RU2808501C1

RU2808501C1 - Рекомбинантная плазмида pBU-LipA, обеспечивающая синтез белка липазы А штамма Bacillus natto IAN

Info

Publication number: RU2808501C1
Application number: RU2023103583A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Николаевич Щербаков; Пётр Владимирович Колосов; Екатерина Николаевич Каргашилова; Алёна Николаевна Иркитова
Filing date: 2023-02-15
Publication date: 2023-11-28

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена рекомбинантная плазмида pBU-LipA, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка липазы А штамма Bacillus natto IAN массой 19,3 кДа в клетках Bacillus subtilis. Размер плазмиды 7444 п. н. Плазмида характеризуется физической и генетической картой, представленной на фиг. 1. Рекомбинантный ген, кодирующий целевой белок липазы A Bacillus natto, встроен по сайтам рестрикции BamHI и AatII в область полилинкера вектора pBU, содержащего сильный промотор и сигнальную последовательность. Изобретение обеспечивает эффективную наработку рекомбинантного белка липазы A и его экспорт в культуральную среду. 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к генетической конструкции (плазмиде), обеспечивающей синтез рекомбинантного белка - липазы A Bacillus natto IAN. Способ включает дизайн генетической конструкции и методы трансформации.

Уровень техники

Липазы - ферменты, осуществляющие гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Основными коммерчески-значимыми характеристиками, которыми должны обладать липазы, являются термостабильность, устойчивость к щелочным условиям, органическим растворителям (RU 2508402 С1).

Источником липолитических ферментов являются грибы и бактерии, в частности многие бациллы (RU 2508402 С1). В изобретениях RU 2500812 C1, RU 2475532 C1, RU 2451075 C1, RU 2575804 C1 (Journal of Biotechnology. - 1997. - V. 56. - Р. 89-102), (Protein Expression and Purification. - 2003. - V. 28. -N. 1. - P. 102-1), RU 93042492 A, RU 2508402 C1 приводятся методы получения термостабильных липаз в продуцентах Bacillus licheniformis, Yarrowia lipolytica, Candida parapsilosis, Geobacillus thermocalenulatus, Pichia pastoris, Rhizopus orizae, Escherichia coli. К недостаткам изобретений можно отнести невысокую активность продуцентов, либо трудозатратный способ выделения и очистки ферментного препарата.

Липаза A (LipA) является небольшим белком с массой 19,3 кДа, продуцируемым Bacillus subtilis. В отличие от большинства липаз, LipA не имеет lid домена, закрывающего активный участок фермента, и не проявляет межфазной активации (Borrelli G. М., Trono D., 2015). Оптимальный рН для работы LipA 10,0, температурный интервал 35-40°С. LipA проявляет активность в отношении сложных эфиров глицерина и жирных кислот, длина цепи которых составляет от 6 до 18 атомов углерода, максимальная активность показана для эфиров жирных кислот с длиной цепи С8-С14 (Eggert T. et al. 2002; R. Jing Ma et al. 2017). На практике LipA широко используется при синтезе фармацевтических препаратов, в частности для получения энантиомеров лекарственных веществ (Безбородов А.М., Загустина Н.А., 2014).

Получение LipA проводят в культурах Е. coli и В. subtilis. По сравнению с Е. coli В. subtilis имеет ряд преимуществ: 1) В. subtilis непатогенна; 2) продуцент В. subtilis способен обеспечить синтез и секрецию рекомбинантных белков непосредственно в культуральную среду; 3) культура В. subtilis легко масштабируется, возможно культивирование в больших ферментерах (R. Jing Ma et al. 2017). Однако, несмотря на достоинства, продукция LipA в рекомбинантной В. subtilis все еще ограничена из-за таких проблем, как низкий уровень транскрипции, блокирование секреторного аппарата, деградация внеклеточной протеазы и так далее. Поэтому поиск и конструирование векторов, позволяющих оптимизировать регуляторные элементы экспрессии В. subtilis, являются актуальными научными задачами.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка экспрессионной системы и структуры плазмиды для получения липазы А, продуцируемой штаммом Bacillus natto IAN.

Техническим результатом изобретения является экспрессионная генетическая конструкция pBU-LipA, содержащая нуклеотидную последовательность белка липазы А, обеспечивающая экспрессию белка липазы А штамма Bacillus natto IAN в культуральную среду.

Указанный технический результат достигается получением рекомбинантной плазмиды pBU-LipA, размером 7444 пар нуклеотидов (п.н.), характеризующейся физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, обеспечивающей синтез рекомбинантного белка липазы А штамма Bacillus natto IAN массой 19,3 кДа в клетках Bacillus subtilis. Рекомбинантный ген белка липазы А, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 от нуклеотида в положении 1650 п. о. до нуклеотида в положении 2285 п. о., кодирующий целевой белок липазы A Bacillus natto полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, встроен по сайтам рестрикции BamHI и AatII в область полилинкера вектора pBU, содержащего сильный промотор, что обеспечивает эффективную наработку рекомбинантного белка и его экспорт в культуральную среду.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами. На фиг. 1 представлена физическая и генетическая карта рекомбинантной плазмиды pBU-LipA, предназначенной для синтеза липазы A Bacillus natto в клетках Bacillus subtilis, имеющей следующие основные структурно-функциональные регионы:

- нуклеотидная последовательность, кодирующая устойчивость к хлорамфениколу (cat) (113-763 п. н.);

- нуклеотидная последовательность синтетического промотора Pg100 (1557-1600 п. н.);

- нуклеотидная последовательность, кодирующая ген липазы А (SEQ ID NO: 1) (1650-2285 п. н.);

- нуклеотидная последовательность начала репликации в Bacillus subtilis (repA) (3246-4438 п. н.);

- ген устойчивости к антибиотику ампициллин AmpR (5626-6486 п. н.) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (5521-5625 п. н.), обеспечивающие репликацию плазмиды в E.coli;

- участок начала репликации ori (6657-7245 п. н.).

На фиг. 2. представлена электрофореграмма, иллюстрирующая наработку липазы A Bacillus natto IAN в клетках Bacillus subtilis: 1 - маркер молекулярного веса (Thermo Scientific Unstained Protein Molecular Weight Marker); 2 - культуральная жидкость, содержащая рекомбинантный белок липазы A Bacillus natto IAN; 3 - культуральная жидкость, полученная при культивировании нетрансформированной Bacillus subtilis (отрицательный контроль).

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры (1-3) его осуществления.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pBU-LipA для синтеза липазы A Bacillus natto IAN в системе Bacillus subtilis

Последовательность гена липазы А была амплифицирована из колонии дикого штамма Bacillus natto из коллекции инжинирингового центра «Промбиотех». Для амплификации использовались праймеры LipA-F и LipA-R (таблица 1). ПЦР-продукт гена липазы А размером 636 п.н. в составе реакционной смеси был нанесен на агарозный гель, выделен из геля с помощью набора «Евроген» Cleanup Standard (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя, встроен в состав вектора pJET.2.1, входящего в набор CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific™), в соответствии с инструкциями производителя. Полученной плазмидой pJET-LipA трансформировали культуру Е. coli штамм Stbl3 по общепринятой методике с помощью CaCl₂. Далее выделяли плазмидную ДНК pJET-LipA с помощью набора Plasmid Miniprep («Евроген», Москва) в соответствии с инструкцией производителя и проверяли секвенированием по методу Сэнгера с помощью набора CEQ2000Dye Terminator Cycle Sequencing Kit в соответствии с инструкциями производителя.

Далее в нуклеотидную последовательность липазы А вводили сайты рестрикции BamHI и AatII с помощью ПЦР с использованием праймеров LpA-F и LpA-R (таблица 1), в качестве матрицы для амплификации была использована плазмида pJET-LipA.

На основе вектора pBU, оптимизированного под штамм Bacillus subtilis, получали конструкцию pBU-LipA (фиг. 1), содержащую нуклеотидную последовательность LipA. Для этого проводили ферментативный гидролиз вектора pBU и ПЦР-продукта нуклеотидной последовательности, кодирующей липазу А, эндонуклеазами рестрикции BamHI и AatII. Далее проводили лигирование гидролизованных ПЦР-продукта и вектора pBU и последующую трансформацию по общепринятой методике с помощью CaCl₂ культуры E.coli штамм Stbl3 полученной плазмидой. Выделяли полученную плазмидную ДНК pBU-LipA с помощью набора Plasmid Miniprep («Евроген», Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Идентичность плазмиды pBU-LipA спроектированной подтверждали секвенированием по методу Сэнгера с помощью набора CEQ2000Dye Terminator Cycle Sequencing Kit в соответствии с инструкциями производителя.

Пример 2. Получение рекомбинантного штамма Bacillus subtilis, обеспечивающего синтез липазы A Bacillus natto IAN

Полученной рекомбинантной плазмидой pBU-LipA была проведена трансформация методом электропорации клеток В. subtilis WB800N. Культуру клеток в количестве 50 мл подращивали до OD_λ600=0.2 о.е. Затем в культуру добавили 0,5 гр. трионина, 1 гр. глицил-глицина, 0,05 гр. триптофана и 15 мкл TWEEN 80 и инкубировали в течение часа при 30°С. После культуру клеток инкубировали 20 мин на льду. 50 мл культуры центрифугировали 10 мин 5000g при 4°С на центрифуге AvantiJ-301. Осажденную биомассу дважды промыли в 5 мл ЕР Buffer (0,5 М трегалоза, 0,5 М сорбитол, 0,5 М маннитол, 0,7 мМ MgCl, 0,5 мМ K₂HPO₄, 0,5 мМ KH₂PO₄, рН=7,4). После промывки ресуспендировали в 0,5 мл ЕР Buffer. 100 мкл суспензии клеток перенесли в 2 мл холодные кюветы для электропорации и добавили ДНК с расчетом 25 нг/мкл. Произвели электропорацию при 2,5 kV на электропораторе MicroPulser. К про электропорированным клеткам добавили питательную среду YTx2 с 0,5 М сорбитолом и 0,38 М маннитолом. Инкубировали 3 часа при 37°С. 50 и 200 мкл культуры высевали на чашки с агаризованной средой YTx2, содержащие 5 мкг/мл хлорамфеникола. Чашки помещали в термостат 30°С и инкубировали в течение ночи. На следующий день были идентифицированы отдельные колонии, содержащие плазмиду pBU-LipA.

Пример 3. Получение рекомбинантного белка липазы A Bacillus natto IAN

Полученные клоны В. subtilis, штамм SVB-1 после электропорации рекомбинантной плазмидой pBU-LipA культивировали в качалочных колбах объемом 750 мл в течение 16 часов при 30°С, 170 об/мин. Биомассу бактериальных клеток отделяли от культуральной среды центрифугированием (7000 об/мин), в течение 10 мин, 4°С. Наличие целевого белка липазы А Bacillus natto IAN (молекулярный вес 19,3 kDa) в культуральной среде анализировали с помощью 12% ПААГ (фиг. 2).

Список использованных источников

1. RU 2508402 С1. Термостабильная липаза из бактерии Thermosyntropha lipolytica, активная в щелочной среде. Гумеров В.М. (RU), Марданов А.В. (RU), Равин Н.В. (RU). Патентообладатель(и): Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук (RU). Заявка: 2012141676/10. Дата подачи заявки: 02.10.2012. Опубликовано: 27.02.2014. Бюл. №6.

2. Borrelli G. М., Trono D. Recombinant lipases and phospholipases and their use as biocatalysts for industrial applications // International journal of molecular sciences. 2015. Vol. 16. №9. P. 20774-20840.

3. T. Eggert, G. van Pouderoyen, G. Pencreac'h, I. Douchet, R. Verger, B. W. Dijkstra, K.-E. Jaeger Biochemical properties and three-dimensional structures of two extracellular lipolytic enzymes from Bacillus subtilis Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 26 (2002) 37-46.

4. R. Jing Ma, Y. H. Wang, L. Liu, L. L. Bai, R. Ban Production enhancement of the extracellular lipase LipA in Bacillus subtilis: Effects of regulatory elements and Sec pathway components. Protein Expression and Purification (2017), doi: 10.1016/j.pep.2017.09.011.

5. Безбородов A.M., Загустина H.А. Липазы в реакциях катализа в органическом синтезе (обзор). Прикладная биохимия и микробиология, 2014, том 50, №4, с. 347-373.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="RU-pBU-LipA.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-12-16">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Р¤Р“Р‘РћРЈ Р’Рћ

В«РђР»С‚Р°Р№СЃРєРёР№ РіРѕСЃСѓРґР°СЂСЃС‚РIРµРЅРЅС‹Р№

СѓРЅРёРIРµСЂСЃРёС‚РµС‚В»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Altai State University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Р РµРєРѕРјР±РёРЅР°РЅС‚РЅР°СЏ

РїР»Р°Р•РјРёРґР° pBU-LipA, РѕР±РµСЃРїРµС‡РёРIР°СЋС‰Р°СЏ СЃРёРЅС‚РµР•

Р±РµР»РєР° Р»РёРїР°Р•С‹ Рђ С€С‚Р°РјРјР° Bacillus natto

IAN</InventionTitle>

<INSDSeq_length>7444</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7444</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttaagttattggtatgactggttttaagcgcaaaaaaagttgctttttc

gtacctattaatgtatcgttttagaaaaccgactgtaaaaagtacagtcggcattatctcatattataaa

agccagtcattaggcctatctgacaattcctgaatagagttcataaacaatcctgcatgataaccatcac

aaacagaatgatgtacctgtaaagatagcggtaaatatattgaattacctttattaatgaattttcctgc

tgtaataatgggtagaaggtaattactattattattgatatttaagttaaacccagtaaatgaagtccat

ggaataatagaaagagaaaaagcattttcaggtataggtgttttgggaaacaatttccccgaaccattat

atttctctacatcagaaaggtataaatcataaaactctttgaagtcattctttacaggagtccaaatacc

agagaatgttttagatacaccatcaaaaattgtataaagtggctctaacttatcccaataacctaactct

ccgtcgctattgtaaccagttctaaaagctgtatttgagtttatcacccttgtcactaagaaaataaatg

cagggtaaaatttatatccttcttgttttatgtttcggtataaaacactaatatcaatttctgtggttat

actaaaagtcgtttgttggttcaaataatgattaaatatctcttttctcttccaattgtctaaatcaatt

ttattaaagttcatttgatatgcctcctaaatttttatctaaagtgaatttaggaggcttacttgtctgc

tttcttcattagaatcaatccttttttaaaagtcaatattactgtaacataaatatatattttaaaaata

tcccactttatccaattttcgtttgttgaactaatgggtgctttagttgaagaataaagaccacattaaa

aaatgtggtcttttgtgtttttttaaaggatttgagcgtagcgaaaaatccttttctttcttatcttgat

aataagggtaactattgccgatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgcc

attcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagct

ggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgt

aaaacgacggccagtgaattcgagctcaggccttaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctt

tccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg

tattgggcgtacgatctttcagccgactcaaacatcaaatcttacaaatgtagtctttgaaagtattaca

tatgtaagatttaaatgcaaccgttttttcggaaggaaatgatgacctcgtttccaccggaattagcttg

gtaccaaaggaggtaaggatcactagaaaattttttaaaaaatctcttgacattggaagggagatatgtt

attataagaattgcggaattgtgagcggataacaattcccatataaaggaggaaggatccatgaaatttg

taaaaagaaggatcattgcacttgtaacaattttgatgctgtctgttacatcgctgtttgcgttgcagcc

gtcagtaaaagccgctgaacacaatccagtcgttatggttcacggcattggaggggcatcattcaatttt

gcgggaattaagagctatctcgtatctcagggctggtcgcgggacaagctgtatgcagttgatttttggg

acaagacaggcacaaattataacaatggcccggtattgtcacgatttgtgcaaaaggttttagatgaaac

gggtgcgaaaaaagtggatattgtcgctcacagtatggggggcgcgaacacactttactacataaaaaat

ctggacggcggaaataaagttgaaaacgtcgtgacgcttggcggcgccaaccgtttgacgacaggcaagg

cgcttccgggaacagatccaaatcaaaagattttatacacatccatttacagcagtgccgatatgattgt

catgaattatttatcaagattagacggtgctagaaacgttcaaatccatggcgttggacacatcggcctt

ctgtacagcagccaagtcaacagcctgattaaagaagggctgaacggcgggggccagaatacaaaccatc

atcaccatcaccactaagacgtccccggggcagcccgcctaatgagcgggcttttttcacgtcacgcgtc

catggagatctttgtctgcaactgaaaagtttataccttacctggaacaaatggttgaaacatacgaggc

taatatcggcttattaggaatagtccctgtactaataaaatcaggtggatcagttgatcagtatattttg

gacgaagctcggaaagaatttggagatgacttgcttaattccacaattaaattaagggaaagaataaagc

gatttgatgttcaaggaatcacggaagaagatactcatgataaagaagctctaaaactattcaataacct

tacaatggaattgatcgaaagggtggaaggttaatggtacgaaaattaggggatctacctagaaagccac

aaggcgataggtcaagcttaaagaacccttacatggatcttacagattctgaaagtaaagaaacaacaga

ggttaaacaaacagaaccaaaaagaaaaaaagcattgttgaaaacaatgaaagttgatgtttcaatccat

aataagattaaatcgctgcacgaaattctggcagcatccgaagggaattcatattacttagaggatacta

ttgagagagctattgataagatggttgagacattacctgagagccaaaaaactttttatgaatatgaatt

aaaaaaaagaaccaacaaaggctgagacagactccaaacgagtctgtttttttaaaaaaaatattaggag

cattgaatatatattagagaattaagaaagacatgggaataaaaatattttaaatccagtaaaaatatga

taagattatttcagaatatgaagaactctgtttgtttttgatgaaaaaacaaacaaaaaaaatccaccta

acggaatctcaatttaactaacagcggccaaactgagaagttaaatttgagaaggggaaaaggcggattt

atacttgtatttaactatctccattttaacattttattaaaccccatacaagtgaaaatcctcttttaca

ctgttcctttaggtgatcgcggagggacattatgagtgaagtaaacctaaaaggaaatacagatgaatta

gtgtattatcgacagcaaaccactggaaataaaatcgccaggaagagaatcaaaaaagggaaagaagaag

tttattatgttgctgaaacggaagagaagatatggacagaagagcaaataaaaaacttttctttagacaa

atttggtacgcatataccttacatagaaggtcattatacaatcttaaataattacttctttgatttttgg

ggctattttttaggtgctgaaggaattgcgctctatgctcacctaactcgttatgcatacggcagcaaag

acttttgctttcctagtctacaaacaatcgctaaaaaaatggacaagactcctgttacagttagaggcta

cttgaaactgcttgaaaggtacggttttatttggaaggtaaacgtccgtaataaaaccaaggataacaca

gaggaatccccgatttttaagattagacgtaaggttcctttgctttcagaagaacttttaaatggaaacc

ctaatattgaaattccagatgacgaggaagcacatgtaaagaaggctttaaaaaaggaaaaagagggtct

tccaaaggttttgaaaaaagagcacgatgaatttgttaaaaaaatgatggatgagtcagaaacaattaat

attccagaggccttacaatatgacacaatgtatgaagatatactcagtaaaggagaaattcgaaaagaaa

tcaaaaaacaaatacctaatcctacaacatcttttgagagtatatcaatgacaactgaagaggaaaaagt

cgacagtactttaaaaagcgaaatgcaaaatcgtgtctctaagccttcttttgatacctggtttaaaaac

actaagatcaaaattgaaaataaaaattgtttattacttgtaccgagtgaatttgcatttgaatggatta

agaaaagatatttagaaacaattaaaacagtccttgaagaagctggatatgttttcgaaaaaatcgaact

aagaaaagtgcaataaactgctgaagtatttcagcagttttttttatttagaaatagtgaaaaaaatata

atcagggaggtatcaatatttaatgagtactgatttaaatttatttagactggaattaataattaacacg

tagactaattaaaatttaatgagggataaagaggatacaaaaatattaatttcaatccctattaaatttt

aacaagggggggattaaaatttaattagaggtttatccacaagaaaagaccctaataaaatttttactag

ggttataacactgattaatttcttaatgggggagggattaaaatttaatgacaaagaaaacaatctttta

agaaaagcttttaaaagataataataaaaagagctttgcgattaagcaaaactctttactttttcattga

cattatcaaattcatcgatttcaaattgttgttgtatcataaagttaattctgttttgcacaaccttttc

aggaatataaaacacatctgaggcttgttttataaactcagggtcgctaaagtcaatgtaacgtagcata

tgatatggtatagcttccacccaagttagcctttctgcttcttctgaatgtttttcatatacttccatgg

gtatctctaaatgattttcctcatgtagcaaggtatgagcaaaaagtttatggaattgatagttcctctc

tttttcttcaacttttttatctaaaacaaacactttaacatctgagtcaatgtaagcataagatgttttt

ccagtcataatttcaatcccaaatcttttagacagaaattctggacgtaaatcttttggtgaaagaattt

ttttatgtagcaatatatccgatacagcaccttctaaaagcgttggtgaatagggcattttacctatctc

ctctcattttgtggaataaaaatagtcatattcgtccatctacctatcctattatcgaacagttgaactt

tttaatcaaggatcagtcctttttttcattattcttaaactgtgctcttaactttaacaactcgatttgt

ttttccagatctcgagggtaactagcctcgccgatcccgcaagaggcccggcagtcaggtggcacttttc

ggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgag

acaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtc

gcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaa

aagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatcct

tgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggta

ttatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttg

agtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccat

aaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgct

tttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccatac

caaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcga

actacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccactt

ctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcg

gtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtca

ggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactg

tcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctagg

tgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcaga

ccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaaca

aaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaa

ctggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaa

gaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgat

aagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgg

ggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagct

atgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaaca

ggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacc

tctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgc

ggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgat

tctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgca

gcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcatgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaaatttgtaaaaagaaggatcattgcacttgtaacaattttgatgc

tgtctgttacatcgctgtttgcgttgcagccgtcagtaaaagccgctgaacacaatccagtcgttatggt

tcacggcattggaggggcatcattcaattttgcgggaattaagagctatctcgtatctcagggctggtcg

cgggacaagctgtatgcagttgatttttgggacaagacaggcacaaattataacaatggcccggtattgt

cacgatttgtgcaaaaggttttagatgaaacgggtgcgaaaaaagtggatattgtcgctcacagtatggg

gggcgcgaacacactttactacataaaaaatctggacggcggaaataaagttgaaaacgtcgtgacgctt

ggcggcgccaaccgtttgacgacaggcaaggcgcttccgggaacagatccaaatcaaaagattttataca

catccatttacagcagtgccgatatgattgtcatgaattatttatcaagattagacggtgctagaaacgt

tcaaatccatggcgttggacacatcggccttctgtacagcagccaagtcaacagcctgattaaagaaggg

ctgaacggcgggggccagaatacaaac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MKFVKRRIIALVTILMLSVTSLFALQPSVKAAEHNPVVMVHGIGGASFN

FAGIKSYLVSQGWSRDKLYAVDFWDKTGTNYNNGPVLSRFVQKVLDETGAKKVDIVAHSMGGANTLYYIK

NLDGGNKVENVVTLGGANRLTTGKALPGTDPNQKILYTSIYSSADMIVMNYLSRLDGARNVQIHGVGHIG

LLYSSQVNSLIKEGLNGGGQNTN</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Рекомбинантная плазмида pBU-LipA, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка липазы А штамма Bacillus natto IAN массой 19,3 кДа в клетках Bacillus subtilis, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 7444 п. н. и содержащая в соответствии с физической и генетической картой следующие структурно-функциональные регионы:
- нуклеотидная последовательность, кодирующая устойчивость к хлорамфениколу (cat) (113-763 п. н.);
- нуклеотидная последовательность синтетического промотора Pg100 (1557-1600 п. н.);
- ген липазы А с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 от нуклеотида в положении 1650 по 2285 п. н., кодирующий целевой белок липазы A Bacillus natto полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 и встроенный по сайтам рестрикции BamHI и AatII в область полилинкера вектора pBU, содержащего сильный промотор и сигнальную последовательность, что обеспечивает эффективную наработку рекомбинантного белка и его экспорт в культуральную среду;
- нуклеотидная последовательность начала репликации в Bacillus subtilis (repA) (3246-4438 п. н.);
- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR (5626-6486 п. н.) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (5521-5625 п. н.), позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е. coli;
- участок начала репликации ori (6657-7245 п. н.).