RU2806049C2 - Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of their application - Google Patents
Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of their application Download PDFInfo
- Publication number
- RU2806049C2 RU2806049C2 RU2020132555A RU2020132555A RU2806049C2 RU 2806049 C2 RU2806049 C2 RU 2806049C2 RU 2020132555 A RU2020132555 A RU 2020132555A RU 2020132555 A RU2020132555 A RU 2020132555A RU 2806049 C2 RU2806049 C2 RU 2806049C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- her2
- antibody
- drug conjugate
- linker
- biparatope
- Prior art date
Links
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ TECHNICAL FIELD
[001] Настоящее описание относится к области противораковых терапевтических средств и, в частности, конъюгатам антител-лекарственных средств, содержащих бипаратопных анти-HER2 антител и аналогу ауристатина.[001] The present disclosure relates to the field of anti-cancer therapeutics and, in particular, to antibody-drug conjugates containing biparatope anti-HER2 antibodies and an auristatin analogue.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART
[002] HER2 (ErbB2) представляет собой трансмембранную поверхностно связанную рецепторную тирозинкиназу, которая является представителем семейства ErbB рецепторных тирозинкиназ и обычно вовлечена в сигнальную трансдукцию путей, ведущих к клеточному росту и дифференцировке. HER2 представляет собой перспективную цель для лечения рака молочной железы, которая, как было обнаружено, сверхэкспрессируется в приблизительно одной четвертой пациентов с раком молочной железы (Bange et al, Nature Medicine 7:548 (2001)).[002] HER2 (ErbB2) is a transmembrane surface-bound receptor tyrosine kinase that is a member of the ErbB family of receptor tyrosine kinases and is generally involved in signal transduction pathways leading to cell growth and differentiation. HER2 is a promising target for the treatment of breast cancer, which has been found to be overexpressed in approximately one-quarter of breast cancer patients (Bange et al , Nature Medicine 7:548 (2001)).
[003] Herceptin® (трастузумаб, патент США № 5,821,337) был первым моноклональным антителом, разработанным для лечения HER2-положительного рака молочной железы, и повысил временные периоды выживаемости у пациентов таким образом, что они теперь такие же как у пациентов с HER2-отрицательным раком молочной железы. Пертузумаб (Perjeta®, патент США № 7,862,817) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое разработано для специфического предотвращения спаривания (димеризации) HER2-рецептора с другими HER-рецепторам (EGFR/HER1, HER3 и HER4) на поверхности клеток, считается, что этот процесс играет важную роль в опухолевом росте и выживаемости. Предполагается, что комбинация Perjeta, Herceptin и химиотерапии обеспечивает более интенсивную блокаду сигнальных путей HER. Пертузумаб связывается с доменом II HER2, необходимым для димеризации, тогда как трастузумаб связывается с внеклеточным доменом IV HER2.[003] Herceptin® (trastuzumab, US Pat. No. 5,821,337) was the first monoclonal antibody developed for the treatment of HER2-positive breast cancer and has improved patient survival times so that they are now similar to those of HER2-negative patients. breast cancer. Pertuzumab (Perjeta®, US Patent No. 7,862,817) is a humanized monoclonal antibody that is designed to specifically prevent the pairing (dimerization) of the HER2 receptor with other HER receptors (EGFR/HER1, HER3 and HER4) on the surface of cells, it is believed that this the process plays an important role in tumor growth and survival. The combination of Perjeta, Herceptin and chemotherapy is thought to provide a more potent blockade of HER signaling pathways. Pertuzumab binds to domain II of HER2, which is required for dimerization, whereas trastuzumab binds to the extracellular domain IV of HER2.
[004] У Li et al (Cancer Res., 73:6471–6483 (2013)) описаны биспецифические, бивалентные антитела к HER2, которые основаны на нативных последовательностях трастузумаба и пертузумаба и которые преодолевают резистентность к трастузумабу. Были описаны другие биспецифические анти-HER2 антитела (международная публикация патентной заявки № WO 2015/077891 и WO 2016/179707; публикации заявок на патент США № 2014/0170148, 2015/0284463, 2017/0029529 и 2017/0291955; патент США № 9,745,382). Был описан также конъюгат антитела-лекарственного вещества, содержащий HER2-нацеливающееся бипаратопное антитело, сайт-специфически конъюгировано с производным тубулизина (Li et al., Cancer Cell, 29:117–129 (2016)). [004] Li et al (Cancer Res., 73:6471–6483 (2013)) describe bispecific, bivalent anti-HER2 antibodies that are based on native trastuzumab and pertuzumab sequences and that overcome trastuzumab resistance. Other bispecific anti-HER2 antibodies have been described (International Patent Application Publication No. WO 2015/077891 and WO 2016/179707; US Patent Application Publication No. 2014/0170148, 2015/0284463, 2017/0029529 and 2017/0291955; US Patent No. 9.7 45,382 ). An antibody-drug conjugate containing a HER2-targeting biparatope antibody site-specifically conjugated to a tubulisin derivative has also been described (Li et al., Cancer Cell, 29:117–129 (2016)).
[005] Ауристатины представляют собой синтетические аналоги доластатина 10, который является мощным ингибитором сборки микротрубочек с противораковой активностью. Были описаны конъюгаты антител-лекарственных веществ, содержащие нагрузочные вещества ауристатины, такие как монометилауристатин E (MMAE) или монометилауристатин F (MMAF) (патент США № 7,498,298 и 7,659,241; международная публикация патентной заявки № WO 2002/088172 и WO 2016/041082). В международной публикации патентной заявки № WO 2106/041082 описывается модифицированные N-ацилсульфонамидом ауристатины и их применение как нагрузочных веществ конъюгатов антител-лекарственных веществ.[005] Auristatins are synthetic analogues of dolastatin 10, which is a potent inhibitor of microtubule assembly with anticancer activity. Antibody-drug conjugates containing auristatin loading agents such as monomethyl auristatin E (MMAE) or monomethyl auristatin F (MMAF) have been described (U.S. Patent No. 7,498,298 and 7,659,241; International Patent Application Publication No. WO 2002/088172 and WO 2016/041082). International Patent Application Publication No. WO 2106/041082 describes N-acylsulfonamide modified auristatins and their use as loading agents in antibody-drug conjugates.
[006] Эта вводная информация предоставляется с целью предоставления известной информации, которая, по мнению заявителя, может иметь отношение к настоящему раскрытию. Не предполагается ни признания в обязательном порядке, ни должно быть истолкования того, что любая предшествующая информация представляет собой предшествующий уровень техники в отношении заявленного изобретения.[006] This background information is provided for the purpose of providing known information that the applicant believes may be relevant to this disclosure. There is neither admission nor interpretation to be made that any prior information constitutes prior art with respect to the claimed invention.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
[007] В данном документе описаны конъюгаты анти-HER2 бипаратопных антител-лекарственных веществ и способы их применения. В одном аспекте изобретения, настоящее описание относится к конъюгату антитела-лекарственного средства, содержащему анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с аналогом ауристатина посредством линкера (L), с низким средним соотношением лекарственное вещество-к-антителу (DAR), причем анти-HER2 бипаратопное антитело содержит первую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая связывает первый эпитоп HER2 и вторую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая связывает второй эпитоп HER2, первый и второй эпитопы HER2 являются различными эпитопами, и при этом низкое значение среднего DAR представляет собой среднее DAR менее 3,9.[007] Disclosed herein are anti-HER2 biparatope antibody-drug conjugates and methods of using them. In one aspect of the invention, the present disclosure provides an antibody-drug conjugate comprising an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to an auristatin analog via a linker (L), with a low average drug-to-antibody ratio (DAR), wherein the anti-HER2 the biparatope antibody comprises a first antigen binding polypeptide construct that binds a first HER2 epitope and a second antigen binding polypeptide construct that binds a second HER2 epitope, the first and second HER2 epitopes being different epitopes, and wherein a low average DAR value is an average DAR less than 3.9.
[008] В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат антитела-лекарственного вещества c аналогом ауристатина-линкером имеет общую формулу (II): [008] In some embodiments, the antibody-drug conjugate with an auristatin analog linker has the general formula ( II ):
(II)( II )
где:Where:
X представляет собой -C(O)NHCH(CH2R2)-, или X отсутствует;X is -C(O)NHCH(CH 2 R 2 )-, or X is absent;
R1 выбран из:R 1 selected from:
и ; And ;
L представляет собой линкер, иL is a linker, and
представляет точку присоединения линкер-токсина к анти-HER2 бипаратопному антителу; represents the point of attachment of the linker toxin to the anti-HER2 biparatope antibody;
причем анти-HER2 бипаратопное антитело содержит первую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая связывает первый эпитоп HER2, и вторую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая связывает второй эпитоп HER2, первый и второй эпитопы HER2 являются различными эпитопами, иwherein the anti-HER2 biparatope antibody comprises a first antigen binding polypeptide construct that binds a first HER2 epitope and a second antigen binding polypeptide construct that binds a second HER2 epitope, the first and second HER2 epitopes being different epitopes, and
причем низкое значение среднего DAR представляет собой среднее DAR меньше 3,9.wherein a low average DAR value represents an average DAR less than 3.9.
[009] В некоторых вариантах осуществления изобретения низкое значение среднего DAR конъюгата антитела-лекарственного вещества составляет от 0,5 до 3,5 или от 0,5 до 2,5.[009] In some embodiments, the low average DAR of the antibody-drug conjugate is from 0.5 to 3.5 or from 0.5 to 2.5.
[0010] В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат антитела-лекарственного вещества содержит 5% или больше типов DAR0, или 15% или больше типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат антитела-лекарственного вещества содержит от около 5% до около 50% типов DAR0 или от около 10% до около 30% типов DAR0, или от около 10% до около 25% типов DAR0, или от около 15% до около 25% типов DAR0.[0010] In some embodiments, the antibody-drug conjugate contains 5% or more DAR0 types, or 15% or more DAR0 types. In some embodiments, the antibody-drug conjugate contains from about 5% to about 50% DAR0 types, or from about 10% to about 30% DAR0 types, or from about 10% to about 25% DAR0 types, or from about 15% up to about 25% of DAR0 types.
[0011] В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат антитела-лекарственного вещества содержит 25% или меньше DAR6 или более крупных типов, или 15% или меньше DAR6 или более крупных типов. В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат антитела-лекарственного вещества содержит от 0% до около 15% DAR6 или более крупных типов, или от около 0% до около 10% DAR6 или более крупных типов.[0011] In some embodiments, the antibody-drug conjugate contains 25% or less DAR6 or larger types, or 15% or less DAR6 or larger types. In some embodiments, the antibody-drug conjugate contains from 0% to about 15% DAR6 or larger types, or from about 0% to about 10% DAR6 or larger types.
[0012] Другой аспект изобретения по настоящему описанию относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат анти-HER2 бипаратопного антитела-лекарственного вещества, описанный в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.[0012] Another aspect of the invention herein relates to a pharmaceutical composition comprising the anti-HER2 biparatope antibody-drug conjugate described herein and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
[0013] Другой аспект относится к способу ингибирования роста HER2-экспрессирующей раковой клетки, способ включает приведение в контакт раковой клетки с эффективным количеством конъюгата анти-HER2 бипаратопного антитела-лекарственного вещества, описанного в данном документе.[0013] Another aspect relates to a method of inhibiting the growth of a HER2-expressing cancer cell, the method comprising contacting the cancer cell with an effective amount of an anti-HER2 biparatope antibody-drug conjugate described herein.
[0014] Другой аспект относится к способу лечения HER2-экспрессирующего ракового заболевания, включающему введение субъекту с HER2-экспрессирующим раковым заболеванием эффективного количества конъюгата анти-HER2 бипаратопного антитела-лекарственного вещества, описанного в данном документе.[0014] Another aspect relates to a method of treating a HER2-expressing cancer, comprising administering to a subject with the HER2-expressing cancer an effective amount of an anti-HER2 biparatope antibody-drug conjugate described herein.
[0015] Другой аспект относится к конъюгату антитела-лекарственного вещества, описанного в данном документе, для применение в терапии.[0015] Another aspect relates to an antibody-drug conjugate described herein for use in therapy.
[0016] Другой аспект относится к конъюгату антитела-лекарственного вещества, описанного в данном документе, для применения при лечении HER2-экспрессирующего ракового заболевания у нуждающегося в этом субъекта.[0016] Another aspect relates to an antibody-drug conjugate described herein for use in treating a HER2-expressing cancer in a subject in need thereof.
[0017] Другой аспект относится к применению конъюгата антитела-лекарственного вещества, описанного в данном документе, в производстве лекарственного средства для лечения HER2-экспрессирующего ракового заболевания. [0017] Another aspect relates to the use of an antibody-drug conjugate described herein in the manufacture of a medicament for the treatment of a HER2-expressing cancer.
[0018] Другой аспект относится к композиции конъюгата антитела-лекарственного вещества, содержащей анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с аналогом ауристатина посредством линкера (L), причем аналог ауристатина-линкер имеет общую формулу (II): [0018] Another aspect relates to an antibody-drug conjugate composition comprising an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to an auristatin analogue via a linker (L), wherein the auristatin analogue-linker has the general formula ( II ):
(II)( II )
где:Where:
X отсутствует;X is missing;
R1 выбран из:R 1 selected from:
и ; And ;
L представляет собой линкер, иL is a linker, and
представляет точку присоединения аналога ауристатина-линкера к анти-HER2 бипаратопному антителу; represents the point of attachment of the auristatin analog linker to the anti-HER2 biparatope antibody;
причем анти-HER2 бипаратопное антитело содержит первую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая связывает первый эпитоп HER2 на ECD4 HER2, и вторую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая связывает второй эпитоп HER2 на ECD2 HER2, иwherein the anti-HER2 biparatope antibody comprises a first antigen binding polypeptide construct that binds a first HER2 epitope on ECD4 HER2, and a second antigen binding polypeptide construct that binds a second HER2 epitope on ECD2 HER2, and
при этом композиция конъюгата антитело-лекарственное средство имеет среднее DAR от 0,5 до 2,5 и содержит от около 10% до около 30% типов DAR0 и от 0% до около 15% DAR6 или более крупных типов.wherein the antibody-drug conjugate composition has an average DAR of 0.5 to 2.5 and contains from about 10% to about 30% DAR0 types and from 0% to about 15% DAR6 or larger types.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS
[0019] На Фиг. 1 показаны результаты электрофореза ДСН-ПААГ в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях (A) v17597 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001 при DAR4), и (B) v21252 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001 при DAR2), каждый по сравнению с исходным анти-HER2 бипаратопным антителом (v10000). [0019] In FIG. Figure 1 shows the results of SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions ( A ) v17597 (anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR4), and ( B ) v21252 (anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR2), each compared to the parent anti-HER2 biparatope antibody (v10000).
[0020] На Фиг. 2 показаны кривые хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ) для (A) исходного анти-HER2 бипаратопного антитела v10000, (B) v17597 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001, демонстрирующего среднее DAR 3,92), и (C) v21252 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001, демонстрирующего среднее DAR 2,07). Отдельные вклады типов DAR0, DAR2, DAR4 и DAR6 в значение среднего DAR очищенных ADC показаны в виде (D) и (E). [0020] In FIG. Figure 2 shows hydrophobic interaction chromatography (HIC) curves for ( A ) the parent anti-HER2 biparatope antibody v10000, ( B ) v17597 (an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001, showing an average DAR of 3.92), and ( C ) v21252 (anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001, showing an average DAR of 2.07). The individual contributions of DAR0, DAR2, DAR4, and DAR6 types to the mean DAR value of purified ADCs are shown in ( D ) and ( E ).
[0021] На Фиг. 3 показаны кривые эксклюзионной хроматографии (SEC) для (A) исходного анти-HER2 бипаратопного антитела v10000, (B) v17597 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001 при DAR4), и (C) v21252 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001 при DAR2). [0021] In FIG. Figure 3 shows size exclusion chromatography (SEC) curves for ( A ) the parent anti-HER2 biparatope antibody v10000, ( B ) v17597 (an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR4), and ( C ) v21252 (anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR2).
[0022] На Фиг. 4 показаны результаты анализов связывания методом проточной цитометрии на антигенположительных клетках, сравнения v17597 (анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с линкер-токсином 001 при DAR4) и v10000 (исходное бипаратопное анти-HER2 антитело), связывания с (A) клетками карциномы молочной железы JIMT-1, и (B) клетками карциномы мочевого пузыря КТ-112, и (C) сравнения v21252 (анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с линкер-токсином 001 при DAR2) и v10000 (исходное анти-HER2 бипаратопное антитело), связывающееся с клетками карциномы молочной железы JIMT-1. [0022] In FIG. Figure 4 shows the results of flow cytometry binding assays on antigen-positive cells comparing v17597 (an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR4) and v10000 (the parent biparatope anti-HER2 antibody) binding to ( A ) breast carcinoma cells JIMT-1, and ( B ) KT-112 bladder carcinoma cells, and ( C ) comparisons of v21252 (anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR2) and v10000 (original anti-HER2 biparatope antibody) binding with JIMT-1 breast carcinoma cells.
[0023] На Фиг. 5 показаны результаты обработки HER2-экспрессирующих линий клеток карциномы молочной железы BT-474 (A), SK-BR-3 (B), HCC1954 (C), JIMT-1 (D) и ZR-75-1 (E), и HER2-отрицательной линии клеток MDA-MB-468 (F) с v17597 (анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с линкер-токсином 001 при DAR4) и v21252 (анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с линкер-токсином 001 при DAR2). [0023] In FIG. Figure 5 shows the results of treatment of HER2-expressing breast carcinoma cell lines BT-474 ( A ), SK-BR-3 ( B ), HCC1954 ( C ), JIMT-1 ( D ), and ZR-75-1 ( E ), and HER2-negative cell line MDA-MB-468 ( F ) with v17597 (anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR4) and v21252 (anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR2).
[0024] На Фиг. 6 показаны результаты обработки HER2-экспрессирующей линии клеток карциномы яичника SK-OV-3 (A) и линий клеток карциномы молочной железы ZR-75-1 (B) и JIMT-1 (C) с конъюгатами антител-лекарственных веществ, содержащими v10000, конъюгированное с линкер-токсином 001 с различными значениями средних DAR. Отдельные вклады типов DAR0, DAR2, DAR4 и DAR6 в значение среднего DAR ADC, имеющих средние DAR 0,7; 2,2 и 3,9, показаны в виде (D). [0024] In FIG. Figure 6 shows the results of treating the HER2-expressing ovarian carcinoma cell line SK-OV-3 ( A ) and the breast carcinoma cell lines ZR-75-1 ( B ) and JIMT-1 ( C ) with antibody-drug conjugates containing v10000. conjugated to linker toxin 001 with different average DAR values. Individual contributions of DAR0, DAR2, DAR4 and DAR6 types to the average DAR ADC value, having average DARs of 0.7; 2.2 and 3.9 are shown in ( D ).
[0025] На Фиг. 7 показаны результаты лечения мышей q14d x2 с ксенотрансплантатом, производным от раковой опухоли HBCx-13b молочной железы пациента с помощью отмеченных доз (A) v17597 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001 при DAR4) и (B) v21252 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001 при DAR2). v15496 = носитель. [0025] In FIG. Figure 7 shows the results of treating q14d x2 mice with a xenograft derived from a patient's HBCx-13b mammary cancer tumor with the indicated doses of ( A ) v17597 (an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR4) and ( B ) v21252 ( anti-HER2 biparatopic antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR2). v15496 = media.
[0026] На Фиг. 8 показаны результаты лечения мышей qdx1 с ксенотрансплантатом, производным от раковой опухоли ST-910 молочной железы пациента с помощью отмеченных доз (A) v17597 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001 при DAR4) и (B) v21252 (анти-HER2 бипаратопного антитела, конъюгированного с линкер-токсином 001 при DAR2). v15496 = носитель. [0026] In FIG. Figure 8 shows the results of treating qdx1 mice bearing a xenograft derived from a patient's breast cancer ST-910 tumor with the indicated doses of ( A ) v17597 (anti-HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR4) and ( B ) v21252 (anti -HER2 biparatope antibody conjugated to linker toxin 001 at DAR2). v15496 = media.
[0027] На Фиг. 9 показаны (A) профили средних значений (+СО) сывороточных концентраций v21252 в зависимости от времени и (B) профили средних значений (±СО) сывороточных концентраций всех антител в зависимости от времени после введения однократной дозы v21252 самкам яванского макака (n=3) при дозе 9 мг/кг или 12 мг/кг.[0027] In FIG. Figure 9 shows ( A ) profiles of mean ( + SD) serum concentrations of v21252 as a function of time and ( B ) profiles of mean (±SD) serum concentrations of all antibodies as a function of time after administration of a single dose of v21252 to female cynomolgus monkeys (n=3 ) at a dose of 9 mg/kg or 12 mg/kg.
[0028] На Фиг. 10 показаны профилисредних значений (±СО) сывороточных концентраций v21252 в зависимости от времени на сутки 1 (A) и сутки 29 (B) после инфузии v21252 два раза в неделю яванским макакам (n=6) в дозе либо 12 мг/кг, либо 9 мг/кг.[0028] In FIG. Figure 10 shows the profiles of mean (±SD) serum concentrations of v21252 as a function of time on day 1 ( A ) and day 29 ( B ) after twice weekly infusion of v21252 into cynomolgus monkeys (n=6) at a dose of either 12 mg/kg or 9 mg/kg.
[0029] На Фиг. 11 показаны профили средних значений (±СО) сывороточных концентраций всех антител в зависимости от времени на сутки 1 (A) и сутки 29 (B) после инфузии v21252 два раза в неделю яванским макакам (n=6) в дозе либо 12 мг/кг, либо 9 мг/кг.[0029] In FIG. Figure 11 shows profiles of mean (±SD) serum concentrations of all antibodies as a function of time on day 1 ( A ) and day 29 ( B ) after infusion of v21252 twice a week into cynomolgus monkeys (n=6) at a dose of either 12 mg/kg , or 9 mg/kg.
[0030] На Фиг. 12 показаны профили средних значений (±СО) сывороточных концентраций в зависимости от времени как антитела v21252, так и всех антител, после инфузии v21252 два раза в неделю яванским макакам (n=6) в дозе либо 12 мг/кг, либо 9 мг/кг.[0030] In FIG. 12 shows the mean (±SD) serum concentration profiles over time for both v21252 antibody and total antibodies following twice weekly infusion of v21252 into cynomolgus monkeys (n=6) at a dose of either 12 mg/kg or 9 mg/kg. kg.
[0031] На Фиг. 13 показана интернализация pHAb-конъюгированного v21252 по сравнению с pHAb-конъюгированным трастузумаб-линкер-токсином 001 и отрицательного контроля внутрь (A) клеток SKBR3 и (B) клеток JIMT-1. [0031] In FIG. 13 shows the internalization of pHAb-conjugated v21252 compared to pHAb-conjugated trastuzumab linker toxin 001 and negative control into ( A ) SKBR3 cells and ( B ) JIMT-1 cells.
[0032] На Фиг. 14 показана интернализация pHAb-конъюгированного v21252 (A) по сравнению с pHAb-конъюгированным трастузумаб-линкер-токсином 001 (B) внутрь клеток SKBR3 в различные указанные моменты времени. Ядра показаны серым цветом, а pHAb показан белым. [0032] In FIG. 14 shows the internalization of pHAb-conjugated v21252 ( A ) versus pHAb-conjugated trastuzumab-linker-toxin 001 ( B ) into SKBR3 cells at the various time points indicated. Nuclei are shown in gray and pHAb is shown in white.
[0033] На Фиг. 15 показано сравнительное воздействие на яванских макак и мышей, получивших лечение с помощью v21252 в указанных дозах: (A) воздействие на яванских макак и мышей, которым подкожно имплантировали полученную у пациента опухоль с высокой экспрессией HER2 (HBCx-13b), (B) воздействие на яванских макак и мышей, которым подкожно имплантировали полученную у пациента опухоль с низкой экспрессией HER2 (ST-910). [0033] In FIG. Figure 15 shows comparative effects on cynomolgus monkeys and mice treated with v21252 at the indicated doses: ( A ) exposure on cynomolgus monkeys and mice implanted subcutaneously with a patient-derived tumor with high HER2 expression (HBCx-13b), ( B ) exposure on cynomolgus monkeys and mice that were subcutaneously implanted with a patient-derived tumor with low HER2 expression (ST-910).
[0034] На Фиг. 16 показаны результаты лечения мышей qwk x4 с ксенотрансплантатом, производным от пациента с раком яичника LTL-654, с помощью 3 мг/кг носителя или v21252. [0034] In FIG. 16 shows the results of treating qwk x4 mice with ovarian cancer patient-derived xenograft LTL-654 with 3 mg/kg vehicle or v21252.
[0035] На Фиг. 17 представлены результаты выживаемости для мышей, которым внутрь черепа имплантировали опухолевые клетки BT-474 молочной железы после еженедельного в.в. введения носителя, контрольного конъюгата (гуманизированное антитело против респираторно-синцитиального вируса, конъюгированного с линкер-токсином 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR 3,5) и v24029 (трастузумаб, конъюгированный при DAR8 с экзатекан-производным ингибитором топоизомеразы I (DXd)), каждый при дозе 6 мг/кг еженедельно с общим получением 12 инъекций. [0035] In FIG. Figure 17 shows survival results for mice intracranially implanted with BT-474 mammary tumor cells after weekly i.v. administration of vehicle, control conjugate (humanized antibody against respiratory syncytial virus conjugated to linker toxin 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR 3.5) and v24029 (trastuzumab conjugated at DAR8 to exatecan-derived topoisomerase I inhibitor (DXd)), each at a dose of 6 mg/kg weekly for a total of 12 injections.
[0036] На Фиг. 18 представлены результаты выживаемости для мышей, которым внутрь черепа имплантировали опухолевые клетки BT-474 молочной железы после еженедельного в.в. введения носителя, контрольного конъюгата (гуманизированное антитело против респираторно-синцитиального вируса, конъюгированного с линкер-токсином 001) или v7155 (T-DM1, DAR3.5) при дозе 6 мг/кг еженедельно с общим получением 12 инъекций или v21252 или v24029 (трастузумаб, конъюгированный при DAR8 с экзатекан-производным ингибитором топоизомеразы I (DXd)), каждый при дозе 6 мг/кг раз в две недели с общим получением 6 инъекций. [0036] In FIG. Figure 18 shows survival results for mice intracranially implanted with BT-474 mammary tumor cells after weekly i.v. administration of vehicle, control conjugate (humanized antibody against respiratory syncytial virus conjugated to linker toxin 001) or v7155 (T-DM1, DAR3.5) at a dose of 6 mg/kg weekly for a total of 12 injections or v21252 or v24029 (trastuzumab , conjugated at DAR8 with exatecan-derived topoisomerase I inhibitor (DXd)), each at a dose of 6 mg/kg biweekly for a total of 6 injections.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0037] Настоящее описание относится к конъюгату анти-HER2 бипаратопного антитела-лекарственного вещества (ADC), в котором лекарственное вещество представляет собой аналог ауристатина и конъюгировано с антителом при низком значении среднего соотношения лекарственное вещество-к-антителу (DAR). ADC с низким значением среднего DAR (<3,9), описанные в данном документе, имеют лучшую переносимость и уменьшенную токсичность по сравнению с соответствующим ADC с DAR >3,9 при введении той же дозы токсина (аналога ауристатина). Особый интерес вызывают ADC, имеющие средние DAR около 2,5 или менее, например от около 1,8 до 2,5. [0037] The present disclosure relates to an anti-HER2 biparatope antibody-drug conjugate (ADC) in which the drug is an auristatin analogue and is conjugated to the antibody at a low average drug-to-antibody ratio (DAR). ADCs with a low mean DAR (<3.9) described herein have better tolerability and reduced toxicity compared to a corresponding ADC with a DAR > 3.9 when administered at the same dose of toxin (auristatin analogue). Of particular interest are ADCs having average DARs of about 2.5 or less, such as about 1.8 to 2.5.
[0038] Настоящее описание также относится к способу применения ADC, описанных в данном документе, при лечении HER2-экспрессирующего ракового заболевания. [0038] The present disclosure also relates to a method of using the ADCs described herein in the treatment of a HER2-expressing cancer.
Определения Definitions
[0039] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники.[0039] Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one skilled in the art.
[0040] Термин «субъект», используемый в данном документе, относится к животному, в некоторых вариантах осуществления, млекопитающему, которое представляет собой объект лечения, наблюдения или эксперимента. Животное может быть человеком, не являющимся человеком приматом, домашним животным (например, собака, кошка и т.п.), сельскохозяйственным животным (например, корова, овца, свинья, лошадь и т.п.) или лабораторным животным (например, крыса, мышь, морская свинка, не являющийся человеком примат и т.п.). В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.[0040] The term “subject” as used herein refers to an animal, in some embodiments, a mammal, that is the subject of treatment, observation, or experiment. The animal may be a human, non-human primate, a domestic animal (e.g., dog, cat, etc.), farm animal (e.g., cow, sheep, pig, horse, etc.), or laboratory animal (e.g., rat , mouse, guinea pig, non-human primate, etc.). In some embodiments, the subject is a human.
[0041] Термин «млекопитающее», используемый в данном документе, включает в себя, но не ограничивается людьми, не являющимися человеком приматами, собаками, кошками, мышами, крупным рогатым скотом, лошадьми и свиньями. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является человеком.[0041] The term “mammal” as used herein includes, but is not limited to, humans, non-human primates, dogs, cats, mice, cattle, horses, and pigs. In some embodiments, the mammal is a human.
[0042] Как используется в данном документе, термин «около» относится к приблизительно +/-10% вариации от данного значения. Следует понимать, что такая вариация всегда включена в любое данное значение, представленное в данном документе, независимо от ее конкретного упоминания.[0042] As used herein, the term “about” refers to approximately +/-10% variation from a given value. It should be understood that such variation is always included in any given value presented herein, regardless of its specific mention.
[0043] Использование слова в единственном числе при применении в сочетании с термином «содержащий» может означать «один», но в некоторых вариантах осуществления изобретения оно также соответствует значению «один или более», «по меньшей мере один» или «один или более одного».[0043] The singular word when used in conjunction with the term “comprising” may mean “one,” but in some embodiments it also means “one or more,” “at least one,” or “one or more one."
[0044] Как используется в данном документе, термины «включающий», «имеющий», «охватывающий» и «содержащий» и их грамматические вариации являются включающими или неограничивающими, и не исключают дополнительные неперечисленные элементы и/или этапы способов. Термин «по существу состоящий», при использовании в данном документе в связи с композицией, применением или способом, отмечает возможно присутствующие дополнительные элементы и/или этапы способа, но такие дополнения фактически не влияют на стиль, которым излагаются композиция, способ или применяемые функции. Термин «состоящий из», при использовании в данном документе в связи с композицией, применением или способом, исключает наличие дополнительных элементов и/или этапов способа. Композиция, применение или способ, описанные в данном документе как включающие определенные элементы и/или этапы, в некоторых вариантах осуществления, также могут по существу состоять из таких элементов и/или этапов, а в других вариантах осуществления состоят из таких элементов и/или этапов, независимо от конкретного упоминания в этих вариантах осуществления.[0044] As used herein, the terms “including,” “having,” “comprising,” and “comprising” and grammatical variations thereof are inclusive or non-limiting, and do not exclude additional unlisted elements and/or method steps. The term “essentially consisting”, when used herein in connection with a composition, application or method, identifies additional elements and/or process steps that may be present, but such additions do not actually affect the style in which the composition, method or functions employed are stated. The term “consisting of,” when used herein in connection with a composition, application, or method, excludes the presence of additional elements and/or method steps. A composition, use, or method described herein as including certain elements and/or steps, in some embodiments, may also essentially consist of such elements and/or steps, and in other embodiments, consist of such elements and/or steps , regardless of specific reference in these embodiments.
[0045] Предполагается, что любой вариант осуществления, обсуждаемый в данном документе, может быть реализован в отношении любого другого способа, применения или композиции, описанных в данном документе, и наоборот.[0045] It is intended that any embodiment discussed herein may be implemented in relation to any other method, application or composition described herein, and vice versa.
[0046] Признаки, структуры и/или характеристики, описанные в связи с раскрытым в данном документе варианте осуществления, могут быть объединены с особенностями, признаками и/или характеристиками, описанными в связи с другим вариантом осуществления, раскрытым в данном документе любым подходящим способом, для обеспечения одного или более дополнительных вариантов осуществления.[0046] The features, structures and/or characteristics described in connection with an embodiment disclosed herein may be combined with the features, features and/or characteristics described in connection with another embodiment disclosed herein in any suitable manner, to provide one or more additional embodiments.
[0047] Следует также понимать, что положительное прочтение признака в одном вариант осуществления служит основанием для исключения этого признака в альтернативном варианте осуществления. Например, если перечень вариаций представлен для данного варианта осуществления или пункта формулы, следует понимать, что один или более вариантов могут быть удалены из этого перечня, а сокращенный перечень может образовывать альтернативный вариант осуществления, независимо от того, отмечается ли конкретно такой альтернативный вариант осуществления или нет.[0047] It should also be understood that a positive reading of a feature in one embodiment provides grounds for eliminating that feature in an alternative embodiment. For example, if a list of variations is provided for a given embodiment or claim, it is understood that one or more variations may be removed from the list and the shortened list may constitute an alternative embodiment, whether such alternative embodiment is specifically noted or No.
КОНЪЮГАТЫ АНТИ-HER2 БИПАРАТОПНЫХ АНТИТЕЛ-ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВANTI-HER2 BIPARATOPIC ANTIBODY-DRUG CONJUGATES
[0048] Конъюгаты антител-лекарственных веществ (ADC) по настоящему описанию содержат анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с токсином посредством линкера при низком значении среднего соотношения лекарственное вещество-к-антителу (DAR), токсин является токсин на основе ауристатина (или «аналога ауристатина»). Примеры токсинов на основе ауристатина известны в данной области техники.[0048] Antibody-drug conjugates (ADCs) of the present disclosure comprise an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to a toxin via a linker at a low average drug-to-antibody ratio (DAR), the toxin being an auristatin-based toxin (or " auristatin analogue"). Examples of auristatin-based toxins are known in the art.
[0049] В некоторых вариантах осуществления изобретения аналог ауристатина представляет собой соединение общей формулы (I):[0049] In some embodiments, the auristatin analog is a compound of general formula ( I ):
(I)( I )
где:Where:
X представляет собой -C(O)NHCH(CH2R2)-, или X отсутствует;X is -C(O)NHCH(CH 2 R 2 )-, or X is absent;
R1 выбран из:R 1 selected from:
и , и And , And
R2 представляет собой фенил.R 2 represents phenyl.
[0050] Термин «низкое DAR», используемый в данном документе, определяется как среднее DAR менее 3,9; но более 0,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет менее 3,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет менее 3,4; например менее 3,3; менее 3,2 или менее 3,1. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет 3,0 или меньше. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет 2,9 или меньше; например 2,8 или меньше; 2,7 или меньше, или 2,6 или меньше. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет 2,5 или меньше; например 2,4 или меньше; 2,3 или меньше, или 2,2 или меньше. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет около 2,0.[0050] The term “low DAR” as used herein is defined as an average DAR less than 3.9; but more than 0.5. In some embodiments, the average DAR ADC is less than 3.5. In some embodiments, the average DAR ADC is less than 3.4; for example less than 3.3; less than 3.2 or less than 3.1. In some embodiments, the average DAR ADC is 3.0 or less. In some embodiments, the average DAR ADC is 2.9 or less; for example 2.8 or less; 2.7 or less, or 2.6 or less. In some embodiments, the average DAR ADC is 2.5 or less; for example 2.4 or less; 2.3 or less, or 2.2 or less. In some embodiments, the average DAR ADC is about 2.0.
[0051] В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет от 0,5 до 3,8; например от 0,5 до 3,5 или от 0,5 и 2,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет от 0,7 до 3,8; например от 0,7 до 3,5; от 0,7 до 3,0 или от 0,7 и 2,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет от 1,0 до 3,8; например от 1,0 до 3,5; от 1,0 до 3,0 или от 1,0 и 2,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет от 1,5 до 3,8; например от 1,5 до 3,5; от 1,5 до 3,0 или от 1,5 и 2,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет от 1,6 до 3,8; например от 1,6 до 3,5; от 1,6 до 3,0 или от 1,6 и 2,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC составляет от 1,8 до 2,8; например от 1,8 до 2,5.[0051] In some embodiments of the invention, the average DAR ADC is from 0.5 to 3.8; for example from 0.5 to 3.5 or from 0.5 and 2.5. In some embodiments, the average DAR ADC is from 0.7 to 3.8; for example from 0.7 to 3.5; from 0.7 to 3.0 or from 0.7 and 2.5. In some embodiments, the average DAR ADC is from 1.0 to 3.8; for example from 1.0 to 3.5; from 1.0 to 3.0 or from 1.0 and 2.5. In some embodiments, the average DAR ADC is from 1.5 to 3.8; for example from 1.5 to 3.5; from 1.5 to 3.0 or from 1.5 and 2.5. In some embodiments, the average DAR ADC is from 1.6 to 3.8; for example from 1.6 to 3.5; from 1.6 to 3.0 or from 1.6 and 2.5. In some embodiments, the average DAR ADC is between 1.8 and 2.8; for example from 1.8 to 2.5.
[0052] Как отмечено выше, ADC с низким значением среднего DAR (<3,9), описанные в данном документе, имеют улучшенную переносимость и уменьшенную токсичность по сравнению с соответствующим ADC с DAR >3,9 при введении той же дозы токсина. Как известно в данной области техники, большинство способов конъюгации дает композицию ADC, которая включает в себя различные типы DAR, при этом указанное DAR является средним значением по отдельным типам DAR. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, более высокая переносимость и уменьшенная токсичность ADC с низким DAR могут быть вызваны одним или обоими факторами из снижения по высоким значениям типов DAR (6 или более) в композиции ADC и/или увеличения типов DAR0 в композиции ADC.[0052] As noted above, ADCs with a low mean DAR (<3.9) described herein have improved tolerability and reduced toxicity compared to a corresponding ADC with a DAR > 3.9 when administered at the same dose of toxin. As is known in the art, most conjugation methods yield an ADC composition that includes various DAR types, with the reported DAR being the average of the individual DAR types. Without being limited to any particular theory, the increased tolerability and reduced toxicity of low DAR ADCs may be due to one or both of a decrease in high DAR types (6 or more) in the ADC composition and/or an increase in DAR0 types in the ADC composition.
[0053] В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции ADC, которые содержат некоторую долю типов DAR0 выше определенного порогового уровня, могут обладать преимуществом. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления композиция ADC с низким DAR может содержать 5% или более типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления композиция ADC с низким DAR может содержать 10% или более типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления композиция ADC с низким DAR может содержать 15% или более типов DAR0 или, например, 20% или более типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция ADC с низким DAR может содержать от около 5% до около 50% типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция ADC с низким DAR может содержать от около 10% до около 50% типов DAR0, например от около 10% до около 40%, от около 10% до около 30% типов DAR0, или от около 10% до около 25% типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция ADC с низким DAR может содержать от около 12% до около 28% типов DAR0, например от около 12% до около 28% типов DAR0, или от около 15% до около 25% типов DAR0.[0053] In some embodiments, ADC compositions that contain a certain proportion of DAR0 types above a certain threshold level may be advantageous. Accordingly, in some embodiments, the low DAR ADC composition may contain 5% or more DAR0 types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain 10% or more DAR0 types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain 15% or more DAR0 types or, for example, 20% or more DAR0 types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain from about 5% to about 50% DAR0 types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain from about 10% to about 50% DAR0 types, such as from about 10% to about 40%, from about 10% to about 30% DAR0 types, or from about 10% to about 25% of DAR0 types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain from about 12% to about 28% DAR0 types, such as from about 12% to about 28% DAR0 types, or from about 15% to about 25% DAR0 types.
[0054] В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции ADC, которые содержат некоторую долю DAR6 или более крупных типов ниже определенного порогового уровня, могут обладать преимуществом. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления композиция ADC с низким DAR может содержать менее около 35% DAR6 или более крупных типов. В некоторых вариантах осуществления композиция ADC с низким DAR может содержать 30% или менее DAR6 или более крупных типов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция ADC с низким DAR может содержать 25% или менее DAR6 или более крупных типов, например 20% или менее, 15% или менее, или 10% или менее DAR6 или более крупных типов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция ADC с низким DAR может содержать 9% или менее DAR6 или более крупных типов, например 8% или менее, 7% или менее, 6% или менее, или 5% или менее DAR6 или более крупных типов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция ADC с низким DAR может содержать от 0% до около 35% DAR6 или более крупных типов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция ADC с низким DAR может содержать от 0% до около 30% DAR6 или более крупных типов, например от 0% до около 25%, или от 0% до около 20% DAR6 или более крупных типов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция ADC с низким DAR может содержать от около 0% до около 15% DAR6 или более крупных типов, например от около 0% до около 10%, от около 0% до около 8%, или от 0% до около 5% DAR6 или более крупных типов.[0054] In some embodiments, ADC compositions that contain a certain proportion of DAR6 or larger types below a certain threshold level may be advantageous. Accordingly, in some embodiments, the low DAR ADC composition may contain less than about 35% DAR6 or larger types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain 30% or less of DAR6 or larger types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain 25% or less DAR6 or larger types, such as 20% or less, 15% or less, or 10% or less DAR6 or larger types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain 9% or less DAR6 or larger types, such as 8% or less, 7% or less, 6% or less, or 5% or less DAR6 or larger types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain from 0% to about 35% DAR6 or larger types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain 0% to about 30% DAR6 or larger types, such as 0% to about 25%, or 0% to about 20% DAR6 or larger types. In some embodiments, the low DAR ADC composition may contain from about 0% to about 15% DAR6 or larger types, such as from about 0% to about 10%, from about 0% to about 8%, or from 0% to about 5% DAR6 or larger types.
[0055] Некоторые варианты осуществления относятся к ADC, которые включают в себя анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с аналогом ауристатина посредством линкера (L) с низким значением среднего соотношения лекарственное вещество-к-антителу (DAR), аналог ауристатина-линкер с общей формулой (II):[0055] Some embodiments provide ADCs that include an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to an auristatin analogue via a linker (L) with a low average drug-to-antibody ratio (DAR), an auristatin analogue-linker with a common formula ( II ):
(II)( II )
где X и R1 являются такими, как определено для общей формулы (I);where X and R 1 are as defined for the general formula ( I );
L представляет собой линкер, иL is a linker, and
представляет точку присоединения аналога ауристатина-линкера к анти-HER2 бипаратопному антителу. represents the point of attachment of the auristatin analog linker to the anti-HER2 biparatope antibody.
[0056] Некоторые варианты осуществления относятся к ADC с общей формулой (III):[0056] Some embodiments refer to an ADC with general formula ( III ):
(III)(III)
где X и R1 являются такими, как определено для общей формулы (I);where X and R 1 are as defined for the general formula ( I );
L представляет собой линкер;L represents a linker;
n представляет собой среднее соотношение лекарственное вещество-к-антителу (DAR), и оно составляет менее 3,9; и n is the average drug-to-antibody ratio (DAR) and is less than 3.9; And
Ab представляет собой анти-HER2 бипаратопное антитело.Ab is an anti-HER2 biparatope antibody.
Анти-HER2 бипаратопные антителаAnti-HER2 biparatope antibodies
[0057] Описанные в данном документе ADC включают в себя анти-HER2 бипаратопное антитело, которое связывается с двумя различными эпитопами HER2. [0057] The ADCs described herein include an anti-HER2 biparatope antibody that binds to two different epitopes of HER2.
[0058] Термин «антитело», используемое в данном документе, в целом относится к белковой связывающей молекуле с иммуноглобулиноподобными функциями. Типичные примеры антитела представляют собой иммуноглобулины, а также производные или их функциональные фрагменты, которые еще сохраняют связывающую специфичность. Методики продуцирования антител хорошо известны в данной области техники. Термин «антитело» также может включать иммуноглобулины различных классов (т. е. IgA, IgG, IgM, IgD и IgE) и субклассов (такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Иллюстративные примеры антитела представлены целыми антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, такими как Fab-фрагменты, F(ab')2, Fv-фрагменты, одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv), диатела, доменные антитела и их комбинации. Доменные антитела могут быть однодоменными антителами, антителами с одним вариабельным доменом или иммуноглобулином с одним вариабельным доменом, содержащим только один вариабельный домен, который может быть вариабельным доменом тяжелой цепи или вариабельным доменом легкой цепи, которые специфически связывают антиген или эпитоп независимо от других вариабельных областей или доменов. Термин «антител» также включает такие варианты осуществления как химерные, одноцепочечные и гуманизированные антитела. [0058] The term “antibody” as used herein generally refers to a protein binding molecule with immunoglobulin-like functions. Typical examples of antibodies are immunoglobulins, as well as derivatives or functional fragments thereof that still retain binding specificity. Techniques for producing antibodies are well known in the art. The term "antibody" may also include immunoglobulins of various classes ( i.e. , IgA, IgG, IgM, IgD, and IgE) and subclasses (such as IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 , IgA 1 , and IgA 2 ). Illustrative examples of antibodies include whole antibodies and antigen binding fragments thereof, such as Fab fragments, F(ab') 2 , Fv fragments, single chain Fv fragments (scFv), diabodies, domain antibodies, and combinations thereof. Domain antibodies may be single domain antibodies, single variable domain antibodies, or single variable domain immunoglobulins containing only one variable domain, which may be a heavy chain variable domain or a light chain variable domain, that specifically bind an antigen or epitope independently of other variable regions or domains. The term "antibodies" also includes embodiments such as chimeric, single-chain and humanized antibodies.
[0059] Типичное антитело содержит по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов известны как α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) и μ (IgM). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит только один домена: CL. Легкие цепи классифицируют на каппа или лямбда. Области VH и VL могут дополнительно подразделяться на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FW). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FW, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен (паратоп), который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с хозяйскими тканями или факторами, включая различные клетки иммунной системы (такие как эффекторные клетки) и C1q, которые представляет собой компонент системы комплемента. [0059] A typical antibody contains at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH). The heavy chain constant region contains three domains, CH1, CH2 and CH3. The heavy chain constant domains that correspond to the various classes of immunoglobulins are known as α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) and μ (IgM). Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region. The light chain constant region contains only one domain: CL. Light chains are classified as kappa or lambda. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more conserved regions called framework regions (FW). Each VH and VL consists of three CDRs and four FWs, arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain (paratope) that interacts with the antigen. Antibody constant regions can mediate the binding of immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (such as effector cells) and C1q, which is a component of the complement system.
[0060] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопные антитела для включения в состав ADC, описанные в данном документе, содержат две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, каждая из которых связывается с отличающимся эпитопом HER2. Термин «антигенсвязывающая полипептидная конструкция», используемый в данном документе, может представлять собой конструкцию на основе иммуноглобулина, например фрагмент антитела, или она может представлять собой формат миметика антитела, не основанного на иммуноглобулине, такой как антикалин, финомер, аффимер, альфатело, DARPin или авимер. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие полипептидные конструкции, составленные анти-HER2 бипаратопным антителом, могут представлять собой конструкции на основе иммуноглобулинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие полипептидные конструкции, составленные анти-HER2 бипаратопным антителом, могут представлять собой фрагменты антител.[0060] In some embodiments, anti-HER2 biparatope antibodies for inclusion in the ADCs described herein comprise two antigen-binding polypeptide constructs, each of which binds to a different HER2 epitope. The term "antigen-binding polypeptide construct" as used herein may be an immunoglobulin-based construct, such as an antibody fragment, or it may be a non-immunoglobulin-based antibody mimetic format, such as anticalin, finomer, affimer, alphabody, DARPin, or avimer. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs may be immunoglobulin based constructs. In some embodiments, antigen-binding polypeptide constructs constituted by an anti-HER2 biparatope antibody may be antibody fragments.
[0061] В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие полипептидные конструкции, составленные анти-HER2 бипаратопным антителом, могут каждая независимо представлять собой Fab-фрагмент, Fab’-фрагмент, scFv или sdAb. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие полипептидные конструкции, составленные анти-HER2 бипаратопным антителом, могут каждая независимо представлять собой Fab-фрагмент или scFv. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна антигенсвязывающая полипептидная конструкция, составленная анти-HER2 бипаратопным антителом, может представлять собой Fab-фрагмент, а другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция может представлять собой scFv.[0061] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs can each independently be a Fab fragment, Fab' fragment, scFv, or sdAb. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs can each independently be a Fab fragment or a scFv. In some embodiments, one anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide construct may be a Fab fragment and the other antigen binding polypeptide construct may be a scFv.
[0062] В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, составленная анти-HER2 бипаратопным антителом, может представлять собой Fab-фрагмент или Fab’-фрагмент. «Fab фрагмент» содержит константный домен легкой цепи (CL) и первый константный домен тяжелой цепи (CH1) вместе с вариабельным доменом легкой и тяжелой цепи (VL и VH, соответственно). Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких аминокислотных остатков на C-конце домена CH1 тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab-фрагмент может также представлять собой одноцепочечную Fab-молекулу, т. е. Fab-молекулу, в которой легкая цепь Fab и тяжелая цепь Fab связаны пептидным линкером с образованием единой пептидной цепи. Например, C-конец легкой цепи Fab может быть связан с N-концом тяжелой цепи Fab в одноцепочечной молекуле Fab. [0062] In some embodiments, at least one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs may be a Fab fragment or a Fab' fragment. The "Fab fragment" contains a light chain constant domain (CL) and a first heavy chain constant domain (CH1) together with a light and heavy chain variable domain (VL and VH, respectively). Fab' fragments differ from Fab fragments by the addition of several amino acid residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteines from the antibody hinge region. The Fab fragment may also be a single-chain Fab molecule, i.e., a Fab molecule in which the Fab light chain and the Fab heavy chain are linked by a peptide linker to form a single peptide chain. For example, the C-terminus of a Fab light chain may be linked to the N-terminus of a Fab heavy chain in a single-chain Fab molecule.
[0063] В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, составленные анти-HER2 бипаратопным антителом, может представлять собой одноцепочечный Fv (scFv). Обозначение «ScFv» включает вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела в единой полипептидной цепи. Необязательно scFv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменами VH и VL, которые дают возможность scFv образовывать требуемую структуру для связывания антигенов. В некоторых вариантах осуществления scFv может включать VL, соединенный полипептидным линкером от своего C-конца до N-конца VH. В альтернативном варианте scFv может содержать VH, соединенный полипептидной цепью или линкером посредством своего C-конца до N-конца VL (см. обзор у Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269–315 (1994)). [0063] In some embodiments, at least one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs may be a single chain Fv (scFv). The designation "ScFv" includes the heavy chain variable domain (VH) and the light chain variable domain (VL) of an antibody in a single polypeptide chain. Optionally, the scFv may further comprise a polypeptide linker between the VH and VL domains, which enable the scFv to form the desired structure for binding antigens. In some embodiments, the scFv may comprise a VL linked by a polypeptide linker from its C-terminus to the N-terminus of the VH. Alternatively, the scFv may contain a VH connected by a polypeptide chain or linker through its C-terminus to the N-terminus of the VL (reviewed by Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269–315 (1994).
[0064] В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, составленная анти-HER2 бипаратопным антителом, может быть представлена в формате однодоменного антитела (sdAb). Формат sdAb относится к единичному иммуноглобулиновому домену. SdAb может быть, например, верблюжьего происхождения. У верблюжьих антител отсутствуют легкие цепи и их антигенсвязывающие сайты содержат единственный домен, называемый VHH. sdAb содержит три CDR/гипервариабельные петли, которые образуют антигенсвязывающий сайт: CDR1, CDR2 и CDR3. sdAb являются достаточно стабильными и легкими для экспрессии, например как гибрид с Fc-цепью антитела (см., например, Harmsen & De Haard, Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13–22 (2007)). [0064] In some embodiments, at least one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs may be presented in a single domain antibody (sdAb) format. The sdAb format refers to a single immunoglobulin domain. The SdAb may, for example, be of camel origin. Camel antibodies lack light chains and their antigen-binding sites contain a single domain called VHH. sdAb contains three CDR/hypervariable loops that form the antigen-binding site: CDR1, CDR2 and CDR3. sdAbs are quite stable and easy to express, for example as a fusion with the Fc chain of an antibody (see, for example, Harmsen & De Haard, Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13–22 (2007)).
Форматы антителAntibody formats
[0065] Анти-HER2 бипаратопные антитела для включения в ADC, описанные в данном документе, могут иметь различные форматы. Минимальные компоненты анти-HER2 бипаратопного антитела представляют собой первую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая связывается с первым HER2 эпитопом, и вторую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая связывается со вторым эпитопом HER2, с различными первым и вторым эпитопами HER2. Антитело, которое содержит две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, которые связываются с различными эпитопами HER2, могут считаться бивалентными, бипаратопными антителами. Некоторые варианты осуществления относятся к бивалентным, анти-HER2 бипаратопным антителам. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя одну или более дополнительных антигенсвязывающих полипептидных конструкций, каждая из которых связывается либо с первым, либо со вторым эпитопом HER2. Например, в некоторых вариантах осуществления анти-HER2 бипаратопное антитело может быть тривалентным или тетравалентным.[0065] Anti-HER2 biparatope antibodies for inclusion in the ADCs described herein can be in various formats. The minimal components of an anti-HER2 biparatope antibody are a first antigen binding polypeptide construct that binds to a first HER2 epitope, and a second antigen binding polypeptide construct that binds to a second HER2 epitope, different first and second HER2 epitopes. An antibody that contains two antigen-binding polypeptide constructs that bind to different epitopes of HER2 can be considered a bivalent, biparatope antibody. Some embodiments are bivalent, anti-HER2 biparatope antibodies. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may include one or more additional antigen binding polypeptide constructs, each of which binds to either a first or a second epitope of HER2. For example, in some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may be trivalent or tetravalent.
[0066] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело дополнительно содержит линкер, который связывает первую и вторую антигенсвязывающие полипептидные конструкции. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело дополнительно содержит каркас, и первая и вторая антигенсвязывающие полипептидные конструкции функционально связаны с данным каркасом. Термин «функционально связанный», используемый в данном документе, означает, что описанные компоненты находятся во взаимосвязи, обеспечивающей их функционирование ожидаемым для них путем. [0066] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody further comprises a linker that links the first and second antigen-binding polypeptide constructs. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody further comprises a scaffold, and the first and second antigen binding polypeptide constructs are operably linked to the scaffold. The term "operably coupled" as used herein means that the described components are in a relationship such that they function in the manner expected of them.
[0067] Анти-HER2 бипаратопные антитела могут, таким образом, считаться имеющими модульную архитектуру, которая содержит два модуля антигенсвязывающих полипептидных конструкций и необязательно один или оба из линкерного модуля и каркасного модуля. Специалист в данной области поймет, что эти модули можно комбинировать различными путями для получения анти-HER2 бипаратопных антител, обладающих различными форматами. Эти форматы основаны в целом на форматах антител, известных в данной области техники (см., например, обзор от Brinkmann & Kontermann, MAB, 9(2):182-212 (2017), и Müller & Kontermann, “Bispecific Antibodies” в Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)).[0067] Anti-HER2 biparatope antibodies can thus be considered to have a modular architecture that contains two modules of antigen binding polypeptide constructs and optionally one or both of a linker module and a framework module. One of ordinary skill in the art will appreciate that these modules can be combined in various ways to produce anti-HER2 biparatope antibodies having different formats. These formats are based generally on antibody formats known in the art (see, for example, review by Brinkmann & Kontermann, MAB, 9(2):182-212 (2017), and Müller & Kontermann, “ Bispecific Antibodies ” in Handbook of Therapeutic Antibodies , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)).
[0068] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело содержит две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, функционально связанные с каркасом. Подходящие каркасы описаны ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело содержит две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, функционально связанные с каркасом, и по меньшей мере одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело содержит две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, функционально связанные с каркасом, и по меньшей мере одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций представляет собой Fab.[0068] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody comprises two antigen binding polypeptide constructs operably linked to a scaffold. Suitable scaffolds are described below. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody comprises two antigen binding polypeptide constructs operably linked to the scaffold, and at least one of the antigen binding polypeptide constructs is a scFv. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody comprises two antigen binding polypeptide constructs operably linked to the framework, and at least one of the antigen binding polypeptide constructs is a Fab.
[0069] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать три или четыре антигенсвязывающие полипептидные конструкции и каркас. В этом формате по меньшей мере первая и вторая антигенсвязывающие конструкции являются функционально связанными с каркасом. Третья и необязательная четвертая антигенсвязывающие полипептидные конструкции могут, каждая независимо, быть функционально связанными с каркасом или с первой антигенсвязывающей полипептидной конструкцией или со второй антигенсвязывающей полипептидной конструкцией. [0069] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise three or four antigen binding polypeptide constructs and a framework. In this format, at least the first and second antigen binding constructs are operably linked to the scaffold. The third and optional fourth antigen binding polypeptide constructs may each independently be operably linked to the framework with either the first antigen binding polypeptide construct or the second antigen binding polypeptide construct.
[0070] Анти-HER2 бипаратопные антитела, у которых отсутствует каркас, как правило содержат две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, функционально связанные одним или более линкерами. Антигенсвязывающие полипептидные конструкции могут находиться в форме scFv, Fab, sdAb или их комбинации. Например, используя scFv в качестве антигенсвязывающих полипептидных конструкций, можно конструировать такие форматы, как тандемный scFv ((scFv)2 или taFv), в которых scFv связаны вместе гибким линкером. Для конструирования форматов диатела, которые содержат соответственно два scFv, связанные коротким линкером (в длину обычно около 5 аминокислот). Ограниченная длина линкера приводит к димеризации scFv путем «голова-к-хвосту». В любом из предшествующих форматов scFv можно дополнительно стабилизировать включением междоменной дисульфидной связи. Например, дисульфидную связь можно вводить между VL и VH, посредством введения дополнительного цистеинового остатка в каждую цепь (например, в положение 44 в VH и 100 в VL) (см., например, Fitzgerald et al., Protein Engineering, 10:1221–1225 (1997)), или дисульфидную связь можно вводить между двумя VH для получения конструкции с форматом DART (см., например, Johnson et al., J Mol. Biol., 399:436–449 (2010)).[0070] Anti-HER2 biparatopic antibodies that lack a framework typically contain two antigen-binding polypeptide constructs operably linked by one or more linkers. Antigen-binding polypeptide constructs may be in the form of scFv, Fab, sdAb, or a combination thereof. For example, using scFvs as antigen-binding polypeptide constructs, formats such as tandem scFv ((scFv) 2 or taFv) can be constructed in which the scFvs are linked together by a flexible linker. To construct diabody formats that each contain two scFvs linked by a short linker (usually about 5 amino acids in length). The limited linker length leads to scFv dimerization in a head-to-tail manner. In any of the previous formats, the scFv can be further stabilized by the inclusion of an interdomain disulfide bond. For example, a disulfide bond can be introduced between VL and VH by introducing an additional cysteine residue into each chain (eg, at position 44 in VH and 100 in VL) (see, for example, Fitzgerald et al., Protein Engineering, 10:1221– 1225 (1997)), or a disulfide bond can be introduced between two VHs to produce a DART format construct (see, e.g., Johnson et al., J Mol. Biol., 399:436–449 (2010)).
[0071] Сходным образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения могут применяться форматы, содержащие два sdAb, такие как VH или VHH, соединенные вместе посредством подходящего линкера.[0071] Similarly, in some embodiments of the invention, formats containing two sdAbs, such as VH or VHH, linked together by a suitable linker may be used.
[0072] Другие примеры форматов анти-HER2 бипаратопных антител, у которых отсутствует каркас, включают основанные на Fab фрагменты, например форматы Fab2 и F(ab’)2, в которых Fab-фрагменты соединены посредством линкера или шарнирной области IgG. [0072] Other examples of anti-HER2 biparatopic antibody formats that lack a framework include Fab-based fragments, such as the Fab 2 and F(ab') 2 formats, in which the Fab fragments are connected via a linker or hinge region of an IgG.
[0073] Для создания альтернативных бескаркасных форматов могут также применять комбинации антигенсвязывающих полипептидных конструкций в различных форматах. Например, scFv или sdAb можно гибридизировать с C-концом любого или обоих Fab-фрагментов легкой и тяжелой цепи, что приводит к бивалентной (Fab-scFV/sdAb) конструкции. [0073] Combinations of antigen-binding polypeptide constructs in different formats can also be used to create alternative frameless formats. For example, scFv or sdAb can be hybridized to the C terminus of either or both light and heavy chain Fab fragments, resulting in a bivalent (Fab-scFV/sdAb) construct.
[0074] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать две антигенсвязывающие полипептидные конструкции и один или более линкеров, и не содержит каркас. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело содержит две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, которые представляют собой scFv, Fab, sdAb или их комбинации, и один или более линкеров, и не содержит каркас.[0074] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise two antigen binding polypeptide constructs and one or more linkers, and does not contain a framework. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody comprises two antigen binding polypeptide constructs that are scFv, Fab, sdAb, or combinations thereof, and one or more linkers, and does not contain a framework.
КаркасыFrames
[0075] Анти-HER2 бипаратопные антитела, содержащие каркас, могут конструировать путем связывания двух антигенсвязывающих полипептидных конструкций с подходящим каркасом. Антигенсвязывающие полипептидные конструкции могут находиться в одной форме или комбинации форм, описанных выше (например, scFv, Fab и/или sdAb). Примеры подходящих каркасов описаны более подробно ниже и включают, но не ограничиваются ими, иммуноглобулиновые Fc-области, альбумин, аналоги и производные альбуминов, гетеродимеризующиеся пептиды (такие как лейциновые застежки-молнии, гетеродимеробразующие пептиды типа «застежка-молнии», полученные из Jun и Fos, домены CH1 и CL IgG или токсины барназа-барстар), цитокины, хемокины или факторы роста. Другие примеры включают антитела, основанные на технологии DOCK-И-LOCKTM (DNLTM), разработанной IBC Pharmaceuticals, Inc. и Immunomedics, Inc. (см., например, Chang, et al., Clin Cancer Res 13:5586s–5591s (2007)).[0075] Anti-HER2 biparatope antibodies containing a scaffold can be constructed by coupling two antigen-binding polypeptide constructs to a suitable scaffold. Antigen-binding polypeptide constructs may be in one form or a combination of the forms described above (eg, scFv, Fab and/or sdAb). Examples of suitable scaffolds are described in more detail below and include, but are not limited to, immunoglobulin Fc regions, albumin, albumin analogs and derivatives, heterodimerizing peptides (such as leucine zippers, heterodimerizing zipper peptides derived from Jun and Fos, CH1 and CL domains of IgG or barnase-barstar toxins), cytokines, chemokines or growth factors. Other examples include antibodies based on DOCK-AND-LOCK ™ (DNL ™ ) technology developed by IBC Pharmaceuticals, Inc. and Immunomedics, Inc. (See, for example, Chang, et al., Clin Cancer Res 13:5586s–5591s (2007)).
[0076] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопные антитела включают в себя две или более антигенсвязывающие полипептидные конструкции и каркас. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопные антитела содержат две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, функционально связанные с каркасом.[0076] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibodies include two or more antigen binding polypeptide constructs and a framework. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibodies comprise two antigen-binding polypeptide constructs operably linked to a scaffold.
[0077] Каркас может быть пептидом, полипептидом, полимером, наночастицей или другим химическим объектом. Когда каркас представляет собой полипептид, каждая антигенсвязывающая полипептидная конструкция анти-HER2 бипаратопного антитела может быть связана как с N-, так и с C-концом полипептидного каркаса. В некоторых вариантах осуществления также предполагаются анти-HER2 бипаратопные антитела, содержащие полипептидный каркас, в котором одна или более из антигенсвязывающих полипептидных конструкций связаны с областью, отличной от N- или C-конца, например посредством боковой цепи аминокислоты с помощью линкера или без него.[0077] The scaffold may be a peptide, polypeptide, polymer, nanoparticle, or other chemical entity. When the scaffold is a polypeptide, each anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide construct can be linked to either the N-terminus or the C-terminus of the polypeptide scaffold. Some embodiments also provide anti-HER2 biparatope antibodies comprising a polypeptide backbone in which one or more of the antigen-binding polypeptide constructs are linked to a region other than the N- or C-terminus, for example through an amino acid side chain with or without a linker.
[0078] В вариантах осуществления, в которых каркас представляет собой пептид или полипептид, антигенсвязывающие полипептидные конструкции могут быть связаны с каркасом генетическим слиянием или химической конъюгацией. Как правило, когда каркас представляет собой пептид или полипептид, антигенсвязывающие полипептидные конструкции могут быть связаны с каркасом генетическим слиянием. В некоторых вариантах осуществления, когда каркас представляет собой полимер или наночастицу, антигенсвязывающие полипептидные конструкции могут быть связаны с каркасом химической конъюгацией. [0078] In embodiments in which the scaffold is a peptide or polypeptide, antigen-binding polypeptide constructs can be linked to the scaffold by genetic fusion or chemical conjugation. Typically, when the scaffold is a peptide or polypeptide, antigen-binding polypeptide constructs can be linked to the scaffold by genetic fusion. In some embodiments, when the scaffold is a polymer or nanoparticle, the antigen-binding polypeptide constructs can be linked to the scaffold by chemical conjugation.
[0079] Ряд белковых доменов, известных в данной области техники, содержат селективные пары двух различных полипептидов и могут применяться для образования каркаса. Примером являются домены лейциновой молнии, такие как Fos и Jun, которые селективно соединяются в пары вместе (Kostelny, et al., J Immunol, 148:1547–53 (1992); Wranik, et al., J. Biol. Chem., 287: 43331–43339 (2012)). Другие селективно спаривающиеся молекулярные пары включают, например, пару барназа-барстар (Deyev, et al., Nat Biotechnol, 21:1486–1492 (2003)), пары нитей ДНК (Chaudri, et al., FEBS Letters, 450(1–2):23–26 (1999)) и разделенные пары флуоресцентных белков (международная публикация патентной заявки № WO 2011/135040). [0079] A number of protein domains known in the art contain selective pairs of two different polypeptides and can be used to form a scaffold. An example is leucine zipper domains such as Fos and Jun, which selectively pair together (Kostelny, et al., J Immunol, 148:1547–53 (1992); Wranik, et al., J. Biol. Chem., 287:43331–43339 (2012)). Other selectively mating molecular pairs include, for example, the barnase-barstar pair (Deyev, et al., Nat Biotechnol, 21:1486–1492 (2003)), DNA strand pairs (Chaudri, et al., FEBS Letters, 450(1– 2):23–26 (1999)) and separated fluorescent protein pairs (International Patent Application Publication No. WO 2011/135040).
[0080] Другие примеры белковых каркасов включают иммуноглобулиновые Fc-области, альбумин, аналоги и производные альбуминов, токсины, цитокины, хемокины и факторы роста. Было описано применение белковых каркасов в комбинации с антигенсвязывающими фрагментами, например Müller et al., J Biol Chem, 282:12650–12660 (2007); McDonaugh et al., Mol Cancer Ther, 11:582–593 (2012); Vallera et al., Clin Cancer Res, 11:3879–3888 (2005); Song et al., Biotech Appl Biochem, 45:147–154 (2006) и публикации заявки на патент № US 2009/0285816.[0080] Other examples of protein scaffolds include immunoglobulin Fc regions, albumin, albumin analogs and derivatives, toxins, cytokines, chemokines and growth factors. The use of protein scaffolds in combination with antigen-binding moieties has been described, for example Müller et al., J Biol Chem, 282:12650–12660 (2007); McDonaugh et al., Mol Cancer Ther, 11:582–593 (2012); Vallera et al., Clin Cancer Res, 11:3879–3888 (2005); Song et al., Biotech Appl Biochem, 45:147–154 (2006) and patent application publication US 2009/0285816.
[0081] Например, было показано, что слияние антигенсвязывающих фрагментов, таких как scFv, диател или одноцепочечных диател, с альбумином увеличивает период полувыведения из сыворотки данных антигенсвязывающих фрагментов (Müller et al., там же). Антигенсвязывающие фрагменты могут сливаться по N- и/или C-концу альбумина, необязательно посредством линкера. [0081] For example, it has been shown that fusion of antigen-binding fragments, such as scFv, diabodies, or single-chain diabodies, with albumin increases the serum half-life of these antigen-binding fragments (Müller et al., ibid.). Antigen-binding fragments can be fused at the N- and/or C-terminus of albumin, optionally via a linker.
[0082] Были описаны производные альбумина в форме гетеромультимеров, которые содержат два транспортерных полипептида, полученных сегментацией белка-альбумина, так что транспортерные полипептиды самостоятельно собираются с образованием квазинативного альбумина (см. международные публикации патентных заявок № WO 2012/116453 и WO 2014/012082). В результате сегментации альбумина гетеромультимер содержит четыре конца и, таким образом, может сливаться с до четырьмя различными антигенсвязывающими фрагментами, необязательно посредством линкеров.[0082] Albumin derivatives have been described in the form of heteromultimers that contain two transporter polypeptides obtained by protein-albumin segmentation such that the transporter polypeptides self-assemble to form quasi-native albumin (see International Patent Application Publication Nos. WO 2012/116453 and WO 2014/012082 ). As a result of albumin segmentation, the heteromultimer contains four ends and can thus be fused to up to four different antigen-binding moieties, optionally through linkers.
[0083] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать белковый каркас. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать белковый каркас, который основан на иммуноглобулиновой Fc-области, альбумине или аналоге или производном альбумина. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать белковый каркас, который основан на иммуноглобулиновой Fc-области, например Fc-области IgG.[0083] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise a protein scaffold. In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may comprise a protein scaffold that is based on an immunoglobulin Fc region, albumin, or an albumin analog or derivative. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise a protein scaffold that is based on an immunoglobulin Fc region, such as an IgG Fc region.
[0084] В некоторых вариантах осуществления анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать белковый каркас, который основан на альбумине, например человеческом сывороточном альбумине (HSA) или аналоге или производном альбумина. В некоторых вариантах осуществления анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать белковый каркас, который основан на производном альбумина, описанном в международной публикации патентной заявки № WO 2012/116453 или WO 2014/012082. [0084] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise a protein scaffold that is based on albumin, such as human serum albumin (HSA) or an albumin analog or derivative. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise a protein scaffold that is based on an albumin derivative described in International Patent Application Publication No. WO 2012/116453 or WO 2014/012082.
Fc-областиFc regions
[0085] Термины «Fc-область», «Fc» или «Fc-домен», используемые в данном документе, относятся к C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Этот термин включает нативную последовательность Fc-областей и варианты Fc-областей. Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой EU-индексом, описанной у Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). [0085] The terms "Fc region", "Fc" or "Fc domain" as used herein refer to the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of a constant region. This term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions. Unless otherwise indicated herein, the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region follows the EU numbering system, also referred to as the EU index, described in Kabat et al , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
[0086] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопные антитела могут содержать каркас, которые основан на иммуноглобулиновой Fc-области. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-область может быть димерной и состоять из двух полипептидов Fc. В некоторых вариантах осуществления Fc-область может состоять из единственного полипептида.[0086] In some embodiments, anti-HER2 biparatopic antibodies may comprise a framework that is based on an immunoglobulin Fc region. In some embodiments, the Fc region may be dimeric and consist of two Fc polypeptides. In some embodiments, the Fc region may consist of a single polypeptide.
[0087] «Полипептид Fc» из димерного Fc, относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный Fc-домен, т. е. полипептид, содержащий одну или более C-концевых константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина, которая способна к стабильной самостоятельной ассоциации. Термин «первый полипептид Fc» и «второй полипептид Fc» может применяться взаимозаменяемо при условии, что Fc-область содержит один первый полипептид Fc и один второй полипептид Fc.[0087] "Fc polypeptide" from dimeric Fc, refers to one of the two polypeptides forming a dimeric Fc domain, i.e., a polypeptide containing one or more C-terminal constant regions of an immunoglobulin heavy chain that is capable of stable self-association. The terms "first Fc polypeptide" and "second Fc polypeptide" may be used interchangeably so long as the Fc region comprises one first Fc polypeptide and one second Fc polypeptide.
[0088] Fc-область содержит домен CH3 или оба домена CH3 и CH2. Например, полипептид Fc димерной Fc-области IgG содержит последовательность константных доменов CH2 IgG и CH3 IgG. Домен CH3 содержит две последовательности CH3, по одной из каждого из двух полипептидов Fc димерной Fc-области. Домен CH2 содержит две последовательности CH2, по одной из каждого из двух полипептидов Fc димерной Fc-области. [0088] The Fc region contains a CH3 domain or both CH3 and CH2 domains. For example, the dimeric IgG Fc region Fc polypeptide contains the sequence of IgG constant domains CH2 and CH3 of IgG. The CH3 domain contains two CH3 sequences, one from each of the two Fc polypeptides of the dimeric Fc region. The CH2 domain contains two CH2 sequences, one from each of the two Fc polypeptides of the dimeric Fc region.
[0089] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать белковый каркас, который основан на Fc-области IgG. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать белковый каркас, который основан на Fc-области человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать каркас, основанный на человека, например Fc-области IgG1 человека. [0089] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise a protein scaffold that is based on the Fc region of an IgG. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise a protein scaffold that is based on the human Fc region. In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may comprise a framework based on a human, such as human IgG1 Fc regions.
[0090] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать каркас, основанный на Fc-области IgG, которая представляет собой гетеродимерную Fc-область, содержащую первый полипептид Fc и второй полипептид Fc, каждый содержащий последовательность CH3, и необязательно последовательность CH2. [0090] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise a framework based on an IgG Fc region that is a heterodimeric Fc region comprising a first Fc polypeptide and a second Fc polypeptide, each containing a CH3 sequence, and optionally a CH2 sequence .
[0091] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать каркас, основанный на Fc-области, которая содержит первый и второй полипептиды Fc, и первая антигенсвязывающая полипептидная конструкция функционально связана с первым полипептидом Fc, а вторая антигенсвязывающая полипептидная конструкция функционально связана со вторым полипептидом Fc. [0091] In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may comprise a framework based on an Fc region that contains first and second Fc polypeptides, and a first antigen binding polypeptide construct is operably linked to the first Fc polypeptide and a second antigen binding polypeptide construct is operably linked with a second Fc polypeptide.
[0092] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать каркас, основанный на Fc-области, которая содержит первый и второй полипептиды Fc, в котором первая антигенсвязывающая полипептидная конструкция функционально связана с первым полипептидом Fc, а вторая антигенсвязывающая полипептидная конструкция функционально связана со вторым полипептидом Fc, и в котором первая и вторая антигенсвязывающая полипептидная конструкции независимо представляют собой Fab-фрагмент или scFv.[0092] In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may comprise a framework based on an Fc region that contains first and second Fc polypeptides, wherein the first antigen binding polypeptide construct is operably linked to the first Fc polypeptide and the second antigen binding polypeptide construct is operably linked to the first Fc polypeptide. linked to a second Fc polypeptide, and wherein the first and second antigen-binding polypeptide constructs are independently a Fab fragment or a scFv.
[0093] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать каркас, основанный на Fc-области, которая содержит две последовательности CH3, по меньшей мере одна из которых содержит одну или более аминокислотных модификаций. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать каркас, основанный на Fc-области, которая содержит две последовательности CH3 и две последовательности CH2, по меньшей мере одна из последовательностей CH2 содержит одну или более аминокислотных модификаций. [0093] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may comprise a framework based on an Fc region that contains two CH3 sequences, at least one of which contains one or more amino acid modifications. In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may comprise a framework based on an Fc region that contains two CH3 sequences and two CH2 sequences, at least one of the CH2 sequences containing one or more amino acid modifications.
[0094] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело содержит гетеродимерную Fc-область, содержащую модифицированный домен CH3, причем модифицированный домен CH3 представляет собой асимметрично модифицированный домен CH3. В целом, первый полипептид Fc содержит первую последовательность CH3, а второй полипептид Fc содержит вторую последовательность CH3. [0094] In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody comprises a heterodimeric Fc region comprising a modified CH3 domain, wherein the modified CH3 domain is an asymmetrically modified CH3 domain. In general, the first Fc polypeptide contains a first CH3 sequence and the second Fc polypeptide contains a second CH3 sequence.
[0095] Используемый в данном документе термин «асимметрическая аминокислотная модификация» относится к модификации, при которой аминокислота в конкретном положении на первой последовательности CH3 отличается от аминокислоты на второй последовательности CH3 в таком же положении. Для последовательностей CH3, содержащих асимметричные аминокислотные модификации, первая и вторая последовательности CH3 будут, как правило, предпочтительно спариваться с образованием гетеродимера, а не гомодимера. Эти асимметричные аминокислотные модификации могут возникать в результате модификации только одной из двух аминокислот в том же соответствующем аминокислотном положении на каждой последовательности, или же различные модификации обеих аминокислот на каждой последовательности в том же соответствующем положении на каждой из первой и второй последовательностях CH3. Каждая из первой и второй последовательности CH3 гетеродимерного Fc могут содержать одну или более, а не одну асимметричную аминокислотную модификацию. [0095] As used herein, the term “asymmetric amino acid modification” refers to a modification in which an amino acid at a particular position on a first CH3 sequence is different from an amino acid at a second CH3 sequence at the same position. For CH3 sequences containing asymmetric amino acid modifications, the first and second CH3 sequences will generally preferentially pair to form a heterodimer rather than a homodimer. These asymmetric amino acid modifications may result from modification of only one of the two amino acids at the same corresponding amino acid position on each sequence, or different modifications of both amino acids on each sequence at the same corresponding position on each of the first and second CH3 sequences. Each of the first and second CH3 sequences of the heterodimeric Fc may contain one or more, rather than just one, asymmetric amino acid modification.
[0096] В некоторых вариантах осуществления анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать белковый каркас, который основан на модифицированной Fc-области, описанной в международной публикации патентной заявки № WO 2012/058768 или WO 2013/063702.[0096] In some embodiments, an anti-HER2 biparatopic antibody may comprise a protein scaffold that is based on a modified Fc region described in International Patent Application Publication No. WO 2012/058768 or WO 2013/063702.
[0097] В таблице 1 предложена аминокислотная последовательность из последовательности Fc IgG1 человека (SEQ ID NO:1), соответствующая аминокислотам от 231 до 447 полноразмерной тяжелой цепи IgG1 человека. Последовательность CH3 содержит аминокислоты 341–447 полноразмерной тяжелой цепи IgG1 человека. [0097] Table 1 provides an amino acid sequence from the human IgG1 Fc sequence (SEQ ID NO:1), corresponding to amino acids 231 to 447 of the full-length human IgG1 heavy chain. The CH3 sequence contains amino acids 341–447 of the full-length human IgG1 heavy chain.
[0098] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя гетеродимерный каркас Fc, содержащий модифицированный домен CH3, который содержит асимметричную аминокислотную модификацию, которая способствует образованию гетеродимерного Fc, а не гомодимерного Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя гетеродимерный каркас Fc, который содержит модификации в одном или более из следующих положений: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 и/или N390, с использованием нумерации EU. [0098] In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may include a heterodimeric Fc scaffold containing a modified CH3 domain that contains an asymmetric amino acid modification that promotes the formation of a heterodimeric Fc rather than a homodimeric Fc. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may include a heterodimeric Fc framework that contains modifications at one or more of the following positions: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400, and/or N390, with using EU numbering.
[0099] В некоторых вариантах осуществления анти-HER2 бипаратопное антитело содержит гетеродимерный Fc, включающий модифицированный домен CH3 с первой полипептидной последовательностью, которая содержит аминокислотные модификации в положениях F405 и Y407, и необязательно дополнительно содержит аминокислотную модификацию в положении L351, и второй полипептидной последовательностью, которая содержит аминокислотные модификации в положениях T366 и T394, и необязательно дополнительно содержит аминокислотную модификацию в положении K392. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная последовательность модифицированного домена CH3 содержит аминокислотные модификации в положениях F405 и Y407, и необязательно дополнительно содержит аминокислотную модификацию в положении L351, а вторая полипептидная последовательность модифицированного домена CH3 содержит аминокислотные модификации в положениях T366 и T394, и необязательно дополнительно содержит аминокислотную модификацию в положении K392, и аминокислотная модификация в положении F405 представляет собой F405A, F405I, F405M, F405S, F405T или F405V; аминокислотная модификация в положении Y407 представляет собой Y407I или Y407V; аминокислотная модификация в положении T366 представляет собой T366I, T366L или T366M; аминокислотная модификация в положении T394 представляет собой T394W; аминокислотная модификация в положении L351 представляет собой L351Y и аминокислотная модификация в положении K392 представляет собой K392F, K392L или K392M. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная модификация в положении F405 представляет собой F405A, F405S, F405T или F405V.[0099] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody comprises a heterodimeric Fc comprising a modified CH3 domain with a first polypeptide sequence that contains amino acid modifications at positions F405 and Y407, and optionally further contains an amino acid modification at position L351, and a second polypeptide sequence, which contains amino acid modifications at positions T366 and T394, and optionally further contains an amino acid modification at position K392. In some embodiments, the first modified CH3 domain polypeptide sequence comprises amino acid modifications at positions F405 and Y407, and optionally further comprises an amino acid modification at position L351, and the second modified CH3 domain polypeptide sequence contains amino acid modifications at positions T366 and T394, and optionally further comprises an amino acid modification the modification at position K392, and the amino acid modification at position F405 is F405A, F405I, F405M, F405S, F405T or F405V; the amino acid modification at position Y407 is Y407I or Y407V; the amino acid modification at position T366 is T366I, T366L or T366M; the amino acid modification at position T394 is T394W; the amino acid modification at position L351 is L351Y and the amino acid modification at position K392 is K392F, K392L or K392M. In some embodiments, the amino acid modification at position F405 is F405A, F405S, F405T, or F405V.
[00100] В некоторых вариантах осуществления анти-HER2 бипаратопное антитело может содержать гетеромерный Fc, включающий модифицированный домен CH3, имеющий первую полипептидную последовательность Fc, содержащую аминокислотные модификации в положениях F405 и Y407, и необязательно дополнительно содержит аминокислотную модификацию в положении L351, а вторая полипептидная последовательность Fc содержит аминокислотные модификации в положениях T366 и T394, и необязательно дополнительно содержит аминокислотную модификацию в положении K392, и аминокислотная модификация в положении F405 представляет собой F405A, F405I, F405M, F405S, F405T или F405V; аминокислотная модификация в положении Y407 представляет собой Y407I или Y407V; аминокислотная модификация в положении T366 представляет собой T366I, T366L или T366M; аминокислотная модификация в положении T394 представляет собой T394W; аминокислотная модификация в положении L351 представляет собой L351Y, и аминокислотная модификация в положении K392 представляет собой K392F, K392L или K392M, и одна или обе из первой и второй полипептидных последовательностей Fc содержат аминокислотную модификацию T350V. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная модификация в положении F405 представляет собой F405A, F405S, F405T или F405V.[00100] In some embodiments, an anti-HER2 biparatopic antibody may comprise a heteromeric Fc comprising a modified CH3 domain having a first Fc polypeptide sequence comprising amino acid modifications at positions F405 and Y407, and optionally further comprising an amino acid modification at position L351, and a second polypeptide sequence the Fc sequence contains amino acid modifications at positions T366 and T394, and optionally further contains an amino acid modification at position K392, and an amino acid modification at position F405 is F405A, F405I, F405M, F405S, F405T or F405V; the amino acid modification at position Y407 is Y407I or Y407V; the amino acid modification at position T366 is T366I, T366L or T366M; the amino acid modification at position T394 is T394W; the amino acid modification at position L351 is L351Y, and the amino acid modification at position K392 is K392F, K392L or K392M, and one or both of the first and second Fc polypeptide sequences contain the amino acid modification T350V. In some embodiments, the amino acid modification at position F405 is F405A, F405S, F405T, or F405V.
[00101] В некоторых вариантах осуществления анти-HER2 бипаратопное антитело содержит гетеродимерный Fc, включающий модифицированный домен CH3, описанный выше, в котором первая полипептидная последовательность Fc содержит аминокислотные модификации в положениях F405 и Y407, и необязательно дополнительно содержит аминокислотную модификацию в положении L351, а вторая полипептидная последовательность Fc содержит аминокислотные модификации в положениях T366 и T394, и необязательно дополнительно содержит аминокислотную модификацию в положении K392, и в котором первая полипептидная последовательность Fc дополнительно содержит аминокислотную модификацию в одном или обоих положениях S400 или Q347, и/или вторая полипептидная последовательность Fc дополнительно содержит аминокислотную модификацию в одном или обоих положениях K360 или N390, причем аминокислотная модификация в положении S400 представляет собой S400E, S400D, S400R или S400K; аминокислотная модификация в положении Q347 представляет собой Q347R, Q347E или Q347K; аминокислотная модификация в положении K360 представляет собой K360D или K360E, и аминокислотная модификация в положении N390 представляет собой N390R, N390K или N390D. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная модификация в положении F405 представляет собой F405A, F405S, F405T или F405V.[00101] In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody comprises a heterodimeric Fc comprising a modified CH3 domain described above, wherein the first Fc polypeptide sequence comprises amino acid modifications at positions F405 and Y407, and optionally further comprises an amino acid modification at position L351, and the second Fc polypeptide sequence comprises amino acid modifications at positions T366 and T394, and optionally further comprises an amino acid modification at position K392, and wherein the first Fc polypeptide sequence further comprises an amino acid modification at one or both of positions S400 or Q347, and/or the second Fc polypeptide sequence further comprises an amino acid modification at one or both positions K360 or N390, wherein the amino acid modification at position S400 is S400E, S400D, S400R or S400K; the amino acid modification at position Q347 is Q347R, Q347E or Q347K; the amino acid modification at position K360 is K360D or K360E, and the amino acid modification at position N390 is N390R, N390K or N390D. In some embodiments, the amino acid modification at position F405 is F405A, F405S, F405T, or F405V.
[00102] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя гетеродимерный каркас Fc, имеющий модифицированный домен CH3, содержащий модификации любого одного из вариант 1, вариант 2, вариант 3, вариант 4 или вариант 5, показанных в таблице 1.[00102] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may include a heterodimeric Fc framework having a modified CH3 domain containing modifications of any one of Option 1, Option 2, Option 3, Option 4, or Option 5 shown in Table 1 .
Таблице 1. Последовательности Fc IgG1Table 1. IgG1 Fc sequences
(SEQ ID NO: 1)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 1)
[00103] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя гетеродимерный каркас Fc, имеющий модифицированный домен CH3 с первой последовательностью CH3, содержащей одну или более аминокислотных модификаций, выбранных из L351Y, F405A, и Y407V, и второй последовательностью CH3, содержащей аминокислотные модификации T366L или T366I; K392L или K392M, и T394W, и одна или две из первой и второй последовательностей CH3 могут необязательно дополнительно включать в себя аминокислотную модификацию T350V. [00103] In some embodiments, an anti-HER2 biparatope antibody may include a heterodimeric Fc framework having a modified CH3 domain with a first CH3 sequence containing one or more amino acid modifications selected from L351Y, F405A, and Y407V, and a second CH3 sequence , containing amino acid modifications T366L or T366I; K392L or K392M, and T394W, and one or two of the first and second CH3 sequences may optionally further include the T350V amino acid modification.
[00104] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя гетеродимерный каркас Fc, имеющий модифицированный домен CH3, содержащий асимметричные аминокислотные модификации, описанные выше, которые способствуют образованию гетеродимерного Fc, в котором гетеродимерный домен CH3 обладает стабильностью, которая сравнимая с гомодимерным доменом CH3 дикого типа. Стабильность домена CH3 можно оценивать путем измерения температуры плавления (Tm) домена CH3, например методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). В некоторых вариантах осуществления одна или более асимметричных аминокислотных модификаций способствуют образованию гетеродимерного домена Fc, в котором домен CH3 обладает стабильностью, наблюдаемой посредством температуры плавления (Tm) в исследовании дифференциальной сканирующей калориметрии, значение которой находится в пределах около 8 oC, например в пределах около 7oC, около 6oC, около 5oC или около 4 °C, от температуры, наблюдаемой для соответствующего симметричного гомодимерного домена CH3 дикого типа. [00104] In some embodiments, an anti-HER2 biparatopic antibody may include a heterodimeric Fc scaffold having a modified CH3 domain containing the asymmetric amino acid modifications described above that promote the formation of a heterodimeric Fc, in which the heterodimeric CH3 domain has a stability that is comparable with a wild-type homodimeric CH3 domain. The stability of the CH3 domain can be assessed by measuring the melting temperature (Tm) of the CH3 domain, for example by differential scanning calorimetry (DSC). In some embodiments, one or more asymmetric amino acid modifications promote the formation of a heterodimeric Fc domain in which the CH3 domain has stability as observed by a melting temperature (Tm) in a differential scanning calorimetry study, the value of which is in the range of about 8 o C, for example, in the range of about 7 o C, about 6 o C, about 5 o C, or about 4 ° C, from the temperature observed for the corresponding wild-type symmetric CH3 homodimeric domain.
[00105] В некоторых вариантах осуществления гетеродимерный Fc, содержащий модифицированные последовательности CH3, может образовываться в экспрессированном продукте с чистотой по меньшей мере около 75% по сравнению с гомодимерным Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя гетеродимерный каркас Fc, имеющий модифицированный домен CH3, включающий асимметричные аминокислотные модификации, которые способствуют образованию гетеродимерного Fc с чистотой более около 80%, более около 85%, более около 90%, более около 95% или более около 97%.[00105] In some embodiments, a heterodimeric Fc containing modified CH3 sequences can be generated in the expressed product at a purity of at least about 75% compared to the homodimeric Fc. In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may include a heterodimeric Fc scaffold having a modified CH3 domain including asymmetric amino acid modifications that promote the formation of a heterodimeric Fc with a purity of greater than about 80%, greater than about 85%, greater than about 90%, more than about 95% or more than about 97%.
[00106] Дополнительные способы модификации мономерных полипептидов Fc для облегчения образования гетеродимерных Fc хорошо известны в данной области и включают, например, описанные в международной публикации патентной заявки № WO 96/027011 (технология «выступы в углубления»), Gunasekaran et al. J Biol Chem, 285, 19637–46 (2010) (разработка электростатической структуры для достижения избирательной гетеродимеризации); Davis et al., Prot Eng Des Sel, 23(4):195-202 (2010) (технология обмена цепей сконструированного домена (SEED)) и Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50 (2013) (обмен Fab-плечей).[00106] Additional methods for modifying monomeric Fc polypeptides to facilitate the formation of heterodimeric Fcs are well known in the art and include, for example, those described in International Patent Application Publication No. WO 96/027011 (knobs-to-wells technology), Gunasekaran et al. J Biol Chem, 285, 19637–46 (2010) (design of electrostatic structure to achieve selective heterodimerization); Davis et al. , Prot Eng Des Sel, 23(4):195-202 (2010) (strand exchange engineered domain (SEED) technology) and Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50 (2013) (exchange of Fab shoulders).
[00107] В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых анти-HER2 бипаратопное антитело содержит гетеродимерный Fc-каркас, гетеродимер Fc также содержит домен CH2. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен CH2 представляет собой модифицированный домен CH2. Один пример домена CH2 из Fc представляет собой аминокислоты 231–340 последовательности, показанной в таблице 1. Fc-рецепторами (FcR), которые связывают Fc антитела, опосредуются несколько эффекторных функций. [00107] In some embodiments in which the anti-HER2 biparatope antibody contains a heterodimeric Fc backbone, the Fc heterodimer also contains a CH2 domain. In some embodiments, the CH2 domain is a modified CH2 domain. One example of a CH2 domain from Fc is amino acids 231–340 of the sequence shown in Table 1. Fc receptors (FcRs), which bind Fc antibodies, mediate several effector functions.
[00108] Fc-рецепторы (FcR) включают в себя рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативные сплайсинговые формы этих рецепторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения термин FcR может также включать неонатальный рецептор, FcRn.[00108] Fc receptors (FcR) include receptors of the FcγRI, FcγRII, and FcγRIII subclasses, including allelic variants and alternative splice forms of these receptors. In some embodiments, the term FcR may also include the neonatal receptor, FcRn.
[00109] Модификации в домене CH2 могут влиять на связывание FcR с Fc. В данной области известен ряд аминокислотных модификаций в Fc-области для избирательного изменения аффинности Fc для различных Fcγ-рецепторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых анти-HER2 бипаратопное антитело содержит гетеродимерный каркас Fc с модифицированным доменом CH2, модифицированный домен CH2 может включать в себя одну или более модификаций для облегчения селективного связывания Fcγ-рецепторов.[00109] Modifications in the CH2 domain can affect the binding of FcR to Fc. A number of amino acid modifications in the Fc region are known in the art to selectively alter Fc affinity for different Fcγ receptors. In some embodiments in which the anti-HER2 biparatope antibody comprises a heterodimeric Fc scaffold with a modified CH2 domain, the modified CH2 domain may include one or more modifications to facilitate selective binding of Fcγ receptors.
[00110] Неограничивающие примеры модификации, которые изменяют связывание Fc рецепторами FcR, включают S298A/E333A/K334A и S298A/E333A/K334A/K326A (Lu, et al., J Immunol Methods, 365(1-2):132-41 (2011)); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L and F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen, et al., Cancer Res, 67(18):8882–90 (2007) и Nordstrom JL, et al., Breast Cancer Res, 13(6):R123 (2011)); F243L (Stewart, et al., Protein Eng Des Sel. 24(9):671–8 (2011)); S298A/E333A/K334A (Shields, et al., J Biol Chem, 276(9):6591–604 (2001)); S239D/I332E/A330L и S239D/I332E (Lazar, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103(11):4005–10 (2006)); S239D/S267E и S267E/L328F (Chu, et al., Mol Immunol, 45(15):3926–33 (2008)). Дополнительные модификации, которые влияют на связывание Fc рецепторами FcR, описаны в Therapeutic Antibody Engineering (Strohl & Strohl, Woodhead Publishing series в Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012, page 283). Fc-области, содержащие асимметричные модификации, которые влияют на связывание рецепторами FcR, описаны в международной публикации патента № WO 2014/190441.[00110] Non-limiting examples of modifications that alter Fc binding to FcR receptors include S298A/E333A/K334A and S298A/E333A/K334A/K326A (Lu, et al. , J Immunol Methods, 365(1-2):132-41 ( 2011)); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L and F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen, et al., Cancer Res, 67(18):8882–90 (2007) and Nordstrom JL, et al., Breast Cancer Res, 13(6):R123 (2011)); F243L (Stewart, et al. , Protein Eng Des Sel. 24(9):671–8 (2011)); S298A/E333A/K334A (Shields, et al., J Biol Chem, 276(9):6591–604 (2001)); S239D/I332E/A330L and S239D/I332E (Lazar, et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 103(11):4005–10 (2006)); S239D/S267E and S267E/L328F (Chu, et al., Mol Immunol, 45(15):3926–33 (2008)). Additional modifications that affect the binding of Fc receptors to FcRs are described in Therapeutic Antibody Engineering (Strohl & Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No. 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012, page 283). Fc regions containing asymmetric modifications that affect FcR receptor binding are described in International Patent Publication No. WO 2014/190441.
[00111] Дополнительные изменения могут быть внесены в Fc-области с целью улучшения их способности опосредовать эффекторную функцию. Такие модификации известны в данной области техники и включают афукозилирование или конструирование аффинности Fc в направлении активации рецептора, в основном FcγRIIIa в отношении АЗКЦ, и в направлении C1q в отношении КЗЦ. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя Fc-область, модифицированную для улучшения способности опосредовать эффекторную функцию.[00111] Additional changes may be made to the Fc regions to improve their ability to mediate effector function. Such modifications are known in the art and include afucosylation or affinity engineering of Fc in the direction of receptor activation, mainly FcγRIIIa for ADCC, and in the C1q direction for ADCC. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may include an Fc region modified to improve the ability to mediate effector function.
[00112] Способы продуцирования антител с низким содержанием или без фукозы на сайте гликозилирования Fc (Asn 297, нумерация EU) с изменением аминокислотной последовательности являются хорошо известными в данной области техники. Например, технология GlymaX® (ProBioGen AG) (см. von Horsten et al., Glycobiology, 20(12):1607–18 (2010) и патент США № 8,409,572). В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя Fc-область, которая является агликозилированной. В этом контексте анти-HER2 бипаратопное антитело может быть полностью афукозилировано (т. е. оно не содержит выявляемой фукозы) или они может быть частично афукозилировано, так что анти-HER2 бипаратопное антитело содержит менее 95%, менее 85%, менее 75%, менее 65%, менее 55%, менее 45%, менее 35%, менее 25%, менее 15% или менее 5%, или любое количество в этих пределах фукозы, обычно выявляемого количества для сходной конструкции, продуцируемой экспрессионной системой млекопитающих.[00112] Methods for producing antibodies with low or no fucose at the Fc glycosylation site (Asn 297, EU numbering) by changing the amino acid sequence are well known in the art. For example, GlymaX® technology (ProBioGen AG) (see von Horsten et al. , Glycobiology, 20(12):1607–18 (2010) and US patent No. 8,409,572). In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody may include an Fc region that is aglycosylated. In this context, the anti-HER2 biparatope antibody may be completely afucosylated ( i.e., it contains no detectable fucose) or it may be partially afucosylated, such that the anti-HER2 biparatope antibody contains less than 95%, less than 85%, less than 75%, less than 65%, less than 55%, less than 45%, less than 35%, less than 25%, less than 15%, or less than 5%, or any amount within the fucose range typically detected for a similar construct produced by a mammalian expression system.
[00113] Модификации Fc, снижающие связывание FcγR и/или комплемента, и/или эффекторную функцию, известны в данной области техники и включают описанные выше. В различных публикациях описаны стратегии, использованные для конструирования антител со сниженной или заглушенной эффекторной активностью (см., например, Strohl, Curr Opin Biotech 20:685–691 (2009), и Strohl & Strohl, “Antibody Fc engineering for optimal antibody performance” в Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225–249). Эти стратегии включают снижение эффекторной функции посредством модификации гликозилирования, используя каркасы IgG2/IgG4 или введение мутаций в шарнир или области CH2 Fc (см. также публикацию патента США № 2011/0212087, международную публикацию патента № WO 2006/105338, публикацию патента США № 2012/0225058, публикацию патента США № 2012/0251531 и Strop et al., J. Mol. 420: 204-219 (2012)).[00113] Fc modifications that reduce FcγR and/or complement binding and/or effector function are known in the art and include those described above. Various publications have described strategies used to engineer antibodies with reduced or silenced effector activity (see, for example, Strohl, Curr Opin Biotech 20:685–691 (2009), and Strohl & Strohl, “ Antibody Fc engineering for optimal antibody performance .” in Therapeutic Antibody Engineering , Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp. 225–249). These strategies include reducing effector function by modifying glycosylation using IgG2/IgG4 scaffolds or introducing mutations in the hinge or CH2 Fc regions (see also US Patent Publication No. 2011/0212087, International Patent Publication No. WO 2006/105338, US Patent Publication No. 2012 /0225058, US Patent Publication No. 2012/0251531 and Strop et al., J. Mol. 420: 204-219 (2012)).
[00114] Конкретные неограничивающие примеры известных аминокислотных модификаций для снижения связывания FcγR или комплемента с Fc включают представленные в таблице 2.[00114] Specific non-limiting examples of known amino acid modifications to reduce FcγR or complement binding to Fc include those presented in Table 2.
Таблица 2. Модификации для снижения связывания FcγR или комплемента с FcTable 2. Modifications to reduce FcγR or complement binding to Fc
[00115] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя Fc-область, которая содержит модифицированный домен CH2 с одной или более мутациями, идентифицированными в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя Fc-область, содержащую модифицированный домен CH2, имеющий аминокислотные модификации в положениях L234, L235 и/или D265. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело может включать в себя Fc-область, содержащую модифицированный домен CH2 с аминокислотными модификациями L234A, L235A и D265S. [00115] In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may include an Fc region that contains a modified CH2 domain with one or more mutations identified in Table 2. In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may include itself an Fc region containing a modified CH2 domain having amino acid modifications at positions L234, L235 and/or D265. In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody may include an Fc region containing a modified CH2 domain with amino acid modifications L234A, L235A, and D265S.
Эпитопы HER2HER2 epitopes
[00116] Две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, составленные анти-HER2 бипаратопным антителом, каждая связывается с отличающимся эпитопом HER2, а именно, первая антигенсвязывающая полипептидная конструкция связывается с первым эпитопом HER2, а вторая антигенсвязывающая полипептидная конструкция связывается со вторым эпитопом HER2. В контексте настоящего описания каждая из антигенсвязывающих полипептидных конструкций специфически связывается со своим целевым эпитопом. [00116] Two antigen binding polypeptide constructs constituted by an anti-HER2 biparatope antibody each bind to a different HER2 epitope, namely, a first antigen binding polypeptide construct binds to a first HER2 epitope and a second antigen binding polypeptide construct binds to a second HER2 epitope. As used herein, each of the antigen-binding polypeptide constructs specifically binds to its target epitope.
[00117] Фраза «специфически связывает» или «специфически связывающий» означает, что связывание селективно для антигена и может быть отделено от нежелательных или не специфических взаимодействий. Способность антигенсвязывающей полипептидной конструкции к связыванию со специфическим эпитопом могут измерять, например, посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), методик поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (анализы на приборе BIAcore) (Liljeblad et al, Glyco J 17, 323–329 (2000)) или традиционного анализа связывания (Heeley, Endocr Res 28, 217–229 (2002)). В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что антигенсвязывающая полипептидная конструкция специфически связывается со своим целевым эпитопом, когда степень связывания антигенсвязывающей полипептидной конструкции с нерелевантным белком составляет менее около 10% связывания антигенсвязывающей полипептидной конструкции со своим целевым эпитопом, как измерено, например, методом SPR. [00117] The phrase “specifically binds” or “specifically binding” means that the binding is selective for the antigen and can be discriminated against unwanted or non-specific interactions. The ability of an antigen-binding polypeptide construct to bind a specific epitope can be measured, for example, by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), surface plasmon resonance (SPR) techniques (BIAcore assays) (Liljeblad et al , Glyco J 17, 323-329 (2000) ) or traditional binding assay (Heeley, Endocr Res 28, 217–229 (2002)). In some embodiments, an antigen binding polypeptide construct is considered to bind specifically to its target epitope when the extent of binding of the antigen binding polypeptide construct to an irrelevant protein is less than about 10% of the binding of the antigen binding polypeptide construct to its target epitope, as measured, for example, by the SPR method.
[00118] «HER2» (также известный как ErbB2) относится к белку HER2 человека, описанному, например, в Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) и Yamamoto et al., Nature, 319:230–234 (1986) (учетный номер X03363 Genbank). Термин «erbB2» и «neu» к гену, кодирующему белок HER2 человека. Термин p185 или p185neu также может применяться по отношению к белковому продукту гена neu.[00118] "HER2" (also known as ErbB2) refers to the human HER2 protein described, for example, in Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) and Yamamoto et al ., Nature, 319 :230–234 (1986) (Genbank accession number X03363). The terms "erbB2" and "neu" refer to the gene encoding the human HER2 protein. The term p185 or p185neu can also be applied to the protein product of the neu gene.
[00119] HER2 содержит внеклеточный домен, который, как правило, связывает лиганд HER, липофильный трансмембранный домен, консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен и карбоксильно-концевой домен передачи сигнала, содержащий несколько тирозиновых остатков, которые могут фосфорилироваться. Внеклеточный домен (ecto) HER2 содержит четыре домена, домены I–IV. Последовательность HER2 представлена в таблице 3 (SEQ ID NO:2). Границы внеклеточного домена (ECD) следующие: домен I — приблизительно аминокислоты 1–165; домен II — приблизительно аминокислоты 166–322; домен III — приблизительно аминокислоты 323–488, и домен IV — приблизительно аминокислоты 489–607.[00119] HER2 contains an extracellular domain that typically binds HER ligand, a lipophilic transmembrane domain, a conserved intracellular tyrosine kinase domain, and a carboxyl-terminal signal transduction domain containing several tyrosine residues that can be phosphorylated. The extracellular domain (ecto) of HER2 contains four domains, domains I–IV. The sequence of HER2 is shown in Table 3 (SEQ ID NO:2). The boundaries of the extracellular domain (ECD) are as follows: domain I—approximately amino acids 1–165; domain II - approximately amino acids 166-322; domain III is approximately amino acids 323–488, and domain IV is approximately amino acids 489–607.
Таблица 3. Аминокислотная последовательность HER2 человека (SEQ ID NO:2)Table 3. Amino acid sequence of human HER2 (SEQ ID NO:2)
61 YVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQL
121 RSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGS
181 RCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSG
241 ICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEV
301 TAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFD
361 GDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYS
421 LTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPED
481 ECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLP
541 CHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGA
601 CQPCPIN1 TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQG
61 YVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQL
121 RSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGS
181 RCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSG
241 ICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEV
301 TAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFD
361 GDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYS
421 LTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPED
481 ECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLP
541 CHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGA
601 CQPCPIN
[00120] «Эпитоп 2C4» представляет собой область во внеклеточном домене HER2, с которым связывается антитело 2C4 и содержит остатки из домена II во внеклеточном домене HER2 (также называемом ECD2). 2C4 и пертузумаб связываются с внеклеточным доменом HER2 у соединения доменов I, II и III (Franklin et al. Cancer Cell 5:317–328 (2004)). [00120] The “2C4 epitope” is the region in the extracellular domain of HER2 to which the 2C4 antibody binds and contains residues from domain II in the extracellular domain of HER2 (also called ECD2). 2C4 and pertuzumab bind to the extracellular domain of HER2 at the junction of domains I, II and III (Franklin et al. Cancer Cell 5:317–328 (2004)).
[00121] «Эпитоп 4D5» представляет собой область во внеклеточном домене HER2 с которой связываются антитело 4D5 (ATCC CRL 10463) и трастузумаб. Этот эпитоп расположен рядом с трансмембранным доменом HER2 и находится в пределах домена IV HER2 (также называемого ECD4).[00121] The “4D5 epitope” is the region in the extracellular domain of HER2 to which the 4D5 antibody (ATCC CRL 10463) and trastuzumab bind. This epitope is located adjacent to the transmembrane domain of HER2 and is within domain IV of HER2 (also called ECD4).
[00122] В целом, анти-HER2 бипаратопное антитело по настоящему описанию будет связываться с эпитопами в пределах внеклеточных доменов HER2. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй эпитопы HER2, связанные первой и второй антигенсвязывающими полипептидными конструкциями анти-HER2 бипаратопного антитела являются неперекрывающимися эпитопами. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй эпитопы HER2, связанные первой и второй антигенсвязывающими полипептидными конструкциями анти-HER2 бипаратопного антитела являются различными внеклеточными доменами HER2. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенсвязывающая полипептидная конструкция анти-HER2 бипаратопного антитела связывается с первым эпитопом HER2 на первом домене HER2, и вторая антигенсвязывающая полипептидная конструкция связывается со вторым эпитопом HER2 на втором домене HER2. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый домен HER2 представляет собой ECD2 и второй домен HER2 представляет собой ECD4.[00122] In general, an anti-HER2 biparatope antibody as described herein will bind to epitopes within the extracellular domains of HER2. In some embodiments, the first and second HER2 epitopes linked by the first and second anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs are non-overlapping epitopes. In some embodiments, the first and second HER2 epitopes linked by the first and second anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs are different extracellular domains of HER2. In some embodiments, a first antigen binding polypeptide construct of an anti-HER2 biparatope antibody binds to a first HER2 epitope on a first HER2 domain, and a second antigen binding polypeptide construct binds to a second HER2 epitope on a second HER2 domain. In some embodiments, the first HER2 domain is ECD2 and the second HER2 domain is ECD4.
[00123] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, конкурирует с трастузумабом за связывание с HER2. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, конкурирует с пертузумабом за связывание с HER2. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, конкурирует с трастузумабом за связывание с HER2, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция конкурирует с пертузумабом за связывание с HER2.[00123] In some embodiments, one of the antigen-binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody competes with trastuzumab for binding to HER2. In some embodiments, one of the antigen-binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody competes with pertuzumab for binding to HER2. In some embodiments, one of the antigen binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody competes with trastuzumab for binding to HER2, and the other antigen binding polypeptide construct competes with pertuzumab for binding to HER2.
[00124] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, представлена в формате Fab или scFv и конкурирует с трастузумабом за связывание с HER2, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция представлена в формате Fab или scFv и конкурирует с пертузумабом за связывание с HER2. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, представлена в формате Fab и конкурирует с трастузумабом за связывание с HER2, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция представлена в формате scFv и конкурирует с пертузумабом за связывание с HER2.[00124] In some embodiments, one of the antigen binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody is in Fab or scFv format and competes with trastuzumab for binding to HER2, and the other antigen binding polypeptide construct is in Fab or scFv format and competes with pertuzumab for binding to HER2. In some embodiments, one of the antigen binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody is in Fab format and competes with trastuzumab for binding to HER2, and the other antigen binding polypeptide construct is in scFv format and competes with pertuzumab for binding to HER2.
[00125] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, связывается с тем же эпитопом на HER2, что и трастузумаб. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, связывается с тем же эпитопом на HER2, что и пертузумаб. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, связывается с тем же эпитопом на HER2, что и трастузумаб, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция связывается с тем же эпитопом на HER2, что и пертузумаб.[00125] In some embodiments, one of the antigen-binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody binds to the same epitope on HER2 as trastuzumab. In some embodiments, one of the antigen-binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody binds to the same epitope on HER2 as pertuzumab. In some embodiments, one of the antigen binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody binds to the same epitope on HER2 as trastuzumab, and the other antigen binding polypeptide construct binds to the same epitope on HER2 as pertuzumab.
[00126] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций, содержащаяся в анти-HER2 бипаратопном антителе, содержит последовательности CDR трастузумаба или их вариант, включающие одну или более мутаций, которые, как известно, увеличивают связывание HER2, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция содержит CDR пертузумаба или их вариант, включающие одну или более мутаций, которые, как известно, увеличивают связывание HER2. Известные в литературе мутации, которые усиливают связывание HER2 трастузумабом или пертузумабом, включать в себя описанные ниже в таблицах 4 и 5 (HC = тяжелая цепь; LC = легкая цепь). Подразумеваются также комбинации этих мутаций.[00126] In some embodiments, one of the antigen binding polypeptide constructs contained in the anti-HER2 biparatope antibody comprises trastuzumab CDR sequences or a variant thereof comprising one or more mutations known to increase HER2 binding and another antigen binding polypeptide construct contains pertuzumab CDRs or a variant thereof comprising one or more mutations known to increase HER2 binding. Mutations known in the literature that enhance HER2 binding by trastuzumab or pertuzumab include those described below in Tables 4 and 5 (HC = heavy chain; LC = light chain). Combinations of these mutations are also contemplated.
Таблица 4. Мутации в трастузумабе, увеличивающие связывание с HER2 Table 4. Mutations in trastuzumab that increase binding to HER2
Таблица 5. Мутации в пертузумабе, увеличивающие связывание с HER2 Table 5. Mutations in pertuzumab that increase binding to HER2
[00127] Различные анти-HER2 бипаратопные антитела известны в данной области техники, и они могут быть подходящими потенциальными антителами для включения в ADC, описанные в данном документе. Примеры включают антитела, описанные в публикациях заявок на патент США № 2014/0170148; 2015/0284463; 2016/0289335; 2017/0029529; 2017/0291955 и 2018/0022820, и международной публикации патентной заявки № WO 2016/179707.[00127] Various anti-HER2 biparatope antibodies are known in the art, and they may be suitable candidate antibodies for inclusion in the ADCs described herein. Examples include the antibodies described in US Patent Application Publication No. 2014/0170148; 2015/0284463; 2016/0289335; 2017/0029529; 2017/0291955 and 2018/0022820, and international patent application publication No. WO 2016/179707.
[00128] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело представляет собой одно из бипаратопных антител, описанных в публикации заявки на патент США № 2016/0289335. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело представляет собой одно из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717 (см. таблицы 6, 6A и 6B, и таблицы с последовательностями). В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VH и последовательность VL из ECD2-связывающего плеча одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VH и последовательность VL из ECD2-связывающего плеча одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция содержит последовательность VH и последовательность VL из ECD4-связывающего плеча одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717. [00128] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody is one of the biparatope antibodies described in US Patent Application Publication No. 2016/0289335. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody is one of v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903, or v6717 (see Tables 6, 6A and 6B, and sequence tables). In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs comprises a VH sequence and a VL sequence from the ECD2 binding arm of one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903, or v6717. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs comprises a VH sequence and a VL sequence from the ECD2 binding arm of one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717, and the other antigen binding polypeptide construct comprises the sequence VH and VL sequence from the ECD4-binding arm of one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717.
[00129] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательности CDR из ECD2-связывающего плеча одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательности CDR из ECD2-связывающего плеча одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция содержит последовательности CDR из ECD4-связывающего плеча одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717. [00129] In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs comprises CDR sequences from the ECD2 binding arm of one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903, or v6717. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs comprises CDR sequences from the ECD2 binding arm of one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717, and the other antigen binding polypeptide construct comprises CDR sequences from ECD4 -binding arm of one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717.
[00130] Специалист в данной области поймет, что может вводиться ограниченное количество аминокислотных замен в последовательности CDR или в последовательности VH или VL известных антител без того, чтобы антитело теряло свою способность связывать свою мишень. Потенциальные аминокислотные замены могут идентифицировать с помощью компьютерного моделирования или известными методами, такими как аланиновое сканирование, при этом полученные варианты проверяются на активность связывания с помощью стандартных методик. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкциях анти-HER2 бипаратопного антитела содержит набор CDR (т. е. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи), который обладает 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% идентичностью последовательностей с набором CDR из ECD2-связывающего плеча из одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем эта антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит вариант этих последовательностей CDR, содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен среди шести CDR (т. е. CDR могут быть модифицированы путем включения до 10 аминокислотных замен, при этом может быть модифицирована любая комбинация CDR), например от 1 до 7 аминокислотных замен, от 1 до 5 аминокислотных замен, от 1 до 4 аминокислотных замен, от 1 до 3 аминокислотных замен, от 1 до 2 аминокислотных замен или 1 аминокислотная замена среди CDR, причем вариант сохраняет способность связывать ECD2. Как правило, такие аминокислотные замены будут консервативными аминокислотными заменами. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкциях анти-HER2 бипаратопного антитела содержит набор CDR (т. е. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи), который обладает 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% идентичностью последовательностей с набором CDR из ECD2-связывающего плеча из антитела v10000, причем эта антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2.[00130] One skilled in the art will appreciate that a limited number of amino acid substitutions can be introduced into the CDR sequence or the VH or VL sequence of known antibodies without the antibody losing its ability to bind its target. Potential amino acid substitutions can be identified using computer modeling or known methods such as alanine scanning, and the resulting variants are tested for binding activity using standard techniques. Accordingly, in some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a set of CDRs ( i.e., heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3, and light chain CDR1, CDR2, and CDR3) that has 90% or greater 95 % or more, 98% or more, 99% or more, or 100% sequence identity with a set of CDRs from the ECD2-binding arm from one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903, or v6717, which antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD2. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs contains a variant of these CDR sequences containing from 1 to 10 amino acid substitutions among the six CDRs (i.e., the CDRs can be modified to include up to 10 amino acid substitutions, which may any combination of CDRs can be modified), for example, 1 to 7 amino acid substitutions, 1 to 5 amino acid substitutions, 1 to 4 amino acid substitutions, 1 to 3 amino acid substitutions, 1 to 2 amino acid substitutions, or 1 amino acid substitution among the CDRs, wherein the variant retains the ability to bind ECD2. Typically, such amino acid substitutions will be conservative amino acid substitutions. Accordingly, in some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a set of CDRs ( i.e., heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3, and light chain CDR1, CDR2, and CDR3) that has 90% or greater 95 % or more, 98% or more, 99% or more, or 100% sequence identity with a set of CDRs from the ECD2 binding arm of the v10000 antibody, wherein the antigen binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD2.
[00131] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VH, которая является на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичной последовательности VH из ECD2-связывающего плеча из одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VL, которая является на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичной последовательности VL из ECD2-связывающего плеча из одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2. [00131] In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a VH sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% identical VH sequences from the ECD2-binding arm from one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717, and the antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD2. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs contains a VL sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92 %, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% identical VL sequence from An ECD2-binding arm from one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717, wherein the antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD2.
[00132] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VH, которая является на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичной последовательности VH из ECD2-связывающего плеча из антитела v10000, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VL, которая является на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичной последовательности VL из ECD2-связывающего плеча из антитела v10000, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2. [00132] In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a VH sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% identical VH sequences from the ECD2-binding arm of the v10000 antibody, wherein the antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD2. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs contains a VL sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92 %, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% identical VL sequence from The ECD2-binding arm of the v10000 antibody, wherein the antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD2.
[00133] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкциях анти-HER2 бипаратопного антитела содержит набор CDR (т. е. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи), который обладает 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% идентичностью последовательностей с набором CDR из ECD4-связывающего плеча из одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем эта антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит вариант этих последовательностей CDR, содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен среди шести CDR (т. е. CDR могут быть модифицированы путем включения до 10 аминокислотных замен, при этом может быть модифицирована любая комбинация CDR), например от 1 до 7 аминокислотных замен, от 1 до 5 аминокислотных замен, от 1 до 4 аминокислотных замен, от 1 до 3 аминокислотных замен, от 1 до 2 аминокислотных замен или 1 аминокислотная замена среди CDR, причем вариант сохраняет способность связывать ECD4. Как правило, такие аминокислотные замены будут консервативными аминокислотными заменами. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкциях анти-HER2 бипаратопного антитела содержит набор CDR (т. е. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи), который обладает 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% идентичностью последовательностей с набором CDR из ECD4-связывающего плеча из антитела v10000, причем эта антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4.[00133] In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a set of CDRs ( i.e., heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3, and light chain CDR1, CDR2, and CDR3) that has 90% or more , 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% sequence identity with a set of CDRs from the ECD4-binding arm from one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717, which antigen-binding the polypeptide construct retains the ability to bind ECD4. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs contains a variant of these CDR sequences containing from 1 to 10 amino acid substitutions among the six CDRs (i.e., the CDRs can be modified to include up to 10 amino acid substitutions, which may any combination of CDRs can be modified), for example, 1 to 7 amino acid substitutions, 1 to 5 amino acid substitutions, 1 to 4 amino acid substitutions, 1 to 3 amino acid substitutions, 1 to 2 amino acid substitutions, or 1 amino acid substitution among the CDRs, wherein the variant retains the ability to bind ECD4. Typically, such amino acid substitutions will be conservative amino acid substitutions. Accordingly, in some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a set of CDRs ( i.e., heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3, and light chain CDR1, CDR2, and CDR3) that has 90% or greater 95 % or more, 98% or more, 99% or more, or 100% sequence identity with a set of CDRs from the ECD4 binding arm of antibody v10000, wherein the antigen binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD4.
[00134] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VH, которая является на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичной последовательности VH из ECD4-связывающего плеча из одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VL, которая является на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичной последовательности VL из ECD4-связывающего плеча из одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4. [00134] In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a VH sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% identical VH sequences from the ECD4-binding arm from one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717, and the antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD4. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs contains a VL sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92 %, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% identical VL sequence from An ECD4-binding arm from one of the antibodies v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 or v6717, wherein the antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD4.
[00135] В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VH, которая является на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичной последовательности VH из ECD4-связывающего плеча из антитела v10000, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VL, которая является на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичной последовательности VL из ECD4-связывающего плеча из антитела v10000, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4. [00135] In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a VH sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% identical VH sequences from the ECD4-binding arm of the v10000 antibody, wherein the antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD4. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs contains a VL sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92 %, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% identical VL sequence from The ECD4-binding arm of the v10000 antibody, wherein the antigen-binding polypeptide construct retains the ability to bind ECD4.
Таблица 6. Примеры анти-HER2 бипаратопных антителTable 6. Examples of anti-HER2 biparatope antibodies
LC: Y96AHC: T30A_A49G_L69F
LC:Y96A
LC: Q124RHC: L143E_K145T
LC:Q124R
LC: Q124E_Q160E_T180EHC: D146G_Q179K
LC: Q124E_Q160E_T180E
LC: Q124R_Q1160K_T178RHC: L143E_K145T
LC: Q124R_Q1160K_T178R
LC: Q124E_Q160E_T180EHC: D146G_Q179K
LC: Q124E_Q160E_T180E
* Нумерация Fab или вариабельного домена в соответствии с Кабатом (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91–3242, p.647, 1991)* Fab or variable domain numbering according to Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91–3242, p.647, 1991)
§ Нумерация CH3 в соответствии с индексом EU, как по Кабату (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78–85) § CH3 numbering according to the EU index, as per Kabat (Edelmanet al.,1969, PNAS USA, 63:78–85)
Таблица 6A. Последовательности CDR ECD2-связывающего плеча вариантов v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 и v6717Table 6A. CDR sequences of the ECD2 binding arm of variants v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 and v6717
Таблица 6B. Последовательности CDR ECD4-связывающего плеча вариантов v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 и v6717Table 6B. CDR sequences of the ECD4-binding arm variants v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 and v6717
[00136] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело представляет собой одно из бипаратопных антител, описанных в международной публикации патентной заявки № WO 2016/179707. В данной заявке описываются высокоаффинные варианты анти-HER2 антитела пертузумаб, включая бипаратопные антитела, содержащие последовательности из высокоаффинного варианта как один антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело представляет собой одно из v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 или v15085 (см. таблицы 7 и 7A, и таблицы последовательностей). В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VH и последовательность VL из ECD2-связывающего плеча одного из антител v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 или v15085. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательности CDR из ECD2-связывающего плеча одного из антител v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 или v15085. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательность VH и последовательность VL из ECD2-связывающего плеча одного из антител v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 или v15085, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция содержит последовательность VH и последовательность VL из трастузумаба. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций анти-HER2 бипаратопного антитела содержит последовательности CDR из ECD2-связывающего плеча одного из антител v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 или v15085, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция содержит последовательности CDR из трастузумаба.[00136] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody is one of the biparatope antibodies described in International Patent Application Publication No. WO 2016/179707. This application describes high-affinity variants of the anti-HER2 antibody pertuzumab, including biparatope antibodies containing sequences from the high-affinity variant as a single antigen-binding domain. In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody is one of v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084, or v15085 (see Tables 7 and 7A, and sequence tables). In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen-binding polypeptide constructs comprises a VH sequence and a VL sequence from the ECD2 binding arm of one of the antibodies v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084, or v15085. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs comprises CDR sequences from the ECD2 binding arm of one of the antibodies v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084, or v15085. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs comprises a VH sequence and a VL sequence from the ECD2 binding arm of one of the antibodies v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084, or v15085, and another antigen binding polypeptide construct contains the VH sequence and the VL sequence from trastuzumab. In some embodiments, one of the anti-HER2 biparatope antibody antigen binding polypeptide constructs comprises CDR sequences from the ECD2 binding arm of one of the antibodies v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 or v15085, and the other antigen binding polypeptide construct comprises CDR sequences from trastuzumab.
Таблица 7. Дополнительные примеры анти-HER2 бипаратопных антител Table 7. Additional examples of anti-HER2 biparatope antibodies
LC: Y96AHC: T30A
LC:Y96A
LC: Y49W_Y96GHC: T30Q
LC: Y49W_Y96G
LC: Y49W_Y96GHC: T30Q_K75W
LC: Y49W_Y96G
LC: Y49W_Y96GHC: T30Y_K75W
LC: Y49W_Y96G
LC: Y49WHC: T30Q_G56Y_S99W
LC:Y49W
LC: Y49W_Y96GHC: T30Q_G56Y
LC: Y49W_Y96G
* Нумерация Fab или вариабельного домена в соответствии с Кабатом (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91–3242, p.647, 1991)* Fab or variable domain numbering according to Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91–3242, p.647, 1991)
§ Нумерация CH3 в соответствии с индексом EU, как по Кабату (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78–85) § CH3 numbering according to the EU index, as per Kabat (Edelmanet al.,1969, PNAS USA, 63:78–85)
Таблица 7A. Последовательности CDR ECD2-связывающего плеча вариантов v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 и v15085Table 7A. CDR sequences of the ECD2-binding arm variants v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 and v15085
1508015080
Свойства анти-HER2 бипаратопных антителProperties of anti-HER2 biparatope antibodies
[00137] Конъюгация токсина при низком DAR имеет особое преимущество для анти-HER2 бипаратопных антител, которые проявляют повышенное связывание с HER2 и/или более высокую интернализацию в HER2-экспрессирующих клетках по сравнению с соответствующим бивалентным моноспецифическим антителом. Соответствующие бивалентные моноспецифические антитела могут включать в себя две из первых антигенсвязывающей полипептидных конструкций, или две из вторых антигенсвязывающих полипептидных конструкций, которые составляют бипаратопное антитело.[00137] Toxin conjugation at low DAR is of particular advantage for anti-HER2 biparatope antibodies, which exhibit increased binding to HER2 and/or higher internalization in HER2-expressing cells compared to the corresponding bivalent monospecific antibody. Suitable bivalent monospecific antibodies may include two of the first antigen-binding polypeptide constructs, or two of the second antigen-binding polypeptide constructs, that constitute the biparatope antibody.
[00138] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопные антитела проявляют повышенное связывание (т. е. связываются с более высокой аффинностью) с HER2 по сравнению с соответствующим бивалентным моноспецифическим антителом. Повышенное связывание может проявляться, например, путем уменьшения в константе диссоциации и/или увеличения в максимальном связывании. [00138] In some embodiments, anti-HER2 biparatope antibodies exhibit increased binding ( ie, bind with higher affinity) to HER2 compared to the corresponding bivalent monospecific antibody. Increased binding may manifest itself, for example, by a decrease in dissociation constant and/or an increase in maximum binding.
[00139] Константа диссоциации (KD) относится к равновесной константе диссоциации конкретного взаимодействия лиганд-белок, такого как взаимодействия антитела-антигена. Значение KD измеряет способность двух белков (например, AB) обратимо диссоциировать на меньшие компоненты (A+B), и определяется как соотношение скорости диссоциации (также называемой «off-rate» или koff) к скорости ассоциации (также называемой «on-rate» или kon). Таким образом, значение KD равняется koff/kon и выражается как молярная концентрация (M). Из этого следует, что чем меньше значение KD, тем больше аффинность связывания. Значения KD для антител могут определять с использованием методов, хорошо обоснованных в данной области техники. Примеры таких методов включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR), обычно применяющий биосенсорную систему, такую как систему Biacore®, и изотермическую титрационную калориметрию (ITC). [00139] Dissociation constant (K D ) refers to the equilibrium dissociation constant of a particular ligand-protein interaction, such as an antibody-antigen interaction. The K D value measures the ability of two proteins (eg AB) to reversibly dissociate into smaller components (A+B), and is defined as the ratio of the rate of dissociation (also called "off-rate" or k off ) to the rate of association (also called "on- rate" or k on ). Thus, the value of K D is equal to k off /k on and is expressed as molar concentration (M). It follows that the lower the K D value, the greater the binding affinity. K D values for antibodies can be determined using methods well established in the art. Examples of such methods include surface plasmon resonance (SPR), typically using a biosensing system such as the Biacore® system, and isothermal titration calorimetry (ITC).
[00140] Кажущая KD, или кажущаяся равновесная константа диссоциации, представляет концентрацию антитела, при которой наблюдается половинное максимальное связывание клеток. Кажущаяся KD является зависимым от условий эксперимента по связыванию клеток, таких как различные уровни рецептора, экспрессируемого на клетках, и условий инкубации, и поэтому кажущаяся KD, в целом, отличается от значений KD, определяемых в бесклеточных молекулярных экспериментах, таких как SPR и ITC. Тем не менее, обычно существует хорошее согласование между различными методами.[00140] The apparent K D , or apparent equilibrium dissociation constant, represents the concentration of antibody at which half maximum cell binding is observed. The apparent KD is dependent on the conditions of the cell binding experiment, such as different levels of receptor expressed on cells and incubation conditions, and therefore the apparent KD is generally different from the KD values determined in cell-free molecular experiments such as SPR and ITC. However, there is usually good agreement between the different methods.
[00141] Максимальный уровень связывания (или «Bmax») относится к максимальному уровню связывания антитела в клетках при насыщающих концентрациях антитела. Этот параметр может регистрироваться в произвольных единицах МИФ для относительных сравнений или преобразовываться в абсолютное значение, соответствующее количеству антител, связанных с клеткой с использованием стандартной кривой. [00141] The maximum binding level (or "Bmax") refers to the maximum level of binding of an antibody in cells at saturating concentrations of the antibody. This parameter can be reported in arbitrary MIF units for relative comparisons or converted to an absolute value corresponding to the amount of antibody bound to the cell using a standard curve.
[00142] Bmax или кажущуюся KD могут определять различными методиками. Один пример представляет собой измерение связывания с клетками, экспрессирующими целевой антиген, методом проточной цитометрии. Как правило, в таком эксперименте клетки, экспрессирующие целевые антигены, инкубируют с антителами при различных концентрациях, промывают, инкубируют со вторичным агентом для обнаружения антитела, промывают и анализируют в проточном цитометре для измерения медианной интенсивности флуоресценции (МИФ), представляющей собой силу сигнала детекции на клетках, которая, в свою очередь, связана с количеством антител, связанных с клетками. Зависимость концентрации антител по сравнению с Затем подбирают данные МИФ под уравнение насыщающего связывания для получения значения Bmax и кажущейся KD.[00142] Bmax or apparent K D can be determined by various techniques. One example is the measurement of binding to cells expressing the target antigen by flow cytometry. Typically, in such an experiment, cells expressing the target antigens are incubated with antibodies at various concentrations, washed, incubated with a secondary agent to detect the antibody, washed, and analyzed on a flow cytometer to measure median fluorescence intensity (MFI), which is the strength of the detection signal per cells, which in turn is related to the amount of antibodies associated with the cells. Dependence of antibody concentration compared to Then, the MIF data is fitted to the saturating binding equation to obtain the value of Bmax and apparent K D .
[00143] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело демонстрирует увеличение по Bmax по отношению к клетке-мишени, отображающей HER2, по сравнению с соответствующим эталонным антителом. Для анти-HER2 бипаратопного антитела, содержащего первую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию и вторую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, описанные в данном документе, соответствующее эталонное антитело должно быть бивалентным моноспецифическим антителом, которое содержит две из первых антигенсвязывающих полипептидных конструкций или две из вторых антигенсвязывающих полипептидных конструкций. В некоторых вариантах осуществления изобретения значение Bmax, определенное для анти-HER2 бипаратопного антитела, составляет по меньшей мере около 110% значения Bmax соответствующего эталонного антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения значение Bmax, определенное для анти-HER2 бипаратопного антитела, составляет по меньшей мере около 125% значения Bmax соответствующего эталонного антитела, например по меньшей мере около 150% значения Bmax соответствующего эталонного антитела, или по меньшей мере около 200% значения Bmax соответствующего эталонного антитела.[00143] In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody exhibits an increase in Bmax relative to the HER2-displaying target cell compared to the corresponding reference antibody. For an anti-HER2 biparatopic antibody comprising a first antigen binding polypeptide construct and a second antigen binding polypeptide construct described herein, the corresponding reference antibody would be a bivalent monospecific antibody that contains two of the first antigen binding polypeptide constructs or two of the second antigen binding polypeptide constructs. In some embodiments, the Bmax value determined for the anti-HER2 biparatope antibody is at least about 110% of the Bmax value of the corresponding reference antibody. In some embodiments, the Bmax value determined for the anti-HER2 biparatope antibody is at least about 125% of the Bmax value of the corresponding reference antibody, such as at least about 150% of the Bmax value of the corresponding reference antibody, or at least about 200% of the Bmax value of the corresponding reference antibody. Bmax of the corresponding reference antibody.
[00144] В некоторых вариантах осуществления изобретения значение Bmax, определенное для анти-HER2 бипаратопного антитела, составляет по меньшей мере 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9 или 2,0 значения Bmax соответствующего эталонного антитела.[00144] In some embodiments, the Bmax value determined for the anti-HER2 biparatope antibody is at least 1.1; 1.2; 1.3; 1.4; 1.5; 1.6; 1.7; 1.8; 1.9 or 2.0 Bmax value of the corresponding reference antibody.
[00145] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопные антитела проявляют более высокую интернализацию внутрь экспрессирующих HER2 клеток, чем соответствующее эталонное бивалентное моноспецифическое антитело. Анти-HER2 бипаратопные антитела интернализируются в HER2+ клетки посредством связывания с рецептором HER2. Анти-HER2 бипаратопные антитела, таким образом, могут считаться способными индуцировать рецепторную интернализацию в HER2+ клетки. [00145] In some embodiments, anti-HER2 biparatopic antibodies exhibit higher internalization into HER2-expressing cells than the corresponding reference bivalent monospecific antibody. Anti-HER2 biparatope antibodies are internalized into HER2+ cells through binding to the HER2 receptor. Anti-HER2 biparatopic antibodies can thus be considered capable of inducing receptor internalization into HER2+ cells.
[00146] Интернализацию антител могут измерять с использованием известных в данной области техники методов, например путем метода прямой интернализации в соответствии с протоколом, подробно описанным в Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879–1890 (2008). Как известно в данной области техники, раковые клетки могут экспрессировать HER2 на различных уровнях. Одним методом классификации экспрессирующих HER2 клеток являются обозначения HER2 1+, 2+ или 3+ (низкая, средняя и высокая экспрессия, соответственно). В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело проявляет более высокую интернализацию, чем соответствующее эталонное бивалентное моноспецифическое антитело, в экспрессирующие HER2 на уровне 3+ клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело проявляет более высокую интернализацию, чем соответствующее эталонное бивалентное моноспецифическое антитело, в экспрессирующие HER2 на уровне 2+ клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-HER2 бипаратопное антитело проявляет более высокую интернализацию, чем соответствующее эталонное бивалентное моноспецифическое антитело, в экспрессирующие HER2 на уровне 1+ клетки. Примеры клеточных линий, экспрессирующих различные уровни HER2, описаны более подробно ниже.[00146] Antibody internalization can be measured using methods known in the art, for example, by the direct internalization method according to the protocol described in detail in Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879–1890 (2008). As is known in the art, cancer cells can express HER2 at various levels. One method of classifying HER2-expressing cells is to designate HER2 1+, 2+, or 3+ (low, intermediate, and high expression, respectively). In some embodiments, the anti-HER2 biparatopic antibody exhibits higher internalization than the corresponding reference bivalent monospecific antibody into HER2-expressing 3+ cells. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody exhibits higher internalization than the corresponding reference bivalent monospecific antibody into HER2-expressing 2+ cells. In some embodiments, the anti-HER2 biparatope antibody exhibits higher internalization than the corresponding reference bivalent monospecific antibody into HER2 1+ expressing cells. Examples of cell lines expressing various levels of HER2 are described in more detail below.
[00147] В контексте настоящего описания считается, что анти-HER2 бипаратопное антитело демонстрирует более высокую интернализацию в HER2-экспрессирующие клетки, чем соответствующее эталонное бивалентное моноспецифическое антитело, когда количество анти-HER2 бипаратопного антитела, интернализированного в HER2-экспрессирующие клетки, оказывается по меньшей мере в 1,2 раза больше, чем количество эталонного бивалентного моноспецифического антитела, интернализированного в те же самые HER2-экспрессирующие клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество интернализированного антитела определяют методом прямой интернализации в соответствии с протоколом, подробно описанным в Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879–1890 (2008). В некоторых вариантах осуществления изобретения количество интернализированного антитела определяют в HER2-экспрессирующих клетках, которые экспрессируют HER2 на уровне 2+. [00147] As used herein, an anti-HER2 biparatope antibody is considered to exhibit higher internalization into HER2-expressing cells than the corresponding reference bivalent monospecific antibody when the amount of anti-HER2 biparatope antibody internalized into HER2-expressing cells is less at least 1.2 times greater than the amount of reference bivalent monospecific antibody internalized into the same HER2-expressing cells. In some embodiments, the amount of internalized antibody is determined by the direct internalization method according to the protocol described in detail in Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879–1890 (2008). In some embodiments, the amount of internalized antibody is determined in HER2-expressing cells that express HER2 at a level of 2+.
[00148] В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что анти-HER2 бипаратопное антитело демонстрирует более высокую интернализацию в HER2-экспрессирующие клетки, чем соответствующее эталонное бивалентное моноспецифическое антитело, когда количество анти-HER2 бипаратопного антитела, интернализированного в HER2-экспрессирующие клетки, оказывается по меньшей мере в 1,3 раза больше, чем количество эталонного бивалентного моноспецифического антитела, интернализированного в те же самые HER2-экспрессирующие клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что анти-HER2 бипаратопное антитело демонстрирует более высокую интернализацию в HER2-экспрессирующие клетки, чем соответствующее эталонное бивалентное моноспецифическое антитело, когда количество анти-HER2 бипаратопного антитела, интернализированного в HER2-экспрессирующие клетки, оказывается по меньшей мере в 1,4 раза больше, например по меньшей мере в 1,5 раз больше, по меньшей мере в 1,6 раз больше, по меньшей мере в 1,7 раз больше, по меньшей мере в 1,8 раз больше, по меньшей мере в 1,9 раз больше или по меньшей мере в 2,0 раз больше, чем количество эталонного бивалентного моноспецифического антитела, интернализированного в те же самые HER2-экспрессирующие клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество интернализированного антитела определяют методом прямой интернализации в соответствии с протоколом, подробно описанным в Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879–1890 (2008). В некоторых вариантах осуществления изобретения количество интернализированного антитела определяют в HER2-экспрессирующих клетках, которые экспрессируют HER2 на уровне 2+.[00148] In some embodiments, an anti-HER2 biparatope antibody is considered to exhibit higher internalization into HER2-expressing cells than the corresponding reference bivalent monospecific antibody when the amount of anti-HER2 biparatope antibody internalized into HER2-expressing cells is at least 1.3 times greater than the amount of reference bivalent monospecific antibody internalized into the same HER2-expressing cells. In some embodiments, an anti-HER2 biparatope antibody is considered to exhibit higher internalization into HER2-expressing cells than the corresponding reference bivalent monospecific antibody when the amount of anti-HER2 biparatope antibody internalized into HER2-expressing cells is at least 1.4 times greater, e.g. at least 1.5 times greater, at least 1.6 times greater, at least 1.7 times greater, at least 1.8 times greater, at least 1.9-fold greater or at least 2.0-fold greater than the amount of the reference bivalent monospecific antibody internalized into the same HER2-expressing cells. In some embodiments, the amount of internalized antibody is determined by the direct internalization method according to the protocol described in detail in Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879–1890 (2008). In some embodiments, the amount of internalized antibody is determined in HER2-expressing cells that express HER2 at a level of 2+.
Аналоги ауристатинаAuristatin analogues
[00149] Описанные в данном документе ADC включают в себя токсин на основе ауристатина (или «аналог ауристатина»). Различные аналоги ауристатина хорошо известны в данной области техники. Примеры включают, но не ограничиваются ими, монометилауристатин F (MMAF), монометилауристатин E (MMAE), ауристатин EB (AEB), ауристатин EVB (AEVB) и ауристатин F фенилендиамин (AFP). Синтез и структура различных ауристатиновых аналогов описаны в патентах США № 6,884,869; 7,098,308; 7,256,257 и 7,498,298.[00149] The ADCs described herein include an auristatin-based toxin (or “auristatin analogue”). Various analogues of auristatin are well known in the art. Examples include, but are not limited to, monomethyl auristatin F (MMAF), monomethyl auristatin E (MMAE), auristatin EB (AEB), auristatin EVB (AEVB), and auristatin F phenylenediamine (AFP). The synthesis and structure of various auristatin analogues are described in US Pat. No. 6,884,869; 7,098,308; 7,256,257 and 7,498,298.
[00150] В некоторых вариантах осуществления изобретения аналог ауристатина, включенный в ADC, описанные в данном документе, может представлять собой аналог ауристатина, описанный в международной публикации патентной заявки № WO 2016/041082. В некоторых вариантах осуществления изобретения аналог ауристатина, который содержат ADC, описанные в данном документе, представляет собой соединение общей формулы (I):[00150] In some embodiments, the auristatin analog included in the ADCs described herein may be an auristatin analog described in International Patent Application Publication No. WO 2016/041082. In some embodiments, the auristatin analogue that the ADCs described herein contain is a compound of general formula ( I ):
(I)( I )
где:Where:
X представляет собой -C(O)NHCH(CH2R2)-, или X отсутствует;X is -C(O)NHCH(CH 2 R 2 )-, or X is absent;
R1 выбран из:R 1 selected from:
и , и And , And
R2 представляет собой фенил.R 2 represents phenyl.
[00151] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях общей формулы (I), R1 выбран из:[00151] In some embodiments, in compounds of general formula ( I ), R 1 is selected from:
и . And .
[00152] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях общей формулы (I) отсутствует X.[00152] In some embodiments, compounds of general formula ( I ) lack X.
[00153] В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение общей формулы (I) представлено общей формулой(IV):[00153] In some embodiments, a compound of general formula ( I ) is represented by general formula ( IV ):
(IV)( IV )
где R1 является таким, как определено для общей формулы (I).where R 1 is as defined for the general formula ( I ).
[00154] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях формулы (IV), R1 выбран из:[00154] In some embodiments, in compounds of formula ( IV ), R 1 is selected from:
и . And .
[00155] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях формулы (IV), R1 представляет собой:[00155] In some embodiments, in compounds of formula ( IV ), R 1 is:
или . or .
[00156] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях формулы (IV), R1 представляет собой:[00156] In some embodiments, in compounds of formula ( IV ), R 1 is:
. .
[00157] В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение общей формулы (I) представлено общей формулой(V):[00157] In some embodiments, a compound of general formula ( I ) is represented by general formula ( V ):
(V)( V )
где R1 является таким, как определено для общей формулы (I).where R 1 is as defined for the general formula ( I ).
[00158] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях формулы (V), R1 выбран из:[00158] In some embodiments, in compounds of formula ( V ), R 1 is selected from:
и . And .
[00159] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях формулы (V), R1 представляет собой:[00159] In some embodiments, in compounds of formula ( V ), R 1 is:
или . or .
[00160] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях формулы (V), R1 представляет собой:[00160] In some embodiments, in compounds of formula ( V ), R 1 is:
. .
[00161] Соединения общей формулы (I) могут получать по протоколам стандартного синтеза органической химии из коммерчески доступных исходных веществ. Типовые способы предложены в международной публикации патентной заявки № WO 2016/041082 и в ниже в разделе примеров. [00161] Compounds of general formula ( I ) can be prepared using standard organic chemistry synthesis protocols from commercially available starting materials. Typical methods are proposed in the international patent application publication No. WO 2016/041082 and in the examples section below.
[00162] Должно быть понятно, что ссылка на соединения общей формулы (I) во всей остальной части этого описания включает, в различных вариантах осуществления, соединения общей формулы (IV) и (V), в той же степени, как если бы варианты осуществления, упоминающие каждую из этих формул отдельно, цитировались специально.[00162] It should be understood that reference to compounds of general formula ( I ) throughout the remainder of this specification includes, in various embodiments, compounds of general formula ( IV ) and ( V ), to the same extent as if embodiments , mentioning each of these formulas separately, were cited specifically.
[00163] В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC по настоящему описанию содержит анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с аналогом ауристатина (токсин) посредством линкера (L), в котором линкер-токсин имеет общую формулу (II):[00163] In some embodiments, the ADC of the present disclosure comprises an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to an auristatin analogue (toxin) via a linker (L), wherein the linker-toxin has the general formula ( II ):
(II)( II )
где:Where:
X представляет собой -C(O)NHCH(CH2R2)-, или X отсутствует;X is -C(O)NHCH(CH 2 R 2 )-, or X is absent;
R1 выбран из:R 1 selected from:
и ; And ;
R2 представляет собой фенил;R 2 represents phenyl;
L представляет собой линкер, иL is a linker, and
представляет точку присоединения линкер-токсина к анти-HER2 бипаратопному антителу. represents the point of attachment of the linker toxin to the anti-HER2 biparatope antibody.
[00164] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (II), R1 выбран из:[00164] In some embodiments, in a linker toxin of general formula ( II ), R 1 is selected from:
и . And .
[00165] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (II) отсутствует X.[00165] In some embodiments, the linker toxin of general formula ( II ) lacks X.
[00166] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (II) L представляет собой расщепляемый линкер.[00166] In some embodiments, in the linker toxin of general formula ( II ), L is a cleavable linker.
[00167] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (II) L представляет собой пептид-содержащий линкер. [00167] In some embodiments, in a linker toxin of general formula ( II ), L is a peptide-containing linker.
[00168] В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер-токсин общей формулы (II) представлено общей формулой(X):[00168] In some embodiments, the linker toxin of general formula ( II ) is represented by general formula ( X ):
(X)( X )
где R1, L и являются такими, как определено выше для общей формулы (II).where R 1 , L and are as defined above for the general formula ( II ).
[00169] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (X), R1 выбран из:[00169] In some embodiments, in a linker toxin of general formula ( X ), R 1 is selected from:
и . And .
[00170] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (X), R1 представляет собой:[00170] In some embodiments, in a linker toxin of general formula ( X ), R 1 is:
или . or .
[00171] В некоторых вариантах осуществления изобретения в соединениях формулы (X), R1 представляет собой:[00171] In some embodiments, in compounds of formula ( X ), R 1 is:
. .
[00172] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (X) L представляет собой расщепляемый линкер.[00172] In some embodiments, in a linker toxin of general formula ( X ), L is a cleavable linker.
[00173] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (X) L представляет собой пептид-содержащий линкер. [00173] In some embodiments, in a linker toxin of general formula ( X ), L is a peptide-containing linker.
[00174] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (X) L представляет собой протеазорасщепляемый линкер. [00174] In some embodiments, in the linker toxin of general formula ( X ), L is a protease cleavable linker.
[00175] В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер-токсин общей формулы (II) представлено общей формулой(XI):[00175] In some embodiments, the linker toxin of general formula ( II ) is represented by general formula ( XI ):
(XI)( XI )
где R1, L и являются такими, как определено выше для общей формулы (II).where R 1 , L and are as defined above for the general formula ( II ).
[00176] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (XI), R1 выбран из:[00176] In some embodiments, in a linker toxin of general formula ( XI ), R 1 is selected from:
и . And .
[00177] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (XI), R1 представляет собой:[00177] In some embodiments, in the linker toxin of general formula ( XI ), R 1 is:
или . or .
[00178] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (XI), R1 представляет собой:[00178] In some embodiments, in the linker toxin of general formula ( XI ), R 1 is:
. .
[00179] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (XI) L представляет собой расщепляемый линкер.[00179] In some embodiments, in the linker toxin of general formula ( XI ), L is a cleavable linker.
[00180] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (XI) L представляет собой пептид-содержащий линкер. [00180] In some embodiments, in a linker toxin of general formula ( XI ), L is a peptide-containing linker.
[00181] В некоторых вариантах осуществления изобретения в линкер-токсине общей формулы (XI) L представляет собой протеазорасщепляемый линкер. [00181] In some embodiments, in the linker toxin of general formula ( XI ), L is a protease cleavable linker.
[00182] В данном документе также подразумеваются ADC, содержащие анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с линкер-токсином общей формулы (II), формулы (X) или формулы (XI), в которых линкер имеет общую формулу (VIII) или (IX), как показано ниже.[00182] Also intended herein are ADCs comprising an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to a linker toxin of general formula ( II ), formula ( X ), or formula ( XI ) wherein the linker has general formula ( VIII ) or ( IX) ) as shown below.
[00183] В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC содержит линкер-токсин со структурой:[00183] In some embodiments, the ADC contains a linker toxin with the structure:
, ,
где A-S- представляет собой точку присоединения к анти-HER2 бипаратопному антителу.where A-S- represents the point of attachment to the anti-HER2 biparatope antibody.
[00184] В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC по настоящему описанию, содержащее анти-HER2 бипаратопное антитело, конъюгированное с аналогом ауристатина (токсин) посредством линкера (L), имеет общую формулу (III):[00184] In some embodiments, the ADC of the present disclosure comprising an anti-HER2 biparatope antibody conjugated to an auristatin analogue (toxin) via a linker (L) has the general formula ( III ):
(III)(III)
где X и R1 являются такими, как определено для общей формулы (II);where X and R 1 are as defined for the general formula ( II );
L представляет собой линкер;L represents a linker;
n представляет собой среднее соотношение лекарственное вещество-к-антителу (DAR), и оно составляет менее 3,9; и n is the average drug-to-antibody ratio (DAR) and is less than 3.9; And
Ab представляет собой анти-HER2 бипаратопное антитело.Ab is an anti-HER2 biparatope antibody.
[00185] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III), R1 выбран из:[00185] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), R 1 is selected from:
и . And .
[00186] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) отсутствует X.[00186] In some embodiments, the ADC of general formula ( III ) lacks X.
[00187] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III), R1 представляет собой:[00187] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), R 1 is:
или , и or , And
отсутствует X.X is missing.
[00188] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III), R1 представляет собой:[00188] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), R 1 is:
, и , And
отсутствует X.X is missing.
[00189] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) X представляет собой -C(O)NHCH(CH2R2)-.[00189] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), X is -C(O)NHCH(CH 2 R 2 )-.
[00190] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III), R1 представляет собой:[00190] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), R 1 is:
или , и or , And
X представляет собой -C(O)NHCH(CH2R2)-.X represents -C(O)NHCH(CH 2 R 2 )-.
[00191] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III), R1 представляет собой:[00191] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), R 1 is:
, и , And
X представляет собой -C(O)NHCH(CH2R2)-.X represents -C(O)NHCH(CH 2 R 2 )-.
[00192] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) L представляет собой расщепляемый линкер.[00192] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), L is a cleavable linker.
[00193] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) L представляет собой пептид-содержащий линкер. [00193] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), L is a peptide-containing linker.
[00194] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) L представляет собой протеазорасщепляемый линкер. [00194] In some embodiments, in an ADC of general formula ( III ), L is a protease cleavable linker.
[00195] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) значение n составляет от 0,5 до 3,8. [00195] In some embodiments of the invention, the ADC of general formula ( III ) has an n value from 0.5 to 3.8.
[00196] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) значение n составляет от 0,7 до 3,8; от 0,7 до 3,5; от 0,7 до 3,0 или от 0,7 до 2,5. [00196] In some embodiments, the ADC of general formula ( III ) has an n value of from 0.7 to 3.8; from 0.7 to 3.5; from 0.7 to 3.0 or from 0.7 to 2.5.
[00197] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) значение n составляет от 1,0 до 3,8; от 1,0 до 3,5; от 1,0 до 3,0 или от 1,0 до 2,5. [00197] In some embodiments, the ADC of general formula ( III ) has a value of n ranging from 1.0 to 3.8; from 1.0 to 3.5; from 1.0 to 3.0 or from 1.0 to 2.5.
[00198] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) значение n составляет от 1,5 до 3,8; от 1,5 до 3,5; от 1,5 до 3,0 или от 1,5 до 2,5.[00198] In some embodiments, the ADC of general formula ( III ) has a value of n ranging from 1.5 to 3.8; from 1.5 to 3.5; from 1.5 to 3.0 or from 1.5 to 2.5.
[00199] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) значение n составляет от 1,6 до 3,8; от 1,6 до 3,5; от 1,6 до 3,0 или от 1,6 до 2,5. [00199] In some embodiments, the ADC of general formula ( III ) has a value of n ranging from 1.6 to 3.8; from 1.6 to 3.5; from 1.6 to 3.0 or from 1.6 to 2.5.
[00200] В некоторых вариантах осуществления изобретения в ADC общей формулы (III) значение n составляет от 1,8 до 2,8 или от 1,8 до 2,5.[00200] In some embodiments, the ADC of general formula ( III ) has an n value of 1.8 to 2.8 or 1.8 to 2.5.
[00201] Подразумеваются также комбинации любого из предыдущих вариантов осуществления для соединений общей формулы (III), и каждая комбинация образует отдельный вариант для целей настоящего раскрытия.[00201] Combinations of any of the previous embodiments for compounds of general formula ( III ) are also contemplated, and each combination constitutes a separate embodiment for the purposes of the present disclosure.
ЛинкерыLinkers
[00202] В описанных в данном документе ADC анти-HER2 бипаратопное антитело связано линкером с аналогом ауристатина (токсин). Линкеры являются бифункциональными или мультифункциональными фрагментами, способными связывать одну или более молекул токсина с антителом. Линкер может быть бифункциональным (или моновалентным), так что он связывает одно лекарственное вещество с одним сайтом на антителе, или он может быть мультифункциональным (или поливалентным), так что он связывает более одной молекулы токсина с одним сайтом на антителе. Линкеры, способные связать одну молекулу токсина с более чем одним сайтом на антителе, также могут считаться мультифункциональными.[00202] In the ADCs described herein, the anti-HER2 biparatope antibody is linked by a linker to an auristatin analogue (toxin). Linkers are bifunctional or multifunctional moieties capable of linking one or more toxin molecules to an antibody. The linker may be bifunctional (or monovalent), so that it binds one drug to one site on the antibody, or it may be multifunctional (or multivalent), so that it binds more than one toxin molecule to one site on the antibody. Linkers capable of binding one toxin molecule to more than one site on an antibody can also be considered multifunctional.
[00203] Присоединение линкера с антителом могут выполнять различными путями, такими как посредством поверхностных лизинов на антителе, восстановительного сочетания с окисленными углеводами на антителе, или посредством цистеиновых остатков на антителе, освобожденных с помощью восстановления межцепных дисульфидных связей. В альтернативном варианте для обеспечения сайт-специфической конъюгации присоединение линкера к антителу могут достигать модификацией антитела таким образом, чтобы включать дополнительные цистеиновые остатки (см., например, патенты США № 7,521,541; 8,455,622 и 9,000,130) или не встречающиеся в природе аминокислоты, которые предоставляют реакционноспособные группы прикрепления, такие как селенометионин, п-ацетилфенилаланин, формилглицин или п-азидометил-L-фенилаланин (см., например, Hofer et al., Biochemistry, 48:12047–12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101–16106 (2012); Wu et al., PNAS, 106:3000–3005 (2009); Zimmerman et al., Bioconj. Chem., 25:351–361 (2014)). [00203] Attachment of a linker to an antibody can be accomplished in a variety of ways, such as through surface lysines on the antibody, reductive coupling with oxidized carbohydrates on the antibody, or through cysteine residues on the antibody released by reduction of interchain disulfide bonds. Alternatively, to provide site-specific conjugation, attachment of a linker to an antibody can be achieved by modifying the antibody to include additional cysteine residues (see, for example, US Pat. Nos. 7,521,541; 8,455,622 and 9,000,130) or non-naturally occurring amino acids that provide reactive attachment groups such as selenomethionine, p-acetylphenylalanine, formylglycine or p-azidomethyl-L-phenylalanine (see, for example, Hofer et al., Biochemistry, 48:12047–12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109 :16101–16106 (2012); Wu et al ., PNAS, 106:3000–3005 (2009); Zimmerman et al ., Bioconj. Chem., 25:351–361 (2014)).
[00204] Линкеры включают в себя функциональную группу, способную взаимодействовать с целевой группой или группой на антителе, и одну или более функциональных групп, способных взаимодействовать с целевой группой на токсине. Подходящие функциональные группы известны в данной области техники и включают те, которые описаны, например, в Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press). [00204] Linkers include a functional group capable of interacting with a target group or group on an antibody, and one or more functional groups capable of interacting with a target group on a toxin. Suitable functional groups are known in the art and include those described, for example, in Bioconjugate Techniques (GT Hermanson, 2013, Academic Press).
[00205] К неограничивающим примерам функциональных групп для взаимодействия со свободными цистеинами или тиолами относятся малеимид, галогенацетамид, галогенацетил, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидные сложные эфиры, 4-нитрофенильные сложные эфиры, пентафторфенильные сложные эфиры, тетрафторфенильные сложные эфиры, ангидриды, хлорангидриды кислот, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. В этом контексте также подходящими являются «самостабилизирующие» малеимиды, описанные в Lyon et al., Nat. Biotechnol., 32:1059–1062 (2014). [00205] Non-limiting examples of functional groups for reacting with free cysteines or thiols include maleimide, haloacetamide, haloacetyl, activated esters such as succinimide esters, 4-nitrophenyl esters, pentafluorophenyl esters, tetrafluorophenyl esters, anhydrides, acid chlorides , sulfonyl chlorides, isocyanates and isothiocyanates. Also suitable in this context are the "self-stabilizing" maleimides described in Lyon et al ., Nat. Biotechnol., 32:1059–1062 (2014).
[00206] К неограничивающим примерам функциональных групп для взаимодействия с поверхностными лизинами на антителе и свободными аминами на токсине, относятся активированные сложные эфиры, такие как N-гидроксисукцинамидные сложные эфиры (NHS), сульфо-NHS сложные эфиры, имидные сложные эфиры, такие как реагент Траута, изотиоцианаты, альдегиды и ангидриды кислот, такие как ангидрид диэтиленетриаминпентауксусной кислоты (DTPA). Другие примеры включают в себя сукцинимидо-1,1,3,3-тетра-метилурония тетрафторбората (TSTU) и бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфат (PyBOP). [00206] Non-limiting examples of functional groups for interaction with surface lysines on the antibody and free amines on the toxin include activated esters such as N-hydroxysuccinamide esters (NHS), sulfo-NHS esters, imide esters such as reagent Trout, isothiocyanates, aldehydes and acid anhydrides such as diethylenetriaminepentaacetic acid anhydride (DTPA). Other examples include succinimido-1,1,3,3-tetra-methyluronium tetrafluoroborate (TSTU) and benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP).
[00207] Неограничивающие примеры функциональных групп, способных взаимодействовать с электрофильной группой на антителе или токсине (такой как, альдегидная или кетон-карбонильная группа), включают в себя гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, карбоксилат гидразина и арилгидразид. [00207] Non-limiting examples of functional groups capable of reacting with an electrophilic group on an antibody or toxin (such as an aldehyde or ketone carbonyl group) include hydrazide, oxime, amino, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazine carboxylate, and arylhydrazide.
[00208] Другие линкеры включают в себя те, которые имеют функциональную группу, позволяющую соединять два межцепных цистеина на антителе, такую как линкер ThioBridgeTM (Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25:1124–1136 (2014)), дитиомалеимидный (DTM) линкер (Behrens et al., Mol. Pharm., 12:3986–3998 (2015)), линкер на основе дитиоарил(TCEP)пиридазиндиона (Lee et al., Chem. Sci., 7:799-802 (2016)), линкер на основе дибромпиридазиндион (Maruani et al., Nat. Commun., 6:6645 (2015)) и другие известные в данной области техники линкеры.[00208] Other linkers include those that have a moiety that allows two interchain cysteines to be linked on an antibody, such as the ThioBridge ™ linker (Badescu et al ., Bioconjug. Chem., 25:1124–1136 (2014)), dithiomaleimide (DTM) linker (Behrens et al ., Mol. Pharm., 12:3986–3998 (2015)), dithioaryl(TCEP)pyridazinedione linker (Lee et al., Chem. Sci., 7:799-802 ( 2016)), a dibromopyridazinedione linker (Maruani et al ., Nat. Commun., 6:6645 (2015)), and other linkers known in the art.
[00209] Линкер может содержать один или более линкерных компонентов. Как правило, линкер будет содержать два или более линкерных компонентов. Примеры линкерных компонентов включают функциональные группы для проведения реакции с антителом, функциональными группами для проведения реакции с токсином, удлиняющими вставками, пептидными компонентами, саморасщепляющимися группами, само-удаляющимися группами, гидрофильными фрагментами и т. п. Различные линкерные компоненты известны в данной области техники, некоторые из них описаны ниже. [00209] The linker may contain one or more linker components. Typically, the linker will contain two or more linker components. Examples of linker components include antibody-reactive functional groups, toxin-reactive functional groups, extension inserts, peptide components, self-cleaving groups, self-removing groups, hydrophilic moieties, etc. Various linker components are known in the art, some of them are described below.
[00210] Определенные подходящие линкерные компоненты могут получать у различных коммерческих поставщиков, таких как Pierce Biotechnology, Inc. (сейчас Thermo Fisher Scientific, г. Уолтем, штат Массачусетс, США) и Molecular Biosciences Inc. (г. Боулдер, штат Колорадо, США) или могут синтезировать в соответствии с процедурами, описанными в данной области техники (см., например, Toki et al., J. Org. Chem., 67:1866–1872 (2002); Dubowchik, et al., Tetrahedron Letters, 38:5257–60 (1997); Walker, M. A., J. Org. Chem., 60:5352–5355 (1995); Frisch, et al., Bioconjugate Chem., 7:180–186 (1996); патент США № 6,214,345 и 7,553,816, и международную публикацию патентной заявки № WO 02/088172). [00210] Certain suitable linker components can be obtained from various commercial suppliers, such as Pierce Biotechnology, Inc. (now Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) and Molecular Biosciences Inc. (Boulder, Colorado, USA) or can be synthesized according to procedures described in the art (see, for example, Toki et al., J. Org. Chem., 67:1866–1872 (2002); Dubowchik, et al ., Tetrahedron Letters, 38:5257–60 (1997); Walker, M. A., J. Org. Chem., 60:5352–5355 (1995); Frisch, et al., Bioconjugate Chem., 7: 180–186 (1996); US Patent Nos. 6,214,345 and 7,553,816, and International Patent Application Publication No. WO 02/088172).
[00211] Примеры линкерных компонентов включают, но не ограничиваются ими, N-(β-малеимидпропилокси)-N-гидрокси сукцинимидный сложный эфир (BMPS), N-(ε-малеимидкапроилокси) сукцинимидный сложный эфир (EMCS), N-[γ-малеимидбутирилокси]сукцинимидный сложный эфир (GMBS), 1,6-гесан-бис-винилсульфон (HBVS), сукцинимидил 4-(N-малеимидметил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат) (LC-SMCC), м-малеимидбензоил-N-гидроксисукцинимидный сложный эфир (MBS), гидразид 4-(4-N-малеимидфенил)масляной кислоты (MPBH), сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (SBAP), сукцинимидил йодацетат (SIA), сукцинимидил (4-йодацетил)аминобензоат (STAB), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP), сукцинимидил 4-(N-малеимидметил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), сукцинимидил 4-(п-малеимидфенил)бутират (SMPB), сукцинимидил 6-[(β-малеимидпропионамидо)гексаноат] (SMPH), иминотиолан (IT), сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, сульфо-SMPB и сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат (SVSB). [00211] Examples of linker components include, but are not limited to, N-(β-maleimidepropyloxy)-N-hydroxy succinimide ester (BMPS), N-(ε-maleimidecaproyloxy) succinimide ester (EMCS), N-[γ- maleimidebutyryloxy]succinimide ester (GMBS), 1,6-hesan-bis-vinylsulfone (HBVS), succinimidyl 4-(N-maleimidemethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate) (LC-SMCC), m-maleimidebenzoyl -N-hydroxysuccinimide ester (MBS), 4-(4-N-maleimidephenyl)butyric acid hydrazide (MPBH), succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate (SBAP), succinimidyl iodoacetate (SIA), succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate (STAB), N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP), N-succinimidyl-4-(2-pyridyldithio)pentanoate (SPP), succinimidyl 4-(N-maleimidemethyl)cyclohexane-1-carboxylate ( SMCC), succinimidyl 4-(p-maleimidephenyl)butyrate (SMPB), succinimidyl 6-[(β-maleimidepropionamido)hexanoate] (SMPH), iminothiolane (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo- MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB and succinimidyl (4-vinyl sulfone) benzoate (SVSB).
[00212] Дополнительные примеры включают такие бис-малеимидные реагенты, как дитиобисмалеимидэтан (DTME), бис-малеимид-триоксиэтилен гликоль (BMPEO), 1,4-бисмалеимидбутан (BMB), 1,4-бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутан (BMDB), бисмалеимидгексан (BMH), бисмалеимидэтан (BMOE), BM(PEG)2 и BM(PEG)3; бифункциональные производные сложных имидоэфиров (например, диметил адипимидат HCl), активные сложные эфиры (например, дисукцинимидил суберат), альдегиды (например, глутаральдегид), бис-азидные соединения (например, бис-(п-азидобензоил) гександиамин), бис-диазониевые производные (например, бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (например, толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фтор-соединения (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).[00212] Additional examples include bis-maleimide reagents such as dithiobismaleimide ethane (DTME), bis-maleimide-trioxyethylene glycol (BMPEO), 1,4-bismaleimidebutane (BMB), 1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane (BMDB ), bismaleimidehexane (BMH), bismaleimidoethane (BMOE), BM(PEG) 2 and BM(PEG) 3 ; bifunctional imidoester derivatives (e.g. dimethyl adipimidate HCl), active esters (e.g. disuccinimidyl suberate), aldehydes (e.g. glutaraldehyde), bis-azide compounds (e.g. bis-(p-azidobenzoyl)hexanediamine), bis-diazonium derivatives (eg bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylenediamine), diisocyanates (eg toluene-2,6-diisocyanate) and bis-active fluorine compounds (eg 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene).
[00213] Подходящие линкеры, как правило, более химически устойчивые в условиях за пределами клетки, чем к условиям внутри клетки, хотя в определенных ситуациях могут предусматривать менее устойчивые линкеры, например когда токсин является селективным или нацеленным и имеет низкую токсичность к нормальным клеткам. Линкеры могут представлять собой «расщепляемые линкеры» или «нерасщепляемые линкеры». Расщепляемый линкер, как правило, чувствительный к расщеплению во внутриклеточных условиях, например посредством лизосомных процессов. Примеры включают линкеры, которые являются протеазочувствительными, кислоточувствительными, чувствительными к восстанавливающим условиях или фотолабильными. Нерасщепляемые линкеры, наоборот, рассчитаны на разрушение антитела в клетке, которое, как правило, приводит к высвобождению фрагмента аминокислота-линкер-токсин.[00213] Suitable linkers are generally more chemically stable to conditions outside the cell than to conditions inside the cell, although less stable linkers may be provided in certain situations, such as when the toxin is selective or targeted and has low toxicity to normal cells. The linkers may be "cleavable linkers" or "non-cleavable linkers". The cleavable linker is typically susceptible to cleavage under intracellular conditions, for example through lysosomal processes. Examples include linkers that are protease sensitive, acid sensitive, sensitive to reducing conditions, or photolabile. Non-cleavable linkers, in contrast, are designed to disrupt the antibody in the cell, which typically results in the release of an amino acid-linker-toxin fragment.
[00214] Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, линкеры, содержащие пептидный компонент, который содержит две или более аминокислот, и является расщепляемым внутриклеточной протеазой, такой как лизосомная протеаза или эндосомная протеаза. Пептидный компонент может включать в себя аминокислотные остатки, которые встречаются естественным образом и/или минорные аминокислоты и/или не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин. Пептидные компоненты могут конструировать и оптимизировать для ферментативного расщепления конкретным ферментом, например опухоле-ассоциированной протеазой, катепсином B, C или D, или плазминовой протеазой.[00214] Suitable cleavable linkers include, for example, linkers containing a peptide moiety that contains two or more amino acids and is cleavable by an intracellular protease, such as a lysosomal protease or an endosomal protease. The peptide component may include amino acid residues that occur naturally and/or minor amino acids and/or non-naturally occurring amino acid analogues, such as citrulline. Peptide components can be designed and optimized for enzymatic cleavage by a specific enzyme, such as tumor-associated protease, cathepsin B, C or D, or plasmin protease.
[00215] В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер, включенный в состав ADC, может представлять собой дипептид-содержащий линкер, такой как линкер, содержащий валин-цитруллин (Val-Cit) или фенилаланин-лизин (Phe-Lys). Другие примеры подходящих дипептидов для включения в линкеры охватывают Val-Lys, Ala-Lys, Me-Val-Cit, Phe-homoLys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, фенилGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys и Met-(D)Lys. Расщепляемые линкеры также могут включать в себя более длинные пептидные компоненты, такие как трипептиды, тетрапептиды или пентапептиды. Примеры охватывают, но не ограничиваются ими, трипептиды Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys и (D)Ala-Phe-Lys, и тетрапептиды Gly-Phe-Leu-Gly и Ala-Leu-Ala-Leu.[00215] In some embodiments, the linker included in the ADC may be a dipeptide-containing linker, such as a valine-citrulline (Val-Cit) or phenylalanine-lysine (Phe-Lys) linker. Other examples of suitable dipeptides for inclusion in linkers include Val-Lys, Ala-Lys, Me-Val-Cit, Phe-homoLys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe , Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me 3 Lys-Pro, phenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys and Met- (D)Lys. Cleavable linkers can also include longer peptide components such as tripeptides, tetrapeptides or pentapeptides. Examples include, but are not limited to, the tripeptides Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys and (D)Ala-Phe-Lys, and the tetrapeptides Gly-Phe-Leu-Gly and Ala -Leu-Ala-Leu.
[00216] Дополнительные примеры расщепляемых линкеров включают дисульфид-содержащие линкеры, такие как, например, N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио) бутаноат (SPBD) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)-2-сульфо бутаноат (сульфо-SPBD). Дисульфид-содержащие линкеры могут необязательно содержать дополнительные группы для обеспечения стерического препятствия рядом с дисульфидной связью с целью улучшить внеклеточную устойчивость линкера, например включением геминальной диметильной группы. Другие подходящие линкеры включают линкеры, гидролизируемые при специфическом значении pH или в пределах некоторого диапазона pH, такие как гидразоновые линкеры. Могут также использоваться линкеры, содержащие комбинации этих функциональных групп, например в данной области техники известны линкеры, содержащие как гидразон, так и дисульфид. [00216] Additional examples of cleavable linkers include disulfide-containing linkers, such as, for example, N-succinimidyl-4-(2-pyridyldithio)butanoate (SPBD) and N-succinimidyl-4-(2-pyridyldithio)-2-sulfobutanoate (sulfo-SPBD). Disulfide-containing linkers may optionally contain additional groups to provide steric hindrance near the disulfide bond to improve the extracellular stability of the linker, for example, the inclusion of a geminal dimethyl group. Other suitable linkers include linkers that are hydrolyzed at a specific pH value or within a certain pH range, such as hydrazone linkers. Linkers containing combinations of these functional groups can also be used, for example linkers containing both a hydrazone and a disulfide are known in the art.
[00217] Дополнительный пример расщепляемого линкера представляет собой линкер, содержащий β-глюкуронид, который является расщепляемым β-глюкуронидазой, находящимся в лизосомах и промежуточной ткани опухолей (см., например, De Graaf et al., Curr. Pharm. Des., 8:1391–1403 (2002)).[00217] An additional example of a cleavable linker is a β-glucuronide-containing linker that is cleavable by β-glucuronidase found in lysosomes and interstitial tissue of tumors (see, for example, De Graaf et al., Curr. Pharm. Des., 8 :1391–1403 (2002)).
[00218] Расщепляемые линкеры необязательно могут дополнительно включать в себя один или более дополнительных компонентов, таких как саморасщепляющиеся и само-удаляющиеся группы, удлиняющие вставки или гидрофильные фрагменты. [00218] Cleavable linkers may optionally further include one or more additional components, such as self-cleaving and self-excision groups, extension inserts, or hydrophilic moieties.
[00219] Саморасщепляющиеся и само-удаляющиеся группы, которые находят применение в линкерах включают в себя, например, группы п-аминобензилоксикарбонила (PABC) и п-аминобензильного простого эфира (PABE), и метилированный этилендиамин (MED). Другие примеры саморасщепляющихся групп включают, но не ограничиваются ими, ароматические соединения, которые по электронной конфигурации являются сходными с группами PABC или PABE, такие как гетероциклические производные, например производные 2-аминоимидазол-5-метанола, описанные в патенте США № 7,375,078. Другие примеры включают группы, которые подвергаются циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 2:223–227 (1995)) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 55:5867–5877 (1990)).[00219] Self-cleaving and self-removing groups that find use in linkers include, for example, p-aminobenzyloxycarbonyl (PABC) and p-aminobenzyl ether (PABE) groups, and methylated ethylenediamine (MED). Other examples of self-cleaving groups include, but are not limited to, aromatic compounds that are similar in electronic configuration to PABC or PABE groups, such as heterocyclic derivatives, such as the 2-aminoimidazole-5-methanol derivatives described in US Pat. No. 7,375,078. Other examples include groups that undergo cyclization upon hydrolysis of the amide bond, such as substituted and unsubstituted 4-aminobutyric acid amides (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 2:223–227 (1995)) and 2-aminophenylpropionic acid amides (Amsberry, et al ., J. Org. Chem., 55:5867–5877 (1990)).
[00220] Удлиняющие вставки, которые могут находить применение в линкерах для ADC, включают в себя, например, алкиленовые группы и удлиняющие вставки на основе алифатических кислот, дикислот, аминов или диаминов, таких как дигликолят, малонат, капроат и капроамид. Другие удлиняющие вставки включают, например, удлиняющие вставки на основе глицина, полиэтиленгликольные (PEG) удлиняющие вставки и монометоксиполиэтиленгликольные (mPEG) удлиняющие вставки. PEG и mPEG удлиняющие вставки также функционируют как гидрофильные фрагменты. [00220] Extension inserts that may find use in ADC linkers include, for example, alkylene groups and extension inserts based on aliphatic acids, diacids, amines or diamines such as diglycolate, malonate, caproate and caproamide. Other extension inserts include, for example, glycine-based extension inserts, polyethylene glycol (PEG) extension inserts, and monomethoxy polyethylene glycol (mPEG) extension inserts. PEG and mPEG extension inserts also function as hydrophilic moieties.
[00221] Примеры компонентов, обычно помещаемых в расщепляемые линкеры, которые могут находить применение в ADC по настоящему описанию, в некоторых вариантах осуществления изобретения включают в себя, но не ограничиваются ими, SPBD, сульфо-SPBD, гидразон, Val-Cit, малеидкапроил (MC или mc), mc-Val-Cit, mc-Val-Cit-PABC, Phe-Lys, mc-Phe-Lys, mc-Phe-Lys-PABC, малеидтриэтиленгликолят (MT), MT-Val-Cit, MT-Phe-Lys и адипат (AD).[00221] Examples of components typically contained in cleavable linkers that may find use in the ADCs of the present disclosure, in some embodiments, include, but are not limited to, SPBD, sulfo-SPBD, hydrazone, Val-Cit, maleide caproyl ( MC or mc), mc-Val-Cit, mc-Val-Cit-PABC, Phe-Lys, mc-Phe-Lys, mc-Phe-Lys-PABC, maleid triethylene glycolate (MT), MT-Val-Cit, MT- Phe-Lys and adipate (AD).
[00222] В некоторых вариантах осуществления изобретения линкеры, включенные в состав ADC по настоящему описанию, представляют собой линкеры на основе пептидов с общей формулой (VI):[00222] In some embodiments, the linkers included in the ADCs herein are peptide-based linkers with the general formula ( VI ):
(VI)( VI )
где:Where:
Z представляет собой функциональную группу, способную взаимодействовать с целевой группой на антителе;Z represents a functional group capable of interacting with the target group on the antibody;
Str представляет собой удлиняющую вставку;Str is an extension insert;
AA1 и AA2 каждый независимо представляет собой аминокислоту, причем AA1-[AA2]m образует сайт расщепления протеазой;AA 1 and AA 2 are each independently an amino acid, with AA 1 -[AA 2 ] m forming a protease cleavage site;
X представляет собой саморасщепляющуюся группу;X represents a self-cleaving group;
D представляет собой точку присоединения к аналогу ауристатина;D represents the point of attachment to the auristatin analogue;
s равно 0 или 1;s is 0 or 1;
m представляет собой целое число от 1 до 4, иm is an integer from 1 to 4, and
o равно 0, 1 или 2.o is 0, 1 or 2.
[00223] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) Z представляет собой:[00223] In some embodiments, in general formula ( VI ), Z is:
. .
[00224] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) Str выбран из:[00224] In some embodiments, in general formula ( VI ), Str is selected from:
; ; ; ; ; ;
; и , ; And ,
где:Where:
R представляет собой Н или (C1–C6)алкил;R represents H or (C 1 –C 6 )alkyl;
p представляет собой целое число от 2 до 10; и p is an integer from 2 to 10; And
q представляет собой целое число от 1 до 10.q represents an integer from 1 to 10.
[00225] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) Str представляет собой:[00225] In some embodiments, in general formula ( VI ), Str is:
, или , , or ,
где p и q такие, как определено выше.where p and q are as defined above.
[00226] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) Str представляет собой:[00226] In some embodiments, in general formula ( VI ), Str is:
или , or ,
где p представляет собой целое число от 2 до 6, и where p is an integer between 2 and 6, and
q представляет собой целое число от 2 до 8.q represents an integer between 2 and 8.
[00227] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI), AA1-[AA2]m выбран из Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, фенилGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys, Met-(D)Lys, Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys, (D)Ala-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu-Gly и Ala-Leu-Ala-Leu.[00227] In some embodiments, in general formula ( VI ), AA 1 -[AA 2 ] m is selected from Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile -Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me 3 Lys-Pro, phenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn- (D)Lys, Pro-(D)Lys, Met-(D)Lys, Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys, (D)Ala-Phe-Lys, Gly -Phe-Leu-Gly and Ala-Leu-Ala-Leu.
[00228] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) m равно 1 (т. е. AA1-[AA2]m является дипептидом).[00228] In some embodiments, in general formula ( VI ), m is 1 ( ie, AA 1 -[AA 2 ] m is a dipeptide).
[00229] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI), AA1-[AA2]m является дипептидом, выбранным из Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit и Trp-Cit.[00229] In some embodiments of the invention in general formula ( VI ), AA 1 -[AA 2 ] m is a dipeptide selected from Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu- Cit, Ile-Cit and Trp-Cit.
[00230] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) каждый X независимо выбран из п-аминобензилоксикарбонила (PABC), п-аминобензильного сложного эфира (PABE) и метилированного этилендиамина (MED). [00230] In some embodiments, in general formula ( VI ), each X is independently selected from p-aminobenzyloxycarbonyl (PABC), p-aminobenzyl ester (PABE), and methylated ethylenediamine (MED).
[00231] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) m равно 1, 2 или 3.[00231] In some embodiments, m is 1, 2, or 3 in general formula ( VI ).
[00232] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) s равно 1.[00232] In some embodiments, s is equal to 1 in general formula ( VI ).
[00233] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI) o равно 0.[00233] In some embodiments, o is 0 in general formula ( VI ).
[00234] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VI):[00234] In some embodiments, in general formula ( VI ):
Z представляет собой ;Z represents ;
Str представляет собой или , где p является целым числом от 2 и 6, и Q представляет собой целое число от 2 до 8;Str represents or , where p is an integer between 2 and 6, and Q is an integer between 2 and 8;
m равно 1 и AA1-[AA2]m является дипептидом, выбранным из Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit и Trp-Cit;m is 1 and AA 1 -[AA 2 ] m is a dipeptide selected from Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit and Trp-Cit;
s равно 1, иs is 1, and
o равно 0.o is equal to 0.
[00235] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой дисульфид-содержащий линкер и ADC имеет общую формулу (VII):[00235] In some embodiments, the linker is a disulfide-containing linker and the ADC has the general formula ( VII ):
(VII)( VII )
где:Where:
A представляет собой антитело;A is an antibody;
D представляет собой аналог ауристатина;D is an analogue of auristatin;
Y представляет собой –(CH2)p- или –(CH2CH2O)q-, где p и q каждый независимо является целым числом от 1 до 10;Y represents -(CH 2 ) p - or -(CH 2 CH 2 O) q -, where p and q are each independently an integer from 1 to 10;
каждый R независимо представляет собой Н или (C1–C6)алкил;each R independently represents H or (C 1 –C 6 )alkyl;
r равно 1, 2 или 3; иr is 1, 2 or 3; And
где представляет собой амидную связь, образованную между линкером и ε-аминогруппой поверхностного лизина на антителе.Where is an amide bond formed between a linker and the ε-amino group of a surface lysine on an antibody.
[00236] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VII), p и q каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 4.[00236] In some embodiments, in general formula ( VII ), p and q are each independently an integer from 1 to 4.
[00237] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VII), Y представляет собой –(CH2)p-, и p является целым числом от 1 до 4.[00237] In some embodiments, in general formula ( VII ), Y is –(CH 2 ) p -, and p is an integer from 1 to 4.
[00238] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VII) каждый R независимо представляет собой H или Me.[00238] In some embodiments, in general formula ( VII ), each R is independently H or Me.
[00239] В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей формуле (VII) r равно 1 или 2.[00239] In some embodiments, in general formula ( VII ), r is 1 or 2.
[00240] Различные нерасщепляемые линкеры хорошо известны в данной области техники для связывания лекарственных веществ с антителами, и их могут применять в ADC по настоящему описанию в некоторых вариантах осуществления. Примеры нерасщепляемых линкеров включают линкеры, содержащие фрагмент N-сукцинимидильного сложного эфира или N-сульфосукцинимидильного сложного эфира для взаимодействия с антителом, а также фрагмент на основе малеимида или галогенацетила для взаимодействия с токсином, или наоборот. Пример такого нерасщепляемого линкера основан на сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилате (сульфо-SMCC). Другие неограничивающие примеры таких линкеров включают основанные на N-сукцинимидил 4-(малеимидметил)циклогексанкарбоксилате (SMCC), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидметил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроате) («длинноцепочечный» SMCC или LC-SMCC), κ-малеимидундекановой кислоты N-сукцинимидильном сложном эфире (KMUA), γ-малеимидмасляной кислоты N-сукцинимидильном сложном эфире (GMBS), ε-малеимидкапроновой кислоты N-гидроксисукцинимидильном сложном эфире (EMCS), м-малеимидбензоил-N-гидроксисукцинимидильном сложном эфире (MBS), N-(α-малеимидацетокси)-сукцинимидном сложном эфире (AMAS), сукцинимидил-6-(β-малеимидпропионамидо)гексаноат (SMPH), N-сукцинимидил 4-(п-малеимидфенил)-бутират (SMPB) и N-(п-малеимидфенил)изоцианат (PMPI). Другие примеры включают те, которые содержат функциональную группу на основе галогенацетила, такую как N-сукцинимидил-4-(йодацетил)-аминобензоат (SIAB), N-сукцинимидил йодацетат (SIA), N-сукцинимидил бромацетат (SBA) и N-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (SBAP). [00240] Various non-cleavable linkers are well known in the art for linking drugs to antibodies, and may be used in the ADCs of the present disclosure in some embodiments. Examples of non-cleavable linkers include linkers containing an N-succinimidyl ester or N-sulfosuccinimidyl ester moiety for interaction with the antibody, and a maleimide or haloacetyl moiety for interaction with the toxin, or vice versa. An example of such a non-cleavable linker is based on sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC). Other non-limiting examples of such linkers include those based on N-succinimidyl 4-(maleimidemethyl)cyclohexanecarboxylate (SMCC), N-succinimidyl-4-(N-maleimidemethyl)-cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate) (“long chain” SMCC, or LC-SMCC), κ-maleimidundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), γ-maleimidebutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ε-maleimidecaproic acid N-hydroxysuccinimidyl ester (EMCS), m-maleimidebenzoyl-N- hydroxysuccinimidyl ester (MBS), N-(α-maleimidacetoxy)-succinimide ester (AMAS), succinimidyl 6-(β-maleimidepropionamido)hexanoate (SMPH), N-succinimidyl 4-(p-maleimidephenyl)-butyrate (SMPB ) and N-(p-maleimidephenyl)isocyanate (PMPI). Other examples include those containing a haloacetyl functional group such as N-succinimidyl-4-(iodoacetyl)-aminobenzoate (SIAB), N-succinimidyl iodoacetate (SIA), N-succinimidyl bromoacetate (SBA) and N-succinimidyl 3 -(bromoacetamido)propionate (SBAP).
[00241] Другие примеры нерасщепляемых линкеров включают малеимидкарбоновые кислоты, такие как малеимидкапроил (MC). [00241] Other examples of non-cleavable linkers include maleimide carboxylic acids such as maleimide caproyl (MC).
[00242] Выбор подходящего линкера для данного ADC может быть легко получен специалистом, компетентным в данной области техники, и принимая во внимание соответствующие факторы, такие как сайт присоединения к антителу, любые структурные ограничения токсина и гидрофобности токсина (см., например, обзор в Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed.), Springer). [00242] The selection of a suitable linker for a given ADC can be readily accomplished by one skilled in the art, taking into account relevant factors such as the site of attachment to the antibody, any structural limitations of the toxin, and the hydrophobicity of the toxin (see, for example, review in Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology , 2013, Ducry (Ed.), Springer).
[00243] В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер, включенный в состав ADC по настоящему описанию, имеет общую формулу (VIII):[00243] In some embodiments, a linker included in an ADC as described herein has the general formula ( VIII ):
(VIII)( VIII )
где:Where:
A-S- представляет собой точку присоединения к анти-HER2 бипаратопному антителу;A-S- represents the point of attachment to the anti-HER2 biparatope antibody;
Y представляет собой один или более дополнительных линкерных компонентов, или отсутствует, иY represents one or more additional linker components, or is absent, and
D представляет собой точку присоединения к аналогу ауристатина.D represents the point of attachment to the auristatin analogue.
[00244] В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер, включенный в состав ADC по настоящему описанию, имеет общую формулу (IX):[00244] In some embodiments, a linker included in an ADC as described herein has the general formula ( IX ):
(IX)( IX )
где:Where:
A-S- представляет собой точку присоединения к анти-HER2 бипаратопному антителу;A-S- represents the point of attachment to the anti-HER2 biparatope antibody;
Y представляет собой один или более дополнительных линкерных компонентов, или отсутствует, иY represents one or more additional linker components, or is absent, and
D представляет собой точку присоединения к аналогу ауристатина.D represents the point of attachment to the auristatin analogue.
Получение конъюгатов антител-лекарственных веществPreparation of antibody-drug conjugates
[00245] ADC по настоящему описанию могут получать одним из нескольких путей, известных в данной области техники, применяя реакции органической химии, условия и реагенты, известные специалистам в данной области техники (см., например, Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press, и предложенные в данном документе). Например, конъюгации можно достигать (1) реакцией нуклеофильной группы или электрофильной группы антитела с бифункциональным линкером с образованием промежуточного соединения антитело-линкер Ab-L посредством ковалентной связи, с последующей реакцией с активированным аналогом ауристатина (D), или (2) реакцией нуклеофильной группы или электрофильной группы аналога ауристатина с линкером с образованием линкер-токсина D-L посредством ковалентной связи, с последующей реакцией с нуклеофильной группой или электрофильной группой антитела. Методы конъюгации (1) и (2) могут применяться с различными антителами, аналогами ауристатина и линкерами для получения ADC, описанных в данном документе.[00245] The ADCs of the present disclosure can be prepared by one of several routes known in the art, using organic chemistry reactions, conditions and reagents known to those skilled in the art (see, for example, Bioconjugate Techniques (GT Hermanson, 2013, Academic Press, and proposed herein.) For example, conjugation can be achieved by (1) reacting a nucleophilic group or electrophilic group of an antibody with a bifunctional linker to form an antibody-linker intermediate Ab-L via a covalent bond, followed by reaction with an activated auristatin analogue (D ), or (2) reaction of a nucleophilic group or electrophilic group of an auristatin analog with a linker to form the linker toxin DL via a covalent bond, followed by reaction with a nucleophilic group or electrophilic group of an antibody. Conjugation methods (1) and (2) can be used with various antibodies, auristatin analogues and linkers to obtain the ADCs described herein.
[00246] Как описано выше, для получения ADC могут конъюгировать аналоги ауристатина посредством соответствующего линкера с различными группами на антителе. Например, конъюгацию может осуществляться посредством поверхностных лизинов, посредством окисленных углеводов или посредством цистеиновых остатков, которые были высвобождены восстановлением одной или более межцепных дисульфидных связей. В альтернативном варианте антитело могут модифицировать для включения дополнительных цистеиновых остатков или не встречающихся в природе аминокислот, которые предоставляют реакционноспособные группы прикрепления, такие как селенометионин, п-ацетилфенилаланин, формилглицин или п-азидометил-L-фенилаланин. Такие модификации хорошо известны в данной области техники (см., например, патенты США № 7,521,541; 8,455,622 и 9,000,130; Hofer et al., Biochemistry, 48:12047–12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101–16106 (2012); Wu et al., PNAS, 106:3000–3005 (2009); Zimmerman et al., Bioconj. Chem, 25:351–361 (2014)).[00246] As described above, ADCs can be prepared by conjugating auristatin analogs via an appropriate linker to various groups on the antibody. For example, conjugation may be accomplished through surface lysines, through oxidized carbohydrates, or through cysteine residues that have been released by reduction of one or more interchain disulfide bonds. Alternatively, the antibody may be modified to include additional cysteine residues or non-naturally occurring amino acids that provide reactive attachment groups, such as selenomethionine, p-acetylphenylalanine, formylglycine, or p-azidomethyl-L-phenylalanine. Such modifications are well known in the art (see, for example, US Patent Nos. 7,521,541; 8,455,622 and 9,000,130; Hofer et al., Biochemistry, 48:12047–12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101– 16106 (2012); Wu et al ., PNAS, 106:3000–3005 (2009); Zimmerman et al ., Bioconj. Chem, 25:351–361 (2014)).
[00247] В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC по настоящему описанию содержат аналог ауристатина, конъюгированный посредством соответствующего линкера с цистеиновыми остатками, которые были высвобождены восстановлением одной или более межцепных дисульфидных связей.[00247] In some embodiments, the ADCs disclosed herein comprise an auristatin analogue conjugated via an appropriate linker to cysteine residues that have been released by reduction of one or more interchain disulfide bonds.
[00248] В описанных в данном документе ADC анти-HER2 бипаратопное антитело конъюгировано с токсином посредством линкера при низком значении среднего соотношения лекарственное вещество-к-антителу (DAR), конкретно среднее DAR меньше 3,9, но больше 0,5; например, в некоторых вариантах осуществления, от около 1,5 до около 2,5.[00248] In the anti-HER2 ADCs described herein, the biparatope antibody is conjugated to the toxin via a linker at a low average drug-to-antibody ratio (DAR), specifically an average DAR less than 3.9 but greater than 0.5; for example, in some embodiments, from about 1.5 to about 2.5.
[00249] В данной области техники известны различные способы получения ADC с низким значением среднего DAR (см., например, обзор McCombs and Owen, The AAPS Journal, 17(2):339–351 (2015) и ссылки в нем; Boutureira & Bernardes, Chem. Rev., 115:2174–2195 (2015)). [00249] Various methods for producing ADCs with low average DAR are known in the art (see, for example, review by McCombs and Owen, The AAPS Journal, 17(2):339–351 (2015) and references therein; Boutureira & Bernardes, Chem. Rev., 115:2174–2195 (2015)).
[00250] Например, для конъюгации с цистеиновыми остатками могут проводить частичное восстановление межцепных дисульфидных связей антитела с последующей конъюгацией с линкер-токсином. Частичного восстановления могут достигать ограничением количества восстановительного агента, применяемого в реакции восстановления (см., например, Lyon et al., Methods in Enzymology, 502:123–138 (2012) и примеры в ней, и предложенные в данном документе примеры). Подходящими восстановительными агентами являются известные в данной области техники вещества и включают, например, дитиотреитол (DTT), трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), 2-меркаптоэтанол, цистеамин и ряд водорастворимых фосфинов. В альтернативном варианте или в дополнение, могут применяться меньшие эквиваленты линкер-токсина для получения низкого значения среднего DAR.[00250] For example, for conjugation with cysteine residues, partial reduction of interchain disulfide bonds of the antibody can be carried out, followed by conjugation with a linker toxin. Partial reduction can be achieved by limiting the amount of reducing agent used in the reduction reaction (see, for example, Lyon et al ., Methods in Enzymology, 502:123–138 (2012) and examples therein, and examples provided herein). Suitable reducing agents are those known in the art and include, for example, dithiothreitol (DTT), tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), 2-mercaptoethanol, cysteamine and a number of water-soluble phosphines. Alternatively or in addition, smaller equivalents of the linker toxin may be used to obtain a low average DAR value.
[00251] В альтернативном варианте, могут применять сконструированное антитело, в котором один или более цистеиновых остатков, которые образуют межцепные дисульфидные связи, заменяют сериновым остатком, что приводит к получению меньшего количества доступных для конъюгации цистеиновых остатков (см. McDonagh et al., Protein Eng. Des. Sel. PEDS, 19(7):299–307). Затем сконструированное антитело могут обрабатывать восстановительным агентом и конъюгировать с линкер-токсином.[00251] Alternatively, an engineered antibody may be used in which one or more cysteine residues that form interchain disulfide bonds are replaced with a serine residue, resulting in fewer cysteine residues available for conjugation (see McDonagh et al., Protein Eng Des Sel PEDS 19(7):299–307). The engineered antibody can then be treated with a reducing agent and conjugated to a linker toxin.
[00252] Другой подход заключается в применении бис-тиольного линкера, который соединяет два цистеина, которые, в обычной ситуации, образуют межцепную дисульфидную связь. Использование бис-тиольного линкера, который несет только одну молекулу токсина, может создавать ADC с максимальным DAR4 для полноразмерного антитела, если все четыре межцепные дисульфидные связи восстановлены и замещены бис-тиольным линкером. Частичное восстановление межцепных дисульфидных связей и/или меньшие эквиваленты линкера могут применять в сочетании с бис-тиольным линкером с целью дополнительного уменьшения DAR. В данной области техники известны различные бис-тиольные линкеры (см., например, Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25(6):1124–1136 (2014); Behrens et al., Mol. Pharm., 12:3986–3998 (2015); Lee et al., Chem. Sci., 7:799–802 (2016); Maruani et al., Nat. Commun., 6:6645 (2015)).[00252] Another approach is to use a bis-thiol linker that connects two cysteines that would normally form an interchain disulfide bond. The use of a bis-thiol linker that carries only one toxin molecule can generate an ADC with the maximum DAR4 for a full-length antibody if all four interchain disulfide bonds are reduced and replaced by the bis-thiol linker. Partial reduction of interchain disulfide bonds and/or smaller linker equivalents can be used in combination with a bis-thiol linker to further reduce DAR. Various bis-thiol linkers are known in the art (see, for example, Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25(6):1124–1136 (2014); Behrens et al ., Mol. Pharm., 12: 3986–3998 (2015); Lee et al., Chem. Sci., 7:799–802 (2016); Maruani et al ., Nat. Commun., 6:6645 (2015)).
[00253] Подходы с цистеиновой инженерией также могут применять для создания ADC с низким значением среднего DAR. В таких подходах привлекают конструирование доступных для растворителя цистеинов в антителе с целью обеспечения сайт-специфической группы прикрепления для конъюгации. Для введения цистеинового остатка было выявлено ряд подходящих сайтов на структуре IgG, и они включают те, которые описаны в Junutula, et al., J. Immunol Methods, 332(1–2):41–52 (2008); Junutula, et al., Nat. Biotechnol., 26(8), 925–932 (2008), и патент США № 9,315,581; 9,000,130; 8,455,622; 8,507,654 и 7,521,541.[00253] Cysteine engineering approaches can also be used to create ADCs with low average DAR. Such approaches involve designing solvent accessible cysteines in the antibody to provide a site-specific attachment group for conjugation. A number of suitable sites on the IgG structure have been identified for the introduction of a cysteine residue, and these include those described in Junutula, et al ., J. Immunol Methods, 332(1-2):41-52 (2008); Junutula, et al ., Nat. Biotechnol., 26(8), 925–932 (2008), and US Patent No. 9,315,581; 9,000,130; 8,455,622; 8,507,654 and 7,521,541.
[00254] ADC с низкими значениями средних DAR также могут получать путем конъюгации лизина с использованием ограниченных количеств активированного линкер-токсина. Могут также применять селективную реакцию N-концевых аминокислот антитела.Например, N-концевой серин могут окислять до альдегида с помощью перйодата, затем проводить реакцию с линкер-токсином (см., например, Thompson, et al., Bioconjug. Chem., 26(10):2085-2096 (2015)). Сходным образом, N-концевые цистеиновые остатки могут селективно взаимодействовать с альдегидами с получением тиазолидонов (см., например, Bernardes, et al., Nature Protocols, 8:2079–2089).[00254] ADCs with low average DAR values can also be produced by lysine conjugation using limited amounts of activated linker toxin. Selective reactions of the N-terminal amino acids of an antibody can also be used. For example, the N-terminal serine can be oxidized to an aldehyde with periodate, then reacted with a linker toxin (see, for example, Thompson, et al., Bioconjug. Chem., 26 (10):2085-2096 (2015)). Likewise, N-terminal cysteine residues can selectively react with aldehydes to produce thiazolidones (see, eg, Bernardes, et al., Nature Protocols, 8:2079–2089).
[00255] Дополнительные подходы включают в себя конструирование антитела с включением одной или более не встречающихся в природе аминокислот, таких как п-ацетилфенилаланин (pAcPhe) или селеноцистеин (Sec). Кето-группа в pAcPhe может реагировать с линкер-токсином, содержащим концевой алкоксиамин или гидразид с образованием оксимной или гидразоновой связи (см., например, Axup, et al., PNAS USA, 109:16101–16106 (2012)). Sec-содержащие антитела могут взаимодействовать с содержащими малеимид- или йодацетамид линкер-токсины с образованием селеноэфирного конъюгата (см., например, Hofer, et al., Biochemistry, 48:12047–12057 (2009)).[00255] Additional approaches include engineering the antibody to include one or more non-naturally occurring amino acids, such as p-acetylphenylalanine (pAcPhe) or selenocysteine (Sec). The keto group on pAcPhe can react with a toxin linker containing a terminal alkoxyamine or hydrazide to form an oxime or hydrazone bond (see, e.g., Axup, et al., PNAS USA, 109:16101–16106 (2012)). Sec-containing antibodies can react with maleimide- or iodoacetamide-containing linker toxins to form a selenium ester conjugate (see, for example, Hofer, et al., Biochemistry, 48:12047–12057 (2009)).
[00256] Антитела также могут конструировать так, чтобы включать в себя пептидные маркеры, распознаваемые определенными ферментами для обеспечения фермент-катализируемой конъюгации. Например, сортаза-A (SortA) распознает последовательность LPXTG. Это пентапептид могут внедрять в N- или C-конец антитела для обеспечения SortA-опосредованной конъюгации (см., например, публикацию патентной заявки США № 2016/0136298; Kornberger and Skerra, mAbs, 6(2):354–366 (2014)). Трансглутаминазы также применяли для создания DAR2 ADC путем использования антител, которые были дегликолизированы в положении N297 (которое предоставляет Q295 для ферментативной конъюгации), или путем конструирования антител для включения «глутаминовой метки» (LLQG) (Jeger, et al., Angew. Chem., 49:9995–9997 (2010); Strop, et al., Chem. Biol., 20(2):161–167 (2013)). В другом подходе формилглициновый остаток могут вводить в антитело путем конструирования соответствующей консенсусной последовательности в антителе и коэкспрессии сконструированного антитела с формилглицин-образующим ферментом (FGE). Альдегидную функциональную группу введенного формилглицина затем можно использовать в качестве группы прикрепления для конъюгации токсина (см., например, Drake, et al., Bioconjug. Chem., 25(7):1331-1341 (2014)).[00256] Antibodies can also be designed to include peptide tags recognized by certain enzymes to allow enzyme-catalyzed conjugation. For example, sortase-A (SortA) recognizes the sequence LPXTG. This pentapeptide can be incorporated into the N- or C-terminus of antibodies to enable SortA-mediated conjugation (see, for example, US Patent Application Publication No. 2016/0136298; Kornberger and Skerra, mAbs, 6(2):354–366 (2014) ). Transglutaminases have also been used to create DAR2 ADCs by using antibodies that have been deglycolyzed at position N297 (which exposes Q295 for enzymatic conjugation) or by engineering antibodies to incorporate a “glutamine tag” (LLQG) (Jeger, et al., Angew. Chem. , 49:9995–9997 (2010); Strop, et al., Chem. Biol., 20(2):161–167 (2013)). In another approach, a formylglycine residue can be introduced into an antibody by designing an appropriate consensus sequence in the antibody and co-expressing the engineered antibody with a formylglycine-forming enzyme (FGE). The aldehyde functionality of the introduced formylglycine can then be used as an attachment group for toxin conjugation (see, for example, Drake, et al., Bioconjug. Chem., 25(7):1331-1341 (2014)).
[00257] Другой подход, примененный для создания DAR2 ADC представляет собой конъюгацию линкер-токсина с нативными углеводами, находящимися на гликолизилированных антителах. Конъюгацию с гликозилированными антителами могут обеспечивать, например, окислением перйодатом концевых углеводных остатков с образованием альдегидов, которые затем могут конъюгироваться с соответствующим линкер-токсином, или путем гликоинжиниринговых подходов, в которых нативные углеводы модифицируют концевыми остатками сиаловых кислот, которые затем окисляют с образованием альдегидов для конъюгации с линкер-токсином (Zhou, et al., Bioconjug. Chem., 25(3):510-520 (2014)).[00257] Another approach used to create a DAR2 ADC is the conjugation of a linker toxin to native carbohydrates found on glycosylated antibodies. Conjugation to glycosylated antibodies can be achieved, for example, by periodate oxidation of terminal carbohydrate residues to form aldehydes, which can then be conjugated to the corresponding linker toxin, or by glycoengineering approaches in which native carbohydrates are modified with terminal sialic acid residues, which are then oxidized to form aldehydes to conjugation with linker toxin (Zhou, et al., Bioconjug. Chem., 25(3):510-520 (2014)).
[00258] Сообщалось также о применении перекрестного связывания под действием УФ для конъюгации активных фрагментов с антителами. В этом методе используется нуклеотид-связывающий сайт (NBS) для сайт-специфической ковалентной функционализации антитела с помощью реакционноспособных тиольных фрагментов. Применяли конъюгированный вариант цистеина, индол-3-масляную кислоту (IBA), для сайт-специфического фотоперекрестного связывания реакционноспособного тиольного фрагмента с антителом в NBS. Затем тиольный фрагмент могут использовать для конъюгации линкер-токсина, содержащего тиольную реакционноспособную группу (Alves, et al., Bioconjug. Chem., 25(7):1198-1202 (2014)).[00258] The use of UV cross-linking to conjugate active moieties to antibodies has also been reported. This method uses a nucleotide binding site (NBS) to site-specifically covalently functionalize an antibody with reactive thiol moieties. A conjugated cysteine variant, indole-3-butyric acid (IBA), was used to perform site-specific photocrosslinking of the reactive thiol moiety to the antibody in NBS. The thiol moiety can then be used to conjugate a linker-toxin containing a thiol reactive group (Alves, et al., Bioconjug. Chem., 25(7):1198-1202 (2014)).
[00259] В альтернативном варианте, ADC с низким значением среднего DAR могут выделять из препарата ADC, содержащего смесь типов DAR с использованием методик хроматографического разделения, таких как хроматография гидрофобных взаимодействий (см., например, Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063-7070 (2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371–81 (2017); публикация заявки на патент США № 2014/0286968). [00259] Alternatively, ADCs with a low average DAR can be isolated from an ADC preparation containing a mixture of DAR types using chromatographic separation techniques such as hydrophobic interaction chromatography (see, e.g., Hamblett, et al., Clin. Cancer Res. ., 10:7063-7070 (2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371–81 (2017); US Patent Application Publication No. 2014/0286968).
[00260] Препараты ADC с низким значением среднего DAR также могут получать добавлением неконъюгированного (т. e. DAR0) антитела к препаратам ADC со средним DAR > 3,9. Как известно в данной области техники, большинство способов конъюгации дает препарат ADC, который включает в себя различные типы DAR, при этом указанное DAR является средним значением по отдельным типам DAR. В некоторых вариантах осуществления изобретения препараты ADC, которые содержат некоторую долю типов DAR0, могут обладать преимуществом. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат ADC со средним DAR менее 3,9 может включать по меньшей мере 5% типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат ADC может содержать по меньшей мере 10% типов DAR0, например по меньшей мере 15% типов DAR0 или по меньшей мере 20% типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат ADC может содержать от около 5% до около 50% типов DAR0. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат ADC может содержать от около 10% до около 50% типов DAR0, например от около 10% до около 40%, или от около 10% до около 30% типов DAR0.[00260] ADC preparations with a low average DAR can also be prepared by adding unconjugated ( i.e., DAR0) antibody to ADC preparations with an average DAR > 3.9. As is known in the art, most conjugation methods produce an ADC formulation that includes various DAR types, with the reported DAR being the average of the individual DAR types. In some embodiments, ADC formulations that contain a certain proportion of DAR0 types may be advantageous. In some embodiments, an ADC formulation with an average DAR of less than 3.9 may include at least 5% DAR0 types. In some embodiments, the ADC formulation may contain at least 10% DAR0 types, such as at least 15% DAR0 types or at least 20% DAR0 types. In some embodiments, the ADC formulation may contain from about 5% to about 50% DAR0 types. In some embodiments, the ADC formulation may contain from about 10% to about 50% DAR0 types, such as from about 10% to about 40%, or from about 10% to about 30% DAR0 types.
[00261] Среднее DAR для ADC могут определять стандартными методиками, такими как УФ/ВС спектроскопический анализ, методики на основе ELISA, хроматографические методики, такие как хроматография гидрофобных взаимодействий (ХГВ), масс-спектрометрия (МС) UV-MALDI и МС MALDI-TOF. Кроме того, распределение форм со связанными лекарственными веществами (например, фракция типов DAR0, DAR1, DAR2 и т. д.) также могут анализировать различными методиками, известными в данной области техники, включая МС (в сопровождении стадии хроматографического разделения или без нее), хроматографию гидрофобных взаимодействий, обращенно-фазовой ВЭЖХ или гель-электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (IEF) (см., например, Sun et al., Bioconj Chem., 28:1371–81 (2017); Wakankar et al., mAb, 3:161–172 (2011)).[00261] The average DAR for an ADC can be determined by standard techniques such as UV/VS spectroscopic analysis, ELISA-based techniques, chromatographic techniques such as hydrophobic interaction chromatography (HIC), UV-MALDI mass spectrometry (MS), and MALDI-MS. TOF. In addition, the distribution of drug-bound forms (e.g. fraction of DAR0, DAR1, DAR2 types, etc.) can also be analyzed by various techniques known in the art, including MS (with or without a chromatographic separation step), hydrophobic interaction chromatography, reversed-phase HPLC, or isoelectric focusing (IEF) gel electrophoresis (see, e.g., Sun et al., Bioconj Chem., 28:1371–81 (2017); Wakankar et al ., mAb, 3 :161–172 (2011)).
[00262] В некоторых вариантах осуществления изобретения среднее DAR ADC определяют методиками хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ).[00262] In some embodiments of the invention, the average DAR ADC is determined by hydrophobic interaction chromatography (HIC) techniques.
[00263] После конъюгации ADC могут очищать и отделять от неконъюгированных реагирующих веществ и/или любых конъюгатных агрегатов известными в данной области техники методами очистки. Такие методы включают, но не ограничиваются ими, эксклюзионную хроматографию (SEC), хроматографию гидрофобных взаимодействий (ХГВ), ионообменную хроматографию, хроматофокусирование, ультрафильтрацию, ультрафильтрацию на центрифуге и их комбинацию. [00263] After conjugation, ADCs can be purified and separated from unconjugated reactants and/or any conjugate aggregates by purification methods known in the art. Such methods include, but are not limited to, size exclusion chromatography (SEC), hydrophobic interaction chromatography (HIC), ion exchange chromatography, chromatofocusing, ultrafiltration, centrifugal ultrafiltration, and combinations thereof.
Тестирование Testing
[00264] Противораковую активность ADC на HER2-экспрессирующих раковых клетках могут тестировать in vitro и/или in vivo с использованием стандартных методик. [00264] The anticancer activity of ADCs on HER2-expressing cancer cells can be tested in vitro and/or in vivo using standard techniques.
[00265] Например, цитотоксическую активность ADC могут измерять, воздействуя на HER2-экспрессирующие раковые клетки с помощью ADC в среде для культивирования клеток, культивируя клетки в течение соответствующего периода времени (например, от около 6 часов до около 7 дней), затем измеряя жизнеспособность клеток. Не экспрессирующие HER2 клетки могут включать в исследование как контроль.[00265] For example, the cytotoxic activity of an ADC can be measured by treating HER2-expressing cancer cells with the ADC in cell culture medium, culturing the cells for an appropriate period of time (e.g., about 6 hours to about 7 days), then measuring viability cells. Cells that do not express HER2 may be included in the study as a control.
[00266] В данной области известны различные линии раковых клеток, экспрессирующих HER2 на разных уровнях, которые могут использовать для тестирования ADC, и многие линии коммерчески доступны (например, из Американской коллекции типовых культур, г. Манассас, штат Вирджиния, США; Addexbio Technologies, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США; DSMZ, г. Брауншвейг, Германия). Примеры включают клеточные линии BT-474 (3+), SK-BR-3 (3+), HCC1954 (3+), JIMT-1 (2+) и ZR-75-1 (1+). Эти и другие примеры обобщены в таблице 8.[00266] Various cancer cell lines expressing HER2 at different levels are known in the art that can be used for ADC testing, and many lines are commercially available (e.g., from the American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA; Addexbio Technologies , San Diego, California, USA; DSMZ, Braunschweig, Germany). Examples include cell lines BT-474 (3+), SK-BR-3 (3+), HCC1954 (3+), JIMT-1 (2+), and ZR-75-1 (1+). These and other examples are summarized in Table 8.
Таблица 8. Относительные уровни экспрессии HER2 в интересующих линиях клетокTable 8. Relative levels of HER2 expression in cell lines of interest
[00267] Способность ADC ингибировать опухолевый рост in vivo могут определять в соответствующих животной модели с использованием стандартных методик, известных в данной области техники (см., например, Enna, et al., Current Protocols in Pharmacology, J. Wiley & Sons, Inc., New York, NY). В целом, текущие животные модели для скрининга противоопухолевых соединений представляют собой модели ксенотрансплантатов, в которых человеческую опухоль имплантируют в организм животного, как правило грызуна. [00267] The ability of ADCs to inhibit tumor growth in vivo can be determined in appropriate animal models using standard techniques known in the art (see, for example, Enna, et al., Current Protocols in Pharmacology, J. Wiley & Sons, Inc. ., New York, NY). In general, current animal models for screening antitumor compounds are xenograft models in which a human tumor is implanted into an animal, typically a rodent.
[00268] Например, ADC могут тестировать in vivo на HER2-экспрессирующих опухолях с использованием мышей, которым на сутки 0 подкожно прививают фрагмент опухоли, или имплантируют подходящее количество раковых клеток. Опухолям дают возможность развиваться до желаемого размера, животных с недостаточно развившимися опухолями исключают. Как правило, лечение ADC начинается с от 3 до 22 суток после прививания, в зависимости от типа опухоли. ADC могут вводить животным, например, внутривенной (в.в.) инъекцией. Опухоли измеряют либо после предварительно заданного периода времени либо непрерывно (например, 2 или 3 раза в неделю) до предварительно определенной конечной точки исследования, например когда опухоль достигает предварительно заданного размера или веса. В моделях с ксенотрансплантатом могут применять опухоли, экспрессирующие HER2 на различных уровнях. Особенно пригодны полученные от пациентов ксенотрансплантаты (PDX).[00268] For example, ADCs can be tested in vivo on HER2-expressing tumors using mice inoculated with a tumor fragment subcutaneously on day 0 or implanted with an appropriate number of cancer cells. Tumors are allowed to develop to the desired size; animals with insufficiently developed tumors are excluded. As a rule, ADC treatment begins from 3 to 22 days after vaccination, depending on the type of tumor. ADCs can be administered to animals, for example, by intravenous (IV) injection. Tumors are measured either after a predetermined period of time or continuously (eg, 2 or 3 times per week) until a predetermined study endpoint, such as when the tumor reaches a predetermined size or weight. Xenograft models can utilize tumors that express HER2 at varying levels. Particularly suitable are patient-derived xenografts (PDX).
[00269] Токсические эффекты ADC in vivo первоначально могут оценивать на грызунах, например мышах или крысах, путем измерения их влияния на массу тела животных во время лечения. Гематологические профили и анализ ферментов печени также могут выполняться на образцах крови, отобранных у животных. [00269] The toxic effects of ADCs in vivo may initially be assessed in rodents, such as mice or rats, by measuring their effect on the body weight of the animals during treatment. Hematological profiles and liver enzyme tests can also be performed on blood samples collected from animals.
[00270] Токсичность и фармакинетику in vivo могут дополнительно анализировать на соответствующих животных моделях, например крысах или человекообразных приматах, придерживаясь стандартных протоколов. Яванские макаки являются особенно используемыми в этой связи, так как человек и яванский макак обладают 98% гомологией последовательностей HER2. [00270] In vivo toxicity and pharmacokinetics can be further analyzed in appropriate animal models, such as rats or great apes, following standard protocols. Cynomolgus macaques are particularly used in this regard, since humans and cynomolgus macaques share 98% HER2 sequence homology.
[00271] ADC, описанные в данном документе, имеют улучшенную переносимость и уменьшенную токсичность по сравнению с соответствующим ADC с DAR >3,9 при введении той же дозы токсина. В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC демонстрируют больше чем 2x улучшение в переносимости по сравнению с соответствующим ADC с DAR >3,9 при введении той же дозы токсина. В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC демонстрируют больше чем 2,2x; например 2,3x; 2,4x или 2,5x; улучшение в переносимости по сравнению с соответствующим ADC с DAR >3,9 при введении той же дозы токсина. Улучшение в переносимости могут определять, например, путем сравнения максимальной переносимой дозы (MTD), не вызывающего побочных эффектов уровня дозы (NOAEL) или наивысшей нетяжелой токсической дозы (HNSTD) для ADC по настоящему описанию и соответствующего ADC с DAR >3,9. Показатели MTD, NOAEL и/или HNSTD могут измерять стандартными методиками в подходящей животной модели, например на грызуне или человекообразном примате. [00271] The ADCs described herein have improved tolerability and reduced toxicity compared to a corresponding ADC with a DAR > 3.9 when administered at the same dose of toxin. In some embodiments, ADCs demonstrate greater than 2x improvement in tolerability compared to a corresponding ADC with a DAR > 3.9 when administered the same dose of toxin. In some embodiments, the ADCs exhibit greater than 2.2x; for example 2.3x; 2.4x or 2.5x; improvement in tolerability compared to a corresponding ADC with a DAR > 3.9 when administered the same dose of toxin. Improvement in tolerability can be determined, for example, by comparing the maximum tolerated dose (MTD), no adverse effect dose level (NOAEL) or highest non-severe toxic dose (HNSTD) for an ADC herein and a corresponding ADC with a DAR > 3.9. MTD, NOAEL and/or HNSTD can be measured using standard techniques in a suitable animal model, such as a rodent or great ape.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИPHARMACEUTICAL COMPOSITIONS
[00272] Для терапевтического применения ADC могут предлагать в форме композиций, содержащих ADC и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Композиции могут готовить известными процедурами с использованием хорошо известных и легкодоступных ингредиентов. [00272] For therapeutic use, ADCs may be provided in the form of compositions containing the ADC and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The compositions can be prepared by known procedures using well known and readily available ingredients.
[00273] Фармацевтические композиции могут составлять в виде лекарственной формы для введения субъекту, например, пероральным (включая, например, буккальный или сублингвальный), местным, парентеральным, ректальным или вагинальным путями, или в виде ингаляции или спрея. Термин «парентеральный», используемый в данном документе, включает в себя подкожную инъекцию, а также внутрикожную, внутрисуставную, внутримышечную, внутрисосудистую, внутригрудинную, интратекальную инъекцию или инфузию. Фармацевтическую композицию будут, как правило, составлять в формате, подходящем для введения субъекту, например в виде сиропа, элексира, таблетки, леденца, пастилки, твердую или мягкую капсулу, пилюлю, суппозиторий, масляную или водную суспензию, диспергируемый порошок или гранулу, эмульсию, инъекционный препарат или раствор. Фармацевтические композиции могут предлагать в виде однодозовых лекарственных форм. [00273] Pharmaceutical compositions may be formulated in dosage form for administration to a subject, for example, by the oral (including, for example, buccal or sublingual), topical, parenteral, rectal or vaginal routes, or by inhalation or spray. The term “parenteral” as used herein includes subcutaneous injection, as well as intradermal, intraarticular, intramuscular, intravascular, intrathoracic, intrathecal injection or infusion. The pharmaceutical composition will generally be formulated in a format suitable for administration to a subject, for example, as a syrup, elixir, tablet, lozenge, lozenge, hard or soft capsule, pill, suppository, oily or aqueous suspension, dispersible powder or granule, emulsion, injection drug or solution. The pharmaceutical compositions may be offered in single-dose dosage forms.
[00274] В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции, содержащие ADC составляют для парентерального введения в однодозовой инъекционной форме, например в виде лиофилизированных лекарственных форм или водных растворов. [00274] In some embodiments, pharmaceutical compositions containing ADCs are formulated for parenteral administration in single-dose injectable form, such as lyophilized dosage forms or aqueous solutions.
[00275] Фармацевтически приемлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях. Примерами таких носителей являются, но не ограничиваются ими, буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и метионин; консерванты, такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид, гексаметония хлорид, бензалкония хлорид, бензетония хлорид, фенол, бутиловый спирт, бензиловый спирт, алкилпарабены (например, метил- или пропилпарабен), катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол; полипептиды с низкой молекулярной массой (менее около 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин или желатин; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, такие как глюкоза, манноза или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами, такие как Zn-белковые комплексы, и неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). [00275] Pharmaceutically acceptable carriers are generally non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used. Examples of such carriers include, but are not limited to, buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; antioxidants such as ascorbic acid and methionine; preservatives such as octadecyldimethylbenzylammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol, butyl alcohol, benzyl alcohol, alkylparabens (eg, methyl or propylparaben), catechin, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol; low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues); proteins such as serum albumin or gelatin; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates such as glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes such as Zn-protein complexes, and nonionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG).
[00276] В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции, содержащие ADC, могут предоставлять в форме стерильного инъекционного водного или масляного раствора или суспензии. Такие суспензии могут составлять с использованием подходящего диспергирующего или увлажняющего агентов и/или суспендирующего агента, которые известны в данной области техники. Стерильный инъекционный раствор или суспензия могут включать в себя ADC в нетоксичном приемлемом для парентерального введения разбавителе или носителе. Приемлемые разбавители и носители, которые могут применяться включают, например, 1,3-бутандиол, воду, раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве носителя могут применяться стерильные нелетучие масла. Для данной цели можно использовать различные легкие нелетучие масла, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в препарате инъекционных лекарственных форм находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. В инъекционный раствор или суспензию также могут включать такие адъюванты, как местные анестетики, консерванты и/или буферизирующие агенты.[00276] In some embodiments, compositions containing ADCs may be provided in the form of a sterile injectable aqueous or oily solution or suspension. Such suspensions can be formulated using suitable dispersing or wetting agents and/or suspending agents as are known in the art. The sterile injectable solution or suspension may include the ADC in a non-toxic parenterally acceptable diluent or carrier. Acceptable diluents and carriers that may be used include, for example, 1,3-butanediol, water, Ringer's solution or isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile non-volatile oils can be used as a carrier. Various light fixed oils can be used for this purpose, including synthetic mono- or diglycerides. In addition, fatty acids such as oleic acid are used in the formulation of injectable dosage forms. The injection solution or suspension may also include adjuvants such as local anesthetics, preservatives and/or buffering agents.
[00277] В некоторых вариантах осуществления изобретения композицию, содержащую ADC, могут составлять для внутривенного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости, композиция может также содержать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно ингредиенты в единичную дозированную форму вводятся по отдельности или смешанными вместе, например в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества действующего вещества. Когда предполагается введение композиции путем инфузии, ее можно наливать в бутылку для инфузий, содержащую воду или солевой раствор фармацевтического качества. Когда композицию вводят путем инъекции, то может прилагаться ампула со стерильной водой для инъекций или солевой раствор, чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.[00277] In some embodiments, the ADC-containing composition may be formulated for intravenous administration to humans. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. If necessary, the composition may also contain a solubilizing agent and a local anesthetic, such as lignocaine, to relieve pain at the injection site. Typically, the ingredients in a unit dosage form are administered individually or mixed together, for example as a dry lyophilized powder or an anhydrous concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachet, indicating the amount of active ingredient. When the composition is to be administered by infusion, it can be poured into an infusion bottle containing pharmaceutical grade water or saline. When the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline may be provided so that the ingredients can be mixed before administration.
[00278] В данной области известны другие фармацевтические композиции и способы приготовления фармацевтических композиций, и это описано, например, в «Remington: The Science and Practice of Pharmacy» (раньше «Remingtons Pharmaceutical Sciences»); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000).[00278] Other pharmaceutical compositions and methods for preparing pharmaceutical compositions are known in the art and are described, for example, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy (formerly Remingtons Pharmaceutical Sciences ); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000).
СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯMETHODS OF USE
[00279] Описанные в данном документе ADC могут применяться в способах ингибирования роста HER2-экспрессирующих опухолевых клеток. Клетки могут находиться in vitro или in vivo. В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC могут применять в способах лечения HER2-экспрессирующего ракового заболевания или опухоли у субъекта. [00279] The ADCs described herein can be used in methods of inhibiting the growth of HER2-expressing tumor cells. The cells may be in vitro or in vivo. In some embodiments, ADCs may be used in methods of treating a HER2-expressing cancer or tumor in a subject.
[00280] Лечение HER2-экспрессирующего рака может привести к ослаблению одного или более симптомов, сокращению размера опухоли, подавлению роста опухоли, уменьшению одного или более прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращению метастазирования, снижению скорости прогрессирования заболевания, улучшению или временному облегчению состояния болезни, улучшению выживаемости, увеличению выживаемости без прогрессирования, ремиссии и/или улучшению прогноза. [00280] Treatment of HER2-expressing cancer may reduce one or more symptoms, reduce tumor size, suppress tumor growth, reduce one or more direct or indirect pathological consequences of the disease, prevent metastasis, reduce the rate of disease progression, improve or temporarily alleviate the disease state , improved survival, increased progression-free survival, remission and/or improved prognosis.
[00281] В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение HER2-экспрессирующего рака с помощью ADC, описанного в данном документе, замедляет прогрессирование заболевания. В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение HER2-экспрессирующего рака с помощью ADC, описанного в данном документе, приводит к регрессии опухоли. В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение HER2-экспрессирующего рака с помощью ADC, описанного в данном документе, приводит к подавлению роста опухоли.[00281] In some embodiments, treatment of HER2-expressing cancer with an ADC described herein slows disease progression. In some embodiments, treatment of HER2-expressing cancer with an ADC described herein results in tumor regression. In some embodiments, treatment of HER2-expressing cancer with an ADC described herein results in inhibition of tumor growth.
[00282] HER2-экспрессирующие раковые заболевания, как правило, являются солидными опухолями. Примеры HER2-экспрессирующих солидных опухолей включают, но не ограничивается ими, рак молочной железы, рак яичника, рак легкого, рак желудка, рак пищевода, колоректальный рак, уротелиальный рак, рак поджелудочной железы, рак слюнной железы и рак головного мозга. HER2-экспрессирующий рак молочной железы включает отрицательный по эстрогенным рецепторам (ER-) и/или отрицательный по прогестеронным рецепторам (PR-) раковые заболевания молочной железы и трижды отрицательные (ER-, PR-, низкая экспрессия HER2) раковые заболевания молочной железы. HER2-экспрессирующие раковые заболевания легких включают немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и мелкоклеточный рак легкого. [00282] HER2-expressing cancers are typically solid tumors. Examples of HER2-expressing solid tumors include, but are not limited to, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, urothelial cancer, pancreatic cancer, salivary gland cancer, and brain cancer. HER2-expressing breast cancers include estrogen receptor-negative (ER-) and/or progesterone receptor-negative (PR-) breast cancers and triple-negative (ER-, PR-, low HER2 expression) breast cancers. HER2-expressing lung cancers include non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer.
[00283] В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном документе ADC могут применять при лечении HER2-экспрессирующего рака молочной железы, рака яичника, рака легкого или рака желудка. В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном документе ADC могут применять при лечении HER2-экспрессирующего рака молочной железы. В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном документе ADC могут применять при лечении HER2-экспрессирующего рака молочной железы, который также является отрицательным по эстрогенным и прогестероновым рецепторам. В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном документе ADC могут применять при лечении HER2-экспрессирующего трижды отрицательного рака молочной железы (TNBC). В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном документе ADC могут применять при лечении HER2-экспрессирующего рака молочной железы, который метастазировал в головной мозг. В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном документе ADC могут применять при лечении HER2-экспрессирующего рака яичника.[00283] In some embodiments, the ADCs described herein can be used in the treatment of HER2-expressing breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, or gastric cancer. In some embodiments, the ADCs described herein can be used in the treatment of HER2-expressing breast cancer. In some embodiments, the ADCs described herein can be used in the treatment of HER2-expressing breast cancer that is also estrogen and progesterone receptor negative. In some embodiments, the ADCs described herein can be used in the treatment of HER2-expressing triple-negative breast cancer (TNBC). In some embodiments, the ADCs described herein can be used in the treatment of HER2-expressing breast cancer that has metastasized to the brain. In some embodiments, the ADCs described herein can be used in the treatment of HER2-expressing ovarian cancer.
[00284] Как известно в данной области, HER2-экспрессирующие раковые заболевания могут характеризоваться по уровню HER2, которые они экспрессируют (т. е. по «статусу HER2»). Статус HER2 может оцениваться, например, методами иммуногистохимии (ИГХ), флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и хромогенной гибридизации in situ (CISH).[00284] As is known in the art, HER2-expressing cancers can be characterized by the level of HER2 they express ( ie, “HER2 status”). HER2 status can be assessed, for example, by immunohistochemistry (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH), and chromogenic in situ hybridization (CISH).
[00285] Методы ИГХ выявляют экспрессию белка HER2 на клеточной мембране. Залитые парафином срезы тканей, полученные в результате биопсии опухоли, могут подвергать ИГХ-анализу, и им могут присваивать критерии интенсивности окрашивания HER2, указанные ниже: [00285] IHC methods detect the expression of HER2 protein on the cell membrane. Paraffin-embedded tissue sections obtained from tumor biopsies can be subjected to IHC analysis and assigned HER2 staining intensity criteria as follows:
Оценка 0: отсутствие наблюдаемого окрашивания или наблюдается окрашивание мембран у менее 10% опухолевых клеток; как правило <20 000 рецепторов/клетку.Score 0: no observed staining or membrane staining observed in less than 10% of tumor cells; typically <20,000 receptors/cell.
Оценка 1+: слабое/едва заметное окрашивание мембран выявляется у более 10% опухолевых клеток. Клетки окрашены лишь в части своих мембран. Как правило, около 100 000 рецепторов/клетку.Score 1+: weak/barely noticeable membrane staining is detected in more than 10% of tumor cells. Cells are stained only in part of their membranes. Typically about 100,000 receptors/cell.
Оценка 2+: от слабого до умеренного окрашивания мембран выявляется у более 10% опухолевых клеток; как правило, около 500 000 рецепторов/клетку. Score 2+: weak to moderate membrane staining is detected in more than 10% of tumor cells; typically about 500,000 receptors/cell.
Оценка 3+: от умеренного до сильного окрашивания мембран выявляется у более 10% опухолевых клеток; как правило, около 2 000 000 рецепторов/клетку.Score 3+: moderate to strong membrane staining is detected in more than 10% of tumor cells; typically about 2,000,000 receptors/cell.
[00286] Опухоли с оценками 0 или 1+ для экспрессии HER2 характеризуют как HER2-отрицательные, тогда как опухоли с оценками 2+ или 3+ характеризуются как HER2-положительные.[00286] Tumors with scores of 0 or 1+ for HER2 expression are characterized as HER2-negative, while tumors with scores of 2+ or 3+ are characterized as HER2-positive.
[00287] Примеры FDA-одобренных коммерческих наборов, доступных для выявления HER2 с использованием ИГХ включают HercepTest™ (Dako Denmark A/S); PATHWAY (Ventana Medical Systems, Inc.); набор InSite™HER2/NEU (Biogenex Laboratories, Inc.) и ИГХ-систему Bond Oracle HER2 (Leica Biosystems).[00287] Examples of FDA-approved commercial kits available for HER2 detection using IHC include HercepTest™ (Dako Denmark A/S); PATHWAY (Ventana Medical Systems, Inc.); InSite™HER2/NEU kit (Biogenex Laboratories, Inc.) and Bond Oracle HER2 IHC system (Leica Biosystems).
[00288] Описанные в данном документе ADC могут применяться при лечении раковых заболеваний, которые экспрессируют HER2 на различных уровнях. В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC могут применять при лечении раковых заболеваний, которые экспрессируют высокие уровни HER2 (ИГХ 3+). В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC могут применять при лечении раковых заболеваний, которые экспрессируют высокие уровни HER2 (3+ ИГХ) или умеренные уровни HER2 (2+ ИГХ или 2+/3+ ИГХ). В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC могут применять при лечении раковых заболеваний, которые экспрессируют высокие уровни HER2 (3+ ИГХ), умеренные уровни HER2 (2+ ИГХ или 2+/3+ ИГХ) или низкие уровни HER2 (1+ ИГХ или 1+/2+ ИГХ). В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном документе ADC могут применять при лечении раковых заболеваний, которые оценены по ИГХ как HER2-отрицательные.[00288] The ADCs described herein can be used in the treatment of cancers that express HER2 at various levels. In some embodiments, ADCs can be used in the treatment of cancers that express high levels of HER2 (IHC 3+). In some embodiments, ADCs can be used in the treatment of cancers that express high levels of HER2 (3+ IHC) or moderate levels of HER2 (2+ IHC or 2+/3+ IHC). In some embodiments, ADCs may be used to treat cancers that express high levels of HER2 (3+ IHC), moderate levels of HER2 (2+ IHC or 2+/3+ IHC), or low levels of HER2 (1+ IHC or 1+ /2+ IHC). In some embodiments, the ADCs described herein can be used in the treatment of cancers that are assessed as HER2 negative by IHC.
[00289] В некоторых вариантах осуществления изобретения уровни HER2 рака, который необходимо лечить с помощью ADC, определяются методом ИГХ. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровни HER2 рака, который необходимо лечить с помощью ADC, определяются методом ИГХ, выполняемым с использованием анализа Herceptest™. [00289] In some embodiments, the HER2 levels of the cancer to be treated with an ADC are determined by IHC. In some embodiments, the HER2 levels of the cancer to be treated with the ADC are determined by IHC performed using the Herceptest™ assay.
[00290] HER2-экспрессирующие раковые заболевания могут быть гомогенными по характеру (т. е. большинство опухолевых клеток экспрессируют сходные количества HER2), или они могут быть гетерогенными по характеру (т. е. содержать различные популяции опухолевых клеток, экспрессирующих различные уровни HER2). Подразумевается, что ADC могут применяться для лечения HER2-экспрессирующих раковых заболеваний, которые являются либо гомогенными, либо гетерогенными применительно к уровням HER2. [00290] HER2-expressing cancers can be homogeneous in nature ( i.e., most tumor cells express similar amounts of HER2), or they can be heterogeneous in nature ( i.e., contain different populations of tumor cells expressing different levels of HER2) . It is understood that ADCs can be used to treat HER2-expressing cancers that are either homogeneous or heterogeneous in terms of HER2 levels.
[00291] В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC находят применение в способах лечения субъекта с HER2-экспрессирующим раком, который является резистентным или становится резистентным к другим терапевтическим средствам стандартов лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC находят применение в способах лечения субъекта с HER2-экспрессирующим раком, который не поддается лечению одним или более действующими терапевтическим средствам, таким как трастузумаб (Herceptin®), пертузумаб (Perjeta®), T-DM1 (Kadcyla® или трастузумаб эмтансин) или таксаны (такие как такие как паклитаксел, доцетаксел, кабазитаксел и т. п.). В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC находят применение в способах лечения субъекта с HER2-экспрессирующим раком, который является резистентным к трастузумабу. В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC находят применение в способах лечения субъекта с HER2-экспрессирующим раком, который является резистентным к пертузумабу. В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC находят применение в способах лечения субъекта с HER2-экспрессирующим раком, который является резистентным к T-DM1. В некоторых вариантах осуществления изобретения ADC находят применение при лечении метастатического рака, когда у пациента произошло прогрессирование после предыдущей анти-HER2 терапии.[00291] In some embodiments, ADCs find use in methods of treating a subject with a HER2-expressing cancer that is resistant or becoming resistant to other standard of care therapeutics. In some embodiments, ADCs find use in methods of treating a subject with a HER2-expressing cancer that is refractory to one or more existing therapeutic agents, such as trastuzumab (Herceptin®), pertuzumab (Perjeta®), T-DM1 (Kadcyla® or trastuzumab emtansine) or taxanes (such as paclitaxel, docetaxel, cabazitaxel, etc.). In some embodiments, ADCs find use in methods of treating a subject with HER2-expressing cancer that is resistant to trastuzumab. In some embodiments, ADCs find use in methods of treating a subject with HER2-expressing cancer that is resistant to pertuzumab. In some embodiments, ADCs find use in methods of treating a subject with HER2-expressing cancer that is resistant to T-DM1. In some embodiments, ADCs find use in the treatment of metastatic cancer where the patient has progressed following previous anti-HER2 therapy.
[00292] Когда ADC используются при лечении субъектов с HER2-экспрессирующим раком, резистентным, рефрактерным и/или рецидивирующим после лечения другим терапевтическим агентом, то ADC могут быть частью терапии второй линии или терапией третьей или четвертой линии, в зависимости от количества предыдущих лечений, которые прошел субъект. [00292] When ADCs are used in the treatment of subjects with HER2-expressing cancer that is refractory, refractory, and/or relapsed after treatment with another therapeutic agent, the ADCs may be part of second-line therapy or third or fourth-line therapy, depending on the number of previous treatments. which the subject went through.
[00293] В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном документе ADC могут применять в сочетании с дополнительным противоопухолевым агентом при лечении субъектов с HER2-экспрессирующим раком. Дополнительный противоопухолевый агент может представлять собой терапевтическое антитело, такое как отмеченные выше, или химиотерапевтический агент. Химиотерапевтические агенты, обычно используемые для лечения HER2-экспрессирующих раковых заболеваний включают в себя, например, цисплатин, карбоплатин, паклитаксел, связанный с альбумином паклитаксел Abraxane®), доцетаксел, гемцитабин, винорелбин, иринотекан, этопозид, винбластин, пеметрексед, 5-фторурацил (с или без фолиновой кислоты), капецитабин, карбоплатин, эпирубицин, оксаплатин, фолфиринокс, циклофосфамид и различные комбинации этих агентов, известных в данной области. Субъекту могут вводит дополнительный(-ые) агент(-ы) параллельно или последовательно с ADC.[00293] In some embodiments, the ADCs described herein may be used in combination with an additional antineoplastic agent in the treatment of subjects with HER2-expressing cancer. The additional antitumor agent may be a therapeutic antibody, such as those noted above, or a chemotherapeutic agent. Chemotherapeutic agents commonly used to treat HER2-expressing cancers include, for example, cisplatin, carboplatin, paclitaxel, albumin-bound paclitaxel Abraxane®), docetaxel, gemcitabine, vinorelbine, irinotecan, etoposide, vinblastine, pemetrexed, 5-fluorouracil ( with or without folinic acid), capecitabine, carboplatin, epirubicin, oxaplatin, folfirinox, cyclophosphamide and various combinations of these agents known in the art. The subject may be administered additional agent(s) in parallel or sequentially with the ADC.
[00294] В некоторых вариантах осуществления изобретения подразумевается, что описанные в данном документе ADC могут применять для лечения субъекта с HER2-экспрессирующим раком, который не проходил какие-либо предварительные противораковые лечения (т. е. ADC могут использовать как терапию первой линии). [00294] In some embodiments, it is contemplated that the ADCs described herein may be used to treat a subject with a HER2-expressing cancer who has not received any prior anticancer treatment ( ie, the ADCs may be used as first-line therapy).
[00295] В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект, проходящий лечение с помощью ADC вышеуказанными способами, может быть человеком, человекообразным приматом или другим млекопитающим. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект, проходящий лечение с помощью ADC вышеуказанными способами, является человеком.[00295] In some embodiments, the subject being treated with an ADC by the above methods may be a human, great ape, or other mammal. In some embodiments, the subject being treated with an ADC by the above methods is a human.
[00296] Количество ADC, которое необходимо вводить субъекту, будет варьировать с учетом соответствующих обстоятельств, включающих состояние, требующее лечения, выбранный путь введения, вводимое в настоящее время соединение, возраст, вес и ответную реакцию конкретного субъекта, и тяжесть симптомов субъекта, на также и терапевтически эффективное количество. [00296] The amount of ADC to be administered to a subject will vary depending on the relevant circumstances, including the condition requiring treatment, the route of administration selected, the compound currently being administered, the age, weight and response of the particular subject, and the severity of the subject's symptoms, as well and a therapeutically effective amount.
[00297] Термин «терапевтически эффективное количество», используемый в данном документе, относится к количеству ADC, требуемому для введения с целью достижения задачи указанного способа, например облегчения одного или более симптомов заболевания, проходящего лечение. Количество ADC, описанных в данном документе, которые будут эффективными при лечении HER2-экспрессирующего рака, могут определять стандартными клиническими методиками. Кроме того, анализы in vitro необязательно могут использовать для облегчения определения оптимальных диапазонов доз. Эффективные дозы экстраполируют из кривых доза-ответ, полученных при испытаниях in vitro или на модельных системах с животными.[00297] The term “therapeutically effective amount” as used herein refers to the amount of ADC required to be administered to achieve the objective of the method, eg, alleviation of one or more symptoms of the disease being treated. The number of ADCs described herein that will be effective in the treatment of HER2-expressing cancer can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays may not necessarily be used to facilitate the determination of optimal dosage ranges. Effective doses are extrapolated from dose-response curves obtained from in vitro testing or animal model systems.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ НАБОРЫPHARMACEUTICAL KITS
[00298] В некоторых вариантах осуществления предлагаются фармацевтические наборы, содержащие описанные в данном документе ADC. [00298] In some embodiments, pharmaceutical kits are provided containing ADCs described herein.
[00299] Набор, как правило, содержит контейнер и размещенную с контейнером или находящуюся на нем этикетку и/или вкладыш в упаковку. Этикетка или вкладыш в упаковку содержит инструкции, в обычном порядке включенные в коммерческие упаковки терапевтических препаратов, предоставляющие информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся использования таких терапевтических препаратов. Этикетка или вкладыш в упаковку могут дополнительно включать указание в предписанной государственным органом форме, регулирующее производство, применение или продажу фармацевтических или биологических препаратов, упоминание которого отображает одобрение этим органом производства, применения или продажи препарата для введения людям или животным. На этикетке или вкладыше в упаковку также указывается, что ADC предназначен для применения при лечении HER2-экспрессирующего ракового заболевания. В контейнере находится композиция, содержащая ADC, и, в некоторых варианте осуществления изобретения, контейнер имеет стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного введения или флакон с пробкой, которая может прокалываться иглой для внутрикожной инъекции).[00299] The kit typically includes a container and a label and/or package insert placed with or on the container. The label or package insert contains instructions routinely included in commercial packages of therapeutic drugs providing information regarding the indications, uses, dosage, administration, contraindications and/or warnings regarding the use of such therapeutic drugs. The label or package insert may additionally include a statement in a form prescribed by a governmental agency regulating the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biologicals, the mention of which indicates that agency's approval of the manufacture, use, or sale of the drug for administration to humans or animals. The label or package insert also states that the ADC is intended for use in the treatment of HER2-expressing cancer. The container contains a composition containing an ADC, and, in some embodiment, the container has a sterile access port (eg, the container may be an intravenous bag or a vial with a stopper that can be pierced by an intradermal injection needle).
[00300] В дополнению к контейнеру, содержащему композицию, включающую ADC, набор может включать в себя один или более дополнительных контейнеров, содержащих другие компоненты набора. Например, фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом солевой раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы; другие буферные растворы или разбавители.[00300] In addition to the container containing the composition including the ADC, the kit may include one or more additional containers containing other components of the kit. For example, a pharmaceutically acceptable buffer such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution or dextrose solution; other buffer solutions or diluents.
[00301] Подходящий контейнер включает, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты для внутривенных растворов и т. п. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Если необходимо, один или более компонентов набора могут быть лиофилизированы или предоставлены в сухой форме, такой как порошок или гранулы, и набор может дополнительно содержать подходящий растворитель для восстановления лиофилизированного(-ых) или сухого(-их) компонентов.[00301] Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, IV bags, and the like. Containers can be made from a variety of materials, such as glass or plastic. If desired, one or more components of the kit may be lyophilized or provided in dry form, such as powder or granules, and the kit may further contain a suitable solvent for reconstituting the lyophilized or dry components.
[00302] Набор может дополнительно содержать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, включая фильтры, иглы и шприцы. [00302] The kit may further contain other materials desirable from a commercial and user perspective, including filters, needles, and syringes.
[00303] Следующие примеры являются исключительно иллюстративными и никоим образом не подразумевают ограничения объема данного изобретения.[00303] The following examples are illustrative only and are in no way intended to limit the scope of the present invention.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
ПРИМЕР 1. СИНТЕЗ ЛИНКЕР-ТОКСИНАEXAMPLE 1. SYNTHESIS OF LINKER TOXIN
[00304] В следующих примерах описывается препарат типового линкер-токсина (линкер-токсин 001), который содержит следующий аналог ауристатина (соединение 9):[00304] The following examples describe a generic linker toxin preparation (linker toxin 001) that contains the following auristatin analogue (compound 9 ):
[00305] Могут применять сходные протоколы для получения линкер-токсинов, содержащих другие аналоги ауристатина, включая следующие типовые соединения (см. также международную публикацию патентной заявки № WO 2016/041082):[00305] Similar protocols can be used to prepare linker toxins containing other auristatin analogues, including the following exemplary compounds (see also International Patent Application Publication No. WO 2016/041082):
1.1 Этил (2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропаноат (соединение 1)1.1 Ethyl (2R,3R)-3-methoxy-2-methyl-3-((S)-pyrrolidin-2-yl)propanoate (compound 1)
[00306] К перемешиваемому раствору (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислоты (Boc-Dap-OH, 4,31 г, 15,0 ммоль) в абсолютном этаноле (27,0 мл) при 0oC добавляли по каплям тионилхлорид (3,0 мл). Полученному раствору дали возможность нагреться до комнатной температуры, и прохождение реакции отслеживали методом ВЭЖХ-МС. Через 18 часов не было обнаружено остаточного исходного вещества, и раствор концентрировали до сухого состояния под пониженным давлением. Полученное масло суспендировали в толуоле (10 мл) и дважды концентрировали под пониженным давлением, затем суспендировали в диэтиловом эфире (5 мл) и дважды концентрировали под пониженным давлением с получением белой твердой пены (3,78 г, количественный выход%). МС набл. m/z = 216,5 (M+1).[00306] To a stirred solution of (2R,3R)-3-((S)-1-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-2-yl)-3-methoxy-2-methylpropanoic acid (Boc-Dap-OH, 4, 31 g, 15.0 mmol) in absolute ethanol (27.0 ml) at 0 o C was added dropwise thionyl chloride (3.0 ml). The resulting solution was allowed to warm to room temperature, and the progress of the reaction was monitored by HPLC-MS. After 18 hours, no residual starting material was detected and the solution was concentrated to dryness under reduced pressure. The resulting oil was suspended in toluene (10 ml) and concentrated twice under reduced pressure, then suspended in diethyl ether (5 ml) and concentrated twice under reduced pressure to give a white solid foam (3.78 g, quantitative yield%). MS obs. m/z = 216.5 (M+1).
1.2 (3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((бензилокси)карбонил)амино)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептановая кислота (соединение 3)1.2 (3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-N,3-dimethylbutanamido)-3-methoxy-5-methylheptanoic acid (compound 3)
[00307] Соединение 2 получали как описано в международной публикации патентной заявки № WO 2016/041082. [00307] Compound 2 was prepared as described in International Patent Application Publication No. WO 2016/041082.
[00308] К перемешиваемому раствору соединения 2 (6,965 г, 14,14 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (5,0 мл). Реакцию отслеживали на завершение методом ВЭЖХ-МС, и через 40 часов исходное вещество израсходовалось. Реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением, испаряя вместе с толуолом (2 x 10 мл) и дихлорметаном (2 x 10 мл) с получением пенистого белого твердого вещества (6,2 г, количественный выход с остаточной ТФК). Это вещество растворяли в 200 мл горячей смеси 1:3 EtOAc:гексаны и давали возможность охладиться до комнатной температуры. Во время охлаждения образовался осадок, а также немного мелких кристаллов. Добавили 5 мл EtOAc и суспензию снова нагрели, чтобы полностью растворить осадок. При охлаждении до комнатной температуры кристаллов образовалось больше, и колбу оставили на ночь при -30 °С. На следующее утро маточную жидкость декантировали, и кристаллы промывали гексанами 2 x 50 мл и высушивали под высоким вакуумом. Выделили 5,67 г кристаллического продукта. МС набл. m/z = 405,7 (M+1).[00308] Trifluoroacetic acid (5.0 mL) was added to a stirred solution of Compound 2 (6.965 g, 14.14 mmol) in dichloromethane (20 mL). The reaction was monitored for completion by HPLC-MS and the starting material was consumed after 40 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure by evaporation with toluene (2 x 10 ml) and dichloromethane (2 x 10 ml) to give a foamy white solid (6.2 g, quantitative yield with residual TPA). This material was dissolved in 200 ml of a hot mixture of 1:3 EtOAc:hexanes and allowed to cool to room temperature. During cooling, a precipitate formed, as well as some small crystals. 5 ml EtOAc was added and the suspension was heated again to completely dissolve the precipitate. When cooled to room temperature, more crystals formed, and the flask was left overnight at -30 °C. The next morning, the mother liquor was decanted and the crystals were washed with 2 x 50 ml hexanes and dried under high vacuum. 5.67 g of crystalline product was isolated. MS obs. m/z = 405.7 (M+1).
1.3 Этил (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((бензилокси)карбонил)амино)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноат (соединение 4)1.3 Ethyl (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-N,3-dimethylbutanamido )-3-methoxy-5-methylheptanoyl)pyrrolidin-2-yl)-3-methoxy-2-methylpropanoate (compound 4)
[00309] К перемешиваемому раствору соединения 3 (6,711 г, 15,37 ммоль, 1,025 эквив.) в смеси дихлорметана (5,0 мл) и N,N-диметилформамида (5,0 мл) при комнатной температуре добавляли HATU (5,732 г, 15,07 ммоль, 1,005 эквив.) и N,N-диизопропилэтиламин (7,84 мл, 3 эквив.). После 30 минут перемешивания при комнатной температуре добавляли по каплям раствор соединения 1 (3,776 г, 15,00 ммоль, 1,0 эквив) в смесь дихлорметана (1,0 мл) и N,N-диметилформамида (1,0 мл), смывая остатки соединения 1 дополнительными 3 мл смеси 1:1 дихлорметана:N,N-диметилформамида. Реакцию отслеживали методом ВЭЖХ-МС и через 15 минут не наблюдали оставшегося соединения 1. Реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением, разбавляли этилацетатом (~125 мл), и органическую фазу извлекали 1 M HCl (2 x 50 мл), 1 x dH2O (1 x 50 мл), насыщенным NaHCO3 (3 x 50 мл), солевым раствором (25 мл). Кислотные и основные водные слои промывали 25 мл EtOAc. Затем все органические вещества объединяли и высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали с образованием красного масла. Остаток растворяли в минимальном количестве дихлорметана (~10 мл), загружали на 360 г силикагелевой колонке Biotage® SNAP Ultra (система флеш-хроматографии Isolera™; Biotage AB, Швеция) для очистки (20–100% EtOAc в гексанах более 10 объемов колонки). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли с выделением 7,9 г пенистого белого твердого вещества. Фракции с примесями подвергали второй очистке на 100 г силикагелевой колонке Biotage® SNAP Ultra и объединяли с чистым продуктом с выделением белого пенистого твердого вещества (8,390 г, 88,3 %). МС набл. m/z = 634,7 (M+1).[00309] To a stirred solution of compound 3 (6.711 g, 15.37 mmol, 1.025 equiv.) in a mixture of dichloromethane (5.0 ml) and N,N -dimethylformamide (5.0 ml) at room temperature was added HATU (5.732 g , 15.07 mmol, 1.005 equiv.) and N,N -diisopropylethylamine (7.84 ml, 3 equiv.). After 30 minutes of stirring at room temperature, a solution of compound 1 (3.776 g, 15.00 mmol, 1.0 equiv) was added dropwise to a mixture of dichloromethane (1.0 ml) and N,N -dimethylformamide (1.0 ml), rinsing the remainder of compound 1 with an additional 3 ml of a 1:1 mixture of dichloromethane: N,N -dimethylformamide. The reaction was monitored by HPLC-MS and no remaining compound 1 was observed after 15 minutes. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, diluted with ethyl acetate (~125 ml), and the organic phase was taken up with 1 M HCl (2 x 50 ml), 1 x dH 2 O (1 x 50 ml), saturated NaHCO 3 (3 x 50 ml) , saline solution (25 ml). The acidic and basic aqueous layers were washed with 25 ml EtOAc. All organics were then combined and dried over MgSO 4 , filtered and concentrated to form a red oil. The residue was dissolved in a minimal amount of dichloromethane (~10 ml), loaded onto a 360 g Biotage ® SNAP Ultra silica gel column (Isolera™ flash chromatography system; Biotage AB, Sweden) for purification (20–100% EtOAc in hexanes over 10 column volumes) . Fractions containing pure product were combined to isolate 7.9 g of a foamy white solid. The impurity fractions were subjected to a second purification on a 100 g Biotage ® SNAP Ultra silica gel column and combined with the pure product to isolate a white foamy solid (8.390 g, 88.3%). MS obs. m/z = 634.7 (M+1).
1.4 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((бензилокси)карбонил)амино)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановая кислота (соединение 5)1.4 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-N,3-dimethylbutanamido) -3-methoxy-5-methylheptanoyl)pyrrolidin-2-yl)-3-methoxy-2-methylpropanoic acid (compound 5)
[00310] К перемешиваемому раствору соединения 4 (8,390 г, 13,24 ммоль) в 1,4-диоксане (158 мл) добавляли dH2O (39,7 мл) и моногидрат гидроксида лития (1 M в H2O, 39,7 мл, 3 эквив.). Реакционную смесь перемешивали при 4 °C и отслеживали методом ВЭЖХ-МС на расходование исходного вещества, что заняло 3 суток, пока не осталось лишь следов соединения 4. В ходе реакции в небольшом процентном соотношении в дополнение к требуемому веществу образовался новый продукт, соответствующий потере метанола (β-отщепление, <2%). Реакционную смесь подкисляли добавлением 1 M водного HCl (50 мл) и концентрировали под пониженным давлением для удаления диоксана. Оставшуюся реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (4 x 50 мл), и органическую фазу объединяли, промывали солевым раствором (15 мл + 2 мл 2 M HCl), высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали под пониженным давлением с получением слабоокрашенного масла. Масло повторно растворяли в диэтиловом эфире (~50 мл) и концентрировали под пониженным давлением (3x) для облегчения удаления остаточного диоксана, получая указанный в заголовке продукт в густого масла (7,81 г, выход 97% с незначительным остатком диоксана и соединения 4). МС набл. m/z = 606,7 (M+1).[00310] To a stirred solution of compound 4 (8.390 g, 13.24 mmol) in 1,4-dioxane (158 ml) was added dH 2 O (39.7 ml) and lithium hydroxide monohydrate (1 M in H 2 O, 39 .7 ml, 3 equiv.). The reaction mixture was stirred at 4 °C and monitored by HPLC-MS for consumption of the starting material, which took 3 days until only traces of compound 4 remained. During the reaction, a small percentage of new product was formed in addition to the desired substance, corresponding to the loss of methanol (β-elimination, <2%). The reaction mixture was acidified by adding 1 M aqueous HCl (50 ml) and concentrated under reduced pressure to remove dioxane. The remaining reaction mixture was extracted with ethyl acetate (4 x 50 ml) and the organic phase was combined, washed with brine (15 ml + 2 ml 2 M HCl), dried over MgSO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure to give a light colored oil. The oil was re-dissolved in diethyl ether (~50 ml) and concentrated under reduced pressure (3x) to facilitate removal of residual dioxane, yielding the title product in a thick oil (7.81 g, 97% yield with trace amounts of dioxane and compound 4 ) . MS obs. m/z = 606.7 (M+1).
1.5 Бензил((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((4-(2,2,2-трифторацетамидо)фенил)сульфонамидо)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат (соединение 7)1.5 Benzyl((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-methoxy-1-((S)-2-((1R,2R)-1-methoxy-2-methyl-3-oxo -3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)phenyl)sulfonamido)propyl)pyrrolidin-1-yl)-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl)(methyl)amino)-3-methyl -1-oxobutan-2-yl)carbamate (compound 7)
[00311] Соединение 6 получали как описано в международной публикации патентной заявки № WO 2016/041082.[00311] Compound 6 was prepared as described in International Patent Application Publication No. WO 2016/041082.
[00312] К перемешиваемому раствору соединения 5 (7,12 г, 11,754 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли 2,2,2-трифтор-N-(4-сульфамоилфенил)ацетамид (соединение 6, 4,095 г, 1,3 эквив., растворенный в 3 мл ДМФ), N,N-диметилпиридин (1,867 г, 1,3 эквив.) и N,N-диметилформамид (1,5 мл) с образованием светло-желтой суспензии. Дополнительное добавление 5 мл ДМФ не сделало раствор прозрачным. N-(3-диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимида гидрохлорид (EDCI) (2,817 г, 1,25 эквив.) добавляли одной порцией и отслеживали реакцию методом ВЭЖХ-МС. Через 48 ч реакция переставала проходить и добавляли дополнительных 400 мг EDCI. Через 18 часов не наблюдалось остатка исходного вещества, и реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением с получением желтого масла. Масло растворяли в этилацетате (~150 мл) и 1 M HCl (20 мл), и органическую фазу промывали холодной 2 M HCl (2 x 10 мл), насыщенным NaHCO3 (1 x 10 мл), солевым раствором (20 мл + 5 мл 2 M HCl). Кислотные и основные водные фракции экстрагировали с помощью EtOAc (1 x 20 мл), все органические фракции объединяли, высушивали над MgSO4 и концентрировали под пониженным давлением с получением маслянистой неочищенной массы (13 г). Остаток растворяли в дихлорметане (~10 мл), загружали на 360 г силикагелевой колонке Biotage® SNAP Ultra и очищали градиентом 10–100% EtOAc (2% AcOH) в гексанах более 12 объемов колонки с плато при 50% EtOAc 3-колоночными объемами. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, концентрировали под пониженным давлением, растворяли и концентрировали из толуола (2 x 10 мл) и диэтилового эфира (2 x 10 мл) с получением требуемого продукта, 7,1 г пенистого белого твердого вещества. Фракции с примесями подвергали повторной очистке в условиях более пологого градиента с использованием 100 г силикагелевой колонке Biotage® SNAP Ultra на приборе Isolera™. Все чистые фракции объединяли для выделения чистого продукта в виде пенистого белого твердого вещества (8,60 г, 86%). МС набл. m/z = 856,7 (M+1).[00312] To a stirred solution of compound 5 (7.12 g, 11.754 mmol) in dichloromethane (20 ml) was added 2,2,2-trifluoro-N-(4-sulfamoylphenyl)acetamide (compound 6 , 4.095 g, 1.3 equiv., dissolved in 3 ml of DMF), N,N -dimethylpyridine (1.867 g, 1.3 equiv.) and N,N -dimethylformamide (1.5 ml) to form a light yellow suspension. Additional addition of 5 ml DMF did not make the solution clear. N- (3-dimethylaminopropyl) -N' -ethylcarbodiimide hydrochloride (EDCI) (2.817 g, 1.25 equiv.) was added in one portion and the reaction was monitored by HPLC-MS. After 48 hours the reaction ceased and an additional 400 mg of EDCI was added. After 18 hours, no residue of starting material was observed and the reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a yellow oil. The oil was dissolved in ethyl acetate (~150 ml) and 1 M HCl (20 ml), and the organic phase was washed with cold 2 M HCl (2 x 10 ml), saturated NaHCO 3 (1 x 10 ml), brine (20 ml + 5 ml 2 M HCl). The acidic and basic aqueous fractions were extracted with EtOAc (1 x 20 ml), all organic fractions were combined, dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure to give an oily crude mass (13 g). The residue was dissolved in dichloromethane (~10 mL), loaded onto a 360 g Biotage ® SNAP Ultra silica gel column, and purified with a gradient of 10–100% EtOAc (2% AcOH) in hexanes over 12 column volumes with a plateau at 50% EtOAc in 3-column volumes. Fractions containing pure product were combined, concentrated under reduced pressure, dissolved and concentrated from toluene (2 x 10 ml) and diethyl ether (2 x 10 ml) to give the desired product, 7.1 g of a foamy white solid. Fractions containing impurities were repurified using a flatter gradient using a 100 g Biotage ® SNAP Ultra silica gel column on an Isolera™ instrument. All pure fractions were combined to isolate the pure product as a foamy white solid (8.60 g, 86%). MS obs. m/z = 856.7 (M+1).
1.6 (S)-2-амино-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((4-(2,2,2-трифторацетамидо)фенил)сульфанамидо)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид (соединение 7a)1.6 (S)-2-amino-N-((3R,4S,5S)-3-methoxy-1-((S)-2-((1R,2R)-1-methoxy-2-methyl-3- oxo-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)phenyl)sulfanamido)propyl)pyrrolidin-1-yl)-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl)-N,3-dimethylbutanamide (compound 7a)
[00313] Соединение 7 (3,71 г, 4,33 ммоль) растворяли в 10% N,N-диметилформамид в этилацетате (30 мл) в круглодонной колбе, содержащей магнитную мешалку и оснащенную 3-ходовым переходником газопровода. Сосуд был дважды вакуумировали под пониженным давлением и заполняли газообразным азотом. Одной порцией добавляли 10% палладий на углероде (0,461 г, 0,1 эквив.), устанавливали на колбу 3-ходовой переходник, к переходнику подсоединяли баллон с водородом, и сосуд дважды вакуумировали под пониженным давлением и заполняли водородом. Оставляли реакционную смесь перемешиваться в течение 2 суток, за этот период времени баллон с водородом периодически заменяли. Через приблизительно 48 ч анализ ВЭЖХ-MS показал расходование исходного вещества. Реакционную смесь разбавляли метанолом (20 мл) и фильтровали через вставку с целитом. Целит промывали метанолом (2 x 50 мл). Все фильтраты объединяли и концентрировали под пониженным давлением, и полученное в результате масло растворяли и концентрировали из дихлорметана. После высыхания под пониженным давлением выделяли указанное в заголовке соединение в виде бесцветного порошка (3,10 г, 99%). МС набл. m/z = 722,6 (M+1).[00313] Compound 7 (3.71 g, 4.33 mmol) was dissolved in 10% N,N -dimethylformamide in ethyl acetate (30 mL) in a round bottom flask containing a magnetic stirrer and equipped with a 3-way gas line adapter. The vessel was evacuated twice under reduced pressure and filled with nitrogen gas. 10% palladium on carbon (0.461 g, 0.1 equiv.) was added in one portion, a 3-way adapter was installed on the flask, a hydrogen cylinder was connected to the adapter, and the vessel was evacuated twice under reduced pressure and filled with hydrogen. The reaction mixture was left to stir for 2 days, during which time the hydrogen cylinder was periodically replaced. After approximately 48 hours, HPLC-MS analysis indicated consumption of the starting material. The reaction mixture was diluted with methanol (20 ml) and filtered through a celite pad. Celite was washed with methanol (2 x 50 ml). All filtrates were combined and concentrated under reduced pressure, and the resulting oil was dissolved and concentrated from dichloromethane. After drying under reduced pressure, the title compound was isolated as a colorless powder (3.10 g, 99%). MS obs. m/z = 722.6 (M+1).
1.7 (S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((4-(2,2,2-трифторацетамидо)фенил)сульфонамидо) пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид (соединение 8)1.7 (S)-2-((S)-2-(dimethylamino)-3-methylbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-3-methoxy-1-((S)-2-((1R ,2R)-1-methoxy-2-methyl-3-oxo-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)phenyl)sulfonamido)propyl)pyrrolidin-1-yl)-5-methyl-1- oxoheptan-4-yl)-N,3-dimethylbutanamide (compound 8)
[00314] К перемешиваемому раствору N,N-(L)-диметилвалина (1,696 г, 9,35 ммоль) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли HATU (3,216 г, 8,46 ммоль) и ди-изопропилэтиламин (3,10 мл, 17,8 ммоль). Через 5 минут образовался прозрачный желтый раствор. Перемешивание продолжали еще дополнительных 10 минут, затем одной порцией добавляли соединение 7a (3,213 г, 4,45 ммоль). После дополнительного 1 ч перемешивания, метод ВЭЖХ-МС показал, что остались следовые количества соединения 7a, и реакцию продолжили на 16 ч. Затем реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением, разбавляли этилацетатом (120 мл) и 40 мл 1:1 NaHCO3 (насыщ.): 5% LiCl и переносили в разделительную воронку. Удаляли водный слой и органическую фазу промывали LiCl (1 x 20 мл), NaHCO3 (насыщ., 2 x 20 мл). Водные слои объединяли и экстрагировали EtOAc (3 x 50 мл). Органические слои объединяли и промывали солевым раствором (1 x 20 мл), высушивали сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением разбавленного ДМФ масла, которое концентрировали с помощью ротационного испарителя для удаления остаточного ДМФ, получая 7 г неочищенного масла соломенной окраски. Масло растворяли в минимальном количестве 10% метанола в дихлорметане (~11 мл), загружали на 360 г силикагелевой колонке Biotage® SNAP Ultra для очистки (2–20% MeOH в CH2Cl2 более 15 объемов колонки, продукт элюировали примерно 10–13%). Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяли и концентрировали под пониженным давлением с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветной пены. Фракции с примесями соединяли, выпаривали и подвергали повторной очистке на 100 г силикагелевой колонке Biotage® SNAP Ultra на приборе Isolera™ и соединяли с чистым продуктом из первой колонки с образованием бесцветного пенистого твердого вещества (3,78 г). МС набл. m/z = 850,6 (M+1).[00314] To a stirred solution of N,N- ( L )-dimethylvaline (1.696 g, 9.35 mmol) in N,N -dimethylformamide (10 mL) was added HATU (3.216 g, 8.46 mmol) and di-isopropylethylamine ( 3.10 ml, 17.8 mmol). After 5 minutes, a clear yellow solution formed. Stirring was continued for an additional 10 minutes, then compound 7a (3.213 g, 4.45 mmol) was added in one portion. After an additional 1 hour of stirring, HPLC-MS showed that trace amounts of compound 7a remained and the reaction was continued for 16 hours. The reaction mixture was then concentrated under reduced pressure, diluted with ethyl acetate (120 ml) and 40 ml of 1:1 NaHCO 3 (sat. .): 5% LiCl and transferred to a separatory funnel. The aqueous layer was removed and the organic phase was washed with LiCl (1 x 20 ml), NaHCO 3 (sat., 2 x 20 ml). The aqueous layers were combined and extracted with EtOAc (3 x 50 ml). The organic layers were combined and washed with brine (1 x 20 ml), dried with sodium sulfate, filtered and concentrated to give a diluted DMF oil, which was concentrated using a rotary evaporator to remove residual DMF to give 7 g of a straw colored crude oil. The oil was dissolved in a minimum amount of 10% methanol in dichloromethane (~11 ml), loaded onto a 360 g Biotage ® SNAP Ultra silica gel column for purification (2–20% MeOH in CH 2 Cl 2 over 15 column volumes, product eluted approximately 10–13 %). Fractions containing the desired product were combined and concentrated under reduced pressure to obtain the title compound as a colorless foam. The impurity fractions were combined, evaporated and repurified on a 100 g Biotage® SNAP Ultra silica gel column on an Isolera™ instrument and combined with the pure product from the first column to form a colorless foamy solid (3.78 g). MS obs. m/z = 850.6 (M+1).
1.8 (S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-аминофенил)сульфанамидо)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамид (соединение 9)1.8 (S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-aminophenyl)sulfanamido)-1-methoxy-2-methyl -3-oxopropyl)pyrrolidin-1-yl)-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl)-2-((S)-2-(dimethylamino)-3-methylbutanamido)-N,3 -dimethylbutanamide (compound 9)
[00315] К перемешиваемому раствору соединения 8 (0,980 г, 1,154 ммоль) в 1,4-диоксанах (15 мл) добавляли воду (3,5 мл) и 1 M моногидрат гидроксида лития (3 эквив., 3,46 мл). Оставляли перемешиваться полученной легкой суспензии при 4 °C и контролировали ВЭЖХ-МС до расходования исходного вещества. После завершения превращения (~5 суток) реакционную смесь нейтрализовали 3,46 мл 1 M HCl и концентрировали под пониженным давлением для удаления диоксана. Полученную водную фазу разбавляли 60 мл EtOAc и 5 мл солевого раствора, затем экстрагировали этилацетатом (2 x 30 мл). Органические фракции объединяли, высушивали над Na2SO4, фильтровали и испаряли с получением указанного в заголовке соединения в виде желтовато-коричневого твердого вещества (0,930 г). Rf = 0,5 (8% MeOH в CH2Cl2). МС набл. m/z = 753,7 (M+1).[00315] To a stirred solution of compound 8 (0.980 g, 1.154 mmol) in 1,4-dioxanes (15 ml) was added water (3.5 ml) and 1 M lithium hydroxide monohydrate (3 equiv., 3.46 ml). The resulting light suspension was left to stir at 4 °C and monitored by HPLC-MS until the starting material was consumed. After completion of the transformation (~5 days), the reaction mixture was neutralized with 3.46 ml of 1 M HCl and concentrated under reduced pressure to remove dioxane. The resulting aqueous phase was diluted with 60 ml EtOAc and 5 ml brine, then extracted with ethyl acetate (2 x 30 ml). The organic fractions were combined, dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated to give the title compound as a tan solid (0.930 g). R f = 0.5 (8% MeOH in CH 2 Cl 2 ). MS obs. m/z = 753.7 (M+1).
1.9 2,3,5,6-тетрафторфенил 3-(2-(2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси)этокси)этокси)пропаноат (соединение 15)1.9 2,3,5,6-tetrafluorophenyl 3-(2-(2-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)propanoate ( connection 15)
[00316] В высушенной конической колбе объемом 50 мл растворяли 3-(2-(2-2(-аминоэтокси)этокси)этокси)пропановую кислоту (соединение 14, 1,000 г, 4,52 ммоль) и малеиновый ангидрид (0,443 г, 4,52 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов в атмосфере N2, после чего охлаждали до 0 °C и добавляли по каплям син-коллидин (1,263 мл, 2,1 экв.). В отдельной высушенной конической колбе объемом 50 мл растворяли тетрафторфенол (3,002 г, 4 экв.) в безводном N,N-диметилформамиде (10 мл). Колбу охлаждали до 0 °C в ледяной ванне, и добавляли по каплям трифторуксусный ангидрид (2,548 мл, 4 экв.). Содержимое этой колбы перемешивали в течение 15 минут, после чего по каплям добавляли син-коллидин (2,407 мл, 4 экв.). Оставляли колбу перемешиваться еще 15 минут, а затем содержимое по каплям через шприц добавляли в первую колбу. Реакционной смеси дали возможность нагреться до комнатной температуры, и перемешивание продолжали в атмосфере N2. Реакционную смесь отслеживали методом ВЭЖХ-МС на расходование исходных веществ. Через 6 дней реакция завершилась полным расходованием соединения 14, оставив только соединение 15 и небольшое количество (~5%) промежуточного соединения бис-ТФФ малеинового амида. Реакцию переносили в разделительную воронку, разбавляли диэтиловым эфиром (75 мл) и промывали 5% LiCl (1 x 20 мл), 1 M HCl (2 x 20 мл), насыщ. NaHCO3 (5 x 20 мл) и солевым раствором (1 x 20 мл). Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и испаряли с получением коричневого неочищенного масла с остаточным ДМФ. Неочищенное масло растворяли в 8 мл 1:1 ДМФ:H2O + 0,1% ТФК, загружали на 60 г колонку Biotage® SNAP Ultra C18 (Biotage AB, г. Уппсала, Швеция) и очищали в условиях линейного градиента 30–100% ACN/H2O + 0,1% ТФК более 8 объемами колонки. Чистые фракции объединяли и разбавляли солевым раствором (20 мл), затем экстрагировали 3 x 50 мл Et2O. Объединенный органические вещества высушивали над MgSO4, фильтровали и испаряли для извлечения светло-желтого масла (1,34 г, выход 66%).[00316] In a dried 50 mL conical flask, dissolved 3-(2-(2-2(-aminoethoxy)ethoxy)ethoxy)propanoic acid (compound 14 , 1.000 g, 4.52 mmol) and maleic anhydride (0.443 g, 4 .52 mmol) in anhydrous N,N -dimethylformamide (5 ml). The reaction mixture was stirred at room temperature for 6 hours under N 2 atmosphere, after which it was cooled to 0 °C and syn -collidine (1.263 ml, 2.1 eq.) was added dropwise. In a separate dried 50 mL conical flask, tetrafluorophenol (3.002 g, 4 eq.) was dissolved in anhydrous N,N -dimethylformamide (10 mL). The flask was cooled to 0 °C in an ice bath, and trifluoroacetic anhydride (2.548 mL, 4 eq.) was added dropwise. The contents of this flask were stirred for 15 minutes, after which syn -collidine (2.407 ml, 4 eq.) was added dropwise. The flask was left to stir for another 15 minutes, and then the contents were added dropwise through a syringe to the first flask. The reaction mixture was allowed to warm to room temperature and stirring was continued under N 2 atmosphere. The reaction mixture was monitored by HPLC-MS for consumption of starting materials. After 6 days, the reaction had completely consumed compound 14 , leaving only compound 15 and a small amount (~5%) of the bis-TPP maleic amide intermediate. The reaction was transferred to a separatory funnel, diluted with diethyl ether (75 ml) and washed with 5% LiCl (1 x 20 ml), 1 M HCl (2 x 20 ml), sat. NaHCO 3 (5 x 20 ml) and saline (1 x 20 ml). The organic layer was dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated to give a brown crude oil with residual DMF. The crude oil was dissolved in 8 ml of 1:1 DMF:H 2 O + 0.1% TFA, loaded onto a 60 g Biotage ® SNAP Ultra C18 column (Biotage AB, Uppsala, Sweden) and purified using a linear gradient of 30–100 % ACN/H 2 O + 0.1% TFA over 8 column volumes. The pure fractions were combined and diluted with brine (20 ml), then extracted with 3 x 50 ml Et 2 O. The combined organics were dried over MgSO 4 , filtered and evaporated to recover a light yellow oil (1.34 g, 66% yield).
1.10 Трет-бутил ((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N, 3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)сульфамоил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат (соединение 12)1.10 Tert-butyl ((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S) -4-((S)-2-((S)-2-(dimethylamino)-3-methylbutanamido)-N,3-dimethylbutanamido)-3-methoxy-5-methylheptanoyl)pyrrolidin-2-yl)-3- methoxy-2-methylpropanoyl)sulfamoyl)phenyl)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-yl)amino)-3-methyl-1-oxobutan-2-yl)carbamate (compound 12)
[00317] Соединение 11 получали как описано в международной публикации патентной заявки № WO 2016/041082.[00317] Compound 11 was prepared as described in International Patent Application Publication No. WO 2016/041082.
[00318] В пустую грушевидную колбу объемом 25 мл добавляли соединение 11 (1,342 г, 3,58 ммоль, 3,0 эквив.), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,664 g, 3,46 ммоль, 2,9 эквив.) и 7-гидрокси-азабензотриазол (HOAT) (0,472 г, 3,46 ммоль, 2,9 эквив.). Эти твердые вещества растворяли в смеси N,N-диметилформамида (0,5 мл) и дихлорметана (4,5 мл) с перемешиванием при комнатной температуре на протяжении 30 минут. Отдельно растворяли соединение 9 (0,900 г, 1,20 ммоль) в смеси N,N-диметилформамида (0,2 мл) и дихлорметана (1,8 мл) и добавляли в грушевидную колбу, ополаскивая дихлорметаном (1,0 мл). Скорость перемешивания увеличивали до 1000 об/мин, создавая завихрение. В течение 2 минут после добавления одной порцией добавляли соединение 9, хлорид меди (II) (0,514 г, 3,83 ммоль, 3,2 эквив.) прямо в центр завихрения через узкую насыпную воронку. Первоначально светло-желтый раствор превращался в темно-коричневую суспензию, которая за 10 минут меняла цвет на темно-зеленую. Реакцию отслеживали на завершение методом ВЭЖХ-МС, и между взятыми через 30 минут и 1 час пробами не наблюдалось никаких изменений в ходе реакции (~95% завершения). Реакционную смесь оставляли перемешивать в течение ночи при комнатной температуре, затем добавляли 2-(2-аминоэтиламино)этанол (0,483 мл, 4,781 ммоль, 4 эквив.), EtOAc (10 мл) и dH2O (5 мл) к перемешиваемой суспензии, которая совершила изменение цвета на темно-синий. Суспензию энергично перемешивали в течение 4 часов по мере того, как суспендированные твердые частицы постепенно растворялись в двухфазной смеси. Эту смесь переносили в разделительную воронку и разбавляли EtOAc (100 мл) и солевым раствором (10 мл), и водный слой экстрагировали 10% IpOH/ EtOAc (4 x 50 мл). Органические слои объединяли и промывали солевым раствором (10 мл), высушивали над Na2SO4, и испаряли с получением слегка голубого неочищенного твердого вещества. Это неочищенное масло растворяли в смеси метанола (0,5 мл) и дихлорметана (6 мл) и очищали на 100 г силикагелевой колонке Biotage® SNAP Ultra (2–20% MeOH в CH2Cl2 более 10 объемов колонки, с последующим плато 8-колоночным объемом 20% MeOH). Продукт элюировался в виде широкого пика после 1–2 объемов колонки ~20% MeOH в CH2Cl2. Фракции, содержащие требуемое вещество, объединяли и концентрировали под пониженным давлением с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (1,105 г, 83%). МС набл. m/z = 555,9 ((M+2)/2), 1109,8 (M+1).[00318] Compound 11 (1.342 g, 3.58 mmol, 3.0 equiv), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (0.664 g, 3.46 mmol) was added to an empty 25 mL pear-shaped flask. , 2.9 equiv.) and 7-hydroxy-azabenzotriazole (HOAT) (0.472 g, 3.46 mmol, 2.9 equiv.). These solids were dissolved in a mixture of N,N -dimethylformamide (0.5 ml) and dichloromethane (4.5 ml) with stirring at room temperature for 30 minutes. Separately, compound 9 (0.900 g, 1.20 mmol) was dissolved in a mixture of N,N -dimethylformamide (0.2 ml) and dichloromethane (1.8 ml) and added to the pear-shaped flask, rinsing with dichloromethane (1.0 ml). The stirring speed was increased to 1000 rpm, creating turbulence. Within 2 minutes of addition, compound 9 , copper(II) chloride (0.514 g, 3.83 mmol, 3.2 equiv.) was added in one portion directly to the center of the swirl through a narrow pour funnel. The initially light yellow solution turned into a dark brown suspension, which changed color to dark green within 10 minutes. The reaction was monitored for completion by HPLC-MS and no change in reaction progress was observed between samples taken at 30 minutes and 1 hour (~95% complete). The reaction mixture was left stirring overnight at room temperature, then 2-(2-aminoethylamino)ethanol (0.483 ml, 4.781 mmol, 4 equiv.), EtOAc (10 ml) and dH 2 O (5 ml) were added to the stirred suspension, which made a color change to dark blue. The suspension was stirred vigorously for 4 hours as the suspended solids gradually dissolved into the two-phase mixture. This mixture was transferred to a separatory funnel and diluted with EtOAc (100 ml) and brine (10 ml), and the aqueous layer was extracted with 10% IpOH/EtOAc (4 x 50 ml). The organic layers were combined and washed with brine (10 ml), dried over Na 2 SO 4 , and evaporated to give a slightly blue crude solid. This crude oil was dissolved in a mixture of methanol (0.5 ml) and dichloromethane (6 ml) and purified on a 100 g Biotage ® SNAP Ultra silica gel column (2-20% MeOH in CH 2 Cl 2 over 10 column volumes, followed by a plateau of 8 - column volume 20% MeOH). The product eluted as a broad peak after 1–2 column volumes of ~20% MeOH in CH 2 Cl 2 . Fractions containing the title compound were combined and concentrated under reduced pressure to give the title compound as a white solid (1.105 g, 83%). MS obs. m/z = 555.9 ((M+2)/2), 1109.8 (M+1).
1.11 (S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N, 3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)сульфамоил)фенил)-5-уреидопентанамид (соединение 13)1.11 (S)-2-((S)-2-amino-3-methylbutanamido)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S ,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(dimethylamino)-3-methylbutanamido)-N,3-dimethylbutanamido)-3-methoxy-5-methylheptanoyl)pyrrolidin-2-yl) -3-methoxy-2-methylpropanoyl)sulfamoyl)phenyl)-5-ureidopentanamide (compound 13)
[00319] К раствору соединения 12 (0,926 г, 0,834 ммоль) добавляли смесь дихлорметана (10 мл) и трифторуксусной кислоты (2,0 мл). Реакционную смесь отслеживали методом ВЭЖХ-МС на расходование исходного вещества (~45 минут). Реакционную смесь выпаривали вместе с ацетонитрилом (2 x 10 мл) и дихлорметаном (2 x 10 мл) под пониженным давлением для удаления избытка трифторуксусной кислоты. Получаемый остаток растворяли в минимальном количестве дихлорметана и метанола (3:1, об./об., ~2 мл) и добавляли через пипетку по каплям к перемешиваемому раствору диэтилового эфира (200 мл) и гексанов (100 мл), получая суспензию белоснежных твердых веществ. Твердые вещества фильтровали и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения в форме белого порошка в виде трифторуксусной соли (1,04 г, количественный выход с некоторыми остаточными растворителями). МС набл. m/z = 505,8 ((M+2)/2).[00319] A mixture of dichloromethane (10 mL) and trifluoroacetic acid (2.0 mL) was added to a solution of compound 12 (0.926 g, 0.834 mmol). The reaction mixture was monitored by HPLC-MS for consumption of starting material (~45 minutes). The reaction mixture was evaporated together with acetonitrile (2 x 10 ml) and dichloromethane (2 x 10 ml) under reduced pressure to remove excess trifluoroacetic acid. The resulting residue was dissolved in a minimal amount of dichloromethane and methanol (3:1, v/v, ~2 ml) and added dropwise through a pipette to a stirred solution of diethyl ether (200 ml) and hexanes (100 ml), obtaining a suspension of snow-white solids substances. The solids were filtered and dried under vacuum to obtain the title compound as a white powder as the trifluoroacetic salt (1.04 g, quantitative yield with some residual solvents). MS obs. m/z = 505.8 ((M+2)/2).
1.12 (S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N, 3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)сульфамоил)фенил)-2-((S)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-14-изопропил-12-оксо-3,6,9-триокса-13-азапентадеканамидо)-5-уреидопентанамид (линкер-токсин 001)1.12 (S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S )-2-(dimethylamino)-3-methylbutanamido)-N, 3-dimethylbutanamido)-3-methoxy-5-methylheptanoyl)pyrrolidin-2-yl)-3-methoxy-2-methylpropanoyl)sulfamoyl)phenyl)-2- ((S)-1-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-14-isopropyl-12-oxo-3,6,9-trioxa-13-azapentadecanamido)- 5-ureidopentanamide (linker-toxin 001)
[00320] К перемешиваемому раствору соединения 13 (0,722 г, 0,584 ммоль) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли соединение 15 (0,314 г, 1,2 эквив.) и диизопропилэтиламин (0,305 мл, 3,0 эквив.). Через 2 часа анализ ВЭЖХ-МС показал отсутствие остаточного исходного вещества. Реакционную смесь подкисляли ТФК (300 мкл), а затем разбавляли diH2O + 0,1% ТФК (9 мл). Полученный раствор загружали на 120 г колонку Biotage® SNAP Ultra C18 (Biotage AB, г. Уппсала, Швеция) и очищали в условиях линейного градиента ACN/H2O + 0,1% ТФК: 20–60% ACN более 10 объемами колонки, 60–100% ACN более 5 объемами колонки. Продукт элюировали приблизительно 40% ACN. Чистые фракции, идентифицированные методом ЖХМС, объединяли и лиофилизировали. Из лиофилизатора извлекали белое порошкообразное твердое вещество. Лиофилизацию повторяли при более высокой концентрации (приблиз. 50 мг/мл в 2:1 H2O/ACN) во флаконе с получением более плотного, менее хлопьевидного лиофилизированного твердого вещества (754,2 мг, 91%). МС набл. m/z = 647,4 ((M+2)/2), 1292,8 (M+1).[00320] To a stirred solution of compound 13 (0.722 g, 0.584 mmol) in N,N -dimethylformamide (4 ml) was added compound 15 (0.314 g, 1.2 equiv.) and diisopropylethylamine (0.305 ml, 3.0 equiv.) . After 2 hours, HPLC-MS analysis showed no residual starting material. The reaction mixture was acidified with TFA (300 µl) and then diluted with diH 2 O + 0.1% TFA (9 ml). The resulting solution was loaded onto a 120 g Biotage ® SNAP Ultra C18 column (Biotage AB, Uppsala, Sweden) and purified under linear gradient conditions of ACN/H 2 O + 0.1% TFA: 20–60% ACN over 10 column volumes, 60–100% ACN over 5 column volumes. The product was eluted with approximately 40% ACN. Pure fractions identified by LCMS were pooled and lyophilized. A white powdery solid was recovered from the lyophilizer. Lyophilization was repeated at a higher concentration (approx. 50 mg/ml in 2:1 H 2 O/ACN) in the vial to obtain a denser, less flaky lyophilized solid (754.2 mg, 91%). MS obs. m/z = 647.4 ((M+2)/2), 1292.8 (M+1).
ПРИМЕР 2. КОНЪЮГАЦИЯ ЛИНКЕР-ТОКСИНА С БИПАРАТОПНЫМ АНТИТЕЛОМEXAMPLE 2. CONJUGATION OF LINKER TOXIN WITH BIPARATOPIC ANTIBODY
[00321] Конъюгаты антитела-лекарственного вещества (ADC) бипаратопного анти-HER2 mAb, v10000, и линкер-токсина 001 создавали частичным восстановлением межцепных дисульфидных связей антитела, с последующим кэпированием свободных цистеиновых остатков взаимодействием с малеимидным компонентом линкер-токсина. Посредством варьирования количеством TCEP, используемого для восстановления антитела, могут получать ADC со средними соотношениями лекарственное вещество-к-антителу от 0 до 6. ADC очищали для удаления загрязняющих малых молекул и характеризовали с демонстрацией DAR, чистоты, содержания мономера, уровней эндотоксина и связывания с антигенположительными опухолевыми клетками.[00321] Antibody-drug conjugates (ADC) of the biparatopic anti-HER2 mAb, v10000, and linker toxin 001 were created by partial reduction of interchain disulfide bonds of the antibody, followed by capping of free cysteine residues by interaction with the maleimide component of the linker toxin. By varying the amount of TCEP used to reconstitute the antibody, ADCs with average drug-to-antibody ratios of 0 to 6 can be produced. ADCs were purified to remove contaminating small molecules and characterized to demonstrate DAR, purity, monomer content, endotoxin levels, and binding to antigen-positive tumor cells.
[00322] Препарат v10000 описан в международной публикации патентной заявки № WO 2015/077891. Подробные свойства этого антитела представлены в таблице 9 ниже. Последовательности представлены в таблицах последовательностей.[00322] Drug v10000 is described in International Patent Application Publication No. WO 2015/077891. The detailed properties of this antibody are presented in Table 9 below. Sequences are presented in sequence tables.
Таблица 9Table 9
* Нумерация Fab или вариабельного домена в соответствии с Кабатом (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91–3242, p.647, 1991)* Fab or variable domain numbering according to Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91–3242, p.647, 1991)
§ Нумерация CH3 в соответствии с индексом EU, как по Кабату (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78–85) § CH3 numbering according to the EU index, as per Kabat (Edelmanet al.,1969, PNAS USA, 63:78–85)
2.1 Конъюгация анти-HER2 антитела частичным восстановлением межцепных дисульфидных связей (v17597; DAR 3,9)2.1 Conjugation of anti-HER2 antibodies by partial reduction of interchain disulfide bonds (v17597; DAR 3.9)
[00323] Восстанавливали раствор (138,9 мл) антитела v10000 (2,0 г) в 10 мМ ацетате натрия, 9% (мас./об.) сахарозы, pH 4,5 добавлением свежеприготовленной смеси 200 мМ Na2HPO4, pH 8,9 (15,4 мл), 5 мМ раствора DTPA (39,5 мл в ФСБ, pH 7,4) и 10 мМ раствора TCEP (3,68 мл, 2,3 экв.). Через 90 минут при 37 °C реакционную смесь охлаждали на льду перед добавлением избытка линкер-токсина 001 (6,41 мл; 8 экв.) из 20 мМ маточного раствора в ДМСО. Через 90 минут конъюгационную смесь гасили добавлением избытка 20 мМ раствора N-ацетилцистеина (4,81 мл; 6 экв.).[00323] Reconstitute a solution (138.9 ml) of antibody v10000 (2.0 g) in 10 mM sodium acetate, 9% (w/v) sucrose, pH 4.5 by adding a freshly prepared mixture of 200 mM Na 2 HPO 4 , pH 8.9 (15.4 ml), 5 mM DTPA solution (39.5 ml in PBS, pH 7.4) and 10 mM TCEP solution (3.68 ml, 2.3 eq.). After 90 min at 37°C, the reaction mixture was cooled on ice before adding excess linker toxin 001 (6.41 mL; 8 eq.) from the 20 mM stock solution in DMSO. After 90 minutes, the conjugation mixture was quenched by adding an excess of 20 mM N -acetylcysteine solution (4.81 ml; 6 eq.).
2.2 Конъюгация анти-HER2 антитела частичным восстановлением межцепных дисульфидных связей (v21252; DAR 2,1)2.2 Conjugation of anti-HER2 antibodies by partial reduction of interchain disulfide bonds (v21252; DAR 2.1)
[00324] Корректировали pH раствора (138,9 мл) антитела v10000 (2,0 г) в 10 мМ ацетате натрия, 9% (мас./об.) сахарозы, pH 4,5 добавлением 200 мМ Na2HPO4, pH 8,9 (15,4 мл). После добавления раствора DTPA (44 мл в ФСБ, pH 7,4, конечная концентрация 1,0 мМ), производили восстановление межцепных дисульфидов добавлением 10 мМ раствора TCEP (1,68 мл, 1,05 экв.). Через 90 минут при 37 °C реакционную смесь охлаждали на льду перед добавлением избытка линкер-токсина 001 (4,81 мл; 6 экв.) из 20 мМ маточного раствора в ДМСО. Через 90 минут конъюгационную смесь гасили добавлением избытка 20 мМ раствора N-ацетилцистеина (4,81 мл; 6 экв.).[00324] The pH of a solution (138.9 ml) of antibody v10000 (2.0 g) in 10 mM sodium acetate, 9% (w/v) sucrose, pH 4.5 was adjusted by adding 200 mM Na 2 HPO 4 , pH 8.9 (15.4 ml). After adding DTPA solution (44 ml in PBS, pH 7.4, final concentration 1.0 mM), interchain disulfides were reduced by adding 10 mM TCEP solution (1.68 ml, 1.05 eq.). After 90 min at 37°C, the reaction mixture was cooled on ice before adding excess linker toxin 001 (4.81 mL; 6 eq.) from the 20 mM DMSO stock solution. After 90 minutes, the conjugation mixture was quenched by adding an excess of 20 mM N -acetylcysteine solution (4.81 ml; 6 eq.).
2.3 Очистка конъюгатов антител-лекарственных веществ v17597 и v212522.3 Purification of antibody-drug conjugates v17597 and v21252
[00325] Погашенные растворы конъюгатов антител-лекарственных веществ (ADC) очищали 9–15 диаобъемами 10 мM ацетата натрия, 9% (мас./об.) сахарозы, pH 4,5 на приборе для фильтрации в тангенциальном потоке Millipore Labscale™ с использованием модуля для ультрафильтрации Pellicon® XL (Ultracel® 30 кДа 0,005 м2; Millipore Sigma). Элюированный раствор ADC подвергали стерильной фильтрации (0,22 мкм). ADC, полученные в малом масштабе, очищали на колонках Zeba™ с отсечением ММ 40 кДа (ThermoFisher Scientific, г. Уолтем, штат Массачусетс, США), прекондиционированных либо ФСБ, либо 10 мM ацетатом натрия, 9% (мас./об.) сахарозы, pH 4,5.[00325] Quenched antibody-drug conjugate (ADC) solutions were purified with 9-15 divolumes of 10 mM sodium acetate, 9% (w/v) sucrose, pH 4.5 on a Millipore Labscale™ tangential flow filtration instrument using module for ultrafiltration Pellicon ® XL (Ultracel ® 30 kDa 0.005 m 2 ; Millipore Sigma). The eluted ADC solution was sterile filtered (0.22 μm). Small scale ADCs were purified on Zeba™ 40 kDa MW cutoff columns (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) preconditioned with either PBS or 10 mM sodium acetate, 9% (w/v). sucrose, pH 4.5.
[00326] После очистки концентрацию ADC определяли анализом BCA на основе стандартной кривой, полученной по антителу v10000. В альтернативном варианте концентрации оценивали измерением поглощения при 280 нм (ε = 195065 M-1 см-1).[00326] After purification, the ADC concentration was determined by a BCA assay based on a standard curve generated from the v10000 antibody. Alternatively, concentrations were estimated by measuring absorbance at 280 nm (ε = 195065 M -1 cm -1 ).
[00327] Образцы ADC оценивали методом невосстанавливающего и восстанавливающего электрофореза ДСН-ПААГ (см. Фиг. 1). Сторонние полосы не наблюдались. [00327] ADC samples were evaluated by non-reducing and reducing SDS-PAGE (see FIG. 1). No extraneous bands were observed.
2.4 Хроматография гидрофобных взаимодействий2.4 Chromatography of hydrophobic interactions
[00328] Антитело и ADC анализировали методом хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ) для оценки соотношения лекарственное вещество-к-антителу (DAR). Хроматографию выполняли на колонке Proteomix® HIC Ethyl (7,8x50 мм, 5 мкм) (Sepax Technologies Inc., г. Ньюарк, штат Делавэр, США), применяя градиент от 80% MPA/20% MPB до 35% MPA/65% MPB в течение периода 13,5 минут при скорости потока 1 мл/мин (MPA = 1,5 M (NH4)2SO4, 25 мM NaxPO4 и MPB = 75% 25 мM NaxPO4, 25% изопропанол).[00328] The antibody and ADC were analyzed by hydrophobic interaction chromatography (HIC) to estimate the drug-to-antibody ratio (DAR). Chromatography was performed on a Proteomix® HIC Ethyl column (7.8 x 50 mm, 5 µm) (Sepax Technologies Inc., Newark, DE, USA) using a gradient from 80% MPA/20% MPB to 35% MPA/65% MPB for a period of 13.5 minutes at a flow rate of 1 ml/min (MPA = 1.5 M (NH 4 ) 2 SO 4 , 25 mM Na x PO 4 and MPB = 75% 25 mM Na x PO 4 , 25% isopropanol).
[00329] Среднее соотношение лекарственного вещества к антителу (DAR) ADC может варьировать в зависимости от количества дисульфидных связей, высвобожденных при восстановлении антитела. Одна реакция конъюгации, которая дает ADC с конкретным средним DAR, создает смесь типов. Для антител v17597 и v21252, получается смесь из четырех типов: неконъюгированное антитело, ADC с DAR равным 2, ADC с DAR равным 4 и ADC с DAR равным 6.[00329] The average drug-to-antibody ratio (DAR) of an ADC may vary depending on the number of disulfide bonds released upon reconstitution of the antibody. A single conjugation reaction that produces an ADC with a specific average DAR creates a mixture of types. For antibodies v17597 and v21252, a mixture of four types is obtained: unconjugated antibody, ADC with a DAR of 2, ADC with a DAR of 4, and ADC with a DAR of 6.
[00330] Результаты анализа ХГВ показаны на Фиг. 2 и демонстрируют, что v17597 имеет среднее DAR равное 3,92 (Фиг. 2A), и v21252 имеет среднее DAR равное 2,07 (Фиг. 2B). [00330] The results of the CHB assay are shown in FIG. 2 and demonstrate that v17597 has an average DAR of 3.92 (Figure 2A) and v21252 has an average DAR of 2.07 (Figure 2B).
[00331] Отдельные доли участия типов DAR0, DAR2, DAR4 и DAR6 в среднем DAR очищенных ADC оценивали путем интегрирования хроматограммы ВЭЖХ-ХГВ. Каждый пик в хроматограмме ХГВ выделяли методом препаративной хроматографии, а идентичность пика подтверждали методом ЖХ-МС. Содержание в % отдельных типов DAR для каждого варианта (как определено методом ХГВ) показано в таблице 10 и на Фиг. 2D. Как видно из таблицы 10 и Фиг. 2D, v17597 содержит значительно больше типов DAR6, чем v21252, и v21252 содержит значительно больше типов DAR0, чем v17597.[00331] The individual contributions of DAR0, DAR2, DAR4 and DAR6 types to the average DAR of purified ADCs were assessed by integrating the HPLC-CHB chromatogram. Each peak in the CHB chromatogram was isolated by preparative chromatography, and the identity of the peak was confirmed by LC-MS. The % content of individual DAR types for each variant (as determined by the CHB method) is shown in Table 10 and FIG. 2D. As can be seen from Table 10 and Fig. 2D, v17597 contains significantly more DAR6 types than v21252, and v21252 contains significantly more DAR0 types than v17597.
[00332] На Фиг. 2E показано изменение относительных количеств типов DAR 0, 2, 4 и 6 у конъюгата v10000-линкер-токсин 001 для ряда препаратов ADC со средними значениями DAR от 0,5 до 6.[00332] In FIG. Figure 2E shows the variation in the relative amounts of DAR types 0, 2, 4, and 6 in the v10000-linker-toxin conjugate 001 for a number of ADC drugs with average DAR values ranging from 0.5 to 6.
Таблица 10. Распределение DAR для v17597 и v21252Table 10. DAR distribution for v17597 and v21252
2.5 Эксклюзионная хроматография2.5 Size exclusion chromatography
[00333] Степень агрегации антител и ADC (~15 мкг, объем инъекции 5 мкл) оценивали методом эксклюзионной хроматографии (SEC) на колонке ACQUITY UPLC® Protein BEH SEC (200 ангстрем, 1,7 мкм, 4,6х150 мм) (Waters Corporation, г. Милфорд, штат Массачусетс, США) с использованием подвижной фазы, состоящей из 150 мМ фосфата, рН 6,8 и скорости потока 400 мкл/мин. Обнаружение осуществляли по поглощению при 280 нм.[00333] The degree of aggregation of antibodies and ADCs (~15 μg, injection volume 5 μl) was assessed by size exclusion chromatography (SEC) on an ACQUITY UPLC® Protein BEH SEC column (200 angstroms, 1.7 μm, 4.6x150 mm) (Waters Corporation , Milford, Massachusetts, USA) using a mobile phase consisting of 150 mM phosphate, pH 6.8, and a flow rate of 400 μL/min. Detection was performed by absorbance at 280 nm.
[00334] Результаты показаны на Фиг. 3 и обобщены в таблице 11. По результатам анализа SEC mAb v10000 является в значительной степени мономерным. При конъюгации с линкер-токсином 001 не наблюдалось значительного увеличения в агрегации. Сравнение v21252 и v17597 указывает, что на степень агрегации не влияет увеличение DAR от 2 до 4. [00334] The results are shown in FIG. 3 and summarized in Table 11. Based on SEC analysis, mAb v10000 is largely monomeric. When conjugated with linker toxin 001, no significant increase in aggregation was observed. A comparison of v21252 and v17597 indicates that the degree of aggregation is not affected by increasing DAR from 2 to 4.
Таблица 11. Обобщение результатов SECTable 11. Summary of SEC results
2.6 Количественное определение свободного токсина и линкер-токсина методом ЖХ-МС-МС2.6 Quantitative determination of free toxin and linker toxin by LC-MS-MS
[00335] Остаточные концентрации свободного токсина (соединение 9), линкер-токсина 001 и погашенного лекарственного вещества-линкера N-ацетилцистеин-линкер-токсин 001 в лекарственных формах ADC оценивали разделением жидкостной хроматографией (ЖХ) и выявлением масс на основе стандартных кривых для каждого анализируемого вещества. Разделения выполняли на колонке PolymerX™ RP-1 (3 мкм, 100 ангстрем, 50x 4 мм) (Phenomenex Inc., г. Торранс, штат Калифорния, США), применяя скорость потока равную 0,4 мл/мин, температуру колонки 30oC и градиент от 75% MPA/25% MPB до 60% MPA/40% MPB в течение 7,8 минут (MPA = 0,1% водная муравьиная кислота, и MPB = 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле). Положительный режим выявления массы ESI-MRM осуществляли на масс-спектрометре Agilent 6470 с тройным квадруполем (Agilent Technologies, г. Санта-Клара, штат Калифорния, США). [00335] Residual concentrations of free toxin (compound 9 ), linker toxin 001, and quenched drug linker N -acetylcysteine-linker-toxin 001 in ADC dosage forms were assessed by liquid chromatography (LC) separation and mass detection based on standard curves for each analyte. Separations were performed on a PolymerX™ RP-1 column (3 µm, 100 Å, 50 x 4 mm) (Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA) using a flow rate of 0.4 ml/min, column temperature 30 o C and a gradient from 75% MPA/25% MPB to 60% MPA/40% MPB over 7.8 minutes (MPA = 0.1% aqueous formic acid, and MPB = 0.1% formic acid in acetonitrile). ESI-MRM positive mass detection mode was performed on an Agilent 6470 triple quadrupole mass spectrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA).
[00336] Все образцы содержали < 0,1 мол.% анализируемого вещества относительно общей конъюгированной нагрузки.[00336] All samples contained <0.1 mol% analyte relative to the total conjugated load.
2.7 Анализ связывания методом проточной цитометрии на антигенположительных клетках2.7 Flow cytometry binding assay on antigen-positive cells
[00337] Связывание ADC с антигенположительными линиями опухолевых клеток JIMT-1 (карцинома молочной железы, Addexbio Technologies, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США) и КТ-112/84 (карцинома мочевого пузыря, Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури, США) сравнивали с исходным антителом (v10000) на связывание методом проточной цитометрии. Клетки культивировали согласно инструкциям поставщика. Вкратце, инкубировали клетки (50 000 клеток/лунку) с серийными разведениями антитела или ADC в течение 90 минут на льду. После этой инкубации клетки промывали дважды и затем инкубировали со вторичным реагентом анти-hIgG, конъюгированным с AlexaFluor® 647 (Jackson ImmunoResearch Inc., г. Вест Гров, штат Пенсильвания, США), в течение 60 минут на льду. Затем клетки промывали дважды и анализировали флуоресценцию методом проточной цитометрии (проточный цитометр LSRFortessa™ X-20, BD, г. Сан-Хосе, штат Калифорния, США). [00337] ADC binding to antigen-positive tumor cell lines JIMT-1 (breast carcinoma, Addexbio Technologies, San Diego, California, USA) and KT-112/84 (bladder carcinoma, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) were compared to the parent antibody (v10000) for binding by flow cytometry. Cells were cultured according to the supplier's instructions. Briefly, cells were incubated (50,000 cells/well) with serial dilutions of antibody or ADC for 90 min on ice. Following this incubation, cells were washed twice and then incubated with secondary anti-hIgG reagent conjugated to AlexaFluor® 647 (Jackson ImmunoResearch Inc., West Grove, PA, USA) for 60 minutes on ice. The cells were then washed twice and fluorescence was analyzed by flow cytometry (LSRFortessa™ X-20 Flow Cytometer, BD, San Jose, CA, USA).
[00338] Результаты показаны на Фиг. 4 и демонстрируют, что на связывание v17597 и v21252 с антигенположительными клетками не влияет конъюгация с токсином, причем оба ADC показывают сходное связывание с исходным антителом v10000.[00338] The results are shown in FIG. 4 and demonstrate that binding of v17597 and v21252 to antigen-positive cells is unaffected by toxin conjugation, with both ADCs showing similar binding to the parent antibody v10000.
2.8 Тестирование содержания эндотоксинов2.8 Endotoxin testing
[00339] Уровень эндотоксинов лекарственных форм ADC оценивали с использованием гель-тромб качественного анализа с лизатом амебоцитов мечехвоста (LAL) (единый тест-набор Genscript ToxinSensor™; GenScript, г. Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США) с пороговым значением 0,125 Ед/мл. Все ADC, использованные в экспериментах in vivo (ниже) дозировали ниже 5 единиц эндотоксина на килограмм массы тела.[00339] Endotoxin levels of ADC dosage forms were assessed using a qualitative horseshoe crab amebocyte lysate (LAL) gel clot assay (Genscript ToxinSensor™ Single Test Kit; GenScript, Piscataway, NJ, USA) with a cutoff value of 0.125 U /ml. All ADCs used in the in vivo experiments (below) were dosed below 5 units of endotoxin per kilogram of body weight.
ПРИМЕР 3. АКТИВНОСТЬ EXAMPLE 3. ACTIVITY IN VITRO IN VITRO БИПАРАТОПНЫХ ADCBIPARATOPIC ADC
[00340] Активность in vitro v17597 и v21252 измеряли анализом клеточной пролиферации на антигенположительных опухолевых клетках BT-474 (протоковая карцинома, ATCC, г. Манассас, штат Вирджиния, США (HTB-20)), SK-BR-3 (карцинома молочной железы, ATCC, г. Манассас, штат Вирджиния, США (HTB-30)), HCC-1954 (карцинома молочной железы, ATCC (CRL-2338)), JIMT-1 (карцинома молочной железы, Addexbio Technologies, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США (C0006005)), ZR-75-1 (карцинома молочной железы, ATCC (CRL-1500)) и антигенотрицательных опухолевых клетках MDA-MB-468 (карцинома молочной железы, Addexbio Technologies (C0006003)). Клетки культивировали согласно инструкциям поставщика. Вкратце, за сутки до добавления ADC добавляли клетки (50 мкл/лунку, 1000 клеток/лунку) к стерильным, обработанным тканевым культурам (ТК), 384-луночные планшеты (ThermoFisher Scientific, г. Уолтем, штат Массачусетс, США) и инкубировали в течение ночи при 37 °C/5% CO2, чтобы позволить клеткам прикрепиться к поверхности планшета. В стерильном 96-луночном планшете с U-образным дном 4,3-кратно разбавляли ADC в полной ростовой среде до желаемой конечной максимальной концентрации и титровали в 1:3 в той же среде, создавая 10-точечное титрование для определения зависимости ответа от дозы. На каждый 96-луночный планшет для микротитрования включали контрольные лунки без ADC (только ростовая среда). В каждую лунку 384-луночного планшета, содержащего высеянные клетки, добавляли 15 мкл из 10-точечной титрование для определения зависимости ответа от дозы в трех повторностях, и планшеты инкубировали при 37 oC/5% CO2 в течение 5 ночей. После 5-ночной инкубации количественно определяли жизнеспособность клеток добавлением 20 мкл/лунку CellTiter-Glo® (Promega, г. Мадисон, штат Висконсин, США) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Люминесценцию измеряли с помощью микропланшетного люминометра. Накопленные относительные световые единицы (ОСЕ) преобразовывали в % цитотоксичности с использованием контроля только ростовой среды, упомянутого выше (% цитотоксичности = 1- [ОСЕ лунки/среднее значение ОСЕ контролей с одной средой]). Данные подгонялись под кривые с помощью нелинейных методов регрессии, доступных в программном обеспечении Prism® (GraphPad Software, г. Ла-Хойя, штат Калифорния, США). [00340] In vitro activity of v17597 and v21252 was measured by cell proliferation assay on antigen-positive tumor cells BT-474 (ductal carcinoma, ATCC, Manassas, VA, USA (HTB-20)), SK-BR-3 (breast carcinoma , ATCC, Manassas, VA, USA (HTB-30)), HCC-1954 (breast carcinoma, ATCC (CRL-2338)), JIMT-1 (breast carcinoma, Addexbio Technologies, San Diego , California, USA (C0006005)), ZR-75-1 (breast carcinoma, ATCC (CRL-1500)) and antigen-negative tumor cells MDA-MB-468 (breast carcinoma, Addexbio Technologies (C0006003)). Cells were cultured according to the supplier's instructions. Briefly, the day before adding ADC, cells (50 μl/well, 1000 cells/well) were added to sterile tissue culture (TC)-treated 384-well plates (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) and incubated in overnight at 37°C/5% CO 2 to allow cells to attach to the surface of the plate. In a sterile 96-well U-bottom plate, ADC was diluted 4.3-fold in complete growth medium to the desired final maximum concentration and titrated 1:3 in the same medium, creating a 10-point titration to determine dose response. Control wells without ADC (growth medium only) were included in each 96-well microtiter plate. To each well of a 384-well plate containing seeded cells, 15 μl of a 10-point titration was added to determine dose response in triplicate, and the plates were incubated at 37 ° C/5% CO 2 for 5 nights. After a 5-night incubation, cell viability was quantified by adding 20 μl/well CellTiter-Glo ® (Promega, Madison, WI, USA) and incubating at room temperature for 30 min. Luminescence was measured using a microplate luminometer. Accumulated relative light units (RLUs) were converted to % cytotoxicity using the growth media only control mentioned above (% cytotoxicity = 1- [RLU wells/average RLU of media alone controls]). Data were curve-fitted using nonlinear regression methods available in Prism ® software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).
[00341] Результаты показаны на Фиг. 5 и обобщены в таблице 12. Результаты демонстрируют, что оба v17597 и v21252 демонстрируют избирательное уничтожение клеток. Экспрессирующие HER2 линии клеток BT-474, SK-BR-3, HCC1954, JIMT-1 и ZR-75-1 (Фиг. 5A–E) оказались чувствительными как к v17597, так и v21252. Оба v17597 и v21252 были неэффективны против клеток MDA-MB-468 (Фиг. 5F), которые получены из клеточной линии HER2-отрицательной карциномы молочной железы. [00341] The results are shown in FIG. 5 and summarized in Table 12. The results demonstrate that both v17597 and v21252 exhibit selective cell killing. The HER2-expressing cell lines BT-474, SK-BR-3, HCC1954, JIMT-1, and ZR-75-1 ( Fig. 5A–E ) were sensitive to both v17597 and v21252. Both v17597 and v21252 were ineffective against MDA-MB-468 cells (Figure 5F), which are derived from a HER2-negative breast carcinoma cell line.
Таблица 12. Активность v17597 и v21252 Table 12. Activity of v17597 and v21252 in vitro in vitro
ПРИМЕР 4. АНАЛИЗ ПРОЛИФЕРАЦИИ EXAMPLE 4. PROLIFERATION ANALYSIS IN VITROIN VITRO v10000-ЛИНКЕР-ТОКСИНА 001 ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СРЕДНИХ DAR v10000-LINKER-TOXIN 001 AT DIFFERENT AVERAGE DAR
[00342] ADC, состоящие из v10000, конъюгированного с линкер-токсином 001 со средним DAR в диапазоне от 0,7 до 3,9, получали путем варьирования количества TCEP (от 0,5 до 10 молярных эквивалентов), используемого в реакции восстановления. Реакцию конъюгации проводили в соответствии с процедурами, отмеченными в примере 2 и получаемые ADC очищали с использованием колонки Zeba™ 40 кДа, предварительно уравновешенной с помощью ФСБ с pH 7,4.[00342] ADCs consisting of v10000 conjugated to linker toxin 001 with an average DAR ranging from 0.7 to 3.9 were prepared by varying the amount of TCEP (0.5 to 10 molar equivalents) used in the reduction reaction. The conjugation reaction was carried out according to the procedures noted in Example 2 and the resulting ADCs were purified using a Zeba™ 40 kDa column pre-equilibrated with PBS pH 7.4.
[00343] Активность in vitro ADC измеряли анализом пролиферации клеток на антигенположительных опухолевых клетках SK-OV-3 (карцинома яичника, ATCC, г. г. Манассас, штат Вирджиния, США (HTB-77)), JIMT-1 (карцинома молочной железы, DSMZ, Брауншвейг, Германия (ACC 589)) и ZR-75-1 (карцинома молочной железы, ATCC (CRL-1500)). Клетки культивировали согласно инструкциям поставщика. Вкратце, за сутки до добавления ADC добавляли клетки (100 мкл/лунку, 2500 клеток/лунку) к стерильным, обработанным ТК, 96-луночные планшеты с матовыми стенками (Corning 3904) и инкубировали в течение ночи при 37 °C/5% CO2, чтобы позволить клеткам прикрепиться к поверхности планшета. На следующий день 5-кратно разбавляли ADC в полной ростовой среде (96-луночный планшет с U-образным дном) до желаемой конечной максимальной концентрации и титровали в 1:3 в той же среде в восемь шагов (всего 9 точек титрования соединения). Включали также контрольную точку титрования, содержащую только ростовую среду, создавая, в целом, 10-точечное титрования для определения ответа в зависимости от дозы. В каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего высеянные клетки, добавляли 25 мкл из 10-точечной титрование для определения зависимости ответа от дозы в трех повторностях, и планшеты инкубировали при 37 °C/5% CO2 в течение 5 ночей. После инкубации количественно определяли жизнеспособность клеток добавлением 25 мкл/лунку CellTiter-Glo® (Promega Corporation, г. Мадисон, штат Висконсин, США) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Люминесценцию измеряли с помощью микропланшетного люминометра и преобразовывали накопленные относительные световые единицы (ОСЕ) в % цитотоксичности, как описано в примере 3. [00343] In vitro ADC activity was measured by cell proliferation assay on antigen-positive tumor cells SK-OV-3 (ovarian carcinoma, ATCC, Manassas, VA, USA (HTB-77)), JIMT-1 (breast carcinoma , DSMZ, Braunschweig, Germany (ACC 589)) and ZR-75-1 (breast carcinoma, ATCC (CRL-1500)). Cells were cultured according to the supplier's instructions. Briefly, the day before adding ADC, cells (100 μl/well, 2500 cells/well) were added to sterile, TC-treated, 96-well frosted plates (Corning 3904) and incubated overnight at 37°C/5% CO 2 to allow cells to attach to the surface of the plate. The next day, ADC was diluted 5-fold in complete growth medium (96-well U-bottom plate) to the desired final maximum concentration and titrated 1:3 in the same medium in eight steps (total of 9 compound titration points). A titration control point containing only growth medium was also included, creating a total of 10 point titrations to determine dose response. 25 μl of a 10-point titration was added to each well of a 96-well plate containing seeded cells to determine dose response in triplicate, and the plates were incubated at 37°C/5% CO 2 for 5 nights. After incubation, cell viability was quantified by adding 25 μl/well CellTiter-Glo ® (Promega Corporation, Madison, WI, USA) and incubating at room temperature for 30 min. Luminescence was measured using a microplate luminometer and the accumulated relative light units (ARL) were converted to % cytotoxicity as described in Example 3.
[00344] Результаты показаны на Фиг. 6. ADC со средними DAR от 3,9 до 1,6 показали сравнительную активность среди трех клеточных линий. Однако ADC со средним DAR 0,7 показало значительное снижение активности. Приблизительные количества отдельных типов DAR, состоящие из ADC с DAR 0,7; DAR 2,2 и DAR 3,9 ; показаны в таблице 13 и на Фиг. 6D. Можно видеть, что ADC с DAR 0,7 содержит приблизительно в три раза больше типов DAR0 (приблизительно 65% по сравнению с приблиз. 20%), чем ADC с DAR 1,9. В свою очередь, ADC с DAR 2,2 содержит значительно больше типов DAR0, чем типов DAR 3,9 (приблиз. 20% по сравнению <3%). Однако ADC с DAR 2,2 показал сравнимую активность in vitro с ADC с DAR 3,9. Эти результаты дают основание предполагать, что может существовать пороговое значение для доли типов DAR0, которую препарат ADC может содержать до нарушения активности ADC.[00344] The results are shown in FIG. 6. ADCs with average DARs ranging from 3.9 to 1.6 showed comparative activity among the three cell lines. However, ADC with an average DAR of 0.7 showed a significant decrease in activity. Approximate numbers of individual DAR types consisting of ADCs with a DAR of 0.7; DAR 2.2 and DAR 3.9; are shown in Table 13 and Fig. 6D. It can be seen that the ADC with DAR 0.7 contains approximately three times more DAR0 types (about 65% compared to about 20%) than the ADC with DAR 1.9. In turn, ADCs with DAR 2.2 contain significantly more DAR0 types than DAR 3.9 types (approx. 20% versus <3%). However, the ADC with DAR 2.2 showed comparable in vitro activity to the ADC with DAR 3.9. These results suggest that there may be a threshold for the proportion of DAR0 types that an ADC formulation can contain before impairing ADC activity.
Таблица 13. Приблизительное распределение DAR для ADCTable 13. Approximate DAR distribution for ADC
ПРИМЕР 5. ИНТЕРНАЛИЗАЦИИ БИПАРАТОПНЫХ ADC В HER2-ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ КЛЕТКИEXAMPLE 5. INTERNALIZATION OF BIPARATOPIC ADC INTO HER2-EXPRESSING CELLS
[00345] Для определения интернализации v21252 соединяли краситель pHAb (Promega Corporation, г. Мадисон, штат Висконсин, США) с аминными остатками v21252, трастузумаб-линкер-токсина 001 и отрицательного контроля ADC в соответствии с рекомендованными производителем протоколами. Отрицательным контролем ADC было анти-RSV белка F антитело, конъюгированное с линкер-токсином 001.[00345] To determine internalization of v21252, pHAb dye (Promega Corporation, Madison, WI, USA) was coupled to the amine residues of v21252, trastuzumab linker toxin 001, and the negative control ADC according to the manufacturer's recommended protocols. The negative control ADC was an anti-RSV F protein antibody conjugated to linker toxin 001.
[00346] Применяли также pHAb-конъюгированные антитела для отслеживания рецептор-опосредованной интернализации антител. Антитела, конъюгированные с красителем pHAb, связанные с антигеном на клеточной мембране проявляют минимальную флуоресценцию, но после рецептор-опосредованной интернализации и транспорта через эндосому и лизосомную систему, конъюгат антитела-pHAb подвергается более кислотному pH, вызывая флуоресценцию конъюгата антитело-pHAb.[00346] pHAb-conjugated antibodies have also been used to monitor receptor-mediated antibody internalization. pHAb dye-conjugated antibodies bound to antigen on the cell membrane exhibit minimal fluorescence, but after receptor-mediated internalization and transport through the endosome and lysosomal system, the antibody-pHAb conjugate is exposed to a more acidic pH, causing the antibody-pHAb conjugate to fluoresce.
[00347] pHAb-конъюгированное v21252, pHAb-конъюгированный трастузумаб-линкер-токсин 001 и pHAb-конъюгированный контроль инкубировали с экспрессирующими HER2 линиями клеток SKBR3 и JIMT-1. Вкратце, SKBR3 и JIMT-1 HER2+ опухолевые клетки высаживали на 384-луночные планшеты с черным оптически прозрачным (ThermoFisher Scientific, г. Уолтем, штат Массачусетс, США) по 5000 клеток/лунку в аналитической среде. Планшет инкубировали в течение ночи при 37oC + 5% CO2. На следующие сутки добавляли pHAb-конъюгированные антитела к планшетам в аналитической среде в концентрации 10 мкг/мл и конечной 1 мкг/мл. Добавляли среду, содержащую фиолетовый краситель Vybrant® DyeCycle™ (ThermoFisher Scientific, г. Уолтем, штат Массачусетс, США) в конечной концентрации 2 мкM для визуализации ядер. Планшет инкубировали при 37oC + 5% CO2 в промежуточные моменты времени. Лунки с образцами сканировали в различные моменты времени на платформе CellInsight™ CX5 High Content Screening (HCS) (ThermoFisher Scientific, г. Уолтем, штат Массачусетс, США). Планшет сканировали с использованием объектива 20x в режиме SpotAnalysis Bioapplication с 2 каналами. Канал 1 (385 нм, фиолетовый краситель Vybrant Dye Cycle) использовали как канал для фокусирования, а канал 2 (560 нм, pHAb) использовали для получения данных интернализации. Флуоресценцию интернализированных pHAb-конъюгированных антител измеряли с использованием параметра «средняя общая интенсивность пятна».[00347] pHAb-conjugated v21252, pHAb-conjugated trastuzumab-linker-toxin 001 and pHAb-conjugated control were incubated with HER2-expressing cell lines SKBR3 and JIMT-1. Briefly, SKBR3 and JIMT-1 HER2+ tumor cells were seeded onto 384-well optical clear black plates (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) at 5000 cells/well in assay medium. The plate was incubated overnight at 37 ° C + 5% CO 2 . The next day, pHAb-conjugated antibodies were added to the plates in the analytical medium at a concentration of 10 μg/ml and a final concentration of 1 μg/ml. Medium containing Vybrant ® DyeCycle™ violet dye (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) at a final concentration of 2 μM was added to visualize nuclei. The plate was incubated at 37 ° C + 5% CO2 at intermediate time points. Sample wells were scanned at various time points on the CellInsight™ CX5 High Content Screening (HCS) platform (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). The plate was scanned using a 20x objective in SpotAnalysis Bioapplication mode with 2 channels. Channel 1 (385 nm, Vybrant Dye Cycle) was used as the focusing channel, and channel 2 (560 nm, pHAb) was used to obtain internalization data. Fluorescence of internalized pHAb-conjugated antibodies was measured using the “average total spot intensity” parameter.
[00348] Результаты показаны на Фиг. 13 и 14 и демонстрируют, что v21252 интернализируется и переносится к лизосомам в экспрессирующих HER2 клетках на более высоком уровне, чем моноспецифический трастузумаб-линкер-токсин 001.[00348] The results are shown in FIG. 13 and 14 and demonstrate that v21252 is internalized and transferred to lysosomes in HER2-expressing cells at a higher level than monospecific trastuzumab linker toxin 001.
ПРИМЕР 6. АКТИВНОСТЬ EXAMPLE 6. ACTIVITY IN VIVO IN VIVO БИПАРАТОПНЫХ ADCBIPARATOPIC ADC
6.1 ADC с v17597 и v21252 ингибируют рост ксенотрансплантата HBCx-13b, полученного от пациента с раком молочной железы 6.1 ADCs with v17597 and v21252 inhibit the growth of HBCx-13b xenograft derived from a breast cancer patient
[00349] Самкам бестимусных мышей (Envigo, г. Хатингдон, Великобритания) подкожно имплантировали фрагмент опухоли объемом 20 мм3 (n=7 на группу). После достижения опухолями размеров от 75 до 200 мм3 животных распределяли на группы лечения и вводили дозы v17597, v21252 или плацебо внутривенной инъекцией в совокупности 2 доз на сутки 1 и сутки 15 (q14d x2) как указано на Фиг. 7. Измерение опухолей выполняли раз в две недели с помощью штангенциркуля. Умерщвляли мышей этичным способом, когда опухоли достигали размера 1764 мм3. Объемы опухолей описывали для каждой группы как среднее значение ± SEM. [00349] Female nude mice (Envigo, Huttingdon, UK) were implanted subcutaneously with a 20 mm 3 tumor fragment (n=7 per group). Once tumors reached sizes between 75 and 200 mm 3 , animals were assigned to treatment groups and dosed with v17597, v21252, or placebo by intravenous injection for a total of 2 doses on day 1 and day 15 (q14d x2) as indicated in FIG. 7. Tumor measurements were performed biweekly using a caliper. Mice were ethically sacrificed when tumors reached a size of 1764 mm 3 . Tumor volumes were described for each group as mean ± SEM.
[00350] На Фиг. 7A представлены результаты опухолевого ответа у мышей с подкожно имплантированными фрагментами опухолей HBCx-13b после в.в. введения носителя или v17597. На Фиг. 7B представлены результаты опухолевого ответа у мышей с подкожно имплантированными фрагментами опухолей HBCx-13b после в.в. введения носителя или v21252. Данные результаты показывают, что лечение мышей, привитых HBCx-13b, либо v17597, либо v21252 приводят к снижению объема опухолей дозозависимым образом.[00350] In FIG. Figure 7A shows the results of tumor response in mice subcutaneously implanted with HBCx-13b tumor fragments after i.v. vehicle administration or v17597. In FIG. Figure 7B shows the results of tumor response in mice subcutaneously implanted with HBCx-13b tumor fragments after i.v. vehicle administration or v21252. These results indicate that treatment of mice inoculated with HBCx-13b with either v17597 or v21252 results in a reduction in tumor volume in a dose-dependent manner.
6.2 ADC с v17597 и v21252 ингибируют рост ксенотрансплантата ST-910, полученного от пациента с раком молочной железы 6.2 ADCs with v17597 and v21252 inhibit the growth of ST-910 xenograft obtained from a breast cancer patient
[00351] Самкам бестимусных мышей (Charles Rivers Laboratories, г. Уилмингтон, штат Массачусетс, США) подкожно имплантировали ~70 мг фрагмента опухоли (n=6 на группу). После достижения опухолями размеров от 125 до 250 мм3 животных распределяли на группы лечения и вводили дозы v17597, v21252 или плацебо внутривенной инъекцией как указано на Фиг. 8. Измерение опухолей выполняли раз в две недели с помощью цифрового штангенциркуля. Умерщвляли мышей этичным способом, когда опухоли достигали размера 2000 мм3. Объемы опухолей описывали для каждой группы как среднее значение ± SEM. [00351] Female nude mice (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA) were implanted subcutaneously with ~70 mg of tumor fragment (n=6 per group). Once tumors reached sizes between 125 and 250 mm 3 , animals were assigned to treatment groups and dosed with v17597, v21252, or placebo by intravenous injection as indicated in FIG. 8. Tumor measurements were performed biweekly using a digital caliper. Mice were ethically sacrificed when tumors reached a size of 2000 mm 3 . Tumor volumes were described for each group as mean ± SEM.
[00352] На Фиг. 8A представлены результаты опухолевого ответа у мышей с подкожно имплантированными фрагментами опухолей ST-910 после в.в. введения носителя или v17597. На Фиг. 8B представлены результаты опухолевого ответа у мышей с подкожно имплантированными фрагментами опухолей ST-910 после в.в. введения носителя или v21252. Данные результаты показывают, что лечение мышей, привитых ST-910, либо v17597, либо v21252 приводят к снижению объема опухолей дозозависимым образом. [00352] In FIG. 8A shows the results of tumor response in mice subcutaneously implanted with ST-910 tumor fragments after i.v. vehicle administration or v17597. In FIG. 8B shows the results of tumor response in mice subcutaneously implanted with ST-910 tumor fragments after i.v. vehicle administration or v21252. These results indicate that treatment of mice inoculated with ST-910 with either v17597 or v21252 results in a reduction in tumor volume in a dose-dependent manner.
[00353] ST-910 представляет собой ксенотрансплантат, полученный от пациента (PDX), который представлять собой HER2 1+ рак молочной железы, тогда как HBCx-13b (примененный в примере 6.1) представляет собой PDX, который представляет собой HER2 3+ рак молочной железы. Примеры 6.1 и 6.2, таким образом, демонстрируют что оба v17597 и v21252 активны как для HER2 3+, так и HER2 1+ опухолей.[00353] ST-910 is a patient-derived xenograft (PDX) that is HER2 1+ breast cancer, while HBCx-13b (used in Example 6.1) is a PDX that is HER2 3+ breast cancer glands. Examples 6.1 and 6.2 thus demonstrate that both v17597 and v21252 are active in both HER2 3+ and HER2 1+ tumors.
6.3 Фармакокинетический анализ6.3 Pharmacokinetic analysis
[00354] Для ксенотрансплантатов HBCx-13b и ST-910, полученных у пациентов, в заранее определенные моменты времени отбирали фармакокинетические образцы на суммарные антитела (неконъюгированные и конъюгированные антитела) и оценивали с использованием анализа на основе ELISA для количественного определения суммарных антител. Концентрации в сыворотке суммарных антител для v21252 или v17597 анализировали первым покрытием 384-луночного планшета для ELISA с козьим античеловеческим IgG Fc антителом (Jackson ImmunoResearch, г. Вест Гров, штат Пенсильвания, США) в ФСБ pH 7,4 и инкубировали при 4 °C в течение ночи. На следующие сутки планшеты промывали и блокировали с использованием аналитического разбавителя и инкубировали при КТ в течение 1 ч. После блокирования добавляли к планшетам образцы стандартной кривой, контроли и образцы разбавленной сыворотки и инкубировали при КТ в течение 1 ч. Затем добавляли на планшеты антитело для выявления, конъюгат HRP-козьего античеловеческого IgG F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch), и после 1-часовой инкубации при КТ на планшеты добавляли субстрат пероксидазы хрена (HRP), 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ). TMB гасили с использованием HCl и измеряли поглощения при 450 нм с использованием считывателя планшетов. На Фиг. 15 показан профиль зависимости концентрации суммарных антител в сыворотке от времени для HBCx-13b (A) и ST-910 (B).[00354] For patient-derived HBCx-13b and ST-910 xenografts, pharmacokinetic samples for total antibodies (unconjugated and conjugated antibodies) were collected at predetermined time points and assessed using an ELISA-based assay to quantify total antibodies. Serum concentrations of total antibodies for v21252 or v17597 were assayed by first coating a 384-well goat anti-human IgG Fc antibody ELISA plate (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) in PBS pH 7.4 and incubated at 4°C during the night. The next day, plates were washed and blocked using assay diluent and incubated at RT for 1 hour. After blocking, standard curve samples, controls, and diluted serum samples were added to the plates and incubated at RT for 1 hour. Detection antibody was then added to the plates , HRP-goat anti-human IgG F(ab') 2 conjugate (Jackson ImmunoResearch), and after a 1-h incubation at RT, the horseradish peroxidase (HRP) substrate, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), was added to the plates. . TMB was quenched using HCl and absorbance was measured at 450 nm using a plate reader. In FIG. Figure 15 shows the serum total antibody concentration versus time profile for HBCx-13b ( A ) and ST-910 ( B ).
ПРИМЕР 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ОДНОДОЗОВОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКИ/ПЕРЕНОСИМОСТИ v17597 и v21252 НА ЯВАНСКИХ МАКАКАХEXAMPLE 7. SINGLE-DOSE PHARMACOKINETICS/TOLERANCE STUDY of v17597 and v21252 IN CYNOMACACA MACACA
[00355] Целью данного исследования было определение параметров фармакокинетики (ФК) и переносимости v17597 и v21252 на яванских макаках после однократного введения внутривенной (ВВ) инфузией. Выбирали яванских макак для неклинической оценки безопасности как v17597, так и v21252, на основе гомологии последовательностей и аффинности связывания. HER2 человека и яванского макака имеют 98% гомологию последовательностей, поэтому гомология последовательностей для HER2 собаки и мыши/крысы составляет 93% и 88%, соответственно. Кроме того, v17597 и v21252 связываются с HER2 яванского макака со сходной аффинностью HER2 человека (KD макака = 0,55x10-9; KD человека = 0,83x10-9) и не связываются с HER2 собаки, мыши или крысы.[00355] The purpose of this study was to determine the pharmacokinetics (PK) and tolerability parameters of v17597 and v21252 in cynomolgus monkeys following a single intravenous (IV) infusion. Cynomolgus monkeys were selected for non-clinical safety assessment of both v17597 and v21252 based on sequence homology and binding affinity. Human and cynomolgus HER2 have 98% sequence homology, so the sequence homology for dog and mouse/rat HER2 is 93% and 88%, respectively. In addition, v17597 and v21252 bind to cynomolgus HER2 with similar affinity to human HER2 (macaque KD = 0.55x10 -9 ; human KD = 0.83x10 -9 ) and do not bind to dog, mouse or rat HER2.
[00356] Данное исследование демонстрирует, что хорошо переносилось однократное дозирование v17597 при дозах 3, 6 или 9 мг/кг, и что хорошо переносилось однократное дозирование v21252 при дозах 9 или 12 мг/кг.[00356] This study demonstrates that single dosing of v17597 was well tolerated at doses of 3, 6, or 9 mg/kg, and that single dosing of v21252 was well tolerated at doses of 9 or 12 mg/kg.
Материалы и методыMaterials and methods
ПереносимостьPortability
[00357] Одну дозу v17597 (3, 6 или 9 мг/кг) или v21252 (9 мг/кг или 12 мг/кг) вводили путем ВВ инфузии на протяжении 60 минут самкам яванского макака (N=3). Общую переносимость оценивала по клиническим наблюдениям, массе тела, потреблению пищи и клинической патологии (гематологические анализы и анализы клинической химии). Кровь отбирали на протяжении всего исследования для биоаналитического анализа v17597 или v21252, определения суммарных антител и свободного токсина (соединение 9). Дизайн исследования обобщен в таблице 14.[00357] A single dose of v17597 (3, 6 or 9 mg/kg) or v21252 (9 mg/kg or 12 mg/kg) was administered by IV infusion over 60 minutes to female cynomolgus monkeys (N=3). General tolerability was assessed by clinical observations, body weight, food intake and clinical pathology (hematology and clinical chemistry tests). Blood was collected throughout the study for bioanalytical analysis of v17597 or v21252, determination of total antibodies and free toxin (compound 9 ). The study design is summarized in Table 14.
Таблица 14. Дизайн исследования однодозовой фармакинетики и общей переносимости на яванских макакахTable 14. Single-dose pharmacokinetics and overall tolerability study design in cynomolgus monkeys
Биоаналитические методыBioanalytical methods
[00358] v17597 и v21252: Анализировали сывороточные концентрации v17597 или v21252 (DAR равное 1 или больше) с использованием электрохемилюминисцентного анализа на платформе Meso Scale Discovery (ECL/MSD) (Meso Scale Diagnostics, LLC, г. Роквилл, штат Мэриленд, США) с помощью мышиного IgG в качестве агента захвата и анти-пертузумаб сульфо-МАРКЕРа в качестве агента выявления. [00358] v17597 and v21252: Serum concentrations of v17597 or v21252 (DAR of 1 or greater) were analyzed using an electrochemiluminescence assay on the Meso Scale Discovery (ECL/MSD) platform (Meso Scale Diagnostics, LLC, Rockville, MD, USA) using mouse IgG as the capture agent and anti-pertuzumab sulfo-MARKER as the detection agent.
[00359] Суммарные антитела: Биоаналитический анализ суммарных антител измерял антительный компонент v17597 или v21252 независимо от того, конъюгировано ли антитело с токсином (при всех значениях DAR) или нет. Анализировали сывороточные концентрации суммарных антител с использованием электрохемилюминисцентного анализа на платформе Meso Scale Discovery (ECL/MSD) (Meso Scale Diagnostics, LLC, г. Роквилл, штат Мэриленд, США) с помощью анти-пертузумаб антитела в качестве агента захвата и анти-трастузумаб сульфо-МАРКЕРа в качестве агента выявления. [00359] Total Antibodies: The total antibody bioanalytical assay measured the antibody component v17597 or v21252 regardless of whether the antibody was conjugated to the toxin (at all DAR values) or not. Serum concentrations of total antibodies were analyzed using an electrochemiluminescence assay on the Meso Scale Discovery (ECL/MSD) platform (Meso Scale Diagnostics, LLC, Rockville, MD, USA) using anti-pertuzumab antibody as a capture agent and anti-trastuzumab sulfo -MARKER as a detection agent.
[00360] Токсин (соединение 9): Концентрации в сыворотке токсина анализировали с использованием метода ЖХ-МС/МС. Образцы сыворотки осаждали ацетонитрилом/ метанолом (50:50, об./об.) и анализировали супернатанты. Использованная система жидкостной хроматографии применяла обращенно-фазную колонку с градиентным потоком, состоящим из воды/уксусной кислоты (100/0,05, об./об.) и ацетонитрила. Токсин и внутренний стандарт (токсин-d4; дейтерированное соединение 9) выявляли с помощью масс-спектрометра с тройным квадруполем, оснащенного источником с ионизацией электрораспылением (ESI), работающим в режиме генерации положительных ионов. [00360] Toxin (Compound 9): Serum toxin concentrations were analyzed using the LC-MS/MS method. Serum samples were precipitated with acetonitrile/methanol (50:50, v/v) and supernatants were analyzed. The liquid chromatography system used used a reverse phase gradient column consisting of water/acetic acid (100/0.05, v/v) and acetonitrile. The toxin and internal standard (toxin-d4; deuterated compound 9 ) were detected using a triple quadrupole mass spectrometer equipped with an electrospray ionization (ESI) source operating in positive ion generation mode.
Фармакокинетический анализPharmacokinetic analysis
[00361] Применяли некомпартментный анализ биоаналитических результатов анализа образцов сыворотки для получения ФК параметров (максимальная сывороточная концентрация [Cmax], конечный период полувыведения [T1/2], клиренс [CL] и кажущийся объем распределение [Vss]).[00361] Non-compartmental analysis of bioanalytical results from serum samples was used to obtain PK parameters (maximum serum concentration [C max ], terminal half-life [T 1/2 ], clearance [CL], and apparent volume distribution [V ss ]).
Результаты results
ФармакокинетикаPharmacokinetics
[00362] v17597: Воздействие v17597, в целом, было пропорционально дозе от 3 до 9 мг/кг. Cmax достигалась в конце 60-минутной инфузии (медианное Tmax) и увеличивалась пропорционально дозе. Системное воздействие (AUC0–∞) увеличивалось немного больше, чем пропорционально дозе. Предварительное среднее конечное время полувыведения (T1/2) обычно увеличивалось с увеличением дозы, клиренс (CL) обычно сокращался с увеличением дозы, и кажущийся объем распределения (Vss), в целом, по-видимому, не изменялись с дозой. [00362] v17597: The effects of v17597 were generally dose proportional from 3 to 9 mg/kg. Cmax was reached at the end of the 60-minute infusion (median Tmax) and increased proportionally to the dose. Systemic exposure (AUC 0–∞ ) increased slightly more than dose proportionally. Preliminary mean terminal half-life (T1 /2 ) generally increased with increasing dose, clearance (CL) generally decreased with increasing dose, and apparent volume of distribution (Vss) generally did not appear to change with dose.
[00363] v21252: Воздействие v21252, в целом, было пропорционально дозе от 9 до 12 мг/кг. Cmax достигалась в конце 60-минутной инфузии (медианное Tmax) и увеличивалась пропорционально дозе. Профиль зависимости концентрации v21252 в сыворотке от времени показан на Фиг. 9A. Системное воздействие (AUC0–∞) увеличивалось немного больше, чем пропорционально дозе. Предварительное среднее конечное время полувыведения (T1/2), клиренс (CL) и кажущийся объем распределения (Vss), в целом, по-видимому, не изменялись с дозой. [00363] v21252: The effects of v21252 were generally dose proportional between 9 and 12 mg/kg. Cmax was reached at the end of the 60-minute infusion (median Tmax) and increased proportionally to the dose. The serum concentration-time profile of v21252 is shown in FIG. 9A. Systemic exposure (AUC 0–∞ ) increased slightly more than dose proportionally. Preliminary mean terminal half-life (T 1/2 ), clearance (CL), and apparent volume of distribution (Vss) generally did not appear to vary with dose.
[00364] Суммарные антитела (конъюгированные и неконъюгированные): Максимальная концентрация в сыворотке суммарных антител (Cmax) достигалась в конце 60-минутной инфузии (медианное Tmax). Профиль для v21252 зависимости концентрации суммарных антител в сыворотке от времени показан на Фиг. 9B. Для получения ФК параметров применяли некомпартментную модель. Cmax увеличивалась пропорционально дозе, в то время как AUC0–∞ увеличилась немного больше, чем пропорционально дозе как для v17597, так и для v21252. Средний конечный период полувыведения v17597 увеличивался с увеличением дозы, в то время как клиренс из сыворотки (CL) и общий кажущийся объем распределения (Vss) суммарных антител уменьшались с увеличением дозы. Средний конечный период полувыведения и общий кажущийся объем распределения (Vss) v21252 увеличивался с увеличением дозы, в то время как клиренс из сыворотки (CL) суммарных антител уменьшался с увеличением дозы. [00364] Total antibodies (conjugated and unconjugated): The maximum serum concentration of total antibodies ( Cmax ) was achieved at the end of the 60-minute infusion (median Tmax ). The v21252 profile of total serum antibody concentration versus time is shown in FIG. 9B. A non-compartmental model was used to obtain PK parameters. Cmax increased dose proportionally, while AUC 0–∞ increased slightly more than dose proportionally for both v17597 and v21252. The mean terminal half-life of v17597 increased with increasing dose, while serum clearance (CL) and total apparent volume of distribution (Vss) of total antibodies decreased with increasing dose. The mean terminal half-life and total apparent volume of distribution (Vss) of v21252 increased with increasing dose, while serum clearance (CL) of total antibodies decreased with increasing dose.
[00365] Токсин (соединение 9): После введения одной дозы v17597 (3, 6 или 9 мг/кг) или v21252 (9 мг/кг или 12 мг/кг) все концентрации токсина в сыворотке были ниже нижнего предела количественного определения (LLOQ, < 5,00 нг/мл). [00365] Toxin (compound 9): After administration of a single dose of v17597 (3, 6, or 9 mg/kg) or v21252 (9 mg/kg or 12 mg/kg), all serum toxin concentrations were below the lower limit of quantitation (LLOQ , < 5.00 ng/ml).
ПереносимостьPortability
[00366] Хорошо переносилось однократное дозирование v17597 (3, 6 или 9 мг/кг) или v21252 (9 или 12 мг/кг). В ходе исследования не было зарегистрировано ни одного летального случая. В клинических наблюдениях по потреблению пищи или массе тела не было отмечено никаких эффектов, связанных с лечением. [00366] Single dosing of v17597 (3, 6, or 9 mg/kg) or v21252 (9 or 12 mg/kg) was well tolerated. There were no deaths reported during the study. No treatment-related effects were noted in clinical observations on food intake or body weight.
[00367] У некоторых животных наблюдались минимальные или умеренные изменения параметров клинической патологии, которые считались связанными с лечением. Среди конечных точек по гематологии ни в одной из групп лечения не было обнаружено эффектов, связанных с исследуемым препаратом. Все отклонения рассматривались в пределах ожидаемых диапазонов для биологических и/или связанных с процедурой отклонений, несмотря на любые явные различия между отдельными значениями.[00367] Some animals showed minimal to moderate changes in clinical pathology parameters that were considered treatment related. Among the hematology endpoints, no effects associated with the study drug were detected in any of the treatment groups. All variations were considered within the expected ranges for biological and/or procedure-related variations, despite any apparent differences between individual values.
ПРИМЕР 8. НЕ-GLP ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ v17597 НА ЯВАНСКИХ МАКАКАХEXAMPLE 8: NON-GLP TOXICITY STUDY OF v17597 IN CYNANO MACACA
[00368] Не-GLP исследование токсичности проводили для изучения токсикокинетики и токсичности v17597 на яванских макаках. Исследование было разработано на основе результатов исследования однодозовой фармакокинетически/переносимости у самок яванского макака (пример 6). [00368] A non-GLP toxicity study was conducted to study the toxicokinetics and toxicity of v17597 in cynomolgus monkeys. The study was designed based on the results of a single-dose pharmacokinetic/tolerability study in female cynomolgus monkeys (Example 6).
[00369] Исследование продемонстрировало, что введение v17597 еженедельно в дозах 2,25 и 4,5 мг/кг и раз в две недели в дозах 4,5 и 9 мг/кг не было хорошо переносимым у самцов и самок яванского макака. Не вызывающий побочных эффектов уровень дозы (NOAEL) и наивысшая нетяжелая токсическая доза (HNSTD) для v17597 после еженедельного или двухнедельного введения в течение до 6 недель считались ниже 2,25 мг/кг при введении еженедельно, или 4,5 мг/кг при введении раз в две недели.[00369] The study demonstrated that administration of v17597 weekly at doses of 2.25 and 4.5 mg/kg and biweekly at doses of 4.5 and 9 mg/kg was not well tolerated in male and female cynomolgus monkeys. The no adverse effect dose level (NOAEL) and highest non-severe toxic dose (HNSTD) for v17597 after weekly or biweekly administration for up to 6 weeks were considered to be below 2.25 mg/kg when administered weekly, or 4.5 mg/kg when administered once in two weeks.
Материалы и методыMaterials and methods
[00370] Носитель или v17597 вводили путем 1-часовой ВВ инфузии еженедельно на сутки 1, 8, 15, 22, 29 и 36 в дозах 0, 2,25 и 4,5 мг/кг, и один раз в две недели на сутки 1, 15 и 29 в дозах 4,5 и 9 мг/кг. У всех животных оценивали изменения клинических признаков, потребление пищи, массу тела, артериальное давление, ЭКГ, частоту дыхания (визуально), клиническую патологию (гематологию, клиническую химию, коагуляцию, анализ мочи), массу органов и проводили макроскопическое/микроскопическое исследование тканей. Отбирали кровь для токсикокинетического анализа и анализа на антитела против лекарственного вещества (ADA). Исследование животных с еженедельным введением доз прекращали на сутки 42, и животных с введением доз раз в две недели — на сутки 36. Дизайн исследования представлен в таблице 15. [00370] Vehicle or v17597 was administered by 1-hour IV infusion weekly on days 1, 8, 15, 22, 29, and 36 at doses of 0, 2.25, and 4.5 mg/kg, and biweekly on day 1, 15 and 29 at doses of 4.5 and 9 mg/kg. All animals were assessed for changes in clinical signs, food intake, body weight, blood pressure, ECG, respiratory rate (visual), clinical pathology (hematology, clinical chemistry, coagulation, urinalysis), organ weights and macroscopic/microscopic examination of tissues. Blood was collected for toxicokinetic and antidrug antibody (ADA) assays. The weekly dosing animals were stopped on day 42 and the biweekly dosing animals were stopped on day 36. The study design is shown in Table 15.
Таблица 15. Дизайн исследованияTable 15. Study design
Результатыresults
[00371] На основании массы тела, клинических наблюдений и результатов по клинической патологии, конъюгат v17597 был признан неблагоприятным во всех дозах, проверенных в этом исследовании. Животные при дозе 9 мг/кг/дозу (раз в две недели) и одна самка при дозе 4,5 мг/кг/дозу (раз в две недели) были исключены из исследования досрочно и получали дозы только на сутки 1 и 15.[00371] Based on body weight, clinical observations, and clinical pathology results, the v17597 conjugate was found to be unfavorable at all doses tested in this study. Animals at 9 mg/kg/dose (biweekly) and one female at 4.5 mg/kg/dose (biweekly) were removed from the study early and only received doses on days 1 and 15.
[00372] На основании результатов этого исследования не вызывающий побочных эффектов уровень дозы (NOAEL) и наивысшая нетяжелая токсическая доза (HNSTD) для v17597 после еженедельного или двухнедельного введения в течение до 6 недель считались ниже 2,25 мг/кг при введении еженедельно, или 4,5 мг/кг при введении раз в две недели.[00372] Based on the results of this study, the no adverse effect dose level (NOAEL) and highest non-severe toxic dose (HNSTD) for v17597 after weekly or biweekly administration for up to 6 weeks were considered to be below 2.25 mg/kg when administered weekly, or 4.5 mg/kg administered once every two weeks.
ПРИМЕР 9. НЕ-GLP ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ v21252 НА ЯВАНСКИХ МАКАКАХEXAMPLE 9: NON-GLP TOXICITY STUDY OF v21252 ON CYNANO MACACA
[00373] Целью данного исследования было дальнейшее определение параметров токсикокинетики и токсичности v21252. [00373] The purpose of this study was to further determine the toxicokinetics and toxicity parameters of v21252.
[00374] Исследование продемонстрировало, что введение v21252 на сутки 1, 15 и 29 в дозах до 12 мг/кг клинически хорошо переносилось у самцов и самок яванского макака. Не вызывающий побочных эффектов уровень дозы (NOAEL) составил 12 мг/кг и наивысшая нетяжелая токсическая доза (HNSTD) составила более 12 мг/кг.[00374] The study demonstrated that administration of v21252 on days 1, 15 and 29 at doses up to 12 mg/kg was clinically well tolerated in male and female cynomolgus monkeys. The no adverse effect dose level (NOAEL) was 12 mg/kg and the highest non-severe toxic dose (HNSTD) was more than 12 mg/kg.
Материалы и методыMaterials and methods
[00375] В данном исследовании носитель или v21252 вводили самцам и самкам яванского макака путем 1-часовой ВВ инфузии один раз в две недели на сутки 1, 15 и 29 в дозах 0, 9 и 12 мг/кг (3 животных на один пол для каждого уровня дозы). У всех животных оценивали изменения клинических признаков, потребление пищи, массу тела, артериальное давление, ЭКГ, частоту дыхания (визуально), клиническую патологию (гематологию, клиническую химию, коагуляцию, анализ мочи), массу органов и проводили макроскопическое/микроскопическое исследование тканей. Отбирали кровь для токсикокинетического (ТК) анализа (v21252, суммарные антитела и свободный токсин (соединение 9)) и анализа на антитела против лекарственного вещества (ADA), и прекращали исследование животных на сутки 36. Другой группе животных вводили одну дозу равную 12 мг/кг v21252 на сутки 1 и прекращали исследование через 4, 8 и 15 суток после дозирования (n=2 на момент времени). Дизайн исследования представлен в таблице 16.[00375] In this study, vehicle or v21252 was administered to male and female cynomolgus monkeys by 1-hour IV infusion once every two weeks on days 1, 15, and 29 at doses of 0, 9, and 12 mg/kg (3 animals per sex for each dose level). All animals were assessed for changes in clinical signs, food intake, body weight, blood pressure, ECG, respiratory rate (visual), clinical pathology (hematology, clinical chemistry, coagulation, urinalysis), organ weights and macroscopic/microscopic examination of tissues. Blood was collected for toxicokinetic (TK) analysis (v21252, total antibodies and free toxin (compound 9 )) and anti-drug antibody (ADA) analysis, and the animals were stopped on day 36. Another group of animals was given a single dose of 12 mg/day. kg v21252 on day 1 and stopped the study at 4, 8, and 15 days after dosing (n=2 per time point). The study design is presented in Table 16.
Таблица 16. Дизайн не-GLP исследования токсичностиTable 16: Non-GLP Toxicity Study Design
Результатыresults
ФармакокинетикаPharmacokinetics
[00376] v21252: Параметры фармакокинетики рассчитывали после повторного введения v21252. (Cmax) достигалась либо в конце 60-минутной инфузии, либо через 60 минут после завершения инфузии (медианное Tmax). Профиль зависимости концентрации v21252 в сыворотке от времени показан на Фиг. 10. На сутки 1 Cmax и системное воздействие (AUC0–168ч) увеличивалось немного больше, чем пропорционально дозе. На сутки 29 Cmax и системное воздействие (AUC0–168ч) увеличивалось приблизительно пропорционально дозе. Системное воздействие и AUC0–168ч, по-видимому, не изменялись и не показали накопления после повторных введений. Средние периоды полувыведения (T1/2) увеличивались от группы, получавшей 9 мг/кг, до группы, получавшей 12 мг/кг. Механизм насыщаемого клиренса для v21252 может объяснить разницу в T1/2 и разницу клиренса между группами, получавшими низкие (9 мг/кг) и высокие (12 мг/кг) дозы. [00376] v21252: Pharmacokinetic parameters were calculated after repeated administration of v21252. ( Cmax ) was achieved either at the end of the 60-minute infusion or 60 minutes after completion of the infusion (median Tmax ). The serum concentration-time profile of v21252 is shown in FIG. 10. On day 1 Cmax and systemic exposure (AUC 0–168 h ) increased slightly more than proportionally to the dose. On day 29 C max and systemic exposure (AUC 0–168 h ) increased approximately proportionally to the dose. Systemic exposure and AUC 0–168h did not appear to change and did not show accumulation after repeated administrations. The mean half-lives (T1 /2 ) increased from the 9 mg/kg group to the 12 mg/kg group. The saturable clearance mechanism for v21252 may explain the difference in T1 /2 and the difference in clearance between the low (9 mg/kg) and high (12 mg/kg) dose groups.
[00377] Суммарные антитела (конъюгированные и неконъюгированные): Суммарные антитела измеряли у яванских макак после повторных введений v21252. Cmax для суммарных антител достигалась в конце 60-минутной инфузии (медианное Tmax). Профиль зависимости концентрации суммарных антител в сыворотке от времени показан на Фиг. 11. На сутки 1 Cmax и системное воздействие (AUC0–168ч) увеличивалось немного больше, чем пропорционально дозе. На сутки 29 Cmax и системное воздействие (AUC0–168ч) увеличивалось приблизительно пропорционально дозе. Системное воздействие и AUC0–168ч не изменялись и не показали накопления после повторных введений. Аналогично v21252, средние периоды полувыведения (T1/2) для суммарных антител увеличивались от группы, получавшей 9 мг/кг, до группы, получавшей 12 мг/кг. [00377] Total antibodies (conjugated and unconjugated): Total antibodies were measured in cynomolgus monkeys after repeated administrations of v21252. The Cmax for total antibodies was reached at the end of the 60-minute infusion (median Tmax ). The time profile of total antibody concentration in serum is shown in Fig. 11. On day 1 Cmax and systemic exposure (AUC 0–168 h ) increased slightly more than proportionally to the dose. On day 29 C max and systemic exposure (AUC 0–168 h ) increased approximately proportionally to the dose. Systemic exposure and AUC 0-168h did not change and did not show accumulation after repeated administrations. Similar to v21252, the mean half-lives (T 1/2 ) for total antibodies increased from the 9 mg/kg group to the 12 mg/kg group.
[00378] Фармакокинетика v21252, как показано профилями для v21252 и суммарных антител зависимости концентрации в сыворотке от времени, указывает на минимальную потерю линкер-токсина из v21252 in vivo (см. Фиг. 12).[00378] The pharmacokinetics of v21252, as shown by the serum concentration-time profiles for v21252 and total antibodies, indicate minimal loss of linker toxin from v21252 in vivo (see FIG. 12).
[00379] Токсин (соединение 9): Содержание свободного токсина измеряли у яванских макак после повторных введений v21252. Все концентрации нагрузки (соединение 9) в сыворотке была ниже предела количественного определения (< 0,500 нг/мл), за исключением одной самки при дозе 12 мг/кг на сутки 1, одной самки при дозе 9 мг/кг на сутки 29 и одного самца при дозе 12 мг/кг на сутки 29. [00379] Toxin (compound 9): Free toxin content was measured in cynomolgus monkeys after repeated administrations of v21252. All loading concentrations (compound 9 ) in serum were below the limit of quantitation (<0.500 ng/ml), except for one female at a dose of 12 mg/kg on day 1, one female at a dose of 9 mg/kg on day 29, and one male at a dose of 12 mg/kg on day 29.
[00380] Антитела против лекарственного вещества (ADA): Проводили скрининг анти-v21252 антител у яванских макак после повторных введений v21252. ADA выявили в сыворотке одной самки в когорте дозирования 9 мг/кг. [00380] Anti-drug antibodies (ADA): Anti-v21252 antibodies were screened in cynomolgus monkeys after repeated administrations of v21252. ADA was detected in the serum of one female in the 9 mg/kg dose cohort.
ТоксичностьToxicity
[00381] В целом, введение v21252 хорошо переносилось клинически при всех тестированных дозах. Никаких изменений, связанных с лечением, в мочеиспускании, параметрах ЭКГ или частоте дыхания не наблюдалось.[00381] Overall, administration of v21252 was well tolerated clinically at all doses tested. No treatment-related changes were observed in urination, ECG parameters, or respiratory rate.
[00382] Спорадическое, минимальное влияние на массу тела отдельных особей отмечалось у животных, получавших повторные введения v21252 при 12 мг/кг/дозу. Эти животные полностью или частично восстановились на сутки 35. Все остальные животные либо поддерживали, либо набирали массу в течение всего исследования.[00382] Sporadic, minimal effects on individual body weight were observed in animals receiving repeated administrations of v21252 at 12 mg/kg/dose. These animals recovered fully or partially on day 35. All other animals either maintained or gained weight throughout the study.
[00383] У некоторых животных наблюдались минимальные или легкие изменения клинических признаков, клинической патологии, массы органов или результатов макроскопического/микроскопического исследования тканей. Макроскопические наблюдения, рассмотренные в связи с v21252, ограничивались покраснением, наблюдаемым в месте инфузии у всех животных, в том числе контрольных. Связанные с исследуемым препаратом изменения массы ограничивались селезенкой. У животных, которых прекратили исследовать на сутки 36 после 3 дозирований раз в две недели, связанные с лечением микроскопические эффекты включали изменения в желудочно-кишечном тракте, печени, селезенке, лимфатических узлах, поджелудочной железе, коже и местах ВВ инфузий. Все они классифицировались как минимальные или умеренные. У животных, которых прекратили исследовать в различные моменты времени после однократной дозы 12 мг/кг, наблюдали аналогичные минимальные или умеренные эффекты, связанные с исследуемым препаратом. [00383] In some animals, minimal or mild changes in clinical signs, clinical pathology, organ weights, or macroscopic/microscopic tissue findings were observed. Macroscopic observations reviewed in relation to v21252 were limited to redness observed at the infusion site in all animals, including controls. Study drug-related weight changes were limited to the spleen. In animals that were discontinued on day 36 after 3 biweekly dosing, treatment-related microscopic effects included changes in the gastrointestinal tract, liver, spleen, lymph nodes, pancreas, skin, and IV infusion sites. All were classified as minimal or moderate. Animals that were discontinued at various time points after a single dose of 12 mg/kg exhibited similar minimal to moderate effects associated with the study drug.
[00384] ФК анализ подтвердил системное воздействие у животных, прошедших лечение v21252, и среднее системное воздействие увеличивалось с увеличением дозы пропорционально дозе для v21252 и суммарных антител, в то время как воздействие свободного токсина (соединение 9) наблюдалось лишь на низких уровнях у нескольких животных.[00384] PK analysis confirmed systemic exposure in animals treated with v21252, and mean systemic exposure increased with increasing dose proportionally for v21252 and total antibodies, while exposure to free toxin (compound 9 ) was observed at only low levels in a few animals .
[00385] В таблицах 17-20 показано сравнение результатов исследований ФК/переносимости и не-GLP исследований повторных дозирований для v17597 и v21252.[00385] Tables 17-20 show a comparison of results from PK/tolerability studies and non-GLP repeat dosing studies for v17597 and v21252.
Таблица 17. Сравнение летальности, наблюдаемой в однодозовом исследовании и исследовании повторных дозирований для v17597 и v21252 у яванских макакTable 17. Comparison of lethality observed in single-dose and repeat-dose studies for v17597 and v21252 in cynomolgus monkeys
ПереносимостьPortability
ПереносимостьPortability
Таблица 18. Сравнение NOAEL и HNSTD, определенных в исследовании повторных дозирований для v17597 и v21252 у яванских макакTable 18. Comparison of NOAEL and HNSTD determined in a repeat dosing study for v17597 and v21252 in cynomolgus monkeys
(<2,25 мг/кг)Unable to determine
(<2.25 mg/kg)
(<4,5 мг/кг)Unable to determine
(<4.5 mg/kg)
(<2,25 мг/кг)Unable to determine
(<2.25 mg/kg)
(<4,5 мг/кг)Unable to determine
(<4.5 mg/kg)
Таблица 19. Биоаналитический анализ ADCTable 19. ADC Bioanalytical Assay
Первая дозаFirst dose
(ч*мкг/мл)(h*mcg/ml)
Последняя дозаLast dose
(ч*мкг/мл)(h*mcg/ml)
# По сравнению с v17597 при 4,5 мг/кг # Compared to v17597 at 4.5 mg/kg
Таблица 20. Биоаналитический анализ суммарных антителTable 20. Bioanalytical analysis of total antibodies
Первая дозаFirst dose
(ч*мкг/мл)(h*mcg/ml)
# По сравнению с v17597 при 4,5 мг/кг # Compared to v17597 at 4.5 mg/kg
Выводыconclusions
[00386] Аналоги ауристатина общей формулы (I) показали, что обладают хорошей переносимостью in vivo при введении мышам. Конъюгация соединения 9 с моноспецифическим анти-HER2 антителом трастузумабом со средним DAR4, создавала ADC, которая показала отличную переносимость у яванских макак с наивысшей нетяжелой токсической дозой (HNSTD) равной 18 мг/кг. Напротив, ADC, содержащий соединение 9, конъюгированное с бипаратопным анти-HER2 антителом, v10000, со средним DAR4 (v17597), показал значительно сниженную переносимость с HNSTD менее 4,5 мг/кг (пример 8). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, предлагается, что сниженная переносимость, наблюдаемая для v17597, может быть частично вызвана повышенным целевым связыванием и интернализацией бипаратопного антитела по сравнению с моноспецифическим трастузумабом, что приводит к повышенной целевой токсичности и/или сниженной доли DAR0 или оголенных типов со средним DAR4 (v17597) по сравнению со средним DAR2 (v21252), что увеличивает токсичность, связанную с более высокими значениями DAR (DAR2, DAR4 и DAR6), и/или увеличенная доля типов DAR6 со средним DAR4 по сравнению со средним DAR2 увеличивает токсичность, связанную с самыми типами с самыми высокими значениями DAR. [00386] Auristatin analogues of general formula ( I ) have been shown to be well tolerated in vivo when administered to mice. Conjugation of Compound 9 to the mid-DAR4 monospecific anti-HER2 antibody trastuzumab generated an ADC that showed excellent tolerability in cynomolgus monkeys with a highest non-severe toxic dose (HNSTD) of 18 mg/kg. In contrast, an ADC containing compound 9 conjugated to the biparatope anti-HER2 antibody, v10000, with intermediate DAR4 (v17597) showed significantly reduced tolerability with an HNSTD of less than 4.5 mg/kg (Example 8). Without being limited to any particular theory, it is proposed that the reduced tolerability observed for v17597 may be due in part to increased on-target binding and internalization of the biparatope antibody compared to monospecific trastuzumab, resulting in increased on-target toxicity and/or a reduced proportion of DAR0 or naked types with average DAR4 (v17597) versus average DAR2 (v21252), which increases toxicity associated with higher DAR values (DAR2, DAR4 and DAR6), and/or an increased proportion of DAR6 types with average DAR4 versus average DAR2 increases toxicity , associated with the most types with the highest DAR values.
[00387] Однако было неожиданно обнаружено, что ADC, содержащий соединение 9, конъюгированное с v10000 со средним DAR2 (v21252), показал намного более улучшенную переносимость с HNSTD равной 12 мг/кг (пример 9). Этот результат является неожиданным, поскольку ранее было показано, что токсичность ADC, включающих либо монометилауристатин E (MMAE), либо майтанзиноид, напрямую коррелирует с общим количеством лекарственного вещества, прикрепленного к антителу, т. е. связь между DAR и максимально допустимой дозой для ADC является линейной (Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063–7070 (2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371–81 (2017)). Конкретно, максимальная переносимая доза ADC с 8 молекулами лекарственных веществ на антитело составила 50 мг/кг и максимальная переносимая доза (MTD) ADC с 4 молекулами лекарственных веществ на антитело (т. е. с половинным количеством токсина) составила 100 мг/кг (Hamblett, et al., там же). А именно, ADC с половинным количеством токсина ADC DAR8, при введении с одной и той же дозой антител, показал MTD в два раза превышающую такую для DAR8 ADC. [00387] However, it was unexpectedly found that an ADC containing compound 9 conjugated to v10000 with middle DAR2 (v21252) showed much improved tolerability with an HNSTD of 12 mg/kg (Example 9). This result is unexpected since the toxicity of ADCs containing either monomethyl auristatin E (MMAE) or a maytansinoid has previously been shown to directly correlate with the total amount of drug attached to the antibody, i.e., the relationship between DAR and the maximum tolerated dose for the ADC is linear (Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063–7070 (2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371–81 (2017)). Specifically, the maximum tolerated dose of an ADC with 8 drug molecules per antibody was 50 mg/kg and the maximum tolerated dose (MTD) of an ADC with 4 drug molecules per antibody ( i.e., with half the amount of toxin) was 100 mg/kg (Hamblett , et al., ibid. ). Specifically, an ADC with half the amount of DAR8 ADC toxin, when administered with the same antibody dose, showed an MTD twice that of the DAR8 ADC.
[00388] Конъюгат v21252 имел DAR равное 2 и, таким образом, половинное количество токсина от v17597 при введении при той же дозы антитела. Поэтому, исходя из предыдущих исследований с v17597, ожидалось, что количество v21252, которое будет переноситься, будет менее 9 мг/кг (т. е. 2x максимальной дозой, переносимой для v17597). Тем не менее, как показано в примере 9, введенный яванским макакам v21252 переносился в дозах либо 9, либо 12 мг/кг каждые две недели в объеме трех доз, и дозу 12 мг/кг, приняли как не вызывающий побочных эффектов уровень (NOAEL). [00388] The v21252 conjugate had a DAR of 2 and thus half the amount of toxin of v17597 when administered at the same dose of antibody. Therefore, based on previous studies with v17597, the amount of v21252 that would be tolerated was expected to be less than 9 mg/kg ( i.e., 2x the maximum dose tolerated for v17597). However, as shown in Example 9, v21252 administered to cynomolgus monkeys was tolerated at doses of either 9 or 12 mg/kg every two weeks for three doses, and a dose of 12 mg/kg was accepted as the NOAEL. .
[00389] Важно отметить, что v21252 обладает меньшей токсичностью и большей переносимостью по сравнению с v17597, когда выполняли дозирование раз в две недели, несмотря на то, что он обладает большим воздействием. На основании не-GLP токсикологического исследования на яванских макаках (пример 8), было установлено, что v17597 дает неблагоприятные показатели в дозировках 4,5 и 9 мг/кг, получаемых раз в две недели. Тем не менее, в аналогичном не-GLP исследовании (пример 9), v21252 не считалось дающим негативные показатели при дозировках раз в две недели как 9 мг/кг, так и 12 мг/кг, несмотря на приблизительно от 1,8 до 4,6 кратные увеличения воздействия (AUC0–336ч после первой дозы или AUC0–168чпоследней дозы) по сравнению с 4,5 мг/кг v17597 (данные обобщены в таблицах 19 и 20).[00389] It is important to note that v21252 has less toxicity and greater tolerability compared to v17597 when dosed biweekly, despite having greater exposure. Based on a non-GLP toxicology study in cynomolgus monkeys (Example 8), v17597 was found to produce adverse effects at dosages of 4.5 and 9 mg/kg given biweekly. However, in a similar non-GLP study (Example 9), v21252 was not considered to produce adverse effects at both 9 mg/kg and 12 mg/kg biweekly dosing, despite approximately 1.8 to 4. 6-fold increases in exposure (AUC 0-336h after first dose or AUC 0-168h last dose) compared to 4.5 mg/kg v17597 (data summarized in Tables 19 and 20).
[00390] Кроме того, v21252 продемонстрировало эффективность in vivo на уровнях воздействия, которые, как показано, переносились у яванских макак. Конкретно, полные ответы достигались в моделях ксенотрансплантатов, полученных у пациентов, как для опухолей с высоким уровнем HER2, так и с низким уровнем HER2 при воздействиях, переносимых у яванских макак, как обобщено на Фиг. 15 (см. также, пример 6).[00390] In addition, v21252 demonstrated in vivo efficacy at exposure levels shown to be tolerated in cynomolgus monkeys. Specifically, complete responses were achieved in patient-derived xenograft models for both HER2-high and HER2-low tumors at exposures tolerated in cynomolgus monkeys, as summarized in FIG. 15 (see also example 6).
ПРИМЕР 10. НЕ-GLP ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ v21252 НА ЯВАНСКИХ МАКАКАХEXAMPLE 10: NON-GLP TOXICITY STUDY OF v21252 ON CYNANO MACACA
[00391] В последующем GLP исследовании токсичности вводили v21252 яванским макакам раз в каждые две недели в количестве 0, 6, 12 и 18 мг/кг в объеме 4 доз с периодом восстановления 6 недель. Определили наивысшую нетяжелую токсическую дозу (HNSTD) равную 18 мг/кг. Конъюгат v21252 хорошо переносился при всех дозах. Никакие клинические наблюдения не были сочтены неблагоприятными, и в этом GLP исследовании не наблюдалось летальности. Единственным систематическим клиническим наблюдением был усиленный понос. При всех дозах не наблюдалось изменение массы тела, и никакие показатели клинической патологии (функция печени — активность аспартат-трансаминазы и аланин-трансаминазы, гематология — нейтрофилы, тромбоциты, гемоглобин, лимфоциты) не считались неблагоприятными. Воздействие (Cmax и AUC0–168ч) v21252 было практически идентичным, воздействию v10000 (только антитело).Ниже приведено подробное описание исследования.[00391] In a subsequent GLP toxicity study, v21252 was administered biweekly to cynomolgus monkeys at 0, 6, 12, and 18 mg/kg for 4 doses with a recovery period of 6 weeks. The highest non-severe toxic dose (HNSTD) was determined to be 18 mg/kg. The v21252 conjugate was well tolerated at all doses. No clinical observations were considered adverse and no mortality was observed in this GLP study. The only systematic clinical observation was increased diarrhea. There was no change in body weight at all doses, and no clinical pathology parameters (liver function - aspartate transaminase and alanine transaminase activity, hematology - neutrophils, platelets, hemoglobin, lymphocytes) were considered unfavorable. The effects ( Cmax and AUC 0-168h ) of v21252 were almost identical to those of v10000 (antibody only). A detailed description of the study is provided below.
[00392] Целью данного GLP исследования было дальнейшее определение параметров токсикокинетики и токсичности v21252, вводимого 4 раза внутривенно яванским макакам. [00392] The purpose of this GLP study was to further determine the toxicokinetics and toxicity parameters of v21252 administered 4 times intravenously to cynomolgus monkeys.
[00393] В GLP исследовании токсичности вводили v21252 самцам и самкам яванского макака на сутки 1, 15, 29 и 43 в дозах 0, 6, 12 и 18 мг/кг с периодом восстановления 6 недель. Не вызывающий побочных эффектов уровень дозы (NOAEL) составил 12 мг/кг и наивысшая нетяжелая токсическая доза (HNSTD) составила 18 мг/кг.[00393] In a GLP toxicity study, v21252 was administered to male and female cynomolgus monkeys on days 1, 15, 29 and 43 at doses of 0, 6, 12 and 18 mg/kg with a recovery period of 6 weeks. The no adverse effect dose level (NOAEL) was 12 mg/kg and the highest non-severe toxic dose (HNSTD) was 18 mg/kg.
Материалы и методыMaterials and methods
[00394] В данном исследовании носитель или v21252 вводили самцам и самкам яванского макака путем 1-часовой ВВ инфузии один раз в две недели на сутки 1, 15, 29 и 43 в дозах 0, 6, 12 и 18 мг/кг (4 животных на один пол для каждого уровня дозы и дополнительно 2 животных на пол при 0, 12 и 18 мг/кг для оценки восстановления). У всех животных оценивали изменения клинических признаков, потребление пищи, массу тела, артериальное давление, ЭКГ, частоту дыхания (визуально), клиническую патологию (гематологию, клиническую химию, коагуляцию, анализ мочи), массу органов и проводили макроскопическое/микроскопическое исследование тканей. Отбирали кровь для токсикокинетического (ТК) анализа (v21252, суммарные антитела и свободный токсин (соединение 9)) и анализа на антитела против лекарственного вещества (ADA), и прекращали исследование животных на сутки 50 и через 6 недель восстановления на сутки 92. Дизайн исследования представлен в таблице 21.[00394] In this study, vehicle or v21252 was administered to male and female cynomolgus monkeys by 1-hour IV infusion once every two weeks on days 1, 15, 29, and 43 at doses of 0, 6, 12, and 18 mg/kg (4 animals per sex for each dose level and an additional 2 animals per sex at 0, 12, and 18 mg/kg to assess recovery). All animals were assessed for changes in clinical signs, food intake, body weight, blood pressure, ECG, respiratory rate (visual), clinical pathology (hematology, clinical chemistry, coagulation, urinalysis), organ weights and macroscopic/microscopic examination of tissues. Blood was collected for toxicokinetic (TK) analysis (v21252, total antibodies and free toxin (compound 9 )) and anti-drug antibody (ADA) analysis, and animals were stopped on day 50 and after 6 weeks of recovery on day 92. Study Design presented in table 21.
Таблица 21. Дизайн GLP исследования токсичностиTable 21: GLP Toxicity Study Design
Результатыresults
ФармакокинетикаPharmacokinetics
[00395] v21252: Медианные концентрации v21252 в сыворотке наблюдали через 1 час после начала инфузии (SOI) на сутки 1 и 43. После введения v21252 раз в две недели средние значения Cmax и AUC для v21252 увеличивались с увеличением дозы. Увеличения Cmax были приблизительно пропорциональными дозе на сутки 1. На сутки 1, 1:2:3 кратное увеличение дозы v21252 привело к приблизительно 1:2,3:3,3 кратному увеличению значений Cmax, приблизительно 1:2,6:3,8 кратному увеличению средних значений AUC0–168ч, и приблизительно 1:2,9:4,5 кратному увеличению значений AUC0–336ч. На сутки 43 Cmax и AUC,0–168ч были приблизительно пропорциональными. На сутки 43, 1:2:3 кратное увеличение дозы v21252 привело к приблизительно 1:2,5:3,5 кратному увеличению значений Cmax и приблизительно 1:3,2:4,7 кратному увеличению значений AUC0–168ч. Системное воздействие v21252, по-видимому, не изменилось после повторной ВВ инфузии раз в две недели при 6 мг/кг. Однако, в целом, оказалось, что воздействие увеличивалось после повторной ВВ инфузии раз в две недели при 12 и 18 мг/кг. Средние соотношения накопления AUC0–168ч составили 1,20; 1,47 и 1,50 при 6, 12 и 18 мг/кг, соответственно. Отдельные соотношения AUC0–168ч находились в диапазонах от 1,01 до 1,64 при 6 мг/кг, от 1,17 до 1,95 в дозе 12 мг/кг и от 0,983 до 2,08 при 18 мг/кг. [00395] v21252: Median serum concentrations of v21252 were observed 1 hour after the start of infusion (SOI) on days 1 and 43. Following biweekly administration of v21252, the median Cmax and AUC values for v21252 increased with increasing dose. Increases in Cmax were approximately proportional to the dose on day 1. On day 1, 1:2:3 fold increases in v21252 dose resulted in approximately 1:2.3:3.3 fold increases in Cmax values, approximately 1:2.6:3 .8 fold increase in mean AUC values 0–168h , and approximately 1:2.9:4.5 fold increase in mean AUC values 0–336h . On day 43 C max and AUC .0–168 h were approximately proportional. On day 43, the 1:2:3 dose increase of v21252 resulted in approximately 1:2.5:3.5 fold increase in Cmax values and approximately 1:3.2:4.7 fold increase in AUC values 0–168h . Systemic exposure of v21252 did not appear to change after repeated biweekly IV infusion at 6 mg/kg. However, overall, exposure appeared to increase after repeated biweekly IV infusions at 12 and 18 mg/kg. The average accumulation ratios AUC 0–168h were 1.20; 1.47 and 1.50 at 6, 12 and 18 mg/kg, respectively. Individual AUC ratios 0–168h ranged from 1.01 to 1.64 at 6 mg/kg, 1.17 to 1.95 at 12 mg/kg, and 0.983 to 2.08 at 18 mg/kg.
[00396] Суммарные антитела (конъюгированные и неконъюгированные): Медианные пиковые концентрации суммарных антител в сыворотке наблюдали через 1 час после SOI v21252 на сутки 1 и 43. После введения v21252 раз в две недели средние значения Cmax и AUC0–168ч для суммарных антител увеличивались с увеличением дозы. На сутки 1, 1:2:3 кратное увеличение дозы v21252 привело к приблизительно 1:2,1:3,3 кратному увеличению значений Cmax, приблизительно 1:2,4:3,8 кратному увеличению значений AUC0–168ч, и приблизительно 1:2,8:4,5 кратному увеличению средних значений AUC0–336ч. На сутки 43, 1:2:3 кратное увеличение дозы v21252 привело к приблизительно 1:2,6:3,9 кратному увеличению значений Cmax и приблизительно 1:3,1:4,8 кратному увеличению значений AUC0–168ч. Системное воздействие на содержание суммарных антител, по-видимому, не изменилось после повторной ВВ инфузии v21252 раз в две недели при 6 мг/кг. Однако обнаружилось его увеличение после повторной ВВ инфузии v21252 раз в две недели при 12 и 18 мг/кг. Средние соотношения накопления AUC0–168ч составили 1,20; 1,47 и 1,50 при 6, 12 и 18 мг/кг, соответственно. [00396] Total antibodies (conjugated and unconjugated): Median peak serum total antibody concentrations were observed 1 hour after SOI v21252 on days 1 and 43. Following biweekly administration of v21252, median Cmax and AUC values of 0-168 hours for total antibodies increased with increasing dose. On day 1, the 1:2:3 dose increase of v21252 resulted in approximately 1:2.1:3.3 fold increase in Cmax values, approximately 1:2.4:3.8 fold increase in AUC values 0–168h , and approximately 1:2.8:4.5 fold increase in mean AUC values 0–336h . On day 43, a 1:2:3 dose increase of v21252 resulted in approximately 1:2.6:3.9 fold increase in Cmax values and approximately 1:3.1:4.8 fold increase in AUC values 0–168h . Systemic effects on total antibodies did not appear to change after repeated biweekly IV infusions of v21252 at 6 mg/kg. However, it was found to increase after repeated IV infusion of v21252 every two weeks at 12 and 18 mg/kg. The average accumulation ratios AUC 0–168h were 1.20; 1.47 and 1.50 at 6, 12 and 18 mg/kg, respectively.
[00397] Токсин (соединение 9): Содержание свободного токсина измеряли после повторных введений v21252. Наибольшие концентрации токсина (Соединения 9) в сыворотке были ниже количественного предела определения (< 0,500 нг/мл). Отмечены следующие исключения: у одной самки при 12 мг/кг на сутки 43 отмечена одна количественно определяемая концентрация токсина (соединение 9) (0,513 нг/мл через 72 ч после введения дозы); у одного самца при 18 мг/кг на сутки 29 отмечена одна количественно определяемая концентрация токсина (соединение 9) (0,532 нг/мл через 1 час после SOI); у каждого из двух самцов и двух самок при 18 мг/кг на сутки 43 отмечена одна количественно определяемая концентрация токсина (соединение 9) (0,555; 0,505; 0,556 и 0,653 нг/мл, соответственно, через 24 ч после SOI); и у одного самца при 18 мг/кг на сутки 43 отмечено четыре последовательных количественно определяемых концентраций токсина (соединение 9) со значением AUC0–168ч 125 ч*нг/мл. [00397] Toxin (compound 9): Free toxin content was measured after repeated administrations of v21252. The highest concentrations of toxin (Compound 9 ) in serum were below the limit of quantitative detection (<0.500 ng/ml). The following exceptions were noted: one female at 12 mg/kg on day 43 had one quantifiable concentration of toxin (compound 9 ) (0.513 ng/ml at 72 hours post-dose); one male at 18 mg/kg on day 29 had one quantifiable concentration of toxin (compound 9 ) (0.532 ng/ml 1 hour after SOI); each of two males and two females at 18 mg/kg on day 43 showed one quantifiable concentration of toxin (compound 9 ) (0.555, 0.505, 0.556 and 0.653 ng/ml, respectively, 24 hours after SOI); and one male at 18 mg/kg on day 43 had four consecutive quantifiable concentrations of the toxin (compound 9 ) with an AUC value of 0–168 h 125 h*ng/ml.
[00398] Антитела против лекарственного вещества (ADA): Провели скрининг на ADA в совокупности 144 образцов для всех когорт дозирования. Семь образцов были определены как положительные в анализе подтверждения/иммуноистощения, включая одно контрольное животное и предварительно исследуемый образец, взятый у проходящего лечение животного. Эти два последних образца были сочтены относящимися к ранее существовавшим реактивным антителам и не связанными с воздействием v21252. Для пяти оставшихся положительных образцов у одной самки, получившей дозу 18 мг/кг, на сутки 43 был обнаружен выявляемый титр, а у остальных 4 животных (2 самки, получившие дозу 12 мг/кг, и один самец и одна самка, получившие дозу 18 мг/кг) на сутки 92 на момент восстановления обнаружены выявляемые титры. Хотя фактические результаты по анти-v21252 антителам не предполагают сильного иммуногенного ответа у большинства животных, циркулирующий v21252 может связываться с анти-v21252 антителами, ограничивая обнаружение антител в этом формате анализа. Однако, маловероятно, что ADA существенно влияли на ФК v21252, так как на сутки 43 дозирования по сравнению с сутками 1 дозирования никаких изменений данных зависимости концентрации в сыворотке от времени не наблюдалось. [00398] Anti-drug antibodies (ADA): A total of 144 samples were screened for ADA across all dosing cohorts. Seven samples were determined to be positive in the confirmation/immunodepletion assay, including one control animal and a pretest sample taken from a treatment animal. These latter two samples were considered to be related to pre-existing reactive antibodies and not related to exposure to v21252. For the five remaining positive samples, one female that received a dose of 18 mg/kg had a detectable titer on day 43, and the remaining 4 animals (2 females that received a dose of 12 mg/kg, and one male and one female that received a dose of 18 mg/kg) on day 92 at the time of recovery, detectable titers were found. Although actual results with anti-v21252 antibodies do not suggest a strong immunogenic response in most animals, circulating v21252 may bind to anti-v21252 antibodies, limiting antibody detection in this assay format. However, it is unlikely that ADAs significantly affected the PK of v21252 as no changes in serum concentration-time data were observed on dosing day 43 compared to dosing day 1.
ТоксичностьToxicity
[00399] Введение повторных доз v21252 (раз в две недели x4), в целом, хорошо переносилось. При офтальмологической и электрокардиографической оценках, визуальных показателях дыхания, мочеиспускания или оценках тропонина I не было зарегистрировано ни одного летального случая, связанного с v21252, и не было отмечено никаких эффектов. Во время лечения или периодов восстановления после приема v21252 не было отмечено никаких изменений параметров массы тела, связанных с v21252.[00399] Repeat dosing of v21252 (biweekly x4) was generally well tolerated. There were no deaths associated with v21252 and no effects were noted by ophthalmologic, electrocardiographic, visual respiration, urination, or troponin I assessments. No changes in body weight parameters associated with v21252 were noted during treatment or recovery periods following v21252.
[00400] У животных, которым вводили повторные дозы v21252 ≥ 6 мг/кг, отмечена увеличенная частота образования мягких/водянистых фекалий. Кроме того, у самцов и самок иногда отмечалась спорадическая утрата аппетита при 18 мг/кг, а у самок сгорбленная поза при 18 мг/кг. После периода восстановления, потеря аппетита и сгорбленная поза отсутствовали, в то же время частота образования мягких/водянистых снизилась или они перестали образовываться, что свидетельствует о реверсии связанных с v21252 эффектов. В ходе исследования животным предоставляли жидкость/питательные добавки (замороженный рацион Gatorade и PeptoPro®) в связи с повторными наблюдениями появления мягких/жидких фекалий. Самкам, получавшим повторное введение v21252, давали жидкость и/или питательные добавки на сутки 4 (6 и 18 мг/кг) или на сутки 8 (12 мг/кг) до завершения периода лечения. Аналогичным образом, самцам, получавшим повторное введение v21252, давали жидкость и/или питательные добавки на сутки 8 (12 мг/кг) или на сутки 7 (18 мг/кг) до завершения периода лечения. Во время восстановления не предоставляли жидкостей или добавок.[00400] Animals administered repeated doses of v21252 ≥ 6 mg/kg experienced an increased incidence of soft/watery feces. In addition, sporadic loss of appetite was sometimes observed in males and females at 18 mg/kg, and hunched posture in females at 18 mg/kg. After the recovery period, loss of appetite and hunched posture were absent, while the incidence of soft/watery lesions decreased or ceased, indicating a reversal of v21252-related effects. During the study, animals were provided with fluid/nutrient supplements (frozen Gatorade chow and PeptoPro ® ) due to repeated observations of soft/liquid feces. Females receiving rechallenge v21252 were given fluid and/or nutritional supplements on day 4 (6 and 18 mg/kg) or day 8 (12 mg/kg) until completion of the treatment period. Similarly, males receiving v21252 rechallenge were given fluid and/or nutritional supplements on day 8 (12 mg/kg) or day 7 (18 mg/kg) until completion of the treatment period. No fluids or supplements were provided during recovery.
[00401] Показатели клинической патологии не рассматривались как неблагоприятные из-за ограниченной тяжести и обратимости показателей. Изменения в гематологии, связанные с исследуемым препаратом, включали: увеличение количеств моноцитов, морфологические изменения у нейтрофилов, уменьшение количества ретикулоцитов и эритроцитарной массы (эритроцитов, гемоглобина и гематокрита) с сопутствующим увеличением ширины распределения эритроцитов. Отмечены от минимальных до умеренных увеличений средних концентраций фибриногена относительно средних значений исходного уровня на сутки от 8 до 50 у самцов при 18 мг/кг и у самок при ≥ 12 мг/кг. Эти изменения были связанными с исследуемым препаратом и являются показателем иммунного или воспалительного стимула. Эти изменения исчезли на сутки 92. Связанные с лечением изменения наблюдали по фосфору, общему белку, альбумину, глобулину и цитруллину. [00401] Clinical pathology scores were not considered unfavorable due to the limited severity and reversibility of the scores. Hematological changes associated with the study drug included: increased monocyte counts, morphological changes in neutrophils, decreased reticulocyte counts and red blood cell mass (RBC, hemoglobin and hematocrit) with a concomitant increase in RBC distribution width. Minimal to moderate increases in mean fibrinogen concentrations relative to mean baseline values on days 8 to 50 were noted in males at 18 mg/kg and in females at ≥ 12 mg/kg. These changes were associated with the study drug and are indicative of an immune or inflammatory stimulus. These changes disappeared on day 92. Treatment-related changes were observed in phosphorus, total protein, albumin, globulin and citrulline.
[00402] В таблицах 22–25 показано сравнение результатов из не-GLP исследований повторных дозирований для v17597 и v21252, и GLP исследования для v21252. [00402] Tables 22-25 show a comparison of results from the non-GLP repeat dosing studies for v17597 and v21252, and the GLP study for v21252.
Таблица 22. Сравнение летальности, наблюдаемой в исследовании повторных доз раз в две недели для v17597 и v21252 у яванских макакTable 22. Comparison of lethality observed in the biweekly repeat dose study for v17597 and v21252 in cynomolgus monkeys
Всего животных Total animals
Всего животныхTotal animals
0/120/6
0/12
0,96 мг/кг0.72 mg/kg
0.96 mg/kg
Таблица 23. Сравнение NOAEL и HNSTD, определенных в исследовании повторных дозирований раз в две недели для v17597 и v21252 у яванских макакTable 23. Comparison of NOAEL and HNSTD determined in the biweekly repeat dosing study for v17597 and v21252 in cynomolgus monkeys
(Кумулятивная доза токсина) v17597 - DAR 4
(Cumulative dose of toxin)
(Кумулятивная доза токсина) v21252 - DAR 2
(Cumulative dose of toxin)
(<0,54 мг/кг)Unable to detect <4.5 mg/kg
(<0.54 mg/kg)
(0,96 мг/кг)12 mg/kg
(0.96 mg/kg)
(<0,54 мг/кг)Unable to detect <4.5 mg/kg
(<0.54 mg/kg)
(1,44 мг/кг)18 mg/kg
(1.44 mg/kg)
Таблица 24. Сравнение ФК параметров ADC для v17597 DAR4 и v21252 DAR2 (доза токсина совпадает) Table 24. Comparison of PK parameters of ADC for v17597 DAR4 and v21252 DAR2 (same toxin dose)
Первая дозаFirst dose
(ч*мкг/мл)(h*mcg/ml)
Первая дозаFirst dose
(часов)(hours)
(9 мг/кг)v21252 DAR2
(9 mg/kg)
# По сравнению с v17597 DAR4 при 4,5 и 9 мг/кг # Compared to v17597 DAR4 at 4.5 and 9 mg/kg
Таблица 25. Сравнение ФК параметров суммарных антител для v17597 DAR4 и v21252 DAR2 (доза токсина совпадает)Table 25. Comparison of PK parameters of total antibodies for v17597 DAR4 and v21252 DAR2 (the toxin dose is the same)
Первая дозаFirst dose
(ч*мкг/мл)(h*mcg/ml)
Первая доза (часов)First dose (hours)
# По сравнению с v17597 при 4,5 и 9 мг/кг # Compared to v17597 at 4.5 and 9 mg/kg
Выводыconclusions
[00403] Определили наивысшую нетяжелую токсическую дозу (HNSTD) v21252 равную 18 мг/кг. Конъюгат v21252 хорошо переносился при всех дозах. Никакие клинические наблюдения не были сочтены неблагоприятными, и в этом GLP исследовании не наблюдалось летальности. Единственным систематическим клиническим наблюдением был усиленный понос.При всех дозах не наблюдалось изменение массы тела, и никакие показатели клинической патологии (функция печени — активность аспартат-трансаминазы и аланин-трансаминазы, гематология — нейтрофилы, тромбоциты, гемоглобин, лимфоциты) не считались неблагоприятными. Эти результаты GLP токсикологии подтверждают клиническую дозировку, превышающую прогнозируемые эффективные дозы у людей.[00403] The highest non-severe toxic dose (HNSTD) of v21252 was determined to be 18 mg/kg. Conjugate v21252 was well tolerated at all doses. No clinical observations were considered adverse and no mortality was observed in this GLP study. The only systematic clinical observation was increased diarrhea. There was no change in body weight at all doses, and no clinical pathology parameters (liver function - aspartate transaminase and alanine transaminase activity, hematology - neutrophils, platelets, hemoglobin, lymphocytes) were considered adverse. These GLP toxicology results support clinical dosing in excess of predicted effective doses in humans.
[00404] Однако было неожиданно обнаружено, что ADC, содержащий соединение 9, конъюгированное v10000 со средним DAR2 (v21252), показал намного улучшенную переносимость по сравнению с ADC со средним DAR4 (v17597) с HNSTD равной 18 мг/кг. Этот результат является неожиданным, поскольку ранее было показано, что соединение 9 токсина, конъюгированное с v10000 при среднем DAR4 (v17597) при введении с дозой токсина 0,36 мг/кг, ассоциировалось с летальным исходом либо при сразу после дозирования (с одной дозой 9 мг/кг), либо при суб-длительном введении (с двумя дозами 4,5 мг/кг, разделенными двумя неделями) (пример 8). В отличие от этого, когда вводили v21252 (DAR2) при дозе 0,36 мг/кг токсина (соединения 9) в совокупности четырех доз (кумулятивная доза токсина 1,44 мг/кг), отсутствовала летальность и существенно снижалась токсичность по сравнению с v17597. К примеру, v21252, вводимое при кумулятивной дозе 0,96 мг/кг токсина (соединение 9), ассоциировали с отсутствием неблагоприятных показателей и определяли ее как не вызывающий побочных эффектов уровень (NOAEL). Кроме того, кумулятивную дозу 1,44 мг/кг токсина (соединение 9) вводили с 18 мг/кг v21252 в объеме 4 доз, и она была переносимой. Это в четыре раза более высокая доза, чем доза v17597, которая ассоциирована с летальностью (0,36 мг/кг). [00404] However, it was unexpectedly found that an ADC containing compound 9 conjugated to v10000 to the middle DAR2 (v21252) showed much improved tolerability compared to the ADC to the middle DAR4 (v17597) with an HNSTD of 18 mg/kg. This result is unexpected, as it was previously shown that toxin compound 9 , conjugated to v10000 at mid-DAR4 (v17597), when administered with a toxin dose of 0.36 mg/kg, was associated with death either immediately after dosing (with a single dose of 9 mg/kg), or with sub-long-term administration (with two doses of 4.5 mg/kg separated by two weeks) (Example 8). In contrast, when v21252 (DAR2) was administered at a dose of 0.36 mg/kg toxin (compound 9 ) over a total of four doses (cumulative toxin dose 1.44 mg/kg), there was no mortality and significantly reduced toxicity compared to v17597 . For example, v21252 administered at a cumulative dose of 0.96 mg/kg toxin (compound 9 ) was associated with the absence of adverse outcomes and was defined as the no adverse effect level (NOAEL). In addition, a cumulative dose of 1.44 mg/kg toxin (compound 9 ) was administered with 18 mg/kg v21252 in 4 doses and was tolerable. This is four times higher than the v17597 dose associated with mortality (0.36 mg/kg).
[00405] Важно отметить, что, v21252 имеет меньшую токсичность и более высокую переносимость по сравнению с v17597 при дозировании раз в две недели, даже несмотря на то, что она обеспечивает приблизительно в два раза большее воздействие (AUC0–336ч после первой дозы) и имеет в два раза более длительный период полувыведения после первой дозы, по сравнению с дозами с совпадающим количеством токсина (4,5 мг/кг v17597 относит. 9 мг/кг v21252, и 9 мг/кг v17597 относит. 18 мг/кг v21252) (обобщено в таблицах 24 и 25).[00405] It is important to note that v21252 has less toxicity and greater tolerability than v17597 when dosed biweekly, even though it provides approximately twice the exposure (AUC 0-336h after first dose) and has twice the half-life after the first dose compared to doses with matching amounts of toxin (4.5 mg/kg v17597 relative to 9 mg/kg v21252, and 9 mg/kg v17597 relative to 18 mg/kg v21252 ) (summarized in Tables 24 and 25).
ПРИМЕР 11. v21252 ИНГИБИРУЕТ EXAMPLE 11. v21252 INHIBITS IN VIVOIN VIVO РОСТ КСЕНОТРАНСПЛАНТАТА С НИЗКИМ УРОВНЕМ HER2, ПОЛУЧЕННЫМ У ПАЦИЕНТА GROWTH OF XENOTRANSPLANT WITH LOW HER2 LEVEL OBTAINED FROM THE PATIENT
[00406] LTL-654 получен из серозной карциномы яичника пациента с метастазами и оценен методами иммуногистохимии (ИГХ) как HER2 отрицательный. Ранний биоптат оценен методом ИГХ как HER2 неопределенный.[00406] LTL-654 is derived from ovarian serous carcinoma of a patient with metastases and assessed by immunohistochemistry (IHC) as HER2 negative. An early biopsy specimen was assessed by IHC as HER2 uncertain.
[00407] Самкам мышей NOD Rag гамма (NRG) подкожно имплантировали через почечную капсулу двумя опухолевыми фрагментами LTL-654, приблизительно по 15 мм3 каждый. Животных случайным образом распределяли в одну из двух групп слепого лечения по шесть животных в каждой, когда средние объемы опухолей достигали 70,3-77,8 мм3.[00407] Female NOD Rag gamma (NRG) mice were subcutaneously implanted through the renal capsule with two LTL-654 tumor fragments, approximately 15 mm 3 each. Animals were randomly assigned to one of two blinded treatment groups of six animals each when mean tumor volumes reached 70.3-77.8 mm 3 .
[00408] Животных лечили либо носителем, либо 3 мг/кг v21252, который внутривенно вводили раз в неделю в общей совокупности четырех инъекций (qwx4) (таблица 21). Измеряли объем опухоли с использованием системы визуализации Vevo®3100 (FUJIFILM VisualSonics, Inc., г. Торонто, Канада) с использованием трехмерного (3D) режима. С помощью программного обеспечения Vevo® LAB v2.1.0 (FUJIFILM VisualSonics, Inc.) записывали и анализировали множество изображений (от 70 до 100 на опухоль) по всей опухоли. Размер опухоли измеряли раз в неделю после рандомизации вплоть до суток 24. Умерщвляли мышей этичным способом, когда отдельные опухоли достигали размера 1500 мм3. Объемы опухолей описывали для каждой группы как среднее значение +SEM. [00408] Animals were treated with either vehicle or 3 mg/kg v21252, which was administered intravenously once a week for a total of four injections (qwx4) (Table 21). Tumor volume was measured using a Vevo®3100 imaging system (FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Canada) using three-dimensional (3D) mode. Using Vevo® LAB v2.1.0 software (FUJIFILM VisualSonics, Inc.), multiple images (70 to 100 per tumor) were recorded and analyzed throughout the tumor. Tumor size was measured once a week after randomization until day 24. Mice were ethically sacrificed when individual tumors reached a size of 1500 mm 3 . Tumor volumes were described for each group as mean + SEM.
[00409] На Фиг. 16 представлены результаты опухолевого ответа у мышей с подкожно имплантированными фрагментами опухолей LTL-654 после в.в. введения носителя или v21252, которые демонстрируют, что лечение привитых LTL-654 мышей с помощью v21252 ингибирует скорость роста опухолевых ксенотрансплантатов LTL-654. [00409] In FIG. Figure 16 shows the results of tumor response in mice with subcutaneously implanted LTL-654 tumor fragments after i.v. administration of vehicle or v21252, which demonstrate that treatment of LTL-654-inoculated mice with v21252 inhibits the growth rate of LTL-654 tumor xenografts.
[00410] Этот пример демонстрирует, что v21252 является эффективным для полученного от пациента ксенотрансплантата, в котором экспрессия HER2 значительно ниже для оценивания методом ИГХ как HER2 отрицательная.[00410] This example demonstrates that v21252 is effective in a patient-derived xenograft in which HER2 expression is significantly lower to be assessed as HER2 negative by IHC.
Таблица 21. Дизайн исследования с PDX моделью рака яичника LTL-654Table 21: Study Design with PDX Model of LTL-654 Ovarian Cancer
(мг/кг)(mg/kg)
ПРИМЕР 12. v21252 ПРОДЛЕВАЕТ ВЫЖИВАЕМОСТЬ МЫШЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ИМПЛАНТИРОВАННЫЕ ВНУТРЬ ЧЕРЕПА ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА EXAMPLE 12. v21252 EXTENDS SURVIVAL OF MICE CONTAINING HUMAN BREAST TUMORS IMPLANTED INSIDE THE SKULL IN VIVOIN VIVO
[00411] Конструкции, примененные в этом примере были следующими: контрольный конъюгат (гуманизированное антитело против респираторно-синцитиального вируса, конъюгированного с линкер-токсином 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR 3,5) и v24029 (трастузумаб, конъюгированный при DAR8 с экзатекан-производным ингибитором топоизомеразы I (DXd)). Имплантированные внутрь черепа опухоли BT-474 молочной железы человека, использованные в этом примере, служат в качестве модели метастазов в головной мозг HER2 положительного рака молочной железы.[00411] The constructs used in this example were as follows: control conjugate (humanized antibody against respiratory syncytial virus conjugated to linker toxin 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR 3.5) and v24029 (trastuzumab conjugated at DAR8 with exatecan-derived topoisomerase I inhibitor (DXd)). The intraskull implanted human breast BT-474 tumors used in this example serve as a model of brain metastasis from HER2 positive breast cancer.
[00412] Самок бестимусных мышей Balb/c (CByJ.Cg-Foxn1nu/J) облучали γ-источником (2 Гр, 60Co, BioMep, г. Бретеньер, Франция). Мышам под анестезией стереотаксически инъецировали 1x105 клеток BT-474 в 2 микролитрах среды RPMI 1640 без фенолового красного. Животных случайным образом распределяли на группы лечения и, начиная с суток 8, им внутривенно вводили носитель, контрольный конъюгат, v21252, v7155 или v24029 при дозе 6 мг/кг каждую неделю в общей совокупности двенадцати инъекций (таблица 26). Дважды в неделю регистрировали массу тела до суток 18, а затем, после этого, ежедневно. Мышей умерщвляли этичным способом, когда потеря массы тела соответствовала или превышала 20% в течение 3 последовательных дней. [00412] Female Balb/c nude mice (CByJ.Cg-Foxn1nu/J) were irradiated with a γ source (2 Gy, 60 Co, BioMep, Bretenieres, France). Anesthetized mice were stereotactically injected with 1x10 5 BT-474 cells in 2 microliters of RPMI 1640 medium without phenol red. Animals were randomly assigned to treatment groups and, beginning on day 8, were intravenously administered vehicle, control conjugate, v21252, v7155, or v24029 at a dose of 6 mg/kg each week for a total of twelve injections (Table 26). Body weight was recorded twice a week until day 18 and then daily thereafter. Mice were ethically sacrificed when body weight loss met or exceeded 20% for 3 consecutive days.
[00413] На Фиг. 17 представлены результаты выживаемости для мышей, которым внутрь черепа имплантировали опухолевые клетки BT-474 после в.в. введения носителя, контрольного конъюгата, v21252, v7155 или v24029. [00413] In FIG. Figure 17 shows survival results for mice in which BT-474 tumor cells were implanted inside the skull after i.v. administration of vehicle, control conjugate, v21252, v7155, or v24029.
[00414] Двум дополнительным когортам животных, которым внутрь черепа имплантировали клетки BT-474, случайным образом также распределяли на группы лечения и, начиная с суток 8, им внутривенно вводили либо v21252, либо v24029 при дозе 6 мг/кг раз в две недели в общей совокупности шести инъекций. Дважды в неделю регистрировали массу тела до суток 18, а затем, после этого, ежедневно. Мышей умерщвляли этичным способом, когда потеря массы тела соответствовала или превышала 20% в течение 3 последовательных дней.[00414] Two additional cohorts of animals intracranially implanted with BT-474 cells were also randomly assigned to treatment groups and, starting on day 8, were given either v21252 or v24029 intravenously at a dose of 6 mg/kg biweekly. a total of six injections. Body weight was recorded twice a week until day 18 and then daily thereafter. Mice were ethically sacrificed when body weight loss met or exceeded 20% for 3 consecutive days.
[00415] На Фиг. 18 представлены результаты выживаемости для мышей, которым внутрь черепа имплантировали опухолевые клетки BT-474 после еженедельного (qw) в.в. введения носителя, контрольного конъюгата или v7155, или в.в. введение каждые две недели (q2w) либо v21252, либо v24029. [00415] In FIG. Figure 18 shows survival results for mice intracranially implanted with BT-474 tumor cells after weekly (qw) i.v. administration of vehicle, control conjugate, or v7155, or i.v. administration every two weeks (q2w) of either v21252 or v24029.
[00416] Этот пример демонстрирует, что v21252 является эффективным в продлении выживаемости мышей с имплантированными внутрь черепа клетками опухоли BT-474 молочной железы.[00416] This example demonstrates that v21252 is effective in prolonging the survival of mice implanted intraskull with BT-474 mammary tumor cells.
Таблица 26. Дизайн исследования с моделью имплантированных внутрь черепа клеток BT-474 рака молочной железы человекаTable 26. Study design using intraskull BT-474 human breast cancer cell model
(мг/кг)(mg/kg)
[00417] Описания всех патентов, заявок на патенты, публикаций и элементов баз данных, упомянутые в данном описании, тем самым конкретно включены в полном объеме в той же степени, как если бы каждый отдельный патент, заявка на патент, публикация и элемент базы данных были специально и отдельно указаны для включения в виде ссылки.[00417] The descriptions of all patents, patent applications, publications and database items mentioned herein are hereby specifically incorporated in their entirety to the same extent as if each individual patent, patent application, publication and database item have been specifically and separately indicated for inclusion by reference.
[00418] Предполагается, что модификации конкретных вариантов осуществления, описанные в данном документе, которые могут быть очевидны специалистам в данной области, должны быть включены в рамки объема следующей формулы изобретения.[00418] It is intended that modifications to the specific embodiments described herein that may be apparent to those skilled in the art are intended to be included within the scope of the following claims.
Таблицы последовательностейSequence tables
Таблица A. Количества клонов для вариантов v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 и v6717Table A. Numbers of clones for variants v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 and v6717
Таблица B. Количества клонов для вариантов v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 и v6717 по количеству клоновTable B. Numbers of clones for variants v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 and v6717 by number of clones
Таблица C. Последовательности для областей VH и VL вариантов v7133, v15082, v15085, v15083, v15080, v15079, v15084 и v15081Table C. Sequences for the VH and VL regions of variants v7133, v15082, v15085, v15083, v15080, v15079, v15084 and v15081
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES
<110> ЗАЙМВОРКС ИНК.<110> ZIMWORKS INC.
<120> Конъюгаты анти-HER2 бипаратопных антител-лекарственных веществ <120> Anti-HER2 biparatope antibody-drug conjugates
и способы их примененияand ways to use them
<130> V813602WO<130> V813602WO
<150> 62/642,483<150> 62/642,483
<151> 13.03.2018<151> 03/13/2018
<150> 62/658,477<150> 62/658,477
<151> 16.04.2018<151> 04/16/2018
<150> 62/743 884<150> 62/743 884
<151> 10.10.2018<151> 10.10.2018
<160> 89<160> 89
<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 217<211> 217
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 1<400> 1
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro LysAla Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 151 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys ValPro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30 20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp TyrVal Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45 35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GluVal Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60 50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu HisGln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 8065 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn LysGln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95 85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnAla Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu LeuPro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125 115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr ProThr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140 130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn AsnSer Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe LeuTyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175 165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn ValTyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190 180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr GlnPhe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205 195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 210 215
<210> 2<210> 2
<211> 607<211> 607
<212> Белок<212> Protein
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 2<400> 2
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala SerThr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 151 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys GlnPro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30 20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala SerVal Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45 35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu IleLeu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60 50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile ValAla His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 8065 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu AspArg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95 85 90 95
Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser ProAsn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
100 105 110 100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu LysGly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp ThrGly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140 130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu ThrIle Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro MetLeu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175 165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln SerCys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190 180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly ProLeu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205 195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr GlyLeu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220 210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser GlyPro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp ThrIle Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255 245 250 255
Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala SerPhe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
260 265 270 260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly SerCys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285 275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu AspCys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val CysGly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr SerTyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335 325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser LeuAla Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350 340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr AlaAla Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365 355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu IlePro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380 370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp LeuThr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His AsnSer Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415 405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu GlyGly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430 420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His HisLeu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445 435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu PheAsn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460 450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu AspArg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480465 470 475 480
Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg GlyGlu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
485 490 495 485 490 495
His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln PheHis Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
500 505 510 500 505 510
Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly LeuLeu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
515 520 525 515 520 525
Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro GluPro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
530 535 540 530 535 540
Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala AspCys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
545 550 555 560545 550 555 560
Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val AlaGln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
565 570 575 565 570 575
Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile TrpArg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
580 585 590 580 585 590
Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile AsnLys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn
595 600 605 595 600 605
<210> 3<210> 3
<211> 448<211> 448
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 3<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PheThr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala LeuPro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140 130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser TrpGly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val LeuAsn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175 165 170 175
Lys Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro SerLys Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys ProSer Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205 195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp LysSer Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220 210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerSer Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu AspArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnPro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285 275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300 290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu LysTyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335 325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ValThr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350 340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu LeuLeu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380 370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val LeuSer Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu
385 390 395 400385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415 405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluSer Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430 420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GlyAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445 435 440 445
<210> 4<210> 4
<211> 1344<211> 1344
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 4<400> 4
gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg gaagtgcagc tggtcgaatc tggagggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg
60 60
tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca
120 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac
180 180
aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat
240 240
ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg
300 300
gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc
360 360
tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga
420 420
actgcagccc tgggctgtct ggtgaagggc tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg actgcagccc tgggctgtct ggtgaagggc tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg
480 480
aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgaa gtcaagcggg aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgaa gtcaagcggg
540 540
ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat
600 600
atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag
660 660
tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca
720 720
agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa
780 780
gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac
840 840
gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca gggaggaaca gtacaacagt gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca ggggaggaaca gtacaacagt
900 900
acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag
960 960
tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag
10201020
gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgctgc ctccatcaag ggatgagctg gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgctgc ctccatcaag ggatgagctg
10801080
acaaagaacc aggtcagcct gctgtgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct acaaagaacc aggtcagcct gctgtgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct
11401140
gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattacc tgacctggcc ccctgtgctg gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattacc tgacctggcc ccctgtgctg
12001200
gactcagatg gcagcttctt tctgtatagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag gactcagatg gcagcttctt tctgtatagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag
12601260
caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag
13201320
aagtcactgt cactgtcacc aggg aagtcactgt cactgtcacc aggg
13441344
<210> 5<210> 5
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 5<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 6<210> 6
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 6<400> 6
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr ThrGly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr
1 515
<210> 7<210> 7
<211> 12<211> 12
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 7<400> 7
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp TyrAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 101 5 10
<210> 8<210> 8
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 8<400> 8
Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly SerVal Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser
1 515
<210> 9<210> 9
<211> 214<211> 214
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 9<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro TyrGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala AlaThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser GlyPro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu AlaThr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser GlnLys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu SerGlu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val TyrSer Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys SerAla Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu CysPhe Asn Arg Gly Glu Cys
210 210
<210> 10<210> 10
<211> 642<211> 642
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 10<400> 10
gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc
60 60
atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca
120 120
ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct
180 180
agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct
240 240
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccatatac ctttggccag gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccatatac ctttggccag
300 300
gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct
360 360
tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac
420 420
cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag
480 480
gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact
540 540
ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg
600 600
ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt
642 642
<210> 11<210> 11
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 11<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro TyrGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 12<210> 12
<211> 6<211> 6
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 12<400> 12
Gln Asp Val Ser Ile GlyGln Asp Val Ser Ile Gly
1 515
<210> 13<210> 13
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 13<400> 13
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr ThrGln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr
1 515
<210> 14<210> 14
<211> 3<211> 3
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 14<400> 14
Ser Ala SerSer Ala Ser
<210> 15<210> 15
<211> 222<211> 222
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 15<400> 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser ProAsp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
1 5 10 151 5 10 15
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys ArgSer Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
20 25 30 20 25 30
Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys ProAla Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr SerGly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe ThrGly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr CysLeu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys ValGln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
100 105 110 100 105 110
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProGlu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125 115 120 125
Ser Asp Glu Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu LeuSer Asp Glu Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
130 135 140 130 135 140
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp AsnAsn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
145 150 155 160145 150 155 160
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp SerAla Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
165 170 175 165 170 175
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys AlaLys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
180 185 190 180 185 190
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln GlyAsp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
195 200 205 195 200 205
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu CysLeu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220 210 215 220
<210> 16<210> 16
<211> 666<211> 666
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 16<400> 16
gactacaaag acgacgatga caaagatatc cagatgaccc agtcccctag ctccctgtcc gactacaaag acgacgatga caaagatatc cagatgaccc agtcccctag ctccctgtcc
60 60
gcttctgtgg gcgatagggt cactattacc tgccgcgcat ctcaggacgt gaacaccgca gcttctgtgg gcgatagggt cactattacc tgccgcgcat ctcaggacgt gaacaccgca
120 120
gtcgcctggt accagcagaa gcctgggaaa gctccaaagc tgctgatcta cagtgcatca gtcgcctggt accagcagaa gcctgggaaa gctccaaagc tgctgatcta cagtgcatca
180 180
ttcctgtatt caggagtgcc cagccggttt agcggcagca gatctggcac cgatttcaca ttcctgtatt caggagtgcc cagccggttt agcggcagca gatctggcac cgatttcaca
240 240
ctgactattt ctagtctgca gcctgaggac tttgccacat actattgcca gcagcactat ctgactattt ctagtctgca gcctgaggac tttgccacat actattgcca gcagcactat
300 300
accacacccc ctactttcgg ccaggggacc aaagtggaga tcaagcgaac tgtggccgct accacacccc ctactttcgg ccaggggacc aaagtggaga tcaagcgaac tgtggccgct
360 360
ccaagtgtct tcatttttcc acccagcgat gaaagactga agtccggcac agcttctgtg ccaagtgtct tcatttttcc acccagcgat gaaagactga agtccggcac agcttctgtg
420 420
gtctgtctgc tgaacaattt ttaccccaga gaggccaaag tgcagtggaa ggtcgacaac gtctgtctgc tgaacaattt ttaccccaga gaggccaaag tgcagtggaa ggtcgacaac
480 480
gctctgcaga gtggcaacag ccaggagagc gtgacagaac aggattccaa agactctact gctctgcaga gtggcaacag ccaggagagc gtgacagaac aggattccaa agactctact
540 540
tatagtctgt caagcaccct gacactgagc aaggcagact acgaaaagca taaagtgtat tatagtctgt caagcaccct gacactgagc aaggcagact acgaaaagca taaagtgtat
600 600
gcctgtgagg tcacacatca ggggctgtca tcaccagtca ccaaatcatt caatcggggg gcctgtgagg tcacacatca ggggctgtca tcaccagtca ccaaatcatt caatcggggg
660 660
gagtgc gagtgc
666 666
<210> 17<210> 17
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 17<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr AlaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro ProGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 18<210> 18
<211> 222<211> 222
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 18<400> 18
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser ProAsp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
1 5 10 151 5 10 15
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys ArgSer Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
20 25 30 20 25 30
Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys ProAla Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr SerGly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe ThrGly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr CysLeu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys ValGln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
100 105 110 100 105 110
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProGlu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125 115 120 125
Ser Asp Glu Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu LeuSer Asp Glu Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
130 135 140 130 135 140
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp AsnAsn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
145 150 155 160145 150 155 160
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Lys Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp SerAla Leu Gln Ser Gly Asn Ser Lys Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
165 170 175 165 170 175
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Arg Leu Thr Leu Ser Lys AlaLys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Arg Leu Thr Leu Ser Lys Ala
180 185 190 180 185 190
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln GlyAsp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
195 200 205 195 200 205
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu CysLeu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220 210 215 220
<210> 19<210> 19
<211> 666<211> 666
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 19<400> 19
gactacaaag acgacgatga caaagatatc cagatgaccc agtcccctag ctccctgtcc gactacaaag acgacgatga caaagatatc cagatgaccc agtcccctag ctccctgtcc
60 60
gcttctgtgg gcgatagggt cactattacc tgccgcgcat ctcaggacgt gaacaccgca gcttctgtgg gcgatagggt cactattacc tgccgcgcat ctcaggacgt gaacaccgca
120 120
gtcgcctggt accagcagaa gcctgggaaa gctccaaagc tgctgatcta cagtgcatca gtcgcctggt accagcagaa gcctgggaaa gctccaaagc tgctgatcta cagtgcatca
180 180
ttcctgtatt caggagtgcc cagccggttt agcggcagca gatctggcac cgatttcaca ttcctgtatt caggagtgcc cagccggttt agcggcagca gatctggcac cgatttcaca
240 240
ctgactattt ctagtctgca gcctgaggac tttgccacat actattgcca gcagcactat ctgactattt ctagtctgca gcctgaggac tttgccacat actattgcca gcagcactat
300 300
accacacccc ctactttcgg ccaggggacc aaagtggaga tcaagcgaac tgtggccgct accacacccc ctactttcgg ccaggggacc aaagtggaga tcaagcgaac tgtggccgct
360 360
ccaagtgtct tcatttttcc acccagcgat gaaagactga agtccggcac agcttctgtg ccaagtgtct tcatttttcc acccagcgat gaaagactga agtccggcac agcttctgtg
420 420
gtctgtctgc tgaacaattt ttaccccaga gaggccaaag tgcagtggaa ggtcgacaac gtctgtctgc tgaacaattt ttaccccaga gaggccaaag tgcagtggaa ggtcgacaac
480 480
gctctgcaga gtggcaacag caaggagagc gtgacagaac aggattccaa agactctact gctctgcaga gtggcaacag caagggagagc gtgacagaac aggattccaa agactctact
540 540
tatagtctgt caagcagact gacactgagc aaggcagact acgaaaagca taaagtgtat tatagtctgt caagcagact gacactgagc aaggcagact acgaaaagca taaagtgtat
600 600
gcctgtgagg tcacacatca ggggctgtca tcaccagtca ccaaatcatt caatcggggg gcctgtgagg tcacacatca ggggctgtca tcaccagtca ccaaatcatt caatcggggg
660 660
gagtgc gagtgc
666 666
<210> 20<210> 20
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 20<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr AlaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro ProGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 21<210> 21
<211> 6<211> 6
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 21<400> 21
Gln Asp Val Asn Thr AlaGln Asp Val Asn Thr Ala
1 515
<210> 22<210> 22
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 22<400> 22
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro ThrGln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 515
<210> 23<210> 23
<211> 3<211> 3
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 23<400> 23
Ser Ala SerSer Ala Ser
<210> 24<210> 24
<211> 214<211> 214
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 24<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro AlaGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala AlaThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser GlyPro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu AlaThr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser GlnLys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu SerGlu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val TyrSer Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys SerAla Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu CysPhe Asn Arg Gly Glu Cys
210 210
<210> 25<210> 25
<211> 642<211> 642
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 25<400> 25
gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc
60 60
atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca
120 120
ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct
180 180
agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct
240 240
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccagccac ctttggccag gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccagccac ctttggccag
300 300
gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct
360 360
tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac
420 420
cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag
480 480
gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact
540 540
ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg
600 600
ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt
642 642
<210> 26<210> 26
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 26<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro AlaGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 27<210> 27
<211> 6<211> 6
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 27<400> 27
Gln Asp Val Ser Ile GlyGln Asp Val Ser Ile Gly
1 515
<210> 28<210> 28
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 28<400> 28
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala ThrGln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala Thr
1 515
<210> 29<210> 29
<211> 3<211> 3
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 29<400> 29
Ser Ala SerSer Ala Ser
<210> 30<210> 30
<211> 449<211> 449
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 30<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp ThrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValTyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser ValAla Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GlnSer Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser ValGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala AlaPhe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140 130 135 140
Leu Gly Cys Glu Val Thr Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val SerLeu Gly Cys Glu Val Thr Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala ValTrp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val ProLeu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His LysSer Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys AspPro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220 210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly GlyLys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met IlePro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255 245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His GluSer Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270 260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val HisAsp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285 275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr ArgAsn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300 290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly LysVal Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile GluGlu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335 325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val TyrLys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350 340 345 350
Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser LeuVal Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365 355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu TrpThr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380 370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro ValGlu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val AspLeu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415 405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met HisLys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430 420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProGlu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445 435 440 445
GlyGly
<210> 31<210> 31
<211> 1347<211> 1347
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 31<400> 31
gaggtgcagc tggtcgaaag cggaggagga ctggtgcagc caggagggtc actgcgactg gaggtgcagc tggtcgaaag cggagggagga ctggtgcagc caggagggtc actgcgactg
60 60
agctgcgcag cttccggctt caacatcaag gacacctaca ttcactgggt ccgccaggct agctgcgcag cttccggctt caacatcaag gacacctaca ttcactgggt ccgccaggct
120 120
cctggaaaag gcctggagtg ggtggcacga atctatccaa ctaatggata cacccggtat cctggaaaag gcctggagtg ggtggcacga atctatccaa ctaatggata cacccggtat
180 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatt tctgcagata caagtaaaaa cactgcctac gccgactccg tgaagggccg gttcaccatt tctgcagata caagtaaaaa cactgcctac
240 240
ctgcagatga acagcctgcg agccgaagat acagccgtgt actattgcag ccgatgggga ctgcagatga acagcctgcg agccgaagat acagccgtgt actattgcag ccgatgggga
300 300
ggcgacggct tctacgctat ggattattgg gggcagggaa ccctggtcac agtgagctcc ggcgacggct tctacgctat ggattattgg gggcagggaa ccctggtcac agtgagctcc
360 360
gcatcaacaa aggggcctag cgtgtttcca ctggccccct ctagtaaatc cacctctggg gcatcaacaa aggggcctag cgtgtttcca ctggccccct ctagtaaatc cacctctggg
420 420
ggaacagcag ccctgggatg tgaggtgacc gactacttcc cagagcccgt cactgtgagc ggaacagcag ccctgggatg tgaggtgacc gactacttcc cagagcccgt cactgtgagc
480 480
tggaactccg gcgccctgac atctggggtc catacttttc ctgctgtgct gcagtcaagc tggaactccg gcgccctgac atctggggtc catacttttc ctgctgtgct gcagtcaagc
540 540
ggcctgtaca gcctgtcctc tgtggtcact gtgccaagtt caagcctggg gactcagacc ggcctgtaca gcctgtcctc tgtggtcact gtgccaagtt caagcctggg gactcagacc
600 600
tatatctgca acgtgaatca caagccatcc aataccaaag tcgacaagaa agtggaaccc tatatctgca acgtgaatca caagccatcc aataccaaag tcgacaagaa agtggaaccc
660 660
aagtcttgtg ataaaacaca tacttgcccc ccttgtcctg caccagagct gctgggagga aagtcttgtg ataaaacaca tacttgcccc ccttgtcctg caccagagct gctgggagga
720 720
ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaagacaccc tgatgattag taggactcca ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaagacaccc tgatgattag taggactcca
780 780
gaagtcacct gcgtggtcgt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaagtcaa gttcaactgg gaagtcacct gcgtggtcgt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaagtcaa gttcaactgg
840 840
tacgtggatg gcgtcgaggt gcataatgcc aagacaaaac ccagggagga acagtacaac tacgtggatg gcgtcgaggt gcataatgcc aagacaaaac ccagggagga acagtacaac
900 900
tccacttatc gcgtcgtgtc tgtcctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag tccacttatc gcgtcgtgtc tgtcctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag
960 960
gagtataagt gcaaagtgag caataaggct ctgcccgcac ctatcgagaa aacaatttcc gagtataagt gcaaagtgag caataaggct ctgcccgcac ctatcgagaa aacaatttcc
10201020
aaggctaaag ggcagcctag agaaccacag gtgtacgtgt accctccatc tagggacgag aaggctaaag ggcagcctag agaaccacag gtgtacgtgt accctccatc tagggacgag
10801080
ctgaccaaga accaggtcag tctgacatgt ctggtgaaag ggttctatcc cagcgatatc ctgaccaaga accaggtcag tctgacatgt ctggtgaaag ggttctatcc cagcgatatc
11401140
gcagtggagt gggaatccaa tggacagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg gcagtggagt gggaatccaa tggacagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg
12001200
ctggactctg atggaagttt cgccctggtg agtaagctga ccgtcgataa atcacggtgg ctggactctg atggaagttt cgccctggtg agtaagctga ccgtcgataa atcacggtgg
12601260
cagcagggca acgtgttcag ctgttcagtg atgcacgaag cactgcacaa ccactacacc cagcagggca acgtgttcag ctgttcagtg atgcacgaag cactgcacaa ccactacacc
13201320
cagaaaagcc tgtccctgtc ccccggc cagaaaagcc tgtccctgtc ccccggc
13471347
<210> 32<210> 32
<211> 120<211> 120
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 32<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp ThrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValTyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser ValAla Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GlnSer Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 33<210> 33
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 33<400> 33
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr TyrGly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 515
<210> 34<210> 34
<211> 13<211> 13
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 34<400> 34
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp TyrSer Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 101 5 10
<210> 35<210> 35
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 35<400> 35
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr ThrIle Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr
1 515
<210> 36<210> 36
<211> 448<211> 448
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 36<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheGly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PheThr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala LeuPro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140 130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser TrpGly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val LeuAsn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175 165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro SerGln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys ProSer Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205 195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp LysSer Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220 210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerSer Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu AspArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnPro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285 275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300 290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu LysTyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335 325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ValThr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350 340 345 350
Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu ThrTyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365 355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380 370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val LeuSer Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415 405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluSer Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430 420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GlyAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445 435 440 445
<210> 37<210> 37
<211> 1344<211> 1344
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 37<400> 37
gaggtgcagc tggtggaatc aggagggggc ctggtgcagc ccggagggtc tctgcgactg gaggtgcagc tggtggaatc aggagggggc ctggtgcagc ccggagggtc tctgcgactg
60 60
tcatgtgccg cttctgggtt cactttcgca gactacacaa tggattgggt gcgacaggcc tcatgtgccg cttctgggtt cactttcgca gactacacaa tggattgggt gcgacaggcc
120 120
cccggaaagg gactggagtg ggtgggcgat gtcaacccta attctggcgg gagtatctac cccggaaagg gactggagtg ggtgggcgat gtcaacccta attctggcgg gagtatctac
180 180
aaccagcggt tcaaggggag attcactttt tcagtggaca gaagcaaaaa caccctgtat aaccagcggt tcaaggggag attcactttt tcagtggaca gaagcaaaaa caccctgtat
240 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaagat accgctgtct actattgcgc tcgcaatctg ctgcagatga acagcctgag ggccgaagat accgctgtct actattgcgc tcgcaatctg
300 300
ggccccagtt tctactttga ctattggggg cagggaaccc tggtgacagt cagctccgct ggccccagtt tctactttga ctattggggg cagggaaccc tggtgacagt cagctccgct
360 360
agcactaagg ggccttccgt gtttccactg gctccctcta gtaaatccac ctctggaggc agcactaagg ggccttccgt gtttccactg gctccctcta gtaaatccac ctctggaggc
420 420
acagctgcac tgggatgtct ggtgaaggat tacttccctg aaccagtcac agtgagttgg acagctgcac tgggatgtct ggtgaaggat tacttccctg aaccagtcac agtgagttgg
480 480
aactcagggg ctctgacaag tggagtccat acttttcccg cagtgctgca gtcaagcgga aactcagggg ctctgacaag tggagtccat acttttcccg cagtgctgca gtcaagcgga
540 540
ctgtactccc tgtcctctgt ggtcaccgtg cctagttcaa gcctgggcac ccagacatat ctgtactccc tgtcctctgt ggtcaccgtg cctagttcaa gcctgggcac ccagacatat
600 600
atctgcaacg tgaatcacaa gccatcaaat acaaaagtcg acaagaaagt ggagcccaag atctgcaacg tgaatcacaa gccatcaaat acaaaagtcg acaagaaagt ggagcccaag
660 660
agctgtgata aaactcatac ctgcccacct tgtccggcgc cagaactgct gggaggacca agctgtgata aaactcatac ctgcccacct tgtccggcgc cagaactgct gggaggacca
720 720
agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gacaccctga tgatttcccg gactcctgag agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gacaccctga tgatttcccg gactcctgag
780 780
gtcacctgcg tggtcgtgga cgtgtctcac gaggaccccg aagtcaagtt caactggtac gtcacctgcg tggtcgtgga cgtgtctcac gaggaccccg aagtcaagtt caactggtac
840 840
gtggatggcg tcgaagtgca taatgccaag accaaacccc gggaggaaca gtacaactct gtggatggcg tcgaagtgca taatgccaag accaaacccc gggaggaaca gtacaactct
900 900
acctatagag tcgtgagtgt cctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa tgggaaggag acctatagag tcgtgagtgt cctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa tgggaaggag
960 960
tataagtgta aagtgagcaa caaagccctg cccgccccaa tcgaaaaaac aatctctaaa tataagtgta aagtgagcaa caaagccctg cccgccccaa tcgaaaaaac aatctctaaa
10201020
gcaaaaggac agcctcgcga accacaggtc tacgtctacc ccccatcaag agatgaactg gcaaaaggac agcctcgcga accacaggtc tacgtctacc ccccatcaag agatgaactg
10801080
acaaaaaatc aggtctctct gacatgcctg gtcaaaggat tctacccttc cgacatcgcc acaaaaaatc aggtctctct gacatgcctg gtcaaaggat tctacccttc cgacatcgcc
11401140
gtggagtggg aaagtaacgg ccagcccgag aacaattaca agaccacacc ccctgtcctg gtggagtggg aaagtaacgg ccagcccgag aacaattaca agaccacacc ccctgtcctg
12001200
gactctgatg ggagtttcgc tctggtgtca aagctgaccg tcgataaaag ccggtggcag gactctgatg ggagtttcgc tctggtgtca aagctgaccg tcgataaaag ccggtggcag
12601260
cagggcaatg tgtttagctg ctccgtcatg cacgaagccc tgcacaatca ctacacacag cagggcaatg tgtttagctg ctccgtcatg cacgaagccc tgcacaatca ctacacacag
13201320
aagtccctga gcctgagccc tggc aagtccctga gcctgagccc tggc
13441344
<210> 38<210> 38
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 38<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheGly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 39<210> 39
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 39<400> 39
Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr ThrGly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Thr
1 515
<210> 40<210> 40
<211> 12<211> 12
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 40<400> 40
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp TyrAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 101 5 10
<210> 41<210> 41
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 41<400> 41
Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly SerVal Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser
1 515
<210> 42<210> 42
<211> 226<211> 226
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 42<400> 42
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr Gly Ser Asp Ile Gln MetTyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr Gly Ser Asp Ile Gln Met
1 5 10 151 5 10 15
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val ThrThr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
20 25 30 20 25 30
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp TyrIle Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr
35 40 45 35 40 45
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala SerGln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
50 55 60 50 55 60
Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyTyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
65 70 75 8065 70 75 80
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe AlaThr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
85 90 95 85 90 95
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly GlnThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val PheGly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125 115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Glu Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser ValIle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Glu Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140 130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln TrpVal Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Glu Glu Ser Val ThrLys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Glu Glu Ser Val Thr
165 170 175 165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu GluGlu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu ValLeu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205 195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg GlyThr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220 210 215 220
Glu CysGlu Cys
225225
<210> 43<210> 43
<211> 678<211> 678
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 43<400> 43
tatccctacg atgtgcctga ctacgctact ggctccgata tccagatgac ccagtctcca tatccctacg atgtgcctga ctacgctact ggctccgata tccagatgac ccagtctcca
60 60
agctccctga gtgcatcagt gggggaccga gtcaccatca catgcaaggc ttcccaggat agctccctga gtgcatcagt gggggaccga gtcaccatca catgcaaggc ttcccaggat
120 120
gtgtctattg gagtcgcatg gtaccagcag aagccaggca aagcacccaa gctgctgatc gtgtctattg gagtcgcatg gtaccagcag aagccaggca aagcacccaa gctgctgatc
180 180
tacagcgcct cctaccggta tactggggtg ccttccagat tctctggcag tgggtcagga tacagcgcct cctaccggta tactggggtg ccttccagat tctctggcag tgggtcagga
240 240
accgacttta ctctgaccat ctctagtctg cagcccgagg atttcgccac ctactattgc accgacttta ctctgaccat ctctagtctg cagcccgagg atttcgccac ctactattgc
300 300
cagcagtact atatctaccc ttataccttt ggccagggga caaaagtgga gatcaagagg cagcagtact atatctaccc ttataccttt ggccagggga caaaagtgga gatcaagagg
360 360
acagtggccg ctccaagtgt cttcattttt cccccttccg acgaagagct gaaaagtgga acagtggccg ctccaagtgt cttcattttt cccccttccg acgaagagct gaaaagtgga
420 420
actgcttcag tggtctgtct gctgaacaat ttctaccccc gcgaagccaa agtgcagtgg actgcttcag tggtctgtct gctgaacaat ttctaccccc gcgaagccaa agtgcagtgg
480 480
aaggtcgata acgctctgca gagcggcaat tccgaggagt ctgtgacaga acaggacagt aaggtcgata acgctctgca gagcggcaat tccgaggagt ctgtgacaga acaggacagt
540 540
aaagattcaa cttatagcct gtcaagcaca ctggagctgt ctaaggcaga ctacgagaag aaagattcaa cttatagcct gtcaagcaca ctggagctgt ctaaggcaga ctacgagaag
600 600
cacaaagtgt atgcctgcga agtcacccat caggggctgt cctctcccgt gacaaagagc cacaaagtgt atgcctgcga agtcacccat caggggctgt cctctcccgt gacaaagagc
660 660
tttaacagag gagagtgt tttaacagag gagagtgt
678 678
<210> 44<210> 44
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 44<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro TyrGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 45<210> 45
<211> 481<211> 481
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 45<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr AlaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro ProGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly GlyThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly GluGly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu
115 120 125 115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerVal Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140 130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr TyrLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145 150 155 160145 150 155 160
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val AlaIle His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175 165 170 175
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val LysArg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190 180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr LeuGly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
195 200 205 195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys SerGln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220 210 215 220
Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln GlyArg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp LysThr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
245 250 255 245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270 260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerSer Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285 275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu AspArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300 290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnPro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335 325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350 340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu LysTyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365 355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ThrThr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380 370 375 380
Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu ThrTyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
385 390 395 400385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415 405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val LeuSer Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
420 425 430 420 425 430
Asp Glu Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Glu Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445 435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluSer Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460 450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GlyAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480465 470 475 480
LysLys
<210> 46<210> 46
<211> 1443<211> 1443
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 46<400> 46
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc
60 60
atcacttgcc gggcaagtca ggacgttaac accgctgtag cttggtatca gcagaaacca atcacttgcc gggcaagtca ggacgttaac accgctgtag cttggtatca gcagaaacca
120 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatcctttt tgtacagtgg ggtcccatca gggaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatcctttt tgtacagtgg ggtcccatca
180 180
aggttcagtg gcagtcgatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct aggttcagtg gcagtcgatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct
240 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattacacta ccccacccac tttcggccaa gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattacacta ccccacccac tttcggccaa
300 300
gggaccaaag tggagatcaa aggtggttct ggtggtggtt ctggtggtgg ttctggtggt gggaccaaag tggagatcaa aggtggttct ggtggtggtt ctggtggtgg ttctggtggt
360 360
ggttctggtg gtggttctgg tgaagtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtacag ggttctggtg gtggttctgg tgaagtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtacag
420 420
cctggcgggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcaacattaa agatacttat cctggcgggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcaacattaa agatacttat
480 480
atccactggg tccggcaagc tccagggaag ggcctggagt gggtcgcacg tatttatccc atccactggg tccggcaagc tccagggaag ggcctggagt gggtcgcacg tatttatccc
540 540
acaaatggtt acacacggta tgcggactct gtgaagggcc gattcaccat ctccgcagac acaaatggtt acacacggta tgcggactct gtgaagggcc gattcaccat ctccgcagac
600 600
acttccaaga acaccgcgta tctgcaaatg aacagtctga gagctgagga cacggccgtt acttccaaga acaccgcgta tctgcaaatg aacagtctga gagctgagga cacggccgtt
660 660
tattactgtt caagatgggg cggagacggt ttctacgcta tggactactg gggccaaggg tattactgtt caagatgggg cggagacggt ttctacgcta tggactactg gggccaaggg
720 720
accctggtca ccgtctcctc agccgccgag cccaagagca gcgataagac ccacacctgc accctggtca ccgtctcctc agccgccgag cccaagagca gcgataagac ccacacctgc
780 780
cctccctgtc cagctccaga actgctggga ggacctagcg tgttcctgtt tccccctaag cctccctgtc cagctccaga actgctggga ggacctagcg tgttcctgtt tccccctaag
840 840
ccaaaagaca ctctgatgat ttccaggact cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg ccaaaagaca ctctgatgat ttccaggact cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg
900 900
tctcacgagg accccgaagt gaagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga agtgcataat tctcacgagg accccgaagt gaagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga agtgcataat
960 960
gctaagacaa aaccaagaga ggaacagtac aactccactt atcgcgtcgt gagcgtgctg gctaagacaa aaccaagaga ggaacagtac aactccactt atcgcgtcgt gagcgtgctg
10201020
accgtgctgc accaggactg gctgaacggg aaggagtata agtgcaaagt cagtaataag accgtgctgc accaggactg gctgaacggg aaggagtata agtgcaaagt cagtaataag
10801080
gccctgcctg ctccaatcga aaaaaccatc tctaaggcca aaggccagcc aagggagccc gccctgcctg ctccaatcga aaaaaccatc tctaaggcca aaggccagcc aagggagccc
11401140
caggtgtaca catacccacc cagcagagac gaactgacca agaaccaggt gtccctgaca caggtgtaca catacccacc cagcagagac gaactgacca agaaccaggt gtccctgaca
12001200
tgtctggtga aaggcttcta tcctagtgat attgctgtgg agtgggaatc aaatggacag tgtctggtga aaggcttcta tcctagtgat attgctgtgg agtgggaatc aaatggacag
12601260
ccagagaaca attacaagac cacacctcca gtgctggacg aggatggcag cttcgccctg ccagagaaca attacaagac cacacctcca gtgctggacg aggatggcag cttcgccctg
13201320
gtgtccaagc tgacagtgga taaatctcga tggcagcagg ggaacgtgtt tagttgttca gtgtccaagc tgacagtgga taaatctcga tggcagcagg ggaacgtgtt tagttgttca
13801380
gtgatgcatg aagccctgca caatcattac actcagaaga gcctgtccct gtctcccggc gtgatgcatg aagccctgca caatcattac actcagaaga gcctgtccct gtctcccggc
14401440
aaa aaa
14431443
<210> 47<210> 47
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 47<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr AlaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro ProGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 48<210> 48
<211> 120<211> 120
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 48<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp ThrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValTyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser ValAla Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GlnSer Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 49<210> 49
<211> 481<211> 481
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 49<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr AlaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro ProGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly GlyThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly GluGly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu
115 120 125 115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerVal Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140 130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr TyrLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145 150 155 160145 150 155 160
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val AlaIle His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175 165 170 175
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val LysArg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190 180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr LeuGly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
195 200 205 195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys SerGln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220 210 215 220
Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln GlyArg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp LysThr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
245 250 255 245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270 260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerSer Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285 275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu AspArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300 290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnPro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335 325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350 340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu LysTyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365 355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ThrThr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380 370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu IleLeu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ile
385 390 395 400385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415 405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Arg Tyr Met Thr Trp Pro Pro Val LeuSer Asn Gly Gln Pro Glu Asn Arg Tyr Met Thr Trp Pro Pro Val Leu
420 425 430 420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445 435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluSer Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460 450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GlyAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480465 470 475 480
LysLys
<210> 50<210> 50
<211> 1443<211> 1443
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 50<400> 50
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc
60 60
atcacttgcc gggcaagtca ggacgttaac accgctgtag cttggtatca gcagaaacca atcacttgcc gggcaagtca ggacgttaac accgctgtag cttggtatca gcagaaacca
120 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatcctttt tgtacagtgg ggtcccatca gggaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatcctttt tgtacagtgg ggtcccatca
180 180
aggttcagtg gcagtcgatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct aggttcagtg gcagtcgatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct
240 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattacacta ccccacccac tttcggccaa gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattacacta ccccacccac tttcggccaa
300 300
gggaccaaag tggagatcaa aggtggttct ggtggtggtt ctggtggtgg ttctggtggt gggaccaaag tggagatcaa aggtggttct ggtggtggtt ctggtggtgg ttctggtggt
360 360
ggttctggtg gtggttctgg tgaagtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtacag ggttctggtg gtggttctgg tgaagtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtacag
420 420
cctggcgggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcaacattaa agatacttat cctggcgggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcaacattaa agatacttat
480 480
atccactggg tccggcaagc tccagggaag ggcctggagt gggtcgcacg tatttatccc atccactggg tccggcaagc tccagggaag ggcctggagt gggtcgcacg tatttatccc
540 540
acaaatggtt acacacggta tgcggactct gtgaagggcc gattcaccat ctccgcagac acaaatggtt acacacggta tgcggactct gtgaagggcc gattcaccat ctccgcagac
600 600
acttccaaga acaccgcgta tctgcaaatg aacagtctga gagctgagga cacggccgtt acttccaaga acaccgcgta tctgcaaatg aacagtctga gagctgagga cacggccgtt
660 660
tattactgtt caagatgggg cggagacggt ttctacgcta tggactactg gggccaaggg tattactgtt caagatgggg cggagacggt ttctacgcta tggactactg gggccaaggg
720 720
accctggtca ccgtctcctc agccgccgag cccaagagca gcgataagac ccacacctgc accctggtca ccgtctcctc agccgccgag cccaagagca gcgataagac ccacacctgc
780 780
cctccctgtc cagctccaga actgctggga ggacctagcg tgttcctgtt tccccctaag cctccctgtc cagctccaga actgctggga ggacctagcg tgttcctgtt tccccctaag
840 840
ccaaaagaca ctctgatgat ttccaggact cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg ccaaaagaca ctctgatgat ttccaggact cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg
900 900
tctcacgagg accccgaagt gaagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga agtgcataat tctcacgagg accccgaagt gaagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga agtgcataat
960 960
gctaagacaa aaccaagaga ggaacagtac aactccactt atcgcgtcgt gagcgtgctg gctaagacaa aaccaagaga ggaacagtac aactccactt atcgcgtcgt gagcgtgctg
10201020
accgtgctgc accaggactg gctgaacggg aaggagtata agtgcaaagt cagtaataag accgtgctgc accaggactg gctgaacggg aaggagtata agtgcaaagt cagtaataag
10801080
gccctgcctg ctccaatcga aaaaaccatc tctaaggcca aaggccagcc aagggagccc gccctgcctg ctccaatcga aaaaaccatc tctaaggcca aaggccagcc aagggagccc
11401140
caggtgtaca cactgccacc cagcagagac gaactgacca agaaccaggt gtccctgatc caggtgtaca cactgccacc cagcagagac gaactgacca agaaccaggt gtccctgatc
12001200
tgtctggtga aaggcttcta tcctagtgat attgctgtgg agtgggaatc aaatggacag tgtctggtga aaggcttcta tcctagtgat attgctgtgg agtgggaatc aaatggacag
12601260
ccagagaaca gatacatgac ctggcctcca gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg ccagagaaca gatacatgac ctggcctcca gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg
13201320
tattccaagc tgacagtgga taaatctcga tggcagcagg ggaacgtgtt tagttgttca tattccaagc tgacagtgga taaatctcga tggcagcagg ggaacgtgtt tagttgttca
13801380
gtgatgcatg aagccctgca caatcattac actcagaaga gcctgtccct gtctcccggc gtgatgcatg aagccctgca caatcattac actcagaaga gcctgtccct gtctcccggc
14401440
aaa aaa
14431443
<210> 51<210> 51
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 51<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr AlaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro ProGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 52<210> 52
<211> 120<211> 120
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 52<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp ThrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValTyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser ValAla Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GlnSer Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 53<210> 53
<211> 448<211> 448
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 53<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PheThr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala LeuPro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140 130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser TrpGly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val LeuAsn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175 165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro SerGln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys ProSer Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205 195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp LysSer Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220 210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerSer Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu AspArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnPro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285 275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300 290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu LysTyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335 325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ValThr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350 340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu LeuLeu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380 370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val LeuSer Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu
385 390 395 400385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415 405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluSer Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430 420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GlyAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445 435 440 445
<210> 54<210> 54
<211> 1344<211> 1344
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 54<400> 54
gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg gaagtgcagc tggtcgaatc tggagggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg
60 60
tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca
120 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac
180 180
aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat
240 240
ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg
300 300
gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc
360 360
tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga
420 420
actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg
480 480
aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg
540 540
ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat
600 600
atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag
660 660
tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca
720 720
agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa
780 780
gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac
840 840
gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca gggaggaaca gtacaacagt gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca ggggaggaaca gtacaacagt
900 900
acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag
960 960
tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag
10201020
gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgctgc ctccatcaag ggatgagctg gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgctgc ctccatcaag ggatgagctg
10801080
acaaagaacc aggtcagcct gctgtgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct acaaagaacc aggtcagcct gctgtgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct
11401140
gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattacc tgacctggcc ccctgtgctg gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattacc tgacctggcc ccctgtgctg
12001200
gactcagatg gcagcttctt tctgtatagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag gactcagatg gcagcttctt tctgtatagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag
12601260
caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag
13201320
aagtcactgt cactgtcacc aggg aagtcactgt cactgtcacc aggg
13441344
<210> 55<210> 55
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 55<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 56<210> 56
<211> 448<211> 448
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 56<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PheThr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala LeuPro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140 130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser TrpGly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val LeuAsn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175 165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro SerGln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys ProSer Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205 195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp LysSer Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220 210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerSer Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu AspArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnPro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285 275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300 290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu LysTyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335 325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ValThr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350 340 345 350
Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu ThrTyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365 355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380 370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val LeuSer Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415 405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluSer Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430 420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GlyAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445 435 440 445
<210> 57<210> 57
<211> 1344<211> 1344
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 57<400> 57
gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg gaagtgcagc tggtcgaatc tggagggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg
60 60
tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca
120 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac
180 180
aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat
240 240
ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg
300 300
gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc
360 360
tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga
420 420
actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg
480 480
aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg
540 540
ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat
600 600
atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag
660 660
tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca
720 720
agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa
780 780
gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac
840 840
gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca gggaggaaca gtacaacagt gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca ggggaggaaca gtacaacagt
900 900
acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag
960 960
tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag
10201020
gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgtatc ctccatcaag ggatgagctg gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgtatc ctccatcaag ggatgagctg
10801080
acaaagaacc aggtcagcct gacttgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct acaaagaacc aggtcagcct gacttgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct
11401140
gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattaca agaccacacc ccctgtgctg gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattaca agaccacacc ccctgtgctg
12001200
gactcagatg gcagcttcgc gctggtgagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag gactcagatg gcagcttcgc gctggtgagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag
12601260
caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag
13201320
aagtcactgt cactgtcacc aggg aagtcactgt cactgtcacc aggg
13441344
<210> 58<210> 58
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 58<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 59<210> 59
<211> 475<211> 475
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 59<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro TyrGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly SerThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110 100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val GluGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser CysSer Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140 130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val ArgAla Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg
145 150 155 160145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro AsnGln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn
165 170 175 165 170 175
Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr LeuSer Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu
180 185 190 180 185 190
Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser LeuSer Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205 195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly ProArg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro
210 215 220 210 215 220
Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val SerSer Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240225 230 235 240
Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro ProSer Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255 245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe ProCys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270 260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val ThrPro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285 275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe AsnCys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300 290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro ArgTrp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr ValGlu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335 325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val SerLeu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350 340 345 350
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala LysAsn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365 355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg AspGly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp
370 375 380 370 375 380
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly PheGlu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro GluTyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415 405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser PheAsn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430 420 425 430
Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln GlyAla Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445 435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His TyrAsn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460 450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysThr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475465 470 475
<210> 60<210> 60
<211> 1425<211> 1425
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 60<400> 60
gacattcaga tgacccagag ccctagctcc ctgagtgcct cagtcgggga cagggtgact gacattcaga tgacccagag ccctagctcc ctgagtgcct cagtcgggga cagggtgact
60 60
atcacctgca aggcttcaca ggatgtcagc attggcgtgg catggtacca gcagaagcca atcacctgca aggcttcaca ggatgtcagc attggcgtgg catggtacca gcagaagcca
120 120
gggaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctaca ggtatacagg cgtgccatcc gggaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctaca ggtatacagg cgtgccatcc
180 180
cgcttctctg gcagtgggtc aggaactgac tttacactga ctatttctag tctgcagccc cgcttctctg gcagtgggtc aggaactgac tttacactga ctatttctag tctgcagccc
240 240
gaagatttcg ccacatacta ttgccagcag tactatatct acccttatac ttttggccag gaagatttcg ccacatacta ttgccagcag tactatatct acccttatac ttttggccag
300 300
gggaccaaag tggagattaa gggcggagga ggctccggag gaggagggtc tggaggagga gggaccaaag tggagattaa gggcggagga ggctccggag gaggagggtc tggagggagga
360 360
ggaagtgagg tccagctggt ggaatctgga ggaggactgg tgcagccagg agggtccctg ggaagtgagg tccagctggt ggaatctgga ggaggactgg tgcagccagg agggtccctg
420 420
aggctgtctt gtgccgctag tggcttcacc tttacagact acacaatgga ttgggtgcgc aggctgtctt gtgccgctag tggcttcacc tttacagact acacaatgga ttgggtgcgc
480 480
caggcaccag gaaagggact ggaatgggtc gctgatgtga accctaatag cggaggctcc caggcaccag gaaagggact ggaatgggtc gctgatgtga accctaatag cggaggctcc
540 540
atctacaacc agcggttcaa aggacggttc accctgtcag tggaccggag caagaacacc atctacaacc agcggttcaa aggacggttc accctgtcag tggaccggag caagaacacc
600 600
ctgtatctgc agatgaacag cctgagagcc gaggatactg ctgtgtacta ttgcgccagg ctgtatctgc agatgaacag cctgagagcc gaggatactg ctgtgtacta ttgcgccagg
660 660
aatctgggcc caagcttcta ctttgactat tgggggcagg gaacactggt cactgtgtca aatctgggcc caagcttcta ctttgactat tgggggcagg gaacactggt cactgtgtca
720 720
agcgcagccg aacccaaatc ctctgataag actcacacct gcccaccttg tccagctcca agcgcagccg aacccaaatc ctctgataag actcacacct gccaccttg tccagctcca
780 780
gagctgctgg gaggacctag cgtgttcctg tttccaccca agccaaaaga cactctgatg gagctgctgg gaggacctag cgtgttcctg tttccaccca agccaaaaga cactctgatg
840 840
atttctagaa cccctgaagt gacatgtgtg gtcgtggacg tcagtcacga ggaccccgaa atttctagaa cccctgaagt gacatgtgtg gtcgtggacg tcagtcacga ggaccccgaa
900 900
gtcaaattca actggtacgt ggatggcgtc gaggtgcata atgccaagac caaaccccga gtcaaattca actggtacgt ggatggcgtc gaggtgcata atgccaagac caaaccccga
960 960
gaggaacagt acaactcaac ctatcgggtc gtgagcgtcc tgacagtgct gcatcaggac gaggaacagt acaactcaac ctatcgggtc gtgagcgtcc tgacagtgct gcatcaggac
10201020
tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaaa gtgagcaaca aggctctgcc tgcaccaatc tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaaa gtgagcaaca aggctctgcc tgcaccaatc
10801080
gagaagacca tttccaaggc taaagggcag ccccgcgaac ctcaggtcta cgtgtatcct gagaagacca tttccaaggc taaagggcag ccccgcgaac ctcaggtcta cgtgtatcct
11401140
ccaagccgag atgagctgac aaaaaaccag gtctccctga cttgtctggt gaagggattt ccaagccgag atgagctgac aaaaaaccag gtctccctga cttgtctggt gaagggattt
12001200
tacccaagtg acatcgcagt ggagtgggaa tcaaatggcc agcccgaaaa caattataag tacccaagtg acatcgcagt ggagtgggaa tcaaatggcc agcccgaaaa caattataag
12601260
accacacccc ctgtgctgga ctctgatggg agtttcgcac tggtctccaa actgaccgtg accacacccc ctgtgctgga ctctgatggg agtttcgcac tggtctccaa actgaccgtg
13201320
gacaagtctc ggtggcagca gggaaacgtc tttagctgtt ccgtgatgca cgaggccctg gacaagtctc ggtggcagca gggaaacgtc tttagctgtt ccgtgatgca cgaggccctg
13801380
cacaatcatt acacacagaa atctctgagt ctgtcacctg gcaag cacaatcatt acacacagaa atctctgagt ctgtcacctg gcaag
14251425
<210> 61<210> 61
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 61<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro TyrGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 62<210> 62
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 62<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 63<210> 63
<211> 480<211> 480
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 63<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr AlaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro ProGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly GlyThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly GluGly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu
115 120 125 115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerVal Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140 130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr TyrLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145 150 155 160145 150 155 160
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val AlaIle His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175 165 170 175
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val LysArg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190 180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr LeuGly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
195 200 205 195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys SerGln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220 210 215 220
Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln GlyArg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp LysThr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
245 250 255 245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270 260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerSer Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285 275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu AspArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300 290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnPro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335 325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350 340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu LysTyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365 355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ValThr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val
370 375 380 370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu LeuLeu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
385 390 395 400385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415 405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val LeuSer Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu
420 425 430 420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445 435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluSer Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460 450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GlyAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480465 470 475 480
<210> 64<210> 64
<211> 1440<211> 1440
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 64<400> 64
gacattcaga tgacacagag ccccagctcc ctgagtgctt cagtcggcga cagggtgact gacattcaga tgacacagag ccccagctcc ctgagtgctt cagtcggcga cagggtgact
60 60
atcacctgcc gcgcatccca ggatgtcaac accgctgtgg catggtacca gcagaagcct atcacctgcc gcgcatccca ggatgtcaac accgctgtgg catggtacca gcagaagcct
120 120
ggaaaagccc caaagctgct gatctacagc gcttccttcc tgtattctgg cgtgccaagt ggaaaagccc caaagctgct gatctacagc gcttccttcc tgtattctgg cgtgccaagt
180 180
cggttttctg gaagtagatc aggcactgac ttcacactga ctatctctag tctgcagccc cggttttctg gaagtagatc aggcactgac ttcacactga ctatctctag tctgcagccc
240 240
gaagattttg ccacctacta ttgccagcag cactatacca caccccctac attcggacag gaagattttg ccacctacta ttgccagcag cactatacca caccccctac attcggacag
300 300
ggcactaaag tggagattaa gggcgggtca ggcggaggga gcggaggagg gtccggagga ggcactaaag tggagattaa gggcgggtca ggcggaggga gcggaggagg gtccggagga
360 360
gggtctggag gagggagtgg agaggtccag ctggtggaat ctggaggagg actggtgcag gggtctggag gagggagtgg agaggtccag ctggtggaat ctggaggagg actggtgcag
420 420
cctggaggct cactgcgact gagctgtgcc gcttccggct ttaacatcaa agacacatac cctggaggct cactgcgact gagctgtgcc gcttccggct ttaacatcaa agacacatac
480 480
attcattggg tcaggcaggc accagggaag ggactggaat gggtggcccg catctatccc attcattggg tcaggcaggc accagggaag ggactggaat gggtggcccg catctatccc
540 540
acaaatgggt acactcgata tgccgacagc gtgaaaggac ggtttaccat ttctgctgat acaaatgggt acactcgata tgccgacagc gtgaaaggac ggtttaccat ttctgctgat
600 600
accagtaaga acacagcata cctgcagatg aacagcctgc gcgcagagga tacagccgtg accagtaaga acacagcata cctgcagatg aacagcctgc gcgcagagga tacagccgtg
660 660
tactattgca gtcgatgggg gggagacggc ttctacgcca tggattattg gggccagggg tactattgca gtcgatgggg ggggacggc ttctacgcca tggattattg gggccagggg
720 720
actctggtca ccgtgtcaag cgcagccgaa cctaaatcct ctgacaagac ccacacatgc actctggtca ccgtgtcaag cgcagccgaa cctaaatcct ctgacaagac ccacacatgc
780 780
ccaccctgtc ctgctccaga gctgctggga ggaccatccg tgttcctgtt tcctccaaag ccaccctgtc ctgctccaga gctgctggga ggaccatccg tgttcctgtt tcctccaaag
840 840
cctaaagata cactgatgat tagccgcact cccgaagtca cctgtgtggt cgtggacgtg cctaaagata cactgatgat tagccgcact cccgaagtca cctgtgtggt cgtggacgtg
900 900
tcccacgagg accccgaagt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtcga ggtgcataat tcccacgagg accccgaagt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtcga ggtgcataat
960 960
gccaagacta aaccaagaga ggaacagtac aattcaacct atagggtcgt gagcgtcctg gccaagacta aaccaagaga ggaacagtac aattcaacct atagggtcgt gagcgtcctg
10201020
acagtgctgc atcaggattg gctgaacggc aaggagtata agtgcaaagt gtctaacaag acagtgctgc atcaggattg gctgaacggc aaggagtata agtgcaaagt gtctaacaag
10801080
gccctgcccg ctcctatcga gaagactatt agcaaggcaa aagggcagcc acgggaaccc gccctgcccg ctcctatcga gaagactatt agcaaggcaa aagggcagcc acgggaaccc
11401140
caggtctacg tgctgccccc tagcagagac gagctgacca aaaaccaggt ctccctgctg caggtctacg tgctgccccc tagcagagac gagctgacca aaaaccaggt ctccctgctg
12001200
tgtctggtga agggctttta tcctagtgat atcgctgtgg agtgggaatc aaatgggcag tgtctggtga agggctttta tcctagtgat atcgctgtgg agtgggaatc aaatgggcag
12601260
ccagaaaaca attacctgac atggccaccc gtgctggaca gcgatgggtc cttctttctg ccagaaaaca attacctgac atggccaccc gtgctggaca gcgatgggtc cttctttctg
13201320
tattccaaac tgactgtgga caagtctaga tggcagcagg gaaacgtctt cagctgttcc tattccaaac tgactgtgga caagtctaga tggcagcagg gaaacgtctt cagctgttcc
13801380
gtgatgcacg aggccctgca caatcattac acccagaagt ctctgagtct gtcacccggc gtgatgcacg aggccctgca caatcattac acccagaagt ctctgagtct gtcacccggc
14401440
<210> 65<210> 65
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 65<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr AlaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro ProGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 66<210> 66
<211> 120<211> 120
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 66<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp ThrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValTyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser ValAla Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GlnSer Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 67<210> 67
<211> 6<211> 6
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 67<400> 67
Gln Asp Val Asn Thr AlaGln Asp Val Asn Thr Ala
1 515
<210> 68<210> 68
<211> 3<211> 3
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 68<400> 68
Ser Ala SerSer Ala Ser
<210> 69<210> 69
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 69<400> 69
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro ThrGln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 515
<210> 70<210> 70
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 70<400> 70
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr TyrGly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 515
<210> 71<210> 71
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 71<400> 71
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr ThrIle Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr
1 515
<210> 72<210> 72
<211> 13<211> 13
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 72<400> 72
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp TyrSer Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 101 5 10
<210> 73<210> 73
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 73<400> 73
Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr SerVal Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser
1 515
<210> 74<210> 74
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 74<400> 74
Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr ThrGly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr Thr
1 515
<210> 75<210> 75
<211> 12<211> 12
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 75<400> 75
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp TyrAla Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 101 5 10
<210> 76<210> 76
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 76<400> 76
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Gly ThrGln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Gly Thr
1 515
<210> 77<210> 77
<211> 8<211> 8
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 77<400> 77
Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr ThrGly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr Thr
1 515
<210> 78<210> 78
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 78<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 79<210> 79
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 79<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro AlaGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 80<210> 80
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 80<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 81<210> 81
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 81<400> 81
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro TyrGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 82<210> 82
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 82<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 83<210> 83
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 83<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 84<210> 84
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 84<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Trp Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTrp Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro GlyGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Gly
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 85<210> 85
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 85<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 86<210> 86
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 86<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Trp Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 87<210> 87
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 87<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 88<210> 88
<211> 107<211> 107
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 88<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleVal Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Trp Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTrp Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro TyrGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 89<210> 89
<211> 119<211> 119
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 89<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValThr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg PheAla Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<---<---
Claims (86)
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862642483P | 2018-03-13 | 2018-03-13 | |
| US62/642,483 | 2018-03-13 | ||
| US201862658477P | 2018-04-16 | 2018-04-16 | |
| US62/658,477 | 2018-04-16 | ||
| US201862743884P | 2018-10-10 | 2018-10-10 | |
| US62/743,884 | 2018-10-10 | ||
| PCT/CA2019/050303 WO2019173911A1 (en) | 2018-03-13 | 2019-03-12 | Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020132555A RU2020132555A (en) | 2022-04-13 |
| RU2806049C2 true RU2806049C2 (en) | 2023-10-25 |
| RU2806049C9 RU2806049C9 (en) | 2023-12-18 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015077891A1 (en) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Zymeworks Inc. | Bispecific antigen-binding constructs targeting her2 |
| WO2016041082A1 (en) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | CDRD Ventures, Inc. | Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same |
| RU2656161C1 (en) * | 2013-11-19 | 2018-05-31 | Ремеджен, Лтд. | Anti-her2 antibody and conjugate thereof |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2656161C1 (en) * | 2013-11-19 | 2018-05-31 | Ремеджен, Лтд. | Anti-her2 antibody and conjugate thereof |
| WO2015077891A1 (en) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Zymeworks Inc. | Bispecific antigen-binding constructs targeting her2 |
| WO2016041082A1 (en) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | CDRD Ventures, Inc. | Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Trail P. A., Dubowchik G. M., Lowinger T. B. Antibody drug conjugates for treatment of breast cancer: novel targets and diverse approaches in ADC design //Pharmacology & therapeutics, 2018, 181, р. 126-142. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI794230B (en) | Anti cdh6 antibodies and anti cdh6 antibody drug conjugates, as well as manufacturing method thereof | |
| JP6333882B2 (en) | Antibody-drug conjugate | |
| TWI657096B (en) | Antibodies specific for epidermal growth factor receptor variant iii and their uses | |
| EP3102244B1 (en) | Antibody-drug conjugates and immunotoxins | |
| JP6979950B2 (en) | Site-specific HER2 antibody drug conjugate | |
| JP6585600B2 (en) | Antibodies containing C-terminal light chain polypeptide extensions, and conjugates and methods of use thereof | |
| US20220356246A1 (en) | Anti-ROR1 antibodies and preparation method and uses thereof | |
| US20210346508A1 (en) | Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use | |
| KR20210125511A (en) | Anti-CD228 Antibodies and Antibody-Drug Conjugates | |
| US20170007714A1 (en) | Antibody-drug conjugates and immunotoxins | |
| TW202122421A (en) | Anti-pd-l1 antibodies and antibody-drug conjugates | |
| JP2024056808A (en) | Methods of using bispecific antigen-binding constructs targeting HER2 for the treatment of biliary tract cancer | |
| AU2022335573A1 (en) | Anti-nectin-4 antibody, drug conjugate, and preparation method therefor and use thereof | |
| RU2806049C2 (en) | Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of their application | |
| RU2806049C9 (en) | Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of their application | |
| WO2023051712A1 (en) | Anti-cd39 antibody-drug conjugate and use thereof | |
| WO2023141714A1 (en) | Methods of using anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates in the treatment of cancer | |
| TW202345907A (en) | Anti-gd2 antibodies, immunoconjugates and therapeutic uses thereof | |
| TW202400651A (en) | Anti-CD200R1 antibodies |