RU2806252C1 - Способ диагностики классической чумы свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (fish) - Google Patents
Способ диагностики классической чумы свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (fish) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2806252C1 RU2806252C1 RU2023102441A RU2023102441A RU2806252C1 RU 2806252 C1 RU2806252 C1 RU 2806252C1 RU 2023102441 A RU2023102441 A RU 2023102441A RU 2023102441 A RU2023102441 A RU 2023102441A RU 2806252 C1 RU2806252 C1 RU 2806252C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hybridization
- swine fever
- virus
- classical swine
- sections
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу диагностики классической чумы свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Способ предусматривает применение нуклеотидной последовательности, при котором исследуются органы свиней на наличие генома вируса, используя гибридизационный зонд в виде нуклеотидной последовательности CTGTGGCTAATAGTGACCTACATAGTTCTAACAGAACAACCCGCCGCTGGTTTACAGCTGGGCCAGGGTGAGGTAGTGTTAATAGGGAACTTAATTACCCACACAGACATTGAGGTTGTAGTATATTTCTTACTGCTCTATTTGGTCATGAGAGATGAGCCTATAAAGAAATG с флуоресцеин-12-dUTP красителем, детектируемым в ультрафиолетовом свете микроскопа в виде изумрудно-зеленого свечения внутри восприимчивых клеток. Изобретение эффективно для выявления генетической последовательности вируса классической чумы свиней в восприимчивых к вирусу клетках органов (миндалина, селезенка и мезентериальный лимфатический узел) и расширения арсенала способов диагностики классической чумы свиней. 6 ил.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и ветеринарных лабораториях для диагностики классической чумы свиней в гистологических срезах органов-мишений путем выявления генетического материала вируса в инфицированных клетках при помощи метода гибридизации in-situ основанном на применении меченного флуоресцеином нуклеотидного зонда.
Уровень техники
Для диагностики КЧС используют разнообразные лабораторные методы, направленные на выделение вируса, обнаружение его антигена или нуклеотидной последовательности. Среди исследований, направленных на достижение данной цели, применяют выделение вируса в клеточных культурах, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА), флуоресцентную гибридизацию in-situ и иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) [Стаффорд В.В., Алексеев К.П., Южаков А.Г., Гулюкин A.M., Алипер Т.И.. Применение иммуногистохимического метода для диагностики классической чумы свиней. Ветеринария и кормление. - 2022. - N3. - С. 61-65. DOI: 10.30917/ATT-VK-1814-9588-2022-3-16].
Иностранные специалисты, для гибридизации in-situ в органах и тканях от свиней, зараженных КЧС, используют протокол опубликованный в сборнике Всемирной организации здоровья животных (МЭБ) «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals» (Глава 3.9.3) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.oie.int/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/. Методика заключается в следующем. В качестве гибридизационного зонда используют нуклеотидную последовательность состоящую из 61 п.н. (TATGATTTATTGCAAGCCCAGAGGTACGGTATAGAAGATGGGATAAATATCACCAAATCCT) меченных цианином (Су3) соответсвующую региону 6728-6788 штамма cF114 (AF333000) [Zhang Q, Xu L, Zhang Y, et al. A novel ViewRNA in-situ hybridization method for the detection of the dynamic distribution of Classical Swine Fever Virus RNA in PK15 cells. Virol J. 2017; 14(1):81]. Для выполнения гибридизации in-situ зарубежные коллеги используют парафиновые гистологические срезы из паренхиматозных органов свиней, которые они инкубируют при 60°С 30 минут с последующей депарафинизацией в ксилоле (2×10 мин) и дегидратацией в серии этанола (100%, 95%, 70% и 50% в течение 5 мин каждый). Затем срезы промывают в диэтилпирокарбонатной воде (DEPC) (2×5 мин), после, в DEPC с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (рН 7,4) (2×5 мин), а после этого промывают в растворе DEPC PBS с содержанием 100 mM глицина (2×5 мин), затем споласкивают DEPC PBS с 0,3% раствором тритона Х-100 (1×15 мин), промывают в PBS, и в DEPC (2×5 мин). Для повышения доступности мишени и проникновения зонда срезы ткани обрабатывают 200 микролитрами раствора протеиназы-К (40 мкг/мл) в течение 45 мин при 37°С в камере гибридизации (HYBAID, США). Затем срезы фиксируют в 4% растворе забуференного параформальдегида (рН 7,4) 15 минут при 4°С и промывают в PBS, а затем в DEPC (2×5 мин).
Предварительная гибридизация, гибридизационная и постгибридизационная промывка. Гибридизацию проводят в пластиковом контейнере с плотно закрывающейся крышкой. Промокательную бумагу, смоченную 6-кратным раствором хлорида натрия и цитрата натрия (SSC), помещают на дно чашки. Избегают контакта предметных стекол с влажным дном при помощи подложки из стеклянных стержней. Предметные стекла, удерживаемые на стеклянных стержнях, должны находиться в ровной плоскости. Срезы предварительно инкубируют в 200 мкл буфера предварительной гибридизации (4Х SSC, содержащего 50% деионизированного формамида) под силиконизированными покровными стеклами при 42°С в течение 1 часа. Затем жидкость сливают, а предметные стекла промывают в 2Х SSC в течение 1 мин. Наконец, срезы покрывают 70 мкл буфера для гибридизации (40% деионизированного формамида, содержащего 4Х SSC, 1X реагент Денхардта, 10% декстрансульфата, 10 мм DTT, 2 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и зонд, меченный термоденатурированным биотином, 100 нг/мкл). Срезы покрывают силиконизированными покровными стеклами и запечатывают резиновым цементом. Денатурацию проводят при 70°С на нагретой платформе в течение 5 мин, с последующим охлаждением на ледяной платформе в течение 3 мин. Предметные стекла переносят в камеру гибридизации и инкубируют в течение ночи при 42°С. Этапы промывки после гибридизации включают в себя полоскание 2 раза SSC (1×10 мин), 2 раза SSC (2×15 мин, 37°С), 1 раз SSC (2×15 мин, 37°С) и ОДХ SSC (2×30 мин, 42°С). Детекция метки. Срезы ткани дважды промывают в буфере TNT (100 мм Tris-HCl, 150 мм NaCl, 0,05% Tween-20) рН 7,5 при RT и инкубируют с 200 мкл блокирующего буфера (TBS, содержащего 3% BSA и 0,1% TritonX-100) в течение 1 часа при 37°С.Затем блокирующий буфер декантируют и срезы инкубируют с флуоресцентно меченным конъюгатом стрептавидина (Bangalore Genei, Индия) в разведении 1:250 в течение 30 минут при 37°С.После, срезы промывают в буфере TNT (3×10 мин). Предметные стекла готовят для просмотра под флуоресцентным микроскопом путем обезвоживания в серии этанола возрастающей концентрации и монтируют в 50% забуференный глицериновый желатин. Положительные сигналы идентифицируют по наличию флуоресценции. [Kumaresan Nagarajan, Guttula Saikumar. Fluorescent in-situ hybridization technique for the detection and localization of classical swine fever virus in infected tissues. Veterinarski Arhiv. 82 (5). 2012. P. 495-504]. Данную разработку мы взяли за прототип.
На территории Российской Федерации для диагностики классической чумы свиней используют биопробу, полимеразную цепную реакцию, реакцию иммунофлюоресценции, реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ [Стаффорд В.В., Алексеев К.П., Южаков А.Г., Гулюкин A.M., Алипер Т.И.. Применение иммуногистохимического метода для диагностики классической чумы свиней. Ветеринария и кормление. - 2022. - N3. - С. 61-65. DOI: 10.30917/ATT-VK-1814-9588-2022-3-16., Стаффорд В.В., Стрельцова Я.Б. Иммуногистохимия и гибридизация insitu в диагностике классической чумы свиней. Ветеринария и кормление. №6. - 2018. - С. 14-16., Методические указания по лабораторной диагностике классической чумы свиней // Утв. Минсельхозпродом России 30.12.1996 N 13-4-2/809].
Технической проблемой является необходимость разработки меченного гибридизационного зонда комплиментарного участку генома вируса классической чумы свиней для создания эффективного и доступного способа диагностики классической чумы свиней, для обнаружения генетического материала вируса в тканях и органах свиней, выполнимого в условиях гистологических лабораторий без использования дорогостоящих расходных материалов, и для расширение арсенала способов диагностики классической чумы свиней.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом является выявление генетической последовательности вируса классической чумы свиней в восприимчивых к вирусу клетках органов (миндалина, селезенка и мезентериальный лимфатический узел) и расширение арсенала способов диагностики классической чумы свиней.
Данный способ гибридизации in-situ позволяет определить локализацию генома вируса в клетках органов в организме, а также изучить патогенез болезни, сопоставить данные при комплексной диагностике, с патогистологическими изменениями, тем самым подтвердить патологическое влияние вируса на зараженные ткани и органы и поставить окончательный диагноз при латентном течении болезни. Использование данного способа важно для патоморфологических исследований и способствует точной дифференциальной диагностике, изучению патогенеза и иммунного ответа у больного животного.
Предложенный способ заключается в следующем.
Для выполнения гибридизации in-situ на нативных гистологических срезах органов свиней используют олигонуклеотидный ДНК зонд. Гибридизационный ДНК зонд получают по следующей методике: в начале, из лиофилизированного вакцинного штамм КС вируса классической чумы свиней выделяют РНК с помощью коммерческого набора «РИБО-преп» («ИнтерЛабСервис», Россия) по методике производителя.
Далее для получения специфичного фрагмента размером 173 п. н. соответствующего участку гена гликопротеина Е2 проводят гнездовую ПЦР. В первом раунде ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) используют прямой праймер F1 5'-ATATATGCTCAAGGGCGAGT-3' и обратный R1 5'-ACAGCAGTAGTATCCATTTCTTTA-3'. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 5 мкл образца, 5 мкл 5х буфера для ОТ-ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смесь dNTP (Диам, Россия), 12,1 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq-полимеразы (Диам, Россия), 0,125 MMLV-ревертазы и по 10 пМ прямого и обратного праймеров. Термический цикл: 50°С - 30 мин, 94°С - 5 мин, затем 25 циклов: 95°С - 30с, 60,5°С - 30с и 72°С - 90с; в конце 72°С - 5 мин. Во втором раунде проводят ПЦР с праймерами: прямой F2 5'-CTGTGGCTAATAGTGACCTAC-3' и обратный R2 5'-CATTTCTTTATGGGCTCATC-3'. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 5 мкл образца, 2,5 мкл 10х буфер для ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смесь dNTP (Диам, Россия), 14,6 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq-полимеразы (Диам, Россия) и по 10 пМ прямого и обратного праймеров. Термический цикл: 94°С - 5 мин, затем 25 циклов: 94°С - 30с, 55°С - 30с и 72°С - 90с; в конце 72°С - 5 мин. После амплификации проводят электрофорез в 1% агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном буферном растворе (рН 8,0) с добавлением 40 мкл бромистого этидия на литр буфера. ПЦР-фрагмент, соответствующий по электрофоретической подвижности размеру в 173 п. н., вырезают и выделяют из геля при помощи набора «LumiPure» (Lumiprobe, Россия) по методике производителя.
Для мечения пробы ДНК с помощью ПЦР используют флуоресцеин-12-dUTP ("Силекс", Россия). Реакционная смесь содержит следующие компоненты: 4,0 мкл смеси флуоресцеин-12-dUTP 1/3, 2,5 мкл Taq-буфера (х10), по 1 мкл праймеров F2 и R2 до конечной концентрации каждого праймера 0.1-1 мкМ, 0,25 мкл Taq-полимеразы, 5 мкл матричной ДНК (0.02-0.15 мкг/25 мкл смеси), деионизированной воды до 25 мкл. Программа амплификации: 40 циклов: 94°С - 10с; 55°С - 10с; 72°С - 30с, после последнего цикла инкубируют при 72°С - 3 мин.
Дополнительно нуклеотидную последовательность зонда определяют по методу Сэнгера с использованием набора «BigDye 3.1» (Applied Biosystems, США). В итоге получают нуклеотидную последовательность, которую используют в качестве меченного флуоресцеином зонда для реакции гибридизации in-situ:
После этого приступают ко второму этапу - реакции гибридизации in-situ. Методика заключается в следующем:
В качестве патологического материала для определения локализации генетического материала вируса классической чумы свиней от павших животных или вынужденно убитых берут миндалину, селезенку и мезентериальный лимфатический узел. Нативный патологический материал охлаждают в течение 6 часов в холодильной камере при температуре 4°С. Транспортировку проб выполняют в сумке-холодильнике с хладоэлементами, поддерживающими температуру 4°С на всем этапе перевозки. Затем для длительного хранения материал помещают в низкотемпературную камеру и хранят при температуре - 70°С. Непосредственно перед исследованием пробы размораживают. Далее из отобранных органов иссекают необходимые образцы размером 0,5 см в длину и ширину и 2 см в толщину. Иссеченные участки органов фиксируют на столиках для криотомии, заполняя область между столиком и тканью специальным криогелем. Столики с объектами помещают в камеру криотома при температуре -34°С на 60 минут. Из готового блока нарезают срезы толщиной 10 микрон и наклеивают на поляризированные стекла. После этого обрабатывают срезы смесью изопропилового спирта 70 мл и физиологического раствора 30 мл, 1 час при 4°С. После этого промывают их в 0,01М ФСБ 3 раза по 5 минут в каждой порции при комнатной температуре.
Приготовление 0,01М ФСБ для отмывки срезов:
рН=7.0
Затем срезы ополаскивают в 4% растворе параформальдегида 15 минут при температуре +4°С. Пропись раствора:
40% параформальдегид - 4 г растворяют в 100 мл 0,1 М ФСБ при
помощи кипячения.
Перед использованием охлаждают раствор во льду.
После этого промывают в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут. Готовят раствор протеиназы К в ФСБ из расчета 20 мг на 1 мл 0,1М ФСБ. Общий объем раствора рассчитывают исходя из 0,3 мл на 1 стекло. Выдерживают в растворе протеиназы К 15 минут при комнатной температуре. Затем промывают в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут. Готовят гибридизационный буфер (ГБ) рН=7.2:
Формамид 5 мл
50% раствор декстрана сульфата натрия на дистиллированой
воде - 1 мл
0,1 МФСБ 1 мл
20хЦитратный буфер (ЦСБ) - 1 мл (87,5 г NaCl + 44 г
Na3цитрат *2Н2О+400 мл бидистиллированной воды) - 1 мл
Регулируют кислотность 37% HCl (12М=>1 мл HCl/11 мл Н2О
=>1М)
Затем готовят гибридизационную смесь (ГС) из расчета:
Гибридизационный буфер 500 мкл
Гибридизационный зонд 5 мкл
Гибридизационную смесь наносят на стекла в количестве 200 мкл на срез, закрывают покровным стеклом и запечатывают резиновым клеем. Помещают в чашки петри на подставках на нагревательный столик при 96°С на 15 минут. После инкубации в ГС снижают температуру до 37°С и оставляют чаши на 16 часов при заданной температуре.
По истечении 16 часовой инкубации аккуратно размонтируют срезы от покровного стекла в 4х ЦСБ 4 раза по 5 минут:
20х ЦСБ - 60 мл
Н2О бидистиллированная - 240 мл
И затем сразу помещают в формамидно-солевую смесь и ополаскивают при комнатной температуре 3 раза по 10 минут в каждой порции:
Формамид - 150 мл
20хЦСБ - 60 мл
Н2О бидистиллированная - 90 мл
После этого, срезы вновь ополаскивают в 4х ЦСБ 4 раза по 5 минут при комнатной температуре. Затем срезы инкубируют в Трис-HCl буфере 30 минут при комнатной температуре и монтируют их покровным стекло на флуоресцентную монтирующую среду. Пропись Трис-HCl буфера:
50 μМ Трис HCl - 5 мл
100 μМ NaCl - 0.58 г
Н2О бидистиллированная до 100 мл
Данный способ применим для гибридизации in-situ на нативных криосрезах миндалины, селезенки, мезентериального лимфатического узла и других органов с использованием гибридимзационного зонда к нуклеотидной последовательности генома вируса классической чумы свиней. Детекция нуклеотидной последовательности вируса происходит в цитоплазме восприимчивых клеток зараженных органов путем визуализации флуоресцентной метки гибридизационного зонда в виде ярко-зеленого свечения в потоке ультрафиолетового луча с длиной волны 480 нм. При использовании предложенного способа при положительной реакции визуализируется флюоресцентная метка, в виде изумрудно-зеленого свечения в цитоплазме восприимчивых клеток (фиг. 1-2).
Предложенный способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет с точностью выявлять локализацию вируса, а также проводить дифференциальную диагностику КЧС от других возбудителей инфекций свиней со схожей клинической картиной.
Сектор патоморфологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН успешно апробировал вышеуказанный способ диагностики классической чумы свиней в научной и практической деятельности. Согласно результатам испытаний, данный способ исследования может быть рекомендован для применения в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.
Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами:
Пример №1
От 30 павших свиней был отобран свежий материал для исследования (миндалина, селезенка и мезентериальный лимфоузел), в течение 8 часов материал был доставлен в лабораторию в сумке холодильнике, в плотно закрытой таре при 3°С. В лаборатории с соблюдением правил асептики и антисептики, иссекли образцы размером 0,5 см на 0,5 см из каждого органа, приморозили к криотомным столикам в камере криостата и нарезали по 2 среза на стекло из каждого органа. Срезы толщиной 10 микрон, поместили на поляризованные стекла, высушили. После этого срезы обрабатывали смесью изопропилового спирта 70 мл и физиологического раствора 30 мл, 1 час при 4°С. Затем промывали их в 0,01М ФСБ 3 раза по 5 минут в каждой порции при комнатной температуре. После ополаскивали в 4% растворе параформальдегида 15 минут при температуре +4°С. И промывали в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут. Далее готовили раствор протеиназы К в ФСБ из расчета 20 мг на 1 мл 0,1М ФСБ. Общий объем раствора рассчитывали исходя из 0,3 мл на 1 стекло. Выдерживали в растворе протеиназы К 15 минут при комнатной температуре. Затем промывали в 0,1М ФСБ 3 раза по 5 минут. Во время ополаскиания в ФСБ готовили гибридизационный буфер (ГБ) рН=7.2 и гибридизационную смесь. ГС наносили на стекла в количестве 200 мкл на срез, закрывали покровным стеклом и запечатывают резиновым клеем. Монтированные стекла помещали в чашки Петри на подставках на нагревательный столик при 96°С на 15 минут. После периода инкубации в ГС снижали температуру столика до 37°С и оставляли чашки на 16 часов при заданной температуре. По истечении 16 часовой инкубации аккуратно размонтировали срезы от покровного стекла окуная их в разные порции в 4х ЦСБ 4 раза по 5 минут. После последней порции, стекла со срезами сразу помещали в формамидно-солевую смесь и ополаскивают при комнатной температуре 3 раза по 10 минут в каждой порции. После этого, срезы вновь ополаскивали в 4х ЦСБ 4 раза по 5 минут при комнатной температуре. Затем инкубировали их в Трис-HCl буфере 30 минут при комнатной температуре и монтировали их покровным стеклом на флуоресцентную монтирующую среду.
В результате исследования материала, было выявлено, что 24 свиньи было инфицировано вирусом классической чумой свиней.
Положительный результат реакции на наличие генома вируса классической чумы свиней продемонстрирован на фигурах 1, 2 и 3, где четко визуализируется изумрудно-зеленое свечение в цитоплазме восприимчивых клеток. При получении отрицательного результата исследования на наличие генома вируса участки изумрудно-зеленого свечения отсутствуют, что наглядно показано на фигурах 4, 5, 6.
Пример №2 Получение гибридизационной смеси
Для выполнения исследования нативных гистологических образцов от 30 павших свиней (миндалина, селезенка и мезентериальный лимфоузел) потребовалось 18 мл гибридизационной смеси. Для этого вначале мы приготовили гибридизационный буфер с рН=7.2, состоящий из 15 мл формамида, 3мл 50% раствора декстрана сульфата натрия на дистиллированной воде, 3мл 0,1М ФСБ, 3мл 20хЦСБ. Затем из получившегося объема отбирали 18 мл в отдельную емкость и добавляли 180 мкл гибридизационного зонда для получения гибридизационной смеси.
Пример №3 Получение гибридизационного зонда
Для приготовления 18 мл объема гибридизационной смеси потребовалось приготовить 180 мкл гибридизационного зонда. Для этого, необходимый объем нарабатывали исходя из строгой схемы количества веществ и этапов наработки описанных ниже. Таким образом, мы взяли лиофилизированный вакцинный штамм КС вируса КЧС для выделения РНК с помощью коммерческого набора «РИБО-преп» («ИнтерЛабСервис», Россия) по методике производителя. Для получения специфичного фрагмента размером 173 п.н. соответствующего участку гена гликопротеина Е2 выполнили гнездовую ПЦР. В первом раунде ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) использовали прямой праймер F1 5'-ATATATGCTCAAGGGCGAGT-3' и обратный R1 5'-ACAGCAGTAGTATCCATTTCTTTA-3'. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 5 мкл образца, 5 мкл 5х буфера для ОТ-ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смесь dNTP (Диам, Россия), 12,1 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq-полимеразы (Диам, Россия), 0,125 MMLV-ревертазы и по 10 пМ прямого и обратного праймеров. Термический цикл: 50°С - 30 мин, 94°С - 5 мин, затем 25 циклов: 95°С - 30с, 60,5°С - 30с и 72°С - 90с; в конце 72°С - 5 мин. Во втором раунде выполняли ПЦР с праймерами: прямым F2 5'-CTGTGGCTAATAGTGACCTAC-3' и обратным R2 5'-CATTTCTTTATGGGCTCATC-3'. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 5 мкл образца, 2,5 мкл 10х буфер для ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смесь dNTP (Диам, Россия), 14,6 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq-полимеразы (Диам, Россия) и по 10 пМ прямого и обратного праймеров. Термический цикл: 94°С - 5 мин, затем 25 циклов: 94°С - 30с, 55°С - 30с и 72°С - 90с; в конце 72°С - 5 мин. После амплификации проводили электрофорез в 1% агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном буферном растворе (рН 8,0) с добавлением 40 мкл бромистого этидия на литр буфера. ПЦР-фрагмент, соответствующий по электрофоретической подвижности размеру в 173 п. н., вырезали и выделяли из геля при помощи набора «LumiPure» (Lumiprobe, Россия) по методике производителя.
Для мечения пробы ДНК с помощью ПЦР использовали флуоресцеин-12-dUTP ("Силекс", Россия). Реакционная смесь содержала следующие компоненты: 4,0 мкл смеси флуоресцеин-12-dUTP 1/3, 2,5 мкл Taq-буфера (х10), по 1 мкл праймеров F2 и R2 до конечной концентрации каждого праймера 0.1-1 мкМ, 0,25 мкл Taq-полимеразы, 5 мкл матричной ДНК (0.02-0.15 мкг/25 мкл смеси), деионизированной воды до 25 мкл. Программа амплификации: 40 циклов: 94°С - 10с; 55°С - 10с; 72°С - 30с, после последнего цикла инкубируют при 72°С - 3 мин.
Дополнительно нуклеотидную последовательность зонда определяли по методу Сэнгера с использованием набора «BigDye 3.1» (Applied Biosystems, США). В итоге получили нуклеотидную последовательность, которую использовали в качестве меченного флуоресцеином зонда для реакции гибридизации in-situ:
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - Миндалина. Положительный результат FISH с ярким свечением флуоресцентной метки при гибридизации зонда с геномом вируса КЧС в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.
Фиг. 2 - Селезенка. Положительный результат FISH с ярким свечением флуоресцентной метки при гибридизации зонда с геномом вируса КЧС в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.
Фиг. 3 - Мезентериальный лимфатический узел. Положительный результат FISH с ярким свечением флуоресцентной метки при гибридизации зонда с геномом вируса КЧС в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.
Фиг. 4 - Миндалина. Отрицательный результат гибридизации зонда с геномом вируса КЧС в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.
Фиг. 5 - Селезенка. Отрицательный результат гибридизации зонда с геномом вируса КЧС в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.
Фиг. 6 - Мезентериальный лимфатический узел. Отрицательный результат гибридизации зонда с геномом вируса КЧС в цитоплазме восприимчивых клеток. Ув. 630х.
Claims (1)
- Способ диагностики классической чумы свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), основанный на использовании гибридизационного зонда, специфичного к участку гена гликопротеина Е2 вируса, отличающийся тем, что объектом исследования являются нативные криотомные срезы из миндалины, селезенки и мезентериального лимфатического узла, а в качестве гибридизационного зонда используется нуклеотидная последовательность CTGTGGCTAATAGTGACCTACATAGTTCTAACAGAACAACCCGCCGCTGGTTTACAGCTGGGCCAGGGTGAGGTAGTGTTAATAGGGAACTTAATTACCCACACAGACATTGAGGTTGTAGTATATTTCTTACTGCTCTATTTGGTCATGAGAGATGAGCCTATAAAGAAATG с флуоресцеин-12-dUTP красителем, детектируемым в ультрафиолетовом свете микроскопа в виде изумрудно-зеленого свечения внутри восприимчивых клеток.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2806252C1 true RU2806252C1 (ru) | 2023-10-30 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2823531C1 (ru) * | 2023-11-08 | 2024-07-23 | Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии Имени К.И. Скрябина И И.Я. Коваленко Российской Академии Гнаук" (Фгбну Фнц Виэв Ран) | Способ диагностики вирусного репродуктивно-респираторного синдрома свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in-situ (fish) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103882051B (zh) * | 2014-03-20 | 2016-04-06 | 北京市农林科学院 | 一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒 |
| CN103751774B (zh) * | 2013-07-17 | 2016-05-18 | 哈尔滨维科生物技术开发公司 | 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用 |
| RU2782275C1 (ru) * | 2021-12-20 | 2022-10-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Способ диагностики классической чумы свиней непрямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103751774B (zh) * | 2013-07-17 | 2016-05-18 | 哈尔滨维科生物技术开发公司 | 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用 |
| CN103882051B (zh) * | 2014-03-20 | 2016-04-06 | 北京市农林科学院 | 一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒 |
| RU2782275C1 (ru) * | 2021-12-20 | 2022-10-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Способ диагностики классической чумы свиней непрямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WANG Y. et al. Visual and label-free ASFV and PCV2 detection by CRISPR-Cas12a combined with G-quadruplex, Front Vet Sci, 2022, vol.9. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2823531C1 (ru) * | 2023-11-08 | 2024-07-23 | Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии Имени К.И. Скрябина И И.Я. Коваленко Российской Академии Гнаук" (Фгбну Фнц Виэв Ран) | Способ диагностики вирусного репродуктивно-респираторного синдрома свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in-situ (fish) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Clavijo et al. | Isolation and identification of bluetongue virus | |
| Siles‐Lucas et al. | Molecular tools for the diagnosis of cystic and alveolar echinococcosis | |
| Koepsell et al. | Parvovirus B19 is a bystander in adult myocarditis | |
| Zakeri et al. | Molecular epidemiology of leptospirosis in northern Iran by nested polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism and sequencing methods | |
| Sutummaporn et al. | Association of feline morbillivirus infection with defined pathological changes in cat kidney tissues | |
| RU2422535C1 (ru) | СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ВИДА Yersinia pestis И Yersinia pseudotuberculosis | |
| Brunetti et al. | Cat-scratch disease in Northern Italy: atypical clinical manifestations in humans and prevalence of Bartonella infection in cats | |
| Tulsiani et al. | Emerging tropical diseases in Australia. Part 1. Leptospirosis | |
| Agerholm et al. | Presence of Coxiella burnetii DNA in inflamed bovine cardiac valves | |
| Johne et al. | Recombinant expression of a truncated capsid protein of beak and feather disease virus and its application in serological tests | |
| Bruno et al. | Evaluation and development of diagnostic methods for Renibacterium salmoninarum causing bacterial kidney disease (BKD) in the UK | |
| ES2911270T3 (es) | Composición para diagnosticar enfermedades infecciosas o complicaciones infecciosas mediante el uso de triptofanil-arnt sintetasa y método para detectar el marcador de diagnóstico | |
| Athanasiou et al. | Evaluation of a direct immunofluorescent assay and/or conjunctival cytology for detection of canine distemper virus antigen | |
| Wasee Ullah et al. | Detection of peste des petits ruminants viral RNA in fecal samples of goats after an outbreak in Punjab province of Pakistan: A longitudinal study | |
| RU2806252C1 (ru) | Способ диагностики классической чумы свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (fish) | |
| Khodakaram-Tafti et al. | Immunohistochemical and polymerase chain reaction studies in Neospora caninum experimentally infected broiler chicken embryonated eggs | |
| Taghadosi et al. | Prevalence of renal lesions in slaughtered cattle in Shiraz, Iran, and detection of Leptospira in them by nested PCR-RFLP | |
| JP2017186262A (ja) | 検査用モノクローナル抗体及びこれを用いた検査キット | |
| Bursle et al. | Free living amoebae and human disease | |
| RU2823532C1 (ru) | Способ диагностики цирковирусной болезни свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in-situ (fish) | |
| RU2607025C1 (ru) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления РНК атипичного пестивируса крупного рогатого скота | |
| Saravanan et al. | Detection of scrub typhus by real-time polymerase chain reaction and immunoglobulin M ELISA among patients with acute febrile illness | |
| RU2823531C1 (ru) | Способ диагностики вирусного репродуктивно-респираторного синдрома свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in-situ (fish) | |
| CN113774166A (zh) | 猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法 | |
| Janse et al. | Indirect immunofluorescence microscopy for the detection and identification of plant pathogenic bacteria (in particular for Ralstonia solanacearum) |