RU2805254C2

RU2805254C2 - Bcma, nkg2d and cd16 binding proteins

Info

Publication number: RU2805254C2
Application number: RU2019127910A
Authority: RU
Inventors: Грегори П. ЧАН; Энн Ф. ЧЕУНГ; Уилльям Хани; Брэдли М. ЛУНДЕ; Бьянка Принц
Original assignee: Драгонфлай Терапьютикс, Инк.
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2023-10-13

Abstract

FIELD: biochemistry; medicine.

SUBSTANCE: invention is related in particular to polyspecific binding proteins that bind to BCMA, the NKG2D receptor and CD16, as well as pharmaceutical compositions and therapeutic methods useful for the treatment of cancer.

EFFECT: present invention provides certain advantages for improving the treatment of cancer expressing BCMA.

27 cl, 39 dwg, 8 tbl, 11 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] По настоящей заявке испрашивается преимущество и приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/457780, поданной 10 февраля 2017 г., полное содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки для всех целей.[0001] This application claims benefit and priority to U.S. Provisional Patent Application No. 62/457,780, filed February 10, 2017, the entire contents of which are incorporated herein by reference for all purposes.

СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LISTS

[0002] Настоящая заявка содержит списки последовательностей, которые представлены в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включены в виде ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 8 февраля 2018 года, называется DFY–003PC_SL.txt и имеет размер 91310 байтов. Данная заявка посредством ссылки полностью включает машиночитаемую форму (CRF) списке последовательностей в текстовом формате ASCII, поданную через EFS-Web. Текстовый файл списка последовательностей, поданный через EFS-Web, названный 14247-424-999_SUB_SEQ_LISTING.txt, был создан 12 июля 2021 г. и имеет размер 98150 байт.[0002] This application contains sequence listings that are presented electronically in ASCII format and are hereby incorporated by reference in their entirety. The ASCII copy in question, created on February 8, 2018, is called DFY–003PC_SL.txt and is 91310 bytes in size. This application incorporates by reference in its entirety the machine readable form (CRF) of the sequence listing in ASCII text format submitted via EFS-Web. The sequence listing text file submitted via EFS-Web, named 14247-424-999_SUB_SEQ_LISTING.txt , was created on July 12, 2021 and is 98150 bytes in size .

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

[0003] Изобретение относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с антигеном созревания В–клеток (ВСМА), рецептором NKG2D и CD16.[0003] The invention relates to multispecific binding proteins that bind to B-cell maturation antigen (BCMA), the NKG2D receptor and CD16.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[0004] Рак продолжает оставаться серьезной проблемой для здоровья, несмотря на значительные исследовательские усилия и научные достижения в лечении этого заболевания, описанные в литературе. Рак крови и костного мозга являются часто диагностируемыми видами рака, включая множественные миеломы, лейкемию и лимфомы. Существующие способы лечения этих видов рака не являются эффективными для всех пациентов и/или могут иметь существенные побочные эффекты. Другие виды рака также не поддаются лечению с помощью современных методов лечения.[0004] Cancer continues to be a serious health problem despite significant research efforts and scientific advances in the treatment of this disease described in the literature. Blood and bone marrow cancers are commonly diagnosed cancers, including multiple myelomas, leukemia and lymphomas. Current treatments for these cancers are not effective for all patients and/or may have significant side effects. Other types of cancer are also not curable with current treatments.

[0005] Иммунотерапия рака является желательной благодаря своей высокой специфичности и способствует разрушению раковых клеток при участии иммунной системы самого пациента. Слитые белки, такие как биспецифические рекрутеры T–клеток, представляют собой описанные в литературе иммунотерапевтические агенты для лечения рака, которые связываются с опухолевыми клетками и T–клетками, способствуя разрушению опухолевых клеток. В литературе описаны антитела, которые связываются с определенными антигенами, ассоциированными с опухолями, и с определенными иммунными клетками. См., например, WO 2016/134371 и WO 2015/095412.[0005] Cancer immunotherapy is desirable due to its high specificity and promotes the destruction of cancer cells with the participation of the patient's own immune system. Fusion proteins, such as bispecific T cell recruiters, are cancer immunotherapy agents described in the literature that bind to tumor cells and T cells, promoting the destruction of tumor cells. The literature describes antibodies that bind to certain tumor-associated antigens and to certain immune cells. See, for example, WO 2016/134371 and WO 2015/095412.

[0006] Натуральные киллерные (NK) клетки (натуральные киллеры) являются компонентом врожденной иммунной системы и составляют примерно 15% циркулирующих лимфоцитов. NK–клетки проникают практически во все ткани и отличаются главным образом своей способностью эффективно убивать опухолевые клетки без необходимости в предварительной сенсибилизации. Активированные NK–клетки убивают клетки–мишени с помощью средств, аналогичных цитотоксическим Т–клеткам, т.е. посредством цитолитических гранул, которые содержат перфорин и гранзимы, а также через рецепторные пути гибели клеток. Активированные NK–клетки также секретируют воспалительные цитокины, такие как IFN–гамма и хемокины, которые рекрутируют другие лейкоциты в ткани–мишени.[0006] Natural killer (NK) cells (natural killer cells) are a component of the innate immune system and constitute approximately 15% of circulating lymphocytes. NK cells penetrate almost all tissues and are distinguished mainly by their ability to effectively kill tumor cells without the need for prior sensitization. Activated NK cells kill target cells using means similar to cytotoxic T cells, i.e. through cytolytic granules that contain perforin and granzymes, and through cell death receptor pathways. Activated NK cells also secrete inflammatory cytokines, such as IFN-gamma and chemokines, which recruit other leukocytes to target tissues.

[0007] NK–клетки реагируют на сигналы посредством множества активирующих и ингибирующих рецепторов на своей поверхности. Например, когда NK–клетки встречают здоровые аутоклетки, их активность подавляется путем активации иммуноглобулин–подобных рецепторов (KIR) киллерных клеток. Альтернативно, когда NK–клетки сталкиваются с чужеродными или раковыми клетками, они активируются посредством своих активирующих рецепторов (например, NKG2D, NCR, DNAM1). NK–клетки также активируются константной областью некоторых иммуноглобулинов через рецепторы CD16 на их поверхности. Общая чувствительность NK–клеток к активации зависит от суммы стимулирующих и ингибирующих сигналов.[0007] NK cells respond to signals through a variety of activating and inhibitory receptors on their surface. For example, when NK cells encounter healthy self-cells, their activity is suppressed by activation of killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs). Alternatively, when NK cells encounter foreign or cancer cells, they are activated through their activating receptors (eg, NKG2D, NCR, DNAM1). NK cells are also activated by the constant region of some immunoglobulins through CD16 receptors on their surface. The overall sensitivity of NK cells to activation depends on the sum of stimulatory and inhibitory signals.

[0008] ВСМА представляет собой трансмембранный белок, принадлежащий к суперсемейству рецепторов TNF. Он специфически связывается с суперсемейством факторов (лигандов) некроза опухолей, членом 13b (TSF13B/TALL–1/BAFF), что приводит к активации NF–κB и MAPK8/JNK. Его экспрессия ограничена линией B–клеток и, как было показано, важна для развития B–клеток и аутоиммунного ответа. BCMA также связывается с различными членами семейства TRAF и, таким образом, может трансдуцировать сигналы выживания и пролиферации клеток. ВСМА задействован в различных раковых заболеваниях, таких как множественная миелома, лимфома и лейкоз. Настоящее изобретение обеспечивает определенные преимущества для улучшения лечения рака экспрессирующего ВСМА.[0008] BCMA is a transmembrane protein belonging to the TNF receptor superfamily. It specifically binds to tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 13b (TSF13B/TALL–1/BAFF), resulting in activation of NF-κB and MAPK8/JNK. Its expression is restricted to the B cell lineage and has been shown to be important for B cell development and the autoimmune response. BCMA also binds to various members of the TRAF family and thus can transduce cell survival and proliferation signals. BCMA has been implicated in various cancers such as multiple myeloma, lymphoma and leukemia. The present invention provides certain advantages for improving the treatment of cancer expressing BCMA.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[0009] Изобретение относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с ВСМА на раковой клетке и рецептором NKG2D и рецептором CD16 на натуральных киллерных клетках. Такие белки могут взаимодействовать с более чем одним типом рецепторов, активирующих NK, и могут блокировать связывание природных лигандов с NKG2D. В определенных вариантах осуществления белки могут оказывать агонистическое воздействие на NK–клетки у людей и у других видов, таких как грызуны и яванские макаки. Различные аспекты и варианты осуществления изобретения более подробно описаны ниже.[0009] The invention relates to multispecific binding proteins that bind to BCMA on a cancer cell and the NKG2D receptor and CD16 receptor on natural killer cells. Such proteins may interact with more than one type of NK-activating receptor and may block the binding of natural ligands to NKG2D. In certain embodiments, the proteins may have agonistic effects on NK cells in humans and in other species, such as rodents and cynomolgus monkeys. Various aspects and embodiments of the invention are described in more detail below.

[0010] Соответственно, один из аспектов изобретения относится к белку, который включает первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; второй антигенсвязывающий участок, который связывается с ВСМА; и F_С–домен антитела, его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16. Каждый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи антитела и вариабельный домен легкой цепи антитела (например, расположенный как в антителе или слитый с scFv), или один или более антигенсвязывающих участков могут представлять собой однодоменное антитело, такое как V_HH антитело, такое как верблюжье антитело, или V_NAR антитело, такое как антитело, обнаруженное у хрящевых рыб.[0010] Accordingly, one aspect of the invention relates to a protein that includes a first antigen binding site that binds NKG2D; a second antigen binding site that binds to BCMA; and the F _C domain of the antibody, the part of it sufficient to bind CD16, or the third antigen-binding region that binds to CD16. Each antigen binding region may include an antibody heavy chain variable domain and an antibody light chain variable domain (eg, located as in an antibody or fused to a scFv), or one or more antigen binding regions may be a single domain antibody, such as a V _H H antibody, such as camel antibody, or V _NAR antibody, such as the antibody found in cartilaginous fish.

[0011] Первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, в одном из вариантов осуществления может включать вариабельный домен тяжелой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 1, такой как имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1 и/или включающий аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 64), CDR2 (SEQ ID NO: 65) и CDR3 (SEQ ID NO: 66) последовательности SEQ ID NO: 1. Альтернативно, первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 41, и вариабельный домен легкой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 42. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или 100% идентичным SEQ ID NO: 41 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 67), CDR2 (SEQ ID NO: 68) и CDR3 (SEQ ID NO: 69) последовательности SEQ ID NO: 41. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или 100% идентичным SEQ ID NO: 42 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 70), CDR2 (SEQ ID NO: 71) и CDR3 (SEQ ID NO: 72) последовательности SEQ ID NO: 42. В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 43, и вариабельный домен легкой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 44. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичным SEQ ID NO: 43 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 73), CDR2 (SEQ ID NO: 74) и CDR3 (SEQ ID NO: 75) последовательности SEQ ID NO: 43. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичным SEQ ID NO: 44 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 76), CDR2 (SEQ ID NO: 77) и CDR3 (SEQ ID NO: 78) последовательности SEQ ID NO: 44.[0011] The first antigen binding region that binds NKG2D, in one embodiment, may comprise a heavy chain variable domain as set forth in SEQ ID NO: 1, such as having an amino acid sequence of at least 90%, at least 95 % or 100% identical to the sequence of SEQ ID NO: 1 and/or including amino acid sequences identical to the sequences CDR1 (SEQ ID NO: 64), CDR2 (SEQ ID NO: 65) and CDR3 (SEQ ID NO: 66) of the sequence SEQ ID NO: 1. Alternatively, the first antigen binding region may include the heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 41 and the light chain variable domain of SEQ ID NO: 42. For example, the heavy chain variable domain of the first antigen binding region may be at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 41 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 67), CDR2 (SEQ ID NO: 68) and CDR3 (SEQ ID NO: 69) of the sequence of SEQ ID NO: 41. Likewise, the light chain variable domain of the second antigen binding region may be at least 90%, at least 95% or 100% identical to SEQ ID NO: 42 and/or include amino acids sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 70), CDR2 (SEQ ID NO: 71) and CDR3 (SEQ ID NO: 72) of SEQ ID NO: 42. In other embodiments, the first antigen binding region may include a heavy chain variable domain, related to SEQ ID NO: 43, and the light chain variable domain related to SEQ ID NO: 44. For example, the heavy chain variable domain of the first antigen binding region may be at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 43 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 73), CDR2 (SEQ ID NO: 74) and CDR3 (SEQ ID NO: 75) of SEQ ID NO: 43. Likewise, variable the light chain domain of the second antigen binding region may be at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 44 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 76), CDR2 ( SEQ ID NO: 77) and CDR3 (SEQ ID NO: 78) of the sequence SEQ ID NO: 44.

[0012] Альтернативно, первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 45, и вариабельный домен легкой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 46, такие как имеющие аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичные SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, соответственно. В другом варианте осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 48, такие как имеющие аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или 100% идентичные SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48, соответственно.[0012] Alternatively, the first antigen binding region may include a heavy chain variable domain referred to in SEQ ID NO: 45 and a light chain variable domain referred to in SEQ ID NO: 46, such as having the amino acid sequences of at least 90%, at least 95% or 100% identical to SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46, respectively. In another embodiment, the first antigen binding region may include a heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 47 and a light chain variable domain of SEQ ID NO: 48, such as having at least 90% of the amino acid sequences at least 95% or 100% identical to SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48, respectively.

[0013] Второй антигенсвязывающий участок необязательно может включать вариабельный домен тяжелой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 49, и вариабельный домен легкой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или 100% идентичным SEQ ID NO: 49 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 50), CDR2 (SEQ ID NO: 51) и CDR3 (SEQ ID NO: 52) последовательности SEQ ID NO: 49. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичным SEQ ID NO: 53 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 55), CDR2 (SEQ ID NO: 56) и CDR3 (SEQ ID NO: 57) последовательности SEQ ID NO: 53. Альтернативно, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или 100% идентичным SEQ ID NO: 54 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 55), CDR2 (SEQ ID NO: 56) и CDR3 (SEQ ID NO: 58) последовательности SEQ ID NO: 54.[0013] The second antigen binding region may optionally include a heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 49 and a light chain variable domain of SEQ ID NO: 53 or SEQ ID NO: 54. For example, a heavy chain variable domain of a second antigen binding region region may be at least 90%, at least 95% or 100% identical to SEQ ID NO: 49 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 50), CDR2 (SEQ ID NO: 51) and CDR3 (SEQ ID NO: 52) of SEQ ID NO: 49. Likewise, the light chain variable domain of the second antigen binding region may be at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 53 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 55), CDR2 (SEQ ID NO: 56) and CDR3 (SEQ ID NO: 57) of SEQ ID NO: 53. Alternatively, a second antigen binding region light chain variable domain may be at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 54 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 55), CDR2 (SEQ ID NO: 56) and CDR3 (SEQ ID NO: 58) of the sequence SEQ ID NO: 54.

[0014] Альтернативно, второй антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 59, и вариабельный домен легкой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 60. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичным SEQ ID NO: 59 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 79), CDR2 (SEQ ID NO: 80) и CDR3 (SEQ ID NO: 81) последовательности SEQ ID NO: 59. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичным SEQ ID NO: 60 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 82), CDR2 (SEQ ID NO: 83) и CDR3 (SEQ ID NO: 84) последовательности SEQ ID NO: 60.[0014] Alternatively, the second antigen binding region may include a heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 59 and a light chain variable domain of SEQ ID NO: 60. For example, the heavy chain variable domain of the second antigen binding region may be at least at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 59 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 79), CDR2 (SEQ ID NO: 80) and CDR3 (SEQ ID NO: 81) of SEQ ID NO: 59. Likewise, the second antigen binding region light chain variable domain may be at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 60 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 82), CDR2 (SEQ ID NO: 83) and CDR3 (SEQ ID NO: 84) of SEQ ID NO: 60.

[0015] В другом варианте осуществления второй антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 61, и вариабельный домен легкой цепи, относящийся к SEQ ID NO: 62. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или 100% идентичным SEQ ID NO: 61 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 85), CDR2 (SEQ ID NO: 86) и CDR3 (SEQ ID NO: 87) последовательности SEQ ID NO: 61. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентичным SEQ ID NO: 62 и/или включать аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 88), CDR2 (SEQ ID NO: 89) и CDR3 (SEQ ID NO: 90) последовательности SEQ ID NO: 62.[0015] In another embodiment, the second antigen binding region may include the heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 61 and the light chain variable domain of SEQ ID NO: 62. For example, the heavy chain variable domain of the second antigen binding region may be at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 61 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 85), CDR2 (SEQ ID NO: 86) and CDR3 ( SEQ ID NO: 87) of the sequence SEQ ID NO: 61. Likewise, the light chain variable domain of the second antigen binding region may be at least 90%, at least 95%, or 100% identical to SEQ ID NO: 62 and/or include amino acid sequences identical to CDR1 (SEQ ID NO: 88), CDR2 (SEQ ID NO: 89) and CDR3 (SEQ ID NO: 90) of SEQ ID NO: 62.

[0016] В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий участок включает вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой цепи, присутствующей в первом антигенсвязывающем участке.[0016] In some embodiments, the second antigen binding region includes a light chain variable domain having an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the light chain variable domain present in the first antigen binding region.

[0017] В некоторых вариантах осуществления белок включает часть F_С–домена антитела, достаточную для связывания CD16, причем F_С–домен антитела содержит шарнирный и CH2–домены и/или аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% идентичные аминокислотной последовательности 234–332 человеческого антитела IgG.[0017] In some embodiments, the protein comprises a portion of an antibody F _C domain sufficient to bind CD16, wherein the antibody F _C domain comprises hinge and CH2 domains and/or amino acid sequences at least 90% identical to amino acid sequence 234-332 human IgG antibody.

[0018] Также предлагаются составы, содержащие один из этих белков; клетки, содержащие одну или более нуклеиновых кислот, экспрессирующих эти белки, и способы ускорения гибели опухолевых клеток с помощью этих белков.[0018] Formulations containing one of these proteins are also provided; cells containing one or more nucleic acids expressing these proteins, and methods of accelerating the death of tumor cells using these proteins.

[0019] В другом аспекте изобретения предлагается способ лечения рака у пациента. Способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества описанного в настоящей заявке полиспецифического связывающего белка. Типичные виды рака, подходящие для лечения с помощью полиспецифических связывающих белков включают, например, множественную миелому, острый миеломоноцитарный лейкоз, Т–клеточную лимфому, острый моноцитарный лейкоз и фолликулярную лимфому.[0019] In another aspect of the invention, a method is provided for treating cancer in a patient. The method includes administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a multispecific binding protein described herein. Typical cancers suitable for treatment with multispecific binding proteins include, for example, multiple myeloma, acute myelomonocytic leukemia, T-cell lymphoma, acute monocytic leukemia and follicular lymphoma.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0020] На фиг. 1 представлено гетеродимерное полиспецифическое антитело. NKG2D–связывающий домен (правое плечо); домен, связывающий опухолевый антиген (левое плечо). Легкие цепи, которые являются общими, представлены на чертеже одинаковым оттенком или узором.[0020] In FIG. 1 shows a heterodimeric polyspecific antibody. NKG2D-binding domain (right arm); tumor antigen binding domain (left arm). Light chains that are common are represented in the drawing by the same shade or pattern.

[0021] На фиг. 2 представлено гетеродимерное полиспецифическое антитело. NKG2D–связывающий домен – scFv (правое плечо); домен, связывающий опухолевый антиген (левое плечо).[0021] In FIG. 2 shows a heterodimeric polyspecific antibody. NKG2D-binding domain – scFv (right arm); tumor antigen binding domain (left arm).

[0022] На фиг. 3 представлено TriNKET в форме Triomab, которое представляет собой трифункциональное биспецифическое антитело, сохранившее IgG–подобную форму. Эта химера состоит из двух полу–антител, каждое из которых содержит одну легкую и одну тяжелую цепь, полученные из двух родительских антител. Форма Triomab может представлять собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 1/2 антитела крысы и 1/2 антитела мыши.[0022] In FIG. 3 presents TriNKET in the form of Triomab, which is a trifunctional bispecific antibody that retains an IgG-like form. This chimera consists of two half-antibodies, each containing one light and one heavy chain derived from two parent antibodies. The Triomab form may be a heterodimeric construct containing 1/2 rat antibody and 1/2 mouse antibody.

[0023] На фиг. Фиг.4 представлено TriNKET в форме KiH с общей легкой цепью (Common Light Chain (LC)), полученное с помощью технологии «выступ–во–впадину» (KIH). KiH представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенями 1 и 2, и F_С, стабилизированный обеспечивающими гетеродимеризацию мутациями. TriNKET в формате KiH может представлять собой гетеродимерную конструкцию с 2 Fab, связывающимися с мишенью 1 и мишенью 2, содержащую две разные тяжелые цепи и общую легкую цепь, которая спаривается с обеими тяжелыми цепями.[0023] In FIG. Figure 4 shows TriNKET in the form of KiH with a common light chain (LC), obtained using the knob-in-groove (KIH) technology. KiH is a heterodimer containing 2 Fabs that bind to targets 1 and 2, and F _C , stabilized by heterodimerization mutations. TriNKET in KiH format can be a heterodimeric construct with 2 Fabs binding to target 1 and target 2, containing two different heavy chains and a common light chain that pairs with both heavy chains.

[0024] На фиг. 5 представлено TriNKET в форме иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами (DVD–Ig^ТМ), в котором мишень–связывающие домены двух моноклональных антител объединены посредством гибких встречающихся в природе линкеров, образуя четырехвалентную IgG–подобную молекулу. DVD–Ig^ТМ представляет собой гомодимерную конструкцию, в которой вариабельный домен, нацеленный на антиген 2, слит с N–концом вариабельного домена Fab, нацеленного на антиген 1. Конструкт содержит нормальный F_С.[0024] In FIG. 5 represents TriNKET in the form of dual variable domain immunoglobulin (DVD- ^IgTM ), in which the target-binding domains of two monoclonal antibodies are combined through flexible, naturally occurring linkers, forming a tetravalent IgG-like molecule. DVD–Ig ^TM is a homodimeric construct in which the variable domain targeting antigen 2 is fused to the N-terminus of the Fab variable domain targeting antigen 1. The construct contains normal F _C .

[0025] На фиг. Фиг.6 представлено TriNKET в форме ортогонального Fab интерфейса (Ortho–Fab), который представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 Fab–фрагмента, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с F_С. Спаривание LC–HC обеспечивается ортогональным интерфейсом. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в F_С.[0025] In FIG. Figure 6 presents TriNKET in the form of an orthogonal Fab interface (Ortho–Fab), which is a heterodimeric construct containing 2 Fab fragments binding to target 1 and target 2, fused to F _C . LC–HC pairing is provided by an orthogonal interface. Heterodimerization is achieved by mutations in F _C.

[0026] На фиг. 7 представлено TrinKET в формате 2–в–1 Ig.[0026] In FIG. 7 shows TrinKET in 2-in-1 Ig format.

[0027] На фиг. 8 представлено TriNKET в форме ES, представляющую собой гетеродимерную конструкцию, содержащую два разных Fab–фрагмента, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с F_С. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями, усиливающими электростатические взаимодействия в F_С.[0027] In FIG. Figure 8 shows TriNKET in ES form, which is a heterodimeric construct containing two different Fab fragments binding to target 1 and target 2 fused to F _C . Heterodimerization is ensured by mutations that enhance electrostatic interactions in F _C.

[0028] На фиг. 9 представлено TriNKET в форме обмена Fab–плечами: антитела, в которых произошел обмен Fab–плечами путем замены тяжелой цепи и присоединения легкой цепи (полу–молекулы) на пару тяжелая–легкая цепи из другой молекулы, что привело к образованию биспецифических антител. Форма обмена Fab–плечами (Fab Arm Exchange form) (cFae) представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и F_С, стабилизированный обеспечивающими гетеродимеризацию мутациями.[0028] In FIG. 9 represents TriNKET in the form of Fab arm exchange: antibodies in which Fab arms have been exchanged by replacing the heavy chain and attaching a light chain (half-molecule) to a heavy-light chain pair from another molecule, resulting in the formation of bispecific antibodies. The Fab Arm Exchange form (cFae) is a heterodimer containing 2 target-binding Fabs 1 and 2, and an F _C stabilized by mutations that enable heterodimerization.

[0029] На фиг. 10 представлено TriNKET в форме тела SEED, которое представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и F_С, стабилизированный обеспечивающими гетеродимеризацию мутациями.[0029] In FIG. 10 shows TriNKET in the form of a SEED body, which is a heterodimer containing 2 target-binding Fabs 1 and 2, and F _C stabilized by heterodimerization mutations.

[0030] На фиг. 11 представлено TriNKET в форме LuZ–Y, в котором для инициации гетеродимеризации двух различных HC используется лейциновая молния. Форма LuZ–Y представляет собой гетеродимер, содержащий два разных слитых с F_С scFab, связывающихся с мишенями 1 и 2. Гетеродимеризация обеспечивается мотивами лейциновой молнии, слитыми с С–концом F_С.[0030] In FIG. 11 presents TriNKET in the form of LuZ–Y, which uses a leucine zipper to initiate heterodimerization of two different HCs. The LuZ–Y form is a heterodimer containing two different F _C -fused scFabs that bind to targets 1 and 2. Heterodimerization is mediated by leucine zipper motifs fused to the C terminus of F _C .

[0031] На фиг. 12 представлено TriNKET в форме Cov–X–тела.[0031] In FIG. 12 shows TriNKET in the form of a Cov-X-body.

[0032] На фиг. 13A–13B представлены TriNKET в формах ĸλ–тела, которые представляют собой гетеродимерные конструкции с двумя разными Fab, слитыми с F_С, стабилизированным обеспечивающими гетеродимеризацию мутациями: Fab1, нацеленный на антиген 1, содержит каппа–LC, тогда как второй Fab, нацеленный на антиген 2, содержит лямбда–LC. На фиг. 13А показан примерный внешний вид одной из форм ĸλ–тела; на фиг. 13B показан примерный внешний вид другого ĸλ–тела.[0032] In FIG. 13A–13B represent TriNKETs in θλ body forms, which are heterodimeric constructs with two different Fabs fused to F _C stabilized by heterodimerization mutations: Fab1 targeting antigen 1 contains kappa LC, while the second Fab targeting antigen 2, contains lambda-LC. In fig. 13A shows an approximate appearance of one of the shapes of the ĸλ-body; in fig. 13B shows an approximate appearance of another ĸλ-body.

[0033] На фиг. 14 показаны линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с человеческим рекомбинантным NKG2D в анализе ИФА.[0033] In FIG. 14 shows line graphs demonstrating the binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to human recombinant NKG2D in an ELISA assay.

[0034] На фиг. 15 показаны линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D яванского макака в анализе ИФА.[0034] In FIG. 15 shows line graphs demonstrating the binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant cynomolgus NKG2D in an ELISA assay.

[0035] На фиг. 16 показаны линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D мыши в анализе ИФА.[0035] In FIG. 16 shows line graphs demonstrating the binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant mouse NKG2D in an ELISA assay.

[0036] На фиг. 17 показана гистограмма, демонстрирующая связывание NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D человека, полученная методом проточной цитометрии, которая отражает увеличение средней интенсивности флуоресценции (СИФ) относительно фона.[0036] In FIG. 17 is a flow cytometric histogram showing the binding of NKG2D binding domains (listed as clones) to EL4 cells expressing human NKG2D, which reflects the increase in mean fluorescence intensity (MFI) relative to background.

[0037] На фиг. 18 представлена гистограмма, демонстрирующая связывание NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с клетками EL4, экспрессирующими мышиный NKG2D, полученная методом проточной цитометрии, которая отражает увеличение средней интенсивности флуоресценции (СИФ) относительно фона.[0037] In FIG. 18 is a histogram showing the binding of NKG2D binding domains (listed as clones) to EL4 cells expressing murine NKG2D by flow cytometry, which reflects the increase in mean fluorescence intensity (MFI) relative to background.

[0038] На фиг. 19 представлены линейные графики, демонстрирующие специфическую аффинность связывания NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным человеческим NKG2D–F_С в условиях конкуренции с природным лигандом ULBP–6.[0038] In FIG. 19 presents line graphs demonstrating the specific binding affinity of the NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant human NKG2D-F _C in competition with the natural ligand ULBP-6.

[0039] На фиг. 20 представлены линейные графики, демонстрирующие специфическую аффинность связывания NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным человеческим NKG2D–F_С в условиях конкуренции с природным лигандом MICA.[0039] In FIG. 20 presents line graphs demonstrating the specific binding affinity of the NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant human NKG2D-F _C in competition with the natural ligand MICA.

[0040] На фиг. 21 представлены линейные графики, демонстрирующие специфическую аффинность связывания NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным мышиным NKG2D–F_С в условиях конкуренции с природным лигандом дельта Rae–1.[0040] In FIG. Figure 21 presents line graphs demonstrating the specific binding affinity of the NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant mouse NKG2D-F _C in competition with the natural ligand delta Rae-1.

[0041] На фиг. 22 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию человеческого NKG2D с помощью NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов), полученная путем количественного определения процентного содержания T–альфа–положительных клеток, экспрессирующих человеческие NKG2D–CD3 дзета слитые белки.[0041] In FIG. 22 is a histogram showing activation of human NKG2D by NKG2D binding domains (listed as clones) obtained by quantifying the percentage of T-alpha positive cells expressing human NKG2D-CD3 zeta fusion proteins.

[0042] На фиг. 23 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию мышиного NKG2D с помощью NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов), полученная путем количественного определения процента T–альфа–положительных клеток, экспрессирующих мышиные NKG2D–CD3 дзета слитые белки.[0042] In FIG. 23 is a histogram showing activation of murine NKG2D by NKG2D binding domains (listed as clones) obtained by quantifying the percentage of T-alpha positive cells expressing murine NKG2D-CD3 zeta fusion proteins.

[0043] На фиг. 24 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию человеческих NK–клеток с помощью NKG2D–связывающх доменов (перечисленных в виде клонов).[0043] In FIG. 24 is a histogram showing activation of human NK cells by NKG2D binding domains (listed as clones).

[0044] На фиг. 25 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию человеческих NK–клеток с помощью NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов).[0044] In FIG. 25 is a histogram showing activation of human NK cells by NKG2D binding domains (listed as clones).

[0045] На фиг. 26 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию мышиных NK–клеток с помощью NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов).[0045] In FIG. 26 is a histogram showing activation of murine NK cells by NKG2D binding domains (listed as clones).

[0046] На фиг. 27 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию мышиных NK–клеток с помощью NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов).[0046] In FIG. 27 is a histogram showing activation of murine NK cells by NKG2D binding domains (listed as clones).

[0047] На фиг. 28 представлена гистограмма, демонстрирующая цитотоксическое действие NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) на опухолевые клетки.[0047] In FIG. Figure 28 is a histogram showing the cytotoxic effect of NKG2D binding domains (listed as clones) on tumor cells.

[0048] На фиг. 29 представлена гистограмма, демонстрирующая температуру плавления NKG2D–связывающих доменов (перечисленных в виде клонов), измеренную методом дифференциальной сканирующей флуориметрии.[0048] In FIG. 29 is a histogram showing the melting temperature of the NKG2D binding domains (listed as clones) measured by differential scanning fluorimetry.

[0049] На фиг. 30 представлены линейные графики, показывающие профиль связывания нацеленных на BCMA TriNKET с NKG2D, экспрессируемыми клетками EL4.[0049] In FIG. 30 are line graphs showing the binding profile of BCMA-targeted TriNKET to NKG2D expressed by EL4 cells.

[0050] На фиг. 31 представлены линейные графики, показывающие профиль связывания нацеленных на BCMA TriNKET с BCMA, экспрессируемыми клетками миеломы человека MM.1S.[0050] In FIG. 31 are line graphs showing the binding profile of BCMA-targeted TriNKET to BCMA expressed by human MM.1S myeloma cells.

[0051] На фиг. 32 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию человеческих NK в культуре с BCMA–положительными клетками миеломы человека ММ.1S.[0051] In FIG. Figure 32 is a histogram showing the activation of human NK cells in culture with BCMA-positive human myeloma cells MM.1S.

[0052] На фиг. 33 представлены линейные графики, показывающие, что нацеленные на BCMA TriNKET с разными NKG2D–связывающими доменами усиливают лизис человеческих NK–клеток в клетках миеломы KMS12–PE.[0052] In FIG. 33 presents line graphs showing that BCMA-targeting TriNKETs with different NKG2D binding domains enhance the lysis of human NK cells in KMS12-PE myeloma cells.

[0053] На фиг. 34A–34C представлены гистограммы синергетической активации NK–клеток с помощью CD16 и NKG2D. На фиг. 34А показаны уровни CD107a; на фиг. 34B показаны уровни IFNγ; на фиг. 34C показаны уровни CD107a и IFNγ. На графиках показано среднее значение (n=2) ± SD. Данные получены в пяти независимых экспериментах с участием пяти разных здоровых доноров.[0053] In FIG. 34A–34C show histograms of synergistic activation of NK cells by CD16 and NKG2D. In fig. 34A shows CD107a levels; in fig. 34B shows IFNγ levels; in fig. 34C shows CD107a and IFNγ levels. Graphs show mean (n=2) ± SD. Data were obtained from five independent experiments involving five different healthy donors.

[0054] На фиг. 35 представлена гетеродимерная конструкция Oasc–Fab, которая включает Fab, связывающийся с мишенью 1, и scFab, связывающийся с мишенью 2, слитые с F_С. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в F_С.[0054] In FIG. 35 shows a heterodimeric Oasc–Fab construct that includes target-binding Fab 1 and target-binding scFab 2 fused to F _C . Heterodimerization is achieved by mutations in F _C.

[0055] На фиг. 36 представлено DuetMab, которое представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую два разных Fab, связывающихся с антигенами 1 и 2, и F_С, стабилизированный обеспечивающими гетеродимеризацию мутациями. Fab 1 и 2 содержат разные S–S мосты, обеспечивающие правильное спаривание легкой цепи (LC) с тяжелой цепью (HC).[0055] In FIG. 36 shows DuetMab, which is a heterodimeric construct containing two different Fabs that bind antigens 1 and 2, and F _C stabilized with heterodimerization mutations. Fabs 1 and 2 contain different S–S bridges that ensure proper pairing of the light chain (LC) with the heavy chain (HC).

[0056] На фиг. 37 представлено CrossmAb, которое представляет собой гетеродимерную конструкцию с двумя разными Fab, связывающимися с мишенями 1 и 2, которые слиты с F_С, стабилизированным гетеродимеризацией. Домены CL и CH1 и домены VH и VL подвергнуты переключению, например, CH1 является линейно слитым с VL, в то время как CL является линейно слитым с VH.[0056] In FIG. 37 shows CrossmAb, which is a heterodimeric construct with two different Fabs binding to targets 1 and 2, which are fused to F _C stabilized by heterodimerization. The CL and CH1 domains and the VH and VL domains are switched, for example, CH1 is linearly fused to VL while CL is linearly fused to VH.

[0057] На фиг. 38 представлено Fit–Ig, которое представляет собой гомодимерную конструкцию, в которой Fab, связывающийся с антигеном 2, слит с N–концом HC Fab, который связывается с антигеном 1. Конструкция содержит F_С дикого типа.[0057] In FIG. 38 shows Fit-Ig, which is a homodimeric construct in which a Fab that binds to antigen 2 is fused to the N-terminus of an HC Fab that binds to antigen 1. The construct contains wild-type F _C.

[0058] На фиг. 39 представлен график, показывающий, что TriNKET усиливают лизис клеток миеломы KMS12–PE, обеспечиваемый человеческими NK–клетками.[0058] In FIG. 39 is a graph showing that TriNKETs enhance KMS12-PE myeloma cell lysis mediated by human NK cells.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0059] Согласно изобретению предоставляются полиспецифические связывающие белки, которые связывают ВСМА на раковой клетке и рецептор NKG2D и рецептор CD16 на натуральных киллерных клетках, для активации натуральных киллерных клеток, фармацевтические композиции, содержащие такие полиспецифические связывающие белки, и терапевтические способы, в которых используются такие полиспецифические белки и фармацевтические композиции, в том числе для лечения рака. Различные аспекты изобретения изложены в приведенных ниже разделах; однако аспекты изобретения, описанные в одном из конкретных разделов, никоим образом не ограничены никаким другим конкретным разделом.[0059] The invention provides multispecific binding proteins that bind BCMA on a cancer cell and the NKG2D receptor and CD16 receptor on natural killer cells to activate natural killer cells, pharmaceutical compositions containing such multispecific binding proteins, and therapeutic methods using such polyspecific proteins and pharmaceutical compositions, including for the treatment of cancer. Various aspects of the invention are set forth in the following sections; however, aspects of the invention described in any particular section are in no way limited to any other specific section.

[0060] Для гарантии понимания настоящего изобретения ниже приведено определение ряда терминов и фраз.[0060] To ensure that the present invention is understood, a number of terms and phrases are defined below.

[0061] Используемое в настоящем описании единственное число означает «один или более» и включают множественное число, если из контекста в явном виде не следует иное.[0061] As used herein, the singular number means “one or more” and includes the plural unless the context clearly indicates otherwise.

[0062] Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающий участок» относится к части молекулы иммуноглобулина, которая участвует в связывании антигена. В человеческих антителах антигенсвязывающий участок образован аминокислотными остатками N–концевых вариабельных ("V") областей тяжелой ("H") и легкой ("L") цепей. Три сильно различающиеся участка в V–областях тяжелой и легкой цепей называются «гипервариабельными областями», расположенными между более консервативными фланкирующими участками, известными как «каркасные области» или «FR». Таким образом, термин «FR» относится к аминокислотным последовательностям, которые в природе расположены в иммуноглобулинах между и рядом с гипервариабельными областями. В молекуле человеческого антитела три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи расположены относительно друг друга в трехмерном пространстве, формируя антигенсвязывающую поверхность. Антигенсвязывающая поверхность является комплементарной трехмерной поверхности связанного антигена, и три гипервариабельные области каждой из тяжелых и легких цепей называются «определяющими комплементарность областями» или «CDR». У некоторых животных, таких как верблюды и хрящевые рыбы, антигенсвязывающий участок образован одной цепью антитела, обеспечивающей «однодоменное антитело». Антигенсвязывающие участки могут существовать в интактном антителе, в антигенсвязывающем фрагменте антитела, в котором сохранена антигенсвязывающая поверхность, или в рекомбинантном полипептиде, таком как scFv, в котором для соединения в одном полипептиде вариабельного домена тяжелой цепи с вариабельным доменом легкой цепи используется пептидный линкер.[0062] As used herein, the term “antigen-binding site” refers to the portion of an immunoglobulin molecule that is involved in antigen binding. In human antibodies, the antigen-binding region is formed by amino acid residues of the N-terminal variable (“V”) regions of the heavy (“H”) and light (“L”) chains. Three highly divergent regions in the V regions of the heavy and light chains are called “hypervariable regions,” located between more conserved flanking regions known as “framework regions” or “FRs.” Thus, the term "FR" refers to amino acid sequences that are naturally located in immunoglobulins between and adjacent to hypervariable regions. In a human antibody molecule, three hypervariable regions of the light chain and three hypervariable regions of the heavy chain are located relative to each other in three-dimensional space, forming the antigen-binding surface. The antigen-binding surface is complementary to the three-dimensional surface of the bound antigen, and the three hypervariable regions of each of the heavy and light chains are called “complementarity determining regions” or “CDRs”. In some animals, such as camels and cartilaginous fish, the antigen-binding region is formed by a single antibody chain, providing a "single domain antibody". The antigen binding regions may exist in an intact antibody, in an antigen binding fragment of an antibody in which the antigen binding surface is retained, or in a recombinant polypeptide, such as a scFv, in which a peptide linker is used to link a heavy chain variable domain to a light chain variable domain in one polypeptide.

[0063] Используемый в настоящем описании термин «ассоциированный с опухолью антиген» означает любой антиген, включая, без ограничения, белок, гликопротеин, ганглиозид, углевод, липид, ассоциированный с раком. Такой антиген может экспрессироваться в злокачественных клетках или в микроокружении опухоли, например в кровеносных сосудах, ассоциированных с опухолью, внеклеточном матриксе, мезенхимальной строме или иммунных инфильтратах.[0063] As used herein, the term “tumor-associated antigen” means any antigen, including, but not limited to, protein, glycoprotein, ganglioside, carbohydrate, lipid, associated with cancer. Such an antigen may be expressed in malignant cells or in the tumor microenvironment, for example in tumor-associated blood vessels, extracellular matrix, mesenchymal stroma or immune infiltrates.

[0064] Используемые в настоящем описании термины «субъект» и «пациент» относятся к организму, подверженному лечению способами и композициями, описанными в настоящем описании. Такие организмы предпочтительно включают, без ограничения, млекопитающих (например, мышей, обезьян, лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кошек и т.п.) и более предпочтительно включают людей.[0064] As used herein, the terms “subject” and “patient” refer to an organism being treated with the methods and compositions described herein. Such organisms preferably include, but are not limited to, mammals (eg, mice, monkeys, horses, cattle, pigs, dogs, cats, etc.) and more preferably include humans.

[0065] Используемый в настоящем описании термин «эффективное количество» относится к количеству соединения (например, соединения по настоящему изобретению), достаточному для достижения полезных или требуемых результатов. Эффективное количество может быть введено в виде одного или более введений, применений или дозировок и не ограничено конкретным препаратом или путем введения. Используемый в настоящем описании термин «лечение» включает любой эффект, например снижение, уменьшение, модуляцию, ослабление или устранение, который приводит к улучшению состояния, ослаблению заболевания, расстройства и т.п., или купированию его симптома.[0065] As used herein, the term “effective amount” refers to an amount of a compound (eg, a compound of the present invention) sufficient to achieve the beneficial or desired results. An effective amount may be administered in one or more administrations, applications, or dosages and is not limited to a particular formulation or route of administration. As used herein, the term “treatment” includes any effect, such as reduction, amelioration, modulation, attenuation, or elimination, that results in an improvement, alleviation of a disease, disorder, etc., or relief of a symptom thereof.

[0066] Используемый в настоящем описании термин «фармацевтическая композиция» относится к комбинации активного агента с носителем, инертным или активным, делающим композицию особенно подходящей для диагностического или терапевтического применения in vivo или ex vivo.[0066] As used herein, the term “pharmaceutical composition” refers to the combination of an active agent with a carrier, inert or active, making the composition particularly suitable for diagnostic or therapeutic use in vivo or ex vivo .

[0067] Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому стандартному фармацевтическому носителю, такому как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии (например, такие как эмульсия масло/вода или вода/масло), и различные типы смачивающих агентов. Композиции также могут включать стабилизаторы и консерванты. Примеры носителей, стабилизаторов и адъювантов см., например, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].[0067] As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to any standard pharmaceutical carrier, such as phosphate buffered saline, water, emulsions (eg, such as oil/water or water/oil emulsion), and various types of wetting agents . The compositions may also include stabilizers and preservatives. For examples of carriers, stabilizers and adjuvants, see, for example, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].

[0068] Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к любой фармацевтически приемлемой соли (например, кислоте или основанию) соединения по настоящему изобретению, которая при введении субъекту способна обеспечить образование соединения по настоящему изобретению или его активный метаболит или остаток. Как известно специалистам в данной области техники, «соли» соединений по настоящему изобретению могут быть получены из неорганических или органических кислот и оснований. Примеры кислот включают, без ограничения, соляную, бромистоводородную, серную, азотную, хлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол–п–сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, этансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин–2–сульфоновую, бензолсульфоновую кислоту и т.п. Другие кислоты, такие как щавелевая кислота, которые сами по себе хотя и не являются фармацевтически приемлемыми, могут быть использованы для получения солей, полезных в качестве промежуточных соединений при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых аддуктов кислот.[0068] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable salt” refers to any pharmaceutically acceptable salt (eg, acid or base) of a compound of the present invention that, when administered to a subject, is capable of producing the compound of the present invention or an active metabolite or residue thereof. As is known to those skilled in the art, "salts" of the compounds of the present invention can be prepared from inorganic or organic acids and bases. Examples of acids include, but are not limited to, hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, nitric, perchloric, fumaric, maleic, phosphoric, glycolic, lactic, salicylic, succinic, toluene-p-sulfonic, tartaric, acetic, citric, methanesulfonic, ethanesulfonic, formic, benzoic , malonic, naphthalene-2-sulfonic, benzenesulfonic acid, etc. Other acids, such as oxalic acid, which themselves, although not pharmaceutically acceptable, can be used to prepare salts useful as intermediates in the preparation of the compounds of the invention and their pharmaceutically acceptable acid adducts.

[0069] Типичные основания включают, без ограничения, гидроксиды щелочных металлов (например, натрия), гидроксиды щелочноземельных металлов (например, магния), аммиак и соединения формулы NW₄ ⁺, где W представляет собой C_1–4 алкил и т.п.[0069] Typical bases include, but are not limited to, alkali metal hydroxides (eg, sodium), alkaline earth metal hydroxides (eg, magnesium), ammonia, and compounds of the formula NW ₄ ⁺ where W is C _1-4 alkyl, and the like.

[0070] Примеры солей включают, без ограничения: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентан–пропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, адипафлукогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2–гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2–нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоционат, тозилат, ундеканоат и т.п. Другие примеры солей включают анионы соединений по настоящему изобретению, соединенные с подходящим катионом, таким как Na⁺, NH₄ ⁺ и NW₄ ⁺ (где W представляет собой C_1–4алкильную группу), и т.п.[0070] Examples of salts include, but are not limited to: acetate, adipate, alginate, aspartate, benzoate, benzenesulfonate, bisulfate, butyrate, citrate, camphorate, camphorsulfonate, cyclopentane propionate, digluconate, dodecyl sulfate, ethanesulfonate, fumarate, adipaflucoheptanoate, glycerophosphate, hemisulfate, heptanoate, hexanoate, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, 2-hydroxyethanesulfonate, lactate, maleate, methanesulfonate, 2-naphthalene sulfonate, nicotinate, oxalate, palmoate, pectinate, persulfate, phenylpropionate, picrate, pivalate, propionate, succinate, tartrate, thiocyanate, tosylate, undecanoate, etc. Other examples of salts include the anions of the compounds of the present invention coupled with a suitable cation such as Na ⁺ , NH ₄ ⁺ and NW ₄ ⁺ (where W represents a C _1-4 alkyl group), and the like.

[0071] Для терапевтического применения рассматриваются соли соединений по настоящему изобретению, которые являются фармацевтически приемлемыми. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, также могут найти применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения.[0071] For therapeutic use, contemplated salts of the compounds of the present invention are pharmaceutically acceptable. However, salts of acids and bases that are not pharmaceutically acceptable may also find use, for example, in the preparation or purification of a pharmaceutically acceptable compound.

[0072] В описании в местах, относящихся к композициям, раскрытым как имеющие, включающие или содержащие конкретные компоненты, или относящихся к процессам и способам, раскрытым как имеющие, включающие или содержащие конкретные этапы, предполагается, что также существуют композиции по настоящему изобретению, которые по существу состоят или состоят из перечисленных компонентов, и процессы и способы по настоящему изобретению, которые по существу состоят или состоят из перечисленных этапов обработки.[0072] Where the description refers to compositions disclosed as having, including, or containing specific components, or to processes and methods disclosed as having, including, or containing specific steps, it is intended that there are also compositions of the present invention that essentially consist of or consist of the listed components, and the processes and methods of the present invention, which essentially consist of or consist of the listed processing steps.

[0073] Как правило, процент, указанный для композиции, является весовым, если не указано иное. Кроме того, если переменная не сопровождается определением, то применимо предыдущее определение этой переменной.[0073] Typically, the percentage indicated for the composition is by weight unless otherwise stated. Additionally, if a variable is not accompanied by a definition, then the previous definition of that variable applies.

I. БЕЛКИI. PROTEINS

[0074] Изобретение относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с ВСМА на раковой клетке и рецептором NKG2D и рецептором CD16 на натуральных киллерных клетках, активируя таким образом натуральные киллерные клетки. Полиспецифические связывающие белки используются в описанных в настоящей заявке фармацевтических композициях и терапевтических способах. Связывание полиспецифического связывающего белка с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на натуральной киллерной клетке усиливает активность натуральной киллерной клетки, которая направлена на разрушение раковой клетки. Связывание полиспецифического связывающего белка с ВСМА на раковой клетке способствует сближению раковой клетки с натуральной киллерной клеткой, что облегчает прямое и опосредованное разрушение раковой клетки натуральной киллерной клеткой. Дальнейшее описание примеров полиспецифических связывающих белков приведено ниже.[0074] The invention relates to multispecific binding proteins that bind to BCMA on a cancer cell and the NKG2D receptor and CD16 receptor on natural killer cells, thereby activating natural killer cells. Polyspecific binding proteins are used in the pharmaceutical compositions and therapeutic methods described herein. The binding of polyspecific binding protein to the NKG2D receptor and CD16 receptor on the natural killer cell enhances the activity of the natural killer cell, which is aimed at destroying the cancer cell. The binding of the polyspecific binding protein to BCMA on the cancer cell promotes the approach of the cancer cell to the natural killer cell, which facilitates direct and indirect destruction of the cancer cell by the natural killer cell. Further descriptions of examples of multispecific binding proteins are provided below.

[0075] Первый компонент полиспецифических связывающих белков связывается с экспрессирующими рецептор NKG2D клетками, включающими, без ограничения, NK–клетки, γδ T–клетки и CD8⁺ αβ T–клетки. При связывании NKG2D полиспецифические связывающие белки могут блокировать связывание NKG2D с природными лигандами, такими как ULBP6 и MICA.[0075] The first component of the multispecific binding proteins binds to NKG2D receptor-expressing cells, including, but not limited to, NK cells, γδ T cells and CD8 ⁺ αβ T cells. When NKG2D binds, multispecific binding proteins can block NKG2D from binding to natural ligands such as ULBP6 and MICA.

[0076] Второй компонент полиспецифических связывающих белков связывается с экспрессирующими BCMA клетками, которые могут включать, без ограничения, клетки множественной миеломы, острого миеломоноцитарного лейкоза, Т–клеточной лимфомы, острого моноцитарного лейкоза и фолликулярной лимфомы.[0076] The second component of the multispecific binding proteins binds to BCMA-expressing cells, which may include, but are not limited to, multiple myeloma, acute myelomonocytic leukemia, T-cell lymphoma, acute monocytic leukemia and follicular lymphoma cells.

[0077] Третий компонент полиспецифических связывающих белков связывается с клетками, экспрессирующими CD16, F_С–рецептор на поверхности лейкоцитов, включающими натуральные киллерные клетки, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, тучные клетки и фолликулярные дендритные клетки.[0077] The third component of the multispecific binding proteins binds to cells expressing CD16, the F _C receptor on the surface of leukocytes, including natural killer cells, macrophages, neutrophils, eosinophils, mast cells and follicular dendritic cells.

[0078] Полиспецифические связывающие белки могут принимать несколько форматов, как показано, без ограничения, в приведенных ниже примерах. Один из форматов представляет собой гетеродимерное полиспецифическое антитело, которое включает первую тяжелую цепь иммуноглобулина, вторую тяжелую цепь иммуноглобулина и легкую цепь иммуноглобулина. Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый F_С–домен (шарнир–CH2–CH3), первый вариабельный домен тяжелой цепи и необязательно первый домен CH1 тяжелой цепи. Легкая цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи; вместе с первой тяжелой цепью иммуноглобулина легкая цепь иммуноглобулина образует антигенсвязывающий участок, который связывает NKG2D. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина содержит второй F_С–домен (ширнир–CH2–CH3), второй вариабельный домен тяжелой цепи и второй домен CH1 тяжелой цепи, которые могут спариваться с легкой цепью иммуноглобулина, идентичной той, которая спаривается с первой тяжелой цепью иммуноглобулина, за исключением того, что когда легкая цепь иммуноглобулина спарена со второй тяжелой цепью иммуноглобулина, полученный антигенсвязывающий участок связывается с ВСМА. Первый F_С–домен и второй F_С–домен вместе могут связываться с CD16 (фиг.1).[0078] Polyspecific binding proteins can take several formats, as shown, without limitation, in the examples below. One format is a heterodimeric multispecific antibody that includes a first immunoglobulin heavy chain, a second immunoglobulin heavy chain, and an immunoglobulin light chain. The first immunoglobulin heavy chain includes a first F _C domain (hinge-CH2-CH3), a first heavy chain variable domain, and optionally a first heavy chain CH1 domain. The light chain of an immunoglobulin includes a light chain variable domain and a light chain constant domain; Together with the first immunoglobulin heavy chain, the immunoglobulin light chain forms the antigen-binding site that binds NKG2D. The second immunoglobulin heavy chain contains a second F _C domain (shirnir-CH2-CH3), a second heavy chain variable domain and a second heavy chain CH1 domain, which can pair with an immunoglobulin light chain identical to that which pairs with the first immunoglobulin heavy chain, for except that when an immunoglobulin light chain is paired with a second immunoglobulin heavy chain, the resulting antigen binding site binds to BCMA. The first F _C domain and the second F _C domain together can bind to CD16 (Fig. 1).

[0079] Другой приведенный в качестве примера формат включает гетеродимерное полиспецифическое антитело, которое включает первую тяжелую цепь иммуноглобулина, легкую цепь иммуноглобулина и вторую тяжелую цепь иммуноглобулина. Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый F_С–домен (шарнир–CH2–CH3), слитый либо через линкер, либо шарнирную область антитела с одноцепочечным Fv (scFv), который связывается с NKG2D. Для связывания scFv с первым F_С–доменом или с самим scFv могут быть использованы различные линкеры. Кроме того, для стабилизации общей структуры scFv последний может включать мутации, способствующие образованию дисульфидной связи. ScFv также может включать мутации для модификации изоэлектрической точки всей первой тяжелой цепи иммуноглобулина и/или для облегчения последующей очистки. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина включает второй F_С–домен (шарнир–CH2–CH3) и второй вариабельный домен тяжелой цепи, и необязательно второй домен CH1 тяжелой цепи. Легкая цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен легкой цепи и константной домен легкой цепи. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина спаривается с легкой цепью иммуноглобулина и связывается с ВСМА. Первый F_С–домен и второй F_С–домен могут вместе связываться с CD16 (фиг.2).[0079] Another exemplary format includes a heterodimeric multispecific antibody that includes a first immunoglobulin heavy chain, an immunoglobulin light chain, and a second immunoglobulin heavy chain. The first immunoglobulin heavy chain includes the first F _C domain (hinge–CH2–CH3), fused through either a linker or the hinge region of the antibody to a single chain Fv (scFv) that binds NKG2D. Various linkers can be used to bind scFv to the first F _C domain or to scFv itself. In addition, to stabilize the overall structure of scFv, the latter may include mutations that promote disulfide bond formation. ScFv may also include mutations to modify the isoelectric point of the entire first immunoglobulin heavy chain and/or to facilitate subsequent purification. The second immunoglobulin heavy chain includes a second F _C domain (hinge-CH2-CH3) and a second heavy chain variable domain, and optionally a second heavy chain domain CH1. The light chain of an immunoglobulin includes a light chain variable domain and a light chain constant domain. The second immunoglobulin heavy chain pairs with the immunoglobulin light chain and binds to BCMA. The first F _C domain and the second F _C domain can together bind to CD16 (Fig. 2).

[0080] Один или более дополнительных мотивов связывания могут быть слиты с С–концом домена СН3 константной области, необязательно, через линкерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок может представлять собой одноцепочечную или стабилизированную дисульфидной связью вариабельную область (scFv) или может образовывать четырехвалентную или трехвалентную молекулу.[0080] One or more additional binding motifs may be fused to the C-terminus of the CH3 domain of the constant region, optionally through a linker sequence. In some embodiments, the antigen binding region may be a single chain or disulfide bond stabilized variable region (scFv) or may form a tetravalent or trivalent molecule.

[0081] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме Triomab, которое представляет собой трифункциональное биспецифическое антитело, сохранившее IgG–подобную форму. Эта химера состоит из двух полу–антител, каждое из которых содержит одну легкую и одну тяжелую цепи, происходящие от двух родительских антител.[0081] In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of Triomab, which is a trifunctional bispecific antibody retained in an IgG-like form. This chimera consists of two half-antibodies, each containing one light and one heavy chain, derived from two parent antibodies.

[0082] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок представляет собой форму KiH с общей легкой цепью (Common Light Chain) (LC), полученную с помощью технологии «выступ–во–впадину» (KIH). Технология KIH включает конструирование доменов C_H3 для создания «выступа» или «впадины» в каждой тяжелой цепи, обеспечивающих возможность гетеродимеризации. Концепция получения F_С с помощью технологии «выступ–во–впадину (KiH)» заключается в образовании «выступа» в одном домене CH3 (CH3A) путем замены небольшого остатка на объемный остаток (т.е. T366W_CH3A согласно нумерации ЕС). Для получения «выступа» на другом домене CH3 (CH3B) создают комплементарную поверхность со «впадиной» путем замены соседних остатков, ближайших к выступу, меньшими по размеру (т.е. T366S/L368A/Y407V_CH3B). Мутация «впадина» была оптимизирована посредством структурно–управляемого скрининга фаговых библиотек (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26–35). Рентгеновские кристаллические структуры KiH вариантов F_С (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C., et al., Antiparallel coormation of knob and hole aglycosylated half–antobody homodimers is mediated by a CH2–CH3 hydrophobic interaction, J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947–57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel assymetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol Immunol (2014) 58(1):132–8) показали, что гетеродимеризация является выгодной с точки зрения термодинамики за счет гидрофобных взаимодействий, возникающих благодаря пространственному соответствию (комплементарности) в интерфейсе между CH3 доменами в ядре, тогда как интерфейсы выступ–выступ и впадина–впадина не способствуют гомодимеризации из–за пространственных затруднений и, соответственно, нарушения благоприятных взаимодействий.[0082] In some embodiments, the polyspecific binding protein is a Common Light Chain (LC) form of KiH produced using knob-in-hole (KIH) technology. The KIH technology involves designing C _H 3 domains to create a “bump” or “cavity” in each heavy chain to allow heterodimerization. The concept of producing F _C using the knob-in-valley (KiH) technology is to form a knob in one CH3 domain (CH3A) by replacing a small residue with a bulky residue (i.e. T366W _CH3A according to EU numbering). To obtain a knob on another CH3 domain (CH3B), a complementary pit surface is created by replacing the adjacent residues closest to the knob with smaller ones (i.e., T366S/L368A/Y407V _CH3B ). The cavity mutation was optimized through structure-driven screening of phage libraries (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J. Mol. Biol. (1997 ) 270(1):26–35). X-ray crystal structures of KiH variants F _C (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C., et al., Antiparallel coormation of knob and hole aglycosylated half–antobody homodimers is mediated by a CH2–CH3 hydrophobic interaction, J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947–57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol Immunol (2014) 58(1):132–8) showed that heterodimerization is thermodynamically advantageous due to hydrophobic interactions arising from spatial correspondence (complementarity) at the interface between CH3 domains in the core, whereas the interfaces protrusion–protrusion and valley–valley do not promote homodimerization due to spatial hindrance and, accordingly, disruption of favorable interactions.

[0083] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами (DVD–Ig^TM), в котором мишень–связывающие домены двух моноклональных антител объединены посредством гибких встречающихся в природе линкеров, образуя четырехвалентную IgG–подобную молекулу.[0083] In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a dual variable domain immunoglobulin (DVD- ^IgTM ), in which the target binding domains of two monoclonal antibodies are combined through flexible naturally occurring linkers, forming a tetravalent IgG-like molecule.

[0084] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме ортогонального Fab интерфейса (ortho–Fab). В подходе ortho–Fab IgG (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure–based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191–8), при конструировании на основе локальной структуры в интерфейс между LC и HC_VH–CH1 вводят комплементарные мутации только в один Fab без каких–либо изменений другого Fab.[0084] In some embodiments, the polyspecific binding protein is in the form of an orthogonal Fab interface (ortho–Fab). In the ortho–Fab IgG approach (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure–based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014 ) 32(2):191–8), when designed based on local structure, complementary mutations are introduced into the interface between LC and HC _VH–CH1 in only one Fab without any changes in the other Fab.

[0085] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в формате Ig 2–в–1. В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме ES, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую два разных слитых с F_С Fab–фрагмента, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2. Гетеродимеризация обеспечивается мутацией, усиливающей электростатические взаимодействия в F_С. В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме ĸλ–тела, которое представляет собой гетеродимерные конструкции с двумя разными Fab, слитыми с F_С, стабилизированными обеспечивающими гетеродимеризацию мутациями: Fab1, нацеленный на антиген 1, содержит каппа–LC, тогда как второй Fab, нацеленный на антиген 2, содержит лямбда LC. На фиг. 13А показан пример одной формы ĸλ–тела; на фиг. 13B показан пример другого ĸλ–тела.[0085] In some embodiments, the multispecific binding protein is in a 2-in-1 Ig format. In some embodiments, the polyspecific binding protein is in the form of an ES, which is a heterodimeric construct comprising two different F _C -fused Fab fragments that bind to target 1 and target 2. Heterodimerization is mediated by a mutation that enhances electrostatic interactions in F _C . In some embodiments, the polyspecific binding protein is in the form of a θλ body that is a heterodimeric construct with two different Fabs fused to F _C stabilized by heterodimerization mutations: Fab1 targeting antigen 1 contains kappa LC, while the second Fab , targeting antigen 2, contains lambda LC. In fig. 13A shows an example of one shape of a ĸλ-body; in fig. Figure 13B shows an example of another ĸλ-body.

[0086] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме обмена Fab–плечами (антитела, в которых произошел обмен Fab–плечами путем замены тяжелой цепи и присоединенной легкой цепи (полу–молекулы) на пару тяжелая–легкая цепи из другой молекулы, что приводит к образованию биспецифических антител). В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме тела SEED. Платформа, позволяющая создавать домен путем обмена цепей, (SEED) была разработана для генерации асимметричных и биспецифических антителоподобных молекул, что расширяет возможности применения природных антител в терапевтических целях. Эта платформа, позволяющая конструировать белки, основана на обмене структурно родственных последовательностей иммуноглобулина в консервативных доменах СН3. Конструкция SEED позволяет эффективно генерировать гетеродимеры AG/GA, в то же время препятствуя гомодимеризации AG и GA в доменах CH3 в SEED. (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24 (5):447–54)). В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме LuZ–Y, в которой лейциновая молния используется для инициации гетеродимеризации двух разных HC. (Wranik, BJ. Et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331–9).[0086] In some embodiments, the polyspecific binding protein is in the form of a Fab arm exchange (an antibody in which a Fab arm has been exchanged by replacing the heavy chain and attached light chain (half-molecule) with a heavy-light chain pair from another molecule, which leads to the formation of bispecific antibodies). In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a SEED body. The Strand Exchange Enabled Domain Engineering (SEED) platform has been developed to generate asymmetric and bispecific antibody-like molecules, expanding the therapeutic applications of natural antibodies. This protein design platform is based on the exchange of structurally related immunoglobulin sequences in conserved CH3 domains. The SEED design allows efficient generation of AG/GA heterodimers while preventing AG and GA homodimerization in the CH3 domains of SEED. (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24 (5):447–54)). In some embodiments, the polyspecific binding protein is in the LuZ–Y form, in which a leucine zipper is used to initiate heterodimerization of two different HCs. (Wranik, B. J. Et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331–9).

[0087] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме Cov–X–тела. В биспецифических CovX–телах два разных пептида соединены вместе посредством разветвленного азетидинового линкера и слиты с каркасным антителом в мягких условиях сайт–специфическим образом. В то время как фармакофоры отвечают за функциональную активность, каркас антитела обеспечивает длительный период полураспада и Ig–подобное распределение. Фармакофоры могут быть химически оптимизированы или заменены другими фармакофорами для получения оптимизированных или уникальных биспецифических антител. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52); 22611–22616).[0087] In some embodiments, the polyspecific binding protein is in the form of a Cov-X body. In bispecific CovX bodies, two different peptides are linked together via a branched azetidine linker and fused to a scaffold antibody under mild conditions in a site-specific manner. While pharmacophores are responsible for functional activity, the antibody framework provides a long half-life and Ig-like distribution. Pharmacophores can be chemically optimized or replaced with other pharmacophores to produce optimized or unique bispecific antibodies. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52); 22611–22616).

[0088] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в гетеродимерной форме Oasc–Fab, которая включает Fab, связывающийся с мишенью 1, и scFab, связывающийся с мишенью 2, оба слитые с F_С. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в F_С.[0088] In some embodiments, the multispecific binding protein is in an Oasc–Fab heterodimeric form that includes a target-binding Fab 1 and a target-binding scFab 2, both fused to F _C . Heterodimerization is achieved by mutations in F _C.

[0089] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме DuetMab, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую два разных Fab, связывающихся с антигенами 1 и 2, и F_С, стабилизированный мутациями, обеспечивающими гетеродимеризацию. Fab 1 и 2 содержат разные мосты S–S, которые обеспечивают правильное спаривание LC и HC.[0089] In some embodiments, the polyspecific binding protein is in the form of a DuetMab, which is a heterodimeric construct containing two different Fabs that bind antigens 1 and 2, and an F _C stabilized by mutations allowing heterodimerization. Fabs 1 and 2 contain different S–S bridges that ensure proper LC and HC pairing.

[0090] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме CrossmAb, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию с двумя разными Fab, связывающимися с мишенями 1 и 2, которые слиты с F_С, стабилизированным гетеродимеризацией. Домены CL и CH1 и домены VH и VL подвергнуты переключению, например, CH1 является линейно слитым с VL, в то время как CL является линейно слитым с VH.[0090] In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a CrossmAb, which is a heterodimeric construct with two different target-binding Fabs 1 and 2 that are fused to an F _C stabilized by heterodimerization. The CL and CH1 domains and the VH and VL domains are switched, for example, CH1 is linearly fused to VL while CL is linearly fused to VH.

[0091] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме Fit–Ig, которая представляет собой гомодимерные конструкции, в которых Fab, связывающийся с антигеном 2, слит с N–концом HC Fab, который связывается с антигеном 1. Конструкция содержит F_С дикого типа.[0091] In some embodiments, the polyspecific binding protein is in the form of Fit-Ig, which are homodimeric constructs in which a Fab that binds to antigen 2 is fused to the N-terminus of an HC Fab that binds to antigen 1. The construct comprises an F _C wild type.

[0092] В таблице 1 перечислены пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с NKG2D.[0092] Table 1 lists the peptide sequences of heavy chain variable domains and light chain variable domains that, in combination, can bind to NKG2D.

Таблица 1Table 1 КлоныClones Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи Amino acid sequence of the heavy chain variable region Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи Amino acid sequence of the light chain variable region QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:1)
CDR1 (SEQ ID NO:64) – GSFSGYYWS
CDR2 (SEQ ID NO:65) –
EIDHSGSTNYNPSLKS
CDR3 (SEQ ID NO:66) –
ARARGPWSFDPQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:1)
CDR1 (SEQ ID NO:64) – GSFSGYYWS
CDR2 (SEQ ID NO:65) –
EIDHSGSTNYNPSLKS
CDR3 (SEQ ID NO:66) –
ARARGPWSFDP DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:2)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:2) ADI–27724ADI–27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:3)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:3) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:4)EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:4) ADI–27740
(A40)ADI–27740
(A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:5)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:5) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:6)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:6) ADI–27741ADI–27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:7)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:7) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSNSYYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:8)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSNSYYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:8) ADI–27743ADI–27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:9)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:9) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:10)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:10) ADI–28153ADI–28153 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWGFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:11)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWGFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:11) ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:12)ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:12) ADI–28226
(C26)ADI–28226
(C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:13)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:13) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:14)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:14) ADI–28154ADI–28154 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:15)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:15) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:16)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:16) ADI–29399ADI–29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:17)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:17) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:18)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:18) ADI–29401ADI–29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:19)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:19) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDIYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:20)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDIYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:20) ADI–29403ADI–29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:21)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:21) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:22)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:22) ADI–29405ADI–29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:23)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:23) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:24)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:24) ADI–29407ADI–29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:25)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:25) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:26)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:26) ADI–29419ADI–29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:27)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:27) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSFSTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:28)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSFSTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:28) ADI–29421ADI–29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:29)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:29) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYESYSTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:30)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYESYSTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:30) ADI–29424ADI–29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:31)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:31) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSFITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:32)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSFITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:32) ADI–29425ADI–29425 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:33)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:33) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:34)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:34) ADI–29426ADI–29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:35)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:35) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:36)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:36) ADI–29429ADI–29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:37)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:37) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYELYSYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:38)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYELYSYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:38) ADI–29447
(F47)ADI–29447
(F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:39)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:39) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDTFITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:40)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDTFITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:40) ADI–27727ADI–27727 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDSSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:41)
CDR1 (SEQ ID NO:67) –
GTFSSYAIS
CDR2 (SEQ ID NO:68) –
GIIPIFGTANYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:69) –
ARGDSSIRHAYYYYGMDVQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDSSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:41)
CDR1 (SEQ ID NO:67) –
GTFSSYAIS
CDR2 (SEQ ID NO:68) –
GIIPIFGTANYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:69) –
ARGDSSIRHAYYYYGMDV DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:42)
CDR1 (SEQ ID NO:70) –
KSSQSVLYSSNNKNYLA
CDR2 (SEQ ID NO:71) –
WASTRES
CDR3 (SEQ ID NO:72) –
QQYYSTPITDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:42)
CDR1 (SEQ ID NO:70) –
KSSQSVLYSSNNNKNYLA
CDR2 (SEQ ID NO:71) –
WASTRES
CDR3 (SEQ ID NO:72) –
QQYYSTPIT ADI–29443
(F43)ADI–29443
(F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSDRFHPYFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:43)
CDR1 (SEQ ID NO:73) –
GSISSSSYYWG
CDR2 (SEQ ID NO:74) –
SIYYSGSTYYNPSLKS
CDR3 (SEQ ID NO:75) –
ARGSDRFHPYFDYQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSDRFHPYFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:43)
CDR1 (SEQ ID NO:73) –
GSISSSSYYWG
CDR2 (SEQ ID NO:74) –
SIYYSGSTYYNPSLKS
CDR3 (SEQ ID NO:75) –
ARGSDRFHPYFDY EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFDTWPPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:44)
CDR1 (SEQ ID NO:76) –
RASQSVSRYLA
CDR2 (SEQ ID NO:77) –
DASNRAT
CDR3 (SEQ ID NO:78) –
QQFDTWPPTEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFDTWPPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:44)
CDR1 (SEQ ID NO:76) –
RASQSVSRYLA
CDR2 (SEQ ID NO:77) –
DASNRAT
CDR3 (SEQ ID NO:78) –
QQFDTWPPT ADI–29404
(F04)ADI–29404
(F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:95)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:95) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCEQYDSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:96)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCEQYDSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:96) ADI–28200ADI–28200 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:97)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:97) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:98)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:98) ADI–27744
(A44)ADI–27744
(A44) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:99)
CDR1 (SEQ ID NO:105) – FTFSSYAMS
CDR2 (SEQ ID NO:106) – AISGSGGSTYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:107) – AKDGGYYDSGAGDYEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:99)
CDR1 (SEQ ID NO:105) – FTFSSYAMS
CDR2 (SEQ ID NO:106) – AISGSGGSTYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:107) – AKDGGYYDSGAGDY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:100)
CDR1 (SEQ ID NO:108) – RASQGIDSWLA
CDR2 (SEQ ID NO:109) – AASSLQS
CDR3 (SEQ ID NO:110) – QQGVSYPRTDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:100)
CDR1 (SEQ ID NO:108) – RASQGIDSWLA
CDR2 (SEQ ID NO:109) – AASSLQS
CDR3 (SEQ ID NO:110) – QQGVSYPRT ADI–27749
(A49)ADI–27749
(A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:101)
CDR1 (SEQ ID NO:111) – FTFSSYSMN
CDR2 (SEQ ID NO:112) – SISSSSSYIYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:113) – ARGAPMGAAAGWFDPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:101)
CDR1 (SEQ ID NO:111) – FTFSSYSMN
CDR2 (SEQ ID NO:112) – SISSSSSYIYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:113) – ARGAPMGAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:102)
CDR1 (SEQ ID NO:114) – RASQGISSWLA
CDR2 (SEQ ID NO:115) – AASSLQS
CDR3 (SEQ ID NO:116) – QQGVSFPRTDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:102)
CDR1 (SEQ ID NO:114) – RASQGISSWLA
CDR2 (SEQ ID NO:115) – AASSLQS
CDR3 (SEQ ID NO:116) – QQGVSFPRT ADI–29463
(F63)ADI–29463
(F63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:103)
CDR1 (SEQ ID NO:117) – YTFTGYYMH
CDR2 (SEQ ID NO:118) – WINPNSGGTNYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:119) – ARDTGEYYDTDDHGMDVQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:103)
CDR1 (SEQ ID NO:117) – YTFTGYYMH
CDR2 (SEQ ID NO:118) – WINPNSGGTNYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:119) – ARDTGEYYDTDDHGMDV EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDDYWPPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:104)
CDR1 (SEQ ID NO:120) – RASQSVSSNLA
CDR2 (SEQ ID NO:121) – GASTRAT
CDR3 (SEQ ID NO:122) – QQDDYWPPTEIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDDYWPPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:104)
CDR1 (SEQ ID NO:120) – RASQSVSSNLA
CDR2 (SEQ ID NO:121) – GASTRAT
CDR3 (SEQ ID NO:122) – QQDDYWPPT

[0093] Альтернативно, вариабельный домен тяжелой цепи, определенный SEQ ID NO: 45, может быть спарен с вариабельным доменом легкой цепи, определенным SEQ ID NO: 46, образуя антигенсвязывающий участок, который может связываться с NKG2D, как показано в US 9273136.[0093] Alternatively, the heavy chain variable domain defined by SEQ ID NO: 45 can be paired with the light chain variable domain defined by SEQ ID NO: 46, forming an antigen binding region that can bind NKG2D, as shown in US 9273136.

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID: 45)QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID: 45)

QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 46)QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 46)

[0094] Альтернативно, вариабельный домен тяжелой цепи, определенный SEQ ID NO: 47, может быть спарен с вариабельным доменом легкой цепи, определенным SEQ ID NO: 48, с образованием антигенсвязывающего участка, который может связываться с NKG2D, как показано в US 7879985.[0094] Alternatively, the heavy chain variable domain defined by SEQ ID NO: 47 can be paired with the light chain variable domain defined by SEQ ID NO: 48 to form an antigen binding region that can bind NKG2D, as shown in US 7879985.

QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 47)QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 47)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 48)EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 48)

[0095] В таблице 2 перечислены пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с ВСМА.[0095] Table 2 lists the peptide sequences of heavy chain variable domains and light chain variable domains that, in combination, can bind to BCMA.

Таблица 2table 2 КлоныClones Пептидная последовательность вариабельной области тяжелой цепиHeavy chain variable region peptide sequence Пептидная последовательность вариабельной области легкой цепиLight chain variable region peptide sequence 1 (US14,776,649)1 (US14,776,649) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS
(SEQ ID NO:49)
CDR1(SEQ ID NO:50) – DYYIN
CDR2 (SEQ ID NO:51) –WIYFASGNSEYNQKFTG
CDR3 (SEQ ID NO:52) – LYDYDWYFDVQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS
(SEQ ID NO:49)
CDR1(SEQ ID NO:50) – DYYIN
CDR2 (SEQ ID NO:51) –WIYFASGNSEYNQKFTG
CDR3 (SEQ ID NO:52) – LYDYDWYFDV DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:53)
или DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:54)
CDR1(SEQ ID NO:55) – KSSQSLVHSNGNTYLH
CDR2 (SEQ ID NO:56) – KVSNRFS
CDR3 – AETSHVPWT (SEQ ID NO:57) или SQSSIYPWT (SEQ ID NO:58)DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:53)
or DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:54)
CDR1(SEQ ID NO:55) – KSSQSLVHSNGNTYLH
CDR2 (SEQ ID NO:56) – KVSNRFS
CDR3 – AETSHVPWT (SEQ ID NO:57) or SQSSIYPWT (SEQ ID NO:58) 2
(PCT/US15/64269)2
(PCT/US15/64269) QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO:59)
CDR1 (SEQ ID NO:79) – DYSIN
CDR2 (SEQ ID NO:80) – WINTETREPAYAYDFR
CDR3 (SEQ ID NO:81) – DYSYAMDYQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO:59)
CDR1 (SEQ ID NO:79) – DYSIN
CDR2 (SEQ ID NO:80) – WINTETREPAYAYDFR
CDR3 (SEQ ID NO:81) – DYSYAMDY DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:60)
CDR1 (SEQ ID NO:82) – RASESVTILGSHLIH
CDR2 (SEQ ID NO:83) – LASNVQT
CDR3 (SEQ ID NO:84) – LQSRTIPRTDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:60)
CDR1 (SEQ ID NO:82) – RASESVTILGSHLIH
CDR2 (SEQ ID NO:83) – LASNVQT
CDR3 (SEQ ID NO:84) – LQSRTIPRT 3
(US14,122,391)3
(US14,122,391) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYNGYDVLDNWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:61)
CDR1 (SEQ ID NO:85) – NYWMH
CDR2 (SEQ ID NO:86) – ATYRGHSDTYYNQKFKG
CDR3 (SEQ ID NO:87) – GAIYNGYDVLDNQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYNGYDVLDNWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:61)
CDR1 (SEQ ID NO:85) - NYWMH
CDR2 (SEQ ID NO:86) – ATYRGHSDTYYNQKFKG
CDR3 (SEQ ID NO:87) – GAIYNGYDVLDN DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR
(SEQ ID NO:62)
CDR1 (SEQ ID NO:88) – SASQDISNYLN
CDR2 (SEQ ID NO:89) – YTSNLHS
CDR3 (SEQ ID NO:90) – QQYRKLPWTDIQMTQSPSSLSSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR
(SEQ ID NO:62)
CDR1 (SEQ ID NO:88) – SASQDISNYLN
CDR2 (SEQ ID NO:89) – YTSNLHS
CDR3 (SEQ ID NO:90) – QQYRKLPWT 4
(US20170051068)4
(US20170051068) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGATAGLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:123)
CDR1: SSSYFWG (SEQ ID NO:125)
CDR2: SIYYSGITYYNPSLKS (SEQ ID NO:126)
CDR3: HDGATAGLFDY (SEQ ID NO:127)QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGATAGLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:123)
CDR1: SSSYFWG (SEQ ID NO:125)
CDR2: SIYYSGITYYNPSLKS (SEQ ID NO:126)
CDR3: HDGATAGLFDY (SEQ ID NO:127) SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:124)
CDR1: GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO:128)
CDR2: DDSDRPS (SEQ ID NO:129)
CDR3: QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO:130)SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:124)
CDR1: GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO:128)
CDR2: DDSDRPS (SEQ ID NO:129)
CDR3: QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO:130) 5
(WO2017021450)5
(WO2017021450) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGPGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:93)
CDR1: DNAMG (SEQ ID NO:131) или GFTFSDNAMG (SEQ ID:143)
CDR2: AISGPGSSTYYADSVK (SEQ ID NO:132)
CDR3: VLGWFDY (SEQ ID NO:133)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGPGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:93)
CDR1: DNAMG (SEQ ID NO:131) or GFTFSDNAMG (SEQ ID:143)
CDR2: AISGPGSSTYYADSVK (SEQ ID NO:132)
CDR3: VLGWFDY (SEQ ID NO:133) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSDEYLSWYQQKPGQAPRLLIHSASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLAISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:94)
CDR1: RASQSVSDEYLS (SEQ ID NO:134)
CDR2: SASTRAT (SEQ ID NO:135)
CDR3: QQYGYPPDFT (SEQ ID NO:136)EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASQSVSDEYLSWYQQKPGQAPRLLIHSASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLAISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:94)
CDR1: RASQSVSDEYLS (SEQ ID NO:134)
CDR2: SASTRAT (SEQ ID NO:135)
CDR3: QQYGYPPDFT (SEQ ID NO:136) 6
(WO2017021450)6
(WO2017021450) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:91)
CDR1: SYAMS (SEQ ID NO:137)
CDR2: AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:138)
CDR3: VLGWFDY (SEQ ID NO:139)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:91)
CDR1: SYAMS (SEQ ID NO:137)
CDR2: AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:138)
CDR3: VLGWFDY (SEQ ID NO:139) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:92)
RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:140)
GASSRAT (SEQ ID NO:141)
QQYGYPPDFT (SEQ ID NO:142)EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:92)
RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:140)
GASSRAT (SEQ ID NO:141)
QQYGYPPDFT (SEQ ID NO:142)

[0096] Альтернативно, новые антигенсвязывающие участки, которые могут связываться с ВСМА, могут быть идентифицированы с помощью скрининга на связывание с аминокислотной последовательностью, определенной SEQ ID NO: 63.[0096] Alternatively, novel antigen binding sites that can bind BCMA can be identified by screening for binding to the amino acid sequence defined by SEQ ID NO: 63.

SEQ ID NO: 63SEQ ID NO: 63

MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISARMLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR

[0097] В пределах F_С–домена связывание CD16 опосредовано шарнирной областью и доменом CH2. Например, в человеческом IgG1 взаимодействие с CD16 главным образом сосредоточено на аминокислотных остатках Asp 265 – Glu 269, Asn 297 – Thr 299, Ala 327 – Ile 332, Leu 234 – Ser 239 и углеводном остатке N–ацетил–D–глюкозамина в домене СН2 (см. Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267–273). Для усиления или уменьшения аффинности связывания с CD16 мутации могут быть выбраны, исходя из известных доменов, например, путем использования библиотек фагового дисплея или дрожжевого дисплея для скрининга кДНК, или могут быть разработаны, исходя из известной трехмерной структуры взаимодействия.[0097] Within the F _C domain, CD16 binding is mediated by the hinge region and the CH2 domain. For example, in human IgG1, the interaction with CD16 is mainly concentrated on the amino acid residues Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 and the carbohydrate residue N-acetyl-D-glucosamine in the CH2 domain (See Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267–273). To increase or decrease CD16 binding affinity, mutations can be selected based on known domains, for example, by using phage display or yeast display libraries to screen cDNA, or can be designed based on a known three-dimensional interaction structure.

[0098] Сборка тяжелых цепей гетеродимерных антител может осуществляться путем экспрессии двух разных последовательностей тяжелых цепей антител в одной и той же клетке, что может привести к образованию гомодимеров каждой тяжелой цепи антитела, а также гетеродимеров. Преимущественная сборка гетеродимеров может быть получена путем включения различных мутаций в домен СН3 каждой константной области тяжелой цепи антитела, как показано в US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480 и US14/830336. Например, мутации могут быть введены в домен CH3 человеческого IgG1 и включать различные пары аминокислотных замен в первом полипептиде и втором полипептиде, которые позволяют осуществить селективную гетеродимеризацию этих двух цепей друг с другом. Положения аминокислотных замен, показанные ниже, пронумерованы в соответствии с индексом ЕС, как в Kabat.[0098] Assembly of heterodimeric antibody heavy chains can be achieved by expressing two different antibody heavy chain sequences in the same cell, which can result in the formation of homodimers of each antibody heavy chain as well as heterodimers. Preferential heterodimer assembly can be achieved by introducing various mutations into the CH3 domain of each antibody heavy chain constant region, as shown in US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207 , US13/866756, US14/647480 and US14/830336. For example, mutations may be introduced into the CH3 domain of human IgG1 and include different pairs of amino acid substitutions in the first polypeptide and the second polypeptide that allow selective heterodimerization of the two chains with each other. The amino acid substitution positions shown below are numbered according to the EC index, as in Kabat.

[0099] В одном из сценариев в результате аминокислотной замены в первом полипептиде исходная аминокислота заменяется более крупной аминокислотой, выбранной из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) или триптофана (W), и в результате по меньшей мере одной аминокислотной замены во втором полипептиде исходная аминокислота(–ы) заменяется аминокислотой(–ами) меньшего размера, выбранными из аланина (A), серина (S), треонина (T) или валина (V) таким образом, чтобы замена на более крупную аминокислоту (выпуклость) соответствовала поверхности с заменами на более мелкие аминокислоты (впадина). Например, один полипептид может включать замену T366W, а другой может включать три замены, включая T366S, L368A и Y407V.[0099] In one scenario, an amino acid substitution in the first polypeptide results in the parent amino acid being replaced by a larger amino acid selected from arginine (R), phenylalanine (F), tyrosine (Y), or tryptophan (W), and resulting in at least one amino acid substitution in a second polypeptide, the original amino acid(s) are replaced by smaller amino acid(s) selected from alanine (A), serine (S), threonine (T) or valine (V) such that the substitution is with a larger amino acid (bulge) corresponded to a surface with substitutions of smaller amino acids (hollow). For example, one polypeptide may include the T366W substitution, and another may include three substitutions, including T366S, L368A, and Y407V.

[0100] Вариабельный домен тяжелой цепи антитела по изобретению необязательно может быть связан с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной константной области антитела, такой как константная область IgG, содержащая шарнирную область, домены СН2 и СН3 и необязательно домен СН1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность константной области по меньшей мере на 90% идентична константной области человеческого антитела, такой как константная область человеческого IgG1, константная область IgG2, константная область IgG3 или константная область IgG4. В некоторых других вариантах осуществления аминокислотная последовательность константной области по меньшей мере на 90% идентична константной области антитела другого млекопитающего, такого как кролик, собака, кошка, мышь или лошадь. Константная область может содержать одну или более мутаций относительно константной области человеческого IgG1, например, в Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 и/или K439. Типичные замены включают, например, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E3636K, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392, K392, K392D, T396, T39F T3F, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D и K439E.[0100] The heavy chain variable domain of an antibody of the invention may optionally be linked to an amino acid sequence that is at least 90% identical to the antibody constant region, such as an IgG constant region comprising a hinge region, CH2 and CH3 domains, and optionally a CH1 domain. In some embodiments, the amino acid sequence of the constant region is at least 90% identical to a human antibody constant region, such as a human IgG1 constant region, an IgG2 constant region, an IgG3 constant region, or an IgG4 constant region. In some other embodiments, the amino acid sequence of the constant region is at least 90% identical to the constant region of an antibody from another mammal, such as a rabbit, dog, cat, mouse, or horse. The constant region may contain one or more mutations relative to the human IgG1 constant region, for example in Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400 , D401, F405, Y407, K409, T411 and/or K439. Typical replacements include, for example, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E3636K, S364, S364, S3 64, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L36 8E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392, K392, K392D, T396, T39F T3F, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K40 9W, K409D, T411D, T411E, K439D and K439E.

[00101] В определенных вариантах осуществления мутации, которые могут быть включены в CH1 константной области человеческого IgG1, могут находиться в аминокислотах V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 и/или V173. В некоторых вариантах осуществления мутации, которые могут быть включены в Cκ константной области человеческого IgG1, могут находиться в аминокислотах E123, F116, S176, V163, S174 и/или T164.[00101] In certain embodiments, mutations that may be included in the CH1 constant region of human IgG1 may be at amino acids V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171, and/or V173. In some embodiments, mutations that may be included in the Cκ constant region of human IgG1 may be at amino acids E123, F116, S176, V163, S174, and/or T164.

[00102] Аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, показанных в таблице 3.[00102] Amino acid substitutions can be selected from the following sets of substitutions shown in Table 3.

Таблица 3Table 3 Первый полипептидFirst polypeptide Второй полипептидSecond polypeptide набор 1set 1 S364E/F405AS364E/F405A Y349K/T394FY349K/T394F набор 2set 2 S364H/D401KS364H/D401K Y349T/T411EY349T/T411E набор 3set 3 S364H/T394FS364H/T394F Y349T/F405AY349T/F405A набор 4set 4 S364E/T394FS364E/T394F Y349K/F405AY349K/F405A набор 5set 5 S364E/T411ES364E/T411E Y349K/D401KY349K/D401K набор 6set 6 S364D/T394FS364D/T394F Y349K/F405AY349K/F405A набор 7set 7 S364H/F405AS364H/F405A Y349T/T394F Y349T/T394F набор 8set 8 S364K/E357QS364K/E357Q L368D/K370SL368D/K370S набор 9set 9 L368D/K370SL368D/K370S S364KS364K набор 10 set 10 L368E/K370SL368E/K370S S364KS364K набор 11set 11 K360E/Q362EK360E/Q362E D401KD401K набор 12set 12 L368D/K370SL368D/K370S S364K/E357LS364K/E357L набор 13set 13 K370SK370S S364K/E357QS364K/E357Q набор 14set 14 F405LF405L K409RK409R набор 15 set 15 K409RK409R F405LF405L

[00103] Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, показанных в таблице 4.[00103] Alternatively, amino acid substitutions may be selected from the following sets of substitutions shown in Table 4.

Таблица 4Table 4 Первый полипептидFirst polypeptide Второй полипептидSecond polypeptide набор 1set 1 K409WK409W D399V/F405TD399V/F405T набор 2set 2 Y349SY349S E357WE357W набор 3set 3 K360EK360E Q347RQ347R набор 4set 4 K360E/K409WK360E/K409W Q347R/D399V/F405TQ347R/D399V/F405T набор 5set 5 Q347E/K360E/K409WQ347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405TQ347R/D399V/F405T набор 6set 6 Y349S/K409WY349S/K409W E357W/D399V/F405TE357W/D399V/F405T

[00104] Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующего набора замен, показанного в таблице 5.[00104] Alternatively, amino acid substitutions may be selected from the following set of substitutions shown in Table 5.

Таблица 5Table 5 Первый полипептидFirst polypeptide Второй полипептидSecond polypeptide набор 1set 1 T366K/L351KT366K/L351K L351D/L368EL351D/L368E набор 2set 2 T366K/L351KT366K/L351K L351D/Y349EL351D/Y349E набор 3set 3 T366K/L351KT366K/L351K L351D/Y349DL351D/Y349D набор 4set 4 T366K/L351KT366K/L351K L351D/Y349E/L368EL351D/Y349E/L368E набор 5set 5 T366K/L351KT366K/L351K L351D/Y349D/L368EL351D/Y349D/L368E набор 6set 6 E356K/D399KE356K/D399K K392D/K409DK392D/K409D

[00105] Альтернативно, по меньшей мере, одна аминокислотная замена в каждой полипептидной цепи может быть выбрана из Таблицы 6.[00105] Alternatively, at least one amino acid substitution in each polypeptide chain can be selected from Table 6.

Таблица 6Table 6 Первый полипептидFirst polypeptide Второй полипептидSecond polypeptide L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I, Y407VL351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I, Y407V T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D и T411ET366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D and T411E

[00106] Альтернативно, по меньшей мере, одна аминокислотная замена может быть выбрана из следующего набора замен, показанного в Таблице 7, где положение(я), указанное(ые) в столбце «Первый полипептид», заменено любой известной отрицательно заряженной аминокислотой, и положение(я), указанное(ые) в столбце «Второй полипептид», заменено(ы) любой известной положительно заряженной аминокислотой.[00106] Alternatively, the at least one amino acid substitution may be selected from the following set of substitutions shown in Table 7, wherein the position(s) indicated in the "First Polypeptide" column is replaced by any known negatively charged amino acid, and the position(s) listed in the Second Polypeptide column are replaced by any known positively charged amino acid.

Таблица 7Table 7 Первый полипептидFirst polypeptide Второй полипептидSecond polypeptide K392, K370, K409 или K439K392, K370, K409 or K439 D399, E356 или E357D399, E356 or E357

[00107] Альтернативно, по меньшей мере, одна аминокислотная замена может быть выбрана из следующего набора, показанного в Таблице 8, где положение(я), указанное(ые) в столбце «Первый полипептид», заменено(ы) любой известной положительно заряженной аминокислотой, и положение(я), указанное(ые) столбце «Второй полипептид», заменено(ы) любой известной отрицательно заряженной аминокислотой.[00107] Alternatively, the at least one amino acid substitution may be selected from the following set shown in Table 8, wherein the position(s) indicated in the "First Polypeptide" column is replaced with any known positively charged amino acid , and the position(s) indicated in the “Second Polypeptide” column are replaced by any known negatively charged amino acid.

Таблица 8Table 8 Первый полипептидFirst polypeptide Второй полипептидSecond polypeptide D399, E356 или E357D399, E356 or E357 K409, K439, K370 или K392K409, K439, K370 or K392

[00108] В качестве альтернативы или в дополнение структурная стабильность гетеромультимерного белка может быть увеличена путем введения S354C в первую или вторую полипептидную цепь и Y349C в противоположную полипептидную цепь с образованием таким образом искусственного дисульфидного мостика в интерфейсе между двумя полипептидами.[00108] Alternatively or in addition, the structural stability of a heteromultimeric protein can be increased by introducing S354C into the first or second polypeptide chain and Y349C into the opposite polypeptide chain, thereby forming an artificial disulfide bridge at the interface between the two polypeptides.

[00109] Полиспецифические белки, описанные выше, могут быть получены методом рекомбинантной ДНК, хорошо известным специалисту в данной области. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первую тяжелую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована в первый вектор экспрессии; вторая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вторую тяжелую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована во второй вектор экспрессии; третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь иммуноглобулина, можно клонировать в третий вектор экспрессии; первый, второй и третий векторы экспрессии вместе могут быть стабильно трансфицированы в клетки–хозяева для продуцирования мультимерных белков.[00109] The polyspecific proteins described above can be produced by recombinant DNA techniques well known to one skilled in the art. For example, a first nucleic acid sequence encoding a first immunoglobulin heavy chain may be cloned into a first expression vector; a second nucleic acid sequence encoding a second immunoglobulin heavy chain may be cloned into a second expression vector; a third nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin light chain can be cloned into a third expression vector; the first, second and third expression vectors together can be stably transfected into host cells to produce multimeric proteins.

[00110] Для получения максимального выхода полиспецифического белка можно исследовать различные соотношения первого, второго и третьего векторов экспрессии с тем, чтобы определить оптимальное соотношение для трансфекции в клетки–хозяева. После трансфекции могут быть выделены отдельные клоны для создания банка клеток методами, известными в данной области, такими как ограниченное разведение, ИФА, FACS, микроскопия или Clonepix.[00110] To obtain maximum polyspecific protein yield, various ratios of the first, second, and third expression vectors can be examined to determine the optimal ratio for transfection into host cells. After transfection, individual clones can be isolated to create a cell bank by methods known in the art, such as limited dilution, ELISA, FACS, microscopy or Clonepix.

[00111] Клоны можно культивировать в условиях, подходящих для роста в биореакторе и поддержания экспрессии полиспецифического белка. Полиспецифические белки могут быть выделены и очищены способами, известными в данной области техники, включая центрифугирование, глубинную фильтрацию, лизис клеток, гомогенизацию, замораживание–оттаивание, аффинную очистку, гель–фильтрацию, ионообменную хроматографию, обменную хроматографию гидрофобного взаимодействия и хроматографию в смешанном режиме.[00111] Clones can be cultured under conditions suitable for growth in a bioreactor and maintenance of polyspecific protein expression. Multispecific proteins can be isolated and purified by methods known in the art, including centrifugation, depth filtration, cell lysis, homogenization, freeze-thaw, affinity purification, gel filtration, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction exchange chromatography and mixed-mode chromatography.

II. Характеристика TriNKETII. Characteristics of TriNKET

[00112] В определенных вариантах осуществления описанные в настоящей заявке TriNKET, которые включают NKG2D–связывающий домен и домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген, связываются с клетками, экспрессирующими человеческий NKG2D. В некоторых вариантах осуществления TriNKET, которые включают NKG2D–связывающий домен и домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген, связываются с ассоциированным с опухолью антигеном на уровне, сопоставимом с таковым для моноклонального антитела, имеющего такой же домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген.[00112] In certain embodiments, the TriNKETs described herein, which include an NKG2D binding domain and a tumor associated antigen binding domain, bind to cells expressing human NKG2D. In some embodiments, TriNKETs that include an NKG2D binding domain and a tumor-associated antigen binding domain bind to a tumor-associated antigen at a level comparable to that of a monoclonal antibody having the same tumor-associated antigen binding domain.

[00113] TriNKET, описанные в настоящей заявке, более эффективно снижают рост опухоли и уничтожают раковые клетки.[00113] TriNKETs described herein are more effective in reducing tumor growth and killing cancer cells.

[00114] В определенных вариантах осуществления описанные в настоящей заявке TriNKET, которые включают NKG2D–связывающий домен и домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген, активируют первичные человеческие NK–клетки в условиях культивирования с опухолевыми клетками, экспрессирующими этот антиген. Активация NK–клеток характеризуется увеличением дегрануляции CD107a и продуцирования цитокинов IFNγ. Кроме того, по сравнению с моноклональным антителом, которое включает домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген, TriNKET демонстрируют превосходную активацию человеческих NK–клеток в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих этот антиген. Например, по сравнению с анти–BCMA моноклональным антителом TriNKET по настоящему изобретению, имеющие BCMA–связывающий домен, демонстрируют превосходную активацию человеческих NK–клеток в присутствии BCMA–экспрессирующих раковых клеток.[00114] In certain embodiments, the TriNKETs described herein, which include an NKG2D binding domain and a tumor-associated antigen binding domain, activate primary human NK cells when cultured with tumor cells expressing the antigen. Activation of NK cells is characterized by increased CD107a degranulation and production of IFNγ cytokines. Additionally, compared to a monoclonal antibody that includes a tumor-associated antigen binding domain, TriNKETs demonstrate superior activation of human NK cells in the presence of tumor cells expressing this antigen. For example, compared with the anti-BCMA monoclonal antibody, the TriNKETs of the present invention having a BCMA binding domain demonstrate superior activation of human NK cells in the presence of BCMA-expressing cancer cells.

[00115] В определенных вариантах осуществления описанные в настоящей заявке TriNKET, включающие NKG2D–связывающий домен и домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген, усиливают активность покоящихся и IL–2–активированных человеческих NK–клеток в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих этот антиген. Покоящиеся NK–клетки показали более слабое фоновое продуцирование IFNγ и дегрануляцию CD107a, чем IL–2–активированные NK–клетки. В некоторых вариантах осуществления покоящиеся NK–клетки демонстрируют более сильное изменение продуцирования IFNγ и дегрануляции CD107a по сравнению с IL–2–активированными NK–клетками. В некоторых вариантах осуществления IL–2–активированные NK–клетки показывают более высокий процент клеток, ставших IFNγ+; CD107a+ после стимуляции с помощью TriNKET.[00115] In certain embodiments, the TriNKETs described herein, comprising an NKG2D binding domain and a tumor-associated antigen binding domain, enhance the activity of resting and IL-2-activated human NK cells in the presence of tumor cells expressing the antigen. Resting NK cells showed weaker background IFNγ production and CD107a degranulation than IL-2-activated NK cells. In some embodiments, resting NK cells exhibit a greater change in IFNγ production and CD107a degranulation compared to IL-2-activated NK cells. In some embodiments, IL-2–activated NK cells exhibit a higher percentage of cells becoming IFNγ+; CD107a+ after stimulation with TriNKET.

[00116] В определенных вариантах осуществления описанные в настоящей заявке TriNKET, которые включают NKG2D–связывающий домен и домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген BCMA, усиливают цитотоксическую активность покоящихся и IL–2–активированных человеческих NK–клеток в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих этот антиген. Кроме того, TriNKET (например, A40–TriNKET, A44–TriNKET, A49–TriNKET, C26–TriNKET, F04–TriNKET, F43–TriNKET, F47–TriNKET и F63–TriNKET), которые включают домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген BCMA, более мощно направляют ответ активированных и покоящихся NK–клеток против клеток опухоли по сравнению с моноклональным антителом, которое включает такой же участок связывания с ассоциированным с опухолью антигеном. В некоторых вариантах осуществления TriNKET имеют преимущество в борьбе с опухолевыми клетками, экспрессирующими средний и низкий уровни ВСМА, по сравнению с моноклональными антителами, которые включают ВСМА–связывающий участок. Следовательно, терапия, включающая TriNKET, может быто более эффективной чем терапия анти–BCMA моноклональными антителами.[00116] In certain embodiments, the TriNKETs described herein, which include an NKG2D binding domain and a BCMA tumor-associated antigen binding domain, enhance the cytotoxic activity of resting and IL-2-activated human NK cells in the presence of tumor cells expressing this antigen. In addition, TriNKETs (eg, A40–TriNKET, A44–TriNKET, A49–TriNKET, C26–TriNKET, F04–TriNKET, F43–TriNKET, F47–TriNKET, and F63–TriNKET), which include a BCMA tumor-associated antigen binding domain , more potently direct the response of activated and resting NK cells against tumor cells compared to a monoclonal antibody that includes the same binding site for a tumor-associated antigen. In some embodiments, TriNKETs have an advantage in targeting tumor cells expressing intermediate and low levels of BCMA compared to monoclonal antibodies that include a BCMA binding site. Therefore, therapy including TriNKET may be more effective than anti-BCMA monoclonal antibody therapy.

[00117] В определенных вариантах осуществления, описанные в настоящей заявке TriNKET (например, A40–TriNKET, A44–TriNKET, A49–TriNKET, C26–TriNKET, F04–TriNKET, F43–TriNKET, F47–TriNKET и F63–TriNKET), которые включают домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген ВСМА, имеют преимущество относительно моноклональных антител в лечении видов рака, для которых характерна высокая экспрессия F_С–рецептора (F_СR), или видов рака в микроокружении опухолей с высокими уровнями F_СR. Моноклональные антитела оказывают влияние на рост опухоли посредством множества механизмов, включая, среди прочего, ADCC, CDC, фагоцитоз и сигнальную блокаду. Среди FcγR CD16 имеет самое низкое сродство к F_С IgG; FcγRI (CD64) является высокоаффинным F_СR, который связывается с F_С IgG примерно в 1000 раз сильнее, чем CD16. CD64 обычно экспрессируется во многих гематопоэтических линиях, таких как миелоидная линия, и может экспрессироваться в опухолях, происходящих из этих типов клеток, таких как острый миелолейкоз (ОМЛ). Иммунные клетки, проникающие в опухоль, такие как MDSC и моноциты, также экспрессируют CD64 и, как известно, проникают в микроокружение опухоли. Экспрессия CD64 опухолью или в микроокружении опухоли может оказывать негативное влияние на терапию моноклональными антителами. Экспрессия CD64 в микроокружении опухоли затрудняет взаимодействие этих антител с CD16 на поверхности NK–клеток, поскольку антитела предпочитают связываться с рецептором, имеющим высокое сродство. TriNKET, за счет направленного воздействия двух активирующих рецепторов на поверхность NK–клеток, могут преодолеть пагубное влияние экспрессии CD64 (либо в опухоли, либо в микроокружении опухоли) на терапию моноклональными антителами. Независимо от экспрессии CD64 в опухолевых клетках, TriNKET способны опосредовать ответы человеческих NK–клеток против всех опухолевых клеток, поскольку двойное нацеливание двух активирующих рецепторов на NK–клетки обеспечивает более сильное специфическое связывание с NK–клетками.[00117] In certain embodiments described herein, TriNKETs (e.g., A40–TriNKET, A44–TriNKET, A49–TriNKET, C26–TriNKET, F04–TriNKET, F43–TriNKET, F47–TriNKET, and F63–TriNKET), which include the BCMA tumor-associated antigen-binding domain and have an advantage over monoclonal antibodies in the treatment of cancers characterized by high F _C receptor (F _C R) expression or cancers in the tumor microenvironment with high levels of F _C R. Monoclonal antibodies influence tumor growth through multiple mechanisms including, but not limited to, ADCC, CDC, phagocytosis, and signal blockade. Among the FcγRs, CD16 has the lowest affinity for F _C IgG; FcγRI (CD64) is a high-affinity F _C R that binds to F _C IgG approximately 1000 times stronger than CD16. CD64 is commonly expressed in many hematopoietic lineages, such as the myeloid lineage, and can be expressed in tumors derived from these cell types, such as acute myeloid leukemia (AML). Tumor-infiltrating immune cells, such as MDSCs and monocytes, also express CD64 and are known to infiltrate the tumor microenvironment. Expression of CD64 by the tumor or in the tumor microenvironment may have a negative impact on monoclonal antibody therapy. The expression of CD64 in the tumor microenvironment makes it difficult for these antibodies to interact with CD16 on the surface of NK cells, since the antibodies prefer to bind to the receptor with high affinity. TriNKETs, by targeting two activating receptors on the surface of NK cells, may overcome the detrimental effects of CD64 expression (either in the tumor or in the tumor microenvironment) on monoclonal antibody therapy. Regardless of CD64 expression on tumor cells, TriNKETs are capable of mediating human NK cell responses against all tumor cells because dual targeting of two NK cell activating receptors allows for stronger NK cell specific binding.

[00118] В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящей заявке TriNKET (например, A40–TriNKET, A44–TriNKET, A49–TriNKET, C26–TriNKET, F04–TriNKET, F43–TriNKET, F47–TriNKET и F63–TriNKET), которые включают домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген BCMA, обеспечивают улучшенный профиль безопасности благодаря уменьшению внеопухолевых побочных эффектов. Натуральные киллерные клетки и CD8 T–клетки способны непосредственно лизировать опухолевые клетки, хотя механизмы распознавания нормальных аутоклеток и опухолевых клеток у NK–клеток и CD8 T–клеток отличаются. Активность NK–клеток регулируется балансом сигналов, поступающих от активирующих (NCR, NKG2D, CD16 и т.д.) и ингибирующих (KIR, NKG2A и т.д.) рецепторов. Баланс этих активирующих и ингибирующих сигналов позволяет NK–клеткам отличать здоровые аутоклетки от подвергнутых стрессу, инфицированных вирусом или трансформированных аутоклеток. Этот «встроенный» механизм аутотолерантности позволяет защищать нормальную здоровую ткань от ответов NK–клеток. Для расширения этого принципа, исходя из аутотолерантности NK–клеток, можно с помощью TriNKET оказывать направленное воздействие на антигены, экспрессируемые как в самих этих клетках, так и в опухолях, не вызывая при этом внеопухолевых побочных эффектов или с увеличенным терапевтическим окном. В отличие от натуральных киллерных клеток для Т–клеток необходимо распознавание специфического пептида, презентированного молекулами МНС, для активации и осуществления эффекторных функций. Т–клетки были основной целью иммунотерапии, и было разработано много стратегий для перенаправления Т–клеточных ответов против опухоли. Биспецифические Т–клетки, ингибиторы контрольных точек и CAR–T–клетки были одобрены FDA, но их недостатком часто оказывалась токсичность, которая является причиной ограничения дозы. Биспецифические Т–клетки и клетки CAR–T работают на уровне системы распознавания TCR–MHC, используя связывающие домены для нацеливания антигенов на поверхность опухолевых клеток и сконструированные сигнальные домены для передачи сигналов активации в эффекторную клетку. Несмотря на то, что эти методы лечения эффективны для вызова противоопухолевого иммунного ответа, они часто сопровождаются синдромом высвобождения цитокинов (CRS) и внеопухолевыми побочными эффектами. TriNKET уникальны в этом контексте, так как они не «перекрывают» природные системы активации и ингибирования NK–клеток. Вместо этого TriNKET предназначены для изменения баланса и обеспечения дополнительных сигналов активации NK–клеток, сохраняя при этом NK–толерантность к здоровым клеткам.[00118] In some embodiments, the TriNKETs described herein (e.g., A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, and F63-TriNKET), which include tumor-associated antigen-binding domain BCMA provide an improved safety profile due to reduced non-tumor side effects. Natural killer cells and CD8 T cells are capable of directly lysing tumor cells, although the mechanisms of recognition of normal autocells and tumor cells differ between NK cells and CD8 T cells. The activity of NK cells is regulated by the balance of signals coming from activating (NCR, NKG2D, CD16, etc.) and inhibitory (KIR, NKG2A, etc.) receptors. The balance of these activating and inhibitory signals allows NK cells to distinguish healthy self-cells from stressed, virus-infected or transformed self-cells. This “built-in” mechanism of self-tolerance allows one to protect normal healthy tissue from NK cell responses. To expand this principle, based on the autotolerance of NK cells, TriNKET can be used to target antigens expressed both in these cells themselves and in tumors, without causing extra-tumor side effects or with an increased therapeutic window. Unlike natural killer cells, T cells require recognition of a specific peptide presented by MHC molecules to activate and carry out effector functions. T cells have been a major target of immunotherapy, and many strategies have been developed to redirect T cell responses against the tumor. Bispecific T cells, checkpoint inhibitors, and CAR T cells have been approved by the FDA, but they often suffer from toxicity, which causes dose restrictions. Bispecific T cells and CAR-T cells operate at the level of the TCR-MHC recognition system, using binding domains to target antigens to the surface of tumor cells and engineered signaling domains to transmit activation signals to the effector cell. Although these treatments are effective in eliciting an antitumor immune response, they are often associated with cytokine release syndrome (CRS) and nontumor side effects. TriNKETs are unique in this context because they do not override natural NK cell activation and inhibition systems. Instead, TriNKETs are designed to alter the balance and provide additional NK cell activation signals while maintaining NK tolerance to healthy cells.

[00119] В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящей заявке TriNKET, включающие NKG2D–связывающий домен (например, A40–TriNKET, A44–TriNKET, A49–TriNKET, C26–TriNKET, F04–TriNKET, F43–TriNKET, F47–TriNKET и F63–TriNKET) и домен, связывающий ассоциированный с опухолью антиген BCMA, задерживают прогрессирование опухоли более эффективно, чем моноклональные антитела, которые включают такой же домен, связывающий опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления TriNKET, включающие NKG2D–связывающий домен и домен, связывающий опухолевый антиген BCMA, являются более эффективными против метастазов рака, чем моноклональные антитела, которые включают анти–ВСМА–связывающий домен.[00119] In some embodiments, the TriNKETs described herein include an NKG2D binding domain (e.g., A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, and F63 –TriNKET) and the BCMA tumor-associated antigen-binding domain delay tumor progression more effectively than monoclonal antibodies that include the same tumor antigen-binding domain. In some embodiments, TriNKETs that include an NKG2D binding domain and a BCMA tumor antigen binding domain are more effective against cancer metastases than monoclonal antibodies that include an anti-BCMA binding domain.

III. Терапевтическое применениеIII. Therapeutic Use

[00120] Изобретение относится к способам лечения рака с помощью полиспецифического связывающего белка, описанного в настоящей заявке, и/или фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке. Способы могут быть использованы для лечения различных видов рака, которые экспрессируют BCMA, путем введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества полиспецифического связывающего белка, описанного в настоящей заявке.[00120] The invention relates to methods of treating cancer using a polyspecific binding protein described herein and/or a pharmaceutical composition described herein. The methods can be used to treat various cancers that express BCMA by administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of the multispecific binding protein described herein.

[00121] Терапевтический способ можно охарактеризовать в зависимости от рака, подлежащего лечению. Например, в определенных вариантах осуществления злокачественные новообразования происходят из клеток крови или костного мозга. Типичные примеры включают множественную миелому, острый миеломоноцитарный лейкоз, Т–клеточную лимфому, острый моноцитарный лейкоз и фолликулярную лимфому. Т–клеточные лимфомы могут включать лимфобластные лимфомы из Т–клеток–предшественников, периферические Т–клеточные лимфомы, кожные Т–клеточные лимфомы, ангиоиммунобластные Т–клеточные лимфомы, экстранодальные NK/Т–клеточные лимфомы, Т–клеточные лимфомы, ассоциированные с энтеропатией, подкожную панникулит–подобную Т–клеточную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому или периферическую Т–клеточную лимфому.[00121] The therapeutic method can be characterized depending on the cancer being treated. For example, in certain embodiments, malignancies originate from blood or bone marrow cells. Common examples include multiple myeloma, acute myelomonocytic leukemia, T-cell lymphoma, acute monocytic leukemia, and follicular lymphoma. T-cell lymphomas may include lymphoblastic T-cell progenitor lymphomas, peripheral T-cell lymphomas, cutaneous T-cell lymphomas, angioimmunoblastic T-cell lymphomas, extranodal NK/T-cell lymphomas, enteropathy-associated T-cell lymphomas, subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma, anaplastic large cell lymphoma or peripheral T-cell lymphoma.

[00122] В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой В–клеточную лимфому, такую как диффузная В–клеточная крупноклеточная лимфома, первичную средостенную В–клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, малую лимфоцитарную лимфому, мантийноклеточную лимфому, В–клеточную лимфому маргинальной зоны, экстранодальную B–клеточную лимфому маргинальной зоны, нодальную B–клеточную лимфому маргинальной зоны, B–клеточную лимфому маргинальной зоны селезенки, лимфому Беркитта, лимфоплазмоцитарную лимфому, волосатоклеточный лейкоз или первичную лимфому центральной нервной системы (ЦНС).[00122] In some embodiments, the cancer is a B cell lymphoma, such as diffuse large B cell lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma, follicular lymphoma, small lymphocytic lymphoma, mantle cell lymphoma, marginal zone B cell lymphoma, extranodal B -marginal zone lymphoma, nodal B-cell marginal zone lymphoma, splenic B-cell marginal zone lymphoma, Burkitt's lymphoma, lymphoplasmacytic lymphoma, hairy cell leukemia, or primary central nervous system (CNS) lymphoma.

[00123] В некоторых других вариантах осуществления рак представляет собой солидную опухоль, такую как рак головного мозга, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак ободочной и прямой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, лейкоз, рак легких, рак печени, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак прямой кишки, рак почки, рак желудка, рак яичка или рак матки. В других вариантах осуществления рак представляет собой васкуляризованную опухоль, плоскоклеточный рак, аденокарциному, мелкоклеточный рак, меланому, глиому, нейробластому, саркому (например, ангиосаркому или хондросаркому), рак гортани, рак околоушной железы, рак желчных путей, рак щитовидной железы, акральную лентигинозную меланому, актинический кератоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, аденоидно–кистозную карциному, аденомы, аденосаркому, аденосквамозную карциному, рак анального канала, анальный рак, аноректальный рак, астроцитарную опухоль, карциному бартолиновой железы, базально–клеточную карциному, рак желчных протоков, рак костей, рак костного мозга, рак бронхов, рак бронхиальной железы, карциноид, холангиокарциному, хондосаркому, папиллому/карциному хориоидного сплетения, хронический лимфолейкоз, хроническую миелоидную лейкемию, светлоклеточный рак, рак соединительной ткани, цистаденому, рак пищеварительной системы, рак двенадцатиперстной кишки, рак эндокринной системы, опухоль эндодермального синуса, гиперплазию эндометрия, эндометриальную стромальную саркому, эндометриоидную аденокарциному, эндотелиальный рак, эпендимальный рак, эпителиально–клеточный рак, саркому Юинга, рак глаз и орбиты, рак женских половых органов, фокальную узловую гиперплазию, рак желчного пузыря, рак антрума желудка, рак дна желудка, гастриному, глиобластому, глюкогоному, рак сердца, гемангиобластому, гемангиоэндотелиому, гемангиомы, печеночную аденому, печеночный аденоматоз, рак гепатобилиарной системы, гепатоцеллюлярную карциному, болезнь Ходжкина, рак подвздошной кишки, инсулиному, интраэпителиальную неоплазию, плоскоклеточную интраэпителиальную неоплазию, рак внутрипеченочных желчных протоков, инвазивную плоскоклеточную карциному, рак тощей кишки, рак суставов, саркому Капоши, рак таза, крупноклеточную карциному, рак задней кишки, лейомиосаркому, злокачественную лентиго–меланому, лимфому, рак мужских половых органов, злокачественную меланому, злокачественные мезотелиальные опухоли, медуллобластому, медуллоэпителиому, менингеальный рак, мезотелиальный рак, метастатический рак, рак рта, мукоэпидермоидный рак, множественную миелому, рак мышц, рак носового канала, рак нервной системы, нейроэпителиальную аденокарциному, узловую меланому, неэпителиальный рак кожи, неходжкинскую лимфому, овсяно–клеточный рак, олигодендроглиальный рак, рак ротовой полости, остеосаркому, папиллярную серозную аденокарциному, рак полового члена, рак глотки, опухоли гипофиза, плазмоцитому, псевдосаркому, легочную бластому, рак прямой кишки, почечно–клеточный рак, рак дыхательной системы, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому, серозную карциному, рак пазухи, рак кожи, мелкоклеточный рак, рак тонкой кишки, рак гладких мышц, рак мягких тканей, соматостатин–секретирующую опухоль, рак позвоночника, плоскоклеточную карциному, рак поперечно–полосатой мускулатуры, субмезотелиальный рак, поверхностно распространяющуюся меланому, Т–клеточный лейкоз, рак языка, недифференцированный рак, рак мочеточника, рак мочеиспускательного канала, рак мочевого пузыря, рак мочевой системы, рак шейки матки, рак тела матки, увеальную меланому, рак влагалища, веррукозную карциному, ВИПому, рак вульвы, хорошо дифференцированную карциному или опухоль Вильмса.[00123] In some other embodiments, the cancer is a solid tumor, such as brain cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, leukemia, lung cancer, liver cancer, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, colorectal cancer, kidney cancer, stomach cancer, testicular cancer or uterine cancer. In other embodiments, the cancer is a vascularized tumor, squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, small cell carcinoma, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma (e.g., angiosarcoma or chondrosarcoma), laryngeal cancer, parotid cancer, biliary tract cancer, thyroid cancer, acral lentiginosis melanoma, actinic keratosis, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, adenoid cystic carcinoma, adenomas, adenosarcoma, adenosquamous carcinoma, anal cancer, anal cancer, anorectal cancer, astrocytic tumor, Bartholin gland carcinoma, basal cell carcinoma, bile duct cancer , bone cancer, bone marrow cancer, bronchial cancer, bronchial gland cancer, carcinoid, cholangiocarcinoma, chondosarcoma, choroid plexus papilloma/carcinoma, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, clear cell cancer, connective tissue cancer, cystadenoma, digestive system cancer, duodenal cancer , endocrine system cancer, endodermal sinus tumor, endometrial hyperplasia, endometrial stromal sarcoma, endometrioid adenocarcinoma, endothelial cancer, ependymal cancer, epithelial cell cancer, Ewing's sarcoma, eye and orbital cancer, cancer of the female genital organs, focal nodular hyperplasia, gallbladder cancer , gastric antrum cancer, gastric fundus cancer, gastrinoma, glioblastoma, glucogonoma, heart cancer, hemangioblastoma, hemangioendothelioma, hemangiomas, hepatic adenoma, hepatic adenomatosis, hepatobiliary cancer, hepatocellular carcinoma, Hodgkin's disease, ileal cancer, insulinoma, intraepithelial neoplasia, squamous accurate intraepithelial neoplasia, intrahepatic bile duct cancer, invasive squamous cell carcinoma, jejunal cancer, joint cancer, Kaposi's sarcoma, pelvic cancer, large cell carcinoma, hindgut cancer, leiomyosarcoma, lentigo-melanoma maligna, lymphoma, male genital cancer, malignant melanoma, malignant mesothelial tumors, medulloblastoma, medulloepithelioma, meningeal cancer, mesothelial cancer, metastatic cancer, oral cancer, mucoepidermoid cancer, multiple myeloma, muscle cancer, nasal canal cancer, nervous system cancer, neuroepithelial adenocarcinoma, nodular melanoma, non-epithelial skin cancer, non-Hodgkin's lymphoma, oatmeal – cell carcinoma, oligodendroglial cancer, oral cancer, osteosarcoma, papillary serous adenocarcinoma, penile cancer, pharyngeal cancer, pituitary tumors, plasmacytoma, pseudosarcoma, pulmonary blastoma, rectal cancer, renal cell carcinoma, respiratory system cancer, retinoblastoma, rhabdomyosarcoma , sarcoma, serous carcinoma, sinus cancer, skin cancer, small cell cancer, small bowel cancer, smooth muscle cancer, soft tissue cancer, somatostatin-secreting tumor, spinal cancer, squamous cell carcinoma, striated muscle cancer, submesothelial cancer, superficial spreading melanoma , T-cell leukemia, tongue cancer, undifferentiated cancer, ureter cancer, urethral cancer, bladder cancer, urinary system cancer, cervical cancer, uterine body cancer, uveal melanoma, vaginal cancer, verrucous carcinoma, VIPoma, vulvar cancer, good differentiated carcinoma or Wilms tumor.

[00124] Рак, подлежащий лечению, может быть охарактеризован в соответствии с наличием конкретного антигена, экспрессируемого на поверхности раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления раковая клетка может экспрессировать, дополнительно к BCMA, одно или более из следующего: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE–A3, B7.1, B7.2, CTLA4 и PD1.[00124] The cancer to be treated can be characterized according to the presence of a particular antigen expressed on the surface of the cancer cell. In some embodiments, the cancer cell may express, in addition to BCMA, one or more of the following: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1 , cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE–A3, B7.1, B7.2, CTLA4 and PD1.

IV. Комбинированная терапияIV. Combination therapy

[00125] Другой аспект изобретения относится к комбинированной терапии. Полиспецифические связывающие белки, описанные в настоящей заявке, используются в комбинации с дополнительными терапевтическими агентами для лечения рака.[00125] Another aspect of the invention relates to combination therapy. The polyspecific binding proteins described herein are used in combination with additional therapeutic agents for the treatment of cancer.

[00126] Примеры терапевтических агентов, которые могут быть использованы в качестве части комбинированной терапии при лечении рака, включают, например, облучение, митомицин, третиноин, рибомустин, гемцитабин, винкристин, этопозид, кладрибин, митобронитол, метотрексат, доксорубицин, карбоквон, пентостатин, нитракрин, зиностатин, цетрореликс, летрозол, ралтитрексид, даунорубицин, фадрозол, фотемустин, тималфазин, собузоксан, недаплатины, цитарабин, бикалутамид, винорелбина, веснаринон, аминоглютетимид, амсакрин, проглумид, эллиптиния ацетат, кетансерин, доксифлуридин, этретинат, изотретиноин, стрептозоцин, нимустин, виндезин, флутамид, дрогенил, бутоцин, кармофур, разоксан, сизофилан, карбоплатины, митолактол, тегафур, ифосфамид, преднимустин, пицибанил, левамизол, тенипозид, импросульфан, эноцитабин, лизурид, оксиметолон, тамоксифен, прогестерон, мепитиостан, эпитиостанол, форместан, интерферон–альфа, интерферон–2 альфа, интерферон–бета, интерферон–гамма, колониестимулирующий фактор–1 колониестимулирующий фактор–2, денилейкин дифитокс, интерлейкин–2, фактор высвобождения лютеинизирующего гормона и варианты вышеупомянутых агентов, которые могут дифференциально связываться со своим родственным рецептором, а также увеличивать или уменьшать период полувыведения из сыворотки.[00126] Examples of therapeutic agents that may be used as part of combination therapy in the treatment of cancer include, for example, radiation, mitomycin, tretinoin, ribomustine, gemcitabine, vincristine, etoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicin, carboquone, pentostatin, nitracrine, zinostatin, cetrorelix, letrozole, raltitrexide, daunorubicin, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxan, nedaplatins, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acetate, ketanserin, doxyfluridine , etretinate, isotretinoin, streptozocin, nimustine , Windows, Flutamide, Drogenil, Butocin, Carmofur, Prisoxan, Sizofilan, Carboplatin, Mitolactol, Tegafur, Ifhospamide, Prenamistin, Picibanil, Levamisole, Tenaposid, Improsufan, Enocitabin, Lizimetolon, Tamoxifen, Progesterone, Mepityistan, Epitiosistan, Epitiosistan Stanol, Forestestan, Interferon -alpha, interferon-2 alpha, interferon-beta, interferon-gamma, colony-stimulating factor-1, colony-stimulating factor-2, denileukin diphytox, interleukin-2, luteinizing hormone releasing factor, and variants of the above agents that may differentially bind to their cognate receptor, and increase or decrease serum half-life.

[00127] Дополнительным классом агентов, которые могут быть использованы в качестве части комбинированной терапии при лечении рака, являются ингибиторы иммунной контрольной точки. Типичные ингибиторы иммунной контрольной точки включают агенты, которые ингибируют одно или более из следующего: (i) цитотоксический T–лимфоцит–ассоциированный антиген 4 (CTLA4), (ii) белок 1 запрограммированной смерти клеток (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7–H3, (vi) B7–H4 и (vii) TIM3. Ипилимумаб, ингибитор CTLA4, был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения меланомы.[00127] An additional class of agents that may be used as part of combination therapy in the treatment of cancer are immune checkpoint inhibitors. Typical immune checkpoint inhibitors include agents that inhibit one or more of the following: (i) cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA4), (ii) programmed cell death protein 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) ) LAG3, (v) B7–H3, (vi) B7–H4 and (vii) TIM3. Ipilimumab, a CTLA4 inhibitor, has been approved by the US Food and Drug Administration for the treatment of melanoma.

[00128] Другими агентами, которые могут быть использованы в качестве части комбинированной терапии при лечении рака, представляют собой моноклональные антитела, которые нацелены на мишени, не являющиеся контрольными точками (например, герцептин), и нецитотоксические агенты (например, ингибиторы тирозинкиназы).[00128] Other agents that may be used as part of combination therapy in the treatment of cancer are monoclonal antibodies that target non-checkpoint targets (eg, Herceptin) and noncytotoxic agents (eg, tyrosine kinase inhibitors).

[00129] Другие категории противораковых агентов включают, например: (i) ингибитор, выбранный из ингибитора ALK, ингибитора ATR, антагониста А2А, ингибитора эксцизионной репарации оснований, ингибитора Bcr–Abl–тирозинкиназы, ингибитора тирозинкиназы Брутона, ингибитора CDC7, ингибитора CHK1, ингибитора циклинзависимой киназы, ингибитора ДНК–ПК, ингибитора ДНК–ПК и mTOR, ингибитора DNMT1, ингибитора DNMT1 плюс 2–хлор–деоксиаденозина, ингибитора HDAC, ингибитора сигнального пути Hedgehog, ингибитора IDO, ингибитора JAK, ингибитора mTOR, ингибитора MEK, ингибитора MELK, ингибитора MTH1, ингибитора PARP, ингибитора фосфоинозитид–3–киназы, ингибитора PARP1 и DHODH, ингибитора протеасом, ингибитора топоизомеразы–II, ингибитора тирозинкиназы, ингибитора VEGFR и ингибитора WEE1; (ii) агонист OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TRSF25 или ICOS; и (iii) цитокин, выбранный из IL–12, IL–15, GM–CSF и G–CSF.[00129] Other categories of anti-cancer agents include, for example: (i) an inhibitor selected from ALK inhibitor, ATR inhibitor, A2A antagonist, base excision repair inhibitor, Bcr-Abl-tyrosine kinase inhibitor, Bruton's tyrosine kinase inhibitor, CDC7 inhibitor, CHK1 inhibitor, inhibitor cyclin-dependent kinase, DNA-PK inhibitor, DNA-PK and mTOR inhibitor, DNMT1 inhibitor, DNMT1 inhibitor plus 2-chloro-deoxyadenosine, HDAC inhibitor, Hedgehog signaling pathway inhibitor, IDO inhibitor, JAK inhibitor, mTOR inhibitor, MEK inhibitor, MELK inhibitor, MTH1 inhibitor, PARP inhibitor, phosphoinositide 3-kinase inhibitor, PARP1 and DHODH inhibitor, proteasome inhibitor, topoisomerase II inhibitor, tyrosine kinase inhibitor, VEGFR inhibitor and WEE1 inhibitor; (ii) an agonist for OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TRSF25, or ICOS; and (iii) a cytokine selected from IL-12, IL-15, GM-CSF and G-CSF.

[00130] Белки по изобретению также можно использовать в качестве дополнения к хирургическому удалению первичного поражения.[00130] The proteins of the invention can also be used as an adjunct to surgical removal of a primary lesion.

[00131] Количество полиспецифического связывающего белка и дополнительного терапевтического агента и относительные сроки введения могут быть выбраны таким образом, чтобы был достигнут желаемый комбинированный терапевтический эффект. Например, при назначении комбинированной терапии нуждающемуся в этом пациенту терапевтические агенты в комбинации или фармацевтическую композицию или композиции, содержащие терапевтические агенты, можно вводить в любом порядке, например, последовательно, параллельно, вместе, одновременно и т.п. Кроме того, например, полиспецифический связывающий белок может быть введен в то время, когда дополнительный терапевтический агент(ы) оказывает свое профилактическое или терапевтическое действие, или наоборот.[00131] The amount of polyspecific binding protein and additional therapeutic agent and the relative timing of administration can be selected so that the desired combined therapeutic effect is achieved. For example, when administering combination therapy to a patient in need thereof, the therapeutic agents in combination or the pharmaceutical composition or compositions containing the therapeutic agents may be administered in any order, for example, sequentially, in parallel, together, simultaneously, and the like. In addition, for example, the multispecific binding protein may be administered while the additional therapeutic agent(s) are exerting their prophylactic or therapeutic effects, or vice versa.

V. Фармацевтические композицииV. Pharmaceutical compositions

[00132] Настоящее раскрытие также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат терапевтически эффективное количество белка, описанного в настоящей заявке. Композиция может быть приготовлена для использования в различных системах доставки лекарственного вещества. Для получения соответствующего состава в композицию также могут быть включены один или более физиологически приемлемых наполнителей или носителей. Подходящие составы для использования в настоящем раскрытии описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed., 1985. Краткий обзор способов доставки лекарственных веществ см., например, у Langer (Science 249: 1527–1533, 1990).[00132] The present disclosure also relates to pharmaceutical compositions that contain a therapeutically effective amount of a protein described herein. The composition can be prepared for use in various drug delivery systems. One or more physiologically acceptable excipients or carriers may also be included in the composition to obtain the appropriate formulation. Suitable formulations for use in the present disclosure are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed., 1985. For a summary of drug delivery methods, see, for example, Langer (Science 249: 1527–1533, 1990) .

[00133] Состав для внутривенной доставки лекарственного вещества по настоящему изобретению может находиться в пакете, ручке или шприце. В определенных вариантах осуществления пакет может быть соединен с каналом, содержащим трубку и/или иглу. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой лиофилизированный состав или жидкий состав. В определенных вариантах осуществления состав может быть сублимированным (лиофилизированным) и содержаться примерно в 12–60 флаконах. В некоторых вариантах осуществления состав может быть сублимирован, и 45 мг суьлимированного состава может содержаться в одном флаконе. В некоторых вариантах осуществления примерно 40–100 мг сублимированного состава может содержаться в одном флаконе. В некоторых вариантах осуществления для получения терапевтической дозы белка в лекарственном составе для внутривенного введения объединяют сублимированный состав из 12, 27 или 45 флаконов. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой жидкий состав и храниться в количестве от примерно 250 мг/флакон до примерно 1000 мг/флакон. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой жидкий состав и храниться в количестве примерно 600 мг/флакон. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой жидкий состав и храниться в количестве примерно 250 мг/флакон.[00133] The intravenous drug delivery composition of the present invention may be contained in a pouch, pen, or syringe. In certain embodiments, the package may be connected to a channel containing a tube and/or a needle. In certain embodiments, the formulation may be a lyophilized formulation or a liquid formulation. In certain embodiments, the formulation may be freeze-dried (lyophilized) and contained in approximately 12 to 60 vials. In some embodiments, the formulation may be freeze-dried, and 45 mg of the freeze-dried formulation may be contained in one vial. In some embodiments, about 40-100 mg of the freeze-dried formulation may be contained in one vial. In some embodiments, a freeze-dried formulation of 12, 27, or 45 vials is combined to produce a therapeutic dose of protein in an intravenous dosage formulation. In certain embodiments, the formulation may be a liquid formulation and be stored in an amount of from about 250 mg/vial to about 1000 mg/vial. In certain embodiments, the formulation may be a liquid formulation and stored in an amount of about 600 mg/vial. In certain embodiments, the formulation may be a liquid formulation and stored in an amount of about 250 mg/vial.

[00134] Состав по настоящему изобретению может находиться в виде жидкого водного фармацевтического состава, включающего терапевтически эффективное количество белка в забуференном растворе, образующем состав.[00134] The composition of the present invention may be in the form of a liquid aqueous pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of protein in a buffered solution forming the composition.

[00135] Эти композиции могут быть стерилизованы обычными методами стерилизации или могут быть стерильно отфильтрованы. Полученные водные растворы могут быть упакованы для применения в том виде, в каком они находятся, или могут быть лиофилизированы, причем лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным носителем перед введением. Значение рН препаратов обычно находится в диапазоне от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 или от 6 до 8, и наиболее предпочтительно от 7 до 8, например от 7 до 7,5. Полученные композиции в твердой форме могут быть упакованы в несколько емкостей однократной дозы, каждая из которых содержит фиксированное количество вышеупомянутого агента или агентов. Композиция в твердой форме также может быть упакована в контейнер переменного объема.[00135] These compositions can be sterilized by conventional sterilization methods or can be sterile filtered. The resulting aqueous solutions may be packaged for use as is or may be lyophilized, the lyophilized preparation being combined with a sterile aqueous vehicle prior to administration. The pH of the preparations is generally in the range of 3 to 11, more preferably 5 to 9 or 6 to 8, and most preferably 7 to 8, such as 7 to 7.5. The resulting compositions in solid form may be packaged in multiple unit dose containers, each containing a fixed amount of the above agent or agents. The composition in solid form may also be packaged in a variable volume container.

[00136] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предоставляется состав с увеличенным сроком хранения, включающий белок по настоящему раскрытию в комбинации с маннитом, моногидратом лимонной кислоты, цитратом натрия, дигидратом динатрийфосфата, дигидратом дигидрофосфата натрия, хлоридом натрия, полисорбатом 80, водой и гидроксидом натрия.[00136] In certain embodiments of the present invention, an extended shelf life formulation is provided comprising a protein of the present disclosure in combination with mannitol, citric acid monohydrate, sodium citrate, disodium phosphate dihydrate, sodium dihydrogen phosphate dihydrate, sodium chloride, polysorbate 80, water and sodium hydroxide .

[00137] В определенных вариантах осуществления готовят водный состав, включающий белок по настоящему изобретению в рН–забуференном растворе. Буфер по настоящему изобретения может иметь рН в диапазоне от примерно 4 до примерно 8, например, от примерно 4,5 до примерно 6,0 или от примерно 4,8 до примерно 5,5, или может иметь рН от примерно 5,0 до примерно 5,2. Диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше значениям pH, также являются частью настоящего изобретения. Например, диапазоны значений, включающие комбинацию любого из приведенных выше значений в качестве верхнего и/или нижнего пределов, также включены в настоящее изобретение. Примеры буферов, позволяющие регулировать рН в этом диапазоне, включают ацетатные (например, ацетат натрия), сукцинатные (такие как сукцинат натрия), глюконатные, гистидиновые, цитратные и другие буферы органических кислот.[00137] In certain embodiments, an aqueous formulation is prepared comprising the protein of the present invention in a pH buffered solution. The buffer of the present invention may have a pH ranging from about 4 to about 8, such as from about 4.5 to about 6.0 or from about 4.8 to about 5.5, or may have a pH from about 5.0 to approximately 5.2. Ranges intermediate to the above pH values are also part of the present invention. For example, ranges of values including a combination of any of the above values as upper and/or lower limits are also included in the present invention. Examples of buffers that allow pH adjustment within this range include acetate (such as sodium acetate), succinate (such as sodium succinate), gluconate, histidine, citrate and other organic acid buffers.

[00138] В определенных вариантах осуществления состав включает буферную систему, которая содержит цитрат и фосфат для поддержания pH в диапазоне от примерно 4 до примерно 8. В некоторых вариантах осуществления диапазон pH может составлять от примерно 4,5 до примерно 6,0 или от примерно рН от 4,8 до примерно 5,5 или в диапазоне рН от примерно 5,0 до примерно 5,2. В некоторых вариантах осуществления буферная система включает моногидрат лимонной кислоты, цитрат натрия, дигидрат динатрийфосфата и/или дигидрат дигидрофосфата натрия. В некоторых вариантах осуществления буферная система включает примерно 1,3 мг/мл лимонной кислоты (например, 1,305 мг/мл), примерно 0,3 мг/мл цитрата натрия (например, 0,305 мг/мл), примерно 1,5 мг/мл дигидрата динатрийфосфата (например, 1,53 мг/мл), примерно 0,9 мг/мл дигидрата дигидрофосфата натрия (например, 0,86) и примерно 6,2 мг/мл хлорида натрия (например, 6,165 мг/мл). В некоторых вариантах осуществления буферная система включает 1–1,5 мг/мл лимонной кислоты, от 0,25 до 0,5 мг мл цитрата натрия, от 1,25 до 1,75 мг/мл дигидрата динатрийфосфата, от 0,7 до 1,1 мг/мл дигидрата дигидрофосфата натрия и от 6,0 до 6,4 мг/мл хлорида натрия. В определенных вариантах осуществления pH состава корректируют с помощью гидроксида натрия.[00138] In certain embodiments, the formulation includes a buffer system that contains citrate and phosphate to maintain a pH in the range of about 4 to about 8. In some embodiments, the pH range can be from about 4.5 to about 6.0, or from about A pH of from 4.8 to about 5.5, or in the pH range from about 5.0 to about 5.2. In some embodiments, the buffer system includes citric acid monohydrate, sodium citrate, disodium phosphate dihydrate, and/or sodium dihydrogen phosphate dihydrate. In some embodiments, the buffer system includes about 1.3 mg/mL citric acid (e.g., 1.305 mg/mL), about 0.3 mg/mL sodium citrate (e.g., 0.305 mg/mL), about 1.5 mg/mL disodium phosphate dihydrate (eg, 1.53 mg/ml), about 0.9 mg/ml sodium dihydrogen phosphate dihydrate (eg, 0.86), and about 6.2 mg/ml sodium chloride (eg, 6.165 mg/ml). In some embodiments, the buffer system includes 1 to 1.5 mg/mL citric acid, 0.25 to 0.5 mg/mL sodium citrate, 1.25 to 1.75 mg/mL disodium phosphate dihydrate, 0.7 to 1.1 mg/ml sodium dihydrogen phosphate dihydrate and 6.0 to 6.4 mg/ml sodium chloride. In certain embodiments, the pH of the formulation is adjusted using sodium hydroxide.

[00139] Полиол, который действует как регулятор тоничности и может стабилизировать антитело, также может быть включен в состав. Полиол добавляют в состав в количестве, которое может меняться в зависимости от требуемой изотоничности состава. В определенных вариантах осуществления водный состав может быть изотоническим. Количество добавляемого полиола также может меняться зависимости от молекулярной массы полиола. Например, может быть добавлено меньшее количество моносахарида (например, маннита) по сравнению с дисахаридом (таким как трегалоза). В некоторых вариантах осуществления полиол, который может быть использован в составе в качестве регулятора тоничности, представляет собой маннит. В определенных вариантах осуществления концентрация маннита может составлять от примерно 5 до примерно 20 мг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация маннита может составлять примерно 7,5–15 мг/мл. В определенных вариантах концентрация маннита может составлять примерно 10–14 мг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация маннита может составлять примерно 12 мг/мл. В определенных вариантах осуществления в качестве полиола в состав может быть включен сорбит.[00139] A polyol that acts as a tonicity regulator and can stabilize the antibody may also be included in the formulation. The polyol is added to the composition in an amount that may vary depending on the required isotonicity of the composition. In certain embodiments, the aqueous composition may be isotonic. The amount of polyol added may also vary depending on the molecular weight of the polyol. For example, a smaller amount of a monosaccharide (such as mannitol) may be added compared to a disaccharide (such as trehalose). In some embodiments, the polyol that can be used in the composition as a tonicity regulator is mannitol. In certain embodiments, the concentration of mannitol may be from about 5 to about 20 mg/ml. In certain embodiments, the mannitol concentration may be about 7.5-15 mg/ml. In certain embodiments, the concentration of mannitol may be about 10-14 mg/ml. In certain embodiments, the concentration of mannitol may be about 12 mg/ml. In certain embodiments, sorbitol may be included in the composition as a polyol.

[00140] В состав также может быть добавлен детергент или поверхностно–активное вещество. Типичные детергенты включают неионогенные детергенты, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20, 80 и т.д.) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Количество добавляемого детергента является таким, которое позволяет уменьшить агрегацию находящегося в составе антитела и/или минимизировать образование частиц в составе и/или уменьшить адсорбцию. В определенных вариантах осуществления состав может включать поверхностно–активное вещество, которое представляет собой полисорбат. В определенных вариантах осуществления состав может содержать детергент, такой как полисорбат 80 или Твин 80. Твин 80 – это термин, используемый для описания полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеата (см. Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th ed., 1996). В определенных вариантах осуществления состав может содержать от примерно 0,1 до примерно 10 мг/мл полисорбата 80 или от примерно 0,5 до примерно 5 мг/мл. В определенных вариантах осуществления в состав может добавлено примерно 0,1% полисорбата 80.[00140] A detergent or surfactant may also be added to the composition. Typical detergents include nonionic detergents such as polysorbates (eg, polysorbates 20, 80, etc.) or poloxamers (eg, poloxamer 188). The amount of detergent added is such that it reduces aggregation of the antibody present in the composition and/or minimizes the formation of particles in the composition and/or reduces adsorption. In certain embodiments, the composition may include a surfactant that is a polysorbate. In certain embodiments, the formulation may contain a detergent such as polysorbate 80 or Tween 80. Tween 80 is the term used to describe polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (see Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th ed., 1996). In certain embodiments, the formulation may contain from about 0.1 to about 10 mg/ml polysorbate 80 or from about 0.5 to about 5 mg/ml. In certain embodiments, approximately 0.1% polysorbate 80 may be added to the formulation.

[00141] В вариантах осуществления белковый продукт по настоящему изобретению готовят в виде жидкого состава. Жидкий состав может быть представлен в концентрации 10 мг/мл в любом флаконе USP/Ph Eur типа I 50R, закрытом резиновой пробкой и запечатанном алюминиевой обжимной крышкой. Пробка может быть изготовлена из эластомера, соответствующего USP и Ph Eur. В некоторых вариантах осуществления флаконы могут быть заполнены 61,2 мл раствора белкового продукта, обеспечивающего экстрагируемый объем 60 мл. В определенных вариантах осуществления жидкий состав может быть разбавлен 0,9% солевым раствором.[00141] In embodiments, the protein product of the present invention is formulated as a liquid formulation. The liquid formulation may be presented at a concentration of 10 mg/ml in any USP/Ph Eur Type I 50R vial, capped with a rubber stopper and sealed with an aluminum crimp cap. The stopper can be made of elastomer conforming to USP and Ph Eur. In some embodiments, the vials may be filled with 61.2 ml of protein product solution, providing an extractable volume of 60 ml. In certain embodiments, the liquid formulation may be diluted with a 0.9% saline solution.

[00142] В определенных вариантах осуществления жидкий состав по настоящему изобретению может быть приготовлен в виде раствора с концентрацией 10 мг/мл в комбинации со стабилизирующими уровнями сахара. В определенных вариантах осуществления жидкий состав может быть приготовлен в водном носителе. В определенных вариантах осуществления стабилизатор может быть добавлен в количестве, не превышающем количество, которое может привести к вязкости, нежелательной или непригодной для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления сахар может представлять собой дисахариды, например сахарозу. В определенных вариантах осуществления жидкий состав также может включать одно или более из следующего: буферный агент, поверхностно–активное вещество и консервант.[00142] In certain embodiments, the liquid composition of the present invention can be formulated as a solution at a concentration of 10 mg/ml in combination with stabilizing sugar levels. In certain embodiments, the liquid composition may be formulated in an aqueous carrier. In certain embodiments, the stabilizer may be added in an amount not exceeding an amount that would result in a viscosity undesirable or unsuitable for intravenous administration. In some embodiments, the sugar may be a disaccharide, such as sucrose. In certain embodiments, the liquid formulation may also include one or more of the following: a buffering agent, a surfactant, and a preservative.

[00143] В определенных вариантах осуществления рН жидкой композиции можно регулировать путем добавления фармацевтически приемлемой кислоты и/или основания. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемая кислота может представлять собой соляную кислоту. В определенных вариантах осуществления основание может представлять собой гидроксид натрия.[00143] In certain embodiments, the pH of the liquid composition can be adjusted by adding a pharmaceutically acceptable acid and/or base. In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable acid may be hydrochloric acid. In certain embodiments, the base may be sodium hydroxide.

[00144] В дополнение к агрегации, дезамидирование является распространенным вариантом пептидного и белкового продукта, которое может происходить во время ферментации, сбора/осветления клеточной культуры, очистки, хранения лекарственного вещества/лекарственного продукта и во время анализа образцов. Дезамидирование представляет собой потерю NH₃ белком с образованием промежуточного сукцинимидного соединения, которое может подвергаться гидролизу. Содержание промежуточного сукцинимидного соединения приводит к снижению массы исходного пептида на 17 дальтон. Последующий гидролиз приводит к увеличению массы на 18 дальтон. Выделение промежуточного сукцинимидного соединения затруднено из–за его нестабильности в водных условиях. Таким образом, дезамидирование обычно определяют по увеличению массы на 1 дальтон. Дезамидирование аспарагина приводит к образованию аспарагиновой или изоаспарагиновой кислоты. Параметры, влияющие на скорость дезамидирования, включают pH, температуру, диэлектрическую проницаемость растворителя, ионную силу, первичную последовательность, локальную конформацию полипептида и третичную структуру. Аминокислотные остатки, расположенные рядом с Asn в пептидной цепи, влияют на скорости дезамидирования. Gly и Ser, следующие за Asn в белковых последовательностях, приводят к более высокой восприимчивости к дезамидированию.[00144] In addition to aggregation, deamidation is a common peptide and protein product that can occur during fermentation, cell culture collection/clarification, purification, drug substance/drug product storage, and during sample analysis. Deamidation is the loss of NH ₃ from a protein to form a succinimide intermediate that can undergo hydrolysis. The content of the intermediate succinimide compound leads to a decrease in the mass of the original peptide by 17 daltons. Subsequent hydrolysis results in an increase in mass of 18 daltons. Isolation of the succinimide intermediate is difficult due to its instability under aqueous conditions. Thus, deamidation is usually defined as a 1 Da increase in mass. Deamidation of asparagine leads to the formation of aspartic or isoaspartic acid. Parameters affecting the rate of deamidation include pH, temperature, solvent dielectric constant, ionic strength, primary sequence, local polypeptide conformation, and tertiary structure. Amino acid residues located near Asn in the peptide chain influence deamidation rates. Gly and Ser following Asn in protein sequences result in higher susceptibility to deamidation.

[00145] В определенных вариантах осуществления жидкий состав по настоящему изобретению может храниться в условиях pH и влажности, предотвращающих дезаминирование белкового продукта.[00145] In certain embodiments, the liquid composition of the present invention may be stored under pH and humidity conditions that prevent deamination of the protein product.

[00146] Представляющий интерес водный носитель является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкого состава. Примеры носителя включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), pH–забуференный раствор (например, физиологический раствор с фосфатным буфером), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.[00146] The aqueous carrier of interest is pharmaceutically acceptable (safe and non-toxic for administration to humans) and useful for the preparation of a liquid formulation. Examples of the vehicle include sterile water for injection (SWFI), bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffered solution (eg, phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution.

[00147] Для уменьшения воздействия бактерий в составы по настоящему изобретению необязательно может быть добавлен консервант. Добавление консерванта может, например, способствовать получению состава для многоразового (многократного) применения.[00147] To reduce exposure to bacteria, a preservative may optionally be added to the compositions of the present invention. The addition of a preservative may, for example, help to obtain a composition for reusable (multiple) use.

[00148] Внутривенные (IV) составы могут быть предпочтительным путем введения в конкретных случаях, например, когда пациент находится в больнице после трансплантации и получает все лекарственные средства через IV введение. В некоторых вариантах осуществления жидкий состав перед введением разбавляют 0,9% раствором хлорида натрия. В определенных вариантах осуществления разбавленный лекарственный продукт для инъекций является изотоническим и пригодным для введения путем внутривенной инфузии.[00148] Intravenous (IV) formulations may be the preferred route of administration in specific cases, for example, when a patient is in the hospital after a transplant and is receiving all medications via IV administration. In some embodiments, the liquid formulation is diluted with a 0.9% sodium chloride solution prior to administration. In certain embodiments, the diluted injectable drug product is isotonic and suitable for administration by intravenous infusion.

[00149] В определенных вариантах осуществления, соль или буферные компоненты могут быть добавлены в количестве от 10 мМ до 200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и полученными из различных известных кислот (неорганических и органических) с «образующими основание» металлами или аминами. В определенных вариантах осуществления буфер может представлять собой фосфатный буфер. В определенных вариантах осуществления буфер может представлять собой глицинатный, карбонатный, цитратный буферы, и в этом случае в качестве противоиона могут служить ионы натрия, калия или аммония.[00149] In certain embodiments, salt or buffer components may be added in an amount of from 10 mM to 200 mM. Salts and/or buffers are pharmaceutically acceptable and derived from various known acids (inorganic and organic) with "base-forming" metals or amines. In certain embodiments, the buffer may be a phosphate buffer. In certain embodiments, the buffer may be a glycinate, carbonate, or citrate buffer, in which case the counterion may be sodium, potassium, or ammonium ions.

[00150] Для уменьшения воздействия бактерий в составы по настоящему изобретению необязательно может быть добавлен консервант. Добавление консерванта может, например, способствовать получению состава для многоразового (многократного) применения.[00150] To reduce exposure to bacteria, a preservative may optionally be added to the compositions of the present invention. The addition of a preservative may, for example, help to obtain a composition for reusable (multiple) use.

[00151] Представляющий интерес водный носитель является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкого состава. Иллюстративные носители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), pH–забуференный раствор (например, физиологический раствор с фосфатным буфером), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.[00151] The aqueous carrier of interest is pharmaceutically acceptable (safe and non-toxic for administration to humans) and useful for the preparation of a liquid formulation. Exemplary vehicles include sterile water for injection (SWFI), bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffered solution (eg, phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution.

[00152] Состав по настоящему изобретению может существовать в виде лиофилизированного состава, включающего белки и лиопротектор. Лиопротектором может быть сахар, например дисахариды. В определенных вариантах осуществления лиопротектор может представлять собой сахарозу или мальтозу. Лиофилизированный состав также может включать одно или более из следующего: буферный агент, поверхностно–активное вещество, образующий объем агент и/или консервант.[00152] The composition of the present invention may exist as a lyophilized composition comprising proteins and a lyoprotectant. The lyoprotector can be sugar, for example disaccharides. In certain embodiments, the lyoprotectant may be sucrose or maltose. The lyophilized formulation may also include one or more of the following: a buffering agent, a surfactant, a bulking agent, and/or a preservative.

[00153] Количество сахарозы или мальтозы, используемое для стабилизации лиофилизированного лекарственного продукта, может находиться в массовом соотношении белка к сахарозе или мальтозе, равном по меньшей мере 1:2. В некоторых вариантах осуществления массовое соотношение белок/сахароза или мальтоза может составлять от 1:2 до 1:5.[00153] The amount of sucrose or maltose used to stabilize the lyophilized drug product may be in a protein to sucrose or maltose weight ratio of at least 1:2. In some embodiments, the protein/sucrose or maltose weight ratio may be from 1:2 to 1:5.

[00154] В определенных вариантах осуществления значение pH состава перед лиофилизацией может быть отрегулировано путем добавления фармацевтически приемлемой кислоты и/или основания. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемая кислота может представлять собой соляную кислоту. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемым основанием может быть гидроксид натрия.[00154] In certain embodiments, the pH of the formulation prior to lyophilization can be adjusted by adding a pharmaceutically acceptable acid and/or base. In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable acid may be hydrochloric acid. In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable base may be sodium hydroxide.

[00155] Перед лиофилизацией значение pH раствора, содержащего белок по настоящему изобретению, можно регулировать таким образом, чтобы оно находилось в диапазоне от 6 до 8. В некоторых вариантах осуществления диапазон pH для лиофилизированного лекарственного продукта может составлять от 7 до 8.[00155] Before lyophilization, the pH value of the solution containing the protein of the present invention can be adjusted to be in the range of 6 to 8. In some embodiments, the pH range for the lyophilized drug product can be from 7 to 8.

[00156] В определенных вариантах осуществления соль или буферные компоненты могут быть добавлены в количестве от 10 мМ до 200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и полученными из различных известных кислот (неорганических и органических) с «образующими основание» металлами или аминами. В определенных вариантах осуществления буфер может представлять собой фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер может представлять собой глицинатный, карбонатный, цитратный буферы, и в этом случае в качестве противоиона могут служить ионы натрия, калия или аммония.[00156] In certain embodiments, salt or buffer components may be added in an amount of 10 mM to 200 mM. Salts and/or buffers are pharmaceutically acceptable and derived from various known acids (inorganic and organic) with "base-forming" metals or amines. In certain embodiments, the buffer may be a phosphate buffer. In some embodiments, the buffer may be a glycinate, carbonate, citrate buffer, in which case the counterion may be sodium, potassium, or ammonium ions.

[00157] В определенных вариантах осуществления может быть добавлен «образующий объем агент». «Образующий объем агент» представляет собой соединение, которое увеличивает массу лиофилизированной смеси и обеспечивает физическую структуру лиофилизированной лепешки (например, облегчает получение по существу однородной лиофилизированной лепешки, которая способна сохранять структуру с открытыми порами). Примеры образующего объем агента включают маннит, глицин, полиэтиленгликоль и сорбит. Лиофилизированные составы по настоящему изобретению могут содержать такие образующие объем агенты.[00157] In certain embodiments, a "bulking agent" may be added. A "bulking agent" is a compound that increases the mass of the lyophilized mixture and provides physical structure to the lyophilized cake (eg, facilitates the production of a substantially uniform lyophilized cake that is capable of maintaining an open-cell structure). Examples of the bulking agent include mannitol, glycine, polyethylene glycol and sorbitol. The lyophilized compositions of the present invention may contain such bulking agents.

[00158] Для уменьшения воздействия бактерий в составы по настоящему изобретению необязательно может быть добавлен консервант. Добавление консерванта может, например, способствовать получению состава для многоразового (многократного) применения.[00158] To reduce exposure to bacteria, a preservative may optionally be added to the compositions of the present invention. The addition of a preservative may, for example, help to obtain a composition for reusable (multiple) use.

[00159] В определенных вариантах осуществления лиофилизированный лекарственный продукт может быть приготовлен с помощью водного носителя. Представляющий интерес водный носитель является фармацевтически приемлемым (например, безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкого состава после лиофилизации. Примеры разбавителя включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), pH–забуференный раствор (например, физиологический раствор с фосфатным буфером), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.[00159] In certain embodiments, the lyophilized drug product may be formulated using an aqueous carrier. The aqueous carrier of interest is pharmaceutically acceptable (eg, safe and non-toxic for administration to humans) and useful for preparing a liquid formulation after lyophilization. Examples of the diluent include sterile water for injection (SWFI), bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffered solution (eg, phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution.

[00160] В определенных вариантах осуществления лиофилизированный лекарственный продукт по настоящему изобретению восстанавливают либо с помощью стерильной воды для инъекций, USP (SWFI), либо 0,9% инъекцией хлорида натрия, USP. Во время восстановления лиофилизированный порошок растворяют в растворе.[00160] In certain embodiments, the lyophilized drug product of the present invention is reconstituted with either Sterile Water for Injection, USP (SWFI) or 0.9% Sodium Chloride Injection, USP. During reconstitution, the lyophilized powder is dissolved in the solution.

[00161] В определенных вариантах осуществления лиофилизированный белковый продукт по настоящему изобретению состоит из примерно 4,5 мл воды для инъекций и разбавлен 0,9% солевым раствором (раствором хлорида натрия).[00161] In certain embodiments, the lyophilized protein product of the present invention consists of about 4.5 ml of water for injection and diluted with 0.9% saline (sodium chloride solution).

[00162] Фактические уровни дозирования активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно менять для получения количества активного ингредиента, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, и при этом не является токсичным для пациента.[00162] The actual dosage levels of the active ingredients in the pharmaceutical compositions of the present invention can be varied to obtain an amount of the active ingredient that is effective to achieve the desired therapeutic response for a particular patient, composition and route of administration, and is not toxic to the patient.

[00163] Конкретная доза может представлять собой унифицированную дозу для каждого пациента, например, 50–5000 мг белка. Альтернативно, доза может быть адаптирована относительно примерной массы тела пациента или площади поверхности пациента. Другие факторы определения подходящей дозы могут включать заболевание или состояние, которое подлежит лечению или профилактике, тяжесть заболевания, способ введения, а также возраст, пол и состояние здоровья пациента. Специалисты в данной области обычно проводят дополнительные уточняющие расчеты, необходимые для определения подходящей дозы для лечения, особенно с учетом информации о дозировании и результатов анализа, раскрытых в настоявшем описании. Доза также может быть определена с помощью известных анализов для определения доз, используемых в комбинации с соответствующими данными доза–ответ. Дозу для отдельного пациента можно корректировать по мере наблюдения за развитием заболевания. Для определения, необходима ли корректировка дозы для достижения или поддержания эффективной концентрации, в крови у пациента могут быть измерены уровни нацеливаемой конструкции или комплекса. Для определения того, какие нацеливаемые конструкции и/или комплексы и их дозы с наибольшей вероятностью окажутся эффективными для данного индивидуума, может быть использована фармакогеномика (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308:43–53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308:33–41, 2001).[00163] The specific dose may be a unit dose for each patient, for example, 50-5000 mg of protein. Alternatively, the dose may be tailored relative to the patient's approximate body weight or surface area. Other factors in determining the appropriate dose may include the disease or condition being treated or prevented, the severity of the disease, the route of administration, and the age, sex, and medical condition of the patient. Those skilled in the art will routinely make additional refinement calculations necessary to determine the appropriate dosage for treatment, especially in light of the dosing information and analytical results disclosed herein. The dose can also be determined using known dose determination assays used in combination with appropriate dose-response data. The dosage for an individual patient may be adjusted as disease progression is monitored. To determine whether dose adjustments are necessary to achieve or maintain an effective concentration, blood levels of the targeted construct or complex may be measured in the patient. Pharmacogenomics can be used to determine which targeting constructs and/or complexes and their dosages are most likely to be effective for a given individual (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308:43–53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308:33–41, 2001).

[00164] Как правило, дозировки, основанные на массе тела, составляют от примерно 0,01 мкг до примерно 100 мг на кг массы тела, например от примерно 0,01 мкг до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 0,01 мкг до примерно 50 мг/кг массы тела, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/кг массы тела, от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг массы тела, от примерно 0,01 до примерно 100 мкг/кг массы тела, от примерно 0,01 до примерно 50 мкг/кг массы тела, от примерно 0,01 до примерно 10 мкг/кг массы тела, от примерно 0,01 до примерно 1 мкг/кг массы тела, от примерно 0,01 до примерно 0,1 мкг/кг массы тела, от примерно 0,1 мкг до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 0,1 мкг до примерно 50 мг/кг массы тела, от примерно 0,1 мкг до примерно 10 мг/кг массы тела, от примерно 0,1 мкг до примерно 1 мг/кг массы тела, от примерно 0,1 мкг до примерно 100 мкг/кг массы тела, от примерно 0,1 мкг до примерно 10 мкг/кг массы тела, от примерно 0,1 мкг до примерно 1 мкг/кг массы тела, от примерно 1 мкг до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 1 мкг до примерно 50 мг/кг массы тела, от примерно 1 мкг до примерно 10 мг/кг массы тела, от примерно 1 мкг до примерно 1 мг/кг массы тела, от примерно 1 мкг до примерно 100 мкг/кг массы тела, от примерно 1 мкг до примерно 50 мкг кг массы тела, от примерно 1 мкг до примерно 10 мкг/кг массы тела, от примерно 10 мкг до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 10 мкг до примерно 50 мг/кг массы тела, от примерно 10 мкг до примерно 10 мг/кг массы тела, от примерно 10 мкг до примерно 1 мг/кг массы тела, от примерно 10 мкг до примерно 100 мкг/кг массы тела, от примерно 10 мкг до примерно 50 мкг/кг массы тела, от примерно 50 мкг до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 50 мкг до примерно 50 мг/кг массы тела, от примерно 50 мкг до примерно 10 мг/кг массы тела, от примерно 50 мкг до примерно 1 мг/кг массы тела, от примерно 50 мкг до примерно 100 мкг/кг массы тела, от примерно 100 мкг до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 100 мкг до примерно 50 мг/кг массы тела, от примерно 100 мкг до примерно 10 мг/кг массы тела, от примерно 100 мкг до примерно 1 мг/кг массы тела, от примерно 1 мг до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 1 мг до примерно 50 мг/кг массы тела, от примерно 1 мг до примерно 10 мг/кг массы тела, от примерно 10 мг до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 10 мг до примерно 50 мг/кг массы тела, от примерно 50 мг до примерно 100 мг/кг массы тела.[00164] Typically, dosages based on body weight range from about 0.01 μg to about 100 mg per kg body weight, such as from about 0.01 μg to about 100 mg/kg body weight, from about 0.01 μg to about 50 mg/kg body weight, from about 0.01 to about 10 mg/kg body weight, from about 0.01 to about 1 mg/kg body weight, from about 0.01 to about 100 μg/kg body weight body weight, from about 0.01 to about 50 μg/kg body weight, from about 0.01 to about 10 μg/kg body weight, from about 0.01 to about 1 μg/kg body weight, from about 0.01 to about 0.1 μg/kg body weight, about 0.1 μg to about 100 mg/kg body weight, about 0.1 μg to about 50 mg/kg body weight, about 0.1 μg to about 10 mg /kg body weight, from about 0.1 μg to about 1 mg/kg body weight, from about 0.1 μg to about 100 μg/kg body weight, from about 0.1 μg to about 10 μg/kg body weight, from about 0.1 μg to about 1 μg/kg body weight, from about 1 μg to about 100 mg/kg body weight, from about 1 μg to about 50 mg/kg body weight, from about 1 μg to about 10 mg/ kg body weight, from about 1 μg to about 1 mg/kg body weight, from about 1 μg to about 100 μg/kg body weight, from about 1 μg to about 50 μg kg body weight, from about 1 μg to about 10 μg /kg body weight, from about 10 μg to about 100 mg/kg body weight, from about 10 μg to about 50 mg/kg body weight, from about 10 μg to about 10 mg/kg body weight, from about 10 μg to about 1 mg/kg body weight, from about 10 μg to about 100 μg/kg body weight, from about 10 μg to about 50 μg/kg body weight, from about 50 μg to about 100 mg/kg body weight, from about 50 μg to about 50 mg/kg body weight, from about 50 μg to about 10 mg/kg body weight, from about 50 μg to about 1 mg/kg body weight, from about 50 μg to about 100 μg/kg body weight, from about 100 mcg to about 100 mg/kg body weight, from about 100 mcg to about 50 mg/kg body weight, from about 100 mcg to about 10 mg/kg body weight, from about 100 mcg to about 1 mg/kg body weight, from about 1 mg to about 100 mg/kg body weight, from about 1 mg to about 50 mg/kg body weight, from about 1 mg to about 10 mg/kg body weight, from about 10 mg to about 100 mg/kg body weight body, from about 10 mg to about 50 mg/kg body weight, from about 50 mg to about 100 mg/kg body weight.

[00165] Дозы могут вводиться один или более раз в сутки, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже один раз каждые 2–20 лет. Специалисты в данной области техники могут легко оценить частоту введения доз, исходя из результатов измерения времени пребывания и концентрации нацеливаемой конструкции или комплекса в жидкостях или тканях организма. Введение по настоящему изобретению может быть внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, интратекальным, внутриполостным, путем перфузии через катетер или путем прямой внутриклеточной инъекции. Введение может осуществляться один или более раз в сутки, один или более раз в неделю, один или более раз в месяц и один или более раз в год.[00165] Doses may be administered one or more times daily, weekly, monthly or annually, or even once every 2 to 20 years. Those skilled in the art can readily estimate dosing frequency based on measurements of residence time and concentration of the target construct or complex in body fluids or tissues. Administration of the present invention may be intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intrapleural, intrathecal, intracavitary, by perfusion through a catheter, or by direct intracellular injection. Administration may be one or more times per day, one or more times per week, one or more times per month, and one or more times per year.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

[00166] Изобретение, описанное в целом, будет более понятным со ссылкой на приведенные ниже примеры, которые включены исключительно с целью иллюстрации определенных аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения изобретения.[00166] The invention, as described generally, will be better understood with reference to the following examples, which are included solely for the purpose of illustrating certain aspects and embodiments of the present invention and are not intended to limit the invention.

Пример 1. NKG2D–связывающие домены связываются с NKG2DExample 1: NKG2D binding domains bind to NKG2D

NKG2D–связывающие домены связываются с очищенным рекомбинантным NKG2DNKG2D binding domains bind to purified recombinant NKG2D

[00167] Выполняли слияние последовательности нуклеиновых кислот эктодоменов NKG2D человека, мыши или яванского макака с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими F_С–домены IgG1 человека, и вводили в клетки млекопитающих для экспрессии. После очистки слитые белки NKG2D–F_С адсорбировали в лунках микропланшетов. После блокирования лунок бычьим сывороточным альбумином для предотвращения неспецифического связывания, NKG2D–связывающие домены титровали и добавляли в лунки с предварительно адсорбированными NKG2D–F_С слитыми белками. Для определения связывания первичного антитела использовали вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, которое специфически распознает человеческую легкую цепь каппа, что позволяет избежать проблем с перекрестной реактивностью с F_С–фрагментом. 3,3',5,5'–Тетраметилбензидин (TMB), субстрат для пероксидазы хрена, добавляли в лунки для визуализации сигнала связывания, поглощение которого измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. В каждую лунку добавляли клон NKG2D–связывающего домена, контроль изотипа или положительный контроль (выбранный из SEQ ID NO: 45–48 или антимышиных клонов NKG2D MI–6 и CX–5, доступных в eBioscience).[00167] Nucleic acid sequences from human, mouse, or cynomolgus NKG2D ectodomains were fused to nucleic acid sequences encoding human IgG1 F _C domains and introduced into mammalian cells for expression. After purification, NKG2D–F _C fusion proteins were adsorbed into the wells of microplates. After blocking the wells with bovine serum albumin to prevent nonspecific binding, the NKG2D binding domains were titrated and added to wells containing preadsorbed NKG2D–F _C fusion proteins. To determine primary antibody binding, a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody, which specifically recognizes the human kappa light chain, was used to avoid problems with cross-reactivity with the F _C moiety. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB), a substrate for horseradish peroxidase, was added to the wells to visualize the binding signal, the absorbance of which was measured at 450 nM and corrected at 540 nM. An NKG2D binding domain clone, isotype control, or positive control (selected from SEQ ID NO: 45-48 or the NKG2D anti-mouse clones MI-6 and CX-5 available from eBioscience) was added to each well.

[00168] Контроль изотипа показал минимальное связывание с NKG2D–F_С рекомбинантными белками, в то время как положительный контроль наиболее сильно связывался с рекомбинантными антигенами. NKG2D–связывающие домены, продуцируемые всеми клонами, показали связывание с NKG2D–F_С рекомбинантными белками человека (фиг. 14), мыши (фиг. 16) и яванского макака (фиг. 15), хотя с разным сродством в зависимости от клона. Как правило, каждый анти–NKG2D–клон связывался с рекомбинантным NKG2D–F_С человека (фиг. 14) и яванского макака (фиг. 15) с аналогичной аффинностью, но с рекомбинантным NKG2D–F_С мыши с более низкой аффинностью (фиг. 16).[00168] The isotype control showed minimal binding to NKG2D-F _C recombinant proteins, while the positive control bound most strongly to the recombinant antigens. The NKG2D-binding domains produced by all clones showed binding to NKG2D-F C recombinant proteins _from human (FIG. 14), mouse (FIG. 16), and cynomolgus monkey (FIG. 15), although with varying affinities depending on the clone. In general, each anti-NKG2D clone bound _to human (FIG. 14) and cynomolgus (FIG. 15) recombinant NKG2D-F C with similar affinity, but to _mouse recombinant NKG2D-F C with lower affinity (FIG. 16) ).

NKG2D–связывающие домены связываются с клетками, экспрессирующими NKG2DNKG2D-binding domains bind to cells expressing NKG2D

[00169] Для экспрессии NKG2D–сигнальный домен CD3–дзета химерного антигенного рецептора человека или мыши создавали линию клеток мышиной лимфомы EL4. NKG2D–связывающий клон, контроль изотипа или положительный контроль использовали в концентрации 100 нМ для окрашивания внеклеточного NKG2D, экспрессированного в клетках EL4. Для определения связывания антител использовали вторичные антитела против человеческого IgG, конъюгированные с флуорофором. Клетки анализировали методом проточной цитометрии и рассчитывали увеличение относительно фона (FOB) средней интенсивности флуоресценции (СИФ) NKG2D–экспрессирующих клеток по сравнению с родительскими клетками EL4.[00169] The EL4 murine lymphoma cell line was generated to express the NKG2D–CD3–zeta signaling domain of human or mouse chimeric antigen receptor. NKG2D–binding clone, isotype control, or positive control was used at a concentration of 100 nM to stain extracellular NKG2D expressed in EL4 cells. Fluorophore-conjugated anti-human IgG secondary antibodies were used to determine antibody binding. Cells were analyzed by flow cytometry and the increase relative to background (FOB) in mean fluorescence intensity (AFI) of NKG2D-expressing cells was calculated compared to parental EL4 cells.

[00170] NKG2D–связывающие домены, продуцированные всеми клонами, связывались с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D человека и мыши. Антитела положительного контроля (выбранные из SEQ ID NO: 45–48 или клоны MI–6 и CX–5 анти–мышиных NKG2D, доступные на eBioscience) показали самый лучший сигнал связывания согласно FOB. Аффинность связывания каждого из клонов с NKG2D была аналогичной между клетками, экспрессирующими человеческий NKG2D (фиг. 17) и мышиный NKG2D (фиг. 18).[00170] NKG2D binding domains produced by all clones bound to EL4 cells expressing human and mouse NKG2D. Positive control antibodies (selected from SEQ ID NO: 45-48 or anti-mouse NKG2D clones MI-6 and CX-5 available from eBioscience) showed the best binding signal according to FOB. The binding affinity of each clone to NKG2D was similar between cells expressing human NKG2D (Fig. 17) and mouse NKG2D (Fig. 18).

Пример 2. NKG2D–связывающие домены блокируют связывание природного лиганда с NKG2DExample 2. NKG2D binding domains block natural ligand binding to NKG2D

Конкуренция с ULBP–6Competition with ULBP–6

[00171] Человеческие NKG2D–F_С рекомбинантные белки адсорбировали в лунках микропланшета, и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для снижения неспецифического связывания. Насыщенную концентрацию ULBP–6–His–биотина добавляли в лунки с последующим добавлением клонов NKG2D–связывающего домена. После 2–часовой инкубации лунки промывали, и ULBP–6–His–биотин, который оставался связанным в лунках, покрытых NKG2D–F_С, детектировали, используя стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена и субстратом TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона вычисляли специфическое связывание NKG2D–связывающих доменов с NKG2D–F_С белками по процентному количеству ULBP–6–His–биотина, который блокировался при связывании с NKG2D–F_С белками в лунках. Антитело положительного контроля (выбранное из SEQ ID NO: 45–48) и различные NKG2D–связывающие домены блокировали связывание ULBP–6 с NKG2D, в то время как контроль изотипа показал слабую конкуренцию с ULBP–6 (фиг. 19).[00171] Human NKG2D-F _C recombinant proteins were adsorbed into microplate wells and the wells were blocked with bovine serum albumin to reduce nonspecific binding. A saturated concentration of ULBP-6-His-biotin was added to the wells, followed by the addition of NKG2D-binding domain clones. After a 2-hour incubation, the wells were washed, and ULBP-6-His-biotin, which remained bound in the NKG2D-F _C- coated wells, was detected using streptavidin conjugated to horseradish peroxidase and the substrate TMB. Absorbance was measured at 450 nM and corrected at 540 nM. After background subtraction, the specific binding of NKG2D-binding domains to NKG2D-F _C proteins was calculated by the percentage of ULBP-6-His-biotin that was blocked upon binding to NKG2D-F _C proteins in the wells. A positive control antibody (selected from SEQ ID NO: 45-48) and various NKG2D binding domains blocked ULBP-6 binding to NKG2D, while the isotype control showed weak competition with ULBP-6 (FIG. 19).

Конкуренция с MICACompetition with MICA

[00172] Человеческие MICA–F_С рекомбинантные белки адсорбировали в лунках микропланшета, и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для уменьшения неспецифического связывания. NKG2D–F_С–биотин добавляли в лунки, после чего добавляли NKG2D–связывающие домены. После инкубации и промывки NKG2D–F_С–биотин, который оставался связанным в лунках, покрытых MICA–F_С, детектировали с помощью субстрата стрептавидин–HRP и TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D–связывающих доменов с белками NKG2D–F_С вычисляли, исходя из процента NKG2D–F_С–биотина, который блокировался при связывании с лунками, покрытыми MICA–F_С. Антитело положительного контроля (выбранное из SEQ ID NO: 45–48) и различные NKG2D–связывающие домены блокировали связывание MICA с NKG2D, в то время как контроль изотипа показал слабую конкуренцию с MICA (фиг. 20).[00172] Human MICA-F _C recombinant proteins were adsorbed into microplate wells, and the wells were blocked with bovine serum albumin to reduce nonspecific binding. NKG2D-F _C -biotin was added to the wells, after which NKG2D-binding domains were added. After incubation and washing of NKG2D-F, the _C -biotin that remained bound in the MICA-F _C- coated wells was detected using the streptavidin-HRP substrate and TMB. Absorbance was measured at 450 nM and corrected at 540 nM. After background subtraction, specific binding of NKG2D-binding domains to NKG2D-F _C proteins was calculated based on the percentage of NKG2D-F _C -biotin that was blocked upon binding to MICA-F _C- coated wells. A positive control antibody (selected from SEQ ID NO: 45-48) and various NKG2D binding domains blocked MICA binding to NKG2D, while the isotype control showed weak competition with MICA (FIG. 20).

Конкуренция с Rae–1 дельтаCompetition with Rae–1 delta

[00173] Мышиный рекомбинантный Rae–1дельта–F_С (приобретенный у компании R&D Systems) адсорбировали в лунках микропланшета, и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для уменьшения неспецифического связывания. Мышиный NKG2D–F_С–биотин добавляли в лунки с последующими добавлением NKG2D–связывающих доменов. После инкубации и промывки NKG2D–F_С–биотин, который оставался связанным в лунках, покрытых Rae–1дельта–F_С, детектировали с помощью субстрата стрептавидин–HRP и TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D–связывающих доменов с белками NKG2D–F_С вычисляли, исходя из процентного содержания NKG2D–F_С–биотина, который блокировался при связывании с лунками, покрытыми Rae–1дельта–F_С. Положительный контроль (выбранный из SEQ ID NO: 45–48 или анти–мышиных NKG2D–клонов MI–6 и CX–5, доступных на eBioscience) и различные клоны NKG2D–связывающего домена блокировали связывание Rae–1дельта с мышиным NKG2D, в то время как изотипное контрольное антитело демонстрировало слабую конкуренцию с Rae–1дельта (фиг. 21).[00173] Mouse recombinant Rae-1delta-F _C (purchased from R&D Systems) was adsorbed into microplate wells, and the wells were blocked with bovine serum albumin to reduce nonspecific binding. Mouse NKG2D-F _C -biotin was added to the wells, followed by the addition of NKG2D-binding domains. After incubation and washing of NKG2D-F, the _C -biotin that remained bound in the wells coated with Rae-1delta-F _C was detected using the streptavidin-HRP substrate and TMB. Absorbance was measured at 450 nM and corrected at 540 nM. After background subtraction, specific binding of NKG2D-binding domains to NKG2D-F _C proteins was calculated based on the percentage of NKG2D-F _C -biotin that was blocked upon binding to Rae-1delta-F _C- coated wells. Positive control (selected from SEQ ID NO: 45-48 or anti-mouse NKG2D clones MI-6 and CX-5, available from eBioscience) and various NKG2D binding domain clones blocked Rae-1delta binding to mouse NKG2D, while as an isotype control antibody showed weak competition with Rae-1delta (Fig. 21).

Пример 3. Клоны NKG2D–связывающего домена активируют NKG2DExample 3: NKG2D-binding domain clones activate NKG2D

[00174] Выполняли слияние последовательностей нуклеиновых кислот NKG2D человека и мыши с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими сигнальный домен CD3–дзета, для получения конструкций химерного антигенного рецептора (CAR). Затем конструкции NKG2D–CAR клонировали в ретровирусный вектор с помощью сборки методом Гибсона и трансфицировали в клетки expi293 для получения ретровируса. Клетки EL4 инфицировали вирусами, содержащими NKG2D–CAR вместе с 8 мкг/мл полибрена. Через 24 часа после заражения уровни экспрессии NKG2D–CAR в клетках EL4 анализировали методом проточной цитометрии, и отбирали клоны, которые экспрессировали высокие уровни NKG2D–CAR на клеточной поверхности.[00174] Fusion of human and mouse NKG2D nucleic acid sequences with nucleic acid sequences encoding the CD3-zeta signaling domain was performed to generate chimeric antigen receptor (CAR) constructs. The NKG2D–CAR constructs were then cloned into a retroviral vector using Gibson assembly and transfected into expi293 cells to produce the retrovirus. EL4 cells were infected with viruses containing NKG2D–CAR along with 8 μg/ml polybrene. At 24 hours postinfection, NKG2D–CAR expression levels in EL4 cells were analyzed by flow cytometry, and clones that expressed high levels of NKG2D–CAR on the cell surface were selected.

[00175] Для определения, активируют ли NKG2D–связывающие домены NKG2D, их адсорбировали в лунках микропланшета, и клетки NKG2D–CAR EL4 культивировали в лунках, покрытых фрагментом антитела, в течение 4 часов в присутствии брефельдина–A и монензина. Внутриклеточное продуцирование T–альфа, индикатора активации NKG2D, анализировали методом проточной цитометрии. Процент TNF–альфа–положительных клеток нормализовали по отношению к клеткам, обработанным положительным контролем. Все NKG2D–связывающие домены активировали как человеческие NKG2D (фиг. 22), так и мышиные NKG2D (фиг. 23).[00175] To determine whether the NKG2D binding domains activate NKG2D, they were adsorbed to microplate wells and NKG2D-CAR EL4 cells were cultured in the wells coated with the antibody fragment for 4 hours in the presence of brefeldin-A and monensin. Intracellular production of T-alpha, an indicator of NKG2D activation, was analyzed by flow cytometry. The percentage of TNF-alpha-positive cells was normalized to that of cells treated with the positive control. All NKG2D binding domains activated both human NKG2D (Fig. 22) and mouse NKG2D (Fig. 23).

Пример 4. NKG2D–связывающие домены активируют NK–клеткиExample 4. NKG2D binding domains activate NK cells

Первичные человеческие NK–клеткиPrimary human NK cells

[00176] Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкоцитарной оболочки периферической крови центрифугированием в градиенте плотности. NK–клетки (CD3^–CD56⁺) выделяли из PBMC посредством отрицательного отбора с помощью магнитных бусин, при этом чистота выделенных NK–клеток обычно превышала 95%. Затем выделенные NK–клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL–2, в течение 24–48 часов, после чего их переносили в лунки микропланшета, на котором были адсорбированы NKG2D–связывающие домены, и культивировали в среде, содержащей конъюгированное с флуорофором анти–CD107a антитело, брефелдин–А и монензин. После культивирования NK–клетки анализировали методом проточной цитометрии, используя конъюгированные с флуорофором антитела против CD3, CD56 и IFN–гамма. Для оценки активации NK–клеток анализировали окрашивание CD107a и IFN–гамма в клетках CD3–CD56⁺. Увеличение количества CD107a/IFN–гамма–двойных положительных клеток свидетельствовало о более высокой активации NK–клеток, обеспечиваемой двумя, а не одним, активирующими рецепторами. NKG2D–связывающие домены и положительный контроль (выбранный из SEQ ID NO: 45–48) показали более высокий процент NK–клеток, которые стали CD107a⁺ и IFN–гамма⁺, по сравнению с контролем изотипа (на фиг. 24 и фиг. 25 приведены данные из двух независимых экспериментов, в каждом из которых использовали PBMC разных доноров для приготовления NK–клеток).[00176] Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from peripheral blood buffy coats by density gradient centrifugation. NK cells (CD3 ^– CD56 ⁺ ) were isolated from PBMCs by negative selection using magnetic beads, and the purity of isolated NK cells was typically greater than 95%. Then the isolated NK cells were cultured in a medium containing 100 ng/ml IL-2 for 24–48 hours, after which they were transferred into the wells of a microplate on which NKG2D-binding domains were adsorbed and cultured in a medium containing conjugated fluorophore anti-CD107a antibody, brefeldin-A and monensin. After cultivation, NK cells were analyzed by flow cytometry using fluorophore-conjugated antibodies against CD3, CD56 and IFN-gamma. To assess NK cell activation, CD107a and IFN-gamma staining in CD3–CD56 ⁺ cells was analyzed. The increase in the number of CD107a/IFN-gamma double-positive cells indicated higher activation of NK cells, provided by two, rather than one, activating receptors. NKG2D-binding domains and positive control (selected from SEQ ID NO: 45-48) showed a higher percentage of NK cells that became CD107a ⁺ and IFN-gamma ⁺ compared to the isotype control (in Fig. 24 and Fig. 25 data are presented from two independent experiments, in each of which PBMC from different donors were used to prepare NK cells).

Первичные мышиные NK–клеткиPrimary mouse NK cells

[00177] У мышей C57Bl/6 извлекали селезенки, которые измельчали через 70 мкм сито для клеток для получения суспензии отдельных клеток. Клетки осаждали и ресуспендировали в лизирующем буфере ACK (приобретенном у Thermo Fisher Scientific # A1049201; 155 мМ хлорида аммония, 10 мМ бикарбоната калия, 0,01 мМ EDTA) для удаления эритроцитов. Оставшиеся клетки культивировали с 100 нг/мл hIL–2 в течение 72 часов, а затем собирали и готовили для выделения NK–клеток. Затем из клеток селезенки выделяли NK–клетки (CD3^–NK1.1⁺) с чистотой, превышающей 90%, методом отрицательного истощения, используя магнитные бусины. Очищенные NK–клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл mIL–15, в течение 48 часов, после чего их переносили в лунки микропланшета, на котором были адсорбированы NKG2D–связывающие домены, и культивировали в среде, содержащей конъюгированное с флуорофором анти–CD107a антитело, брефелдин–А и монензин. После культивирования в лунках, покрытых NKG2D–связывающим доменом, NK–клетки анализировали методом проточной цитометрии с помощью конъюгированных с флуорофором антител против CD3, NK1.1 и IFN–гамма. Для оценки активации NK–клеток анализировали окрашивание CD107a и IFN–гамма в клетках CD3^–NK1.1⁺. Увеличение количества CD107a/IFN–гамма–двойных положительных клеток свидетельствовало о более высокой активации NK–клеток, обеспечиваемой двумя, а не одним, активирующими рецепторами. NKG2D–связывающие домены и положительный контроль (выбранный из анти–мышиных NKG2D–клонов MI–6 и CX–5, доступных в eBioscience) показали более высокий процент NK–клеток, которые стали CD107a⁺ и IFN–гамма⁺, по сравнению с контролем изотипа (на фиг. 26 и фиг. 27 представлены данные двух независимых экспериментов, в каждом из которых использовали для приготовления NK–клеток разных мышей).[00177] Spleens were removed from C57Bl/6 mice and ground through a 70 μm cell strainer to obtain a single cell suspension. Cells were pelleted and resuspended in ACK lysis buffer (purchased from Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM ammonium chloride, 10 mM potassium bicarbonate, 0.01 mM EDTA) to remove red blood cells. The remaining cells were cultured with 100 ng/ml hIL-2 for 72 hours and then harvested and prepared for NK cell isolation. NK cells (CD3 ^– NK1.1 ⁺ ) were then isolated from the spleen cells with a purity exceeding 90% by negative depletion using magnetic beads. Purified NK cells were cultured in a medium containing 100 ng/ml mIL-15 for 48 hours, after which they were transferred into the wells of a microplate on which NKG2D-binding domains were adsorbed and cultured in a medium containing fluorophore-conjugated anti- CD107a antibody, brefeldin-A and monensin. After cultivation in wells coated with the NKG2D binding domain, NK cells were analyzed by flow cytometry using fluorophore-conjugated antibodies against CD3, NK1.1, and IFN-gamma. To assess NK cell activation, CD107a and IFN-gamma staining was analyzed in CD3 ^– NK1.1 ⁺ cells. The increase in the number of CD107a/IFN-gamma double-positive cells indicated higher activation of NK cells, provided by two, rather than one, activating receptors. NKG2D binding domains and positive control (selected from the anti-mouse NKG2D clones MI-6 and CX-5 available from eBioscience) showed a higher percentage of NK cells that became CD107a ⁺ and IFN-gamma ⁺ compared to control isotype (Fig. 26 and Fig. 27 show data from two independent experiments, in each of which different mice were used to prepare NK cells).

Пример 5. NKG2D–связывающие домены обеспечивают цитотоксичность опухолевых клеток–мишенейExample 5. NKG2D-binding domains ensure cytotoxicity of target tumor cells

[00178] Результаты анализа активации первичных человеческих и мышиных NK–клеток показали увеличенный уровень маркеров цитотоксичности на NK–клетках после инкубации с NKG2D–связывающими доменами. Для определения, приводит ли это к усилению лизиса опухолевых клеток, использовали клеточный анализ, в котором каждый NKG2D–связывающий домен превращали в моноспецифическое антитело. F_С–область использовали в качестве одного плеча направленного воздействия, тогда как область Fab (NKG2D–связывающий домен) действовал в качестве другого плеча направленного воздействия для активации NK–клеток. Клетки THP–1, которые имеют человеческое происхождение и экспрессируют высокие уровни F_С–рецепторов, использовали в качестве опухоли–мишени, и использовали набор для определения цитотоксичности Perkin Elmer DELFIA. Клетки THP–1 метили реагентом BATDA и ресуспендировали в 105/мл в культуральной среде. Затем меченые клетки THP–1 объединяли с антителами NKG2D и выделенными мышиными NK–клетками в лунках микротитровального планшета при 37°С в течение 3 часов. После инкубации извлекали 20 мкл культурального супернатанта, смешивали с 200 мкл раствора европия и инкубировали при встряхивании в течение 15 минут в темноте. Флуоресценцию измеряли с течением времени с помощью планшетного ридера PheraStar, оборудованного модулем флуоресценции с временным разрешением (возбуждение при 337 нм, излучение при 620 нм), и в соответствии с прилагаемыми к набору инструкциями рассчитывали показатель специфического лизиса.[00178] Results from primary human and murine NK cell activation assays showed increased levels of cytotoxicity markers on NK cells after incubation with NKG2D binding domains. To determine whether this resulted in increased tumor cell lysis, a cell-based assay was used in which each NKG2D-binding domain was converted into a monospecific antibody. The F _C region was used as one targeting arm, while the Fab region (NKG2D binding domain) acted as the other targeting arm to activate NK cells. THP-1 cells, which are of human origin and express high levels of F _C receptors, were used as the target tumor and the Perkin Elmer DELFIA cytotoxicity assay kit was used. THP–1 cells were labeled with BATDA reagent and resuspended in 105/ml culture medium. Labeled THP-1 cells were then combined with NKG2D antibodies and isolated mouse NK cells in microtiter plate wells at 37°C for 3 hours. After incubation, 20 μl of the culture supernatant was removed, mixed with 200 μl of europium solution and incubated with shaking for 15 minutes in the dark. Fluorescence was measured over time using a PheraStar plate reader equipped with a time-resolved fluorescence module (excitation at 337 nm, emission at 620 nm), and the specific lysis rate was calculated according to the instructions provided with the kit.

[00179] Положительный контроль, ULBP–6, являющийся природным лигандом для NKG2D, показал увеличенный уровень специфического лизиса клеток–мишеней THP–1 мышиными NK–клетками. Анти–NKG2D антитела также увеличивали специфический лизис клеток–мишеней THP–1, тогда как антитело к контролю изотипа показало сниженный уровень специфического лизиса. Пунктирная линия указывает на специфический лизис клеток THP–1 мышиными NK–клетками без добавления антител (фиг. 28).[00179] The positive control, ULBP-6, a natural ligand for NKG2D, showed increased levels of specific lysis of THP-1 target cells by murine NK cells. Anti-NKG2D antibodies also increased specific lysis of THP-1 target cells, whereas the isotype control antibody showed a reduced level of specific lysis. The dotted line indicates specific lysis of THP-1 cells by mouse NK cells without the addition of antibodies (Fig. 28).

Пример 6. Анти–NKG2D антитела показывают высокую термостабильностьExample 6. Anti-NKG2D antibodies show high thermal stability

[00180] Температуры плавления NKG2D–связывающих доменов анализировали методом дифференциальной сканирующей флуориметрии. Экстраполированные значения кажущейся температуры плавления оказались высокими по сравнению с типичными антителами IgG1 (фиг. 29).[00180] Melting temperatures of NKG2D binding domains were analyzed by differential scanning fluorimetry. The extrapolated apparent melting temperature values were found to be high compared to typical IgG1 antibodies (Figure 29).

Пример 7. Полиспецифические связывающие белки связываются с NKG2DExample 7 Polyspecific binding proteins bind to NKG2D

[00181] Для экспрессии человеческого NKG2D создавали линии клеток EL4 мышиных лимфом. Триспецифические связывающие белки (TriNKET), каждый из которых содержал NKG2D–связывающий домен, ассоциированный с опухолью антигенсвязывающий домен (BCMA–связывающий домен) и F_С–домен, который связывается с CD16, как показано на фиг. 1, тестировали на сродство к внеклеточному NKG2D, экспрессированному в клетках EL4. Связывание полиспецифических связывающих белков с NKG2D детектировали с использованием вторичных антител против человеческого IgG, конъюгированных с флуорофором. Клетки анализировали методом проточной цитометрии и вычисляли увеличение относительно фона (FOB) средней интенсивности флуоресценции (СИФ) NKG2D–экспрессирующих клеток по сравнению с родительскими клетками EL4.[00181] Murine lymphoma EL4 cell lines were generated to express human NKG2D. Trispecific binding proteins (TriNKET), each containing an NKG2D-binding domain, a tumor-associated antigen-binding domain (BCMA-binding domain), and an F _C domain that binds to CD16, as shown in FIG. 1 were tested for affinity for extracellular NKG2D expressed in EL4 cells. Binding of polyspecific binding proteins to NKG2D was detected using fluorophore-conjugated anti-human IgG secondary antibodies. Cells were analyzed by flow cytometry and the increase over background (FOB) in mean fluorescence intensity (AFI) of NKG2D-expressing cells was calculated compared to parental EL4 cells.

[00182] Протестированные TriNKET включают BCMA–TriNKET–C26 (ADI–28226 и BCMA–связывающий домен), BCMA–TriNKET–F04 (ADI–29404 и BCMA–связывающий домен), BCMA–TriNKET–F43 (ADI–29443 и BCMA–связывающий домен) и BCMA–TriNKET–F47 (ADI–29447 и BCMA–связывающий домен).[00182] Tested TriNKETs include BCMA-TriNKET-C26 (ADI-28226 and BCMA binding domain), BCMA-TriNKET-F04 (ADI-29404 and BCMA binding domain), BCMA-TriNKET-F43 (ADI-29443 and BCMA-binding domain). binding domain) and BCMA–TriNKET–F47 (ADI–29447 and BCMA–binding domain).

[00183] BCMA–связывающий домен, использованный в тестируемых молекулах, состоял из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи, как указано ниже.[00183] The BCMA binding domain used in the test molecules consisted of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, as follows.

[00184] Вариабельный домен тяжелой цепи EM–801 (SEQ ID NO: 91):[00184] EM-801 Heavy Chain Variable Domain (SEQ ID NO: 91):

[00185] Вариабельный домен легкой цепи EM–801 (SEQ ID NO: 92):[00185] EM-801 light chain variable domain (SEQ ID NO: 92):

[00186] Вариабельный домен тяжелой цепи EM–901 (SEQ ID NO: 93)[00186] EM-901 Heavy Chain Variable Domain (SEQ ID NO: 93)

[00187] Вариабельный домен легкой цепи EM–901 (SEQ ID NO: 94)[00187] EM-901 light chain variable domain (SEQ ID NO: 94)

Пример 8. Полиспецифические связывающие белки связываются с опухолевыми антигенами человека.Example 8 Polyspecific binding proteins bind to human tumor antigens.

Триспецифические связывающие белки связываются с ВСМАTrispecific binding proteins bind to BCMA

[00188] Клетки миеломы человека MM.1S, экспрессирующие ВСМА, использовали для анализа связывания TriNKET с антигеном ВСМА, ассоциированным с опухолью. TriNKET разбавляли и инкубировали с соответствующими клетками. TriNKET и, необязательно, родительское анти–ВСМА моноклональное антитело (ЕМ–801) инкубировали с клетками, и связывание детектировали с помощью конъюгированных с флуорофором вторичных антител против человеческого IgG. Клетки анализировали методом проточной цитометрии, и увеличение относительно фона (FOB) вычисляли по средней интенсивности флуоресценции (СИФ) для TriNKET и EM–801, нормализованной относительно контрольных вторичных антител. C26–TriNKET–BCMA, F04–TriNKET–BCMA, F43–TriNKET–BCMA и F47–TriNKET–BCMA показали сопоставимые с EM–801 уровни связывания с BCMA, экспрессируемыми в клетках MM.1S, (фиг. 31).[00188] Human myeloma cells MM.1S expressing BCMA were used to assay the binding of TriNKET to the tumor associated antigen BCMA. TriNKET was diluted and incubated with the appropriate cells. TriNKET and optionally the parental anti-BCMA monoclonal antibody (EM-801) were incubated with the cells, and binding was detected using a fluorophore-conjugated anti-human IgG secondary antibody. Cells were analyzed by flow cytometry, and enhancement over background (FOB) was calculated from mean fluorescence intensity (AFI) for TriNKET and EM–801 normalized to control secondary antibodies. C26-TriNKET-BCMA, F04-TriNKET-BCMA, F43-TriNKET-BCMA, and F47-TriNKET-BCMA showed comparable levels of binding to BCMA expressed in MM.1S cells as EM-801 (Figure 31).

Пример 9. Полиспецифические связывающие белки активируют NK–клеткиExample 9. Polyspecific binding proteins activate NK cells

Первичные человеческие NK–клетки активируются TriNKET при совместном культивировании с линиями раковых клеток человека, экспрессирующих мишень Primary human NK cells are activated by TriNKET when co-cultured with target-expressing human cancer cell lines

[00189] Совместное культивирование первичных человеческих NK–клеток с BCMA–положительными клетками миеломы MM.1S приводило к TriNKET–опосредованной активации первичных человеческих NK–клеток. TriNKET, нацеленные на BCMA (например, C26–TriNKET–BCMA и F04–TriNKET–BCMA), опосредовали активацию человеческих NK–клеток, совместно культивированных с клетками миеломы MM.1S, о чем свидетельствовало увеличение дегрануляции CD107a и продуцирования цитокинов IFNγ (фиг. 32). По сравнению с TriNKET изотипом, TriNKET, нацеленные на BCMA (например, A44–TriNKET–BCMA, A49–TriNKET–BCMA, C26–TriNKET–BCMA, F04–TriNKET–BCMA, F43–TriNKET–BCMA, F43–TriNKET–BCMA, F47–TriNK–BCMA и F63–TriNKET–BCMA), показали увеличение активности NK–клеток (фиг. 32).[00189] Co-culture of primary human NK cells with BCMA-positive MM.1S myeloma cells resulted in TriNKET-mediated activation of primary human NK cells. TriNKETs targeting BCMA (e.g., C26–TriNKET–BCMA and F04–TriNKET–BCMA) mediated the activation of human NK cells cocultured with MM.1S myeloma cells, as evidenced by increased CD107a degranulation and IFNγ cytokine production (Fig. 32). Compared to the TriNKET isotype, TriNKETs targeting BCMA (e.g., A44–TriNKET–BCMA, A49–TriNKET–BCMA, C26–TriNKET–BCMA, F04–TriNKET–BCMA, F43–TriNKET–BCMA, F43–TriNKET–BCMA, F47–TriNK–BCMA and F63–TriNKET–BCMA) showed an increase in NK cell activity (Fig. 32).

Пример 10. Триспецифические связывающие белки обеспечивают цитотоксичность раковых клеток–мишеней.Example 10 Trispecific binding proteins provide cytotoxicity to target cancer cells.

[00190] Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкоцитарной оболочки периферической крови центрифугированием в градиенте плотности. NK–клетки (CD3^–CD56⁺) выделяли из PBMC посредством отрицательного отбора с помощью магнитных бусин, при этом чистота выделенных NK–клеток обычно превышала 90%. Выделенные NK–клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL–2, для активации или оставляли на ночь без цитокина. IL–2–активированные или покоящиеся NK–клетки использовали на следующий день в анализах на цитотоксичность.[00190] Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from peripheral blood buffy coats by density gradient centrifugation. NK cells (CD3 ^– CD56 ⁺ ) were isolated from PBMCs by negative selection using magnetic beads, and the purity of isolated NK cells was typically greater than 90%. Isolated NK cells were cultured in a medium containing 100 ng/ml IL-2 for activation or left overnight without the cytokine. IL-2-activated or quiescent NK cells were used the next day in cytotoxicity assays.

DELFIA анализ цитотоксичности:DELFIA cytotoxicity assay:

[00191] Линии раковых клеток человека, экспрессирующие представляющую интерес мишень, собирали из культуры, клетки промывали PBS и ресуспендировали в ростовой среде при 106 мл/мл для мечения реагентом BATDA (Perkin Elmer AD0116). Мечение клеток–мишеней выполняли согласно инструкциям производителя. После мечения клетки промывали 3 раза PBS и ресуспендировали при 0,5–1,0×10⁵/мл в культуральной среде. Для приготовления фоновых лунок брали аликвоту меченых клеток, и клетки извлекали из среды. В лунки осторожно, чтобы не повредить гранулированные клетки, добавляли 100 мкл среды в трех экземплярах. 100 мкл BATDA–меченных клеток добавляли в каждую лунку 96–луночного планшета. Часть лунок оставляли для спонтанного высвобождения из клеток–мишеней, и часть лунок готовили для максимального лизиса клеток–мишеней путем добавления 1% Triton–X. Моноклональные антитела или TriNKET к представляющей интерес опухоли–мишени разводили в культуральной среде, в каждую лунку добавляли 50 мкл разведенного mAb или TriNKET. Покоящиеся и/или активированные NK–клетки собирали из культуры, клетки промывали и ресуспендировали при 105–2,0×10⁶/мл в культуральной среде в зависимости от требуемого соотношения E:T. 50 мкл NK–клеток добавляли в каждую лунку планшета, получая общий объем культуры, равный 200 мкл. До проведения анализа планшет инкубировали при 37ºC с 5% CO₂ в течение 2–3 часов.[00191] Human cancer cell lines expressing the target of interest were harvested from culture, the cells were washed with PBS and resuspended in growth medium at 106 ml/ml for labeling with BATDA reagent (Perkin Elmer AD0116). Target cell labeling was performed according to the manufacturer's instructions. After labeling, cells were washed 3 times with PBS and resuspended at 0.5–1.0×10 ⁵ /ml in culture medium. To prepare background wells, an aliquot of labeled cells was taken and the cells were removed from the medium. 100 μl of medium was added to the wells carefully so as not to damage the granulated cells in triplicate. 100 μl of BATDA-labeled cells was added to each well of a 96-well plate. A portion of the wells were left to allow spontaneous release from the target cells, and a portion of the wells were prepared for maximum lysis of the target cells by adding 1% Triton-X. Monoclonal antibodies or TriNKET to the target tumor of interest were diluted in culture medium, and 50 μl of the diluted mAb or TriNKET was added to each well. Resting and/or activated NK cells were collected from the culture, the cells were washed and resuspended at 105–2.0×10 ⁶ /ml in culture medium depending on the required E:T ratio. 50 μl of NK cells was added to each well of the plate, resulting in a total culture volume of 200 μl. Before analysis, the plate was incubated at 37ºC with 5% CO ₂ for 2–3 hours.

[00192] После культивирования в течение 2–3 часов планшет извлекали из инкубатора, и клетки осаждали центрифугированием при 200g в течение 5 минут. 20 мкл культурального супернатанта переносили в чистый микропланшет, предоставленный производителем, и в каждую лунку добавляли 200 мкл раствора европия при комнатной температуре. Планшет защищали от света и инкубировали на шейкере при 250 об/мин в течение 15 минут. Планшет считывали на приборе Victor 3 или SpectraMax i3X. Процент специфического лизиса рассчитывали следующим образом: % специфического лизиса = ((Экспериментальное высвобождение – спонтанное высвобождение)/(Максимальное высвобождение – спонтанное высвобождение))*100%.[00192] After culture for 2-3 hours, the plate was removed from the incubator and the cells were pelleted by centrifugation at 200g for 5 minutes. 20 μL of culture supernatant was transferred to a clean microplate provided by the manufacturer, and 200 μL of europium solution was added to each well at room temperature. The plate was protected from light and incubated on a shaker at 250 rpm for 15 minutes. The plate was read on a Victor 3 or SpectraMax i3X. The percentage of specific lysis was calculated as follows: % specific lysis = ((Experimental release - spontaneous release)/(Maximum release - spontaneous release))*100%.

[00193] Анализировали TriNKET–опосредованный лизис BCMA–положительных клеток миеломы. На фиг. 39 показан TriNKET–опосредованный лизис BCMA–положительных клеток миеломы KMS12–PE в присутствии покоящихся эффекторных NK–клеток человека. Два TriNKET (cFAE–A49.801 и cFAE–A49.901), содержащие один и тот же NKG2D–связывающий домен (A49), но разные домены, направленные на BCMA, тестировали относительно их in vitro эффективности. Оба TriNKET в одинаковой степени усиливали опосредованный NK–клетками лизис клеток KMS12–PE, но TriNKET, содержащий домен EM–901 направленного воздействия, обеспечивал повышенную активность (фиг. 39).[00193] TriNKET-mediated lysis of BCMA-positive myeloma cells was analyzed. In fig. 39 shows TriNKET-mediated lysis of BCMA-positive KMS12-PE myeloma cells in the presence of resting human effector NK cells. Two TriNKETs (cFAE–A49.801 and cFAE–A49.901) containing the same NKG2D binding domain (A49) but different BCMA-targeting domains were tested for their in vitro potency. Both TriNKETs similarly enhanced NK cell-mediated lysis of KMS12-PE cells, but TriNKET containing the targeting domain EM-901 provided increased activity (Figure 39).

[00194] На фиг. 33 показана цитотоксическая активность нескольких TriNKET, содержащих разные NKG2D–связывающие домены (A40, A44, A49, C26 и F47), но один и тот же домен, нацеленный на BCMA. Изменение NKG2D–связывающего домена в TriMAKET, нацеленном на BCMA, влияло на максимальный уровень гибели клеток, а также на эффективности TriNKET. Для всех TriNKET был продемонстрирован увеличенный уровень гибели клеток–мишеней KMS12–PE по сравнению с моноклональным антителом EM–901 (фиг. 33).[00194] In FIG. 33 shows the cytotoxic activity of several TriNKETs containing different NKG2D binding domains (A40, A44, A49, C26 and F47) but the same BCMA-targeting domain. Altering the NKG2D binding domain in BCMA-targeting TriMAKET affected the maximum level of cell death as well as the efficacy of TriNKET. All TriNKETs showed increased levels of KMS12-PE target cell death compared to monoclonal antibody EM-901 (Figure 33).

Пример 11Example 11

[00195] Исследовали синергетическую активацию человеческих NK–клеток путем сшивания NKG2D и CD16.[00195] Synergistic activation of human NK cells by cross-linking NKG2D and CD16 was studied.

Первичный анализ активации человеческих NK–клетокPrimary analysis of human NK cell activation

[00196] Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкоцитарной оболочки периферической крови человека центрифугированием в градиенте плотности. NK–клетки очищали от РВМС с помощью отрицательных магнитных бусин (StemCell # 17955). Согласно результатам проточной цитометрии NK–клетки были CD3^–CD56⁺ на >90%. Затем перед использованием в анализах активации клетки размножали в течение 48 часов в среде, содержащей 100 нг/мл hIL–2 (Peprotech # 200–02). Антитела наносили в 96–луночный планшет с плоским дном с концентрацией 2 мкг/мл (анти–CD16, Biolegend # 302013) и 5 мкг/мл (анти–NKG2D, R&D # MAB139) в 100 мкл стерильного PBS в течение ночи при 4°С с последующей тщательной промывкой лунок для удаления избытка антител. Для оценки дегрануляции IL–2–активированные NK–клетки ресуспендировали при 5×10⁵ клеток/мл в культуральной среде, дополненной 100 нг/мл hIL2 и 1 мкг/мл APC–конъюгированного анти–CD107a mAb (Biolegend # 328619). Затем в планшеты, покрытые антителами, добавляли 1×10⁵ клеток/лунку. Ингибиторы транспорта белка Брефелдин А (BFA, Biolegend # 420601) и монензин (Biolegend # 420701) добавляли с конечным разведением 1:1000 и 1:270 соответственно. Планшеты с клетками инкубировали в течение 4 часов при 37°С в 5% СО₂. Для внутриклеточного окрашивания IFN–γ NK–клетки метили анти–CD3 (Biolegend # 300452) и анти–CD56 mAb (Biolegend # 318328), а затем фиксировали и пермеабилизовали, и метили анти–IFN–γ mAb (Biolegend # 506507). NK–клетки анализировали на экспрессию CD107a и IFN–γ методом проточной цитометрии после стробирования на живые CD56⁺CD3^– клетки.[00196] Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from human peripheral blood buffy coats by density gradient centrifugation. NK cells were purified from PBMCs using negative magnetic beads (StemCell #17955). According to the results of flow cytometry, NK cells were CD3 ^– CD56 ⁺ >90%. Cells were then propagated for 48 hours in media containing 100 ng/ml hIL–2 (Peprotech #200–02) before use in activation assays. Antibodies were applied to a 96-well flat-bottom plate at a concentration of 2 μg/ml (anti-CD16, Biolegend # 302013) and 5 μg/ml (anti-NKG2D, R&D # MAB139) in 100 μl of sterile PBS overnight at 4°C C, followed by thorough washing of the wells to remove excess antibodies. To assess degranulation, IL2-activated NK cells were resuspended at ^5x105 cells/ml in culture medium supplemented with 100 ng/ml hIL2 and 1 μg/ml APC-conjugated anti-CD107a mAb (Biolegend #328619). Then 1×10 ⁵ cells/well were added to the antibody-coated plates. The protein transport inhibitors Brefeldin A (BFA, Biolegend #420601) and monensin (Biolegend #420701) were added at final dilutions of 1:1000 and 1:270, respectively. The cell plates were incubated for 4 hours at 37°C in 5% CO ₂ . For intracellular IFN-γ staining, NK cells were labeled with anti-CD3 (Biolegend #300452) and anti-CD56 mAb (Biolegend #318328) and then fixed and permeabilized and labeled with anti-IFN-γ mAb (Biolegend #506507). NK cells were analyzed for CD107a and IFN-γ expression by flow cytometry after gating on live CD56 ⁺ CD3 ^– cells.

[00197] Для изучения относительной активности комбинации рецепторов выполняли связывание NKG2D или CD16 и совместное связывание обоих рецепторов путем стимуляции связывания на планшете. Как показано на фиг. 34 (фиг. 34A–3C), комбинированная стимуляция CD16 и NKG2D приводила к сильно увеличенным уровням CD107a (дегрануляция) (фиг. 3A) и/или продуцирования IFN–γ (фиг. 34B). Пунктирные линии представляют аддитивный эффект отдельных стимуляций каждого рецептора.[00197] To study the relative activity of a combination of receptors, binding of NKG2D or CD16 and co-binding of both receptors was performed by stimulating binding on the plate. As shown in FIG. 34 (Fig. 34A–3C), combined stimulation of CD16 and NKG2D resulted in highly increased levels of CD107a (degranulation) (Fig. 3A) and/or IFN-γ production (Fig. 34B). The dotted lines represent the additive effect of individual stimulations of each receptor.

[00198] Уровни CD107a и внутриклеточного продуцирования IFN–γ у IL–2–активированных NK–клеток анализировали через 4 часа после начала стимуляции связывания на планшете с помощью анти–CD16, анти–NKG2D или комбинации обоих моноклональных антител. На графиках показано среднее значение (n=2) ± SD. На фиг. 34А показаны уровни CD107a; на фиг. 34B показаны уровни IFNγ; на фиг. 34C показаны уровни CD107a. Данные, показанные на фиг. 34A–34C, получены в пяти независимых экспериментах с участием пяти здоровых доноров.[00198] Levels of CD107a and intracellular IFN-γ production in IL-2-activated NK cells were analyzed 4 hours after initiation of plate binding stimulation with anti-CD16, anti-NKG2D, or a combination of both monoclonal antibodies. Graphs show mean (n=2) ± SD. In fig. 34A shows CD107a levels; in fig. 34B shows IFNγ levels; in fig. 34C shows CD107a levels. The data shown in FIG. 34A–34C were obtained in five independent experiments involving five healthy donors.

ВКЛЮЧЕНИЕ В ВИДЕ ССЫЛКИINCLUSION BY REFERENCE

[00199] Полное раскрытие каждого из патентных документов и научных статей, упомянутых в настоящем описании, включено в виде ссылки для всех целей.[00199] The entire disclosure of each of the patent documents and scientific articles mentioned herein is incorporated by reference for all purposes.

ЭКВИВАЛЕНТЫEQUIVALENTS

[00200] Изобретение может быть реализовано в других конкретных формах без отклонения от сущности или его существенных характеристик. Таким образом, приведенные выше варианты осуществления следует рассматривать исключительно как иллюстративные, а не ограничивающие изобретение, описанное в настоящей заявке. Таким образом, объем изобретения обозначен прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и все изменения, которые охвачены значением и диапазоном эквивалентов формулы изобретения, включены в объем изобретения.[00200] The invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. Thus, the above embodiments should be considered solely as illustrative and not limiting of the invention described in this application. Accordingly, the scope of the invention is indicated by the appended claims and not by the preceding description, and all changes that are covered by the meaning and range of equivalents of the claims are included within the scope of the invention.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> DRAGONFLY THERAPEUTICS, INC.<110> DRAGONFLY THERAPEUTICS, INC.

<120> БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ BCMA, NKG2D И CD16<120> BCMA, NKG2D AND CD16 BINDING PROTEINS

<130> 14247-424-999<130> 14247-424-999

<140> US 16/484,936<140>US 16/484,936

<141> 2019-08-09<141> 2019-08-09

<150> PCT/US2018/017653<150> PCT/US2018/017653

<151> 2018-02-09<151> 2018-02-09

<150> 62/457,780<150> 62/457,780

<151> 2017-02-10<151> 2017-02-10

<160> 143<160> 143

<170> PatentIn version 3.5<170> Patent In version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический<223> Description of artificial sequence: synthetic

полипептид polypeptide

<400> 1<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu LysGly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuSer Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys AlaLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr LeuArg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 2<210> 2

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 2<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser TrpAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro IleAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Ile

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 3<210> 3

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 3<400> 3

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 4<210> 4

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 4<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro GlyGlu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser SerGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuTyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe SerIle Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu GluGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 8065 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser ProPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95 85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysIle Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 5<210> 5

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 5<400> 5

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 6<210> 6

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 6<400> 6

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser TrpAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Tyr ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Tyr Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 7<210> 7

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 7<400> 7

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 8<210> 8

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 8<400> 8

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Tyr Tyr ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Tyr Tyr Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 9<210> 9

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 9<400> 9

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 10<210> 10

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 10<400> 10

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 11<210> 11

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 11<400> 11

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr LeuArg Ala Arg Gly Pro Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 12<210> 12

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 12<400> 12

Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyGlu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser TyrAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu IleLeu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser GlyTyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ile Pro TyrGlu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ile Pro Tyr

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 13<210> 13

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 13<400> 13

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 14<210> 14

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 14<400> 14

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro IleAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro Ile

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 15<210> 15

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 15<400> 15

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 16<210> 16

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 16<400> 16

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro TrpAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 17<210> 17

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 17<400> 17

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 18<210> 18

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 18<400> 18

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 19<210> 19

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 19<400> 19

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 20<210> 20

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 20<400> 20

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 21<210> 21

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 21<400> 21

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 22<210> 22

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 22<400> 22

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 23<210> 23

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 23<400> 23

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 24<210> 24

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 24<400> 24

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 25<210> 25

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 25<400> 25

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 26<210> 26

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 26<400> 26

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Phe Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Phe Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 27<210> 27

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 27<400> 27

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 28<210> 28

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 28<400> 28

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Ser ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Ser Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 29<210> 29

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 29<400> 29

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 30<210> 30

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 30<400> 30

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 31<210> 31

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 31<400> 31

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 32<210> 32

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 32<400> 32

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Phe Ile ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Phe Ile Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 33<210> 33

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 33<400> 33

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 34<210> 34

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 34<400> 34

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 35<210> 35

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 35<400> 35

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 36<210> 36

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 36<400> 36

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 37<210> 37

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 37<400> 37

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 38<210> 38

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 38<400> 38

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Leu Tyr Ser TyrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Leu Tyr Ser Tyr

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 39<210> 39

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 39<400> 39

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 40<210> 40

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 40<400> 40

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Ile ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Ile Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 41<210> 41

<211> 125<211> 125

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 41<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly SerGln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 151 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser TyrSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp MetAla Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys PheGly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrGln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysMet Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly MetAla Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser SerAsp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125 115 120 125

<210> 42<210> 42

<211> 113<211> 113

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 42<400> 42

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu GlyAsp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr SerGlu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnSer Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrPro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 8065 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln GlnIle Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95 85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu IleTyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110 100 105 110

LysLys

<210> 43<210> 43

<211> 121<211> 121

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 43<400> 43

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser GluGln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser SerThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu GluSer Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45 35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro SerTrp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln PheLeu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 8065 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr TyrSer Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95 85 90 95

Cys Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp GlyCys Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 44<210> 44

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 44<400> 44

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro GlyGlu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg TyrGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser GlyTyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro ProGlu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 45<210> 45

<211> 121<211> 121

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 45<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly GlyGln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValGly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser ValAla Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp GlyAla Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser SerGln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 46<210> 46

<211> 110<211> 110

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 46<400> 46

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly GlnGln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 151 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn AsnSer Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30 20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu LeuAla Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe SerIle Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu GlnGly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 8065 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser LeuSer Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95 85 90 95

Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val LeuAsn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110 100 105 110

<210> 47<210> 47

<211> 115<211> 115

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 47<400> 47

Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser GluGln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu LysGly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val ThrAsn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110 100 105 110

Val Ser SerVal Ser Ser

115 115

<210> 48<210> 48

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 48<400> 48

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysTrp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 49<210> 49

<211> 119<211> 119

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 49<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly AlaGln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 151 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp TyrSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp MetTyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys PheGly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala TyrThr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe CysMet Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln GlyAla Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110 100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser SerThr Met Val Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 50<210> 50

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 50<400> 50

Asp Tyr Tyr Ile AsnAsp Tyr Tyr Ile Asn

1 515

<210> 51<210> 51

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 51<400> 51

Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe ThrTrp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 52<210> 52

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 52<400> 52

Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp ValLeu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 101 5 10

<210> 53<210> 53

<211> 112<211> 112

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 53<400> 53

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro GlyAsp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His SerGlu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln SerAsn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45 35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val ProPro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys IleAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 8065 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu ThrSer Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr

85 90 95 85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile LysSer His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110 100 105 110

<210> 54<210> 54

<211> 112<211> 112

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 54<400> 54

1 5 10 151 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His SerGln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys IleAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 8065 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln SerSer Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95 85 90 95

Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile LysSer Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110 100 105 110

<210> 55<210> 55

<211> 16<211> 16

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 55<400> 55

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu HisLys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 151 5 10 15

<210> 56<210> 56

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 56<400> 56

Lys Val Ser Asn Arg Phe SerLys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 515

<210> 57<210> 57

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 57<400> 57

Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp ThrAla Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr

1 515

<210> 58<210> 58

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 58<400> 58

Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp ThrSer Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr

1 515

<210> 59<210> 59

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 59<400> 59

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly GluGln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp TyrThr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp MetSer Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp PheGly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala TyrArg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe CysLeu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr SerAla Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 60<210> 60

<211> 111<211> 111

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 60<400> 60

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu GlyAsp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 151 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile LeuLys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu

20 25 30 20 25 30

Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro ProGly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45 35 40 45

Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro AlaThr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile AspArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 8065 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser ArgPro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95 85 90 95

Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile LysThr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110 100 105 110

<210> 61<210> 61

<211> 121<211> 121

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 61<400> 61

1 5 10 151 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn TyrSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp MetTrp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys PheGly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala TyrLys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp GlyAla Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 62<210> 62

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 62<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn TyrAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleLeu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro TrpGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys ArgThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 100 105

<210> 63<210> 63

<211> 184<211> 184

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 63<400> 63

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp SerMet Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 151 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn ThrLeu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30 20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn SerPro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser

35 40 45 35 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser LeuVal Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu

50 55 60 50 55 60

Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys IleIle Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile

65 70 75 8065 70 75 80

Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly LeuAsn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu

85 90 95 85 90 95

Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp GluLeu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu

100 105 110 100 105 110

Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr CysIle Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys

115 120 125 115 120 125

Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys PheGlu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe

130 135 140 130 135 140

Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr LysPro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys

145 150 155 160145 150 155 160

Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr GluThr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu

165 170 175 165 170 175

Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala ArgIle Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

180 180

<210> 64<210> 64

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 64<400> 64

Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp SerGly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser

1 515

<210> 65<210> 65

<211> 16<211> 16

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 65<400> 65

Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerGlu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 151 5 10 15

<210> 66<210> 66

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 66<400> 66

Ala Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp ProAla Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro

1 5 101 5 10

<210> 67<210> 67

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 67<400> 67

Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile SerGly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

1 515

<210> 68<210> 68

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 68<400> 68

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe GlnGly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 69<210> 69

<211> 18<211> 18

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 69<400> 69

1 5 10 151 5 10 15

Asp ValAsp Val

<210> 70<210> 70

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 70<400> 70

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr LeuLys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 151 5 10 15

AlaAla

<210> 71<210> 71

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 71<400> 71

Trp Ala Ser Thr Arg Glu SerTrp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 515

<210> 72<210> 72

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 72<400> 72

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile ThrGln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr

1 515

<210> 73<210> 73

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 73<400> 73

Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp GlyGly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly

1 5 101 5 10

<210> 74<210> 74

<211> 16<211> 16

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 74<400> 74

Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerSer Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 151 5 10 15

<210> 75<210> 75

<211> 13<211> 13

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 75<400> 75

Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp TyrAla Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr

1 5 101 5 10

<210> 76<210> 76

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 76<400> 76

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu AlaArg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu Ala

1 5 101 5 10

<210> 77<210> 77

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 77<400> 77

Asp Ala Ser Asn Arg Ala ThrAsp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 515

<210> 78<210> 78

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 78<400> 78

Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro ThrGln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro Thr

1 515

<210> 79<210> 79

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 79<400> 79

Asp Tyr Ser Ile AsnAsp Tyr Ser Ile Asn

1 515

<210> 80<210> 80

<211> 16<211> 16

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 80<400> 80

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe ArgTrp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg

1 5 10 151 5 10 15

<210> 81<210> 81

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 81<400> 81

Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp TyrAsp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 515

<210> 82<210> 82

<211> 15<211> 15

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 82<400> 82

Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile HisArg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His

1 5 10 151 5 10 15

<210> 83<210> 83

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 83<400> 83

Leu Ala Ser Asn Val Gln ThrLeu Ala Ser Asn Val Gln Thr

1 515

<210> 84<210> 84

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 84<400> 84

Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg ThrLeu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr

1 515

<210> 85<210> 85

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 85<400> 85

Asn Tyr Trp Met HisAsn Tyr Trp Met His

1 515

<210> 86<210> 86

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 86<400> 86

Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe LysAla Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 87<210> 87

<211> 12<211> 12

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 87<400> 87

Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp AsnGly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn

1 5 101 5 10

<210> 88<210> 88

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 88<400> 88

Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu AsnSer Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 101 5 10

<210> 89<210> 89

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 89<400> 89

Tyr Thr Ser Asn Leu His SerTyr Thr Ser Asn Leu His Ser

1 515

<210> 90<210> 90

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 90<400> 90

Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp ThrGln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr

1 515

<210> 91<210> 91

<211> 116<211> 116

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 91<400> 91

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ala Lys Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu ValAla Lys Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110 100 105 110

Thr Val Ser SerThr Val Ser Ser

115 115

<210> 92<210> 92

<211> 109<211> 109

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 92<400> 92

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro ProPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro

85 90 95 85 90 95

Asp Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysAsp Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 93<210> 93

<211> 116<211> 116

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 93<400> 93

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp AsnSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn

20 25 30 20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Pro Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Ala Ile Ser Gly Pro Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Val Ser SerThr Val Ser Ser

115 115

<210> 94<210> 94

<211> 109<211> 109

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 94<400> 94

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp GluGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Glu

20 25 30 20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuTyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile His Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe SerIle His Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Arg Leu GluGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 95<210> 95

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 95<400> 95

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Val Thr Val Ser SerVal Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 96<210> 96

<211> 106<211> 106

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 96<400> 96

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro ThrAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 97<210> 97

<211> 126<211> 126

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 97<400> 97

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr GlyAla Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

100 105 110 100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser SerMet Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125 115 120 125

<210> 98<210> 98

<211> 113<211> 113

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 98<400> 98

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn SerGlu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30 20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly GlnGly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45 35 40 45

Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly ValPro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln AsnIle Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95 85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu IleAsp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110 100 105 110

LysLys

<210> 99<210> 99

<211> 121<211> 121

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 99<400> 99

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Trp GlyAla Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 100<210> 100

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 100<400> 100

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser TrpAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro ArgGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 101<210> 101

<211> 122<211> 122

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 101<400> 101

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValSer Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro TrpAla Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 102<210> 102

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 102<400> 102

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser TrpAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro ArgGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 103<210> 103

<211> 124<211> 124

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 103<400> 103

1 5 10 151 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly TyrSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp MetTyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys PheGly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala TyrGln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysMet Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met AspAla Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp

100 105 110 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser SerVal Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 104<210> 104

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

полипептид polypeptide

<400> 104<400> 104

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser AsnGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser GlyTyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln SerSer Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro ProGlu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 105<210> 105

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 105<400> 105

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met SerPhe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 515

<210> 106<210> 106

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 106<400> 106

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val LysAla Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 107<210> 107

<211> 14<211> 14

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 107<400> 107

Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp TyrAla Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr

1 5 101 5 10

<210> 108<210> 108

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 108<400> 108

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu AlaArg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala

1 5 101 5 10

<210> 109<210> 109

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 109<400> 109

Ala Ala Ser Ser Leu Gln SerAla Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 515

<210> 110<210> 110

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 110<400> 110

Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg ThrGln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg Thr

1 515

<210> 111<210> 111

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 111<400> 111

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met AsnPhe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn

1 515

<210> 112<210> 112

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 112<400> 112

Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val LysSer Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 113<210> 113

<211> 15<211> 15

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 113<400> 113

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp ProAla Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 151 5 10 15

<210> 114<210> 114

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 114<400> 114

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu AlaArg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 101 5 10

<210> 115<210> 115

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 115<400> 115

Ala Ala Ser Ser Leu Gln SerAla Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 515

<210> 116<210> 116

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 116<400> 116

Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg ThrGln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg Thr

1 515

<210> 117<210> 117

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 117<400> 117

Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met HisTyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His

1 515

<210> 118<210> 118

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 118<400> 118

Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe GlnTrp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 119<210> 119

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 119<400> 119

1 5 10 151 5 10 15

ValVal

<210> 120<210> 120

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 120<400> 120

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu AlaArg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 101 5 10

<210> 121<210> 121

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 121<400> 121

Gly Ala Ser Thr Arg Ala ThrGly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 515

<210> 122<210> 122

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептид peptide

<400> 122<400> 122

Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro ThrGln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro Thr

1 515

<210> 123<210> 123

<211> 121<211> 121

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический <223> Description of artificial sequence: synthetic

пептидpeptide

<400> 123<400> 123

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Tyr Phe Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu GluSer Tyr Phe Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45 35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro SerTrp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Cys Ala Arg His Asp Gly Ala Thr Ala Gly Leu Phe Asp Tyr Trp GlyCys Ala Arg His Asp Gly Ala Thr Ala Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 124<210> 124

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 124<400> 124

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly GlnSer Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 151 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser ValThr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val TyrHis Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr

35 40 45 35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly SerAsp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala GlyAsn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp HisAsp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95 85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val LeuVal Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 100 105

<210> 125<210> 125

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 125<400> 125

Ser Ser Ser Tyr Phe Trp GlySer Ser Ser Tyr Phe Trp Gly

1 515

<210> 126<210> 126

<211> 16<211> 16

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 126<400> 126

Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerSer Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 151 5 10 15

<210> 127<210> 127

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 127<400> 127

His Asp Gly Ala Thr Ala Gly Leu Phe Asp TyrHis Asp Gly Ala Thr Ala Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5 101 5 10

<210> 128<210> 128

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 128<400> 128

Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val HisGly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His

1 5 101 5 10

<210> 129<210> 129

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 129<400> 129

Asp Asp Ser Asp Arg Pro SerAsp Asp Ser Asp Arg Pro Ser

1 515

<210> 130<210> 130

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 130<400> 130

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val ValGln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val

1 5 101 5 10

<210> 131<210> 131

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 131<400> 131

Asp Asn Ala Met GlyAsp Asn Ala Met Gly

1 515

<210> 132<210> 132

<211> 16<211> 16

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 132<400> 132

Ala Ile Ser Gly Pro Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val LysAla Ile Ser Gly Pro Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 151 5 10 15

<210> 133<210> 133

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 133<400> 133

Val Leu Gly Trp Phe Asp TyrVal Leu Gly Trp Phe Asp Tyr

1 515

<210> 134<210> 134

<211> 12<211> 12

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 134<400> 134

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Glu Tyr Leu SerArg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Glu Tyr Leu Ser

1 5 101 5 10

<210> 135<210> 135

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 135<400> 135

Ser Ala Ser Thr Arg Ala ThrSer Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 515

<210> 136<210> 136

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 136<400> 136

Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro Asp Phe ThrGln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro Asp Phe Thr

1 5 101 5 10

<210> 137<210> 137

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид<223> Description of artificial sequence: synthetic peptide

<400> 137<400> 137

Ser Tyr Ala Met SerSer Tyr Ala Met Ser

1 515

<210> 138<210> 138

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<400> 138<400> 138

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 139<210> 139

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<400> 139<400> 139

Val Leu Gly Trp Phe Asp TyrVal Leu Gly Trp Phe Asp Tyr

1 515

<210> 140<210> 140

<211> 12<211> 12

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<400> 140<400> 140

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu AlaArg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 101 5 10

<210> 141<210> 141

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<400> 141<400> 141

Gly Ala Ser Ser Arg Ala ThrGly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 515

<210> 142<210> 142

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<400> 142<400> 142

Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro Asp Phe ThrGln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro Asp Phe Thr

1 5 101 5 10

<210> 143<210> 143

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

пептидpeptide

<400> 143<400> 143

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn Ala Met GlyGly Phe Thr Phe Ser Asp Asn Ala Met Gly

1 5 101 5 10

<---<---

Claims

1. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, BCMA и CD16, содержащий:1. Polyspecific binding protein that binds to NKG2D, BCMA and CD16, containing:

(а) первый антигенсвязывающий участок молекулы иммуноглобулина, который связывается с NKG2D, где указанный первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL);(a) a first antigen binding region of an immunoglobulin molecule that binds NKG2D, wherein said first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain (VH) and a light chain variable domain (VL);

(b) второй антигенсвязывающий участок молекулы иммуноглобулина, который связывается с ВСМА, где указанный второй антигенсвязывающий участок содержит VH и VL; и(b) a second antigen binding region of the immunoglobulin molecule that binds to BCMA, wherein said second antigen binding region comprises VH and VL; And

(c) домен Fc антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, где указанный домен Fc антитела содержит первый домен Fc и второй домен Fc, и (c) an antibody Fc domain or a portion thereof sufficient to bind CD16, wherein said antibody Fc domain comprises a first Fc domain and a second Fc domain, and

где указанные VH или VL первого антигенсвязывающего участка связаны с указанным первым доменом Fc и указанные VH или VL второго антигенсвязывающего участка связаны с указанным вторым доменом Fc, иwherein said VH or VL of the first antigen binding region is linked to said first Fc domain and said VH or VL of the second antigen binding region is linked to said second Fc domain, and

где указанный второй антигенсвязывающий участок содержит: wherein said second antigen-binding region comprises:

(i) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 131 или SEQ ID NO: 143, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 132, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 133, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 134, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 135, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 136; (i) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 131 or SEQ ID NO: 143, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 132, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid the sequence presented in SEQ ID NO: 133, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 134, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 135, and a light chain CDR3 sequence, identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 136;

(ii) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 50, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 51, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 52, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 55, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 56, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 58; (ii) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 51, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 55, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 56, and a light chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 58;

(iii) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 79, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 80, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 81, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 82, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 83, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 84; (iii) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 79, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 80, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 81, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 82, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 83, and a light chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 84;

(iv) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 85, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 86, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 87, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 88, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 89, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 90; (iv) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 85, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 86, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 87, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 88, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 89, and a light chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 90;

(v) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 125, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 126, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 127, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 128, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 129, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 130; или(v) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 125, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 126, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 127, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 128, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 129, and a light chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 130; or

(vi) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 137, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 138, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 139, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 140, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 141, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 142.(vi) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 137, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 138, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 139, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 140, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 141, and a light chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 142.

2. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором первый антигенсвязывающий участок связывается с NKG2D у людей, приматов, не являющихся людьми, и грызунов.2. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the first antigen binding region binds to NKG2D in humans, non-human primates and rodents.

3. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором указанный VH первого антигенсвязывающего участка и указанный VL первого антигенсвязывающего участка находятся в одном и том же полипептиде.3. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein said VH of the first antigen binding region and said VL of the first antigen binding region are in the same polypeptide.

4. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором указанный VH второго антигенсвязывающего участка и указанный VL второго антигенсвязывающего участка находятся в одном и том же полипептиде.4. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein said VH of the second antigen binding region and said VL of the second antigen binding region are in the same polypeptide.

5. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором указанный VL первого антигенсвязывающего участка имеет аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности указанного VL второго антигенсвязывающего участка.5. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein said VL of the first antigen binding region has an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of said VL of the second antigen binding region.

6. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором первый антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 1.6. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the first antigen binding region comprises a VH amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 1.

7. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором первый антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 101, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 102.7. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the first antigen binding region comprises a VH amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 101 and a VL amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 102 .

8. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором первый антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 41, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичный SEQ ID NO: 42.8. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the first antigen binding region comprises a VH amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 41 and a VL amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 42 .

9. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором первый антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 43, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 44.9. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the first antigen binding region comprises a VH amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 43 and a VL amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 44 .

10. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором первый антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 45, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 46.10. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the first antigen binding region comprises a VH amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 45 and a VL amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 46 .

11. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором первый антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 47, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 48.11. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the first antigen binding region comprises a VH amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 47 and a VL amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 48 .

12. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором первый антигенсвязывающий участок содержит:12. The polyspecific binding protein according to claim 1, wherein the first antigen-binding site comprises:

(i) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 111, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 112, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 113, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 114, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 115, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичную к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 116;(i) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 111, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 112, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 113, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 114, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 115, and a light chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 116;

(ii) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 64, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 65, и последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 66;(ii) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 64, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 65, and a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 66;

(iii) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 67, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 68, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 69, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичную к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 72; или(iii) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 67, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 68, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 69, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 70, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 71, and a light chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 72; or

(iv) последовательность CDR1 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 73, последовательность CDR2 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 74, последовательность CDR3 тяжелой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 75, последовательность CDR1 легкой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 76, последовательность CDR2 легкой цепи, идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 77, и последовательность CDR3 легкой цепи, идентичную к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78.(iv) a heavy chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 73, a heavy chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 74, a heavy chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 75, a light chain CDR1 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 76, a light chain CDR2 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 77, and a light chain CDR3 sequence identical to the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 78.

13. Полиспецифический связывающий белок по п.1, где второй антигенсвязывающий сайт содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 93, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 94.13. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the second antigen binding site comprises a VH amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 93 and a VL amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 94.

14. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором второй антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 49, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54.14. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the second antigen binding region comprises a VH amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 49 and a VL amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 53 or SEQ ID NO: 54.

15. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором второй антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 59, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 60.15. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the second antigen binding region comprises a VH amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 59 and a VL amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 59. 60.

16. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором второй антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 61, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 62.16. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the second antigen binding region comprises a VH amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 61 and a VL amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 62.

17. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором второй антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 123, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 124.17. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the second antigen binding region comprises a VH amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 123 and a VL amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 124.

18. Полиспецифический связывающий белок по п.1, в котором второй антигенсвязывающий участок содержит аминокислотную последовательность VH, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 91, и аминокислотную последовательность VL, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 92.18. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein the second antigen binding region comprises a VH amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 91 and a VL amino acid sequence that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 92.

19. Полиспецифический связывающий белок по п.1, где указанный полиспецифический белок содержит указанную часть домена Fc антитела, достаточную для связывания CD16, причем указанный домен Fc антитела содержит шарнирный и CH2 домены.19. The polyspecific binding protein of claim 1, wherein said polyspecific protein comprises said portion of an antibody Fc domain sufficient to bind CD16, said antibody Fc domain comprising a hinge and CH2 domains.

20. Полиспецифический связывающий белок по п.19, в котором указанный домен Fc антитела содержит шарнирный и СН2 домены человеческого антитела IgG1.20. The polyspecific binding protein of claim 19, wherein said Fc domain of the antibody comprises the hinge and CH2 domains of the human IgG1 antibody.

21. Полиспецифический связывающий белок по п.19, в котором указанный домен Fc антитела содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотам 234–332 человеческого IgG1 антитела.21. The polyspecific binding protein of claim 19, wherein said Fc domain of the antibody comprises an amino acid sequence that is at least 95% identical to amino acids 234-332 of the human IgG1 antibody.

22. Полиспецифический связывающий белок по п.19, в котором указанный домен Fc антитела содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную домену Fc человеческого IgG1, и отличается в одном или более положений, выбранных из группы, состоящей из Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 и K439.22. The polyspecific binding protein of claim 19, wherein said Fc domain of the antibody contains an amino acid sequence that is at least 95% identical to the Fc domain of human IgG1 and differs at one or more positions selected from the group consisting of Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 and K439.

23. Фармацевтический состав для лечения рака, экспрессирующего ВСМА, содержащий эффективное количество полиспецифического связывающего белка по любому из предшествующих пунктов и фармацевтически приемлемый носитель.23. A pharmaceutical composition for the treatment of cancer expressing BCMA, comprising an effective amount of a polyspecific binding protein according to any of the preceding claims and a pharmaceutically acceptable carrier.

24. Клетка-хозяин для получения полиспецифического связывающего белка по любому из пп.1–22, содержащая один или более экспрессионных векторов, содержащих одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих полиспецифический связывающий белок по любому из пп.1–22.24. A host cell for producing a polyspecific binding protein according to any one of claims 1 to 22, containing one or more expression vectors containing one or more nucleic acids encoding a polyspecific binding protein according to any one of claims 1 to 22.

25. Способ усиления гибели клеток опухоли, экспрессирующей BCMA, включающий приведение клетки опухоли, экспрессирующей BCMA, и натуральной киллерной клетки в контакт с полиспецифическим связывающим белком по любому из пп.1–22.25. A method of enhancing the death of tumor cells expressing BCMA, comprising bringing the tumor cell expressing BCMA and a natural killer cell into contact with a multispecific binding protein according to any one of claims 1 to 22.

26. Способ лечения рака, экспрессирующего ВСМА, включающий введение пациенту эффективного количества полиспецифического связывающего белка по любому из пп.1–22.26. A method of treating cancer expressing BCMA, comprising administering to a patient an effective amount of a polyspecific binding protein according to any one of claims 1 to 22.

27. Способ по п.26, в котором рак, экспрессирующий ВСМА, выбирают из группы, состоящей из множественной миеломы, острого миеломоноцитарного лейкоза, Т–клеточной лимфомы, острого моноцитарного лейкоза и фолликулярной лимфомы.27. The method of claim 26, wherein the cancer expressing BCMA is selected from the group consisting of multiple myeloma, acute myelomonocytic leukemia, T-cell lymphoma, acute monocytic leukemia and follicular lymphoma.