RU2805552C2 - Polyvalent vaccine against influenza based on nanoparticles - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology; virology and medicine.

SUBSTANCE: proposed polyvalent immunogenic composition against influenza. The composition contains (a) a nanoparticle with a detergent core, wherein the nanoparticle with a detergent core contains a recombinant influenza hemagglutinin (HA) glycoprotein from a type B strain of influenza virus; (b) a nanoparticle based on a saponin matrix with hemagglutinin (HaSMaN), wherein HaSMaN contains a recombinant influenza HA glycoprotein from an influenza type A strain and an adjuvant ISCOM Matrix; and (c) a pharmaceutically acceptable buffer. A method of stimulating an immune response against influenza is proposed, including the introduction of a polyvalent anti-influenza composition, as well as a pre-filled syringe containing the composition, and a container containing the composition obtained by blowing/filling/sealing.

EFFECT: invention makes it possible to obtain an effective polyvalent immunogenic composition against influenza.

24 cl, 14 tbl, 37 dwg, 10 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[001] Данная заявка испрашивает приоритет в соответствии с 35 USC. §119 (e) по предварительной заявке на патент США № 62/644 623, поданной 19 марта 2018 г.; и предварительной заявке на патент США № 62/787980, поданной 3 января 2019 г., содержание каждой из которых полностью включено в данный документ посредством ссылки для всех целей. [001] This application claims priority under 35 USC. §119(e) under US Provisional Patent Application No. 62/644,623, filed March 19, 2018; and U.S. Provisional Patent Application No. 62/787980, filed January 3, 2019, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

[002] Заявка также включает в себя посредством ссылки содержание заявки США № 15/257436, поданной 6 сентября 2016 г.; и заявки США № 15/819962, поданной 21 ноября 2017 г., во всей их полноте для всех целей. [002] The application also incorporates by reference the contents of US application No. 15/257436, filed September 6, 2016; and US Application No. 15/819962, filed November 21, 2017, in its entirety for all purposes.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD

[003] Данное описание в целом относится к композициям вакцин против гриппа, применимым для стимуляции иммунных ответов против гриппа. [003] This disclosure generally relates to influenza vaccine compositions useful for stimulating immune responses against influenza.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[004] Существенное глобальное бремя сезонного гриппа детально задокументировано. Только в США ежегодно от 140000 до 10000 госпитализаций и от 12000 до 56000 смертей связаны с гриппом ежегодно, причем на пожилых людей приходится непропорционально 62% госпитализаций и 72% смертности. Вакцинация против сезонного гриппа является основой усилий по профилактике и повсеместно рекомендована в США с 2010 года. [004] The significant global burden of seasonal influenza has been well documented. In the US alone, 140,000 to 10,000 hospitalizations and 12,000 to 56,000 deaths are associated with influenza each year, with older adults disproportionately accounting for 62% of hospitalizations and 72% of deaths. Seasonal influenza vaccination is the mainstay of prevention efforts and has been widely recommended in the United States since 2010.

[005] Однако последние события, включая сезон тяжелого гриппа A (H3N2), преобладающий в США в 2017-2018 годах, свидетельствуют о низкой эффективности вакцин по меньшей мере в Австралии, Канаде и США. Другие проблемы, такие как антигенное несоответствие, связанное с вакцинами против гриппа на основе яиц, и постоянная проблема антигенного дрейфа, также представляют собой необходимость разработки более эффективных стратегий вакцинации. [005] However, recent events, including the severe influenza A (H3N2) season prevalent in the United States in 2017-2018, indicate low vaccine effectiveness in at least Australia, Canada and the United States. Other issues, such as antigenic mismatch associated with egg-based influenza vaccines and the persistent problem of antigenic drift, also represent a need to develop more effective vaccination strategies.

[006] Следовательно, сохраняется интерес к производству вакцин против вирусов гриппа, и сохраняется постоянная потребность в производстве эффективных вакцин, особенно с использованием подходов без применения рекомбинантных яичных белков. [006] Consequently, there remains interest in the production of vaccines against influenza viruses, and there remains an ongoing need to produce effective vaccines, especially using non-recombinant egg white approaches.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[007] В данном описании предложены поливалентные композиции против гриппа. Композиции стимулируют иммунные ответы против множества штаммов гриппа. Преимущественно иммунные ответы могут включать нейтрализующие антитела в широком смысле, направленные против вариантов штаммов, отличных от тех, которые используются для получения композиций. Мутации гриппа приводят к «дрейфующим штаммам», а описанные композиции обеспечивают защиту от «дрейфующих штаммов». Кроме того, композиции демонстрируют превосходную стабильность и могут храниться в течение продолжительных периодов времени и могут быть изготовлены в предварительно заполненных шприцах, готовых к введению. В некоторых аспектах предварительно заполненный шприц (ПЗШ) может уже содержать адъювант и антиген гриппа, и может храниться в течение продолжительных периодов. Композиции, описанные в данном документе, не нуждаются в охлаждении (2-8^oC), демонстрируя хорошую стабильность при более высоких температурах (например, при комнатной температуре, около 25^oC). Таким образом, описанные в данном документе композиции обеспечивают превосходное удобство, а также превосходные иммунные ответы. [007] Provided herein are multivalent anti-influenza compositions. The compositions stimulate immune responses against multiple strains of influenza. Advantageously, immune responses may include broadly neutralizing antibodies directed against variant strains other than those used to prepare the compositions. Influenza mutations lead to "drift strains", and the described compositions provide protection against "drift strains". In addition, the compositions exhibit excellent stability and can be stored for extended periods of time and can be prepared in pre-filled syringes ready for administration. In some aspects, the prefilled syringe (PFS) may already contain adjuvant and influenza antigen, and may be stored for extended periods. The compositions described herein do not require refrigeration (2-8 ^° C), demonstrating good stability at higher temperatures (eg, at room temperature, about 25 ^° C). Thus, the compositions described herein provide excellent convenience as well as excellent immune responses.

[008] В конкретных аспектах наночастицы, содержащие антигены гриппа, вводят в состав композиций вакцин путем смешивания с адъювантом Матрица ИСКОМ (иммуностимулирующего комплекса) (также называемым в данном документе «Матрица») в течение некоторого времени с образованием HaSMaN (наночастицы на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином) перед введением субъекту. Композиции, содержащие HaSMaN, демонстрируют хорошую стабильность и иммуногенность и, таким образом, хорошо подходят для упаковки, например, в предварительно заполненных шприцах. Действительно, HaSMaN более стабильны, чем наночастицы с детергентным ядром. Термическая стабильность, измеренная с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, была лучше примерно на 1 градус для HaSMaN по сравнению с наночастицами с детергентным ядром. Ранее подходы к применению адъюванта Матрица ИСКОМ включали комбинирование композиции вакцины с адъювантом у постели больного непосредственно перед введением. В конкретных аспектах описанные в данном документе композиции исключают это требование, обеспечивая тем самым улучшенные способы индукции иммунных ответов. Неожиданно было обнаружено, что формирование HaSMaN варьируется в зависимости от типа гриппа. HaSMaN, как правило, образуются, когда композиции содержат белки гемагглютинина (HA) из штаммов гриппа типа A, но не образуются, когда белки HA получены из штаммов гриппа типа B. [008] In specific aspects, nanoparticles containing influenza antigens are formulated into vaccine formulations by mixing with ISCOM Matrix (immune stimulating complex) adjuvant (also referred to herein as "Matrix") over a period of time to form HaSMaN (saponin matrix nanoparticles). with hemagglutinin) before administration to the subject. Compositions containing HaSMaN show good stability and immunogenicity and are thus well suited for packaging, for example, in pre-filled syringes. Indeed, HaSMaNs are more stable than nanoparticles with a detergent core. Thermal stability measured by differential scanning calorimetry was improved by approximately 1 degree for HaSMaN compared to detergent core nanoparticles. Previous approaches to the use of the ISCOM Matrix adjuvant involved combining the vaccine formulation with the adjuvant at the bedside immediately prior to administration. In certain aspects, the compositions described herein eliminate this requirement, thereby providing improved methods for inducing immune responses. Surprisingly, HaSMaN formation was found to vary depending on the type of influenza. HaSMaNs typically form when compositions contain hemagglutinin (HA) proteins from influenza type A strains, but do not form when HA proteins are derived from influenza type B strains.

[009] В некоторых вариантах осуществления адъювант Матрица ИСКОМ в поливалентной композиции против гриппа представляет собой Матрицу M, комбинацию двух типов Матриц, первого типа, Матрицы A, содержащей сапониновую фракцию A (также называемую в данном документе как Матрица с фракцией A), и второго типа, Матрицы C, содержащей сапониновую фракцию C (также называемую в данном документе как Матрица с фракцией C). В некоторых аспектах Матрица M может содержать по меньшей мере около 85% (мас./мас.) Матрицы с фракцией A, а остальная часть представляет собой Матрицу с фракцией C. Если не указано иное, Матрица M, используемая в данном документе, содержит Матрицу с фракцией A и Матрицу с фракцией C в соотношении 85:15 (мас./мас.), также называемую в данном документе как Матрица M1. [009] In some embodiments, the ISCOM Matrix adjuvant in the multivalent influenza composition is Matrix M, a combination of two types of Matrix, the first type, Matrix A, containing saponin fraction A (also referred to herein as Matrix with Fraction A), and the second type, Matrix C containing saponin fraction C (also referred to herein as Matrix with fraction C). In some aspects, Matrix M may comprise at least about 85% (w/w) of Fraction A Matrix, with the remainder being Fraction C Matrix. Unless otherwise specified, Matrix M as used herein comprises Matrix with Fraction A and Matrix with Fraction C in a ratio of 85:15 (w/w), also referred to herein as Matrix M1.

[010] В некоторых вариантах осуществления каждый белок НА гриппа в поливалентной композиции против гриппа на основе наночастиц может быть получен из другого штамма гриппа. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один штамм может представлять собой штамм подтипа A или штамм подтипа B. В некоторых вариантах осуществления штамм подтипа A может образовывать комплекс с адъювантом Матрица M, но штаммы подтипа B - нет. [010] In some embodiments, each influenza HA protein in the nanoparticle-based multivalent influenza composition may be derived from a different influenza strain. In some embodiments, at least one strain may be a subtype A strain or a subtype B strain. In some embodiments, a subtype A strain can form a complex with the Matrix M adjuvant, but subtype B strains cannot.

[011] Хотя в данном описании предусмотрены поливалентные композиции, особенно для применения в сезонных вакцинах, моновалентные композиции вакцин также могут быть получены с HaSMaN для применения, например, для вакцинации против штаммов пандемического гриппа, которые возникают время от времени. [011] Although multivalent compositions are contemplated herein, particularly for use in seasonal vaccines, monovalent vaccine compositions can also be prepared with HaSMaN for use, for example, for vaccination against pandemic influenza strains that emerge from time to time.

[012] Стабильность, особенно стабильность при комнатной температуре, является ценным свойством, поскольку она снижает или устраняет необходимость в хранении в холодовой цепи, что делает распространение более дешевым и более простым. Преимущественно поливалентные композиции, описанные в данном документе, стабильны в течение продолжительных периодов времени, например, до 3 месяцев, до 6 месяцев, до 12 месяцев, и при комнатной температуре (т.е. около 25°C) в течение этих периодов. Превосходная стабильность, особенно при объединении в процессе получения состава с адъювантом Матрица M, означает, что композиции вакцин подходят для доставки в клинические условия в формате, готовом к введению; например, составы в предварительно заполненных шприцах. [012] Stability, especially stability at room temperature, is a valuable property because it reduces or eliminates the need for cold chain storage, making distribution cheaper and easier. Advantageously, the multivalent compositions described herein are stable for extended periods of time, for example, up to 3 months, up to 6 months, up to 12 months, and at room temperature (ie, about 25°C) during these periods. Excellent stability, especially when combined with the Matrix M adjuvant during formulation, means that vaccine formulations are suitable for delivery into the clinical setting in a ready-to-administer format; for example, formulations in pre-filled syringes.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS

[013] На Фиг. 1 показаны примеры изображений просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) одних наночастиц на основе детергентного ядра и HA гриппа (слева), одной Матрицы M (в центре) и комбинации наночастиц с HA и Матрицей M, которая образует наночастицы на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином (HaSMaN) (справа). [013] In FIG. Figure 1 shows examples of transmission electron microscopy (TEM) images of detergent core and influenza HA nanoparticles alone (left), Matrix M alone (center), and a combination of nanoparticles with HA and Matrix M that forms hemagglutinin saponin matrix nanoparticles (HaSMaN). ) (on right).

[014] На Фиг. 2 показаны изображения восстановленного ДСН-ПААГ геля для антигенов гриппа в высокодозных и низкодозных свежеприготовленных четырехвалентных составах во флаконах (240 мкг/мл/штамм и 60 мкг/мл/штамм); и составах в предварительно заполненных шприцах (ПЗШ) (120 мкг/мл/штамм и 30 мкг/мл/штамм) с или без Матрицы M при 4°C через T = 0, 6 месяцев и 12 месяцев. Сокращения на фигуре: ПЗШ: предварительно заполненные шприцы; M1: Матрица M. [014] In FIG. Figure 2 shows images of a reconstituted SDS-PAGE gel for influenza antigens in high-dose and low-dose freshly prepared tetravalent formulations in vials (240 μg/ml/strain and 60 μg/ml/strain); and prefilled syringe (PFS) formulations (120 μg/mL/strain and 30 μg/mL/strain) with or without Matrix M at 4°C at T = 0, 6 months, and 12 months. Abbreviations in the figure: PZS: pre-filled syringes; M1: Matrix M.

[015] На Фиг. 3 показаны изображения невосстановленного и восстановленного ДСН-ПААГ геля для антигенов гриппа в высокодозных свежеприготовленных составах во флаконах (240 мкг/мл/штамм); и составах ПЗШ (120 мкг/мл/штамм) с или без Матрицы M при 4°C в момент времени = 0. [015] In FIG. Figure 3 shows images of unreduced and reduced SDS-PAGE gels for influenza antigens in high-dose, freshly prepared formulations in vials (240 μg/ml/strain); and PZS formulations (120 μg/ml/strain) with or without Matrix M at 4°C at time = 0.

[016] На Фиг.4 показаны изображения невосстановленного ДСН-ПААГ геля для антигенов гриппа высокодозных и низкодозных свежеприготовленных составов во флаконах (240 мкг/мл/штамм и 60 мкг/мл/штамм); и составах ПЗШ (120 мкг/мл/штамм и 30 мкг/мл/штамм) с или без Матрицы M при 4°C и 25°C через 3 месяца. [016] Figure 4 shows images of unreduced SDS-PAGE gels for influenza antigens of high-dose and low-dose freshly prepared formulations in vials (240 μg/ml/strain and 60 μg/ml/strain); and PZH formulations (120 μg/ml/strain and 30 μg/ml/strain) with or without Matrix M at 4°C and 25°C after 3 months.

[017] На Фиг. 5 показаны результаты реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) штаммов A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane, и B/Phuket для составов ПЗШ с дозой 120 мкг/мл/штамм с или без Матрицы M при 2-8°C через Т = 0, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев. Сокращения на фигуре: MXM: Матрица M; HK: Hong Kong; MI: Michigan; Bris: Brisbane; Phu: Phuket. [017] In FIG. Figure 5 shows the results of a single radial immunodiffusion reaction (SRID) of strains A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane, and B/Phuket for PZH formulations at a dose of 120 μg/ml/strain with or without Matrix M at 2-8°C after T = 0, 2 weeks, 1 month, 3 months, 6 months, 9 months and 12 months. Abbreviations in the figure: MXM: Matrix M; HK: Hong Kong; MI: Michigan; Bris: Brisbane; Phu: Phuket.

[018] На Фиг. 6 показаны результаты ОРИД для штаммов A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane, и B/Phuket для составов ПЗШ с дозой 120 мкг/мл/штамм с или без Матрицы M при 25°C через Т = 0, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца, и 6 месяцев. [018] In FIG. Figure 6 shows the ORID results for strains A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane, and B/Phuket for PZH formulations with a dose of 120 μg/ml/strain with or without Matrix M at 25°C after T = 0.2 weeks , 1 month, 3 months, and 6 months.

[019] На Фиг. 7 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы М, по сравнению с коммерческими вакцинами против гриппа A/Hong Kong/4801/2014. Образование антител представлено в виде титров HAI. Сокращения на фигуре: HAI: ингибирование гемагглютинации; НА: гемагглютинин; Совм. сост.: совместные составы; Quad-NIV: четырехвалентная вакцина против гриппа на основе наночастиц; QIV: четырехвалентная вакцина против гриппа.[019] In FIG. 7 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies in mice administered Quad-NIV co-formulations; or fresh mixture formulations with or without Matrix M, compared with commercial influenza A/Hong Kong/4801/2014 vaccines. Antibody production is presented as HAI titers. Abbreviations in the figure: HAI: hemagglutination inhibition; HA: hemagglutinin; Joint composition: joint compositions; Quad-NIV: quadrivalent nanoparticle influenza vaccine; QIV: quadrivalent influenza vaccine.

[020] На Фиг. 8 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против A/Michigan/45/2015 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы М, по сравнению с коммерческими вакцинами против гриппа. [020] In FIG. 8 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against A/Michigan/45/2015 in mice administered Quad-NIV co-formulations; or fresh mixture formulations with or without Matrix M, compared with commercial influenza vaccines.

[021] На Фиг. 9 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против B/Brisbane/60/2008 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы М, по сравнению с коммерческими вакцинами против гриппа. [021] In FIG. 9 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Brisbane/60/2008 in mice administered Quad-NIV co-formulations; or fresh mixture formulations with or without Matrix M, compared with commercial influenza vaccines.

[022] На Фиг. 10 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против B/Phuket/3073/2013 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы М, по сравнению с коммерческими вакцинами против гриппа. [022] In FIG. 10 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Phuket/3073/2013 in mice administered Quad-NIV co-formulations; or fresh mixture formulations with or without Matrix M, compared with commercial influenza vaccines.

[023] На Фиг. 11 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител у мышей, которым вводили составы предварительно приготовленных смесей Quad-NIV или свежеприготовленных смесей с Матрицей M против A/Hong Kong/4801/2014, A/Michigan/45/2015, B/Brisbane/60/2008, и B/Phuket/3073/2013. Составы ПЗШ хранили при 4°C в течение 3 месяцев. В случае свежеприготовленных вакцин вирусный антиген хранился при -60°C в течение 3 месяцев и смешивался с адъювантом Матрица M непосредственно перед введением. Ответ антител был представлен в виде СГТ титров HAI. Для результатов СГТ использовали 95% нижний контрольный предел и 95% верхний контрольный предел. Сокращения на фигуре: HAI: ингибирование гемагглютинации; НА: гемагглютинин; СГТ: среднее геометрическое титра; НКП: нижний контрольный предел; ВКП: верхний контрольный предел. [023] In FIG. 11 shows the formation of hemagglutination-inhibiting antibodies in mice that were administered pre-mixed Quad-NIV or freshly prepared mixtures with Matrix M against A/Hong Kong/4801/2014, A/Michigan/45/2015, B/Brisbane/60/2008, and B/Phuket/3073/2013. PZS formulations were stored at 4°C for 3 months. For freshly prepared vaccines, the viral antigen was stored at -60°C for 3 months and mixed with Matrix M adjuvant immediately before administration. Antibody responses were reported as GCT HAI titers. A 95% lower reference limit and a 95% upper reference limit were used for GST results. Abbreviations in the figure: HAI: hemagglutination inhibition; HA: hemagglutinin; GMT: geometric mean titer; LCL: lower control limit; UCL: upper control limit.

[024] На Фиг. 12 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Michigan у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.[024] In FIG. 12 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against A/Michigan strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 21st day. The preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at the indicated temperatures for 6 months.

[025] На Фиг. 13 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Michigan у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.[025] In FIG. 13 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against A/Michigan strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 35th day. The preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at the indicated temperatures for 6 months.

[026] На Фиг. 14 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Hong Kong/4801/2014 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.[026] In FIG. 14 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against strains A/Hong Kong/4801/2014 in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 21st day. The preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at the indicated temperatures for 6 months.

[027] На Фиг. 15 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Hong Kong у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.[027] In FIG. 15 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against A/Hong Kong strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 35th day. The preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at the indicated temperatures for 6 months.

[028] На Фиг. 16 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Brisbane у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.[028] In FIG. 16 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Brisbane strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 21st day. The preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at the indicated temperatures for 6 months.

[029] На Фиг. 17 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Brisbane у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Образование антител представляли в виде титров HAI. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.[029] In FIG. 17 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Brisbane strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 35th day. Antibody production was reported as HAI titers. The preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at the indicated temperatures for 6 months.

[030] На Фиг. 18 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Phuket у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.[030] In FIG. 18 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Phuket strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 21st day. The preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at the indicated temperatures for 6 months.

[031] На Фиг. 19 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Phuket у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Образование антител представляли в виде титров HAI. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев. [031] In FIG. 19 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Phuket strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 35th day. Antibody production was reported as HAI titers. The preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at the indicated temperatures for 6 months.

[032] На Фиг. 20 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Hong Kong/4801/2014 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.[032] In FIG. 20 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against strains A/Hong Kong/4801/2014 in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 21st day. Preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at 4°C for 12 months.

[033] На Фиг. 21 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Hong Kong у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.[033] In FIG. 21 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against A/Hong Kong strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 35th day. Preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at 4°C for 12 months.

[034] На Фиг. 22 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Michigan у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.[034] In FIG. 22 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against A/Michigan strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 21st day. Preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at 4°C for 12 months.

[035] На Фиг. 23 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Michigan у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.[035] In FIG. 23 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against A/Michigan strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 35th day. Preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at 4°C for 12 months.

[036] На Фиг. 24 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Brisbane у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.[036] In FIG. 24 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Brisbane strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 21st day. Preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at 4°C for 12 months.

[037] На Фиг. 25 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Brisbane у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Образование антител представляли в виде титров HAI. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.[037] In FIG. 25 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Brisbane strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 35th day. Antibody production was reported as HAI titers. Preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at 4°C for 12 months.

[038] На Фиг. 26 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Phuket у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.[038] In FIG. 26 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Phuket strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 21st day. Preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at 4°C for 12 months.

[039] На Фиг. 27 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Phuket у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Образование антител представляли в виде титров HAI. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев. [039] In FIG. 27 shows the formation of hemagglutination inhibitory antibodies against B/Phuket strains in mice administered Quad-NIV co-formulations; or compositions of freshly prepared mixtures with or without Matrix M (100 μg/ml) on the 35th day. Antibody production was reported as HAI titers. Preformulated Quad-NIV co-formulations were stored at 4°C for 12 months.

[040] На Фиг. 28 показаны профили седиментации AUC составов ПЗШ Quad-NIV (120 мкг/мл) через Т = 0, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев или 12 месяцев при 4°C и составов Quad-NIV ПЗШ с 100 мкг/мл Матрицы M1 через T = 3 месяца, 6 месяцев 9 месяцев или 12 месяцев при 4°C. [040] In FIG. 28 shows the AUC sedimentation profiles of Quad-NIV PZS formulations (120 μg/mL) at T = 0, 3 months, 6 months, 9 months, or 12 months at 4°C and Quad-NIV PZS formulations with 100 μg/mL M1 matrices through T = 3 months, 6 months 9 months or 12 months at 4°C.

[041] На Фиг. 29 показаны профили седиментации при аналитическом центрифугировании (AUC) составов Quad-NIV ПЗШ с или без Матрицы M1 (100 мкг/мл) в начале исследования (T0), через 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. Составы инкубировали при 25°C. [041] In FIG. 29 shows analytical centrifugation (AUC) sedimentation profiles of Quad-NIV PZS formulations with or without M1 Matrix (100 μg/mL) at baseline (T0), 1 month, 3 months, and 6 months. The compositions were incubated at 25°C.

[042] На Фиг. 30 показаны ПЭМ-изображения только высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм), только Матрицы M (100 мкг/мл), высокодозной Quad-NIV + Матрица M и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) без инкубации (T = 0). [042] In FIG. 30 shows TEM images of high-dose Quad-NIV only (120 μg/ml/strain), Matrix M only (100 μg/ml), high-dose Quad-NIV + Matrix M, and low-dose Quad-NIV (30 μg/ml/strain) + Matrix M (100 µg/ml) without incubation (T = 0).

[043] На Фиг. 31 показаны ПЭМ-изображения высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C. Все образцы инкубировали 4 часа.[043] In FIG. 31 shows TEM images of high-dose Quad-NIV (120 μg/ml/strain) + Matrix M (100 μg/ml) at 4°C or 25°C and low-dose Quad-NIV (30 μg/ml/strain) + Matrix M (100 µg/ml) at 4°C or 25°C. All samples were incubated for 4 hours.

[044] На Фиг. 32 показаны ПЭМ-изображения высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C. Все образцы инкубировали в течение 24 часов. Иллюстративные HaSMaN обведены кружком. [044] In FIG. 32 shows TEM images of high-dose Quad-NIV (120 μg/ml/strain) + Matrix M (100 μg/ml) at 4°C or 25°C and low-dose Quad-NIV (30 μg/ml/strain) + Matrix M (100 µg/ml) at 4°C or 25°C. All samples were incubated for 24 hours. Illustrative HaSMaNs are circled.

[045] На Фиг. 33 показаны ПЭМ-изображения высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C. Все образцы инкубировали 48 часа. Иллюстративные HaSMaN обведены кружком.[045] In FIG. Figure 33 shows TEM images of high-dose Quad-NIV (120 μg/ml/strain) + Matrix M (100 μg/ml) at 4°C or 25°C and low-dose Quad-NIV (30 μg/ml/strain) + Matrix M (100 µg/ml) at 4°C or 25°C. All samples were incubated for 48 hours. Illustrative HaSMaNs are circled.

[046] На Фиг. 34 показаны ПЭМ-изображения высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C. Все образцы инкубировали в течение 7 суток. Иллюстративные HaSMaN обведены кружком.[046] In FIG. Figure 34 shows TEM images of high-dose Quad-NIV (120 μg/ml/strain) + Matrix M (100 μg/ml) at 4°C or 25°C and low-dose Quad-NIV (30 μg/ml/strain) + Matrix M (100 µg/ml) at 4°C or 25°C. All samples were incubated for 7 days. Illustrative HaSMaNs are circled.

[047] На Фиг. 35 показаны ПЭМ-изображения для групп ПЗШ с низкой дозой (30 мкг/мл/штамм) с или без Матрицы M (100 мкг/мл), инкубированных в течение 1 месяца при различных температурах (2-8°C, 25°C и 37°C). [047] In FIG. Figure 35 shows TEM images of low dose PZH groups (30 µg/ml/strain) with or without Matrix M (100 µg/ml) incubated for 1 month at different temperatures (2-8°C, 25°C and 37°C).

[048] На Фиг. 36 показаны профили ДСК Quad-NIV в составах с дозой 120 мкг/мл/штамм с или без Матрицы M1 (100 мкг/мл). Показаны молярные теплоемкости (Cp: кДж/моль*K) антигенов четырехвалентной вакцины при 4°C, инкубированных в течение 3 месяцев, 6 месяцев и 12 месяцев и при 25°C в течение 3 месяцев и 6 месяцев. [048] In FIG. 36 shows the DSC profiles of Quad-NIV in 120 μg/ml/strain formulations with or without M1 Matrix (100 μg/ml). Shown are the molar heat capacities (Cp: kJ/mol*K) of quadrivalent vaccine antigens at 4°C incubated for 3 months, 6 months and 12 months and at 25°C for 3 months and 6 months.

[049] На Фиг. 37 показано образование HaSMaN, измеренное по уменьшению в nHA (т.е. наночастиц с детергентным ядром) с белками HA из штаммов A, штамма B и штамма A с модифицированным С-концом, слитым с фолдоном. [049] In FIG. 37 shows the formation of HaSMaN as measured by the decrease in nHA (ie, nanoparticles with a detergent core) with HA proteins from strain A, strain B, and strain A with a modified C-terminus fused to a foldon.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

ОпределенияDefinitions

[050] Использование в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения форм единственного числа включает ссылку на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «белок» может относиться к одному белку или к смесям такого белка, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и/или способы, известные специалистам в данной области техники, и так далее. [050] The use of the singular in this specification and in the accompanying claims includes reference to the plural unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, a reference to “protein” may refer to a single protein or to mixtures of such proteins, and a reference to “method” includes reference to equivalent steps and/or methods known to those skilled in the art, and so on.

[051] В контексте данного документа термин «адъювант» относится к соединению, которое при использовании в комбинации с иммуногеном усиливает или иным образом изменяет или модифицирует иммунный ответ, индуцированный против иммуногена. Модификация иммунного ответа может включать усиление или увеличение специфичности антител и/или клеточного иммунного ответа.[051] As used herein, the term “adjuvant” refers to a compound that, when used in combination with an immunogen, enhances or otherwise alters or modifies the immune response induced against the immunogen. Modification of the immune response may include enhancing or increasing the specificity of antibodies and/or cellular immune response.

[052] В контексте данного документа термин «около» или «приблизительно», предшествующие числовому значению, указывают на это значение плюс или минус диапазон в 10%. Например, «около 100» включает 90 и 110.[052] As used herein, the terms “about” or “approximately” preceding a numerical value indicate that value plus or minus a 10% range. For example, "about 100" includes 90 and 110.

[053] В контексте данного документа термины «иммуноген», «антиген» и «эпитоп» относятся к таким веществам, как белки, включая гликопротеины, и пептиды, которые способны вызывать иммунный ответ. [053] As used herein, the terms “immunogen,” “antigen,” and “epitope” refer to substances such as proteins, including glycoproteins, and peptides that are capable of inducing an immune response.

[054] В контексте данного документа термин «иммуногенная композиция» представляет собой композицию, которая содержит антиген, причем введение композиции субъекту приводит к развитию у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на антиген. [054] As used herein, the term “immunogenic composition” is a composition that contains an antigen, wherein administration of the composition to a subject results in the subject developing a humoral and/or cellular immune response to the antigen.

[055] В контексте данного документа термины «Quad-NIV», «QuadNIV» или «четырехвалентная вакцина против гриппа на основе наночастиц» относятся к составам вакцин против гриппа, содержащим антигены из четырех штаммов вируса гриппа. [055] As used herein, the terms “Quad-NIV,” “QuadNIV,” or “quadrivalent nanoparticle influenza vaccine” refer to influenza vaccine formulations containing antigens from four strains of influenza virus.

[056] В контексте данного документа термины «свежеприготовленная смесь», «свежеприготовленные составы», «свежеприготовленные композиции вакцины», «флаконы со свежеприготовленной смесью», «свежеприготовленные составы во флаконах» относятся к составам вакцины, которые готовятся непосредственно перед введением. Такие составы вакцин содержат вирусные антигены и адъюванты, которые хранятся отдельно в разных контейнерах и вводятся субъекту (например, или путем двух последовательных инъекций, или путем объединения антигенов и адъювантов в одну инъекцию перед введением). [056] As used herein, the terms “freshly prepared formula,” “freshly prepared formulations,” “freshly prepared vaccine compositions,” “freshly prepared formula vials,” and “freshly prepared vial formulations” refer to vaccine formulations that are prepared immediately prior to administration. Such vaccine formulations contain viral antigens and adjuvants that are stored separately in separate containers and administered to the subject (eg, either by two sequential injections or by combining the antigens and adjuvants into a single injection prior to administration).

[057] В контексте данного документа термины «смесь для совместного составления», «совместный состав», «композиции вакцин для совместного составления», «предварительно заполненные шприцы», «предварительно приготовленная смесь» относятся к составам вакцин, которые готовят для кратковременного или длительного хранения до момента введения субъекту. Такие композиции вакцин содержат комбинацию антигенов гриппа и адъювант Матрица ИСКОМ в одном и том же контейнере и приготовлены в условиях, достаточных для образования HaSMaN (наночастиц на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином). [057] As used herein, the terms “co-formulation”, “co-formulation”, “co-formulation of vaccines”, “pre-filled syringes”, “pre-formulation” refer to vaccine formulations that are formulated for short-term or long-term use. storage until administration to the subject. Such vaccine compositions contain a combination of influenza antigens and ISCOM Matrix adjuvant in the same container and are formulated under conditions sufficient to form HaSMaN (hemagglutinin saponin matrix nanoparticles).

[058] В контексте данного документа термины «лечить», «лечение» и «процесс лечения» относятся к подходу к получению полезных или желаемых результатов, например, клинических результатов. Для целей данного описания полезные или желаемые результаты могут включать ингибирование или подавление инициации или прогрессирования инфекции или заболевания; облегчение или уменьшение развития симптомов инфекции или заболевания; или их комбинацию. [058] As used herein, the terms “treat,” “treatment,” and “treatment process” refer to an approach to obtaining useful or desired results, such as clinical results. For purposes of this description, beneficial or desired results may include inhibition or suppression of initiation or progression of infection or disease; relief or reduction in the development of symptoms of infection or disease; or a combination thereof.

[059] «Предотвращение» в данном контексте используется взаимозаменяемо с «профилактикой» и может означать полное предотвращение инфекции или заболевания, или предотвращение развития симптомов этой инфекции или заболевания; задержку начала инфекции или заболевания или их симптомов; или снижение тяжести впоследствии развившейся инфекции или заболевания или их симптомов.[059] “Prevention” in this context is used interchangeably with “prevention” and can mean preventing an infection or disease entirely, or preventing the development of symptoms of that infection or disease; delay in onset of infection or disease or symptoms thereof; or reducing the severity of a subsequent infection or disease or its symptoms.

[060] В контексте данного документа «эффективная доза» или «эффективное количество» относится к количеству иммуногена, достаточному для индукции иммунного ответа, который уменьшает по меньшей мере один симптом инфекции, вызванной патогеном. Эффективная доза или эффективное количество могут быть определены, например, при помощи измерения количества нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например, посредством нейтрализации бляшек, фиксации комплемента, иммуноферментного анализа (ИФА), анализа микронейтрализации и титров HAI.[060] As used herein, “effective dose” or “effective amount” refers to an amount of an immunogen sufficient to induce an immune response that reduces at least one symptom of an infection caused by a pathogen. An effective dose or effective amount can be determined, for example, by measuring the amount of neutralizing secretory and/or serum antibodies, for example, by plaque neutralization, complement fixation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), microneutralization assay, and HAI titers.

[061] В контексте данного документа термин «вакцина» относится к иммуногенной композиции, такой как иммуноген, полученный из патогена, который используется для индукции иммунного ответа против патогена, который обеспечивает защитный иммунитет (например, иммунитет, который защищает субъекта от инфекции, вызванной возбудителем, и/или снижает тяжесть заболевания или патологического состояния, вызванного инфицированием патогеном). Защитный иммунный ответ может включать образование антител и/или опосредованный клетками ответ. В зависимости от контекста термин «вакцина» может также относиться к суспензии или раствору иммуногена, которые вводят субъекту для выработки защитного иммунитета.[061] As used herein, the term “vaccine” refers to an immunogenic composition, such as an immunogen derived from a pathogen, that is used to induce an immune response against the pathogen that provides protective immunity (e.g., immunity that protects a subject from infection caused by the pathogen , and/or reduces the severity of the disease or pathological condition caused by infection with the pathogen). The protective immune response may include antibody production and/or a cell-mediated response. Depending on the context, the term "vaccine" may also refer to a suspension or solution of an immunogen that is administered to a subject to produce protective immunity.

[062] В контексте данного документа термин «субъект» включает людей и других животных. Как правило, субъект представляет собой человека. Например, субъектом может быть взрослый, подросток, ребенок (от 2 лет до 14 лет), младенец (от 1 месяца до 24 месяцев) или новорожденный (до 1 месяца). В некоторых аспектах взрослыми являются пожилые люди около 65 лет и старше или около 60 лет и старше. В типичных аспектах возраст взрослых составляет от около 60 до около 75 лет или по меньшей мере около 75 лет. В некоторых аспектах субъект представляет собой беременную женщину или женщину, намеревающуюся забеременеть. В других аспектах субъект не представляет собой человека, например, представляет собой примата, не являющегося человеком; например, павиана, шимпанзе, гориллу или макака. В определенных аспектах субъект может представлять собой домашнее животное, такое как собака или кошка. [062] As used herein, the term “subject” includes humans and other animals. Typically, the subject is a person. For example, the subject may be an adult, an adolescent, a child (2 years to 14 years), an infant (1 month to 24 months), or a newborn (under 1 month). In some aspects, adults are older people around 65 years of age or older or around 60 years of age or older. In typical aspects, the adults are between about 60 and about 75 years old, or at least about 75 years old. In some aspects, the subject is a pregnant woman or a woman intending to become pregnant. In other aspects, the subject is not human, for example, is a non-human primate; for example, a baboon, chimpanzee, gorilla or macaque. In certain aspects, the subject may be a domestic animal such as a dog or cat.

[063] В контексте данного документе термин «фармацевтически приемлемый» обозначает одобренный регуляторным ведомством Федерального правительства или правительства штата США, или другой общепризнанный Фармакопеей США, Европейской фармакопеей или другой общепризнанный фармакопеей для применения у млекопитающих и, в частности, у людей. Эти композиции могут быть использованы в качестве вакцин и/или антигенных композиций для индукции защитного иммунного ответа у позвоночных.[063] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory agency of the Federal or State government of the United States, or other generally accepted by the United States Pharmacopoeia, European Pharmacopoeia or other generally accepted pharmacopoeia for use in mammals and, in particular, in humans. These compositions can be used as vaccines and/or antigen compositions to induce a protective immune response in vertebrates.

Наночастицы: структура и морфологияNanoparticles: structure and morphology

[064] Описанные в данном документе композиции содержат два типа наночастиц. Первый тип, называемый наночастицами с детергентным ядром, в основном соответствует описанному ранее. См. регистрационный номер США 15/257436, который для всех целей включен в данный документ посредством ссылки. Вкратце, эти наночастицы продуцируются в клетках насекомых путем экспрессии белков НА с использованием систем экспрессии бакуловирусов и затем экстракции белков НА с помощью детергента. Во время очистки первый детергент заменяется вторым детергентом, как правило, неионным детергентом, что приводит к образованию наночастиц, имеющих ядро из неионогенного детергента, в которое заключена концевая часть белка НА, в форме тримеров. На Фиг. 1 (левая панель) показаны эти структуры, наблюдаемые при помощи электронного микроскопа. [064] The compositions described herein contain two types of nanoparticles. The first type, called detergent core nanoparticles, is essentially as described previously. See US Registration No. 15/257436, which is incorporated herein by reference for all purposes. Briefly, these nanoparticles are produced in insect cells by expressing HA proteins using baculovirus expression systems and then extracting the HA proteins using detergent. During purification, the first detergent is replaced by a second detergent, typically a nonionic detergent, resulting in the formation of nanoparticles having a nonionic detergent core enclosing the terminal portion of the HA protein in the form of trimers. In FIG. Figure 1 (left panel) shows these structures observed using an electron microscope.

[065] Второй тип наночастиц упоминается в данном документе как HaSMaN (наночастица на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином). На Фиг. 1 (правая панель) показаны эти структуры, наблюдаемые при помощи электронного микроскопа. Гликопротеины HA декорируют структуры, похожие на клетки матрицы. Структуры HaSMaN формируются путем приготовления наночастиц HA и затем их инкубирования с частицами адъюванта Матрица ИСКОМ в течение определенного периода времени. Частицы Матрицы ИСКОМ показаны на центральной панели Фиг.1. Примечательно, что HaSMaN легко образуются с белками HA вируса гриппа типа A, но не с белками HA вируса гриппа типа B. Соответственно, в конкретных аспектах композиции, содержащие наночастицы, содержащие белки HA из вируса типа A и типа B, будут содержать оба типа наночастиц (т.е. наночастицы с детергентным ядром и HaSMaN). В некоторых аспектах наночастицы будут переходить между двумя состояниями, и, таким образом, композиции могут содержать переходные наночастицы. [065] The second type of nanoparticle is referred to herein as HaSMaN (hemagglutinin saponin matrix nanoparticle). In FIG. Figure 1 (right panel) shows these structures observed using an electron microscope. HA glycoproteins decorate matrix cell-like structures. HaSMaN structures are formed by preparing HA nanoparticles and then incubating them with ISCOM Matrix adjuvant particles for a specified period of time. The ISCOM Matrix particles are shown in the central panel of Figure 1. Notably, HaSMaNs are readily formed with the HA proteins of influenza A virus, but not with the HA proteins of influenza B virus. Accordingly, in certain aspects, compositions containing nanoparticles containing HA proteins from a type A and type B virus will contain both types of nanoparticles (i.e. nanoparticles with detergent core and HaSMaN). In some aspects, the nanoparticles will transition between two states, and thus the compositions may contain transition nanoparticles.

[066] В конкретных вариантах осуществления наночастицы с детергентным ядром состоят из множества тримеров белка, окружающих ядро из неионного детергента. Например, каждая наночастица может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 15 тримеров. В некоторых вариантах осуществления каждая наночастица содержит от 2 до 6 тримеров. В конкретных вариантах осуществления каждая наночастица содержит от 2 до 9 тримеров. [066] In specific embodiments, detergent core nanoparticles are composed of multiple protein trimers surrounding a nonionic detergent core. For example, each nanoparticle may contain 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 15 trimers. In some embodiments, each nanoparticle contains from 2 to 6 trimers. In specific embodiments, each nanoparticle contains from 2 to 9 trimers.

[067] Белки НА связаны с ядром наночастицы, содержащим неионные детергенты. Как правило, детергент выбран из полисорбата-20 (PS20), полисорбата-40 (PS40), полисорбата-60 (PS60), полисорбата-65 (PS65) и полисорбата-80 (PS80). Присутствие детергента облегчает образование наночастиц за счет формирования ядра, которое организует и презентует антигены. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления наночастицы содержат антигены, собранные в мультиолигомерные наночастицы гликопротеин-PS80-белок-детергент с выступающими наружу областями головок и гидрофобными областями, и детергент PS80, образующий центральное ядро, окруженное антигенами. В конкретных вариантах осуществления неионный детергент в композициях вакцин против гриппа представляет собой PS80. Z-средний размер наночастиц с детергентным ядром составляет от около 25 нм до около 30 нм. Однако после того как наночастицы с детергентным ядром объединяются с Матрицей M в течение некоторого времени, образуются HaSMaN, и они с размером от около 50 до 60 нм немного больше, чем наночастицы с детергентным ядром. Размер частиц (Z-средний размер) измеряют методом динамического рассеяния света (DLS) с использованием Malvern Zetasizer, если не указано иное. [067] HA proteins are associated with the nanoparticle core containing nonionic detergents. Typically, the detergent is selected from polysorbate-20 (PS20), polysorbate-40 (PS40), polysorbate-60 (PS60), polysorbate-65 (PS65) and polysorbate-80 (PS80). The presence of detergent facilitates the formation of nanoparticles by forming a core that organizes and presents antigens. Thus, in some embodiments, the nanoparticles comprise antigens assembled into multi-oligomeric glycoprotein-PS80-protein-detergent nanoparticles with protruding head regions and hydrophobic regions, and the PS80 detergent forming a central core surrounded by antigens. In specific embodiments, the nonionic detergent in influenza vaccine compositions is PS80. The Z-average size of detergent core nanoparticles ranges from about 25 nm to about 30 nm. However, after the detergent core nanoparticles combine with Matrix M for some time, HaSMaN is formed and, with a size of about 50 to 60 nm, they are slightly larger than the detergent core nanoparticles. Particle size (Z-average size) is measured by dynamic light scattering (DLS) using a Malvern Zetasizer unless otherwise specified.

Наночастицы: ПолучениеNanoparticles: Preparation

[068] Наночастицы с детергентным ядром и HaSMaN согласно данному изобретению представляют собой продукты неприродного происхождения, компоненты которых не встречаются вместе в природе. Как правило, в описанных в данном документе способах используется подход с заменой детергента, при котором первый детергент используется для выделения белка, а затем этот первый детергент заменяется вторым детергентом с образованием наночастиц. [068] The detergent core nanoparticles and HaSMaN of this invention are non-natural products whose components do not occur together in nature. Typically, the methods described herein use a detergent replacement approach, in which a first detergent is used to isolate a protein, and then that first detergent is replaced with a second detergent to form nanoparticles.

[069] Гликопротеиновые антигены, как правило, НА, в наночастицах, как правило, продуцируются при помощи рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах. Как правило, гликопротеины экспрессируются в клетках-хозяевах насекомых с использованием бакуловирусной системы. В предпочтительных вариантах осуществления бакуловирус представляет собой бакуловирус с нокаутом по катепсину-L. В других предпочтительных вариантах осуществления бакуловирус представляет собой бакуловирус с нокаутом по хитиназе. В еще других предпочтительных вариантах осуществления бакуловирус представляет собой бакуловирус с двойным нокаутом как по катепсину-L, так и по хитиназе. Высокий уровень экспрессии может быть получен в системах экспрессии клеток насекомых. Неограничивающими примерами клеток насекомых являются клетки Spodoptera frugiperda (Sf), например, Sf9, Sf21, клетки Trichoplusia ni , например, клетки «High Five», и клетки Drosophila S2. Предпочтительно клетки представляют собой клетки Sf9 или их производные. [069] Glycoprotein antigens, typically HA, in nanoparticles are typically produced by recombinant expression in host cells. Typically, glycoproteins are expressed in insect host cells using the baculovirus system. In preferred embodiments, the baculovirus is a cathepsin-L knockout baculovirus. In other preferred embodiments, the baculovirus is a chitinase knockout baculovirus. In yet other preferred embodiments, the baculovirus is a double knockout baculovirus for both cathepsin-L and chitinase. High levels of expression can be obtained in insect cell expression systems. Non-limiting examples of insect cells include Spodoptera frugiperda (Sf) cells, eg Sf9, Sf21, Trichoplusia ni cells, eg "High Five" cells, and Drosophila S2 cells. Preferably the cells are Sf9 cells or derivatives thereof.

[070] Для культивирования клеток можно использовать типичные методы трансфекции и роста клеток. Векторы, например, векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие слитые белки, можно трансфицировать в клетки-хозяева в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Например, введение нуклеиновых кислот в эукариотические клетки может быть достигнуто путем совместного осаждения фосфатом кальция, электропорации, микроинъекции, липофекции и трансфекции с использованием реагентов на основе полиаминов для трансфекции. [070] Typical transfection and cell growth methods can be used to culture cells. Vectors, for example, vectors containing polynucleotides encoding fusion proteins, can be transfected into host cells in accordance with methods well known in the art. For example, introduction of nucleic acids into eukaryotic cells can be achieved by calcium phosphate co-precipitation, electroporation, microinjection, lipofection and transfection using polyamine-based transfection reagents.

[071] Способы выращивания клеток-хозяев включают, но не ограничиваются ими, способы периодического, периодического с подпиткой, непрерывного и перфузионного культивирования клеток. Под культивированием клеток подразумевают рост и размножение клеток в биореакторе (камере ферментации), где клетки размножаются и экспрессируют белок (например, рекомбинантные белки) для очистки и выделения. Как правило, культивирование клеток проводят в стерильных, контролируемых температурных и атмосферных условиях в биореакторе. Биореактор представляет собой камеру, используемую для культивирования клеток, в которой можно контролировать такие условия окружающей среды, как температура, атмосфера, перемешивание и/или pH. В одном варианте осуществления биореактор представляет собой камеру из нержавеющей стали. В другом варианте осуществления биореактор представляет собой предварительно стерилизованный пластиковый мешок (например, Cellbag®, Wave Biotech, Бриджуотер, штат Нью-Джерси). В другом варианте осуществления предварительно стерилизованные пластиковые пакеты представляют собой пакеты от около 50 л до 3500 л. [071] Methods for culturing host cells include, but are not limited to, batch, fed-batch, continuous, and perfusion cell culture methods. Cell culture refers to the growth and propagation of cells in a bioreactor (fermentation chamber) where the cells multiply and express protein (eg, recombinant proteins) for purification and isolation. Typically, cell culture is carried out under sterile, controlled temperature and atmospheric conditions in a bioreactor. A bioreactor is a chamber used for culturing cells in which environmental conditions such as temperature, atmosphere, agitation and/or pH can be controlled. In one embodiment, the bioreactor is a stainless steel chamber. In another embodiment, the bioreactor is a pre-sterilized plastic bag (eg, Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ). In another embodiment, the pre-sterilized plastic bags are bags from about 50 L to 3500 L.

Экстракция детергентами и очистка наночастицDetergent extraction and nanoparticle purification

[072] После роста клеток-хозяев белок может быть выделен из клеток-хозяев с использованием детергентов и протоколов очистки. После того как клетки-хозяева выросли в течение 48-96 часов, клетки выделяют из среды и добавляют раствор, содержащий детергент, для растворения клеточной мембраны, высвобождая белок в детергентный экстракт. Тритон X-100 и тергитол, также известный как NP-9, представляют собой предпочтительные детергенты для экстракции. Детергент можно добавлять до конечной концентрации от около 0,1% до около 1,0%. Например, концентрация может составлять около 0,1%, около 0,2%, около 0,3%, около 0,5%, около 0,7%, около 0,8% или около 1,0%. В некоторых вариантах осуществления диапазон может составлять от около 0,1% до около 0,3%. Предпочтительно концентрация составляет около 0,5%.[072] After growth of the host cells, the protein can be isolated from the host cells using detergents and purification protocols. After the host cells have grown for 48-96 hours, the cells are isolated from the medium and a detergent-containing solution is added to dissolve the cell membrane, releasing the protein into the detergent extract. Triton X-100 and Tergitol, also known as NP-9, are the preferred extraction detergents. The detergent can be added to a final concentration of about 0.1% to about 1.0%. For example, the concentration may be about 0.1%, about 0.2%, about 0.3%, about 0.5%, about 0.7%, about 0.8%, or about 1.0%. In some embodiments, the range may be from about 0.1% to about 0.3%. Preferably the concentration is about 0.5%.

[073] В других аспектах для выделения белка из клетки-хозяина можно использовать разные первые детергенты. Например, первым детергентом может быть бис(полиэтиленгликоль бис[имидазоилкарбонил]), ноноксинол-9, бис(полиэтиленгликоль бис[имидазоилкарбонил]), Brij® 35, Brij®56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij ® 58P, Cremophor® EL, монододециловый эфир декаэтиленгликоля, N-деканоил-N-метилглюкамин, н-децил-альфа-D-глюкопиранозид, децил-бета-D-мальтопиранозид, н-додеканоил-N-метилглюкамид, н-додецил-альфа-D-мальтозид, н-додецил-бета-D-мальтозид, н-додецил бета-D-мальтозид, монодециловый эфир гептаэтиленгликоля, монододециловый эфир гептаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир гептаэтиленгликоля, н-гексадецил бета-D-мальтозид, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир гексаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир гексаэтиленгликоля, Igepal CA-630, Igepal CA-630, метил-6-0-(N-гептилкарбамоил) -альфа-D-глюкопиранозид, монододециловый эфир нонаэтиленгликоля, N-нонаноил-N-метилглюкамин, N-нонаноил-N-метилглюкамин, монодециловый эфир октаэтиленгликоля, монододециловый эфир октаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир октаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир октаэтиленгликоля-бета-монооктадецилгликоля, монооктадециловый эфир октаэтиленгликоля, монодециловый эфир пентаэтиленгликоля, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир пентаэтиленгликоля, моногексиловый эфир пентаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир пентаэтиленгликоля, монооктиловый эфир пентаэтиленгликоля, диглицидиловый эфир полиэтиленгликоля, простой эфир полиэтиленгликоля W-1, тридециловый эфир полиоксиэтилена 10, полиоксиэтилен стеарат 100, изогексадециловый эфир полиоксиэтилена 20, олеиловый эфир полиоксиэтилена 20, полиоксиэтилен 40 стеарат, полиоксиэтилен 50 стеарат, полиоксиэтилен 8 стеарат, полиоксиэтилен бис(имидазолилкарбонил), полиоксиэтилен 25 пропиленгликоль стеарат, сапонин из коры Quillaja, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85, тергитол типа 15-S-12, тергитол типа 15-S-30 , тергитол типа 15-S-5, тергитол типа 15-S-7, тергитол типа 15-S-9, тергитол типа NP-10, тергитол типа NP-4, тергитол типа NP-40, тергитол типа NP-7, тергитол типа NP-9, тергитол типа TMN-10, тергитол типа TMN-6, Тритон X-100 или их комбинации. [073] In other aspects, various first detergents can be used to isolate the protein from the host cell. For example, the first detergent may be bis(polyethylene glycol bis[imidazoylcarbonyl]), nonoxynol-9, bis(polyethylene glycol bis[imidazoylcarbonyl]), Brij® 35, Brij®56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij ® 58P, Cremophor® EL, decaethylene glycol monododecyl ether, N-decanoyl-N-methylglucamine, n-decyl-alpha-D-glucopyranoside, decyl-beta-D-maltopyranoside, n-dodecanoyl-N-methylglucamide, n- dodecyl alpha-D-maltoside, n-dodecyl beta-D-maltoside, n-dodecyl beta-D-maltoside, heptaethylene glycol monodecyl ether, heptaethylene glycol monododecyl ether, heptaethylene glycol monotetradecyl ether, n-hexadecyl beta-D-maltoside, monododecyl ether hexaethylene glycol, hexaethylene glycol monododecyl ether, hexaethylene glycol monododecyl ether, hexaethylene glycol monooctadecyl ether, hexaethylene glycol monotetradecyl ether, Igepal CA-630, Igepal CA-630, methyl-6-0-(N-heptylcarbamoyl)-alpha-D- glucopyranoside, nonaethylene glycol monododecyl ether, N-nonanoyl-N-methylglucamine, N-nonanoyl-N-methylglucamine, octaethylene glycol monodecyl ether, octaethylene glycol monododecyl ether, octaethylene glycol monohexadecyl ether, octaethylene glycol beta-monooctadecyl glycol monooctadecyl ether, monooctadecyl ether octaethylene glycol, pentaethylene glycol monodecyl ether, pentaethylene glycol monododecyl ether, monohexadecyl ether pentaethylene glycol, pentaethylene glycol monohexyl ether, pentaethylene glycol monooctadecyl ether, pentaethylene glycol monooctyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, polyethylene glycol ether W-1, polyoxyethylene tridecyl ether 10, polyoxyethylene stearate 100, polyoxyethylene isohexadecyl ether ylene 20, polyoxyethylene oleyl ether 20, polyoxyethylene 40 stearate, polyoxyethylene 50 stearate, polyoxyethylene 8 stearate, polyoxyethylene bis(imidazolylcarbonyl), polyoxyethylene 25 propylene glycol stearate, Quillaja bark saponin, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85, tergitol type 15- S-12, tergitol type 15-S-30, tergitol type 15-S-5, tergitol type 15-S-7, tergitol type 15-S-9, tergitol type NP-10, tergitol type NP-4, tergitol type NP-40, tergitol type NP-7, tergitol type NP-9, tergitol type TMN-10, tergitol type TMN-6, Triton X-100 or combinations thereof.

[074] Затем наночастицы можно выделить из клеточного дебриса с помощью центрифугирования. В некоторых вариантах осуществления можно использовать градиентное центрифугирование, например, с использованием хлорида цезия, сахарозы и йодиксанола. В качестве альтернативы или в дополнение могут использоваться другие методы, такие как стандартные методы очистки, включая, например, ионообменную, аффинную и гель-фильтрационную хроматографию. [074] The nanoparticles can then be isolated from the cellular debris using centrifugation. In some embodiments, gradient centrifugation can be used, for example, using cesium chloride, sucrose and iodixanol. Alternatively or in addition, other methods may be used, such as standard purification methods, including, for example, ion exchange, affinity and gel filtration chromatography.

[075] Например, первая колонка может быть смолой для ионообменной хроматографии, такой как Fractogel® EMD TMAE (EMD Millipore), вторая колонка может быть чечевичной (Lens culinaris) лектиновой аффинной смолой, а третья колонка может быть катионообменной колонкой, например, смолой Fractogel® EMD SO3 (EMD Millipore). В других аспектах катионообменная колонка может быть колонкой MMC или колонкой Nuvia C Prime (Bio-Rad Laboratories, Inc.). В описанных в данном документе способах предпочтительно не использовать колонку экстракции детергентом; например, колонку гидрофобного взаимодействия. Такая колонка часто используется для удаления детергентов во время очистки, но может отрицательно повлиять на описанные в данном документе способы. [075] For example, the first column may be an ion exchange chromatography resin such as Fractogel® EMD TMAE (EMD Millipore), the second column may be a Lens culinaris lectin affinity resin, and the third column may be a cation exchange column such as Fractogel resin ® EMD SO3 (EMD Millipore). In other aspects, the cation exchange column can be an MMC column or a Nuvia C Prime column (Bio-Rad Laboratories, Inc.). The methods described herein preferably do not use a detergent extraction column; for example, a hydrophobic interaction column. This column is often used to remove detergents during purification, but may adversely affect the methods described herein.

Замена детергентовReplacing detergents

[076] Для образования наночастиц с детергентным ядром, первый детергент, используемый для экстракции белка из клетки-хозяина, по существу заменяется вторым детергентом для получения структуры наночастиц. NP-9 представляет собой предпочтительный детергент для экстракции. Как правило, наночастицы не содержат детектируемого NP-9 при измерении с помощью ВЭЖХ. Второй детергент, как правило, выбран из группы, состоящей из PS20, PS40, PS60, PS65 и PS80. Предпочтительно второй детергент представляет собой PS80. [076] To form nanoparticles with a detergent core, the first detergent used to extract the protein from the host cell is essentially replaced by a second detergent to produce the nanoparticle structure. NP-9 is the preferred extraction detergent. Typically, nanoparticles do not contain detectable NP-9 when measured by HPLC. The second detergent is typically selected from the group consisting of PS20, PS40, PS60, PS65 and PS80. Preferably the second detergent is PS80.

[077] В конкретных аспектах замену детергента проводят с использованием аффинной хроматографии для связывания гликопротеинов через их углеводный фрагмент. Например, для аффинной хроматографии можно использовать колонку с лектинами бобовых. Лектины бобовых представляют собой белки, изначально идентифицированные в растениях и, как было обнаружено, специфично и обратимо взаимодействуют с углеводными остатками. См., например, Sharon and Lis, «Legume lectins--a large family of homologous proteins», FASEB J. 1990 Nov;4(14):3198-208; Liener, «The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine», Elsevier, 2012. Подходящие лектины включают конканавалин A (con A), лектин гороха, лектин эспарцета и лектин чечевицы. Лектин чечевицы представляет собой предпочтительную колонку для замены детергентов из-за его связывающих свойств. Колонки с лектином коммерчески доступны; например, Capto Lentil Lectin доступен от GE Healthcare. В некоторых аспектах в колонке с лектином чечевицы может использоваться рекомбинантный лектин. На молекулярном уровне считается, что углеводные фрагменты связываются с лектином чечевицы, освобождая аминокислоты белка для слияния вокруг детергента, что приводит к образованию детергентного ядра, обеспечивающего наночастицы, имеющие множественные копии антигена, например, олигомеры гликопротеина, которые могут представлять собой димеры, тримеры или тетрамеры, закрепленные в детергенте. [077] In particular aspects, detergent replacement is performed using affinity chromatography to bind glycoproteins through their carbohydrate moiety. For example, a legume lectin column can be used for affinity chromatography. Legume lectins are proteins originally identified in plants and have been found to interact specifically and reversibly with carbohydrate moieties. See, for example, Sharon and Lis, “Legume lectins—a large family of homologous proteins,” FASEB J. 1990 Nov;4(14):3198–208; Liener, “The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine,” Elsevier, 2012. Suitable lectins include concanavalin A (con A), pea lectin, sainfoin lectin, and lentil lectin. Lentil lectin is a preferred detergent replacement column due to its binding properties. Lectin columns are commercially available; for example, Capto Lentil Lectin is available from GE Healthcare. In some aspects, a recombinant lectin may be used in the lentil lectin column. At the molecular level, it is believed that carbohydrate moieties bind to the lentil lectin, freeing the protein amino acids to fuse around the detergent, resulting in the formation of a detergent core providing nanoparticles having multiple copies of the antigen, such as glycoprotein oligomers, which can be dimers, trimers or tetramers fixed in detergent.

[078] Детергент, инкубируемый с белком для образования наночастиц во время замены детергента, может присутствовать в количестве до около 0,1% (мас./об.) на ранних стадиях очистки. [078] The detergent incubated with the protein to form nanoparticles during detergent replacement may be present in amounts up to about 0.1% (w/v) during the early stages of purification.

[079] Как правило, наночастицы с детергентным ядром против гриппа готовят индивидуально в виде одновалентного продукта одного штамма. Например, неионный детергент (например, PS80) может составлять от около 0,03% до около 0,5%. В конкретном аспекте одновалентная лекарственная субстанция может содержать около 1,5 мг/мл белка, измеренного с помощью A280, и около 0,12% PS80, обеспечивая молярное соотношение около 40:1. В конкретных четырехвалентных композициях концентрация белка может составлять около 0,48 мг/мл, как измерено с помощью реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД), а расчетное количество PS80 составляет около 0,04%. [079] Typically, influenza detergent core nanoparticles are formulated individually as a single strain monovalent product. For example, a nonionic detergent (eg, PS80) may be from about 0.03% to about 0.5%. In a particular aspect, the monovalent drug substance may contain about 1.5 mg/ml protein, measured by A280, and about 0.12% PS80, providing a molar ratio of about 40:1. In specific tetravalent compositions, the protein concentration may be about 0.48 mg/ml, as measured by single radial immunodiffusion (SRID) reaction, and the estimated amount of PS80 is about 0.04%.

[080] Замена детергента может выполняться с белками, очищенными, как описано выше, и очищенными, замороженными для хранения, а затем размороженными для замены детергента. [080] Detergent replacement can be performed with proteins purified as described above and purified, frozen for storage, and then thawed for detergent replacement.

Образование HaSMaNEducation

[081] Описанные в данном документе HaSMaN получают путем инкубации наночастиц с детергентным ядром и адъюванта Матрица ИСКОМ, содержащим сапониновую фракцию, холестерин и фосфолипид. [081] The HaSMaNs described herein are prepared by incubating nanoparticles with a detergent core and an ISCOM Matrix adjuvant containing a saponin fraction, cholesterol and phospholipid.

[082] Как правило, для образования требуется от 24 до 48 часов инкубации при 4^oC или 25^oC. Образованию HaSMaN способствует более высокие температуры. См., например, Фиг. 33 и 35. Таким образом, в конкретных аспектах, образование HaSMaN происходит при инкубации в течение по меньшей мере 24 часов при температуре около 25^oC. Смешивание наночастиц с детергентным ядром и адъюванта Матрица ИСКОМ незадолго до введения субъекту, т.е. смешивание у постели больного, не приводит к образованию HaSMaN. Более длительные периоды инкубации не оказывают отрицательного воздействия на образование HaSMaN. [082] Typically, formation requires 24 to 48 hours of incubation at 4 ^o C or 25 ^o C. HaSMaN formation is favored by higher temperatures. See, for example, FIG. 33 and 35. Thus, in specific aspects, the formation of HaSMaN occurs upon incubation for at least 24 hours at a temperature of about 25 ^o C. Mixing of the detergent core nanoparticles and the ISCOM Matrix adjuvant shortly before administration to the subject, i.e. mixing at the bedside does not result in the formation of HaSMaN. Longer incubation periods do not have a negative effect on HaSMaN formation.

Белки HA гриппа для наночастиц Influenza HA proteins for nanoparticles

[083] Гликопротеины НА, используемые в качестве антигенов гриппа, могут происходить из любого штамма вируса гриппа. Вирусы человеческого гриппа типа A и типа B вызывают сезонные эпидемии болезней почти каждую зиму в Соединенных Штатах. Вирусы гриппа типа A делятся на подтипы на основе двух белков на поверхности вируса: гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA).[083] HA glycoproteins used as influenza antigens can be derived from any strain of influenza virus. Human influenza viruses type A and type B cause seasonal epidemics of illness almost every winter in the United States. Influenza A viruses are divided into subtypes based on two proteins on the surface of the virus: hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA).

[084] Белок HA может быть выбран из подтипов H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 и H18. Филогенетически грипп делится на группы. Для HA группа 1 содержит H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 и H18, а группа 2 содержит H3, H4, H7, H10, H14 и H15. [084] The HA protein can be selected from the subtypes H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 and H18. Phylogenetically, influenza is divided into groups. For HA, group 1 contains H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, and H18, and group 2 contains H3, H4, H7, H10, H14, and H15.

[085] В некоторых аспектах наночастицы на основе вируса гриппа представляют собой устойчивые к трипсину наночастицы, полученные с использованием очистки при нейтральном pH. Устойчивость к трипсину достигается за счет диапазона нейтрального pH от 6,9 до 8,5 во время очистки и получения наночастиц на основе HA. Устойчивые к трипсину гликопротеины гриппа, и наночастицы на основе вируса гриппа, устойчивые к трипсину; и способы их изготовления подробно описаны в заявке США № 15/819962, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки для всех целей. [085] In some aspects, the influenza virus nanoparticles are trypsin-resistant nanoparticles produced using neutral pH purification. Trypsin resistance is achieved through a neutral pH range of 6.9 to 8.5 during purification and preparation of HA-based nanoparticles. Trypsin-resistant influenza glycoproteins, and trypsin-resistant influenza virus nanoparticles; and methods for making them are described in detail in US Application No. 15/819962, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

Модифицированные антигеныModified antigens

[086] Как правило, антиген представляет собой полноразмерную последовательность дикого типа, однако антиген может быть вариацией или мутантом антигена дикого типа. В некоторых аспектах антиген может быть идентичен описанному антигену; например, процентная идентичность может составлять по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98%. Идентичность в процентах можно рассчитать с помощью программы выравнивания ClustalW2, доступной на www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. Для попарного выравнивания могут использоваться следующие параметры по умолчанию: матрица сравнения аминокислот = Gonnet; Открытие гэпа= 10; Продление гэпа = 0,1. [086] Typically, the antigen is the full-length wild-type sequence, however, the antigen may be a variation or mutant of the wild-type antigen. In some aspects, the antigen may be identical to a described antigen; for example, the percent identity may be at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, or at least 98%. Percentage identity can be calculated using the alignment program ClustalW2, available at www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. The following default parameters can be used for pairwise alignment: amino acid comparison matrix = Gonnet; Gap opening= 10; Gap extension = 0.1.

[087] Могут использоваться другие варианты. НА представляет собой гомотример, каждый мономер которого состоит из ~550 аминокислотных остатков. Каждый мономер HA согласно принятому представлению разделен на три домена: эктодомен из ~515 остатков составляет экстравирусную часть молекулы; единственный участок из 27 остатков определяет трансмембранный (TM) домен; и ~10 остатков составляют цитоплазматический хвост (CT). Хотя некоторые изменения могут быть внесены в антигены, для образования как наночастиц с детергентным ядром, так и HaSMaN требуется интактный трансмембранный домен (TM). Таким образом, в конкретных примерах, модифицированная последовательность белка НА имеет 100% идентичность (т.е. является диким типом) по отношению к доменам TM и CT с некоторой вариативностью в оставшейся части эктодомена, где идентичность может составлять по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%. Домены могут быть идентифицированы по гомологии с аминокислотными последовательностями доменов TM и CT HA Japan/305/57, приведенными на Фиг. 1 Melikyan et al. (Mol Biol Cell. 1999 Jun; 10(6): 1821–1836), хотя следует отметить, что границы между эктодоменом, доменами TM и CT могут варьироваться от белка HA к белку HA максимум на три аминокислоты.[087] Other options may be used. HA is a homotrimer, each monomer consisting of ~550 amino acid residues. Each HA monomer, according to the accepted concept, is divided into three domains: the ectodomain of ~515 residues constitutes the extraviral part of the molecule; a single 27-residue region defines the transmembrane (TM) domain; and ~10 residues constitute the cytoplasmic tail (CT). Although some changes can be made to the antigens, the formation of both detergent core nanoparticles and HaSMaN requires an intact transmembrane domain (TM). Thus, in specific examples, the modified HA protein sequence has 100% identity (i.e., is wild type) to the TM and CT domains, with some variation in the remainder of the ectodomain, where the identity may be at least 90% or more at least 95%. The domains can be identified by homology to the amino acid sequences of the TM and CT domains of HA Japan/305/57 shown in FIG. 1 Melikyan et al. (Mol Biol Cell. 1999 Jun; 10(6): 1821–1836), although it should be noted that the boundaries between the ectodomain, TM and CT domains can vary from HA protein to HA protein by a maximum of three amino acids.

Стабильность вакциныVaccine stability

[088] Преимущественно, описанные составы вакцины на основе наночастиц против гриппа являются стабильными и пригодными для длительного хранения. Составы, предложенные в данном документе, могут быть особенно подходящими для стратегий совместного приготовления (то есть когда антигены и адъювант Матрица комбинируются задолго до введения; например, в предварительно заполненном шприце). Как описано в данном документе, стратегии совместного составления вакцин против гриппа могут обеспечить преимущества для клинической практики и могут быть экономически эффективной альтернативой используемым в настоящее время свежеприготовленным составам. [088] Advantageously, the disclosed nanoparticle influenza vaccine formulations are stable and suitable for long-term storage. The formulations proposed herein may be particularly suitable for co-formulation strategies (ie, where the antigens and adjuvant Matrix are combined well before administration; for example, in a pre-filled syringe). As described herein, co-formulation strategies for influenza vaccines may provide benefits for clinical practice and may be a cost-effective alternative to currently used fresh formulations.

[089] В некоторых вариантах осуществления антигены гриппа в комбинированных композициях вакцин стабильны, когда композиции хранятся до 12 месяцев. Хотя композиции вакцин можно хранить при 2-8°C, они демонстрируют отличную стабильность при 25°C. [089] In some embodiments, the influenza antigens in combination vaccine compositions are stable when the compositions are stored for up to 12 months. Although vaccine compositions can be stored at 2-8°C, they demonstrate excellent stability at 25°C.

[090] Стабильность предварительно приготовленных (совместно составленных) составов можно оценить способами и протоколами, известными в данной области техники. Стабильность можно измерить по уровням деградации антигенов вакцины и по иммуногенности вакцин. Стабильность можно исследовать путем оценки термостабильности вирусных антигенов в вакцинах. [090] The stability of preformed (co-formulated) formulations can be assessed by methods and protocols known in the art. Stability can be measured by the levels of degradation of vaccine antigens and the immunogenicity of vaccines. Stability can be examined by assessing the thermal stability of viral antigens in vaccines.

[091] Стабильность составов вакцин при комнатной температуре (25°C) в течение длительного периода времени является преимуществом для эффективных с точки зрения затрат стратегий вакцинации, особенно в регионах, где распространение и хранение в холодовой цепи может быть ограничено. Как указано в рекомендациях ВОЗ по оценке стабильности вакцин, контролируемая температурная цепочка во время производства, распространения и хранения важна для обеспечения эффективности вакцин («Руководство по оценке стабильности вакцин для использования в цепочке поставок с контролируемой температурой; доступно по адресу www.who.int/biologicals/WHO_CTC_first_draft_22_Dec_2014_amended.pdf).[091] The stability of vaccine formulations at room temperature (25°C) over long periods of time is an advantage for cost-effective vaccination strategies, especially in regions where distribution and cold chain storage may be limited. As stated in the WHO guidelines for assessing the stability of vaccines, controlled temperature chains during production, distribution and storage are important to ensure the effectiveness of vaccines (“Guide to assessing the stability of vaccines for use in a temperature-controlled supply chain; available at www.who.int/ biologicals/WHO_CTC_first_draft_22_Dec_2014_amended.pdf).

[092] Не ограничиваясь теорией, считается, что структура HaSMaN может способствовать стабильности совместно составленных составов вакцин. (См. Фиг. 36, демонстрирующую более высокую термическую стабильность в присутствии адъюванта Матрица, т.е. демонстрирующую, что частицы HaSMaN обладают большей стабильностью, чем составы, содержащие только детергентное ядро). Смешивание наночастиц с детергентным ядром с Матрицей M для получения HaSMaN обеспечивает композиции вакцины с повышением температуры от около 0,5°C до около 1,0°C (по данным дифференциальной сканирующей калориметрии) по сравнению с композициями вакцины, содержащими только наночастицы с детергентным ядром. [092] Without being limited by theory, it is believed that the structure of HaSMaN may contribute to the stability of co-formulated vaccine formulations. (See FIG. 36 demonstrating greater thermal stability in the presence of the Matrix adjuvant, ie demonstrating that HaSMaN particles are more stable than formulations containing only the detergent core). Mixing detergent core nanoparticles with Matrix M to produce HaSMaN provides vaccine compositions with a temperature increase of about 0.5°C to about 1.0°C (as measured by differential scanning calorimetry) compared to vaccine compositions containing only detergent core nanoparticles .

[093] Эта улучшенная термостабильность способствует увеличению срока хранения вакцины. В конкретных аспектах составы вакцины могут быть стабильными до 6 месяцев или до 12 месяцев. Тестируемый образец считается «стабильным» в контексте данного описания, если титр HAI против тестируемого образца после 12 месяцев хранения при 2-8°C статистически не отличается от свежеприготовленного образца; и если реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) дают значение не менее около 70% после 12 месяцев хранения при 2-8^oC. Анализ статистической значимости измерений титра HAI выполняли следующим образом. Среднее геометрическое титра (СГТ) и связанные 95% доверительные интервалы (ДИ) рассчитывали по группам. Среднее значение log10 трансформированных измерений титра с помощью HAI сравнивали между группами с использованием критерия подлинной значимости Тьюки с программным обеспечением JMP13. Значение p <0,05 указывает на статистически значимую разницу между двумя сравниваемыми группами.[093] This improved thermal stability helps extend the shelf life of the vaccine. In certain aspects, vaccine formulations may be stable for up to 6 months or up to 12 months. A test sample is considered "stable" for the purposes of this specification if the HAI titer against the test sample after 12 months of storage at 2-8°C is not statistically different from a freshly prepared sample; and if single radial immunodiffusion (SRID) reactions give a value of at least about 70% after 12 months of storage at 2-8 ^o C. Analysis of statistical significance of HAI titer measurements was performed as follows. Geometric mean titers (GMT) and associated 95% confidence intervals (CIs) were calculated by group. The mean log10 transformed HAI titer measurements were compared between groups using Tukey's true significance test with JMP13 software. A p value <0.05 indicates a statistically significant difference between the two groups compared.

Композиции вакцин Vaccine compositions

[094] Описанные в данном документе композиции можно использовать как профилактически, так и терапевтически. Изобретение включает способы предотвращения заражения вирусом гриппа. Способы включают введение субъекту терапевтического или профилактического количества иммуногенных композиций согласно описанию. Предпочтительно фармацевтическая композиция представляет собой композицию вакцины, которая обеспечивает защитный эффект. В аспектах защитный эффект может включать ослабление симптома, связанного с инфекцией, в процентном отношении к популяции, подвергшейся воздействию. Например, композиция может предотвращать или уменьшать один или более симптомов гриппа, выбранных из: лихорадочной усталости, мышечной боли, головной боли и боли в горле, по сравнению с неполучавшим лечение субъектом. [094] The compositions described herein can be used both prophylactically and therapeutically. The invention includes methods for preventing infection with influenza virus. The methods include administering to a subject a therapeutic or prophylactic amount of immunogenic compositions as described. Preferably, the pharmaceutical composition is a vaccine composition that provides a protective effect. In aspects, the protective effect may include a reduction in a symptom associated with the infection as a percentage of the exposed population. For example, the composition may prevent or reduce one or more symptoms of influenza selected from: feverish fatigue, muscle pain, headache and sore throat, compared to an untreated subject.

[095] Композиции вакцин могут содержать различные вспомогательные вещества, фармацевтически приемлемые буферы и тому подобное. Например, фармацевтически приемлемые буферы в композициях вакцины могут содержать одно или более из следующего: фосфата натрия, хлорида натрия, гистидина, аргинин гидрохлорида и трегалозы. Фосфат натрия может присутствовать в концентрации от около 10 мМ до около 50 мМ, от около 15 мМ до около 30 мМ. В конкретных случаях присутствует около 25 мМ фосфата натрия. Гистидин может присутствовать в диапазоне от около 0,1% (мас./об.) до около 2,5% (мас./об.); например, гистидин может присутствовать в количестве около 0,1% (мас./об.), около 0,5% (мас./об.), около 0,7% (мас./об.), около 1% (мас./об.), около 1,5% (мас./об.), около 2% (мас./об.) или около 2,5% (мас./об.). [095] Vaccine compositions may contain various excipients, pharmaceutically acceptable buffers, and the like. For example, pharmaceutically acceptable buffers in vaccine compositions may contain one or more of the following: sodium phosphate, sodium chloride, histidine, arginine hydrochloride and trehalose. Sodium phosphate may be present in a concentration of from about 10 mM to about 50 mM, from about 15 mM to about 30 mM. In specific cases, about 25 mM sodium phosphate is present. Histidine may be present in a range from about 0.1% (w/v) to about 2.5% (w/v); for example, histidine may be present in an amount of about 0.1% (w/v), about 0.5% (w/v), about 0.7% (w/v), about 1% ( w/v), about 1.5% (w/v), about 2% (w/v), or about 2.5% (w/v).

[096] Хлорид натрия может находиться в диапазоне от около 50 мМ до около 300 мМ. Как правило, хлорид натрия, когда он содержится в композиции, присутствует в концентрации около 150 мМ. [096] Sodium chloride may range from about 50 mM to about 300 mM. Typically, sodium chloride, when contained in a composition, is present at a concentration of about 150 mM.

[097] Аргинин гидрохлорид может присутствовать в концентрации от около 50 мМ до около 200 мМ, от около 80 мМ до около 150 мМ или от около 100 мМ до около 180 мМ. В конкретных случаях присутствует около 100 мМ аргинин гидрохлорида. [097] Arginine hydrochloride may be present at a concentration of from about 50 mM to about 200 mM, from about 80 mM to about 150 mM, or from about 100 mM to about 180 mM. In specific cases, about 100 mM arginine hydrochloride is present.

[098] Трегалоза может присутствовать в диапазоне от около 1% до около 10%; например, около 1%, около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9% или около 10%. [098] Trehalose may be present in a range from about 1% to about 10%; for example, about 1%, about 2%, about 3%, about 4%, about 5%, about 6%, about 7%, about 8%, about 9%, or about 10%.

[099] Диапазон pH для композиции вакцины против гриппа, как правило, близок к нейтральному и поддерживается на уровне выше 6,9 во время очистки и в композициях. Например, pH буферов и композиций может составлять от около 7,2 до около 7,8, более предпочтительно от около 7,2 до около 7,5. В конкретных аспектах pH составляет около 7,5. Уровни pH ниже 6,9 следует избегать, поскольку они отрицательно влияют на стабильность структуры HA. [099] The pH range for the influenza vaccine composition is generally close to neutral and is maintained above 6.9 during purification and in the compositions. For example, the pH of buffers and compositions can be from about 7.2 to about 7.8, more preferably from about 7.2 to about 7.5. In specific aspects, the pH is about 7.5. pH levels below 6.9 should be avoided as they negatively affect the stability of the HA structure.

АдъювантыAdjuvants

[0100] В определенных вариантах осуществления описанные в данном документе композиции могут быть объединены с одним или более адъювантами для усиления иммунного ответа. В других вариантах осуществления композиции готовят без адъювантов и, таким образом, доступны для введения в виде композиций без адъювантов. [0100] In certain embodiments, the compositions described herein can be combined with one or more adjuvants to enhance the immune response. In other embodiments, the compositions are formulated without adjuvants and are thus available for administration as non-adjuvanted compositions.

[0101] Иммуногенность конкретной композиции может быть увеличена за счет использования неспецифических стимуляторов иммунного ответа, известных как адъюванты. Эффективные количества адъювантов давно используются для обеспечения общего повышения иммунитета против антигенов (например, патент США № 4877611). В протоколах иммунизации адъюванты используются для стимулирования ответов в течение многих лет, и поэтому адъюванты хорошо известны специалисту в данной области техники. Некоторые адъюванты влияют на способ презентации антигенов. Например, иммунный ответ усиливается, когда белковые антигены осаждаются квасцами. Эмульгирование антигенов также продлевает продолжительность презентации антигена. Включение любого адъюванта, описанного в Vogel et al., «A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2-е издание)», включенном в данный документ посредством ссылки во всей его полноте для всех целей, входит в объем данного описания.[0101] The immunogenicity of a particular composition can be increased through the use of non-specific stimulators of the immune response, known as adjuvants. Effective amounts of adjuvants have long been used to provide a general enhancement of immunity against antigens (eg, US Pat. No. 4,877,611). In immunization protocols, adjuvants have been used to stimulate responses for many years, and therefore adjuvants are well known to one skilled in the art. Some adjuvants affect the way antigens are presented. For example, the immune response is enhanced when protein antigens are precipitated by alum. Emulsification of antigens also prolongs the duration of antigen presentation. The inclusion of any adjuvant described in Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)", incorporated herein by reference in its entirety for all purposes, is within the scope of this description.

[0102] Хотя могут быть включены различные адъюванты, HaSMaN получают с использованием адъюванта Матрица ИСКОМ, который сохраняет свою эффективную адъювантную активность после введения субъекту. Соответственно, в некоторых аспектах в состав нельзя добавлять дополнительный адъювант. Как отмечалось выше, такой подход к составлению позволяет изготавливать предварительно заполненные шприцы, содержащие вакцину, без необходимости смешивания антигена с адъювантом у постели больного. [0102] Although various adjuvants may be included, HaSMaN is prepared using the ISCOM Matrix adjuvant, which retains its effective adjuvant activity after administration to a subject. Accordingly, in some aspects, no additional adjuvant may be added to the formulation. As noted above, this formulation approach allows for the production of prefilled syringes containing the vaccine without the need to mix the antigen with the adjuvant at the bedside.

Сапониновые адъюванты для матрицыSaponin adjuvants for matrix

[0103] Матрицу ИСКОМ готовят с использованием сапониновых фракций. Сапонины представляет собой гликозиды, полученные из коры дерева Quillaja saponaria Molina. Как правило, сапонин получают с использованием многостадийного процесса очистки, в результате которого образуются несколько фракций. В контексте данного документа термин «сапониновая фракция из Quillaja saponaria Molina» в общем используется для описания полуочищенной или определенной сапониновой фракции Quillaja saponaria или ее по существу чистой фракции. [0103] The ISCOM matrix is prepared using saponin fractions. Saponins are glycosides obtained from the bark of the Quillaja saponaria Molina tree. Typically, saponin is obtained using a multi-step purification process that results in multiple fractions. As used herein, the term "saponin fraction from Quillaja saponaria Molina" is generally used to describe the semi-purified or defined saponin fraction of Quillaja saponaria or a substantially pure fraction thereof.

Сапониновые фракцииSaponin fractions

[0104] Существует несколько подходов к получению сапониновых фракций. Фракции A, B и C описаны в патенте США № 6352697 и может быть получен следующим образом. Липофильная фракция из Quil A, неочищенного водного экстракта Quillaja saponaria Molina, разделяется хроматографией и элюируется 70% ацетонитрилом в воде для извлечения липофильной фракции. Затем эту липофильную фракцию разделяют полупрепаративной ВЭЖХ с элюированием, используя градиент от 25% до 60% ацетонитрила в кислой воде. Фракция, называемая в данном документе «фракцией A» или «QH-A», представляет собой или соответствует фракции, которая элюируется приблизительно при 39% ацетонитрила. Фракция, называемая в данном документе «фракцией B» или «QH-B», представляет собой или соответствует фракции, которая элюируется приблизительно при 47% ацетонитрила. Фракция, называемая в данном документе «фракцией C» или «QH-C», представляет собой или соответствует фракции, которая элюируется приблизительно при 49% ацетонитрила. Дополнительную информацию относительно очистки фракций можно найти в патенте США № 5057540. При получении, как описано в данном документе, каждая фракция A, B и C Quillaja saponaria Molina представляет собой группы или семейства химически близких молекул с определенными свойствами. Хроматографические условия, при которых они получены, таковы, что воспроизводимость от партии к партии с точки зрения профиля элюирования и биологической активности очень стабильна.[0104] There are several approaches to obtaining saponin fractions. Fractions A, B and C are described in US Pat. No. 6,352,697 and can be prepared as follows. The lipophilic fraction from Quil A, a crude aqueous extract of Quillaja saponaria Molina, was separated by chromatography and eluted with 70% acetonitrile in water to recover the lipophilic fraction. This lipophilic fraction is then separated by semipreparative HPLC, eluting using a gradient of 25% to 60% acetonitrile in acidic water. The fraction referred to herein as “fraction A” or “QH-A” is or corresponds to the fraction that elutes at approximately 39% acetonitrile. The fraction referred to herein as “fraction B” or “QH-B” is or corresponds to the fraction that elutes at approximately 47% acetonitrile. The fraction referred to herein as “fraction C” or “QH-C” is or corresponds to the fraction that elutes at approximately 49% acetonitrile. Additional information regarding the purification of fractions can be found in US Pat. No. 5,057,540. When prepared as described herein, Quillaja saponaria Molina Fractions A, B and C each represent groups or families of chemically related molecules with specific properties. The chromatographic conditions under which they are produced are such that the batch-to-batch reproducibility in terms of elution profile and biological activity is very consistent.

[0105] Были описаны другие сапониновые фракции. Фракции B3, B4 и B4b описаны в EP 0436620. Фракции QA1-QA22 описаны в EP03632279 B2, Q-VAC (Nor-Feed, AS Denmark), спикозид из Quillaja saponaria Molina (lsconova AB, Ultunaallén 2B, 756 51 Упсала, Швеция). Могут использоваться фракции QA-1, QA-2, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12, QA-13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20, QA-21, и QA-22 из EP 0 3632 279 B2, особенно QA-7, QA-17, QA-18, и QA-21. Их получают, как описано в EP 03632279 B2, особенно на странице 6 и в Примере 1 на страницах 8 и 9.[0105] Other saponin fractions have been described. Fractions B3, B4 and B4b are described in EP 0436620. Fractions QA1-QA22 are described in EP03632279 B2, Q-VAC (Nor-Feed, AS Denmark), spicoside from Quillaja saponaria Molina (lsconova AB, Ultunaallén 2B, 756 51 Uppsala, Sweden) . Fractions QA-1, QA-2, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12 can be used , QA-13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20, QA-21, and QA-22 from EP 0 3632 279 B2, especially QA -7, QA-17, QA-18, and QA-21. They are prepared as described in EP 03632279 B2, especially on page 6 and in Example 1 on pages 8 and 9.

[0106] Сапониновые фракции, описанные в данном документе и используемые для образования адъювантов, часто представляют собой по существу чистые фракции; то есть фракции по существу не содержат примесей других материалов. В конкретных аспектах по существу чистая сапониновая фракция может содержать до 40% по массе, до 30% по массе, до 25% по массе, до 20% по массе, до 15% по массе, до 10% по массе, до 7% по массе, до 5% по массе, до 2% по массе, до 1% по массе, до 0,5% по массе или до 0,1% по массе других соединений, таких как другие сапонины или другие адъювантные вещества.[0106] The saponin fractions described herein and used to form adjuvants are often substantially pure fractions; that is, the fractions are substantially free of admixtures of other materials. In particular aspects, the substantially pure saponin fraction may contain up to 40% by weight, up to 30% by weight, up to 25% by weight, up to 20% by weight, up to 15% by weight, up to 10% by weight, up to 7% by weight by weight, up to 5% by weight, up to 2% by weight, up to 1% by weight, up to 0.5% by weight or up to 0.1% by weight of other compounds such as other saponins or other adjuvant substances.

[0107] Другие сапониновые фракции, такие как фракции QS-7 и QS-21, их получение и применение описаны в патентах США №№ 5057540; 6231859; 6352697; 6524584; 6846489; 7776343 и 8173141. Эти фракции можно использовать в описанных в данном документе способах и композициях.[0107] Other saponin fractions, such as fractions QS-7 and QS-21, their preparation and use are described in US patent No. 5057540; 6231859; 6352697; 6524584; 6846489; 7776343 and 8173141. These fractions can be used in the methods and compositions described herein.

Частицы матрицыMatrix particles

[0108] Адъюванты на основе частиц Матрицы, описанные в данном документе, можно использовать для получения HaSMaN или использовать в качестве дискретных частиц из-за их адъювантных свойств. Матрица ИСКОМ содержит по меньшей мере одну сапониновую фракцию и липид. Липид представляет собой по меньшей мере стерол, такой как холестерин. В конкретных аспектах липид представляет собой фосфолипид. Комплексы Матриц ИСКОМ могут также содержать одно или более других иммуномодулирующих (адъювантно-активных) веществ, не обязательно гликозид, и могут быть получены, как описано в EP0436620B1. [0108] Particle-Based Adjuvants The matrices described herein can be used to prepare HaSMaN or used as discrete particles for their adjuvant properties. The ISCOM matrix contains at least one saponin fraction and a lipid. The lipid is at least a sterol, such as cholesterol. In particular aspects, the lipid is a phospholipid. ISCOM Matrix complexes may also contain one or more other immunomodulatory (adjuvant active) substances, not necessarily a glycoside, and can be prepared as described in EP0436620B1.

[0109] Сапониновая фракция может представлять собой фракцию A, фракцию B или фракцию C Quillaja saponaria, полуочищенный препарат Quillaja saponaria, очищенный препарат Quillaja saponaria или любую очищенную субфракцию, например, QA 1-21.[0109] The saponin fraction may be Fraction A, Fraction B, or Fraction C of Quillaja saponaria, a semi-purified Quillaja saponaria preparation, a purified Quillaja saponaria preparation, or any purified subfraction, for example, QA 1-21.

[0110] Матричные частицы могут содержать смеси сапониновых фракций, или частица может быть образована с использованием только одной сапониновой фракции. Композиции, описанные в данном документе, могут содержать несколько частиц, при этом каждая частица содержит только одну сапониновую фракцию. То есть определенные композиции могут содержать один или более различных типов Матриц ИСКОМ, где каждая отдельная частица содержит одну сапониновую фракцию из Quillaja saponaria Molina, причем сапониновая фракция в одной частице отличается от сапониновой фракции в других частицах комплекса. [0110] The matrix particles may contain mixtures of saponin fractions, or the particle may be formed using only one saponin fraction. The compositions described herein may contain multiple particles, with each particle containing only one saponin fraction. That is, certain compositions may contain one or more different types of ISCOM Matrices, where each individual particle contains one saponin fraction from Quillaja saponaria Molina, and the saponin fraction in one particle is different from the saponin fraction in other particles of the complex.

[0111] В конкретных аспектах, один тип сапониновой фракции или неочищенная сапониновая фракция могут быть интегрированы в одну частицу Матрицы ИСКОМ, а другой тип по существу чистой сапониновой фракции или неочищенной сапониновой фракции может быть интегрирован в другую частицу Матрицы ИСКОМ. Композиция или вакцина могут содержать по меньшей мере два типа комплексов или частиц, каждый из которых имеет один тип сапонинов, интегрированных в физически разные частицы.[0111] In particular aspects, one type of saponin fraction or crude saponin fraction may be integrated into one ISCOM Matrix particle, and another type of substantially pure saponin fraction or crude saponin fraction may be integrated into another ISCOM Matrix particle. The composition or vaccine may contain at least two types of complexes or particles, each of which has one type of saponins integrated into physically different particles.

[0112] В композициях могут использоваться смеси частиц Матрицы ИСКОМ, в которых одна сапониновая фракция Quillaja saponaria Molina и другая сапониновая фракция Quillaja saponaria Molina по отдельности включены в различные частицы комплекса Матрицы ИСКОМ и/или частицы комплекса ИСКОМ. [0112] The compositions may use mixtures of ISCOM Matrix particles in which one saponin fraction of Quillaja saponaria Molina and another saponin fraction of Quillaja saponaria Molina are separately included in different ISCOM Matrix complex particles and/or ISCOM complex particles.

[0113] Матрица ИСКОМ, каждая из которых имеет одну сапониновую фракцию, может присутствовать в композиции в любой комбинации % по массе. В конкретных аспектах композиция может содержать от 0,1% до 99,9% по массе, от 5% до 95% по массе, от 10% до 90% по массе, от 15% до 85% по массе, от 20% до 80% по массе, 25%. до 75% по массе, от 30% до 70% по массе, от 35% до 65% по массе, от 40% до 60% по массе, от 45% до 55% по массе, от 40% до 60% по массе или 50% по массе Матрицы ИСКОМ, содержащей первую сапониновую фракцию, а оставшаяся часть состоит из Матрицы ИСКОМ, содержащей другую сапониновую фракцию. В некоторых аспектах оставшаяся часть представляет собой одну или более частиц Матрицы ИСКОМ, содержащих только одну сапониновую фракцию. В других аспектах частица Матрицы ИСКОМ может содержать более одной сапониновой фракции. [0113] The ISCOM matrix, each of which has one saponin fraction, may be present in the composition in any combination of % by weight. In specific aspects, the composition may contain from 0.1% to 99.9% by weight, from 5% to 95% by weight, from 10% to 90% by weight, from 15% to 85% by weight, from 20% to 80% by weight, 25%. up to 75% by weight, from 30% to 70% by weight, from 35% to 65% by weight, from 40% to 60% by weight, from 45% to 55% by weight, from 40% to 60% by weight or 50% by weight of the ISCOM Matrix containing the first saponin fraction, and the remainder consisting of the ISCOM Matrix containing the other saponin fraction. In some aspects, the remainder is one or more ISCOM Matrix particles containing only one saponin fraction. In other aspects, an ISCOM Matrix particle may contain more than one saponin fraction.

[0114] В предпочтительных композициях сапониновая фракция в первой Матрице ИСКОМ представляет собой фракцию A («Матрица c фракцией A»), а сапониновая фракция во второй Матрице ИСКОМ или частице комплекса ИСКОМ представляет собой фракцию C («Матрица с фракцией C»). Таким образом, предпочтительные композиции содержат в качестве адъюванта: адъювант Матрица с фракцией А и адъювант «Матрица с фракцией С». Количество каждой Матрицы в составе может варьироваться. Например, количество Матрицы с фракцией А может составлять около 80% (мас./мас.), около 85% (мас./мас.), около 90% (мас./мас.), около 92% (мас./мас.) или около 95% (мас./мас.), а остальная часть представляет собой Матрицу с фракцией С. Пример подходящей комбинации Матрицы с фракцией A и Матрицы с фракцией C 85:15 (называемой в данном документе Матрицей M или Матрицей M1) может быть получен от Novavax AB, Упсала, Швеция, как Matrix-M™.[0114] In preferred compositions, the saponin fraction in the first ISCOM Matrix is fraction A (“Matrix with Fraction A”) and the saponin fraction in the second ISCOM Matrix or ISCOM complex particle is fraction C (“Matrix with Fraction C”). Thus, preferred compositions contain as adjuvant: Matrix adjuvant with fraction A and adjuvant Matrix with fraction C. The quantity of each Matrix in the composition may vary. For example, the amount of Fraction A Matrix may be about 80% (w/w), about 85% (w/w), about 90% (w/w), about 92% (w/w) .) or about 95% (w/w) and the remainder is Matrix C. Example of a suitable combination of Matrix A and Matrix C 85:15 (referred to herein as Matrix M or Matrix M1) can be obtained from Novavax AB, Uppsala, Sweden, as Matrix-M™.

[0115] В некоторых аспектах Матрица-M может использоваться в качестве адъюванта в композициях, представленных в данном документе. В некоторых аспектах Матрица-M может использоваться в качестве единственного адъюванта в композиции вакцины против гриппа на основе наночастиц, представленной в данном документе. [0115] In some aspects, Matrix-M can be used as an adjuvant in the compositions presented herein. In some aspects, Matrix-M can be used as the sole adjuvant in a nanoparticle influenza vaccine composition provided herein.

[0116] В некоторых вариантах осуществления количество Матрицы-M на вводимую дозу может находиться в диапазоне от около 20 мкг до около 140 мкг; например, около 20 мкг, около 30 мкг, около 40 мкг, около 50 мкг, около 60 мкг, около 70 мкг, около 75 мкг, около 80 мкг, около 90 мкг, около 100 мкг, около 110 мкг, около 120 мкг, около 130 мкг или около 140 мкг. В конкретных аспектах адъювант может присутствовать в количестве от около 50 мкг до около 75 мкг. [0116] In some embodiments, the amount of Matrix-M per administered dose may range from about 20 μg to about 140 μg; for example, about 20 µg, about 30 µg, about 40 µg, about 50 µg, about 60 µg, about 70 µg, about 75 µg, about 80 µg, about 90 µg, about 100 µg, about 110 µg, about 120 µg, about 130 mcg or about 140 mcg. In particular aspects, the adjuvant may be present in an amount from about 50 μg to about 75 μg.

Другие адъювантыOther adjuvants

[0117] Иллюстративные адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (неспецифический стимулятор иммунного ответа, содержащий убитые Mycobacterium tuberculosis), неполные адъюванты Фрейнда и адъювант алюминия гидроксид. Другие адъюванты включают GMCSP, BCG, соединения MDP, такие как thur-MDP и nor-MDP, CGP (MTP-PE), липид A и монофосфориллипид A (MPL), MF-59, RIBI, который содержит три компонента, экстрагированных из бактерии, MPL, димиколат трегалозы (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS) в 2% эмульсии сквален/Tween® 80. В других предпочтительных аспектах используются квасцы, такие как 2% альгидрогель (Al(OH)₃). В некоторых аспектах адъювант может представлять собой олиголамеллярную липидную везикулу; например, Novasomes®. Novasomes® представляют собой олиголамеллярные нефосфолипидные везикулы в диапазоне от около 100 нм до около 500 нм. Они содержат Brij 72, холестерин, олеиновую кислоту и сквален. Было показано, что Novasomes представляют собой эффективный адъювант (см. патенты США №№ 5629021, 6387373 и 4911928.[0117] Exemplary adjuvants include Freund's complete adjuvant (a nonspecific immune response stimulator containing killed Mycobacterium tuberculosis), Freund's incomplete adjuvant, and aluminum hydroxide adjuvant. Other adjuvants include GMCSP, BCG, MDP compounds such as thur-MDP and nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipid A and monophosphoryl lipid A (MPL), MF-59, RIBI which contains three components extracted from the bacterium , MPL, trehalose dimycolate (TDM) and cell wall skeleton (CWS) in 2% squalene/Tween® 80 emulsion. In other preferred aspects, alum is used, such as 2% alhydrogel (Al(OH) ₃ ). In some aspects, the adjuvant may be an oligolamellar lipid vesicle; eg Novasomes®. Novasomes® are oligolamellar non-phospholipid vesicles ranging from about 100 nm to about 500 nm. They contain Brij 72, cholesterol, oleic acid and squalene. Novasomes have been shown to be an effective adjuvant (see US Pat. Nos. 5,629,021, 6,387,373, and 4,911,928.

Введение и дозировка композиций вакцин на основе наночастиц Administration and Dosage of Nanoparticle Vaccine Compositions

[0118] Описанные в данном документе композиции можно вводить системным путем, через слизистую оболочку, трансдермальным путем или непосредственно в конкретную ткань. В контексте данного документа термин «системное введение» включает парентеральные пути введения. В частности, парентеральное введение включает подкожную, внутрибрюшинную, внутривенную, внутримышечную или внутригрудинную инъекцию. Как правило, композиции вводят при помощи внутримышечной инъекции. В конкретных аспектах композиции можно вводить через слизистую оболочку. В контексте данного документа термин «введение через слизистую оболочку» включает пероральное, интраназальное, интравагинальное, интраректальное и интратрахеальное введение. [0118] The compositions described herein can be administered systemically, transmucosally, transdermally, or directly into a specific tissue. As used herein, the term “systemic administration” includes parenteral routes of administration. In particular, parenteral administration includes subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, intramuscular or intrasternal injection. Typically, the compositions are administered by intramuscular injection. In certain aspects, the compositions can be administered transmucosally. As used herein, the term “mucosal administration” includes oral, intranasal, intravaginal, intrarectal and intratracheal administration.

[0119] Композиции можно вводить нуждающемуся в этом субъекту, как правило, человеку. [0119] The compositions can be administered to a subject in need thereof, typically a human.

[0120] Композиции можно вводить по схеме введения однократной дозы или схеме введения многократных доз. Многократные дозы можно использовать в схеме первичной иммунизации или в схеме бустер-иммунизации. В схеме введения многократных доз различные дозы можно вводить одним и тем же или разными путями, например, парентеральный прайм и мукозальный буст, мукозальный буст и парентеральный буст и т.д. В некоторых аспектах последующая бустерная доза вводится через около 2 недели, около 3 недели, около 4 недели, около 5 недель или около 6 недель после предыдущей дозы. [0120] The compositions can be administered in a single-dose schedule or multiple-dose schedule. Multiple doses can be used in a primary immunization schedule or in a booster immunization schedule. In a multiple dose regimen, different doses may be administered by the same or different routes, for example, parenteral prime and mucosal boost, mucosal boost and parenteral boost, etc. In some aspects, the subsequent booster dose is administered about 2 weeks, about 3 weeks, about 4 weeks, about 5 weeks, or about 6 weeks after the previous dose.

[0121] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один штамм из четырех штаммов в композициях четырехвалентных вакцин против гриппа является штаммом типа А. Например, четырехвалентная вакцина против гриппа может содержать три штамма типа A и один штамм типа B. [0121] In some embodiments, at least one of the four strains in the quadrivalent influenza vaccine compositions is a type A strain. For example, a quadrivalent influenza vaccine may contain three type A strains and one type B strain.

[0122] Общее количество НА гриппа в композициях вакцин может находиться в диапазоне от около 25 мкг до около 200 мкг, от около 30 мкг до около 150 мкг, от около 50 мкг до около 100 мкг, от около 45 мкг до около 180 мкг, от около 60 мкг до около 190 мкг или от около 100 мкг до около 200 мкг. В определенных вариантах осуществления количество белка НА гриппа в композиции вакцины может находиться в диапазоне от около 5 мкг на штамм до около 80 мкг на штамм, от около 10 мкг на штамм до около 75 мкг на штамм, от около 15 мкг на штамм до около 70 мкг на штамм, от около 20 мкг на штамм до около 65 мкг на штамм, от около 25 мкг на штамм до около 60 мкг на штамм, от около 30 мкг на штамм до около 55 мкг на штамм, от около 35 мкг на штамм до около 50 мкг на штамм, от около 15 мкг на штамм до около 60 мкг на штамм. Преимущественно композиции демонстрируют стабильность до 9-12 месяцев, так что оставшееся количество, измеренное с помощью ОРИД, составляет значительный процент от начального количества; например, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75% или по меньшей мере около 80% от начального количества. [0122] The total amount of influenza HA in vaccine compositions may range from about 25 μg to about 200 μg, from about 30 μg to about 150 μg, from about 50 μg to about 100 μg, from about 45 μg to about 180 μg, from about 60 μg to about 190 μg or from about 100 μg to about 200 μg. In certain embodiments, the amount of influenza HA protein in the vaccine composition may range from about 5 μg per strain to about 80 μg per strain, from about 10 μg per strain to about 75 μg per strain, from about 15 μg per strain to about 70 µg per strain, from about 20 µg per strain to about 65 µg per strain, from about 25 µg per strain to about 60 µg per strain, from about 30 µg per strain to about 55 µg per strain, from about 35 µg per strain to about 50 μg per strain, from about 15 μg per strain to about 60 μg per strain. Advantageously, the compositions exhibit stability for up to 9-12 months, such that the remaining amount measured by ORID is a significant percentage of the initial amount; for example, at least about 70%, at least about 75%, or at least about 80% of the initial amount.

[0123] В некоторых вариантах осуществления в описании предложены стратегии совместного составления (т.е. предварительно заполненные шприцы или предварительно приготовленная смесь) композиций вакцин против гриппа на основе наночастиц. Типичные стратегии введения вакцины против гриппа, используемыми в данном документе время, относятся к составам свежеприготовленных смесей. То есть композиции вакцин и адъюванты хранятся отдельно и смешиваются перед введением. Стратегии предварительного смешивания, совместного приготовления или предварительно заполнения шприцев для вакцины против гриппа менее распространены из-за опасений по поводу стабильности антигенов гриппа и их последующих иммуногенных свойств. В данном описании предложены композиции вакцин против гриппа на основе наночастиц, которые можно предварительно смешивать и хранить. Описанные стратегии вакцинации и получения составов могут повысить эффективность вакцинации и могут снизить риски ошибок при смешивании у постели больного, сохраняя при этом общую безопасность и иммуногенность. [0123] In some embodiments, the disclosure provides co-formulation strategies (i.e., prefilled syringes or premix) of nanoparticle-based influenza vaccine compositions. Typical influenza vaccine administration strategies used herein refer to freshly prepared mixture formulations. That is, vaccine compositions and adjuvants are stored separately and mixed before administration. Strategies of premixing, co-formulation, or prefilling syringes for influenza vaccine are less common due to concerns about the stability of influenza antigens and their subsequent immunogenic properties. Disclosed herein are nanoparticle-based influenza vaccine compositions that can be premixed and stored. The vaccination and formulation strategies described may improve vaccination efficacy and may reduce the risks of bedside mixing errors while maintaining overall safety and immunogenicity.

Иммуногенность вакцины против гриппа на основе наночастицImmunogenicity of nanoparticle-based influenza vaccine

[0124] В данном описании предложены способы предотвращения инфекции гриппа. Иммуногенность вакцин против гриппа на основе наночастиц, описанных в данном документе, может быть определена с использованием подходящих подходов, включая выполнение анализов HAI или путем измерения нейтрализующих антител. В некоторых вариантах осуществления иммуногенность вакцин против гриппа на основе наночастиц можно сравнить с коммерчески доступной композицией вакцины против гриппа. В контексте данного документа термин «коммерчески доступная композиция вакцины против гриппа» может представлять собой любые композиции вакцин против гриппа, которые доступны для применения в медицинских целях. Например, коммерчески доступная композиция вакцины против гриппа может быть составлена для инъекции трехвалентной или четырехвалентной композиции. В некоторых аспектах состав для инъекции может содержать инактивированную форму вируса. В другом примере коммерчески доступная композиция вакцины против гриппа может быть составлена для назального спрея. В некоторых аспектах состав для назального спрея может содержать аттенуированные или ослабленные формы вируса.[0124] Disclosed herein are methods for preventing influenza infection. The immunogenicity of the nanoparticle-based influenza vaccines described herein can be determined using suitable approaches, including performing HAI assays or by measuring neutralizing antibodies. In some embodiments, the immunogenicity of nanoparticle-based influenza vaccines can be compared to a commercially available influenza vaccine composition. As used herein, the term “commercially available influenza vaccine composition” can be any influenza vaccine composition that is available for medical use. For example, a commercially available influenza vaccine composition may be formulated for injection as a trivalent or quadrivalent composition. In some aspects, the injection composition may contain an inactivated form of the virus. In another example, a commercially available influenza vaccine composition may be formulated for a nasal spray. In some aspects, the nasal spray formulation may contain attenuated or weakened forms of the virus.

[0125] Композиция, описанная в данном документе, обеспечивает не худший иммунный ответ по сравнению с другими вакцинами, в частности, коммерчески доступными вакцинами, включая четырехвалентную Афлюрию, четырехвалентную Флюарикс, четырехвалентную вакцину ФлюЛавал, четырехвалентную Флюзон, четырехвалентную Флюцельвакс, интрадермальную четырехвалентную Флюзон, Афлюрию, Флювирин, Флюад, Флюзон с высокой дозой, четырехвалентую Флюблок, Флюблок и четырехвалентную ФлюМист. [0125] The composition described herein provides a non-inferior immune response compared to other vaccines, particularly commercially available vaccines, including Afluria quadrivalent, Fluarix quadrivalent, FluLaval quadrivalent, Fluzon quadrivalent, Flucelvax quadrivalent, Fluzone intradermal quadrivalent, Afluria , Fluvirin, Fluad, Fluzon with a high dose, tetravalent Flublok, Flublok and tetravalent FluMist.

[0126] Преимущественно композиции, описанные в данном документе, индуцируют нейтрализующие антитела, которые связываются со штаммом, который дрейфовал (т.е. претерпел небольшую мутацию) относительно последовательности, используемой в вирусе в пределах того же подтипа гриппа. В конкретных аспектах один, два, три, четыре или все штаммы, используемые в композициях, индуцируют нейтрализующие антитела против одного дрейфующего штамма, против двух дрейфующих штаммов, против трех дрейфующих штаммов, против четырех дрейфующих штаммов или против пяти дрейфующих штаммов. Не ограничиваясь теорией, считается, что присутствие адъюванта Матрица в композициях способствует экспозиции дополнительных антигенов, обеспечивая расширенную защиту от дрейфующего штамма. Аналогичным образом, образование HaSMaN после инкубации с адъювантом Матрица с белками НА подтипа A, как полагают, вносит вклад в этот процесс. [0126] Advantageously, the compositions described herein induce neutralizing antibodies that bind to a strain that has drifted (ie, has undergone a slight mutation) relative to a sequence used in a virus within the same influenza subtype. In particular aspects, one, two, three, four, or all of the strains used in the compositions induce neutralizing antibodies against one drift strain, against two drift strains, against three drift strains, against four drift strains, or against five drift strains. Without being limited by theory, it is believed that the presence of the Matrix adjuvant in the compositions promotes exposure to additional antigens, providing enhanced protection against strain drift. Likewise, the formation of HaSMaN after incubation with Matrix adjuvant with HA subtype A proteins is believed to contribute to this process.

[0127] Важно отметить, что HaSMaN по меньшей мере так же иммуногенны, как и наночастицы с детергентным ядром. Например, как показано в Таблице 6 ниже, титр HAI против A/Michigan на 35-е сутки для 1,5 мкг составов предварительно приготовленных смесей составлял около 538 при 25°C, тогда как титр HAI против A/Michigan для 1,5 мкг составов свежеприготовленных смесей составлял около 453 при 25°C. В другом примере, приведенном в Таблице 8, титр HAI против A/Hong Kong на 35-е сутки для 1,5 мкг составов предварительно приготовленных смесей составлял около 538 при 25°C, тогда как титр HAI против A/Michigan для 1,5 мкг составов свежеприготовленных смесей составлял около 494 при -60°C. Сходная иммуногенность среди составов предварительно приготовленных смесей и составов свежеприготовленных смесей также предполагает, что составы предварительно приготовленных смесей стабильны при комнатной температуре. Кроме того, данные составы предварительно приготовленных смесей, хранящиеся при комнатной температуре, неожиданно могут иметь аналогичную иммуногенность по сравнению с составами свежеприготовленных смесей, которые инкубируются при -60°C. [0127] It is important to note that HaSMaN is at least as immunogenic as detergent core nanoparticles. For example, as shown in Table 6 below, the anti-A/Michigan HAI titer at day 35 for 1.5 μg premix formulations was approximately 538 at 25°C, whereas the anti-A/Michigan HAI titer for 1.5 μg compositions of freshly prepared mixtures was about 453 at 25°C. In another example shown in Table 8, the anti-A/Hong Kong HAI titer at day 35 for 1.5 μg premix formulations was about 538 at 25°C, while the anti-A/Michigan HAI titer for 1.5 The μg compositions of freshly prepared mixtures were about 494 at -60°C. Similar immunogenicity among premix formulations and freshly prepared formulas also suggests that premix formulations are stable at room temperature. In addition, these premixed formulations stored at room temperature may unexpectedly have similar immunogenicity compared to freshly prepared admixture formulations that are incubated at -60°C.

КонтейнерыContainers

[0128] Для хранения и транспортировки составов предварительно приготовленных смесей можно использовать различные контейнеры, включая шприцы для одноразового введения и пластиковые ампулы. В некоторых случаях пластиковые ампулы могут быть изготовлены с использованием технологии или способа изготовления раздув-заполнение-уплотнение. В общем, способ изготовления раздув-заполнение-уплотнение (BFS) включает экструзию пластикового материала (например, смолы) с образованием заготовки, которую затем помещают в форму и разрезают по размеру. Затем используют заполняющую иглу или оправку для надувания пластика, что, в свою очередь, приводит к получению полой ампулы, которая по существу соответствует форме формованного изделия. После надувания в ампулу можно ввести желаемый объем жидкости, можно удалить иглу для наполнения или оправку и запечатать ампулу. Соответственно, BFS может быть автоматизированным процессом, который может выполняться в стерильной среде без прямого вмешательства человека.[0128] A variety of containers can be used to store and transport premixed formulations, including single-use syringes and plastic vials. In some cases, plastic ampoules may be manufactured using a blow-fill-seal technology or manufacturing method. In general, the blow-fill-seal (BFS) manufacturing method involves extruding a plastic material (eg, resin) to form a preform, which is then placed into a mold and cut to size. A filling needle or mandrel is then used to inflate the plastic, which in turn results in a hollow ampoule that substantially conforms to the shape of the molded article. Once inflated, the ampoule can be filled with the desired volume of liquid, the filling needle or mandrel can be removed, and the ampoule can be sealed. Accordingly, BFS can be an automated process that can be performed in a sterile environment without direct human intervention.

[0129] В некоторых случаях способность производить стерильные ампулы, содержащие желаемую жидкость, в асептических условиях, может сделать ампулы, изготовленные при помощи BFS, особенно подходящими для фармацевтической промышленности. Однако технология BFS не совместима со всеми фармацевтическими жидкостями, продуктами и т. д. Например, некоторые известные методы изготовления BFS включают доставку жидкости или продукта в ампулу, пока пластик еще относительно горячий, что может привести к неблагоприятным последствиям для чувствительных к температуре жидкости и/или продуктам, таким как вакцины, биопрепараты и т. д. Однако достижения в технологии охлаждения BFS увеличили разнообразие подходящих продуктов, жидкостей и т.д., позволяя хранить некоторые вакцины, биопрепараты и/или другие чувствительные к температуре фармацевтические препараты в ампулах BFS.[0129] In some cases, the ability to produce sterile ampoules containing the desired liquid under aseptic conditions may make ampoules made using BFS particularly suitable for the pharmaceutical industry. However, BFS technology is not compatible with all pharmaceutical liquids, products, etc. For example, some known BFS manufacturing methods involve delivering the liquid or product into the ampoule while the plastic is still relatively hot, which can lead to adverse effects for temperature-sensitive liquids and/or or products such as vaccines, biologics, etc. However, advances in BFS refrigeration technology have increased the variety of suitable products, liquids, etc., allowing some vaccines, biologics, and/or other temperature-sensitive pharmaceuticals to be stored in BFS ampoules.

[0130] В некоторых случаях ампула BFS может иметь размер, форму и/или конфигурацию, которая по меньшей мере частично зависит от желаемого применения и/или желаемой фармацевтической жидкости или дозировки, для содержания которых сконфигурирована ампула. Например, некоторые известные ампулы BFS могут включать прокалываемый верх, откручивающийся верх, верхнюю часть, включающую конус или канюлю Люэра, и/или тому подобное. Некоторые известные ампулы BFS могут иметь размер и/или форму в зависимости от объема жидкости или дозировки, предназначенной для размещения в них. Кроме того, некоторые известные ампулы BFS могут быть изготовлены в виде стрипа из нескольких временно соединенных ампул, что может повысить эффективность производства, упаковки и/или хранения, и/или т.п.[0130] In some cases, the BFS ampoule may have a size, shape and/or configuration that is at least partially dependent on the desired application and/or the desired pharmaceutical liquid or dosage that the ampoule is configured to contain. For example, some known BFS ampoules may include a pierceable top, a screw-on top, a top including a cone or a Luer cannula, and/or the like. Some known BFS ampoules may be sized and/or shaped depending on the volume of liquid or dosage intended to be contained therein. In addition, some known BFS ampoules can be manufactured in the form of a strip of several ampoules temporarily connected, which can improve the efficiency of production, packaging and/or storage, and/or the like.

[0131] Все патенты, заявки на патенты, ссылки и журнальные статьи, цитируемые в этом описании, явным образом включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.[0131] All patents, patent applications, references, and journal articles cited in this specification are expressly incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1: Очистка наночастиц с HAExample 1: Purification of Nanoparticles with HA

[0132] Белки НА из одного штамма экспрессировались в клетках Sf9 с помощью бакуловирусной инфекции и позволяли расти в течение 48-96 часов перед сбором. Затем белки НА были собраны путем экстракции детергентом и во время очистки превращены в наночастицы с детергентным ядром. Вкратце, колонку TMAE предварительно уравновешивали буфером, состоящим из 25 мМ Трис, pH 8,0, 1,5 М хлорида натрия, 0,02% NP9. Образец загружали со скоростью ≤ 90 см/час (время пребывания 24 мин), а затем промывали буфером EQ (25 мМ Трис, pH 8,0, 50 мМ хлорид натрия или 81 мМ хлорид натрия (штаммы A, B, соответственно), 0,02% NP-9). Затем очищенный образец элюировали 1,5 CV буфера EQ . [0132] HA proteins from one strain were expressed in Sf9 cells by baculovirus infection and allowed to grow for 48-96 hours before harvesting. The HA proteins were then collected by detergent extraction and converted into nanoparticles with a detergent core during purification. Briefly, the TMAE column was pre-equilibrated with a buffer consisting of 25 mM Tris, pH 8.0, 1.5 M sodium chloride, 0.02% NP9. The sample was loaded at ≤ 90 cm/h (residence time 24 min) and then washed with EQ buffer (25 mM Tris, pH 8.0, 50 mM sodium chloride or 81 mM sodium chloride (strains A, B, respectively), 0 .02% NP-9). The purified sample was then eluted with 1.5 CV EQ buffer.

[0133] Для штаммов A проводили нанофильтрацию продукта из колонки TMAE с последующим нанесением на колонку с лектином чечевицы для аффинной хроматографии, предварительно уравновешенную буфером, состоящим из 25 мМ Трис, 50 мМ и 107 мМ хлорида натрия (для штаммов A и B, соответственно). 0,02% (мас./об.) NP-9, pH 8,0 для 3CV (скорость потока: 150 см/ч). Образец загружали с временем удерживания 4 мин. После загрузки выполняли промывку 3CV уравновешивающего буфера лектина чечевицы. Продукт элюировали 25 мМ фосфата натрия, pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия, 500 мМ метил-α-D-маннопиранозида, 0,01% (мас./об.) PS80, pH 7,5, собирая 2CV при 75 см/час и 8-минутном временем удерживания. [0133] For strains A, the product was nanofiltrated from a TMAE column followed by application to a lentil lectin affinity chromatography column pre-equilibrated with a buffer consisting of 25 mM Tris, 50 mM and 107 mM sodium chloride (for strains A and B, respectively) . 0.02% (w/v) NP-9, pH 8.0 for 3CV (flow rate: 150 cm/h). The sample was loaded with a retention time of 4 min. After loading, a 3CV lentil lectin equilibration buffer wash was performed. The product was eluted with 25 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM sodium chloride, 500 mM methyl-α-D-mannopyranoside, 0.01% (w/v) PS80, pH 7.5, collecting 2CV at 75 cm /hour and 8-minute retention time.

[0134] Для штаммов B продукт колонки TMAE дополнительно очищали с использованием колонки Capto Blue. Колонку уравновешивали 25 мМ Трис, pH 8,0, 107 мМ хлорида натрия, 0,02% (мас./об.) NP-9 с последующей загрузкой продукта TMAE со скоростью потока 225 см/час при времени удерживания 4 минуты и сбором 2CV уравновешивающего буфера. Нанофильтрацию продукта из колонки Capto Blue проводили с последующим нанесением на колонку для аффинной хроматографии на лектине чечевицы, предварительно уравновешенную буфером, состоящим из 25 мМ Трис, 50 мМ и 107 мМ хлорида натрия (для штаммов A и B, соответственно), 0,02% (мас./об.) NP-9, pH 8,0 для 3CV (скорость потока: 150 см/ч). Образец загружали с временем удерживания 4 мин. После загрузки выполняли промывку 3CV уравновешивающего буфера лектина чечевицы. Продукт элюировали 25 мМ фосфата натрия, pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия, 500 мМ метил-α-D-маннопиранозида, 0,01% (мас./об.) PS80, pH 7,5, собирая 2CV при 75 см/час и 8-минутном временем удерживания.[0134] For strains B, the TMAE column product was further purified using a Capto Blue column. The column was equilibrated with 25 mM Tris, pH 8.0, 107 mM sodium chloride, 0.02% (w/v) NP-9 followed by loading of TMAE product at a flow rate of 225 cm/h with a retention time of 4 minutes and collection of 2CV balancing buffer. Nanofiltration of the product from a Capto Blue column was carried out followed by application to a lentil lectin affinity chromatography column pre-equilibrated with a buffer consisting of 25 mM Tris, 50 mM and 107 mM sodium chloride (for strains A and B, respectively), 0.02% (w/v) NP-9, pH 8.0 for 3CV (flow rate: 150 cm/h). The sample was loaded with a retention time of 4 min. After loading, a 3CV lentil lectin equilibration buffer wash was performed. The product was eluted with 25 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM sodium chloride, 500 mM methyl-α-D-mannopyranoside, 0.01% (w/v) PS80, pH 7.5, collecting 2CV at 75 cm /hour and 8-minute retention time.

[0135] Продукты лектина чечевицы как для штаммов A, так и для штаммов B концентрировали до целевой концентрации НА, а затем заменяли буфер на буфер для конечной композиции лекарственного вещества. Концентрирование и замену буфера выполняли при помощи ультрафильтрации и диафильтрации.[0135] The lentil lectin products for both strains A and B were concentrated to the target HA concentration and then buffer exchanged for the final drug formulation. Concentration and buffer exchange were performed using ultrafiltration and diafiltration.

Пример 2 – Анализ методом ДСН-ПААГ-электрофореза Example 2 – SDS-PAGE analysis

[0136] Для оценки стабильности совместного составления Quad-NIV и адъюванта Матрица ИСКОМ (Матрица M) в предварительно заполненных шприцах и для понимания физических, химических и биологических свойств такой вакцины были приготовлены составы, как показано в Таблице 1 ниже. Тестируемые композиции вакцин были разделены на три группы: (1) стеклянные флаконы со свежеприготовленной смесью, содержащие только антигены HA, (2) предварительно заполненные шприцы (ПЗШ), содержащие антигены HA вакцины, составленные вместе с Матрицей M1, и (3) ПЗШ, содержащие антигены HA вакцины. Стеклянные флаконы для свежеприготовленной смеси и ПЗШ были приобретены коммерческим путем (Schott). [0136] To evaluate the stability of co-formulation of Quad-NIV and the adjuvant ISCOM Matrix (Matrix M) in prefilled syringes and to understand the physical, chemical and biological properties of such a vaccine, formulations were prepared as shown in Table 1 below. The vaccine compositions tested were divided into three groups: (1) freshly mixed glass vials containing only HA antigens, (2) prefilled syringes (PFS) containing vaccine HA antigens formulated together with the M1 Matrix, and (3) PFS, containing HA antigens vaccines. Glass vials for the freshly prepared mixture and PZS were purchased commercially (Schott).

Таблица 1. Сравнительное исследование свежеприготовленных составов флаконов и составов ПЗШ Table 1. Comparative study of freshly prepared vial formulations and PZS formulations

[0137] На Фиг. 2 показаны уменьшенные изображения ДСН-ПААГ геля, демонстрирующие полосы белков или из флаконов со свежеприготовленной смесью, хранящихся при 4°C; или из предварительно заполненных шприцев (ПЗШ), с Матрицей M1 или без нее, хранящиеся при 4°C. Во все тестируемые моменты времени электрофореграмма белков из ПЗШ была подобна электрофореграмме белков из флаконов со свежеприготовленной смесью, что указывает на то, что белки в ПЗШ были по меньшей мере такими же стабильными, как белки в флаконах со свежеприготовленной смесью. Присутствие или отсутствие Матрицы M не изменило электрофореграммы среди групп ПЗШ, равно как и хранение в течение 6 или даже 12 месяцев. Группы флаконов со свежеприготовленной смесью с LD и группы ПЗШ с LD также имели неизменно похожие электрофореграммы при 4°C, хотя в группах LD были более слабые электрофореграммы по сравнению с их когортами HD в тот же момент времени.[0137] In FIG. Figure 2 shows reduced-scale images of an SDS-PAGE gel showing protein bands or from vials of freshly prepared mixture stored at 4°C; or from prefilled syringes (PFS), with or without M1 Matrix, stored at 4°C. At all time points tested, the electropherogram of proteins from the PZS was similar to that of the proteins from the freshly prepared bottles, indicating that the proteins in the PZS were at least as stable as the proteins in the freshly prepared bottles. The presence or absence of Matrix M did not change the electropherograms among the PZS groups, nor did storage for 6 or even 12 months. The freshly prepared bottle groups with LD and the PZS groups with LD also had consistently similar electropherograms at 4°C, although the LD groups had weaker electropherograms compared to their HD cohorts at the same time point.

[0138] На Фиг. 3 показаны электрофореграммы белков из ПЗШ или флаконов со свежеприготовленной смесью, хранящихся при 4°C, исследованных на невосстановленном ДСН-ПААГ геле и восстановленном ДСН-ПААГ геле. Результаты демонстрируют, что электрофореграмма белка была одинаковой для всех групп даже в невосстановленном геле, что дополнительно демонстрирует, что белки в ПЗШ были аналогичны белкам в флаконах со свежеприготовленной смесью в нулевой момент времени.[0138] In FIG. Figure 3 shows electropherograms of proteins from PZS or vials with a freshly prepared mixture stored at 4°C, examined on an unreduced SDS-PAGE gel and a reduced SDS-PAGE gel. The results demonstrate that the protein electropherogram was similar for all groups even in the unreconstituted gel, further demonstrating that the proteins in the PZS were similar to those in the freshly prepared bottles at time zero.

[0139] Кроме того, стабильность белка для групп флаконов со свежеприготовленной смесью; и группы ПЗШ с или без Матрицы M, хранящиеся при 4°C или 25°C в течение 3 месяцев, были исследованы с использованием анализов методом ДСН-ПААГ-электрофореза в невосстанавливающих условиях (Фиг. 4). Полосы с более высокой молекулярной массой, как правило, появлялись в некоторых группах, которые хранили при более высокой температуре (25°C), по сравнению с группами, которые хранили при более низкой температуре (например, 4°C). Более сильную экспрессию белков наблюдали также в группах, хранящихся при более низких температурах. Результаты демонстрируют, что белки в ПЗШ были по меньшей мере такими же стабильными, как белки во флаконах со свежеприготовленной смесью, даже после длительного периода хранения, такого как хранение в течение 3 месяцев. [0139] In addition, protein stability for groups of freshly prepared bottles; and PZH groups with or without M Matrices stored at 4°C or 25°C for 3 months were examined using SDS-PAGE assays under non-reducing conditions (Figure 4). Higher molecular weight bands tended to appear in some groups that were stored at higher temperatures (25°C) compared to groups that were stored at lower temperatures (eg, 4°C). Stronger protein expression was also observed in groups stored at lower temperatures. The results demonstrate that the proteins in the PZS were at least as stable as the proteins in freshly prepared formula vials, even after a long storage period, such as storage for 3 months.

[0140] Эти данные демонстрируют, что стратегии совместного составления вакцин в ПЗШ могут быть осуществимы в отношении стабильности. Допустимо хранение совместно составленных в ПЗШ вакцин как при 4°C, так и при 25°C. Присутствие Матрицы M1 и продолжительность хранения (например, 3 месяца) не повлияли отрицательно на стабильность составов вакцин, подтверждая, что образование HaSMaN не влияет на стабильность белка в течение продолжительных периодов времени. [0140] These data demonstrate that vaccine co-formulation strategies in PZS can be feasible with respect to stability. It is permissible to store vaccines combined in PZH at both 4°C and 25°C. The presence of Matrix M1 and storage duration (e.g., 3 months) did not negatively impact the stability of the vaccine formulations, confirming that HaSMaN formation does not affect protein stability over extended periods of time.

Пример 3 – анализ методом ОРИД Example 3 – analysis using the ORID method

[0141] Стабильность белка тестировали путем проведения анализа методом ОРИД для различных штаммов гриппа A и штаммов B, составленных в группах ПЗШ. Анализ методом ОРИД выполняли при 2-8°C (например, 4°C) при Т = 0, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев; и при 25°C при Т = 0, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. На Фиг. 5 и 6 представлены данные ОРИД для 120 мкг/мл составов ПЗШ, содержащих A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane или B/Phuket, с или без 100 мкг/мл Матрицы M при 2-8°C (Фиг. 5) и 25°C (Фиг. 6). [0141] Protein stability was tested by performing the ORID assay on various influenza A strains and B strains composed in PZH groups. The ORID assay was performed at 2–8°C (eg, 4°C) at T = 0, 2 weeks, 1 month, 3 months, 6 months, 9 months, and 12 months; and at 25°C at T = 0, 2 weeks, 1 month, 3 months and 6 months. In FIG. 5 and 6 present ORID data for 120 µg/ml PZH formulations containing A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane or B/Phuket, with or without 100 µg/ml Matrix M at 2-8°C (Fig. 5) and 25°C (Fig. 6).

[0142] Результаты иммунореактивности ОРИД ПЗШ с Матрицей M были подобны или лучше результатов иммунореактивности ОРИД ПЗШ без Матрицы M. Данные демонстрируют, что общая тенденция иммунореактивности во времени при хранении при 25°C заметно не отличается от результатов, наблюдаемых при 4°C. Отсутствие заметных изменений в иммунореактивности вакцины указывает на то, что составы Quad-NIV ПЗШ стабильны при различных температурах в течение по меньшей мере до 6 месяцев. Стабильность составов Quad-NIV ПЗШ при комнатной температуре (25°C) обеспечивает преимущественно экономически эффективные стратегии вакцинации, поскольку составы ПЗШ не нуждаются в длительном охлаждении или ограничиваются транспортировкой при низких температурах. Эти данные также демонстрируют, что массовое производство стабильных предварительно приготовленных вакцин (содержащих антигены гриппа и Матрицу M) задолго до вакцинации в клиниках является целесообразным подходом. [0142] The immunoreactivity results for ORID PZS with Matrix M were similar to or better than the immunoreactivity results for ORID PZS without Matrix M. The data demonstrate that the overall trend of immunoreactivity over time when stored at 25°C is not noticeably different from the results observed at 4°C. The lack of noticeable changes in vaccine immunoreactivity indicates that Quad-NIV PZH formulations are stable at various temperatures for at least up to 6 months. The stability of Quad-NIV PZS formulations at room temperature (25°C) provides advantageous cost-effective vaccination strategies because PZS formulations do not require prolonged refrigeration or are limited to transportation at low temperatures. These data also demonstrate that mass production of stable preformed vaccines (containing influenza antigens and Matrix M) well before clinic vaccination is a viable approach.

[0143] Пример 4 - Сравнительное исследование иммуногенности вакцины против гриппа Quad-NIV и коммерческой вакцины против гриппа у хорьков[0143] Example 4 - Comparative Immunogenicity Study of Quad-NIV Influenza Vaccine and Commercial Influenza Vaccine in Ferrets

[0144] Были проведены исследования на хорьках для сравнения иммуногенности при различных стратегиях получения тестируемых вакцин (свежеприготовленных и совместно составленных) с коммерчески доступными вакцинами против гриппа.[0144] Ferret studies were conducted to compare the immunogenicity of various test vaccine strategies (freshly formulated and coformulated) with commercially available influenza vaccines.

Таблица 2. Сравнительное исследование иммуногенности вакцины Quad-NIV и коммерческой вакцины на хорьках Table 2. Comparative Immunogenicity Study of Quad-NIV Vaccine and Commercial Vaccine in Ferrets

^*- Доза каждого штамма B составляла 90 мкг; и доза каждого штамма A составляла 60 мкг. ^* - The dose of each strain B was 90 μg; and the dose of each strain A was 60 μg.

^№- Результаты, представленные на Фиг. 7-10, соответствуют 42 суткам. ^No. - Results presented in Fig. 7-10, correspond to 42 days.

[0145] Для составов Quad-NIV использовали штаммы A/Michigan/45/2015-H1N1, штаммы A/Hong Kong/4801/2014-H3N2, штаммы B/Brisbane/60/2008, штаммы B/Phuket/3073/2013. Для Флюзон с HD (TIV; Sanofi Pasteur) использовали A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2 и B/Brisbane/60/2008. Для Флюзон с HD (QIV; Sanofi Pasteur) использовали A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2, B/Brisbane/60/2008 и B/Phuket/3073/2013. Для Флюад (TIV; Seqirus) использовали A/Singapore/GP1908/2015 (подобный A/Michigan/45/2015-H1N1), A/HongKong/4801/2014-H3N2 и B/Brisbane/60/2008. Для Флюблок (QIV; Protein Sciences) использовали A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2, B/Brisbane/60/2008 и B/Phuket/3073/2013. Для Флюцельвакс (QIV; Seqirus) использовались A/Singapore/GP1908/2015 (подобный A/Michigan/45/2015-H1N1), A/Singapore/GP2050/2015 (подобный A/Hong Kong/4801/2014 - H3N2), B/Hong Kong/259/2010 (подобный B/Brisbane/60/08) и B/Utah/9/2014 (подобный B/Phuket/3073/2013). [0145] For the Quad-NIV formulations, strains A/Michigan/45/2015-H1N1, strains A/Hong Kong/4801/2014-H3N2, strains B/Brisbane/60/2008, strains B/Phuket/3073/2013 were used. For Fluzone with HD (TIV; Sanofi Pasteur), A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2, and B/Brisbane/60/2008 were used. For Fluzone with HD (QIV; Sanofi Pasteur), A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2, B/Brisbane/60/2008, and B/Phuket/3073/2013 were used. For Fluad (TIV; Seqirus), A/Singapore/GP1908/2015 (similar to A/Michigan/45/2015-H1N1), A/HongKong/4801/2014-H3N2 and B/Brisbane/60/2008 were used. For Flublok (QIV; Protein Sciences), A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2, B/Brisbane/60/2008, and B/Phuket/3073/2013 were used. For Flucelvax (QIV; Seqirus) A/Singapore/GP1908/2015 (similar to A/Michigan/45/2015-H1N1), A/Singapore/GP2050/2015 (similar to A/Hong Kong/4801/2014 - H3N2), B were used /Hong Kong/259/2010 (same as B/Brisbane/60/08) and B/Utah/9/2014 (same as B/Phuket/3073/2013).

[0146] Хорьков иммунизировали на 0-е сутки и на 21-е сутки исследования. Кровь отбирали за сутки до начала исследования, на 21-е и 42-е сутки исследования. Анализ HAI проводили с использованием красных кровяных телец человека для оценки иммуногенности тестируемых составов у хорьков. Протоколы экспериментов известны в данной области техники и обсуждаются выше. Следующие реагенты HAI были использованы в анализе в качестве эталонных антигенов гриппа в формах VLP: (1) A/Michigan 45/15 (BV № 001), (2) A/HongKong/4801/14 (BV № 1808), (3) B/Bris/60/08 (BV № 714), (4) B/Phuket/3073/13 (BV № 1659), (5) A/Switzerland/9715293/13 (BV № 1660), (6 ) A/Singapore/2016 (BV № 2165), (7) A/Texas/50/2012 (BV № 1324), (8) A/Victoria/36/11 (BV № 1577) и (9) A/Perth/16/09. Способы создания VLP антигена гриппа описаны, например, в заявке на патент США № 15/901000, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. [0146] Ferrets were immunized on day 0 and day 21 of the study. Blood was collected the day before the start of the study, on the 21st and 42nd days of the study. The HAI assay was performed using human red blood cells to evaluate the immunogenicity of test formulations in ferrets. Experimental protocols are known in the art and are discussed above. The following HAI reagents were used in the assay as reference influenza VLP antigens: (1) A/Michigan 45/15 (BV #001), (2) A/HongKong/4801/14 (BV #1808), (3) B/Bris/60/08 (BV No. 714), (4) B/Phuket/3073/13 (BV No. 1659), (5) A/Switzerland/9715293/13 (BV No. 1660), (6) A/ Singapore/2016 (BV No. 2165), (7) A/Texas/50/2012 (BV No. 1324), (8) A/Victoria/36/11 (BV No. 1577) and (9) A/Perth/16/ 09. Methods for creating influenza antigen VLPs are described, for example, in US Patent Application No. 15/901000, which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes.

[0147] Все коммерчески доступные вакцины против гриппа имели более низкие титры HAI по сравнению со всеми составами Quad-NIV в присутствии Матрицы M, независимо от схем применения, типов составов (т.е. свежеприготовленных и совместных составов). См. Фиг. 7 (A/Hong Kong/4801-2014), Фиг. 8 (A/Michigan/45/2015), Фиг. 9 (B/Brisbane/60/2008) и Фиг. 10 (B/Phuket/3073/2013). [0147] All commercially available influenza vaccines had lower HAI titers compared to all Quad-NIV formulations in the presence of Matrix M, regardless of dosage regimens, formulation types (i.e., fresh and co-formulations). See FIG. 7 (A/Hong Kong/4801-2014), Fig. 8 (A/Michigan/45/2015), Fig. 9 (B/Brisbane/60/2008) and Fig. 10 (B/Phuket/3073/2013).

[0148] Таким образом, составы Quad-NIV могут вызывать более устойчивые иммуногенные эффекты у хорьков для всех тестируемых штаммов гриппа, описанных в данном документе, по сравнению с коммерческими вакцинами, в то время как различия более значительны при наличии Матрицы M в составах. Совместные составы Quad-NIV (предварительно приготовленные), содержащие HaSMaN, обладали сходной иммуногенностью по сравнению с составами Quad-NIV у постели больного. Среди групп совместных составов, составы, хранящиеся при 4°C и 25°C, как правило, имели очень похожую иммуногенность. [0148] Thus, Quad-NIV formulations may produce more consistent immunogenic effects in ferrets for all influenza strains tested herein compared to commercial vaccines, while the differences are more significant when Matrix M is present in the formulations. Quad-NIV co-formulations (preformulated) containing HaSMaN had similar immunogenicity compared to bedside Quad-NIV formulations. Among the coformulation groups, formulations stored at 4°C and 25°C tended to have very similar immunogenicity.

Пример 5 - Оценка иммуногенности четырехвалентных вакцин против гриппа на основе наночастиц, хранящихся при 4°CExample 5 - Evaluation of the immunogenicity of quadrivalent influenza vaccines based on nanoparticles stored at 4°C

[0149] В таблице 3 приведен дизайн исследования на мышах для изучения иммуногенности и стабильности предварительно приготовленных в ПЗШ составов вакцин и свежеприготовленных вакцин. Составы ПЗШ хранили при 4°C в течение 3 месяцев. Для предварительно приготовленных вакцин вирусные антигены хранили при -60°C в течение 3 месяцев и смешивали с адъювантом Матрица M непосредственно перед введением. [0149] Table 3 shows the mouse study design to examine the immunogenicity and stability of PZS preformulated vaccines and freshly prepared vaccines. PZS formulations were stored at 4°C for 3 months. For preformed vaccines, viral antigens were stored at -60°C for 3 months and mixed with Matrix M adjuvant immediately before administration.

[0150] Таблица 3. Составы Quad-NIV для оценки иммуногенности [0150] Table 3. Quad-NIV Formulations for Immunogenicity Assessment

[0151] Иммунизации проводили внутримышечно на 0-е сутки и 21-е сутки. Образцы крови отбирали за сутки до начала исследования и повторно на 42-е сутки исследования (или 21-е сутки после второй иммунизации) для анализа иммуногенности. Иммуногенность определяли на основании ответов ингибирования гемагглютинации (HAI) на следующие штаммы гриппа A и B: (1) A /Hong Kong/4801/2014; (2) A/Michigan/45/2015; (3) B/Brisbane/60/2008; и (4) B/Phuket/3073/2013. HAI измеряли, как описано в Руководстве по лабораторной диагностике и вирусологическому надзору за гриппом (Всемирная организация здравоохранения 2011 г., дата обращения 15.02.2018 г., по адресу: www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/manual_diagnosis_surveillance_influenza/en/, которое включено в это описание посредством ссылки. [0151] Immunizations were performed intramuscularly on days 0 and 21. Blood samples were collected the day before the start of the study and again on the 42nd day of the study (or 21st day after the second immunization) for immunogenicity analysis. Immunogenicity was determined based on hemagglutination inhibition (HAI) responses to the following influenza A and B strains: (1) A/Hong Kong/4801/2014; (2) A/Michigan/45/2015; (3) B/Brisbane/60/2008; and (4) B/Phuket/3073/2013. HAI was measured as described in the Manual of Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza (World Health Organization 2011, accessed 15/02/2018, at: www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/manual_diagnosis_surveillance_influenza/en/ , which is incorporated herein by reference.

[0152] На Фиг. 11 показаны титры HAI против четырех штаммов гриппа для всех групп HD через 3 месяца для составов, перечисленных в таблице 3. Результаты демонстрируют, что предварительно приготовленные составы, хранящиеся при 4°C в течение 3 месяцев, обладали аналогичными иммуногенными свойствами по сравнению с составами свежеприготовленных смесей, хранящихся при -60°C. Результаты также демонстрируют, что Матрица M не изменяет иммуногенность тестируемых составов Quad-NIV, даже когда состав предварительно приготовленной смеси хранится в течение длительного периода, например, 3 месяцев. [0152] In FIG. Figure 11 shows HAI titers against four influenza strains for all HD groups after 3 months for the formulations listed in Table 3. The results demonstrate that preformulated formulations stored at 4°C for 3 months had similar immunogenic properties compared to freshly prepared formulations. mixtures stored at -60°C. The results also demonstrate that Matrix M does not alter the immunogenicity of the Quad-NIV formulations tested, even when the premixed formulation is stored for an extended period, such as 3 months.

[0153] Пример 6 - Иммуногенность и долговременная стабильность наночастиц с HA на основе предварительно приготовленной смеси и свежеприготовленной смеси с Матрицей M при 25°C[0153] Example 6 - Immunogenicity and long-term stability of HA nanoparticles based on pre-mix and fresh-mix with Matrix M at 25°C

[0154] Группы с 1 по 14 были получены, как показано в таблице 4 ниже. Для групп предварительно приготовленной смеси наночастицы с НА и Матрицу M (85:15 мас./мас. Матрицы с фракцией A и Матрицы с фракцией C) объединяли и хранили при 4°C в течение 6 месяцев или 12 месяцев или при 25°C в течение 6 месяцев перед введением. В группах свежеприготовленных смесей HA хранили при 25°C, или замораживали при -60°C в течение 6 месяцев, или замораживали при -60°C в течение 12 месяцев, а затем объединяли с Матрицей M непосредственно перед введением мышам. Наночастицы с белком НА содержали НА из следующих штаммов A/Michigan H1N1, A/Hong Kong-H3N2 B/Brisbane и B/Phuket. [0154] Groups 1 to 14 were obtained as shown in Table 4 below. For premix groups, nanoparticles with ND and Matrix M (85:15 w/w Matrix with Fraction A and Matrix with Fraction C) were combined and stored at 4°C for 6 months or 12 months or at 25°C at for 6 months before administration. In the freshly prepared mixture groups, HA was stored at 25°C, or frozen at -60°C for 6 months, or frozen at -60°C for 12 months, and then combined with Matrix M immediately before administration to mice. The HA protein nanoparticles contained HA from the following strains A/Michigan H1N1, A/Hong Kong-H3N2 B/Brisbane and B/Phuket.

[0155] Таблица 4. Составы для анализа стабильности в течение 6 и 12 месяцев³ [0155] Table 4. Formulations for Stability Analysis for 6 and 12 Months ³

¹ Высокая доза: 120 мкг/мл/штамм (всего 480 мкг HA) + 100 мкг/мл Матрицы. ¹ High dose: 120 µg/ml/strain (total 480 µg HA) + 100 µg/ml Matrix.

² Низкая доза: 30 мкг/мл/штамм HA (всего 120 мкг HA) + 100 мкг/мл Матрицы. ² Low dose: 30 µg/ml/strain HA (total 120 µg HA) + 100 µg/ml Matrix.

³ 12-месячное исследование стабильности не включало образцы, хранящиеся при 25°C. ³ The 12-month stability study did not include samples stored at 25°C.

[0156] Мы измеряли титры HAI против каждого из четырех штаммов. На Фиг. 12-19 и в таблицах 5-12 приведены титры HAI против штаммов A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane и B/Phuket для групп HD и LD через 6 месяцев.[0156] We measured HAI titers against each of the four strains. In FIG. 12-19 and Tables 5-12 show HAI titers against strains A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane and B/Phuket for the HD and LD groups after 6 months.

[0157] Таблица 5. Титры A/Michigan H1N1-HAI на 21-е сутки[0157] Table 5. A/Michigan H1N1-HAI titers on day 21

[0158] Таблица 6. Титры A/Michigan H1N1-HAI на 35-е сутки[0158] Table 6. A/Michigan H1N1-HAI titers on day 35

[0159] Таблица 7. Титры HAI A/Hong Kong-H3N2 на 21-е сутки[0159] Table 7. HAI A/Hong Kong-H3N2 titers on day 21

[0160] Таблица 8. Титры HAI A/Hong Kong-H3N2 на 35-е сутки[0160] Table 8. HAI A/Hong Kong-H3N2 titers on day 35

[0161] Таблица 9. Титры HAI B/Brisbane на 21-е сутки [0161] Table 9. HAI B/Brisbane titers on day 21

[0162] Таблица 10. Титры HAI B/Brisbane на 35-е сутки[0162] Table 10. HAI B/Brisbane titers on day 35

[0163] Таблица 11. Титры HAI B/Phuket на 21-е сутки[0163] Table 11. HAI B/Phuket titers on day 21

[0164] Таблица 12. Титры HAI B/Phuket на 35-е сутки[0164] Table 12. HAI B/Phuket titers on day 35

[0165] На Фиг. 20-27 показаны титры HAI против штаммов A/Hong Kong, штаммов A/Michigan, штаммов B/Brisbane и штаммов B/Phuket для групп с высокими дозами (HD) и низкими дозами (LD) через 12 месяцев. [0165] In FIG. 20-27 show HAI titers against A/Hong Kong strains, A/Michigan strains, B/Brisbane strains, and B/Phuket strains for the high dose (HD) and low dose (LD) groups at 12 months.

[0166] Данные демонстрируют, что вакцины на основе свежеприготовленной смеси и вакцины на основе предварительно приготовленной смеси вызывают аналогичную иммуногенность у мышей даже после 6 или 12 месяцев хранения по измерениям титров HAI. Исследование также подтвердило, что присутствие Матрицы M было полезно для генерации более сильных иммунных ответов. Матрица M, даже при хранении в течение продолжительных периодов времени, не изменяет иммуногенность тестируемых составов Quad-NIV. [0166] Data demonstrate that fresh-mix vaccines and pre-mix vaccines produce similar immunogenicity in mice even after 6 or 12 months of storage as measured by HAI titers. The study also confirmed that the presence of Matrix M was beneficial for generating stronger immune responses. Matrix M, even when stored for extended periods of time, does not alter the immunogenicity of the Quad-NIV formulations tested.

[0167] Предварительно приготовленные составы при 25°C обладали аналогичными иммуногенными свойствами по сравнению со составами свежеприготовленных смесей при 25°C. Например, группы 1,5 мкг предварительно приготовленной смеси, хранящихся при 4°C или 25°C, вызвали аналогичный ответ с титром HAI против штамма A/Michigan на 21-е сутки день (таблица 5; СГТ (среднее геометрическое значение титра): 57 против 67, соответственно). В сочетании со стабильностью составов предварительно приготовленных смесей, хранящихся при 25°C в течение длительных периодов времени, вакцины, таким образом, особенно полезны в условиях, когда хранение в холодовой цепи может быть ограничено или может отсутствовать.[0167] Preformulated formulations at 25°C had similar immunogenic properties compared to freshly prepared formulations at 25°C. For example, the 1.5 μg premix groups stored at 4°C or 25°C produced a similar response with HAI titer against the A/Michigan strain at day 21 (Table 5; GMT (geometric mean titer): 57 versus 67, respectively). Combined with the stability of premixed formulations stored at 25°C for long periods of time, vaccines are therefore particularly useful in settings where cold chain storage may be limited or non-existent.

[0168] Данные, приведенные на Фиг. 12-27, демонстрируют, что группы с высокими дозами, в частности составы предварительно приготовленных смесей, имели более высокие ответы титра HAI по сравнению с группами с низкими дозами для всех штаммов на 21-е сутки. Ответы с титрами HAI на 35-е сутки были выше во всех группах для всех штаммов по сравнению с ответами с титрами HAI, наблюдавшимися на 21-е сутки, (например, титры HAI A/Hong Kong для 1,5 мкг составов предварительно приготовленных смесей при 25°C на 21-е сутки и 35-е сутки: 22 и 538), в то время как минимальные различия наблюдались между группами с высокой дозой и группами с низкой дозой на 35-е сутки. [0168] The data shown in FIG. 12-27 demonstrate that the high-dose groups, particularly the premix formulations, had higher HAI titer responses compared to the low-dose groups for all strains at day 21. Responses with HAI titers at day 35 were higher in all groups for all strains compared with responses with HAI titers observed at day 21 (e.g., HAI A/Hong Kong titers for 1.5 μg premix formulations at 25°C on days 21 and 35: 22 and 538), while minimal differences were observed between the high-dose groups and the low-dose groups on day 35.

[0169] Данные подтверждают, что частицы HaSMaN, образованные с белками НА типа A, по меньшей мере так же эффективны в индукции иммунных ответов, как наночастицы с HA с детергентным ядром не в форме HaSMaN. Данные демонстрируют, что взаимодействие наночастиц с HA с Матрицей с образованием HaSMaN не оказывает отрицательного воздействия ни на адъювантный эффект Матрицы, ни на иммуногенность самого белка HA. Хотя наночастицы с HA, по-видимому, сохраняют стабильность белка HA путем вставки в детергентное ядро, данные, таким образом, предполагают, что частицы HaSMaN могут обеспечивать некоторую защиту структуры белка HA, а также могут положительно влиять на представление в иммунной системе, не требуя белок, встроенный в детергентное ядро. [0169] Data confirm that HaSMaN particles formed with type A HA proteins are at least as effective in inducing immune responses as HA nanoparticles with a non-HaSMaN detergent core detergent core. The data demonstrate that the interaction of HA nanoparticles with the Matrix to form HaSMaN does not negatively impact either the adjuvant effect of the Matrix or the immunogenicity of the HA protein itself. Although HA nanoparticles appear to maintain the stability of the HA protein by insertion into the detergent core, the data thus suggest that HaSMaN particles may provide some protection to the structure of the HA protein and may also positively influence presentation to the immune system without requiring protein embedded in the detergent core.

Пример 7 – Анализ коэффициентов седиментацииExample 7 - Analysis of sedimentation coefficients

[0170] Четырехвалентные композиции, которые ранее были протестированы на стабильность на мышах в примере 6, были проанализированы при помощи аналитического ультрацентрифугирования (AUC) для измерения скорости седиментации (SV) для определения размера частиц.На Фиг. 28 показаны результаты только с 120 мкг/мл/штамм Quad-NIV (только QIV) через 0, 3, 6, 9 и 12 месяцев при 4°C; или QIV + 100 мкг/мл M1 через 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев при 4°C. Данные демонстрируют, что с течением времени количество быстро оседающих частиц увеличивалось, т.е. структур, появляющихся при более высоких значениях, демонстрируя, что частицы HA с увеличением времени превращаются в HaSMaN.На Фиг. 29 показаны результаты с Quad-NIV, отдельно или с 100 мкг/мл M1 через 0, 3 или 6 месяцев при 25°C, и подтверждает, что образование HaSMaN происходит быстрее при более высокой температуре. [0170] The tetravalent compositions that were previously tested for stability in mice in Example 6 were analyzed using analytical ultracentrifugation (AUC) to measure sedimentation velocity (SV) to determine particle size. FIG. Figure 28 shows results with 120 μg/mL/strain Quad-NIV (QIV only) at 0, 3, 6, 9, and 12 months at 4°C; or QIV + 100 µg/ml M1 at 3 months, 6 months, 9 months and 12 months at 4°C. The data demonstrate that the amount of rapidly settling particles increased over time, i.e. structures appearing at higher values, demonstrating that HA particles transform into HaSMaN with increasing time. FIG. Figure 29 shows results with Quad-NIV alone or with 100 μg/mL M1 at 0, 3, or 6 months at 25°C and confirms that HaSMaN formation occurs more rapidly at higher temperatures.

Пример 8 - Анализ образования HaSMaN с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)Example 8 - Analysis of HaSMaN formation by transmission electron microscopy (TEM)

[0171] Как описано ранее, на Фиг. 1 показаны различные структуры наночастиц с HA (Flu), матрицы M и HaSMaN (взаимодействие Flu-матрицей), как показано с помощью ПЭМ. Как и ожидалось, наночастицы с HA не образовывали HaSMaN. Скорее, наночастицы с НА демонстрируют структуру детергентного ядра с белками НА, окружающими ядро. Матрица M имеет клеточные структуры, которые содержат сапониновую фракцию (фракцию A или фракцию C, но не обе), фосфолипид и холестерин. В структурах HaSMaN гликопротеин HA прикреплен к клеточным частицам Матрицы, при этом головная часть HA выходит наружу. [0171] As described previously, FIG. Figure 1 shows the different structures of nanoparticles with HA (Flu), M matrix and HaSMaN (Flu-matrix interaction) as shown by TEM. As expected, HA nanoparticles did not form HaSMaN. Rather, HA nanoparticles exhibit a detergent core structure with HA proteins surrounding the core. Matrix M has cellular structures that contain a saponin fraction (fraction A or fraction C, but not both), phospholipid and cholesterol. In HaSMaN structures, the HA glycoprotein is attached to the cellular particles of the Matrix, with the head part of the HA coming out.

[0172] Затем мы просмотрели динамику различных образцов, описанных ниже под ТЕМ, чтобы визуально оценить образование HaSMaN в различных условиях. В таблице 13 ниже показаны условия образцов и моменты времени для тестирования структур наночастиц составов предварительно приготовленных смесей Quad-NIV (высокая доза, HD и низкая доза, LD) с использованием ТЕМ. Обозначение «X» указывает на условия образцов, доступные для каждого момента времени. Кроме того, составы LD были испытаны при различных температурах через 1 месяц (Фиг. 35). [0172] We then looked at the dynamics of the various samples described below under TEM to visually assess the formation of HaSMaN under different conditions. Table 13 below shows the sample conditions and time points for testing nanoparticle structures of Quad-NIV premix formulations (high dose, HD and low dose, LD) using TEM. The “X” indicates the sample conditions available at each time point. In addition, the LD formulations were tested at various temperatures after 1 month (Figure 35).

[0173] На Фиг. 30 – Фиг. 34 показаны репрезентативные изображения со структурами HaSMaN. Данные демонстрируют, что образование HaSMaN видно через около 4 часа инкубации; и что нет никаких доказательств образования HaSMaN до 4 часов (Фиг. 30 и Фиг. 31). К 24 часам HaSMaN образовывались как при низких (4°C), так и при высоких (25°C) температурах; однако образование HaSMaN не наблюдалось при высокодозной Quad-NIV при 4°C. При высокодозной Quad-NIV показано образование HaSMaN при 4°C через 48 часов (Фиг. 33) и через 7 суток (Фиг. 34). Данные также показывают, что к 1 месяцу структуры HaSMaN оставались в группе LD и были более заметными при более высоких температурах, особенно при 37^oC (Фиг. 35). [0173] In FIG. 30 – Fig. Figure 34 shows representative images of HaSMaN structures. The data demonstrate that HaSMaN formation is visible after about 4 hours of incubation; and that there is no evidence of HaSMaN formation before 4 hours (Fig. 30 and Fig. 31). By 24 h, HaSMaN had formed at both low (4°C) and high (25°C) temperatures; however, HaSMaN formation was not observed with high-dose Quad-NIV at 4°C. High-dose Quad-NIV showed the formation of HaSMaN at 4°C after 48 hours (Fig. 33) and after 7 days (Fig. 34). The data also show that by 1 month the HaSMaN structures remained in the LD group and were more prominent at higher temperatures, especially at 37 ^° C (Figure 35).

Таблица 13. Получение ПЭМ-изображений: дизайн исследованияTable 13. TEM imaging: study design

Концентрация Матрицы M: 100 мкг/мл во всех образцахMatrix M concentration: 100 µg/ml in all samples

[0174] Эти данные демонстрируют, что для образования HaSMaN требуется около 4 часов совместной инкубации наночастиц с HA с Матрицей M1. При всех условиях показано образование HaSMaN в течение 48 часов. Образующиеся частицы HaSMaN стабильны в течение продолжительных периодов времени. HaSMaN образуются раньше при более высокой температуре и меньших дозах Quad-NIV. [0174] These data demonstrate that the formation of HaSMaN requires approximately 4 hours of co-incubation of HA nanoparticles with Matrix M1. Under all conditions, the formation of HaSMaN was shown within 48 hours. The resulting HaSMaN particles are stable over long periods of time. HaSMaNs formed earlier at higher temperatures and lower doses of Quad-NIV.

[0175] Это говорит о том, что составы предварительно заполненных шприцев, содержащие HaSMaN, можно хранить при комнатной температуре или выше (например, 37°C), что позволит избежать затрат на хранение и транспортировку при низкой температуре и предотвратит потенциальные несоответствия при смешивании и приготовлении вакцин непосредственно перед вакцинацией в клинике.[0175] This suggests that prefilled syringe formulations containing HaSMaN can be stored at or above room temperature (e.g., 37°C), avoiding the costs of cold storage and transportation and preventing potential inconsistencies in mixing and preparing vaccines immediately before vaccination in the clinic.

Пример 9Example 9

Профили дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) Quad-NIVQuad-NIV Differential Scanning Calorimetry (DSC) Profiles

[0176] Стабильность составов Quad-NIV, описанных в примерах 6 и 7, исследовали с помощью анализа методом ДСК. 120 мкг/мл/штамм Quad-NIV со 100 мкг/мл Матрицы M1 получали в буферах, содержащих 25 мМ NaPi, 150 мМ NaCl, 100 мМ аргинина, 5% трегалозу, 0,03% PS80 при pH 7,5. Все образцы Quad-NIV инкубировали при 4°C в течение 3 месяцев, 6 месяцев или 12 месяцев; или 25°C в течение 3 месяцев или 6 месяцев. Сканирование при помощи ДСК проводили при температуре от 4°C до 120°C при скорости 1°C в минуту и измеряли молярную теплоемкость (Cp: кДж/моль*К) Quad-NIV. [0176] The stability of the Quad-NIV formulations described in Examples 6 and 7 was examined by DSC analysis. 120 μg/ml/strain Quad-NIV with 100 μg/ml M1 matrices were prepared in buffers containing 25 mM NaPi, 150 mM NaCl, 100 mM arginine, 5% trehalose, 0.03% PS80 at pH 7.5. All Quad-NIV samples were incubated at 4°C for 3 months, 6 months, or 12 months; or 25°C for 3 months or 6 months. DSC scans were performed from 4°C to 120°C at a rate of 1°C per minute and the molar heat capacity (Cp: kJ/mol*K) of the Quad-NIV was measured.

[0177] На Фиг. 36 показано, что составы, инкубированные при 25°C, имели меньший сдвиг температуры плавления (T_пл) и имели более широкую ширину пика, чем те же группы, инкубированные при 4°C.В таблице 14 показано, что составы 120 мкг/мл/штамм Quad-NIV + Матрица M1, инкубированные при 25°C, имели более низкую T_пл, чем 4°C, как через 3 месяца (59,6°C против 60,4°C), так и через 6 месяцев (59,0°C против 60,4°С). В таблице 14 также показано, что составы при 25°C требовали меньших изменений Hcal для достижения пиковых температур, чем 4°C, что дополнительно предполагает, что этот состав содержит относительно меньше комплексов HaSMaN. [0177] In FIG. Table 36 shows that formulations incubated at 25°C had a smaller melting point shift ( _Tm ) and had a wider peak width than the same groups incubated at 4°C. Table 14 shows that formulations 120 µg/ml /strain Quad-NIV + Matrix M1 incubated at 25°C had a lower _Tm than 4°C at both 3 months (59.6°C vs. 60.4°C) and 6 months ( 59.0°C versus 60.4°C). Table 14 also shows that the 25°C formulations required smaller changes in Hcal to reach peak temperatures than the 4°C formulation, further suggesting that this formulation contains relatively fewer HaSMaN complexes.

[0178] Профили ДСК и T_пл являются мерой термостабильности белка. Результаты демонстрируют, что образование HaSMaN увеличивает T_пл белка HA от около 0,5°C до около 1°C, тем самым улучшая термостабильность белка HA в HaSMaN по сравнению с наночастицей с детергентным ядром. [0178] DSC and _Tm profiles are a measure of the thermal stability of a protein. The results demonstrate that the formation of HaSMaN increases the _{Tm of} the HA protein from about 0.5°C to about 1°C, thereby improving the thermal stability of the HA protein in HaSMaN compared to the detergent core nanoparticle.

Таблица 14. Профили ДСК для высокодозных и низкодозных составов Quad-NIVTable 14. DSC profiles for high-dose and low-dose Quad-NIV formulations

[0179] Пример 10 - Штаммы типа A, но не штамм типа B для HaSMaN [0179] Example 10 - Type A Strains, but Not Type B Strain for HaSMaN

[0180] Мы исследовали способность гликопротеинов НА из разных штаммов гриппа образовывать HaSMaN. Наночастицы с детергентным ядром были приготовлены и очищены, как описано в примере 1, для следующих штаммов: Тип A: A/Hunan, A/Guangdong (оба подтипа H7N9) и A/Panama и A/Hong Kong/4801/2014 (оба относятся к подтипу H3N2) и для типа B: B/Brisbane/60/2008.[0180] We examined the ability of HA glycoproteins from different influenza strains to form HaSMaN. Detergent core nanoparticles were prepared and purified as described in Example 1 for the following strains: Type A: A/Hunan, A/Guangdong (both H7N9 subtypes) and A/Panama and A/Hong Kong/4801/2014 (both to subtype H3N2) and for type B: B/Brisbane/60/2008.

[0181] Наночастицы смешивали с Матрицей M (85:15 по массе Матрицы с фракцией A и Матрицы с фракцией C) в течение до 4 недель. Конечная концентрация HA составляла 120 мкг/мл (60 мкг каждого штамма A + 60 мкг каждого штамма B в 0,5 мл). Были измерены свободные nHA. Результаты показаны на Фиг. 37. Уменьшение количества свободных частиц nHA соответствует образованию HaSMaN. [0181] The nanoparticles were mixed with Matrix M (85:15 by weight of Matrix Fraction A and Matrix Fraction C) for up to 4 weeks. The final concentration of HA was 120 μg/ml (60 μg each strain A + 60 μg each strain B in 0.5 ml). Free nHA was measured. The results are shown in Fig. 37. The decrease in the number of free nHA particles corresponds to the formation of HaSMaN.

[0182] Эти данные позволяют предположить, что гликопротеины НА штамма А образуют HaSMaN, а гликопротеины НА штамма В - нет. Мы также протестировали слитый белок гликопротеина НА, имеющий фолдон на С-конце. Присутствие фолдона блокирует образование HaSMaN, что указывает на то, что С-конец должен быть свободным, чтобы гликопротеин НА мог образовывать HaSMaN.[0182] These data suggest that strain A HA glycoproteins form HaSMaN, but strain B HA glycoproteins do not. We also tested a HA glycoprotein fusion protein that has a foldon at the C terminus. The presence of the foldon blocks the formation of HaSMaN, indicating that the C-terminus must be free for the HA glycoprotein to form HaSMaN.

Claims (27)

1. Поливалентная иммуногенная композиция против гриппа, содержащая1. Polyvalent immunogenic composition against influenza, containing (a) наночастицу с детергентным ядром, причем наночастица с детергентным ядром содержит рекомбинантный гликопротеин гемагглютинина (НА) гриппа из штамма вируса гриппа типа В; и(a) a nanoparticle with a detergent core, wherein the nanoparticle with a detergent core contains a recombinant influenza hemagglutinin (HA) glycoprotein from an influenza B virus strain; And (b) наночастицу на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином (HaSMaN), причем HaSMaN содержит рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А и адъювант Матрица ИСКОМ; и(b) a hemagglutinin saponin matrix nanoparticle (HaSMaN), wherein the HaSMaN contains recombinant influenza glycoprotein HA from an influenza A virus strain and the adjuvant ISCOM Matrix; And (c) фармацевтически приемлемый буфер.(c) a pharmaceutically acceptable buffer. 2. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая одну или более наночастиц с детергентным ядром и/или одну или более HaSMaN.2. The composition according to claim 1, further containing one or more nanoparticles with a detergent core and/or one or more HaSMaN. 3. Композиция по п. 1, в которой каждая из наночастиц представляет собой устойчивую к трипсину наночастицу.3. The composition according to claim 1, wherein each of the nanoparticles is a trypsin-resistant nanoparticle. 4. Композиция по п. 1, в которой адъювант Матрица ИСКОМ представляет собой Матрицу М.4. The composition according to claim 1, in which the ISCOM Matrix adjuvant is Matrix M. 5. Композиция по п. 4, в которой Матрица М содержит 85% Матрицы с фракцией А и 15% Матрицы с фракцией С по массе.5. The composition according to claim 4, in which Matrix M contains 85% of the Matrix with fraction A and 15% of the Matrix with fraction C by weight. 6. Композиция по п. 1, в которой детергент представляет собой PS-80.6. The composition according to claim 1, wherein the detergent is PS-80. 7. Композиция по п. 6, в которой детергент PS-80 присутствует в количестве от около 0,03% до около 0,5%.7. The composition of claim 6, wherein the PS-80 detergent is present in an amount of from about 0.03% to about 0.5%. 8. Композиция по п. 6, в которой детергент PS-80 присутствует в количестве около 0,04%.8. The composition according to claim 6, in which the detergent PS-80 is present in an amount of about 0.04%. 9. Композиция по п. 1, в которой штамм вируса гриппа относится к подтипу, выбранному из группы, состоящей из H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16, Н17 и Н18.9. The composition according to claim 1, in which the influenza virus strain belongs to a subtype selected from the group consisting of H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14 , H15, H16, H17 and H18. 10. Композиция по п. 1, в которой фармацевтически приемлемый буфер содержит (i) фосфат натрия в концентрации около 25 мМ; (ii) хлорид натрия в концентрации около 150 мМ; (iii) гидрохлорид аргинина в концентрации около 100 мМ; (iv) трегалозу в концентрации около 5%; при этом рН композиции составляет около 7,5.10. The composition according to claim 1, in which the pharmaceutically acceptable buffer contains (i) sodium phosphate at a concentration of about 25 mM; (ii) sodium chloride at a concentration of about 150 mM; (iii) arginine hydrochloride at a concentration of about 100 mM; (iv) trehalose at a concentration of about 5%; the pH of the composition is about 7.5. 11. Композиция по п. 1, в которой адъювант присутствует в количестве от около 50 мкг до около 75 мкг на дозу.11. The composition of claim 1, wherein the adjuvant is present in an amount of from about 50 μg to about 75 μg per dose. 12. Композиция по п. 1, в которой как рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа В, так и рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А присутствуют в количестве около 60 мкг.12. The composition according to claim 1, wherein both the recombinant influenza glycoprotein HA from the influenza virus type B strain and the recombinant influenza glycoprotein HA from the influenza virus type A strain are present in an amount of about 60 μg. 13. Композиция по п. 1, в которой как рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа В, так и рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А представляют собой гликопротеины НА вируса гриппа дикого типа.13. The composition of claim 1, wherein both the recombinant influenza glycoprotein HA from an influenza B virus strain and the recombinant influenza glycoprotein HA from an influenza A virus strain are wild-type influenza virus HA glycoproteins. 14. Композиция по п. 1, в которой рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа В и рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А экспрессируются в клетке-хозяине.14. The composition according to claim 1, wherein the recombinant influenza glycoprotein HA from a type B influenza virus strain and the recombinant influenza glycoprotein HA from a type A influenza virus strain are expressed in the host cell. 15. Композиция по п. 14, в которой клетка-хозяин представляет собой клетку Sf9 насекомого.15. The composition of claim 14, wherein the host cell is an insect Sf9 cell. 16. Композиция по п. 14, в которой рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа В и рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А экспрессируются с использованием бакуловируса.16. The composition of claim 14, wherein the recombinant influenza glycoprotein HA from an influenza B virus strain and the recombinant influenza glycoprotein HA from an influenza A virus strain are expressed using a baculovirus. 17. Предварительно заполненный шприц, содержащий композицию по п. 1.17. A pre-filled syringe containing the composition of claim 1. 18. Предварительно заполненный шприц по п. 17, в котором композиция стабильна в течение по меньшей мере 12 месяцев.18. The pre-filled syringe of claim 17, wherein the composition is stable for at least 12 months. 19. Предварительно заполненный шприц по п. 17, в котором композиция стабильна при 25°С.19. The pre-filled syringe according to claim 17, wherein the composition is stable at 25°C. 20. Способ стимуляции иммунного ответа против гриппа, включающий введение поливалентной композиции против гриппа по любому из пп. 1-16.20. A method of stimulating an immune response against influenza, comprising administering a polyvalent anti-influenza composition according to any one of claims. 1-16. 21. Способ по п. 20, в котором композицию вводят внутримышечно.21. The method according to claim 20, in which the composition is administered intramuscularly. 22. Полученный выдуванием/фасовкой/запаиванием контейнер, содержащий композицию по п. 1.22. A blown/filled/sealed container containing the composition according to claim 1. 23. Полученный выдуванием/фасовкой/запаиванием контейнер по п. 22, в котором композиция стабильна в течение по меньшей мере 12 месяцев.23. The blow/fill/seal container of claim 22, wherein the composition is stable for at least 12 months. 24. Полученный выдуванием/фасовкой/запаиванием контейнер по п. 22, в котором композиция стабильна при 25°С.24. The blow/fill/seal container of claim 22, wherein the composition is stable at 25°C.