RU2805960C1 - Methylotrophic yeast strain ogataea polymorpha 16 ap (bkm y-3389d) for protein production - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: strain of methylotrophic yeast Ogataea polymorpha 16AP is proposed, intended for production of protein and deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms of the G.K.Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of the Russian Academy of Sciences under registration number ВКМ Y-3389D.

EFFECT: invention ensures efficient production of protein.

1 cl, 3 ex

Description

Изобретение относится к промышленной биотехнологии и может быть использовано для производства белка, применяемого в кормопроизводстве для сельскохозяйственных животных, птицы и рыбы (аквакультуры).The invention relates to industrial biotechnology and can be used for the production of protein used in feed production for farm animals, poultry and fish (aquaculture).

Высокопродуктивное животноводство, птицеводство и рыбоводство имеют потребность в комбикормах, богатых белком. Особенностью климатических условий Российской Федерации является производство продукции растениеводства с низким содержанием белка. В результате нехватка белка для производства кормов в Российской Федерации по экспертным оценкам составляет около 2 млн. тонн в год. Эта нехватка частично удовлетворяется за счет импорта таких источников белка как соевый шрот и рыбная мука, а частично, - за счет увеличения доли фуражного зерна в составе комбикормов, доходящая до 70%.Highly productive livestock, poultry and fish farming require feed rich in protein. A feature of the climatic conditions of the Russian Federation is the production of crop products with low protein content. As a result, the shortage of protein for feed production in the Russian Federation, according to expert estimates, is about 2 million tons per year. This shortage is partially met by importing protein sources such as soybean meal and fishmeal, and partially by increasing the share of feed grains in the composition of feed, reaching up to 70%.

По этой причине создание крупнотоннажного отечественного производства белка, способного конкурировать по цене с импортируемыми соевым шротом и рыбной мукой, является актуальной задачей.For this reason, the creation of large-scale domestic protein production capable of competing in price with imported soybean meal and fishmeal is an urgent task.

Во второй половине 20 века активно велись работы по созданию крупнотоннажных производств белка, с использованием промышленных штаммов микроорганизмов, способных синтезировать клеточный белок, потребляя непищевое сырье в качестве единственного источника углерода и энергии. В частности, в СССР было создано крупнейшее в мире микробиологическое производство белка путем управляемого культивирования дрожжей рода Candida на питательной среде с парафинами нефти, являвшимися отходами нефтепереработки. По оценке западных экспертов в СССР производилось около 70% мирового производства белка, получаемого с помощью микробиологических процессов. Однако используемый в этом производстве штамм дрожжей рода Candida Albicans обладал патогенностью и вызывал различные инфекционные заболевания у персонала, занятого на этих производствах. Более того, воздушные выбросы предприятий, содержащие получаемый с помощью этого штамма белок, стали причиной острых аллергических заболеваний населения, живущего в населенных пунктах около указанных промышленных производств. По этой причине, в конце 80-х годов это крупнейшее в мире микробиологическое производство белка было полностью прекращено.In the second half of the 20th century, work was actively carried out to create large-scale protein production, using industrial strains of microorganisms capable of synthesizing cellular protein, consuming non-food raw materials as the only source of carbon and energy. In particular, in the USSR, the world's largest microbiological protein production was created by controlled cultivation of yeast of the genus Candida on a nutrient medium with oil paraffins, which were waste from oil refining. According to Western experts, the USSR produced about 70% of the world's protein production obtained through microbiological processes. However, the yeast strain of the genus Candida Albicans used in this production was pathogenic and caused various infectious diseases among personnel employed in these productions. Moreover, air emissions from enterprises containing the protein produced using this strain have become the cause of acute allergic diseases of the population living in settlements near these industrial productions. For this reason, this world's largest microbiological protein production facility was completely discontinued in the late 1980s.

Одновременно с этим в СССР и во многих зарубежных странах велись исследования по микробиологическому производству белка (в англоязычных публикациях такой белок получил название single cell protein) на питательной среде с метанолом как единственным источником углерода и энергии, используемым микроорганизмами для биосинтеза белка. В результате этих работ были получены патенты на штаммы микроорганизмов-продуцентов белка, использующих метанол в качестве единственного источника углерода и энергии.At the same time, in the USSR and in many foreign countries, research was carried out on the microbiological production of protein (in English-language publications such a protein was called single cell protein) on a nutrient medium with methanol as the only source of carbon and energy used by microorganisms for protein biosynthesis. As a result of this work, patents were obtained for strains of protein-producing microorganisms using methanol as the only source of carbon and energy.

В частности, известен штамм метилотрофных бактерий Methylobacillus methylophilus ВСБ-792 (патент SU 989867 А1), который является продуцентом белка, получаемого на минеральной питательной среде с метанолом.In particular, the known strain of methylotrophic bacteria Methylobacillus methylophilus VSB-792 (patent SU 989867 A1), which is a protein producer obtained on a mineral nutrient medium with methanol.

Известен штамм метилотрофных бактерий Methylomonas methanolica NRRL-B- 5458 (Патент США US 4048013 A), который был также предложен для получения белка при использовании метанола в качестве единственного источника углерода и энергии.A known strain of methylotrophic bacteria Methylomonas methanolica NRRL-B-5458 (US Patent US 4048013 A), which was also proposed for the production of protein using methanol as the only source of carbon and energy.

Известен штамм (Патент Китая CN 103484395 А) метилотрофных бактерий Methylovorus glucosotrophus М25 (CGMCC No.7036), культивируемых на питательной среде с метанолом, и используемых для производства белка, применяемого в качестве добавки в корм для сельскохозяйственных животных.A known strain (Chinese Patent CN 103484395 A) of methylotrophic bacteria Methylovorus glucosotrophus M25 (CGMCC No.7036), cultivated in a nutrient medium with methanol, and used for the production of protein used as an additive in feed for farm animals.

В Великобритании химический концерн ICI в 70-е и 80-е годы разработал и создал промышленное производство кормового белка под торговой маркой Pruteen с использованием метилотрофных бактерий Methylophilus methilotropus (патент СА 3008874), растущих в аэробных условиях на питательной среде с метанолом. В 1980 г. производство белка на промышленном предприятии этого концерна составило до 100000 тонн в год. Однако в связи с резким подорожанием природного газа, из которого производился метанол, а также из-за того, что процесс культивирования бактерий велся в стерильных условиях с высоким удельным потреблением энергии, производство белка Pruteen оказалось убыточным. По этой причине в конце 80-х годов предприятие было закрыто.In the UK, the chemical concern ICI in the 70s and 80s developed and created the industrial production of feed protein under the Pruteen brand using methylotrophic bacteria Methylophilus methilotropus (patent CA 3008874), growing under aerobic conditions in a nutrient medium with methanol. In 1980, protein production at the industrial enterprise of this concern amounted to up to 100,000 tons per year. However, due to a sharp rise in the price of natural gas, from which methanol was produced, and also due to the fact that the process of cultivating bacteria was carried out in sterile conditions with high specific energy consumption, the production of Pruteen protein turned out to be unprofitable. For this reason, the enterprise was closed at the end of the 80s.

Аналогичная участь постигла промышленные предприятия по производству белка из метанола, созданные примерно в это же время в США (компанией Philips Petroleum), в Германии (компанией Hoechst-Uhde), в Японии (компанией Mitsubishi gas), в Швеции (компанией Sweden Norprotein) и во Франции (компанией IFP). Позднее такие же работы проводились в Китае, но тоже не получили развития в промышленном масштабе. Во всех перечисленных случаях недостатком технологического процесса являлась высокая себестоимость промышленного производства белка на питательной среде с метанолом. В частности, сообщалось, что себестоимость белка под торговой маркой Pruteen была в два раза выше оптовой цены соевого шрота. Это обстоятельство не позволяло ему конкурировать по цене с такими источниками белка, как соевый шрот и рыбная мука.A similar fate befell industrial enterprises for the production of protein from methanol, created around the same time in the USA (by Philips Petroleum), in Germany (by Hoechst-Uhde), in Japan (by Mitsubishi gas), in Sweden (by Sweden Norprotein) and in France (by IFP). Later, the same work was carried out in China, but also did not develop on an industrial scale. In all of these cases, the disadvantage of the technological process was the high cost of industrial protein production in a nutrient medium with methanol. In particular, it was reported that the cost of protein under the Pruteen brand was twice the wholesale price of soybean meal. This circumstance did not allow it to compete on price with such protein sources as soybean meal and fishmeal.

Недостатками используемых в этих производствах штаммов метилотрофных бактерий являлось то, что в применяемой для их культивирования питательной среде использовался дорогой метанол, а биосинтез белка велся в стерильных условиях с высоким потреблением энергии, что делало производство убыточным.The disadvantages of the methylotrophic bacterial strains used in these productions were that expensive methanol was used in the nutrient medium used for their cultivation, and protein biosynthesis was carried out under sterile conditions with high energy consumption, which made the production unprofitable.

Полученный опыт показал, что себестоимость белка, получаемого с помощью промышленных штаммов микроорганизмов во многом определяется стоимостью питательной среды и энергетическими затратами на процесс производства. Затраты энергии зависят в основном от того, ведется ли процесс культивирования микроорганизмов, используемых для производства белка в стерильных условиях или в нестерильных. Если процесс ведется в стерильных аэробных условиях, то он всегда связан с высокими удельными затратами энергии как на тепловую стерилизацию оборудования и питательной среды, так и на приготовление высоких удельных объемов стерильного воздуха, подаваемого на аэрацию питательной среды для обеспечения потребности культуры микроорганизмов в растворенном кислороде. Поэтому ведение процесса биосинтеза белка в нестерильных условиях является важным подходом к снижению себестоимости его производства.The experience gained has shown that the cost of protein produced using industrial strains of microorganisms is largely determined by the cost of the nutrient medium and the energy costs of the production process. Energy expenditure depends mainly on whether the process of culturing microorganisms used for protein production is carried out under sterile conditions or under non-sterile conditions. If the process is carried out under sterile aerobic conditions, then it is always associated with high specific energy costs both for thermal sterilization of equipment and nutrient medium, and for the preparation of high specific volumes of sterile air supplied for aeration of the nutrient medium to meet the needs of the microorganism culture in dissolved oxygen. Therefore, conducting the protein biosynthesis process under non-sterile conditions is an important approach to reducing the cost of its production.

Как показал мировой опыт, для экономически эффективного промышленного производства белка требуется максимально снизить издержки производства. Возможности для этого дает проведение процесса культивирования микроорганизмов-продуцентов белка в нестерильных условиях, а также использование дешевой питательной среды. Первая возможность достигается получением микроорганизмов-продуцентов белка, способных потреблять метанол в качестве единственного источника углерода и энергии в условиях, неблагоприятных для роста посторонних микроорганизмов. Вторую возможность может дать использование штаммов микроорганизмов-продуцентов белка, устойчивых к присутствию в питательной среде различных загрязнений, содержащихся в неочищенном метаноле. Учитывая то, что доля, вносимая метанолом в стоимость питательной среды, составляет до 70%, использование более дешевого метанола-сырца является также эффективным путем снижения себестоимости производства белка.As world experience has shown, for economically efficient industrial production of protein it is necessary to reduce production costs as much as possible. Opportunities for this are provided by the process of cultivating protein-producing microorganisms under non-sterile conditions, as well as the use of a cheap nutrient medium. The first possibility is achieved by obtaining protein-producing microorganisms capable of consuming methanol as the only source of carbon and energy under conditions unfavorable for the growth of foreign microorganisms. The second opportunity can be provided by the use of strains of protein-producing microorganisms that are resistant to the presence in the nutrient medium of various contaminants contained in crude methanol. Considering that the share contributed by methanol to the cost of the nutrient medium is up to 70%, the use of cheaper raw methanol is also an effective way to reduce the cost of protein production.

Метанол может производиться из различного углеродсодержащего сырья, в частности, из нефти, угля, древесины, из природного и попутного нефтяного газа. Наиболее дешевым метанол получается из природного и попутного нефтяного газа. Производство метанола осуществляют методом органического синтеза, который ведут в несколько стадий. На первой стадии из исходного углеводородного сырья получают синтез-газ, содержащий водород и оксиды углерода. На второй стадии из синтез-газа получают полупродукт - неочищенный метанол, так называемый метанол-сырец. В нем, помимо метанола, доля которого составляет 83-85%, содержатся вода, диметиловый эфир и высшие спирты, в частности, изобутанол. На третьей стадии производится очистка метанола-сырца методом двойной последовательной ректификации с получением высокоочищенного продукта с содержанием метанола 99,95%. Очистка метанола-сырца на двух последовательных ректификационных колоннах приводит к удорожанию метанола. Как правило, цена очищенного метанола в 2-3 раза выше цены, по которой реализуется метанол-сырец. По этой причине, получение штамма микроорганизма-продуцента белка, способного расти на питательной среде, в которой вместо очищенного метанола используется метанол-сырец, является эффективным путем снижения себестоимости производства белка из метанола.Methanol can be produced from various carbon-containing raw materials, in particular from oil, coal, wood, natural and associated petroleum gas. The cheapest methanol is obtained from natural and associated petroleum gas. Methanol production is carried out by organic synthesis, which is carried out in several stages. At the first stage, synthesis gas containing hydrogen and carbon oxides is obtained from the initial hydrocarbon feedstock. At the second stage, an intermediate product is obtained from the synthesis gas - crude methanol, the so-called raw methanol. In addition to methanol, whose share is 83-85%, it contains water, dimethyl ether and higher alcohols, in particular isobutanol. At the third stage, raw methanol is purified using the method of double sequential rectification to obtain a highly purified product with a methanol content of 99.95%. Purification of raw methanol in two successive distillation columns leads to an increase in the cost of methanol. As a rule, the price of purified methanol is 2-3 times higher than the price at which raw methanol is sold. For this reason, obtaining a protein-producing microorganism strain capable of growing on a nutrient medium in which raw methanol is used instead of purified methanol is an effective way to reduce the cost of protein production from methanol.

Перспективным направлением получения белка на среде с метанолом является использование метилотрофных дрожжей, в частности, вида Ogataea polymorpha (старое название Hansenula polymorpha). Метилотрофные дрожжи имеют ряд преимуществ по сравнению с метилотрофными бактериями. Они растут при более низких значениях рН среды, чем метилотрофные бактерии, что позволяет их культивировать в нестерильных условиях. Клетки дрожжей содержат сбалансированный набор аминокислот и витаминов группы В. Содержание незаменимых аминокислот в клетке дрожжей значительно выше, чем в клетке бактерий. По этой причине использование метилотрофных дрожжей для производства белка является более предпочтительным.A promising direction for obtaining protein in a medium with methanol is the use of methylotrophic yeast, in particular, the species Ogataea polymorpha (old name Hansenula polymorpha). Methylotrophic yeasts have a number of advantages over methylotrophic bacteria. They grow at lower pH values than methylotrophic bacteria, which allows them to be cultivated under non-sterile conditions. Yeast cells contain a balanced set of amino acids and B vitamins. The content of essential amino acids in a yeast cell is much higher than in a bacterial cell. For this reason, the use of methylotrophic yeast for protein production is preferred.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является патент Китая CN 105861343 А, который защищает штамм метилотрофных дрожжей Hansenula Polymorpha ССТСС NO:M 2016173, используемый для получения белка на питательной среде с метанолом. Недостатком этого штамма является его культивирование на дорогой питательной среде, в которой используются два источника углерода и энергии - химически чистый глицерин и чистый метанол.The closest in technical essence and achieved result is the Chinese patent CN 105861343 A, which protects the strain of methylotrophic yeast Hansenula Polymorpha ССТСС NO:M 2016173, used to obtain protein on a nutrient medium with methanol. The disadvantage of this strain is its cultivation on an expensive nutrient medium, which uses two sources of carbon and energy - chemically pure glycerol and pure methanol.

Авторами заявляемого изобретения была поставлена задача получения штамма метилотрофных дрожжей, предназначенного для экономически эффективного промышленного производства белка.The authors of the claimed invention set the task of obtaining a strain of methylotrophic yeast intended for cost-effective industrial production of protein.

Поставленная задача была решена получением нового штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР. Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН с регистрационным номером ВКМ Y-3389D.The problem was solved by obtaining a new strain of methylotrophic yeast Ogataea polymorpha 16AP. The specified strain was deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms of the IBFM named after. G.K. Scriabin RAS with registration number VKM Y-3389D.

Полученный штамм метилотрофных дрожжей обладает следующими технологическими особенностями:The resulting strain of methylotrophic yeast has the following technological features:

- повышенной устойчивостью к таким загрязнениям, содержащимся в метаноле-сырце, как диметиловый эфир и высшие спирты (в частности, изобутанол);- increased resistance to such contaminants contained in raw methanol, such as dimethyl ether and higher alcohols (in particular, isobutanol);

- повышенной устойчивостью к значительным колебаниям рН питательной среды, и температуры в процессе культивирования;- increased resistance to significant fluctuations in the pH of the nutrient medium and temperature during the cultivation process;

- высокой скоростью роста при низких значениях рН (4,0-5,0) питательной среды, что делает возможным вести процесс промышленного производства белка в нестерильных условиях с относительно низкими удельными затратами энергии;- high growth rate at low pH values (4.0-5.0) of the nutrient medium, which makes it possible to carry out the process of industrial protein production in non-sterile conditions with relatively low specific energy costs;

- способностью активно расти на питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии;- the ability to actively grow on a nutrient medium with raw methanol as the only source of carbon and energy;

- способностью активно расти на питательной среде с минимальным содержанием витаминов.- the ability to actively grow on a nutrient medium with a minimum content of vitamins.

Новый штамм метилотрофных дрожжей был получен селекцией из культуры дрожжей, выделенной в природе из коры дерева.A new strain of methylotrophic yeast was obtained by selection from a yeast culture isolated in nature from tree bark.

Селекция проводилась по способности штамма расти с наивысшей удельной скоростью роста на обедненной витаминами питательной среде с метанолом-сырцом в присутствии таких загрязнений, как диметиловый эфир и изобутанол. Другим критерием отбора являлась максимальная удельная скорость роста штамма дрожжей на питательной среде со значением рН в диапазоне 4,0-5,0 для обеспечения возможности ведения процесса культивирования в нестерильных условиях. Наконец, отбирали штамм, наиболее устойчивый к резким колебаниям рН в диапазоне 4,0-9,0, температуры - от 30°С до 46°С. В качестве единственного источника углерода и энергии в питательной среде для культивирования штамма метилотрофных дрожжей использовался метанол-сырец следующего состава:Selection was carried out based on the ability of the strain to grow with the highest specific growth rate on a vitamin-depleted nutrient medium with raw methanol in the presence of contaminants such as dimethyl ether and isobutanol. Another selection criterion was the maximum specific growth rate of the yeast strain on a nutrient medium with a pH value in the range of 4.0-5.0 to ensure the possibility of carrying out the cultivation process under non-sterile conditions. Finally, the strain most resistant to sharp fluctuations in pH in the range of 4.0-9.0 and temperatures from 30°C to 46°C was selected. Raw methanol of the following composition was used as the only source of carbon and energy in the nutrient medium for cultivating the methylotrophic yeast strain:

- метанол 83,1-85,0%;- methanol 83.1-85.0%;

- вода 14,7-15,2%;- water 14.7-15.2%;

- диметиловый эфир - 0,1-1,6%;- dimethyl ether - 0.1-1.6%;

- изобутанол - 0,1 -0,3%.- isobutanol - 0.1 -0.3%.

Генетические модификации с полученным штаммом дрожжей не проводились.No genetic modifications were performed with the resulting yeast strain.

В результате проведенной селекции был получен новый штамм метилотрофных дрожжей, отвечающий всем вышеприведенным критериям отбора.As a result of the selection, a new strain of methylotrophic yeast was obtained that meets all the above selection criteria.

Для идентификации отобранного штамма метилотрофных дрожжей было проведено исследование его филогенетического статуса. Исследование проводили с выделения ДНК с помощью набора "ZymoResearch Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™" (Irvine, США), согласно рекомендациям фирмы производителя.To identify the selected strain of methylotrophic yeast, a study of its phylogenetic status was carried out. The study was carried out with DNA extraction using the "ZymoResearch Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™" kit (Irvine, USA), according to the manufacturer's recommendations.

LSU rDNA D1/D2 регион амплифицировали с использованием праймеров NL1 (5'GCA TAT САА ТАА GCG GAG GAA AAG) и NL4 (5'GGT CCG TGT ТТС AAG ACG G), а также ITS1-5.8S-ITS2 регион амплифицировали с праймерами ITS4 (5ТСС ТСС GCT TAT TGA TAT GC) and ITS5 (5'GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) [5] на термоциклере MJ mini (BioRad, США). Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле, выделяли и очищали из легкоплавкой агарозы с использованием Haбopa "ZymoResearch Fungal/Bacterial MiniPrep™" (Irvine, США)The LSU rDNA D1/D2 region was amplified using primers NL1 (5'GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG) and NL4 (5'GGT CCG TGT TTC AAG ACG G), and the ITS1-5.8S-ITS2 region was amplified with primers ITS4 (5ТСС ТСС GCT TAT TGA TAT GC) and ITS5 (5'GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) [5] on an MJ mini thermal cycler (BioRad, USA). The reaction products were separated by electrophoresis in a 1% agarose gel, isolated and purified from low-melting agarose using the ZymoResearch Fungal/Bacterial MiniPrep™ kit (Irvine, USA)

Секвенирование ДНК выполняли на автоматическом сиквенаторе "ABI PRISM" (США) с помощью набора реактивов "ABI PRISM ®RigDyeTM Terminator v.3.1".DNA sequencing was performed on an automatic sequencer "ABI PRISM" (USA) using a set of reagents "ABI PRISM ® RigDyeTM Terminator v.3.1".

Предварительный филогенетический скрининг сходства последовательностей генов проводили по базе данных GeneBank [NCBI] с помощью пакета программ BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov). Кроме того, использовали специальные ресурсы: MycoBank www.mycobank.org и YeastIP http://genome.jouy.inra.fr/yeastip/authentification.php.Preliminary phylogenetic screening of gene sequence similarities was carried out against the GeneBank [NCBI] database using the BLAST software package (http://ncbi.nlm.nih.gov). In addition, we used special resources: MycoBank www.mycobank.org and YeastIP http://genome.jouy.inra.fr/yeastip/authentification.php.

Для более точного определения филогенетического положения отобранного штамма метилотрофных дрожжей нуклеотидные последовательности генов выравнивали с последовательностями референтных штаммов ближайших прокариот с помощью программы CLUSTAL W [6]. Нуклеотидные последовательности также анализировали, используя программу Vector NTI (версия 9.1) ("Invitrogen", США). Филогенетический анализ выполнен при помощи программы MEGA 5 [7]. Филогенетические деревья (филограммы) строили методом правдоподобия ("maximum likelihood"). Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью "bootstrap-анализа" 1000 альтернативных филограмм.To more accurately determine the phylogenetic position of the selected methylotrophic yeast strain, the nucleotide sequences of the genes were aligned with the sequences of reference strains of nearby prokaryotes using the CLUSTAL W program [6]. Nucleotide sequences were also analyzed using the Vector NTI program (version 9.1) (Invitrogen, USA). Phylogenetic analysis was performed using the MEGA 5 program [7]. Phylogenetic trees (phylograms) were constructed using the “maximum likelihood” method. The statistical significance of branching was assessed using “bootstrap analysis” of 1000 alternative phylograms.

В результате проведенного исследования методом полифазной таксономии, включая секвенирование нуклеотидных последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 домена 26S (LSU) рДНК, полученная культура метилотрофных дрожжей была идентифицирована как новый штамм известного вида - Ogataea polymorpha 16АР. Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН с регистрационным номером ВКМ Y-3389D.As a result of the study using the polyphase taxonomy method, including sequencing of the nucleotide sequences of the ITS1-5.8S-ITS2 region and the D1/D2 domain of the 26S (LSU) rDNA, the resulting culture of methylotrophic yeast was identified as a new strain of a known species - Ogataea polymorpha 16AP. The specified strain was deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms of the IBFM named after. G.K. Scriabin RAS with registration number VKM Y-3389D.

Полученный штамм обладает следующими характерными признаками:The resulting strain has the following characteristic features:

Культурально-морфологические:Cultural-morphological:

На сусло-агаре колонии дрожжей - молочные, на ГКА (глюкозо-картофельном агаре) - белые, на агаризованной среде с 0.5% метанола-сырца - белые. Края колоний ровные, поверхность выпуклая, гладкая. При микроскопическом исследовании клетки дрожжей неподвижные, шаровидные/эллипсовидные, одиночные или в парах.On wort agar, yeast colonies are milky, on GCA (glucose-potato agar) they are white, on an agar medium with 0.5% raw methanol they are white. The edges of the colonies are smooth, the surface is convex and smooth. On microscopic examination, yeast cells are immobile, spherical/ellipsoid, single or in pairs.

Физиолого-биохимические:Physiological-biochemical:

Термотолерантные дрожжи, способны расти на сусло-агаре при температуре до 46°С, оптимально при 30-40°С. Способны расти при рН 4,0-5,0. Используют широкий спектр полиуглеродных субстратов в качестве единственного источника углерода и энергии (метанол, метанол-сырец, глюкозу, арабинозу, сахарозу, рибозу, мальтозу, раффинозу, глицерин, трегалозу, цитрат), а также в качестве источника азота - аммиак, аммонийные соли, нитраты и метиламин.Thermotolerant yeast, capable of growing on wort agar at temperatures up to 46°C, optimally at 30-40°C. Capable of growing at pH 4.0-5.0. They use a wide range of polycarbon substrates as the only source of carbon and energy (methanol, raw methanol, glucose, arabinose, sucrose, ribose, maltose, raffinose, glycerol, trehalose, citrate), and also as a source of nitrogen - ammonia, ammonium salts, nitrates and methylamine.

Хемотаксономические:Chemotaxonomic:

Основной убихинон Q-7.Basic ubiquinone Q-7.

Данные молекулярно-генетического анализа:Molecular genetic analysis data:

Рекомендуемые среда и условия культивирования: Recommended media and cultivation conditions:

Сусло-агар: Сусло пивное неохмеленное 7 баллингов 1000 мл, агар-агар 18-20 г, рН до стерилизации 7.5.Wort-agar: Unhopped beer wort 7 points 1000 ml, agar-agar 18-20 g, pH before sterilization 7.5.

Жидкая минеральная среда следующего состава:Liquid mineral medium of the following composition:

KH₂PO₄ - 2.0 г/лKH ₂ PO ₄ - 2.0 g/l

MgSO₄*7H₂O - 0.5 г/лMgSO ₄ *7H ₂ O - 0.5 g/l

NH₄Cl - 2.0 г/лNH ₄ Cl - 2.0 g/l

метанол-сырец - 5 г/лraw methanol - 5 g/l

витамины:vitamins:

тиамин - 500 мкг/л;thiamine - 500 µg/l;

биотин - 30 мкг/л;biotin - 30 µg/l;

DL-лейцина 40 мкг/лDL-leucine 40 µg/l

микроэлементы следующего состава (мг/л):microelements of the following composition (mg/l):

CaCl₂ - 370 мг/л,CaCl ₂ - 370 mg/l,

ZnSO₄ *6H₂O - 180 мг/л,ZnSO ₄ *6H ₂ O - 180 mg/l,

CuSO₄*3H₂O - 210 мг/л,CuSO ₄ *3H ₂ O - 210 mg/l,

MnSO₄*H₂O - 110, мг/л,MnSO ₄ *H ₂ O - 110, mg/l,

CoCl₂*6Н₂О - 180 мг/л,CoCl ₂ *6H ₂ O - 180 mg/l,

FeSO₄ *7H₂O - 250 мг/л.FeSO ₄ *7H ₂ O - 250 mg/l.

Значение рН питательной среды - в диапазоне 4.0-5.0.The pH value of the nutrient medium is in the range of 4.0-5.0.

Температура культивирования 30-40°С.Cultivation temperature 30-40°C.

Рекомендуемые метод / условия сохранения:Recommended storage method/conditions:

Пересевы на среде сусло-агар через 3-4 месяца; криоконсервация в 10% ДМСО, 50% глицерине; лиофилизация (защитная среда: обезжиренное молоко).Re-seeding on wort-agar medium after 3-4 months; cryopreservation in 10% DMSO, 50% glycerol; lyophilization (protective medium: skim milk).

Штамм не патогенен для человека, животных и растений в соответствии с Приложением 1 «Классификация микроорганизмов-возбудителей инфекционных заболеваний...» к санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами», в ред. дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011 N 86. Его безопасность подтверждена также в публикации зарубежных авторов: Holzchy DL, Chandler FW, Ajello L, Ahearn DG (1979) Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity, Medical Micology 17:71-78.The strain is not pathogenic for humans, animals and plants in accordance with Appendix 1 “Classification of microorganisms that cause infectious diseases...” to the sanitary and epidemiological rules SP 1.3.2322-08 “Safety of working with microorganisms”, as amended. additions and changes No. 2, approved. Resolution of the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation dated June 29, 2011 N 86. Its safety is also confirmed in the publication of foreign authors: Holzchy DL, Chandler FW, Ajello L, Ahearn DG (1979) Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity, Medical Micology 17:71-78 .

Полученный штамм обладает следующими признаками, делающими его пригодным для промышленного применения:The resulting strain has the following characteristics that make it suitable for industrial use:

- штамм активно растет на минеральной питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии;- the strain actively grows on a mineral nutrient medium with raw methanol as the only source of carbon and energy;

- штамм является термотолерантным (выдерживает температуру до 46°С, оптимальная температура для роста 36-40°С);- the strain is thermotolerant (withstands temperatures up to 46°C, optimal temperature for growth is 36-40°C);

- штамм является ацидофильным (активно растет при рН 4,0-5,0);- the strain is acidophilic (grows actively at pH 4.0-5.0);

- штамм активно растет при рН 4,0 на дешевой питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии, что позволяет его успешно культивировать в промышленном масштабе в нестерильных условиях.- the strain grows actively at pH 4.0 on a cheap nutrient medium with raw methanol as the only source of carbon and energy, which allows it to be successfully cultivated on an industrial scale under non-sterile conditions.

Пример 1. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на указанной выше жидкой минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 4.0 и температуре 36°С, с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ = 0,11 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанола-сырца составил 27%. Содержание белка в биомассе штамма составило 48%.Example 1. Cultivation of the methylotrophic yeast strain Ogataea polymorpha 16AP (hereinafter referred to as the strain) was carried out in a controlled cultivation apparatus ANKUM-2M (working volume 6 l) in the above liquid mineral medium with raw methanol at pH 4.0 and temperature 36°C, with measurements optical density of the culture every 6 hours to determine the specific growth rate. Optical density was recalculated to the mass of dry cells using previously constructed calibration curves. The maximum specific growth rate of the culture μ = 0.11 h ^-1 indicates favorable conditions for cultivating the resulting strain. The economic yield of the raw methanol substrate used was 27%. The protein content in the biomass of the strain was 48%.

Пример 2. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на такой же, что и в примере 1 минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 4.5 и температуре 40°С, с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ = 0,13 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанола-сырца составил 36%. Содержание белка в биомассе штамма составило 50%.Example 2. Cultivation of the methylotrophic yeast strain Ogataea polymorpha 16AP (hereinafter referred to as the strain) was carried out in a controlled cultivation apparatus ANKUM-2M (working volume 6 l) in the same mineral medium as in example 1 with raw methanol at pH 4.5 and temperature 40 °C, with measurement of the optical density of the culture every 6 hours to determine the specific growth rate. Optical density was recalculated to the mass of dry cells using previously constructed calibration curves. The maximum specific growth rate of the culture μ = 0.13 h ^-1 indicates favorable conditions for cultivating the resulting strain. The economic yield of the raw methanol substrate used was 36%. The protein content in the biomass of the strain was 50%.

Пример 3. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на такой же, что и в примере 1 минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 5,0 и температуре 37°С, с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ = 0,15 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанола-сырца составил 39%. Содержание белка в биомассе штамма составило 54%.Example 3. Cultivation of the methylotrophic yeast strain Ogataea polymorpha 16AP (hereinafter referred to as the strain) was carried out in a controlled cultivation apparatus ANKUM-2M (working volume 6 l) in the same mineral medium as in example 1 with raw methanol at pH 5.0 and temperature 37°C, with measurement of the optical density of the culture every 6 hours to determine the specific growth rate. Optical density was recalculated to the mass of dry cells using previously constructed calibration curves. The maximum specific growth rate of the culture μ = 0.15 h ^-1 indicates favorable conditions for cultivating the resulting strain. The economic yield of the raw methanol substrate used was 39%. The protein content in the biomass of the strain was 54%.

Как видно из вышеприведенного описания, в результате проведенной селекции был получен новый штамм метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР, который может быть использован для экономически эффективного промышленного производства белка.As can be seen from the above description, as a result of the selection, a new strain of methylotrophic yeast Ogataea polymorpha 16AP was obtained, which can be used for cost-effective industrial production of protein.

Источники информации:Information sources:

1. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами», в ред. дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011 N86.1. Sanitary and epidemiological rules SP 1.3.2322-08 “Safety of working with microorganisms”, as amended. additions and changes No. 2, approved. Resolution of the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation dated June 29, 2011 N86.

2. Holzchy DL, Chandler FW, Ajello L, Ahearn DG (1979) Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity, Medical Micology 17:71-78.2. Holzchy DL, Chandler FW, Ajello L, Ahearn DG (1979) Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity, Medical Micology 17:71-78.

3. ТУ 20.14.22-046-00203803-2021 «Метанол-сырец. Технические условия».3. TU 20.14.22-046-00203803-2021 “Crude methanol. Technical conditions".

GCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGAAGAAAGCTATCTTGGAGGTGGCCTTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTGTGATGAGGTGTCCATTTCCGTGTAAGATGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTTGATCAGACTTGGTATTTAGCTATCATCGCTCCTTGTGGGTGGTGCTCTAGCTTTTTACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAAGATAATGACAGTTGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCTTCTGTTGATGTTGCCTACCGAGACTGAGGTCTGCGGCTTTTGCCTAGGATGCTGGCGTAATGATCCAATACCGCCCGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGAAGAAAGCTATCTTGGAGGTGGCCTTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTGTGATGAGGTGTCCATTTCCGTGTAAGATGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCA GCTCAAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTTTGATCAGACTTGGTATTTAGCTATCATCGCTCCTTGTGGGTGGTGCTCTAGCTTTTTACTGGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAAGATAATGACAGTTGAAT GTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCTTCTGTTGATGTTGCCTACCGAGACTGAGGTCTGCGGCTTTTGCCTAGGATGCTGGCGTAATGATCCAATACCGCCC

Claims (1)

Штамм метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР ВКМ Y-3389D для получения белка.Methylotrophic yeast strain Ogataea polymorpha 16AP VKM Y-3389D for protein production.