RU2806628C2

RU2806628C2 - Composition containing antibody

Info

Publication number: RU2806628C2
Application number: RU2021114424A
Authority: RU
Inventors: Кристиан ФРАЙХЕЛЬ; Клаудия МЮЛЛЕР; Роберт МЮЛЛЕР; Пётр Ян ЩЕНСНЫЙ; Мартин ВОРГУЛЛЬ; Кристине ВУРТ
Original assignee: Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2023-11-02

Abstract

FIELD: pharmaceuticals; medicine.

SUBSTANCE: objects 1 and 2 are a liquid pharmaceutical composition containing from 118 to 128 mg/ml of the bispecific antibody to VEGF/ANG2, which is faricimab, from 15 to 35 mM sodium chloride, from 15 to 25 mM histidine acetate buffer, at a pH of 5.5 to 6.1, including for use in the treatment of vascular eye disease. Object 3 is a method for obtaining a pharmaceutical composition. Objects 4 and 5 are a bottle and a pre-filled syringe containing a pharmaceutical composition. Object 6 is a lyophilized form of a liquid pharmaceutical composition.

EFFECT: low viscosity and low turbidity of the composition at a high concentration of the antibody.

17 cl, 14 dwg, 16 tbl, 8 ex

Description

Область техники изобретенияTechnical field of the invention

Данное изобретение относится к жидкому фармацевтическому составу биспецифических антител к ангиопоэтину-2 (ANG-2)-2 и фактору роста эндотелия сосудов человека (VEGF, VEGF-A) (биспецифических антител к VEGF/ANG2) и способу получения и применениям состава.This invention relates to a liquid pharmaceutical composition of bispecific antibodies to angiopoietin-2 (ANG-2)-2 and human vascular endothelial growth factor (VEGF, VEGF-A) (bispecific antibodies to VEGF/ANG2) and a method for preparing and uses of the composition.

Уровень техникиState of the art

Биспецифические антитела к ангиопоэтину-2 (ANG-2)-2 и фактору роста эндотелия сосудов человека (VEGF, VEGF-A) (биспецифические антитела к VEGF/ANG2) представляют терапевтический интерес, в частности, в качестве лекарственных средств для лечения и профилактики лечения сосудистых заболеваний, включая сосудистое заболевание глаз. Биспецифические антитела к VEGF/ANG2 описаны, например, в WO 2010040508, WO 2011/117329 или WO 2014/009465. Эти антитела ингибируют связывание Vegf с рецептором VEGF и в то же время связывание ANG-2 с Tie2.Bispecific antibodies to angiopoietin-2 (ANG-2)-2 and human vascular endothelial growth factor (VEGF, VEGF-A) (bispecific antibodies to VEGF/ANG2) are of therapeutic interest, in particular as drugs for the treatment and prevention of treatment vascular diseases, including vascular eye disease. Bispecific antibodies to VEGF/ANG2 are described, for example, in WO 2010040508, WO 2011/117329 or WO 2014/009465. These antibodies inhibit the binding of Vegf to the VEGF receptor and at the same time the binding of ANG-2 to Tie2.

Молекулы антител, как часть группы белковых фармацевтических препаратов, очень предрасположены к физическому и химическому разложению. Химическое разложение включает любой процесс, который включает модификацию белка посредством образования или разрыва связи, что дает новое химическое вещество. Известно множество химических реакций, которые воздействуют на белки. Эти реакции могут включать гидролиз, включая разрыв пептидных связей, а также дезамидирование, изомеризацию, окисление и разложение. Физическое разложение относится к изменениям в структуре более высокого порядка и включает денатурацию, адсорбцию на поверхностях, агрегацию и осаждение. На стабильность белка влияют характеристики самого белка, например, аминокислотная последовательность, профиль гликозилирования, и внешние факторы, такие как температура, рН растворителя, вспомогательные вещества, поверхности контакта или скорости сдвига. Таким образом, важно определить оптимальные условия состава для защиты белка от реакций разложения при изготовлении, хранении и введении. (Manning, М.С, et al. (1989), "Stability of protein pharmaceuticals", Pharm Res 6(11), 903-918; Zheng, J. Y., Janis, L.J. (2005), "Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298", Int. J. Pharmaceutics 308, 46-51). Стабильные жидкие составы терапевтических антител особенно сложно получать, когда состав должен содержать антитела в высокой концентрации.Antibody molecules, as part of a group of protein pharmaceuticals, are highly susceptible to physical and chemical degradation. Chemical degradation involves any process that involves modifying a protein by forming or breaking a bond, resulting in a new chemical substance. There are many known chemical reactions that affect proteins. These reactions may include hydrolysis, including cleavage of peptide bonds, as well as deamidation, isomerization, oxidation, and degradation. Physical degradation refers to higher order changes in structure and includes denaturation, adsorption to surfaces, aggregation and precipitation. Protein stability is influenced by characteristics of the protein itself, such as amino acid sequence, glycosylation profile, and external factors such as temperature, solvent pH, excipients, contact surfaces, or shear rates. Thus, it is important to determine optimal formulation conditions to protect the protein from degradation reactions during manufacturing, storage, and administration. (Manning, M.S., et al. (1989), "Stability of protein pharmaceuticals", Pharm Res 6(11), 903-918; Zheng, J.Y., Janis, L.J. (2005), "Influence of pH, buffer species , and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298", Int. J. Pharmaceutics 308, 46-51). Stable liquid formulations of therapeutic antibodies are particularly difficult to prepare when the formulation must contain antibodies at high concentrations.

Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение жидкого, в частности, высококонцентрированного, состава биспецифического антитела к VEGF/ANG2 с как можно меньшим количеством необходимых вспомогательных веществ, который облегчает желаемое дозирование и обеспечивает удобное интравитреальное введение биспецифического антитела посредством тонких игл пациенту.It is therefore an object of the present invention to provide a liquid, particularly highly concentrated, anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody formulation with as few necessary excipients as possible, which facilitates desired dosing and allows convenient intravitreal administration of the bispecific antibody via fine needles to the patient.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящее изобретение относится к жидкому фармацевтическому составу биспецифического антитела к VEGF/ANG2, способу получения и применениям состава. В частности, фармацевтические составы настоящего изобретения предназначены для применения при интравитреальном введении для лечения офтальмологических заболеваний, таких как ВМД и ДМО.The present invention relates to a liquid pharmaceutical composition of a bispecific antibody to VEGF/ANG2, a method of preparation and uses of the composition. In particular, the pharmaceutical compositions of the present invention are intended for use by intravitreal administration for the treatment of ophthalmic diseases such as AMD and DME.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к жидкому фармацевтическому составу, содержащему:In one aspect, the present invention relates to a liquid pharmaceutical composition containing:

- от 20 до 150 мг/мл биспецифического антитела к VEGF/ANG2, содержащего константную область тяжелой цепи подкласса IgG1 человека,- from 20 to 150 mg/ml of a bispecific antibody to VEGF/ANG2 containing the heavy chain constant region of the human IgG1 subclass,

- от 15 до 35 мМ хлорида натрия,- from 15 to 35 mM sodium chloride,

- от 15 до 25 мМ гистидин-ацетатного буфера, при рН 5,5±0,5; где- from 15 to 25 mM histidine acetate buffer, at pH 5.5±0.5; Where

биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 является двухвалентным и содержит первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с ANG-2 человека, гдеThe anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody is bivalent and contains a first antigen binding site that specifically binds to human VEGF and a second antigen binding site that specifically binds to human ANG-2, where

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся с VEGF, содержит в вариабельном домене тяжелой цепи CDR3H-область с SEQ ID NO: 1, CDR2H-область с SEQ ID NO: 2 и CDR1H-область с SEQ ID NO: 3, а в вариабельном домене легкой цепи CDR3L-область с SEQ ID NO: 4, CDR2L-область с SEQ ID NO: 5 и CDR2L-область с SEQ ID NO: 6; иi) said first antigen-binding site specifically binding to VEGF contains, in the heavy chain variable domain, a CDR3H region with SEQ ID NO: 1, a CDR2H region with SEQ ID NO: 2 and a CDR1H region with SEQ ID NO: 3, and in light chain variable domain CDR3L region with SEQ ID NO: 4, CDR2L region with SEQ ID NO: 5 and CDR2L region with SEQ ID NO: 6; And

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся с ANG-2, содержит в вариабельном домене тяжелой цепи CDR3H-область с SEQ ID NO: 9, CDR2H-область с SEQ ID NO: 10 и CDR1H-область с SEQ ID NO: 11, и в вариабельном домене легкой цепи CDR3L-область с SEQ ID NO: 12, CDR2L-область с SEQ ID NO: 13 и CDR1L-область с SEQ ID NO: 14, и гдеii) said second antigen-binding site specifically binding to ANG-2 contains, in the heavy chain variable domain, a CDR3H region with SEQ ID NO: 9, a CDR2H region with SEQ ID NO: 10, and a CDR1H region with SEQ ID NO: 11, and in the light chain variable domain, the CDR3L region of SEQ ID NO: 12, the CDR2L region of SEQ ID NO: 13, and the CDR1L region of SEQ ID NO: 14, and where

iii) биспецифическое антитело содержит константную область тяжелой цепи подкласса IgG1 человека, содержащую мутации 1253А, Н310А и Н435А и мутации L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кабата).iii) the bispecific antibody contains the heavy chain constant region of the human IgG1 subclass, containing mutations 1253A, H310A and H435A and mutations L234A, L235A and P329G (numbered according to the Kabat EU index).

В одном варианте реализации биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 является двухвалентным и содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.In one embodiment, the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody is bivalent and comprises the amino acid sequences of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 20.

В одном варианте реализации биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 представляет собой фарицимаб.In one embodiment, the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody is faricimab.

В одном варианте реализации состав дополнительно содержитIn one embodiment, the composition further comprises

- от 1 до 20 мМ по меньшей мере одного стабилизатора.- from 1 to 20 mM of at least one stabilizer.

- 7,0 мМ ± 2,0 мМ метионина.- 7.0 mM ± 2.0 mM methionine.

- 0,01-0,07% (масс./об.) поверхностно-активного вещества.- 0.01-0.07% (w/v) surfactant.

- 0,04% (масс./об.) ± 0,02% (масс./об.) полисорбата 20.- 0.04% (wt./vol.) ± 0.02% (wt./vol.) polysorbate 20.

- 50-250 мМ регулятора тоничности.- 50-250 mM tonicity regulator.

- 160 мМ ± 24 мМ сахарозы.- 160 mM ± 24 mM sucrose.

В одном варианте реализации состав по существу не содержит видимые частицы.In one embodiment, the composition is substantially free of visible particles.

В одном варианте реализации состав представляет собой стабильный состав.In one embodiment, the composition is a stable composition.

В одном варианте реализации осмоляльность состава составляет 300±100 мОсм/кг.In one embodiment, the osmolality of the formulation is 300 ± 100 mOsm/kg.

В одном варианте реализации состав предназначен для интравитреального введения.In one embodiment, the composition is intended for intravitreal administration.

В одном аспекте состав предназначен для применения в лечении сосудистого заболевания глаз.In one aspect, the composition is for use in the treatment of vascular eye disease.

В одном варианте реализации сосудистое заболевание глаз выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии (ДР), диабетического макулярного отека (ДМО), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), макулярной дегенерации, влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД), ретинопатии недоношенных (РН), неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), ретинальной ангиоматозной пролиферации, макулярной телеангиэктазии, ишемической ретинопатии, неоваскуляризации радужной оболочки, внутриглазной неоваскуляризации, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки, хориоидальной неоваскуляризации и дегенерации сетчатки, в частности из группы, состоящей из диабетической ретинопатии (ДР), диабетического макулярного отека (ДМО), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД).In one embodiment, the vascular eye disease is selected from the group consisting of diabetic retinopathy (DR), diabetic macular edema (DME), retinal vein occlusion (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO), macular degeneration, wet age-related macular degeneration ( wet AMD), retinopathy of prematurity (ROP), neovascular glaucoma, retinitis pigmentosa (RP), retinal angiomatous proliferation, macular telangiectasia, ischemic retinopathy, iris neovascularization, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization and retinal degeneration, in particular from the group consisting of diabetic retinopathy (DR), diabetic macular edema (DME), retinal vein occlusion (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO), wet form of age-related macular degeneration (wet AMD).

Один аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения фармацевтического состава согласно настоящему изобретению.One aspect of the present invention is a method for preparing a pharmaceutical composition according to the present invention.

Один аспект настоящего изобретения представляет собой флакон, содержащий фармацевтический состав согласно настоящему изобретению.One aspect of the present invention is a vial containing a pharmaceutical composition according to the present invention.

Один аспект настоящего изобретения представляет собой предварительно заполненный шприц, содержащий фармацевтический состав согласно настоящему изобретению.One aspect of the present invention is a pre-filled syringe containing a pharmaceutical composition according to the present invention.

Один аспект настоящего изобретения представляет собой лиофилизированную форму жидкого фармацевтического состава согласно настоящему изобретению.One aspect of the present invention is a lyophilized form of a liquid pharmaceutical composition according to the present invention.

Настоящее изобретение обеспечивает жидкий фармацевтический состав биспецифического антитела к VEGF/ANG2 (с константной областью IgG1), который имеет полезные свойства, пригодные для офтальмологического применения и интравитреального введения: состав имеет низкую вязкость и низкую мутность (даже при высоких концентрациях, например, приблизительно 120 мг/л), состав стабильный и изотоничный. Это, в частности, достигается комбинацией 20-150 мг/мл (в частности, 100-140 мг/мл) биспецифического антитела к VEGF/ANG2, содержащего константную область тяжелой цепи подкласса IgG1 человека, как описано в настоящем документе, 15-35 мМ хлорида натрия и 15-25 мМ гистидинового буфера при рН 5,5±0,5.The present invention provides a liquid pharmaceutical composition of a bispecific antibody to VEGF/ANG2 (with IgG1 constant region) that has beneficial properties suitable for ophthalmic use and intravitreal administration: the composition has low viscosity and low turbidity (even at high concentrations, for example, approximately 120 mg /l), the composition is stable and isotonic. This is particularly achieved by a combination of 20-150 mg/ml (in particular 100-140 mg/ml) of a bispecific anti-VEGF/ANG2 antibody containing the heavy chain constant region of the human IgG1 subclass as described herein, 15-35 mM sodium chloride and 15-25 mM histidine buffer at pH 5.5±0.5.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

Фигура 1 Результаты по мутности (фиг. 1А) и вязкости (фиг. 1Б) составов из части I отбора рН/буфера. Фиг. 1 сравнивает результаты по мутности и вязкости составов из части I отбора рН/буфера (под столбиками: первая строка: №образца состава; вторая строка: значение рН; третья строка: буферная система; четвертая строка: ионная сила).Figure 1 Results for turbidity (Fig. 1A) and viscosity (Fig. 1B) of the formulations from part I of the pH/buffer selection. Fig. 1 compares the results for turbidity and viscosity of the compositions from part I of the pH/buffer selection (under the bars: first line: composition sample number; second line: pH value; third line: buffer system; fourth line: ionic strength).

Фигура 2 Результаты по мутности (фиг. 2А) и вязкости (фиг. 2Б) составов из части II отбора рН/буфера (под столбиками: первая строка: №образца состава; вторая строка: значение рН; третья строка: понизитель вязкости отсутствует (-), NaCl или CaCl2; четвертая строка: ионная сила).Figure 2 Results for turbidity (Fig. 2A) and viscosity (Fig. 2B) of the compositions from part II of pH/buffer selection (under the columns: first line: composition sample number; second line: pH value; third line: no viscosity reducer (- ), NaCl or CaCl2; fourth line: ionic strength).

Фигура 3 Высокомолекулярные соединения (ВМС) составов из части II отбора рН/буфера вначале и через 8 недель хранения при 5°С и 25°С (под столбиками: первая строка: №образца состава; вторая строка: значение рН; третья строка: понизитель вязкости отсутствует (-), NaCl или CaCl2; четвертая строка: ионная сила).Figure 3 High molecular weight compounds (HMCs) of the compositions from part II of pH/buffer selection at the beginning and after 8 weeks of storage at 5°C and 25°C (under the columns: first line: composition sample number; second line: pH value; third line: reducer no viscosity (-), NaCl or CaCl2; fourth line: ionic strength).

Фигура 4 Уровни высокомолекулярных соединений (ВМС) вначале и после механического стресса (под столбиками: первая строка: тип физического стресса; вторая строка: % поверхностно-активного вещества; третья строка: №образца состава).Figure 4 Levels of high molecular weight compounds (HMW) at the beginning and after mechanical stress (under the bars: first line: type of physical stress; second line: % surfactant; third line: composition sample no.).

Фигура 5 Мутность (фиг. 5А) и вязкость (фиг. 5Б) составов из отбора I вспомогательных веществ (под столбиками: первая строка: значение рН с NaCl в качестве понизителя вязкости, отсутствие (-) или присутствие (+) метионина в качестве стабилизатора; вторая строка: №образца состава).Figure 5 Turbidity (Fig. 5A) and viscosity (Fig. 5B) of compositions from selection I of excipients (under the bars: first row: pH value with NaCl as a viscosity reducer, absence (-) or presence (+) of methionine as a stabilizer ; second line: composition sample number).

Фигура 6 Уровни высокомолекулярных соединений (ВМС) вначале и при хранении при 5°С (под столбиками: первая строка: значение рН с NaCl в качестве понизителя вязкости, отсутствие (-) или присутствие (+) метионина в качестве стабилизатора; вторая строка: № образца состава).Figure 6 Levels of high molecular weight compounds (HMCs) at the beginning and during storage at 5°C (under the bars: first line: pH value with NaCl as a viscosity reducer, absence (-) or presence (+) of methionine as a stabilizer; second line: No. composition sample).

Фигура 7 Уровни высокомолекулярных соединений (ВМС) вначале и при хранении при 25°С (под столбиками: первая строка: значение рН с NaCl в качестве понизителя вязкости, отсутствие (-) или присутствие (+) метионина в качестве стабилизатора; вторая строка: №образца состава).Figure 7 Levels of high molecular weight compounds (HMCs) at the beginning and during storage at 25°C (under the bars: first line: pH value with NaCl as a viscosity reducer, absence (-) or presence (+) of methionine as a stabilizer; second line: No. composition sample).

Фигура 8 Уровни заряженных частиц (главный пик (фиг. 8А), кислотный пик (фиг. 8Б) и основной пик (фиг. 8В)) вначале и при хранении при 5°С (под столбиками: первая строка: значение рН с NaCl в качестве понизителя вязкости, отсутствие (-) или присутствие (+) метионина в качестве стабилизатора; вторая строка: №образца состава).Figure 8 Levels of charged species (main peak (Fig. 8A), acid peak (Fig. 8B) and main peak (Fig. 8B)) initially and during storage at 5°C (below the bars: first row: pH value with NaCl in as a viscosity reducer, absence (-) or presence (+) of methionine as a stabilizer; second line: composition sample number).

Фигура 9 Уровни заряженных частиц (главный пик (фиг. 9А), кислотный пик (фиг. 9Б) и основной пик (фиг. 9В)) вначале и при хранении при 25°С (под столбиками: первая строка: значение рН с NaCl в качестве понизителя вязкости; отсутствие (-) или присутствие (+) метионина в качестве стабилизатора; вторая строка: №образца состава).Figure 9 Levels of charged species (main peak (Fig. 9A), acid peak (Fig. 9B) and main peak (Fig. 9B)) initially and during storage at 25°C (below the bars: first row: pH value with NaCl in as a viscosity reducer; absence (-) or presence (+) of methionine as a stabilizer; second line: composition sample number).

Фигура 10 Мутность (фиг. 10А) и вязкость (фиг. 10Б) оптимизированного и эталонного состава с концентрацией белка 120 мг/мл из отбора II вспомогательных веществ.Figure 10 Turbidity (Fig. 10A) and viscosity (Fig. 10B) of the optimized and reference formulation with a protein concentration of 120 mg/ml from selection II of excipients.

Фигура 11 Мутность (фиг. 11А) и вязкость (фиг. 11Б) оптимизированного и эталонного состава с концентрацией белка 30 мг/мл из отбора II вспомогательных веществ.Figure 11 Turbidity (Fig. 11A) and viscosity (Fig. 11B) of the optimized and reference formulation with a protein concentration of 30 mg/ml from selection II of excipients.

Фигура 12 Уровни высокомолекулярных соединений (ВМС) вначале (левый столбик) и через 13 недель хранения при 5 (средний столбик) и 25°С (правый столбик) оптимизированного и эталонного состава с концентрацией белка 120 мг/мл.Figure 12 High molecular weight compound (HMW) levels initially (left column) and after 13 weeks of storage at 5 (middle column) and 25°C (right column) of the optimized and reference formulation with a protein concentration of 120 mg/ml.

Фигура 13 Уровни высокомолекулярных соединений (ВМС) вначале (левый столбик) и через 13 недель хранения при 5 (средний столбик) и 25°С (правый столбик) оптимизированного и эталонного состава с концентрацией белка 30 мг/мл.Figure 13 High molecular weight compound (HMW) levels initially (left column) and after 13 weeks of storage at 5 (middle column) and 25°C (right column) of the optimized and reference formulation with a protein concentration of 30 mg/ml.

Фигура 14 Уровни заряженных частиц (главный пик (фиг. 14А), кислотный пик (фиг. 14Б) и основной пик (фиг. 14В)) вначале (левый столбик) и через 13 недель хранения при 5 (средний столбик) и 25°С (правый столбик) оптимизированного и эталонного состава.Figure 14 Levels of charged species (main peak (Fig. 14A), acid peak (Fig. 14B) and main peak (Fig. 14B)) initially (left column) and after 13 weeks of storage at 5 (middle column) and 25°C (right column) optimized and reference composition.

Подробное описание сущности изобретенияDetailed description of the invention

Настоящее изобретение относится к жидкому фармацевтическому составу, содержащему биспецифическое антитело к VEGF/ANG2, содержащее константную область тяжелой цепи подкласса IgG1 человека.The present invention relates to a liquid pharmaceutical composition containing a bispecific antibody to VEGF/ANG2 containing the heavy chain constant region of the human IgG1 subclass.

Термин «фармацевтический состав» относится к препаратам, которые находятся в такой форме, чтобы обеспечивать однозначную эффективность биологической активности активных ингредиентов, и которые не содержат дополнительные компоненты, которые являются токсичными для субъектов, которым вводят состав.The term "pharmaceutical composition" refers to preparations that are in such a form as to provide unambiguous effectiveness of the biological activity of the active ingredients, and which do not contain additional components that are toxic to the subjects to whom the composition is administered.

Термин «жидкий» при использовании в настоящем документе применительно к составу согласно настоящему изобретению означает состав, который является жидким по меньшей мере при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 35°С (в одном варианте реализации - от приблизительно 2°С до приблизительно 25°С) при атмосферном давлении. Концентрация биспецифического антитела к VEGF/ANG2, содержащегося в фармацевтическом составе, находится в диапазоне от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл, в частности, концентрация составляет 120 мг/мл ± 18 мг/мл, более конкретно концентрация составляет 120 мг/мл ± 12 мг/мл. В другом варианте реализации концентрация может составлять 30 мг/мл ± 4,5 мг/мл.The term “liquid” as used herein in relation to a composition of the present invention means a composition that is liquid at least at a temperature of from about 2°C to about 35°C (in one embodiment, from about 2°C to about 25°C). °C) at atmospheric pressure. The concentration of the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody contained in the pharmaceutical composition ranges from about 20 mg/ml to about 150 mg/ml, in particular the concentration is 120 mg/ml ± 18 mg/ml, more particularly the concentration is 120 mg /ml ± 12 mg/ml. In another embodiment, the concentration may be 30 mg/ml ± 4.5 mg/ml.

При использовании в настоящем документе «антитело» относится к связывающему белку, который содержит антигенсвязывающие сайты. Термины «связывающий сайт» или «антигенсвязывающий сайт» при использовании в настоящем документе означают область(и) молекулы антитела, с которой фактически связывается лиганд. Термин «антигенсвязывающий сайт» включает вариабельные домены тяжелой цепи (VH) антитела и вариабельные домены легкой цепи (VL) антитела (пара VH/VL).As used herein, “antibody” refers to a binding protein that contains antigen binding sites. The terms "binding site" or "antigen binding site" as used herein mean the region(s) of the antibody molecule to which the ligand actually binds. The term "antigen binding site" includes the variable domains of the heavy chain (VH) of an antibody and the variable domains of the light chain (VL) of an antibody (VH/VL pair).

Специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Естественные антитела, например, являются моноспецифическими.Antibody specificity refers to the selective recognition by an antibody of a specific epitope of an antigen. Natural antibodies, for example, are monospecific.

«Биспецифические антитела» согласно настоящему изобретению представляют собой антитела, которые имеют две различные антигенсвязывающие специфичности. Антитела настоящего изобретения являются специфическими к двум различным антигенам, VEGF в качестве первого антигена и ANG-2 в качестве второго антигена."Bispecific antibodies" according to the present invention are antibodies that have two different antigen-binding specificities. The antibodies of the present invention are specific for two different antigens, VEGF as the first antigen and ANG-2 as the second antigen.

Термин «моноспецифическое» антитело при использовании в настоящем документе означает антитело, которое имеет один или более связывающих сайтов, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.The term "monospecific" antibody as used herein means an antibody that has one or more binding sites, each of which binds to the same epitope of the same antigen.

Термин «валентный» при использовании в настоящей заявке означает присутствие определенного числа связывающих сайтов в молекуле антитела. Таким образом, термины «двухвалентный», «четырехвалентный» и «шестивалентный» означают присутствие двух связывающих сайтов, четырех связывающих сайтов и шести связывающих сайтов, соответственно, в молекуле антитела. Биспецифические антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно являются «двухвалентными».The term "valency" as used herein means the presence of a certain number of binding sites in the antibody molecule. Thus, the terms "divalent", "tetravalent" and "hexavalent" mean the presence of two binding sites, four binding sites and six binding sites, respectively, in an antibody molecule. The bispecific antibodies of the present invention are preferably "divalent".

Термины «биспецифическое антитело, которое связывается с фактором роста эндотелия сосудов человека (VEGF) и с ангиопоэтином-2 (ANG-2) человека», «биспецифическое антитело к VEGF/ANG2» и «биспецифическое антитело <VEGF/ANG2>» при использовании в настоящем документе являются взаимозаменяемыми и относятся к антителу, которое имеет по меньшей мере два различных антигенсвязывающих сайта, один, который связывается с VEGF, и второй, который связывается с ANG2.The terms "bispecific antibody that binds to human vascular endothelial growth factor (VEGF) and human angiopoietin-2 (ANG-2), "VEGF/ANG2 bispecific antibody" and "<VEGF/ANG2> bispecific antibody" when used in herein are used interchangeably and refer to an antibody that has at least two different antigen binding sites, one that binds to VEGF and a second that binds to ANG2.

Биспецифические антитела к VEGF/ANG2 описаны, например, в WO 2010/040508, WO 2011/117329, WO 2012/131078, WO 2015/083978, WO 2017/197199 и WO 2014/009465. WO 2014/009465 описывает биспецифические антитела к VEGF/ANG2, специально разработанные для лечения сосудистых заболеваний глаз. Биспецифические антитела к VEGF/ANG2 из WO 2014/009465 (который включен в настоящий документ во всей своей полноте) являются особенно пригодными в лечении и в схемах лечения сосудистых заболеваний глаз, как описано в настоящем документе. В частности, антитело к VEGF/ANG2 CrossMAb VEGFang2-0016, как описано в WO 2014/009465, которое также описано как фарицимаб (в World Health Organization (2017). "International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN). Proposed INN: List 118" WHO Drug Information. 31 (4)), является предпочтительным биспецифическим антителом к VEGF/ANG2 настоящего изобретения.Bispecific antibodies to VEGF/ANG2 are described, for example, in WO 2010/040508, WO 2011/117329, WO 2012/131078, WO 2015/083978, WO 2017/197199 and WO 2014/009465. WO 2014/009465 describes bispecific antibodies to VEGF/ANG2 specifically designed for the treatment of vascular diseases of the eye. The anti-VEGF/ANG2 bispecific antibodies of WO 2014/009465 (which is incorporated herein in its entirety) are particularly useful in the treatment and treatment regimens for vascular diseases of the eye as described herein. Specifically, the anti-VEGF/ANG2 antibody CrossMAb VEGFang2-0016, as described in WO 2014/009465, which is also described as faricimab (in World Health Organization (2017). "International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN). Proposed INN: List 118" WHO Drug Information. 31(4)) is the preferred VEGF/ANG2 bispecific antibody of the present invention.

В одном варианте реализации биспецифическое антитело, которое связывается с фактором роста эндотелия сосудов человека (VEGF) и с ангиопоэтином-2 (ANG-2) человека, является биспецифическим антителом к VEGF/ANG2, содержащим первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с ANG-2 человека, гдеIn one embodiment, the bispecific antibody that binds to human vascular endothelial growth factor (VEGF) and human angiopoietin-2 (ANG-2) is a VEGF/ANG2 bispecific antibody containing a first antigen binding site that specifically binds to human VEGF, and a second antigen binding site that specifically binds to human ANG-2, where

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся с VEGF, содержит в вариабельном домене тяжелой цепи CDR3H-область с SEQ ID NO: 1, CDR2H-область с SEQ ID NO: 2 и CDR1H-область с SEQ ID NO: 3, а в вариабельном домене легкой цепи CDR3L-область с SEQ ID NO: 4, CDR2L-область с SEQ ID NO: 5 и CDR1L-область с SEQ ID NO: 6; иi) said first antigen-binding site specifically binding to VEGF contains, in the heavy chain variable domain, a CDR3H region with SEQ ID NO: 1, a CDR2H region with SEQ ID NO: 2 and a CDR1H region with SEQ ID NO: 3, and in light chain variable domain CDR3L region with SEQ ID NO: 4, CDR2L region with SEQ ID NO: 5 and CDR1L region with SEQ ID NO: 6; And

В одном варианте реализации такое биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 является двухвалентным.In one embodiment, such a bispecific anti-VEGF/ANG2 antibody is bivalent.

В одном варианте реализации такое биспецифическое двухвалентное антитело к VEGF/ANG2 характеризуется тем, чтоIn one embodiment, such a bispecific divalent anti-VEGF/ANG2 antibody is characterized in that

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся с VEGF, содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи VH аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, а в качестве вариабельного домена легкой цепи VL - аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, иi) said first antigen-binding site specifically binding to VEGF contains, as a VH heavy chain variable domain, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and as a VL light chain variable domain, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся с ANG-2, содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи VH аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, а в качестве вариабельного домена легкой цепи VL аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.ii) said second antigen-binding site specifically binding to ANG-2 contains, as a VH heavy chain variable domain, the amino acid sequence SEQ ID NO: 15, and as a VL light chain variable domain, the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.

В одном аспекте настоящего изобретения такое биспецифическое двухвалентное антитело согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что содержитIn one aspect of the present invention, such a bispecific divalent antibody according to the present invention is characterized in that it contains

а) тяжелую цепь и легкую цепь первого полноразмерного антитела, которое специфически связывается с VEGF;a) a heavy chain and a light chain of a first full-length antibody that specifically binds to VEGF;

б) модифицированную тяжелую цепь и модифицированную легкую цепь второго полноразмерного антитела, которое специфически связывается с ANG-2, где константные домены CL и СН1 заменяются друг другом.b) a modified heavy chain and a modified light chain of a second full-length antibody that specifically binds to ANG-2, where the CL and CH1 constant domains are replaced with each other.

Этот формат биспецифического двухвалентного антитела для биспецифического антитела, специфически связывающегося с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) человека и ангиопоэтином-2 (ANG-2) человека, описан в WO 2009/080253 (включая модифицированные по типу «выступы во впадины» домены СН3). Антитела на основе этого формата биспецифического двухвалентного антитела называются CrossMAb.This bispecific divalent antibody format for a bispecific antibody that specifically binds to human vascular endothelial growth factor (VEGF) and human angiopoietin-2 (ANG-2) is described in WO 2009/080253 (including modified ridge-to-groove CH3 domains) . Antibodies based on this bispecific divalent antibody format are called CrossMAb.

В одном варианте реализации такое биспецифическое двухвалентное антитело к VEGF/ANG2 характеризуется тем, что содержит:In one embodiment, such a bispecific divalent anti-VEGF/ANG2 antibody is characterized in that it contains:

а) в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, а в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, иa) as the heavy chain of the first full-length antibody, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and as the light chain of the first full-length antibody, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and

б) в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.b) as a modified heavy chain of the second full-length antibody, the amino acid sequence SEQ ID NO: 19, as a modified light chain of the second full-length antibody, the amino acid sequence SEQ ID NO: 20.

В одном варианте реализации такое биспецифическое, двухвалентное антитело к VEGF/ANG2 характеризуется тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.In one embodiment, such a bispecific, divalent anti-VEGF/ANG2 antibody is characterized by comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.

Следовательно, один вариант реализации настоящего изобретения представляет собой биспецифическое двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с ANG-2 человека, характеризующееся тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.Therefore, one embodiment of the present invention is a bispecific divalent antibody comprising a first antigen binding site that specifically binds to human VEGF and a second antigen binding site that specifically binds to human ANG-2, characterized in that it contains the amino acid sequences of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.

В одном варианте реализации домены СН3 биспецифического двухвалентного антитела согласно настоящему изобретению изменены по технологии «выступы во впадины», которая описана подробно с несколькими примерами, например, в WO 96/027011, Ridgway J.В., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; и Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. В этом способе поверхности контакта двух доменов СН3 изменяют для повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два домена СН3. Каждый из двух доменов СН3 (двух тяжелых цепей) может быть «выступом», тогда как другой является «впадиной». Введение дисульфидного мостика стабилизирует гетеродимеры (Merchant, А.М, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) и повышает выход.In one embodiment, the CH3 domains of a bispecific divalent antibody of the present invention are modified using a knob-to-valve technology, which is described in detail with several examples, for example, in WO 96/027011, Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 ( 1996) 617-621; and Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. In this method, the contact surfaces of two CH3 domains are modified to increase heterodimerization of both heavy chains containing the two CH3 domains. Each of the two CH3 domains (the two heavy chains) can be a "bump" while the other is a "cavity". The introduction of a disulfide bridge stabilizes heterodimers (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) and increases exit.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения биспецифические антитела к VEGF/ANG2 согласно настоящему изобретению характеризуются тем, чтоIn a preferred aspect of the present invention, the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibodies of the present invention are characterized in that

каждый из домена СН3 одной тяжелой цепи и домена СН3 другой тяжелой цепи стыкуются на поверхности контакта, которая содержит исходную поверхность контакта между доменами СН3 антитела;each of the CH3 domain of one heavy chain and the CH3 domain of the other heavy chain are docked at a contact surface that contains the original contact surface between the CH3 domains of the antibody;

где указанная поверхность контакта изменена для обеспечения образования биспецифического антитела, причем изменение характеризуется тем, что:wherein said contact surface is modified to provide the formation of a bispecific antibody, the modification being characterized in that:

а) домен СН3 одной тяжелой цепи изменен так,a) the CH3 domain of one heavy chain is changed so

чтобы в пределах исходной поверхности контакта домен СН3 одной тяжелой цепи, которая стыкуется с исходной поверхностью контакта домена СН3 другой тяжелой цепи в пределах биспецифического антитела,so that within the original contact surface of the CH3 domain of one heavy chain that docks with the original contact surface of the CH3 domain of another heavy chain within the bispecific antibody,

аминокислотный остаток заменялся на аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковых цепей, при этом образуя выступ в пределах поверхности контакта домена СН3 одной тяжелой цепи, который может располагаться в полости в пределах поверхности контакта домена СН3 другой тяжелой цепи,the amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a larger volume of side chains, while forming a protrusion within the contact surface of the CH3 domain of one heavy chain, which can be located in a cavity within the contact surface of the CH3 domain of another heavy chain,

иAnd

б) домен СН3 другой тяжелой цепи измени так,b) change the CH3 domain of another heavy chain so

чтобы в пределах исходной поверхности контакта второго домена СН3, который стыкуется с исходной поверхностью контакта первого домена СН3 в пределах биспецифического антитела,so that, within the original contact surface of a second CH3 domain that docks with the original contact surface of a first CH3 domain within the bispecific antibody,

аминокислотный остаток заменялся на аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковых цепей, при этом образуя полость в пределах поверхности контакта второго домена СН3, в котором может располагаться выступ в пределах поверхности контакта первого домена СН3. Таким образом, биспецифические антитела к VEGF/ANG2 для применения, описанного в настоящем документе, предпочтительно характеризуются тем, чтоthe amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a smaller volume of side chains, thereby forming a cavity within the contact surface of the second CH3 domain, in which a protrusion can be located within the contact surface of the first CH3 domain. Thus, bispecific antibodies to VEGF/ANG2 for use described herein are preferably characterized in that

каждый домен СН3 тяжелой цепи полноразмерного антитела из а) и домен СН3 тяжелой цепи полноразмерного антитела из б) стыкуются на поверхности контакта, которая содержит изменение в исходной поверхности контакта между доменами СН3 антитела;each full-length antibody heavy chain CH3 domain of a) and the full-length antibody heavy chain CH3 domain of b) are docked at a contact surface that contains a change in the original contact surface between the antibody CH3 domains;

где i) в домене СН3 одной тяжелой цепиwhere i) in the CH3 domain of one heavy chain

и гдеand where

ii) в домене СН3 другой тяжелой цепиii) in the CH3 domain of another heavy chain

аминокислотный остаток заменялся на аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковых цепей, при этом образуя полость в пределах поверхности контакта второго домена СН3, в котором может располагаться выступ в пределах поверхности контакта первого домена СН3.the amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a smaller volume of side chains, thereby forming a cavity within the contact surface of the second CH3 domain, in which a protrusion can be located within the contact surface of the first CH3 domain.

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковых цепей, выбирают из группы, состоящей из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W).Preferably, said amino acid residue having a larger volume of side chains is selected from the group consisting of arginine (R), phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W).

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковых цепей, выбирают из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (Т), валина (V).Preferably, said amino acid residue having a smaller amount of side chains is selected from the group consisting of alanine (A), serine (S), threonine (T), valine (V).

В одном аспекте настоящего изобретения оба домена СН3 дополнительно изменены путем введения цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующих положениях каждого домена СН3, так что между обоими доменами СН3 может образовываться дисульфидный мостик.In one aspect of the present invention, both CH3 domains are further modified by introducing cysteine (C) as an amino acid at corresponding positions of each CH3 domain so that a disulfide bridge can be formed between both CH3 domains.

В одном варианте реализации биспецифическое антитело содержит мутацию T366W в домене СН3 «цепи выступов» и мутации T366S, L368A, Y407V в домене СН3 «цепи впадин». Дополнительный дисульфидный мостик между цепями между доменами СН3 можно также использовать (Merchant, А.М, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), например, путем введения мутации S354C в домен СН3 и мутации Y349C в другой домен СН3.In one embodiment, the bispecific antibody contains the T366W mutation in the knob chain CH3 domain and the T366S, L368A, Y407V mutations in the trench chain CH3 domain. An additional interchain disulfide bridge between CH3 domains can also be used (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), for example, by introducing the S354C mutation into the CH3 domain and the Y349C mutation into another CH3 domain.

В другом предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело содержит мутации S354C и T366W в одном из двух доменов СН3 и мутации Y349C, T366S, L368A, Y407V в другом из двух доменов СН3. В другом предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух доменов СН3 и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в другом из двух доменов СН3 (дополнительная мутация Y349C или S354C в одном домене СН3 и дополнительная мутация S354C или Y349C в другом домене СН3, образующие дисульфидный мостик между цепями) (нумерация всегда согласно EU-индексу Кабата (Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).In another preferred embodiment, the bispecific antibody contains mutations S354C and T366W in one of the two CH3 domains and mutations Y349C, T366S, L368A, Y407V in the other of the two CH3 domains. In another preferred embodiment, the bispecific antibody contains mutations Y349C, T366W in one of two CH3 domains and mutations S354C, T366S, L368A, Y407V in the other of two CH3 domains (an additional mutation Y349C or S354C in one CH3 domain and an additional mutation S354C or Y349C in another CH3 domain, forming a disulfide bridge between the chains) (numbering is always according to the Kabat EU index (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, M. D. (1991).

Другие техники для модификаций СН3 для усиления гетеродимеризации рассматриваются как альтернативы настоящего изобретения и описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 и WO 2013/096291.Other techniques for modifying CH3 to enhance heterodimerization are considered alternatives to the present invention and are described, for example, in WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/ 129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 and WO 2013/096291.

В одном варианте реализации подход к гетеродимеризации, описанный в ЕР 1870459А1, используется альтернативно. Этот подход основан на введении замещений/мутаций заряженных аминокислот с противоположным зарядом в конкретных положениях аминокислот на поверхности раздела доменов СН3/СН3 между обеими тяжелыми цепями. Один предпочтительный вариант реализации для указанных мультиспецифических антител представляет мутации R409D и K370E аминокислот в домене СН3 одной тяжелой цепи и мутации D399K и E357K аминокислот в домене СН3 другой тяжелой цепи мультиспецифического антитела (нумерация согласно EU-индексу Кабата).In one embodiment, the heterodimerization approach described in EP 1870459A1 is used alternatively. This approach is based on introducing substitutions/mutations of charged amino acids with opposite charges at specific amino acid positions at the CH3/CH3 domain interface between both heavy chains. One preferred embodiment for these multispecific antibodies is the R409D and K370E amino acid mutations in the CH3 domain of one heavy chain and the D399K and E357K amino acid mutations in the CH3 domain of the other heavy chain of the multispecific antibody (Kabat EU index numbering).

В другом варианте реализации указанное мультиспецифическое антитело содержит мутацию T366W аминокислоты в домене СН3 «цепи выступов» и мутации T366S, L368A и Y407V аминокислот в домене СН3 «цепи впадин»; и дополнительно содержит мутации R409D и K370E аминокислот в домене СН3 «цепи выступов» и мутации D399K и E357K аминокислот в домене СН3 «цепи впадин».In another embodiment, the multispecific antibody comprises the T366W amino acid mutation in the "knob chain" CH3 domain and the T366S, L368A and Y407V amino acid mutations in the "groove chain" CH3 domain; and additionally contains mutations R409D and K370E of amino acids in the CH3 domain of the “knob chain” and mutations D399K and E357K of amino acids in the CH3 domain of the “groove chain”.

В одном варианте реализации подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2013/157953, используется альтернативно. В одном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи содержит мутацию Т366К аминокислоты, а домен СН3 другой тяжелой цепи содержит мутацию L351D аминокислоты. В дополнительном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи также содержит мутацию L351K аминокислоты. В дополнительном варианте реализации домен СН3 другой тяжелой цепи также содержит мутацию аминокислоты, выбранную из Y349E, Y349D и L368E (в одном варианте реализации L368E).In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2013/157953 is used alternatively. In one embodiment, the CH3 domain of one heavy chain contains the T366K amino acid mutation, and the CH3 domain of the other heavy chain contains the L351D amino acid mutation. In a further embodiment, the single heavy chain CH3 domain also contains the L351K amino acid mutation. In a further embodiment, the CH3 domain of the other heavy chain also contains an amino acid mutation selected from Y349E, Y349D, and L368E (in one embodiment, L368E).

В одном варианте реализации подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2012/058768, используется альтернативно. В одном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи содержит мутации L351Y и Y407A аминокислот, а домен СН3 другой тяжелой цепи содержит мутации Т366А и K409F аминокислот.В дополнительном варианте реализации домен СН3 другой тяжелой цепи также содержит мутацию аминокислоты в положении Т411, D399, S400, F405, N390 или К392. В одном варианте реализации указанную мутацию аминокислоты выбирают из группы, состоящей изIn one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2012/058768 is used alternatively. In one embodiment, the CH3 domain of one heavy chain contains the amino acid mutations L351Y and Y407A, and the CH3 domain of the other heavy chain contains the amino acid mutations T366A and K409F. In a further embodiment, the CH3 domain of the other heavy chain also contains an amino acid mutation at positions T411, D399, S400, F405, N390 or K392. In one embodiment, said amino acid mutation is selected from the group consisting of

а) T411N, T411R, T411Q, Т411К, T411D, Т411Е и T411W,a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E and T411W,

б) D399R, D399W, D399Y и D399K,b) D399R, D399W, D399Y and D399K,

в) S400E, S400D, S400R и S400K,c) S400E, S400D, S400R and S400K,

г) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V и F405W,d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V and F405W,

д) N390R, N390K и N390D,e) N390R, N390K and N390D,

е) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F и K392E.e) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F and K392E.

В дополнительном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи содержит мутации L351Y и Y407A аминокислот, а домен СН3 другой тяжелой цепи содержит мутации T366V и K409F аминокислот. В дополнительном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи содержит мутацию Y407A аминокислоты, а домен СН3 другой тяжелой цепи содержит мутации Т366А и K409F аминокислот. В дополнительном варианте реализации домен СН3 другой тяжелой цепи также содержит мутации K392E, Т411Е, D399R и S400R аминокислот.In a further embodiment, the CH3 domain of one heavy chain contains mutations of amino acids L351Y and Y407A, and the CH3 domain of the other heavy chain contains mutations of amino acids T366V and K409F. In a further embodiment, the CH3 domain of one heavy chain contains the amino acid Y407A mutation, and the CH3 domain of the other heavy chain contains the T366A and K409F amino acid mutations. In a further embodiment, the CH3 domain of the other heavy chain also contains the K392E, T411E, D399R and S400R amino acid mutations.

В одном варианте реализации подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2011/143545, используется альтернативно. В одном варианте реализации модификацию аминокислот согласно WO 2011/143545 вводят в домен СН3 тяжелой цепи в положении, выбранном из группы, состоящей из 368 и 409.In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2011/143545 is used alternatively. In one embodiment, an amino acid modification according to WO 2011/143545 is introduced into the CH3 domain of the heavy chain at a position selected from the group consisting of 368 and 409.

В одном варианте реализации подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2011/090762, который также использует технологию «выступы во впадины», описанную выше, используется альтернативно. В одном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи содержит мутацию T366W аминокислоты, а домен СН3 другой тяжелой цепи содержит мутацию Y407A аминокислоты. В одном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи содержит мутацию T366Y аминокислоты, а домен СН3 другой тяжелой цепи содержит мутацию Y407T аминокислоты.In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2011/090762, which also uses the peak-to-trough technology described above, is used alternatively. In one embodiment, the CH3 domain of one heavy chain contains the T366W amino acid mutation, and the CH3 domain of the other heavy chain contains the Y407A amino acid mutation. In one embodiment, the CH3 domain of one heavy chain contains the T366Y amino acid mutation, and the CH3 domain of the other heavy chain contains the Y407T amino acid mutation.

В одном варианте реализации полиспецифическое антитело представляет изотип IgG2, и подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2010/129304, используется альтернативно.In one embodiment, the multispecific antibody is of the IgG2 isotype, and the heterodimerization approach described in WO 2010/129304 is used alternatively.

В одном варианте реализации подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2009/089004, используется альтернативно. В одном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи содержит аминокислотную замену K392 или N392 на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном варианте реализации глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D); в дополнительном варианте реализации мутацию K392D или N392D), а домен СН3 другой тяжелой цепи содержит аминокислотную замену D399, Е356, D356 или Е357 на положительно заряженную аминокислоту (в одном варианте реализации лизин (К) или аргинин (R), в дополнительном варианте реализации замену D399K, Е356К, D356K или Е357К; а в еще одном дополнительном варианте реализации мутацию D399K или E356K). В дополнительном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи также содержит аминокислотную замену К409 или R409 на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном варианте реализации глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D); в дополнительном варианте реализации мутацию K409D или R409D). В дополнительном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи дополнительно или альтернативно содержит аминокислотную замену K439 и/или K370 на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном варианте реализации глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D)).In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2009/089004 is used alternatively. In one embodiment, the CH3 domain of one heavy chain contains an amino acid substitution of K392 or N392 with a negatively charged amino acid (in one embodiment, glutamic acid (E) or aspartic acid (D); in a further embodiment, the mutation K392D or N392D), and the CH3 domain of the other heavy chain contains an amino acid substitution D399, E356, D356, or E357 with a positively charged amino acid (in one embodiment, lysine (K) or arginine (R); in a further embodiment, a substitution D399K, E356K, D356K, or E357K; and in yet another embodiment implementation of the D399K or E356K mutation). In a further embodiment, the single heavy chain CH3 domain also contains an amino acid substitution of K409 or R409 with a negatively charged amino acid (in one embodiment, glutamic acid (E) or aspartic acid (D); in a further embodiment, the mutation K409D or R409D). In a further embodiment, the single heavy chain CH3 domain additionally or alternatively comprises an amino acid substitution of K439 and/or K370 with a negatively charged amino acid (in one embodiment, glutamic acid (E) or aspartic acid (D)).

В одном варианте реализации подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2007/147901, используется альтернативно. В одном варианте реализации домен СН3 одной тяжелой цепи содержит мутации K253E, D282K и K322D аминокислот, а домен СН3 другой тяжелой цепи содержит мутации D239K, Е240К и K292D аминокислот.In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2007/147901 is used alternatively. In one embodiment, the CH3 domain of one heavy chain contains the K253E, D282K, and K322D amino acid mutations, and the other heavy chain CH3 domain contains the D239K, E240K, and K292D amino acid mutations.

В одном варианте реализации подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2007/110205, используется альтернативно.In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2007/110205 is used alternatively.

В одном предпочтительном варианте реализации такое биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 является двухвалентным.In one preferred embodiment, such a bispecific anti-VEGF/ANG2 antibody is bivalent.

В одном варианте реализации биспецифическое двухвалентное антитело,In one embodiment, a bispecific divalent antibody,

которое связывается с фактором роста эндотелия сосудов человека (VEGF) и с ангиопоэтином-2 (ANG-2) человека, является биспецифическим антителом к VEGF/ANG2, содержащим первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с ANG-2 человека, гдеwhich binds to human vascular endothelial growth factor (VEGF) and human angiopoietin-2 (ANG-2), is a VEGF/ANG2 bispecific antibody containing a first antigen-binding site that specifically binds to human VEGF and a second antigen-binding site that specifically contacts the person's ANG-2, where

iii) биспецифическое антитело содержит константную область тяжелой цепи подкласса IgG1 человека, содержащую мутации 1253А, Н310А и Н435А и мутации L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кабата); и гдеiii) the bispecific antibody contains a heavy chain constant region of the human IgG1 subclass containing mutations 1253A, H310A and H435A and mutations L234A, L235A and P329G (numbered according to the Kabat EU index); and where

iv) в константной области тяжелой цепи мутация T366W содержится вiv) in the heavy chain constant region, the T366W mutation is contained in

одном домене СН3, а мутации T366S, L368A, Y407V содержатся в другом домене СН3 (нумерация согласно EU-индексу Кабата). В одном варианте реализации биспецифическое двухвалентное антитело,one CH3 domain, and mutations T366S, L368A, Y407V are contained in another CH3 domain (numbering according to the Kabat EU index). In one embodiment, a bispecific divalent antibody,

i) указанный первый антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся с VEGF, содержит в вариабельном домене тяжелой цепи CDRSH-область с SEQ ID NO: 1, CDR2H-область с SEQ ID NO: 2 и CDR1H-область с SEQ ID NO: 3, а в вариабельном домене легкой цепи CDRSL-область с SEQ ID NO: 4, CDR2L-область с SEQ ID NO: 5 и CDR1L-область с SEQ ID NO: 6; иi) said first antigen-binding site specifically binding to VEGF comprises, in the heavy chain variable domain, a CDRSH region of SEQ ID NO: 1, a CDR2H region of SEQ ID NO: 2, and a CDR1H region of SEQ ID NO: 3, and in light chain variable domain CDRSL region with SEQ ID NO: 4, CDR2L region with SEQ ID NO: 5 and CDR1L region with SEQ ID NO: 6; And

iv) в константной области тяжелой цепи мутации S354C и T366W содержатся в одном домене СН3, а мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V содержатся в другом домене СН3 (нумерация согласно EU-индексу Кабата).iv) in the heavy chain constant region, mutations S354C and T366W are contained in one CH3 domain, and mutations Y349C, T366S, L368A and Y407V are contained in another CH3 domain (numbered according to the Kabat EU index).

В одном предпочтительном варианте реализации такое биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 представляет собой фарицимаб.In one preferred embodiment, the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody is faricimab.

Термин «VEGF» при использовании в настоящем документе относится к фактору роста эндотелия сосудов человека (VEGF/VEGF-A), фактору роста эндотелиальных клеток сосудов человека из 165 аминокислот (аминокислоты 27-191 последовательности предшественника VEGF165 человека: SEQ ID NO: 25; аминокислоты 1-26 представляют сигнальный белок) и родственным изоформам 121, 189 и 206 фактора роста эндотелиальных клеток сосудов, как описано в Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9; Houck et al., Mol. Endocrin. 5 (1991) 1806-1814; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12, и Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24; вместе с встречающимися в природе аллельными и процессированными формами этих факторов роста. VEGF вовлечен в регуляцию нормального и атипичного ангиогенеза и неоваскуляризации, связанных с опухолями и внутриглазными заболеваниями (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A.,et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; и Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF представляет собой гомодимерный гликопротеин, который был выделен из нескольких источников и содержит несколько изоформ. VEGF показывает высокоспецифическую митогенную активность относительно эндотелиальных клеток. Антагонист/ингибитор VEGF ингибирует связывание VEGF с его рецептором VEGFR. Известные антагонисты/ингибиторы VEGF включают биспецифические антитела к VEGF/ANG2, как описано в WO 2014/009465.The term “VEGF” as used herein refers to human vascular endothelial growth factor (VEGF/VEGF-A), a 165 amino acid human vascular endothelial cell growth factor (amino acids 27-191 of the human VEGF165 precursor sequence: SEQ ID NO: 25; amino acids 1-26 represent a signaling protein) and related vascular endothelial cell growth factor isoforms 121, 189 and 206, as described in Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9; Houck et al., Mol. Endocrin. 5 (1991) 1806-1814; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12, and Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24; together with naturally occurring allelic and processed forms of these growth factors. VEGF is involved in the regulation of normal and atypical angiogenesis and neovascularization associated with tumors and intraocular diseases (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L. F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L. F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern , J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; and Dvorak, H. F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF is a homodimeric glycoprotein that has been isolated from several sources and contains multiple isoforms. VEGF shows highly specific mitogenic activity against endothelial cells. A VEGF antagonist/inhibitor inhibits the binding of VEGF to its receptor VEGFR. Known VEGF antagonists/inhibitors include bispecific antibodies to VEGF/ANG2, as described in WO 2014/009465.

Термин «ANG-2» при использовании в настоящем документе относится к ангиопоэтину-2 (ANG-2) человека (альтернативно имеет сокращение ANGPT2 или ANG2) (SEQ ID NO: 24), который описан, например, в Maisonpierre, Р.С, et al, Science 277 (1997) 55-60, и Cheung, А.Н., et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Ангиопоэтины 1 и 2 были обнаружены как лиганды к Tie, семейству тирозинкиназ, которые селективно экспрессируются в эндотелии сосудов (Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48). Сейчас существует четыре точно определенных члена семейства ангиопоэтинов. Ангиопоэтины 3 и 4 (Ang-3 и Ang-4) могут представлять сильно отличающиеся аналоги одного и того же локуса гена у мышей и человека (Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28). ANG-1 и ANG-2 были первоначально идентифицированы при экспериментах на культурах тканей в виде агониста и антагониста, соответственно (см. для ANG-1: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; а для ANG-2: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60). Все из известных ангиопоэтинов связываются в первую очередь со своим рецептором TIE2, и как Ang-1, так и Ang-2 связываются с TIE2 с аффинностью 3 нМ (Kd) (Maisonpierre, Р.О, et al., Science 277 (1997) 55-60). Антагонист/ингибитор ANG2 ингибирует связывание ANG2 с его рецептором TIE2. Известные антагонисты/ингибиторы ANG2 включают биспецифические антитела к VEGF/ANG2, как описано в WO 2014/009465.The term "ANG-2" as used herein refers to human angiopoietin-2 (ANG-2) (alternatively abbreviated ANGPT2 or ANG2) (SEQ ID NO: 24), which is described, for example, in Maisonpierre, R.C. et al., Science 277 (1997) 55-60, and Cheung, A. N., et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Angiopoietins 1 and 2 have been discovered as ligands for Tie, a family of tyrosine kinases that are selectively expressed in vascular endothelium (Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48). There are now four well-defined members of the angiopoietin family. Angiopoietins 3 and 4 (Ang-3 and Ang-4) may represent very different counterparts of the same gene locus in mice and humans (Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim , I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28). ANG-1 and ANG-2 were originally identified in tissue culture experiments as agonist and antagonist, respectively (see for ANG-1: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; and for ANG-2: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60). All known angiopoietins bind primarily to their receptor TIE2, and both Ang-1 and Ang-2 bind to TIE2 with an affinity of 3 nM (Kd) (Maisonpierre, R. O, et al., Science 277 (1997) 55-60). An ANG2 antagonist/inhibitor inhibits the binding of ANG2 to its receptor TIE2. Known ANG2 antagonists/inhibitors include bispecific antibodies to VEGF/ANG2, as described in WO 2014/009465.

Антигенсвязывающие сайты биспецифического антитела настоящего изобретения содержат шесть определяющих комплементарность областей (CDR), которые вносят в различной степени вклад в аффинность связывающего сайта для антигена. Существуют три вариабельных домена CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три вариабельных домена CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Размер CDR и каркасные области (FR) определяются сравнением с собранной базой данных аминокислотных последовательностей, в которой эти области были определены согласно вариабельности среди последовательностей.The antigen binding sites of the bispecific antibody of the present invention contain six complementarity determining regions (CDRs) that contribute to varying degrees to the affinity of the binding site for the antigen. There are three heavy chain CDR variable domains (CDRH1, CDRH2 and CDRH3) and three light chain CDR variable domains (CDRL1, CDRL2 and CDRL3). The size of the CDRs and framework regions (FRs) are determined by comparison with a compiled database of amino acid sequences in which these regions have been defined according to variability among sequences.

Антитела настоящего изобретения содержат константные области иммуноглобулина, полученные из иммуноглобулина класса IgG1 человека.The antibodies of the present invention contain immunoglobulin constant regions derived from human IgG1 immunoglobulin.

Термины «моноклональное антитело» или «состав моноклонального антитела» при использовании в настоящем документе относятся к препарату молекул антител с одним аминокислотным составом.The terms “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody composition” as used herein refer to a preparation of antibody molecules with a single amino acid composition.

Термин «химерное антитело» относится к антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, из одного источника или вида и, по меньшей мере, часть константной области, полученную из другого источника или вида, обычно полученную путем технологий рекомбинантной ДНК. Химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область, представляют особый интерес.Другие формы «химерных антител», охватываемые настоящим изобретением, представляют такие, в которых константная область была модифицирована или изменена относительно таковой в исходном антителе для получения желаемых свойств согласно настоящему изобретению, особенно в отношении связывания с C1q и/или связывания с рецептором Fc (FcR). Такие химерные антитела также называются «антителами с переключенным классом». Химерные антитела являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулинов, и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулинов. Способы получения химерных антител включают обычные технологии рекомбинантной ДНК и генной трансфекции и хорошо известны в данной области. См., например, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; патенты США №5202238 и №5204244.The term "chimeric antibody" refers to an antibody containing a variable region, i.e. a binding region from one source or species and at least a portion of a constant region derived from another source or species, typically obtained by recombinant DNA technologies. Chimeric antibodies containing a murine variable region and a human constant region are of particular interest. Other forms of "chimeric antibodies" covered by the present invention are those in which the constant region has been modified or changed from that of the parent antibody to obtain the desired properties of the present invention , especially in relation to binding to C1q and/or binding to the Fc receptor (FcR). Such chimeric antibodies are also called "class switched antibodies". Chimeric antibodies are the product of expressed immunoglobulin genes containing DNA segments encoding immunoglobulin variable regions and DNA segments encoding immunoglobulin constant regions. Methods for producing chimeric antibodies include conventional recombinant DNA and gene transfection technologies and are well known in the art. See, for example, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US patents No. 5202238 and No. 5204244.

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасные области или «определяющие комплементарность области» (CDR) были модифицированы так, чтобы содержать CDR иммуноглобулина с отличной специфичностью по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном варианте реализации мышиная CDR прививается в каркасную область антитела человека для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; и Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Особенно предпочтительные CDR соответствуют таким, которые представляют последовательности, распознающие антигены, указанные выше для химерных антител. Другие формы «гуманизированных антител», охватываемые настоящим изобретением, представляют такие, в которых константная область была дополнительно модифицирована или изменена относительно таковой в исходном антителе для получения свойств согласно настоящему изобретению, особенно в отношении связывания с C1q и/или связывания с рецептором Fc (FcR).The term “humanized antibody” refers to antibodies in which the framework regions or “complementarity determining regions” (CDRs) have been modified to contain the CDRs of an immunoglobulin with different specificity compared to the parent immunoglobulin. In a preferred embodiment, a mouse CDR is grafted into the framework region of a human antibody to produce a “humanized antibody.” See, for example, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Particularly preferred CDRs correspond to those representing the antigen recognition sequences mentioned above for chimeric antibodies. Other forms of "humanized antibodies" embraced by the present invention are those in which the constant region has been further modified or altered from that of the parent antibody to obtain the properties of the present invention, particularly with respect to binding to C1q and/or binding to the Fc receptor (FcR ).

Термин «антитело человека» при использовании в настоящем документе предназначен включать антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевых линий человека. Антитела человека хорошо известны в данной области техники (van Dijk, М.А., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Антитела человека можно также получать у трансгенных животных (например, мышей), которые могут при иммунизации продуцировать полный набор или выборку антител человека в отсутствие продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. Перенос генной матрицы иммуноглобулинов зародышевых линий человека у таких мышей с мутантной зародышевой линией будет приводить к продуцированию антител человека при антигенной стимуляции (см., например, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Антитела человека можно также получать в фаг-дисплейных библиотеках (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Технологии Cole и соавт.и Boerner и соавт.также доступны для получения моноклональных антител человека (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); и Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Как уже упоминалось для химерных и гуманизированных антител согласно настоящему изобретению, термин «антитело человека» при использовании в настоящем документе также включает такие антитела, которые модифицированы в константной области для получения свойств согласно настоящему изобретению, особенно в отношении связывания Clq и/или связывания с FcR, например, путем «переключения класса», т.е. изменения или мутации частей Fc (например, с IgG1 на IgG4 и/или мутация IgG1/IgG4).The term "human antibody" as used herein is intended to include antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies are well known in the art (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Human antibodies can also be obtained from transgenic animals (eg, mice), which can, when immunized, produce a full complement or selection of human antibodies in the absence of production of endogenous immunoglobulins. Transfer of a human germline immunoglobulin gene template into such germline mutant mice will result in the production of human antibodies upon antigen stimulation (see, e.g., Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993 ) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Human antibodies can also be generated from phage display libraries (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). The technologies of Cole et al. and Boerner et al. are also available for the production of human monoclonal antibodies (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al. , J. Immunol. 147 (1991) 86-95). As already mentioned for the chimeric and humanized antibodies of the present invention, the term "human antibody" as used herein also includes those antibodies that are modified in the constant region to obtain the properties of the present invention, particularly with respect to Clq binding and/or FcR binding , for example, by "class switching", i.e. changes or mutations of Fc parts (for example, from IgG1 to IgG4 and/or IgG1/IgG4 mutation).

Термин «рекомбинантное антитело человека» при использовании в настоящем документе предназначен включать все антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как клетка NS0 или СНО, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным в отношении генов иммуноглобулинов человека, или антитела, экспрессированные при помощи рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека согласно настоящему изобретению подвергались in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют последовательности, которые, хотя получены из и являются родственными последовательностям VH и VL зародышевых линий человека, не могут естественным образом существовать в наборе зародышевых линий антитела человека in vivo.The term "recombinant human antibody" as used herein is intended to include all human antibodies that are produced, expressed, engineered or isolated by recombinant means, such as antibodies isolated from a host cell, such as an NS0 or CHO cell, or from an animal (eg , mouse) that is transgenic for human immunoglobulin genes, or antibodies expressed using a recombinant expression vector transfected into a host cell. Such recombinant human antibodies have variable and constant regions in rearranged form. The recombinant human antibodies of the present invention have undergone somatic hypermutation in vivo. Thus, the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies represent sequences that, although derived from and related to human germline VH and VL sequences, would not naturally exist in the human antibody germline repertoire in vivo.

«Вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (V_L), вариабельная область тяжелой цепи (V_H)) или «вариабельный домен» при использовании в настоящем документе означает каждую из пар доменов легких и тяжелых цепей, которые вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасные области (FR), последовательности которых являются в значительной степени консервативными, соединенные тремя «гипервариабельными областями» (или определяющими комплементарность областями, CDR). Каркасные области принимают β-складчатую конформацию, a CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи удерживаются в своей трехмерной структуре при помощи каркасных областей и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий сайт. CDR3-области тяжелых и легких цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности/аффинности связывания антител согласно настоящему изобретению. Термин «антигенсвязывающая часть антитела» при использовании в настоящем документе относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность областей» или «CDR». «Каркасные» области или «FR» являются областями вариабельных доменов, не относящихся к остаткам гипервариабельной области, как определено в данном документе. Таким образом, вариабельные домены тяжелых и легких цепей антитела содержат от N- до С-конца домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи представляет собой область, которая обеспечивает главным образом связывание антигена и определяет свойства антитела. Области CDR и FR определяются согласно стандартному определению из Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), и/или их остаткам из «гипервариабельной петли»."Variable region" (variable light chain region ( _VL ), variable heavy chain region ( _VH )) or "variable domain" as used herein means each of the pairs of light and heavy chain domains that are directly involved in the binding of an antibody to antigen. The light and heavy chain variable domains have the same general structure, and each domain contains four framework regions (FRs), the sequences of which are largely conserved, connected by three “hypervariable regions” (or complementarity determining regions, CDRs). The framework regions adopt a β-sheet conformation, and the CDRs can form loops connecting the β-sheet structure. The CDRs on each strand are held in their three-dimensional structure by framework regions and, together with the CDRs from the other strand, form an antigen-binding site. The CDR3 regions of the antibody heavy and light chains play a particularly important role in the binding specificity/affinity of the antibodies of the present invention. The term "antigen-binding portion of an antibody" as used herein refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for binding antigen. The antigen-binding portion of an antibody contains amino acid residues from the "complementarity determining regions" or "CDRs". "Framework" regions or "FRs" are regions of variable domains other than hypervariable region residues as defined herein. Thus, the variable domains of the heavy and light chains of an antibody contain from N- to C-terminus the domains FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. In particular, the heavy chain CDR3 is the region that primarily mediates antigen binding and determines the properties of the antibody. The CDR and FR regions are defined according to the standard definition from Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), and/or their hypervariable loop residues "

Термин «эпитоп» включает любую полипептидную детерминанту, способную специфически связываться с антителом. В некоторых вариантах реализации детерминанта-эпитоп включает химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорил или сульфонил, а в некоторых вариантах реализации может иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические зарядные характеристики. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антителом.The term "epitope" includes any polypeptide determinant capable of specifically binding to an antibody. In some embodiments, the epitope determinant includes reactive surface moieties of molecules such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl, or sulfonyl, and in some embodiments may have specific three-dimensional structural characteristics and/or specific charging characteristics. An epitope is the region of an antigen that is bound by an antibody.

Термин «полноразмерное антитело» означает антитело, состоящее из двух «тяжелых цепей полноразмерного антитела» и двух «легких цепей полноразмерного антитела». «Тяжелая цепь полноразмерного антитела» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца до С-конца из вариабельного домена (VH) тяжелой цепи антитела, константного домена 1 (СН1) тяжелой цепи антитела, шарнирной области (HR) антитела, константного домена 2 (СН2) тяжелой цепи антитела и константного домена 3 (СН3) тяжелой цепи антитела, который сокращенно называется VH-CH1-HR-СН2-СН3; и необязательно константного домена 4 (СН4) тяжелой цепи антитела в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно «тяжелая цепь полноразмерного антитела» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца до С-конца из VH, CHI, HR, СН2 и СН3. «Легкая цепь полноразмерного антитела» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца до С-конца из вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела и константного домена легкой цепи (CL) антитела, что сокращенно называется VL-CL. Константный домен легкой цепи (CL) антитела может быть каппа или лямбда. Две цепи полноразмерного антитела связаны вместе посредством дисульфидных связей между полипептидами между доменом CL и доменом СН1 и между шарнирными областями тяжелых цепей полноразмерного антитела. Примеры типичных полноразмерных антител представляют естественные антитела, такие как IgG (например, IgG1 и IgG2), IgM, IgA, IgD и IgE. Полноразмерные антитела согласно настоящему изобретению могут быть от одного вида, например, человека, или они могут быть химерными или гуманизированными антителами. Полноразмерные антитела согласно настоящему изобретению содержат два антигенсвязывающих сайта, каждый образован парой VH и VL, оба из которых специфически связываются с одним и тем же антигеном. С-конец тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела означает последнюю аминокислоту на С-конце указанной тяжелой или легкой цепи. N-конец тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела означает последнюю аминокислоту на N-конце указанной тяжелой или легкой цепи.The term “full-length antibody” means an antibody consisting of two “full-length antibody heavy chains” and two “full-length antibody light chains.” A “full-length antibody heavy chain” is a polypeptide consisting, from N-terminus to C-terminus, of an antibody heavy chain variable domain (VH), an antibody heavy chain constant domain 1 (CH1), an antibody hinge region (HR), a constant domain 2 (CH2) of the antibody heavy chain and constant domain 3 (CH3) of the antibody heavy chain, which is abbreviated as VH-CH1-HR-CH2-CH3; and optionally the antibody heavy chain constant domain 4 (CH4) in the case of an antibody of the IgE subclass. Preferably, the "full-length antibody heavy chain" is a polypeptide consisting in the N-terminal to C-terminal direction of VH, CHI, HR, CH2 and CH3. A “full-length antibody light chain” is a polypeptide consisting, from N-terminus to C-terminus, of an antibody light chain variable domain (VL) and an antibody light chain constant domain (CL), abbreviated as VL-CL. The light chain (CL) constant domain of an antibody can be kappa or lambda. The two chains of a full-length antibody are linked together through polypeptide disulfide bonds between the CL domain and the CH1 domain and between the hinge regions of the full-length antibody heavy chains. Examples of typical full-length antibodies include natural antibodies such as IgG (eg, IgG1 and IgG2), IgM, IgA, IgD, and IgE. Full length antibodies of the present invention may be from a single species, such as human, or they may be chimeric or humanized antibodies. Full length antibodies of the present invention contain two antigen binding sites, each formed by a pair of VH and VL, both of which specifically bind to the same antigen. The C-terminus of the heavy or light chain of the specified full-length antibody means the last amino acid at the C-terminus of the specified heavy or light chain. The N-terminus of the heavy or light chain of the specified full-length antibody means the last amino acid at the N-terminus of the specified heavy or light chain.

Термин «константная область» или «константные домены» при использовании в рамках текущих применений означает сумму доменов антитела, отличных от вариабельной области. Константная область не вовлечена непосредственно в связывание антигена, а проявляет различные эффекторные функции. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела разделяются на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы, такие как IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам антител, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Константные области легкой цепи, которые можно обнаружить во всех пяти классах антител, называются каппа и лямбда.The term "constant region" or "constant domains" as used in current applications means the sum of the domains of an antibody other than the variable region. The constant region is not directly involved in antigen binding, but exhibits various effector functions. Depending on the amino acid sequence of the constant region of the heavy chains, antibodies are divided into classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and some of them can be further divided into subclasses such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, IgA1 and IgA2. The heavy chain constant regions that correspond to different classes of antibodies are called alpha, delta, epsilon, gamma and mu, respectively. The light chain constant regions that can be found in all five classes of antibodies are called kappa and lambda.

Термин «константная область человеческого происхождения» при использовании в настоящей заявке означает константную область тяжелой цепи антитела человека подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и/или константную область каппа или лямбда легкой цепи. Такие константные области хорошо известны в данной области техники и, например, описаны у Kabat, Е. А. (см., например, Johnson, G., and Wu, Т.Т., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E. A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788).The term "constant region of human origin" as used herein means the heavy chain constant region of a human antibody of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subclass and/or the kappa or lambda light chain constant region. Such constant regions are well known in the art and, for example, are described in Kabat, E. A. (see, for example, Johnson, G., and Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214- 218; Kabat, E. A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788).

Термин константный домен (или область) тяжелой цепи при использовании в настоящем документе определяет С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи.The term heavy chain constant domain (or region) as used herein defines the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of the heavy chain constant region.

Термин включает нативные последовательности константных доменов тяжелой цепи и вариантные константные домены тяжелой цепи. Вариантные константные домены тяжелой цепи включают, например, мутации в константных доменах, которые используются для содействия гетеродимеризации, как описано выше для технологии выступы во впадины. Также могут быть включены другие мутации, такие как, например, L234A (Leu235Ala), L235A (Leu234Ala) и P329G (Pro329Gly), так как константные домены с такими мутациями имеют сниженное связывание с FcR (в частности, они больше не демонстрируют связывание с FcR-гамма-I, FcR-гамма-II и FcR-гамма-Ш). Это особенно пригодно для снижения потенциальных побочных эффектов, таких как, например, тромбоз (Meyer, Т., et al., J. Thromb. Haemost. 7 (2009) 171-81). Кроме того, например, также мутации 1253А, Н310А и Н435А (нумерация согласно EU-индексу Кабата) могут быть включены в константный домен, поскольку константные домены с такими мутациями имеют сниженное связывание с FcRn (одна или две мутации) или устраненное связывание с FcRn (все 3 мутации).The term includes native heavy chain constant domain sequences and variant heavy chain constant domains. Variant heavy chain constant domains include, for example, mutations in the constant domains that are used to promote heterodimerization, as described above for the ridge-to-hole technology. Other mutations may also be included, such as for example L234A (Leu235Ala), L235A (Leu234Ala) and P329G (Pro329Gly), since constant domains with such mutations have reduced FcR binding (in particular, they no longer show FcR binding -gamma-I, FcR-gamma-II and FcR-gamma-III). This is particularly useful for reducing potential side effects such as, for example, thrombosis (Meyer, T., et al., J. Thromb. Haemost. 7 (2009) 171-81). In addition, for example, also mutations 1253A, H310A and H435A (numbered according to the Kabat EU index) can be included in the constant domain, since constant domains with such mutations have reduced binding to FcRn (one or two mutations) or eliminated binding to FcRn ( all 3 mutations).

В одном аспекте константная область тяжелой цепи IgG человека идет от аланина 118 (А118) (нумерация согласно EU-индексу Кабата) до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако антитела, продуцируемые клетками-хозяевами, могут подвергаться посттрансляционному отщеплению одной или более, в частности одной или двух, аминокислот от С-конца тяжелой цепи. Таким образом, антитело, продуцируемое клеткой-хозяином путем экспрессии специфической молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную тяжелую цепь, может содержать полноразмерную тяжелую цепь, или оно может содержать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи. Это может быть случай, в котором конечные две аминокислоты С-конца тяжелой цепи представляют собой глицин (G446) и лизин (К447, нумерация согласно EU-индексу). Таким образом, лизин (Lys447) на С-конце или глицин (Gly446) и лизин (Lys447) на С-конце константного домена тяжелой цепи могут присутствовать или могут не присутствовать. Аминокислотные последовательности тяжелых цепей, включающих константный домен тяжелой цепи, обозначаются в настоящем документе как С-концевой дипептид глицин-лизин, если не указано иное.In one aspect, the human IgG heavy chain constant region extends from alanine 118 (A118) (Kabat EU index numbering) to the carboxyl terminus of the heavy chain. However, antibodies produced by host cells may undergo post-translational cleavage of one or more, in particular one or two, amino acids from the C-terminus of the heavy chain. Thus, an antibody produced by a host cell by expressing a specific nucleic acid molecule encoding a full-length heavy chain may contain a full-length heavy chain, or it may contain a cleaved version of a full-length heavy chain. This may be the case in which the final two amino acids at the C-terminus of the heavy chain are glycine (G446) and lysine (K447, EU numbering). Thus, lysine (Lys447) at the C-terminus or glycine (Gly446) and lysine (Lys447) at the C-terminus of the heavy chain constant domain may or may not be present. The amino acid sequences of the heavy chains comprising the heavy chain constant domain are referred to herein as C-terminal glycine-lysine dipeptide unless otherwise indicated.

«Стабильный» состав представляет собой такой, в котором белок, например, антитело, по существу сохраняет свою физическую и химическую стабильность и, таким образом, свою биологическую активность при хранении; например, где содержание высокомолекулярных соединений (ВМС) биспецифического антитела в фармацевтическом составе составляет менее 10% через 8 недель при 25°С (в одном варианте реализации менее 5%, в одном варианте реализации менее 2,5%). В одном варианте реализации содержание высокомолекулярных соединений (ВМС) биспецифического антитела в фармацевтическом составе составляет менее 10% через 52 недель при 25°С (в одном варианте реализации менее 5%). В одном варианте реализации «стабильный жидкий фармацевтический состав» представляет собой жидкий состав без значительных изменений, наблюдаемых при температуре охлаждения (2-8°С) в течение по меньшей мере 12 месяцев, в частности, 2 лет и более конкретно 3 лет.Критерии для стабильности являются следующими: не более 10%, в частности 5%, мономера антитела разлагается, что измерено при помощи эксклюзионной хроматографии (ЭХ-ВЭЖХ). Кроме того, раствор является бесцветным или от прозрачного до слегка опалового при визуальном анализе. Концентрация белка в составе изменяется не более чем на +/-10%. Образуется не более чем 10%, в частности 5%, агрегатов. Стабильность измеряется методами, известными в данной области, такими как УФ-спектроскопия, эксклюзионная хроматография (ЭХ-ВЭЖХ), ионообменная хроматография (ИО-ВЭЖХ), турбидиметрия и визуальный осмотр.A "stable" formulation is one in which the protein, such as an antibody, substantially retains its physical and chemical stability and thus its biological activity during storage; for example, wherein the high molecular weight compound (HMW) content of the bispecific antibody in the pharmaceutical composition is less than 10% after 8 weeks at 25° C. (in one embodiment, less than 5%, in one embodiment, less than 2.5%). In one embodiment, the high molecular weight compound (HMC) content of the bispecific antibody in the pharmaceutical composition is less than 10% after 52 weeks at 25°C (in one embodiment, less than 5%). In one embodiment, a "stable liquid pharmaceutical formulation" is a liquid formulation without significant changes observable at refrigeration temperature (2-8°C) for at least 12 months, in particular 2 years, and more particularly 3 years. Criteria for stability are as follows: no more than 10%, in particular 5%, of the antibody monomer is degraded, as measured by size exclusion chromatography (SEC-HPLC). Additionally, the solution is colorless or clear to slightly opalescent when visually analyzed. The protein concentration in the composition changes by no more than +/-10%. No more than 10%, in particular 5%, of aggregates are formed. Stability is measured by methods known in the art, such as UV spectroscopy, size exclusion chromatography (SEC-HPLC), ion exchange chromatography (IO-HPLC), turbidimetry and visual inspection.

Мутность (в ЕМФ (=единица мутности по формазину))Turbidity (in EMF (=formazin turbidity unit))

Мутность фармацевтического состава может быть определена на турбидиметре (например, на турбидиметре Hach 2100 AN согласно Европейской фармакопее 2.2.1 (Прозрачность и степень опалесценции жидкостей)). Объем образца приблизительно 2 мл раствора образца переносят в стеклянную кювету с внутренним диаметром 11 мм. Стеклянную кювету помещают в турбидиметр и мутность измеряют относительно калибровочной кривой эталонных суспензий 1 ЕМФ, 3 ЕМФ, 10 ЕМФ, 20 ЕМФ и 100 ЕМФ.The turbidity of a pharmaceutical composition can be determined using a turbidimeter (for example, a Hach 2100 AN turbidimeter according to European Pharmacopoeia 2.2.1 (Clarity and degree of opalescence of liquids)). A sample volume of approximately 2 mL of sample solution is transferred into a glass cuvette with an internal diameter of 11 mm. A glass cuvette is placed in a turbidimeter and the turbidity is measured relative to the calibration curve of standard suspensions of 1 EMF, 3 EMF, 10 EMF, 20 EMF and 100 EMF.

Вязкость (в мПа)Viscosity (in mPa)

Вязкость образцов фармацевтического состава можно определять на реометре (например, ротационном реометре Anton Рааг Physica MCR 301 с 25 мм - конусом 0,5° при скорости сдвига 1000 с^-1 и температуре 20°С).The viscosity of samples of the pharmaceutical composition can be determined on a rheometer (for example, an Anton Raag Physica MCR 301 rotational rheometer with a 25 mm - 0.5° cone at a shear rate of 1000 s ^-1 and a temperature of 20 ° C).

Видимые частицыVisible particles

Образцы во флаконах визуально осматривали на соответствующей контрольно-измерительной машине (например, контрольно-измерительной машине Seidenader V90-T) с помощью 2 х увеличительной линзы. Источники освещения LI, L2 и L3 доводили до установки 5. Образцы флаконов изучали при вращательном движении на наличие частиц. Образование видимых частиц неприемлемо для интравитреального введения согласно требованиям USP-NF <790>, которые по существу не содержат видимые частицы. USP-NF <790>обеспечивает, что достигается стандарт «по существу не содержит», когда проверяются парентеральные лекарственные средства, и наблюдается, что не более определенного числа элементов содержат видимые твердые частицы. Более конкретно, для парентеральных лекарственных средств, подвергнутых 100% проверке, стандарт «по существу не содержит» удовлетворяется, когда партия удовлетворяет приемлемому уровню качества (ПУК) 0,65% или менее. И если будет необходимо оценить продукт, который был отгружен заказчикам (например, из-за претензии или нормативного запроса), фирма может отобрать и осмотреть 20 элементов. Если в образце не наблюдаются частицы, партия считается такой, которая «по существу не содержит» видимые твердые частицы.Samples in vials were visually inspected on an appropriate inspection machine (eg Seidenader V90-T inspection machine) using a 2 x magnifying lens. Illumination sources LI, L2 and L3 were brought to setting 5. Sample bottles were examined under rotational motion for the presence of particles. Formation of visible particles is unacceptable for intravitreal administration according to USP-NF <790>, which is essentially free of visible particles. USP-NF <790>ensures that the “substantially free” standard is achieved when parenteral drug products are tested and no more than a certain number of elements are observed to contain visible particulate matter. More specifically, for parenteral medicinal products subject to 100% inspection, the “substantially free” standard is satisfied when the lot meets an acceptable quality level (AQL) of 0.65% or less. And if it becomes necessary to evaluate a product that has been shipped to customers (for example, due to a complaint or regulatory request), the firm can select and inspect 20 items. If no particles are observed in the sample, the lot is considered to be “substantially free” of visible particulate matter.

Концентрация белка (в мг/мл)Protein concentration (in mg/ml)

Концентрацию белка в образцах состава измеряли путем поглощения ультрафиолетового (УФ) излучения на фотометре для ультрафиолетовой и видимой части спектра Lambda 35 от Perkin Elmer. Образцы состава разбавляли при помощи 20 мМ раствора L-гистидин-ацетатного буфера рН 5,5 до концентрации белка приблизительно 0,5 мг/мл и набирали в кювету для измерения с толщиной 1 см. УФ-поглощение кюветы для измерения измеряли при длине волны 280 и 320 нм.Protein concentration of formulation samples was measured by ultraviolet (UV) absorption on a Perkin Elmer Lambda 35 ultraviolet-visible photometer. Formulation samples were diluted with 20 mM L-histidine acetate buffer pH 5.5 to a protein concentration of approximately 0.5 mg/ml and collected in a 1 cm thick measurement cuvette. The UV absorbance of the measurement cuvette was measured at a wavelength of 280 and 320 nm.

Концентрацию белка рассчитывали из измеренных поглощений УФ-излучения при 280 (А280) и 320 нм (А320), коэффициенте экстинкции (Е) 1,70 мл/(мг × см), толщине (d) 1 см и коэффициенте разведения (КР), соответствующем фактическому разведению, согласно следующему уравнению:Protein concentration was calculated from measured UV absorbances at 280 (A280) and 320 nm (A320), extinction coefficient (E) 1.70 ml/(mg × cm), thickness (d) 1 cm and dilution factor (DF), corresponding to the actual dilution, according to the following equation:

рНpH

рН образцов составов определяли потенциометрией со стеклянным электродом.The pH of the composition samples was determined by potentiometry with a glass electrode.

Ионная силаIonic strength

Безразмерную ионную силу I составов рассчитывали согласно Уравнение 1:The dimensionless ionic strength I of the compounds was calculated according to Equation 1:

В этом выражении z представляет собой зарядовое число иона I (положительное для катионов и отрицательное для анионов), b_i представляет его молярность. b^θ соответствует 1 моль/кг и требуется для того, чтобы сделать I безразмерным (Physical Chemistry, P. Atkins, J. de Paula, Oxford Press Nineth edition, p. 194).In this expression, z represents the charge number of the ion I (positive for cations and negative for anions), b _i represents its molarity. b ^θ corresponds to 1 mol/kg and is required to make I dimensionless (Physical Chemistry, P. Atkins, J. de Paula, Oxford Press Nineth edition, p. 194).

Молярность заряженных частиц буфера рассчитывали при помощи уравнения Хендерсона-Хассельбаха (Methods in Enzymology- Guide to Protein Purification, Volume 182, M.P. Deutscher, Academic Press, Inc., 1990, p. 24ff).The molarity of the charged buffer particles was calculated using the Henderson-Hasselbach equation (Methods in Enzymology-Guide to Protein Purification, Volume 182, M.P. Deutscher, Academic Press, Inc., 1990, p. 24ff).

ОсмоляльностьOsmolality

Осмоляльность образцов состава измеряли на осмометре Osmomat 030 3Р от Gonotec согласно принципу понижения температуры замерзания. Поверхностно-активные веществаThe osmolality of the composition samples was measured using an Osmomat 030 3P osmometer from Gonotec according to the principle of freezing point depression. Surfactants

Фармацевтический состав настоящего изобретения содержит поверхностно-активное вещество для снижения агрегации антител и образования частиц. Термин «поверхностно-активное вещество» при использовании в настоящем документе означает фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое используется для защиты составов белков от механических нагрузок, таких как перемешивание и усилия сдвига. Примеры фармацевтически приемлемых поверхностно-активных веществ включают сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот (Tween), алкиловые эфиры полиоксиэтилена (например, продаваемые под торговым названием Brij™) и сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена (Poloxamer, Pluronic).The pharmaceutical composition of the present invention contains a surfactant to reduce antibody aggregation and particle formation. The term "surfactant" as used herein means a pharmaceutically acceptable excipient that is used to protect protein formulations from mechanical stress such as agitation and shear. Examples of pharmaceutically acceptable surfactants include polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters (Tween), polyoxyethylene alkyl esters (eg, sold under the trade name Brij™), and polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (Poloxamer, Pluronic).

Предпочтительно поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот или полоксамер. Примеры сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот представляют полисорбат 20 (продаваемый под торговым названием Tween 20™) и полисорбат 80 (продаваемый под торговым названием Tween 80™). Предпочтительным эфиром полиоксиэтиленсорбитана и жирной кислоты является полисорбат 20.Preferably, the surfactant is a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester or a poloxamer. Examples of polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters are polysorbate 20 (sold under the trade name Tween 20™) and polysorbate 80 (sold under the trade name Tween 80™). The preferred polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester is polysorbate 20.

Вышеуказанные поверхностно-активные вещества обычно используют в концентрации 0,01% (масс./об.) или выше, например, от 0,01 до приблизительно 0,09% (масс./об.). Поверхностно-активное вещество в фармацевтической композиции настоящего изобретения, в частности, используется в диапазоне от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,06% (масс./об.), более конкретно в диапазоне от приблизительно 0,03% до приблизительно 0,05% (масс./об.), еще более конкретно в концентрации приблизительно 0,04% (масс./об.).The above surfactants are typically used at a concentration of 0.01% (w/v) or higher, such as 0.01 to about 0.09% (w/v). The surfactant in the pharmaceutical composition of the present invention is particularly used in the range of about 0.02% to about 0.06% (w/v), more particularly in the range of about 0.03% to about 0. 05% (w/v), even more specifically at a concentration of approximately 0.04% (w/v).

Термин «полоксамер» при использовании в настоящем документе включает триблок-сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, состоящий из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена с двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена по бокам, известный как полоксамер 188, продаваемый под торговым названием PLURONIC® F68 от BASF (Парсипини, Нью-Джерси). Другие полоксамеры, которые можно использовать в составах настоящего изобретения, включают полоксамер 403 (продаваемый как PLURONIC® PI23), полоксамер 407 (продаваемый как PLURONIC® PI 27), полоксамер 402 (продаваемый как PLURONIC® PI 22), полоксамер 181 (продаваемый как PLURONIC® L61), полоксамер 401 (продаваемый как PLURONIC® L121), полоксамер 185 (продаваемый как PLURONIC® Р65) и полоксамер 338 (продаваемый как PLURONIC® F108).The term "poloxamer" as used herein includes a polyoxyethylene-polyoxypropylene triblock copolymer consisting of a central hydrophobic polyoxypropylene chain flanked by two hydrophilic polyoxyethylene chains, known as poloxamer 188, sold under the trade name PLURONIC® F68 from BASF (Parsipine, New York). Jersey). Other poloxamers that can be used in the compositions of the present invention include poloxamer 403 (sold as PLURONIC® PI23), poloxamer 407 (sold as PLURONIC® PI 27), poloxamer 402 (sold as PLURONIC® PI 22), poloxamer 181 (sold as PLURONIC ® L61), poloxamer 401 (sold as PLURONIC® L121), poloxamer 185 (sold as PLURONIC® P65) and poloxamer 338 (sold as PLURONIC® F108).

БуферыBuffers

Термин «буфер» при использовании в настоящем документе обозначает фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое стабилизирует рН фармацевтического препарата. Подходящие буферы хорошо известны в данной области и могут быть найдены в литературных источниках. Типичные фармацевтически приемлемые буферы для интравитреального введения включают, помимо прочего, гистидиновые буферы, цитратные буферы, сукцинатные буферы, ацетатные буферы, фосфатные буферы или их смеси. В этом контексте буферы, представляющие особый интерес, включают L-гистидин («гистидиновый буфер») или смеси L-гистидина и гидрохлорида L-гистидина с регулированием рН при помощи кислоты или основания, известного в данной области. Буферы, представляющие особый интерес, включают L-гистидин («гистидиновый буфер»), в частности L-гистидин с регулированием рН при помощи уксусной кислоты (например, 30%) или гидрохлорида. Вышеуказанные буферы обычно используются в концентрации от приблизительно 2 мМ до приблизительно 200 мМ или от приблизительно 5 мМ до приблизительно 100 мМ, в частности, в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ или от приблизительно 15 мМ до приблизительно 20 мМ, и более конкретно приблизительно 20 мМ. Независимо от используемого буфера рН можно доводить до значения в диапазоне от 4,5 до 7,0 и, в частности, до значения в диапазоне от 5,0 до 6,0 и наиболее конкретно рН 5,5±0,2 при помощи кислоты или основания, известных в данной области, например, уксусной кислоты, соляной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты и лимонной кислоты, гидроксида натрия и гидроксида калия, в частности уксусной кислоты. Буфером, представляющим особый интерес, является гистидин (L-гистидин)-ацетатный буфер в концентрации 15-25 мМ (в одном варианте реализации 20 мМ ± 3 мМ, в частности 20 мМ ± 2 мМ) при рН 5,5±0,5 (в одном варианте реализации при рН 5,5±0,3; в частности, при рН 5,5±0,2) СтабилизаторыThe term "buffer" as used herein refers to a pharmaceutically acceptable excipient that stabilizes the pH of a pharmaceutical preparation. Suitable buffers are well known in the art and can be found in the literature. Typical pharmaceutically acceptable buffers for intravitreal administration include, but are not limited to, histidine buffers, citrate buffers, succinate buffers, acetate buffers, phosphate buffers, or mixtures thereof. In this context, buffers of particular interest include L-histidine (“histidine buffer”) or mixtures of L-histidine and L-histidine hydrochloride with pH adjustment using an acid or base known in the art. Buffers of particular interest include L-histidine (“histidine buffer”), particularly pH-adjusted L-histidine with acetic acid (eg 30%) or hydrochloride. The above buffers are typically used in a concentration of from about 2 mM to about 200 mM or from about 5 mM to about 100 mM, in particular in a concentration from about 10 mM to about 30 mM or from about 15 mM to about 20 mM, and more particularly approximately 20 mM. Regardless of the buffer used, the pH can be adjusted to a value in the range of 4.5 to 7.0 and in particular to a value in the range of 5.0 to 6.0 and most particularly pH 5.5 ± 0.2 using acid or bases known in the art, for example acetic acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid and citric acid, sodium hydroxide and potassium hydroxide, in particular acetic acid. A buffer of particular interest is histidine (L-histidine) acetate buffer at a concentration of 15-25 mM (in one embodiment 20 mM ± 3 mM, in particular 20 mM ± 2 mM) at pH 5.5 ± 0.5 (in one embodiment, at a pH of 5.5±0.3; in particular, at a pH of 5.5±0.2) Stabilizers

Термин «стабилизатор» означает фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое защищает активный фармацевтический ингредиент и/или состав от химического и/или физического разложения при производстве, хранении и применении. Пути химического и физического разложения белковых фармацевтических препаратов рассматриваются в Cleland et al. (1993), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4):307-77, Wang (1999) Int J Pharm 185(2): 129-88, Wang (2000) Int J Pharm 203(1-2): 1-60, и Chi et al. (2003) Pharm Res 20(9): 1325-36. Стабилизаторы включают, помимо прочего, сахара, аминокислоты, полиолы, циклодекстрины, например, гидроксипропил-р-циклодекстрин, сульфобутилэтил-р-циклодекстрин, р-циклодекстрин,The term "stabilizer" means a pharmaceutically acceptable excipient that protects the active pharmaceutical ingredient and/or formulation from chemical and/or physical degradation during manufacture, storage and use. Chemical and physical degradation pathways for protein pharmaceuticals are reviewed in Cleland et al. (1993), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4):307-77, Wang (1999) Int J Pharm 185(2): 129-88, Wang (2000) Int J Pharm 203(1-2): 1 -60, and Chi et al. (2003) Pharm Res 20(9): 1325-36. Stabilizers include, but are not limited to, sugars, amino acids, polyols, cyclodextrins, for example, hydroxypropyl-p-cyclodextrin, sulfobutylethyl-p-cyclodextrin, p-cyclodextrin,

полиэтиленгликоли, например, PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, альбумин, альбумин человеческой сыворотки (АЧС), альбумин бычьей сыворотки (АБС), соли, например, хлорид натрия, хлорид магния, хлорид кальция, хелаторы, например, ЭДТК, как определено далее. Стабилизаторы, которые в том числе используются в настоящем изобретении, выбирают из группы, состоящей из сахаров, полиолов и аминокислот. Более конкретно, стабилизаторы выбирают из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, сорбита и метионина.polyethylene glycols, e.g. PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, albumin, human serum albumin (ASA), bovine serum albumin (BSA), salts, e.g. sodium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, chelators, e.g. EDTA , as defined below. Stabilizers, which are also used in the present invention, are selected from the group consisting of sugars, polyols and amino acids. More specifically, stabilizers are selected from the group consisting of sucrose, trehalose, sorbitol and methionine.

Более предпочтительно стабилизатор представляет собой метионин. Метионин использовали в составах, описанных в настоящем документе, впервые для использования в применениях для глаз. Доклинические исследования безопасности показали, что метионин показывает хороший профиль безопасности для использования при заболеваниях глаз при введении, например, интравитреально.More preferably, the stabilizer is methionine. Methionine was used in the formulations described herein for the first time for use in ophthalmic applications. Preclinical safety studies have shown that methionine shows a good safety profile for use in ocular diseases when administered, for example, intravitreally.

Стабилизаторы могут присутствовать в составе в концентрации от приблизительно 2 мМ до приблизительно 600 мМ, в частности, если стабилизатором является метионин, в концентрации от приблизительно 2 мМ до приблизительно 15 мМ или от 5 до 12 мМ; более конкретно в концентрации от приблизительно 5 до 9 мМ или приблизительно 7 мМ.Stabilizers may be present in the formulation at a concentration of from about 2 mM to about 600 mM, particularly if the stabilizer is methionine, at a concentration of from about 2 mM to about 15 mM or from 5 to 12 mM; more specifically at a concentration of about 5 to 9 mM or about 7 mM.

В одном предпочтительном варианте реализации стабилизатором является метионин в концентрации 7,0 мМ ± 2,0 мМ метионина (в одном варианте реализации 7,0 мМ ± 1,0 мМ метионина; в одном варианте реализации 7,0 мМ ± 0,7 мМ метионина). Метионин в качестве стабилизатора является особенно полезным, поскольку он может работать, помимо прочего, в качестве поглотителя для пероксида водорода, который используется для стерилизации инъекционных растворов или упакованных предварительно заполненных шприцев.In one preferred embodiment, the stabilizer is methionine at a concentration of 7.0 mM ± 2.0 mM methionine (in one embodiment, 7.0 mM ± 1.0 mM methionine; in one embodiment, 7.0 mM ± 0.7 mM methionine ). Methionine as a stabilizer is particularly useful because it can act, among other things, as a scavenger for hydrogen peroxide, which is used to sterilize injection solutions or packaged prefilled syringes.

В некоторых вариантах реализации жидкий фармацевтический состав настоящего изобретения содержит антиоксидант в качестве второго стабилизатора. «Антиоксидант» представляет собой фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое предотвращает окисление активного фармацевтического ингредиента. Антиоксиданты включают, помимо прочего, хелатирующие средства, такие как ЭДТК, лимонная кислота, аскорбиновая кислота, бутилированный гидрокситолуол (БГТ), бутилированный гидроксианизол (БГА), сульфит натрия, п-аминобензойная кислота, глутатион, пропилгаллат, цистеин, метионин, этанол, бензиловый спирт и н-ацетилцистеин. Антиоксиданты можно использовать в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мМ, в частности, в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 50 мМ и более конкретно в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 25 мМ. В частности, метионин выбирают как второй стабилизатор, в частности, в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 25 мМ, более конкретно в концентрации приблизительно 10 мМ.In some embodiments, the liquid pharmaceutical composition of the present invention contains an antioxidant as a second stabilizer. An "antioxidant" is a pharmaceutically acceptable excipient that prevents the oxidation of an active pharmaceutical ingredient. Antioxidants include, but are not limited to, chelating agents such as EDTA, citric acid, ascorbic acid, butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), sodium sulfite, p-aminobenzoic acid, glutathione, propyl gallate, cysteine, methionine, ethanol, benzyl alcohol and n-acetylcysteine. Antioxidants can be used at a concentration of from about 0.01 to about 100 mM, in particular at a concentration of from about 5 to about 50 mM, and more particularly at a concentration of from about 5 to about 25 mM. In particular, methionine is selected as the second stabilizer, particularly at a concentration of from about 5 to about 25 mM, more particularly at a concentration of about 10 mM.

Термин «сахар» при использовании в настоящем документе означает моносахарид или олигосахарид. Моносахарид представляет собой мономерный углевод, который не гидролизуется кислотами, включая простые сахара и их производные, например, аминосахара. Примеры моносахаридов включают глюкозу, фруктозу, галактозу, маннозу, сорбозу, рибозу, дезоксирибозу, нейраминовую кислоту. Олигосахарид представляет собой углевод, состоящий из более чем одного мономерного сахаридного звена, соединенного гликозидной(ыми) связью(ями), или разветвленного, или в виде цепи. Мономерные сахаридные звенья в олигосахариде могут быть одинаковыми или разными. В зависимости от числа мономерных сахаридных звеньев олигосахарид является ди-, три-, тетра- пента- и т.д. сахаридом. В отличие от полисахаридов моносахариды и олигосахариды являются растворимыми в воде. Примеры олигосахаридов включают сахарозу, трегалозу, лактозу, мальтозу и рафинозу. В частности, сахара выбирают из сахарозы и трегалозы, в частности сахарозы.The term "sugar" as used herein means a monosaccharide or oligosaccharide. A monosaccharide is a monomeric carbohydrate that is not hydrolyzed by acids, including simple sugars and their derivatives, such as amino sugars. Examples of monosaccharides include glucose, fructose, galactose, mannose, sorbose, ribose, deoxyribose, neuraminic acid. An oligosaccharide is a carbohydrate consisting of more than one monomeric saccharide unit linked by glycosidic linkage(s) or branched or chained. The monomeric saccharide units in an oligosaccharide may be the same or different. Depending on the number of monomeric saccharide units, an oligosaccharide is di-, tri-, tetra-penta, etc. saccharide. Unlike polysaccharides, monosaccharides and oligosaccharides are water soluble. Examples of oligosaccharides include sucrose, trehalose, lactose, maltose and raffinose. In particular, sugars are selected from sucrose and trehalose, in particular sucrose.

Термин «аминокислота» при использовании в настоящем документе означает в общем фармацевтически приемлемую органическую молекулу, имеющую аминофрагмент, расположенный в а-положении относительно карбоксильной группы. Примеры аминокислот включают аргинин, глицин, орнитин, лизин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, серии, пролин, в частности, метионин.The term "amino acid" as used herein means a generally pharmaceutically acceptable organic molecule having an amino moiety located in the a-position relative to the carboxyl group. Examples of amino acids include arginine, glycine, ornithine, lysine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, isoleucine, leucine, alanine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine, serine, proline, particularly methionine.

Термин «полиолы» при использовании в настоящем документе означает фармацевтически приемлемые спирты с более чем одной гидроксигруппой. Подходящие полиолы включают, помимо прочего, маннит, сорбит, глицерин, декстран, глицерин, арабит, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и их комбинации. Полиолы можно использовать в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ, в частности, в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 250 мМ и более конкретно в концентрации от приблизительно 200 до приблизительно 250 мМ.The term "polyols" as used herein means pharmaceutically acceptable alcohols with more than one hydroxy group. Suitable polyols include, but are not limited to, mannitol, sorbitol, glycerin, dextran, glycerin, arabitol, propylene glycol, polyethylene glycol, and combinations thereof. The polyols can be used at a concentration of from about 10 mM to about 500 mM, in particular at a concentration of from about 10 to about 250 mM, and more particularly at a concentration of from about 200 to about 250 mM.

Термин «стабилизаторы» также включает лиопротекторы. Термин «лиопротектор» означает фармацевтическое приемлемое вспомогательное вещество, которое защищает нестабильный активный ингредиент (например, белок) от дестабилизирующих условий в процессе лиофилизации, при последующем хранении и разбавлении. Лиопротекторы включают, помимо прочего, группу, состоящую из сахаров, полиолов (таких как, например, сахарные спирты) и аминокислот. В частности, лиопротекторы можно выбирать из группы, состоящей из сахаров, таких как сахароза, трегалоза, лактоза, глюкоза, манноза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сорбоза, рафиноза, нейраминовая кислота, аминосахаров, таких как глюкозамин, галактозамин, N-метилглюкозамин («меглюмин»), полиолов, таких как маннит и сорбит, и аминокислот, таких как метионин или глицин. Лиопротекторы обычно используют в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 600 мМ, в частности, в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 250 мМ и более конкретно в концентрации от приблизительно 100 до приблизительно 250 мМ.The term "stabilizers" also includes lyoprotectors. The term "lyoprotector" means a pharmaceutically acceptable excipient that protects an unstable active ingredient (eg, a protein) from destabilizing conditions during lyophilization, subsequent storage and reconstitution. Lyoprotectants include, but are not limited to, the group consisting of sugars, polyols (such as, for example, sugar alcohols) and amino acids. In particular, lyoprotectants can be selected from the group consisting of sugars such as sucrose, trehalose, lactose, glucose, mannose, maltose, galactose, fructose, sorbose, raffinose, neuraminic acid, amino sugars such as glucosamine, galactosamine, N-methylglucosamine ( meglumine), polyols such as mannitol and sorbitol, and amino acids such as methionine or glycine. Lyoprotectants are typically used at a concentration of about 10 to about 600 mM, particularly at a concentration of about 10 to about 250 mM, and more particularly at a concentration of about 100 to about 250 mM.

Регуляторы тоничностиTonicity regulators

Фармацевтический состав может также содержать регуляторы тоничности. Термин «регуляторы тоничности» при использовании в настоящем документе означает фармацевтически приемлемые регуляторы тоничности, которые используют для модулирования тоничности состава. Состав может быть гипотоничным, изотоничным или гипертоничным. Изотоничность, в общем, относится к осмотическому давлению относительно раствора, обычно относительно сыворотки крови человека. Состав согласно настоящему изобретению может быть гипотоничным, изотоничным или гипертоничным, предпочтительно фармацевтический состав является изотоничным. Изотоничный состав представляет собой жидкость или жидкость, разведенную из твердой формы, например, из лиофилизированной формы, и означает раствор, имеющий тоничность, подобную тоничности некоторого другого раствора, с которым его сравнивают, таким как физиологический солевой раствор и сыворотка крови. Подходящие регуляторы тоничности включают, помимо прочего, хлорид натрия, хлорид калия, глицерин и любой компонент из группы аминокислот, сахаров, в частности сахарозу. В одном варианте реализации настоящего изобретения предпочтительным регулятором тоничности является сахароза. Регуляторы тоничности обычно используют в концентрации от приблизительно 5 мМ до приблизительно 1000 мМ, в частности, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 500 мМ, более конкретно от приблизительно 120 мМ до приблизительно 200 мМ. Регуляторы тоничности для изотоничных составов настоящего изобретения обычно используют в концентрации от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ, в частности, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 200 мМ. Более конкретно, регуляторы тоничности для изотоничных составов используют в концентрации от 130 мМ до 190 мМ и еще более конкретно в концентрации приблизительно 160 мМ ± 24 мМ в случае, когда сахарозу используют в качестве регулятора тоничности. Регулятор тоничности и его концентрацию выбирают для обеспечения изотоничного состава с целевой осмоляльностью 300±100 мОсм/кг (в частности, с целевой осмоляльностью 300±50 мОсм/кг).The pharmaceutical composition may also contain tonicity regulators. The term "tonicity regulators" as used herein refers to pharmaceutically acceptable tonicity regulators that are used to modulate the tonicity of a formulation. The composition can be hypotonic, isotonic or hypertonic. Isotonicity, in general, refers to the osmotic pressure relative to a solution, usually relative to human blood serum. The composition according to the present invention may be hypotonic, isotonic or hypertonic, preferably the pharmaceutical composition is isotonic. An isotonic formulation is a liquid or liquid reconstituted from a solid form, such as a lyophilized form, and means a solution having a tonicity similar to that of some other solution to which it is compared, such as physiological saline and blood serum. Suitable tonicity regulators include, but are not limited to, sodium chloride, potassium chloride, glycerol and any member of the group of amino acids, sugars, in particular sucrose. In one embodiment of the present invention, the preferred tonicity regulator is sucrose. Tonicity regulators are typically used at a concentration of from about 5 mM to about 1000 mM, in particular from about 30 mM to about 500 mM, more particularly from about 120 mM to about 200 mM. Tonicity regulators for isotonic formulations of the present invention are typically used at a concentration of from about 50 mM to about 250 mM, in particular from about 120 mM to about 200 mM. More specifically, tonicity regulators for isotonic formulations are used at a concentration of 130 mM to 190 mM, and even more particularly at a concentration of approximately 160 mM ± 24 mM when sucrose is used as a tonicity regulator. The tonicity regulator and its concentration are selected to provide an isotonic formulation with a target osmolality of 300 ± 100 mOsm/kg (specifically, a target osmolality of 300 ± 50 mOsm/kg).

В рамках стабилизаторов и регуляторов тоничности есть группа соединений, которая может работать обоими путями, т.е. они могут одновременно быть стабилизатором и регулятором тоничности. Их примеры можно найти в группе сахаров, аминокислот, полиолов, циклодекстринов, полиэтиленгликолей и солей. Примером сахара, который может одновременно быть стабилизатором и регулятором тоничности, является сахароза и трегалоза, в частности, сахароза.Within the scope of stabilizers and tonicity regulators there is a group of compounds that can work in both ways, i.e. they can simultaneously act as a stabilizer and regulator of tonicity. Examples of these can be found in the group of sugars, amino acids, polyols, cyclodextrins, polyethylene glycols and salts. An example of a sugar that can be both a stabilizer and a tonicity regulator is sucrose and trehalose, in particular sucrose.

Понизитель вязкостиViscosity reducer

Фармацевтический состав может также содержать понизители вязкости. Термин «понизители вязкости» при использовании в настоящем документе означает фармацевтически приемлемый модификатор ионной силы, который используют для снижения вязкости состава, что важно для составов с высокими концентрациями и составов, которые предусмотрены для интравитреального введения в глаз посредством тонких иголок (обеспечивая относительно быстрое введение без необходимости в высоком давлении для инъекции) в лечении заболеваний глаз. Примерами типичных понизителей вязкости являются, например, хлорид кальция или хлорид натрия.The pharmaceutical composition may also contain viscosity reducers. The term "viscosity reducers" as used herein means a pharmaceutically acceptable ionic strength modifier that is used to reduce the viscosity of a formulation, which is important for high concentration formulations and formulations that are intended for intravitreal administration into the eye via fine needles (enabling relatively rapid administration without the need for high pressure for injection) in the treatment of eye diseases. Examples of typical viscosity reducers are, for example, calcium chloride or sodium chloride.

АдъювантыAdjuvants

Фармацевтический состав может также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие средства, эмульгаторы и диспергирующие средства. Предотвращение присутствия микроорганизмов может обеспечиваться как процедурами стерилизации, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и подобного. Консерванты обычно используют в концентрации от приблизительно 0,001 до приблизительно 2% (масс./об.). Консерванты включают, помимо прочего, этанол, бензиловый спирт, фенол, м-крезол, п-хлор-м-крезол, метил- или пропилпарабены, хлорид бензалкония.The pharmaceutical composition may also contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifiers and dispersants. Prevention of the presence of microorganisms can be achieved both by sterilization procedures and by the inclusion of various antibacterial and antifungal agents, for example, paraben, chlorobutanol, phenol, sorbic acid and the like. Preservatives are typically used at a concentration of from about 0.001 to about 2% (w/v). Preservatives include, but are not limited to, ethanol, benzyl alcohol, phenol, m-cresol, p-chloro-m-cresol, methyl or propyl parabens, benzalkonium chloride.

Фармацевтический состав может также содержать различные вышеуказанные средства, такие как буферы, поверхностно-активные вещества, стабилизатор, модификатор ионной силы, в меньших количествах, которые по существу не изменяют технические признаки фармацевтического состава настоящего изобретения, например, такие как вязкость 20 мПа⋅с или менее (предпочтительно 15 мПа⋅с или менее), мутность 30 ЕМФ или менее (предпочтительно 25 ЕМФ или менее), осмоляльность 300±50 мОсм/кг, по существу отсутствие видимых частиц.The pharmaceutical composition may also contain various of the above agents, such as buffers, surfactants, stabilizer, ionic strength modifier, in smaller quantities, which do not substantially change the technical features of the pharmaceutical composition of the present invention, for example, such as a viscosity of 20 mPa.s or less (preferably 15 mPa.s or less), turbidity 30 FMU or less (preferably 25 FMU or less), osmolality 300 ± 50 mOsm/kg, substantially free of visible particles.

ПрименениеApplication

Фармацевтический состав биспецифического антитела к VEGF/ANG2 согласно настоящему изобретению можно использовать при профилактике или лечении сосудистых заболеваний глаз. Для этой цели обеспечивается фармацевтический состав биспецифического антитела к VEGF/ANG2 для интравитреального введения в виде жидкого изотоничного состава с вязкостью 20 мПа⋅с или менее (предпочтительно 15 мПа⋅с или менее), мутностью 30 ЕМФ или менее (предпочтительно 25 ЕМФ или менее), осмоляльностью 300±50 мОсм/кг, по существу отсутствием видимых частиц. Жидкий изотоничный фармацевтический состав биспецифического антитела к VEGF/ANG2 для этой цели можно обеспечивать в стеклянных флаконах или в виде предварительно заполненного шприца, в частности, в виде предварительно заполненного стеклянного шприца.The pharmaceutical composition of the bispecific anti-VEGF/ANG2 antibody according to the present invention can be used in the prevention or treatment of vascular diseases of the eye. For this purpose, a pharmaceutical formulation of a bispecific anti-VEGF/ANG2 antibody is provided for intravitreal administration in the form of a liquid isotonic formulation with a viscosity of 20 mPa⋅s or less (preferably 15 mPa⋅s or less), a turbidity of 30 FFU or less (preferably 25 FFU or less) , osmolality 300±50 mOsm/kg, essentially free of visible particles. A liquid isotonic pharmaceutical formulation of a bispecific anti-VEGF/ANG2 antibody for this purpose can be provided in glass vials or in the form of a pre-filled syringe, in particular in the form of a pre-filled glass syringe.

Для таких составов, которые вводят интравитреально в глаз, вспомогательных веществ, таких как например, аргинин, следует избегать, поскольку была описана токсичность аргинина в качестве носителя для тканевого активатора плазминогена (t-PA) для сетчатки и пигментного эпителия сетчатки (см., например, Benner J D, Morse LS, Toth С A et al Arch Ophthalmol 19911091731-1736.1736; Johnson MW, Olsen KR. Hernandez E. et al, Arch Ophthalmool 1990108259-263.263, Irvine W D, Johnson MW, Heinandez E. et al,. Arch Ophthalmol 1991109718-722.722, Johnson MW, Olsen KR. Heinandez E., Retina 199111250-258.258). Таким образом, жидкий фармацевтический состав настоящего изобретения по существу не содержит аргинин (что означает, что состав не содержит аргинин или содержит количества аргинина ниже концентрации/уровня, при которых они могут быть токсичными (за счет их функции носителя для тканевого активатора плазминогена (t-PA)), или не содержит аргинин. Низкая вязкость также важна для обеспечения промышленного способа производства (повышение концентрации ультрафильтрацией) и для обеспечения простого и удобного интравитреального введения (силы впрыска (скольжения) менее 20 Н, в частности менее 15 Н, при скорости впрыска 50 мм/мин). Было показано, что жидкий фармацевтический состав настоящего изобретения с вязкостью менее 15 мПа⋅с можно было вводить при помощи инъекционной иглы 30G с временем впрыска 5 с при силе впрыска менее 5 Н. Для этой цели фармацевтический состав биспецифического антитела к VEGF/ANG2 представляет собой жидкий изотоничный состав с вязкостью 15 мПа⋅с или менее, мутностью 25 ЕМФ или менее, осмоляльностью 300±50 мОсм/кг, по существу не содержащий видимых частиц. Чтобы избежать каких-либо видимых частиц, жидкий фармацевтический состав настоящего изобретения по существу не содержит хлорид кальция (что означает, что состав не содержит хлорид кальция или содержит количества хлорида кальция ниже концентрации/уровня, при которых они могут способствовать образованию видимых частиц, так что состав остается таким, который не содержит видимых частиц/по существу не содержит видимых частиц) или не содержит хлорид кальция.For such formulations that are administered intravitreally into the eye, excipients such as arginine should be avoided as toxicity of arginine as a carrier for tissue plasminogen activator (t-PA) to the retina and retinal pigment epithelium has been described (see e.g. , Benner J D, Morse LS, Toth C A et al Arch Ophthalmol 19911091731-1736.1736; Johnson MW, Olsen KR. Hernandez E. et al, Arch Ophthalmool 1990108259-263.263, Irvine W D, Johnson MW, Heinandez E. et al, Arch Ophthalmol 1991109718-722.722, Johnson MW, Olsen KR, Heinandez E, Retina 199111250-258.258). Thus, the liquid pharmaceutical composition of the present invention is substantially free of arginine (meaning that the composition does not contain arginine or contains amounts of arginine below the concentration/level at which they may be toxic (due to their function as a carrier for tissue plasminogen activator (t- PA)), or does not contain arginine. Low viscosity is also important to ensure an industrial production method (increasing concentration by ultrafiltration) and to ensure simple and convenient intravitreal administration (injection (sliding) forces of less than 20 N, in particular less than 15 N, at injection speed 50 mm/min.) It was shown that the liquid pharmaceutical composition of the present invention with a viscosity of less than 15 mPa⋅s could be administered using a 30G injection needle with an injection time of 5 s at an injection force of less than 5 N. For this purpose, the pharmaceutical composition of a bispecific antibody to VEGF/ANG2 is an isotonic liquid formulation with a viscosity of 15 mPa.s or less, a turbidity of 25 FFU or less, an osmolality of 300 ± 50 mOsm/kg, and substantially free of visible particles. To avoid any visible particles, the liquid pharmaceutical composition of the present invention is substantially free of calcium chloride (meaning that the composition does not contain calcium chloride or contains amounts of calcium chloride below the concentration/level at which they can contribute to the formation of visible particles, so that the composition remains one that does not contain visible particles/substantially does not contain visible particles) or does not contain calcium chloride.

Термины «глазное сосудистое заболевание» и «сосудистое заболевание глаз» используются взаимозаменяемо в настоящем документе и включают, помимо прочего, внутриглазные неоваскулярные синдромы, такие как диабетическая ретинопатия, диабетический макулярный отек, ретинопатия недоношенных, неоваскулярная глаукома, окклюзии вены сетчатки, окклюзии центральной вены сетчатки, макулярная дегенерация, возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит, ретинальная ангиоматозная пролиферация, макулярная телеангиэктазия, ишемическая ретинопатия, неоваскуляризация радужной оболочки, внутриглазная неоваскуляризация, неоваскуляризация роговицы, неоваскуляризация сетчатки, хориоидальная неоваскуляризация и дегенерация сетчатки. (Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710). При использовании в настоящем документе глазное сосудистое заболевание относится к любому патологическому состоянию, характеризующемуся измененной или нерегулируемой пролиферацией и инвазией новых кровеносных сосудов в структуры глазных тканей, таких как сетчатка или роговица. В одном варианте реализации глазное сосудистое заболевание выбирают из группы, состоящей из: влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД) (также называемой неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией (нВМД)), диабетического макулярного отека (ДМО), диабетической ретинопатии (ДР), непролиферативной диабетической ретинопатии (НПДР), пролиферативной диабетической ретинопатии (ПДР), кистозного макулярного отека (КМО), васкулита (например, окклюзии центральной вены сетчатки), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), отека диска зрительного нерва, ретинита, конъюктивита, увеита, хориоидита, мультифокального хориоидита, окулярного гистоплазмоза, блефарита, синдрома сухого глаза (синдрома Шегрена) и других офтальмологических заболеваний, причем заболевание или расстройство глаз связано с неоваскуляризацией в глазах, транссудацией и/или отеком сетчатки, в частности, влажной формой возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД) (также называемой неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией (нВМД)), диабетическим макулярным отеком (ДМО), диабетической ретинопатией (ДР), непролиферативной диабетической ретинопатией (НПДР), пролиферативной диабетической ретинопатией (ПДР), кистозным макулярным отеком (КМО), васкулитом (например, окклюзией центральной вены сетчатки), окклюзией вены сетчатки (ОВС), окклюзией центральной вены сетчатки (ОЦВС). Таким образом, биспецифические антитела к VEGF/ANG2 для применения и способы, описанные в настоящем документе, пригодны для профилактики и лечения влажной ВМД (также называемой неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией (нВМД)), ДМО, ДР, НПДР, ПДР, также предпочтительно влажной ВМД, ДМО и ОВС, также предпочтительно влажной ВМД. В некоторых вариантах реализации сосудистое заболевание глаз выбирают из группы, содержащей влажную форму возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД)), диабетический макулярный отек (ДМО), окклюзию вены сетчатки (ОВС), диабетическую ретинопатию (ДР) и ретинопатию недоношенных (РН).The terms "ocular vascular disease" and "ocular vascular disease" are used interchangeably herein and include, but are not limited to, intraocular neovascular syndromes such as diabetic retinopathy, diabetic macular edema, retinopathy of prematurity, neovascular glaucoma, retinal vein occlusions, central retinal vein occlusions , macular degeneration, age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, retinal angiomatous proliferation, macular telangiectasia, ischemic retinopathy, iris neovascularization, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization and retinal degeneration. (Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625 -1710). As used herein, ocular vascular disease refers to any pathological condition characterized by altered or dysregulated proliferation and invasion of new blood vessels into ocular tissue structures, such as the retina or cornea. In one embodiment, the ocular vascular disease is selected from the group consisting of: wet age-related macular degeneration (wet AMD) (also called neovascular age-related macular degeneration (nAMD)), diabetic macular edema (DME), diabetic retinopathy (DR), nonproliferative diabetic retinopathy (CPDR), proliferative diabetic retinopathy (PDR), cystoid macular edema (CME), vasculitis (eg, central retinal vein occlusion), retinal vein occlusion (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO), papilledema, retinitis , conjunctivitis, uveitis, choroiditis, multifocal choroiditis, ocular histoplasmosis, blepharitis, dry eye syndrome (Sjögren's syndrome) and other ophthalmic diseases, and the eye disease or disorder is associated with neovascularization in the eye, extravasation and/or swelling of the retina, in particular the wet form age-related macular degeneration (wet AMD) (also called neovascular age-related macular degeneration (nAMD)), diabetic macular edema (DME), diabetic retinopathy (DR), non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR), proliferative diabetic retinopathy (PDR), cystoid macular edema ( CME), vasculitis (for example, central retinal vein occlusion), retinal vein occlusion (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO). Thus, the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibodies for use and the methods described herein are useful for the prevention and treatment of wet AMD (also called neovascular age-related macular degeneration (nAMD)), DME, DR, NPDR, PDR, also preferably wet AMD , DMO and OBC, also preferably wet AMD. In some embodiments, the vascular ocular disease is selected from the group consisting of wet age-related macular degeneration (wet AMD), diabetic macular edema (DME), retinal vein occlusion (RVO), diabetic retinopathy (DR), and retinopathy of prematurity (ROP).

Другие заболевания, связанные с неоваскуляризацией роговицы, включают, помимо прочего, эпидемический кератоконъюнктивит, дефицит витамина А, чрезмерное ношение контактных линз, атопический кератит, верхний лимбальный кератит, сухой кератит крыловидной плевы, синдром Шегрена, розацею, фликтенулезный конъюнктивит, сифилис, микобактериальные инфекции, липидную дегенерацию, химические ожоги, бактериальные язвы, грибковые язвы, инфекции простого герпеса, инфекции опоясывающего герпеса, инфекции простейшими, саркому Капоши, язву Мурена, маргинальную дегенерацию Терриена, краевую дистрофию роговицы, ревматоидный артрит, системную волчанку, полиартериит, травму, саркоидоз Вегенера, склерит, синдром Стивенса-Джонсона, перифигоидную радиальную кератотомию и отторжение роговичного трансплантата.Other diseases associated with corneal neovascularization include, but are not limited to, epidemic keratoconjunctivitis, vitamin A deficiency, excessive contact lens wear, atopic keratitis, superior limbal keratitis, dry pterygoid keratitis, Sjögren's syndrome, rosacea, phlyctenular conjunctivitis, syphilis, mycobacterial infections, lipid degeneration, chemical burns, bacterial ulcers, fungal ulcers, herpes simplex infections, herpes zoster infections, protozoa infections, Kaposi's sarcoma, Moray's ulcer, marginal Therrien degeneration, marginal corneal dystrophy, rheumatoid arthritis, systemic lupus, polyarteritis, trauma, Wegener's sarcoidosis, scleritis, Stevens-Johnson syndrome, periphygoid radial keratotomy and corneal graft rejection.

Заболевания, связанные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, включают, помимо прочего, диабетическую ретинопатию, макулярную дегенерацию, серповидноклеточную анемию, саркоид, сифилис, эластическую псевдоксантому, болезнь Педжета, окклюзию вен, окклюзию артерий, обструктивное заболевание сонной артерии, хронический увеит/витрит, микобактериальные инфекции, болезнь Лайма, системную красную волчанку, ретинопатию новорожденных, пигментный ретинит, отек сетчатки (включая макулярный отек), болезнь Илза, болезнь Бехчета, инфекции, вызывающие ретинит или хориоидит, предполагаемый гистоплазмоз глаз, болезнь Беста, миопию, врожденные ямки в диске зрительного нерва, болезнь Штаргардта, парспланит, хроническое отслоение сетчатки, синдром повышенной вязкости крови, токсоплазмоз, травму и осложнения после лазерной операции. Другие заболевания включают, помимо прочего, заболевания, связанные с покраснением радужки (неоваскуляризацией угла передней камеры), и заболевания, вызываемые атипичной пролиферацией сосудисто-волокнистой или волокнистой ткани, включая все формы пролиферативной витреоретинопатии.Diseases associated with retinal neovascularization/choroidal neovascularization include, but are not limited to, diabetic retinopathy, macular degeneration, sickle cell disease, sarcoid, syphilis, pseudoxanthoma elasticum, Paget's disease, venous occlusion, arterial occlusion, obstructive carotid disease, chronic uveitis/vitritis, mycobacterial infections, Lyme disease, systemic lupus erythematosus, neonatal retinopathy, retinitis pigmentosa, retinal edema (including macular edema), Eales disease, Behçet disease, infections causing retinitis or choroiditis, suspected ocular histoplasmosis, Best disease, myopia, congenital pitting of the disc optic nerve, Stargardt disease, parsplanitis, chronic retinal detachment, hyperviscosity syndrome, toxoplasmosis, trauma and complications after laser surgery. Other diseases include, but are not limited to, diseases associated with iris redness (neovascularization of the anterior chamber angle) and diseases caused by atypical proliferation of fibrovascular or fibrous tissue, including all forms of proliferative vitreoretinopathy.

Ретинопатия недоношенных (РН) представляет собой заболевание глаза, которое поражает недоношенных младенцев. Считается, что она вызвана нарушенным ростом кровеносных сосудов сетчатки, что может приводить к рубцеванию и отслоению сетчатки. РН может быть умеренной и может самопроизвольно устраняться, но может приводить к слепоте в серьезных случаях. Таким образом, все родившиеся преждевременно младенцы находятся в группе риска РН, и очень малый вес при рождении является дополнительным фактором риска. Как отравление кислородом, так и относительная гипоксия может способствовать развитию РН.Retinopathy of prematurity (ROP) is an eye disease that affects premature infants. It is thought to be caused by abnormal growth of blood vessels in the retina, which can lead to scarring and detachment of the retina. ROP can be mild and may resolve spontaneously, but can lead to blindness in severe cases. Thus, all infants born prematurely are at risk for ROP, and very low birth weight is an additional risk factor. Both oxygen toxicity and relative hypoxia can contribute to the development of ROP.

Макулярная дегенерация является медицинским состоянием, главным образом обнаруживаемым у людей старшего возраста, при котором центр внутренней оболочки глаза, известной как желтое пятно сетчатки, подвергается утонению, атрофии и в некоторых случаях кровотечению. Это может приводить к потере центрального зрения, что вызывает неспособность видеть мелкие детали, читать или узнавать лица. Согласно Американской академии офтальмологии сегодня это основная причина потери центрального зрения (слепоты) в Соединенных Штатах для людей возрастом более пятидесяти лет.Хотя некоторые виды макулярной дегенерации, которые поражают более молодых индивидуумов, иногда называют макулярной дистрофией, термин в общем относится к возрастной макулярной дегенерации (ВМД или СВМД).Macular degeneration is a medical condition, mainly found in older people, in which the center of the inner lining of the eye, known as the macula of the retina, undergoes thinning, atrophy and, in some cases, bleeding. This can lead to loss of central vision, causing an inability to see fine details, read, or recognize faces. According to the American Academy of Ophthalmology, it is today the leading cause of central vision loss (blindness) in the United States for people over fifty years of age. Although some types of macular degeneration that affect younger individuals are sometimes called macular degeneration, the term generally refers to age-related macular degeneration ( AMD or SVMD).

«Возрастная макулярная дегенерация (ВМД)» при использовании в настоящем документе относится к серьезному патологическому состоянию глаз, когда разрушается небольшая центральная часть сетчатки, известная как макула. Влажная форма ВМД (влажная ВМД (вВМД), также называемая неоваскулярной ВМД (нВМД)), форма развитой ВМД, характеризуется ростом атипичных кровеносных сосудов из хориоида под макулой. Это называется хориоидальной неоваскуляризацией. Эти кровеносные сосуды пропускают кровь и жидкость в сетчатку, вызывая искажение зрения, из-за которого прямые линии кажутся волнистыми, а также приводит к слепым пятнам и потере центрального зрения. Эти атипичные кровеносные сосуды в итоге рубцуются, что приводит к безвозвратной потере центрального зрения. Симптомы ВМД включают темные, смазанные области в центре зрения; и ухудшают или изменяют цветовосприятие. ВМД можно обнаружить при обычной проверке глаз. Одним из наиболее ранних признаков макулярной дегенерации является присутствие мелких желтых отложений в друзах под сетчаткой или агрегация пигмента.“Age-related macular degeneration (AMD)” as used herein refers to a serious eye condition in which the small central portion of the retina, known as the macula, is destroyed. Wet AMD (wet AMD (wAMD), also called neovascular AMD (nAMD)), a form of advanced AMD, is characterized by the growth of abnormal blood vessels from the choroid under the macula. This is called choroidal neovascularization. These blood vessels leak blood and fluid into the retina, causing distorted vision that makes straight lines appear wavy, leading to blind spots and loss of central vision. These abnormal blood vessels eventually become scarred, leading to permanent loss of central vision. Symptoms of AMD include dark, blurry areas in the center of vision; and impair or change color perception. AMD can be detected during routine eye examinations. One of the earliest signs of macular degeneration is the presence of small yellow deposits in drusen under the retina or pigment aggregation.

Пигментный ретинит (ПР) представляет группу генетических патологических состояний глаз. При прогрессировании симптомов ПР ночная слепота обычно предшествует туннельному зрению за годы или даже десятилетия. Многие люди с ПР не официально не признаются слепыми до 40 или 50 лет и сохраняют некоторую часть зрения всю свою жизнь. Другие становятся полностью слепыми из-за ПР, в некоторых случаях даже в детстве. Развитие ПР отличается в каждом случае. ПР представляет тип наследственной дистрофии сетчатки, группу наследственных расстройств, при которой отклонения от нормы фоторецепторов (палочек и колбочек) или пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) приводят к постепенной потере зрения. Индивидуумы с нарушением сначала испытывают нарушение темновой адаптации или никталопию (ночную слепоту), а затем снижение периферического поля зрения (известное как туннельное зрение) и иногда потерю центрального зрения на поздних стадиях заболевания.Retinitis pigmentosa (RP) is a group of genetic pathological eye conditions. As PD symptoms progress, night blindness usually precedes tunnel vision by years or even decades. Many people with ID are not legally blind until they are 40 or 50 years old and retain some vision throughout their lives. Others become completely blind due to PD, in some cases even during childhood. The development of PR is different in each case. RP is a type of hereditary retinal dystrophy, a group of inherited disorders in which abnormalities in the photoreceptors (rods and cones) or retinal pigment epithelium (RPE) lead to gradual loss of vision. Individuals with the disorder first experience dark adaptation disorder or nyctalopia (night blindness), followed by a decrease in the peripheral visual field (known as tunnel vision) and sometimes loss of central vision in later stages of the disease.

Макулярный отек возникает, когда жидкость и отложения белков собираются на или под макулой глаза, желтой центральной областью сетчатки, вызывая ее утолщение и набухание. Набухание может искажать центральное зрение человека, поскольку макула находится около центра сетчатки сзади глазного яблока. Эта область содержит плотно упакованные колбочки, которые обеспечивают острое, ясное центральное зрение, чтобы обеспечить то, что человек видит форму, цвет и детали, которые находятся непосредственно на линии взгляда. Кистозный макулярный отек представляет тип макулярного отека, который включает образование кист.Macular edema occurs when fluid and protein deposits collect on or under the eye's macula, the yellow central area of the retina, causing it to thicken and swell. The swelling can distort a person's central vision because the macula is located near the center of the retina at the back of the eyeball. This area contains densely packed cones that provide sharp, clear central vision to ensure that a person sees shape, color and detail that is directly in the line of sight. Cystic macular edema is a type of macular edema that involves the formation of cysts.

«Диабетический макулярный отек» (ДМО) при использовании в настоящем документе относится к серьезному патологическому состоянию глаз, которое поражает людей с диабетом (1 или 2 типа). Макулярный отек возникает, когда кровеносные сосуды в сетчатке протекают в макулу, и жидкость и отложения белков собираются на или под макулой глаза (желтой центральной областью сетчатки) и вызывают ее утолщение и набухание (отек). Набухание может искажать центральное зрение человека, поскольку макула находится около центра сетчатки сзади глазного яблока. Первичные симптомы ДМО включают, помимо прочего, туманный взгляд, плавающие точки, потерю контраста, двоение в глазах и возможную потерю зрения. Патология ДМО характеризуется разрушением гемато-ретинального барьера, обычно мешая движению воды в сетчатке, таким образом обеспечивая накопление жидкости в ткани сетчатки и присутствие утолщения сетчатки. ДМО в настоящее время диагностируется при осмотре глаз, состоящем из проверки остроты зрения, при котором определяют самые мелкие буквы, которые человек может читать на стандартной карте, расширенной проверке зрения для проверки на признаки заболевания, процедуре получения изображений, такой как оптическая когерентная томография (ОКТ) или флуоресцентная ангиография (ФА) и тонометрия, инструмент, который измеряет давление внутри глаза. Следующие исследования также проводили для определения лечения: оптическая когерентная томография (ОКТ), флуоресцентная ангиография и стереофотография глазного дна. ДМО можно в широком смысле разделить на две основные категории - фокальный и диффузный. Фокальный ДМО характеризуется конкретными зонами отдельного и различимого протекания в макулу с достаточным макулярным кровотоком. Диффузный ДМО происходит вследствие протекания из всего капиллярного ложа, окружающего макулу, что происходит из-за разрушения внутреннего гемато-ретинального барьера глаза. Помимо фокального и диффузного, ДМО также подразделяют на основе результатов клинических обследований на клинически значимый макулярный отек (КЗМО), не-КЗМО и КЗМО с центральным поражением (КЗМО-ЦП), которое включает ямку. Настоящее изобретение включает способы для лечения вышеуказанных категорий ДМО. В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз выбрано из группы, состоящей из: влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД), диабетического макулярного отека (ДМО), диабетической ретинопатии (ДР), непролиферативной диабетической ретинопатии (НПДР), пролиферативной диабетической ретинопатии (ПДР), васкулита (например, окклюзии вены сетчатки (ОВС) и окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС). В одном варианте реализации сосудистое заболевание глаз выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии (ДР), диабетического макулярного отека (ДМО), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), макулярной дегенерации, влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД), ретинопатии недоношенных (РН), неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), ретинальной ангиоматозной пролиферации, макулярной телеангиэктазии, ишемической ретинопатии, неоваскуляризации радужной оболочки, внутриглазной неоваскуляризации, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки, хориоидальной неоваскуляризации и дегенерации сетчатки, в частности из группы, состоящей из диабетической ретинопатии (ДР), диабетического макулярного отека (ДМО), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД).“Diabetic macular edema” (DME) as used herein refers to a serious eye condition that affects people with diabetes (type 1 or 2). Macular edema occurs when blood vessels in the retina leak into the macula and fluid and protein deposits collect on or under the eye's macula (the yellow central area of the retina) and cause it to thicken and swell (edema). The swelling can distort a person's central vision because the macula is located near the center of the retina at the back of the eyeball. Primary symptoms of DME include, but are not limited to, blurred vision, floaters, loss of contrast, double vision, and possible vision loss. The pathology of DME is characterized by disruption of the blood-retinal barrier, typically interfering with the movement of water in the retina, thereby allowing fluid to accumulate in the retinal tissue and the presence of retinal thickening. DME is currently diagnosed by an eye exam consisting of a visual acuity test that measures the smallest letters a person can read on a standard card, an advanced vision test to check for signs of the disease, an imaging procedure such as optical coherence tomography (OCT) ) or fluorescein angiography (FA) and tonometry, a tool that measures the pressure inside the eye. The following studies were also performed to guide treatment: optical coherence tomography (OCT), fluorescein angiography, and fundus stereophotography. DME can be broadly divided into two main categories - focal and diffuse. Focal DME is characterized by specific areas of separate and distinct flow into the macula with sufficient macular blood flow. Diffuse DME occurs due to leakage from the entire capillary bed surrounding the macula, which occurs due to the destruction of the internal blood-retinal barrier of the eye. In addition to focal and diffuse, DME is also classified based on clinical examination findings into clinically significant macular edema (CSMO), non-CSMO, and CMMO with central involvement (CSMO-CP), which includes the fovea. The present invention includes methods for treating the above categories of DME. In one embodiment of the present invention, the vascular eye disease is selected from the group consisting of: wet age-related macular degeneration (wet AMD), diabetic macular edema (DME), diabetic retinopathy (DR), non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR), proliferative diabetic retinopathy ( PDR), vasculitis (e.g., retinal vein occlusion (RVO) and central retinal vein occlusion (CRVO). In one embodiment, the vascular ocular disease is selected from the group consisting of diabetic retinopathy (DR), diabetic macular edema (DME), vein occlusion retinal vein (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO), macular degeneration, wet age-related macular degeneration (wet AMD), retinopathy of prematurity (ROP), neovascular glaucoma, retinitis pigmentosa (RP), retinal angiomatous proliferation, macular telangiectasia, ischemic retinopathy , iris neovascularization, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization and retinal degeneration, particularly from the group consisting of diabetic retinopathy (DR), diabetic macular edema (DME), retinal vein occlusion (RVO), central vein occlusion retina (CRVO), wet form of age-related macular degeneration (wet AMD).

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет диабетическую ретинопатию (ДР).In one embodiment of the present invention, the vascular eye disease is diabetic retinopathy (DR).

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет диабетический макулярный отек (ДМО).In one embodiment of the present invention, the vascular eye disease is diabetic macular edema (DME).

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет окклюзию вены сетчатки (ОВС).In one embodiment of the present invention, the ocular vascular disease is retinal vein occlusion (RVO).

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет окклюзию центральной вены сетчатки (ОЦВС).In one embodiment of the present invention, the ocular vascular disease is central retinal vein occlusion (CRVO).

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет ретинопатию недоношенных (РН).In one embodiment of the present invention, the vascular eye disease is retinopathy of prematurity (ROP).

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет макулярную дегенерацию.In one embodiment of the present invention, the vascular eye disease is macular degeneration.

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет возрастную макулярную дегенерацию (ВМД).In one embodiment of the present invention, the vascular eye disease is age-related macular degeneration (AMD).

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет влажную форму возрастной макулярной дегенерации (вВМД).In one embodiment of the present invention, the vascular eye disease is the wet form of age-related macular degeneration (AMD).

В одном варианте реализации настоящего изобретения сосудистое заболевание глаз представляет хориоидальную неоваскуляризацию.In one embodiment of the present invention, the vascular disease of the eye is choroidal neovascularization.

ВведениеIntroduction

Жидкий фармацевтический состав согласно настоящему изобретению можно вводить интравитреальными (ИВТ) средствами, например, известными в фармацевтической области (например, соответствующим шприцем). Для интравитреальной инъекции обычно объемы инъекции составляют 50-100 мкл. Интравитреальную инъекцию осуществляют путем использования одноразового шприца и иглы для инъекции 30G (25G-30G) или предварительно заполненного шприца с соответствующей иглой для инъекции. Жидкий состав можно отбирать из флакона, содержащего состав, при помощи иглы с фильтром с размером пор 5 мкм. Техника введения интравитреальных инъекций описана, например, в D.Yorston, Community Eye Health. 2014; 27(87): 47.The liquid pharmaceutical composition of the present invention can be administered by intravitreal (IV) means, for example, known in the pharmaceutical field (eg, an appropriate syringe). For intravitreal injection, injection volumes are typically 50-100 µl. Intravitreal injection is performed by using a disposable syringe and a 30G (25G-30G) injection needle or a prefilled syringe with a matching injection needle. The liquid formulation can be withdrawn from the vial containing the formulation using a 5 µm filter needle. The technique of administering intravitreal injections is described, for example, in D. Yorston, Community Eye Health. 2014; 27(87): 47.

Для этой цели фармацевтический состав биспецифического антитела к VEGF/ANG2 находится в виде жидкого изотоничного состава с вязкостью 15 мПа⋅с или менее, мутностью 25 ЕМФ или менее, осмоляльностью 300±50 мОсм/кг, по существу не содержащего видимые частицы.For this purpose, the pharmaceutical composition of the bispecific antibody to VEGF/ANG2 is in the form of a liquid isotonic formulation with a viscosity of 15 mPa.s or less, a turbidity of 25 FFU or less, an osmolality of 300 ± 50 mOsm/kg, essentially free of visible particles.

Составы, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко выполняется путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны и асептической производственной практики.Formulations intended for in vivo administration must be sterile. This is easily accomplished by filtration through sterile filter membranes and aseptic manufacturing practices.

Способ получения составаMethod of obtaining the composition

Фармацевтический состав согласно настоящему изобретению можно получать способами или процессами, известными в данной области, например, ультрафильтрацией-диафильтрацией, диализом, добавлением и перемешиванием, лиофилизацией, разбавлением и их комбинациями. Примеры получения составов согласно настоящему изобретению можно найти далее в настоящем документе.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by methods or processes known in the art, for example, ultrafiltration-diafiltration, dialysis, addition and mixing, lyophilization, dilution, and combinations thereof. Examples of the preparation of compositions according to the present invention can be found later in this document.

В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтический состав может быть получен путем следующего способа или процесса изготовления, включающего шаги:In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition can be prepared by the following manufacturing method or process, comprising the steps:

1. Замена буфера на буфер диафильтрации, содержащий гистидин-ацетатный буфер, или гистидин-ацетатный буфер и хлорид натрия, или гистидин-ацетатный буфер, хлорид натрия и метионин, или гистидин-ацетатный буфер, хлорид натрия, метионин и сахарозу, путем ультрафильтрации и диафильтрации с использованием полупроницаемой мембраны с ОММ (отсечением по молекулярной массе) от 5 до 80 кДа (30-50 кДа) (30 кДа). Обычно отношение между буфером для диафильтрации и основным объемом раствора составляет 5-20 (5-10).1. Replacing the buffer with a diafiltration buffer containing histidine acetate buffer, or histidine acetate buffer and sodium chloride, or histidine acetate buffer, sodium chloride and methionine, or histidine acetate buffer, sodium chloride, methionine and sucrose, by ultrafiltration and diafiltration using a semi-permeable membrane with a MW (molecular weight cut-off) of 5 to 80 kDa (30-50 kDa) (30 kDa). Typically the ratio between diafiltration buffer and bulk solution volume is 5-20 (5-10).

2. Альтернативно 1, замену буфера можно обеспечить при помощи диализа, используя буфер для диализа, содержащий гистидин-ацетатный буфер, или гистидин-ацетатный буфер и хлорид натрия, или гистидин-ацетатный буфер, хлорид натрия и метионин, или гистидин-ацетатный буфер, хлорид натрия, метионин и сахарозу, и диализную мембрану с ОММ от 5 до 80 кДа (30-50 кДа) (30 кДа). Обычно отношение между буфером для диализа и основным объемом раствора составляет 5-20 (5-10).2. Alternative 1, buffer exchange can be achieved by dialysis using a dialysis buffer containing histidine acetate buffer, or histidine acetate buffer and sodium chloride, or histidine acetate buffer, sodium chloride and methionine, or histidine acetate buffer, sodium chloride, methionine and sucrose, and a dialysis membrane with a GMM of 5 to 80 kDa (30-50 kDa) (30 kDa). Typically the ratio between dialysis buffer and bulk solution is 5-20 (5-10).

3. Основной объем раствора с замененным буфером концентрируют ультрафильтрацией, используя мембрану для диафильтрации с ОММ (отсечением по молекулярной массе) от 5 до 80 кДа (30-50 кДа) (30 кДа) с концентрацией белка более 120 мг/мл (120-160 мг/мл) (120-200 мг/мл).3. The main volume of the solution with the replaced buffer is concentrated by ultrafiltration using a diafiltration membrane with a GMM (molecular weight cutoff) from 5 to 80 kDa (30-50 kDa) (30 kDa) with a protein concentration of more than 120 mg/ml (120-160 mg/ml) (120-200 mg/ml).

4. Готовую композицию фармацевтического состава регулируют добавлением исходных растворов соответствующих вспомогательных веществ или при помощи соответствующего стабилизирующего буфера. Раствор гомогенизируют перемешиванием.4. The finished pharmaceutical composition is adjusted by adding stock solutions of appropriate excipients or using an appropriate stabilizing buffer. The solution is homogenized by stirring.

Кроме того, способ или процесс изготовления может включать следующие шаги:In addition, the manufacturing method or process may include the following steps:

5. Готовый составленный раствор можно хранить замороженным при температуре ниже -20°С (ниже -40°С).5. The prepared solution can be stored frozen at temperatures below -20°C (below -40°C).

6. Перед заполнением в окончательный первичный контейнер раствор размораживают.6. The solution is thawed before filling into the final primary container.

7. Несколько контейнеров или партий фармацевтического состава смешивают и гомогенизируют перемешиванием.7. Several containers or batches of the pharmaceutical composition are mixed and homogenized by stirring.

8. Гомогенизированный фармацевтический состав фильтруют через несколько (по меньшей мере два) стерилизующих фильтра с размером пор по меньшей мере 0,2 или 0,22 мкм.8. The homogenized pharmaceutical composition is filtered through several (at least two) sterilizing filters with a pore size of at least 0.2 or 0.22 microns.

9. Стерильно отфильтрованным раствором заполняют в асептических условиях в стерильные флаконы или предварительно заполняемые шприцы и закрывают эластомерной пробкой, соответствующими ограничителем хода поршня и колпачками наконечников.9. The sterile filtered solution is filled aseptically into sterile vials or pre-filled syringes and sealed with an elastomeric stopper, appropriate plunger stop and tip caps.

10. Заполненные первичные контейнеры осматривают на дефекты и видимые частицы.10. Filled primary containers are inspected for defects and visible particles.

11. Предварительно заполненные шприцы собирают с соответствующими компонентами устройства, упаковывают в стерильную защитную систему и стерилизуют по наружной поверхности.11. Prefilled syringes are assembled with appropriate device components, packaged in a sterile containment system, and externally sterilized.

12. Флаконы и стерилизованные шприцы упаковывают в окончательную вторичную упаковку.12. Vials and sterilized syringes are packaged in final secondary packaging.

Фармацевтические составы согласно настоящему изобретению также могут быть в лиофилизированной форме или в жидком виде, восстановленном из лиофилизированной формы. «Лиофилизированную форму» изготавливают путем способов лиофильной сушки, известных в данной области. Лиофилизат обычно имеет остаточное содержание влаги приблизительно 0,1-5% (масс./масс.) и находится в виде порошка или физически стабильного осадка. «Восстановленную форму» можно получать из лиофилизата путем быстрого растворения после добавления среды для восстановления. Подходящие среды для восстановления включают, помимо прочего, воду для инъекции (ВДИ), бактериостатическую воду для инъекции (БВДИ), растворы хлорида натрия (например, 0,9% (масс./об.) NaCl) и растворы глюкозы (например, 5% (масс./об.) глюкозы).The pharmaceutical compositions of the present invention may also be in lyophilized form or in liquid form reconstituted from lyophilized form. The “lyophilized form” is prepared by freeze-drying methods known in the art. The lyophilisate typically has a residual moisture content of approximately 0.1-5% (w/w) and is in the form of a powder or physically stable precipitate. The "reconstituted form" can be prepared from the lyophilisate by rapid dissolution after addition of reconstitution medium. Suitable reconstitution media include, but are not limited to, water for injection (WFI), bacteriostatic water for injection (WFI), sodium chloride solutions (eg, 0.9% (w/v) NaCl), and glucose solutions (eg, 5 % (wt./vol.) glucose).

Получение антителObtaining antibodies

Антитела к VEGF/ANG2, которые особенно пригодны для настоящего изобретения, получают рекомбинантными средствами. Способы рекомбинантного получения широко известны в уровне техники и включают экспрессию белков в клетках прокариот и эукариот с последующим выделением антитела и обычно очисткой до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии антител, как указано выше в клетке-хозяине, нуклеиновые кислоты, кодирующие соответствующие модифицированные легкие и тяжелые цепи, вставляют в векторы экспрессии стандартными методами. Экспрессию проводят в соответствующих клетках-хозяевах прокариот или эукариот, таких как клетки СНО, клетки NSO, клетки SP2/0, клетки НЕК293, клетки COS, клетки PER.C6, дрожжи или клетки E.coli, и выделяют антитело из клеток (супернатанта или клеток после лизиса). Общие методы рекомбинантного получения антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в обзорных статьях Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. Способ получения антитела, пригодный в настоящем изобретении, включает шаги а) трансформация клетки-хозяина векторами, содержащими молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих указанное антитело; б) культивацию клетки-хозяина при условиях, которые обеспечивают синтез указанной молекулы антитела; и в) выделение указанной молекулы антитела из указанной культуры.Antibodies to VEGF/ANG2, which are particularly useful in the present invention, are produced by recombinant means. Recombinant production methods are widely known in the art and involve expression of proteins in prokaryotic and eukaryotic cells, followed by isolation of the antibody and typically purification to pharmaceutically acceptable purity. To express antibodies as described above in a host cell, nucleic acids encoding the appropriate modified light and heavy chains are inserted into expression vectors by standard methods. Expression is carried out in appropriate prokaryotic or eukaryotic host cells, such as CHO cells, NSO cells, SP2/0 cells, HEK293 cells, COS cells, PER.C6 cells, yeast or E. coli cells, and the antibody is isolated from the cells (supernatant or cells after lysis). General methods for recombinant antibody production are well known in the art and are described, for example, in review articles by Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol 16 (2000) 151-160; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. A method for producing an antibody useful in the present invention comprises the steps of a) transforming a host cell with vectors containing nucleic acid molecules encoding said antibody; b) cultivating the host cell under conditions that ensure the synthesis of said antibody molecule; and c) isolating said antibody molecule from said culture.

Антитела удобно отделять от культуральной среды с помощью традиционных процедур очистки иммуноглобулина, таких как, например, хроматография с протеином А-сефарозой, с гидроксиапатитом, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделять и секвенировать при помощи обычных процедур. Клетки гибридомы могут служить в качестве источника такой ДНК и РНК. Как только выделена, ДНК может быть вставлена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки НЕК 293, клетки СНО или клетки миеломы, которые в ином случае не продуцируют белок-иммуноглобулин, с получением синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.Antibodies are conveniently separated from the culture medium using conventional immunoglobulin purification procedures, such as, for example, protein A-Sepharose chromatography, hydroxyapatite, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography. DNA and RNA encoding monoclonal antibodies can be easily isolated and sequenced using routine procedures. Hybridoma cells can serve as a source of such DNA and RNA. Once isolated, the DNA can be inserted into expression vectors, which are then transfected into host cells, such as HEK 293 cells, CHO cells, or myeloma cells that do not otherwise produce immunoglobulin protein, to produce recombinant monoclonal antibodies in the cells -the owners.

Варианты аминокислотных последовательностей (или мутанты) биспецифического антитела получают путем введения соответствующих изменений нуклеотидов в ДНК антитела или путем нуклеотидного синтеза. Такие модификации можно проводить, однако, только в очень ограниченном диапазоне. Например, модификации не изменяют вышеуказанные характеристики антитела, такие как изотип IgG и связывание антигена, но могут улучшать выход рекомбинантного получения, стабильность белка или облегчать очистку.Amino acid sequence variants (or mutants) of a bispecific antibody are produced by introducing appropriate nucleotide changes into the antibody's DNA or by nucleotide synthesis. Such modifications can, however, only be carried out within a very limited range. For example, modifications do not change the above characteristics of the antibody, such as IgG isotype and antigen binding, but may improve recombinant yield, protein stability, or facilitate purification.

Термин «клетка-хозяин» при использовании в настоящей заявке означает любой вид клеточной системы, который можно сконструировать для создания антител, содержащихся в составе настоящего изобретения. В одном варианте реализации клетки НЕК293 и клетки СНО используют в качестве клеток-хозяев.The term "host cell" as used herein means any type of cellular system that can be engineered to generate the antibodies contained in the present invention. In one embodiment, HEK293 cells and CHO cells are used as host cells.

При использовании в настоящем документе выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первично измененные клетки и культуры, полученные из них, вне зависимости от числа переносов. Также понятно, что все потомство может не быть точно идентичным в отношении содержания ДНК из-за намеренных или случайных мутаций. Включено потомство вариантов, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, в отношении которых проводится скрининг изначально трансформированных клеток.When used herein, the expressions “cell,” “cell line,” and “cell culture” are used interchangeably, and all such designations include progeny. Thus, the words “transformants” and “transformed cells” include primarily modified cells and cultures derived from them, regardless of the number of transfers. It is also understood that all offspring may not be exactly identical with respect to DNA content due to intentional or accidental mutations. Progeny variants that have the same function or biological activity against which the initially transformed cells are screened are included.

Экспрессия в клетках NS0 описана, например, в Barnes, L.M., et al, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Временная экспрессия описана, например, в Durocher, Y., et al, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Клонирование вариабельных доменов описано в Orlandi, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; и Norderhaug, L., et al, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Предпочтительная система временной экспрессии (НЕК 293) описана Schlaeger, E.-J., и Christensen, К., в Cytotechnology 30 (1999) 71-83 и Schlaeger, E.-J., в J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.Expression in NS0 cells is described, for example, in Barnes, L.M., et al, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Transient expression is described, for example, in Durocher, Y., et al, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Cloning of variable domains is described in Orlandi, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; and Norderhaug, L., et al, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. A preferred transient expression system (HEK 293) is described by Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 and Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

Например, регуляторные последовательности, которые подходят для прокариот, включают промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.For example, regulatory sequences that are suitable for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to use promoters, enhancers, and polyadenylation signals.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде белка-предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчить трансляцию. Как правило, «функционально связанный» означает, что последовательности ДНК, являющиеся связанными, являются смежными и, в случае секреторной лидерной последовательности, смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования в удобных сайтах рестрикции. Если таких сайтов не существует, синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры используются в соответствии с общепринятой практикой.A nucleic acid is "operably linked" when it is in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a presequence or secretory leader sequence is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a precursor protein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects transcription of the sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is located to facilitate translation. Generally, “operably linked” means that the DNA sequences that are linked are contiguous and, in the case of a secretory leader sequence, contiguous and in reading frame. However, enhancers do not need to be contiguous. Binding is accomplished by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to standard practice.

Очистку антител проводят для исключения компонентов клеток или других загрязняющих веществ, например, других нуклеиновых кислот или белков клеток, стандартными технологиями, включая обработку щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие, хорошо известные в данной области. См. Ausubel, F., et al, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Для очистки белков разработаны и нашли широкое распространение различные методы, такие как аффинная хроматография с использованием белков микроорганизмов (например, аффинная хроматография на белке А или белке G), ионообменная хроматография (например, катионообменная (карбоксиметиловые смолы), анионообменная (аминоэтиловые смолы) хроматография и хроматография со смешанной формой разделения), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH-лигандами), хроматография на основе гидрофобного взаимодействия или адсорбционная хроматография ароматических соединений (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами или м-аминофенилбороновой кислотой), металлхелатирующая аффинная хроматография (например, с материалом, обладающим аффинностью к Ni(II) и Cu(II)), гель-фильтрация и электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi, М.А., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).Antibodies are purified to eliminate cellular components or other contaminants, such as other nucleic acids or cellular proteins, by standard techniques including alkali/SDS treatment, CsCl banding, column chromatography, agarose gel electrophoresis, and others well known in the art. See Ausubel, F., et al, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Various methods have been developed and are widely used for the purification of proteins, such as affinity chromatography using microbial proteins (for example, affinity chromatography on protein A or protein G), ion exchange chromatography (for example, cation exchange (carboxymethyl resins), anion exchange (aminoethyl resins) chromatography and mixed form chromatography), thiophilic adsorption (e.g. with beta-mercaptoethanol and other SH ligands), hydrophobic interaction chromatography or aromatic adsorption chromatography (e.g. with phenyl-Sepharose, aza-arenophilic resins or m-aminophenylboronic acid ), metal chelating affinity chromatography (eg with material having affinity for Ni(II) and Cu(II)), gel filtration and electrophoretic techniques (such as gel electrophoresis, capillary electrophoresis) (Vijayalakshmi, M.A., Appl Biochem Biotech 75 (1998) 93-102).

Далее перечислены варианты реализации настоящего изобретения:The following are embodiments of the present invention:

1. Жидкий фармацевтический состав, содержащий:1. Liquid pharmaceutical composition containing:

- от 20 до 150 мг/мл биспецифического антитела к VEGF/ANG2, содержащего константную область тяжелой цепи подкласса IgG1 человека (в одном варианте реализации 30 мг/мл ± 4,5 мг/мл или 120 мг/мл ± 18 мг/мл),- from 20 to 150 mg/ml of a bispecific antibody to VEGF/ANG2 containing the heavy chain constant region of the human IgG1 subclass (in one embodiment, 30 mg/ml ± 4.5 mg/ml or 120 mg/ml ± 18 mg/ml) ,

- от 15 до 35 мМ хлорида натрия (в одном варианте реализации 25 мМ ± 5 мМ; в одном варианте реализации 25 мМ ± 3,75 мМ хлорида натрия; в частности, 25 мМ ± 2,5 мМ хлорида натрия),- 15 to 35 mM sodium chloride (in one embodiment, 25 mM ± 5 mM; in one embodiment, 25 mM ± 3.75 mM sodium chloride; in particular, 25 mM ± 2.5 mM sodium chloride),

- от 15 до 25 мМ гистидин-ацетатного буфера (в одном варианте реализации 20 мМ ± 3 мМ гистидин-ацетатного буфера; в одном варианте реализации 20 мМ ± 2 мМ гистидин-ацетатного буфера),- 15 to 25 mM histidine acetate buffer (in one embodiment, 20 mM ± 3 mM histidine acetate buffer; in one embodiment, 20 mM ± 2 mM histidine acetate buffer),

при рН 5,5±0,5 (в одном варианте реализации при рН 5,5±0,3; в частности, при рН 5,5±0,2);at a pH of 5.5±0.5 (in one embodiment, at a pH of 5.5±0.3; in particular, at a pH of 5.5±0.2);

где биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 является двухвалентным и содержит первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с ANG-2 человека, гдеwherein the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody is bivalent and contains a first antigen binding site that specifically binds to human VEGF and a second antigen binding site that specifically binds to human ANG-2, wherein

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся с ANG-2, содержит в вариабельном домене тяжелой цепи CDRSH-область с SEQ ID NO: 9, CDR2H-область с SEQ ID NO: 10 и CDR1H-область с SEQ ID NO: 11, и в вариабельном домене легкой цепи CDR3L-область с SEQ ID NO: 12, CDR2L-область с SEQ ID NO: 13 и CDR1L-область с SEQ ID NO: 14, и гдеii) said second antigen binding site specifically binding to ANG-2 comprises, in the heavy chain variable domain, a CDRSH region of SEQ ID NO: 9, a CDR2H region of SEQ ID NO: 10, and a CDR1H region of SEQ ID NO: 11, and in the light chain variable domain, the CDR3L region of SEQ ID NO: 12, the CDR2L region of SEQ ID NO: 13, and the CDR1L region of SEQ ID NO: 14, and where

2. Фармацевтический состав согласно варианту реализации 1, в котором2. The pharmaceutical composition according to embodiment 1, in which

ii) указанный второй антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся с ANG-2, содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи VH аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, а в качестве вариабельного домена легкой цепи VL - аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.ii) said second antigen binding site specifically binding to ANG-2 contains, as a VH heavy chain variable domain, the amino acid sequence SEQ ID NO: 15, and as a VL light chain variable domain, the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.

3. Фармацевтический состав согласно варианту реализации 2, в котором биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 является двухвалентным и содержит первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с VEGF человека, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с ANG-2 человека, где3. The pharmaceutical composition according to embodiment 2, wherein the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody is bivalent and contains a first antigen binding site that specifically binds to human VEGF and a second antigen binding site that specifically binds to human ANG-2, wherein

4. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-3, в котором биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 является двухвалентным и содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.4. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-3, wherein the bispecific antibody to VEGF/ANG2 is divalent and contains the amino acid sequences of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.

5. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-3, в котором биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 представляет собой фарицимаб.5. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-3, wherein the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody is faricimab.

6. Фармацевтический состав согласно варианту реализации 1, причем состав содержит6. The pharmaceutical composition according to embodiment 1, wherein the composition contains

- 120 мг/мл ± 18 мг/мл биспецифического антитела к VEGF/ANG2 (в частности, 120 мг/мл ± 12 мг/мл биспецифического антитела к VEGF/ANG2).- 120 mg/ml ± 18 mg/ml bispecific antibody to VEGF/ANG2 (in particular, 120 mg/ml ± 12 mg/ml bispecific antibody to VEGF/ANG2).

7. Фармацевтический состав по любому одному из пп. 1-7 для интравитреального введения.7. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-7 for intravitreal administration.

8. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-6, причем состав по существу не содержит видимые частицы.8. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-6, wherein the composition is substantially free of visible particles.

9. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-8, причем состав дополнительно содержит9. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-8, wherein the composition further comprises

- от 1 до 20 мМ по меньшей мере одного стабилизатора (в одном варианте реализации выбранного из сахаров, полиолов и аминокислот).- from 1 to 20 mm of at least one stabilizer (in one embodiment selected from sugars, polyols and amino acids).

10. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-8, причем состав дополнительно содержит10. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-8, wherein the composition further comprises

- 7,0 мМ ± 2,0 мМ метионина (в одном варианте реализации 7,0 мМ ± 1,0 мМ метионина; в одном варианте реализации 7,0 мМ ± 0,7 мМ метионина).- 7.0 mM ± 2.0 mM methionine (in one embodiment, 7.0 mM ± 1.0 mM methionine; in one embodiment, 7.0 mM ± 0.7 mM methionine).

11. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-10, причем состав дополнительно содержит11. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-10, wherein the composition further comprises

- 0,01-0,07% поверхностно-активного вещества (в одном варианте реализации выбранного из полисорбата 20, полисорбата 80 или полоксамера).- 0.01-0.07% surfactant (in one embodiment selected from polysorbate 20, polysorbate 80 or poloxamer).

12. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-10, причем состав дополнительно содержит12. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-10, wherein the composition further comprises

- 0,04% (масс./об.) ± 0,02 (масс./об.) полисорбата 20 (в одном варианте реализации от 0,03% (масс./об.) до 0,07% (масс./об.)); в одном варианте реализации 0,04% (масс./об.) ± 0,01 (масс./об.); в одном варианте реализации приблизительно 0,04% (масс./об.)).- 0.04% (wt./vol.) ± 0.02 (wt./vol.) polysorbate 20 (in one embodiment, from 0.03% (wt./vol.) to 0.07% (wt./vol.) /about.)); in one embodiment, 0.04% (w/v) ± 0.01 (w/v); in one embodiment, approximately 0.04% (w/v)).

13. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-12, причем состав дополнительно содержит13. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-12, wherein the composition further comprises

- 50-250 мМ регулятора тоничности (в одном варианте реализации регулятор тоничности выбирают из сахарозы, трегалозы и сорбита).- 50-250 mM tonicity regulator (in one embodiment, the tonicity regulator is selected from sucrose, trehalose and sorbitol).

14. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-12, причем состав дополнительно содержит14. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-12, wherein the composition further comprises

- 160 мМ ± 24 мМ сахарозы (в одном варианте реализации 160 мМ ± 16 мМ; в одном варианте реализации приблизительно 160 мМ).- 160 mM ± 24 mM sucrose (in one embodiment, 160 mM ± 16 mM; in one embodiment, approximately 160 mM).

15. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-14, причем состав имеет вязкость 20 мПа⋅с или менее (в одном варианте реализации 17 мПа⋅с или менее; в одном варианте реализации 16 мПа⋅с или менее, в одном варианте реализации приблизительно 15 мПа⋅с или менее; в одном варианте реализации 15 мПа⋅с или менее).15. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-14, wherein the composition has a viscosity of 20 mPa.s or less (in one embodiment, 17 mPa.s or less; in one embodiment, 16 mPa.s or less, in one embodiment implementations of approximately 15 mPa⋅s or less; in one embodiment, 15 mPa⋅s or less).

16. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-15, причем состав имеет мутность 30 ЕМФ или менее (в одном варианте реализации 27 ЕМФ или менее; в одном варианте реализации 26 ЕМФ или менее; в одном варианте реализации приблизительно 25 ЕМФ или менее; в одном варианте реализации 25 ЕМФ или менее).16. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-15, wherein the composition has a turbidity of 30 FFU or less (in one embodiment, 27 FFU or less; in one embodiment, 26 FFU or less; in one embodiment, approximately 25 FFU or less ; in one embodiment, 25 EMF or less).

17. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-16, причем состав имеет ионную силу от 20 до 50 (в одном варианте реализации ионную силу от 30 до 50 (в одном варианте реализации ионную силу от 30 до 45; в одном варианте реализации ионную силу 30±10).17. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-16, wherein the composition has an ionic strength from 20 to 50 (in one embodiment, an ionic strength from 30 to 50 (in one embodiment, an ionic strength from 30 to 45; in one embodiment ionic strength 30±10).

18. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-17 для интравитреального введения, причем состав по существу не содержит хлорид кальция (или не содержит хлорид кальция).18. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-17 for intravitreal administration, wherein the composition is substantially free of calcium chloride (or does not contain calcium chloride).

19. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-17 для интравитреального введения, причем состав по существу не содержит аргинин (или не содержит аргинин).19. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-17 for intravitreal administration, wherein the composition is substantially free of arginine (or does not contain arginine).

20. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-17 для интравитреального введения, причем состав по существу не содержит аргинин и хлорид кальция (или не содержит аргинин и хлорид кальция).20. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-17 for intravitreal administration, wherein the composition is substantially free of arginine and calcium chloride (or free of arginine and calcium chloride).

21. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-5 и 7-20, причем состав содержит или состоит (по меньшей мере) из следующих компонентов:21. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-5 and 7-20, wherein the composition contains or consists of (at least) the following components:

- от 20 до 150 мг/мл биспецифического антитела к VEGF/ANG2 (в одном варианте реализации 30 мг/мл ± 4,5 мг/мл или 120 мг/мл ± 18 мг/мл, в частности, 120 мг/мл ± 12 мг/мл);- from 20 to 150 mg/ml of a bispecific antibody to VEGF/ANG2 (in one embodiment, 30 mg/ml ± 4.5 mg/ml or 120 mg/ml ± 18 mg/ml, in particular, 120 mg/ml ± 12 mg/ml);

- от 15 до 35 мМ хлорида натрия (в одном варианте реализации 25 мМ ± 5 мМ; в одном варианте реализации 25 мМ ± 3,75 мМ хлорида натрия; в частности, 25 мМ ± 2,5 мМ хлорида натрия);- 15 to 35 mM sodium chloride (in one embodiment, 25 mM ± 5 mM; in one embodiment, 25 mM ± 3.75 mM sodium chloride; in particular, 25 mM ± 2.5 mM sodium chloride);

- от 15 до 25 мМ гистидин-ацетатного буфера (в одном варианте реализации 20 мМ ± 3 мМ гистидин-ацетатного буфера; в одном варианте реализации 20 мМ ± 2 мМ гистидин-ацетатного буфера);- 15 to 25 mM histidine acetate buffer (in one embodiment, 20 mM ± 3 mM histidine acetate buffer; in one embodiment, 20 mM ± 2 mM histidine acetate buffer);

- 7,0 мМ ± 2,0 мМ метионина (в одном варианте реализации 7,0 мМ ± 1,0 мМ метионина; в одном варианте реализации 7,0 мМ ± 0,7 мМ метионина);- 7.0 mM ± 2.0 mM methionine (in one embodiment, 7.0 mM ± 1.0 mM methionine; in one embodiment, 7.0 mM ± 0.7 mM methionine);

- от 0,03% (масс./об.) до 0,07% (масс./об.) полисорбата 20 (в одном варианте реализации 0,04% (масс./об.) ± 0,02 (масс./об.); в одном варианте реализации 0,04% (масс./об.) ± 0,01 (масс./об.); в одном варианте реализации приблизительно 0,04% (масс./об.));- from 0.03% (wt./vol.) to 0.07% (wt./vol.) polysorbate 20 (in one embodiment, 0.04% (wt./vol.) ± 0.02 (wt./vol.) /v); in one embodiment, 0.04% (w/v) ± 0.01 (w/v); in one embodiment, approximately 0.04% (w/v));

- 160 мМ ± 24 мМ сахарозы (в одном варианте реализации 160 мМ ± 16 мМ; в одном варианте реализации приблизительно 160 мМ);- 160 mM ± 24 mM sucrose (in one embodiment, 160 mM ± 16 mM; in one embodiment, approximately 160 mM);

- вода (для (офтальмологических) инъекций);- water (for (ophthalmic) injections);

22. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-21, причем состав представляет собой стабильный состав.22. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-21, wherein the composition is a stable formulation.

23. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-21, в котором содержание высокомолекулярных соединений (ВМС) биспецифического антитела в фармацевтическом составе составляет менее 10% через 8 недель при 25°С или через 52 недели при 25°С (в одном варианте реализации менее 5%).23. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-21, in which the content of high molecular weight compounds (HMW) of the bispecific antibody in the pharmaceutical composition is less than 10% after 8 weeks at 25°C or after 52 weeks at 25°C (in one embodiment sales less than 5%).

24. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-21, причем главный пик биспецифического антитела в фармацевтическом составе составляет более 50%, и содержание высокомолекулярных соединений (ВМС) биспецифического антитела в фармацевтическом составе составляет менее 10% через 2 года при 2-8°С (или через 3 года при 2-8°С) (главный пик биспецифического антитела в фармацевтическом составе составляет более 55%, и содержание высокомолекулярных соединений (ВМС) биспецифического антитела в фармацевтическом составе составляет менее 7% через 2 года при 2-8°С (или через 3 года при 2-8°С)).24. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-21, wherein the main peak of the bispecific antibody in the pharmaceutical composition is more than 50%, and the high molecular weight compounds (HMW) content of the bispecific antibody in the pharmaceutical composition is less than 10% after 2 years at 2-8 °C (or after 3 years at 2-8 °C) (the main peak of the bispecific antibody in the pharmaceutical composition is more than 55%, and the content of high molecular weight compounds (HMCs) of the bispecific antibody in the pharmaceutical composition is less than 7% after 2 years at 2-8 °C (or after 3 years at 2-8 °C)).

25. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-24, причем осмоляльность состава составляет 300±100 мОсм/кг (в одном варианте реализации 300±50 мОсм/кг).25. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-24, wherein the osmolality of the composition is 300 ± 100 mOsm/kg (in one embodiment, 300 ± 50 mOsm/kg).

26. Фармацевтический состав согласно любому одному из вариантов реализации 1-25 для применения в лечении сосудистого заболевания глаз.26. The pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-25 for use in the treatment of vascular eye disease.

27. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, где сосудистые заболевания глаз выбраны из группы, состоящей из диабетической ретинопатии (ДР), диабетического макулярного отека (ДМО), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), макулярной дегенерации, влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД), ретинопатии недоношенных (РН), неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), ретинальной ангиоматозной пролиферации, макулярной телеангиэктазии, ишемической ретинопатии, неоваскуляризации радужной оболочки, внутриглазной неоваскуляризации, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки, хориоидальной неоваскуляризации и дегенерации сетчатки, в частности из группы, состоящей из диабетической ретинопатии (ДР), диабетического макулярного отека (ДМО), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД).27. The pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the vascular diseases of the eye are selected from the group consisting of diabetic retinopathy (DR), diabetic macular edema (DME), retinal vein occlusion (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO), macular degeneration, wet age-related macular degeneration (wet AMD), retinopathy of prematurity (ROP), neovascular glaucoma, retinitis pigmentosa (RP), retinal angiomatous proliferation, macular telangiectasia, ischemic retinopathy, iris neovascularization, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization , choroidal neovascularization and retinal degeneration, in particular from the group consisting of diabetic retinopathy (DR), diabetic macular edema (DME), retinal vein occlusion (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO), wet age-related macular degeneration (wet AMD) .

28. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, причем сосудистое заболевание глаз представляет диабетическую ретинопатию.28. A pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the vascular eye disease is diabetic retinopathy.

29. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, причем сосудистое заболевание глаз представляет диабетический макулярный отек (ДМО).29. A pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the vascular eye disease is diabetic macular edema (DME).

30. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, причем сосудистое заболевание глаз представляет окклюзию вены сетчатки (ОВС).30. A pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the vascular eye disease is retinal vein occlusion (RVO).

31. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, причем окклюзия вены сетчатки представляет окклюзию центральной вены сетчатки (ОЦВС).31. A pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the retinal vein occlusion is a central retinal vein occlusion (CRVO).

32. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, причем сосудистое заболевание глаз представляет макулярную дегенерацию.32. A pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the vascular eye disease is macular degeneration.

33. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, причем макулярная дегенерация представляет возрастную макулярную дегенерацию (ВМД).33. A pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the macular degeneration is age-related macular degeneration (AMD).

34. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, причем макулярная дегенерация представляет влажную форму возрастной макулярной дегенерации (вВМД) (также называемой неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией (нВМД).34. A pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the macular degeneration is a wet form of age-related macular degeneration (aAMD) (also referred to as neovascular age-related macular degeneration (nAMD).

35. Фармацевтический состав для применения согласно варианту реализации 26, причем сосудистое заболевание глаз представляет хориоидальную неоваскуляризацию.35. A pharmaceutical composition for use according to embodiment 26, wherein the vascular eye disease is choroidal neovascularization.

36. Способ получения фармацевтического состава по любому одному из вариантов реализации 1-25, причем36. A method for producing a pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-25, wherein

способ включает такие шаги:the method includes the following steps:

- замена буфера основного объема раствора биспецифического антитела а) на буфер для диафильтрации путем ультрафильтрации и диафильтрации или б) путем диализа при помощи буфера для диализа, причем буферы содержат гистидин-ацетатный буфер, или гистидин-ацетатный буфер и хлорид натрия, или гистидин-ацетатный буфер, хлорид натрия и метионин, или гистидин-ацетатный буфер, хлорид натрия, метионин и сахарозу;- replacing the buffer of the main volume of the bispecific antibody solution with a) a diafiltration buffer by ultrafiltration and diafiltration or b) by dialysis using a dialysis buffer, the buffers containing a histidine acetate buffer, or a histidine acetate buffer and sodium chloride, or histidine acetate buffer, sodium chloride and methionine, or histidine acetate buffer, sodium chloride, methionine and sucrose;

- концентрирование основного объема раствора с замененным буфером путем ультрафильтрации;- concentration of the main volume of the solution with the replaced buffer by ultrafiltration;

- регулирование готовой композиции фармацевтического состава путем добавления исходных растворов соответствующих вспомогательных веществ или при помощи соответствующего стабилизирующего буфера и гомогенизация жидкого фармацевтического состава путем перемешивания.- adjusting the finished pharmaceutical composition by adding stock solutions of appropriate excipients or using an appropriate stabilizing buffer and homogenizing the liquid pharmaceutical composition by stirring.

37. Флакон, содержащий фармацевтический состав по любому одному из вариантов реализации 1-25.37. A bottle containing the pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-25.

38. Предварительно заполненный шприц, содержащий фармацевтический состав по любому одному из вариантов реализации 1-25.38. A pre-filled syringe containing the pharmaceutical composition of any one of embodiments 1-25.

39. Лиофилизированная форма жидкого фармацевтического состава по любому одному из вариантов реализации 1-25.39. Lyophilized form of the liquid pharmaceutical composition according to any one of embodiments 1-25.

ПримерыExamples

Жидкие фармацевтические составы лекарственных средств для интравитреального (ИВТ) введения согласно настоящему изобретению были разработаны следующим образом.Liquid pharmaceutical formulations of drugs for intravitreal (IV) administration according to the present invention have been developed as follows.

Пример 1: Материалы и способыExample 1: Materials and Methods

Биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимаб), полученное и очищенное, как описано в WO 2014/009465, предоставляли для дальнейших экспериментов исходно в концентрации приблизительно 130-140 мг/мл в 20 мМ гистидин-HCl буфера при рН 5,5.Anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody CrossMAb VEGFang2-0016 (faricimab), prepared and purified as described in WO 2014/009465, was provided for further experiments initially at a concentration of approximately 130-140 mg/ml in 20 mM histidine-HCl buffer at pH 5 ,5.

Краткое описание материалов (включая поставщика), используемых при получении составов, и их первичная упаковка даны в таблице 1 и таблице 2.A brief description of the materials (including the supplier) used in the preparation of the formulations and their primary packaging is given in Table 1 and Table 2.

Укупорочная система контейнераContainer closure system

Бесцветный 2 мл или 6 мл стеклянный флакон (стекло 1 типа), закрытый посредством резиновой пробки (D 777-1, 13 мм) и алюминиевой дополнительной укупорки с предохранительным колпачком.Colorless 2 ml or 6 ml glass bottle (type 1 glass), closed with a rubber stopper (D 777-1, 13 mm) and an aluminum additional closure with a safety cap.

Бесцветный 1,0 мл предварительно заполняемый шприц (стекло 1 типа) с насадкой Люэра, закрытый посредством колпачка наконечника Gerresheimer Buende TELC и ограничителя хода поршня West 4023/50.Clear 1.0 ml pre-fill syringe (type 1 glass) with luer lock, sealed with Gerresheimer Buende TELC tip cap and West 4023/50 plunger stop.

Бесцветный 0,5 мл предварительно заполняемый шприц (стекло 1 типа) с насадкой Люэра, закрытый посредством колпачка наконечника Vetter OVS и ограничителя хода поршня West 4023/50. Колпачок наконечника Vetter OVS состоит из эластомера West 4023/50.Clear 0.5 ml pre-fill syringe (type 1 glass) with luer lock, sealed with Vetter OVS tip cap and West 4023/50 plunger stop. The Vetter OVS tip cap consists of West 4023/50 elastomer.

Эксклюзионная хроматография (ЭХ-ВЭЖХ)Size exclusion chromatography (SEC-HPLC)

Эксклюзионную хроматографию (ЭХ) использовали для обнаружения растворимых высокомолекулярных соединений (агрегатов) и низкомолекулярных продуктов гидролиза (НМ) в составах. Метод проводили при помощи TSK-Gel G3000SWXL, 7,8 × 300 мм, 5 мкм (Tosoh Bioscience, №по каталогу 08541) или BioSuite 250, 7,8 × 300 мм или 5 мкм (Waters, №по каталогу 186002165). Интактный мономер, агрегаты и фрагменты разделяли по профилю изократического элюирования, используя 0,2 М фосфат калия, 0,25 М KCl, рН 7,0 в качестве подвижной фазы, и обнаруживали при длине волны 280 нм.Size exclusion chromatography (SEC) was used to detect soluble high molecular weight compounds (aggregates) and low molecular weight hydrolysis products (LMW) in the formulations. The method was performed using TSK-Gel G3000SWXL, 7.8 × 300 mm, 5 μm (Tosoh Bioscience, Cat. No. 08541) or BioSuite 250, 7.8 × 300 mm or 5 μm (Waters, Cat. No. 186002165). Intact monomer, aggregates and fragments were separated by an isocratic elution profile using 0.2 M potassium phosphate, 0.25 M KCl, pH 7.0 as the mobile phase and detected at 280 nm.

Ионообменная хроматография (ИО-ВЭЖХ)Ion exchange chromatography (IO-HPLC)

Ионообменную хроматографию (ИОХ) проводили для обнаружения продуктов химического разложения, изменяющих полный заряд тестируемого антитела в составах. Метод проводили при помощи колонки YMC BioPro SP-F, 100 × 4,6 мм, 5 мкм (YMC, номер по каталогу SF00S05-1046WP). 20 мМ BES (N,N-бис[2-гидроксиэтил]-2-аминоэтансульфоновая кислота), рН 6,8, использовали в качестве элюента А, а 20 мМ BES, 488 мМ NaCl, рН 6,8 в качестве элюента В, соответственно, при скорости потока 0,8 мл/мин. Образцы разводили элюентом А до 3 мг/мл перед впрыском в колонку.Ion exchange chromatography (IEC) was performed to detect chemical degradation products that alter the overall charge of the test antibody in the formulations. The method was performed using a YMC BioPro SP-F column, 100 × 4.6 mm, 5 μm (YMC, catalog number SF00S05-1046WP). 20 mM BES (N,N-bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethanesulfonic acid), pH 6.8, was used as eluent A, and 20 mM BES, 488 mM NaCl, pH 6.8 was used as eluent B. accordingly, at a flow rate of 0.8 ml/min. Samples were diluted with eluent A to 3 mg/mL before injection into the column.

Программа градиента:Gradient program:

Мутность образцов состава измеряли на турбидиметре Hach 2100 AN согласно Европейской фармакопее 2.2.1 (Прозрачность и степень опалесценции жидкостей). Объем образца приблизительно 2 мл раствора образца переносят в стеклянную кювету с внутренним диаметром 11 мм. Стеклянную кювету помещают в турбидиметр и мутность измеряют относительно калибровочной кривой эталонных суспензий 1 ЕМФ, 3 ЕМФ, 10 ЕМФ, 20 ЕМФ и 100 ЕМФ.The turbidity of the composition samples was measured on a Hach 2100 AN turbidimeter according to European Pharmacopoeia 2.2.1 (Clarity and degree of opalescence of liquids). A sample volume of approximately 2 mL of sample solution is transferred into a glass cuvette with an internal diameter of 11 mm. A glass cuvette is placed in a turbidimeter and the turbidity is measured relative to the calibration curve of standard suspensions of 1 EMF, 3 EMF, 10 EMF, 20 EMF and 100 EMF.

Вязкость (в мПа)Viscosity (in mPa)

Вязкость образцов состава измеряли на ротационном реометре Anton Paar Physica MCR 301 с 25 мм - конусом 0,5° при скорости сдвига 1000 с^-1 и температуре 20°С.The viscosity of the composition samples was measured on an Anton Paar Physica MCR 301 rotational rheometer with a 25 mm 0.5° cone at a shear rate of 1000 s ^-1 and a temperature of 20°C.

Видимые частицыVisible particles

Образцы во флаконах визуально осматривали на контрольно-измерительной машине Seidenader V90-T с помощью 2 х увеличительной линзы. Источники освещения L1, L2 и L3 доводили до установки 5. Образцы флаконов изучали при вращательном движении на наличие частиц.Samples in vials were visually inspected on a Seidenader V90-T inspection machine using a 2 x magnifying lens. Illumination sources L1, L2 and L3 were brought to setting 5. Sample vials were examined in a rotating motion for the presence of particles.

Концентрацию белка в образцах состава измеряли путем поглощения ультрафиолетового (УФ) излучения на фотометре для ультрафиолетовой и видимой части спектра Lambda 35 от Perkin Elmer. Образцы состава разбавляли при помощи 20 мМ раствора L-гистидин-ацетатного буфера рН 5,5 до концентрации белка приблизительно 0,5 мг/мл и набирали в кювету для измерения с толщиной 1 см. УФ-поглощение кюветы для измерения измеряли при длине волны 280 и 320 нм.The protein concentration of the formulation samples was measured by ultraviolet (UV) absorption on a Perkin Elmer Lambda 35 ultraviolet-visible photometer. Formulation samples were diluted with 20 mM L-histidine acetate buffer pH 5.5 to a protein concentration of approximately 0.5 mg/ml and collected in a 1 cm thick measurement cuvette. The UV absorbance of the measurement cuvette was measured at a wavelength of 280 and 320 nm.

Концентрацию белка рассчитывали из измеренных поглощений УФ-излучения при 280 (А280) и 320 нм (А320), коэффициенте экстинкции (Е) 1,70 мл/(мг × см), толщине (d) 1 см и коэффициенте разведения (КР), соответствующем фактическому разбавлению, согласно следующему уравнению:Protein concentration was calculated from measured UV absorbances at 280 (A280) and 320 nm (A320), extinction coefficient (E) 1.70 ml/(mg × cm), thickness (d) 1 cm and dilution factor (DF), corresponding to the actual dilution, according to the following equation:

ОсмоляльностьOsmolality

Осмоляльность образцов состава измеряли на осмометре Osmomat 030 3Р от Gonotec согласно принципу понижения температуры замерзания. рНThe osmolality of the composition samples was measured using an Osmomat 030 3P osmometer from Gonotec according to the principle of freezing point depression. pH

Пример 2: Отбор I рН/буфера УстановкаExample 2: Selection of I pH/buffer Installation

Целью отбора рН/буфера был выбор оптимального рН и буфера для коммерческого состава антитела к VEGF/ANG2 и выбор состава с низкой вязкостью, сниженной мутностью и хорошей стабильностью, что дает низкое образование растворимых агрегатов и заряженных изоформ.The purpose of pH/buffer selection was to select the optimal pH and buffer for a commercial anti-VEGF/ANG2 antibody formulation and to select a formulation with low viscosity, reduced turbidity, and good stability, resulting in low formation of soluble aggregates and charged isoforms.

Первая часть отбора рН/буфера включала три буферные системы L-гистидин/ L-гистидин-HCl (His/His-HCl), L-гистидин-ацетат (His/ацетат) и ацетат натрия (Na/ацетат), диапазон рН от 5,3 до 6,5, диапазоны буферной силы от 7 до 300 мМ и диапазон ионной силы от 5 до 86. Установка активных составов показана в таблице 3.The first part of the pH/buffer selection included three buffer systems L-histidine/L-histidine-HCl (His/His-HCl), L-histidine-acetate (His/acetate) and sodium acetate (Na/acetate), pH range from 5 ,3 to 6.5, buffer strength ranges from 7 to 300 mM, and ionic strength ranges from 5 to 86. The setup of active formulations is shown in Table 3.

Материал и методыMaterial and methods

Краткое описание материалов, используемых при получении составов, и их первичная упаковка даны в таблице 1 и таблице 2.A brief description of the materials used in the preparation of the compositions and their primary packaging is given in Table 1 and Table 2.

В лекарственном веществе заменяли буфер путем диализа, используя Slide-A-Lyzer G2 (Thermo Scientific) с отсечением по молекулярной массе 10 кДа, на буферные системы, перечисленные в таблице 3. Таким образом, 42 мл лекарственного вещества вводили в устройство для диализа и заменяли буфер трижды на 5 л буфера для диализа.The drug substance was buffer exchanged by dialysis using a Slide-A-Lyzer G2 (Thermo Scientific) with a 10 kDa molecular weight cutoff with the buffer systems listed in Table 3. Thus, 42 ml of drug substance was injected into the dialysis device and exchanged buffer three times per 5 liters of dialysis buffer.

Необязательно, если концентрация белка была менее 120 мг/мл после диализа, лекарственное вещество концентрировали центрифугированием при помощи устройства Amicon Ultra 15, Ultracel 10К (Millipore) (20°C, 4000 об/мин).Optionally, if the protein concentration was less than 120 mg/ml after dialysis, the drug was concentrated by centrifugation using an Amicon Ultra 15, Ultracel 10K (Millipore) (20°C, 4000 rpm).

Затем диализированное и необязательно концентрированное лекарственное вещество разводили соответствующим буфером для диализа до целевой концентрации белка 120 мг/мл, что давало конечный раствор лекарственного вещества.The dialyzed and optionally concentrated drug was then diluted with an appropriate dialysis buffer to a target protein concentration of 120 mg/mL to produce the final drug solution.

Каждый раствор лекарственного вещества фильтровали через 0,22 мкм фильтр Sterivex GV (Millipore) и набирали в чистые и стерильные 6 мл флаконы с объемом заполнения 2,7 мл. Флаконы закрывали пробками и обжимали.Each drug solution was filtered through a 0.22 μm Sterivex GV filter (Millipore) and filled into clean and sterile 6 mL vials with a fill volume of 2.7 mL. The bottles were capped and crimped.

Аналитические методыAnalytical methods

Аналитические методы тестирования мутности и вязкости описаны в примере 1.Analytical methods for testing turbidity and viscosity are described in Example 1.

Результатыresults

Фиг. 1 сравнивает результаты мутности и вязкости составов из отбора I рН/буфера.Fig. 1 compares the results of turbidity and viscosity of compositions from selection I pH/buffer.

В общем, составы с высокой ионной силой (например 4, 14, 10, 3, 8 и 18) показывают высокую мутность (свыше 30 ЕМФ) и низкую вязкость (приблизительно 10 мПа⋅с). Напротив, составы с низкой ионной силой имеют высокую вязкость (приблизительно 25-40 мПа⋅с) и низкую мутность (ниже 10 ЕМФ). Неожиданно, что составы с буферной системой гистидин-ацетата (13, 6, 4, 14) можно идентифицировать с низкими вязкостями приблизительно 10 мПа⋅с и мутностью менее 25 ЕМФ.In general, formulations with high ionic strength (eg 4, 14, 10, 3, 8 and 18) exhibit high turbidity (over 30 FFU) and low viscosity (approximately 10 mPa.s). In contrast, formulations with low ionic strength have high viscosity (approximately 25-40 mPa⋅s) and low turbidity (below 10 FFU). Surprisingly, formulations with a histidine acetate buffer system (13, 6, 4, 14) can be identified with low viscosities of approximately 10 mPa⋅s and turbidities of less than 25 FTU.

ВыводConclusion

Измеряли вязкость и мутность составов из отбора I рН/буфера. Неожиданно, что составы гистидин-ацетатной буферной системы и с ионной силой 45,5 или выше показали низкую вязкость и сниженные значения мутности.The viscosity and turbidity of the compositions from selection I pH/buffer were measured. Surprisingly, formulations with histidine acetate buffer system and ionic strength of 45.5 or higher showed low viscosity and reduced turbidity values.

Пример 3: Отбор II рН/буфераExample 3: Selection II pH/buffer

УстановкаInstallation

Целью отбора рН/буфера был выбор оптимального рН и буфера для состава антитела к VEGF/ANG2 CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимаб) и выбор состава с низкой вязкостью, сниженной мутностью и хорошей стабильностью, что дает низкое образование растворимых агрегатов и заряженных изоформ.The purpose of pH/buffer selection was to select the optimal pH and buffer for the anti-VEGF/ANG2 antibody formulation CrossMAb VEGFang2-0016 (faricimab) and to select a formulation with low viscosity, reduced turbidity, and good stability, resulting in low formation of soluble aggregates and charged isoforms.

Вторая часть отбора рН/буфера была разработана на основе результата отбора I рН/буфера и включала буферную систему L-гистидин-ацетат (His/ацетат), диапазон рН от 5,5 до 6,0 с диапазоном буферной силы от 14 до 59 мМ. Ионную силу составов изменяли или путем повышения буферной силы, или путем добавления хлорида натрия (NaCl) или хлорида кальция (Са С12), что давало диапазон ионной силы от 10 до 50. Установка активных составов показана в таблице 4.The second part of the pH/buffer selection was developed based on the result of pH/buffer selection I and included the L-histidine acetate (His/acetate) buffer system, pH range from 5.5 to 6.0 with a buffer strength range from 14 to 59 mM . The ionic strength of the formulations was varied either by increasing the buffer strength or by adding sodium chloride (NaCl) or calcium chloride (CaCl2), giving an ionic strength range of 10 to 50. The setting of the active formulations is shown in Table 4.

Материал и методыMaterial and methods

В лекарственном веществе заменяли буфер при помощи ультрафильтрации-диафильтрации, используя полупроницаемую мембрану Labscale TTF (Millipore) с отсечением по молекулярной массе 30 кДа, на буферные системы, как перечислено в таблице 4. Таким образом, 120 мл лекарственного вещества вводили в систему Labscale и заменяли буфер на 1050 мл буфера для диафильтрации.The drug substance was buffer exchanged using ultrafiltration-diafiltration using a Labscale TTF semi-permeable membrane (Millipore) with a 30 kDa molecular weight cutoff, with buffer systems as listed in Table 4. Thus, 120 ml of drug substance was injected into the Labscale system and exchanged buffer for 1050 ml of diafiltration buffer.

После замены буфера лекарственное вещество концентрировали в системе Labscale до концентрации белка приблизительно 150 мг/мл.After buffer exchange, the drug was concentrated in a Labscale system to a protein concentration of approximately 150 mg/mL.

Затем концентрированное лекарственное вещество разводили исходными растворами соответствующего буфера и солевыми растворами до целевой концентрации белка 120 мг/мл, что давало конечный раствор лекарственного вещества согласно таблице 4.The concentrated drug substance was then diluted with the appropriate buffer stock solutions and saline solutions to a target protein concentration of 120 mg/mL, resulting in the final drug solution according to Table 4.

Аналитические методыAnalytical methods

Аналитические методы тестирования мутности, вязкости и ЭХ-ВЭЖХ описаны в примере I.Analytical methods for testing turbidity, viscosity and SEC-HPLC are described in Example I.

Программа для стабильностиProgram for stability

Составы сохраняли стабильность при 2-8°С и 25 в течение 8 недель. Образцы отбирали и анализировали в начале испытания на стабильность и через 8 недель хранения.The compositions remained stable at 2-8°C and 25 for 8 weeks. Samples were collected and analyzed at the start of the stability test and after 8 weeks of storage.

Результатыresults

Фиг. 2 сравнивает результаты мутности и вязкости второй части отбора рН/буфера. В общем, мутность повышается при повышении ионной силы и при рН 6,0 по сравнению с рН 5,5. Кроме того, присутствие хлорида натрия также приводит к большей мутности. рН 5,5 также снижает вязкость по сравнению с рН 6. Кроме того, ионная сила по меньшей мере 30 способствует снижению вязкости до уровня приблизительно 15 мПа⋅с. При сравнении действия различных солей на вязкость хлорид кальция или большая буферная сила являются более эффективными для снижения вязкости, чем хлорид натрия.Fig. 2 compares the turbidity and viscosity results of the second part of the pH/buffer selection. In general, turbidity increases with increasing ionic strength and at pH 6.0 compared to pH 5.5. In addition, the presence of sodium chloride also leads to greater turbidity. A pH of 5.5 also reduces the viscosity compared to a pH of 6. In addition, an ionic strength of at least 30 helps reduce the viscosity to approximately 15 mPa.s. When comparing the effects of different salts on viscosity, calcium chloride or high buffering force is more effective in reducing viscosity than sodium chloride.

Учитывая обе цели, снижение мутности и вязкости, состав с ионной силой по меньшей мере 30 и рН 5,5 показывает сниженный уровень мутности приблизительно 20 ЕМФ и вязкость приблизительно 15 мПа⋅с.Considering both the goals of reducing turbidity and viscosity, a formulation with an ionic strength of at least 30 and a pH of 5.5 shows a reduced turbidity level of approximately 20 FU and a viscosity of approximately 15 mPa.s.

Фиг. 3 сравнивает уровни агрегатов (ВМС) составов отбора II рН/буфера в начале (=0) с уровнями через 8 недель при 5°С и 25°С. В общем, уровни ВМС повышаются с увеличением ионной силы. Если сравнивать влияние различных солей, высокая буферная сила или присутствие хлорида натрия приводит к более низкому увеличению агрегатов, чем присутствие хлорида натрия. Более низкий рН 5,5 имеет небольшое влияние на снижение образования агрегатов.Fig. 3 compares aggregate levels (AMC) of selection II pH/buffer formulations at baseline (=0) with levels after 8 weeks at 5°C and 25°C. In general, BMC levels increase with increasing ionic strength. When comparing the effects of different salts, high buffering strength or the presence of sodium chloride results in a lower increase in aggregates than the presence of sodium chloride. A lower pH of 5.5 has little effect on reducing aggregate formation.

ВыводConclusion

Состав с рН 5,5 и ионной силой 30 обеспечивает оптимум со сниженной мутностью, низкой вязкостью и сниженным образованием агрегатов. Ионную силу можно регулировать при помощи большей буферной силы или добавления солей хлорида натрия и хлорида кальция. В общем, более высокая буферная сила или присутствие хлорида кальция демонстрируют предпочтительные свойства мутности и вязкости.The pH 5.5 and ionic strength 30 formulation provides optimum performance with reduced turbidity, low viscosity and reduced aggregate formation. The ionic strength can be adjusted by using a higher buffer strength or adding sodium chloride and calcium chloride salts. In general, higher buffering strength or the presence of calcium chloride exhibit preferable turbidity and viscosity properties.

Пример 4: Отбор поверхностно-активного веществаExample 4: Surfactant Selection

УстановкаInstallation

Целью отбора поверхностно-активного вещества является выбор оптимального типа поверхностно-активного вещества и концентрации поверхностно-активного вещества для состава антитела к VEGF/ANG2 CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимаба).The purpose of surfactant selection is to select the optimal surfactant type and surfactant concentration for the anti-VEGF/ANG2 antibody CrossMAb VEGFang2-0016 (faricimab) formulation.

Матрица состава из 120 мг/мл антитела к VEGF/Ang-2, 20 мМ L-гистидин-ацетатного буфера при рН 5,5, 25 мМ хлорида натрия и 180 мМ сахарозы основана на результате отборов I и II рН/буфера и для обеспечения изотоничного состава с целевой осмоляльностью 300±50 мОсм/кг.The composition matrix of 120 mg/ml anti-VEGF/Ang-2 antibody, 20 mM L-histidine acetate buffer at pH 5.5, 25 mM sodium chloride and 180 mM sucrose is based on the result of selections I and II pH/buffer and to ensure isotonic composition with a target osmolality of 300±50 mOsm/kg.

При отборе поверхностно-активного вещества исследовали стабилизирующий эффект поверхностно-активных веществ полисорбата 20 и полоксамера 188 при различных концентрациях поверхностно-активного вещества от 0,01 до 0,07% на антитело к Vegf-Ang2. Кроме того, исследовали состав без поверхностно-активного вещества.In surfactant screening, the stabilizing effect of surfactants polysorbate 20 and poloxamer 188 was examined at various surfactant concentrations from 0.01 to 0.07% on anti-Vegf-Ang2 antibody. In addition, a surfactant-free formulation was examined.

В таблице 5 подытожены тестовые составы отбора поверхностно-активного вещества.Table 5 summarizes the surfactant selection test formulations.

Материал и методыMaterial and methods

В лекарственном веществе заменяли буфер при помощи ультрафильтрации-диафильтрации, используя полупроницаемую мембрану Labscale TTF (Millipore) с отсечением по молекулярной массе 30 кДа, на 20 мМ гистидин-ацетатного буфера для диафильтрации с рН 5,3. Таким образом, 250 мл лекарственного вещества вводили в систему Labscale и заменяли буфер на 1700 мл буфера для диафильтрации.The drug substance was buffer exchanged by ultrafiltration-diafiltration using a Labscale TTF semi-permeable membrane (Millipore) with a molecular weight cutoff of 30 kDa with 20 mM histidine acetate diafiltration buffer pH 5.3. Thus, 250 ml of drug was injected into the Labscale system and the buffer was exchanged for 1700 ml of diafiltration buffer.

После замены буфера лекарственное вещество концентрировали в системе Labscale до концентрации белка приблизительно 170 мг/мл и рН приблизительно 5,5.After buffer exchange, the drug was concentrated in a Labscale system to a protein concentration of approximately 170 mg/mL and a pH of approximately 5.5.

Затем концентрированное лекарственное вещество разводили исходными растворами соответствующего буфера и солевыми растворами до целевой концентрации белка 120 мг/мл, что давало конечный раствор лекарственного вещества согласно таблице 5.The concentrated drug was then diluted with the appropriate buffer stock solutions and saline solutions to a target protein concentration of 120 mg/mL, resulting in the final drug solution as shown in Table 5.

Аналитические методыAnalytical methods

Аналитические методы тестирования концентрации белка, рН, осмоляльности, мутности, вязкости, видимых частиц и ЭХ-ВЭЖХ описаны в примере I.Analytical methods for testing protein concentration, pH, osmolality, turbidity, viscosity, visible particles, and SEC-HPLC are described in Example I.

Программа для стабильностиProgram for stability

При испытании поверхностно-активного вещества на механический стресс при отборе применяли условия горизонтального встряхивания в течение 1 недели при 2-8°С (200 об/мин), горизонтального встряхивания в течение 1 недели при 25°С (200 об/мин) и 5 циклов замораживания-размораживания (-40°С/5°С).When testing the surfactant for mechanical stress during selection, horizontal shaking for 1 week at 2-8°C (200 rpm), horizontal shaking for 1 week at 25°C (200 rpm) and 5 freeze-thaw cycles (-40°C/5°C).

Результатыresults

В таблице 6 подытожены исходные результаты образцов отбора поверхностно-активного вещества. Все составы имели концентрацию белка приблизительно 120 мг/мл и рН 5,5±0,1. Измеренная осмоляльность составляла от 335 до 350 мОсм/кг и, таким образом, была несколько выше, чем целевая 311 мОсм/кг.Выбранная матрица состава из 120 мг/мл Vegf-Ang2 с 20 мМ гистидин-ацетатного буфера при рН 5,5 плюс 25 мМ хлорида натрия и 180 мМ сахарозы давала низкие вязкости приблизительно 15 мПа⋅с и сниженную мутность 20 ЕМФ.Table 6 summarizes the initial results of the surfactant selection samples. All formulations had a protein concentration of approximately 120 mg/ml and a pH of 5.5 ± 0.1. The measured osmolality was between 335 and 350 mOsm/kg and was thus slightly higher than the target of 311 mOsm/kg. Selected formulation matrix of 120 mg/mL Vegf-Ang2 with 20 mM histidine acetate buffer at pH 5.5 plus 25 mM sodium chloride and 180 mM sucrose gave low viscosities of approximately 15 mPa⋅s and reduced turbidity of 20 FU.

Составы отбора поверхностно-активного вещества подвергали стрессу вследствие встряхивания при 5°С и 25°С и стрессу вследствие замораживания-размораживания (пять циклов замораживания-размораживания) и анализировали на видимые частицы и растворимые агрегаты (ВМЧ).The surfactant selection formulations were subjected to shaking stress at 5°C and 25°C and freeze-thaw stress (five freeze-thaw cycles) and analyzed for visible particles and soluble aggregates (VPA).

В таблице 7 подытожены результаты для видимых частиц в начале и после физического стресса. Все образцы составов вначале не содержали частицы. После воздействия различных физических стрессов состав GRM0071-01 без поверхностно-активного вещества всегда показывал множество частиц.Table 7 summarizes the results for visible particles at the beginning and after physical stress. All formulation samples initially contained no particles. After exposure to various physical stresses, the surfactant-free formulation of GRM0071-01 always showed many particles.

Добавление по меньшей мере 0,01% полисорбата 20 предотвращает образование видимых частиц при воздействии трех методов обеспечения физического стресса.The addition of at least 0.01% polysorbate 20 prevents the formation of visible particles when exposed to three physical stress methods.

Неожиданно, что добавление полоксамера не может предотвратить образование видимых частиц после воздействия встряхивания в течение 1 недели при 5°С, тогда как он мог защищать белок от встряхивания при 25°С и стресса вследствие замораживания-размораживания.Surprisingly, the addition of poloxamer could not prevent the formation of visible particles after exposure to shaking for 1 week at 5°C, whereas it could protect the protein from shaking at 25°C and freeze-thaw stress.

Фиг. 4 показывает уровни растворимых агрегатов (ВМЧ) исходных образцов и подвергнутых стрессу образцов. Состав GRM0071-01 (1) без поверхностно-активного вещества был чувствительным к стрессу вследствие встряхивания и продемонстрировал повышенные уровни агрегатов до 10% через 1 неделю встряхивания при 5°С и 25°С. Присутствие 0,01% полисорбата 20 не было достаточным для полного предотвращения увеличения количества растворимых агрегатов через 1 неделю встряхивания при 25°С, поскольку уровень агрегатов повышался с 3 до 3,8%. Неожиданно, что уровень полисорбата 20 равный или выше чем 0,03% требовался для предотвращения увеличения количества растворимых агрегатов через 1 неделю встряхивания при 25°С.Fig. 4 shows the levels of soluble aggregates (SAM) of the original samples and the stressed samples. Formulation GRM0071-01 (1) without surfactant was sensitive to shaking stress and showed increased aggregate levels of up to 10% after 1 week of shaking at 5°C and 25°C. The presence of 0.01% polysorbate 20 was not sufficient to completely prevent the increase in soluble aggregates after 1 week of shaking at 25°C, as the level of aggregates increased from 3 to 3.8%. Surprisingly, a level of polysorbate 20 equal to or greater than 0.03% was required to prevent an increase in soluble aggregates after 1 week of shaking at 25°C.

ВыводConclusion

Добавление по меньшей мере 0,03% полисорбата 20 требуется для полной стабилизации антитела к VEGF/ANG2 при концентрации 120 мг/мл от стресса вследствие встряхивания и замораживания-размораживания.The addition of at least 0.03% polysorbate 20 is required to fully stabilize the anti-VEGF/ANG2 antibody at a concentration of 120 mg/ml from shaking and freeze-thaw stress.

Поверхностно-активное вещество полоксамер не может защитить биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 при концентрации 120 мг/мл от стресса вследствие встряхивания при 5°С.Poloxamer surfactant failed to protect anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody at 120 mg/mL from shaking stress at 5°C.

Матрица состава с 20 мМ гистидин-ацетатного буфера при рН 5,5, 25 мМ хлорида натрия и 180 мМ сахарозы обеспечивает приемлемые результаты мутности (приблизительно 20 ЕМФ) и вязкости (приблизительно 15 мПа⋅с) для 120 мг/мл состава антитела к VEGF/ANG2.A formulation matrix with 20 mM histidine acetate buffer at pH 5.5, 25 mM sodium chloride, and 180 mM sucrose provides acceptable turbidity (approximately 20 FUF) and viscosity (approximately 15 mPa⋅s) results for a 120 mg/mL anti-VEGF antibody formulation /ANG2.

Пример 5: Отбор I вспомогательных веществExample 5: Selection of excipients I

УстановкаInstallation

Целью отбора вспомогательных веществ является выбор конечной композиции для коммерческого состава антитела к VEGF/ANG2 CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимаба).The purpose of excipient selection is to select the final composition for the commercial formulation of the anti-VEGF/ANG2 antibody CrossMAb VEGFang2-0016 (faricimab).

На основе результатов предыдущих отборов I и II рН/буфера и отбора поверхностно-активного вещества выбирали матрицу состава, которая состояла из 120 мг/мл антитела к Vegf-Ang2, 20 мМ гистидин-ацетатной буферной системы, 160 мМ сахарозы и 0,04% полисорбата 20. В матрице состава исследовали влияние рН (5,5 относительно 5,8), соли (25 мМ хлорида натрия относительно 8 мМ хлорида кальция) и метионина (0 относительно 7 мМ). Ионную силу доводили до 40 на основе вклада от концентрации буфера и соли.Based on the results of previous pH/buffer selections I and II and surfactant selection, a composition matrix was selected that consisted of 120 mg/ml anti-Vegf-Ang2 antibody, 20 mM histidine acetate buffer system, 160 mM sucrose and 0.04% polysorbate 20. In the composition matrix, the effects of pH (5.5 vs. 5.8), salt (25 mM sodium chloride vs. 8 mM calcium chloride), and methionine (0 vs. 7 mM) were examined. The ionic strength was adjusted to 40 based on contributions from buffer and salt concentrations.

В таблице 8 подытожены составы отбора I вспомогательных веществ.Table 8 summarizes the compositions of selection I of excipients.

Материал и методыMaterial and methods

В лекарственном веществе заменяли буфер при помощи ультрафильтрации-диафильтрации, используя полупроницаемую мембрану Labscale TTF (Millipore) с отсечением по молекулярной массе 30 кДа, или на 20 мМ гистидин-ацетатного буфера для диафильтрации с рН 5,3, или 20 мМ гистидин-ацетата с рН 5,6. Таким образом, 410 мл лекарственного вещества вводили в систему Labscale и заменяли буфер на 3000 мл буфера для диафильтрации.The drug substance was buffer exchanged using ultrafiltration-diafiltration using Labscale TTF semipermeable membrane (Millipore) with a molecular weight cutoff of 30 kDa, or with 20 mM histidine acetate diafiltration buffer pH 5.3, or 20 mM histidine acetate with pH 5.6. Thus, 410 ml of drug was injected into the Labscale system and the buffer was exchanged for 3000 ml of diafiltration buffer.

После замены буфера лекарственное вещество концентрировали в системе Labscale до концентрации белка приблизительно 165 мг/мл и рН или приблизительно 5,5, или рН 5,8.After buffer exchange, drug was concentrated in a Labscale system to a protein concentration of approximately 165 mg/mL and a pH of either approximately 5.5 or pH 5.8.

Затем концентрированное лекарственное вещество разводили исходными растворами соответствующего буфера и солевыми растворами до целевой концентрации белка 120 мг/мл, что давало конечный раствор лекарственного вещества согласно таблице 8.The concentrated drug substance was then diluted with the appropriate buffer stock solutions and saline solutions to a target protein concentration of 120 mg/mL, resulting in the final drug solution according to Table 8.

Аналитические методыAnalytical methods

Аналитические методы тестирования концентрации белка, рН, осмоляльности, мутности, вязкости, видимых частиц, ЭХ-ВЭЖХ и ИО-ВЭЖХ описаны в примере I.Analytical methods for testing protein concentration, pH, osmolality, turbidity, viscosity, visible particles, SEC-HPLC and AI-HPLC are described in Example I.

Программа для стабильностиProgram for stability

Составы сохраняли стабильность при 2-8°С до 20 недель и при 25°С до 13 недель. Кроме того, образцы подвергали горизонтальному встряхиванию в течение 1 недели при 2-8°С (200 об/мин), горизонтальному встряхиванию в течение 1 недели при 25°С (200 об/мин) и 5 циклам замораживания-размораживания (-40°С/5°С).The formulations remained stable at 2-8°C for up to 20 weeks and at 25°C for up to 13 weeks. In addition, the samples were subjected to horizontal shaking for 1 week at 2-8°C (200 rpm), horizontal shaking for 1 week at 25°C (200 rpm) and 5 freeze-thaw cycles (-40°C). С/5°С).

Результатыresults

В таблице 9 подытожены исходные результаты отбора I вспомогательных веществ. Все составы имели концентрацию белка от 125 до 130 мг/мл. Составы GRM0073-01 04 с целевым рН 5,5 имели измеренные значения рН приблизительно 5,6, тогда как составы GRM0073-05 - 08 с целевым рН 5,8 имели измеренные значения рН приблизительно 5,9. Осмоляльность составов, содержащих 25 мМ хлорида натрия (GRM0073-01, -02, -05 и -06), имела более высокие результаты осмоляльности (от 313 до 322 мОсм/кг) по сравнению с составами с 8 мМ хлорида кальция (GRM0073-03, -04, -07 и -08), где она была от 273 до 288 мОсм/кг).Table 9 summarizes the initial results of the selection of I excipients. All formulations had protein concentrations ranging from 125 to 130 mg/mL. Formulations GRM0073-01 04 with a target pH of 5.5 had measured pH values of approximately 5.6, while formulations GRM0073-05 - 08 with a target pH of 5.8 had measured pH values of approximately 5.9. Formulations containing 25 mM sodium chloride (GRM0073-01, -02, -05, and -06) had higher osmolality results (313 to 322 mOsm/kg) compared to formulations containing 8 mM calcium chloride (GRM0073-03 , -04, -07 and -08), where it was from 273 to 288 mOsm/kg).

В таблице 10 подытожены результаты для видимых частиц вначале, после физической нагрузки и через 13 недель хранения при 5°С и 25°С. После изготовления и после воздействия физического стресса (1 неделя встряхивания при 5°С или 25°С или пять циклов замораживания-размораживания) все составы не содержали частицы. Неожиданно, что все составы, которые содержали 8 мМ хлорида кальция, показали наличие видимых частиц через 13 недель хранения при 5°С и 25°С, тогда как все составы, которые содержали 25 мМ хлорида натрия, не содержали частицы.Table 10 summarizes the results for visible particles at baseline, after exercise and after 13 weeks of storage at 5°C and 25°C. After manufacture and after exposure to physical stress (1 week of shaking at 5°C or 25°C or five freeze-thaw cycles), all formulations were free of particles. Surprisingly, all formulations that contained 8 mM calcium chloride showed visible particles after 13 weeks of storage at 5°C and 25°C, while all formulations that contained 25 mM sodium chloride did not contain particles.

Фиг. 5 сравнивает результаты мутности и вязкости составов, содержащих 25 мМ хлорида натрия. Таким образом, составы с рН 5,5 показали более низкую мутность (21 ЕМФ относительно 25 ЕМФ) и более низкую вязкость (17 мПа⋅с относительно 21 мПа⋅с).Fig. 5 compares the turbidity and viscosity results of formulations containing 25 mM sodium chloride. Thus, the formulations with pH 5.5 showed lower turbidity (21 FMU versus 25 FMU) and lower viscosity (17 mPa⋅s versus 21 mPa⋅s).

Фиг. 6 и 7 показывают увеличение количества растворимых агрегатов (ВМЧ) при хранении 20 недель при 5°С, соответственно, хранении 13 недель при 25°С.Составы с рН 5,8 показали несколько более низкое увеличение количества растворимых агрегатов по сравнению с составами при рН 5,5. Неожиданно, что добавление метионина может снижать образование растворимых агрегатов и может компенсировать влияние более низкого рН на агрегацию.Fig. 6 and 7 show an increase in the number of soluble aggregates (SAM) with storage for 20 weeks at 5°C, respectively, storage for 13 weeks at 25°C. Formulations with pH 5.8 showed a slightly lower increase in the number of soluble aggregates compared to formulations at pH 5.5. Surprisingly, the addition of methionine can reduce the formation of soluble aggregates and can compensate for the effect of lower pH on aggregation.

Фиг. 8 и 9 сравнивают изменение заряженных изоформ, измеренное при помощи ИОХ, через 20 недель хранения при 5°С и 13 недель хранения при 25°С, соответственно. Все составы показали небольшое уменьшение приблизительно в 1% площади главного пика через 13 недель хранения при 5°С. Это сопровождается приблизительно 0,2% увеличением количества кислотных изоформ и приблизительно 1% увеличением площади основного пика. Нет явных различий, вызванных разным рН или присутствием метионина. Хотя уменьшение главного пика намного больше (приблизительно 18%) через 13 недель хранения при 25°С, нет явных различий на основе рН и метионина. Снижение главного пика при хранении при 25°С главным образом вызвано увеличением количества кислотных изоформ.Fig. 8 and 9 compare the change in charged isoforms, as measured by IOC, after 20 weeks of storage at 5°C and 13 weeks of storage at 25°C, respectively. All formulations showed a slight decrease of approximately 1% of the main peak area after 13 weeks of storage at 5°C. This is accompanied by an approximately 0.2% increase in the number of acidic isoforms and an approximately 1% increase in the main peak area. There are no obvious differences caused by different pH or the presence of methionine. Although the reduction in the main peak is much greater (approximately 18%) after 13 weeks of storage at 25°C, there are no obvious differences based on pH and methionine. The decrease in the main peak upon storage at 25°C is mainly caused by an increase in the number of acidic isoforms.

ВыводConclusion

Хотя присутствие хлорида кальция приводит к снижению уровней вязкости и мутности по сравнению с составами с хлоридом натрия (ссылка на примеры 2 и 3), оно также неожиданно вызывает образование видимых частиц. Образование видимых частиц неприемлемо для интравитреального введения согласно требованиям USP-NF <790>, которые по существу не содержат видимые частицы. Таким образом, добавление хлорида натрия в качестве модификатора ионной силы для снижения вязкости предпочтительно относительно использования хлорида кальция.Although the presence of calcium chloride results in reduced viscosity and turbidity levels compared to sodium chloride formulations (link to Examples 2 and 3), it also unexpectedly causes the formation of visible particles. Formation of visible particles is unacceptable for intravitreal administration according to USP-NF <790>, which is essentially free of visible particles. Thus, the addition of sodium chloride as an ionic strength modifier to reduce viscosity is preferable to the use of calcium chloride.

Кроме того, составы при рН 5,5 показывают более низкую мутность и более низкую вязкость по сравнению с составами при рН 5,8. Однако составы при рН 5,8 показали несколько меньшее образование растворимых агрегатов, чем составы при рН 5,5, но этот эффект может быть компенсирован добавлением 7 мМ метионина. Таким образом, добавление метионина обеспечивает снижение количества растворимых агрегатов при рН 5,5, в то же время все еще давая более низкие уровни вязкости и мутности.In addition, formulations at pH 5.5 exhibit lower turbidity and lower viscosity compared to formulations at pH 5.8. However, formulations at pH 5.8 showed slightly less soluble aggregate formation than formulations at pH 5.5, but this effect could be compensated for by the addition of 7 mM methionine. Thus, the addition of methionine provides a reduction in the amount of soluble aggregates at pH 5.5, while still producing lower levels of viscosity and turbidity.

Разница рН (рН 5,5 относительно 5,8) или присутствие или отсутствие метионина не имеет влияния на образование заряженных изоформ.The difference in pH (pH 5.5 vs. 5.8) or the presence or absence of methionine has no effect on the formation of charged isoforms.

В общем, состав с 25 мМ хлорида натрия, а не 8 мМ хлорида кальция, и 20 мМ гистидин-ацетатного буфера при рН 5,5 с 7 мМ метионина и 160 мМ сахарозы и 0,04% полисорбата 20 обеспечивает состав без частиц с низкой мутностью и вязкостью и улучшенными свойствами стабильности.In general, a formulation with 25 mM sodium chloride rather than 8 mM calcium chloride and 20 mM histidine acetate buffer at pH 5.5 with 7 mM methionine and 160 mM sucrose and 0.04% polysorbate 20 provides a formulation free of particles with low turbidity and viscosity and improved stability properties.

Пример 6: Отбор II вспомогательных веществExample 6: Selection II of excipients

УстановкаInstallation

Во второй части отбора вспомогательных веществ свойство стабильности дополнительно определяют в предварительно заполненном шприце и при концентрации белка 30 мг/мл.In the second part of the selection of excipients, the stability property is further determined in a pre-filled syringe and at a protein concentration of 30 mg/ml.

Отбор I вспомогательных веществ давал оптимизированный состав, состоящий из 120 мг/мл антитела к VEGF/ANG2 CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимаб), 20 мМ гистидин-ацетата при рН 5,5, 25 мМ хлорида натрия, 160 мМ сахарозы, 7 мМ метионина и 0,04% полисорбата 20, которым заполняли стеклянный флакон (соответствует составу GRM0073-02).Selection I of excipients yielded an optimized composition consisting of 120 mg/ml anti-VEGF/ANG2 antibody CrossMAb VEGFang2-0016 (faricimab), 20 mM histidine acetate at pH 5.5, 25 mM sodium chloride, 160 mM sucrose, 7 mM methionine and 0.04% polysorbate 20, which was filled into a glass vial (corresponding to the composition GRM0073-02).

Этим составом также заполняли предварительно заполняемый шприц (GRM0076-02). Кроме того, свойство стабильности этой матрицы состава тестировали при концентрации белка 30 мг/мл, набранного в предварительно заполняемый шприц (GRM0077-02) или в стеклянный флакон (GRM0077-06).This composition was also filled into a pre-filled syringe (GRM0076-02). In addition, the stability property of this formulation matrix was tested at a protein concentration of 30 mg/mL drawn into a pre-filled syringe (GRM0077-02) or a glass vial (GRM0077-06).

Для сравнения стабильность эталонного состава, набранного в стеклянный флакон, тестировали при 30 мг/мл (GRM0077-09) и 120 мг/мл (GRM0076-05).For comparison, the stability of the reference formulation filled in a glass vial was tested at 30 mg/ml (GRM0077-09) and 120 mg/ml (GRM0076-05).

В таблице 11 подытожены составы отбора II вспомогательных веществ.Table 11 summarizes the compositions of selection II excipients.

Материал и методыMaterial and methods

В лекарственном веществе заменяли буфер при помощи ультрафильтрации-диафильтрации, используя полупроницаемую мембрану Labscale TTF (Millipore) с отсечением по молекулярной массе 30 кДа.The drug substance was buffer exchanged by ultrafiltration-diafiltration using a Labscale TTF semipermeable membrane (Millipore) with a molecular weight cutoff of 30 kDa.

Для получения антитела к VEGF/ AN G2 CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимаба) в 20 мМ гистидин-ацетатного буфера рН 5,5, приблизительно 340 мл лекарственного вещества вводили в систему Labscale и заменяли буфер на 2400 мл 20 мМ гистидин-ацетатный буфер для диафильтрации рН 5,2.To prepare the anti-VEGF/AN G2 CrossMAb VEGFang2-0016 (faricimab) in 20 mM histidine acetate buffer pH 5.5, approximately 340 mL of drug was injected into the Labscale system and the buffer was exchanged for 2400 mL of 20 mM histidine acetate diafiltration buffer. pH 5.2.

Антитело к VEGF/ANG2 CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимаб) в 20 мМ гистидин-HCl буфере рН 6,0 получали, используя приблизительно 200 мл лекарственного вещества. Его вводили в систему Labscale и заменяли буфер на 1400 мл 20 мМ гистидин-HCl буфера для диафильтрации рН 5,85.The anti-VEGF/ANG2 antibody CrossMAb VEGFang2-0016 (faricimab) in 20 mM histidine-HCl buffer pH 6.0 was prepared using approximately 200 ml of drug. It was injected into the Labscale system and the buffer was exchanged with 1400 ml of 20 mM histidine-HCl diafiltration buffer pH 5.85.

После замены буфера соответствующее лекарственное вещество концентрировали в системе Labscale до концентрации белка приблизительно 165 мг/мл и рН или приблизительно 5,5, или рН 6,0.After buffer exchange, the appropriate drug was concentrated in the Labscale system to a protein concentration of approximately 165 mg/ml and a pH of either approximately 5.5 or pH 6.0.

Затем концентрированное лекарственное вещество разводили исходными растворами соответствующего буфера и солевыми растворами до целевой концентрации белка 30 или 120 мг/мл, что давало конечный раствор лекарственного вещества согласно таблице 8.The concentrated drug substance was then diluted with the appropriate buffer stock solutions and saline solutions to a target protein concentration of 30 or 120 mg/ml, resulting in a final drug solution according to Table 8.

Каждый раствор лекарственного вещества фильтровали через 0,22 мкм фильтр Sterivex GV (Millipore) и набирали в чистые и стерильные 6 мл флаконы с объемом заполнения 2,7 мл или в чистые стерилизованные 1 мл предварительно заполненные шприцы с объемом заполнения 1 мл. Флаконы закрывали пробками и обжимали, тогда как шприцы закрывали ограничителем хода поршня.Each drug solution was filtered through a 0.22-μm Sterivex GV filter (Millipore) and drawn into clean and sterile 6-mL vials with a 2.7-mL fill volume or into clean, sterilized 1-mL prefilled syringes with a 1-mL fill volume. The vials were capped and crimped, while the syringes were closed with a piston stroke stopper.

Аналитические методыAnalytical methods

Программа для стабильностиProgram for stability

Составы сохраняли стабильность при 2-8°С и 24°С до 13 недель. Кроме того, образцы подвергали горизонтальному встряхиванию в течение 1 недели при 2-8°С (200 об/мин), горизонтальному встряхиванию в течение 1 недели при 25°С (200 об/мин) и 5 циклам замораживания-размораживания (-40°С/5°С).The formulations remained stable at 2-8°C and 24°C for up to 13 weeks. In addition, the samples were subjected to horizontal shaking for 1 week at 2-8°C (200 rpm), horizontal shaking for 1 week at 25°C (200 rpm) and 5 freeze-thaw cycles (-40°C). С/5°С).

Результатыresults

В Таблице 12 подытожены исходные результаты отбора II вспомогательных веществ. GRM0076-02 (оптимизированный состав в ПЗШ) и GRM0076-05 (эталонный состав) оба соответствуют целевой концентрации белка 120 мг/мл с измеренными значениями 119 или 123 мг/мл, соответственно. GRM0077-02 (оптимизированный состав в ПЗШ), GRM0077-06 (оптимизированный состав в флаконе) и GRM0076-05 (эталонный состав) получали с целевой концентрацией белка 30 мг/мл. Фактическая концентрация белка находилась в диапазоне от 30 до 31 мг/мл.Table 12 summarizes the initial results of selection II excipients. GRM0076-02 (optimized formulation in PZS) and GRM0076-05 (reference formulation) both met a target protein concentration of 120 mg/mL with measured values of 119 or 123 mg/mL, respectively. GRM0077-02 (optimized formulation in PZH), GRM0077-06 (optimized formulation in vial) and GRM0076-05 (reference formulation) were prepared with a target protein concentration of 30 mg/mL. The actual protein concentration ranged from 30 to 31 mg/mL.

рН всех составов был близок к целевому рН и с максимальным отклонением только 0,1 единицы рН.The pH of all formulations was close to the target pH with a maximum deviation of only 0.1 pH unit.

Осмоляльность составов при 120 мг/мл была несколько выше и от 310 до 320 мОсм/кг, тогда как составы с 30 мг/мл имели от 278 до 394 мОсм/кг.The osmolality of the 120 mg/mL formulations was slightly higher, ranging from 310 to 320 mOsm/kg, while the 30 mg/mL formulations ranged from 278 to 394 mOsm/kg.

В Таблице 13 подытожены результаты для видимых частиц в начале, после физического стресса и через 13 недель хранения при 5°С и 25°С.После изготовления и после воздействия физического стресса (1 неделя встряхивания при 5°С или 25°С или пять циклов замораживания-размораживания) все составы не содержали частицы. Неожиданно, что эталонные составы показали много частиц через 13 недель хранения при 5 и 25°С. Все остальные составы не содержали частицы.Table 13 summarizes the results for visible particles at baseline, after physical stress, and after 13 weeks of storage at 5°C and 25°C. After manufacture and after exposure to physical stress (1 week of shaking at 5°C or 25°C or five cycles freezing-thawing) all formulations did not contain particles. Surprisingly, the reference formulations showed many particles after 13 weeks of storage at 5 and 25°C. All other formulations did not contain particles.

Фигура 10 сравнивает результаты мутности и вязкости оптимизированных и эталонных составов при концентрации белка 120 мг/мл. Оптимизированный состав показал явно более низкую мутность приблизительно 23 ЕМФ, тогда как состав для клинического исследования имел мутность более 45 ЕМФ. Интересно, что вязкость обоих составов была ниже 14 мПа⋅с.Figure 10 compares the turbidity and viscosity results of the optimized and reference formulations at a protein concentration of 120 mg/mL. The optimized formulation showed a clearly lower turbidity of approximately 23 FFU, while the clinical study formulation had a turbidity of more than 45 FFU. Interestingly, the viscosity of both formulations was below 14 mPa⋅s.

Фигура 11 показывает мутность и вязкость составов с 30 мг/мл. Здесь различие в мутности меньше между составами GRM0072-02 и GRM0077-09, но все еще оптимизированные составы показывали более низкую мутность. Вязкости для обоих составов с 30 мг/мл были очень низкими по сравнению с составами с 120 мг/мл и составляли ниже 2 мПа⋅с.Figure 11 shows the turbidity and viscosity of the 30 mg/ml formulations. Here the difference in turbidity is smaller between formulations GRM0072-02 and GRM0077-09, but still the optimized formulations showed lower turbidity. The viscosities for both 30 mg/ml formulations were very low compared to the 120 mg/ml formulations and were below 2 mPa⋅s.

Фигура 12 и Фигура 13 показывают увеличение соединений ВМС через 13 недели хранения при 5 и 25°С. Оптимизированный состав показывал как при 120 мг/мл, так и 30 мг/мл меньшее увеличение количества ВМ-соединений, чем эталонный состав. Стабилизирующий эффект наиболее явно выражен через 13 недель хранения при 25°С, где количество ВМ повышалось только до 2,4% в оптимизированном составе GRM0076-02, тогда как состав GRM0076-05 показывал увеличение до 2,9%. Такая же тенденция также наблюдалась для составов с 30 мг/мл, причем более низкое увеличение до 1,0% наблюдали для оптимизированного состава и увеличение до 1,3% для эталонной формы.Figure 12 and Figure 13 show the increase in BMC compounds after 13 weeks of storage at 5 and 25°C. The optimized formulation showed at both 120 mg/mL and 30 mg/mL a smaller increase in the number of HMW compounds than the reference formulation. The stabilizing effect was most pronounced after 13 weeks of storage at 25°C, where the amount of VM increased to only 2.4% in the optimized formulation GRM0076-02, while the formulation GRM0076-05 showed an increase of up to 2.9%. The same trend was also observed for the 30 mg/mL formulations, with a lower increase of up to 1.0% observed for the optimized formulation and an increase of up to 1.3% for the reference form.

Фигура 14 сравнивает изменение заряженных изоформ, измеренное при помощи ИОХ через 13 недель хранения при 5°С и 25°С. Все составы показали небольшое уменьшение приблизительно на 1% площади главного пика через 13 недель хранения при 5°С.Это сопровождается соответствующим увеличением площади основного пика, тогда как площадь кислотного пика остается постоянной. Хотя уменьшение главного пика намного больше (приблизительно 10%) через 13 недель хранения при 25°С, нет явных различий между составами. Уменьшение главного пика при хранении при 25°С главным образом вызвано увеличением кислотных изоформ (около 8%) и небольшим увеличением основных изоформ (1-2%). Увеличение основных изоформ через 13 недель при 25°С несколько ниже (прибл. 1%) у эталонных составов (составленных при рН 6,0) по сравнению с оптимизированными составами (прибл. 2% увеличение). Более низкая концентрация белка и первичный контейнер не влияют на заряженные изоформы.Figure 14 compares the change in charged isoforms measured by IOC after 13 weeks of storage at 5°C and 25°C. All formulations showed a slight decrease of approximately 1% in the main peak area after 13 weeks of storage at 5°C. This was accompanied by a corresponding increase in the main peak area, while the acid peak area remained constant. Although the reduction in the main peak is much greater (approximately 10%) after 13 weeks of storage at 25°C, there are no obvious differences between the formulations. The decrease in the main peak upon storage at 25°C is mainly caused by an increase in acidic isoforms (about 8%) and a slight increase in basic isoforms (1-2%). The increase in major isoforms after 13 weeks at 25°C is slightly lower (ca. 1%) for the reference formulations (formulated at pH 6.0) compared to the optimized formulations (ca. 2% increase). Lower protein concentration and primary container do not affect charged isoforms.

ВыводConclusion

Результат отбора II вспомогательных веществ подтвердил, что оптимизированные составы лучше эталонного состава. Мутность оптимизированных составов при 120 мг/мл снижалась от более чем 45 ЕМФ до менее чем 25 ЕМФ, в то же время сохраняя вязкость менее 15 мПа⋅с.Низкая вязкость важна для обеспечения промышленного способа производства (повышение концентрации ультрафильтрацией) и для обеспечения простого и удобного интравитреального введения (силы впрыска менее 20 Н, в частности менее 15 Н). Было показано, что оптимизированный состав с вязкостью менее 15 мПа⋅с можно было инъецировать при помощи иглы для инъекции 30G с временем впрыска 5 с при силе впрыска менее 5 Н.The result of selection II of excipients confirmed that the optimized formulations were better than the reference formulation. The turbidity of the optimized formulations at 120 mg/ml was reduced from more than 45 FFU to less than 25 FFU, while maintaining a viscosity of less than 15 mPa⋅s. Low viscosity is important to ensure industrial production (increasing concentration by ultrafiltration) and to ensure easy and convenient intravitreal injection (injection forces less than 20 N, in particular less than 15 N). It was shown that the optimized formulation with a viscosity of less than 15 mPa⋅s could be injected using a 30G injection needle with an injection time of 5 s and an injection force of less than 5 N.

Кроме того, оптимизированные составы с 30 мг/мл все еще не содержали частицы, тогда как эталонные составы показали видимые частицы через 13 недель хранения при 5 и 25°С. Кроме того, увеличение количества ВМ-соединений было ниже в оптимизированных составах.Additionally, the optimized formulations at 30 mg/mL were still free of particles, whereas the reference formulations showed visible particles after 13 weeks of storage at 5 and 25°C. In addition, the increase in the number of VM compounds was lower in the optimized formulations.

Улучшенное свойство стабильности оптимизированных составов наблюдали при концентрациях белка 30 и 120 мг/мл и во флаконе, а также в предварительно заполненном шприце.Improved stability properties of the optimized formulations were observed at protein concentrations of 30 and 120 mg/mL in both vial and prefilled syringe.

В общем, оптимизированный состав с концентрацией белка 30 и 120 мг/мл, содержащий гистидин-ацетатный буфер рН 5,5, 25 мМ хлорида натрия, 7 мМ метионина, 160 мМ сахарозы и 0,04% полисорбата 20, обеспечивает состав без частиц с низкой мутностью и вязкостью и улучшенным свойством стабильности во флаконе и предварительно заполненном шприце.In general, an optimized formulation at 30 and 120 mg/mL protein concentrations containing pH 5.5 histidine acetate buffer, 25 mM sodium chloride, 7 mM methionine, 160 mM sucrose, and 0.04% polysorbate 20 provides a particle-free formulation with low turbidity and viscosity and improved stability properties in the vial and pre-filled syringe.

Пример 7: Безопасность метионина для применения при показаниях для глаз (в составе для интравитреального введения) Обзор неклинических исследований токсичности с L-метиониномExample 7: Safety of Methionine for Ocular Indications (Intravitreal Formulation) Review of Non-Clinical Toxicity Studies with L-Methionine

Проводили исследование токсичности у яванских макаков, в котором метионин (10 мМ) был компонентом носителя и составленного тестового материала CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимаб). В этом исследовании всего 12 животным (6 самцов/6 самок) вводили интравитреально 50 цл/глаз дважды через 14 дней. Левые глаза обрабатывали носителем (содержащим 10 мМ метионина), а правые глаза обрабатывали составленным тестовым материалом CrossMAb VEGFang2-0016 (фарицимабом), также содержащим 10 мМ метионина. В этом исследовании не наблюдали никаких воздействий метионина на глаза у яванских макаков.A toxicity study was conducted in cynomolgus monkeys in which methionine (10 mM) was a component of the vehicle and CrossMAb VEGFang2-0016 (faricimab) formulation test material. In this study, a total of 12 animals (6 males/6 females) were administered intravitreal 50 ml/eye twice after 14 days. Left eyes were treated with vehicle (containing 10 mM methionine) and right eyes were treated with CrossMAb VEGFang2-0016 compounded test material (faricimab), also containing 10 mM methionine. In this study, no effects of methionine on the eyes were observed in cynomolgus monkeys.

Проводили три исследования (на яванских макаках и новозеландских белых кроликах), в которых метионин (5-25 мМ) был компонентом носителя, вводимого интравитреально (также 50 цл/глаз) до шести раз через 14 дней. В этих исследованиях не наблюдали никаких воздействий метионина на глаза у любых животных, обработанных содержащим метионин носителем.Three studies were conducted (cynomolgus monkeys and New Zealand white rabbits) in which methionine (5-25 mM) was a component of vehicle administered intravitreally (also 50 ml/eye) up to six times over 14 days. In these studies, no effects of methionine on the eyes were observed in any animals treated with methionine-containing vehicle.

Обзор неклинических исследований токсичности представлен в Таблице 14.A summary of non-clinical toxicity studies is presented in Table 14.

Сокращения: NAT=N-ацетилтриптофан; НЗБ=новозеландский белый.Abbreviations: NAT=N-acetyltryptophan; NZB=New Zealand White.

Пример 8: СтабильностьExample 8: Stability

Партию лекарственного продукта (120 мг/мл антитела к Vegf/Ang2 (фарицимаб) в 20 мМ L-гистидин-ацетата рН 5,5, 160 мМ сахарозы, 25 мМ хлорида натрия, 7 мМ L-метионина, 0,04% полисорбата 20) фильтровали через 0,22 мкм стерильный фильтр и набирали в чистые и стерильные 2 мл стеклянные флаконы с объемом заполнения 0,24 мл.A batch of medicinal product (120 mg/ml antibody to Vegf/Ang2 (faricimab) in 20 mM L-histidine acetate pH 5.5, 160 mM sucrose, 25 mM sodium chloride, 7 mM L-methionine, 0.04% polysorbate 20 ) were filtered through a 0.22 µm sterile filter and filled into clean and sterile 2 ml glass vials with a filling volume of 0.24 ml.

После изготовления рН составлял 5,6, осмоляльность 320 мОсм/кг и концентрация белка 120 мг/мл.After production, the pH was 5.6, the osmolality was 320 mOsm/kg, and the protein concentration was 120 mg/mL.

Таблица 15 представляет данные о стабильности партии лекарственного продукта GLI0219-01 при хранении при 5°С. Таблица 16 показывает стабильность при хранении при 25°С.Table 15 provides data on the stability of a batch of drug product GLI0219-01 when stored at 5°C. Table 16 shows stability when stored at 25°C.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ<110> F.HOFFMANN-LA ROCHE AG

<120> СОСТАВ, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИТЕЛО<120> ANTIBODY CONTAINING COMPOSITION

<130> P35108-WO<130> P35108-WO

<150> EP18203104.7<150>EP18203104.7

<151> 2018-10-29<151> 2018-10-29

<160> 25<160> 25

<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 14<211> 14

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR3H тяжелой цепи, <VEGF><223> CDR3H heavy chain, <VEGF>

<400> 1<400> 1

Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp ValTyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 101 5 10

<210> 2<210> 2

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR2H тяжелой цепи, <VEGF><223> Heavy chain CDR2H, <VEGF>

<400> 2<400> 2

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe LysTrp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys

1 5 10 151 5 10 15

ArgArg

<210> 3<210> 3

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR1H тяжелой цепи, <VEGF><223> Heavy chain CDR1H, <VEGF>

<400> 3<400> 3

His Tyr Gly Met AsnHis Tyr Gly Met Asn

1 515

<210> 4<210> 4

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR3L легкой цепи, <VEGF><223> CDR3L light chain, <VEGF>

<400> 4<400> 4

Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp ThrGln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr

1 515

<210> 5<210> 5

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR2L легкой цепи, <VEGF><223> CDR2L light chain, <VEGF>

<400> 5<400> 5

Phe Thr Ser Ser Leu His SerPhe Thr Ser Ser Leu His Ser

1 515

<210> 6<210> 6

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR1L легкой цепи, <VEGF><223> CDR1L light chain, <VEGF>

<400> 6<400> 6

Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu AsnSer Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 101 5 10

<210> 7<210> 7

<211> 123<211> 123

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи VH, <VEGF><223> VH heavy chain variable domain, <VEGF>

<400> 7<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

20 25 30 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValGly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp PheGly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60 50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala TyrLys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp ValAla Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110 100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 8<210> 8

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> вариабельный домен легкой цепи VL, <VEGF><223> VL light chain variable domain, <VEGF>

<400> 8<400> 8

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn TyrAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu IleLeu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro TrpGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 9<210> 9

<211> 20<211> 20

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR3H тяжелой цепи, <ANG-2><223> CDR3H heavy chain, <ANG-2>

<400> 9<400> 9

Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro GlySer Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ala Phe Asp IleAla Phe Asp Ile

20 20

<210> 10<210> 10

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR2H тяжелой цепи, <ANG-2><223> CDR2H heavy chain, <ANG-2>

<400> 10<400> 10

Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe GlnTrp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 11<210> 11

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR1H тяжелой цепи, <ANG-2><223> CDR1H heavy chain, <ANG-2>

<400> 11<400> 11

Gly Tyr Tyr Met HisGly Tyr Tyr Met His

1 515

<210> 12<210> 12

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR3L легкой цепи, <ANG-2><223> CDR3L light chain, <ANG-2>

<400> 12<400> 12

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp ValGln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val

1 5 101 5 10

<210> 13<210> 13

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR2L легкой цепи, <ANG-2><223> CDR2L light chain, <ANG-2>

<400> 13<400> 13

Asp Asp Ser Asp Arg Pro SerAsp Asp Ser Asp Arg Pro Ser

1 515

<210> 14<210> 14

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> CDR1L легкой цепи, <ANG-2><223> CDR1L light chain, <ANG-2>

<400> 14<400> 14

Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val HisGly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His

1 5 101 5 10

<210> 15<210> 15

<211> 129<211> 129

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи VH, <ANG-2><223> VH heavy chain variable domain, <ANG-2>

<400> 15<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly AlaGln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 151 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly TyrSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp MetTyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys PheGly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala TyrGln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysMet Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr TyrAla Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr

100 105 110 100 105 110

Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val SerPro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

115 120 125 115 120 125

SerSer

<210> 16<210> 16

<211> 110<211> 110

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> вариабельный домен легкой цепи VL, <ANG-2><223> VL light chain variable domain, <ANG-2>

<400> 16<400> 16

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly GlnSer Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 151 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser ValThr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val TyrHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45 35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly SerAsp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala GlyAsn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp HisAsp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95 85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser SerTrp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser

100 105 110 100 105 110

<210> 17<210> 17

<211> 453<211> 453

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> Тяжелая цепь 1 <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG1 с мутациями AAA<223> Heavy chain 1 <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG1 with AAA mutations

и мутациями P329G LALA (VEGFang2-0016) and P329G LALA mutations (VEGFang2-0016)

<400> 17<400> 17

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys GlyTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125 115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly GlyPro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140 130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro ValThr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr PheThr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175 165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val ValPro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190 180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn ValThr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205 195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro LysAsn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220 210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu AlaSer Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

225 230 235 240225 230 235 240

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp ThrAla Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255 245 250 255

Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp ValLeu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270 260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly ValSer His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285 275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn SerGlu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300 290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp LeuThr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly AlaAsn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala

325 330 335 325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu ProPro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350 340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn GlnGln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365 355 360 365

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile AlaVal Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380 370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr ThrVal Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys LeuPro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415 405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys SerThr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430 420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu SerVal Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445 435 440 445

Leu Ser Pro Gly LysLeu Ser Pro Gly Lys

450 450

<210> 18<210> 18

<211> 463<211> 463

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> Тяжелая цепь 2 <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG1 с мутациями AAA<223> Heavy chain 2 <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG1 with AAA mutations

<400> 18<400> 18

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser AspSer Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140 130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn AsnGlu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala LeuPhe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175 165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys AspGln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190 180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp TyrSer Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205 195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu SerGlu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220 210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr HisSer Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His

225 230 235 240225 230 235 240

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser ValThr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

245 250 255 245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg ThrPhe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr

260 265 270 260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro GluPro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285 275 280 285

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala LysVal Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300 290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val SerThr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320305 310 315 320

Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr LysVal Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335 325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr IleCys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350 340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu ProSer Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

355 360 365 355 360 365

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys AlaPro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

370 375 380 370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser AsnVal Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp SerGly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415 405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser ArgAsp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430 420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala LeuTrp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445 435 440 445

His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysHis Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460 450 455 460

<210> 19<210> 19

<211> 214<211> 214

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> Легкая цепь 1 <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG1 с мутациями AAA<223> Light chain 1 <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG1 with AAA mutations

<400> 19<400> 19

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala AlaThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser GlyPro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu AlaThr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser GlnLys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu SerGlu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val TyrSer Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys SerAla Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu CysPhe Asn Arg Gly Glu Cys

210 210

<210> 20<210> 20

<211> 213<211> 213

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственный<213> Artificial

<220><220>

<223> Легкая цепь 2 <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG1 с мутациями AAA<223> Light chain 2 <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG1 with AAA mutations

<400> 20<400> 20

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala SerTrp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser

100 105 110 100 105 110

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser ThrThr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe ProSer Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

130 135 140 130 135 140

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly ValGlu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

145 150 155 160145 150 155 160

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu SerHis Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

165 170 175 165 170 175

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr IleSer Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

180 185 190 180 185 190

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys ValCys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

195 200 205 195 200 205

Glu Pro Lys Ser CysGlu Pro Lys Ser Cys

210 210

<210> 21<210> 21

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 21<400> 21

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp GluArg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 151 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn PheGln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu GlnTyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp SerSer Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60 50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr GluThr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 8065 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser SerLys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95 85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu CysPro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105 100 105

<210> 22<210> 22

<211> 105<211> 105

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 22<400> 22

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser GluGln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp PheGlu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30 20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro ValTyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45 35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn LysLys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60 50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys SerTyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 8065 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val GluHis Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95 85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys SerLys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105 100 105

<210> 23<210> 23

<211> 330<211> 330

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 23<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser LysAla Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 151 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp TyrSer Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr SerPhe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr SerGly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln ThrLeu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 8065 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp LysTyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro CysLys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro ProPro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr CysLys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn TrpVal Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg GluTyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175 165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val LeuGlu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190 180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser AsnHis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys GlyLys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220 210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp GluGln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe TyrLeu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu AsnPro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe PheAsn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly AsnLeu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr ThrVal Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysGln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330 325 330

<210> 24<210> 24

<211> 191<211> 191

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 24<400> 24

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu LeuMet Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 151 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu GlyTyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30 20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr GlnGly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45 35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln GluArg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60 50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro LeuTyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val ProMet Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95 85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro HisThr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys CysGln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125 115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys GlyGlu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly

130 135 140 130 135 140

Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln ThrPro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr

145 150 155 160145 150 155 160

Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg GlnCys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln

165 170 175 165 170 175

Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg ArgLeu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

180 185 190 180 185 190

<210> 25<210> 25

<211> 496<211> 496

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 25<400> 25

Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu AlaMet Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala

1 5 10 151 5 10 15

Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys LysAla Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys

20 25 30 20 25 30

Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu ProGln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro

35 40 45 35 40 45

Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn AlaGlu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala

50 55 60 50 55 60

Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg LeuVal Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met LysGln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys

85 90 95 85 90 95

Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu IleLeu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile

100 105 110 100 105 110

Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile GlyGln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly

115 120 125 115 120 125

Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr AspThr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp

130 135 140 130 135 140

Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln LeuVal Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu

145 150 155 160145 150 155 160

Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu AspLeu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp

165 170 175 165 170 175

Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu GluGln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu

180 185 190 180 185 190

Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln SerLys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser

195 200 205 195 200 205

Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln AsnIle Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn

210 215 220 210 215 220

Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val AsnSer Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn

225 230 235 240225 230 235 240

Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val AsnAsn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn

245 250 255 245 250 255

Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro ThrAsn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr

260 265 270 260 265 270

Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val PheVal Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe

275 280 285 275 280 285

Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro AsnLys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn

290 295 300 290 295 300

Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly GlySer Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly

305 310 315 320305 310 315 320

Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe GlnGly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln

325 330 335 325 330 335

Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly GluArg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu

340 345 350 340 345 350

Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln ArgTyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg

355 360 365 355 360 365

Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala TyrTyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr

370 375 380 370 375 380

Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr ArgSer Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg

385 390 395 400385 390 395 400

Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser IleIle His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile

405 410 415 405 410 415

Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp LysSer Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys

420 425 430 420 425 430

Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe AspCys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp

435 440 445 435 440 445

Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg GlnAla Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln

450 455 460 450 455 460

Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly SerAsn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser

465 470 475 480465 470 475 480

Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp PheGly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe

485 490 495 485 490 495

<---<---

Claims

- от 118 до 128 мг/мл биспецифического антитела к VEGF/ANG2, содержащего константную область тяжелой цепи подкласса IgG1 человека,- from 118 to 128 mg/ml of a bispecific antibody to VEGF/ANG2 containing the heavy chain constant region of the human IgG1 subclass,

- от 15 до 35 мM хлорида натрия,- from 15 to 35 mM sodium chloride,

- от 15 до 25 мM гистидин-ацетатного буфера,- from 15 to 25 mM histidine acetate buffer,

при pH от 5,5 до 6,1; at pH from 5.5 to 6.1;

где биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 представляет собой фарицимаб.wherein the anti-VEGF/ANG2 bispecific antibody is faricimab.

2. Фармацевтический состав по п. 1 для интравитреального введения.2. Pharmaceutical composition according to claim 1 for intravitreal administration.

3. Фармацевтический состав по любому из пп. 1, 2, причем состав по существу не содержит видимых частиц.3. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1, 2, the composition being substantially free of visible particles.

4. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-3, причем состав дополнительно содержит4. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-3, and the composition additionally contains

- от 5,0 до 9,0 мM метионина.- from 5.0 to 9.0 mM methionine.

5. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, причем состав дополнительно содержит5. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-4, and the composition additionally contains

- от 0,03 до 0,07% масс./об. полисорбата 20.- from 0.03 to 0.07% w/v. polysorbate 20.

6. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-5, причем состав дополнительно содержит6. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-5, and the composition additionally contains

- от 136 до 184 мM сахарозы.- from 136 to 184 mM sucrose.

7. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-6, причем состав имеет вязкость 20 мПа⋅с или менее.7. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-6, and the composition has a viscosity of 20 mPa.s or less.

8. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-7, причем состав имеет мутность 30 ЕМФ или менее.8. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-7, and the composition has a turbidity of 30 FFU or less.

9. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-8, причем состав имеет ионную силу от 20 до 50.9. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-8, and the composition has an ionic strength from 20 to 50.

10. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-9, в котором содержание высокомолекулярных соединений (ВМС) биспецифического антитела в фармацевтическом составе составляет менее 10% через 8 недель при 25°C или через 52 недели при 25°C.10. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-9, in which the content of high molecular weight compounds (HMW) of the bispecific antibody in the pharmaceutical composition is less than 10% after 8 weeks at 25°C or after 52 weeks at 25°C.

11. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-10, в котором осмоляльность состава составляет от 200 до 400 мОсм/кг.11. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-10, in which the osmolality of the composition is from 200 to 400 mOsm/kg.

12. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-11 для применения в лечении сосудистого заболевания глаз.12. Pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-11 for use in the treatment of vascular eye disease.

13. Фармацевтический состав для применения по п. 12, где сосудистые заболевания глаз выбраны из группы, состоящей из диабетической ретинопатии (ДР), диабетического макулярного отека (ДМО), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), макулярной дегенерации, влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД), ретинопатии недоношенных (РН), неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), ретинальной ангиоматозной пролиферации, макулярной телеангиэктазии, ишемической ретинопатии, неоваскуляризации радужной оболочки, внутриглазной неоваскуляризации, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки, хориоидальной неоваскуляризации и дегенерации сетчатки, в частности из группы, состоящей из диабетической ретинопатии (ДР), диабетического макулярного отека (ДМО), окклюзии вены сетчатки (ОВС), окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД).13. Pharmaceutical composition for use according to claim 12, where vascular eye diseases are selected from the group consisting of diabetic retinopathy (DR), diabetic macular edema (DME), retinal vein occlusion (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO), macular degeneration, wet age-related macular degeneration (wet AMD), retinopathy of prematurity (ROP), neovascular glaucoma, retinitis pigmentosa (RP), retinal angiomatous proliferation, macular telangiectasia, ischemic retinopathy, iris neovascularization, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization , choroidal neovascularization and retinal degeneration, in particular from the group consisting of diabetic retinopathy (DR), diabetic macular edema (DME), retinal vein occlusion (RVO), central retinal vein occlusion (CRVO), wet age-related macular degeneration (wet AMD) .

14. Способ получения фармацевтического состава по любому из пп. 1-11,14. A method for producing a pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-11,

при этом способ включает стадии:the method includes the stages:

- замены буфера основного объема раствора биспецифического антитела a) на буфер для диафильтрации путем ультрафильтрации и диафильтрации или б) путем диализа при помощи буфера для диализа, причем буферы содержат гистидин-ацетатный буфер, или гистидин-ацетатный буфер и хлорид натрия, или гистидин-ацетатный буфер, хлорид натрия и метионин, или гистидин- ацетатный буфер, хлорид натрия, метионин и сахарозу;- replacing the bulk buffer of the bispecific antibody solution a) with a diafiltration buffer by ultrafiltration and diafiltration or b) by dialysis with a dialysis buffer, the buffers containing a histidine acetate buffer, or a histidine acetate buffer and sodium chloride, or histidine acetate buffer, sodium chloride and methionine, or histidine acetate buffer, sodium chloride, methionine and sucrose;

- концентрирования основного объема раствора с замененным буфером путем ультрафильтрации;- concentrating the main volume of the solution with the replaced buffer by ultrafiltration;

- регулирования готовой композиции фармацевтического состава путем добавления исходных растворов соответствующих вспомогательных веществ или при помощи соответствующего стабилизирующего буфера и гомогенизации жидкого фармацевтического состава путем перемешивания.- adjusting the finished pharmaceutical composition by adding stock solutions of appropriate excipients or using an appropriate stabilizing buffer and homogenizing the liquid pharmaceutical composition by stirring.

15. Флакон, содержащий фармацевтический состав по любому из пп. 1-4.15. A bottle containing a pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-4.

16. Предварительно заполненный шприц, содержащий фармацевтический состав по любому из пп. 1-11.16. A pre-filled syringe containing the pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-11.

17. Лиофилизированная форма жидкого фармацевтического состава по любому из пп. 1-11.17. Lyophilized form of the liquid pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 1-11.