах осуществления, CAR можно совместно экспрессировать с цитокином для улучшения персистенции, когда присутствует низкое количество опухолеассоциированного антигена. Например, CAR можно совместно экспрессировать с IL-15. [0089] In certain embodiments, a CAR can be co-expressed with a cytokine to improve persistence when low amounts of tumor-associated antigen are present. For example, CAR can be co-expressed with IL-15.

[0090] Последовательность открытой рамки считывания, кодирующую химерный рецептор, можно получать из источника геномной ДНК, из источника кДНК или можно синтезировать (например, посредством ПЦР), или использовать их комбинацию. В зависимости от размера геномной ДНК и количества интронов, может являться желательным использование кДНК или их комбинации, поскольку обнаружено, что интроны стабилизируют мРНК. Также, может обеспечивать дополнительные преимущества использование эндогенных или экзогенных некодирующих областей для стабилизации мРНК. [0090]The open reading frame sequence encoding the chimeric receptor can be obtained from a genomic DNA source, from a cDNA source, or can be synthesized (e.g. through PCR), or use a combination of them. Depending on the size of the genomic DNA and the number of introns, the use of cDNAs or a combination thereof may be desirable since introns have been found to stabilize the mRNA. Also, the use of endogenous or exogenous non-coding regions to stabilize the mRNA may provide additional benefits.

[0091] Предусматривают, что химерную конструкцию можно вводить в клетки NK в форме голой ДНК или в подходящем векторе. Способы стабильной трансфекции клеток посредством электропорации с использованием голой ДНК известны в данной области. См., например, Патент США No. 6410319. Голая ДНК, в общем, относится к ДНК, кодирующей химерный рецептор, содержащийся в плазмидном экспрессирующем векторе в правильной ориентации для экспрессии. [0091] It is contemplated that the chimeric construct can be introduced into NK cells in naked DNA form or in a suitable vector. Methods for stably transfecting cells by electroporation using naked DNA are known in the art. See, for example, US Patent No. 6410319. Naked DNA generally refers to DNA encoding a chimeric receptor contained in a plasmid expression vector in the correct orientation for expression.

[0092] Альтернативно, вирусный вектор (например, ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор или лентивирусный вектор) можно использовать для введения химерной конструкции в клетки NK. Подходящие векторы для использования в соответствии со способом по настоящему изобретению не реплицируются в клетках NK. Известно большое количество векторов, основанных на вирусах, где количество копий вируса, поддерживаемое в клетках, является достаточно низким для поддержания жизнеспособности клетки, например, такие как векторы на основе HIV, SV40, EBV, HSV или BPV. [0092]Alternatively, a viral vector (e.g. retroviral vector, adenoviral vector, adeno-associated viral vector, or lentiviral vector) can be used to introduce the chimeric construct into NK cells. Suitable vectors for use in accordance with the method of the present invention do not replicate in NK cells. A large number of virus-based vectors are known where the number of copies of the virus maintained in cells is low enough to maintain cell viability, such as vectors based on HIV, SV40, EBV, HSV or BPV.

[0093] CAR может экспрессировать ген самоубийства, такой как CD20, CD52, EGFRv3 или индуцируемую каспазу 9. [0093] The CAR may express a suicide gene such as CD20, CD52, EGFRv3 or inducible caspase 9.

[0094] CAR может содержать связывающий антиген опухоли домен. Связывающий антиген опухоли домен может быть предназначен, но без ограничения, для CD19, CD20, карциноэмбрионального антигена, альфафетопротеина, CA-125, MUC-1, эпителиального опухолевого антигена, ассоциированного с меланомой антигена, мутантного p53, мутантного ras, HER2/Neu, ERBB2, связывающего фолат белка, оболочечного гликопротеина gp120 HIV-1, оболочечного гликопротеина gp41 HIV-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, мезотелина, GD3, HERV-K, IL-11-Rальфа, каппа-цепи, лямбда-цепи, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII или VEGFR2. CAR может содержать гуманизированный scFv, такой как гуманизированный scFv для CD19, CD123, мезотелина, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 или BCMA. [0094] The CAR may contain a tumor antigen binding domain. The tumor antigen binding domain may be for, but not limited to, CD19, CD20, carcinoembryonic antigen, alphafetoprotein, CA-125, MUC-1, epithelial tumor antigen, melanoma associated antigen, mutant p53, mutant ras, HER2/Neu, ERBB2 , folate binding protein, HIV-1 gp120 envelope glycoprotein, HIV-1 gp41 envelope glycoprotein, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesothelin, GD3, HERV-K, IL-11-Ralpha, kappa chain , lambda chains, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII or VEGFR2. The CAR may contain a humanized scFv, such as a humanized scFv for CD19, CD123, mesothelin, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1, or BCMA.

V. Способы примененияV. Methods of application

[0095] Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам применения иммуноцитов, таких как клетки NK или T-клетки, представленные в настоящем описании (например, размноженные посредством настоящих UAPC), для лечения или предотвращения медицинского заболевания или нарушения посредством переноса популяции иммуноцитов, вызывающих иммунный ответ. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества размноженных иммуноцитов, таким образом, лечение или предотвращение нарушения у субъекта. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, злокачественную опухоль или инфекцию лечат посредством переноса популяции иммуноцитов, вызывающей иммунный ответ. Благодаря высвобождению из них провоспалительных цитокинов, иммуноциты могут обращать противовоспалительное микроокружение опухолей и увеличивать адаптивные иммунные ответы посредством стимуляции дифференцировки, активации и/или привлечения вспомогательных иммуноцитов к участкам злокачественности. [0095]Embodiments of the present invention relate to methods of using immunocytes, such as NK cells or T cells presented herein (for example, propagated by present UAPCs) to treat or prevent a medical disease or disorder by transferring a population of immunocytes that induce an immune response. The method includes administering to a subject a therapeutically effective amount of expanded immunocytes, thereby treating or preventing a disorder in the subject. In specific embodiments of the present invention, a cancer or infection is treated by transferring a population of immunocytes that induces an immune response. By releasing proinflammatory cytokines from them, immunocytes can reverse the anti-inflammatory microenvironment of tumors and enhance adaptive immune responses by stimulating the differentiation, activation and/or recruitment of helper immunocytes to sites of malignancy.

[0096] Опухоли, для которых можно использовать настоящие способы лечения, включают любой тип злокачественных клеток, такой как обнаруженные в солидной опухоли или гематологической опухоли. Иллюстративные солидные опухоли могут включать, но без ограничения, опухоль органа, выбранного из группы, состоящей из поджелудочной железы, ободочной кишки, слепой кишки, желудка, головного мозга, головы, шеи, яичника, почки, гортани, саркомы, легкого, мочевого пузыря, меланомы, предстательной железы и молочной железы. Иллюстративные гематологические опухоли включают опухоли костного мозга, T- или В-клеточные злокачественные новообразования, лейкозы, лимфомы, бластомы, миеломы и т.п. Дополнительные примеры злокачественных опухолей, которые можно лечить с использованием способов, представленных в настоящем описании, включают, но без ограничения, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), злокачественную опухоль брюшины, рак желудочно-кишечного тракта или желудка (включая злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта и стромальную злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстого кишечника, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, злокачественную опухоль почки или ренальную злокачественную опухоль, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, различные типы злокачественной опухоли головы и шеи и меланому. [0096] Tumors for which the present treatment methods can be used include any type of malignant cell, such as those found in a solid tumor or hematologic tumor. Exemplary solid tumors may include, but are not limited to, a tumor of an organ selected from the group consisting of pancreas, colon, cecum, stomach, brain, head, neck, ovary, kidney, larynx, sarcoma, lung, bladder, melanoma, prostate and breast. Exemplary hematologic tumors include bone marrow tumors, T- or B-cell malignancies, leukemias, lymphomas, blastomas, myelomas, and the like. Additional examples of cancers that can be treated using the methods presented herein include, but are not limited to, lung cancer (including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma and squamous cell lung carcinoma), peritoneal cancer, gastrointestinal cancer intestinal or gastric cancer (including gastrointestinal malignancy and gastrointestinal stromal malignancy), pancreatic cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer , endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, renal or renal malignancy, prostate cancer, cancer of the female external genitalia, thyroid cancer, various types of head and neck malignancy, and melanoma.

[0097] Злокачественная опухоль может специфически иметь следующий гистологический тип, хотя и без ограничения: неоплазия, злокачественная; карцинома; карцинома, недифференцированная; гигантоклеточная и веретеноклеточная карцинома; мелкоклеточная карцинома; папиллярная карцинома; плоскоклеточная карцинома; лимфоэпителиальная карцинома; базальноклеточная карцинома; пиломатриксная карцинома; переходноклеточная карцинома; папиллярная переходноклеточная карцинома; аденокарцинома; гастринома, злокачественная; холангиокарцинома; печеночноклеточная карцинома; комбинированная печеночноклеточная карцинома и холангиокарцинома; трабекулярная аденокарцинома; аденокистозная карцинома; аденокарцинома в аденоматозном полипе; аденокарцинома, семейная коли-полипозная аденокарцинома; солидная карцинома; карциноидная опухоль, злокачественная; бронхиоло-альвеолярная аденокарцинома; папиллярная аденокарцинома; хромофобная карцинома; ацидофильная карцинома; оксифильная аденокарцинома; базофильная карцинома; светлоклеточная аденокарцинома; зернистоклеточная карцинома; фолликулярная аденокарцинома; папиллярная и фолликулярная аденокарцинома; неинкапсулированная склерозирующая карцинома; карцинома коры надпочечников; эндометриоидная карцинома; карцинома из придатков кожи; апокринная аденокарцинома; сальная аденокарцинома; церуминозная аденокарцинома; мукоэпидермоидная карцинома; цистаденокарцинома; папиллярная цистаденокарцинома; папиллярная серозная цистаденокарцинома; муцинозная цистаденокарцинома; муцинозная аденокарцинома; перстневидноклеточная карцинома; инфильтрирующая карцинома протоков; медуллярная карцинома; лобулярная карцинома; воспалительная карцинома; болезнь Педжета, молочной железы; ацинарноклеточная карцинома; аденосквамозная карцинома; аденокарцинома с плоскоклеточной метаплазией; тимома, злокачественная; стромальная опухоль яичников, злокачественная; текома, злокачественная; гранулезоклеточная опухоль, злокачественная; андробластома, злокачественная; карцинома из клеток Сертоли; опухоль из клеток Лейдига, злокачественная; липидноклеточная опухоль, злокачественная; параганглиома, злокачественная; экстрамамиллярная параганглиома, злокачественная; феохромоцитома; гломангиосаркома; злокачественная меланома; амеланотическая меланома; поверхностно распространяющаяся меланома; злокачественная меланома типа лентиго; акральные лентигинозные меланомы; нодулярные меланомы; злокачественная меланома в гигантском пигментном невусе; меланома эпителиоидных клеток; синий невус, злокачественная; саркома; фибросаркома; фиброзная гистиоцитома, злокачественная; миксосаркома; липосаркома; лейомиосаркома; рабдомиосаркома; эмбриональная рабдомиосаркома; альвеолярная рабдомиосаркома; стромальная саркома; смешанная опухоль, злокачественная; смешанная опухоль Мюллера; нефробластома; гепатобластома; карциносаркома; мезенхимома, злокачественная; опухоль Бреннера, злокачественная; филлоидная опухоль, злокачественная; синовиальная саркома; мезотелиома, злокачественная; дисгерминома; эмбриональная карцинома; тератома, злокачественная; струма яичника, злокачественная; хориокарцинома; мезонефрома, злокачественная; гемангиосаркома; гемангиоэндотелиома, злокачественная; саркома Капоши; гемангиоперицитома, злокачественная; лимфангиосаркома; остеосаркома; юкстакортикальная остеосаркома; хондросаркома; хондробластома, злокачественная; мезенхимальная хондросаркома; гигантоклеточная опухоль кости; саркома Юинга; одонтогенная опухоль, злокачественная; амелобластическая одонтосаркома; амелобластома, злокачественная; амелобластическая фибросаркома; пинеалома, злокачественная; хордома; глиома, злокачественная; эпендимома; астроцитома; протоплазматическая астроцитома; фибриллярная астроцитома; астробластома; глиобластома; олигодендроглиома; олигодендробластома; примитивная нейроэктодермальная опухоль; мозжечковая саркома; ганглионейробластома; нейробластома; ретинобластома; нейрогенная опухоль органов обоняния; менингиома, злокачественная; нейрофибросаркома; неврилеммома, злокачественная; зернистоклеточная опухоль, злокачественная; злокачественная лимфома; болезнь Ходжкина; парагранулема Ходжкина; злокачественная лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная; злокачественная лимфома, крупноклеточная, диффузная; злокачественная лимфома, фолликулярная; фунгоидный микоз; другие указанные неходжскинские лимфомы; B-клеточная лимфома; неходжскинская лимфома (NHL) низкой степени злокачественности/фолликулярная NHL; мелкоклеточная лимфоцитарная (SL) NHL; NHL промежуточной степени злокачественности/фолликулярная NHL; диффузная NHL промежуточной степени злокачественности; иммунобластная NHL высокой степени злокачественности; лимфобластная NHL высокой степени злокачественности; мелкоклеточная NHL с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности; массивное поражение NHL; лимфома из клеток мантийной зоны; связанная со СПИД лимфома; макроглобулинемия Вальденстрема; злокачественный гистиоцитоз; множественная миелома; саркома тучных клеток; иммунопролиферативное заболевание тонкого кишечника; лейкоз; лимфоидный лейкоз; лейкоз плазматических клеток; эритролейкоз; лейкоз с клетками лимфосаркомы; миелоидный лейкоз; базофильный лейкоз; эозинофильный лейкоз; моноцитарный лейкоз; лейкоз тучных клеток; мегакариобластный лейкоз; миелоидная саркома; волосатоклеточный лейкоз; хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); острый миелоидный лейкоз (AML); и хронический миелобластный лейкоз. [0097] A malignant tumor may specifically be of the following histological type, although not limited to: neoplasia, malignant; carcinoma; carcinoma, undifferentiated; giant cell and spindle cell carcinoma; small cell carcinoma; papillary carcinoma; squamous cell carcinoma; lymphoepithelial carcinoma; basal cell carcinoma; pilomatrix carcinoma; transitional cell carcinoma; papillary transitional cell carcinoma; adenocarcinoma; gastrinoma, malignant; cholangiocarcinoma; hepatocellular carcinoma; combined hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma; trabecular adenocarcinoma; adenoid cystic carcinoma; adenocarcinoma in adenomatous polyp; adenocarcinoma, familial coli-polyposis adenocarcinoma; solid carcinoma; carcinoid tumor, malignant; bronchioloalveolar adenocarcinoma; papillary adenocarcinoma; chromophobe carcinoma; acidophilic carcinoma; oxyphilic adenocarcinoma; basophilic carcinoma; clear cell adenocarcinoma; granular cell carcinoma; follicular adenocarcinoma; papillary and follicular adenocarcinoma; non-encapsulated sclerosing carcinoma; adrenal cortex carcinoma; endometrioid carcinoma; skin appendage carcinoma; apocrine adenocarcinoma; sebaceous adenocarcinoma; ceruminous adenocarcinoma; mucoepidermoid carcinoma; cystadenocarcinoma; papillary cystadenocarcinoma; papillary serous cystadenocarcinoma; mucinous cystadenocarcinoma; mucinous adenocarcinoma; signet ring cell carcinoma; infiltrating ductal carcinoma; medullary carcinoma; lobular carcinoma; inflammatory carcinoma; Paget's disease, breast; acinar cell carcinoma; adenosquamous carcinoma; adenocarcinoma with squamous metaplasia; thymoma, malignant; ovarian stromal tumor, malignant; thecoma, malignant; granulosa cell tumor, malignant; androblastoma, malignant; Sertoli cell carcinoma; Leydig cell tumor, malignant; lipid cell tumor, malignant; paraganglioma, malignant; extramamillary paraganglioma, malignant; pheochromocytoma; glomangiosarcoma; malignant melanoma; amelanotic melanoma; superficial spreading melanoma; malignant melanoma of the lentigo type; acral lentiginous melanomas; nodular melanomas; malignant melanoma in a giant pigmented nevus; epithelioid cell melanoma; blue nevus, malignant; sarcoma; fibrosarcoma; fibrous histiocytoma, malignant; myxosarcoma; liposarcoma; leiomyosarcoma; rhabdomyosarcoma; embryonal rhabdomyosarcoma; alveolar rhabdomyosarcoma; stromal sarcoma; mixed tumor, malignant; mixed Mullerian tumor; nephroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenchymoma, malignant; Brenner tumor, malignant; phyllodes tumor, malignant; synovial sarcoma; mesothelioma, malignant; dysgerminoma; embryonal carcinoma; teratoma, malignant; ovarian struma, malignant; choriocarcinoma; mesonephroma, malignant; hemangiosarcoma; hemangioendothelioma, malignant; Kaposi's sarcoma; hemangiopericytoma, malignant; lymphangiosarcoma; osteosarcoma; juxtacortical osteosarcoma; chondrosarcoma; chondroblastoma, malignant; mesenchymal chondrosarcoma; giant cell tumor of bone; Ewing's sarcoma; odontogenic tumor, malignant; ameloblastic odontosarcoma; ameloblastoma, malignant; ameloblastic fibrosarcoma; pinealoma, malignant; chordoma; glioma, malignant; ependymoma; astrocytoma; protoplasmic astrocytoma; fibrillary astrocytoma; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; primitive neuroectodermal tumor; cerebellar sarcoma; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; neurogenic tumor of the olfactory organs; meningioma, malignant; neurofibrosarcoma; neurilemmoma, malignant; granular cell tumor, malignant; malignant lymphoma; Hodgkin's disease; Hodgkin's paragranuloma; malignant lymphoma, small cell lymphocytic; malignant lymphoma, large cell, diffuse; malignant lymphoma, follicular; fungoid mycosis; other specified non-Hodgkin's lymphomas; B-cell lymphoma; low-grade non-Hodgkin's lymphoma (NHL)/follicular NHL; small lymphocytic (SL) NHL; Intermediate grade NHL/follicular NHL; diffuse NHL of intermediate grade; high-grade immunoblastic NHL; high-grade lymphoblastic NHL; small cell NHL with undissected nuclei of high grade; massive NHL lesion; mantle cell lymphoma; AIDS-related lymphoma; Waldenström's macroglobulinemia; malignant histiocytosis; multiple myeloma; mast cell sarcoma; immunoproliferative disease of the small intestine; leukemia; lymphoid leukemia; plasma cell leukemia; erythroleukemia; leukemia with lymphosarcoma cells; myeloid leukemia; basophilic leukemia; eosinophilic leukemia; monocytic leukemia; mast cell leukemia; megakaryoblastic leukemia; myeloid sarcoma; hairy cell leukemia; chronic lymphocytic leukemia (CLL); acute lymphoblastic leukemia (ALL); acute myeloid leukemia (AML); and chronic myeloblastic leukemia.

[0098] Конкретные варианты осуществления относятся к способам лечения лейкоза. Лейкоз представляет собой злокачественную опухоль крови или костного мозга и характеризуется аномальной пролиферацией (образованием посредством умножения) клеток крови, обычно, белых кровяных клеток (лейкоцитов). Он является частью широкой группы заболеваний, называемых гематологическими неоплазиями. Лейкоз является широким термином, покрывающим спектр заболеваний. Лейкоз клинически и патологически разделяется на острые и хронические формы. [0098] Specific embodiments relate to methods of treating leukemia. Leukemia is a malignant tumor of the blood or bone marrow and is characterized by the abnormal proliferation (production by multiplication) of blood cells, usually white blood cells (leukocytes). It is part of a broad group of diseases called hematologic neoplasias. Leukemia is a broad term covering a spectrum of diseases. Leukemia is clinically and pathologically divided into acute and chronic forms.

[0099] Острый лейкоз характеризуется быстрой пролиферацией незрелых клеток крови. Эта скученность делает костный мозг неспособным образовывать здоровые клетки крови. Острые формы лейкоза могут возникать у детей и молодых взрослых. Немедленное лечение необходимо при остром лейкозе из-за быстрого прогрессирования и накопления злокачественных клеток, которые затем переходят в кровоток и распространяются к другим органам организма. Вовлечение центральной нервной системы (ЦНС) является необычным, хотя это заболевание может иногда вызывать паралич черепных нервов. Хронический лейкоз отличается избыточным образованием относительно зрелых, но все еще аномальных, клеток крови. Как правило, прогрессирование занимает от нескольких месяцев до нескольких лет, клетки образуются с намного более высокой скоростью, чем нормальные клетки, что приводит к множеству аномальных кровяных клеток в крови. Хронический лейкоз в большинстве случаев возникает у более старших людей, однако, теоретически может возникать в любой возрастной группе. В то время как острый лейкоз необходимо лечить немедленно, хронические формы иногда мониторируют в течение некоторого временя до лечения, чтобы обеспечить максимальную эффективность терапии. [0099] Acute leukemia is characterized by rapid proliferation of immature blood cells. This crowding makes the bone marrow unable to produce healthy blood cells. Acute forms of leukemia can occur in children and young adults. Immediate treatment is necessary for acute leukemia due to the rapid progression and accumulation of malignant cells, which then enter the bloodstream and spread to other organs of the body. Involvement of the central nervous system (CNS) is uncommon, although the disease can occasionally cause cranial nerve palsy. Chronic leukemia is characterized by an overproduction of relatively mature, but still abnormal, blood cells. Typically progressing over several months to several years, cells are produced at a much higher rate than normal cells, resulting in many abnormal blood cells in the blood. Chronic leukemia most often occurs in older people, but theoretically can occur in any age group. While acute leukemia must be treated immediately, chronic forms are sometimes monitored for some time before treatment to ensure maximum effectiveness of therapy.

[00100] Кроме того, заболевания классифицируют на лимфоцитарные или лимфобластные, что показывает, что злокачественное изменение имеет место в том типе клеток костного мозга, который в норме переходит к формированию лимфоцитов, и миелогенные или миелоидные, что показывает, что злокачественное изменение имеет место в том типе клеток костного мозга, который в норме переходит к формированию красных кровяных клеток, некоторых типов белых кровяных клеток и тромбоцитов. [00100] In addition, diseases are classified as lymphocytic or lymphoblastic, which indicates that the malignant change takes place in the type of bone marrow cell that normally proceeds to form lymphocytes, and myelogenous or myeloid, which indicates that the malignant change takes place in the type of bone marrow cell that normally goes on to form red blood cells, some types of white blood cells, and platelets.

[00101] Острый лимфоцитарный лейкоз (также известный как острый лимфобластный лейкоз или ALL) является наиболее распространенным типом лейкоза у детей раннего возраста. Это заболевание также поражает взрослых, особенно в возрасте 65 лет и старше. Хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) наиболее часто поражает взрослых в возрасте старше 55 лет. Он иногда возникает у более молодых взрослых, но почти никогда не поражает детей. Острый миелогенный лейкоз (также известный как острый миелоидный лейкоз, или AML) более часто возникает у взрослых, чем у детей. Этот тип лейкоза ранее называли острым нелимфоцитарным лейкозом. Хронический миелогенный лейкоз (CML) возникает в основном у взрослых. [00101] Acute lymphocytic leukemia (also known as acute lymphoblastic leukemia or ALL) is the most common type of leukemia in young children. This disease also affects adults, especially those aged 65 and older. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) most often affects adults over the age of 55. It sometimes occurs in younger adults, but almost never affects children. Acute myelogenous leukemia (also known as acute myeloid leukemia, or AML) occurs more often in adults than in children. This type of leukemia was previously called acute nonlymphocytic leukemia. Chronic myelogenous leukemia (CML) occurs primarily in adults.

[00102] Лимфома представляет собой тип злокачественной опухоли, возникающий в лимфоцитах (типе белых кровяных клеток в иммунной системе позвоночных). Существует множество типов лимфомы. Согласно Национальным институтам здравоохранения США, лимфомы насчитывают приблизительно пять процентов из всех случаев злокачественных опухолей в США, и лимфома Ходжкина, в частности, насчитывает менее одного процента из всех случаев злокачественных опухолей в США. Поскольку лимфатическая система является частью иммунной системы организма, пациенты с ослабленной иммунной системой, например, из-за инфекции HIV или из-за определенных наркотических или лекарственных средств, также имеют более высокую встречаемость лимфомы. [00102] Lymphoma is a type of malignant tumor that originates in lymphocytes (a type of white blood cell in the vertebrate immune system). There are many types of lymphoma. According to the US National Institutes of Health, lymphomas account for approximately five percent of all cancer cases in the United States, and Hodgkin lymphoma in particular accounts for less than one percent of all cancer cases in the United States. Because the lymphatic system is part of the body's immune system, patients with a weakened immune system, for example due to HIV infection or due to certain drugs or medications, also have a higher incidence of lymphoma.

[00103] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, иммуноциты доставляют нуждающемуся в этом индивидууму, такому как индивидуум, имеющий злокачественную опухоль или инфекцию. Затем клетки усиливают иммунную систему индивидуума для атаки на соответствующие злокачественные или патогенные клетки. В некоторых случаях, индивидууму вводят одну или несколько доз иммуноцитов. В случаях, когда индивидууму вводят две или более доз иммуноцитов, длительность между введениями должна являться достаточной, чтобы обеспечить время для размножения у индивидуума, и, в конкретных вариантах осуществления, длительность между дозами составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более суток. [00103] In specific embodiments of the present invention, the immunocytes are delivered to an individual in need, such as an individual having a cancer or infection. The cells then enhance the individual's immune system to attack relevant malignant or pathogenic cells. In some cases, the individual is administered one or more doses of immunocytes. In cases where two or more doses of immunocytes are administered to an individual, the duration between administrations should be sufficient to allow time for the individual to multiply, and, in particular embodiments, the duration between doses is 1, 2, 3, 4, 5, 6. 7 or more days.

[00104] Источник иммуноцитов, которые предварительно активируют и размножают, может принадлежать к любому виду, однако, в конкретных вариантах осуществления, клетки получают, например, из банка пуповинной крови, периферической крови, человеческих эмбриональных стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Подходящие дозы для терапевтического эффекта могут составлять по меньшей мере 10⁵ или между приблизительно 10⁵ и приблизительно 10¹⁰ клеток на дозу, например, предпочтительно в сериях из циклов дозирования. Иллюстративный режим дозирования состоит из четырех циклов дозирования по одной неделе в увеличивающихся дозах, начиная по меньшей мере при приблизительно 10⁵ клеток на сутки 0, например, с пошаговым увеличением вплоть до целевой дозы приблизительно 10¹⁰ клеток в пределах нескольких недель от начала схемы повышения дозы для одного и того же пациента. Подходящие способы введения включают внутривенный, подкожный, внутриполостной (например, посредством устройства доступа к резервуару), внутрибрюшинный и прямую инъекцию в опухолевую массу. [00104] The source of the immunocytes that are preactivated and expanded can be of any species, however, in particular embodiments, the cells are obtained, for example, from an umbilical cord blood bank, peripheral blood bank, human embryonic stem cells, or induced pluripotent stem cells. Suitable doses for therapeutic effect may be at least 10 ⁵ or between about 10 ⁵ and about 10 ¹⁰ cells per dose, for example, preferably in a series of dosing cycles. An exemplary dosing regimen consists of four one-week dosing cycles of increasing doses, starting at at least about 10 ⁵ cells on day 0, for example, increasing stepwise up to a target dose of approximately 10 ¹⁰ cells within a few weeks of the start of the dose escalation regimen for the same patient. Suitable routes of administration include intravenous, subcutaneous, intracavitary (eg, via a reservoir access device), intraperitoneal, and direct injection into the tumor mass.

[00105] В одном иллюстративном способе, клетки NK можно получать из биологического образца, такого как одна или несколько доз пуповинной крови. Доза пуповинной крови может представлять собой замороженную дозу пуповинной крови. Дозу пуповинной крови можно размораживать и подвергать разделению в градиенте фиколла для получения мононуклеарных клеток. Мононуклеарные клетки можно истощать по положительным по CD3, CD14 и CD19, например, посредством CliniMAS. Затем клетки NK после отрицательного отбора можно культивировать в присутствии APC и IL-2 (например, 200 ед./мл). Затем клетки NK можно трансдуцировать с использованием ретровирусного супернатанта, экспрессирующего CAR, и культивировать с γ-облученными APC и IL-2. Наконец, клетки можно сортировать по положительной экспрессии CAR, например, для CD56, CD16, CD3, CD19, CD14 или CD45. [00105]In one exemplary method, NK cells can be obtained from a biological sample, such as one or more units of umbilical cord blood. The cord blood unit may be a frozen unit of umbilical cord blood. A unit of cord blood can be thawed and subjected to Ficoll gradient separation to obtain mononuclear cells. Mononuclear cells can be depleted of CD3, CD14 and CD19 positive cells, for example by CliniMAS. NK cells after negative selection can then be cultured in the presence of APC and IL-2 (e.g. 200 units/ml). NK cells can then be transduced with retroviral supernatant expressing CAR and cultured with γ-irradiated APCs and IL-2. Finally, cells can be sorted by positive CAR expression, for example for CD56, CD16, CD3, CD19, CD14 or CD45.

[00106] Иммуноциты, полученные в соответствии с настоящими способами, могут иметь множество потенциальных применений, включая экспериментальные и терапевтические применения. В частности, предусматривают, что такие популяции клеток могут быть необычайно полезными для супрессии нежелательных или ненадлежащих иммунных ответов. В таких способах, небольшое количество иммуноцитов отбирают у пациента и затем подвергают манипуляции и размножению ex vivo перед их повторной инфузией пациенту. Примерами заболеваний, которые можно лечить этим способом, являются аутоиммунные заболевания и состояния, при которых супрессированная иммунная активность является желательной, например, для переносимости аллотрансплантации. Терапевтический способ может включать предоставление млекопитающего, получение иммуноцитов от млекопитающего; размножение иммуноцитов ex vivo в соответствии со способами из настоящих способов, как описано выше; и введение размноженных иммуноцитов млекопитающему, подлежащему лечению. [00106] Immunocytes obtained in accordance with the present methods may have many potential applications, including experimental and therapeutic applications. In particular, it is contemplated that such cell populations may be particularly useful in suppressing unwanted or inappropriate immune responses. In such methods, a small number of immunocytes are collected from the patient and then manipulated and expanded.ex vivobefore their re-infusion to the patient. Examples of diseases that can be treated by this method are autoimmune diseases and conditions in which suppressed immune activity is desirable, e.g. for tolerability of allotransplantation. The therapeutic method may include providing a mammal, obtaining immunocytes from the mammal; immunocyte proliferationex vivoin accordance with the methods of the present methods as described above; and administering the expanded immunocytes to the mammal being treated.

[00107] Фармацевтическую композицию по настоящему описанию можно использовать отдельно или в комбинации с другими хорошо разработанными средствами, которые можно использовать для лечения злокачественной опухоли. При доставке отдельно или в комбинации с другими средствами, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять различными способами и в различные участки в организме млекопитающего, в частности, человека, для достижения конкретного эффекта. Специалисту в данной области известно, что, несмотря на то, что более одного способа можно использовать для введения, конкретный способ может обеспечивать более немедленную и более эффективную реакцию, чем другой способ. Например, внутрикожную доставку можно использовать более преимущественным способом, по сравнению с ингаляцией, для лечения меланомы. Местную или системную доставку можно осуществлять посредством введения, включающего нанесение или инстилляцию состава в полости организма, ингаляцию или инсуфляцию аэрозоля, или посредством парентерального введения, включающего внутримышечное, внутривенное, интрапортальное, внутрипеченочное, перитонеальное, подкожное или внутрикожное введение. [00107] The pharmaceutical composition of the present description can be used alone or in combination with other well-developed agents that can be used to treat cancer. When delivered alone or in combination with other agents, the pharmaceutical composition of the present invention can be delivered in various ways and to various sites in the body of a mammal, in particular a human, to achieve a specific effect. One skilled in the art will recognize that although more than one route may be used for administration, a particular route may provide a more immediate and more effective response than another route. For example, intradermal delivery may be used advantageously over inhalation for the treatment of melanoma. Local or systemic delivery can be achieved by administration, including application or instillation of the composition into a body cavity, inhalation or insufflation of an aerosol, or by parenteral administration, including intramuscular, intravenous, intraportal, intrahepatic, peritoneal, subcutaneous or intradermal administration.

[00108] Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам лечения или предотвращения иммуноопосредованного нарушения. В одном варианте осуществления, субъект имеет аутоиммунное заболевание. Неограничивающие примеры аутоиммунных заболеваний включают: очаговую алопецию, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания надпочечника, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, аутоиммунную тромбоцитопению, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, целиакию-дерматит, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, синдром Черджа-Стросс, рубцовый пемфигоид, синдром CREST, болезнь холодовой агглютинации, болезнь Крона, дискоидную волчанку, первичную криоглобулинемию смешанного типа, фибромиалгию-фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грэйвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический пульмонарный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), IgA невропатию, ювенильный артрит, лишай Вильсона, красную волчанку, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет типа 1 или иммуноопосредованный сахарный диабет, миастению, нефротический синдром (такой как гломерулонефрит с минимальными изменениями, фокальный гломерулосклероз или мембранозная нефропатия), обыкновенную пузырчатку, пернициозную анемию, узелковый полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный биллиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, системную красную волчанку, красную волчанку, язвенный колит, увеит, васкулиты (такие как узелковый полиартериит, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит или герпетиформный дерматит васкулит), витилиго и гранулематоз Вегенера. Таким образом, некоторые примеры аутоиммунного заболевания, которое можно лечить с использованием способов, описанных в настоящем описании, включают, но без ограничения, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, сахарный диабет типа I, болезнь Крона; язвенный колит, миастению, гломерулонефрит, анкилозирующий спондилит, васкулит или псориаз. Субъект может также иметь аллергическое нарушение, такое как астма. [00108] Specific embodiments of the present invention relate to methods of treating or preventing an immune-mediated disorder. In one embodiment, the subject has an autoimmune disease. Non-limiting examples of autoimmune diseases include: alopecia areata, ankylosing spondylitis, antiphospholipid syndrome, autoimmune Addison's disease, autoimmune adrenal diseases, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune hepatitis, autoimmune oophoritis and orchitis, autoimmune thrombocytopenia, Behçet's disease, bullous pemphigoid, cardiomyopathy, celiac disease, dermatitis, chronic fatigue and immune dysfunction syndrome (CFIDS), chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, Churg-Strauss syndrome, cicatricial pemphigoid, CREST syndrome, cold agglutination disease, Crohn's disease, discoid lupus, primary cryoglobulinemia mixed type, fibromyalgia-fibromyositis, glomerulonephritis, Graves' disease, Guillain-Barré syndrome, Hashimoto's thyroiditis, idiopathic pulmonary fibrosis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), IgA neuropathy, juvenile arthritis, Wilson's lichen, lupus erythematosus, Meniere's disease, mixed connective tissue disease, multiple sclerosis, type 1 diabetes mellitus or immune-mediated diabetes mellitus , myasthenia gravis, nephrotic syndrome (such as minimal change glomerulonephritis, focal glomerulosclerosis or membranous nephropathy), pemphigus vulgaris, pernicious anemia, polyarteritis nodosa, polychondritis, polyglandular syndromes, polymyalgia rheumatica, polymyositis and dermatomyositis, primary agammaglobulinemia , primary biliary cirrhosis, psoriasis, psoriatic arthritis, Raynaud's phenomenon, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, sarcoidosis, scleroderma, Sjögren's syndrome, stiff muscle syndrome, systemic lupus erythematosus, lupus erythematosus, ulcerative colitis, uveitis, vasculitis (such as polyarteritis nodosa, Takayasu's arteritis, temporal arteritis/giant cell arteritis or dermatitis herpetiformis vasculitis), vitiligo and Wegener's granulomatosis. Thus, some examples of an autoimmune disease that can be treated using the methods described herein include, but are not limited to, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, type I diabetes mellitus, Crohn's disease; ulcerative colitis, myasthenia gravis, glomerulonephritis, ankylosing spondylitis, vasculitis or psoriasis. The subject may also have an allergic disorder such as asthma.

[00109] В другом варианте осуществления, субъект является реципиентом трансплантированного органа или стволовых клеток, и иммуноциты используют для предотвращения и/или лечения отторжения. В конкретных вариантах осуществления, субъект имеет реакцию или подвержен риску развития реакции трансплантат против хозяина. GVHD является возможным осложнением для любого трансплантата с использованием или с содержанием стволовых клеток либо от родственного, либо от неродственного донора. Существует два вида GVHD, острая и хроническая. Острая GVHD возникает в пределах первых трех месяцев после трансплантации. Признаки острой GVHD включают красноватую кожную сыпь на руках и ногах, которая может распространяться и становиться более тяжелой, с шелушащейся или пузырящейся кожей. Острая GVHD может также поражать желудок и кишечник, в этом случае присутствуют судороги, тошнота и диарея. Пожелтение кожи и глаз (желтуха) показывает, что острая GVHD поразила печень. Хроническую GVHD ранжируют на основании ее тяжести: стадия/градация 1 является мягкой; стадия/градация 4 является тяжелой. Хроническая GVHD развивается через три месяца или позже после трансплантации. Симптомы хронической GVHD являются сходными с симптомами острой GVHD, но кроме того, хроническая GVHD может также поражать слизистые железы в глазах, слюнные железы во рту, и железы, смазывающие слизистую оболочку желудка и кишечника. Можно использовать любую из описанных популяций иммуноцитов. Примеры трансплантированного органа включают трансплантат солидного органа, такого как почка, печень, кожа, поджелудочная железа, легкое и/или сердце, или клеточный трансплантат, такой как клетки островков, гепатоциты, миобласты, клетки костного мозга, или гематопоэтические или другие стволовые клетки. Трансплантат может представлять собой композитный трансплантат, такой как ткани лица. Иммуноциты можно вводить до трансплантации, во время трансплантации или после трансплантации. В некоторых вариантах осуществления, иммуноциты вводят до трансплантации, например, за по меньшей мере 1 час, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 1 неделю, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели или по меньшей мере 1 месяц до трансплантации. В одном конкретном неограничивающем примере, введение терапевтически эффективного количества иммуноцитов проводят за 3-5 суток до трансплантации. [00109] In another embodiment, the subject is a recipient of an organ transplant or stem cells, and the immunocytes are used to prevent and/or treat rejection. In specific embodiments, the subject has or is at risk of developing graft-versus-host disease. GVHD is a possible complication of any transplant using or containing stem cells from either a related or unrelated donor. There are two types of GVHD, acute and chronic. Acute GVHD occurs within the first three months after transplantation. Signs of acute GVHD include a reddish skin rash on the arms and legs that may spread and become more severe, with scaly or blistering skin. Acute GVHD can also affect the stomach and intestines, in which case cramps, nausea and diarrhea are present. Yellowing of the skin and eyes (jaundice) indicates that acute GVHD has affected the liver. Chronic GVHD is graded based on its severity: stage/grade 1 is mild; stage/gradation 4 is severe. Chronic GVHD develops three months or later after transplantation. The symptoms of chronic GVHD are similar to those of acute GVHD, but in addition, chronic GVHD can also affect the mucous glands in the eyes, the salivary glands in the mouth, and the glands that lubricate the lining of the stomach and intestines. Any of the described immunocyte populations can be used. Examples of a transplanted organ include a solid organ transplant such as a kidney, liver, skin, pancreas, lung and/or heart, or a cellular graft such as islet cells, hepatocytes, myoblasts, bone marrow cells, or hematopoietic or other stem cells. The graft may be a composite graft, such as facial tissue. Immunocytes can be administered before transplantation, during transplantation, or after transplantation. In some embodiments, the immunocytes are administered prior to transplantation, for example, at least 1 hour, at least 12 hours, at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 4 days, at least 5 days, at least 6 days, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks or at least 1 month before transplantation. In one specific non-limiting example, administration of a therapeutically effective amount of immunocytes is administered 3-5 days prior to transplantation.

[00110] В конкретных вариантах осуществления, иммуноциты вводят в комбинации с вторым лекарственным средством. Например, второе лекарственное средство может содержать T-клетки, иммуномодулирующее средство, моноклональное антитело или химиотерапевтическое средство. В неограничивающих примерах, иммуномодулирующее средство представляет собой ленолидомид, моноклональное антитело представляет собой ритуксимаб, офатумаб или лумиликсимаб, и химиотерапевтическое средство представляет собой флударабин или циклофосфамид. [00110] In specific embodiments, immunocytes are administered in combination with a second drug. For example, the second drug may comprise T cells, an immunomodulatory agent, a monoclonal antibody, or a chemotherapeutic agent. In non-limiting examples, the immunomodulatory agent is lenolidomide, the monoclonal antibody is rituximab, ofatumab or lumiliximab, and the chemotherapeutic agent is fludarabine or cyclophosphamide.

[00111] Композиция по настоящему описанию может быть предоставлена в единичной дозированной форме, где каждая единичная доза, например, для инъекции, содержит предопределенное количество композиции, отдельно или в подходящей комбинации с другими действующими веществами. Термин единичная дозированная форма, в рамках изобретения, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов-людей и животных, где каждая единица содержит предопределенное количество композиции по настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с другим действующим веществом, рассчитанное как количество, достаточное для оказания желательного эффекта, в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или связующим, когда это целесообразно. Характеристики новых единичных дозированных форм по настоящему изобретению зависят от конкретной фармакодинамики, ассоциированной с фармацевтической композицией у конкретного субъекта. [00111]The composition herein may be provided in unit dosage form, wherein each unit dose, e.g. for injection, contains a predetermined amount of the composition, alone or in a suitable combination with other active ingredients. The term unit dosage form, as used herein, refers to physically discrete units suitable as unitary dosages for human and animal subjects, wherein each unit contains a predetermined amount of the composition of the present invention, alone or in combination with another active ingredient, calculated as the amount sufficient to produce the desired effect, in combination with a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or vehicle, when appropriate. The characteristics of the new unit dosage forms of the present invention depend on the specific pharmacodynamics associated with the pharmaceutical composition in a particular subject.

[00112] Желательно, эффективное количество или достаточное количество выделенных трансдуцированных иммуноцитов присутствует в композиции, и его вводят субъекту, таким образом, чтобы вызывать длительные, специфические, противоопухолевые ответы для уменьшения объема опухоли или прекращения роста или повторного роста опухоли, который в ином случае возникает в результате отсутствия такого лечения. Желательно, количество иммуноцитов, повторно введенных субъекту, вызывает уменьшение размера опухоли на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 100%, по сравнению с такими же условиями, когда иммуноциты не присутствуют. [00112] Desirably, an effective amount or sufficient amount of isolated transduced immunocytes is present in the composition and administered to a subject so as to elicit long-lasting, specific, antitumor responses to reduce tumor volume or stop tumor growth or regrowth that would otherwise occur as a result of the lack of such treatment. Desirably, the number of immunocytes reintroduced to a subject causes a reduction in tumor size of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% or 100%, compared to the same conditions when no immunocytes are present.

[00113] Соответственно, количество введенных иммуноцитов должно учитывать способ введения и должно являться таким, чтобы вводить достаточное количество иммуноцитов, чтобы достигать желательного терапевтического ответа. Кроме того, количество каждого действующего вещества, включенное в композиции, описанные в настоящем описании (например, количество на каждую клетку, подлежащую приведению в контакт или количество на определенную массу тела), можно менять в различных применениях. Как правило, концентрация иммуноцитов, желательно, должна являться достаточной для предоставления субъекту, подвергаемому лечению, по меньшей мере от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁹ иммуноцитов, даже более желательно, от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 5×10⁸ иммуноцитов, хотя можно использовать любое подходящее количество, либо выше, например, более 5×10⁸ клеток, либо ниже, например, менее 1×10⁷ клеток. Расписание дозирования может быть основано на хорошо разработанных видах терапии на основе клеток (см., например, Topalian and Rosenberg, 1987; Патент США No. 4690915), или можно использовать альтернативный способ непрерывной инфузии. [00113]Accordingly, the number of immunocytes administered should take into account the route of administration and should be such that a sufficient number of immunocytes are administered to achieve the desired therapeutic response. In addition, the amount of each active ingredient included in the compositions described herein (e.g. the amount per cell to be brought into contact or the amount per specific body weight) can be varied in different applications. In general, the concentration of immunocytes should desirably be sufficient to provide the subject being treated with at least about 1 x 10⁶ up to approximately 1x10⁹ immunocytes, even more preferably from approximately 1x10⁷ up to approximately 5x10⁸ immunocytes, although any suitable number or higher can be used, e.g. more than 5×10⁸ cells, or lower, for example, less than 1×10⁷ cells. The dosing schedule can be based on well-developed cell-based therapies (see e.g. Topalian and Rosenberg, 1987; US Patent No. 4690915), or an alternative continuous infusion method can be used.

[00114] Эти значения обеспечивают общее руководство по диапазону иммуноцитов для использования практикующим специалистом в данной области при оптимизации способа по настоящему изобретению для практического осуществления изобретения. Перечисление в настоящем описании таких диапазонов никоим образом не препятствует использованию более высокого или более низкого количества компонента, как может потребоваться при конкретном применении. Например, фактические доза и расписание могут меняться, в зависимости от того, вводят ли композиции в комбинации с другими фармацевтическими композициями, или в зависимости от различий между индивидуумами в фармакокинетике, распределении и метаболизме лекарственного средства. Специалист в данной области может легко осуществлять любые необходимые коррекции в соответствии с требованиями конкретной ситуации. [00114] These values provide a general guide to the range of immunocytes for use by a practitioner of the art in optimizing the method of the present invention for the practice of the invention. The listing of such ranges herein in no way precludes the use of higher or lower amounts of a component as may be required for a particular application. For example, the actual dosage and schedule may vary depending on whether the compositions are administered in combination with other pharmaceutical compositions or depending on differences between individuals in the pharmacokinetics, distribution and metabolism of the drug. One skilled in the art can easily make any necessary adjustments according to the requirements of a particular situation.

VI.VI. НаборыSets

[00115] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к набору, который может включать, например, одну или несколько сред и компонентов для получения UAPC и/или иммуноцитов. Такие составы могут содержать коктейль факторов, в форме, пригодной для комбинации с APC и/или иммуноцитами. Система реагентов может быть упакована либо в водных средах, либо в лиофилизированной форме, когда это целесообразно. Контейнерные средства из наборов могут, в общем, включать по меньшей мере одну ампулу, пробирку, флакон, бутыль, шприц или другие контейнерные средства, в которые компонент может быть помещен, и предпочтительно, подходящим образом аликвотирован. Когда в наборе присутствует более одного компонента, набор также, как правило, содержит второй, третий или другой дополнительный контейнер, в который могут быть отдельно помещены дополнительные компоненты. Однако, различные комбинации компонентов могут содержаться в флаконе. Компоненты набора могут быть представлены в форме высушенного порошка(порошков). Когда реагенты и/или компоненты представлены в форме сухого порошка, порошок можно разводить посредством добавления подходящего растворителя. Предусматривают, что растворитель может также быть представлен в других контейнерных средствах. Наборы также, как правило, включают средства для содержания компонента(компонентов) набора в надежной изоляции для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать полученные литьем под давлением или формованием с раздувом и растяжением пластиковые контейнеры, в которых удерживают желательные ампулы. Набор может также включать инструкции для использования, например, в печатном или электронном формате, таком как цифровой формат. [00115] In some embodiments, the present invention provides a kit that may include, for example, one or more media and components for obtaining UAPC and/or immunocytes. Such formulations may contain a cocktail of factors in a form suitable for combination with APCs and/or immunocytes. The reagent system may be packaged in either aqueous media or lyophilized form when appropriate. The container means of the kits may generally include at least one ampoule, tube, vial, bottle, syringe or other container means into which the component can be placed, and preferably suitably aliquoted. When more than one component is present in a kit, the kit also typically includes a second, third, or other additional container into which additional components can be separately placed. However, various combinations of components may be contained in the bottle. The components of the kit may be presented in the form of dried powder(s). When the reagents and/or components are in dry powder form, the powder may be reconstituted by adding a suitable solvent. It is contemplated that the solvent may also be present in other container means. Kits also typically include means for containing the kit component(s) in secure isolation for commercial sale. Such containers may include injection molded or stretch blow molded plastic containers that hold the desired ampoules. The kit may also include instructions for use, for example, in a printed or electronic format, such as a digital format.

VII.VII. ПримерыExamples

[00116] Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалист в данной области должен понимать, что способы, описанные в следующих примерах, представляют способы, которые, как открыто авторами настоящего изобретения, хорошо функционируют для практического осуществления изобретения, и таким образом, можно считать, что они составляют предпочтительные способы для его практического осуществления. Однако, специалист в данной области должен, в свете настоящего описания, понимать, что множество изменений можно вносить в описанные конкретные варианты осуществления и все еще получать подобный или сходный результат без отклонения от содержания и объема изобретения. [00116] The following examples are included to demonstrate preferred embodiments of the invention. One skilled in the art will understand that the methods described in the following examples represent methods that have been discovered by the inventors to work well for the practice of the invention, and thus may be considered to constitute the preferred methods for its practice. However, one skilled in the art should, in light of the present description, understand that many changes can be made to the specific embodiments described and still obtain a similar or similar result without deviating from the scope and scope of the invention.

Пример 1 - Комбинация mbIL21, 4-1BBL и SLAM (CD48/CS1)Example 1 - Combination of mbIL21, 4-1BBL and SLAM (CD48/CS1)

[00117] Универсальные антигенпрезентирующие клетки (UAPC) получали посредством трансдукции клеток K562 с использованием ретровирусных конструкций для связанного с мембраной IL-21 и 41BBL (лиганда CD137) либо с CD48-Katushka, либо с CS1-EGFP. Карты и аннотации MMLV-ретровирусных конструкций показаны на ФИГ. 4A-4D. Клон 46 (ФИГ. 3B) получали в результате вынужденной экспрессии mblL-21 и 41BBL в чувствительных к клеткам NK APC K562 (HLA-A^-, HLA-B^-) (ФИГ. ЗА). UAPC получали посредством вынужденной экспрессии mbIL-1, 41BBL и CD48 в клетках K562 (ФИГ. 3C). UAPC2 получали посредством вынужденной экспрессии mbIL-21, 41BBL и CS1 в клетках K562 (ФИГ. 3D). [00117] Universal antigen presenting cells (UAPCs) were generated by transducing K562 cells using retroviral constructs for membrane-bound IL-21 and 41BBL (a CD137 ligand) with either CD48-Katushka or CS1-EGFP. Maps and annotations of MMLV retroviral constructs are shown in FIG. 4A-4D. Clone 46 (FIG. 3B) was obtained by forced expression of mblL-21 and 41BBL in sensitive NK APC K562 cells (HLA-A ^- , HLA-B ^- ) (FIG. 3). UAPCs were generated by forced expression of mbIL-1, 41BBL, and CD48 in K562 cells (FIG. 3C). UAPC2 was generated by forced expression of mbIL-21, 41BBL and CS1 in K562 cells (FIG. 3D).

[00118] Количественное размножение клеток NK проводили с использованием активации посредством клона 46, UAPC или UAPC2. Пролиферация и размножение клеток NK посредством совместного культивирования с APC показали, что клон 46 являлся превосходным по своей способности к размножению как нетрансдуцированных клеток NK (NT-NK), так и трансдуцированных CAR-10 (SG4-NK), по сравнению с ранее опубликованным клоном 9 (ФИГ. 2B). [00118] Quantitative expansion of NK cells was performed using activation through clone 46, UAPC or UAPC2. Proliferation and expansion of NK cells by co-culture with APC showed that clone 46 was superior in its ability to propagate both non-transduced NK cells (NT-NK) and transduced CAR-10 (SG4-NK) compared to the previously published clone 9 (FIG. 2B).

[00119] Показано, что размножение клеток NK посредством совместного культивирования с UAPC являлось превосходным по своей способности уменьшать время удвоения клеток NK до 31,38 часов, по сравнению с ранее опубликованным клоном 9 (время удвоения 33 часа), приводя к пролиферативному преимуществу 44% (1671-кратное размножение для UAPC против 1161-кратного размножения для клона 9) в течение 2 недель (ФИГ. 2E). Взаимосвязь между временем удвоения, кратностью размножения и исходной популяцией клеток заключена в следующей формуле: [00119]Shown, that NK cell expansion by co-culture with UAPC was superior in its ability to reduce NK cell doubling time to 31.38 hours, compared to previously reported clone 9 (33 hour doubling time), resulting in a proliferative advantage of 44% (1671-fold expansion for UAPC vs. 1161-fold expansion for clone 9) over 2 weeks (FIG. 2E). The relationship between doubling time, multiplication rate and initial cell population is contained in the following formula:

[00120] где Nf представляет собой конечное количество клеток, Nb представляет собой начальное количество клеток, e=2,71828 (математическая константа, также известная как число Эйлера), T представляет собой длительность культивирования в часах, Td представляет собой время удвоения в часах. Время удвоения влияет на конечное количество клеток экспоненциальным образом, таким образом увеличивая пролиферативное преимущество в течение указанного периода культивирования клеток, позволяя сбор клинически значимых количеств клеток в компактные временные рамки. Таким образом, настоящие способы позволяют эффективное получение клеток NK посредством совместного культивирования с UAPC. [00120] where Nf represents the final number of cells, Nb represents the initial number of cells, e=2.71828 (a mathematical constant also known as Euler's number), T represents the culture duration in hours, Td represents the doubling time in hours. Doubling time affects the final cell number in an exponential manner, thereby increasing the proliferative advantage over a given cell culture period, allowing the collection of clinically relevant numbers of cells in a compact time frame. Thus, the present methods allow efficient generation of NK cells through co-culture with UAPC.

[00121] Технология настоящей платформы принимает преимущество специфических комбинаторных терапевтических путей для предоставления практических способов получения больших количеств высоко функциональных и цитотоксических клеток NK клинической квалификации, предназначенных для иммунотерапии злокачественных опухолей. Размноженные клетки на 100% представляют собой клетки NK, без поддающихся детекции T-клеток, исключая непреднамеренные побочные эффекты трансплантат против хозяина, обычные для многих препаратов иммуноцитов. [00121] The technology of the present platform takes advantage of specific combinatorial therapeutic pathways to provide practical methods for producing large quantities of highly functional and clinical grade cytotoxic NK cells intended for immunotherapy of malignant tumors. The expanded cells are 100% NK cells, with no detectable T cells, eliminating the unintended graft-versus-host side effects common to many immune cell preparations.

* * ** * *

[00122] Все способы, описанные и заявленные в настоящем описании, можно осуществлять и исполнять без излишнего экспериментирования в свете настоящего описания. В то время как композиции и способы по этому изобретению описаны в отношении предпочтительных вариантов осуществления, специалисту в данной области очевидно, что варианты можно применять для способов и в стадиях или в последовательности стадий способа, описанного в настоящем описании, без отклонения от концепции, содержания и объема изобретения. Более конкретно, очевидно, что конкретными средствами, которые являются как химически, так и физиологически родственными, можно заменять средства, описанные в настоящем описании, в то же время можно достигать таких же или сходных результатов. Все такие сходные замены и модификации, очевидные специалисту в данной области, по-видимому, включены в содержание, объем и концепцию изобретения, как определено посредством прилагаемой формулы изобретения. [00122] All methods described and claimed herein can be practiced and performed without undue experimentation in light of the present disclosure. While the compositions and methods of this invention are described with respect to preferred embodiments, it will be apparent to one skilled in the art that embodiments can be used for the methods and in the steps or sequence of steps of the method described herein without departing from the concept, content and scope of the invention. More specifically, it will be appreciated that specific agents that are both chemically and physiologically related can substitute for the agents described herein while still achieving the same or similar results. All such like substitutions and modifications apparent to one skilled in the art are intended to be included within the scope, scope and concept of the invention as defined by the appended claims.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫBIBLIOGRAPHY

Содержание следующих ссылок, до той степени, в которой они предоставляют иллюстративные процедурные или другие детали, дополнительные к деталям, указанным в настоящем описании, конкретно приведено в настоящем описании в качестве ссылки.The contents of the following references, to the extent that they provide illustrative procedural or other details additional to those set forth herein, are specifically incorporated herein by reference.

Czerkinsky et al, J. Immunol. Methods 1988; 110:29-36.Czerkinsky et al, J. Immunol. Methods 1988; 110:29-36.

Fast et al., Transfusion 2004;44:282-5.Fast et al., Transfusion 2004;44:282-5.

He Y, et al. Journal of immunology research. 2014;2014:7.He Y, et al. Journal of immunology research. 2014;2014:7.

Международная публикация No. PCT/US95/01570International publication no. PCT/US95/01570

Международная публикация No. WO2000/06588International publication no. WO2000/06588

Международная публикация No. WO2005/035570International publication no. WO2005/035570

Olsson et al. J. Clin. Invest. 1990;86:981-985.Olsson et al. J. Clin. Invest. 1990;86:981-985.

Taitano et al., The Journal of Immunology, 196, 2016.Taitano et al., The Journal of Immunology, 196, 2016.

Патент США No. 5939281US Patent No. 5939281

Патент США No. 6218132US Patent No. 6218132

Патент США No. 6264951US Patent No. 6264951

Патент США No. 7488490US Patent No. 7488490

Публикация патента США No. 2007/0078113US Patent Publication No. 2007/0078113

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES

<110> Board of Regents, The University of Texas System<110> Board of Regents, The University of Texas System

REZVANI, KATY REZVANI, KATY

ANG, SONNY O.T. ANG, SONNY O.T.

LIU, ENLI LIU, ENLI

SHPALL, ELIZABETH SHPALL, ELIZABETH

<120> УНИВЕРСАЛЬНЫЕ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ<120> UNIVERSAL ANTIGEN PRESENTING CELLS AND THEIR APPLICATIONS

<130> UTFC.P1355WO<130>UTFC.P1355WO

<150> 62633587<150> 62633587

<151> 2018-02-21<151> 2018-02-21

<160> 2 <160> 2

<170> PatentIn версии 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 8202<211> 8202

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Конструкция CS1<223> CS1 design

<400> 1<400> 1

aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60

atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120

agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180

aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240

ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300

agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360

tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttatgctc cccgagctca 420tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttatgctc cccgagctca 420

ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480

ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540

cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 600cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 600

ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 660ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 660

tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatgcgact gattttatgc 720tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatgcgact gattttatgc 720

gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg gcggacccgt gggctggaac 780gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg gcggacccgt gggctggaac 780

tgacgagttc ggaacacccg gccgcaaccc tgggagacgt cccagggact tcgggggccg 840tgacgagttc ggaacacccg gccgcaaccc tgggagacgt cccagggact tcgggggccg 840

gctttttgtg gcccgacctg agtcctaaaa tcccgatcgt ttaggactct ttggtgcacc 900gctttttgtg gcccgacctg agtcctaaaa tcccgatcgt ttaggactct ttggtgcacc 900

ccccttaggc aggagggata tgtggttctg gtaggagacg agaacctaaa acagttcccg 960ccccttaggc aggagggata tgtggttctg gtaggagacg agaacctaaa acagttcccg 960

cctccgtctg aatttttgct ttcggtttgg gaccgaagcc gcgccgcgcg tcttgtctgc 1020cctccgtctg aatttttgct ttcggtttgg gaccgaagcc gcgccgcgcg tcttgtctgc 1020

tgcagcatcg ttctgtgttg tcgctctgtc tgactgtgtt tctgtatttg tctgaaaata 1080tgcagcatcg ttctgtgttg tcgctctgtc tgactgtgtt tctgtatttg tctgaaaata 1080

tgggcccggg ctagcctgtt accactccct gctaagtttg accttaggtc actggaaaga 1140tgggcccggg ctagcctgtt accactccct gctaagtttg accttaggtc actggaaaga 1140

tgtcgagcgg atcgctcaca accagtcggt agatgtcagc agaagagacg ttgggttacc 1200tgtcgagcgg atcgctcaca accagtcggt agatgtcagc agaagagacg ttgggttacc 1200

ttctgctctg cagaatggcc aacctttaac gtcggatggc cgcgaggcac ggcaccttta 1260ttctgctctg cagaatggcc aacctttaac gtcggatggc cgcgaggcac ggcaccttta 1260

accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc acctggcccg catggacacc 1320accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc acctggcccg catggacacc 1320

cagaccaggt ggggtacatc gtgacctggg aagccttggc ttttgacccc cctccctggg 1380cagaccaggt ggggtacatc gtgacctggg aagccttggc ttttgacccc cctccctggg 1380

tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc 1440tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc 1440

cccttggcaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc ctttatccag ccctcactcc 1500cccttggcaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc ctttatccag ccctcactcc 1500

ttctctaggc gcccccatat ggccatatga gatcttatat ggggcacccc cgccccttgt 1560ttctctaggc gcccccatat ggccatatga gatcttatat ggggcacccc cgccccttgt 1560

aaacttccct gaccctgaca tgacaagagt tactaacagc ccctctctcc aagctcactt 1620aaacttccct gaccctgaca tgacaagagt tactaacagc ccctctctcc aagctcactt 1620

acaggctctc tacttagtcc agcacggcaa gtctggagac ctctggcggc agcctaccaa 1680acaggctctc tacttagtcc agcacggcaa gtctggagac ctctggcggc agcctaccaa 1680

gaacaactgg accgaccggt ggtacctcac ccttgcaccg agtcggcgac acagtgtggg 1740gaacaactgg accgaccggt ggtacctcac ccttgcaccg agtcggcgac acagtgtggg 1740

tccgccgaca ccagactaag aacctagaac ctcgctggaa aggcgacctt acacagtcct 1800tccgccgaca ccagactaag aacctagaac ctcgctggaa aggcgacctt acacagtcct 1800

gctgaccacc cccaccgccc tcaaagtaga cggcatcgca gcttggatac acgccgccca 1860gctgaccacc cccaccgccc tcaaagtaga cggcatcgca gcttggatac acgccgccca 1860

cgtgaaggct gccgaccccg ggggtggacc atcctctaga ctgccatgct cgaggccggc 1920cgtgaaggct gccgaccccg ggggtggacc atcctctaga ctgccatgct cgaggccggc 1920

agccccacct gcctgaccct gatctacatc ctgtggcagc tgaccggcag cgccgccagc 1980agccccacct gcctgaccct gatctacatc ctgtggcagc tgaccggcag cgccgccagc 1980

ggccccgtga aggagctggt gggcagcgtg ggcggcgccg tgaccttccc cctgaagagc 2040ggccccgtga aggagctggt gggcagcgtg ggcggcgccg tgaccttccc cctgaagagc 2040

aaggtgaagc aggtggacag catcgtgtgg accttcaaca ccacccccct ggtgaccatc 2100aaggtgaagc aggtggacag catcgtgtgg accttcaaca ccacccccct ggtgaccatc 2100

cagcccgagg gcggcaccat catcgtgacc cagaacagaa acagagagag agtggacttc 2160cagcccgagg gcggcaccat catcgtgacc cagaacagaa acagagagag agtggacttc 2160

cccgacggcg gctacagcct gaagctgagc aagctgaaga agaacgacag cggcatctac 2220cccgacggcg gctacagcct gaagctgagc aagctgaaga agaacgacag cggcatctac 2220

tacgtgggca tctacagcag cagcctgcag cagcccagca cccaggagta cgtgctgcac 2280tacgtgggca tctacagcag cagcctgcag cagcccagca cccaggagta cgtgctgcac 2280

gtgtacgagc acctgagcaa gcccaaggtg accatgggcc tgcagagcaa caagaacggc 2340gtgtacgagc acctgagcaa gcccaaggtg accatgggcc tgcagagcaa caagaacggc 2340

acctgcgtga ccaacctgac ctgctgcatg gagcacggcg aggaggacgt gatctacacc 2400acctgcgtga ccaacctgac ctgctgcatg gagcacggcg aggaggacgt gatctacacc 2400

tggaaggccc tgggccaggc cgccaacgag agccacaacg gcagcatcct gcccatcagc 2460tggaaggccc tgggccaggc cgccaacgag agccacaacg gcagcatcct gcccatcagc 2460

tggagatggg gcgagagcga catgaccttc atctgcgtgg ccagaaaccc cgtgagcaga 2520tggagatggg gcgagagcga catgaccttc atctgcgtgg ccagaaaccc cgtgagcaga 2520

aacttcagca gccccatcct ggccagaaag ctgtgcgagg gcgccgccga cgaccccgac 2580aacttcagca gccccatcct ggccagaaag ctgtgcgagg gcgccgccga cgaccccgac 2580

agcagcatgg tgctgctgtg cctgctgctg gtgcccctgc tgctgagcct gttcgtgctg 2640agcagcatgg tgctgctgtg cctgctgctg gtgcccctgc tgctgagcct gttcgtgctg 2640

ggcctgttcc tgtggttcct gaagagagag agacaggagg agtacatcga ggagaagaag 2700ggcctgttcc tgtggttcct gaagagagag agacaggagg agtacatcga ggagaagaag 2700

agagtggaca tctgcagaga gacccccaac atctgccccc acagcggcga gaacaccgag 2760agagtggaca tctgcagaga gacccccaac atctgccccc acagcggcga gaacaccgag 2760

tacgacacca tcccccacac caacagaacc atcctgaagg aggaccccgc caacaccgtg 2820tacgacacca tcccccacac caacagaacc atcctgaagg aggaccccgc caacaccgtg 2820

tacagcaccg tggagatccc caagaagatg gagaaccccc acagcctgct gaccatgccc 2880tacagcaccg tggagatccc caagaagatg gagaaccccc acagcctgct gaccatgccc 2880

gacaccccca gactgttcgc ctacgagaac gtgatcggca gcacctccgg cagcggcgcg 2940gacaccccca gactgttcgc ctacgagaac gtgatcggca gcacctccgg cagcggcgcg 2940

cctggcagcg gcgagggcag caccaagggc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc 3000cctggcagcg gcgagggcag caccaagggc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc 3000

ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg 3060ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg 3060

tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 3120tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 3120

accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag 3180accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag 3180

tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc 3240tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc 3240

gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc 3300gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc 3300

gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac 3360gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac 3360

ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac 3420ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac 3420

gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac 3480gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac 3480

aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc 3540aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc 3540

gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa 3600gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa 3600

gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc 3660gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc 3660

actctcggca tggacgagct gtacaagtga cgcgtcatca tcgatccgga ttagtccaat 3720actctcggca tggacgagct gtacaagtga cgcgtcatca tcgatccgga ttagtccaat 3720

ttgttaaaga caggatatca gtggtccagg ctctagtttt gactcaacaa tatcaccagc 3780ttgttaaaga caggatatca gtggtccagg ctctagtttt gactcaacaa tatcaccagc 3780

tgaagcctat agagtacgag ccatagataa aataaaagat tttatttagt ctccagaaaa 3840tgaagcctat agagtacgag ccatagataa aataaaagat tttatttagt ctccagaaaa 3840

aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta acgccatttt 3900aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta acgccatttt 3900

gcaaggcatg gaaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg tcaggaacag 3960gcaaggcatg gaaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg tcaggaacag 3960

atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 4020atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 4020

cagggccaag aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 4080cagggccaag aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 4080

gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc agccctcagc 4140gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc agccctcagc 4140

agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 4200agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 4200

ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 4260ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 4260

gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggggcgc cagtcctccg attgactgag 4320gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggggcgc cagtcctccg attgactgag 4320

tcgcccgggt acccgtgtat ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc 4380tcgcccgggt acccgtgtat ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc 4380

gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg ggtctttcac 4440gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg ggtctttcac 4440

acatgcagca tgtatcaaaa ttaatttggt tttttttctt aagtatttac attaaatggc 4500acatgcagca tgtatcaaaa ttaatttggt tttttttctt aagtatttac attaaatggc 4500

catagtactt aaagttacat tggcttcctt gaaataaaca tggagtattc agaatgtgtc 4560catagtactt aaagttacat tggcttcctt gaaataaaca tggagtattc agaatgtgtc 4560

ataaatattt ctaattttaa gatagtatct ccattggctt tctacttttt cttttatttt 4620ataaatattt ctaattttaa gatagtatct ccattggctt tctacttttt cttttatttt 4620

tttttgtcct ctgtcttcca tttgttgttg ttgttgtttg tttgtttgtt tgttggttgg 4680tttttgtcct ctgtcttcca tttgttgttg ttgttgtttg tttgtttgtt tgttggttgg 4680

ttggttaagc ttttttttta aagatcctac actatagttc aagctagact attagctact 4740ttggttaagc ttttttttta aagatcctac actatagttc aagctagact attagctact 4740

ctgtaaccca gggtgagccc ttgaagtcat gggtagcctg ctgttttagc cttcccacat 4800ctgtaaccca gggtgagccc ttgaagtcat gggtagcctg ctgttttagc cttcccacat 4800

ctaagattac aggtatgagc tatcgcattt ttggtatatt gattgattga ttgattgatg 4860ctaagattac aggtatgagc tatcgcattt ttggtatatt gattgattga ttgattgatg 4860

tgtgtgtgtg tgattgtgtt tgtgtgtgtg acgctgtgaa aatgtgtgta tgggtgtgtg 4920tgtgtgtgtg tgattgtgtt tgtgtgtgtg acgctgtgaa aatgtgtgta tgggtgtgtg 4920

tgaatgtgtg tatgtatgtg tgtgtgtgag tgtgtgtgtg tgtgtgtgca tgtgtgtgtg 4980tgaatgtgtg tatgtatgtg tgtgtgtgag tgtgtgtgtg tgtgtgtgca tgtgtgtgtg 4980

tgtgactgtg tctatgtgta tgactgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtggctg tgtgtgtgtg 5040tgtgactgtg tctatgtgta tgactgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtggctg tgtgtgtgtg 5040

tgtgtgtgtg tgttgtgaaa aaatattcta tggtagtgag agccaacgct ccgggcctca 5100tgtgtgtgtg tgttgtgaaa aaatattcta tggtagtgag agccaacgct ccgggcctca 5100

ggtgtcaggt tggtttttga gacagagtct ttcacttagc ttggaattca ctggccgtcg 5160ggtgtcaggt tggtttttga gacagagtct ttcacttagc ttggaattca ctggccgtcg 5160

ttgcttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 5220ttgcttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 5220

acatccccct gcttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 5280acatccccct gcttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 5280

caacagttgc gcagcctggc aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 5340caacagttgc gcagcctggc aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 5340

atctgtgcgg tatttcacac cgcatagctg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 5400atctgtgcgg tatttcacac cgcatagctg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 5400

cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacagccccg ctgacgcgcc ctgacgggct 5460cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacagccccg ctgacgcgcc ctgacgggct 5460

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tcgctccggg agctgcatgt 5520tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tcgctccggg agctgcatgt 5520

gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gcgtgatacg 5580gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gcgtgatacg 5580

cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 5640cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 5640

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 5700tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 5700

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 5760tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 5760

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 5820gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 5820

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 5880ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 5880

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 5940agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 5940

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 6000agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 6000

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 6060tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 6060

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 6120tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 6120

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 6180cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 6180

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 6240aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 6240

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 6300tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 6300

tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 6360tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 6360

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 6420ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 6420

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 6480ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 6480

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 6540cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 6540

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 6600gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 6600

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 6660actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 6660

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 6720aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 6720

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 6780caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 6780

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 6840aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 6840

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 6900accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 6900

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg 6960aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg 6960

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 7020ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 7020

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 7080agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 7080

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 7140accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 7140

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 7200gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 7200

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 7260tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 7260

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 7320cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 7320

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 7380cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 7380

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 7440cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 7440

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 7500ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 7500

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 7560taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 7560

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 7620gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 7620

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 7680cgacaggttt cccgactgga aagcggggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 7680

cactgccatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 7740cactgccatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 7740

attgtgagcg gagctaacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 7800attgtgagcg gagctaacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 7800

tttgctctta ggagtttcct gcaatacatc ccaaactcaa atatataaag catttgactt 7860tttgctctta ggagtttcct gcaatacatc ccaaactcaa atatataaag catttgactt 7860

gttctatgcc ctagggggcg gggggaaggc ctaagccagc tttttttaac atttaaaatg 7920gttctatgcc ctagggggcg gggggaaggc ctaagccagc tttttttaac atttaaaatg 7920

ttaattccat tttaaatgca cagatgtttt tatttcgcat aagggtttca atgtgcatga 7980ttaattccat tttaaatgca cagatgtttt tatttcgcat aagggtttca atgtgcatga 7980

atgctgcaat attcctgtta ccaaagctag tataaataaa aatagataaa cgtggaaatt 8040atgctgcaat attcctgtta ccaaagctag tataaataaa aatagataaa cgtggaaatt 8040

acttagagtt tctgtcatta acgtttcctt cctcagttga caacataaat gcgcgctgct 8100acttagagtt tctgtcatta acgtttcctt cctcagttga caacataaat gcgcgctgct 8100

gagcaagcca gtttgcatct gtcaggatca atttcccatt atgccagtca tattaattgc 8160gagcaagcca gtttgcatct gtcaggatca atttcccatt atgccagtca tattaattgc 8160

actagtcaat tagttgattt ttatttttga catatacatg tg 8202actagtcaat tagttgattt ttatttttga catatacatg tg 8202

<210> 2<210> 2

<211> 7935<211> 7935

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Конструкция CD48<223> CD48 design

<400> 2<400> 2

aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60

atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120

agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180

aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240

ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300

agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360

tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttatgctc cccgagctca 420tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttatgctc cccgagctca 420

ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480

ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540

cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 600cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 600

ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 660ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 660

tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatcgactg attttatgcg 720tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatcgactg attttatgcg 720

cctgcgtcgg tactagttag ctaactagct ctgtatctgg cggacccgtg gctggaactg 780cctgcgtcgg tactagttag ctaactagct ctgtatctgg cggacccgtg gctggaactg 780

acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc cagggacttc gggggccgct 840acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc cagggacttc gggggccgct 840

ttttgtggcc cgacctgagt cctaaaatcc cgatcgttta ggactctttg gtgcaccccc 900ttttgtggcc cgacctgagt cctaaaatcc cgatcgttta ggactctttg gtgcaccccc 900

cttagcagga gggatatgtg gttctggtag gagacgagaa cctaaaacag ttcccgcctc 960cttagcagga gggatatgtg gttctggtag gagacgagaa cctaaaacag ttcccgcctc 960

cgtctgaatt tttgctttcg gtttgggacc gaagccgcgc cgcgcgtctt gtctgctgca 1020cgtctgaatt tttgctttcg gtttgggacc gaagccgcgc cgcgcgtctt gtctgctgca 1020

gcatcgttct gtgttgtcct ctgtctgact gtgtttctgt atttgtctga aaatatgggc 1080gcatcgttct gtgttgtcct ctgtctgact gtgtttctgt atttgtctga aaatatgggc 1080

ccgggctagc ctgttaccac tccctctaag tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga 1140ccgggctagc ctgttaccac tccctctaag tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga 1140

gcggatcgct cacaaccagt cggtagatgt cacagaagag acgttgggtt accttctgct 1200gcggatcgct cacaaccagt cggtagatgt cacagaagag acgttgggtt accttctgct 1200

ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgagc acggcacctt taaccgagac 1260ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgagc acggcacctt taaccgagac 1260

ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc cgcatggaca cccagaccag 1320ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc cgcatggaca cccagaccag 1320

gtggggtaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc cccctccctg ggtcaagccc 1380gtggggtaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc cccctccctg ggtcaagccc 1380

tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg ccccgtctct cccccttgca 1440tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg ccccgtctct cccccttgca 1440

acctcctcgt tcgaccccgc ctcgatcctc cctttatcca gccctcactc cttctctagg 1500acctcctcgt tcgaccccgc ctcgatcctc cctttatcca gccctcactc cttctctagg 1500

cgcccccata tggccatatg agatcttata tggggcaccc ccgccccttg taaacttccc 1560cgcccccata tggccatatg agatcttata tggggcaccc ccgccccttg taaacttccc 1560

tgaccctgac atgacaagag ttactaacag cccctctctc caagctcact tacaggctct 1620tgaccctgac atgacaagag ttactaacag cccctctctc caagctcact tacaggctct 1620

ctacttagtc cagcacgcaa gtctggagac ctctggcggc agcctaccaa gaacaactgg 1680ctacttagtc cagcacgcaa gtctggagac ctctggcggc agcctaccaa gaacaactgg 1680

accgaccggt ggtacctcac ccttcaccga gtcggcgaca cagtgtgggt ccgccgacac 1740accgaccggt ggtacctcac ccttcaccga gtcggcgaca cagtgtgggt ccgccgacac 1740

cagactaaga acctagaacc tcgctggaaa gcgaccttac acagtcctgc tgaccacccc 1800cagactaaga acctagaacc tcgctggaaa gcgaccttac acagtcctgc tgaccacccc 1800

caccgccctc aaagtagacg gcatcgcagc ttggatacac gccgcccacg tgaaggctgc 1860caccgccctc aaagtagacg gcatcgcagc ttggatacac gccgcccacg tgaaggctgc 1860

cgaccccggg ggtggaccat cctctagact gccatgctcg aggtgggtga ggatagcgtg 1920cgaccccggg ggtggaccat cctctagact gccatgctcg aggtgggtga ggatagcgtg 1920

ctgatcaccg agaacatgca catgaaactg tacatggagg gcaccgtgaa cgaccaccac 1980ctgatcaccg agaacatgca catgaaactg tacatggagg gcaccgtgaa cgaccaccac 1980

ttcaagtgca catccgaggg cgaaggcaag ccctacgagg gcacccagac catgaagatc 2040ttcaagtgca catccgaggg cgaaggcaag ccctacgagg gcacccagac catgaagatc 2040

aaggtggtcg agggcggccc tctccccttc gccttcgaca tcctggctac cagcttcatg 2100aaggtggtcg agggcggccc tctccccttc gccttcgaca tcctggctac cagcttcatg 2100

tacggcagca aaacctttat caaccacacc cagggcatcc ccgacttctt taagcagtcc 2160tacggcagca aaacctttat caaccacacc cagggcatcc ccgacttctt taagcagtcc 2160

ttccctgagg gcttcacatg ggagaggatc accacatacg aagacggggg cgtgctgacc 2220ttccctgagg gcttcacatg ggagaggatc accacatacg aagacgggg cgtgctgacc 2220

gctacccagg acaccagcct ccagaacggc tgcctcatct acaacgtcaa gatcaacggg 2280gctacccagg acaccagcct ccagaacggc tgcctcatct acaacgtcaa gatcaacggg 2280

gtgaacttcc catccaacgg ccctgtgatg cagaagaaaa cactcggctg ggaggccagc 2340gtgaacttcc catccaacgg ccctgtgatg cagaagaaaa cactcggctg ggaggccagc 2340

accgagatgc tgtaccccgc tgacagcggc ctgagaggcc atgcccagat ggccctgaag 2400accgagatgc tgtaccccgc tgacagcggc ctgagaggcc atgcccagat ggccctgaag 2400

ctcgtgggcg ggggctacct gcactgctcc ctcaagacca catacagatc caagaaaccc 2460ctcgtgggcg ggggctacct gcactgctcc ctcaagacca catacagatc caagaaaccc 2460

gctaagaacc tcaagatgcc cggcttctac ttcgtggacc ggagactgga aagaatcaag 2520gctaagaacc tcaagatgcc cggcttctac ttcgtggacc ggagactgga aagaatcaag 2520

gaggccgaca aagagaccta cgtcgagcag cacgagatgg ctgtggccag atactgcgac 2580gaggccgaca aagagaccta cgtcgagcag cacgagatgg ctgtggccag atactgcgac 2580

ctgcctagca aactggggca cagcggcagc acctccggca gcggcgcgcc tggcagcggc 2640ctgcctagca aactggggca cagcggcagc acctccggca gcggcgcgcc tggcagcggc 2640

gagggcagca ccaagggcga gggcagggga agtcttctaa catgcgggga cgtggaggaa 2700gagggcagca ccaagggcga gggcagggga agtcttctaa catgcgggga cgtggaggaa 2700

aatcccgggc ccatgtgcag cagaggctgg gacagctgcc tggccctgga gctgctgctg 2760aatcccgggc ccatgtgcag cagaggctgg gacagctgcc tggccctgga gctgctgctg 2760

ctgcccctga gcctgctggt gaccagcatc cagggccacc tggtgcacat gaccgtggtg 2820ctgcccctga gcctgctggt gaccagcatc cagggccacc tggtgcacat gaccgtggtg 2820

agcggcagca acgtgaccct gaacatcagc gagagcctgc ccgagaacta caagcagctg 2880agcggcagca acgtgaccct gaacatcagc gagagcctgc ccgagaacta caagcagctg 2880

acctggttct acaccttcga ccagaagatc gtggagtggg acagcagaaa gagcaagtac 2940acctggttct acaccttcga ccagaagatc gtggagtggg acagcagaaa gagcaagtac 2940

ttcgagagca agttcaaggg cagagtgaga ctggaccccc agagcggcgc cctgtacatc 3000ttcgagagca agttcaaggg cagagtgaga ctggaccccc agagcggcgc cctgtacatc 3000

agcaaggtgc agaaggagga caacagcacc tacatcatga gagtgctgaa gaagaccggc 3060agcaaggtgc agaaggagga caacagcacc tacatcatga gagtgctgaa gaagaccggc 3060

aacgagcagg agtggaagat caagctgcag gtgctggacc ccgtgcccaa gcccgtgatc 3120aacgagcagg agtggaagat caagctgcag gtgctggacc ccgtgcccaa gcccgtgatc 3120

aagatcgaga agatcgagga catggacgac aactgctacc tgaagctgag ctgcgtgatc 3180aagatcgaga agatcgagga catggacgac aactgctacc tgaagctgag ctgcgtgatc 3180

cccggcgaga gcgtgaacta cacctggtac ggcgacaaga gacccttccc caaggagctg 3240cccggcgaga gcgtgaacta cacctggtac ggcgacaaga gacccttccc caaggagctg 3240

cagaacagcg tgctggagac caccctgatg ccccacaact acagcagatg ctacacctgc 3300cagaacagcg tgctggagac caccctgatg ccccacaact acagcagatg ctacacctgc 3300

caggtgagca acagcgtgag cagcaagaac ggcaccgtgt gcctgagccc cccctgcacc 3360caggtgagca acagcgtgag cagcaagaac ggcaccgtgt gcctgagccc cccctgcacc 3360

ctggccagaa gcttcggcgt ggagtggatc gccagctggc tggtggtgac cgtgcccacc 3420ctggccagaa gcttcggcgt ggagtggatc gccagctggc tggtggtgac cgtgcccacc 3420

atcctgggcc tgctgctgac ctgacgcgtc atcatcgatc cggattagtc caatttgtta 3480atcctgggcc tgctgctgac ctgacgcgtc atcatcgatc cggattagtc caatttgtta 3480

aagacaggat atcagtggtc caggctctag ttttgactca acaatatcac cagctgaagc 3540aagacaggat atcagtggtc caggctctag ttttgactca acaatatcac cagctgaagc 3540

ctatagagta cgagccatag ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg 3600ctatagagta cgagccatag ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg 3600

gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg 3660gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg 3660

catggaaaaa tacataactg agaatagaga agttcagatc aaggtcagga acagatggaa 3720catggaaaaa tacataactg agaatagaga agttcagatc aaggtcagga acagatggaa 3720

cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc 3780cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc 3780

caagaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 3840caagaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 3840

gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtccagccct cagcagtttc 3900gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtccagccct cagcagtttc 3900

tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat 3960tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat 3960

ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc 4020ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc 4020

aataaaagag cccacaaccc ctcactcggg gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc 4080aataaaagag cccacaaccc ctcactcggg gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc 4080

gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt 4140gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt 4140

ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcacacatgc 4200ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cggggggtctt tcacacatgc 4200

agcatgtatc aaaattaatt tggttttttt tcttaagtat ttacattaaa tggccatagt 4260agcatgtatc aaaattaatt tggttttttt tcttaagtat ttacattaaa tggccatagt 4260

acttaaagtt acattggctt ccttgaaata aacatggagt attcagaatg tgtcataaat 4320acttaaagtt acattggctt ccttgaaata aacatggagt attcagaatg tgtcataaat 4320

atttctaatt ttaagatagt atctccattg gctttctact ttttctttta tttttttttg 4380atttctaatt ttaagatagt atctccattg gctttctact ttttctttta tttttttttg 4380

tcctctgtct tccatttgtt gttgttgttg ttctgtttgt ttgtttgttg gttggttggt 4440tcctctgtct tccatttgtt gttgttgttg ttctgtttgt ttgtttgttg gttggttggt 4440

taattttttt ttaaagatcc tacactatag ttcaagctag actattagct actctgtaac 4500taattttttt ttaaagatcc tacactatag ttcaagctag actattagct actctgtaac 4500

ccagggtgac cttgaagtca tgggtagcct gctgttttag ccttccccac atctaagatt 4560ccagggtgac cttgaagtca tgggtagcct gctgttttag ccttccccac atctaagatt 4560

acaggtatga gctatcattt ttggtatatt gattgattga ttgattgatg tgtgtgtgtg 4620acaggtatga gctatcattt ttggtatatt gattgattga ttgattgatg tgtgtgtgtg 4620

tgattgtgtt tgtgtgtgtg actgtgaaaa tgtgtgtatg ggtgtgtgtg aatgtgtgct 4680tgattgtgtt tgtgtgtgtg actngtgaaaa tgtgtgtatg ggtgtgtgtg aatgtgtgct 4680

atgtatgtgt gtgtgtgagt gtgtgtgtgt gtgtgtgcat gtgtgtgtgt gtgactgtgt 4740atgtatgtgt gtgtgtgagt gtgtgtgtgt gtgtgtgcat gtgtgtgtgt gtgactgtgt 4740

ctatgctgta tgactgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 4800ctatgctgta tgactgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 4800

ttgtgaaaaa atcattctat ggtagtgaga gccaacgctc cggctcaggt gtcaggttgg 4860ttgtgaaaaa atcattctat ggtagtgaga gccaacgctc cggctcaggt gtcaggttgg 4860

tttttgagac agagtctttc cacttagctt ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 4920tttttgagac agagtctttc cacttagctt ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 4920

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 4980gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 4980

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca cccgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc 5040ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca cccgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc 5040

ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctccttc acgcatctgt gcggtatttc 5100ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctccttc acgcatctgt gcggtatttc 5100

acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc 5160acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc 5160

ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cgcgcatccg 5220ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cgcgcatccg 5220

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 5280cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 5280

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 5340caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 5340

tgatacataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 5400tgatacataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 5400

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 5460cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 5460

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 5520tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 5520

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 5580gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 5580

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 5640gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 5640

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 5700ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 5700

acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 5760acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 5760

ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 5820ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 5820

aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 5880aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 5880

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 5940gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 5940

tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 6000tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 6000

gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 6060gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 6060

cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 6120cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 6120

atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 6180atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 6180

attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 6240attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 6240

ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 6300ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 6300

gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 6360gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 6360

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 6420tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 6420

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 6480aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 6480

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 6540tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 6540

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 6600tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 6600

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 6660ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 6660

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 6720ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 6720

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 6780gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 6780

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 6840aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 6840

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 6900ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 6900

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 6960agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 6960

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 7020aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 7020

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 7080aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 7080

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 7140ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 7140

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atccccctga 7200cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atccccctga 7200

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 7260ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 7260

gcaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 7320gcaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 7320

ctctcccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 7380ctctcccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 7380

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 7440aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 7440

gctttacact ttatgcttcc gcgctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 7500gctttacact ttatgcttcc gcgctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 7500

tcacacagga aacagctatg accatgatct acgccaagct ttgctcttag gagtttccta 7560tcacacagga aacagctatg accatgatct acgccaagct ttgctcttag gagtttccta 7560

atacatccca aactcaaata tataaagcat ttgacttgtt ctatgcccta gggggcgggg 7620atacatccca aactcaaata tataaagcat ttgacttgtt ctatgcccta gggggcgggg 7620

ggaagctaag ccagcttttt ttaacattta aaatgttaat tcccatttta aatgcacaga 7680ggaagctaag ccagcttttt ttaacattta aaatgttaat tcccatttta aatgcacaga 7680

tgtttttatt tcataagggt ttcaatgtgc atgaatgctg caatattccc tgttaccaaa 7740tgtttttatt tcataagggt ttcaatgtgc atgaatgctg caatattccc tgttaccaaa 7740

gctagtataa ataaaaatag ataaacgtgg aaattactta gagtttctgt cattacacgt 7800gctagtataa ataaaaatag ataaacgtgg aaattactta gagtttctgt cattacacgt 7800

ttccttcctc agttgacaac ataaatgcgc tgctgagcaa gccagtttgc atctgtcagg 7860ttccttcctc agttgacaac ataaatgcgc tgctgagcaa gccagtttgc atctgtcagg 7860

atccaatttc ccattatgcc agtcatatta attactagtc aattagttga tttttatttt 7920atccaatttc ccattatgcc agtcatatta attactagtc aattagttga tttttatttt 7920

tgacatatac atgtg 7935tgacatatac atgtg 7935

<---<---

Claims (71)

1. Антигенпрезентирующая клетка (APC), модифицированная для экспрессии и содержания CD48, связанного с мембраной интерлейкина-21 (mbIL-21) и лиганда 41BB (41BBL),1. Antigen presenting cell (APC) modified to express and contain CD48, membrane-bound interleukin-21 (mbIL-21) and 41BB ligand (41BBL), где:Where: CD48 для подкрепления межклеточного взаимодействия;CD48 to reinforce cell-cell communication; mbIL-21 для концентрирования и локализации транс-взаимодействия с IL21R; иmbIL-21 to concentrate and localize trans-interaction with IL21R; And 41BBL для управления противоопухолевыми ответами посредством увеличения клеточной пролиферации и секреции IFN-γ.41BBL to drive antitumor responses by increasing cell proliferation and IFN-γ secretion. 2. APC, модифицированная для экспрессии и содержания CS1 (CD319), mbIL-21 и лиганда 41BB (41BBL),2. APC modified to express and contain CS1 (CD319), mbIL-21 and 41BB ligand (41BBL), где:Where: CS1 для включения уничтожающей активности;CS1 to enable destructive activity; mbIL-21 для концентрирования и локализации транс-взаимодействия с IL21R; иmbIL-21 to concentrate and localize trans-interaction with IL21R; And 41BBL для управления противоопухолевыми ответами посредством увеличения клеточной пролиферации и секреции IFN-γ.41BBL to drive antitumor responses by increasing cell proliferation and IFN-γ secretion. 3. APC, модифицированная для экспрессии и содержания CD48, CS1 (CD319), mbIL-21 и лиганда 41BB (41BBL),3. APC modified to express and contain CD48, CS1 (CD319), mbIL-21 and 41BB ligand (41BBL), где:Where: CD48 для подкрепления межклеточного взаимодействия;CD48 to reinforce cell-cell communication; CS1 для включения уничтожающей активности;CS1 to enable destructive activity; mbIL-21 для концентрирования и локализации транс-взаимодействия с IL21R; иmbIL-21 to concentrate and localize trans-interaction with IL21R; And 41BBL для управления противоопухолевыми ответами посредством увеличения клеточной пролиферации и секреции IFN-γ.41BBL to drive antitumor responses by increasing cell proliferation and IFN-γ secretion. 4. APC по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что APC по существу не имеет экспрессии эндогенных молекул HLA класса I, II или CDId.4. APC according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the APC is substantially free of expression of endogenous HLA class I, II or CDId molecules. 5. APC по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что APC экспрессирует ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58).5. APC according to any one of claims 1-3, characterized in that the APC expresses ICAM-1 (CD54) and LFA-3 (CD58). 6. APC по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что APC представляет собой происходящую из клетки лейкоза APC.6. APC according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the APC is a leukemia cell-derived APC. 7. APC по п.6, где происходящую из клетки лейкоза APC дополнительно определяют как клетку K562.7. The APC according to claim 6, wherein the leukemia cell-derived APC is further defined as a K562 cell. 8. APC по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что APC модифицирована посредством ретровирусной трансдукции.8. APC according to any one of claims 1-3, characterized in that the APC is modified by retroviral transduction. 9. APC по п.8, где ретровирусную трансдукцию дополнительно определяют как трансдукцию вирусной конструкцией из SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2.9. The APC of claim 8, wherein retroviral transduction is further defined as transduction with the viral construct of SEQ ID NO:1 and/or SEQ ID NO:2. 10. APC по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что APC является облученной.10. APC according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the APC is irradiated. 11. Способ размножения иммуноцитов, включающий культивирование иммуноцитов в присутствии эффективного количества APC по любому из пп.1-10.11. A method for propagating immunocytes, comprising culturing immunocytes in the presence of an effective amount of APC according to any one of claims 1 to 10. 12. Способ по п.11, где иммуноциты и APC культивируют в соотношении от 3:1 до 1:3.12. The method according to claim 11, where immunocytes and APCs are cultured in a ratio of 3:1 to 1:3. 13. Способ по п.11, где иммуноциты и APC культивируют в соотношении 1:2.13. The method according to claim 11, where immunocytes and APCs are cultured in a ratio of 1:2. 14. Способ по п.11, где размножение проводят в присутствии IL-2.14. The method according to claim 11, where the propagation is carried out in the presence of IL-2. 15. Способ по п.14, где IL-2 присутствует в концентрации 10-500 ед./мл.15. The method according to claim 14, where IL-2 is present at a concentration of 10-500 units/ml. 16. Способ по п.14, где IL-2 присутствует в концентрации 100-300 ед./мл.16. The method according to claim 14, where IL-2 is present at a concentration of 100-300 units/ml. 17. Способ по п.14, где IL-2 присутствует в концентрации 200 ед./мл.17. The method according to claim 14, where IL-2 is present at a concentration of 200 units/ml. 18. Способ по п.14, где IL-2 представляет собой рекомбинантный человеческий IL-2.18. The method of claim 14, wherein the IL-2 is recombinant human IL-2. 19. Способ по п.14, где IL-2 восполняют каждые 2-3 суток.19. The method according to claim 14, where IL-2 is replenished every 2-3 days. 20. Способ по п.11, где APC добавляют по меньшей мере второй раз.20. The method of claim 11, wherein APC is added at least a second time. 21. Способ по п.11, где иммуноциты представляют собой клетки NK или T-клетки.21. The method according to claim 11, where the immunocytes are NK cells or T cells. 22. Способ по п.11, где иммуноциты представляют собой клетки NK.22. The method according to claim 11, where the immunocytes are NK cells. 23. Способ по п.11, где иммуноциты представляют собой T-клетки.23. The method according to claim 11, where the immunocytes are T cells. 24. Способ по п.11, где иммуноциты происходят из пуповинной крови (CB), периферической крови (PB), стволовых клеток или костного мозга.24. The method of claim 11, wherein the immunocytes are derived from umbilical cord blood (CB), peripheral blood (PB), stem cells or bone marrow. 25. Способ по п.11, где стволовые клетки представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.25. The method of claim 11, wherein the stem cells are induced pluripotent stem cells. 26. Способ по п.11, где иммуноциты получены из CB.26. The method according to claim 11, where the immunocytes are obtained from CB. 27. Способ по п.26, где CB пулирована из 2 или более индивидуальных доз пуповинной крови.27. The method of claim 26, wherein the CB is pooled from 2 or more individual units of umbilical cord blood. 28. Способ по п.26, где CB пулирована из 3, 4, 5, 6, 7 или 8 индивидуальных доз пуповинной крови.28. The method according to claim 26, where the CB is pooled from 3, 4, 5, 6, 7 or 8 individual units of umbilical cord blood. 29. Способ по п.22, где клетки NK представляют собой мононуклеарные клетки CB (CBMC).29. The method of claim 22, wherein the NK cells are CB mononuclear cells (CBMC). 30. Способ по п.22, где клетки NK дополнительно определяют как CD56⁺ клетки NK.30. The method of claim 22, wherein the NK cells are further defined as CD56 ⁺ NK cells. 31. Способ по п.11, где способ осуществляют в бессыровоточной среде.31. The method according to claim 11, where the method is carried out in a serum-free environment. 32. Способ по любому из пп.11-31, где иммуноциты модифицируют для экспрессии химерного рецептора антигена (CAR).32. The method according to any one of claims 11 to 31, wherein the immunocytes are modified to express a chimeric antigen receptor (CAR). 33. Способ по п.32, где CAR содержит гуманизированный антигенсвязывающий домен.33. The method of claim 32, wherein the CAR comprises a humanized antigen binding domain. 34. Способ по п.32, где CAR содержит антигенсвязывающий домен для CD19, CD123, мезотелина, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 или BCMA.34. The method of claim 32, wherein the CAR contains an antigen binding domain for CD19, CD123, mesothelin, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1, or BCMA. 35. Способ по п.32, где CAR содержит антигенсвязывающий домен для CD19 или CD123.35. The method of claim 32, wherein the CAR comprises an antigen binding domain for CD19 or CD123. 36. Способ по п.32, где CAR содержит IL-15.36. The method according to claim 32, wherein the CAR contains IL-15. 37. Способ по п.32, где CAR содержит ген самоубийства.37. The method according to claim 32, where the CAR contains a suicide gene. 38. Способ по п.37, где ген самоубийства представляет собой CD20, CD52, EGFRv3 или индуцируемую каспазу 9.38. The method of claim 37, wherein the suicide gene is CD20, CD52, EGFRv3 or inducible caspase 9. 39. Популяция размноженных иммуноцитов, полученная в соответствии со способами по любому из пп.11-38, где популяция клеток имеет улучшенное уничтожение опухолей; и где клетки секретируют цитокины I типа, такие как интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).39. A population of expanded immunocytes obtained in accordance with the methods of any one of claims 11 to 38, wherein the cell population has improved tumor killing; and where cells secrete type I cytokines such as interferon-γ, tumor necrosis factor-α, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). 40. Способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества размноженных иммуноцитов по п.39 субъекту, где терапевтически эффективное количество размноженных иммуноцитов составляет между приблизительно 10⁵ и приблизительно 10¹⁰ клеток на дозу в сериях из циклов дозирования.40. A method of treating a disease or disorder in a subject, comprising administering a therapeutically effective number of expanded immunocytes according to claim 39 to the subject, wherein the therapeutically effective number of expanded immunocytes is between about 10 ⁵ and about 10 ¹⁰ cells per dose in a series of dosing cycles. 41. Способ по п.40, где заболевание или нарушение представляет собой злокачественную опухоль, воспаление, реакцию трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата, аутоиммунное нарушение, иммунодефицитное заболевание, В-клеточное злокачественное новообразование или инфекцию.41. The method of claim 40, wherein the disease or disorder is cancer, inflammation, graft-versus-host disease, graft rejection, autoimmune disorder, immunodeficiency disease, B-cell malignancy, or infection. 42. Способ по п.41, где злокачественная опухоль представляет собой лейкоз.42. The method according to claim 41, wherein the malignant tumor is leukemia. 43. Способ по п.42, где лейкоз представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML) или хронический миелогенный лейкоз (CML).43. The method of claim 42, wherein the leukemia is acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), acute myelogenous leukemia (AML) or chronic myelogenous leukemia (CML). 44. Способ по п.40, где иммуноциты являются аллогенными.44. The method according to claim 40, where the immunocytes are allogeneic. 45. Способ по п.40, где иммуноциты являются аутологичными.45. The method according to claim 40, where the immunocytes are autologous. 46. Способ по п.40, где иммуноциты представляют собой клетки NK или T-клетки.46. The method of claim 40, wherein the immunocytes are NK cells or T cells. 47. Способ по п.40, где иммуноциты представляют собой клетки NK.47. The method according to claim 40, where the immunocytes are NK cells. 48. Способ по п.40, где нарушение представляет собой реакцию трансплантат против хозяина (GVHD).48. The method of claim 40, wherein the disorder is graft-versus-host disease (GVHD). 49. Способ по п.40, где нарушение представляет собой рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, диабет типа I, системную красную волчанку, контактную гиперчувствительность, астму или синдром Шегрена.49. The method of claim 40, wherein the disorder is multiple sclerosis, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, type I diabetes, systemic lupus erythematosus, contact hypersensitivity, asthma or Sjögren's syndrome. 50. Способ по п.40, где субъект представляет собой человека.50. The method of claim 40, wherein the subject is a human. 51. Способ по п.40, дополнительно включающий введение по меньшей мере второго лекарственного средства.51. The method of claim 40, further comprising administering at least a second drug. 52. Способ по п.51, где по меньшей мере второе лекарственное средство представляет собой терапевтически эффективное количество противоракового средства, иммуномодулирующего средства или иммуносупрессивного средства.52. The method of claim 51, wherein at least the second drug is a therapeutically effective amount of an anticancer agent, an immunomodulatory agent, or an immunosuppressive agent. 53. Способ по п.52, где противораковое средство представляет собой химиотерапию, радиотерапию, генотерапию, хирургию, гормонотерапию, антиангиогенную терапию или иммунотерапию.53. The method of claim 52, wherein the anticancer agent is chemotherapy, radiotherapy, gene therapy, surgery, hormone therapy, antiangiogenic therapy, or immunotherapy. 54. Способ по п.52, где иммуносупрессивное средство представляет собой ингибитор кальциневрина, ингибитор mTOR, антитело, химиотерапевтическое средство, облучение, хемокин, интерлейкины или ингибитор хемокина или интерлейкина.54. The method of claim 52, wherein the immunosuppressive agent is a calcineurin inhibitor, an mTOR inhibitor, an antibody, a chemotherapeutic agent, radiation, a chemokine, interleukins, or a chemokine or interleukin inhibitor. 55. Способ по п.51, где иммуноциты и/или по меньшей мере второе лекарственное средство вводят внутривенно, внутрибрюшинно, интратрахеально, внутрь опухоли, внутримышечно, эндоскопически, внутрь очага, чрескожно, подкожно, местно, или посредством прямой инъекции или перфузии.55. The method of claim 51, wherein the immunocytes and/or at least the second drug are administered intravenously, intraperitoneally, intratracheally, intratumorally, intramuscularly, endoscopically, intralesively, percutaneously, subcutaneously, locally, or by direct injection or perfusion. 56. Способ по п.51, где второе лекарственное средство представляет собой антитело.56. The method of claim 51, wherein the second drug is an antibody. 57. Способ по п.56, где антитело представляет собой моноклональное, биспецифическое или триспецифическое антитело.57. The method of claim 56, wherein the antibody is a monoclonal, bispecific or trispecific antibody. 58. Способ по п.57, где антитело представляет собой ритуксимаб.58. The method of claim 57, wherein the antibody is rituximab.

Images