RU2805212C2 - Humanized rodents for testing therapeutic agents - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to a method of using a genetically modified mouse to determine the therapeutic effect of a human antibody, including the introduction of a human mouse antibody. The said mouse contains in its genome an immunoglobulin heavy chain locus that contains an immunoglobulin heavy chain variable region, an immunoglobulin heavy chain constant region containing one or more C_H gene segments, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region additionally contains: C_γ2 human gene segment, C_γ3 human gene segment, C_μ human or rodent gene segment, C_δ human or rodent gene segment, C_ε human or rodent gene segment and/or C_α human or rodent gene segment.

EFFECT: invention is effective for conducting non-clinical testing of complex therapeutic agents.

28 cl, 13 dwg, 14 tbl, 6 ex

Description

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИRELATED APPLICATIONS

[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/648197, поданной 26 марта 2018 г., и предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/689628, поданной 25 июня 2018 г., каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.[0001] This application claims benefit from U.S. Provisional Patent Application Serial No. 62/648197, filed March 26, 2018, and U.S. Provisional Patent Application Serial No. 62/689628, filed June 25, 2018, each is incorporated herein by reference in its entirety.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

[0002] Данная заявка содержит Перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 20 марта 2019 г., имеет название RPB-01925_(28744-01925)_SL.txt и размер 12008 байтов.[0002] This application contains a Sequence Listing that was filed electronically in ASCII format and is incorporated herein by reference in its entirety. The ASCII copy in question, created on March 20, 2019, is named RPB-01925_(28744-01925)_SL.txt and is 12008 bytes in size.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[0003] Безопасность, эффективность и фармакокинетические свойства терапевтических агентов обычно тестируют в животных моделях перед тем, как вводить эти лекарства людям. Использование крупных животных, таких как отличные от человека приматы, в подобных доклинических исследованиях является дорогостоящим, и часто при этом недоступны подходящие модели заболеваний, что ограничивает применимость таких животных при тестировании эффективности лекарств.[0003] The safety, efficacy, and pharmacokinetic properties of therapeutic agents are typically tested in animal models before the drugs are administered to humans. The use of large animals, such as non-human primates, in such preclinical studies is expensive and suitable disease models are often unavailable, limiting the utility of such animals in testing drug efficacy.

[0004] Благодаря малым размерам и хорошо изученной физиологии грызунов уже долгое время используют в качестве животных моделей для доклинического тестирования терапевтических агентов. Кроме того, грызуны хорошо поддаются генетической модификации с применением хорошо отработанных методик и, следовательно, доступно много моделей заболеваний у грызунов, которые недоступны у более крупных животных. Однако комплексные терапевтические агенты, такие как антитела и Fc-слитые белки, часто по-разному ведут себя в случае грызунов и людей. Например, такие терапевтические агенты часто демонстрируют очень отличные фармакокинетические свойства при введении грызунам по сравнению с введением людям, что ограничивает применимость моделей на грызунах в качестве средства прогнозирования безопасности, эффективности и оптимального дозирования комплексных терапевтических агентов для людей. Это, в свою очередь, снижает применимость таких животных моделей в доклиническом тестировании.[0004] Due to their small size and well-studied physiology, rodents have long been used as animal models for preclinical testing of therapeutic agents. In addition, rodents are highly amenable to genetic modification using well-established techniques and, therefore, many disease models are available in rodents that are not available in larger animals. However, complex therapeutic agents such as antibodies and Fc fusion proteins often behave differently in rodents and humans. For example, such therapeutic agents often exhibit very different pharmacokinetic properties when administered to rodents compared to when administered to humans, limiting the utility of rodent models as a means of predicting the safety, efficacy, and optimal dosing of complex therapeutic agents in humans. This, in turn, reduces the utility of such animal models in preclinical testing.

[0005] Таким образом, существует большая потребность в новых животных моделях и способах, которые позволяют проводить точное доклиническое тестирование комплексных терапевтических агентов на грызунах, которое дает результаты, более точно прогнозирующие свойства таких терапевтических агентов у пациентов-людей.[0005] Thus, there is a great need for new animal models and methods that allow for accurate preclinical testing of complex therapeutic agents in rodents that yield results that more accurately predict the properties of such therapeutic agents in human patients.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[0006] В данном документе предложены способы и композиции, относящиеся к in vivo тестированию терапевтических агентов, содержащих Fc человека (например, тестированию фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств таких терапевтических агентов и схем введения доз), на генетически модифицированных грызунах (например, мышах или крысах).[0006] Provided herein are methods and compositions related to in vivo testing of human Fc-containing therapeutic agents (e.g., testing the pharmacokinetic and/or pharmacodynamic properties of such therapeutic agents and dosing schedules) in genetically modified rodents (e.g., mice or rats).

[0007] В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены генетически модифицированные грызуны, у которых введение человеческих антител и/или слитых с Fc человека белков индуцирует иммунный ответ против Fc человека (например, ответ мышиного антитела против человеческих антител или MAHA у мышей). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны (например, мыши или крысы) экспрессируют антитела, содержащие Fc человека (например, Fc IgG1 человека, Fc IgG4 человека). В некоторых вариантах осуществления грызуны экспрессируют полные человеческие антитела (т. е. антитела, имеющие человеческие тяжелые цепи и человеческие легкие (λ или κ) цепи).[0007] In certain embodiments, provided herein are genetically modified rodents in which administration of human antibodies and/or human Fc fusion proteins induces an anti-human Fc immune response (eg, a mouse anti-human antibody or MAHA response in mice). In some embodiments, the genetically modified rodents (eg, mice or rats) express antibodies containing human Fc (eg, human IgG1 Fc, human IgG4 Fc). In some embodiments, the rodents express full human antibodies (ie, antibodies having human heavy chains and human light (λ or κ) chains).

[0008] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены грызуны, которые экспрессируют один или более гуманизированных или частично гуманизированных Fc-рецепторов, которые взаимодействуют с Fc-слитыми белками или антителами таким образом, который отражает то, как Fc-рецепторы пациента-человека взаимодействовали бы с такими Fc-слитыми белками или антителами. Таким образом, в определенных вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны содержат один или более Fc-рецепторов с человеческим внеклеточным доменом (например, неонатальный Fc-рецептор (FcRn), полипептид β-2-микроглобулина (β2M), Fc-ε-рецептор 1 α (FcεR1α), Fc-γ-рецептор 1 альфа (FcγR1a), Fc-гамма-рецептор 2a (FcγR2a), Fc-гамма-рецептор 2b (FcγR2b), Fc-гамма-рецептор 3a (FcγR3a), Fc-гамма-рецептор 3b (FcγR3b), Fc-гамма-рецептор 2c (FcγR2c)). Трансмембранный и цитоплазматический домен таких рецепторов может быть человеческим или не человеческим (например, грызуна, такого как крысы или мышь).[0008] In some embodiments, provided herein are rodents that express one or more humanized or partially humanized Fc receptors that interact with Fc fusion proteins or antibodies in a manner that reflects how the human patient's Fc receptors interacted with such Fc fusion proteins or antibodies. Thus, in certain embodiments, the genetically modified rodents contain one or more Fc receptors with a human extracellular domain (e.g., neonatal Fc receptor (FcRn), β-2-microglobulin polypeptide (β2M), Fc-ε receptor 1 α ( FcεR1α), Fc-γ receptor 1 alpha (FcγR1a), Fc-gamma receptor 2a (FcγR2a), Fc-gamma receptor 2b (FcγR2b), Fc-gamma receptor 3a (FcγR3a), Fc-gamma receptor 3b (FcγR3b), Fc gamma receptor 2c (FcγR2c)). The transmembrane and cytoplasmic domain of such receptors may be human or non-human (eg, rodent, such as rat or mouse).

[0009] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши) и ЭС-клетки грызунов, содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH). В определенных вариантах осуществления локус IgH содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую один или более генных сегментов V_H, один или более генных сегментов D_H и один или более генных сегментов J_H (например, крысиных или мышиных генных сегментов V_H, генных сегментов D_H и генных сегментов J_H); и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую один или более генных сегментов C_H, кодирующих константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG человека или грызуна и цитоплазматический домен IgG человека или грызуна. В некоторых вариантах осуществления все генные сегменты C_H в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина являются человеческими. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина таким образом, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H. В определенных вариантах осуществления указанный локус расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела и Fc-слитые белки, которые совпадают по изотипу с Fc, кодируемым C_H человека в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна, вызывают сниженный иммунный ответ при введении таким грызунам. Например, в некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG1 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG2 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG3 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG3 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG4 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело, имеющее легкую цепь κ, вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие легкую цепь κ человека, например, экспрессирует антитела, имеющие константный домен κ человека, или экспрессирует антитела, имеющие вариабельный и константный домены κ человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело, имеющее легкую цепь λ, вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие легкую цепь λ человека, например, экспрессирует антитела, имеющие константный домен λ человека, или экспрессирует антитела, имеющие вариабельный и константный домены λ человека. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0009] In certain aspects, provided herein are rodents (eg, rats or mice) and rodent ES cells containing a genetically modified immunoglobulin heavy chain (IgH) locus in their genome. In certain embodiments, the IgH locus comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising one or more V _H gene segments, one or more D _H gene segments, and one or more J _H gene segments (e.g., rat or mouse V gene segments _H , gene segments _DH and gene segments _JH ); and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising one or more C _H gene segments encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, an IgG transmembrane domain human or rodent and the cytoplasmic domain of human or rodent IgG. In some embodiments, all C _H gene segments in the immunoglobulin heavy chain constant region are human. In some embodiments, the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region such that the rodent produces IgG antibodies comprising variable domains derived from the _VH gene segment, _DH gene segment, and _JH gene segment, and constant domains heavy chain derived from the _CH gene segment. In certain embodiments, said locus is located at an endogenous rodent immunoglobulin heavy chain locus. In some embodiments, human antibodies and Fc fusion proteins that are isotype-matched to the Fc encoded by the human _CH in the rodent immunoglobulin heavy chain locus produce a reduced immune response when administered to such rodents. For example, in some embodiments, a human IgG1 antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having human variable domains and human IgG1 constant domains. In some embodiments, a human IgG2 antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having human variable domains and human IgG2 constant domains. In some embodiments, a human IgG3 antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having human variable domains and human IgG3 constant domains. In some embodiments, a human IgG4 antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having human variable domains and human IgG4 constant domains. In some embodiments, a human κ light chain antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having a human κ light chain, e.g., expresses antibodies having a human κ constant domain, or expresses antibodies having a variable and constant domain κ person. In some embodiments, a human λ light chain antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having a human λ light chain, e.g., expresses antibodies having a human λ constant domain, or expresses antibodies having a variable and constant domain λ person. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0010] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус каппа-цепи иммуноглобулина (Igκ). В некоторых вариантах осуществления локус Igκ содержит: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую один или более генных сегментов V_κ человека и один или более генных сегментов J_κ человека; и (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_κ человека. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина таким образом, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_κ. В определенных вариантах осуществления указанный локус расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела, которые содержат цепь κ человека, вызывают сниженный иммунный ответ при введении таким грызунам. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител с использованием таких грызунов.[0010] In certain aspects, provided herein are rodents (eg, rats or mice) containing a genetically modified immunoglobulin kappa chain (Igκ) locus in their genome. In some embodiments, the Igκ locus comprises: (1) an immunoglobulin κ chain variable region comprising one or more human V _κ gene segments and one or more human J _κ gene segments; and (2) an immunoglobulin κ chain constant region containing the human _κ C gene segment. In some embodiments, the immunoglobulin κ chain variable region is operably linked to the immunoglobulin κ chain constant region such that the rodent produces antibodies comprising light chain variable domains derived from the human _κ V gene segment and the human _κ J gene segment, and the light chain constant domains , derived from the _Cκ gene segment. In certain embodiments, said locus is located at the endogenous rodent immunoglobulin κ chain locus. In some embodiments, human antibodies that contain the human κ chain cause a reduced immune response when administered to such rodents. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies using such rodents.

[0011] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус лямбда-цепи иммуноглобулина (Igλ). В определенных вариантах осуществления локус Igλ содержит один или более генных сегментов V_λ человека, один или более генных сегментов J_λ человека и один или более генных сегментов C_λ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты J_λ человека и генные сегменты C_λ упорядочены в виде одного или более кластеров J_λ-C_λ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты J_λ человека и генные сегменты C_λ упорядочены так, чтобы генные сегменты J_λ человека вместе были расположены выше одного или более генных сегментов C_λ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты J_λ человека и генные сегменты C_λ упорядочены так, чтобы некоторые генные сегменты J_λ человека и генные сегменты C_λ были упорядочены в виде одного или более кластеров J_λ-C_λ, тогда как другие генные сегменты J_λ вместе были расположены выше одного или более генных сегментов C_λ. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом C_λ человека таким образом, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_λ. В определенных вариантах осуществления указанный локус расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела, которые содержат цепь λ человека, вызывают сниженный иммунный ответ при введении таким грызунам. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител с использованием таких грызунов.[0011] In certain aspects, provided herein are rodents (eg, rats or mice) containing a genetically modified immunoglobulin lambda chain (Igλ) locus in their genome. In certain embodiments, the Igλ locus comprises one or more human _Vλ gene segments, one or more human _Jλ gene segments, and one or more _Cλ gene segments. In some embodiments, the human J _λ gene segments and C _λ gene segments are arranged as one or more J _λ -C _λ clusters. In some embodiments, the human J _λ gene segments and the C _λ gene segments are ordered such that the human J _λ gene segments are collectively located above one or more C _λ gene segments. In some embodiments, the human J _λ gene segments and C _λ gene segments are ordered such that some human J _λ gene segments and C _λ gene segments are ordered as one or more J _λ -C _λ clusters, while other J _λ gene segments were together located upstream of one or more _Cλ gene segments. In some embodiments, the human V _λ gene segment and the human J _λ gene segment are operably linked to the human C _λ gene segment such that the rodent produces antibodies comprising light chain variable domains derived from the human V _λ gene segment and the human J _λ gene segment , and light chain constant domains derived from the _Cλ gene segment. In certain embodiments, said locus is located at the endogenous rodent immunoglobulin λ chain locus. In some embodiments, human antibodies that contain a human λ chain cause a reduced immune response when administered to such rodents. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies using such rodents.

[0012] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn). В определенном варианте осуществления локус FcRn содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна или человека и цитоплазматический домен грызуна или человека. В определенных вариантах осуществления указанный локус расположен в эндогенном локусе FcRn грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызуны дополнительно содержат в своем геноме локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид β-2-микроглобулина (β2M) человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид β2M человека, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0012] In certain aspects, provided herein are rodents (eg, rats or mice) containing a genetically modified neonatal Fc receptor (FcRn) locus in their genome. In a certain embodiment, the FcRn locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide comprising a human extracellular domain, a rodent or human transmembrane domain, and a rodent or human cytoplasmic domain. In certain embodiments, said locus is located at the endogenous rodent FcRn locus. In some embodiments, rodents further contain in their genome a β-2-microglobulin (β2M) locus containing a nucleic acid sequence encoding a human β-2-microglobulin (β2M) polypeptide. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human β2M polypeptide is located at an endogenous rodent β2M locus. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0013] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна или человека и цитоплазматический домен грызуна или человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α человека, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0013] In certain aspects, provided herein are rodents (e.g., rats or mice) containing in their genome a genetically modified Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcεR1α polypeptide , a rodent or human transmembrane domain, and a rodent or human cytoplasmic domain. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human FcεR1α polypeptide is located at an endogenous rodent FcεR1α locus. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0014] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 1a (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна или человека и цитоплазматический домен грызуна или человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR1a, расположена в эндогенном локусе α-цепи FcγR1a грызуна. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе генетически модифицированные грызуны дополнительно содержат функциональную γ-цепь FcR. В определенных вариантах осуществления функциональная γ-цепь FcR представляет собой γ-цепь FcR грызуна (например, γ-цепь FcR, эндогенную для генетически модифицированных грызунов). В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0014] In certain aspects, provided herein are rodents (e.g., rats or mice) containing in their genome a genetically modified Fc gamma receptor 1a (FcγR1a) α chain locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR1a α chain polypeptide , containing a human extracellular domain, a rodent or human transmembrane domain, and a rodent or human cytoplasmic domain. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding an FcγR1a α chain polypeptide is located at an endogenous rodent FcγR1a α chain locus. In some embodiments, the genetically modified rodents provided herein further comprise a functional FcR γ chain. In certain embodiments, the functional FcR γ chain is a rodent FcR γ chain (eg, an FcR γ chain endogenous to genetically modified rodents). In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0015] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR2a человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR2a, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0015] In certain aspects, provided herein are rodents (e.g., rats or mice) containing in their genome a genetically modified Fc gamma receptor 2a (FcγR2a) α chain locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR2a α chain polypeptide person. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding an FcγR2a α-chain polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR α-chain locus. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0016] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR2b человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR2b, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0016] In certain aspects, provided herein are rodents (e.g., rats or mice) containing in their genome a genetically modified Fc gamma receptor 2b (FcγR2b) α chain locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR2b α chain polypeptide person. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding an FcγR2b α-chain polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR α-chain locus. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0017] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR3a человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR3a, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе генетически модифицированные грызуны дополнительно содержат функциональную γ-цепь FcR. В определенных вариантах осуществления функциональная γ-цепь FcR представляет собой γ-цепь FcR грызуна (например, γ-цепь FcR, эндогенную для генетически модифицированных грызунов). В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0017] In certain aspects, provided herein are rodents (e.g., rats or mice) containing in their genome a genetically modified Fc gamma receptor 3a (FcγR3a) α chain locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR3a α chain polypeptide person. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding an FcγR3a α-chain polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR α-chain locus. In some embodiments, the genetically modified rodents provided herein further comprise a functional FcR γ chain. In certain embodiments, the functional FcR γ chain is a rodent FcR γ chain (eg, an FcR γ chain endogenous to genetically modified rodents). In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0018] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR3b человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR3b, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0018] In certain aspects, provided herein are rodents (e.g., rats or mice) containing in their genome a genetically modified Fc gamma receptor 3b (FcγR3b) α chain locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR3b α chain polypeptide person. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding an FcγR3b α-chain polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR α-chain locus. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0019] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR2c человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR2c, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.[0019] In certain aspects, provided herein are rodents (e.g., rats or mice) containing in their genome a genetically modified Fc gamma receptor 2c α chain locus (FcγR2c) comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR2c α chain polypeptide person. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding an FcγR2c α-chain polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR α-chain locus. In certain embodiments, provided herein are animal models and methods for testing human antibodies and Fc fusion proteins using such rodents.

[0020] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме комбинацию генетически модифицированных локусов, предложенных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат один или более генетически модифицированных локусов, выбранных из генетически модифицированного локуса IgH, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса Igκ, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса Igλ, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcRn, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса β2M, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcεR1α, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR1a, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR2a, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR2b, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR2c, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR3a, предложенного в данном документе, и/или генетически модифицированного локуса FcγR3b, предложенного в данном документе. В определенных вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и генетически модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR1a, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2a, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2b, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2c, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR3a, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус FcγR3b, предложенный в данном документе.[0020] In certain aspects, provided herein are rodents (eg, rats or mice) containing in their genome a combination of genetically modified loci provided herein. For example, in some embodiments, rodents provided herein contain one or more genetically modified loci selected from a genetically modified IgH locus provided herein, a genetically modified Igκ locus provided herein, a genetically modified Igλ locus provided herein , genetically modified FcRn locus as provided herein, genetically modified β2M locus as provided herein, genetically modified FcεR1α locus as provided herein, genetically modified FcγR1a locus as provided herein, genetically modified FcγR2a locus as provided herein , a genetically modified FcγR2b locus as provided herein, a genetically modified FcγR2c locus as provided herein, a genetically modified FcγR3a locus as provided herein, and/or a genetically modified FcγR3b locus as provided herein. In certain embodiments, rodents provided herein contain a genetically modified IgH locus as provided herein and/or a genetically modified Igκ locus as provided herein. In some embodiments, rodents provided herein contain a genetically modified IgH locus as provided herein and/or a genetically modified Igλ locus as provided herein. In some embodiments, rodents provided herein contain a genetically modified IgH locus provided herein, a genetically modified Igκ and/or Igλ locus provided herein, a genetically modified FcRn locus provided herein, and a genetically modified β2M locus. proposed in this document. In some embodiments, rodents provided herein comprise a genetically modified IgH locus as provided herein, a genetically modified FcRn locus as provided herein, a genetically modified β2M locus as provided herein, a genetically modified FcεR1α locus as provided herein, a genetically modified FcγR1a locus as provided herein, a genetically modified FcγR2a locus as provided herein, a genetically modified FcγR2b locus as provided herein, a genetically modified FcγR2c locus as provided herein, a genetically modified FcγR3a locus as provided herein, and/or the genetically modified FcγR3b locus provided herein.

[0021] В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены способы тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека (например, человеческое антитело или Fc-слитый белок), включающие введение терапевтического белка грызуну (например, мыши или крысы), предложенному в данном документе. В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка. В некоторых вариантах осуществления один или более фармакокинетических параметров включают, но не ограничиваются этим, площадь под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановление (IVR), скорость выведения (CL), среднее время удержания (СВУ), время полужизни агента и объем распределения в равновесном состоянии (Vss). В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают определение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка (например, способности вводимой дозы терапевтического белка уменьшать или устранять один или более симптомов заболевания в животной модели). В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают определение безопасности вводимого терапевтического белка (например, степени, в которой вводимая доза терапевтического белка вызывает одно или более нежелательных явлений в животной модели). В определенных вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает определение степени, в которой терапевтический белок индуцирует один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна (например, степени, в которой терапевтический белок индуцирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ)). В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает определение степени, в которой введение терапевтического белка индуцирует иммунный ответ против Fc человека у грызуна. В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает оценку безопасности и/или эффективности схемы введения доз терапевтического белка.[0021] In certain embodiments, provided herein are methods of testing a therapeutic protein containing a human Fc domain (e.g., a human antibody or Fc fusion protein), comprising administering the therapeutic protein to a rodent (e.g., mouse or rat) provided herein . In some embodiments, the method further includes measuring one or more pharmacokinetic properties of the administered therapeutic protein. In some embodiments, one or more pharmacokinetic parameters include, but are not limited to, area under the plasma concentration-time curve (AUC), in vivo recovery (IVR), elimination rate (CL), mean retention time (MRT), agent half-life and volume of distribution at steady state (Vss). In some embodiments, the methods further comprise determining the therapeutic efficacy of the administered therapeutic protein (eg, the ability of the administered dose of the therapeutic protein to reduce or eliminate one or more symptoms of a disease in an animal model). In some embodiments, the methods further include determining the safety of the administered therapeutic protein (eg, the extent to which an administered dose of the therapeutic protein causes one or more adverse events in an animal model). In certain embodiments, the method further includes determining the extent to which the therapeutic protein induces one or more Fc receptor-mediated responses in a rodent (eg, the extent to which the therapeutic protein induces antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)). In some embodiments, the method further includes determining the extent to which administration of the therapeutic protein induces an anti-human Fc immune response in a rodent. In some embodiments, the method further includes assessing the safety and/or effectiveness of the dosing regimen of the therapeutic protein.

[0022] В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели для тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека (например, человеческое антитело или Fc-слитый белок). В некоторых вариантах осуществления животная модель включает введение терапевтического белка грызуну (например, мыши или крысы), предложенному в данном документе. В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка. В некоторых вариантах осуществления один или более фармакокинетических параметров включают, но не ограничиваются этим, площадь под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановление (IVR), скорость выведения (CL), среднее время удержания (СВУ), время полужизни агента и объем распределения в равновесном состоянии (Vss). В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает определение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка (например, способности вводимой дозы терапевтического белка уменьшать или устранять один или более симптомов заболевания в животной модели). В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает определение безопасности вводимого терапевтического белка (например, степени, в которой вводимая доза терапевтического белка вызывает одно или более нежелательных явлений в животной модели). В определенных вариантах осуществления животная модель дополнительно включает определение степени, в которой терапевтический белок индуцирует один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна (например, степени, в которой терапевтический белок индуцирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ)). В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает определение степени, в которой введение терапевтического белка индуцирует иммунный ответ против Fc человека у грызуна. В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает оценку безопасности и/или эффективности схемы введения доз терапевтического белка.[0022] In certain embodiments, provided herein are animal models for testing a therapeutic protein containing a human Fc domain (eg, a human antibody or Fc fusion protein). In some embodiments, the animal model includes administering the therapeutic protein to a rodent (eg, mouse or rat) provided herein. In some embodiments, the animal model further includes measuring one or more pharmacokinetic properties of the administered therapeutic protein. In some embodiments, one or more pharmacokinetic parameters include, but are not limited to, area under the plasma concentration-time curve (AUC), in vivo recovery (IVR), elimination rate (CL), mean retention time (MRT), agent half-life and volume of distribution at steady state (Vss). In some embodiments, the animal model further includes determining the therapeutic efficacy of the administered therapeutic protein (eg, the ability of the administered dose of the therapeutic protein to reduce or eliminate one or more symptoms of a disease in the animal model). In some embodiments, the animal model further includes determining the safety of the administered therapeutic protein (eg, the extent to which an administered dose of the therapeutic protein causes one or more adverse events in the animal model). In certain embodiments, the animal model further includes determining the extent to which the therapeutic protein induces one or more Fc receptor-mediated responses in the rodent (eg, the extent to which the therapeutic protein induces antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)). In some embodiments, the animal model further includes determining the extent to which administration of a therapeutic protein induces an anti-human Fc immune response in a rodent. In some embodiments, the animal model further includes assessing the safety and/or effectiveness of the therapeutic protein dosing regimen.

[0023] В некоторых вариантах осуществления вводимый терапевтический агент вызывает сниженный иммунный ответ при введении предложенному в данном документе грызуну. В некоторых вариантах осуществления вводимые человеческое антитело или Fc-слитый белок имеют изотип и/или аллотип, который совпадает с изотипом и/или аллотипом Fc-домена, кодируемого C_H человека в генетически модифицированном локусе IgH предложенного в данном документе грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела и Fc-слитые белки, которые совпадают по изотипу с Fc, кодируемым C_H человека в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна, вызывают сниженный иммунный ответ при введении таким грызунам. Например, в некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG1 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG2 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG3 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG3 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG4 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело, имеющее легкую цепь κ, вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие легкую цепь κ человека, например, экспрессирует антитела, имеющие константный домен κ человека, или экспрессирует антитела, имеющие вариабельный и константный домены κ человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело, имеющее легкую цепь λ, вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие легкую цепь λ человека, например, экспрессирует антитела, имеющие константный домен λ человека, или экспрессирует антитела, имеющие вариабельный и константный домены λ человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igκ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igλ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе.[0023] In some embodiments, the administered therapeutic agent causes a reduced immune response when administered to a rodent as provided herein. In some embodiments, the administered human antibody or Fc fusion protein has an isotype and/or allotype that matches the isotype and/or allotype of the Fc domain encoded by the human _CH at the genetically modified rodent IgH locus provided herein. In some embodiments, human antibodies and Fc fusion proteins that are isotype-matched to the Fc encoded by the human _CH in the rodent immunoglobulin heavy chain locus produce a reduced immune response when administered to such rodents. For example, in some embodiments, a human IgG1 antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having human variable domains and human IgG1 constant domains. In some embodiments, a human IgG2 antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having human variable domains and human IgG2 constant domains. In some embodiments, a human IgG3 antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having human variable domains and human IgG3 constant domains. In some embodiments, a human IgG4 antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having human variable domains and human IgG4 constant domains. In some embodiments, a human κ light chain antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having a human κ light chain, e.g., expresses antibodies having a human κ constant domain, or expresses antibodies having a variable and constant domain κ person. In some embodiments, a human λ light chain antibody is administered to a rodent provided herein that expresses antibodies having a human λ light chain, e.g., expresses antibodies having a human λ constant domain, or expresses antibodies having a variable and constant domain λ person. In some embodiments, the agent is a human IgG1 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a C _H gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ and CH ₃ domains of human IgG1. In some embodiments, the agent is a human IgG4 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a C _H gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ and CH ₃ domains of human IgG4. In some embodiments, the therapeutic agent is a human antibody having an Igκ light chain, and the rodent contains a genetically modified Igκ locus as provided herein. In some embodiments, the therapeutic agent is a human antibody having an Igλ light chain, and the rodent contains a genetically modified Igλ locus as provided herein.

[0024] В определенных аспектах в данном документе предложены клетки грызунов (например, ЭС-клетки, иммунные клетки, эндотелиальные клетки, B-клетки, NK-клетки, макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангерганса, эозинофилы, тучные клетки и базофилы), содержащие один или более генетически модифицированных локусов, предложенных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки грызунов (например, ЭС-клетки грызунов), предложенные в данном документе, содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки грызунов (например, ЭС-клетки грызунов), предложенные в данном документе, содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки грызунов (например, ЭС-клетки грызунов), предложенные в данном документе, содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и генетически модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки грызунов (например, ЭС-клетки грызунов), предложенные в данном документе, содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR1a, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2a, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2b, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2c, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR3a, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус FcγR3b, предложенный в данном документе.[0024] In certain aspects, provided herein are rodent cells (e.g., ES cells, immune cells, endothelial cells, B cells, NK cells, macrophages, dendritic cells, Langerhans cells, eosinophils, mast cells, and basophils) containing one or more genetically modified loci proposed herein. For example, in some embodiments, rodent cells (eg, rodent ES cells) provided herein comprise a genetically modified IgH locus provided herein and/or a genetically modified Igκ locus provided herein. In some embodiments, rodent cells (eg, rodent ES cells) provided herein comprise a genetically modified IgH locus provided herein and/or a genetically modified Igλ locus provided herein. In some embodiments, the rodent cells (e.g., rodent ES cells) provided herein comprise a genetically modified IgH locus provided herein, a genetically modified Igκ and/or Igλ locus provided herein, a genetically modified FcRn locus, proposed herein, and the genetically modified β2M locus proposed herein. In some embodiments, the rodent cells (e.g., rodent ES cells) provided herein comprise a genetically modified IgH locus provided herein, a genetically modified FcRn locus provided herein, a genetically modified β2M locus provided herein , genetically modified FcεR1α locus proposed herein, genetically modified FcγR1a locus proposed herein, genetically modified FcγR2a locus proposed herein, genetically modified FcγR2b locus proposed herein, genetically modified FcγR2c locus proposed herein , the genetically modified FcγR3a locus provided herein, and/or the genetically modified FcγR3b locus provided herein.

[0025] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы создания генетически модифицированных грызунов (например, крыс или мышей) и ЭС-клеток грызунов (например, ЭС-клеток крыс или мышей), предложенных в данном документе. В определенных вариантах осуществления указанный способ включает генетическую модификацию генома грызуна (например, крысы или мыши) или ЭС-клетки грызуна (например, ЭС-клетки крысы или мыши) так, чтобы он содержал один или более генетически модифицированных локусов, предложенных в данном документе.[0025] In some embodiments, methods for creating genetically modified rodents (eg, rats or mice) and rodent ES cells (eg, rat or mouse ES cells) provided herein are provided herein. In certain embodiments, the method comprises genetically modifying the genome of a rodent (eg, rat or mouse) or rodent ES cell (eg, rat or mouse ES cell) so that it contains one or more genetically modified loci provided herein.

Краткое описание графических материалов Brief description of graphic materials

[0026] На Фиг. 1A приведены общие схемы, без соблюдения масштаба, типовых модифицированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с определенными типовыми вариантами осуществления, предложенными в данном документе. Как показано, типовой локус 1 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ мыши, генный сегмент C_δ мыши, генный сегмент C_γ3 мыши, генный сегмент C_γ1 мыши, генный сегмент C_γ2b мыши, гибридный генный сегмент C_H, кодирующий внеклеточный домен IgG1 человека и трансмембранный и цитоплазматический домены IgG2a мыши, генный сегмент C_ε мыши, генный сегмент C_α мыши и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 2 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ мыши, генный сегмент C_δ мыши, генный сегмент C_γ3 мыши, генный сегмент C_γ1 мыши, генный сегмент C_γ2b мыши, генный сегмент C_γ1 человека (последовательности, кодирующие как внеклеточный, так и трансмембранный/цитоплазматический домены IgG1, являются человеческими), генный сегмент C_ε мыши, генный сегмент C_α мыши и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 3 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ мыши, генный сегмент C_δ мыши, генный сегмент C_γ3 мыши, гибридный генный сегмент C_H, кодирующий внеклеточный домен IgG4 человека и трансмембранный и цитоплазматический домены IgG1 мыши, генный сегмент C_γ2b мыши, генный сегмент C_γ2a мыши, генный сегмент C_ε мыши, генный сегмент C_α мыши и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 4 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ мыши, генный сегмент C_δ мыши, генный сегмент C_γ3 мыши, генный сегмент C_γ4 человека (последовательности, кодирующие как внеклеточный, так и трансмембранный/цитоплазматический домен IgG4, являются человеческими), генный сегмент C_γ2b мыши, генный сегмент C_γ2a мыши, генный сегмент C_ε мыши, генный сегмент Cα мыши и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 5 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер человека, генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека, генный сегмент C_γ1 человека и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 6 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер человека, генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека, генный сегмент C_γ1 человека, генный сегмент C_γ2 человек, генный сегмент C_γ4 человека и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 7 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область мыши (содержащую генные сегменты V_H мыши, D_H мыши и J_H мыши, для упрощения генные сегменты V_H мыши не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека, генный сегмент C_γ1 человека и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 8 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область мыши (содержащую генные сегменты V_H мыши, D_H мыши и J_H мыши, для упрощения генные сегменты V_H мыши не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека, генный сегмент C_γ1 человека, генный сегмент C_γ2 человека, генный сегмент C_γ4 человека и 3’ регуляторную область мыши. Хотя это не показано, локусы в этих вариантах осуществления содержат функциональные мышиные гены Adam6 (например, Adam6a и/или Adam6b). Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0026] In FIG. 1A depicts general diagrams, not to scale, of exemplary modified immunoglobulin heavy chain loci in accordance with certain exemplary embodiments provided herein. As shown, the typical mouse heavy chain locus 1 contains, in order 5' to 3', the human variable region (containing the human _VH , human _DH , and human _JH gene segments; for simplicity, the human _VH gene segments are not shown; only a small number gene segments are presented schematically; for the full repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org, in Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) and Lefranc, M. .-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001), incorporated herein by reference), mouse intronic enhancer, mouse _Cμ gene segment, mouse _Cδ gene segment, mouse C _γ3 gene segment, mouse C _γ1 gene segment, mouse C _γ2b gene segment, hybrid _CH gene segment encoding the extracellular domain of human IgG1 and the transmembrane and cytoplasmic domains of mouse IgG2a, mouse C _ε gene segment, mouse C _α gene segment and 3' mouse regulatory region. As shown, the typical mouse heavy chain locus 2 contains, in order 5' to 3', the human variable region (containing the human _VH , human _DH , and human _JH gene segments; for simplicity, the human _VH gene segments are not shown; only a small number gene segments are presented schematically; for the full repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org, in Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) and Lefranc, M. .-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001), incorporated herein by reference), mouse intronic enhancer, mouse _Cμ gene segment, mouse _Cδ gene segment, mouse _{γ3 C} gene segment, mouse _γ1 C gene segment, mouse _γ2b C gene segment, human _γ1 C gene segment (sequences encoding both the extracellular and transmembrane/cytoplasmic domains of IgG1 are human), mouse C _ε gene segment, C gene segment mouse _α and mouse 3' regulatory region. As shown, the typical mouse heavy chain locus 3 contains, in order 5' to 3', the human variable region (containing the human _VH , human _DH , and human _JH gene segments; for simplicity, the human _VH gene segments are not shown; only a small number gene segments are presented schematically; for the full repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org, in Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) and Lefranc, M. .-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001), incorporated herein by reference), mouse intronic enhancer, mouse _Cμ gene segment, mouse _Cδ gene segment, mouse _γ3 C segment, hybrid _CH gene segment encoding the extracellular domain of human IgG4 and the transmembrane and cytoplasmic domains of mouse IgG1, mouse C _γ2b gene segment, mouse C _γ2a gene segment, mouse C _ε gene segment, mouse C _α gene segment and 3' mouse regulatory region. As shown, the typical mouse heavy chain locus 4 contains, in order 5' to 3', the human variable region (containing the human _VH , human _DH , and human _JH gene segments; for simplicity, the human _VH gene segments are not shown; only a small number gene segments are presented schematically; for the full repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org, in Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) and Lefranc, M. .-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001), incorporated herein by reference), mouse intronic enhancer, mouse _Cμ gene segment, mouse _Cδ gene segment, mouse C _γ3 gene segment, human C _γ4 gene segment (sequences encoding both the extracellular and transmembrane/cytoplasmic domain of IgG4 are human), mouse C _γ2b gene segment, C mouse _γ2a gene segment, mouse C _ε gene segment, Cα gene segment mouse and the mouse 3' regulatory region. As shown, the typical mouse heavy chain locus 5 contains, in order 5' to 3', the human variable region (containing the human _VH , human _DH , and human _JH gene segments; for simplicity, the human _VH gene segments are not shown; only a small number gene segments are presented schematically; for the full repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org, in Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) and Lefranc, M. .-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001), incorporated herein by reference), human intronic enhancer, human _Cμ gene segment, human _Cδ gene segment, gene human _γ3 C segment, human _γ1 C gene segment, and mouse 3' regulatory region. As shown, the typical mouse heavy chain locus 6 contains, in order 5' to 3', the human variable region (containing the human _VH , human _DH , and human _JH gene segments; for simplicity, the human _VH gene segments are not shown; only a small number gene segments are presented schematically; for the full repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org, in Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) and Lefranc, M. .-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001), incorporated herein by reference), human intronic enhancer, human _Cμ gene segment, human _Cδ gene segment, gene human _γ3 C gene segment, human _γ1 C gene segment, human _γ2 C gene segment, human _γ4 C gene segment, and mouse 3' regulatory region. As shown, the typical mouse heavy chain locus 7 contains, in order 5' to 3', the mouse variable region (containing mouse _VH , mouse _DH , and mouse _JH gene segments; for simplicity, mouse _VH gene segments are not shown; only a small number gene segments are presented schematically; for the full repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org), mouse intronic enhancer, human _Cμ gene segment, human _Cδ gene segment, human _Cγ3 gene segment, human _Cγ1 gene segment and the mouse 3' regulatory region. As shown, the typical mouse heavy chain locus 8 contains, in order 5' to 3', the mouse variable region (containing mouse _VH , mouse _DH , and mouse _JH gene segments; for simplicity, mouse _VH gene segments are not shown; only a small number gene segments are presented schematically; for the full repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org), mouse intronic enhancer, human _Cμ gene segment, human _Cδ gene segment, human _Cγ3 gene segment, human _Cγ1 gene segment , human C _γ2 gene segment, human C _γ4 gene segment, and mouse 3' regulatory region. Although not shown, the loci in these embodiments contain functional mouse Adam6 genes (eg, Adam6a and/or Adam6b). Unless otherwise noted (eg for lox sites, etc.), open figures and double lines represent human sequences and filled figures and single lines represent mouse sequences.

[0027] На Фиг. 1B приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса 5 тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 1A, описанного в примере 1.1. Для упрощения генные сегменты V_H человека и ген Adam6 мыши не показаны на каждом схематическом изображении. Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0027] In FIG. 1B is a general diagram, not to scale, of an exemplary method for generating the exemplary modified immunoglobulin heavy chain locus 5 depicted in FIG. 1A, described in example 1.1. For simplicity, the human V _H gene segments and the mouse Adam6 gene are not shown in each diagram. Unless otherwise noted (eg for lox sites, etc.), open figures and double lines represent human sequences and filled figures and single lines represent mouse sequences.

[0028] На Фиг. 1C приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса 6 тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 1A, описанного в примере 1.1. Для упрощения генные сегменты V_H человека и ген Adam6 мыши не показаны на каждом схематическом изображении. Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0028] In FIG. 1C is a general diagram, not to scale, of an exemplary method for generating the exemplary modified immunoglobulin heavy chain locus 6 depicted in FIG. 1A, described in example 1.1. For simplicity, the human V _H gene segments and the mouse Adam6 gene are not shown in each diagram. Unless otherwise noted (eg for lox sites, etc.), open figures and double lines represent human sequences and filled figures and single lines represent mouse sequences.

[0029] На Фиг. 1D приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса 7 тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 1A, описанного в примере 1.2. Для упрощения генные сегменты V_H мыши не показаны на каждом схематическом изображении. Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0029] In FIG. 1D is a general diagram, not to scale, of an exemplary method for generating the exemplary modified immunoglobulin heavy chain locus 7 shown in FIG. 1A, described in example 1.2. For simplicity, mouse _VH gene segments are not shown in each diagram. Unless otherwise noted (eg for lox sites, etc.), open figures and double lines represent human sequences and filled figures and single lines represent mouse sequences.

[0030] На Фиг. 1E приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса 8 тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 1A, описанного в примере 1.2. Для упрощения генные сегменты V_H мыши не показаны на каждом схематическом изображении. Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0030] In FIG. 1E is a general diagram, not to scale, of an exemplary method for generating the exemplary modified immunoglobulin heavy chain locus 8 shown in FIG. 1A, described in example 1.2. For simplicity, mouse _VH gene segments are not shown in each diagram. Unless otherwise noted (eg for lox sites, etc.), open figures and double lines represent human sequences and filled figures and single lines represent mouse sequences.

[0031] На Фиг. 2A приведены общие схемы, без соблюдения масштаба, типовых модифицированных локусов легкой цепи иммуноглобулина в соответствии с определенными типовыми вариантами осуществления, предложенными в данном документе. На верхней типовой схеме изображен локус Igκ, содержащий вариабельную область человека, интронный энхансер мыши, генный сегмент константной области C_κ человека и 3’ энхансер мыши. На нижней типовой схеме изображен локус Igλ, содержащий генные сегменты V_λ, тандемные пары J_λ-C_λ человека, J_λ7 человека и генный сегмент C_λ1 мыши, энхансеры 1, 2 и 3 человека и 3’ энхансер мыши. Если не указано иное (например, для сайта loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0031] In FIG. 2A depicts general diagrams, not to scale, of exemplary modified immunoglobulin light chain loci in accordance with certain exemplary embodiments provided herein. The top typical diagram shows the Igκ locus containing the human variable region, the mouse intronic enhancer, the human _Cκ constant region gene segment, and the mouse 3' enhancer. The lower typical diagram shows the Igλ locus containing V _λ gene segments, human J _λ -C _λ tandem pairs, human J _λ7 and mouse C _λ1 gene segment, human enhancers 1, 2 and 3, and the mouse 3' enhancer. Unless otherwise noted (eg for the loxp site, etc.), open figures and double lines represent human sequences and filled figures and single lines represent mouse sequences.

[0032] На Фиг. 2B приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса каппа-цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 2A, описанного в примере 1.3. Если не указано иное (например, для сайтов loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0032] In FIG. 2B is a general diagram, not to scale, of an exemplary method for generating the exemplary modified immunoglobulin kappa chain locus depicted in FIG. 2A, described in example 1.3. Unless otherwise noted (eg for loxp sites, etc.), open figures and double lines represent human sequences and filled figures and single lines represent mouse sequences.

[0033] На Фиг. 3A приведены уровни мышиного IgG, мышиного IgM, человеческого IgM, человеческого IgG1 и человеческого IgG3 в сыворотке мышей hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 (локус 5), мышей VELOCIMMUNE® и нормальной человеческой сыворотке.[0033] In FIG. 3A shows the levels of mouse IgG, mouse IgM, human IgM, human IgG1 and human IgG3 in the serum of hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 mice (locus 5), VELOCIMMUNE® mice and normal human serum.

[0034] На Фиг. 3B приведены графики FACS для hIgM в сравнении с mIgM и hIgD в сравнении с mIgD, чтобы проиллюстрировать использование аллелей и наличие аллельного исключения у мышей hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 (локус 5) и мышей VELOCIMMUNE®.[0034] In FIG. 3B shows FACS plots of hIgM versus mIgM and hIgD versus mIgD to illustrate allele usage and the presence of allelic exclusion in hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 (locus 5) and VELOCIMMUNE® mice.

[0035] На Фиг. 3C приведены уровни мышиного IgG, мышиного IgM, человеческого IgM, человеческого IgG1 и человеческого IgG4 в сыворотке указанных мышей.[0035] In FIG. 3C shows the levels of mouse IgG, mouse IgM, human IgM, human IgG1 and human IgG4 in the serum of the indicated mice.

[0036] На Фиг. 3D приведены концентрации мышиных и человеческих антител на 0 сутки и 34 сутки у указанных мышей после инъекции человеческого антитела IgG4.[0036] In FIG. 3D shows the concentrations of mouse and human antibodies on days 0 and 34 in these mice after injection of the human IgG4 antibody.

[0037] На Фиг. 3E приведены концентрации человеческого антитела IgG4 у указанных мышей в течение первых 34 суток после его инъекции.[0037] In FIG. 3E shows the concentrations of human IgG4 antibody in these mice during the first 34 days after its injection.

[0038] На Фиг. 4 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса FcRn, описанного в примере 3. Если не указано иное (например, для сайтов loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0038] In FIG. 4 is a general diagram, not to scale, of a typical method for generating the generic modified FcRn locus described in Example 3. Unless otherwise indicated (eg, for loxp sites, etc.), open figures and double lines represent human sequences, and filled figures shapes and single lines represent mouse sequences.

[0039] На Фиг. 5 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса FcRn и локусов β2M, описанного в примере 3. Если не указано иное (например, для сайтов loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0039] In FIG. 5 is a general diagram, not to scale, of an exemplary method for generating the generic modified FcRn locus and β2M loci described in Example 3. Unless otherwise noted (eg, for loxp sites, etc.), open figures and double lines represent human sequences , and the filled shapes and single lines represent mouse sequences.

[0040] На Фиг. 6 проиллюстрирован клиренс (выраженный в виде концентрации антитела) человеческого антитела у мышей, содержащих типовые модифицированные локусы FcRn и β2M, по сравнению с мышами дикого типа.[0040] In FIG. 6 illustrates the clearance (expressed as antibody concentration) of a human antibody in mice containing typical modified FcRn and β2M loci compared to wild-type mice.

[0041] На Фиг. 7 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типовых модифицированных локусов FcγR1α (на фигуре показан как FCGR1), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb и тяжелой цепи, описанного в примере 4. Незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0041] In FIG. 7 is a general diagram, not to scale, of a typical method for generating generic modified FcγR1α (shown as FCGR1 in the figure), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb and heavy chain loci described in Example 4. Open figures and double lines represent human sequences , and the filled shapes and single lines represent mouse sequences.

[0042] На Фиг. 8A приведены графики FACS, иллюстрирующие использование мышиного IgD в сравнении с мышиным IgM, человеческого IgD в сравнении с человеческим IgM у мышей, несущих высокоаффинный FcγR человека и низкоаффинный FcγR человека и константные области тяжелой цепи человека.[0042] In FIG. 8A shows FACS plots illustrating the use of mouse IgD versus mouse IgM, human IgD versus human IgM in mice carrying high affinity human FcγR and low affinity human FcγR and human heavy chain constant regions.

[0043] На Фиг. 8B приведены число или процентное содержание T-клеток (mCD3-положительных) и B-клеток (mCD19-положительных) в селезенке мышей, несущих высокоаффинный FcγR человека и низкоаффинный FcγR человека и константные области тяжелой цепи человека, по сравнению с мышами дикого типа.[0043] In FIG. 8B shows the number or percentage of T cells (mCD3-positive) and B cells (mCD19-positive) in the spleen of mice carrying high-affinity human FcγR and low-affinity human FcγR and human heavy chain constant regions, compared with wild-type mice.

[0044] На Фиг. 8C приведена сывороточная концентрация человеческого IgM, человеческого IgG1 и человеческого IgG3 мышей, несущих высокоаффинный FcγR человека и низкоаффинный FcγR человека и константные области тяжелой цепи человека, по сравнению с нормальной человеческой сывороткой.[0044] In FIG. 8C shows the serum concentration of human IgM, human IgG1 and human IgG3 of mice bearing high-affinity human FcγR and low-affinity human FcγR and human heavy chain constant regions, compared with normal human serum.

[0045] На Фиг. 9 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания мышей, содержащих типовой модифицированный локус FcεR1α, описанного в примере 5. Если не указано иное (например, для сайта loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0045] In FIG. 9 is a general diagram, not to scale, of a typical method for generating mice containing the generic modified FcεR1α locus described in Example 5. Unless otherwise noted (eg, for the loxp site, etc.), open figures and double lines represent human sequences , and the filled shapes and single lines represent mouse sequences.

[0046] На Фиг. 10 на левой панели приведен график FACS, демонстрирующий, что гуманизированный FcεR1α экспрессируется на поверхности базофилов у типовых мышей, содержащих гуманизированный локус FcεR1α, раскрытый в данном документе. На левой панели на этой фигуре приведено процентное содержание мышиных или человеческих FcεR1α+ базофилов в селезенке мышей, содержащих гуманизированный локус FcεR1α, раскрытый в данном документе, по сравнению с мышами дикого типа.[0046] In FIG. 10, left panel is a FACS plot demonstrating that humanized FcεR1α is expressed on the surface of basophils in generic mice containing the humanized FcεR1α locus disclosed herein. The left panel of this figure shows the percentage of mouse or human FcεR1α+ basophils in the spleen of mice containing the humanized FcεR1α locus disclosed herein compared with wild-type mice.

[0047] На Фиг. 11 показано, что предложенный в данном документе типовой гуманизированный локус FcεR1α является функциональным. Мышей сенсибилизировали интрадермальными инъекциями в ухо человеческих аллерген-специфических IgE или IgG в качестве отрицательного контроля. Через 1 сутки мышей в/в стимулировали аллергеном, разведенным в красителе Эванса синем. Экстравазацию красителя Эванса синего в ухо определяли по данным дегрануляции тучных клеток. Так как человеческий IgE не связывается с мышиным FcεR1, ответ у мышей, содержащих гуманизированный локус FcεR1α, указывает на выработку функционального FcεR1α.[0047] In FIG. 11 shows that the generic humanized FcεR1α locus proposed herein is functional. Mice were sensitized with intradermal ear injections of human allergen-specific IgE or IgG as a negative control. After 1 day, mice were stimulated intravenously with allergen diluted in Evans blue dye. Extravasation of Evans blue dye into the ear was determined by mast cell degranulation. Since human IgE does not bind to murine FcεR1, the response in mice containing the humanized FcεR1α locus indicates the production of functional FcεR1α.

[0048] На Фиг. 12 показано, что предложенный в данном документе типовой гуманизированный локус FcεR1α является функциональным. Мышей сенсибилизировали в/в инъекцией человеческих аллерген-специфических IgE. Через 1 сутки мышей стимулировали в/в инъекцией аллергена и отслеживали изменения температуры в течение 4-часового периода времени после инъекции. Резкое снижение температуры является результатом общей анафилактической реакции.[0048] In FIG. 12 shows that the generic humanized FcεR1α locus proposed herein is functional. Mice were sensitized by intravenous injection of human allergen-specific IgE. After 1 day, mice were stimulated with an IV injection of allergen and changes in temperature were monitored over a 4-hour period after injection. A sharp drop in temperature is the result of a general anaphylactic reaction.

[0049] На Фиг. 13 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания мышей, содержащих типовые гуманизированные локусы FcRn, β2M, FcεR1α, FcγR1α (на фигуре показан как FCGR1), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb, константной области тяжелой цепи, и локусы вариабельной области тяжелой цепи, описанного в примере 6. Для упрощения в локусах F и F' только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки. Незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.[0049] In FIG. 13 is a general diagram, not to scale, of an exemplary method for generating mice containing exemplary humanized loci FcRn, β2M, FcεR1α, FcγR1α (shown as FCGR1 in the figure), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb, heavy chain constant region, and loci heavy chain variable region described in Example 6. For simplicity, in the F and F' loci, only a small number of gene segments are represented schematically; For a complete repertoire of possible V, D and J gene segments present, see imgt.org, in Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) and Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001), incorporated herein by reference. Open shapes and double lines represent human sequences, and filled shapes and single lines represent mouse sequences.

Подробное описание Detailed description

Общие сведенияGeneral information

[0050] В данном документе предложены способы и композиции, относящиеся к in vivo тестированию терапевтических агентов, содержащих Fc человека, на генетически модифицированных грызунах (например, тестированию фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств и схем введения доз таких терапевтических агентов на генетически модифицированных грызунах). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны экспрессируют антитела, содержащие Fc человека (например, Fc IgG1 человека, Fc IgG2 человека, Fc IgG3 человека, Fc IgG4 человека) или константные области легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления грызуны экспрессируют полные человеческие антитела (т. е. антитела, имеющие человеческие тяжелые цепи и человеческие легкие (γ или κ) цепи). В определенных вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны содержат один или более Fc-рецепторов с человеческим внеклеточным доменом (например, неонатальный Fc-рецептор (FcRn), полипептид β-2-микроглобулина (β2M), Fc-ε-рецептор 1 α (FcεR1α), Fc-γ-рецептор 1 альфа (FcγR1a), Fc-гамма-рецептор 2a (FcγR2a), Fc-гамма-рецептор 2b (FcγR2b), Fc-гамма-рецептор 3a (FcγR3a), Fc-гамма-рецептор 3b (FcγR3b), Fc-гамма-рецептор 2c (FcγR2c)). Трансмембранный и цитоплазматический домен таких рецепторов может быть человеческим или не человеческим (например, грызуна).[0050] Provided herein are methods and compositions related to in vivo testing of human Fc-containing therapeutic agents in genetically modified rodents (e.g., testing the pharmacokinetic and/or pharmacodynamic properties and dosing regimens of such therapeutic agents in genetically modified rodents). In some embodiments, the genetically modified rodents express antibodies comprising human Fc (eg, human IgG1 Fc, human IgG2 Fc, human IgG3 Fc, human IgG4 Fc) or human light chain constant regions. In some embodiments, the rodents express full human antibodies (ie, antibodies having human heavy chains and human light (γ or κ) chains). In certain embodiments, the genetically modified rodents contain one or more Fc receptors with a human extracellular domain (e.g., neonatal Fc receptor (FcRn), β-2-microglobulin polypeptide (β2M), Fc-ε receptor 1 α (FcεR1α), Fc-γ receptor 1 alpha (FcγR1a), Fc-gamma receptor 2a (FcγR2a), Fc-gamma receptor 2b (FcγR2b), Fc-gamma receptor 3a (FcγR3a), Fc-gamma receptor 3b (FcγR3b) , Fc gamma receptor 2c (FcγR2c)). The transmembrane and cytoplasmic domain of such receptors may be human or non-human (eg, rodent).

[0051] Терапевтические агенты, содержащие Fc человека, такие как терапевтические человеческие антитела и человеческие Fc-слитые белки, как правило, тестируют на отличных от человека видах перед тем, как вводить их людям. Хотя такие агенты часто тестируют на отличных от человека приматах или других относительно крупных млекопитающих, такое тестирование является дорогостоящим и составляет значительную финансовую нагрузку для разработчиков лекарств. Кроме того, отличные от человека приматы и другие относительно крупные млекопитающие часто не поддаются генетической модификации, что ограничивает количество моделей заболеваний, доступных в таких организмах.[0051] Therapeutic agents containing human Fc, such as therapeutic human antibodies and human Fc fusion proteins, are typically tested in non-human species before being administered to humans. Although such agents are often tested in non-human primates or other relatively large mammals, such testing is expensive and poses a significant financial burden to drug developers. In addition, nonhuman primates and other relatively large mammals are often not amenable to genetic modification, limiting the number of disease models available in such organisms.

[0052] В противоположность этому, виды грызунов (например, крысы и мыши) являются удобными животными моделями для тестирования терапевтических антител и Fc-слитых белков благодаря своему малому размеру, хорошо изученной физиологии и подверженности генетическим модификациям. К сожалению, агенты, содержащие Fc-область человека, часто демонстрируют очень отличные фармакокинетические и фармакодинамические свойства при введении грызунам известного уровня техники по сравнению с введением людям. Например, когда терапевтические агенты с человеческими Fc-областями вводят традиционным грызунам, человеческие последовательности в Fc-областях часто распознаются как чужеродные иммунной системой грызуна (например, крысы или мыши). Как следствие, у грызуна может развиваться иммунный ответ против вводимых терапевтических агентов (что известно как мышиный ответ против человеческих антител или MAHA (англ. «mouse anti-human response»)), что влияет на фармакокинетические и фармакодинамические свойства вводимых агентов. Кроме того, человеческие Fc-области терапевтических агентов могут по-разному взаимодействовать с Fc-рецепторами грызуна (например, крысы или мыши) у грызунов и с Fc-рецепторами человека у пациентов, что также может влиять на фармакокинетические и фармакодинамические свойства вводимых агентов. Таким образом, традиционные модели на грызунах (например, крысах или мышах) часто обеспечивают плохой прогноз в отношении человеческих терапевтических ответов на терапевтические агенты, содержащие Fc человека. Таким образом, мыши, имеющие области локуса иммуноглобулина человека (например, смотрите локусы на Фиг. 1 и 2), могут помочь в снижении или устранении ответов MAHA.[0052] In contrast, rodent species (eg, rats and mice) are convenient animal models for testing therapeutic antibodies and Fc fusion proteins due to their small size, well-studied physiology, and susceptibility to genetic modification. Unfortunately, agents containing the human Fc region often exhibit very different pharmacokinetic and pharmacodynamic properties when administered to rodents in the prior art compared to administration to humans. For example, when therapeutic agents with human Fc regions are administered to conventional rodents, human sequences in the Fc regions are often recognized as foreign by the immune system of the rodent (eg, rat or mouse). As a consequence, the rodent may develop an immune response against the administered therapeutic agents (known as a mouse anti-human antibody response), which affects the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of the administered agents. In addition, the human Fc regions of therapeutic agents may interact differently with rodent (eg, rat or mouse) Fc receptors in rodents and with human Fc receptors in patients, which may also influence the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of the administered agents. Thus, traditional rodent models (eg, rats or mice) often provide poor prognosis for human therapeutic responses to human Fc-containing therapeutic agents. Thus, mice having regions of the human immunoglobulin locus (eg, see loci in Figures 1 and 2) may help reduce or eliminate MAHA responses.

[0053] Наличие молекулы, которая может специфически связывать лекарственный препарат, очень полезно в исследовательских и диагностических целях. Создание мышей, с мышиными вариабельными областями и человеческими константными областями (например, мышиный локус 8 на Фиг. 1A) обеспечивает усовершенствованный способ для создания антител против лекарственных препаратов, когда лекарственным препаратом является человеческое моноклональное антитело. Любой ответ MAHA, вызываемый введением мышам человеческого антитела, будет направлен на вариабельные области антитела. Это устраняет фоновый ответ против константной области антитела и делает создание специфических к лекарственному препарату антител более эффективным.[0053] Having a molecule that can specifically bind a drug is very useful for research and diagnostic purposes. The generation of mice with murine variable regions and human constant regions (eg, murine locus 8 in FIG. 1A) provides an improved method for generating anti-drug antibodies when the drug is a human monoclonal antibody. Any MAHA response elicited by injecting mice with a human antibody will be directed to the variable regions of the antibody. This eliminates the background response against the constant region of the antibody and makes the generation of drug-specific antibodies more efficient.

[0054] В данном документе предложены in vivo системы для разработки, скрининга и тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков для терапевтического применения. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены генетически модифицированные грызуны со сниженным иммунным ответом антител грызуна против антител человека после введения терапевтического агента, содержащего Fc человека. Как продемонстрировано в данном документе, это можно осуществить путем применения грызунов, которые были генетически модифицированы так, чтобы экспрессировать Fc человека, который соответствует Fc, присутствующему во вводимых антителе и Fc-слитом белке. Таких мышей можно создавать, например, посредством вставки последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, полностью или частично (например, IgG C_H1-H-C_H2-C_H3), вместо последовательности, которая кодирует соответствующие части эндогенного генного сегмента константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. Такие животные распознают Fc человека как «собственный» белок и, следовательно, у них менее вероятно разовьется иммунный ответ против вводимого терапевтического средства, содержащего Fc человека.[0054] Proposed herein are in vivo systems for the development, screening and testing of human antibodies and Fc fusion proteins for therapeutic use. In certain embodiments, provided herein are genetically modified rodents with a reduced rodent anti-human antibody immune response upon administration of a human Fc-containing therapeutic agent. As demonstrated herein, this can be accomplished by using rodents that have been genetically modified to express a human Fc that matches the Fc present in the administered antibody and Fc fusion protein. Such mice can be created, for example, by inserting a nucleic acid sequence that encodes the human immunoglobulin heavy chain constant region, in whole or in part (for example, IgG C _H 1-HC _H 2-C _H 3), instead of a sequence that encodes the corresponding parts of the endogenous non-human immunoglobulin heavy chain constant region gene segment. Such animals recognize human Fc as a “self” protein and are therefore less likely to develop an immune response against an administered human Fc therapeutic.

[0055] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены генетически модифицированные грызуны (например, мыши или крысы), экспрессирующие Fc-рецепторы, способные взаимодействовать с Fc человека аналогично Fc-рецепторам, экспрессируемым пациентом-человеком. Например, в определенных вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны, предложенные в данном документе, экспрессируют один или более Fc-рецепторов, имеющих по меньшей мере внеклеточные домены человека (например, трансмембранный и цитоплазматический домены могут принадлежать человеку или грызуну). Таким образом, в определенных вариантах осуществления предложенные в данном документе мыши экспрессируют человеческий или частично человеческий FcRn, человеческий или частично человеческий β2M, человеческий или частично человеческий FcεR1α, человеческий или частично человеческий FcγR1a, человеческий или частично человеческий FcγR2a, человеческий или частично человеческий FcγR2b, человеческий или частично человеческий FcγR3a, человеческий или частично человеческий FcγR3b и/или человеческий или частично человеческий FcγR2c. Следовательно, такие мыши могут более точно имитировать ответы на Fc человека пациентов-людей по сравнению с грызунами с полностью нечеловеческими Fc-рецепторами.[0055] Additionally, in some embodiments, provided herein are genetically modified rodents (eg, mice or rats) expressing Fc receptors capable of interacting with human Fc in a manner similar to Fc receptors expressed by a human patient. For example, in certain embodiments, the genetically modified rodents provided herein express one or more Fc receptors having at least human extracellular domains (eg, the transmembrane and cytoplasmic domains may be human or rodent). Thus, in certain embodiments, mice provided herein express human or partially human FcRn, human or partially human β2M, human or partially human FcεR1α, human or partially human FcγR1a, human or partially human FcγR2a, human or partially human FcγR2b, human or partially human FcγR3a, human or partially human FcγR3b and/or human or partially human FcγR2c. Therefore, such mice may more closely mimic the human Fc responses of human patients compared to rodents with completely non-human Fc receptors.

[0056] Таким образом, предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) обеспечивают новую in vivo систему для разработки, отбора и тестирования терапевтических человеческих антител и Fc-слитых белков на основании не только специфичности и/или аффинности к антигену, но также релевантной полной биологической функции выбранного антитела посредством оценки эффекторных функций во внутренней среде иммунной системы. Таким образом, можно осуществлять разработку и отбор человеческих терапевтических кандидатов на основании терапевтического потенциала, оцененного на уровне целых молекул с релевантными биологическими ответами (например, клеточными ответами), вместо прогнозов на основании лишь отдельной оценки индивидуальных компонентов. Таким образом, предложенные в данном документе грызуны обеспечивают систему, которая больше подходит для прогнозирования клинической функции человеческого терапевтического антитела in vivo.[0056] Thus, rodents (eg, mice or rats) provided herein provide a novel in vivo system for the development, selection and testing of therapeutic human antibodies and Fc fusion proteins based not only on specificity and/or affinity for the antigen, but also relevant to the overall biological function of the selected antibody by assessing effector functions in the internal environment of the immune system. Thus, it is possible to develop and select human therapeutic candidates based on therapeutic potential assessed at the level of whole molecules with relevant biological responses (eg, cellular responses), rather than predictions based only on individual assessment of individual components. Thus, the rodents proposed herein provide a system that is more suitable for predicting the clinical function of a human therapeutic antibody in vivo.

ОпределенияDefinitions

[0057] В контексте данного документа форма единственного числа используется для обозначения одного или более чем одного (т. е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. Как пример, «элемент» означает один элемент или более одного элемента.[0057] As used herein, the singular form is used to denote one or more than one (ie, at least one) grammatical entity. As an example, "element" means one element or more than one element.

[0058] Подразумевается, что термин «аминокислота» включает все молекулы, природные или синтетические, которые имеют как амино-функциональную группу, так и кислую функциональную группу, и могут быть включены в полимер из аминокислот природного происхождения. Примеры аминокислот включают аминокислоты природного происхождения; их аналоги, производные и родственные соединения; аминокислотные аналоги, имеющие вариантные боковые цепи; и все стереоизомеры любых вышеперечисленных соединений.[0058] The term “amino acid” is intended to include all molecules, natural or synthetic, that have both an amino functionality and an acidic functionality and can be incorporated into a naturally occurring amino acid polymer. Examples of amino acids include naturally occurring amino acids; their analogs, derivatives and related compounds; amino acid analogues having variant side chains; and all stereoisomers of any of the above compounds.

[0059] В контексте данного документа термин «антитело» может относиться как к интактному антителу, так и к его антигенсвязывающему фрагменту. Интактные антитела представляют собой гликопротеины, которые содержат по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен тяжелой цепи. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Вариабельные домены тяжелой цепи и вариабельные домены легкой цепи можно дополнительно поделить на домены гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждый вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном.[0059] As used herein, the term “antibody” can refer to either an intact antibody or an antigen-binding fragment thereof. Intact antibodies are glycoproteins that contain at least two heavy (H) chains and two light (L) chains linked by disulfide bonds. Each heavy chain contains a heavy chain variable domain and a heavy chain constant domain. Each light chain contains a light chain variable domain and a light chain constant domain. The heavy chain variable domains and the light chain variable domains can be further divided into hypervariability domains called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs). Each heavy chain variable domain and light chain variable domain consists of three CDRs and four FRs, arranged from amino terminus to carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The heavy and light chain variable domains contain a binding domain that interacts with the antigen.

[0060] В контексте данного документа термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «антигенсвязывающая часть» относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, дисульфидно-связанный Fv, Fd, одноцепочечные антитела, выделенную CDRH3 и другие фрагменты антитела, которые сохраняют по меньшей мере часть вариабельного домена интактного антитела. Эти фрагменты антитела можно получать, используя традиционные рекомбинантные и/или ферментативные технологии, и проводить их скрининг в отношении связывания антигена так же, как и для интактных антител.[0060] As used herein, the term “antigen-binding fragment” or “antigen-binding moiety” refers to one or more antibody fragments that retain the ability to bind an antigen. Examples of binding fragments encompassed by the term "antigen binding fragment" of an antibody include Fab, Fab', F(ab') ₂ , Fv, scFv, disulfide-linked Fv, Fd, single chain antibodies, isolated CDRH3, and other antibody fragments that retain at least at least part of the variable domain of an intact antibody. These antibody fragments can be produced using conventional recombinant and/or enzymatic technologies and screened for antigen binding in the same manner as intact antibodies.

[0061] В контексте данного документа термин «площадь под кривой зависимости плазменной концентрации от времени» или «ППК» относится к скорости и степени элиминирования терапевтического агента после введения. В некоторых вариантах осуществления ППК определяют в течение определенного временного периода, такого как 12, 18, 24, 36, 48 или 72 часа, или до бесконечности, используя экстраполяцию на основании наклона кривой. Если не указано иное, ППК определяют до бесконечности (ППК_беск.). ППК также можно рассчитывать на дозу. Как и в случае многих других ФК-параметров, определение ППК можно проводить на одном животном или на популяции животных, для которой рассчитывают среднее значение.[0061] As used herein, the term “area under the plasma concentration-time curve” or “AUC” refers to the rate and extent of elimination of a therapeutic agent following administration. In some embodiments, the AUC is determined over a specific time period, such as 12, 18, 24, 36, 48, or 72 hours, or ad infinitum, using extrapolation based on the slope of the curve. Unless otherwise specified, AUC is determined ad infinitum (AUC _infinity ). The AUC can also be calculated per dose. As with many other PK parameters, the determination of AUC can be performed on a single animal or on a population of animals for which an average value is calculated.

[0062] В контексте данного документа термин «скорость выведения (клиренса)» или «CL» относится к определению способности организма элиминировать лекарственный препарат и выражается в объеме плазмы, очищенной от лекарственного препарата, в течение времени.[0062] As used herein, the term “clearance rate” or “CL” refers to the determination of the body's ability to eliminate a drug and is expressed as the volume of plasma cleared of the drug over time.

[0063] Выражение «полученный из», используемое в отношении перестроенного гена вариабельной области, «полученного из» неперестроенной вариабельной области и/или неперестроенных генных сегментов вариабельной области, относится к возможности отследить последовательность перестроенного гена вариабельной области до группы неперестроенных генных сегментов вариабельной области, которые были перестроены для образования гена, который экспрессирует вариабельный домен (с учетом, в случае целесообразности, разницы в сплайсинге и соматических мутаций). Например, перестроенный ген вариабельной области, подвергшийся соматической мутации, все еще считается полученным из неперестроенных генных сегментов вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления, в которых эндогенный локус замещен универсальным локусом легкой цепи или тяжелой цепи, термин «полученный из» указывает на возможность отследить источник последовательности до указанного перестроенного локуса даже в случае, когда последовательность подверглась соматическим мутациям.[0063] The expression "derived from" when used with respect to a rearranged variable region gene "derived from" a non-rearranged variable region and/or non-rearranged variable region gene segments refers to the ability to trace the rearranged variable region gene sequence to a group of non-rearranged variable region gene segments, which have been rearranged to produce a gene that expresses a variable domain (taking into account, where appropriate, differences in splicing and somatic mutations). For example, a rearranged variable region gene that has undergone a somatic mutation is still considered to be derived from non-rearranged variable region gene segments. In some embodiments, in which the endogenous locus is replaced by a universal light chain or heavy chain locus, the term “derived from” indicates the ability to trace the source of the sequence to the rearranged locus even when the sequence has been somatically mutated.

[0064] В контексте данного документа выражение «эндогенный ген» или «эндогенный генный сегмент» относится к гену или генному сегменту, находившемуся в родительском или референсном организме до внесения разрыва, делеции, замены, изменения или модификации, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления референсный организм представляет собой организм дикого типа. В некоторых вариантах осуществления референсный организм представляет собой сконструированный организм. В некоторых вариантах осуществления референсный организм представляет собой выращенный в лаборатории организм (дикого типа или сконструированный).[0064] As used herein, the expression “endogenous gene” or “endogenous gene segment” refers to a gene or gene segment present in the parent or reference organism prior to the introduction of a break, deletion, substitution, alteration, or modification as described herein. In some embodiments, the reference organism is a wild-type organism. In some embodiments, the reference organism is an engineered organism. In some embodiments, the reference organism is a laboratory-grown organism (wild type or engineered).

[0065] Термин «in vivo восстановление» или «IVR» относится к постепенному восстановлению (K-значению), которое представляет собой разность наблюдаемой пиковой активности и уровня до введения дозы, деленную на дозу. IVR также можно рассчитывать в процентном виде. Среднее значение IVR можно определять для популяции животных или же индивидуальное значение IVR можно определять для одного животного.[0065] The term "in vivo recovery" or "IVR" refers to the incremental recovery (K-value), which is the difference between the observed peak activity and the predose level divided by the dose. IVR can also be calculated as a percentage. The average IVR can be determined for a population of animals, or the individual IVR can be determined for a single animal.

[0066] В контексте данного документа термин «локус» относится к участку в хромосоме, который содержит набор родственных генетических элементов (например, генов, генных сегментов, регуляторных элементов). Например, неперестроенный локус иммуноглобулина может содержать генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина, один или более генов константной области иммуноглобулина и связанные с ними регуляторные элементы (например, промоторы, энхансеры, элементы переключения и т.д.), которые управляют рекомбинацией V(D)J и экспрессией иммуноглобулина. Локус может быть эндогенным или неэндогенным. Термин «эндогенный локус» относится к участку в хромосоме, в котором конкретный генетический элемент встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус имеет последовательность, встречающуюся в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой локус дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой сконструированный локус. Например, эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина мыши относится к участку в мышиной хромосоме 12, который содержит генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи и гены константной области иммуноглобулина у мыши дикого типа, эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина мыши относится к участку в мышиной хромосоме 16, который содержит генные сегменты вариабельной области легкой цепи λ и гены константной области иммуноглобулина у мыши дикого типа, тогда как эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина мыши относится к участку в мышиной хромосоме 6, который содержит генные сегменты вариабельной области легкой цепи κ и гены константной области иммуноглобулина у мыши дикого типа.[0066] As used herein, the term “locus” refers to a region on a chromosome that contains a set of related genetic elements (eg, genes, gene segments, regulatory elements). For example, an unrearranged immunoglobulin locus may contain immunoglobulin variable region gene segments, one or more immunoglobulin constant region genes, and associated regulatory elements (e.g., promoters, enhancers, switch elements, etc.) that direct V(D)J recombination and immunoglobulin expression. A locus may be endogenous or non-endogenous. The term "endogenous locus" refers to the region on a chromosome where a particular genetic element occurs naturally. In some embodiments, the endogenous locus has a naturally occurring sequence. In some embodiments, the endogenous locus is a wild-type locus. In some embodiments, the endogenous locus is an engineered locus. For example, the endogenous mouse immunoglobulin heavy chain locus refers to the region on mouse chromosome 12 that contains the heavy chain variable region and constant region genes for immunoglobulin in a wild-type mouse, the endogenous mouse immunoglobulin λ light chain locus refers to the region on mouse chromosome 16 that contains the λ light chain variable region gene segments and immunoglobulin constant region genes in the wild-type mouse, whereas the endogenous mouse immunoglobulin κ light chain locus refers to the region on mouse chromosome 6 that contains the κ light chain variable region gene segments and the immunoglobulin constant region genes in wild type mice.

[0067] Можно сказать, что неперестроенные генные сегменты вариабельной области «функционально связаны» с непрерывным геном константной области, если неперестроенные генные сегменты вариабельной области способны к перестройке с образованием перестроенного гена вариабельной области, который экспрессируется в сочетании с геном константной области в виде полипептидной цепи или антигенсвязывающего белка.[0067] Non-rearranged variable region gene segments can be said to be “operably linked” to a contiguous constant region gene if the non-rearranged variable region gene segments are capable of rearrangement to form a rearranged variable region gene that is expressed in combination with the constant region gene as a polypeptide chain or antigen binding protein.

[0068] Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используют взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, как дезоксирибонуклеотидов, так и рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию. Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают: кодирующие или некодирующие области гена или генного фрагмента, локусы (локус), определенные по анализу связей, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомальную РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенную ДНК любой последовательности, выделенную РНК любой последовательности, зонды на основе нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги. В случае наличия модификации в нуклеотидной структуре могут быть осуществлены до или после сборки полимера. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать, например, путем конъюгации с метящим компонентом. Во всех нуклеотидных последовательностях, приведенных в данном документе, нуклеотиды U взаимно заменяются нуклеотидами T.[0068] The terms "polynucleotide" and "nucleic acid" are used interchangeably. They refer to the polymeric form of nucleotides of any length, both deoxyribonucleotides and ribonucleotides, or their analogues. Polynucleotides can have any three-dimensional structure and can perform any function. Non-limiting examples of polynucleotides include: coding or non-coding regions of a gene or gene fragment, loci (locus) determined by linkage analysis, exons, introns, messenger RNA (mRNA), transfer RNA, ribosomal RNA, ribozymes, cDNAs, recombinant polynucleotides, branched-chain polynucleotides, plasmids, vectors, isolated DNA of any sequence, isolated RNA of any sequence, nucleic acid probes and primers. The polynucleotide may contain modified nucleotides, such as methylated nucleotides and nucleotide analogues. If present, modifications to the nucleotide structure can be made before or after polymer assembly. The polynucleotide can be further modified, for example, by conjugation with a labeling moiety. In all nucleotide sequences given herein, U nucleotides are interchanged with T nucleotides.

[0069] Термин «неперестроенный» включает состояние локуса вариабельной области или генных сегментов вариабельной области иммуноглобулина, в которых генные сегменты V и генные сегменты J (в случае тяжелых вариабельных областей также и генные сегменты D) присутствуют по отдельности, но способны к соединению с образованием перестроенного гена V(D)J («гена вариабельной области»), который содержит один V,(D),J из репертуара V(D)J.[0069] The term “unrearranged” includes the state of the variable region locus or immunoglobulin variable region gene segments in which the V gene segments and the J gene segments (in the case of severe variable regions, also the D gene segments) are present separately but are capable of combining to form a rearranged V(D)J gene (“variable region gene”) that contains one V,(D),J from the V(D)J repertoire.

[0070] В контексте данного документа термин «объем распределения в равновесном состоянии» или «Vss» относится к кажущемуся пространству (объему), в котором распределен лекарственный препарат. Конкретнее, Vss представляет количество лекарственного препарата в организме животного, деленное на плазменную концентрацию в равновесном состоянии.[0070] As used herein, the term “volume of distribution at steady state” or “Vss” refers to the apparent space (volume) in which the drug is distributed. More specifically, Vss represents the amount of drug in the animal's body divided by the plasma concentration at steady state.

[0071] В контексте данного документа термин «генный сегмент C_H» (например, генный сегмент Cγ1, генный сегмент C_γ2a, генный сегмент C_γ2c, генный сегмент C_μ, генный сегмент C_γ2b, генный сегмент C_γ3, генный сегмент C_δ, генный сегмент Cε, генный сегмент C_α и т. д.) относится к сегменту последовательности ДНК, который кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, и может взаимозаменяемо использоваться с термином ген C_H (например, ген Cγ, ген C_γ2a, ген C_γ2c, ген C_γ3, ген C_γ2b, ген Cμ, ген C_δ, ген Cε, ген C_α и т. д.). Например, генный сегмент Cγ1 или генный сегмент Cγ1 относится к сегменту последовательности ДНК, который кодирует константную область IgG1. Термин «локус генного сегмента C_H» относится к участку в хромосоме, в котором в природном состоянии находится генный сегмент C_H или ген C_H.[0071] As used herein, the term " _CH gene segment" (e.g., Cγ1 gene segment, _Cγ2a gene segment, _Cγ2c gene segment, _Cμ gene segment, _Cγ2b gene segment, _Cγ3 gene segment, _Cδ gene segment , Cε gene segment, C _α gene segment, etc.) refers to the segment of DNA sequence that encodes the immunoglobulin heavy chain constant region, and can be used interchangeably with the term C _H gene (e.g., Cγ gene, C _γ2a gene, C gene _γ2c , C gene _γ3 , C gene _γ2b , Cμ gene, C _δ gene, Cε gene, C _α gene, etc.). For example, a Cγ1 gene segment or Cγ1 gene segment refers to a segment of DNA sequence that encodes an IgG1 constant region. The term " _CH gene segment locus" refers to the region on the chromosome in which the _CH gene segment or _CH gene is naturally located.

Генетически модифицированные локусыGenetically modified loci

[0072] В определенных аспектах в данном документе предложены генетически модифицированные грызуны (например, мыши или крысы), применимые для in vivo тестирования терапевтических агентов, содержащих Fc человека, на генетически модифицированных грызунах (например, тестирования фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств такого терапевтического агента на генетически модифицированных грызунах). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны содержат генетически модифицированные локусы, которые кодируют тяжелые цепи антител, содержащих Fc человека (например, Fc IgG1 человека, Fc IgG4 человека). В некоторых вариантах осуществления грызуны содержат генетически модифицированные локусы, которые кодируют, полностью или частично, легкие цепи человека (например, которые кодируют легкие цепи γ или легкие цепи κ). В определенных вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны содержат один или более локусов, которые кодируют Fc-рецепторы с человеческим внеклеточным доменом (например, α-цепь неонатального Fc-рецептора (FcRn), полипептид β-2-микроглобулина (β2M), α-цепь Fc-ε-рецептора 1 α (FcεR1α), α-цепь Fc-γ-рецептора 1 альфа (FcγR1a), α-цепь Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), α-цепь Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), α-цепь Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), α-цепь Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), α-цепь Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c)). В определенных вариантах осуществления трансмембранный и цитоплазматический домен, кодируемый такими локусами, может быть человеческим или не человеческим (например, грызуна).[0072] In certain aspects, this document provides genetically modified rodents (e.g., mice or rats) useful for in vivo testing of therapeutic agents containing human Fc in genetically modified rodents (e.g., testing the pharmacokinetic and/or pharmacodynamic properties of such therapeutic agent on genetically modified rodents). In some embodiments, the genetically modified rodents contain genetically modified loci that encode human Fc-containing antibody heavy chains (eg, human IgG1 Fc, human IgG4 Fc). In some embodiments, rodents contain genetically modified loci that encode, in whole or in part, human light chains (eg, that encode γ light chains or κ light chains). In certain embodiments, the genetically modified rodents contain one or more loci that encode Fc receptors with a human extracellular domain (e.g., neonatal Fc receptor α chain (FcRn), β-2-microglobulin polypeptide (β2M), Fc α chain -ε receptor 1 α (FcεR1α), Fc γ receptor 1 alpha chain (FcγR1a), Fc gamma receptor α chain 2a (FcγR2a), Fc gamma receptor α chain 2b (FcγR2b), Fc gamma receptor α chain 3a (FcγR3a), Fc gamma receptor α chain 3b (FcγR3b), Fc gamma receptor α chain 2c (FcγR2c)). In certain embodiments, the transmembrane and cytoplasmic domain encoded by such loci may be human or non-human (eg, rodent).

Гуманизированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулинаHumanized immunoglobulin heavy chain loci

[0073] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, мыши или крысы), содержащие генетически модифицированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig). Такие локусы в общем случае содержат вариабельную область и константную область. Вариабельная область содержит генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи Ig (например, по меньшей мере генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H). Локус константной области содержит один или более генных сегментов константной области тяжелой цепи Ig (C_H). В определенных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина таким образом, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.[0073] In certain aspects, provided herein are rodents (eg, mice or rats) containing genetically modified immunoglobulin heavy chain (Ig) loci. Such loci generally contain a variable region and a constant region. The variable region comprises Ig heavy chain variable region gene segments (eg, at least a _VH gene segment, a _DH gene segment, and a _JH gene segment). The constant region locus contains one or more Ig heavy chain constant region ( _CH ) gene segments. In certain embodiments, the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region such that the rodent produces antibodies comprising variable domains derived from a V _H gene segment, a _DH gene segment, and a J _H gene segment, and heavy chain constant domains. chains derived from the _CH gene segment.

[0074] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область представляет собой неперестроенную вариабельную область и содержит неперестроенные генные сегменты вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область представляет собой перестроенную вариабельную область и, следовательно, содержит перестроенный ген вариабельной области. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Ig представляют собой генные сегменты вариабельной области человека. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Ig представляют собой генные сегменты вариабельной области грызуна (например, крысы или мыши) (например, генные сегменты вариабельной области крысы или мыши). В определенных вариантах осуществления локус вариабельной области тяжелой цепи Ig содержит генные сегменты вариабельной области Ig человека. Типовые локусы вариабельной области, содержащие генные сегменты вариабельной области человека, описаны в данной области техники. Например, такие локусы описаны в патентах США №№5770429, 5814318, 6114598, 6998514, 8232449, 8502018 и 8697940, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки, и в публикациях патентов США №№2008/0098490, 2012/0167237, 2013/0145484, 2013/0326647, 2014/013275 и 2014/093908, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.[0074] In some embodiments, the variable region is a non-rearranged variable region and comprises non-rearranged variable region gene segments. In some embodiments, the variable region is a rearranged variable region and therefore comprises a rearranged variable region gene. In certain embodiments, the Ig variable region gene segments are human variable region gene segments. In certain embodiments, the Ig variable region gene segments are rodent (eg, rat or mouse) variable region gene segments (eg, rat or mouse variable region gene segments). In certain embodiments, the Ig heavy chain variable region locus comprises human Ig variable region gene segments. Exemplary variable region loci containing human variable region gene segments are described in the art. For example, such loci are described in US Patent Nos. 5770429, 5814318, 6114598, 6998514, 8232449, 8502018 and 8697940, each of which is incorporated herein by reference, and US Patent Publications Nos. 2008/0098490, 2012/0167237 , 2013 /0145484, 2013/0326647, 2014/013275 and 2014/093908, each of which is incorporated herein by reference.

[0100] В определенных вариантах осуществления локус вариабельной области тяжелой цепи Ig содержит неперестроенные генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области Ig человека содержат один или более сегментов V_H человека, один или более сегментов D_H человека и один или более сегментов J_H человека. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области Ig человека содержат по меньшей мере 3 генных сегмента V_H, по меньшей мере 18 генных сегментов V_H, по меньшей мере 20 генных сегментов V_H, по меньшей мере 30 генных сегментов V_H, по меньшей мере 40 генных сегментов V_H, по меньшей мере 50 генных сегментов V_H, по меньшей мере 60 генных сегментов V_H, по меньшей мере 70 генных сегментов V_H или по меньшей мере 80 генных сегментов V_H. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит все или практически все функциональные генные сегменты V_H человека, находящиеся между генными сегментами V_H3-74 человека и V_H6-1 человека включительно, локуса IgH человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит по меньшей мере генные сегменты V_H человека V_H3-74, V_H3-73, V_H3-72, V_H2-70, V_H1-69, V_H3-66, V_H3-64, V_H4-61, V_H4-59, V_H1-58, V_H3-53, V_H5-51, V_H3-49, V_H3-48, V_H1-46, V_H1-45, V_H3-43, V_H4-39, V_H4-34, V_H3-33, V_H4-31, V_H3-30, V_H4-28, V_H2-26, V_H1-24, V_H3-23, V_H3-21, V_H3-20, V_H1-18, V_H3-15, V_H3-13, V_H3-11, V_H3-9, V_H1-8, V_H3-7, V_H2-5, V_H7-4-1, V_H4-4, V_H1-3, V_H1-2 и V_H6-1. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе отличные от человека животные имеют ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся одним полиморфным генным сегментом V_H человека, некоторым количеством генных сегментов D_H и некоторым количеством генных сегментов J_H (например, как описано в публикации патента США №2013/0096287, которая включена в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления генный сегмент V_H представляет собой V_H1-2 или V_H1-69. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе отличные от человека животные имеют перестроенную вариабельную область тяжелой цепи (последовательность, кодирующую универсальную вариабельную область тяжелой цепи или общую тяжелую цепь, например, как описано в публикации патента США №20140245468 и патентах США №№9204624 и 9930871, которые все в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе отличные от человека животные содержат неперестроенные генные сегменты легкой цепи иммуноглобулина человека, например, κ, функционально связанные с геном константной области тяжелой цепи в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (например, патент США №9516868, в полном объеме включенный в данный документ посредством ссылки).[0100] In certain embodiments, the Ig heavy chain variable region locus comprises unrearranged human Ig heavy chain variable region gene segments. In some embodiments, the unrearranged human Ig variable region gene segments comprise one or more human _VH segments, one or more human _DH segments, and one or more human _JH segments. In some embodiments, the unrearranged human Ig variable region gene segments comprise at least 3 _VH gene segments, at least 18 _VH gene segments, at least 20 VH gene segments _, at least 30 _VH gene segments, at least at least 40 _VH gene segments, at least 50 VH gene segments, at least 60 _VH gene segments, at least 70 _VH gene segments, _or at least 80 _VH gene segments. In some certain embodiments, the engineered IgH locus (or engineered allele) contains all or substantially all of the functional human V _H gene segments located between the human V _H 3-74 and human V _H 6-1 gene segments, inclusive, of the human IgH locus that occurs in nature. In some certain embodiments, the engineered IgH locus (or engineered allele) comprises at least the human _VH gene segments _VH 3-74, _VH 3-73, _VH 3-72, _VH 2-70, _VH 1- 69, V _H 3-66, V _H 3-64, V _H 4-61, V _H 4-59, V _H 1-58, V H 3-53, _{V H} 5-51, V _H 3-49, V _H 3-48, V _H 1-46, V _H 1-45, V _H 3-43, V _H 4-39, V H 4-34, V _H 3-33, _{V H 4-31} , V _H 3-30, V _H 4-28, V _H 2-26, V _H 1-24, V _H 3-23, V _H 3-21, V _H 3-20, V _H 1-18, V _H 3- 15, V _H 3-13, V _H 3-11, V _H 3-9, V _H 1-8, V _H 3-7, V _H 2-5, V _H 7-4-1, V _H 4- 4, _VH 1-3, _VH 1-2 and _VH 6-1. In some embodiments, non-human animals provided herein have a limited immunoglobulin heavy chain locus characterized by one polymorphic human V _H gene segment, a number of D _H gene segments, and a number of J _H gene segments (e.g., as described in U.S. Patent Publication No. 2013/0096287, which is incorporated herein by reference). In some embodiments, the V _H gene segment is V _H 1-2 or V _H 1-69. In some embodiments, non-human animals provided herein have a rearranged heavy chain variable region (a sequence encoding a universal heavy chain variable region or common heavy chain, for example, as described in US Patent Publication No. 20140245468 and US Patent Nos. 9,204,624 and 9,930,871 , all of which are incorporated herein by reference in their entirety). In some embodiments, non-human animals provided herein comprise unrearranged human immunoglobulin light chain gene segments, e.g., κ, operably linked to a heavy chain constant region gene at the immunoglobulin heavy chain locus (e.g., U.S. Pat. No. 9,516,868, incorporated in its entirety into this document by reference).

[0101] В других вариантах осуществления отличный от человека организм может содержать в зародышевой линии и/или геноме локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит вставки и/или замены кодонов гистидина, предназначенные для придания pH-зависимых свойств связывания антителам, вырабатываемым в таком отличном от человека организме. В некоторых таких вариантах осуществления вставка и/или замена кодонов гистидина проведена в последовательностях нуклеиновых кислот, кодирующих CDR3. Различные такие локусы тяжелой цепи иммуноглобулина приведены в патентах США №№9301510, 9334334, публикациях заявок на патенты США №№2013/0247236, 20140013456, включенных в данный документ посредством ссылки.[0101] In other embodiments, a non-human organism may contain in the germline and/or genome an immunoglobulin heavy chain locus that contains insertions and/or histidine codon substitutions designed to impart pH-dependent binding properties to antibodies produced in such non-human host. human body. In some such embodiments, the insertion and/or replacement of histidine codons is carried out in the nucleic acid sequences encoding CDR3. Various such immunoglobulin heavy chain loci are described in US Patent Nos. 9301510, 9334334, US Patent Application Publications Nos. 2013/0247236, 20140013456, incorporated herein by reference.

[0102] В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит 5, 10, 15, 20, 25 или более (например, 26, 27 и т. д.) генных сегментов D_H человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит все или практически все функциональные генные сегменты D_H человека, находящиеся между генными сегментами D_H1-1 человека и D_H7-27 человека включительно, локуса IgH человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит по меньшей мере генные сегменты D_H человека D_H1-1, D_H2-2, D_H3-3, D_H4-4, D_H5-5, D_H6-6, D_H1-7, D_H2-8, D_H3-9, D_H3-10, D_H5-12, D_H6-13, D_H2-15, D_H3-16, D_H4-17, D_H6-19, D_H1-20, D_H2-21, D_H3-22, D_H6-25, D_H1-26 и D_H7-27. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты Ig человека содержат все генные сегменты D_H человека.[0102] In some embodiments, the engineered IgH locus (or engineered allele) contains 5, 10, 15, 20, 25, or more (e.g., 26, 27, etc.) human D _H gene segments. In some certain embodiments, the engineered IgH locus (or engineered allele) contains all or substantially all of the functional human D _H gene segments located between the human D _H 1-1 and human D _H 7-27 gene segments, inclusive, of the human IgH locus that occurs in nature. In some certain embodiments, the engineered IgH locus (or engineered allele) comprises at least the human D _H gene segments D _H 1-1, D _H 2-2, D _H 3-3, D _H 4-4, D _H 5- 5, D _H 6-6, D _H 1-7, D _H 2-8, D _H 3-9, D _H 3-10, D _H 5-12, D _H 6-13, D _H 2-15, D _H 3-16, D _H 4-17, D _H 6-19, D _H 1-20, D _H 2-21, D _H 3-22, D _H 6-25, D _H 1-26 and D _H 7-27. In some embodiments, the unrearranged human Ig gene segments comprise all human D _H gene segments.

[0103] В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более функциональных генных сегментов J_H человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит все или практически все функциональные генные сегменты J_H человека, находящиеся между генными сегментами J_H1 человека и J_H6 человека включительно, локуса IgH человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит по меньшей мере генные сегменты J_H человека J_H1, J_H2, J_H3, J_H4, J_H5 и J_H6. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты Ig человека содержат все генные сегменты J_H человека.[0103] In some embodiments, the engineered IgH locus (or engineered allele) contains 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more functional human _JH gene segments. In some certain embodiments, the engineered IgH locus (or engineered allele) contains all or substantially all of the functional human _JH gene segments between the human _JH1 and human _JH6 gene segments, inclusive, of the human IgH locus that occurs in nature. In certain embodiments, the engineered IgH locus (or engineered allele) comprises at least human J _H gene segments J _H 1, J _H 2, J _H 3, J _H 4, J _H 5, and J _H 6. In some embodiments, unrearranged human Ig gene segments contain all human _JH gene segments.

[0104] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе сконструированный локус IgH не содержит эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе сконструированный локус IgH не содержит эндогенный ген Adam6 (или последовательность, кодирующую Adam6) в той же геномной позиции зародышевой линии, что и в геноме зародышевой линии отличного от человека животного дикого типа того же вида. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе сконструированный локус IgH не содержит псевдоген Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе сконструированный локус IgH содержит вставку по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности, которая кодирует один или более не принадлежащих человеку (например, принадлежащих грызуну) полипептидов Adam6. Указанная вставка может находиться за пределами сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, описанного в данном документе (например, выше самого крайнего 5' генного сегмента V_H), в сконструированном локусе IgH или в любом другом месте в геноме зародышевой линии отличного от человека животного (например, случайно внесенной кодирующей не принадлежащий человеку Adam6 последовательности), клетки или ткани.[0104] In some embodiments, the engineered IgH locus described herein does not contain the endogenous Adam6 gene. In some embodiments, the engineered IgH locus described herein does not contain an endogenous Adam6 gene (or an Adam6 coding sequence) at the same germline genomic position as in the germline genome of a wild-type non-human animal of the same species. In some embodiments, the engineered IgH locus described herein does not contain the human Adam6 pseudogene. In some embodiments, an engineered IgH locus described herein comprises an insertion of at least one nucleotide sequence that encodes one or more non-human (eg, rodent) Adam6 polypeptides. The insertion may be located outside the engineered immunoglobulin heavy chain locus described herein (e.g., upstream of the 5'most _VH gene segment), in the engineered IgH locus, or at any other location in the germline genome of a non-human animal (e.g. accidentally introduced non-human Adam6 coding sequence), cell or tissue.

[0105] В некоторых вариантах осуществления в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна. В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии грызуна, содержащий сконструированный локус тяжелой цепи, содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления происходит экспрессия одного или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов (например, в клетке мужской репродуктивной системы, например в клетке яичек).[0105] In some embodiments, the engineered endogenous immunoglobulin heavy chain locus lacks a functional endogenous rodent Adam6 gene. In some embodiments, the rodent germline genome containing the engineered heavy chain locus comprises one or more nucleotide sequences encoding one or more rodent ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologs, or functional fragments thereof. In some embodiments, one or more rodent ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologs, or functional fragments thereof are expressed (eg, in a male reproductive system cell, such as a testicular cell).

[0106] В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, включены в ту же хромосому, что и сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, включены в сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, находятся между первым генным сегментом V_H человека и вторым генным сегментом V_H человека. В некоторых вариантах осуществления первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1-2, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6-1. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, находятся на месте псевдогена Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, замещают псевдоген Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, находятся между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.[0106] In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more rodent ADAM6 polypeptides, functional orthologues, functional homologues, or functional fragments thereof are included on the same chromosome as the engineered endogenous immunoglobulin heavy chain locus. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more rodent ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologues, or functional fragments thereof are included in an engineered endogenous immunoglobulin heavy chain locus. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more rodent ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologs, or functional fragments thereof are located between a first human _VH gene segment and a second human _VH gene segment. In some embodiments, the first human V _H gene segment is V _H 1-2 and the second human V _H gene segment is V _H 6-1. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more rodent ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologs, or functional fragments thereof are located at the site of the human Adam6 pseudogene. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more rodent ADAM6 polypeptides, functional orthologues, functional homologs, or functional fragments thereof replace the human Adam6 pseudogene. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more rodent ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologues, or functional fragments thereof are located between a human V _H gene segment and a human D _H gene segment.

[0107] Примеры вариабельных областей Ig, содержащих генные сегменты тяжелой цепи Ig, приведены, например, в Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 и справочной информации, которая включена в данный документ посредством ссылки. Такие мыши описаны, например, в патентах США №№8642835 и 8697940, включенных в данный документ посредством ссылки.[0107] Examples of Ig variable regions containing Ig heavy chain gene segments are provided, for example, in Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 and supporting information, which is incorporated herein by reference. Such mice are described, for example, in US patent Nos. 8642835 and 8697940, incorporated herein by reference.

[0108] В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области тяжелой цепи Ig, содержащий неперестроенные генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи Ig человека, также содержит межгенные последовательности вариабельной области тяжелой цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области тяжелой цепи Ig содержит не принадлежащие человеку (например, принадлежащие грызуну, крысе, мыши) межгенные последовательности вариабельной области тяжелой цепи Ig. В некоторых вариантах осуществления локус IgH содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления локус IgH содержит энхансер IgM (Eμ). В некоторых вариантах осуществления энхансер IgM представляет собой не принадлежащий человеку Eμ (например, Eμ грызуна, такой как мышиный или крысиный Eμ).[0108] In some embodiments, the Ig heavy chain variable region gene locus comprising unrearranged human Ig heavy chain variable region gene segments also contains intergenic human Ig heavy chain variable region sequences. In some embodiments, the Ig heavy chain variable region gene locus comprises non-human (eg, rodent, rat, mouse) intergenic Ig heavy chain variable region sequences. In some embodiments, the IgH locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers). In some embodiments, the IgH locus comprises an IgM enhancer (Eμ). In some embodiments, the IgM enhancer is a non-human Eμ (eg, rodent Eμ, such as murine or rat Eμ).

[0109] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи Ig представляет собой перестроенную вариабельную область, содержащую ген вариабельной области тяжелой цепи Ig (универсальной вариабельной области тяжелой цепи). В некоторых вариантах осуществления ген перестроенной вариабельной области тяжелой цепи Ig представляет собой ген перестроенной вариабельной области тяжелой цепи Ig человека. Примеры перестроенных вариабельных областей тяжелой цепи Ig приведены в публикации патента США №2014/0245468, которая включена в данный документ посредством ссылки.[0109] In some embodiments, the Ig heavy chain variable region is a rearranged variable region comprising an Ig heavy chain variable region (universal heavy chain variable region) gene. In some embodiments, the rearranged Ig heavy chain variable region gene is a rearranged human Ig heavy chain variable region gene. Examples of rearranged Ig heavy chain variable regions are provided in US Patent Publication No. 2014/0245468, which is incorporated herein by reference.

[0110] В определенных вариантах осуществления константная область иммуноглобулина содержит генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG. В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна (например, мышиный или крысиный трансмембранный домен). В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен IgG человека. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна (например, мышиный или крысиный цитоплазматический домен). В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG человека. В некоторых вариантах осуществления соединительная область IgG представляет собой соединительную область IgG грызуна (например, мышиный или крысиный соединительный домен). В определенных вариантах осуществления соединительный домен IgG представляет собой соединительный домен IgG человека.[0110] In certain embodiments, the immunoglobulin constant region comprises a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, an IgG transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. IgG. In certain embodiments, the IgG transmembrane domain is a rodent IgG transmembrane domain (eg, mouse or rat transmembrane domain). In certain embodiments, the transmembrane domain is a human IgG transmembrane domain. In some embodiments, the IgG cytoplasmic domain is a rodent IgG cytoplasmic domain (eg, mouse or rat cytoplasmic domain). In some embodiments, the cytoplasmic domain of the IgG is a human IgG cytoplasmic domain. In some embodiments, the IgG junction region is a rodent IgG junction domain (eg, a mouse or rat junction domain). In certain embodiments, the IgG connecting domain is a human IgG connecting domain.

[0111] В определенных вариантах осуществления домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG1. В некоторых вариантах осуществления такой домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05.[0111] In certain embodiments, the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are IgG1 domains. In some embodiments, such an IgG1 domain is encoded by an allele selected from IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04, and IGHG1*05.

[0112] В определенных вариантах осуществления домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG2. В некоторых вариантах осуществления такой домен IgG2 кодируется аллелем, выбранным из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06.[0112] In certain embodiments, the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are IgG2 domains. In some embodiments, such an IgG2 domain is encoded by an allele selected from IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05, and IGHG2*06.

[0113] В определенных вариантах осуществления домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG3. В некоторых вариантах осуществления такой домен IgG3 кодируется аллелем, выбранным из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19.[0113] In certain embodiments, the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are IgG3 domains. In some embodiments, such an IgG3 domain is encoded by an allele selected from IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3* 10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 and IGHG3*19.

[0114] В определенных вариантах осуществления домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG4. В некоторых вариантах осуществления такой домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04.[0114] In certain embodiments, the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are IgG4 domains. In some embodiments, such an IgG4 domain is encoded by an allele selected from IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03, and IGHG4*04.

[0115] В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует вариантную последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (т. е. последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которая содержит одну или более добавок, делеций и/или замен по сравнению с соответствующей референсной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека), которая характеризуется повышенной или сниженной эффекторной функцией и/или аффинностью в отношении FcR по сравнению с референсной константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина человека.[0115] In some embodiments, the C _H gene segment encodes a variant human immunoglobulin heavy chain constant region sequence (i.e., a human immunoglobulin heavy chain constant region sequence that contains one or more additions, deletions, and/or substitutions relative to the corresponding reference human immunoglobulin heavy chain constant region sequence) that is characterized by increased or decreased effector function and/or affinity for FcR compared to the human immunoglobulin heavy chain reference constant region.

[0116] В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, характеризующуюся измененной аффинностью в отношении активирующих и/или ингибирующих рецепторов. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, характеризующуюся повышенным или сниженным связыванием с FcRn-рецептором, например, при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H, который кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, полностью или частично, кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, имеющую одну или более аминокислотных модификаций. Примеры аминокислотных модификаций включают, но не ограничиваются этим, замену в позиции 297 (например, N297A), позиции 250 (например, 250E или 250Q), позиции 252 (например, 252L, 252Y, 252F, 252W или 252T), позиции 254 (например, 254S или 254T), позиции 256 (например, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, или 256T), позиции 307 (например, 307P или 307A), позиции 308 (например, 308F или 308V), позиции 428 (например, 428L или 428F), позиции 433 (например, 433H, 433Lm, 433R, 433S, 433P, 433Q или 433K), позиции 434 (например, 434A, 434W, 434H, 434F или 434Y) и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, имеющую одну или более пар или групп аминокислотных модификаций, выбранных из группы, состоящей из 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254T и 256E (например, M252Y, S254T и T256E); 428L и 434S (например, M428L и N434S); 257I и 311I (например, P257I и Q311I); 257I и 434H (например, P257I и N434H); 376V и 434H (например, D376V и N434H); 307A, 380A и 434A (например, T307A, E380A и N434A); и 433K и 434F (например, H433K и N434F).[0116] In some embodiments, the C _H gene segment encodes a human immunoglobulin heavy chain constant region characterized by altered affinity for activating and/or inhibitory receptors. In some embodiments, the C _H gene segment encodes a human immunoglobulin heavy chain constant region characterized by increased or decreased binding to the FcRn receptor, for example, at acidic pH compared to neutral pH. In some embodiments, a _CH gene segment that encodes a human immunoglobulin heavy chain constant region, in whole or in part, encodes a human immunoglobulin heavy chain constant region having one or more amino acid modifications. Examples of amino acid modifications include, but are not limited to, substitution at position 297 (e.g., N297A), position 250 (e.g., 250E or 250Q), position 252 (e.g., 252L, 252Y, 252F, 252W, or 252T), position 254 (e.g. , 254S or 254T), Item 256 (for example, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, or 256T), Item 307 (for example, 307P or 307A), Item 308 (for example, 308F or 308V), Item 428 (for example, 428L or 428F), item 433 (e.g., 433H, 433Lm, 433R, 433S, 433P, 433Q, or 433K), item 434 (e.g., 434A, 434W, 434H, 434F, or 434Y), and combinations thereof. In some embodiments, the C _H gene segment encodes a human immunoglobulin heavy chain constant region having one or more pairs or groups of amino acid modifications selected from the group consisting of 250Q and 248L (eg, T250Q and M248L); 252Y, 254T and 256E (for example, M252Y, S254T and T256E); 428L and 434S (for example, M428L and N434S); 257I and 311I (for example, P257I and Q311I); 257I and 434H (for example, P257I and N434H); 376V and 434H (for example, D376V and N434H); 307A, 380A and 434A (eg T307A, E380A and N434A); and 433K and 434F (for example, H433K and N434F).

[0117] В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует химерный константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит сегменты или части, полученные из иммуноглобулина человека более чем одного изотипа (или которые встречаются в них). Например, такая химерная область C_H может содержать домен C_H2, полученный из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в комбинации с доменом C_H3, полученным из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В некоторых определенных вариантах осуществления химерная область C_H дополнительно содержит химерную шарнирную область. Например, химерная шарнирная область может содержать «верхнюю шарнирную» аминокислотную последовательность (аминокислотные остатки от позиции 216 до 227 в соответствии с нумерацией EU), полученную из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в комбинации с «нижней шарнирной» последовательностью (аминокислотные остатки от позиции 228 до 236 в соответствии с нумерацией EU), полученной из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В некоторых определенных вариантах осуществления химерная шарнирная область содержит аминокислотные остатки, полученные из верхней шарнирной области IgG1 человека или IgG4 человека, и аминокислотные остатки, полученные из нижней шарнирной области IgG2 человека.[0117] In some embodiments, the C _H gene segment encodes a chimeric immunoglobulin heavy chain constant domain that contains (or is found in) segments or portions derived from more than one isotype of human immunoglobulin. For example, such a chimeric C _H region may comprise a C _H 2 domain derived from a human IgG1, human IgG2 or human IgG4 molecule in combination with a C _H 3 domain derived from a human IgG1, human IgG2 or human IgG4 molecule. In some certain embodiments, the _CH chimeric region further comprises a chimeric hinge region. For example, a chimeric hinge region may comprise an "upper hinge" amino acid sequence (amino acid residues 216 to 227 according to EU numbering) derived from a human IgG1, human IgG2, or human IgG4 hinge region, in combination with a "lower hinge" sequence ( amino acid residues from position 228 to 236 according to EU numbering) derived from the hinge region of human IgG1, human IgG2 or human IgG4. In certain embodiments, the chimeric hinge region comprises amino acid residues derived from a human IgG1 or human IgG4 upper hinge region and amino acid residues derived from a human IgG2 lower hinge region.

[0118] В определенных вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_H. В определенных вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1, локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a, локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b, локусе эндогенного генного сегмента C_γ2c или локусе эндогенного генного сегмента C_γ3 .[0118] In certain embodiments, the modified _CH gene segment is located at an endogenous _CH gene segment locus. In certain embodiments, the modified C _H gene segment is located at an endogenous C _γ1 gene segment locus, an endogenous C _γ2a gene segment locus, an endogenous C _γ2b gene segment locus, an endogenous C _γ2c gene segment locus, or an endogenous C _γ3 gene segment locus.

[0119] Структура эндогенного гена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина может варьироваться между грызунами. Например, норвежская крыса не имеет генный сегмент C_γ3 в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, тогда как мышиные линии в общем случае имеют его. Даже в рамках одного вида константная область тяжелой цепи иммуноглобулина может варьироваться между линиями. Например, тогда как некоторые линии мышей имеют генный сегмент C_γ2a в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, другие линии мышей (например, линии мышей с аллелью Igh1-b) имеют вместо этого генный сегмент C_γ2c, а некоторые линии мышей могут иметь оба генных сегмента, C_γ2a и C_γ2c. Генные сегменты C_γ1, C_γ2a, C_γ2b и C_γ3 грызунов, раскрытые на фигурах, в примерах и/или в описаниях в данном документе, следовательно, представляют собой примеры генных сегментов C_H грызунов, а специалисту в данной области техники понятно, что генная структура конкретной константной области будет варьироваться между линиями грызунов. Таким образом, например, специалисту в данной области техники понятно, что данное раскрытие предусматривает грызунов, содержащих генный сегмент C_γ2c грызуна вместо или в дополнение к любому раскрытому генному сегменту C_γ2a грызуна.[0119] The structure of the endogenous immunoglobulin heavy chain constant region gene may vary between rodents. For example, the Norway rat does not have the C _γ3 gene segment at the endogenous immunoglobulin heavy chain locus, whereas mouse strains generally do. Even within a species, the immunoglobulin heavy chain constant region can vary between lineages. For example, while some mouse strains have a C _γ2a gene segment at the endogenous immunoglobulin heavy chain locus, other mouse strains (e.g., mouse strains with the Igh1-b allele) have a C _γ2c gene segment instead, and some mouse strains may have both gene segments , C _γ2a and C _γ2c . The rodent _Cγ1 , _Cγ2a , _Cγ2b , and _Cγ3 gene segments disclosed in the figures, examples, and/or descriptions herein are therefore examples of rodent _CH gene segments, and one skilled in the art will appreciate that the gene structure of a particular constant region will vary between rodent strains. Thus, for example, one skilled in the art will appreciate that this disclosure provides rodents containing a rodent C _γ2c gene segment instead of or in addition to any disclosed rodent C _γ2a gene segment.

[0120] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ1 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1) и расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ2a грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG2a.[0120] In some embodiments, the modified C _H gene segment is a human C _γ1 gene segment (or at least a portion of a human C _γ1 gene segment encoding a C _H 1 domain, a hinge region, a C _H 2 domain, and a C _H 3 constant domain IgG1 domain) and is located in the endogenous gene segment C _γ2a locus. In some embodiments, a portion of the human _γ1 C gene segment encoding the C _H 1 domain, hinge region, C _H 2 domain, and C _H 3 domain of the IgG1 constant domain is operably linked to a portion of the endogenous rodent C _γ2a gene segment encoding transmembrane and/or cytoplasmic IgG2a domain.

[0121] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ1 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1) и расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2c. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ2c грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG2c.[0121] In some embodiments, the modified C _H gene segment is a human C _γ1 gene segment (or at least a portion of a human C _γ1 gene segment encoding a C _H 1 domain, a hinge region, a C _H 2 domain, and a C _H 3 constant domain domain IgG1) and is located in the locus of the endogenous gene segment C _γ2c . In some embodiments, a portion of the human _γ1 C gene segment encoding the C _H 1 domain, hinge region, C _H 2 domain, and C _H 3 domain of the IgG1 constant domain is operably linked to a portion of the endogenous rodent C _γ2c gene segment encoding transmembrane and/or cytoplasmic IgG2c domain.

[0122] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ4 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4) и расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ1 грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG1.[0122] In some embodiments, the modified C _H gene segment is a human C _γ4 gene segment (or at least a portion of a human C _γ4 gene segment encoding a C _H 1 domain, a hinge region, a C _H 2 domain, and a C _H 3 constant domain domain IgG4) and is located in the locus of the endogenous gene segment C _γ1 . In some embodiments, a portion of the human _γ4 C gene segment encoding the C _H 1 domain, hinge region, C _H 2 domain, and C _H 3 domain of the IgG4 constant domain is operably linked to a portion of the endogenous rodent C _γ1 gene segment encoding the transmembrane and/or cytoplasmic IgG1 domain.

[0123] В определенных вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H замещает весь или часть эндогенного генного сегмента C_H. В определенных вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H замещает весь или часть эндогенного генного сегмента C_γ1, эндогенного генного сегмента C_γ2a, эндогенного генного сегмента C_γ2b, эндогенного генного сегмента C_γ2c или эндогенного генного сегмента C_γ3.[0123] In certain embodiments, the modified _CH gene segment replaces all or a portion of the endogenous _CH gene segment. In certain embodiments, the modified C _H gene segment replaces all or a portion of an endogenous C _γ1 gene segment, an endogenous C _γ2a gene segment, an endogenous C _γ2b gene segment, an endogenous C _γ2c gene segment, or an endogenous C _γ3 gene segment.

[0124] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ1 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1) и замещает весь или часть локуса эндогенного генного сегмента C_γ2a. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, замещает часть эндогенного генного сегмента C_γ2a грызуна, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG2a, так что часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ2a грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG2a.[0124] In some embodiments, the modified C _H gene segment is a human C _γ1 gene segment (or at least a portion of a human C _γ1 gene segment encoding a C _H 1 domain, a hinge region, a C _H 2 domain, and a C _H 3 constant domain IgG1 domain) and replaces all or part of the endogenous gene segment C _γ2a locus. In some embodiments, the portion of the human _γ1 C gene segment encoding the C _H 1 domain, hinge region, C _H 2 domain, and C _H 3 domain of the IgG1 constant domain replaces the portion of the endogenous rodent C _γ2a gene segment encoding the C _H 1 domain, hinge region , the C _H 2 domain and the C _H 3 domain of the IgG2a constant domain, so that the portion of the human C _γ1 gene segment encoding the C _H 1 domain, the hinge region, the C _H 2 domain, and the C _H 3 domain of the IgG1 constant domain is functionally linked to a portion of the endogenous rodent _γ2a C gene segment encoding the transmembrane and/or cytoplasmic domain of IgG2a.

[0125] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ4 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4) и замещает весь или часть локуса эндогенного генного сегмента C_γ1. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4, замещает часть эндогенного генного сегмента C_γ1 грызуна, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, так что часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ1 грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG1.[0125] In some embodiments, the modified C _H gene segment is a human C _γ4 gene segment (or at least a portion of a human C _γ4 gene segment encoding a C _H 1 domain, a hinge region, a C _H 2 domain, and a C _H 3 constant domain IgG4 domain) and replaces all or part of the endogenous gene segment C _γ1 locus. In some embodiments, the portion of the human _γ4 C gene segment encoding the C _H 1 domain, hinge region, C _H 2 domain, and C _H 3 domain of the IgG4 constant domain replaces the portion of the endogenous rodent C _γ1 gene segment encoding the C _H 1 domain, hinge region , the C _H 2 domain and the C _H 3 domain of the IgG1 constant domain, so that the portion of the human C _γ4 gene segment encoding the C _H 1 domain, the hinge region, the C _H 2 domain, and the C _H 3 domain of the IgG4 constant domain is functionally linked to a portion of the endogenous rodent C _γ1 gene segment encoding the transmembrane and/or cytoplasmic domain of IgG1.

[0126] В определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит один или более генных сегментов C_H грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_μ грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_δ грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ1 грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ2a грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ2b грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ2c грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ3 грызуна (например, мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_ε грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_ε грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления один или более генных сегментов константной области грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты константной области. В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H, описанный выше, является единственным модифицированным генным сегментом C_H в константной области тяжелой цепи Ig.[0126] In certain embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises one or more rodent (eg, rat or mouse) _CH gene segments. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, rat or mouse) _Cμ gene segment. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, rat or mouse) _Cδ gene segment. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, rat or mouse) C _γ1 gene segment. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, rat or mouse) _γ2a C gene segment. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, rat or mouse) C _γ2b gene segment. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, rat or mouse) C _γ2c gene segment. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, mouse) _γ3 C gene segment. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, rat or mouse) _Cε gene segment. In some embodiments, the Ig constant region comprises a rodent (eg, rat or mouse) _Cε gene segment. In some embodiments, the one or more rodent constant region gene segments are endogenous constant region gene segments. In some embodiments, the modified _CH gene segment described above is the only modified _CH gene segment in the Ig heavy chain constant region.

[0127] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H, описанный выше, представляет собой один из некоторого количества модифицированных генных сегментов C_H в константной области тяжелой цепи Ig (например, один из 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 модифицированных генных сегментов, которые являются частично или полностью гуманизированными, в константной области тяжелой цепи Ig). В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_μ. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_δ. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_γ1. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_γ2. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_γ3. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_γ4. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_ε. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_α. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий генный сегмент C_μ, человеческий генный сегмент C_δ, человеческий генный сегмент C_γ1 и человеческий генный сегмент C_γ3. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig дополнительно содержит человеческий генный сегмент C_γ2 и человеческий генный сегмент C_γ4. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig дополнительно содержит человеческий генный сегмент C_α. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig дополнительно содержит человеческий генный сегмент C_ε.[0127] In some embodiments, the modified _CH gene segment described above is one of a number of modified _CH gene segments in the Ig heavy chain constant region (e.g., one of 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 modified gene segments, which are partially or fully humanized, in the Ig heavy chain constant region). In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human or partially human _Cμ gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human or partially human _Cδ gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human or partially human _Cγ1 gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human or partially human _Cγ2 gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human or partially human _Cγ3 gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human or partially human _Cγ4 gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human or partially human _Cε gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human or partially human _Cα gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region comprises a human _Cμ gene segment, a human _Cδ gene segment, a human _Cγ1 gene segment, and a human _Cγ3 gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region further comprises a human _Cα gene segment. In some embodiments, the Ig heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0128] В некоторых вариантах осуществления локус IgH содержит регуляторные элементы человека или грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент представляет собой эндогенный регуляторный элемент. В определенных вариантах осуществления локус IgH содержит интронный энхансер (E_i) грызуна (например, крысы или мыши) или человека. В некоторых вариантах осуществления локус IgH содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна (например, крысы или мыши) или человека.[0128] In some embodiments, the IgH locus comprises human or rodent (eg, rat or mouse) regulatory elements. In some embodiments, the regulatory element is an endogenous regulatory element. In certain embodiments, the IgH locus comprises a rodent (eg, rat or mouse) or human intronic enhancer (E _i ). In some embodiments, the IgH locus comprises a rodent (eg, rat or mouse) or human 3' regulatory region (3' RO).

[0129] В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления модифицированный локус IgH находится в трансгене, расположенном за пределами эндогенного локуса. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус IgH инактивирован (например, посредством делеции, перемещения и/или инверсии всего или части эндогенного локуса тяжелой цепи Ig).[0129] In some embodiments, the modified immunoglobulin heavy chain locus is located at an endogenous immunoglobulin heavy chain locus. In some embodiments, the immunoglobulin heavy chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin heavy chain locus. In certain embodiments, the modified IgH locus is located in a transgene located outside the endogenous locus. In some embodiments, the endogenous IgH locus is inactivated (eg, through deletion, displacement, and/or inversion of all or part of the endogenous Ig heavy chain locus).

[0130] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления одна или более константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина (или их частей) локуса тяжелой цепи иммуноглобулина не удалены (т. е. являются интактными). В некоторых вариантах осуществления один или более генных сегментов C_H локуса тяжелой цепи иммуноглобулина изменены, разрушены, удалены или замещены, помимо прочего, последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, описанной в данном документе (например, последовательностью, кодирующей полипептид C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека), функционально связанной с кодирующей(ими) трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью(ями) гена константной области тяжелой цепи не принадлежащего человеку иммуноглобулина IgG (например, последовательностью, кодирующей M1 и/или M2 ), и, в некоторых вариантах осуществления, последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, последовательностью, кодирующей полипептид C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 IgE человека), функционально связанной с кодирующей(ими) трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью(ями) гена константной области IgE. В некоторых вариантах осуществления вся или практически вся константная область тяжелой цепи иммуноглобулина замещена гетерологичной константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью (например, экзоны M1 и M2) одного или более генов константной области IgG. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью (например, экзоны M1 и M2) гена константной области IgE. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью (например, экзон(ы) M) гена константной области IgA. В некоторых вариантах осуществления один или более генных сегментов C_H (например, C_μ, C_δ и т. д.) не удалены или не замещены константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит гетерологичную последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, функционально связанную с кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью одного или более генов константной области, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая была изменена, разрушена, удалена, замещена или сконструирована с использованием одной или более гетерологичных последовательностей константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, представляет собой константную область тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина вставлена в одну копию (т.е. аллель) гена константной области IgG (например, C_γ1, C_γ2a, C_γ2b, C_γ2c или C_γ3) из двух копий гена константной области IgG константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, что позволяет получать отличное от человека животное, гетерозиготное в отношении гетерологичной последовательности константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления предложено отличное от человека животное, гомозиготное в отношении константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит гетерологичную последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, описанную в данном документе.[0130] Thus, in some embodiments, one or more immunoglobulin heavy chain constant regions (or portions thereof) of the immunoglobulin heavy chain locus are not deleted (ie, are intact). In some embodiments, one or more gene segments of the immunoglobulin heavy chain locus C _H are altered, disrupted, deleted, or replaced by, among other things, an immunoglobulin heavy chain constant region sequence described herein (e.g., a sequence encoding a C _H 1-HC _H polypeptide 2-C _H 3 human IgG) operably linked to the transmembrane and cytoplasmic domain encoding sequence(s) of the non-human immunoglobulin IgG heavy chain constant region gene (e.g., the sequence encoding M1 and/or M2), and, in In some embodiments, an immunoglobulin heavy chain constant region sequence (e.g., a sequence encoding a human IgE C _H 1 -C _H 2 -C _H 3 -C _H 4 polypeptide) operably linked to transmembrane and cytoplasmic domain encoding sequence(s) ) IgE constant region gene. In some embodiments, all or substantially all of the immunoglobulin heavy chain constant region is replaced with a heterologous immunoglobulin heavy chain constant region. In some embodiments, the heterologous immunoglobulin heavy chain constant region is operably linked to the transmembrane and cytoplasmic domain coding sequence (eg, exons M1 and M2) of one or more IgG constant region genes. In some embodiments, the heterologous immunoglobulin heavy chain constant region is operably linked to the transmembrane and cytoplasmic domain coding sequence (eg, exons M1 and M2) of the IgE constant region gene. In some embodiments, the heterologous immunoglobulin heavy chain constant region is operably linked to a transmembrane and cytoplasmic domain coding sequence (eg, M exon(s)) of the IgA constant region gene. In some embodiments, one or more _CH gene segments (e.g., _Cμ , _Cδ , etc.) are not deleted or replaced by an immunoglobulin heavy chain constant region that contains a heterologous immunoglobulin heavy chain constant region sequence operably linked to the coding transmembrane and cytoplasmic domain sequence of one or more constant region genes as described herein. In some embodiments, the heterologous immunoglobulin heavy chain constant region sequence is a human immunoglobulin heavy chain constant region sequence. In some embodiments, the immunoglobulin heavy chain constant region that has been altered, disrupted, deleted, substituted, or engineered using one or more heterologous immunoglobulin heavy chain constant region sequences is a mouse immunoglobulin heavy chain constant region. In some embodiments, the heterologous immunoglobulin heavy chain constant region sequence is inserted into one copy (i.e., allele) of an IgG constant region gene (e.g., _Cγ1 , _Cγ2a , _{Cγ2b, Cγ2c} , or _Cγ3 ) of two copies of the constant region gene IgG of the immunoglobulin heavy chain constant region, which allows the production of a non-human animal that is heterozygous for a heterologous immunoglobulin heavy chain constant region sequence. In some embodiments, a non-human animal is provided that is homozygous for an immunoglobulin heavy chain constant region that contains a heterologous immunoglobulin heavy chain constant region sequence described herein.

[0131] В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит один или более кодирующих IgG генных сегментов C_H, каждый из которых содержит последовательность, кодирующую внеклеточный домен человека (например, C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека), функционально связанную с последовательностью, кодирующей не принадлежащий человеку трансмембранный и цитоплазматический домен (например, M1-M2 не принадлежащего человеку IgG) такого же или другого подкласса IgG.[0131] In some embodiments, an engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises one or more IgG-encoding _CH gene segments, each of which contains a sequence encoding a human extracellular domain (e.g., _CH 1-HC _H 2-C _H 3 human IgG) operably linked to a sequence encoding the non-human transmembrane and cytoplasmic domain (eg, M1-M2 of non-human IgG) of the same or a different IgG subclass.

[0132] В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит один или более кодирующих IgG генных сегментов C_H, описанных в данном документе, и дополнительно содержит ген константной области C_μ дикого типа (например, не модифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный).[0132] In some embodiments, an engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises one or more IgG-encoding C _H gene segments described herein and further comprises a wild-type (e.g., unmodified or unmodified) _Cμ constant region gene. belonging to a person, for example, rat or mouse).

[0133] В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит один или более кодирующих IgG генных сегментов C_H, описанных в данном документе, и дополнительно содержит гены константной области C_μ и C_δ дикого типа (например, не модифицированные и не принадлежащие человеку, например, крысиные или мышиные).[0133] In some embodiments, an engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises one or more IgG-encoding _CH gene segments described herein and further comprises wild-type (e.g., non- _Cμ ) Cμ and _Cδ constant region genes. modified and non-human, such as rat or mouse).

[0134] В различных вариантах осуществления сконструированный кодирующий IgG генный сегмент C_H, содержащий последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанную в данном документе, представляет собой сконструированный кодирующий IgG генный сегмент C_H подкласса IgG, выбранный из C_γ1, C_γ2a, C_γ2b, C_γ2c или C_γ3.[0134] In various embodiments, the engineered IgG coding C _H gene segment comprising the human immunoglobulin heavy chain constant region sequence described herein is an engineered IgG coding C _H gene segment of an IgG subclass selected from C _γ1 , C _γ2a , C _γ2b , C _γ2c or C _γ3 .

[0135] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2a.[0135] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered C _γ2a gene segment containing a human IgG1 CH ₁ -HC _H 2 -C _H 3 coding sequence in place of the C _H 1 exons -HC _H 2-C _H 3 and functionally associated with exons M1 and M2 of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ2a gene segment.

[0136] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2a.[0136] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered _Cγ2a gene segment containing a human IgG1 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 coding sequence instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally associated with the switch region of the non-human (eg, rat or murine) gene segment C _γ2a .

[0137] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2c.[0137] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered C _γ2c gene segment containing a human IgG1 C _H 1 -HC _H 2 -C _H 3 coding sequence in place of the C _H 1 exons -HC _H 2-C _H 3 and functionally associated with exons M1 and M2 of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ2c gene segment.

[0138] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2c.[0138] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered _Cγ2c gene segment containing a human IgG1 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 coding sequence instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally associated with the switch region of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ2c gene segment.

[0139] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.[0139] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered C _γ1 gene segment containing a human IgG4 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 coding sequence in place of the C _H 1 exons -HC _H 2-C _H 3 and functionally associated with exons M1 and M2 of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ1 gene segment.

[0140] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.[0140] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered _Cγ1 gene segment containing a human IgG4 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 coding sequence instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally associated with the switch region of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ1 gene segment.

[0141] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2a, и сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.[0141] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered C _γ2a gene segment containing a human IgG1 CH ₁ -HC _H 2 -C _H 3 coding sequence in place of the C _H 1 exons -HC _H 2-C _H 3 and operably linked to exons M1 and M2 of a non-human (eg, rat or mouse) C _γ2a gene segment, and a constructed C _γ1 gene segment containing a sequence encoding CH ₁ -HC _H 2- C _H 3 human IgG4, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally linked to exons M1 and M2 of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ1 gene segment.

[0142] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2a, и сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.[0142] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered _Cγ2a gene segment containing a human IgG1 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 coding sequence instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally linked to the switch region of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ2a gene segment, and a constructed C _γ1 gene segment containing the sequence encoding C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG4, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally related to the switch region of a non-human (e.g., rat or mouse) gene segment C _γ1 .

[0143] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2c, и сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.[0143] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered C _γ2c gene segment containing a human IgG1 CH ₁ -HC _H 2 -C _H 3 coding sequence in place of the C _H 1 exons -HC _H 2-C _H 3 and operably linked to exons M1 and M2 of a non-human (eg, rat or mouse) C _γ2c gene segment, and a constructed C _γ1 gene segment containing a sequence encoding CH ₁ -HC _H 2- C _H 3 human IgG4, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally linked to exons M1 and M2 of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ1 gene segment.

[0144] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2c, и сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.[0144] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises an engineered _Cγ2c gene segment containing a human IgG1 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 coding sequence instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally linked to the switch region of the non-human (eg, rat or mouse) C _γ2c gene segment, and a constructed C _γ1 gene segment containing the sequence encoding C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG4, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally related to the switch region of a non-human (e.g., rat or mouse) gene segment C _γ1 .

[0145] В различных вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит одну или более дополнительных модификаций, в том числе обеспечивающих нефункциональность генов константной области (т.е. изотипов), отличной от одной или более константных областей IgG, которые содержат последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека или C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG человека (например, IgG1 и/или IgG2a), например, посредством делеции, полной или частичной, изменения, полного или частичного, разрушения, полного или частичного, замещения, полного или частичного, одного или более генов константной области иммуноглобулина, кодирующих IgD, IgE, IgA и IgG, которые сами не содержат последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека или C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG человека, описанные в данном документе (например, IgG2b и/или IgG3). Также предложены сконструированные не принадлежащие человеку эмбрионы, клетки и нацеливающие векторы для создания таких отличных от человека животных, эмбрионов и клеток.[0145] In various embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein contains one or more additional modifications, including rendering nonfunctional constant region genes (i.e., isotypes) other than one or more IgG constant regions that contain a sequence encoding C _H 1-HC _H 2-C _H 3 human IgG or C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG (for example, IgG1 and/or IgG2a), for example, by deletion, complete or partial, change, complete or partial, destruction, complete or partial, replacement, complete or partial, of one or more immunoglobulin constant region genes encoding IgD, IgE, IgA and IgG, which themselves do not contain a sequence encoding C _H 1- HC _H 2-C _H 3 human IgG or CH 1-HC _{H 2} -C _H 3-M1-M2 human IgG described herein (eg, IgG2b and/or IgG3). Engineered non-human embryos, cells, and targeting vectors for creating such non-human animals, embryos, and cells are also provided.

[0146] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ1, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ2a, C_γ2c, C_γ2b, C_γ3, C_ε и C_α.[0146] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region provided herein comprises a wild-type (e.g., unmodified and non-human, e.g., rat or murine) _Cμ gene segment, a _Cγ1 gene segment containing the sequence , encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 human IgG4, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally associated with exons M1-M2 of the specified gene segment C _γ1 , and deletion of gene segments C _δ , C _γ2a, C _γ2c , C _γ2b , C _γ3, C _ε and C _α .

[0147] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ1, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ2a, C_γ2c, C_γ2b, C_γ3, C_ε и C_α.[0147] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region provided herein comprises a wild-type (e.g., unmodified and non-human, e.g., rat or murine) _Cμ gene segment, a _Cγ1 gene segment containing the sequence , encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG4, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and operably linked to the switch region of the specified C _γ1 gene segment, and deletion of gene segments _Cδ , _{Cγ2a, Cγ2c} , _Cγ2b , _Cγ3 , _Cε and _Cα .

[0148] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2a, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ1, C_γ2b, C_γ2c, C_γ3, C_ε и C_α.[0148] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region provided herein comprises a wild-type (e.g., unmodified and non-human, e.g., rat or murine) _Cμ gene segment, a _Cγ2a gene segment containing the sequence , encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 human IgG1, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally associated with exons M1-M2 of the specified gene segment C _γ2a , and deletion of gene segments C _δ , C _γ1, C _γ2b , C _γ2c , C _γ3, C _ε and C _α .

[0149] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2a, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ1, C_γ2b, C_γ2c, C_γ3, C_ε и C_α.[0149] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region provided herein comprises a wild-type (e.g., unmodified and non-human, e.g., rat or murine) _Cμ gene segment, a _Cγ2a gene segment containing the sequence , encoding C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG1, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and operably linked to the switch region of the specified C _γ2a gene segment, and deletion of gene segments _Cδ , _{Cγ1, Cγ2b} , _Cγ2c , _Cγ3 , _Cε and _Cα .

[0150] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2c, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ1, C_γ2a, C_γ2b, C_γ3, C_ε и C_α.[0150] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region provided herein comprises a wild-type (e.g., unmodified and non-human, e.g., rat or murine) _Cμ gene segment, a _Cγ2c gene segment containing the sequence , encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 human IgG1, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally associated with exons M1-M2 of the specified gene segment C _γ2c , and deletion of gene segments C _δ , C _γ1 , C _γ2a , C _γ2b , C _γ3 , C _ε and C _α .

[0151] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2c, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ1, C_γ2a, C_γ2b, C_γ3, C_ε и C_α.[0151] In certain certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region provided herein comprises a wild-type (e.g., unmodified and non-human, e.g., rat or murine) _Cμ gene segment, a _Cγ2c gene segment containing the sequence , encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG1, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and operably linked to the switch region of the specified C _γ2c gene segment, and deletion of gene segments _Cδ , _{Cγ1, Cγ2a} , _Cγ2b , _Cγ3 , _Cε and _Cα .

[0152] В различных вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит одну или более дополнительных модификаций, в том числе конструирование измененных, модифицированных, замещенных, сконструированных и т. д. генов константной области (т.е. изотипов), отличной от одной или более константных областей IgG, которые содержат последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека или C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG человека (например, IgG1 и/или IgG2a), посредством вставки последовательности константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанной в данном документе, в один или более генов константной области иммуноглобулина для IgD, IgE, IgA и IgG, которые сами не содержат последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека или C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG человека, описанные в данном документе (например, IgG2b и/или IgG3).[0152] In various embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region described herein comprises one or more additional modifications, including the construction of altered, modified, replaced, engineered, etc. constant region genes (i.e., isotypes) other than one or more IgG constant regions that contain a sequence encoding human IgG C _H 1-HC _H2 -C _H 3 or human IgG C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 (e.g., IgG1 and /or IgG2a), by inserting a human immunoglobulin heavy chain constant region sequence described herein into one or more immunoglobulin constant region genes for IgD, IgE, IgA and IgG that do not themselves contain a C _H 1-HC _H coding sequence 2-C _H 3 human IgG or C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG described herein (eg, IgG2b and/or IgG3).

[0153] Также предложены сконструированные не принадлежащие человеку эмбрионы, клетки и нацеленные векторы для создания отличных от человека животных, эмбрионов и клеток, содержащих локусы иммуноглобулина с описанными в данном документе сконструированными константными областями.[0153] Engineered non-human embryos, cells, and targeting vectors are also provided to create non-human animals, embryos, and cells containing immunoglobulin loci with the engineered constant regions described herein.

[0154] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа, генный сегмент C_δ дикого типа, генный сегмент C_γ3, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG3 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ3, генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ1, генный сегмент C_γ2b, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG2 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2b, генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2a (и/или генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2c), генный сегмент C_ε, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 IgE человека, вместо экзонов C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_ε, и генный сегмент C_α, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgA1 или IgA2 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с M-экзоном(ами) указанного генного сегмента C_α.[0154] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region provided herein comprises a wild-type _Cμ gene segment, a wild-type _Cδ gene segment, a _Cγ3 gene segment comprising a _CH 1- _HCH coding sequence 2-C _H 3 human IgG3, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally related to exons M1-M2 of the specified gene segment C _γ3 , gene segment C _γ1 containing the sequence encoding _CH 1-HC _H 2-C _H 3 human IgG4, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally related to exons M1-M2 of the specified gene segment C _γ1 , gene segment C _γ2b containing the sequence encoding _CH 1-HC _H 2-C _H 3 human IgG2, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally related to exons M1-M2 of the specified gene segment C _γ2b , gene segment C _γ2a containing the sequence encoding _CH 1-HC _H 2-C _H 3 human, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally linked to exons M1-M2 of the specified C _γ2a gene segment (and/or C _γ2c gene segment containing the sequence encoding _CH 1- HC _H 2-C _H 3 human IgG1, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally related to exons M1-M2 of the specified gene segment C _γ2c ), gene segment C _ε containing the sequence encoding _CH 1 -CH ₂ -C _H 3-C _H 4 human IgE, instead of exons C _H 1-C _H 2-C _H 3-C _H 4 and functionally associated with exons M1-M2 of the specified gene segment C _ε , and gene segment C _α containing a sequence encoding C _H 1-HC _H 2-C _H 3 human IgA1 or IgA2, instead of the C _H 1-HC _H 2-C _H 3 exons and functionally linked to the M-exon(s) of the specified C _α gene segment .

[0155] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа, генный сегмент C_δ дикого типа, генный сегмент C_γ3, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG3 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ3, генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента a C_γ1, генный сегмент C_γ2b, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG2 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2b, генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2a (и/или генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2c), генный сегмент C_ε, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 IgE человека, вместо экзонов C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_ε, и генный сегмент C_α, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgA1 или IgA2 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с M-экзоном(ами) указанного генного сегмента C_α.[0155] In some certain embodiments, the engineered immunoglobulin heavy chain constant region provided herein comprises a wild-type _Cμ gene segment, a wild-type _Cδ gene segment, a _Cγ3 gene segment comprising a _CH 1- _HCH coding sequence 2-C _H 3-M1-M2 human IgG3, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally related to the switching region of the specified C _γ3 gene segment, the C _γ1 gene segment containing the coding sequence C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG4, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally associated with the switching region of the specified gene segment a C _γ1 gene segment C _γ2b , containing a sequence encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG2, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 and functionally associated with the switching region of the specified gene segment C _γ2b , gene segment C _γ2a containing the sequence encoding human IgG1 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2, instead of the CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 exons and functionally associated with the switch region of the specified gene segment C _γ2a (and/or gene segment C _γ2c containing the sequence encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG1, instead of exons C _H 1-HC _H 2- C _H 3-M1-M2 and functionally associated with the switching region of the specified gene segment C _γ2c ), gene segment C _ε containing the sequence encoding CH ₁ -C _H 2-C _H 3-C _H 4 human IgE, instead of exons C _H 1-C _H 2-C _H 3-C _H 4 and functionally associated with exons M1-M2 of the specified C _ε gene segment, and the C _α gene segment containing the coding sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 IgA1 or human IgA2, instead of exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and functionally linked to the M exon(s) of the specified C _α gene segment.

[0156] В различных вариантах осуществления в данном документе предложены генетически сконструированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенные на Фиг. 1, а также генетически модифицированные грызуны (например, крысы или мыши), ЭС и другие клетки, и ткани, содержащие такие локусы. Таким образом, в одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1, C_γ2b грызуна (например, крысы или мыши), химерный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 генного сегмента C_γ2a грызуна (например, крысы или мыши) (например так, чтобы экзоны, кодирующие внеклеточный домен IgG1 человека, были функционально связаны с экзонами, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены IgG2a грызуна, например, крысы или мыши) (и/или химерный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 генного сегмента C_γ2c грызуна (например, крысы или мыши) (например так, чтобы экзоны, кодирующие внеклеточный домен IgG1 человека, были функционально связаны с экзонами, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены IgG2c грызуна, например, крысы или мыши), генные сегменты C_ε и C_α грызуна (например, крысы или мыши) и 3’ регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3’ энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 1. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.[0156] In various embodiments, provided herein are the genetically engineered immunoglobulin heavy chain loci depicted in FIG. 1, as well as genetically modified rodents (for example, rats or mice), ES and other cells and tissues containing such loci. Thus, in one embodiment, provided herein is a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus comprising human heavy chain variable region gene segments (human heavy chain V, D, and J gene segments), a rodent (e.g., rat or mouse) Ei enhancer), gene segments C _μ , C _δ , C _γ3 , C _γ1 , C _γ2b rodent (for example, rat or mouse), chimeric gene segment C _γ2a containing the sequence encoding CH ₁ -HC _H 2- _CH 3 human IgG1, instead exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and operably linked to exons M1-M2 of the rodent (e.g., rat or mouse) C _γ2a gene segment (e.g., so that exons encoding the extracellular domain of human IgG1 are operably linked to exons , encoding the transmembrane and cytoplasmic domains of rodent, e.g., rat or mouse IgG2a (and/or a chimeric C _γ2c gene segment containing the sequence encoding human IgG1 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 instead of the CH ₁ -HC exons _H 2-C _H 3 and operably linked to exons M1-M2 of the rodent (eg rat or mouse) _γ2c gene segment (e.g. so that the exons encoding the extracellular domain of human IgG1 are operably linked to the exons encoding the transmembrane and cytoplasmic domains rodent IgG2c, e.g., rat or mouse), rodent (e.g., rat or mouse) C _ε and C _α gene segments, and a rodent (e.g., rat or mouse) 3' regulatory region containing rodent (e.g., rat or mouse) 3' enhancers ). A typical genetically modified heavy chain locus is shown in FIG. 1 as the mouse locus 1. In some embodiments, the genetically modified locus contains a functional Adam6 gene described herein and in US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Also provided are genetically modified non-human animals, ES cells and other cells and tissues containing such genetically engineered loci.

[0157] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1, C_γ2b грызуна (например, крысы или мыши), генный сегмент C_γ1 человека, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, так что обе последовательности, кодирующие внеклеточный и трансмембранный/цитоплазматический домены IgG1, являются человеческими, генные сегменты C_ε и C_α грызуна (например, крысы или мыши) и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 2. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.[0157] In one embodiment, provided herein is a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus comprising human heavy chain variable region gene segments (human heavy chain V, D, and J gene segments), a rodent (e.g., rat or mouse) Ei enhancer), rodent (e.g. rat or mouse) _Cμ , _Cδ , _Cγ3 , _Cγ1 , _Cγ2b gene segments, human _Cγ1 gene segment containing the coding sequence CH1 _{- HCH2} - _CH3 -M1-M2 Human IgG1, such that both the sequences encoding the extracellular and transmembrane/cytoplasmic domains of IgG1 are human, the rodent (e.g., rat or mouse) C _ε and C _α gene segments, and the rodent (e.g., rat or mouse) 3' regulatory region containing Rodent 3' enhancers (eg rat or mouse). A typical genetically modified heavy chain locus is shown in FIG. 1 as the mouse locus 2. In some embodiments, the genetically modified locus contains a functional Adam6 gene described herein and in US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Also provided are genetically modified non-human animals, ES cells and other cells and tissues containing such genetically engineered loci.

[0158] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3 грызуна (например, крысы или мыши), химерный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 генного сегмента C_γ1 грызуна (например, крысы или мыши) (например так, чтобы экзоны, кодирующие внеклеточный домен IgG4 человека, были функционально связаны с экзонами, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены IgG1 грызуна, например, крысы или мыши), генные сегменты C_γ2b, C_γ2a (и/или C_γ2c), C_ε, C_α грызуна (например, крысы или мыши) и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 3. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.[0158] In one embodiment, provided herein is a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus comprising human heavy chain variable region gene segments (human heavy chain V, D, and J gene segments), a rodent (e.g., rat or mouse) Ei enhancer), gene segments C _μ , C _δ , C _γ3 rodent (for example, rat or mouse), chimeric gene segment C _γ1 containing the sequence encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 human IgG4, instead of C _H 1-HC exons _H 2-C _H 3 and operably linked to exons M1-M2 of the rodent (e.g., rat or mouse) C _γ1 gene segment (e.g., so that the exons encoding the extracellular domain of human IgG4 are operably linked to the exons encoding the transmembrane and cytoplasmic domains Rodent IgG1, e.g., rat or mouse), rodent _Cγ2b , _Cγ2a (and/or _Cγ2c ), _Cε , _Cα gene segments (e.g., rat or mouse), and rodent 3' regulatory region (e.g., rat or mouse) ), containing rodent (eg rat or mouse) 3' enhancers. A typical genetically modified heavy chain locus is shown in FIG. 1 as the murine locus 3. In some embodiments, the genetically modified locus contains a functional Adam6 gene described herein and in US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Also provided are genetically modified non-human animals, ES cells and other cells and tissues containing such genetically engineered loci.

[0159] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3 грызуна (например, крысы или мыши), генный сегмент C_γ4 человека, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, так что обе последовательности, кодирующие внеклеточный и трансмембранный/цитоплазматический домены IgG4, являются человеческими, генные сегменты C_γ2b, C_γ2a (и/или C_γ2c) грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_ε и C_α грызуна (например, крысы или мыши) и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 4. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.[0159] In one embodiment, provided herein is a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus comprising human heavy chain variable region gene segments (human heavy chain V, D, and J gene segments), a rodent (e.g., rat or mouse) Ei enhancer), rodent (e.g. rat or mouse) _Cμ , _Cδ , _Cγ3 gene segments, human _Cγ4 gene segment containing the sequence encoding CH1 _{- HCH2} - _CH3 -M1-M2 human IgG4, so that both sequences encoding the extracellular and transmembrane/cytoplasmic domains of IgG4 are human, rodent (eg rat or mouse) _Cγ2b , _Cγ2a (and/or _Cγ2c ) gene segments, rodent (eg rat or mouse) _Cε and _Cα gene segments mouse) and a rodent (eg rat or mouse) 3' regulatory region containing rodent (eg rat or mouse) 3' enhancers. A typical genetically modified heavy chain locus is shown in FIG. 1 as the mouse locus 4. In some embodiments, the genetically modified locus contains a functional Adam6 gene described herein and in US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Also provided are genetically modified non-human animals, ES cells and other cells and tissues containing such genetically engineered loci.

[0160] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei человека, генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3 и C_γ1 человека и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 5. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.[0160] In one embodiment, provided herein is a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus comprising human heavy chain variable region gene segments (human heavy chain V, D and J gene segments), human Ei enhancer, _Cμ , _Cδ gene segments , C _γ3 and C _γ1 of a human and a rodent (eg, rat or mouse) 3' regulatory region containing the rodent (eg, rat or mouse) 3' enhancers. A typical genetically modified heavy chain locus is shown in FIG. 1 as the murine locus 5. In some embodiments, the genetically modified locus contains a functional Adam6 gene described herein and in US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Also provided are genetically modified non-human animals, ES cells and other cells and tissues containing such genetically engineered loci.

[0161] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei человека, генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1, C_γ2 и C_γ4 человека и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 6. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.[0161] In one embodiment, provided herein is a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus comprising human heavy chain variable region gene segments (human heavy chain V, D and J gene segments), human Ei enhancer, _Cμ , _Cδ gene segments , _{Cγ3, Cγ1, Cγ2,} and _Cγ4 of a human and a rodent (eg, rat or mouse) 3' regulatory region containing the rodent (eg, rat or mouse) 3' enhancers. A typical genetically modified heavy chain locus is shown in FIG. 1 as the murine locus 6. In some embodiments, the genetically modified locus contains a functional Adam6 gene described herein and in US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Also provided are genetically modified non-human animals, ES cells and other cells and tissues containing such genetically engineered loci.

[0162] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши) (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши)), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, и C_γ1 человека и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 7. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.[0162] In one embodiment, provided herein is a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus comprising rodent (e.g., rat or mouse) heavy chain variable region gene segments (rodent (e.g., rat or mouse) heavy chain V, D, and J gene segments )), the rodent (e.g., rat or mouse) Ei enhancer, the human _Cμ , _Cδ , _Cγ3, and _Cγ1 gene segments, and the rodent (e.g., rat or mouse) 3' regulatory region containing the rodent 3' enhancers (e.g. , rat or mouse). A typical genetically modified heavy chain locus is shown in FIG. 1 as the murine locus 7. In some embodiments, the genetically modified locus comprises a functional Adam6 gene. Also provided are genetically modified non-human animals, ES cells and other cells and tissues containing such genetically engineered loci.

[0163] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши) (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши)), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1, C_γ2 и C_γ4 человека и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 8. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.[0163] In one embodiment, provided herein is a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus comprising rodent (e.g., rat or mouse) heavy chain variable region gene segments (rodent (e.g., rat or mouse) heavy chain V, D, and J gene segments )), the rodent (e.g., rat or mouse) Ei enhancer, the human _Cμ , _Cδ , _Cγ3, Cγ1 _{, Cγ2,} and _Cγ4 gene segments, and the rodent (e.g., rat or mouse) 3' regulatory region containing 3 ' rodent enhancers (e.g. rat or mouse). A typical genetically modified heavy chain locus is shown in FIG. 1 as the murine locus 8. In some embodiments, the genetically modified locus comprises a functional Adam6 gene. Also provided are genetically modified non-human animals, ES cells and other cells and tissues containing such genetically engineered loci.

[0164] Также в данном документе предложены способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 1,6 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 генного сегмента C_γ2a, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека функционально связана с экзонами M1 и M2 указанного генного сегмента C_γ2a.[0164] Also provided herein are methods for generating engineered immunoglobulin heavy chain loci. In some embodiments, the methods for creating engineered immunoglobulin heavy chain loci described herein include a DNA insert of about 1.6 kb that contains the nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 of human IgG1, encoding a polypeptide of the constant domain of the immunoglobulin heavy chain, instead of the exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 of the C _γ2a gene segment, so that the specified nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 of human IgG1 is functionally related to the exons M1 and M2 of the indicated gene segment C _γ2a .

[0165] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 6,8 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 генного сегмента C_γ2a, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека функционально связана с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2a.[0165] In some embodiments, the methods for creating engineered immunoglobulin heavy chain loci described herein include a DNA insert of about 6.8 kb that contains the nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 -M1-M2 human IgG1 encoding a polypeptide of the constant domain of the immunoglobulin heavy chain, instead of the exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 of the C _γ2a gene segment, so that the indicated nucleotide sequence is CH ₁ -HC _H 2- Human C _H 3-M1-M2 IgG1 is functionally linked to the switch region of the indicated C _γ2a gene segment.

[0166] Также в данном документе предложены способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 1,6 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 генного сегмента C_γ2c, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека функционально связана с экзонами M1 и M2 указанного генного сегмента C_γ2c.[0166] Also provided herein are methods for generating engineered immunoglobulin heavy chain loci. In some embodiments, the methods for creating engineered immunoglobulin heavy chain loci described herein include a DNA insert of about 1.6 kb that contains the nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 of human IgG1, encoding a polypeptide of the constant domain of the immunoglobulin heavy chain, instead of the exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 of the C _γ2c gene segment, so that the specified nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 of human IgG1 is functionally related to the exons M1 and M2 of the indicated gene segment C _γ2c .

[0167] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 6,8 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 генного сегмента C_γ2c, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека функционально связана с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2c.[0167] In some embodiments, the methods for creating engineered immunoglobulin heavy chain loci described herein include a DNA insert of about 6.8 kb that contains the nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 -M1-M2 human IgG1 encoding a polypeptide of the constant domain of the immunoglobulin heavy chain, instead of the exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 of the C _γ2c gene segment, so that the indicated nucleotide sequence is CH ₁ -HC _H 2- Human C _H 3-M1-M2 IgG1 is functionally linked to the switch region of the specified C _γ2c gene segment.

[0168] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 1,5 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 генного сегмента C_γ1, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека функционально связана с экзонами M1 и M2 указанного генного сегмента C_γ1.[0168] In some embodiments, the methods for creating engineered immunoglobulin heavy chain loci described herein include a DNA insert of about 1.5 kb that contains the nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 Human IgG4 encoding a polypeptide of the constant domain of the immunoglobulin heavy chain, instead of the exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3 of the C _γ1 gene segment, so that the specified nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 of human IgG4 is functionally related to exons M1 and M2 of the specified gene segment C _γ1 .

[0169] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 5,8 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 генного сегмента C_γ1, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека функционально связана с областью переключения указанного генного сегмента C_γ1.[0169] In some embodiments, the methods for creating engineered immunoglobulin heavy chain loci described herein include a DNA insert of about 5.8 kb that contains the nucleotide sequence CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 -M1-M2 human IgG4 encoding a polypeptide of the constant domain of the immunoglobulin heavy chain, instead of the exons C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 of the C _γ1 gene segment, so that the indicated nucleotide sequence is CH ₁ -HC _H 2- Human IgG4 C _H 3-M1-M2 is functionally linked to the switch region of the specified C _γ1 gene segment.

[0170] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 130 т.п.о., содержащей последовательности C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1 человека. В других вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают дополнительную вставку ДНК размером около 43 т.п.о., содержащей последовательности C_γ2 и C_γ4 человека.[0170] In some embodiments, the methods for creating engineered immunoglobulin heavy chain loci described herein involve inserting approximately 130 kb of DNA containing human _Cμ , _Cδ , _Cγ3 , _Cγ1 sequences. In other embodiments, the methods further include an additional DNA insert of about 43 kb containing human _Cγ2 and _Cγ4 sequences.

[0171] В различных способах создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанных выше, ДНК можно вносить в эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна (например, крысы или мыши), содержащий эндогенные генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши), или локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека. ДНК можно вносить посредством гомологичной рекомбинации или другими методами, известными в данной области техники или описанными в данном документе.[0171] In the various methods for creating engineered immunoglobulin heavy chain loci described above, DNA can be introduced into an endogenous rodent (e.g., rat or mouse) immunoglobulin heavy chain locus containing endogenous rodent (e.g., rat or mouse) heavy chain variable region gene segments. , or immunoglobulin heavy chain locus, containing gene segments of the human heavy chain variable region. DNA can be introduced by homologous recombination or other methods known in the art or described herein.

[0172] В некоторых вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гетерозиготным в отношении модифицированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, описанного в данном документе. В определенных вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гомозиготным в отношении модифицированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, описанного в данном документе.[0172] In some embodiments, the rodent (eg, rat or mouse) is heterozygous for the modified immunoglobulin heavy chain locus described herein. In certain embodiments, the rodent (eg, rat or mouse) is homozygous for the modified immunoglobulin heavy chain locus described herein.

Гуманизированные локусы каппа-цепи иммуноглобулинаHumanized immunoglobulin kappa chain loci

[0173] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, мыши или крысы), содержащие генетически модифицированные локусы цепи Igκ. Такие локусы содержат вариабельную область κ и константную область κ. Вариабельная область κ содержит генные сегменты вариабельной области цепи Igκ (т.е. по меньшей мере генный сегмент V_κ и генный сегмент J_κ). Константная область содержит генный сегмент константной области цепи Igκ (C_κ). В определенных вариантах осуществления вариабельная область цепи κ иммуноглобулина, такая как вариабельная область Igκ человека, функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина таким образом, чтобы грызун (например, крыса или мышь) вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_κ. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область Igκ представляет собой неперестроенную вариабельную область Igκ и, следовательно, содержит неперестроенные генные сегменты вариабельной области Igκ. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область Igκ представляет собой перестроенную вариабельную область Igκ и, следовательно, содержит перестроенный ген вариабельной области Igκ. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Igκ представляют собой генные сегменты вариабельной области Igκ человека. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Igκ представляют собой генные сегменты вариабельной области Igκ грызуна (например, генные сегменты вариабельной области крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления локус константной области Igκ содержит генный сегмент константной области Igκ, который является частично или полностью человеческим. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе локусы цепи Igκ расположены в эндогенном локусе цепи Igκ.[0173] In certain aspects, provided herein are rodents (eg, mice or rats) containing genetically modified Igκ chain loci. Such loci contain a κ variable region and a κ constant region. The κ variable region contains Igκ chain variable region gene segments (ie, at least a V _κ gene segment and a J _κ gene segment). The constant region contains the Igκ chain constant region ( _Cκ ) gene segment. In certain embodiments, an immunoglobulin κ chain variable region, such as a human Igκ variable region, is operably linked to an immunoglobulin κ chain constant region such that a rodent (e.g., a rat or mouse) produces antibodies comprising light chain variable domains derived from the gene segment Human V _κ and human J _κ gene segment, and light chain constant domains derived from the C _κ gene segment. In some embodiments, the Igκ variable region is a non-rearranged Igκ variable region and therefore comprises non-rearranged Igκ variable region gene segments. In some embodiments, the Igκ variable region is a rearranged Igκ variable region and therefore comprises a rearranged Igκ variable region gene. In certain embodiments, the Igκ variable region gene segments are human Igκ variable region gene segments. In certain embodiments, the Igκ variable region gene segments are rodent Igκ variable region gene segments (eg, rat or mouse variable region gene segments). In some embodiments, the Igκ constant region locus comprises an Igκ constant region gene segment that is partially or fully human. In some embodiments, the Igκ chain loci described herein are located at an endogenous Igκ chain locus.

[0174] В определенных вариантах осуществления вариабельная область Igκ содержит неперестроенные генные сегменты вариабельной области Igκ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты V_κ человека, которые находятся в дистальном вариабельном кластере (или дистальном плече, или дистальном дубликате) локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты V_κ человека, которые находятся в проксимальном вариабельном кластере (или проксимальном плече, или проксимальном дубликате) локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит генные сегменты V_κ человека, которые находятся в дистальном и проксимальном вариабельных кластерах локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит все или практически все функциональные генные сегменты V_κ человека, находящиеся между генными сегментами V_κ 2-40 человека (или V_κ 3D-7) и V_κ 4-1 человека включительно, локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе.[0174] In certain embodiments, the Igκ variable region comprises unrearranged human Igκ variable region gene segments. In certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) comprises at least human _Vκ gene segments that are located in a distal variable cluster (or distal arm or distal duplicate) of the human Igκ light chain locus that occurs naturally. . In certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) comprises at least human _Vκ gene segments that are located in the proximal variable cluster (or proximal arm or proximal duplicate) of the human Igκ light chain locus that occurs naturally. . In some certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) comprises human _Vκ gene segments that are located in the distal and proximal variable clusters of the naturally occurring human Igκ light chain locus. In certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) contains all or substantially all of the functional human _Vκ gene segments located between the human _Vκ 2-40 (or _Vκ 3D-7) and _Vκ 4- gene segments 1 human, inclusive, human Igκ light chain locus, which occurs in nature.

[0175] В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина человека содержат некоторое количество сегментов V_κ человека и один или более сегментов J_κ человека. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина содержат четыре функциональных сегмента V_κ и все сегменты J_κ человека. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина содержат 16 функциональных сегментов V_κ и все сегменты J_κ человека. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина человека содержат все сегменты V_κ человека и все сегменты J_κ человека.[0175] In some embodiments, the unrearranged human immunoglobulin variable region gene segments comprise a number of human _Vκ segments and one or more human _Jκ segments. In some embodiments, the immunoglobulin variable region gene segments comprise four functional human _Vκ segments and all _Jκ segments. In some embodiments, the immunoglobulin variable region gene segments comprise 16 functional _Vκ segments and all human _Jκ segments. In some embodiments, the unrearranged human immunoglobulin variable region gene segments comprise all human _Vκ segments and all human _Jκ segments.

[0176] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или более (например, 36, 37, 38, 39, 40 и т.д.) генных сегментов V_κ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит генные сегменты V_κ человека V_κ 3D-7, V_κ 1D-8, V_κ 1D-43, V_κ 3D-11, V_κ 1D-12, V_κ 1D-13, V_κ 3D-15, V_κ 1D-16, V_κ 1D-17, V_κ 3D-20, V_κ 6D-21, V_κ 2D-26, V_κ 2D-28, V_κ 2D-29, V_κ 2D-30, V_κ 1D-33, V_κ 1D-39, V_κ 2D-40, V_κ 2-40, V_κ 1-39, V_κ 1-33, V_κ 2-30, V_κ 2-28, V_κ 1-27, V_κ 2-24, V_κ 6-21, V_κ 3-20, V_κ 1-17, V_κ 1-16, V_κ 3-15, V_κ 1-12, V_κ 3-11, V_κ 1-9, V_κ 1-8, V_κ 1-6, V_κ 1-5, V_κ 5-2 и V_κ 4-1. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты V_κ человека V_κ 3D-7, V_κ 1D-8, V_κ 1D-43, V_κ 3D-11, V_κ 1D-12, V_κ 1D-13, V_κ 3D-15, V_κ 1D-16, V_κ 1D-17, V_κ 3D-20, V_κ 6D-21, V_κ 2D-26, V_κ 2D-28, V_κ 2D-29, V_κ 2D-30, V_κ 1D-33, V_κ 1D-39 и V_κ 2D-40. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты V_κ человека V_κ 2-40, V_κ 1-39, V_κ 1-33, V_κ 2-30, V_κ 2-28, V_κ 1-27, V_κ 2-24, V_κ 6-21, V_κ 3-20, V_κ 1-17, V_κ 1-16, V_κ 3-15, V_κ 1-12, V_κ 3-11, V_κ 1-9, V_κ 1-8, V_κ 1-6, V_κ 1-5, V_κ 5-2 и V_κ 4-1.[0176] In some certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) contains 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 or more (for example, 36, 37, 38, 39, 40, etc.) human _Vκ gene segments. In certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) comprises _human Vκ gene segments _Vκ 3D-7, _Vκ 1D-8, _Vκ 1D-43, _Vκ 3D-11, _Vκ 1D-12 , V _κ 1D-13, V _κ 3D-15, V _κ 1D-16, V _{κ 1D-17, V κ 3D} -20, V κ 6D-21, V _κ 2D-26, _{V κ 2D} -28, V _κ 2D-29, V _κ 2D-30, V _κ 1D-33, V _κ 1D-39, V _κ 2D-40, V _{κ 2-40, V κ 1-39} , V _κ 1-33, V _κ 2 -30, V _κ 2-28, V _κ 1-27, V _κ 2-24, V _κ 6-21, V _κ 3-20, V _κ 1-17, V _κ 1-16, V _κ 3-15 , _Vκ 1-12, _Vκ 3-11, _Vκ 1-9, _Vκ 1-8, _Vκ 1-6, _Vκ 1-5, _Vκ 5-2 and _Vκ 4-1. In certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) comprises at least the human _Vκ gene segments _Vκ 3D-7, _Vκ 1D-8, _Vκ 1D-43, _Vκ 3D-11, _Vκ 1D-12, V _κ 1D-13, V _κ 3D-15, V _κ 1D-16, V _κ 1D-17, V κ 3D-20, V _κ 6D-21, _{V κ 2D} -26, V _κ 2D- 28, V _κ 2D-29, V _κ 2D-30, V _κ 1D-33, V _κ 1D-39 and V _κ 2D-40. In certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) comprises at least the human _Vκ gene segments _Vκ 2-40, _Vκ 1-39, _Vκ 1-33, _Vκ 2-30, _Vκ 2-28, V _κ 1-27, V _κ 2-24, V _κ 6-21, V _κ 3-20, V _κ 1-17, V _κ 1-16, V _κ 3-15, V _κ 1- 12, V _κ 3-11, V _κ 1-9, V _κ 1-8, V _κ 1-6, V _κ 1-5, V _κ 5-2 and V _κ 4-1.

[0177] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе отличные от человека животные имеют ограниченный локус легкой цепи иммуноглобулина, характеризующийся не более чем двумя генными сегментами V_L человека и некоторым количеством генных сегментов J_L (например, мыши с двойной легкой цепью или DLC (англ. «dual light chain»), описанные в публикации патента США №2013/0198880, которая включена в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления генные сегменты V_L представляют собой генные сегменты V_κ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты V_L представляют собой генные сегменты V_λ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты V_κ представляют собой V_κ 3-20 и V_κ 1-39.[0177] In some embodiments, non-human animals provided herein have a restricted immunoglobulin light chain locus characterized by no more than two human V _L gene segments and a number of J _L gene segments (e.g., mouse double light chain or DLC ( English "dual light chain"), described in US patent publication No. 2013/0198880, which is incorporated herein by reference). In some embodiments, the V _L gene segments are V _κ gene segments. In some embodiments, the V _L gene segments are V _λ gene segments. In some embodiments, the _Vκ gene segments are _Vκ 3-20 and _Vκ 1-39.

[0178] В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит 1, 2, 3, 4, 5 или более функциональных генных сегментов J_κ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит все или практически все функциональные генные сегменты J_κ человека, находящиеся между генными сегментами J_κ1 человека и J_κ5 человека включительно, локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты J_κ человека J_κ1, J_κ2, J_κ3, J_κ4 и J_κ5.[0178] In some embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) contains 1, 2, 3, 4, 5 or more functional human _Jκ gene segments. In certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) comprises all or substantially all of the functional human _Jκ gene segments between the human _Jκ1 and human _Jκ5 gene segments, inclusive, of the human Igκ light chain locus that occurs in nature. In certain embodiments, the engineered Igκ light chain locus (or engineered allele) comprises at least the human _Jκ gene segments _Jκ1 , _Jκ2 , _Jκ3 , _Jκ4 , and _Jκ5 .

[0179] В других вариантах осуществления отличный от человека организм может содержать в зародышевой линии и/или геноме локус легкой цепи иммуноглобулина, который содержит вставки и/или замены кодонов гистидина, предназначенные для придания pH-зависимых свойств связывания антителам, вырабатываемым в таком отличном от человека организме. В некоторых таких вариантах осуществления вставка и/или замена кодонов гистидина проведена в последовательностях нуклеиновых кислот, кодирующих CDR3. Различные такие локусы легкой цепи иммуноглобулина приведены в патентах США №№9301510, 9334334, публикациях заявок на патент США №№2013/0247236, 20140013456, включенных в данный документ посредством ссылки.[0179] In other embodiments, a non-human organism may contain in the germline and/or genome an immunoglobulin light chain locus that contains insertions and/or histidine codon substitutions designed to impart pH-dependent binding properties to antibodies produced in such non-human host. human body. In some such embodiments, the insertion and/or replacement of histidine codons is carried out in the nucleic acid sequences encoding CDR3. Various such immunoglobulin light chain loci are described in US Patent Nos. 9301510, 9334334, US Patent Application Publications Nos. 2013/0247236, 20140013456, incorporated herein by reference.

[0180] Примеры вариабельных областей, содержащих генные сегменты Igκ, приведены, например, в Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 и справочной информации, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина человека содержат все сегменты Jκ человека.[0180] Examples of variable regions containing Igκ gene segments are provided, for example, in Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 and supporting information, which is incorporated herein by reference. In some embodiments, the unrearranged human immunoglobulin variable region gene segments comprise all human Jκ segments.

[0181] В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области Igκ, содержащий неперестроенные генные сегменты вариабельной области Igκ человека, также содержит межгенные последовательности вариабельной области Igκ человека. В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области Igκ содержит не принадлежащие человеку (например, принадлежащие грызуну, крысе, мыши) межгенные последовательности вариабельной области Igκ. В некоторых вариантах осуществления генный локус Igκ содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0181] In some embodiments, the Igκ variable region gene locus comprising unrearranged human Igκ variable region gene segments also contains intergenic human Igκ variable region sequences. In some embodiments, the Igκ variable region gene locus comprises non-human (eg, rodent, rat, mouse) intergenic Igκ variable region sequences. In some embodiments, the Igκ gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0182] В некоторых вариантах осуществления локус вариабельной области Igκ представляет собой перестроенный локус вариабельной области, содержащий ген вариабельной области Igκ (универсальной вариабельной области легкой цепи). В некоторых вариантах осуществления ген перестроенной вариабельной области Igκ представляет собой ген перестроенной вариабельной области Igκ человека. Применение универсальных вариабельных областей легкой цепи облегчает создание биспецифических антител. Примеры перестроенных вариабельных областей легкой цепи Ig приведены в публикации патента США №2013/0185821, которая включена в данный документ посредством ссылки.[0182] In some embodiments, the Igκ variable region locus is a rearranged variable region locus comprising an Igκ variable region (universal light chain variable region) gene. In some embodiments, the rearranged Igκ variable region gene is a rearranged human Igκ variable region gene. The use of universal light chain variable regions facilitates the creation of bispecific antibodies. Examples of rearranged Ig light chain variable regions are provided in US Patent Publication No. 2013/0185821, which is incorporated herein by reference.

[0183] В некоторых вариантах осуществления локус цепи Igκ содержит регуляторные элементы человека или грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент представляет собой эндогенный регуляторный элемент. В определенных вариантах осуществления локус цепи Igκ содержит интронный энхансер κ (E_κi) грызуна (например, крысы или мыши) или человека. В определенных вариантах осуществления локус IgH содержит 3’ энхансер κ (E_κ3’) грызуна (например, крысы или мыши) или человека.[0183] In some embodiments, the Igκ chain locus comprises human or rodent (eg, rat or mouse) regulatory elements. In some embodiments, the regulatory element is an endogenous regulatory element. In certain embodiments, the Igκ chain locus comprises a rodent (eg, rat or mouse) or human intronic enhancer κ (E _κi ). In certain embodiments, the IgH locus comprises a rodent (eg, rat or mouse) or human κ 3' enhancer ( _Eκ3' ).

[0184] В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления модифицированный локус цепи Igκ находится в трансгене, расположенном за пределами эндогенного локуса. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус цепи Igκ инактивирован (например, посредством делеции, перемещения и/или инверсии всего или части эндогенного локуса цепи Igκ).[0184] In some embodiments, the modified immunoglobulin κ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin κ chain locus. In some embodiments, the immunoglobulin κ chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin κ chain locus. In certain embodiments, the modified Igκ chain locus is located in a transgene located outside the endogenous locus. In some embodiments, the endogenous Igκ chain locus is inactivated (eg, through deletion, displacement, and/or inversion of all or part of the endogenous Igκ chain locus).

[0185] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов легкой цепи κ иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 0,5 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность константной области Igκ человека, кодирующую полипептид константного домена легкой цепи κ иммуноглобулина, вместо экзона константной области Igκ гена константной области Igκ так, чтобы указанная нуклеотидная последовательность константной области Igκ человека была функционально связана с энхансером и/или регуляторными областями указанного гена константной области Igκ.[0185] In some embodiments, the methods for creating engineered immunoglobulin κ light chain loci described herein include a DNA insert of about 0.5 kb that contains a human Igκ constant region nucleotide sequence encoding a light constant domain polypeptide. immunoglobulin κ chain instead of the Igκ constant region exon of the Igκ constant region gene so that said human Igκ constant region nucleotide sequence is operably linked to the enhancer and/or regulatory regions of said Igκ constant region gene.

[0186] В некоторых вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гетерозиготным в отношении модифицированного локуса цепи κ иммуноглобулина, описанного в данном документе. В определенных вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гомозиготным в отношении модифицированного локуса цепи κ иммуноглобулина, описанного в данном документе.[0186] In some embodiments, the rodent (eg, rat or mouse) is heterozygous for the modified immunoglobulin κ chain locus described herein. In certain embodiments, the rodent (eg, rat or mouse) is homozygous for the modified immunoglobulin κ chain locus described herein.

Гуманизированные локусы лямбда-цепи иммуноглобулина Humanized immunoglobulin lambda chain loci

[0187] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, мыши или крысы), содержащие генетически модифицированные локусы цепи Igλ. Такие локусы содержат генные сегменты вариабельной области цепи Igλ (т.е. по меньшей мере генный сегмент V_λ и генный сегмент J_λ). Модифицированный локус λ дополнительно содержит по меньшей мере один генный сегмент константной области Igλ (C_λ). В определенных вариантах осуществления генный сегмент V_λ и генный сегмент J_λ, такие как генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека, функционально связаны с C_λ человека таким образом, чтобы грызун (например, крыса или мышь) вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_λ. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент V_λ и генный сегмент J_λ являются неперестроенными генными сегментами V_λ и J_λ. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент V_λ и генный сегмент J_λ являются перестроенными генными сегментами V_λ и J_λ и, следовательно, находятся в форме перестроенного гена вариабельной области. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Ig_λ представляют собой генные сегменты вариабельной области человека. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Ig_λ представляют собой генные сегменты вариабельной области грызуна (например, генные сегменты вариабельной области крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления локус константной области Ig_λ содержит генный сегмент константной области λ, который является частично или полностью человеческим. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе локусы цепи Igλ расположены в эндогенном локусе цепи Igλ. Типовые вариабельные области, содержащие генные сегменты Igλ, приведены, например, в публикациях патентов США №№2012/0073004 и 2002/0088016 и заявке на патент США №15/803,513 (поданной 3 ноября 2017 г.; опубликованной как US 2018/0125043), которые все включены в данный документ посредством ссылки.[0187] In certain aspects, provided herein are rodents (eg, mice or rats) containing genetically modified Igλ chain loci. Such loci contain Igλ chain variable region gene segments (ie, at least a _Vλ gene segment and a _Jλ gene segment). The modified λ locus further contains at least one Igλ constant region ( _Cλ ) gene segment. In certain embodiments, a _Vλ gene segment and a _Jλ gene segment, such as a human _Vλ gene segment and a human _Jλ gene segment, are operably linked to human _Cλ such that a rodent (e.g., a rat or mouse) produces antibodies comprising light chain variable domains derived from the human _Vλ gene segment and the human _Jλ gene segment, and light chain constant domains derived from the _Cλ gene segment. In some embodiments, the _Vλ gene segment and the _Jλ gene segment are unrearranged _Vλ and _Jλ gene segments. In some embodiments, the _Vλ gene segment and the _Jλ gene segment are rearranged _Vλ and _Jλ gene segments and are therefore in the form of a rearranged variable region gene. In certain embodiments, the _Igλ variable region gene segments are human variable region gene segments. In certain embodiments, the _Igλ variable region gene segments are rodent variable region gene segments (eg, rat or mouse variable region gene segments). In some embodiments, the Ig _λ constant region locus comprises a λ constant region gene segment that is partially or fully human. In some embodiments, the Igλ chain loci described herein are located at an endogenous Igλ chain locus. Exemplary variable regions containing Igλ gene segments are shown, for example, in US Patent Publications Nos. 2012/0073004 and 2002/0088016 and US Patent Application No. 15/803,513 (filed November 3, 2017; published as US 2018/0125043) , all of which are incorporated herein by reference.

[0188] В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области Igλ, содержащий неперестроенные генные сегменты вариабельной области Igλ человека, также содержит межгенные последовательности вариабельной области Igλ человека. В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области Igλ содержит не принадлежащие человеку (например, принадлежащие грызуну, крысе, мыши) межгенные последовательности вариабельной области Igλ. В некоторых вариантах осуществления генный локус Igλ содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0188] In some embodiments, the Igλ variable region gene locus comprising unrearranged human Igλ variable region gene segments also contains intergenic human Igλ variable region sequences. In some embodiments, the Igλ variable region gene locus comprises non-human (eg, rodent, rat, mouse) intergenic Igλ variable region sequences. In some embodiments, the Igλ gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0189] Локус легкой цепи Igλ человека в некоторых вариантах осуществления содержит генетический материал из локуса легкой цепи Igλ человека. В некоторых вариантах осуществления локус легкой цепи Igλ человека, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере один генный сегмент V_λ человека, по меньшей мере один генный сегмент J_λ человека, по меньшей мере один генный сегмент C_λ человека, и одну или более последовательностей, необходимых для стимуляции перестройки (например, последовательностей сигнала рекомбинации) указанного по меньшей мере одного генного сегмента V_λ человека с указанным по меньшей мере одним генным сегментом J_λ человека с образованием функциональной перестроенной последовательности V_λ-J_λ человека, которая кодирует домен V_λ человека. Во многих вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека содержит некоторое количество генных сегментов V_λ человека и одну или более последовательностей, необходимых для стимуляции перестройки указанных генных сегментов V_λ человека с по меньшей мере одним генным сегментом J_λ человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека, описанная в данном документе, представляет собой геномную последовательность локуса легкой цепи Igλ человека (например, выделенную и/или клонированную из бактериальной искусственной хромосомы) и содержит некоторое количество генных сегментов V_λ человека в конфигурации зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека содержит последовательности V_λ, J_λ и C_λ человека в конфигурации зародышевой линии (т. е. в том виде, в котором указанные последовательности V_λ, J_λ и C_λ человека находятся в локусе легкой цепи Igλ в клетке человека, другими словами, последовательности J_λ и C_λ находятся в виде кластеров J_λ C_λ). В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека кодирует полипептид легкой цепи Igλ, полностью или частично, причем указанный полипептид легкой цепи Igλ находится в иммуноглобулине, в частности, иммуноглобулине, который экспрессирует B-клетка человека. Также предложены отличные от человека животные, эмбрионы, клетки и нацеленные конструкции для создания отличных от человека животных, отличных от человеческих эмбрионов и клеток, содержащих указанную последовательность легкой цепи Igλ человека вместо соответствующей не принадлежащей человеку последовательности легкой цепи Igλ (например, эндогенный локус легкой цепи Igλ грызуна).[0189] The human Igλ light chain locus, in some embodiments, comprises genetic material from the human Igλ light chain locus. In some embodiments, the human Igλ light chain locus described herein comprises at least one human _Vλ gene segment, at least one human _Jλ gene segment, at least one human _Cλ gene segment, and one or more sequences necessary to promote rearrangement (e.g., recombination signal sequences) of said at least one human V _λ gene segment with said at least one human J _λ gene segment to form a functional rearranged human V _λ -J _λ sequence that encodes a V domain _λ person. In many embodiments, the human Igλ light chain sequence comprises a number of human _Vλ gene segments and one or more sequences necessary to promote rearrangement of said human _Vλ gene segments with at least one human _Jλ gene segment. In some embodiments, the human Igλ light chain sequence described herein is the genomic sequence of the human Igλ light chain locus (e.g., isolated and/or cloned from a bacterial artificial chromosome) and contains a number of human _Vλ gene segments in a germline configuration . In some embodiments, the human Igλ light chain sequence comprises human _Vλ , _Jλ, and _Cλ sequences in a germline configuration (i.e., in the manner in which said human _Vλ , _Jλ, and _Cλ sequences are found at the light locus Igλ chains in a human cell, in other words, the J _λ and C _λ sequences are found in the form of clusters J _λ C _λ ). In some embodiments, the human Igλ light chain sequence encodes an Igλ light chain polypeptide, in whole or in part, wherein said Igλ light chain polypeptide is located in an immunoglobulin, particularly an immunoglobulin that is expressed by a human B cell. Non-human animals, embryos, cells, and targeting constructs are also provided for generating non-human animals, non-human embryos and cells containing a specified human Igλ light chain sequence in place of a corresponding non-human Igλ light chain sequence (e.g., an endogenous light chain locus rodent Igλ).

[0190] В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека вставлена вместо соответствующей не принадлежащей человеку последовательности легкой цепи Igλ в геноме зародышевой линии отличного от человека животного. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека вставлена выше не принадлежащей человеку последовательности легкой цепи Igλ (например, не принадлежащей человеку последовательности константной области легкой цепи Igλ). В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека вставлена посреди одной или более не принадлежащих человеку последовательностей легкой цепи Igλ так, чтобы последовательность легкой цепи Igλ человека находилась рядом с не принадлежащими человеку последовательностями легкой цепи Igλ.[0190] In some embodiments, a human Igλ light chain sequence is inserted in place of a corresponding non-human Igλ light chain sequence in the germline genome of a non-human animal. In some embodiments, a human Igλ light chain sequence is inserted upstream of a non-human Igλ light chain sequence (eg, a non-human Igλ light chain constant region sequence). In some embodiments, a human Igλ light chain sequence is inserted in the middle of one or more non-human Igλ light chain sequences such that the human Igλ light chain sequence is adjacent to non-human Igλ light chain sequences.

[0191] В определенных вариантах осуществления локус легкой цепи Igλ содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 20, 30 или 40 функциональных генных сегментов V_λ. В некоторых вариантах осуществления локус содержит генные сегменты V_λ человека V_λ3-10, V_λ3-9, V_λ2-8, V_λ4-3 и V_λ3-1. В некоторых вариантах осуществления локус содержит V_λ2-11, V_λ3-12, V_λ2-14, V_λ3-16, V_λ3-19, V3-21, V_λ3-22, V_λ2-23, V_λ3-25 и V_λ3-27. В некоторых вариантах осуществления локус содержит V_λ3-27, V_λ1-36, V_λ5-37, V_λ5-39, V_λ1-40, V_λ7-43, V_λ1-44, V_λ5-45, V_λ7-46, V_λ1-47, V_λ9-49, V_λ1-51 и V_λ5-52. В определенных вариантах осуществления локус содержит V_λ10-54, V_λ6-57, V_λ4-60, V_λ8-61 и V_λ4-69. В некоторых вариантах осуществления локус легкой цепи Igλ содержит одну или более пар J_λ-C_λ человека. Например, в определенных вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит J_λ1-C_λ1, J_λ2-C_λ2, J_λ3-C_λ3, J_λ6-C_λ6 и/или J_λ7-C_λ7 человека ниже генных сегментов V_λ человека. В некоторых вариантах осуществления локус цепи Ig_λ содержит J_λ1-C_λ1, J_λ2-C_λ2, J_λ3-C_λ3, J_λ6-C_λ6, человека J_λ7 человека и C_λ1 мыши ниже генных сегментов V_λ человека, как проиллюстрировано на Фиг. 2A.[0191] In certain embodiments, the Igλ light chain locus contains at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 20, 30, or 40 functional _Vλ gene segments. In some embodiments, the locus comprises human _Vλ gene segments _Vλ 3-10, _Vλ 3-9, _Vλ 2-8, _Vλ 4-3, and _Vλ 3-1. In some embodiments, the locus comprises _Vλ 2-11, _Vλ 3-12, Vλ 2-14, _{Vλ 3-16} , _Vλ 3-19, V3-21, _Vλ 3-22, _Vλ 2- 23, V _λ 3-25 and V _λ 3-27. In some embodiments, the locus comprises _Vλ 3-27, _Vλ 1-36, Vλ 5-37, _Vλ 5-39, _{Vλ 1-40} , _Vλ 7-43, _Vλ 1-44, _Vλ 5-45, _Vλ 7-46, _Vλ 1-47, _Vλ 9-49, _Vλ 1-51 and _Vλ 5-52. In certain embodiments, the locus comprises _Vλ 10-54, _Vλ 6-57, _Vλ 4-60, _Vλ 8-61, and _Vλ 4-69. In some embodiments, the Igλ light chain locus comprises one or more human _Jλ - _Cλ pairs. For example, in certain embodiments, the Igλ chain locus comprises J _λ 1-C _λ 1, J _λ 2-C _λ 2, J _λ 3-C _λ 3, J _λ 6-C _λ 6, and/or J _λ 7-C _λ 7 human downstream human V _λ gene segments. In some embodiments, the Ig _λ chain locus comprises J _λ 1-C _λ 1, J _λ 2-C _λ 2, J _λ 3-C _λ 3, J _λ 6-C _λ 6, human J _λ 7, and C _λ 1 mouse downstream of the human _Vλ gene segments, as illustrated in FIG. 2A.

[0192] В некоторых вариантах осуществления локус Igλ представляет собой перестроенный локус, содержащий ген вариабельной области Igλ (универсальной вариабельной области легкой цепи). В некоторых вариантах осуществления ген перестроенной вариабельной области Igλ представляет собой ген перестроенной вариабельной области Igλ человека. Применение универсальных вариабельных областей легкой цепи облегчает создание биспецифических антител, в которых по меньшей мере один антигенсвязывающий домен обладает связыванием. Примеры перестроенных вариабельных областей легкой цепи Ig приведены в публикации патента США №2013/0185821, которая включена в данный документ посредством ссылки.[0192] In some embodiments, the Igλ locus is a rearranged locus containing an Igλ variable region (universal light chain variable region) gene. In some embodiments, the rearranged Igλ variable region gene is a rearranged human Igλ variable region gene. The use of universal light chain variable regions facilitates the creation of bispecific antibodies in which at least one antigen binding domain has binding properties. Examples of rearranged Ig light chain variable regions are provided in US Patent Publication No. 2013/0185821, which is incorporated herein by reference.

[0193] В некоторых вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит регуляторные элементы человека или грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент представляет собой эндогенный регуляторный элемент. В определенных вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит энхансер 2.4 λ грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит 3’ энхансер λ человека или грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит энхансер 3.1 λ грызуна (например, крысы или мыши).[0193] In some embodiments, the Igλ chain locus comprises human or rodent (eg, rat or mouse) regulatory elements. In some embodiments, the regulatory element is an endogenous regulatory element. In certain embodiments, the Igλ chain locus comprises a rodent (eg, rat or mouse) 2.4λ enhancer. In some embodiments, the Igλ chain locus comprises a human or rodent (eg, rat or mouse) 3' λ enhancer. In some embodiments, the Igλ chain locus comprises a rodent (eg, rat or mouse) 3.1λ enhancer.

[0194] В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления модифицированный локус цепи Igλ находится в трансгене, расположенном за пределами эндогенного локуса. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус цепи Igλ инактивирован (например, посредством делеции, перемещения и/или инверсии всего или части эндогенного локуса цепи Igλ).[0194] In some embodiments, the modified immunoglobulin λ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin λ chain locus. In some embodiments, the immunoglobulin λ chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin λ chain locus. In certain embodiments, the modified Igλ chain locus is located in a transgene located outside the endogenous locus. In some embodiments, the endogenous Igλ chain locus is inactivated (eg, through deletion, displacement, and/or inversion of all or part of the endogenous Igλ chain locus).

[0195] В некоторых вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гетерозиготным в отношении модифицированного локуса цепи λ иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гомозиготным в отношении модифицированного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0195] In some embodiments, the rodent (eg, rat or mouse) is heterozygous for the modified immunoglobulin λ chain locus. In certain embodiments, the rodent (eg, rat or mouse) is homozygous for the modified immunoglobulin λ chain locus.

[0196] В некоторых вариантах осуществления отличный от человека организм содержит в зародышевой линии и/или геноме локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий ограниченный репертуар генных сегментов вариабельной области легкой цепи (например, вариабельной области двойной легкой цепи, содержащей два генных сегмента вариабельной области легкой цепи). В некоторых вариантах осуществления генные сегменты легкой цепи в ограниченном репертуаре генных сегментов легкой цепи представляют собой генные сегменты легкой цепи человека. Примеры вариабельных областей двойной легкой цепи приведены в публикации патента США №2013/0198880, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления отличный от человека организм, содержащий вариабельную область двойной легкой цепи, используют для выработки биспецифических антител.[0196] In some embodiments, the non-human organism contains in the germline and/or genome an immunoglobulin light chain locus containing a limited repertoire of light chain variable region gene segments (e.g., a double light chain variable region containing two light chain variable region gene segments ). In some embodiments, the light chain gene segments in the limited repertoire of light chain gene segments are human light chain gene segments. Examples of double light chain variable regions are provided in US Patent Publication No. 2013/0198880, which is incorporated herein by reference. In some embodiments, a non-human organism containing a double light chain variable region is used to generate bispecific antibodies.

Гуманизированные локусы CD79a и CD79bHumanized CD79a and CD79b loci

[0197] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны (например, крысы или мыши) содержат человеческие или гуманизированные локусы альфа-цепи белка, связанного с комплексом B-клеточного антиген-распознающего рецептора (CD79a или Igα), и/или бета-цепи белка, связанного с комплексом B-клеточного антиген-распознающего рецептора (CD79b или Igβ). Грызуны, которые содержат человеческие или гуманизированные гены CD79a и CD79b, экспрессируют человеческие или гуманизированные полипептиды CD79a и CD79b в виде гетеродимеров на поверхности B-клеток, которые нековалентно связываются с экспрессируемыми на мембране иммуноглобулинами с образованием B-клеточного рецептора (BCR, нагл. «B cell receptor»). BCR связывается с антигеном и принимает участие в передаче сигналов и интернализации после связывания с антигеном. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны содержат человеческие или гуманизированные гены CD79a и CD79b. В некоторых определенных вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны дополнительно содержат ген CD79a, который содержит часть CD79a грызуна и часть CD79a человека, и ген CD79b, который содержит часть CD79b грызуна и часть CD79b человека, при этом часть CD79a человека кодирует практически весь внеклеточный домен полипептида CD79a человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 33-143 полипептида CD79a человека), а часть CD79b человека кодирует практически весь внеклеточный домен полипептида CD79b человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 29-159 полипептида CD79b человека). В некоторых вариантах осуществления каждая из частей CD79a и CD79b кодирует по меньшей мере внутриклеточный домен эндогенных полипептидов CD79a и CD79b, соответственно; в некоторых определенных вариантах осуществления - трансмембранный и внутриклеточный домены эндогенных полипептидов CD79a и CD79b, соответственно. В некоторых вариантах осуществления человеческая и эндогенная части функционально связаны с эндогенными промоторами CD79a и CD79b, соответственно.[0197] In some embodiments, rodents (e.g., rats or mice) described herein contain human or humanized B cell antigen recognition receptor complex-related protein alpha chain (CD79a or Igα) and/or beta chain loci protein chain associated with the B-cell antigen recognition receptor complex (CD79b or Igβ). Rodents that contain human or humanized CD79a and CD79b genes express human or humanized CD79a and CD79b polypeptides as heterodimers on the surface of B cells that bind non-covalently to membrane-expressed immunoglobulins to form the B cell receptor (BCR, apt. "B" cell receptor"). The BCR binds to antigen and is involved in signaling and internalization following antigen binding. In some embodiments, the rodents described herein contain human or humanized CD79a and CD79b genes. In certain certain embodiments, rodents described herein further comprise a CD79a gene that contains a portion of a rodent CD79a and a portion of a human CD79a, and a CD79b gene that contains a portion of a rodent CD79b and a portion of a human CD79b, wherein the human CD79a portion encodes substantially the entire extracellular domain of the polypeptide human CD79a (eg, amino acids corresponding to residues 33-143 of the human CD79a polypeptide), and a portion of human CD79b encodes substantially the entire extracellular domain of the human CD79b polypeptide (eg, amino acids corresponding to residues 29-159 of the human CD79b polypeptide). In some embodiments, the CD79a and CD79b portions each encode at least an intracellular domain of the endogenous CD79a and CD79b polypeptides, respectively; in some certain embodiments, the transmembrane and intracellular domains of the endogenous CD79a and CD79b polypeptides, respectively. In some embodiments, the human and endogenous portions are operably linked to the endogenous CD79a and CD79b promoters, respectively.

[0198] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны дополнительно содержат химерный ген CD79a, который содержит часть CD79a грызуна и часть CD79a человека, при этом часть CD79a человека кодирует последовательность, содержащую аминокислоты, соответствующие остаткам 33-116 полипептида CD79a человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 33-119 полипептида CD79a человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 33-143 полипептида CD79a человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 33-165 полипептида CD79a человека. В некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79a содержит домен, подобный C2 Ig человека; в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79a также содержит стеблевую область человека; в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79a также содержит трансмембранный домен человека; и в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79a дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна (например, мыши). В некоторых вариантах осуществления грызун содержит химерный ген CD79a, содержащий часть человеческой области, описанную в данном документе, и последовательность, кодирующую сигнальный пептид CD79a человека или грызуна (например, мыши); в одном варианте осуществления последовательность, кодирующая сигнальный пептид, представляет собой последовательность CD79a мыши, кодирующую аминокислоты 1-28 CD79a мыши.[0198] In some embodiments, the rodents described herein further comprise a chimeric CD79a gene that contains a portion of a rodent CD79a and a portion of a human CD79a, wherein the portion of human CD79a encodes a sequence comprising amino acids corresponding to residues 33-116 of the human CD79a polypeptide in one in one embodiment, it encodes the sequence comprising amino acids 33-119 of the human CD79a polypeptide, in one embodiment it encodes the sequence comprising amino acids 33-143 of the human CD79a polypeptide, in one embodiment it encodes the sequence comprising amino acids 33-165 of the human CD79a polypeptide. In some embodiments, the chimeric CD79a polypeptide comprises a human Ig C2-like domain; in some embodiments, the chimeric CD79a polypeptide also contains a human stem region; in some embodiments, the chimeric CD79a polypeptide also contains a human transmembrane domain; and in some embodiments, the chimeric CD79a polypeptide further comprises a rodent (eg, mouse) cytoplasmic domain. In some embodiments, the rodent comprises a chimeric CD79a gene comprising a portion of the human region described herein and a sequence encoding a human or rodent (eg, mouse) CD79a signal peptide; in one embodiment, the signal peptide coding sequence is a mouse CD79a sequence encoding amino acids 1-28 of mouse CD79a.

[0199] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны дополнительно содержат химерный ген CD79b, который содержит часть CD79b грызуна и часть CD79b человека, при этом часть CD79b человека кодирует последовательность, содержащую аминокислоты, соответствующие остаткам 29-135 полипептида CD79b человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 29-159 полипептида CD79b человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 29-184 полипептида CD79b человека. В некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79b содержит домен, подобный V Ig человека; в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79b также содержит стеблевую область человека; в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79b также содержит трансмембранный домен человека; и в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79b дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна (например, мыши). В некоторых вариантах осуществления грызун содержит химерный ген CD79b, содержащий часть человеческой области, описанную в данном документе, и последовательность, кодирующую сигнальный пептид CD79b человека или грызуна (например, мыши); в одном варианте осуществления последовательность, кодирующая сигнальный пептид, представляет собой последовательность CD79b мыши, кодирующую аминокислоты 1-25 CD79b мыши.[0199] In some embodiments, the rodents described herein further comprise a chimeric CD79b gene that contains a portion of a rodent CD79b and a portion of a human CD79b, wherein the portion of a human CD79b encodes a sequence comprising amino acids corresponding to residues 29-135 of the human CD79b polypeptide in one in one embodiment, it encodes the sequence comprising amino acids 29-159 of the human CD79b polypeptide; in one embodiment, it encodes the sequence comprising amino acids 29-184 of the human CD79b polypeptide. In some embodiments, the chimeric CD79b polypeptide comprises a human Ig V-like domain; in some embodiments, the chimeric CD79b polypeptide also contains a human stem region; in some embodiments, the chimeric CD79b polypeptide also contains a human transmembrane domain; and in some embodiments, the chimeric CD79b polypeptide further comprises a rodent (eg, mouse) cytoplasmic domain. In some embodiments, the rodent comprises a chimeric CD79b gene comprising a portion of the human region described herein and a sequence encoding a human or rodent (eg, mouse) CD79b signal peptide; in one embodiment, the signal peptide coding sequence is a mouse CD79b sequence encoding amino acids 1-25 of mouse CD79b.

[0200] Под номерами доступа GenBank №№ NP_001774.1, NM_001783.3, NP_067612.1 и NM_021601.3 и UniProt ID P11912 приведены репрезентативные последовательности-источники гена CD79A человека и полипептида CD79A человека, из которых можно получить необходимую человеческую часть. Под номерами доступа GenBank №№ NP_000617.1, NM_000626.2, NP_001035022.1, NM_001039933.1, NP_067613.1 и NM_021602.2 и UniProt ID P40259 приведены репрезентативные последовательности-источники гена CD79B человека и полипептида CD79B человека, из которых можно получить необходимую человеческую часть.[0200] GenBank accession numbers NP_001774.1, NM_001783.3, NP_067612.1 and NM_021601.3 and UniProt ID P11912 provide representative source sequences of the human CD79A gene and human CD79A polypeptide from which the required human portion can be obtained. GenBank accession numbers NP_000617.1, NM_000626.2, NP_001035022.1, NM_001039933.1, NP_067613.1 and NM_021602.2 and UniProt ID P40259 provide representative source sequences of the human CD79B gene and human CD79B polypeptide , from which one can obtain the necessary human part.

[0201] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) дополнительно содержат один или более генов CD79A и CD79B человека, описанных в публикациях патентов США №№ 2011-0093963 A1 и 2009-0053210 A1; публикации заявки на Международный патент № WO 2008/027986; и Европейском патенте №2064325 B1, которые все включены в данный документ посредством ссылки. В некоторых определенных вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат гуманизированный ген CD79a, который содержит часть эндогенного CD79a и часть CD79a человека, и гуманизированный ген CD79b, который содержит часть эндогенного CD79b и часть CD79b человека, при этом часть CD79a человека кодирует практически весь внеклеточный домен полипептида CD79a человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 33-143 полипептида CD79a человека), а часть CD79b человека кодирует практически весь внеклеточный домен полипептида CD79b человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 29-159 полипептида CD79b человека). В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат гуманизированный ген CD79a, который содержит часть эндогенного CD79a и часть CD79a человека, и гуманизированный ген CD79b, который содержит часть эндогенного CD79b и часть CD79b человека, при этом часть CD79a человека кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 33-116 (например, последовательность, содержащую аминокислоты 33-119, последовательность, содержащую аминокислоты 33-143, или последовательность, содержащую аминокислоты 33-165 полипептида CD79a человека), а часть CD79b человека кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 29-135 (например, последовательность, содержащую аминокислоты 29-159, или последовательность, содержащую аминокислоты 29-184 полипептида CD79a человека). В некоторых вариантах осуществления эндогенные части CD79a и CD79b, каждая, кодируют по меньшей мере внутриклеточный домен эндогенных полипептидов CD79a и CD79b, соответственно; в некоторых определенных вариантах осуществления - трансмембранный и внутриклеточный домены эндогенных полипептидов CD79a и CD79b, соответственно.[0201] In some embodiments, rodents (eg, mice or rats) provided herein further contain one or more of the human CD79A and CD79B genes described in US Patent Publications Nos. 2011-0093963 A1 and 2009-0053210 A1; publication of the application for International Patent No. WO 2008/027986; and European Patent No. 2064325 B1, all of which are incorporated herein by reference. In certain certain embodiments, rodents provided herein contain a humanized CD79a gene that contains a portion of endogenous CD79a and a portion of human CD79a, and a humanized CD79b gene that contains a portion of endogenous CD79b and a portion of human CD79b, wherein the human CD79a portion encodes substantially the entire extracellular domain human CD79a polypeptide (e.g., amino acids corresponding to residues 33-143 of the human CD79a polypeptide), and the human CD79b portion encodes substantially the entire extracellular domain of the human CD79b polypeptide (e.g., amino acids corresponding to residues 29-159 of the human CD79b polypeptide). In some embodiments, rodents provided herein contain a humanized CD79a gene that contains a portion of endogenous CD79a and a portion of human CD79a, and a humanized CD79b gene that contains a portion of endogenous CD79b and a portion of human CD79b, wherein the portion of human CD79a encodes a sequence comprising amino acids 33 -116 (e.g., the sequence containing amino acids 33-119, the sequence containing amino acids 33-143, or the sequence containing amino acids 33-165 of the human CD79a polypeptide), and the human CD79b portion encodes the sequence containing amino acids 29-135 (e.g., the sequence , containing amino acids 29-159, or the sequence containing amino acids 29-184 of the human CD79a polypeptide). In some embodiments, the endogenous portions of CD79a and CD79b each encode at least an intracellular domain of the endogenous CD79a and CD79b polypeptides, respectively; in some certain embodiments, the transmembrane and intracellular domains of the endogenous CD79a and CD79b polypeptides, respectively.

Гуманизированные локусы неонатального Fc-рецептораHumanized neonatal Fc receptor loci

[0202] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) экспрессируют и/или содержат в геноме гуманизированный или человеческий локус неонатального Fc-рецептора (FcRn). FcRn, также известный как рецептор Брамбелла, представляет собой белок, который экспрессируется эндотелиальными клетками и ассоциирует с бета-2-микроглобулином (β2M), и связывается как с Fc-доменами антител IgG, так и с сывороточным альбумином. FcRn продлевает время полужизни IgG и сывороточного альбумина. В частности, за счет связывания IgG и сывороточного альбумина pH-зависимым образом FcRn способен защищать сывороточные белки от лизосомной деградации эндотелиальными клетками, тем самым повышая сывороточное время полужизни таких белков.[0202] In some embodiments, rodents (eg, mice or rats) provided herein express and/or contain in their genome a humanized or human neonatal Fc receptor (FcRn) locus. FcRn, also known as the Brambell receptor, is a protein that is expressed by endothelial cells and associates with beta-2-microglobulin (β2M), and binds to both the Fc domains of IgG antibodies and serum albumin. FcRn prolongs the half-life of IgG and serum albumin. In particular, by binding IgG and serum albumin in a pH-dependent manner, FcRn is able to protect serum proteins from lysosomal degradation by endothelial cells, thereby increasing the serum half-life of such proteins.

[0203] В некоторых вариантах осуществления локус FcRn содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcRn содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcRn содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен человека (например, мыши или крысы).[0203] In some embodiments, the FcRn locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide comprising a human extracellular domain, a rodent (eg, mouse or rat) transmembrane domain, and a rodent (eg, mouse or rat) cytoplasmic domain. In some embodiments, the FcRn locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide comprising a human extracellular domain, a human (eg, mouse or rat) transmembrane domain, and a rodent (eg, mouse or rat) cytoplasmic domain. In some embodiments, the FcRn locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide comprising a human extracellular domain, a human (eg, mouse or rat) transmembrane domain, and a human (eg, mouse or rat) cytoplasmic domain.

[0204] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен в эндогенном локусе FcRn, замещена последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточный домен FcRn человека, так что грызун, содержащий такой локус, экспрессирует FcRn с внеклеточным доменом человека и трансмембранным и цитоплазматическим доменом грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует FcRn грызуна или не экспрессирует функциональный FcRn грызуна. В некоторых вариантах осуществления генный локус FcRn содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0204] In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the FcRn polypeptide is located at an endogenous rodent FcRn locus. In certain embodiments, the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent FcRn gene. For example, in some embodiments, a nucleic acid sequence encoding an extracellular domain at an endogenous FcRn locus is replaced with a nucleic acid sequence encoding an extracellular domain of a human FcRn such that a rodent containing such locus expresses an FcRn with a human extracellular domain and a rodent transmembrane and cytoplasmic domain ( e.g. rats or mice). In some embodiments, the rodent does not express a rodent FcRn or does not express a functional rodent FcRn. In some embodiments, the FcRn gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0205] В определенных вариантах осуществления мышиные экзоны, кодирующие домены альфа 1, альфа 2 и альфа 3 (экзоны 3, 4 и 5, которые являются первыми тремя кодирующими экзонами) гена FcRn мыши, замещены человеческими экзонами, кодирующими домены альфа 1, альфа 2 и альфа 3 (экзоны 3, 4 и 5) гена FcRn человека (смотрите Фиг. 4). В некоторых вариантах осуществления ген FcRn содержит мышиный экзон 1 (некодирующий экзон), мышиный экзон 2 (содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид) и человеческие экзоны 3-6, мышиные экзоны 6 и 7 (кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены). В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность гуманизированного FcRn, кодируемая локусом, представляет собой SEQ ID NO: 16.[0205] In certain embodiments, the mouse exons encoding the alpha 1, alpha 2, and alpha 3 domains (exons 3, 4, and 5, which are the first three coding exons) of the mouse FcRn gene are replaced with human exons encoding the alpha 1, alpha 2 domains and alpha 3 (exons 3, 4 and 5) of the human FcRn gene (see Fig. 4). In some embodiments, the FcRn gene comprises mouse exon 1 (a non-coding exon), mouse exon 2 (containing a nucleic acid sequence encoding a signal peptide), and human exons 3-6, mouse exons 6 and 7 (encoding transmembrane and cytoplasmic domains). In some embodiments, the amino acid sequence of the humanized FcRn encoded by the locus is SEQ ID NO: 16.

[0206] Под номерами доступа NC_000019.10 (49512279-49526428), NM_001136019.1 и NP_001129491.1 приведены репрезентативные последовательности-источники гена, кДНК и полипептида FcRn человека, из которых можно получить необходимую человеческую часть. Под номерами доступа NC_000073.6 (45092992-45103846), NM_010189.1 и NP_034319.1 приведены репрезентативные последовательности-источники гена, кДНК и полипептида FcRn мыши, из которых можно получить необходимую мышиную часть и/или которые можно использовать при конструировании плеч гомологии нацеленного вектора.[0206] Accession numbers NC_000019.10 (49512279-49526428), NM_001136019.1 and NP_001129491.1 provide representative human FcRn gene, cDNA and polypeptide source sequences from which the required human part can be obtained. Accession numbers NC_000073.6 (45092992-45103846), NM_010189.1 and NP_034319.1 provide representative source sequences of the mouse FcRn gene, cDNA and polypeptide from which the required mouse portion can be obtained and/or which can be used in the construction of homology targeting arms vector.

[0207] В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcRn. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcRn.[0207] In some embodiments, the rodent is heterozygous for the genetically modified FcRn locus. In some embodiments, the rodent is homozygous for the genetically modified FcRn locus.

Гуманизированный β-2-микроглобулинHumanized β-2-microglobulin

[0208] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе генетически модифицированные грызуны (например, крысы или мыши) и ЭС-клетки экспрессируют и/или содержат в геноме локус, кодирующий полипептид гуманизированного β-2-микроглобулина (β2M). β2M представляет собой полипептид, в котором отсутствует трансмембранная область и который связывается с FcRn и молекулами ГКГС класс I.[0208] In some embodiments, the genetically modified rodents (eg, rats or mice) and ES cells described herein express and/or contain in the genome a locus encoding a humanized β-2-microglobulin (β2M) polypeptide. β2M is a polypeptide that lacks the transmembrane region and binds to FcRn and MHC class I molecules.

[0209] В некоторых вариантах осуществления локус β2M содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид β2M человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид β2M человека, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид β2M замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует β2M грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид β2M грызуна. В некоторых вариантах осуществления генный локус β2M содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0209] In some embodiments, the β2M locus comprises a nucleic acid sequence encoding a human β2M polypeptide. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human β2M polypeptide is located at an endogenous rodent β2M locus. In certain embodiments, the nucleic acid sequence encoding the β2M polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent β2M gene. In some embodiments, the rodent does not express rodent β2M or does not express a functional rodent β2M polypeptide. In some embodiments, the β2M gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0210] Гуманизированные полипептиды β2M, локусы, кодирующие гуманизированные полипептиды β2M, и отличные от человека животные, экспрессирующие гуманизированные полипептиды β2M, описаны в публикациях патентов США №№2013/0111617 и 2013/0185819, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Таким образом, как описано в публикациях патентов США №№2013/0111617 и 2013/0185819, в некоторых вариантах осуществления отличные от человека животные (например, мыши) содержат гуманизированный ген β2M, причем указанный ген содержит экзоны 2, 3 и 4 гена β2M человека, а в некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген β2M содержит экзон 1 не принадлежащего человеку (например, мышиного) гена β2M. Гуманизированный локус β2M схематически изображен на Фиг. 5. В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса β2M. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса β2M.[0210] Humanized β2M polypeptides, loci encoding humanized β2M polypeptides, and non-human animals expressing humanized β2M polypeptides are described in US Patent Publications Nos. 2013/0111617 and 2013/0185819, each of which is incorporated herein by reference. Thus, as described in US Patent Publications Nos. 2013/0111617 and 2013/0185819, in some embodiments, non-human animals (e.g., mice) contain a humanized β2M gene, wherein said gene comprises exons 2, 3, and 4 of the human β2M gene and in some embodiments, the humanized β2M gene comprises exon 1 of a non-human (eg, mouse) β2M gene. The humanized β2M locus is schematically depicted in FIG. 5. In some embodiments, the rodent is heterozygous for the genetically modified β2M locus. In some embodiments, the rodent is homozygous for the genetically modified β2M locus.

Гуманизированный Fc-эпсилон-рецептор 1 альфаHumanized Fc epsilon receptor 1 alpha

[0211] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) экспрессируют и/или содержат в геноме гуманизированный или человеческий локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α). FcεR1α связывается с FcεR1β и FcεR1γ с образованием FcεR1, высокоаффинного рецептора для IgE, который экспрессируется на эпидермальных клетках Лангерганса, эозинофилах, тучных клетках и базофилах. Сайт связывания IgE в FcεR1 находится в субъединице FcεR1α.[0211] In some embodiments, rodents (eg, mice or rats) provided herein express and/or contain in their genome a humanized or human Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus. FcεR1α binds to FcεR1β and FcεR1γ to form FcεR1, a high-affinity receptor for IgE that is expressed on epidermal Langerhans cells, eosinophils, mast cells, and basophils. The IgE binding site in FcεR1 is located in the FcεR1α subunit.

[0212] В некоторых вариантах осуществления локус FcεR1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcεR1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcεR1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека. Пример варианта осуществления сконструированного локуса FcεR1α проиллюстрирован на Фиг. 9.[0212] In some embodiments, the FcεR1α locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide comprising a human extracellular domain, a rodent (eg, mouse or rat) transmembrane domain, and a rodent (eg, mouse or rat) cytoplasmic domain. In some embodiments, the FcεR1α locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide comprising a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a rodent (eg, mouse or rat) cytoplasmic domain. In some embodiments, the FcεR1α locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide comprising a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain. An example embodiment of an engineered FcεR1α locus is illustrated in FIG. 9.

[0213] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α человека, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен в эндогенном локусе FcεR1α, замещена последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточный домен FcεR1α человека, так что грызун, содержащий такой локус, экспрессирует FcεR1α с внеклеточным доменом человека и трансмембранным и цитоплазматическим доменом грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека, замещает весь или часть эндогенного локуса FcεR1α грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна или не экспрессирует функциональный FcεR1α грызуна. В некоторых вариантах осуществления генный локус FcεR1α содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0213] In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human FcεR1α polypeptide is located at an endogenous rodent FcεR1α locus. In certain embodiments, the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent FcεR1α gene. For example, in some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain at the endogenous FcεR1α locus is replaced with a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcεR1α, such that a rodent containing such locus expresses FcεR1α with the human extracellular domain and the rodent transmembrane and cytoplasmic domain ( e.g. rats or mice). In some embodiments, a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide comprising a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain is located at the endogenous rodent FcεR1α locus. In some embodiments, a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide comprising a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain replaces all or a portion of the endogenous rodent FcεR1α locus. In some embodiments, the rodent does not express rodent FcεR1α or does not express functional rodent FcεR1α. In some embodiments, the FcεR1α gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0214] В определенных вариантах осуществления часть мышиного кодирующего экзона 1, кодирующего экзона 2, кодирующего экзона 3, кодирующего экзона 4 и кодирующего экзона 5 FcεRIα мыши замещены частью человеческого кодирующего экзона 1, кодирующего экзона 2, кодирующего экзона 3, кодирующего экзона 4 и кодирующего экзона 5 гена FcεRIα человека. В некоторых вариантах осуществления ген FcεRIα содержит химерный мышиный/человеческий экзон 1 (содержащий мышиный промотор и 5’ НТО), человеческие кодирующие экзоны 2-5 до стоп-кодона, человеческие 3’ НТО и полиА, за которыми идут мышиные 3' НТО и полиА. В некоторых вариантах осуществления экзоны 1 (частично) и 2 химерного гена кодируют сигнальный пептид, экзоны 3 и 4 кодируют два Ig-подобных домена FcεRIα, которые, как считается, взаимодействуют с IgE, а экзон 5 кодирует цитоплазматический и трансмембранный домены белка (смотрите Фиг. 9).[0214] In certain embodiments, a portion of mouse coding exon 1, coding exon 2, coding exon 3, coding exon 4, and coding exon 5 of mouse FcεRIα is replaced with a portion of human coding exon 1, coding exon 2, coding exon 3, coding exon 4, and coding exon 5 of the human FcεRIα gene. In some embodiments, the FcεRIα gene comprises a chimeric mouse/human exon 1 (containing the mouse promoter and 5' UTR), human coding exons 2-5 up to the stop codon, human 3' UTR and polyA, followed by mouse 3' UTR and polyA . In some embodiments, exons 1 (partially) and 2 of the chimeric gene encode a signal peptide, exons 3 and 4 encode two Ig-like domains of FcεRIα that are thought to interact with IgE, and exon 5 encodes the cytoplasmic and transmembrane domains of the protein (see FIG. . 9).

[0215] Под номерами доступа NC_000001.11 (159283888-159308224), NM_002001.3 и NP_001992.1 приведены репрезентативные последовательности-источники гена, кДНК и полипептида FcεR1α человека, из которых можно получить необходимую человеческую часть. Под номерами доступа NC_000067.6 (173221269-173227232), NM_010184.1 и NP_034314.1 приведены репрезентативные последовательности-источники гена, кДНК и полипептида FcεR1α мыши, из которых можно получить необходимую мышиную часть и/или которые можно использовать при конструировании плеч гомологии нацеленного вектора.[0215] Accession numbers NC_000001.11 (159283888-159308224), NM_002001.3 and NP_001992.1 provide representative source sequences of the human FcεR1α gene, cDNA and polypeptide from which the required human part can be obtained. Accession numbers NC_000067.6 (173221269-173227232), NM_010184.1 and NP_034314.1 provide representative source sequences of the mouse FcεR1α gene, cDNA and polypeptide from which the required mouse part can be obtained and/or which can be used in the construction of homology targeting arms vector.

[0216] В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcεR1α. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcεR1α.[0216] In some embodiments, the rodent is heterozygous for the genetically modified FcεR1α locus. In some embodiments, the rodent is homozygous for the genetically modified FcεR1α locus.

Гуманизированный Fc-гамма-рецептор 1aHumanized Fc gamma receptor 1a

[0217] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) экспрессируют и/или содержат в геноме гуманизированный или человеческий локус Fc-гамма-рецептор 1a (FcγR1a, часто обозначаемый FcγR1 на фигурах). FcγR1a представляет собой высокоаффинный белок FcγR, экспрессируемый на моноцитах, который связывается с Fc-частью IgG и вызывает активацию клетки-хозяина.[0217] In some embodiments, rodents (eg, mice or rats) provided herein express and/or contain in their genome a humanized or human Fc gamma receptor 1a locus (FcγR1a, often referred to as FcγR1 in the figures). FcγR1a is a high-affinity FcγR protein expressed on monocytes that binds to the Fc portion of IgG and causes host cell activation.

[0218] В некоторых вариантах осуществления локус FcγR1a содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcγR1a содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcγR1a содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен человека (например, мыши или крысы). [0218] In some embodiments, the FcγR1a locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide comprising a human extracellular domain, a rodent (eg, mouse or rat) transmembrane domain, and a rodent (eg, mouse or rat) cytoplasmic domain. In some embodiments, the FcγR1a locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide comprising a human extracellular domain, a human (eg, mouse or rat) transmembrane domain, and a rodent (eg, mouse or rat) cytoplasmic domain. In some embodiments, the FcγR1a locus comprises a nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide comprising a human extracellular domain, a human (eg, mouse or rat) transmembrane domain, and a human (eg, mouse or rat) cytoplasmic domain.

[0219] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a замещает весь или часть эндогенного гена FcγR1a грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен в эндогенном локусе FcγR1a, замещена последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточный домен FcεR1α человека, так что грызун, содержащий такой локус, экспрессирует FcγR1a с внеклеточным доменом человека и трансмембранным и цитоплазматическим доменом грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует FcγR1a грызуна или не экспрессирует функциональный FcγR1a грызуна. В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγR1a содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0219] In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide is located at the endogenous rodent FcγR1a locus. In certain embodiments, the nucleic acid sequence encoding the FcγR1a polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent FcγR1a gene. For example, in some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain at the endogenous FcγR1a locus is replaced with a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcεR1α such that a rodent containing such locus expresses FcγR1a with the human extracellular domain and the rodent transmembrane and cytoplasmic domain ( e.g. rats or mice). In some embodiments, the rodent does not express rodent FcγR1a or does not express functional rodent FcγR1a. In some embodiments, the FcγR1a gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0220] Гуманизированные полипептиды FcγR1a, локусы, кодирующие гуманизированные полипептиды FcγR1a, и отличные от человека животные, экспрессирующие гуманизированные полипептиды FcγR1a, описаны в патенте США №9474255 и публикации патента США №2017/0086432, которые включены в данный документ посредством ссылки.[0220] Humanized FcγR1a polypeptides, loci encoding humanized FcγR1a polypeptides, and non-human animals expressing humanized FcγR1a polypeptides are described in U.S. Patent No. 9,474,255 and U.S. Patent Publication No. 2017/0086432, which are incorporated herein by reference.

[0221] В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcγR1a. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcγR1a.[0221] In some embodiments, the rodent is heterozygous for the genetically modified FcγR1a locus. In some embodiments, the rodent is homozygous for the genetically modified FcγR1a locus.

Гуманизированные низкоаффинные Fc-гамма-рецепторыHumanized Low Affinity Fc Gamma Receptors

[0222] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе генетически модифицированные грызуны (например, крысы или мыши) и ЭС-клетки экспрессируют и/или содержат в геноме локус, кодирующий, полипептид человеческого низкоаффинного Fc-гамма-рецептора (FcγR) (например, полипептид FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa или FcγRIIIb человека).[0222] In some embodiments, the genetically modified rodents (e.g., rats or mice) and ES cells described herein express and/or contain in the genome a locus encoding a human low-affinity Fc gamma receptor (FcγR) polypeptide (e.g., human FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa or FcγRIIIb polypeptide).

[0223] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIa человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIa человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIa замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В конкретном варианте осуществления ген FcγRIIa человека содержит полиморфизм, причем полиморфизм выбран из полиморфизма с низким уровнем ответа 131His и полиморфизма с высоким уровнем ответа 131Arg. В конкретном варианте осуществления полиморфизм FcγRIIa представляет собой полиморфизм с низким уровнем ответа 131His. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIa содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0223] In some embodiments, the low-affinity FcγR locus comprises a nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIa polypeptide. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIa polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus. In certain embodiments, the nucleic acid sequence encoding the FcγRIIa polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent low-affinity FcγR locus. In a specific embodiment, the human FcγRIIa gene contains a polymorphism, wherein the polymorphism is selected from a 131His low response polymorphism and a 131Arg high response polymorphism. In a specific embodiment, the FcγRIIa polymorphism is a 131His low response polymorphism. In some embodiments, the rodent does not express a low-affinity rodent FcγR polypeptide (e.g., does not express a rodent FcγRIIb, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide or does not express a functional rodent FcγRIIb, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide). In some embodiments, the FcγRIIa gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0224] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIb человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIb человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIb замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В конкретном варианте осуществления ген FcγRIIb человека содержит аминокислотную замену, причем замена выбрана из замены 187Ile или 187Thr. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIb содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0224] In some embodiments, the low-affinity FcγR locus comprises a nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIb polypeptide. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIb polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus. In certain embodiments, the nucleic acid sequence encoding the FcγRIIb polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent low-affinity FcγR locus. In a specific embodiment, the human FcγRIIb gene contains an amino acid substitution, wherein the substitution is selected from the 187Ile or 187Thr substitution. In some embodiments, the rodent does not express a low-affinity rodent FcγR polypeptide (e.g., does not express a rodent FcγRIIb, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide or does not express a functional rodent FcγRIIb, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide). In some embodiments, the FcγRIIb gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0225] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIc человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIc человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIc замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В одном варианте осуществления ген FcγRIIc является определенным аллельным вариантом, причем аллельный вариант выбран из варианта 57Stop и варианта 57Q. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIB, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIc содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0225] In some embodiments, the low-affinity FcγR locus comprises a nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIc polypeptide. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIc polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus. In certain embodiments, the nucleic acid sequence encoding the FcγRIIc polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent low-affinity FcγR locus. In one embodiment, the FcγRIIc gene is a specific allelic variant, the allelic variant being selected from the 57Stop variant and the 57Q variant. In some embodiments, the rodent does not express the low affinity rodent FcγR polypeptide (eg, does not express the rodent FcγRIIB, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide). In some embodiments, the FcγRIIc gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0226] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIIa человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIIa человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIIa замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В одном варианте осуществления ген FcγRIIIa является определенным аллельным вариантом, причем аллельный вариант выбран из варианта 176Val и варианта 176Phe. В конкретном варианте осуществления аллельный вариант FcγRIIIa представляет собой вариант 176Val. В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIIa содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0226] In some embodiments, the low-affinity FcγR locus comprises a nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIIa polypeptide. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIIa polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus. In certain embodiments, a nucleic acid sequence encoding an FcγRIIIa polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR locus. In some embodiments, the rodent does not express a low-affinity rodent FcγR polypeptide (e.g., does not express a rodent FcγRIIb, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide or does not express a functional rodent FcγRIIb, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide). In one embodiment, the FcγRIIIa gene is a specific allelic variant, the allelic variant being selected from the 176Val variant and the 176Phe variant. In a specific embodiment, the FcγRIIIa allelic variant is the 176Val variant. In some embodiments, the FcγRIIIa gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0227] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIIb человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIIb человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIIb замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В конкретном варианте осуществления ген FcγRIIIb является определенным аллельным вариантом, причем аллельный вариант выбран из варианта NA1 и варианта NA2. В другом конкретном варианте осуществления аллельный вариант FcγRIIIb представляет собой вариант NA2. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIIb содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).[0227] In some embodiments, the low-affinity FcγR locus comprises a nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIIb polypeptide. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a human FcγRIIIb polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus. In certain embodiments, a nucleic acid sequence encoding an FcγRIIIb polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR locus. In a specific embodiment, the FcγRIIIb gene is a specific allelic variant, the allelic variant being selected from the NA1 variant and the NA2 variant. In another specific embodiment, the FcγRIIIb allelic variant is the NA2 variant. In some embodiments, the rodent does not express a low-affinity rodent FcγR polypeptide (e.g., does not express a rodent FcγRIIb, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide or does not express a functional rodent FcγRIIb, FcγRIV, and/or FcγRIII polypeptide). In some embodiments, the FcγRIIIb gene locus contains non-human regulatory elements (eg, non-human promoters and/or enhancers). In some embodiments, the non-human regulatory elements are rodent regulatory elements (eg, rat or murine promoters or enhancers).

[0228] В некоторых вариантах осуществления предложенный в данном документе грызун (например, мышь или крыса) содержит один или более генов низкоаффинного FcγR человека, описанных в патентах США №№9221894, 9056130, 9089599, 8658154, 8883496 или 8658853. В некоторых вариантах осуществления предложенный в данном документе грызун (например, мышь или крыса) содержит по меньшей мере два гена низкоаффинного FcγR человека и эндогенный ген γ-цепи Fc грызуна (например, крысы или мыши), причем гены низкоаффинного FcγR человека выбраны из группы, состоящей из FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa и FcγRIIIb человека. В некоторых определенных вариантах осуществления предложенный в данном документе грызун (например, мышь или крыса) содержит FcγRIIa и FcγRIIIb человека и эндогенный ген γ-цепи Fc грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых определенных вариантах осуществления предложенный в данном документе грызун (например, мышь или крыса) содержит гены FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIb, FcγRIIc и FcγRIIId и эндогенный ген γ-цепи Fc грызуна (например, крысы или мыши). В различных вариантах осуществления грызун (например, мышь или крыса), содержащий один или более FcγR человека, дополнительно содержит гомозиготное разрушение в эндогенных генах FcγRIIB, FcγRIV и FcγRIII грызуна (например, крысы или мыши) (т.е. эндогенных последовательностях, кодирующих α-цепь FcγRIIb, FcγRIV и FcγRIII грызуна). В различных вариантах осуществления грызун (например, мышь или крыса), содержащий один или более низкоаффинных FcγR человека, описанных в данном документе, не экспрессирует на обнаруживаемом уровне эндогенный низкоаффинный полипептид FcγR (например, эндогенный низкоаффинный полипептид α-цепи FcγR).[0228] In some embodiments, a rodent (e.g., a mouse or rat) provided herein contains one or more low-affinity human FcγR genes described in US Pat. Nos. 9,221,894, 9,056,130, 9089,599, 8658154, 8883496, or 8658853. In some embodiments, a rodent (e.g., mouse or rat) provided herein contains at least two low-affinity human FcγR genes and an endogenous rodent (e.g., rat or mouse) Fc γ-chain gene, wherein the low-affinity human FcγR genes are selected from the group consisting of FcγRIIa, Human FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa and FcγRIIIb. In certain certain embodiments, a rodent (eg, mouse or rat) provided herein comprises human FcγRIIa and FcγRIIIb and an endogenous rodent (eg, rat or mouse) Fc γ chain gene. In certain certain embodiments, a rodent (eg, mouse or rat) provided herein contains FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, and FcγRIIId genes and an endogenous rodent (eg, rat or mouse) Fc γ chain gene. In various embodiments, a rodent (e.g., mouse or rat) containing one or more human FcγRs further comprises a homozygous disruption in the endogenous rodent (e.g., rat or mouse) FcγRIIB, FcγRIV, and FcγRIII genes (i.e., the endogenous sequences encoding α -chain FcγRIIb, FcγRIV and FcγRIII rodent). In various embodiments, a rodent (eg, mouse or rat) containing one or more low-affinity human FcγRs described herein does not express at a detectable level an endogenous low-affinity FcγR polypeptide (eg, an endogenous low-affinity FcγR α-chain polypeptide).

[0229] В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса низкоаффинного FcγR. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса низкоаффинного FcγR.[0229] In some embodiments, the rodent is heterozygous for the genetically modified low-affinity FcγR locus. In some embodiments, the rodent is homozygous for the genetically modified low-affinity FcγR locus.

Генетически модифицированные отличные от человека животные и ЭС-клеткиGenetically modified non-human animals and ES cells

[0230] В определенных аспектах в данном документе предложены генетически модифицированные отличные от человека животные (например, грызуны, такие как крысы или мыши), содержащие один или более гуманизированных локусов, раскрытых в данном документе, а также генетически модифицированные ЭС-клетки отличных от человека животных, применимые для получения таких отличных от человека животных.[0230] In certain aspects, provided herein are genetically modified non-human animals (e.g., rodents such as rats or mice) containing one or more of the humanized loci disclosed herein, as well as genetically modified non-human ES cells animals applicable to the production of such non-human animals.

[0231] В определенных аспектах в данном документе предложены генетически модифицированные отличные от человека животные и ЭС-клетки отличных от человека животных, содержащие в зародышевой линии и/или геноме один или более сконструированных локусов, описанных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка дополнительно содержит локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус CD79a и/или CD79b, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcRn, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус β2M, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcεR1α, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR1a, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR2a, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR2b, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR3a, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR3b, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR2c, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка являются гетерозиготными в отношении одного или более локусов, например, генетически сконструированных локусов, предложенных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка являются гомозиготными в отношении одного или более локусов, например, генетически сконструированных локусов, предложенных в данном документе.[0231] In certain aspects, provided herein are genetically modified non-human animals and non-human animal ES cells containing in the germline and/or genome one or more of the engineered loci described herein. For example, in some embodiments, a non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome an IgH locus as provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell further comprises an Igκ and/or Igλ locus as provided herein. In some embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the CD79a and/or CD79b locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the FcRn locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the β2M locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the FcεR1α locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the FcγR1a locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the FcγR2a locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the FcγR2b locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the FcγR3a locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the FcγR3b locus provided herein. In certain embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome the FcγR2c locus provided herein. In some embodiments, the non-human animal or ES cell is heterozygous for one or more loci, such as the genetically engineered loci provided herein. In some embodiments, the non-human animal or ES cell is homozygous for one or more loci, such as the genetically engineered loci provided herein.

[0232] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное может представлять собой любое отличное от человека животное. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой позвоночное. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе генетически модифицированное отличное от человека животное может быть выбрано из группы, состоящей из мыши, крысы, кролика, свиньи, представителя бычьих (например, коровы, быка, буйвола), оленя, овцы, козы, ламы, курицы, кошки, собаки, хорька, примата (например, мармозетки, макака-резус). В случае отличных от человека животных, для которых недоступны подходящие для генетической модификации ЭС-клетки, можно применять другие способы для создания отличного от человека животного, содержащего генетические модификации, описанные в данном документе. Такие способы включают, например, модификацию генома отличной от ЭС клетки (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки) и применение ядерного переноса для переноса модифицированного генома в подходящую клетку, такую как ооцит, и вынашивание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) отличным от человека животным в подходящих условиях для формирования эмбриона.[0232] In some embodiments, the non-human animal may be any non-human animal. In some embodiments, the non-human animal is a vertebrate. In some embodiments, the non-human animal is a mammal. In some embodiments, the genetically modified non-human animal described herein may be selected from the group consisting of mouse, rat, rabbit, pig, bovine (e.g., cow, bull, buffalo), deer, sheep, goat, llama, chicken, cat, dog, ferret, primate (eg marmoset, rhesus monkey). In the case of non-human animals for which suitable ES cells for genetic modification are not available, other methods can be used to create a non-human animal containing the genetic modifications described herein. Such methods include, for example, modifying the genome of a non-ES cell (eg, a fibroblast or an induced pluripotent cell) and using nuclear transfer to transfer the modified genome into a suitable cell, such as an oocyte, and gestating the modified cell (eg, a modified oocyte) non-human animals in suitable conditions for embryo formation.

[0233] В различных вариантах осуществления в данном документе предложены отличные от человека животные, например, грызуны (например, крысы или мыши), содержащие генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. Типовые варианты осуществления таких генетически сконструированных локусов схематически проиллюстрированы на Фиг. 1 и подробно описаны в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) ген Adam6, который кодирует полипептид ADAM6, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент (смотрите, например, патенты США №8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления полипептид ADAM6, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент экспрессируется из гена Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 не получен от отличного от человека животного, которое содержит ген Adam6 (например, мыши, которая содержит ген Adam6 крысы или ген Adam6 мыши, полученный от другой линии мышей). В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит эктопический ген Adam6. В контексте данного документа «эктопический» ген Adam6 относится к гену Adam6, который находится в окружении, отличном от того, в котором Adam6 находится в организме отличного от человека животного дикого типа. Например, ген Adam6 может быть расположен в другой хромосоме, расположен в другом локусе или размещен рядом с другими последовательностями. Типовым эктопическим геном Adam6 является ген Adam6 мыши, расположенный в последовательностях иммуноглобулина человека (например, генных сегментах вариабельной области тяжелой цепи человека). В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит вставленный или интегрированный ген Adam6.[0233] In various embodiments, provided herein are non-human animals, such as rodents (eg, rats or mice), containing a genetically engineered immunoglobulin heavy chain locus. Exemplary embodiments of such genetically engineered loci are schematically illustrated in FIG. 1 and are described in detail herein. In some embodiments, the non-human animal described herein contains in its genome (e.g., germline genome) an Adam6 gene that encodes an ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof (see, for example, U.S. Pat. No. 8642835 and 8697940, each of which is incorporated herein by reference in its entirety). In some embodiments, the ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is expressed from the Adam6 gene. In some embodiments, the Adam6 gene is not derived from a non-human animal that contains the Adam6 gene (eg, a mouse that contains a rat Adam6 gene or a mouse Adam6 gene derived from a different strain of mice). In some embodiments, the non-human animal described herein contains the ectopic Adam6 gene. As used herein, an “ectopic” Adam6 gene refers to an Adam6 gene that is found in an environment different from that in which Adam6 is found in a wild-type non-human animal. For example, the Adam6 gene may be located on a different chromosome, located at a different locus, or located near different sequences. An exemplary ectopic Adam6 gene is the mouse Adam6 gene, located in human immunoglobulin sequences (eg, human heavy chain variable region gene segments). In some embodiments, the non-human animal described herein contains an inserted or integrated Adam6 gene.

[0234] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) вставку одной или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов Adam6, не принадлежащих человеку, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов.[0234] In some embodiments, a non-human animal described herein contains in its genome (e.g., germline genome) an insertion of one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human Adam6 polypeptides, functional orthologs thereof, functional homologs or functional fragments.

[0235] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) ген Adam6a мыши и/или ген Adam6b мыши. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих ADAM6a мыши, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, и/или ADAM6b мыши, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент.[0235] In some embodiments, a non-human animal described herein contains in its genome (e.g., germline genome) one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologs thereof, functional homologs or functional fragments. In some embodiments, the non-human animal described herein contains in its genome (eg, germline genome) a mouse Adam6a gene and/or a mouse Adam6b gene. In some embodiments, the non-human animal described herein comprises one or more nucleotide sequences encoding mouse ADAM6a, a functional orthologue, functional homolog, or functional fragment thereof, and/or mouse ADAM6b, a functional ortholog, functional homolog, or functional fragment thereof .

[0236] В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в той же хромосоме, что и эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в позиции так, чтобы одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, были непрерывными с генными сегментами вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в позиции так, чтобы одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, являются смежными с генными сегментами вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в позиции так, чтобы одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, расположены между генными сегментами вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены между первым и вторым генным сегментом V_H человека. В некоторых вариантах осуществления первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1-2 человека, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6-1 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены на месте псевдогена Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.[0236] In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologs, or functional fragments thereof are inserted and/or located on the same chromosome as the endogenous immunoglobulin heavy chain locus . In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologues, or functional fragments thereof are inserted and/or positioned such that the one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, their functional orthologues, functional homologues or functional fragments, were contiguous with human immunoglobulin heavy chain variable region gene segments. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologues, or functional fragments thereof are inserted and/or positioned such that the one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologues, functional homologues or functional fragments thereof, are adjacent to human immunoglobulin heavy chain variable region gene segments. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologues, or functional fragments thereof are inserted and/or positioned such that the one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologues, functional homologues or functional fragments thereof, are located between human immunoglobulin heavy chain variable region gene segments. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologs, or functional fragments thereof are inserted and/or located between the first and second human _VH gene segments. In some embodiments, the first human V _H gene segment is human V _H 1-2 and the second human V _H gene segment is human V _H 6-1. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologs, or functional fragments thereof are inserted and/or located at the site of the human Adam6 pseudogene. In some embodiments, one or more nucleotide sequences encoding one or more non-human ADAM6 polypeptides, functional orthologs, functional homologs, or functional fragments thereof are inserted between a human V _H gene segment and a human D _H gene segment.

[0237] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит ген Adam6, который восстанавливает или повышает активность ADAM6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает активность ADAM6 до уровня, сопоставимого с уровнем отличного от человека животного, которое содержит функциональный эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 повышает активность ADAM6 до уровня, который по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или по меньшей мере в 10 раз больше по сравнению с активностью ADAM6 сопоставимого отличного от человека животного, которое не содержит функциональный ген Adam6.[0237] In some embodiments, the non-human animal described herein contains an Adam6 gene that restores or enhances ADAM6 activity. In some embodiments, the Adam6 gene restores ADAM6 activity to a level comparable to that of a non-human animal that contains a functional endogenous Adam6 gene. In some embodiments, the Adam6 gene increases ADAM6 activity to a level that is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold greater than the ADAM6 activity of a comparable non-human animal that does not contain a functional Adam6 gene.

[0238] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит ген Adam6, который восстанавливает или повышает фертильность самцов отличного от человека животного. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает фертильность самцов отличного от человека животного до уровня, сопоставимого с уровнем отличного от человека животного, которое содержит функциональный эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает фертильность самцов отличного от человека животного, так что количество детенышей, полученных в результате спаривания самца отличного от человека животного, составляет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% от количества детенышей, полученных в результате сопоставимого спаривания сопоставимого самца отличного от человека животного, которое не содержит функциональный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 повышает фертильность самцов отличного от человека животного так, что количество детенышей, полученных в результате спаривания самца отличного от человека животного, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или по меньшей мере в 10 раз больше количества детенышей, полученных в результате сопоставимого спаривания сопоставимого самца отличного от человека животного, которое не содержит функциональный ген Adam6.[0238] In some embodiments, the non-human animal described herein contains the Adam6 gene, which restores or enhances the fertility of male non-human animals. In some embodiments, the Adam6 gene restores the fertility of male non-human animals to a level comparable to that of a non-human animal that contains a functional endogenous Adam6 gene. In some embodiments, the Adam6 gene restores fertility to male non-human animals such that the number of offspring resulting from mating of a male non-human animal is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least at least 95% of the number of offspring resulting from a comparable mating of a comparable male non-human animal that does not contain a functional Adam6 gene. In some embodiments, the Adam6 gene increases the fertility of male non-human animals such that the number of offspring resulting from the mating of a male non-human animal is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5 times, at least 6 times, at least 7 times, at least 8 times, at least 9 times or at least 10 times the number of offspring resulting from comparable matings a comparable male non-human animal that does not contain a functional Adam6 gene.

[0239] В некоторых вариантах осуществления в локусе тяжелой цепи не принадлежащего человеку иммуноглобулина, описанном в данном документе, отсутствует по меньшей мере один не принадлежащий человеку эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления отсутствие по меньшей мере одного не принадлежащего человеку эндогенного гена Adam6 снижает активность ADAM6 и/или фертильность самцов мышей, у которых отсутствует не принадлежащий человеку эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления в локусе тяжелой цепи не принадлежащего человеку иммуноглобулина, описанном в данном документе, присутствует разрушение по меньшей мере одного не принадлежащего человеку эндогенного гена Adam6. В некоторых вариантах осуществления разрушение по меньшей мере одного не принадлежащего человеку гена Adam6 снижает активность ADAM6 и/или фертильность самцов мышей, у которых отсутствует не принадлежащий человеку эндогенный ген Adam6.[0239] In some embodiments, the non-human immunoglobulin heavy chain locus described herein lacks at least one non-human endogenous Adam6 gene. In some embodiments, the absence of at least one non-human endogenous Adam6 gene reduces ADAM6 activity and/or fertility of male mice that lack the non-human endogenous Adam6 gene. In some embodiments, at the non-human immunoglobulin heavy chain locus described herein, there is disruption of at least one non-human endogenous Adam6 gene. In some embodiments, disruption of at least one non-human Adam6 gene reduces ADAM6 activity and/or fertility in male mice lacking the non-human endogenous Adam6 gene.

[0240] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой небольшое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В определенных вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, крысу или хомяка. В некоторых вариантах осуществления грызун выбран из надсемейства Muroidea. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное принадлежит семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомяки), Cricetidae (например хомяк, крысы и мыши Нового Света, полевки), Muridae (например, истинные мыши и крысы, песчанки, колючие рисовые хомяки, косматые хомяки), Nesomyidae (например, рипидомисы, скалистые хомячки, белохвостые крысы, мадагаскарские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки), and Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В некоторых вариантах осуществления грызун выбран из истинной мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, колючего рисового хомяка и косматого хомяка. В некоторых вариантах осуществления мышь является представителем семейства Muridae. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун выбран из мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой мышь.[0240] In some embodiments, the non-human animal is a mammal. In some embodiments, the non-human animal is a small mammal, such as a member of the superfamily Dipodoidea or Muroidea. In some embodiments, the non-human animal is a rodent. In certain embodiments, the rodent is a mouse, rat, or hamster. In some embodiments, the rodent is selected from the superfamily Muroidea. In some embodiments, the non-human animal belongs to a family selected from Calomyscidae (e.g., mouse-like hamsters), Cricetidae (e.g., hamster, New World rats and mice, voles), Muridae (e.g., true mice and rats, gerbils, spiny rice hamsters, shaggy hamsters), Nesomyidae (eg, rhipidomys, rock hamsters, white-tailed rats, Madagascar rats and mice), Platacanthomyidae (eg, spiny dormouse), and Spalacidae (eg, mole rats, bamboo rats and zokor). In some embodiments, the rodent is selected from a true mouse or rat (family Muridae), a gerbil, a spiny rice hamster, and a shaggy hamster. In some embodiments, the mouse is a member of the family Muridae. In some embodiments, the non-human animal is a rodent. In some embodiments, the rodent is selected from mouse and rat. In some embodiments, the non-human animal is a mouse.

[0241] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой мышь линии C57BL. В некоторых вариантах осуществления линия C57BL выбрана из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой мышь линии 129. В некоторых вариантах осуществления линия 129 выбрана из группы, состоящей из линии, которая представляет собой 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная мышь получена при смешении линии 129 и линии C57BL. В некоторых вариантах осуществления мышь получена при смешении линий 129 и/или смешении линий C57BL/6. В некоторых вариантах осуществления линия 129 из смеси представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В некоторых вариантах осуществления мышь принадлежит линии BALB (например, BALB/c). В некоторых вариантах осуществления мышь получена при смешении линии BALB и другой линии (например, линии C57BL и/или линии 129). В некоторых вариантах осуществления предложенное в данном документе отличное от человека животное может представлять собой мышь, полученную из любой комбинации вышеуказанных линий.[0241] In some embodiments, the non-human animal is a C57BL mouse. In some embodiments, the C57BL line is selected from C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/ 10Cr and C57BL/Ola. In some embodiments, the non-human animal is a mouse strain 129. In some embodiments, strain 129 is selected from the group consisting of a strain that is 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (e.g., 129S1/SV, 129S1/SvIm ), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2. In some embodiments, the genetically modified mouse is produced by mixing the 129 strain and the C57BL strain. In some embodiments, the mouse is produced by mixing 129 lines and/or mixing C57BL/6 lines. In some embodiments, line 129 of the mixture is line 129S6 (129/SvEvTac). In some embodiments, the mouse belongs to the BALB lineage (eg, BALB/c). In some embodiments, the mouse is obtained by mixing the BALB line and another line (eg, the C57BL line and/or the 129 line). In some embodiments, a non-human animal provided herein may be a mouse derived from any combination of the foregoing strains.

[0242] В некоторых вариантах осуществления предложенное в данном документе отличное от человека животное представляет собой крысу. В некоторых вариантах осуществления крыса выбрана из крыс линии Вистар (Wistar), линии LEA, линии Спрег - Доули (Sprague Dawley), линии Фишер (Fischer), F344, F6 и Dark Agouti. В некоторых вариантах осуществления линия крыс представляет собой смесь двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из Вистар, LEA, Спрег - Доули, Фишер, F344, F6 и Dark Agouti.[0242] In some embodiments, the non-human animal provided herein is a rat. In some embodiments, the rat is selected from the Wistar strain, LEA strain, Sprague Dawley strain, Fischer strain, F344, F6, and Dark Agouti rats. In some embodiments, the rat strain is a mixture of two or more strains selected from the group consisting of Wistar, LEA, Sprague-Dawley, Fisher, F344, F6, and Dark Agouti.

[0243] В определенных вариантах осуществления генетически модифицированные отличные от человека животные или ЭС-клетки содержат в геноме и/или зародышевой линии некоторое количество предложенных в данном документе локусов, например, некоторое количество предложенных в данном документе генетически сконструированных локусов. Например, в некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе, и локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе, локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, и, необязательно, локус CD79a и/или CD79b, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе, локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, локус FcRn, предложенный в данном документе, и локус β2M, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе, локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, локус FcRn, предложенный в данном документе, локус β2M, предложенный в данном документе, локус FcεR1α, предложенный в данном документе, локус FcγR1a, предложенный в данном документе, локус FcγR2a, предложенный в данном документе, локус FcγR2b, предложенный в данном документе, локус FcγR3a, предложенный в данном документе, локус FcγR3b, предложенный в данном документе, и/или локус FcγR2c, предложенный в данном документе, и любые их комбинации.[0243] In certain embodiments, genetically modified non-human animals or ES cells contain in the genome and/or germ line a number of loci provided herein, for example, a number of genetically engineered loci provided herein. For example, in some embodiments, a non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome an IgH locus as provided herein and an Igκ and/or Igλ locus as provided herein. In some embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome an IgH locus as provided herein, an Igκ and/or Igλ locus as provided herein, and optionally a CD79a and/or CD79b locus , proposed in this document. In some embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome an IgH locus as provided herein, an Igκ and/or Igλ locus as provided herein, an FcRn locus as provided herein, and a β2M proposed in this paper. In some embodiments, the non-human animal or ES cell contains in the germline and/or genome an IgH locus as provided herein, an Igκ and/or Igλ locus as provided herein, an FcRn locus as provided herein, a β2M locus , proposed herein, FcεR1α locus, proposed herein, FcγR1a locus, proposed herein, FcγR2a locus, proposed herein, FcγR2b locus, proposed herein, FcγR3a locus, proposed herein, FcγR3b locus, proposed herein, and/or the FcγR2c locus as provided herein, and any combination thereof.

[0244] В определенных аспектах генетически модифицированное отличное от человека животное экспрессирует один или более гуманизированных полипептидов, кодируемых гуманизированными локусами, предложенными в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид тяжелой цепи Ig. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид Igκ и/или гуманизированный полипептид Igλ. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид CD79a и/или гуманизированный полипептид CD79b. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcRn. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид β2M. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcεR1α. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR1a. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка отличного от человека животного экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR2a. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR2b. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR3a. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR3b. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR2c.[0244] In certain aspects, the genetically modified non-human animal expresses one or more humanized polypeptides encoded by the humanized loci provided herein. For example, in some embodiments, the non-human animal expresses a humanized Ig heavy chain polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses a humanized Igκ polypeptide and/or a humanized Igλ polypeptide. In some embodiments, the non-human animal expresses a humanized CD79a polypeptide and/or a humanized CD79b polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses the humanized FcRn polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses the humanized β2M polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses the humanized FcεR1α polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses the humanized FcγR1a polypeptide. In certain embodiments, a non-human animal or a non-human animal ES cell expresses a humanized FcγR2a polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses the humanized FcγR2b polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses the humanized FcγR3a polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses the humanized FcγR3b polypeptide. In certain embodiments, the non-human animal expresses the humanized FcγR2c polypeptide.

[0245] Генетически модифицированных отличных от человека животных и ЭС-клетки можно создавать, используя соответствующий способ, известный в данной области техники. Например, такие генетически модифицированные ЭС-клетки отличных от человека животных можно создавать, используя технологию VELOCIGENE®, которая описана в патентах США №№6586251, 6596541, 7105348 и в Valenzuela et al. (2003) “High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis” Nat. Biotech. 21(6): 652-659, которые все включены в данный документ посредством ссылки. Модификации также можно осуществлять, используя нацеленную на геном нуклеазную систему, такую как система CRISPR/Cas, система на основе эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), система на основе цинк-пальцевых нуклеаз (ZFN). В некоторых вариантах осуществления модификации осуществляют, используя систему CRISPR/Cas, описанную, например, в заявках на патенты США №№14/314866, 14/515503, 14/747461 и 14/731914, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Типовые способы создания таких генетически модифицированных отличных от человека животных и ЭС-клеток также приведены в данном документе в примерах 1 и 3-5.[0245] Genetically modified non-human animals and ES cells can be created using an appropriate method known in the art. For example, such genetically modified non-human ES cells can be created using VELOCIGENE® technology, which is described in US patent No. 6586251, 6596541, 7105348 and Valenzuela et al. (2003) “High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis” Nat. Biotech. 21(6): 652-659, all of which are incorporated herein by reference. Modifications can also be carried out using a genome-targeted nuclease system, such as the CRISPR/Cas system, the transcription activator-like effector nuclease (TALEN) system, the zinc finger nuclease (ZFN) system. In some embodiments, modifications are made using the CRISPR/Cas system described, for example, in US patent applications No. 14/314866, 14/515503, 14/747461 and 14/731914, each of which is incorporated herein by reference. Exemplary methods for creating such genetically modified non-human animals and ES cells are also provided herein in Examples 1 and 3-5.

[0246] После этого описанные в данном документе ЭС-клетки можно использовать для создания отличного от человека животного, используя способы, известные в данной области техники. Например, описанные в данном документе мышиные ЭС-клетки можно использовать для создания генетически модифицированных мышей, используя способ VELOCIMOUSE®, описанный в патенте США №7294754 и в Poueymirou et al., Nature Biotech 25:91-99 (2007), которые все включены в данный документ посредством ссылки. Полученных в результате мышей можно скрещивать до гомозиготности.[0246] The ES cells described herein can then be used to create a non-human animal using methods known in the art. For example, the murine ES cells described herein can be used to create genetically modified mice using the VELOCIMOUSE® method described in US Pat. No. 7,294,754 and Poueymirou et al., Nature Biotech 25:91-99 (2007), all of which are included into this document by reference. The resulting mice can be bred to homozygosity.

Способы тестирования терапевтических средств, содержащих Fc человекаMethods for testing human Fc-containing therapeutics

[0247] В определенных аспектах в данном документе предложены способы тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека (например, человеческое антитело или Fc-слитый белок), включающие введение терапевтического белка грызуну, предложенному в данном документе (например, мыши или крысе, предложенным в данном документе). В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели для осуществления таких способов.[0247] In certain aspects, provided herein are methods of testing a therapeutic protein containing a human Fc domain (e.g., a human antibody or Fc fusion protein), comprising administering the therapeutic protein to a rodent provided herein (e.g., a mouse or rat as provided herein). in this document). In certain embodiments, animal models for implementing such methods are provided herein.

[0248] В некоторых вариантах осуществления вводимые человеческое антитело или Fc-слитый белок имеют изотип и/или аллотип, который совпадает с изотипом и/или аллотипом Fc-домена, кодируемого C_H человека в генетически модифицированном локусе IgH предложенного в данном документе грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG2, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG3, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG3 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgM, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-, CH₂-, CH₃- и CH₄-домены IgM человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgD, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-, H1-, H2-, CH₂-, CH₃-, M1- и M2-домены IgD человека. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igκ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igλ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе.[0248] In some embodiments, the administered human antibody or Fc fusion protein has an isotype and/or allotype that matches the isotype and/or allotype of the Fc domain encoded by the human _CH at the genetically modified rodent IgH locus provided herein. For example, in some embodiments, the agent is a human IgG1 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ and CH ₃ domains of human IgG1. In some embodiments, the agent is a human IgG4 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ and CH ₃ domains of human IgG4. In some embodiments, the agent is a human IgG1 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ , CH ₃ , M1 and M2 domains of IgG1 person. In some embodiments, the agent is a human IgG2 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ , CH ₃ , M1 and M2 domains of IgG2 person. In some embodiments, the agent is a human IgG3 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ , CH ₃ , M1 and M2 domains of IgG3 person. In some embodiments, the agent is a human IgG4 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ , CH ₃ , M1 and M2 domains of IgG4 person. In some embodiments, the agent is a human IgM antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ , CH ₂ , CH ₃ and CH ₄ domains of human IgM. In some embodiments, the agent is a human IgD antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding CH ₁ -, H1-, H2-, CH ₂ -, CH ₃ -, M1- and M2- human IgD domains. In some embodiments, the therapeutic agent is a human antibody having an Igκ light chain, and the rodent contains a genetically modified Igκ locus as provided herein. In some embodiments, the therapeutic agent is a human antibody having an Igλ light chain, and the rodent contains a genetically modified Igλ locus as provided herein.

[0249] В некоторых вариантах осуществления указанный способ включает измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка. В определенных вариантах осуществления животная модель, используемая для определения фармакокинетических свойств вводимого человеческого антитела или слитого белка, представляет собой предложенного в данном документе генетически модифицированного грызуна, содержащего модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления животная модель, используемая для определения фармакокинетических свойств вводимого человеческого антитела или слитого белка, представляет собой предложенного в данном документе генетически модифицированного грызуна, содержащего модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и модифицированный локус Igκ и/или модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вводимые человеческое антитело или Fc-слитый белок имеют изотип и/или аллотип, который совпадает с изотипом и/или аллотипом константного домена, кодируемого гуманизированным C_H в генетически модифицированном локусе IgH. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе.[0249] In some embodiments, the method includes measuring one or more pharmacokinetic properties of the administered therapeutic protein. In certain embodiments, the animal model used to determine the pharmacokinetic properties of the administered human antibody or fusion protein is a genetically modified rodent as provided herein, containing a modified IgH locus as provided herein. In certain embodiments, the animal model used to determine the pharmacokinetic properties of the administered human antibody or fusion protein is a genetically modified rodent as provided herein, comprising a modified IgH locus as provided herein, and a modified Igκ locus and/or a modified Igλ locus, proposed in this document. In some embodiments, the administered human antibody or Fc fusion protein has an isotype and/or allotype that matches the isotype and/or allotype of the constant domain encoded by the humanized _CH at the genetically modified IgH locus. In some embodiments, the rodent further comprises a modified FcRn locus as provided herein. In some embodiments, the rodent further comprises a modified β2M locus as provided herein.

[0250] В некоторых вариантах осуществления один или более фармакокинетических параметров включают, но не ограничиваются этим, площадь под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановление (IVR), скорость выведения (CL), среднее время удержания (СВУ), время полужизни агента и объем распределения в равновесном состоянии (Vss). В общем случае фармакокинетические свойства вводимого терапевтического агента определяют путем введения выбранной дозы терапевтического агента (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или больше) и определения после этого, как меняется со временем плазменная концентрация терапевтического агента (например, в течение 0 ч, 6 ч, 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток или до 30 или более суток).[0250] In some embodiments, one or more pharmacokinetic parameters include, but are not limited to, area under the plasma concentration-time curve (AUC), in vivo recovery (IVR), elimination rate (CL), mean retention time (MRT), agent half-life and volume of distribution at steady state (Vss). In general, the pharmacokinetic properties of the administered therapeutic agent are determined by administering the selected dose of the therapeutic agent (eg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg /kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, or 50 mg/kg or more) and then determine how the plasma concentration of the therapeutic agent changes over time (eg, over 0 hour, 6 hour, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days or up to 30 or more days).

[0251] В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают определение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка (например, способности вводимой дозы терапевтического белка уменьшать или устранять один или более симптомов заболевания в животной модели). В некоторых вариантах осуществления животная модель представляет собой модель онкологического заболевания, а симптомы заболевания могут включать, например, размер опухоли, метастазирование опухоли и/или выживаемость животного. В определенных вариантах осуществления животная модель представляет собой модель аутоиммунного или воспалительного заболевания, а симптомы заболевания могут включать, например, уровни экспрессии цитокинов, пролиферацию иммунных клеток, повреждение тканей и/или выживаемость животного. В некоторых вариантах осуществления животная модель представляет собой модель инфекционного заболевания, а симптомы заболевания могут включать, например, уровни инфекционного агента, повреждение тканей и/или выживаемость животного.[0251] In some embodiments, the methods further include determining the therapeutic effectiveness of the administered therapeutic protein (eg, the ability of the administered dose of the therapeutic protein to reduce or eliminate one or more symptoms of a disease in an animal model). In some embodiments, the animal model is a cancer disease model, and symptoms of the disease may include, for example, tumor size, tumor metastasis, and/or survival of the animal. In certain embodiments, the animal model is a model of an autoimmune or inflammatory disease, and symptoms of the disease may include, for example, cytokine expression levels, immune cell proliferation, tissue damage, and/or survival of the animal. In some embodiments, the animal model is a model of an infectious disease, and symptoms of the disease may include, for example, levels of the infectious agent, tissue damage, and/or survival of the animal.

[0252] В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают определение безопасности и дозы вводимого терапевтического белка (например, степени, в которой вводимая доза терапевтического белка вызывает одно или более нежелательных явлений в животной модели). Нежелательные явления включают, но не ограничиваются этим, аллергические реакции, алопецию, анафилаксию, анемию, отсутствие аппетита, нарушение равновесия, кровотечение, образование тромбов, затрудненное дыхание, бронхит, кровоподтеки, низкое количество белых кровяных телец, низкое количество красных кровяных телец, низкое количество тромбоцитов, кардиотоксичность, конъюнктивит, запор, кашель, обезвоживание, диарею, нарушения баланса электролитов, утрату фертильности, повышение температуры, выпадение волос, сердечную недостаточность, инфекцию, реакции в месте инъекции, дефицит железа, почечную недостаточность, лейкопению, нарушение функции печени, пневмонию, частое сердцебиение, ректальное кровотечение, судороги, потерю массы и набор массы. Например, в определенных вариантах осуществления в данном документе предложен способ определения аллергических реакций, индуцированных терапевтическим агентом, с использованием моделей пассивной кожной анафилаксии (ПКА) и/или пассивной системной анафилаксии (ПСА).[0252] In some embodiments, the methods further include determining the safety and dose of the therapeutic protein administered (eg, the extent to which the administered dose of the therapeutic protein causes one or more adverse events in an animal model). Adverse effects include, but are not limited to, allergic reactions, alopecia, anaphylaxis, anemia, lack of appetite, imbalance, bleeding, blood clots, difficulty breathing, bronchitis, bruising, low white blood cell count, low red blood cell count, low count platelets, cardiotoxicity, conjunctivitis, constipation, cough, dehydration, diarrhea, electrolyte imbalances, loss of fertility, fever, hair loss, heart failure, infection, injection site reactions, iron deficiency, renal failure, leukopenia, liver dysfunction, pneumonia , rapid heartbeat, rectal bleeding, seizures, weight loss and weight gain. For example, in certain embodiments, provided herein is a method for determining allergic reactions induced by a therapeutic agent using passive cutaneous anaphylaxis (PCA) and/or passive systemic anaphylaxis (PSA) models.

[0253] В определенных вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает определение степени, в которой терапевтический белок индуцирует один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна (например, степени, в которой терапевтический белок индуцирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ)). Например, в определенных вариантах осуществления в данном документе предложен способ скрининга терапевтического агента, содержащего человеческую Fc-область человеческого антитела, включающий: (a) введение агента, содержащего Fc-область человеческого антитела, предложенному в данном документе грызуну, причем агент связывается с целевой клеткой в организме грызуна; (b) определение антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) естественных клеток-киллеров (NK) против целевой клетки; и (c) сравнение уровня АЗКЦ на этапе (b) с контролем, причем повышенное уничтожение целевых клеток указывает на то, что агент обладает повышенной способностью опосредовать АЗКЦ.[0253] In certain embodiments, the method further includes determining the extent to which the therapeutic protein induces one or more Fc receptor-mediated responses in a rodent (eg, the extent to which the therapeutic protein induces antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)). For example, in certain embodiments, provided herein is a method of screening a therapeutic agent comprising a human Fc region of a human antibody, comprising: (a) administering an agent comprising the Fc region of a human antibody to a rodent provided herein, wherein the agent binds to a target cell in the body of a rodent; (b) determining antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of natural killer (NK) cells against the target cell; and (c) comparing the level of ADCC in step (b) with the control, with increased killing of target cells indicating that the agent has an increased ability to mediate ADCC.

[0254] В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает определение степени, в которой введение терапевтического белка индуцирует иммунный ответ против Fc человека у грызуна.[0254] In some embodiments, the method further includes determining the extent to which administration of the therapeutic protein induces an anti-human Fc immune response in a rodent.

[0255] В некоторых вариантах осуществления вводимый терапевтический агент вызывает сниженный иммунный ответ при введении предложенному в данном документе грызуну. В некоторых вариантах осуществления вводимые человеческое антитело или Fc-слитый белок имеют изотип и/или аллотип, который совпадает с изотипом и/или аллотипом Fc-домена, кодируемого C_H человека в генетически модифицированном локусе IgH предложенного в данном документе грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG2, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG3, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG3 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgM, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-, CH₂-, CH₃- и CH₄-домены IgM человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgD, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-, H1-, H2-, CH₂-, CH₃-, M1- и M2-домены IgD человека. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igκ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igλ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе.[0255] In some embodiments, the administered therapeutic agent causes a reduced immune response when administered to a rodent as provided herein. In some embodiments, the administered human antibody or Fc fusion protein has an isotype and/or allotype that matches the isotype and/or allotype of the Fc domain encoded by the human _CH at the genetically modified rodent IgH locus provided herein. For example, in some embodiments, the agent is a human IgG1 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ and CH ₃ domains of human IgG1. In some embodiments, the agent is a human IgG4 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ and CH ₃ domains of human IgG4. In some embodiments, the agent is a human IgG1 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ , CH ₃ , M1 and M2 domains of IgG1 person. In some embodiments, the agent is a human IgG2 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ , CH ₃ , M1 and M2 domains of IgG2 person. In some embodiments, the agent is a human IgG3 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ , CH ₃ , M1 and M2 domains of IgG3 person. In some embodiments, the agent is a human IgG4 antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ domain, hinge domain, CH ₂ , CH ₃ , M1 and M2 domains of IgG4 person. In some embodiments, the agent is a human IgM antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding the CH ₁ , CH ₂ , CH ₃ and CH ₄ domains of human IgM. In some embodiments, the agent is a human IgD antibody and the rodent contains a genetically modified IgH locus that contains a _CH gene segment encoding CH ₁ -, H1-, H2-, CH ₂ -, CH ₃ -, M1- and M2- human IgD domains. In some embodiments, the therapeutic agent is a human antibody having an Igκ light chain, and the rodent contains a genetically modified Igκ locus as provided herein. In some embodiments, the therapeutic agent is a human antibody having an Igλ light chain, and the rodent contains a genetically modified Igλ locus as provided herein.

[0256] В определенных вариантах осуществления предложенные в данном документе способы включают тестирование терапевтических антител, содержащих Fc человека. В некоторых вариантах осуществления тестируемые антитела содержат вариабельные домены тяжелой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат константные домены тяжелой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе антитела содержат константный домен IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. Последовательности константных доменов тяжелой цепи человека известны в данной области техники (смотрите, например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публикацию NIH № 91-3242 и базу данных IMGT, доступную на www.imgt.org).[0256] In certain embodiments, the methods provided herein include testing therapeutic antibodies containing human Fc. In some embodiments, the test antibodies comprise human heavy chain variable domains. In some embodiments, the antibodies comprise human heavy chain constant domains. In some embodiments, antibodies provided herein comprise an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, or IgD constant domain. Human heavy chain constant domain sequences are known in the art (see, for example, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 and the IMGT database, available at www.imgt.org).

[0257] В некоторых вариантах осуществления тестируемые антитела содержат модифицированный Fc-домен (например, мутацию, которая меняет взаимодействие между Fc и Fc-рецептором). Например, в некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе антитела содержат модификацию в Fc-домене в позиции 235, 236, 237, 239, 265, 267, 268, 269, 270, 298, 326, 327, 330, 332, 350, 351, 366, 392, 394, 405 и/или 407 (по системе нумерации EU). В некоторых вариантах осуществления модификация выбрана из группы, состоящей из L235A, G236E, G237F, S239E, S239D, D265E, D265S, S267E, S267D, S267G, H268E, H268D, E269L, D270N, D270E, S298A, K326A, K326D, A327H, A327V, A327L, A330I, A330S, I332E, T350V, L351Y, T366L, K392M, K392L, T394W, F405A и/или Y407V (по системе нумерации EU). В некоторых вариантах осуществления антитела содержать некоторое количество модификаций в Fc-домене. В некоторых вариантах осуществления некоторое количество модификаций выбраны из группы, состоящей из D270N/K326D, S239E/S298A/K326A/A327H, L235A/S239E/D265E/A327H, G236E/G237F/S239E, G237F/S239E/D265E, G327F/S239E/H268D, G236E/D270N/A327V/I332E, G237F/S239E/A327H, G237F/A327L/A330I, S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/D265S/H268D/I332E, S239E/D265S/I332E, S239E/S267E/H268D, S239E/A327L/A330I, D265E/S267D/A330S, S267G/H268E/D270E, H268D/E269L/S298A/K326A/A327H, H268D//K326A/A327H. Дополнительные Fc-модификации и комбинации Fc-модификаций приведены в патентах США №№5624821, 5648260, 6528624, 6737056, 7122637, 7183387, 7297775, 7317091, 7332581, 7632497, 7662925, 7695936, 8093359, 8216805, 8218805, 8388955 и 8937158, и публикациях патентов США №№2005/0054832, 2006/0222653, 2006/0275282, 2006/0275283, 2007/0190063, 2008/0154025, 2009/0042291 2013/0108623 и 2013/0089541, которые все включены в данный документ посредством ссылки.[0257] In some embodiments, the test antibodies contain a modified Fc domain (eg, a mutation that alters the interaction between the Fc and the Fc receptor). For example, in some embodiments, the antibodies provided herein contain a modification in the Fc domain at positions 235, 236, 237, 239, 265, 267, 268, 269, 270, 298, 326, 327, 330, 332, 350, 351 , 366, 392, 394, 405 and/or 407 (according to the EU numbering system). In some embodiments, the modification is selected from the group consisting of L235A, G236E, G237F, S239E, S239D, D265E, D265S, S267E, S267D, S267G, H268E, H268D, E269L, D270N, D270E, S298A, K326A, K326D , A327H, A327V , A327L, A330I, A330S, I332E, T350V, L351Y, T366L, K392M, K392L, T394W, F405A and/or Y407V (according to the EU numbering system). In some embodiments, the antibodies contain a number of modifications in the Fc domain. In some embodiments, a number of modifications are selected from the group consisting of D270N/K326D, S239E/S298A/K326A/A327H, L235A/S239E/D265E/A327H, G236E/G237F/S239E, G237F/S239E/D265E, G327F/S 239E/H268D , G236E/D270N/A327V/I332E, G237F/S239E/A327H, G237F/A327L/A330I, S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/D265S/H268D/I332E, S239E/D265S/ I332E, S239E/S267E/H268D, S239E /A327L/A330I, D265E/S267D/A330S, S267G/H268E/D270E, H268D/E269L/S298A/K326A/A327H, H268D//K326A/A327H. Additional Fc modifications and combinations of Fc modifications are given in US patents No. 5624821, 5648260, 6528624, 6737056, 7122637, 7183387, 7297775, 7317091, 7332581, 7632497, 7662925, 7695936, 8093359, 8216805, 8218805, 8388955 and 8937158, and US patent publications Nos. 2005/0054832, 2006/0222653, 2006/0275282, 2006/0275283, 2007/0190063, 2008/0154025, 2009/0042291 2013/0108623 and 2013 /0089541, all of which are incorporated herein by reference.

[0258] В некоторых вариантах осуществления тестируемое антитело представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах осуществления два антигенсвязывающих домена биспецифического антитела имеют отличные вариабельные домены тяжелой цепи, но имеют идентичные вариабельные домены легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления Fc-домены тяжелых цепей содержат модификации для облегчения образования гетеродимеров тяжелых цепей и/или ингибирования образования гомодимеров тяжелых цепей. Такие модификации приведены, например, в патентах США №№5731168, 5807706, 5821333, 7642228 и 8679785 и в публикации патента США №2013/0195849, которые все включены в данный документ посредством ссылки.[0258] In some embodiments, the antibody being tested is a bispecific antibody. In some embodiments, the two antigen binding domains of a bispecific antibody have different heavy chain variable domains but have identical light chain variable domains. In some embodiments, the heavy chain Fc domains contain modifications to facilitate the formation of heavy chain heterodimers and/or inhibit the formation of heavy chain homodimers. Such modifications are set forth, for example, in US Patent Nos. 5,731,168, 5,807,706, 5821,333, 7,642,228 and 8,679,785 and US Patent Publication No. 2013/0195849, all of which are incorporated herein by reference.

[0259] В некоторых вариантах осуществления антитела, тестируемые в предложенных в данном документе способах, имеют вариабельные домены легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены легкой цепи представляют собой вариабельные домены легкой цепи λ. В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены легкой цепи представляют собой вариабельные домены легкой цепи κ. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат константные домены легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления константные домены легкой цепи представляют собой константные домены легкой цепи λ. В некоторых вариантах осуществления константные домены легкой цепи представляют собой константные домены легкой цепи κ. Последовательности константных доменов легкой цепи человека известны в данной области техники (смотрите, например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публикацию NIH №91-3242 и базу данных IMGT, доступную на www.imgt.org).[0259] In some embodiments, the antibodies tested in the methods provided herein have human light chain variable domains. In some embodiments, the light chain variable domains are λ light chain variable domains. In some embodiments, the light chain variable domains are κ light chain variable domains. In some embodiments, the antibodies comprise human light chain constant domains. In some embodiments, the light chain constant domains are λ light chain constant domains. In some embodiments, the light chain constant domains are κ light chain constant domains. Human light chain constant domain sequences are known in the art (see, for example, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 and the IMGT database, available at www.imgt.org).

[0260] В определенных вариантах осуществления терапевтический агент вводят предложенному в данном документе грызуну в виде части фармацевтической композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей человеческое антитело или Fc-слитый белок, смешанные с фармацевтически приемлемым носителем.[0260] In certain embodiments, the therapeutic agent is administered to a rodent provided herein as part of a pharmaceutical composition, for example, a pharmaceutical composition comprising a human antibody or Fc fusion protein admixed with a pharmaceutically acceptable carrier.

[0261] Предложенные в данном документе фармацевтические композиции могут быть составлены специально для введения в твердой или жидкой форме, включая адаптированные для: (1) перорального введения, например, жидкие формы (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, например, предназначенные для буккального, подъязычного и системного всасывания, болюсы, порошки, гранулы, пасты для применения под язык; или (2) парентерального введения, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции, такие как, например, стерильные растворы или суспензии, или составы с замедленным высвобождением.[0261] Pharmaceutical compositions provided herein may be formulated specifically for administration in solid or liquid form, including those adapted for: (1) oral administration, e.g., liquid forms (aqueous or non-aqueous solutions or suspensions), tablets, e.g. buccal, sublingual and systemic absorption, boluses, powders, granules, pastes for use under the tongue; or (2) parenteral administration, for example, by subcutaneous, intramuscular, intravenous or epidural injection, such as, for example, sterile solutions or suspensions, or sustained release formulations.

[0262] Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, содержат человеческое антитело или Fc-слитый белок в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками, которые можно восстанавливать в стерильных инъекционных растворах или дисперсиях непосредственно перед применением, которые могут содержать сахара, спирты, антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты, растворимые вещества, которые придают составу изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, или суспендирующие или загущающие агенты.[0262] Pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration contain a human antibody or Fc fusion protein in combination with one or more pharmaceutically acceptable sterile isotonic aqueous or non-aqueous solutions, dispersions, suspensions or emulsions, or sterile powders that can be reconstituted in sterile injectable solutions or dispersions immediately before use, which may contain sugars, alcohols, antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, solutes that render the composition isotonic with the blood of the intended recipient, or suspending or thickening agents.

[0263] Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях, предложенных в данном документе, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем использования поверхностно-активных веществ.[0263] Examples of suitable aqueous and non-aqueous carriers that can be used in the pharmaceutical compositions provided herein include water, ethanol, polyols (such as glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof, vegetable oils, such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of coating materials such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by the use of surfactants.

[0264] В определенных вариантах осуществления композиции содержат человеческое антитело или Fc-слитый белок в концентрации, дающей в результате надлежащее соотношение масс./об. для необходимой дозы. Антитело может присутствовать в композиции в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 20 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 30 мг/мл, по меньшей мере 35 мг/мл, по меньшей мере 40 мг/мл, по меньшей мере 45 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 55 мг/мл, по меньшей мере 60 мг/мл, по меньшей мере 65 мг/мл, по меньшей мере 70 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл, по меньшей мере 80 мг/мл, по меньшей мере 85 мг/мл, по меньшей мере 90 мг/мл, по меньшей мере 95 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 105 мг/мл, по меньшей мере 110 мг/мл, по меньшей мере 115 мг/мл, по меньшей мере 120 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл, по меньшей мере 130 мг/мл, по меньшей мере 135 мг/мл, по меньшей мере 140 мг/мл, по меньшей мере 150 мг/мл, по меньшей мере 200 мг/мл, по меньшей мере 250 мг/мл или по меньшей мере 300 мг/мл.[0264] In certain embodiments, the compositions contain a human antibody or Fc fusion protein at a concentration resulting in an appropriate w/v ratio. for the required dose. The antibody may be present in the composition at a concentration of at least 1 mg/ml, at least 5 mg/ml, at least 10 mg/ml, at least 15 mg/ml, at least 20 mg/ml, at least 25 mg/ml, at least 30 mg/ml, at least 35 mg/ml, at least 40 mg/ml, at least 45 mg/ml, at least 50 mg/ml, at least 55 mg /ml, at least 60 mg/ml, at least 65 mg/ml, at least 70 mg/ml, at least 75 mg/ml, at least 80 mg/ml, at least 85 mg/ml , at least 90 mg/ml, at least 95 mg/ml, at least 100 mg/ml, at least 105 mg/ml, at least 110 mg/ml, at least 115 mg/ml, according at least 120 mg/ml, at least 125 mg/ml, at least 130 mg/ml, at least 135 mg/ml, at least 140 mg/ml, at least 150 mg/ml, at least 200 mg/ml, at least 250 mg/ml or at least 300 mg/ml.

[0265] В некоторых вариантах осуществления композиции готовят путем смешивания антитела или Fc-слитого белка человека с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами, включая, но не ограничиваясь этим, буферные агенты, сахариды, соли, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, полиолы, разбавители, связующие вещества, стабилизаторы, соли, липофильные растворители, аминокислоты, хелаторы, консерванты и т.п. (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, L. Brunton, et al. and Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1999)), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов в необходимой конечной концентрации. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как гистидин, фосфат, цитрат, глицин, ацетат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; феноловый, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая трегалозу, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ТВИН, полисорбат 80, ПЛЮРОНИКИ® или полиэтиленгликоль (ПЭГ).[0265] In some embodiments, compositions are prepared by mixing an antibody or human Fc fusion protein with optional physiologically acceptable carriers, excipients or stabilizers, including, but not limited to, buffering agents, saccharides, salts, surfactants, solubilizers, polyols , diluents, binders, stabilizers, salts, lipophilic solvents, amino acids, chelators, preservatives, etc. (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, L. Brunton, et al. and Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1999)), in the form of lyophilized compositions or aqueous solutions at the required final concentration . Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used and include buffers such as histidine, phosphate, citrate, glycine, acetate and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkylparabens such as methyl or propylparaben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including trehalose, glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes); and/or non-ionic surfactants such as TWIN, polysorbate 80, PLURONICS® or polyethylene glycol (PEG).

[0266] В некоторых вариантах осуществления буферный агент представляет собой гистидин, цитрат, фосфат, глицин или ацетат. Сахаридный эксципиент может представлять собой трегалозу, сахарозу, маннит, мальтозу или раффинозу. Поверхностно-активное вещество может представлять собой полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 80 или плюроник F68. Соль может представлять собой NaCl, KCl, MgCl2 или CaCl2.[0266] In some embodiments, the buffering agent is histidine, citrate, phosphate, glycine, or acetate. The saccharide excipient may be trehalose, sucrose, mannitol, maltose or raffinose. The surfactant may be polysorbate 20, polysorbate 40, polysorbate 80, or Pluronic F68. The salt may be NaCl, KCl, MgCl2 or CaCl2.

[0267] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит буферный или pH-регулирующий агент для обеспечения улучшенного контроля pH. Такая композиция может иметь pH от около 3,0 до около 9,0, от около 4,0 до около 8,0, от около 5,0 до около 8,0, от около 5,0 до около 7,0, от около 5,0 до около 6,5, от около 5,5 до около 8,0, от около 5,5 до около 7,0 или от около 5,5 до около 6,5. В дополнительном варианте осуществления такая композиция имеет pH около 3,0, около 3,5, около 4,0, около 4,5, около 5,0, около 5,1, около 5,2, около 5,3, около 5,4, около 5,5, около 5,6, около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6, около 6,7, около 6,8, около 6,9, около 7,0, около 7,5, около 8,0, около 8,5 или около 9,0. В конкретном варианте осуществления композиция имеет pH около 6,0. Специалисту в данной области техники понятно, что pH композиции в общем случае не должен быть равным изоэлектрической точке антитела или Fc-слитого белка человека, предназначенного для применения в композиции. Как правило, буферный агент представляет собой соль, полученную из органических или неорганических кислот или оснований. Типовые буферные агенты включают, но не ограничиваются этим, соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; Трис, трометамина гидрохлорид или фосфатные буферы. Кроме того, аминокислотные компоненты также могут служить в качестве буферного средства. Типовые аминокислотные компоненты, которые можно использовать в композиции в качестве буферных агентов, включают, но не ограничиваются этим, глицин и гистидин. В определенных вариантах осуществления буферный агент выбран из гистидина, цитрата, фосфата, глицина и ацетата. В конкретном варианте осуществления буферный агент представляет собой гистидин. В другом конкретном варианте осуществления буферный агент представляет собой цитрат. В другом конкретном варианте осуществления буферный агент представляет собой глицин. Чистота буферного агента должна составлять по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5%. В данном документе термин «чистота» в контексте гистидина и глицина относится к химической чистоте гистидина или глицина, как известно в данной области техники, например, как описано в The Merck Index, 13th ed., O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001).[0267] In some embodiments, the composition contains a buffering or pH-regulating agent to provide improved pH control. Such a composition may have a pH of from about 3.0 to about 9.0, from about 4.0 to about 8.0, from about 5.0 to about 8.0, from about 5.0 to about 7.0, from about 5.0 to about 6.5, about 5.5 to about 8.0, about 5.5 to about 7.0, or about 5.5 to about 6.5. In a further embodiment, such a composition has a pH of about 3.0, about 3.5, about 4.0, about 4.5, about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5 ,4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, about 6 .4, about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.5, about 8.0, about 8.5 or about 9 ,0. In a specific embodiment, the composition has a pH of about 6.0. One skilled in the art will appreciate that the pH of the composition generally should not be equal to the isoelectric point of the antibody or human Fc fusion protein to be used in the composition. Typically, the buffering agent is a salt derived from organic or inorganic acids or bases. Typical buffering agents include, but are not limited to, salts of organic acids such as salts of citric acid, ascorbic acid, gluconic acid, carbonic acid, tartaric acid, succinic acid, acetic acid or phthalic acid; Tris, tromethamine hydrochloride or phosphate buffers. In addition, the amino acid components can also serve as a buffering agent. Typical amino acid components that can be used in the composition as buffering agents include, but are not limited to, glycine and histidine. In certain embodiments, the buffering agent is selected from histidine, citrate, phosphate, glycine, and acetate. In a specific embodiment, the buffering agent is histidine. In another specific embodiment, the buffering agent is citrate. In another specific embodiment, the buffering agent is glycine. The purity of the buffering agent must be at least 98%, or at least 99%, or at least 99.5%. As used herein, the term “purity” in the context of histidine and glycine refers to the chemical purity of histidine or glycine as known in the art, for example, as described in The Merck Index, 13th ed., O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001).

[0268] В определенных вариантах осуществления композиция содержит гистидин в качестве буферного агента. В определенных вариантах осуществления гистидин присутствует в композиции в концентрации по меньшей мере около 1 мМ, по меньшей мере около 5 мМ, по меньшей мере около 10 мМ, по меньшей мере около 20 мМ, по меньшей мере около 30 мМ, по меньшей мере около 40 мМ, по меньшей мере около 50 мМ, по меньшей мере около 75 мМ, по меньшей мере около 100 мМ, по меньшей мере около 150 мМ или по меньшей мере около 200 мМ гистидина. В другом варианте осуществления композиция содержит от около 1 мМ до около 200 мМ, от около 1 мМ до около 150 мМ, от около 1 мМ до около 100 мМ, от около 1 мМ до около 75 мМ, от около 10 мМ до около 200 мМ, от около 10 мМ до около 150 мМ, от около 10 мМ до около 100 мМ, от около 10 мМ до около 75 мМ, от около 10 мМ до около 50 мМ, от около 10 мМ до около 40 мМ, от около 10 мМ до около 30 мМ, от около 20 мМ до около 75 мМ, от около 20 мМ до около 50 мМ, от около 20 мМ до около 40 мМ или от около 20 мМ до около 30 мМ гистидина. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит около 1 мМ, около 5 мМ, около 10 мМ, около 20 мМ, около 25 мМ, около 30 мМ, около 35 мМ, около 40 мМ, около 45 мМ, около 50 мМ, около 60 мМ, около 70 мМ, около 80 мМ, около 90 мМ, около 100 мМ, около 150 мМ или около 200 мМ гистидина. В конкретном варианте осуществления композиция может содержать около 10 мМ, около 25 мМ гистидина или не содержать его.[0268] In certain embodiments, the composition contains histidine as a buffering agent. In certain embodiments, histidine is present in the composition at a concentration of at least about 1 mM, at least about 5 mM, at least about 10 mM, at least about 20 mM, at least about 30 mM, at least about 40 mM, at least about 50 mM, at least about 75 mM, at least about 100 mM, at least about 150 mM, or at least about 200 mM histidine. In another embodiment, the composition contains from about 1 mM to about 200 mM, from about 1 mM to about 150 mM, from about 1 mM to about 100 mM, from about 1 mM to about 75 mM, from about 10 mM to about 200 mM , from about 10 mM to about 150 mM, from about 10 mM to about 100 mM, from about 10 mM to about 75 mM, from about 10 mM to about 50 mM, from about 10 mM to about 40 mM, from about 10 mM to about 30 mM, from about 20 mM to about 75 mM, from about 20 mM to about 50 mM, from about 20 mM to about 40 mM, or from about 20 mM to about 30 mM histidine. In a further embodiment, the composition contains about 1 mM, about 5 mM, about 10 mM, about 20 mM, about 25 mM, about 30 mM, about 35 mM, about 40 mM, about 45 mM, about 50 mM, about 60 mM, about 70 mM, about 80 mM, about 90 mM, about 100 mM, about 150 mM or about 200 mM histidine. In a particular embodiment, the composition may contain about 10 mm, about 25 mm, or no histidine.

[0269] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит углеводный эксципиент. Углеводные эксципиенты могут действовать, например, как агенты, повышающие вязкость, стабилизаторы, объемообразующие агенты, солюбилизирующие агенты и т.п. Углеводные эксципиенты в общем случае присутствуют в количестве от около 1% до около 99% по массе или объему, например, от около 0,1% до около 20%, от около 0,1% до около 15%, от около 0,1% до около 5%, от около 1% до около 20%, от около 5% до около 15%, от около 8% до около 10%, от около 10% до около 15%, от около 15% до около 20%, от 0,1% до 20%, от 5% до 15%, от 8% до 10%, от 10% до 15%, от 15% до 20%, от около 0,1% до около 5%, от около 5% до около 10% или от около 15% до около 20%. В других конкретных вариантах осуществления углеводный эксципиент может присутствовать в количестве 1%, или 1,5%, или 2%, или 2,5%, или 3%, или 4%, или 5%, или 10%, или 15%, или 20%.[0269] In some embodiments, the composition contains a carbohydrate excipient. Carbohydrate excipients may act, for example, as viscosity increasing agents, stabilizers, bulking agents, solubilizing agents, and the like. Carbohydrate excipients are generally present in an amount of from about 1% to about 99% by weight or volume, for example, from about 0.1% to about 20%, from about 0.1% to about 15%, from about 0.1 % to about 5%, from about 1% to about 20%, from about 5% to about 15%, from about 8% to about 10%, from about 10% to about 15%, from about 15% to about 20% , from 0.1% to 20%, from 5% to 15%, from 8% to 10%, from 10% to 15%, from 15% to 20%, from about 0.1% to about 5%, from about 5% to about 10% or about 15% to about 20%. In other specific embodiments, the carbohydrate excipient may be present in an amount of 1%, or 1.5%, or 2%, or 2.5%, or 3%, or 4%, or 5%, or 10%, or 15%, or 20%.

[0270] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит углеводный эксципиент. Углеводные эксципиенты, подходящие для применения в композиции, включают, но не ограничиваются этим, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелицитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит) и т.п. В определенных вариантах осуществления углеводные эксципиенты для применения в предложенных в данном документе композициях выбраны из сахарозы, трегалозы, лактозы, маннита и раффинозы. В конкретном варианте осуществления углеводный эксципиент представляет собой трегалозу. В другом конкретном варианте осуществления углеводный эксципиент представляет собой маннит. В другом конкретном варианте осуществления углеводный эксципиент представляет собой сахарозу. В другом конкретном варианте осуществления углеводный эксципиент представляет собой раффинозу. Чистота буферного углеводного эксципиента должна составлять по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5%.[0270] In some embodiments, the composition contains a carbohydrate excipient. Carbohydrate excipients suitable for use in the composition include, but are not limited to, monosaccharides such as fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, sorbose and the like; disaccharides such as lactose, sucrose, trehalose, cellobiose and the like; polysaccharides such as raffinose, melicitose, maltodextrins, dextrans, starches and the like; and alditols such as mannitol, xylitol, maltitol, lactitol, xylitol, sorbitol (glucite), and the like. In certain embodiments, carbohydrate excipients for use in the compositions provided herein are selected from sucrose, trehalose, lactose, mannitol, and raffinose. In a specific embodiment, the carbohydrate excipient is trehalose. In another specific embodiment, the carbohydrate excipient is mannitol. In another specific embodiment, the carbohydrate excipient is sucrose. In another specific embodiment, the carbohydrate excipient is raffinose. The purity of the buffered carbohydrate excipient must be at least 98%, or at least 99%, or at least 99.5%.

[0271] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит трегалозу. В определенных вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере около 1%, по меньшей мере около 2%, по меньшей мере около 4%, по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30% или по меньшей мере около 40% трегалозы. В другом варианте осуществления композиция содержит от около 1% до около 40%, от около 1% до около 30%, от около 1% до около 20%, от около 2% до около 40%, от около 2% до около 30%, от около 2% до около 20%, от около 4% до около 40%, от около 4% до около 30% или от около 4% до около 20% трегалозы. В другом варианте осуществления композиция содержит около 1%, около 2%, около 4%, около 6%, около 8%, около 15%, около 20%, около 30% или около 40% трегалозы. В конкретном варианте осуществления композиция содержит около 4%, около 6% или около 15% трегалозы.[0271] In some embodiments, the composition contains trehalose. In certain embodiments, the composition contains at least about 1%, at least about 2%, at least about 4%, at least about 8%, at least about 20%, at least about 30%, or at least at least about 40% trehalose. In another embodiment, the composition contains from about 1% to about 40%, from about 1% to about 30%, from about 1% to about 20%, from about 2% to about 40%, from about 2% to about 30% , about 2% to about 20%, about 4% to about 40%, about 4% to about 30%, or about 4% to about 20% trehalose. In another embodiment, the composition contains about 1%, about 2%, about 4%, about 6%, about 8%, about 15%, about 20%, about 30%, or about 40% trehalose. In a specific embodiment, the composition contains about 4%, about 6%, or about 15% trehalose.

[0272] В определенных вариантах осуществления композиция содержит эксципиент. В конкретном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере один эксципиент, выбранный из сахара, соли, поверхностно-активного вещества, аминокислоты, полиола, хелатирующего агента, эмульгатора и консерванта. В определенных вариантах осуществления композиция содержит соль, например, соль, выбранную из NaCl, KCl, CaCl2 и MgCl2. В конкретном варианте осуществления композиция содержит NaCl.[0272] In certain embodiments, the composition contains an excipient. In a specific embodiment, the composition contains at least one excipient selected from sugar, salt, surfactant, amino acid, polyol, chelating agent, emulsifier and preservative. In certain embodiments, the composition contains a salt, for example, a salt selected from NaCl, KCl, CaCl2 and MgCl2. In a specific embodiment, the composition contains NaCl.

[0273] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит аминокислоту, например, лизин, аргинин, глицин, гистидин, или соль аминокислоты. Композиция может содержать по меньшей мере около 1 мМ, по меньшей мере около 10 мМ, по меньшей мере около 25 мМ, по меньшей мере около 50 мМ, по меньшей мере около 100 мМ, по меньшей мере около 150 мМ, по меньшей мере около 200 мМ, по меньшей мере около 250 мМ, по меньшей мере около 300 мМ, по меньшей мере около 350 мМ или по меньшей мере около 400 мМ аминокислоты. В другом варианте осуществления композиция может содержать от около 1 мМ до около 100 мМ, от около 10 мМ до около 150 мМ, от около 25 мМ до около 250 мМ, от около 25 мМ до около 300 мМ, от около 25 мМ до около 350 мМ, от около 25 мМ до около 400 мМ, от около 50 мМ до около 250 мМ, от около 50 мМ до около 300 мМ, от около 50 мМ до около 350 мМ, от около 50 мМ до около 400 мМ, от около 100 мМ до около 250 мМ, от около 100 мМ до около 300 мМ, от около 100 мМ до около 400 мМ, от около 150 мМ до около 250 мМ, от около 150 мМ до около 300 мМ или от около 150 мМ до около 400 мМ аминокислоты. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит около 1 мМ, 1,6 мМ, 25 мМ, около 50 мМ, около 100 мМ, около 150 мМ, около 200 мМ, около 250 мМ, около 300 мМ, около 350 мМ или около 400 мМ аминокислоты.[0273] In some embodiments, the composition contains an amino acid, such as lysine, arginine, glycine, histidine, or a salt of an amino acid. The composition may contain at least about 1 mM, at least about 10 mM, at least about 25 mM, at least about 50 mM, at least about 100 mM, at least about 150 mM, at least about 200 mM, at least about 250 mM, at least about 300 mM, at least about 350 mM, or at least about 400 mM amino acid. In another embodiment, the composition may contain from about 1 mM to about 100 mM, from about 10 mM to about 150 mM, from about 25 mM to about 250 mM, from about 25 mM to about 300 mM, from about 25 mM to about 350 mM, from about 25 mM to about 400 mM, from about 50 mM to about 250 mM, from about 50 mM to about 300 mM, from about 50 mM to about 350 mM, from about 50 mM to about 400 mM, from about 100 mM to about 250 mM, from about 100 mM to about 300 mM, from about 100 mM to about 400 mM, from about 150 mM to about 250 mM, from about 150 mM to about 300 mM, or from about 150 mM to about 400 mM amino acids. In a further embodiment, the composition contains about 1 mM, 1.6 mM, 25 mM, about 50 mM, about 100 mM, about 150 mM, about 200 mM, about 250 mM, about 300 mM, about 350 mM, or about 400 mM amino acid .

[0274] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит поверхностно-активное вещество. В контексте данного документа термин «поверхностно-активное вещество» относится к органическим веществам, имеющим амфипатическую структуру; а именно, они состоят из групп с противоположной растворимостью, как правило, растворимой в масле углеводородной цепи и растворимой в воде ионной группы. Поверхностно-активные вещества можно классифицировать в зависимости от заряда поверхностно-активного фрагмента, на анионные, катионные и неионные поверхностно-активные вещества. Поверхностно-активные вещества часто используют в качестве смачивающих, емульгирующих, солюбилизирующих и диспергирующих агентов для различных фармацевтических композиций и препаратов биологических материалов. Фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20 или 80); полиоксамеры (например, полоксамер 188); Тритон; октилгликозид натрия; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-сульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-саркозин; линолеил-, миристил- или цетил-бетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеамидопропил-, миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-бетаин (например, лауроамидопропил); миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-диметиламин; натрия метил-кокоил- или динатрия метил олеил-таурат; и ряд MONAQUA® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), полиэтилгликоль, полипропилгликоль и сополимеры этилен- и пропиленгликоля (например, ПЛЮРОНИКИ® PF68 и т.д.), можно необязательно добавлять в композиции для снижения агрегации. В определенных вариантах осуществления композиция содержит полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 или полисорбат 80. Поверхностно-активные вещества в особенности полезны в случае применения насоса или пластикового контейнера для введения композиции. Наличие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества снижает подверженность белка агрегации. Композиции могут содержать полисорбат в концентрации от около 0,001% до около 1%, или от около 0,001% до около 0,1%, или от около 0,01% до около 0,1%. В других конкретных вариантах осуществления композиции содержат полисорбат в концентрации 0,001%, или 0,002%, или 0,003%, или 0,004%, или 0,005%, или 0,006%, или 0,007%, или 0,008%, или 0,009%, или 0,01%, или 0,015%, или 0,02%.[0274] In some embodiments, the composition contains a surfactant. As used herein, the term "surfactant" refers to organic substances having an amphipathic structure; namely, they are composed of groups with opposite solubilities, typically an oil-soluble hydrocarbon chain and a water-soluble ionic group. Surfactants can be classified based on the charge of the surfactant moiety into anionic, cationic and nonionic surfactants. Surfactants are often used as wetting, emulsifying, solubilizing and dispersing agents for various pharmaceutical compositions and biological preparations. Pharmaceutically acceptable surfactants such as polysorbates (eg polysorbates 20 or 80); polyoxamers (eg poloxamer 188); Triton; sodium octyl glycoside; lauryl-, myristyl-, linoleyl- or stearyl-sulfobetaine; lauryl-, myristyl-, linoleyl- or stearyl-sarcosine; linoleyl-, myristyl- or cetyl-betaine; lauroamidopropyl, cocamidopropyl, linoleamidopropyl, myristamidopropyl, palmidopropyl or isostearamidopropyl betaine (eg lauroamidopropyl); myristamidopropyl-, palmidopropyl- or isostearamidopropyl-dimethylamine; sodium methyl cocoyl or disodium methyl oleyl taurate; and the MONAQUA® series (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polyethylglycol, polypropylglycol, and ethylene-propylene glycol copolymers (eg, PLURONICS® PF68, etc.), may optionally be added to compositions to reduce aggregation. In certain embodiments, the composition contains polysorbate 20, polysorbate 40, polysorbate 60, or polysorbate 80. Surfactants are particularly useful when a pump or plastic container is used to administer the composition. The presence of a pharmaceutically acceptable surfactant reduces the susceptibility of the protein to aggregation. The compositions may contain polysorbate at a concentration of from about 0.001% to about 1%, or from about 0.001% to about 0.1%, or from about 0.01% to about 0.1%. In other specific embodiments, the compositions contain polysorbate at a concentration of 0.001%, or 0.002%, or 0.003%, or 0.004%, or 0.005%, or 0.006%, or 0.007%, or 0.008%, or 0.009%, or 0.01% , or 0.015%, or 0.02%.

[0275] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит другие эксципиенты и/или добавки, включая, но не ограничиваясь этим, разбавители, связующие вещества, стабилизаторы, липофильные растворители, консерванты, адъюванты и т.п. Фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или добавки можно использовать в предложенных в данном документе композициях. Обычно используемые эксципиенты/добавки, такие как фармацевтически приемлемые хелаторы (например, без ограничения, ЭДТА, ДТПА или ЭГТА), можно необязательно добавлять в композиции для снижения агрегации. Эти добавки в особенности полезны в случае применения насоса или пластикового контейнера для введения композиции.[0275] In some embodiments, the composition contains other excipients and/or additives, including, but not limited to, diluents, binders, stabilizers, lipophilic solvents, preservatives, adjuvants, and the like. Pharmaceutically acceptable excipients and/or additives can be used in the compositions provided herein. Commonly used excipients/additives, such as pharmaceutically acceptable chelators (eg, without limitation, EDTA, DTPA or EGTA), can optionally be added to the compositions to reduce aggregation. These additives are particularly useful when a pump or plastic container is used to administer the composition.

[0276] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит консервант. Консерванты, такие как фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензиловый спирт, фенилмеркурнитрит, феноксиэтанол, формальдегид, хлорбутанол, хлорид магния (например, без ограничения, гексагидрат), алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), бензалкония хлорид, бензетония хлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал или их смеси, можно необязательно добавлять в композиции в любой подходящей концентрации, например, от около 0,001% до около 5%, или любом промежуточном диапазоне. Концентрация консерванта, используемого в композициях, представляет собой концентрацию, достаточную для оказания противомикробного действия. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и могут быть легко определены специалистом в данной области техники.[0276] In some embodiments, the composition contains a preservative. Preservatives such as phenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, chlorocresol, benzyl alcohol, phenylmercuritrite, phenoxyethanol, formaldehyde, chlorobutanol, magnesium chloride (e.g., but not limited to, hexahydrate), alkylparaben (methyl-, ethyl-, propyl-, butyl-, etc.), benzalkonium chloride, benzethonium chloride, sodium dehydroacetate and thimerosal, or mixtures thereof, may optionally be added to the compositions at any suitable concentration, for example, from about 0.001% to about 5%, or any intermediate range. The concentration of preservative used in the compositions is a concentration sufficient to provide antimicrobial effect. Such concentrations depend on the preservative chosen and can be easily determined by one skilled in the art.

[0277] В некоторых вариантах осуществления композиция является изотонической с человеческой кровью, при этом композиции имеют практические такое же осмотическое давление, что и человеческая кровь. Такие изотонические композиции в общем случае имеют осмотическое давление от около 250 мОсм до около 350 мОсм. Изотоничность можно измерять, например, используя осмометр давления пара или осмометр по точке замерзания. Тоничность композиции доводят, используя модификаторы тоничности. «Модификаторами тоничности» являются фармацевтически приемлемые инертные вещества, которые можно добавлять в композицию для обеспечения изотоничности композиции. Модификаторы тоничности, подходящие для предложенных в данном документе композиций, включают, но не ограничиваются этим, сахариды, соли и аминокислоты.[0277] In some embodiments, the composition is isotonic with human blood, wherein the compositions have substantially the same osmotic pressure as human blood. Such isotonic compositions generally have an osmotic pressure of from about 250 mOsm to about 350 mOsm. Isotonicity can be measured, for example, using a vapor pressure osmometer or a freezing point osmometer. The tonicity of the composition is adjusted using tonicity modifiers. "Tonicity modifiers" are pharmaceutically acceptable inert substances that can be added to a composition to ensure that the composition is isotonic. Tonicity modifiers suitable for the compositions provided herein include, but are not limited to, saccharides, salts and amino acids.

[0278] В определенных вариантах осуществления композиция является апирогенной композицией, которая практически не содержит эндотоксины и/или родственные пирогенные вещества. Эндотоксины включают токсины, которые содержатся внутри микроорганизма и высвобождаются только при разрушении или гибели микроорганизма. Пирогенные вещества также включают индуцирующие повышение температуры термостабильные вещества из внешней мембраны бактерий и других микроорганизмов. Оба типа веществ могут вызывать повышение температуры, гипотензию и шок при введении людям. Из-за потенциальных вредоносных эффектов даже низкие количества эндотоксинов необходимо удалять из внутривенно вводимых фармацевтических лекарственных растворов. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США («FDA») установило верхнюю границу в 5 единиц эндотоксина (ЕЭ) на дозу на килограмм массы тела в одночасовой период для внутривенного применения лекарственных препаратов (Фармакопейная конвенция США, Фармакопейный форум 26 (1):223 (2000)). Когда терапевтические белки вводят в количествах нескольких сотен или тысяч миллиграммов на килограмм массы тела, как может быть в случае с представляющими интерес белками (например, антителами), даже следовые количества вредоносного и опасного эндотоксина необходимо удалять. В некоторых вариантах осуществления уровни эндотоксинов и пирогенные уровни в композиции составляют менее 10 ЕЭ/мг, или менее 5 ЕЭ/мг, или менее 1 ЕЭ/мг, или менее 0,1 ЕЭ/мг, или менее 0,01 ЕЭ/мг, или менее 0,001 ЕЭ/мг.[0278] In certain embodiments, the composition is a pyrogen-free composition that is substantially free of endotoxins and/or related pyrogenic substances. Endotoxins include toxins that are contained within a microorganism and are released only when the microorganism is destroyed or killed. Pyrogens also include temperature-inducing, heat-stable substances from the outer membrane of bacteria and other microorganisms. Both types of substances can cause fever, hypotension, and shock when administered to humans. Because of the potential for harmful effects, even low levels of endotoxins must be removed from intravenously administered pharmaceutical drug solutions. The US Food and Drug Administration ("FDA") has established an upper limit of 5 endotoxin units (EU) per dose per kilogram of body weight over a one-hour period for intravenous drug use (USP Convention, Pharmacopoeial Forum 26(1) :223 (2000)). When therapeutic proteins are administered in quantities of several hundred or thousands of milligrams per kilogram of body weight, as may be the case with proteins of interest (eg, antibodies), even trace amounts of harmful and dangerous endotoxin must be removed. In some embodiments, the endotoxin levels and pyrogenic levels in the composition are less than 10 EU/mg, or less than 5 EU/mg, or less than 1 EU/mg, or less than 0.1 EU/mg, or less than 0.01 EU/mg, or less than 0.001 EU/mg.

[0279] В случае применения для in vivo введения, описанная в данном документе композиция должна быть стерильной. Композицию можно стерилизовать различными методами стерилизации, включая стерильную фильтрацию, облучение и т.д. В определенных вариантах осуществления композицию подвергают стерильной фильтрации с помощью предварительно простерилизованного 0,22-микронного фильтра. Стерильные композиции для инъекции можно составлять в соответствии с традиционной фармацевтической практикой, как описано в “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005). Композиции, содержащие представляющие интерес белки (например, антитела), такие как раскрыты в данном документе, обычно хранят в лиофилизированной форме или в растворе. Подразумевается, что стерильные композиции, содержащие представляющие интерес белки (например, антитела), помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, пакет или флакон для внутривенного раствора, имеющий адаптер, который позволяет извлекать композицию, такой как пробка, прокалываемая гиподермической иглой для инъекций. В определенных вариантах осуществления композиция предложена в виде предварительно заполненного шприца.[0279] When used for in vivo administration, the composition described herein must be sterile. The composition can be sterilized by various sterilization methods, including sterile filtration, irradiation, etc. In certain embodiments, the composition is sterile filtered using a pre-sterilized 0.22 micron filter. Sterile injectable compositions can be formulated in accordance with traditional pharmaceutical practice, as described in “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005). Compositions containing proteins of interest (eg, antibodies), such as those disclosed herein, are typically stored in lyophilized form or in solution. It is contemplated that sterile compositions containing proteins of interest (eg, antibodies) are placed in a container having a sterile access port, such as an intravenous solution bag or vial having an adapter that allows the composition to be removed, such as a plug pierced by a hypodermic needle to injections. In certain embodiments, the composition is provided in the form of a pre-filled syringe.

[0280] В определенных вариантах осуществления композиция представляет собой лиофилизированный состав. Термин «лиофилизированный» или «высушенный сублимацией» включает состояние вещества, которое было подвергнуто процедуре сушки, такой как лиофилизация, в которой было удалено по меньшей мере 50% влаги.[0280] In certain embodiments, the composition is a lyophilized formulation. The term "lyophilized" or "freeze-dried" includes the state of a substance that has been subjected to a drying procedure, such as lyophilization, in which at least 50% of the moisture has been removed.

[0281] Вне зависимости от выбранного пути введения, предложенные в данном документе агенты, которые можно использовать в подходящей гидратированной форме, и/или предложенные в данном документе фармацевтические композиции готовят в фармацевтически приемлемых дозированных формах традиционными способами, известными специалистам в данной области техники.[0281] Regardless of the route of administration chosen, agents provided herein that can be used in a suitable hydrated form and/or pharmaceutical compositions provided herein are prepared in pharmaceutically acceptable dosage forms by conventional methods known to those skilled in the art.

[0282] В предложенных в данном документе способах человеческое антитело, Fc-слитый белок и/или фармацевтические композиции можно доставлять любым подходящим путем введения, включая пероральный, назальный, например в виде спрея, ректальный, внутривагинальный, парентеральный, интрацистернальный и местный, например, используя порошки, мази или капли, включая буккальный и подъязычный. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции доставляют обычным способом (например, путем перорального или парентерального введения).[0282] In the methods provided herein, the human antibody, Fc fusion protein, and/or pharmaceutical compositions can be delivered by any suitable route of administration, including oral, nasal, e.g., spray, rectal, intravaginal, parenteral, intracisternal, and topical, e.g. using powders, ointments or drops, including buccal and sublingual. In certain embodiments, the pharmaceutical compositions are delivered in a conventional manner (eg, by oral or parenteral administration).

[0283] В определенных вариантах осуществления фактические уровни дозировки активных ингредиентов в описанных в данном документе фармацевтических композициях можно варьировать, чтобы получить количество активного ингредиента, эффективное для достижения необходимого терапевтического ответа для животной модели, композиции и режима введения, без токсического эффекта для животной модели.[0283] In certain embodiments, the actual dosage levels of the active ingredients in the pharmaceutical compositions described herein can be varied to provide an amount of the active ingredient effective to achieve the desired therapeutic response for the animal model, composition and mode of administration, without causing toxicity to the animal model.

[0284] Например, в определенных вариантах осуществления описанных в данном документе отличных от человека животных используют для определения фармакокинетических профилей одного или более кандидатных человеческих антител. В различных вариантах осуществления одно или более описанных в данном документе отличных от человека животных и одно или более контрольных или референсных отличных от человека животных подвергают воздействию одного или более кандидатных человеческих антител в различных дозах (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или более), Кандидатные терапевтические антитела можно вводить любым необходимым путем введения, включая парентеральный и непарентеральный пути введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, внутрипортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутричерепной, внутриплевральный или другие пути введения. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, назальный, трансдермальный, легочный, ректальный, буккальный, вагинальный, глазной. Введение также можно осуществлять путем непрерывной инфузии, местного введения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран и т.п.) и/или внутривенной инъекции. Кровь берут у отличных от человека животных (гуманизированных и контрольных) в различные моменты времени (например, 0 ч, 6 ч, 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток или до 30 и более суток). Можно проводить различные анализы для определения фармакокинетических профилей вводимых кандидатных терапевтических антител, используя образцы, полученные от отличных от человека животных, описанных в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, анализ на общий IgG, ответ против терапевтического антитела, агглютинацию и т.д.[0284] For example, in certain embodiments described herein, non-human animals are used to determine the pharmacokinetic profiles of one or more candidate human antibodies. In various embodiments, one or more non-human animals described herein and one or more control or reference non-human animals are exposed to one or more candidate human antibodies at different doses (e.g., 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg or 50 mg/kg or more), Candidate therapeutic antibodies can be administered by any necessary route of administration, including parenteral and non-parenteral routes of administration. Parenteral routes include, for example, intravenous, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intraspinal, intrathecal, intracerebroventricular, intracranial, intrapleural or other routes of administration. Non-parenteral routes include, for example, oral, nasal, transdermal, pulmonary, rectal, buccal, vaginal, ocular. Administration may also be by continuous infusion, local administration, sustained release from implants (gels, membranes, etc.) and/or intravenous injection. Blood is collected from non-human animals (humanized and control) at various time points (for example, 0 hours, 6 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days or up to 30 or more days). Various assays can be performed to determine the pharmacokinetic profiles of administered therapeutic antibody candidates using samples obtained from non-human animals described herein, including, but not limited to, assays for total IgG, anti-therapeutic antibody response, agglutination, etc. .

[0285] В различных вариантах осуществления отличных от человека животных, описанных в данном документе, используют для определения терапевтического эффекта блокировки или модуляции активности представляющего интерес полипептида и влияния на генную экспрессию в результате клеточных изменений или, в контексте рецепторного полипептида, плотность рецепторного полипептида на поверхности клеток у отличных от человека животных. В различных вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, или выделенные из него клетки, подвергают воздействию кандидатного терапевтического средства, которое связывает представляющий интерес полипептид, и через некоторое время анализируют в отношении эффектов на специфические клеточные процессы, которые связаны с указанным представляющим интерес полипептидом, например, взаимодействия лиганд-рецептор или передачу сигнала.[0285] In various embodiments, non-human animals described herein are used to determine the therapeutic effect of blocking or modulating the activity of a polypeptide of interest and influencing gene expression as a result of cellular changes or, in the context of a receptor polypeptide, the density of the receptor polypeptide on the surface cells in non-human animals. In various embodiments, a non-human animal described herein, or cells isolated from it, is exposed to a therapeutic candidate that binds the polypeptide of interest and is analyzed over time for effects on specific cellular processes that are associated with the polypeptide of interest. polypeptide of interest, such as ligand-receptor interactions or signal transduction.

[0286] Описанные в данном документе отличные от человека животные обеспечивают улучшенную in vivo систему для разработки и отбора человеческих антител для применения при онкологических и/или инфекционных заболеваниях. В различных вариантах осуществления отличным от человека животным, описанным в данном документе, и контрольным отличным от человека животным (например, имеющим генетическую модификацию, которая отличается от описанной в данном документе, или не имеющим генетической модификации, т.е. дикого типа) могут имплантировать опухоли (или опухолевые клетки) или инфицировать вирусом (например, вирусом гриппа, ВИЧ, HCV, HPV и т.д.). После имплантации или инфекции отличным от человека животным можно вводить кандидатное терапевтическое средство. Опухоли или вирусу можно давать достаточное время для развития в одной или более локациях в организме отличных от человека животных перед введением кандидатного терапевтического средства. В альтернативном и/или дополнительном варианте у таких отличных от человека животных можно отслеживать иммунный ответ для изучения характеристик и отбора потенциальных человеческих антител, которые можно разрабатывать в качестве терапевтического средства.[0286] The non-human animals described herein provide an improved in vivo system for the development and selection of human antibodies for use in cancer and/or infectious diseases. In various embodiments, a non-human animal described herein and a control non-human animal (e.g., having a genetic modification that differs from that described herein, or not having a genetic modification, i.e., wild type) may be implanted with tumors (or tumor cells) or infected with a virus (for example, influenza virus, HIV, HCV, HPV, etc.). Following implantation or infection, a candidate therapeutic agent can be administered to non-human animals. The tumor or virus may be given sufficient time to develop in one or more locations in the body of non-human animals before administration of the candidate therapeutic agent. Alternatively and/or additionally, the immune response of such non-human animals can be monitored to characterize and screen for potential human antibodies that can be developed as therapeutics.

Способы получения человеческих антителMethods for obtaining human antibodies

[0287] В определенных аспектах в данном документе предложен способ получения человеческого антитела с использованием грызуна (например, мыши или крысы), который содержит гуманизированный локус тяжелой цепи, предложенный в данном документе, и человеческий локус легкой цепи, предложенный в данном документе (например, гуманизированный локус легкой цепи κ и/или λ, предложенный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус CD79a, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус CD79b, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус β2M, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус FcγR1a, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус FcγR2b, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR2c, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR3a, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус FcγR3b, предложенный в данном документе.[0287] In certain aspects, provided herein is a method for producing a human antibody using a rodent (e.g., mouse or rat) that contains a humanized heavy chain locus as provided herein and a human light chain locus as provided herein (e.g., humanized κ and/or λ light chain locus as provided herein). In some embodiments, the rodent further comprises a humanized CD79a locus as provided herein and/or a humanized CD79b locus as provided herein. In some embodiments, the rodent further comprises a humanized FcRn locus as provided herein and/or a humanized β2M locus as provided herein. In certain embodiments, the rodent further comprises a humanized FcγR1a locus as provided herein. In some embodiments, the rodent further comprises a humanized FcεR1α locus as provided herein. In some embodiments, the rodent further comprises a humanized FcγR2b locus as provided herein, a humanized FcγR2c locus as provided herein, a humanized FcγR3a locus as provided herein, and/or a humanized FcγR3b locus as provided herein.

[0288] Предложенных в данном документе грызунов можно использовать для создания антитела (например, человеческого антитела), используя стандартные способы, известные в данной области техники. Например, в некоторых вариантах осуществления предложенного в данном документе грызуна иммунизируют представляющим интерес антигеном в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы у грызуна развился иммунный ответ на указанный представляющий интерес антиген. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес антиген представляет собой человеческое антитело (например, человеческое терапевтическое антитело) или Fc-слитый белок (например, терапевтической Fc-слитый белок). Антитела выделяют из грызуна (или одной или более клеток, например, одной или более B-клеток) и изучают их характеристики, используя различные анализы с определением, например, аффинности, специфичности, картирования эпитопов, способности блокировать взаимодействие лиганд-рецептор, ингибирования активации рецепторов и т.д.[0288] Rodents provided herein can be used to generate an antibody (eg, a human antibody) using standard methods known in the art. For example, in some embodiments provided herein, a rodent is immunized with an antigen of interest under conditions and for a period of time sufficient to cause the rodent to develop an immune response to the antigen of interest. In some embodiments, the antigen of interest is a human antibody (eg, a human therapeutic antibody) or an Fc fusion protein (eg, a therapeutic Fc fusion protein). Antibodies are isolated from a rodent (or one or more cells, e.g., one or more B cells) and characterized using a variety of assays, e.g., affinity, specificity, epitope mapping, ability to block ligand-receptor interactions, inhibition of receptor activation etc.

[0289] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения антитела в организме грызуна (например, мыши или крысы), включающий этапы (а) иммунизации грызуна, который вырабатывает антитела, описанные в данном документе, представляющим интерес антигеном; (b) содержание грызуна в условиях, достаточных для того, чтобы у грызуна вырабатывался иммунный ответ на представляющий интерес антиген; и (c) выделение из грызуна или клетки грызуна антитела, которое связывает представляющий интерес антиген. В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает нарушение иммунологической толерантности к антигену у грызуна или удаление представляющего интерес антигена иным способом, например, с применением системы CRISPR/Cas9 и использованием некоторого количества направляющих РНК, для снижения или устранения экспрессии собственного антигена, гомологичного или содержащего одинаковый представляющий интерес эпитоп с представляющим интерес антигеном, которым иммунизирован грызун (например, как описано в публикации патента США №2017/0332610, которая включена в данный документ посредством ссылки).[0289] In some embodiments, a method of producing an antibody in a rodent (eg, a mouse or rat) is provided, comprising the steps of (a) immunizing a rodent that produces antibodies described herein with an antigen of interest; (b) maintaining the rodent under conditions sufficient to permit the rodent to mount an immune response to the antigen of interest; and (c) isolating from the rodent or rodent cell an antibody that binds the antigen of interest. In some embodiments, the method further includes breaking immunological tolerance to an antigen in a rodent or otherwise removing the antigen of interest, for example, using the CRISPR/Cas9 system and using a number of guide RNAs, to reduce or eliminate expression of a self-antigen that is homologous or contains the same an epitope of interest with an antigen of interest with which a rodent is immunized (for example, as described in US Patent Publication No. 2017/0332610, which is incorporated herein by reference).

[0290] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь человека, в организме грызуна, включающий этапы (а) иммунизации грызуна, который экспрессирует человеческие антитела, описанные в данном документе, представляющим интерес антигеном; (b) содержание грызуна в условиях, достаточных для того, чтобы у грызуна вырабатывался иммунный ответ на представляющий интерес антиген; и (c) выделение из грызуна или клетки грызуна нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь человека.[0290] In some embodiments, a method is provided for producing a nucleic acid encoding a human heavy and/or light chain in a rodent, comprising the steps of (a) immunizing a rodent that expresses human antibodies described herein with an antigen of interest; (b) maintaining the rodent under conditions sufficient to permit the rodent to mount an immune response to the antigen of interest; and (c) isolating from a rodent or rodent cell a nucleic acid encoding a human heavy and/or light chain.

[0291] В некоторых вариантах осуществления предложенных в данном документе грызунов можно использовать для создания антител против лекарственных препаратов (например, анти-идиотипических антител). Например, в некоторых вариантах осуществления предложенного в данном документе грызуна иммунизируют человеческим терапевтическим антителом в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы у грызуна развился иммунный ответ на указанное человеческое терапевтическое антитело. В некоторых вариантах осуществления человеческое терапевтическое антитело имеет такие же константные домены тяжелой цепи, что и константные домены тяжелой цепи, кодируемые гуманизированным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина предложенного в данном документе грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческое терапевтическое антитело имеет такой же константный домен легкой цепи, что и константный домен легкой цепи, кодируемый гуманизированным локусом легкой цепи иммуноглобулина (например, гуманизированным локусом легкой цепи κ и/или λ) предложенного в данном документе грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун не содержит в геноме один или более генных сегментов вариабельной области человека, из которых получено терапевтическое антитело (например, один или более локусов иммуноглобулина у грызуна содержат вариабельные области грызуна или их части). Антитела против лекарственного препарата (например, анти-идиотипические антитела) выделяют из грызуна (или одной или более клеток, например, одной или более B-клеток) и изучают их характеристики, используя различные анализы с определением, например, аффинности, специфичности, картирования эпитопов, способности блокировать взаимодействие антиген-терапевтическое антитело и т.д. Созданные антитела против лекарственного препарата (например, анти-идиотипические антитела) можно использовать для анализа фармакокинетики (ФК) человеческого терапевтического антитела, или использовать для анализа иммуногенности человеческого терапевтического антитела во время доклинического анализа, или использовать для локализации человеческого терапевтического антитела.[0291] In some embodiments provided herein, rodents can be used to generate anti-drug antibodies (eg, anti-idiotypic antibodies). For example, in some embodiments provided herein, a rodent is immunized with a human therapeutic antibody under conditions and for a period of time sufficient to allow the rodent to develop an immune response to the human therapeutic antibody. In some embodiments, the human therapeutic antibody has the same heavy chain constant domains as the heavy chain constant domains encoded by the humanized rodent immunoglobulin heavy chain locus as provided herein. In some embodiments, the human therapeutic antibody has the same light chain constant domain as the light chain constant domain encoded by a humanized immunoglobulin light chain locus (e.g., a humanized κ and/or λ light chain locus) of a rodent as provided herein. In some embodiments, the rodent does not contain in its genome one or more human variable region gene segments from which the therapeutic antibody is derived (eg, one or more immunoglobulin loci in the rodent contain rodent variable regions or portions thereof). Anti-drug antibodies (eg, anti-idiotypic antibodies) are isolated from a rodent (or one or more cells, eg, one or more B cells) and characterized using various assays, eg, affinity, specificity, epitope mapping , the ability to block the antigen-therapeutic antibody interaction, etc. Generated anti-drug antibodies (eg, anti-idiotypic antibodies) can be used to analyze the pharmacokinetics (PK) of a human therapeutic antibody, or used to analyze the immunogenicity of a human therapeutic antibody during preclinical analysis, or used to localize a human therapeutic antibody.

[0292] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения антитела против лекарственного препарата (например, анти-идиотипического антитела), включающий этапы (а) иммунизации грызуна, который вырабатывает антитела, содержащие человеческие константные области, описанные в данном документе, человеческим терапевтическим антителом, которое совпадает по изотипу с человеческой константной областью, присутствующей у грызуна; (b) содержание грызуна в условиях, достаточных для того, чтобы у грызуна вырабатывался иммунный ответ на человеческое терапевтическое антитело; и (c) выделение из грызуна или клетки грызуна антитела, которое связывает человеческое терапевтическое антитело.[0292] In some embodiments, a method of producing an anti-drug antibody (e.g., an anti-idiotypic antibody) is provided, comprising the steps of (a) immunizing a rodent that produces antibodies containing human constant regions described herein with a human therapeutic antibody that isotype-matched to the human constant region present in rodents; (b) maintaining the rodent under conditions sufficient to cause the rodent to mount an immune response to the human therapeutic antibody; and (c) isolating from the rodent or rodent cell an antibody that binds the human therapeutic antibody.

Способы создания генетически модифицированных отличных от человека животных и ЭС-клетокMethods for creating genetically modified non-human animals and ES cells

[0293] В определенных аспектах в данном документе предложены способы создания отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые содержат один или более генетически модифицированных локусов, предложенных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые содержат гуманизированный локус тяжелой цепи, предложенный в данном документе, и человеческий локус легкой цепи, предложенный в данном документе (например, гуманизированный локус легкой цепи κ и/или λ, предложенный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус CD79a, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус CD79b, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус β2M, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcγR1a, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcγR2a, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR2b, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR2c, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR3a, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус FcγR3b, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые содержат гуманизированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус β2M, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые содержат гуманизированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе. Типовые способы получения генетически модифицированных отличных от человека животных и ЭС-клеток, предложенных в данном документе, описаны в описании, примерах и/или на фигурах.[0293] In certain aspects, provided herein are methods for generating non-human animals (eg, mice or rats) and ES cells that contain one or more genetically modified loci provided herein. For example, in some embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (e.g., mice or rats) and ES cells that contain a humanized heavy chain locus as provided herein and a human light chain locus as provided herein. (eg, the humanized κ and/or λ light chain locus provided herein). In some embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (eg, mice or rats) and ES cells that further comprise a humanized CD79a locus as provided herein and/or a humanized CD79b locus as provided herein. In some embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (eg, mice or rats) and ES cells that further comprise a humanized FcRn locus as provided herein and/or a humanized β2M locus as provided herein. In some embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (eg, mice or rats) and ES cells that further comprise the humanized FcεR1α locus provided herein. In certain embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (eg, mice or rats) and ES cells that further comprise the humanized FcγR1a locus provided herein. In some embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (eg, mice or rats) and ES cells that further comprise the humanized FcεR1α locus provided herein. In some embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (e.g., mice or rats) and ES cells that further comprise a humanized FcγR2a locus as provided herein, a humanized FcγR2b locus as provided herein, a humanized FcγR2c locus , as provided herein, the humanized FcγR3a locus as provided herein, and/or the humanized FcγR3b locus as provided herein. In certain embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (eg, mice or rats) and ES cells that contain a humanized FcRn locus as provided herein and/or a humanized β2M locus as provided herein. In certain embodiments, provided herein are methods of producing non-human animals (eg, mice or rats) and ES cells that contain the humanized FcεR1α locus provided herein. Exemplary methods for producing genetically modified non-human animals and ES cells provided herein are described in the specification, examples, and/or figures.

НаборыSets

[0294] В данном документе предложены упаковка или набор, содержащие один или более контейнеров, заполненных по меньшей мере одним отличным от человека животным, не принадлежащими человеку клеткой, фрагментом ДНК и/или нацеленным вектором, описанными в описании, примерах и/или на фигурах. Наборы можно использовать любым приемлемым способов (например, исследовательским способом). Необязательно, к таким контейнерам может прилагаться уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем это уведомление отображает (а) утверждение органом, регулирующим производство, использование или продажу препаратов для введения человеку, (b) инструкции по применению, (c) контракт, который регулирует передачу материалов и/или биологических продуктов (например, отличного от человека животного или не принадлежащей человеку клетки, описанных в данном документе), между двумя или более сторонами, и их комбинации.[0294] Provided herein is a package or kit containing one or more containers filled with at least one non-human animal, non-human cell, DNA fragment and/or targeting vector described in the description, examples and/or figures . The kits can be used in any suitable manner (eg, in a research manner). Optionally, such containers may be accompanied by a notice in a form prescribed by the government agency regulating the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products, which notice shall reflect (a) approval by the agency regulating the manufacture, use, or sale of the preparations for human administration, (b ) instructions for use, (c) a contract that governs the transfer of materials and/or biological products (such as a non-human animal or non-human cell described herein) between two or more parties, and combinations thereof.

Дополнительные типовые варианты осуществленияAdditional exemplary embodiments

[0295] В типовом варианте осуществления 1 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.[0295] Exemplary Embodiment 1 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a V _H gene segment, a D _H gene segment, and a J gene segment _H ; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, an IgG transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. IgG, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region such that the rodent produces IgG antibodies comprising variable domains derived from a V _H gene segment, a _DH gene segment, and a J _H gene segment, and heavy chain constant domains , derived from the _CH gene segment.

[0296] В типовом варианте осуществления 2 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна.[0296] In Exemplary Embodiment 2, herein provided is the rodent of Embodiment 1, wherein the IgG transmembrane domain is a rodent IgG transmembrane domain.

[0297] В типовом варианте осуществления 3 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG человека.[0297] In Exemplary Embodiment 3, the rodent of Embodiment 1 is provided herein, wherein the IgG transmembrane domain is a human IgG transmembrane domain.

[0298] В типовом варианте осуществления 4 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-3, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна.[0298] Exemplary Embodiment 4 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-3, wherein the IgG cytoplasmic domain is a rodent IgG cytoplasmic domain.

[0299] В типовом варианте осуществления 5 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-3, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG человека.[0299] Exemplary Embodiment 5 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1 to 3, wherein the cytoplasmic domain of the IgG is a cytoplasmic domain of human IgG.

[0300] В типовом варианте осуществления 6 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG1.[0300] Exemplary Embodiment 6 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-5, wherein the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are domains IgG1.

[0301] В типовом варианте осуществления 7 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 6, отличающийся тем, что домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05.[0301] Exemplary Embodiment 7 herein provides the rodent of Embodiment 6, wherein the IgG1 domain is encoded by an allele selected from IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04, and IGHG1*05.

[0302] В типовом варианте осуществления 8 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG2.[0302] Exemplary Embodiment 8 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-5, wherein the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are domains IgG2.

[0303] В типовом варианте осуществления 9 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 8, отличающийся тем, что домен IgG2 кодируется аллелем, выбранным из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06.[0303] Exemplary Embodiment 9 herein provides the rodent of Embodiment 8, wherein the IgG2 domain is encoded by an allele selected from IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05, and IGHG2 *06.

[0304] В типовом варианте осуществления 10 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG3.[0304] Exemplary Embodiment 10 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-5, wherein the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are domains IgG3.

[0305] В типовом варианте осуществления 11 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 10, отличающийся тем, что домен IgG3 кодируется аллелем, выбранным из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19.[0305] Exemplary Embodiment 11 herein provides the rodent of Embodiment 10, wherein the IgG3 domain is encoded by an allele selected from IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3 *06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 and IGHG3*19.

[0306] В типовом варианте осуществления 12 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG4.[0306] Exemplary Embodiment 12 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-5, wherein the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are domains IgG4.

[0307] В типовом варианте осуществления 13 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 12, отличающийся тем, что домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04.[0307] Exemplary Embodiment 13 herein provides the rodent of Embodiment 12, wherein the IgG4 domain is encoded by an allele selected from IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03, and IGHG4*04.

[0308] В типовом варианте осуществления 14 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 6-13, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a или C_γ2c.[0308] Exemplary embodiment 14 herein provides the rodent of any one of embodiments 6-13, characterized in that a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain, and a C domain Human _H 3 is located at the locus of the endogenous gene segment C _γ2a or C _γ2c .

[0309] В типовом варианте осуществления 15 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 14, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2a или C_γ2c.[0309] Exemplary Embodiment 15 herein provides the rodent of Embodiment 14, wherein the _CH gene segment encoding the human _CH 1 domain, the human hinge region, the human _CH 2 domain, and the human _CH 3 domain are replaces the endogenous gene segment C _γ2a or C _γ2c .

[0310] В типовом варианте осуществления 16 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 6-13, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1.[0310] Exemplary embodiment 16 herein provides the rodent of any one of embodiments 6-13, characterized in that a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain, and a C domain Human _H 3, located in the locus of the endogenous gene segment C _γ1 .

[0311] В типовом варианте осуществления 17 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 16, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ1.[0311] Exemplary Embodiment 17 herein provides the rodent of Embodiment 16, wherein the _CH gene segment encoding the human _CH 1 domain, the human hinge region, the human _CH 2 domain, and the human _CH 3 domain are replaces the endogenous gene segment C _γ1 .

[0312] В типовом варианте осуществления 18 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 6-13, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b.[0312] Exemplary embodiment 18 herein provides the rodent of any one of embodiments 6-13, characterized in that a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain, and a C domain Human _H 3, located in the locus of the endogenous gene segment C _γ2b .

[0313] В типовом варианте осуществления 19 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 18, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2b.[0313] Exemplary Embodiment 19 herein provides the rodent of Embodiment 18, wherein the _CH gene segment encoding the human _CH 1 domain, the human hinge region, the human _CH 2 domain, and the human _CH 3 domain are replaces the endogenous gene segment C _γ2b .

[0314] В типовом варианте осуществления 20 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 6-13, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ3.[0314] Exemplary embodiment 20 herein provides the rodent of any one of embodiments 6-13, characterized in that a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain, and a C domain Human _H 3 is located at the locus of the endogenous gene segment C _γ3 .

[0315] В типовом варианте осуществления 21 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 20, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ3.[0315] Exemplary Embodiment 21 herein provides the rodent of Embodiment 20, wherein the _CH gene segment encoding the human _CH 1 domain, the human hinge region, the human _CH 2 domain, and the human _CH 3 domain are replaces the endogenous C _γ3 gene segment.

[0316] В типовом варианте осуществления 22 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-21, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ грызуна.[0316] Exemplary Embodiment 22 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-21, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cμ gene segment.

[0317] В типовом варианте осуществления 23 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-21, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ человека.[0317] Exemplary Embodiment 23 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-21, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cμ gene segment.

[0318] В типовом варианте осуществления 24 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-23, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ грызуна.[0318] Exemplary Embodiment 24 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-23, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cδ gene segment.

[0319] В типовом варианте осуществления 25 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-23, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.[0319] Exemplary Embodiment 25 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-23, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cδ gene segment.

[0320] В типовом варианте осуществления 26 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-25, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 грызуна.[0320] Exemplary Embodiment 26 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-25, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cγ1 gene segment.

[0321] В типовом варианте осуществления 27 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-26, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна.[0321] Exemplary embodiment 27 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-26, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent C _γ2a and/or C _γ2c gene segment.

[0322] В типовом варианте осуществления 28 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-27, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2b грызуна.[0322] Exemplary Embodiment 28 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-27, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent C _γ2b gene segment.

[0323] В типовом варианте осуществления 29 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-28, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 грызуна.[0323] Exemplary embodiment 29 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-28, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent C _γ3 gene segment.

[0324] В типовом варианте осуществления 30 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-29, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε грызуна.[0324] Exemplary embodiment 30 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-29, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cε gene segment.

[0325] В типовом варианте осуществления 31 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-29, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0325] Exemplary Embodiment 31 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-29, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0326] В типовом варианте осуществления 32 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-31, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α грызуна.[0326] Exemplary Embodiment 32 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-31, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cα gene segment.

[0327] В типовом варианте осуществления 33 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-31, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0327] Exemplary Embodiment 33 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-31, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0328] В типовом варианте осуществления 34 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-21, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.[0328] Exemplary Embodiment 34 herein provides the rodent of any one of Embodiments 1-21, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region comprises a human _Cμ gene segment, a human _Cδ gene segment, a human _Cγ3 gene segment, and human C _γ1 gene segment.

[0329] В типовом варианте осуществления 35 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 34, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.[0329] Exemplary Embodiment 35 herein provides the rodent of Embodiment 34, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment.

[0330] В типовом варианте осуществления 36 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 34, или осуществления 35, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0330] Exemplary Embodiment 36 herein provides the rodent of Embodiment 34, or Embodiment 35, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0331] В типовом варианте осуществления 37 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 34-36, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0331] Exemplary embodiment 37 herein provides the rodent of any one of embodiments 34-36, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0332] В типовом варианте осуществления 38 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgM, содержащий домен C_H1 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, домен C_H4 человека, трансмембранный домен IgM человека и цитоплазматический домен IgM человека, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgM, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.[0332] Exemplary embodiment 38 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a V _H gene segment, a D _H gene segment, and a J gene segment _H ; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgM constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, a human C _H 4 domain, and a human IgM transmembrane domain. and a cytoplasmic domain of human IgM, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgM antibodies comprising variable domains derived from a _VH gene segment, a _DH gene segment, and a _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from the _CH gene segment.

[0333] В типовом варианте осуществления 39 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 38, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.[0333] In exemplary embodiment 39, the rodent of embodiment 38 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cδ gene segment.

[0334] В типовом варианте осуществления 40 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 38 или 39, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 человека.[0334] Exemplary Embodiment 40 herein provides a rodent of Embodiment 38 or 39, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _γ3 C gene segment.

[0335] В типовом варианте осуществления 41 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 38-40, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 человека.[0335] Exemplary embodiment 41 herein provides the rodent of any one of embodiments 38-40, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cγ1 gene segment.

[0336] В типовом варианте осуществления 42 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 38-41, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека.[0336] Exemplary embodiment 42 herein provides the rodent of any one of embodiments 38-41, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment.

[0337] В типовом варианте осуществления 43 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 38-42, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ4 человека.[0337] Exemplary embodiment 43 herein provides the rodent of any one of embodiments 38-42, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _γ4 C gene segment.

[0338] В типовом варианте осуществления 44 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 38-43, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.[0338] Exemplary embodiment 44 herein provides the rodent of any one of embodiments 38-43, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region comprises a human _Cμ gene segment, a human _Cδ gene segment, a human _Cγ3 gene segment, and human C _γ1 gene segment.

[0339] В типовом варианте осуществления 45 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 44, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.[0339] Exemplary Embodiment 45 herein provides the rodent of Embodiment 44, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment.

[0340] В типовом варианте осуществления 46 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 44 или варианту осуществления 45, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0340] Exemplary Embodiment 46 herein provides a rodent of Embodiment 44 or Embodiment 45, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0341] В типовом варианте осуществления 47 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 44-46, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0341] Exemplary embodiment 47 herein provides the rodent of any one of embodiments 44-46, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0342] В типовом варианте осуществления 48 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgD, содержащий домен C_H1 человека, шарнирный домен H1 человека, шарнирный домен H2 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgD человека и цитоплазматический домен IgD человека, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgD, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.[0342] Exemplary embodiment 48 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a V _H gene segment, a D _H gene segment, and a J gene segment _H ; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgD constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human H1 hinge domain, a human H2 hinge domain, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, a human IgD transmembrane domain and a human IgD cytoplasmic domain, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region such that the rodent produces IgD antibodies comprising variable domains derived from the V _H gene segment, the D _H gene segment and the D H gene segment _JH , and heavy chain constant domains derived from the _CH gene segment.

[0343] В типовом варианте осуществления 49 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 48, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ человека.[0343] In exemplary embodiment 49, the rodent of embodiment 48 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cμ gene segment.

[0344] В типовом варианте осуществления 50 в данном документе предложен грызун по вариантам осуществления 48 или 49, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 человека.[0344] Exemplary Embodiment 50 herein provides the rodent of Embodiments 48 or 49, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _γ3 C gene segment.

[0345] В типовом варианте осуществления 51 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 48-50, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 человека.[0345] Exemplary embodiment 51 herein provides the rodent of any one of embodiments 48-50, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ1 gene segment.

[0346] В типовом варианте осуществления 52 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 48-51, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека.[0346] Exemplary embodiment 52 herein provides the rodent of any one of embodiments 48-51, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment.

[0347] В типовом варианте осуществления 53 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 48-52, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ4 человека.[0347] Exemplary embodiment 53 herein provides the rodent of any one of embodiments 48-52, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ4 gene segment.

[0348] В типовом варианте осуществления 54 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 48-53, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.[0348] Exemplary embodiment 54 herein provides the rodent of any one of embodiments 48-53, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region comprises a human _Cμ gene segment, a human _Cδ gene segment, a human _Cγ3 gene segment, and human C _γ1 gene segment.

[0349] В типовом варианте осуществления 55 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 54, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.[0349] Exemplary Embodiment 55 herein provides the rodent of Embodiment 54, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment.

[0350] В типовом варианте осуществления 56 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 54 или варианту осуществления 55, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0350] Exemplary Embodiment 56 herein provides a rodent of Embodiment 54 or Embodiment 55, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0351] В типовом варианте осуществления 57 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 54-56, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0351] Exemplary embodiment 57 herein provides the rodent of any one of embodiments 54-56, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0352] В типовом варианте осуществления 58 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-57, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) грызуна.[0352] Exemplary embodiment 58 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-57, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent intronic enhancer (E _i ).

[0353] В типовом варианте осуществления 59 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-57, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) человека.[0353] Exemplary embodiment 59 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-57, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human intronic enhancer (E _i ).

[0354] В типовом варианте осуществления 60 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-59, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна.[0354] Exemplary embodiment 60 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-59, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent 3' regulatory region (3' RO).

[0355] В типовом варианте осуществления 61 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) человека.[0355] Exemplary embodiment 61 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-5, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human 3' regulatory region (3' RO).

[0356] В типовом варианте осуществления 62 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ грызуна.[0356] Exemplary embodiment 62 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-61, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sμ switch site.

[0357] В типовом варианте осуществления 63 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-62, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 грызуна.[0357] Exemplary embodiment 63 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-62, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _γ3 switch site.

[0358] В типовом варианте осуществления 64 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-63, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 грызуна.[0358] Exemplary embodiment 64 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-63, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sγ1 switch site.

[0359] В типовом варианте осуществления 65 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-64, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2b грызуна.[0359] Exemplary embodiment 65 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-64, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _γ2b switch site.

[0360] В типовом варианте осуществления 66 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-65, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2a и/или S_γ2c грызуна.[0360] Exemplary embodiment 66 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-65, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _γ2a and/or S _γ2c switch site.

[0361] В типовом варианте осуществления 67 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-66, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε грызуна.[0361] Exemplary embodiment 67 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-66, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sε switch site.

[0362] В типовом варианте осуществления 68 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-67, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α грызуна.[0362] Exemplary embodiment 68 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-67, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _α switch site.

[0363] В типовом варианте осуществления 69 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ человека.[0363] Exemplary embodiment 69 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-61, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sμ switch site.

[0364] В типовом варианте осуществления 70 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 человека.[0364] Exemplary embodiment 70 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-61 and 69, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ3 switch site.

[0365] В типовом варианте осуществления 71 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-70, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 человека.[0365] Exemplary embodiment 71 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-61 and 69-70, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ1 switch site.

[0366] В типовом варианте осуществления 72 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-71, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2 человека.[0366] Exemplary embodiment 72 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-61 and 69-71, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ2 switch site.

[0367] В типовом варианте осуществления 73 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-72, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ4 человека.[0367] Exemplary embodiment 73 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-61 and 69-72, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ4 switch site.

[0368] В типовом варианте осуществления 74 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-73, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε человека.[0368] Exemplary embodiment 74 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-61 and 69-73, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sε switch site.

[0369] В типовом варианте осуществления 75 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-74, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α человека.[0369] Exemplary embodiment 75 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-61 and 69-74, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human S _α switch site.

[0370] В типовом варианте осуществления 76 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-75, отличающийся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H грызуна, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H грызуна.[0370] Exemplary embodiment 76 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-75, wherein the V _H gene segment is a rodent V _H gene segment, the D _H gene segment is a rodent D _H gene segment, and the J _H gene segment is a rodent J _H gene segment.

[0371] В типовом варианте осуществления 77 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 76, отличающийся тем, что генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты грызуна.[0371] In exemplary embodiment 77, herein provided is the rodent of embodiment 76, wherein the rodent V _H gene segment, the rodent D _H gene segment, and the rodent J _H gene segment are endogenous rodent gene segments.

[0372] В типовом варианте осуществления 78 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-75, отличающийся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H человека, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H человека.[0372] Exemplary embodiment 78 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-75, wherein the V _H gene segment is a human V _H gene segment, the D _H gene segment is a human D _H gene segment, and the J _H gene segment is a human J _H gene segment.

[0373] В типовом варианте осуществления 79 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 78, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере 3 генных сегмента V_H человека.[0373] In exemplary embodiment 79, a rodent of embodiment 78 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region contains at least 3 human _VH gene segments.

[0374] В типовом варианте осуществления 80 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 78 или варианту осуществления 79, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты D_H человека.[0374] Exemplary Embodiment 80 herein provides a rodent of Embodiment 78 or Embodiment 79, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region contains all human D _H gene segments.

[0375] В типовом варианте осуществления 81 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 78-80, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_H человека.[0375] Exemplary embodiment 81 herein provides the rodent of any one of embodiments 78-80, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region contains all human _JH gene segments.

[0376] В типовом варианте осуществления 82 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 78-81, отличающийся тем, что в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна.[0376] Exemplary embodiment 82 herein provides the rodent of any one of embodiments 78-81, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region lacks a functional endogenous rodent Adam6 gene.

[0377] В типовом варианте осуществления 83 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 78-82, отличающийся тем, что геном зародышевой линии дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный полипептид Adam6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент.[0377] Exemplary embodiment 83 herein provides the rodent of any one of embodiments 78-82, wherein the germline genome further comprises a nucleotide sequence encoding a functional rodent Adam6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof.

[0378] В типовом варианте осуществления 84 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 83, отличающийся тем, что происходит экспрессия функционального полипептида Adam6 грызуна, его функционального ортолога, функционального гомолога или функционального фрагмента.[0378] Exemplary embodiment 84 herein provides a rodent of embodiment 83, characterized in that it expresses a functional rodent Adam6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof.

[0379] В типовом варианте осуществления 85 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 83 или варианту осуществления 84, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в той же хромосоме, что и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина.[0379] Exemplary Embodiment 85 herein provides a rodent of Embodiment 83 or Embodiment 84, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is located on the same chromosome, same as the variable region of the immunoglobulin heavy chain.

[0380] В типовом варианте осуществления 86 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-85, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в сконструированном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.[0380] Exemplary embodiment 86 herein provides the rodent of any one of embodiments 83-85, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional orthologue, a functional homologue, or a functional fragment thereof is located at an engineered heavy chain locus immunoglobulin.

[0381] В типовом варианте осуществления 87 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-86, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится на месте псевдогена Adam6 человека.[0381] Exemplary embodiment 87 herein provides the rodent of any one of embodiments 83-86, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is located at the site of a human Adam6 pseudogene .

[0382] В типовом варианте осуществления 88 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-87, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, замещает псевдоген Adam6 человека.[0382] Exemplary embodiment 88 herein provides the rodent of any one of embodiments 83-87, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof replaces the human Adam6 pseudogene.

[0383] В типовом варианте осуществления 89 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-88, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между первым генным сегментом V_H человека и вторым генным сегментом V_H человека.[0383] Exemplary embodiment 89 herein provides the rodent of any one of embodiments 83-88, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof is located between the first gene segment V human _H and a second human V _H gene segment.

[0384] В типовом варианте осуществления 90 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 89, отличающийся тем, что первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1-2, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6-1.[0384] Exemplary embodiment 90 herein provides a rodent of embodiment 89, wherein the first human V _H gene segment is V _H 1-2 and the second human V _H gene segment is V _H 6-1 .

[0385] В типовом варианте осуществления 91 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-86, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.[0385] Exemplary embodiment 91 herein provides the rodent of any one of embodiments 83-86, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof is located between a V _H gene segment human and the human D _H gene segment.

[0386] В типовом варианте осуществления 92 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-91, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.[0386] Exemplary embodiment 92 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-91, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus is located at an endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0387] В типовом варианте осуществления 93 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 92, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0387] In exemplary embodiment 93, the rodent of embodiment 92 is provided herein, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0388] В типовом варианте осуществления 94 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-93, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0388] Exemplary embodiment 94 herein provides a rodent according to any one of embodiments 1-93, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0389] В типовом варианте осуществления 95 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-93, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0389] Exemplary embodiment 95 herein provides a rodent according to any one of embodiments 1-93, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0390] В типовом варианте осуществления 96 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0390] Exemplary embodiment 96 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a human D _H gene segment, and a human J _H segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of rodent IgG2a, and the cytoplasmic domain of rodent IgG2a; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies containing variable domains derived from a human V _H gene segment, gene human _DH segment and human _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0391] В типовом варианте осуществления 97 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0391] Exemplary embodiment 97 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a human D _H gene segment, and a human J _H segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of human IgG1, and the cytoplasmic domain of human IgG1; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies containing variable domains derived from a human V _H gene segment, gene human _DH segment and human _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0392] В типовом варианте осуществления 98 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0392] Exemplary embodiment 98 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a human D _H gene segment, and a human J _H segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of rodent IgG1, and the cytoplasmic domain of rodent IgG1; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) rodent _Cγ2a and/or _Cγ2c gene segment; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, gene human _DH segment and human _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0393] В типовом варианте осуществления 99 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0393] Exemplary embodiment 99 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a human D _H gene segment, and a human J _H segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of human IgG4, and the cytoplasmic domain of human IgG4; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) rodent _Cγ2a and/or _Cγ2c gene segment; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies containing variable domains derived from a human V _H gene segment, gene human _DH segment and human _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0394] В типовом варианте осуществления 100 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие полностью человеческую тяжелую цепь.[0394] Exemplary embodiment 100 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a human D _H gene segment, and a human J _H segment; (ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies comprising a fully human heavy chain.

[0395] В типовом варианте осуществления 101 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие полностью человеческую тяжелую цепь.[0395] Exemplary embodiment 101 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a human D _H gene segment, and a human J _H segment; (ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; (c) human C _γ2 gene segment; (d) human _γ4 C gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies comprising a fully human heavy chain.

[0396] В типовом варианте осуществления 102 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент _H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.[0396] Exemplary embodiment 102 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a rodent V _H gene segment, a rodent D _H gene segment, and a segment _H rodent; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies comprising a heavy chain comprising the rodent variable domain and the human constant domain.

[0397] В типовом варианте осуществления 103 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.[0397] Exemplary embodiment 103 herein provides a rodent having in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a rodent V _H gene segment, a rodent D _H gene segment, and a segment J _H rodent; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; (c) human C _γ2 gene segment; (d) human _γ4 C gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies comprising a heavy chain comprising the rodent variable domain and the human constant domain.

[0398] В типовом варианте осуществления 104 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 96-103, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.[0398] Exemplary embodiment 104 herein provides the rodent of any one of embodiments 96-103, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus is located at an endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0399] В типовом варианте осуществления 105 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 104, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0399] Exemplary Embodiment 105 herein provides the rodent of Embodiment 104, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0400] В типовом варианте осуществления 106 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 96-105, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0400] Exemplary embodiment 106 herein provides the rodent of any one of embodiments 96-105, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0401] В типовом варианте осуществления 107 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 96-105, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0401] Exemplary embodiment 107 herein provides the rodent of any one of embodiments 96-105, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0402] В типовом варианте осуществления 108 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-107, дополнительно содержащий в геноме: сконструированный локус цепи каппа (κ) иммуноглобулина, который содержит: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_κ человека и генный сегмент J_κ человека; и (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_κ человека, причем вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_κ человека.[0402] Exemplary embodiment 108 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-107, further comprising in the genome: an engineered immunoglobulin kappa (κ) chain locus that contains: (1) an immunoglobulin κ chain variable region containing a gene human _Vκ segment and human _Jκ gene segment; and (2) an immunoglobulin κ chain constant region comprising a human _κ C gene segment, wherein the immunoglobulin κ chain variable region is operably linked to the immunoglobulin κ constant region such that the rodent produces antibodies comprising light chain variable domains derived from the V _κ gene segment human and human _Jκ gene segment, and light chain constant domains derived from human _Cκ gene segment.

[0403] В типовом варианте осуществления 109 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 108, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) грызуна.[0403] Exemplary Embodiment 109 herein provides the rodent of Embodiment 108, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a rodent κ intronic enhancer (E _κi ).

[0404] В типовом варианте осуществления 110 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 108, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) человека.[0404] Exemplary embodiment 110 herein provides the rodent of embodiment 108, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a human κ intronic enhancer (E _κi ).

[0405] В типовом варианте осуществления 111 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-110, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер κ (E_κ3’) грызуна.[0405] Exemplary embodiment 111 herein provides the rodent of any one of embodiments 108-110, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a rodent κ 3' enhancer (E _κ3' ).

[0406] В типовом варианте осуществления 112 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-110, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер κ (E_κ3’) человека.[0406] Exemplary embodiment 112 herein provides the rodent of any one of embodiments 108-110, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a human κ 3' enhancer (E _κ3' ).

[0407] В типовом варианте осуществления 113 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-112, отличающийся тем, что вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 6 генных сегментов V_κ человека.[0407] Exemplary embodiment 113 herein provides the rodent of any one of embodiments 108-112, wherein the immunoglobulin κ chain variable region contains at least 6 human V _κ gene segments.

[0408] В типовом варианте осуществления 114 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-113, отличающийся тем, что вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_κ человека.[0408] Exemplary embodiment 114 herein provides the rodent of any one of embodiments 108-113, wherein the immunoglobulin κ chain variable region contains all human J _κ gene segments.

[0409] В типовом варианте осуществления 115 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-114, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина.[0409] Exemplary embodiment 115 herein provides the rodent of any one of embodiments 108-114, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin κ chain locus.

[0410] В типовом варианте осуществления 116 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 115, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0410] Exemplary embodiment 116 herein provides the rodent of embodiment 115, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin κ chain locus.

[0411] В типовом варианте осуществления 117 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-116, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0411] Exemplary embodiment 117 herein provides the rodent of any one of embodiments 108-116, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin κ chain locus.

[0412] В типовом варианте осуществления 118 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-116, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0412] Exemplary embodiment 118 herein provides a rodent according to any one of embodiments 108-116, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin κ chain locus.

[0413] В типовом варианте осуществления 119 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-118, дополнительно содержащий в геноме: сконструированный локус цепи лямбда (λ) иммуноглобулина, который содержит: генный сегмент V_λ человека, генный сегмент J_λ человека и генный сегмент C_λ человека, причем генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом C_λ человека так, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_λ человека.[0413] Exemplary embodiment 119 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-118, further comprising in the genome: an engineered immunoglobulin lambda (λ) chain locus that contains: a human V _λ gene segment, a human J _λ gene segment and a human _Cλ gene segment, wherein the human _Vλ gene segment and the human _Jλ gene segment are operably linked to the human _Cλ gene segment such that the rodent produces antibodies comprising light chain variable domains derived from the human _Vλ gene segment and the human Cλ gene segment Human _Jλ , and light chain constant domains derived from the human _Cλ gene segment.

[0414] В типовом варианте осуществления 120 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ1 человека.[0414] Exemplary embodiment 120 herein provides the rodent of embodiment 119, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ1 gene segment.

[0415] В типовом варианте осуществления 121 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 120, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ1 человека. [0415] In exemplary embodiment 121, the rodent of embodiment 120 is provided herein, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ1 gene segment.

[0416] В типовом варианте осуществления 122 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ2 человека.[0416] Exemplary embodiment 122 herein provides the rodent of embodiment 119, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ2 gene segment.

[0417] В типовом варианте осуществления 123 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 122, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ2 человека.[0417] In exemplary embodiment 123, the rodent of embodiment 122 is provided herein, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ2 gene segment.

[0418] В типовом варианте осуществления 124 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ3 человека.[0418] In exemplary embodiment 124, the rodent of embodiment 119 is provided herein, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ3 gene segment.

[0419] В типовом варианте осуществления 125 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 124, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ3 человека.[0419] In exemplary embodiment 125, the rodent of embodiment 124 is provided herein, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ3 gene segment.

[0420] В типовом варианте осуществления 126 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ6 человека.[0420] In exemplary embodiment 126, the rodent of embodiment 119 is provided herein, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ6 gene segment.

[0421] В типовом варианте осуществления 127 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 126, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ6 человека.[0421] In exemplary embodiment 127, the rodent of embodiment 126 is provided herein, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ6 gene segment.

[0422] В типовом варианте осуществления 128 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ7 человека.[0422] In exemplary embodiment 128, the rodent of embodiment 119 is provided herein, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ7 gene segment.

[0423] В типовом варианте осуществления 129 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-128, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент C_λ1 человека, генный сегмент C_λ2 человека, генный сегмент C_λ3 человека, генный сегмент C_λ6 человека и генный сегмент C_λ1 грызуна.[0423] Exemplary embodiment 129 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-128, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus comprises a human C _λ1 gene segment, a human C _λ2 gene segment, a human C _λ3 gene segment, human C _λ6 gene segment and rodent C _λ1 gene segment.

[0424] В типовом варианте осуществления 130 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 129, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент J_λ1 человека, генный сегмент J_λ2 человека, генный сегмент J_λ3 человека, генный сегмент J_λ6 человека и генный сегмент J_λ7 человека.[0424] Exemplary Embodiment 130 herein provides a rodent of Embodiment 129, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus comprises a human J _λ1 gene segment, a human J _λ2 gene segment, a human J _λ3 gene segment, a J _λ6 gene segment human and human J _λ7 gene segment.

[0425] В типовом варианте осуществления 131 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 130, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит кластер генных сегментов J_λ1 - C_λ1 человека, кластер генных сегментов J_λ2 - C_λ2 человека, кластер генных сегментов J_λ3 - C_λ3 человека, кластер генных сегментов J_λ6 - C_λ6 человека и кластер генных сегментов J_λ7 человека - C_λ1 грызуна.[0425] Exemplary Embodiment 131 herein provides a rodent ES cell of Embodiment 130, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus comprises a human J _λ1 - C _λ1 gene segment cluster, a human J _λ2 - C _λ2 gene segment cluster , human J _λ3 - C _λ3 gene segment cluster, human J _λ6 - C _λ6 gene segment cluster, and rodent J _λ7 - C _λ1 gene segment cluster.

[0426] В типовом варианте осуществления 132 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-131, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 7 генных сегментов V_λ человека.[0426] Exemplary embodiment 132 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-131, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus contains at least 7 human V _λ gene segments.

[0427] В типовом варианте осуществления 133 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-132, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 2.4 λ грызуна.[0427] Exemplary embodiment 133 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-132, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent 2.4 λ enhancer.

[0428] В типовом варианте осуществления 134 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-133, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер λ грызуна.[0428] Exemplary embodiment 134 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-133, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent λ 3' enhancer.

[0429] В типовом варианте осуществления 135 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-134, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 3.1 λ грызуна.[0429] Exemplary embodiment 135 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-134, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent 3.1 λ enhancer.

[0430] В типовом варианте осуществления 136 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-135, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер λ человека.[0430] Exemplary embodiment 136 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-135, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a human λ 3' enhancer.

[0431] В типовом варианте осуществления 137 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-136, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина.[0431] Exemplary embodiment 137 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-136, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin λ chain locus.

[0432] В типовом варианте осуществления 138 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 137, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0432] Exemplary Embodiment 138 herein provides the rodent of Embodiment 137, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin λ chain locus.

[0433] В типовом варианте осуществления 139 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-138, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0433] Exemplary embodiment 139 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-138, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin λ chain locus.

[0434] В типовом варианте осуществления 140 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-138, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0434] Exemplary embodiment 140 herein provides the rodent of any one of embodiments 119-138, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin λ chain locus.

[0435] В типовом варианте осуществления 141 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-140, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.[0435] Exemplary embodiment 141 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-140, further comprising in the genome an engineered neonatal Fc receptor (FcRn) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcRn polypeptide.

[0436] В типовом варианте осуществления 142 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 141, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0436] In exemplary embodiment 142, the rodent of embodiment 141 is provided herein, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0437] В типовом варианте осуществления 143 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 141, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0437] In exemplary embodiment 143, the rodent of embodiment 141 is provided herein, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0438] В типовом варианте осуществления 144 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-143, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0438] Exemplary embodiment 144 herein provides the rodent of any one of embodiments 141-143, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0439] В типовом варианте осуществления 145 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-143, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0439] Exemplary embodiment 145 herein provides the rodent of any one of embodiments 141-143, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0440] В типовом варианте осуществления 146 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-145, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.[0440] Exemplary embodiment 146 herein provides the rodent of any one of embodiments 141-145, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcRn polypeptide is located at an endogenous FcRn locus of the rodent.

[0441] В типовом варианте осуществления 147 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 146, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.[0441] Exemplary Embodiment 147 herein provides the rodent of Embodiment 146, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous FcRn gene.

[0442] В типовом варианте осуществления 148 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 141, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.[0442] Exemplary Embodiment 148 herein provides the rodent of Embodiment 141, wherein the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of the FcRn replaces the endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of the rodent FcRn.

[0443] В типовом варианте осуществления 149 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-148, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.[0443] Exemplary embodiment 149 herein provides a rodent according to any one of embodiments 141-148, wherein the rodent does not express a rodent FcRn.

[0444] В типовом варианте осуществления 150 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-149, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0444] Exemplary embodiment 150 herein provides a rodent according to any one of embodiments 141-149, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcRn locus.

[0445] В типовом варианте осуществления 151 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-149, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0445] Exemplary embodiment 151 herein provides a rodent according to any one of embodiments 141-149, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcRn locus.

[0446] В типовом варианте осуществления 152 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-151, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).[0446] Exemplary embodiment 152 herein provides the rodent of any one of embodiments 141-151, further comprising in the genome an engineered β-2-microglobulin (β2M) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β-2 polypeptide -microglobulin (β2M).

[0447] В типовом варианте осуществления 153 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 152, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.[0447] Exemplary Embodiment 153 herein provides the rodent of Embodiment 152, wherein the nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide is located at the endogenous β2M locus of the rodent.

[0448] В типовом варианте осуществления 154 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 153, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.[0448] Exemplary embodiment 154 herein provides the rodent of embodiment 153, wherein the nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent β2M gene.

[0449] В типовом варианте осуществления 155 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 152-154, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2-4 гена β2M человека.[0449] Exemplary embodiment 155 herein provides the rodent of any one of embodiments 152-154, wherein the nucleic acid sequence comprises exons 2-4 of the human β2M gene.

[0450] В типовом варианте осуществления 156 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 152-155, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.[0450] Exemplary embodiment 156 herein provides the rodent of any one of embodiments 152-155, wherein the rodent does not express the rodent β2M polypeptide.

[0451] В типовом варианте осуществления 157 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 152-156, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0451] Exemplary embodiment 157 herein provides a rodent according to any one of embodiments 152-156, wherein the rodent is heterozygous for the engineered β2M locus.

[0452] В типовом варианте осуществления 158 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 152-156, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0452] Exemplary embodiment 158 herein provides a rodent according to any one of embodiments 152-156, wherein the rodent is homozygous for the engineered β2M locus.

[0453] В типовом варианте осуществления 159 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-158, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.[0453] Exemplary embodiment 159 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-158, further comprising in its genome an engineered Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide containing an extracellular human domain.

[0454] В типовом варианте осуществления 160 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 159, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0454] Exemplary embodiment 160 herein provides the rodent of embodiment 159, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0455] В типовом варианте осуществления 161 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 159, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0455] In exemplary embodiment 161, the rodent of embodiment 159 is provided herein, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0456] В типовом варианте осуществления 162 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-161, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0456] Exemplary embodiment 162 herein provides the rodent of any one of embodiments 159-161, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0457] В типовом варианте осуществления 163 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-161, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0457] Exemplary embodiment 163 herein provides the rodent of any one of embodiments 159-161, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0458] В типовом варианте осуществления 164 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-163, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.[0458] Exemplary embodiment 164 herein provides the rodent of any one of embodiments 159-163, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide is located at the endogenous FcεR1α locus of the rodent.

[0459] В типовом варианте осуществления 165 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 164, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.[0459] Exemplary embodiment 165 herein provides the rodent of embodiment 164, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous FcεR1α gene.

[0460] В типовом варианте осуществления 166 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 165, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.[0460] In exemplary embodiment 166, the rodent of embodiment 165 is provided herein, wherein the FcεR1α polypeptide comprises a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain.

[0461] В типовом варианте осуществления 167 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 159, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.[0461] Exemplary embodiment 167 herein provides the rodent of embodiment 159, wherein the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcεR1α replaces the endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcεR1α.

[0462] В типовом варианте осуществления 168 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-167, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.[0462] Exemplary embodiment 168 herein provides a rodent according to any one of embodiments 159-167, wherein the rodent does not express rodent FcεR1α.

[0463] В типовом варианте осуществления 169 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-168, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0463] Exemplary embodiment 169 herein provides a rodent according to any one of embodiments 159-168, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0464] В типовом варианте осуществления 170 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-168, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0464] Exemplary embodiment 170 herein provides a rodent according to any one of embodiments 159-168, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0465] В типовом варианте осуществления 171 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-170, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 1a (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека.[0465] Exemplary embodiment 171 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-170, further comprising in its genome an engineered Fc gamma receptor 1a (FcγR1a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide containing an extracellular domain person.

[0466] В типовом варианте осуществления 172 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 171, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0466] In exemplary embodiment 172, the rodent of embodiment 171 is provided herein, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0467] В типовом варианте осуществления 173 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 171, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0467] In exemplary embodiment 173, the rodent of embodiment 171 is provided herein, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0468] В типовом варианте осуществления 174 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-173, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0468] Exemplary embodiment 174 herein provides the rodent of any one of embodiments 171-173, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0469] В типовом варианте осуществления 175 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-173, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0469] Exemplary embodiment 175 herein provides the rodent of any one of embodiments 171-173, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0470] В типовом варианте осуществления 176 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-175, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна.[0470] Exemplary embodiment 176 herein provides the rodent of any one of embodiments 171-175, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR1a polypeptide is located at the endogenous FcγR1a locus of the rodent.

[0471] В типовом варианте осуществления 177 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 176, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, замещает весь или часть эндогенного гена FcγR1a грызуна.[0471] Exemplary Embodiment 177 herein provides the rodent of Embodiment 176, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous FcγR1a gene.

[0472] В типовом варианте осуществления 178 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 171, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcγR1a человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcγR1a грызуна.[0472] Exemplary embodiment 178 herein provides the rodent of embodiment 171, wherein the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcγR1a replaces the endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcγR1a.

[0473] В типовом варианте осуществления 179 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-178, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcγR1a грызуна.[0473] Exemplary embodiment 179 herein provides a rodent according to any one of embodiments 171-178, wherein the rodent does not express rodent FcγR1a.

[0474] В типовом варианте осуществления 180 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-179, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.[0474] Exemplary embodiment 180 herein provides a rodent according to any one of embodiments 171-179, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR1a locus.

[0475] В типовом варианте осуществления 181 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-179, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.[0475] Exemplary embodiment 181 herein provides a rodent according to any one of embodiments 171-179, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR1a locus.

[0476] В типовом варианте осуществления 182 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-181, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2a человека.[0476] Exemplary embodiment 182 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-181, further comprising in its genome an engineered Fc gamma receptor 2a (FcγR2a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2a polypeptide.

[0477] В типовом варианте осуществления 183 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 182, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0477] Exemplary Embodiment 183 herein provides the rodent of Embodiment 182, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2a polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus.

[0478] В типовом варианте осуществления 184 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 183, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0478] Exemplary Embodiment 184 herein provides the rodent of Embodiment 183, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR2a polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous low-affinity FcγR gene.

[0479] В типовом варианте осуществления 185 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 182-184, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.[0479] Exemplary embodiment 185 herein provides a rodent according to any one of embodiments 182-184, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2a locus.

[0480] В типовом варианте осуществления 186 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 182-184, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.[0480] Exemplary embodiment 186 herein provides a rodent according to any one of embodiments 182-184, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2a locus.

[0481] В типовом варианте осуществления 187 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-186, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2b человека.[0481] Exemplary embodiment 187 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-186, further comprising in its genome an engineered Fc gamma receptor 2b (FcγR2b) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2b polypeptide.

[0482] В типовом варианте осуществления 188 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 187, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0482] Exemplary Embodiment 188 herein provides the rodent of Embodiment 187, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2b polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus.

[0483] В типовом варианте осуществления 189 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 188, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0483] Exemplary Embodiment 189 herein provides the rodent of Embodiment 188, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR2b polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous low-affinity FcγR gene.

[0484] В типовом варианте осуществления 190 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 187-189, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.[0484] Exemplary embodiment 190 herein provides a rodent according to any one of embodiments 187-189, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2b locus.

[0485] В типовом варианте осуществления 191 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 187-189, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.[0485] Exemplary embodiment 191 herein provides a rodent according to any one of embodiments 187-189, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2b locus.

[0486] В типовом варианте осуществления 192 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-191, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3a человека.[0486] Exemplary embodiment 192 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-191, further comprising in its genome an engineered Fc gamma receptor 3a (FcγR3a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR3a polypeptide.

[0487] В типовом варианте осуществления 193 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 192, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0487] Exemplary Embodiment 193 herein provides the rodent of Embodiment 192, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR3a polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus.

[0488] В типовом варианте осуществления 194 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 193, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0488] Exemplary Embodiment 194 herein provides the rodent of Embodiment 193, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR3a polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous low-affinity FcγR gene.

[0489] В типовом варианте осуществления 195 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 192-194, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.[0489] Exemplary embodiment 195 herein provides a rodent according to any one of embodiments 192-194, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR3a locus.

[0490] В типовом варианте осуществления 196 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 192-194, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.[0490] Exemplary embodiment 196 herein provides a rodent according to any one of embodiments 192-194, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR3a locus.

[0491] В типовом варианте осуществления 197 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-196, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3b человека.[0491] Exemplary embodiment 197 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-196, further comprising in its genome an engineered Fc gamma receptor 3b (FcγR3b) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR3b polypeptide.

[0492] В типовом варианте осуществления 198 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 197, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0492] Exemplary embodiment 198 herein provides the rodent of embodiment 197, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR3b polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus.

[0493] В типовом варианте осуществления 199 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 197, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0493] Exemplary Embodiment 199 herein provides the rodent of Embodiment 197, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR3b polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous low-affinity FcγR gene.

[0494] В типовом варианте осуществления 200 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 197-199, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.[0494] Exemplary embodiment 200 herein provides a rodent according to any one of embodiments 197-199, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR3b locus.

[0495] В типовом варианте осуществления 201 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 197-199, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.[0495] Exemplary embodiment 201 herein provides a rodent according to any one of embodiments 197-199, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR3b locus.

[0496] В типовом варианте осуществления 202 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-201, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2c человека.[0496] Exemplary embodiment 202 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-201, further comprising in its genome an engineered Fc gamma receptor 2c (FcγR2c) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2c polypeptide.

[0497] В типовом варианте осуществления 203 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 202, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0497] Exemplary embodiment 203 herein provides the rodent of embodiment 202, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2c polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus.

[0498] В типовом варианте осуществления 204 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 203, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0498] Exemplary embodiment 204 herein provides the rodent of embodiment 203, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR2c polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous low-affinity FcγR gene.

[0499] В типовом варианте осуществления 205 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 202-204, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcγR2c грызуна.[0499] Exemplary embodiment 205 herein provides a rodent according to any one of embodiments 202-204, wherein the rodent does not express rodent FcγR2c.

[0500] В типовом варианте осуществления 206 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 202-205, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.[0500] Exemplary embodiment 206 herein provides a rodent according to any one of embodiments 202-205, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2c locus.

[0501] В типовом варианте осуществления 207 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 202-205, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.[0501] Exemplary embodiment 207 herein provides the rodent of any one of embodiments 202-205, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2c locus.

[0502] В типовом варианте осуществления 208 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.[0502] Exemplary embodiment 208 herein provides a rodent having an engineered neonatal Fc receptor (FcRn) locus in its genome comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcRn polypeptide.

[0503] В типовом варианте осуществления 209 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 208, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0503] In exemplary embodiment 209, a rodent is provided herein according to embodiment 208, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0504] В типовом варианте осуществления 210 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 208, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0504] Exemplary embodiment 210 herein provides a rodent of embodiment 208, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0505] В типовом варианте осуществления 211 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-210, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0505] Exemplary embodiment 211 herein provides the rodent of any one of embodiments 208-210, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0506] В типовом варианте осуществления 212 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-210, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0506] Exemplary embodiment 212 herein provides the rodent of any one of embodiments 208-210, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0507] В типовом варианте осуществления 213 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-212, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.[0507] Exemplary embodiment 213 herein provides the rodent of any one of embodiments 208-212, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcRn polypeptide is located at an endogenous FcRn locus of the rodent.

[0508] В типовом варианте осуществления 214 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 213, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.[0508] Exemplary embodiment 214 herein provides a rodent of embodiment 213, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous FcRn gene.

[0509] В типовом варианте осуществления 215 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 208, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.[0509] Exemplary embodiment 215 herein provides a rodent of embodiment 208, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of a human FcRn replaces an endogenous nucleic acid sequence encoding an extracellular domain of a rodent FcRn.

[0510] В типовом варианте осуществления 216 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-215, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.[0510] Exemplary embodiment 216 herein provides a rodent according to any one of embodiments 208-215, wherein the rodent does not express a rodent FcRn.

[0511] В типовом варианте осуществления 217 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-216, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0511] Exemplary embodiment 217 herein provides a rodent according to any one of embodiments 208-216, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcRn locus.

[0512] В типовом варианте осуществления 218 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-216, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0512] Exemplary embodiment 218 herein provides a rodent according to any one of embodiments 208-216, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcRn locus.

[0513] В типовом варианте осуществления 219 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-218, дополнительно содержащий в геноме локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).[0513] Exemplary embodiment 219 herein provides the rodent of any one of embodiments 208-218, further comprising in its genome a β-2-microglobulin (β2M) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β-2- polypeptide microglobulin (β2M).

[0514] В типовом варианте осуществления 220 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 219, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.[0514] Exemplary embodiment 220 herein provides the rodent of embodiment 219, wherein the nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide is located at an endogenous rodent β2M locus.

[0515] В типовом варианте осуществления 221 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 220, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.[0515] Exemplary embodiment 221 herein provides a rodent of embodiment 220, wherein a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous β2M gene.

[0516] В типовом варианте осуществления 222 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 219-221, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2-4 гена β2M человека.[0516] Exemplary embodiment 222 herein provides the rodent of any one of embodiments 219-221, wherein the nucleic acid sequence comprises exons 2-4 of the human β2M gene.

[0517] В типовом варианте осуществления 223 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 219-222, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.[0517] Exemplary embodiment 223 herein provides the rodent of any one of embodiments 219-222, wherein the rodent does not express the rodent β2M polypeptide.

[0518] В типовом варианте осуществления 224 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 219-223, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0518] Exemplary embodiment 224 herein provides a rodent according to any one of embodiments 219-223, wherein the rodent is heterozygous for the engineered β2M locus.

[0519] В типовом варианте осуществления 225 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 219-223, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0519] Exemplary embodiment 225 herein provides a rodent according to any one of embodiments 219-223, wherein the rodent is homozygous for the engineered β2M locus.

[0520] В типовом варианте осуществления 226 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.[0520] Exemplary embodiment 226 herein provides a rodent having an engineered Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus in its genome comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcεR1α polypeptide.

[0521] В типовом варианте осуществления 227 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 226, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0521] In exemplary embodiment 227, a rodent is provided herein according to embodiment 226, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0522] В типовом варианте осуществления 228 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 226, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0522] In exemplary embodiment 228, the rodent of embodiment 226 is provided herein, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0523] В типовом варианте осуществления 229 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-228, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0523] Exemplary embodiment 229 herein provides the rodent of any one of embodiments 226-228, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0524] В типовом варианте осуществления 230 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-228, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0524] Exemplary embodiment 230 herein provides the rodent of any one of embodiments 226-228, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0525] В типовом варианте осуществления 231 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-230, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.[0525] Exemplary embodiment 231 herein provides the rodent of any one of embodiments 226-230, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide is located at the endogenous FcεR1α locus of the rodent.

[0526] В типовом варианте осуществления 232 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 231, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.[0526] Exemplary embodiment 232 herein provides the rodent of embodiment 231, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide replaces all or a portion of the rodent's endogenous FcεR1α gene.

[0527] В типовом варианте осуществления 233 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 232, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.[0527] In exemplary embodiment 233, the rodent of embodiment 232 is provided herein, wherein the FcεR1α polypeptide comprises a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain.

[0528] В типовом варианте осуществления 234 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 226, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.[0528] Exemplary embodiment 234 herein provides the rodent of embodiment 226, wherein the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcεR1α replaces the endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcεR1α.

[0529] В типовом варианте осуществления 235 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-234, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.[0529] Exemplary embodiment 235 herein provides a rodent according to any one of embodiments 226-234, wherein the rodent does not express rodent FcεR1α.

[0530] В типовом варианте осуществления 236 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-235, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0530] Exemplary embodiment 236 herein provides a rodent according to any one of embodiments 226-235, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0531] В типовом варианте осуществления 237 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-235, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0531] Exemplary embodiment 237 herein provides a rodent according to any one of embodiments 226-235, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0532] В типовом варианте осуществления 238 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-237, отличающийся тем, что грызун представляет собой мышь.[0532] Exemplary embodiment 238 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-237, wherein the rodent is a mouse.

[0533] В типовом варианте осуществления 239 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-237, отличающийся тем, что грызун представляет собой крысу.[0533] Exemplary embodiment 239 herein provides the rodent of any one of embodiments 1-237, wherein the rodent is a rat.

[0534] В типовом варианте осуществления 240 в данном документе предложен способ тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка.[0534] Exemplary embodiment 240 herein provides a method for testing a human Fc domain-containing therapeutic protein, comprising administering the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and measuring one or more pharmacokinetic properties of the administered therapeutic protein.

[0535] В типовом варианте осуществления 241 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 240, отличающийся тем, что одно или более фармакокинетических свойств выбраны из одного или более из площади под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановления (IVR), скорости выведения (CL), среднего времени удержания (СВУ), времени полужизни агента и объема распределения в равновесном состоянии (Vss).[0535] Exemplary Embodiment 241 herein provides the method of Embodiment 240, wherein one or more pharmacokinetic properties are selected from one or more of the area under the plasma concentration-time curve (AUC), in vivo recovery (IVR) , clearance rate (CL), average retention time (ART), agent half-life and volume of distribution at steady state (Vss).

[0536] В типовом варианте осуществления 242 в данном документе предложен способ тестирования эффективности терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка.[0536] Exemplary embodiment 242 herein provides a method for testing the effectiveness of a human Fc domain-containing therapeutic protein, comprising administering the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and measuring the therapeutic effectiveness of the administered therapeutic protein.

[0537] В типовом варианте осуществления 243 в данном документе предложен способ определения терапевтически эффективной дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение терапевтической эффективности каждой дозы терапевтического белка.[0537] Exemplary embodiment 243 herein provides a method for determining a therapeutically effective dose of a human Fc domain-containing therapeutic protein, comprising administering a number of doses of the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and determining the therapeutic effectiveness of each dose of the therapeutic protein. .

[0538] В типовом варианте осуществления 244 в данном документе предложен способ определения безопасной дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение безопасности каждой дозы терапевтического белка.[0538] Exemplary embodiment 244 herein provides a method for determining a safe dose of a therapeutic protein containing a human Fc domain, comprising administering a number of doses of the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and determining the safety of each dose of the therapeutic protein.

[0539] В типовом варианте осуществления 245 в данном документе предложен способ определения переносимой дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение переносимости каждой дозы терапевтического белка.[0539] Exemplary embodiment 245 herein provides a method for determining a tolerable dose of a human Fc domain-containing therapeutic protein, comprising administering a number of doses of the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and determining the tolerability of each dose of the therapeutic protein.

[0540] В типовом варианте осуществления 246 в данном документе предложен способ тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 148-239 и измерение одного или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна.[0540] In exemplary embodiment 246, a method of testing a therapeutic protein containing a human Fc domain is provided herein, comprising administering the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 148-239 and measuring one or more Fc receptor-mediated responses in the rodent.

[0541] В типовом варианте осуществления 247 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 246, отличающийся тем, что один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов включают ответ АЗКЦ.[0541] In exemplary embodiment 247, the method of embodiment 246 is provided herein, wherein one or more Fc receptor-mediated responses include an ADCC response.

[0542] В типовом варианте осуществления 248 в данном документе предложен способ скрининга терапевтического агента, содержащего человеческую Fc-область человеческого антитела, включающий: (a) введение агента, содержащего Fc-область человеческого антитела, грызуну по любому из вариантов осуществления 148-239, причем агент связывается с целевой клеткой в организме мыши; (b) определение антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) естественных клеток-киллеров (NK) против целевой клетки; и (c) сравнение уровня АЗКЦ на этапе (b) с контролем, причем повышенное уничтожение целевых клеток указывает на то, что агент обладает повышенной способностью опосредовать АЗКЦ.[0542] Exemplary embodiment 248 herein provides a method for screening a therapeutic agent containing a human Fc region of a human antibody, comprising: (a) administering an agent containing a human Fc region to a rodent as in any one of embodiments 148-239, wherein the agent binds to a target cell in the mouse; (b) determining antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of natural killer (NK) cells against the target cell; and (c) comparing the level of ADCC in step (b) with the control, with increased killing of target cells indicating that the agent has an increased ability to mediate ADCC.

[0543] В типовом варианте осуществления 249 в данном документе предложен способ измерения иммунного ответа, вырабатываемого грызуном против терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение иммунного ответа, вырабатываемого грызуном против терапевтического белка.[0543] In exemplary embodiment 249, there is provided herein a method of measuring an immune response produced by a rodent against a therapeutic protein containing a human Fc domain, comprising administering the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and measuring the immune response produced by the rodent against therapeutic protein.

[0544] В типовом варианте осуществления 250 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-249, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело.[0544] Exemplary embodiment 250 herein provides the method of any one of embodiments 240-249, wherein the therapeutic protein is a human antibody.

[0545] В типовом варианте осуществления 251 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-249, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок.[0545] Exemplary embodiment 251 herein provides the method of any one of embodiments 240-249, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein.

[0546] В типовом варианте осуществления 252 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-251, отличающийся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG1 человека.[0546] Exemplary embodiment 252 herein provides the method of any one of embodiments 240-251, wherein the human Fc domain is a human IgG1 Fc domain.

[0547] В типовом варианте осуществления 253 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 252, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG1.[0547] In exemplary embodiment 253, the method of embodiment 252 is provided herein, wherein the therapeutic protein is a human IgG1 antibody.

[0548] В типовом варианте осуществления 254 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 252, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG1 человека.[0548] In exemplary embodiment 254, the method of embodiment 252 is provided herein, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein containing the Fc domain of human IgG1.

[0549] В типовом варианте осуществления 255 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 252-254, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ1.[0549] Exemplary embodiment 255 herein provides the method of any one of embodiments 252-254, wherein a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a C _H domain 2 human, human C _H domain 3, IgG transmembrane domain and IgG cytoplasmic domain, is the C _γ1 gene segment.

[0550] В типовом варианте осуществления 256 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-251, отличающийся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG2 человека.[0550] Exemplary embodiment 256 herein provides the method of any one of embodiments 240-251, wherein the human Fc domain is a human IgG2 Fc domain.

[0551] В типовом варианте осуществления 257 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 256, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG2.[0551] In exemplary embodiment 257, the method of embodiment 256 is provided herein, wherein the therapeutic protein is a human IgG2 antibody.

[0552] В типовом варианте осуществления 258 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 256, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG2 человека.[0552] In exemplary embodiment 258, the method of embodiment 256 is provided herein, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein comprising a human IgG2 Fc domain.

[0553] В типовом варианте осуществления 259 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 256-258, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ2.[0553] Exemplary embodiment 259 herein provides the method of any one of embodiments 256-258, wherein a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a C _H domain 2 human, human C _H 3 domain, IgG transmembrane domain and IgG cytoplasmic domain, is the C _γ2 gene segment.

[0554] В типовом варианте осуществления 260 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-251, отличающийся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG3 человека.[0554] Exemplary embodiment 260 herein provides the method of any one of embodiments 240-251, wherein the human Fc domain is a human IgG3 Fc domain.

[0555] В типовом варианте осуществления 261 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 260, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG3.[0555] In exemplary embodiment 261, the method of embodiment 260 is provided herein, wherein the therapeutic protein is a human IgG3 antibody.

[0556] В типовом варианте осуществления 262 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 260, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG3 человека.[0556] In exemplary embodiment 262, the method of embodiment 260 is provided herein, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein containing the Fc domain of a human IgG3.

[0557] В типовом варианте осуществления 263 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 260-262, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ3.[0557] Exemplary embodiment 263 herein provides the method of any one of embodiments 260-262, wherein a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a C _H domain 2 human, human C _H 3 domain, IgG transmembrane domain and IgG cytoplasmic domain, is the C _γ3 gene segment.

[0558] В типовом варианте осуществления 264 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-251, отличающийся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG4 человека.[0558] Exemplary embodiment 264 herein provides the method of any one of embodiments 240-251, wherein the human Fc domain is a human IgG4 Fc domain.

[0559] В типовом варианте осуществления 265 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 264, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG4.[0559] Exemplary Embodiment 265 herein provides the method of Embodiment 264, wherein the therapeutic protein is a human IgG4 antibody.

[0560] В типовом варианте осуществления 266 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 264, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG4 человека.[0560] In exemplary embodiment 266, the method of embodiment 264 is provided herein, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein comprising the Fc domain of a human IgG4.

[0561] В типовом варианте осуществления 267 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 264-266, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ4.[0561] Exemplary embodiment 267 herein provides the method of any one of embodiments 264-266, wherein a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a C _H domain 2 human, human C _H 3 domain, IgG transmembrane domain and IgG cytoplasmic domain, is the C _γ4 gene segment.

[0562] В типовом варианте осуществления 268 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 250, 252, 253, 255-257, 259-261, 263-265 и 267, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело с легкой цепью κ, а грызун экспрессирует антитела, содержащие легкие цепи κ человека.[0562] Exemplary embodiment 268 herein provides the method of any one of embodiments 250, 252, 253, 255-257, 259-261, 263-265, and 267, wherein the therapeutic protein is a human antibody with mild κ chain, and the rodent expresses antibodies containing human κ light chains.

[0563] В типовом варианте осуществления 269 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 250, 252, 253, 255-257, 259-261, 263-265 и 267, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело с легкой цепью λ, а грызун экспрессирует антитела, содержащие легкие цепи λ человека.[0563] Exemplary embodiment 269 herein provides a method as in any one of embodiments 250, 252, 253, 255-257, 259-261, 263-265, and 267, wherein the therapeutic protein is a human antibody with mild λ chain, and the rodent expresses antibodies containing human λ light chains.

[0564] В типовом варианте осуществления 270 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-269, отличающийся тем, что грызун представляет собой мышь.[0564] Exemplary embodiment 270 herein provides the method of any one of embodiments 240-269, wherein the rodent is a mouse.

[0565] В типовом варианте осуществления 271 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-269, отличающийся тем, что грызун представляет собой крысу.[0565] Exemplary embodiment 271 herein provides the method of any one of embodiments 240-269, wherein the rodent is a rat.

[0566] В типовом варианте осуществления 272 в данном документе предложена животная модель для тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка.[0566] Exemplary embodiment 272 herein provides an animal model for testing a human Fc domain-containing therapeutic protein, comprising administering the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and measuring one or more pharmacokinetic properties of the administered therapeutic protein.

[0567] В типовом варианте осуществления 273 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 272, отличающаяся тем, что одно или более фармакокинетических свойств выбраны из одного или более из площади под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановления (IVR), скорости выведения (CL), среднего времени удержания (СВУ), времени полужизни агента и объема распределения в равновесном состоянии (Vss).[0567] Exemplary Embodiment 273 herein provides an animal model of Embodiment 272, wherein one or more pharmacokinetic properties are selected from one or more of the area under the plasma concentration-time curve (AUC), in vivo recovery (IVR). ), clearance rate (CL), average retention time (ART), agent half-life and volume of distribution at steady state (Vss).

[0568] В типовом варианте осуществления 274 в данном документе предложена животная модель для тестирования эффективности терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка.[0568] Exemplary embodiment 274 herein provides an animal model for testing the effectiveness of a human Fc domain-containing therapeutic protein, comprising administering the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and measuring the therapeutic effectiveness of the administered therapeutic protein.

[0569] В типовом варианте осуществления 275 в данном документе предложена животная модель для определения терапевтически эффективной дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение терапевтической эффективности каждой дозы терапевтического белка.[0569] Exemplary embodiment 275 herein provides an animal model for determining a therapeutically effective dose of a therapeutic human Fc domain-containing protein, comprising administering a number of doses of the therapeutic protein to a rodent of any one of embodiments 1-207 and determining the therapeutic effectiveness of each dose. therapeutic protein.

[0570] В типовом варианте осуществления 276 в данном документе предложена животная модель для определения безопасной дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение безопасности каждой дозы терапевтического белка.[0570] Exemplary embodiment 276 herein provides an animal model for determining a safe dose of a therapeutic protein containing a human Fc domain, comprising administering a number of doses of the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and determining the safety of each dose of the therapeutic protein .

[0571] В типовом варианте осуществления 277 в данном документе предложена животная модель для определения переносимой дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение переносимости каждой дозы терапевтического белка.[0571] Exemplary embodiment 277 herein provides an animal model for determining the tolerability of a therapeutic protein containing a human Fc domain, comprising administering a number of doses of the therapeutic protein to a rodent according to any one of embodiments 1-207 and determining the tolerability of each dose of the therapeutic protein. .

[0572] В типовом варианте осуществления 278 в данном документе предложена животная модель для тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 148-239 и измерение одного или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна.[0572] Exemplary embodiment 278 herein provides an animal model for testing a human Fc domain-containing therapeutic protein, comprising administering the therapeutic protein to a rodent of any one of embodiments 148-239 and measuring one or more Fc receptor-mediated responses in the rodent. .

[0573] В типовом варианте осуществления 279 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 278, отличающаяся тем, что один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов включают ответ АЗКЦ.[0573] In exemplary embodiment 279, an animal model of embodiment 278 is provided herein, wherein one or more Fc receptor-mediated responses include an ADCC response.

[0574] В типовом варианте осуществления 280 в данном документе предложена животная модель для скрининга терапевтического агента, содержащего человеческую Fc-область человеческого антитела, включающая: (a) введение агента, содержащего Fc-область человеческого антитела, грызуну по любому из вариантов осуществления 148-239, причем агент связывается с целевой клеткой в организме мыши; (b) определение антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) естественных клеток-киллеров (NK) против целевой клетки; и (c) сравнение уровня АЗКЦ на этапе (b) с контролем, причем повышенное уничтожение целевых клеток указывает на то, что агент обладает повышенной способностью опосредовать АЗКЦ.[0574] Exemplary embodiment 280 herein provides an animal model for screening a therapeutic agent containing a human Fc region of a human antibody, comprising: (a) administering an agent containing a human Fc region to a rodent according to any one of embodiments 148- 239, wherein the agent binds to a target cell in the mouse; (b) determining antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of natural killer (NK) cells against the target cell; and (c) comparing the level of ADCC in step (b) with the control, with increased killing of target cells indicating that the agent has an increased ability to mediate ADCC.

[0575] В типовом варианте осуществления 281 в данном документе предложена животная модель для измерения иммунного ответа, вырабатываемого грызуном против терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение иммунного ответа, вырабатываемого грызуном против терапевтического белка.[0575] Exemplary embodiment 281 herein provides an animal model for measuring the immune response generated by a rodent against a therapeutic protein containing a human Fc domain, comprising administering the therapeutic protein to the rodent of any one of embodiments 1-207 and measuring the immune response generated rodent against therapeutic protein.

[0576] В типовом варианте осуществления 282 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-281, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело.[0576] Exemplary embodiment 282 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-281, wherein the therapeutic protein is a human antibody.

[0577] В типовом варианте осуществления 283 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-281, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок.[0577] Exemplary embodiment 283 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-281, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein.

[0578] В типовом варианте осуществления 284 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-283, отличающаяся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG1 человека.[0578] Exemplary embodiment 284 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-283, wherein the human Fc domain is a human IgG1 Fc domain.

[0579] В типовом варианте осуществления 285 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 284, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG1.[0579] In exemplary embodiment 285, an animal model of embodiment 284 is provided herein, wherein the therapeutic protein is a human IgG1 antibody.

[0580] В типовом варианте осуществления 286 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 284, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG1 человека.[0580] In exemplary embodiment 286, an animal model of embodiment 284 is provided herein, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein containing the Fc domain of human IgG1.

[0581] В типовом варианте осуществления 287 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-286, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ1.[0581] Exemplary embodiment 287 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-286, wherein a C _H gene segment encoding an IgG constant domain containing a human C _H 1 domain, a human hinge region, a C domain Human _H 2, human C _H 3 domain, IgG transmembrane domain and IgG cytoplasmic domain, is the C _γ1 gene segment.

[0582] В типовом варианте осуществления 288 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-283, отличающаяся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG2 человека.[0582] Exemplary embodiment 288 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-283, wherein the human Fc domain is a human IgG2 Fc domain.

[0583] В типовом варианте осуществления 289 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 288, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG2.[0583] In exemplary embodiment 289, an animal model of embodiment 288 is provided herein, wherein the therapeutic protein is a human IgG2 antibody.

[0584] В типовом варианте осуществления 290 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 288, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG2 человека.[0584] In exemplary embodiment 290, an animal model of embodiment 288 is provided herein, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein containing the Fc domain of human IgG2.

[0585] В типовом варианте осуществления 291 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 288-290, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ2.[0585] Exemplary embodiment 291 herein provides an animal model of any one of embodiments 288-290, wherein a C _H gene segment encoding an IgG constant domain containing a human C _H 1 domain, a human hinge region, a C domain Human _H 2, human C _H 3 domain, IgG transmembrane domain and IgG cytoplasmic domain, is the C _γ2 gene segment.

[0586] В типовом варианте осуществления 292 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-283, отличающаяся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG3 человека.[0586] Exemplary embodiment 292 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-283, wherein the human Fc domain is a human IgG3 Fc domain.

[0587] В типовом варианте осуществления 293 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 292, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG3.[0587] In exemplary embodiment 293, an animal model of embodiment 292 is provided herein, wherein the therapeutic protein is a human IgG3 antibody.

[0588] В типовом варианте осуществления 294 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 292, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG3 человека.[0588] In exemplary embodiment 294, an animal model of embodiment 292 is provided herein, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein containing the Fc domain of human IgG3.

[0589] В типовом варианте осуществления 295 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 292-294, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ3.[0589] Exemplary embodiment 295 herein provides an animal model of any one of embodiments 292-294, wherein a C _H gene segment encoding an IgG constant domain containing a human C _H 1 domain, a human hinge region, a C domain Human _H 2, human C _H 3 domain, IgG transmembrane domain and IgG cytoplasmic domain, is the C _γ3 gene segment.

[0590] В типовом варианте осуществления 296 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-283, отличающаяся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG4 человека.[0590] Exemplary embodiment 296 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-283, wherein the human Fc domain is a human IgG4 Fc domain.

[0591] В типовом варианте осуществления 297 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 296, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG4.[0591] In exemplary embodiment 297, an animal model of embodiment 296 is provided herein, wherein the therapeutic protein is a human IgG4 antibody.

[0592] В типовом варианте осуществления 298 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 296, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG4 человека.[0592] In exemplary embodiment 298, an animal model of embodiment 296 is provided herein, wherein the therapeutic protein is an Fc fusion protein containing the Fc domain of human IgG4.

[0593] В типовом варианте осуществления 299 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 296-298, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ4.[0593] Exemplary embodiment 299 herein provides an animal model of any one of embodiments 296-298, wherein a C _H gene segment encoding an IgG constant domain containing a human C _H 1 domain, a human hinge region, a C domain Human _H 2, human C _H 3 domain, IgG transmembrane domain and IgG cytoplasmic domain, is the C _γ4 gene segment.

[0594] В типовом варианте осуществления 300 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 282, 284, 285, 287-289, 291-293, 295-297 и 299, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело с легкой цепью κ, а грызун экспрессирует антитела, содержащие легкие цепи κ человека.[0594] Exemplary embodiment 300 herein provides an animal model of any one of embodiments 282, 284, 285, 287-289, 291-293, 295-297, and 299, wherein the therapeutic protein is a human antibody with κ light chain, and the rodent expresses antibodies containing human κ light chains.

[0595] В типовом варианте осуществления 301 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 282, 284, 285, 287-289, 291-293, 295-297 и 299, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело с легкой цепью λ, а грызун экспрессирует антитела, содержащие легкие цепи λ человека.[0595] Exemplary embodiment 301 herein provides an animal model of any one of embodiments 282, 284, 285, 287-289, 291-293, 295-297, and 299, wherein the therapeutic protein is a human antibody with λ light chain, and the rodent expresses antibodies containing human λ light chains.

[0596] В типовом варианте осуществления 302 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-301, отличающаяся тем, что грызун представляет собой мышь.[0596] Exemplary embodiment 302 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-301, wherein the rodent is a mouse.

[0597] В типовом варианте осуществления 303 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-301, отличающаяся тем, что грызун представляет собой крысу.[0597] Exemplary embodiment 303 herein provides an animal model of any one of embodiments 272-301, wherein the rodent is a rat.

[0598] В типовом варианте осуществления 304 в данном документе предложена эмбриональная стволовая (ЭС) клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0598] In exemplary embodiment 304, provided herein is a rodent embryonic stem (ES) cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a V _H gene segment, a gene segment D _H and gene segment J _H ; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, an IgG transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. IgG, wherein the variable region of the immunoglobulin heavy chain is operably linked to the constant region of the immunoglobulin heavy chain.

[0599] В типовом варианте осуществления 305 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 304, отличающаяся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна.[0599] In exemplary embodiment 305, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 304, wherein the IgG transmembrane domain is a rodent IgG transmembrane domain.

[0600] В типовом варианте осуществления 306 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 304, отличающаяся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG человека.[0600] In exemplary embodiment 306, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 304, wherein the IgG transmembrane domain is a human IgG transmembrane domain.

[0601] В типовом варианте осуществления 307 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-306, отличающаяся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна.[0601] Exemplary embodiment 307 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-306, wherein the IgG cytoplasmic domain is a rodent IgG cytoplasmic domain.

[0602] В типовом варианте осуществления 308 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-306, отличающаяся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG человека.[0602] Exemplary embodiment 308 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-306, wherein the IgG cytoplasmic domain is a human IgG cytoplasmic domain.

[0603] В типовом варианте осуществления 309 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-308, отличающаяся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG1.[0603] Exemplary embodiment 309 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-308, characterized in that a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, and a human C _H 3 domain are domains of IgG1.

[0604] В типовом варианте осуществления 310 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 309, отличающаяся тем, что домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05.[0604] Exemplary embodiment 310 herein provides a rodent ES cell of embodiment 309, wherein the IgG1 domain is encoded by an allele selected from IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04, and IGHG1* 05.

[0605] В типовом варианте осуществления 311 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-308, отличающаяся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG2.[0605] Exemplary embodiment 311 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-308, characterized in that a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, and a human C _H 3 domain are domains of IgG2.

[0606] В типовом варианте осуществления 312 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 311, отличающаяся тем, что домен IgG2 кодируется аллелем, выбранным из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06.[0606] Exemplary embodiment 312 herein provides a rodent ES cell of embodiment 311, wherein the IgG2 domain is encoded by an allele selected from IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2* 05 and IGHG2*06.

[0607] В типовом варианте осуществления 313 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-308, отличающаяся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG3.[0607] Exemplary embodiment 313 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-308, characterized in that a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, and a human C _H 3 domain are IgG3 domains.

[0608] В типовом варианте осуществления 314 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 313, отличающаяся тем, что домен IgG3 кодируется аллелем, выбранным из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19.[0608] Exemplary embodiment 314 herein provides a rodent ES cell of embodiment 313, wherein the IgG3 domain is encoded by an allele selected from IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3* 05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 and IGHG3*19.

[0609] В типовом варианте осуществления 315 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-308, отличающаяся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG4.[0609] Exemplary embodiment 315 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-308, characterized in that a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, and a human C _H 3 domain are domains of IgG4.

[0610] В типовом варианте осуществления 316 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 315, отличающаяся тем, что домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04.[0610] Exemplary embodiment 316 herein provides a rodent ES cell of embodiment 315, wherein the IgG4 domain is encoded by an allele selected from IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03, and IGHG4*04.

[0611] В типовом варианте осуществления 317 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 309-316, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a или C_γ2c.[0611] Exemplary embodiment 317 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 309-316, characterized in that a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain and the human C _H 3 domain, located at the endogenous gene segment C _γ2a or C _γ2c locus.

[0612] В типовом варианте осуществления 318 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 317, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2a или C_γ2c.[0612] In exemplary embodiment 318, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 317, characterized in that a C _H gene segment encoding a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, and a C _H domain 3 humans, replaces the endogenous gene segment C _γ2a or C _γ2c .

[0613] В типовом варианте осуществления 319 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 309-316, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1.[0613] Exemplary embodiment 319 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 309-316, characterized in that a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain and the human C _H 3 domain, located in the endogenous C _γ1 gene segment locus.

[0614] В типовом варианте осуществления 320 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 319, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ1.[0614] In exemplary embodiment 320, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 319, characterized in that a C _H gene segment encoding a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, and a C _H domain 3 humans, replaces the endogenous gene segment C _γ1 .

[0615] В типовом варианте осуществления 321 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 309-316, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b.[0615] Exemplary embodiment 321 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 309-316, wherein a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain and the human C _H 3 domain, located at the endogenous C _γ2b gene segment locus.

[0616] В типовом варианте осуществления 322 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 321, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2b.[0616] In exemplary embodiment 322, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 321, characterized in that a C _H gene segment encoding a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, and a C _H domain 3 humans, replaces the endogenous gene segment C _γ2b .

[0617] В типовом варианте осуществления 323 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 309-316, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ3.[0617] Exemplary embodiment 323 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 309-316, characterized in that a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain and the human C _H 3 domain, located at the endogenous C _γ3 gene segment locus.

[0618] В типовом варианте осуществления 324 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 323, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ3.[0618] In exemplary embodiment 324, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 323, characterized in that a C _H gene segment encoding a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, and a C _H domain 3 humans, replaces the endogenous gene segment C _γ3 .

[0619] В типовом варианте осуществления 325 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-324, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ грызуна.[0619] Exemplary embodiment 325 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-324, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cμ gene segment.

[0620] В типовом варианте осуществления 326 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-324, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ человека.[0620] In exemplary embodiment 326, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-324, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cμ gene segment.

[0621] В типовом варианте осуществления 327 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-326, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ грызуна.[0621] In exemplary embodiment 327, provided herein is the rodent ES cell of any one of embodiments 304-326, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cδ gene segment.

[0622] В типовом варианте осуществления 328 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-326, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.[0622] Exemplary embodiment 328 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-326, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cδ gene segment.

[0623] В типовом варианте осуществления 329 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-328, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 грызуна.[0623] In exemplary embodiment 329, provided herein is the rodent ES cell of any one of embodiments 304-328, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cγ1 gene segment.

[0624] В типовом варианте осуществления 330 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-329, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна.[0624] Exemplary embodiment 330 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-329, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent C _γ2a and/or C _γ2c gene segment.

[0625] В типовом варианте осуществления 331 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-330, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2b грызуна.[0625] Exemplary embodiment 331 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-330, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent C _γ2b gene segment.

[0626] В типовом варианте осуществления 332 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-331, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 грызуна.[0626] Exemplary embodiment 332 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-331, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent C _γ3 gene segment.

[0627] В типовом варианте осуществления 333 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-332, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε грызуна.[0627] In exemplary embodiment 333, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-332, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cε gene segment.

[0628] В типовом варианте осуществления 334 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-332, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0628] Exemplary embodiment 334 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-332, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0629] В типовом варианте осуществления 335 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-334, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α грызуна.[0629] In exemplary embodiment 335, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-334, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cα gene segment.

[0630] В типовом варианте осуществления 336 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-334, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0630] In exemplary embodiment 336, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-334, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0631] В типовом варианте осуществления 337 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-324, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.[0631] In exemplary embodiment 337, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-324, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region comprises a human C _μ gene segment, a human C _δ gene segment, a C gene segment human _γ3 and human _γ1 C gene segment.

[0632] В типовом варианте осуществления 338 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 337, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.[0632] In exemplary embodiment 338, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 337, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment.

[0633] В типовом варианте осуществления 339 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 337 или варианту осуществления 338, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0633] In exemplary embodiment 339, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 337 or embodiment 338, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0634] В типовом варианте осуществления 340 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 337-339, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0634] Exemplary embodiment 340 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 337-339, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0635] В типовом варианте осуществления 341 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-340, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) грызуна.[0635] Exemplary embodiment 341 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-340, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent intronic enhancer (E _i ).

[0636] В типовом варианте осуществления 342 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-340, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) человека.[0636] Exemplary embodiment 342 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-340, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human intronic enhancer (E _i ).

[0637] В типовом варианте осуществления 343 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-342, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна.[0637] Exemplary embodiment 343 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-342, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent 3' regulatory region (3' RO).

[0638] В типовом варианте осуществления 344 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-342, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) человека.[0638] Exemplary embodiment 344 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-342, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human 3' regulatory region (3' RO).

[0639] В типовом варианте осуществления 345 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-344, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ грызуна.[0639] Exemplary embodiment 345 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-344, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sμ switch site.

[0640] В типовом варианте осуществления 346 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-345, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 грызуна.[0640] Exemplary embodiment 346 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-345, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _γ3 switch site.

[0641] В типовом варианте осуществления 347 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-346, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 грызуна.[0641] In exemplary embodiment 347, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-346, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sγ1 switch site.

[0642] В типовом варианте осуществления 348 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-347, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2b грызуна.[0642] Exemplary embodiment 348 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-347, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _γ2b switch site.

[0643] В типовом варианте осуществления 349 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-348, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2a и/или S_γ2c грызуна.[0643] Exemplary embodiment 349 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-348, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _γ2a and/or S _γ2c switch site.

[0644] В типовом варианте осуществления 350 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-349, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε грызуна.[0644] Exemplary embodiment 350 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-349, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sε switch site.

[0645] В типовом варианте осуществления 351 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-350, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α грызуна.[0645] Exemplary embodiment 351 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-350, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _α switch site.

[0646] В типовом варианте осуществления 352 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ человека.[0646] Exemplary embodiment 352 herein provides the rodent of any one of embodiments 304-344, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sμ switch site.

[0647] В типовом варианте осуществления 353 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 человека.[0647] Exemplary embodiment 353 herein provides the rodent of any one of embodiments 304-344 and 352, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ3 switch site.

[0648] В типовом варианте осуществления 354 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-353, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 человека.[0648] Exemplary embodiment 354 herein provides the rodent of any one of embodiments 304-344 and 352-353, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ1 switch site.

[0649] В типовом варианте осуществления 355 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-354, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2 человека.[0649] Exemplary embodiment 355 herein provides the rodent of any one of embodiments 304-344 and 352-354, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ2 switch site.

[0650] В типовом варианте осуществления 356 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-355, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ4 человека.[0650] Exemplary embodiment 356 herein provides the rodent of any one of embodiments 304-344 and 352-355, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ4 switch site.

[0651] В типовом варианте осуществления 357 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-356, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε человека.[0651] Exemplary embodiment 357 herein provides the rodent of any one of embodiments 304-344 and 352-356, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sε switch site.

[0652] В типовом варианте осуществления 358 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-357, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α человека.[0652] Exemplary embodiment 358 herein provides the rodent of any one of embodiments 304-344 and 352-357, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human S _α switch site.

[0653] В типовом варианте осуществления 359 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-358, отличающаяся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H грызуна, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H грызуна.[0653] Exemplary embodiment 359 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-358, wherein the V _H gene segment is a rodent V _H gene segment, the D _H gene segment is a D gene segment _H rodent, and the J _H gene segment is a rodent J _H gene segment.

[0654] В типовом варианте осуществления 360 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 359, отличающаяся тем, что генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты грызуна.[0654] Exemplary embodiment 360 herein provides a rodent ES cell of embodiment 359, wherein the rodent _VH gene segment, rodent _DH gene segment, and rodent _JH gene segment are endogenous rodent gene segments.

[0655] В типовом варианте осуществления 361 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-358, отличающаяся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H человека, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H человека.[0655] Exemplary embodiment 361 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 304-358, wherein the V _H gene segment is a human V _H gene segment, the D _H gene segment is a D gene segment human _H , and the J _H gene segment is a human J _H gene segment.

[0656] В типовом варианте осуществления 362 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 361, отличающаяся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере 3 генных сегмента V_H человека.[0656] In exemplary embodiment 362, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 361, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region contains at least 3 human _VH gene segments.

[0657] В типовом варианте осуществления 363 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 361 или варианту осуществления 362, отличающаяся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты D_H человека.[0657] In exemplary embodiment 363, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 361 or embodiment 362, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region contains all human D _H gene segments.

[0658] В типовом варианте осуществления 364 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 361-363, отличающаяся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_H человека.[0658] In exemplary embodiment 364, provided herein is the rodent ES cell of any one of embodiments 361-363, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region contains all human _JH gene segments.

[0659] В типовом варианте осуществления 365 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 361-364, отличающаяся тем, что в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна.[0659] Exemplary embodiment 365 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 361-364, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region lacks a functional endogenous rodent Adam6 gene.

[0660] В типовом варианте осуществления 366 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 361-365, отличающаяся тем, что геном зародышевой линии дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный полипептид Adam6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент.[0660] Exemplary embodiment 366 provided herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 361-365, wherein the germline genome further comprises a nucleotide sequence encoding a functional rodent Adam6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or functional fragment.

[0661] В типовом варианте осуществления 367 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 366, отличающаяся тем, что происходит экспрессия функционального полипептида Adam6 грызуна, его функционального ортолога, функционального гомолога или функционального фрагмента. [0661] In exemplary embodiment 367, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 366, characterized in that it expresses a functional rodent Adam6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof.

[0662] В типовом варианте осуществления 368 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 366 или варианту осуществления 367, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в той же хромосоме, что и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина.[0662] In exemplary embodiment 368, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 366 or embodiment 367, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof is in that the same chromosome as the variable region of the immunoglobulin heavy chain.

[0663] В типовом варианте осуществления 369 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-368, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в сконструированном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.[0663] In exemplary embodiment 369, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 366-368, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is in an engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0664] В типовом варианте осуществления 370 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-369, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится на месте псевдогена Adam6 человека.[0664] Exemplary embodiment 370 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 366-369, wherein a nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional orthologue, a functional homologue, or a functional fragment thereof is in place human Adam6 pseudogene.

[0665] В типовом варианте осуществления 371 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-370, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, замещает псевдоген Adam6 человека.[0665] Exemplary embodiment 371 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 366-370, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof replaces the Adam6 pseudogene person.

[0666] В типовом варианте осуществления 372 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-371, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между первым генным сегментом V_H человека и вторым генным сегментом V_H человека.[0666] Exemplary embodiment 372 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 366-371, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is between the first a human _VH gene segment and a second human _VH gene segment.

[0667] В типовом варианте осуществления 373 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 372, отличающаяся тем, что первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1-2, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6-1.[0667] In exemplary embodiment 373, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 372, wherein the first human V _H gene segment is V _H 1-2 and the second human V _H gene segment is V _H 6-1.

[0668] В типовом варианте осуществления 374 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-369, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.[0668] In exemplary embodiment 374, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 366-369, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is located between the gene human _VH segment and human _DH gene segment.

[0669] В типовом варианте осуществления 375 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-374, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.[0669] Exemplary embodiment 375 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-374, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus is located at an endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0670] В типовом варианте осуществления 376 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 375, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0670] In exemplary embodiment 376, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 375, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus replaces all or part of the endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0671] В типовом варианте осуществления 377 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-376, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0671] In exemplary embodiment 377, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-376, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0672] В типовом варианте осуществления 378 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-376, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0672] In exemplary embodiment 378, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 304-376, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0673] В типовом варианте осуществления 379 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0673] In an exemplary embodiment 379 provided herein is a rodent ES cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of rodent IgG2a, and the cytoplasmic domain of rodent IgG2a; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region.

[0674] В типовом варианте осуществления 380 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0674] In exemplary embodiment 380, provided herein is a rodent ES cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of human IgG1, and the cytoplasmic domain of human IgG1; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region.

[0675] В типовом варианте осуществления 381 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0675] In an exemplary embodiment 381 provided herein is a rodent ES cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of rodent IgG1, and the cytoplasmic domain of rodent IgG1; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) rodent _Cγ2a and/or _Cγ2c gene segment; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region.

[0676] В типовом варианте осуществления 382 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0676] In an exemplary embodiment 382 provided herein is a rodent ES cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of human IgG4, and the cytoplasmic domain of human IgG4; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) rodent _Cγ2a and/or _Cγ2c gene segment; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region.

[0677] В типовом варианте осуществления 383 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0677] In an exemplary embodiment 383 provided herein is a rodent ES cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region.

[0678] В типовом варианте осуществления 384 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент Cμ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0678] In an exemplary embodiment 384 provided herein is a rodent ES cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; (c) human C _γ2 gene segment; (d) human _γ4 C gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region.

[0679] В типовом варианте осуществления 385 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0679] In an exemplary embodiment 385 provided herein is a rodent ES cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that comprises: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a rodent V _H gene segment, a D _H gene segment rodent and rodent J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region.

[0680] В типовом варианте осуществления 386 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.[0680] In an exemplary embodiment 386 provided herein is a rodent ES cell comprising in the genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a rodent V _H gene segment, a D _H gene segment rodent and rodent J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; (c) human C _γ2 gene segment; (d) human _γ4 C gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region.

[0681] В типовом варианте осуществления 387 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-386, дополнительно содержащая в геноме: сконструированный локус цепи каппа (κ) иммуноглобулина, который содержит: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_κ человека и генный сегмент J_κ человека; и (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_κ человека, причем вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина.[0681] In exemplary embodiment 387, provided herein is a rodent ES cell of any one of embodiments 304-386, further comprising in the genome: an engineered immunoglobulin kappa (κ) chain locus that contains: (1) an immunoglobulin κ chain variable region , containing a human V _κ gene segment and a human J _κ gene segment; and (2) an immunoglobulin κ chain constant region comprising a human _κ C gene segment, wherein the immunoglobulin κ chain variable region is operably linked to the immunoglobulin κ chain constant region.

[0682] В типовом варианте осуществления 388 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 387, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) грызуна.[0682] In exemplary embodiment 388, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 387, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a rodent κ intronic enhancer (E _κi ).

[0683] В типовом варианте осуществления 389 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 387, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) человека.[0683] In exemplary embodiment 389, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 387, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a human intronic κ enhancer (E _κi ).

[0684] В типовом варианте осуществления 390 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-389, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер κ (E_κ3') грызуна.[0684] Exemplary embodiment 390 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 387-389, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a rodent κ 3' enhancer (E _κ3' ).

[0685] В типовом варианте осуществления 391 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-389, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер κ (E_κ3') человека.[0685] Exemplary embodiment 391 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 387-389, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a human κ 3' enhancer (E _κ3' ).

[0686] В типовом варианте осуществления 392 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-391, отличающаяся тем, что сконструированная вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 6 генных сегментов V_κ человека.[0686] In exemplary embodiment 392, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 387-391, wherein the engineered immunoglobulin κ chain variable region contains at least 6 human V _κ gene segments.

[0687] В типовом варианте осуществления 393 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 387 или варианту осуществления 392, отличающаяся тем, что сконструированная вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_κ человека.[0687] In exemplary embodiment 393, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 387 or embodiment 392, wherein the engineered immunoglobulin κ chain variable region contains all human J _κ gene segments.

[0688] В типовом варианте осуществления 394 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-393, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина.[0688] In exemplary embodiment 394, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 387-393, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin κ chain locus.

[0689] В типовом варианте осуществления 395 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 394, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0689] Exemplary embodiment 395 herein provides a rodent ES cell of embodiment 394, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus replaces all or part of the endogenous immunoglobulin κ chain locus.

[0690] В типовом варианте осуществления 396 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-395, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0690] In exemplary embodiment 396, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 387-395, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin κ chain locus.

[0691] В типовом варианте осуществления 397 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-395, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0691] In exemplary embodiment 397, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 387-395, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin κ chain locus.

[0692] В типовом варианте осуществления 398 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-397, дополнительно содержащая в геноме: сконструированный локус цепи лямбда (λ) иммуноглобулина, который содержит: генный сегмент V_λ человека, генный сегмент J_λ человека и генный сегмент C_λ человека, причем генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом C_λ человека.[0692] Exemplary embodiment 398 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-397, further comprising in the genome: an engineered immunoglobulin lambda (λ) chain locus that contains: a human _Vλ gene segment, a gene segment Human J _λ and human C _λ gene segment, wherein the human V _λ gene segment and human J _λ gene segment are operably linked to the human C _λ gene segment.

[0693] В типовом варианте осуществления 399 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ1 человека.[0693] In exemplary embodiment 399, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 398, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ1 gene segment.

[0694] В типовом варианте осуществления 400 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 399, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ1 человека. [0694] Exemplary embodiment 400 herein provides a rodent ES cell of embodiment 399, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ1 gene segment.

[0695] В типовом варианте осуществления 401 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ2 человека.[0695] Exemplary embodiment 401 herein provides a rodent ES cell of embodiment 398, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ2 gene segment.

[0696] В типовом варианте осуществления 402 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 401, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ2 человека.[0696] In exemplary embodiment 402, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 401, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ2 gene segment.

[0697] В типовом варианте осуществления 403 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ3 человека.[0697] Exemplary embodiment 403 herein provides a rodent ES cell of embodiment 398, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ3 gene segment.

[0698] В типовом варианте осуществления 404 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 403, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ3 человека.[0698] In exemplary embodiment 404, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 403, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ3 gene segment.

[0699] В типовом варианте осуществления 405 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ6 человека.[0699] Exemplary embodiment 405 herein provides a rodent ES cell of embodiment 398, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ6 gene segment.

[0700] В типовом варианте осуществления 406 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 405, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ6 человека.[0700] In exemplary embodiment 406, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 405, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ6 gene segment.

[0701] В типовом варианте осуществления 407 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ7 человека.[0701] In exemplary embodiment 407, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 398, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ7 gene segment.

[0702] В типовом варианте осуществления 408 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-407, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент C_λ1 человека, генный сегмент C_λ2 человека, генный сегмент C_λ3 человека, генный сегмент C_λ6 человека и генный сегмент C_λ1 грызуна.[0702] Exemplary embodiment 408 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 398-407, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus comprises a human _λ1 C gene segment, a human _λ2 C gene segment, a C gene segment human _λ3 , human _λ6 C gene segment, and rodent C _λ1 gene segment.

[0703] В типовом варианте осуществления 409 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 408, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент J_λ1 человека, генный сегмент J_λ2 человека, генный сегмент J_λ3 человека, генный сегмент J_λ6 человека и генный сегмент J_λ7 человека.[0703] Exemplary embodiment 409 herein provides a rodent ES cell of embodiment 408, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus comprises a human J _λ1 gene segment, a human J _λ2 gene segment, a human J _λ3 gene segment, a the human J _λ6 gene segment and the human J _λ7 gene segment.

[0704] В типовом варианте осуществления 410 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 409, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ содержит кластер генных сегментов J_λ1 - C_λ1 человека, кластер генных сегментов J_λ2 - C_λ2 человека, кластер генных сегментов J_λ3 - C_λ3 человека, кластер генных сегментов J_λ6 - C_λ6 человека и кластер генных сегментов J_λ7 человека - C_λ1 грызуна.[0704] Exemplary embodiment 410 herein provides a rodent ES cell of embodiment 409, wherein the engineered λ chain locus comprises a human J _λ1 - C _λ1 gene segment cluster, a human J _λ2 - C _λ2 gene segment cluster, human J _λ3 - C _λ3 gene segment cluster, human J _λ6 - C _λ6 gene segment cluster, and rodent J _λ7 - C _λ1 gene segment cluster.

[0705] В типовом варианте осуществления 411 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-410, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 7 генных сегментов V_λ человека.[0705] Exemplary embodiment 411 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 398-410, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus contains at least 7 human V _λ gene segments.

[0706] В типовом варианте осуществления 412 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-411, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 2.4 λ грызуна.[0706] Exemplary embodiment 412 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 398-411, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent λ 2.4 enhancer.

[0707] В типовом варианте осуществления 413 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-412, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер λ грызуна.[0707] Exemplary embodiment 413 herein provides the rodent ES cell of any one of embodiments 398-412, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent λ 3' enhancer.

[0708] В типовом варианте осуществления 414 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-413, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 3.1 λ грызуна.[0708] Exemplary embodiment 414 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 398-413, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent λ 3.1 enhancer.

[0709] В типовом варианте осуществления 415 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398–414, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер λ человека.[0709] Exemplary embodiment 415 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 398 to 414, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a human λ 3' enhancer.

[0710] В типовом варианте осуществления 416 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398–415, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина.[0710] Exemplary embodiment 416 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 398-415, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin λ chain locus.

[0711] В типовом варианте осуществления 417 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 416, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0711] In exemplary embodiment 417, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 416, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus replaces all or part of the endogenous immunoglobulin λ chain locus.

[0712] В типовом варианте осуществления 418 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398–417, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0712] Exemplary embodiment 418 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 398-417, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin λ chain locus.

[0713] В типовом варианте осуществления 419 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398–417, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0713] Exemplary embodiment 419 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 398-417, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin λ chain locus.

[0714] В типовом варианте осуществления 420 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–419, дополнительно содержащая в геноме локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.[0714] Exemplary embodiment 420 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-419, further comprising in the genome a neonatal Fc receptor (FcRn) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide containing an extracellular domain person.

[0715] В типовом варианте осуществления 421 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 420, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0715] In exemplary embodiment 421, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 420, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0716] В типовом варианте осуществления 422 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 420, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0716] In exemplary embodiment 422, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 420, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0717] В типовом варианте осуществления 423 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–422, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0717] Exemplary embodiment 423 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 420-422, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0718] В типовом варианте осуществления 424 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–422, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0718] Exemplary embodiment 424 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 420-422, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0719] В типовом варианте осуществления 425 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–424, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.[0719] Exemplary embodiment 425 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 420-424, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide is located at an endogenous rodent FcRn locus.

[0720] В типовом варианте осуществления 426 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 425, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.[0720] In exemplary embodiment 426, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 425, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent FcRn gene.

[0721] В типовом варианте осуществления 427 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 420, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.[0721] Exemplary embodiment 427 herein provides a rodent ES cell of embodiment 420, wherein the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of the FcRn replaces the endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of the rodent FcRn.

[0722] В типовом варианте осуществления 428 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–427, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.[0722] Exemplary embodiment 428 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 420-427, wherein the rodent does not express a rodent FcRn.

[0723] В типовом варианте осуществления 429 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–428, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0723] In exemplary embodiment 429, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 420-428, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcRn locus.

[0724] В типовом варианте осуществления 430 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–428, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0724] Exemplary embodiment 430 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 420-428, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcRn locus.

[0725] В типовом варианте осуществления 431 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–430, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).[0725] Exemplary embodiment 431 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 420-430, further comprising in the genome an engineered β-2-microglobulin (β2M) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human or humanized polypeptide β-2-microglobulin (β2M).

[0726] В типовом варианте осуществления 432 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 431, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.[0726] Exemplary embodiment 432 herein provides a rodent ES cell of embodiment 431, wherein the nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide is located at the endogenous rodent β2M locus.

[0727] В типовом варианте осуществления 433 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 432, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.[0727] Exemplary embodiment 433 herein provides a rodent ES cell of embodiment 432, wherein a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent β2M gene.

[0728] В типовом варианте осуществления 434 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 431–433, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2–4 гена β2M человека.[0728] Exemplary embodiment 434 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 431-433, wherein the nucleic acid sequence comprises exons 2-4 of the human β2M gene.

[0729] В типовом варианте осуществления 435 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 431–434, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.[0729] Exemplary embodiment 435 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 431-434, wherein the rodent does not express a rodent β2M polypeptide.

[0730] В типовом варианте осуществления 436 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 431–435, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0730] Exemplary embodiment 436 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 431-435, wherein the rodent is heterozygous for the engineered β2M locus.

[0731] В типовом варианте осуществления 437 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 431–435, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0731] In exemplary embodiment 437, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 431-435, wherein the rodent is homozygous for the engineered β2M locus.

[0732] В типовом варианте осуществления 438 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–437, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.[0732] Exemplary embodiment 438 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-437, further comprising in its genome an engineered Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide , containing the human extracellular domain.

[0733] В типовом варианте осуществления 439 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 438, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0733] In exemplary embodiment 439, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 438, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0734] В типовом варианте осуществления 440 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 438, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0734] In exemplary embodiment 440, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 438, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0735] В типовом варианте осуществления 441 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–440, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0735] Exemplary embodiment 441 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 438-440, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0736] В типовом варианте осуществления 442 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–440, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0736] In exemplary embodiment 442, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 438-440, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0737] В типовом варианте осуществления 443 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–442, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.[0737] In exemplary embodiment 443, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 438-442, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide is located at the endogenous rodent FcεR1α locus.

[0738] В типовом варианте осуществления 444 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 443, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.[0738] In exemplary embodiment 444, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 443, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent FcεR1α gene.

[0739] В типовом варианте осуществления 445 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 444, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.[0739] In exemplary embodiment 445, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 444, wherein the FcεR1α polypeptide comprises a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain.

[0740] В типовом варианте осуществления 446 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 438, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.[0740] Exemplary embodiment 446 herein provides a rodent ES cell of embodiment 438, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcεR1α replaces an endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcεR1α.

[0741] В типовом варианте осуществления 447 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–446, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.[0741] In exemplary embodiment 447, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 438-446, wherein the rodent does not express rodent FcεR1α.

[0742] В типовом варианте осуществления 448 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–447, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0742] In exemplary embodiment 448, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 438-447, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0743] В типовом варианте осуществления 449 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–447, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0743] In exemplary embodiment 449, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 438-447, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0744] В типовом варианте осуществления 450 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–449, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 1a (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека.[0744] Exemplary embodiment 450 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304 to 449, further comprising in its genome an engineered Fc gamma receptor 1a (FcγR1a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide, containing the human extracellular domain.

[0745] В типовом варианте осуществления 451 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 450, отличающаяся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0745] In exemplary embodiment 451, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 450, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0746] В типовом варианте осуществления 452 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 450, отличающаяся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0746] In exemplary embodiment 452, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 450, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0747] В типовом варианте осуществления 453 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–452, отличающаяся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0747] In exemplary embodiment 453, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 450-452, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0748] В типовом варианте осуществления 454 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–452, отличающаяся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0748] In exemplary embodiment 454, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 450-452, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0749] В типовом варианте осуществления 455 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–454, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна.[0749] Exemplary embodiment 455 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 450-454, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide is located at the endogenous rodent FcγR1a locus.

[0750] В типовом варианте осуществления 456 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 455, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, замещает весь или часть эндогенного гена FcγR1a грызуна.[0750] In exemplary embodiment 456, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 455, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent FcγR1a gene.

[0751] В типовом варианте осуществления 457 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 450, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcγR1a человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcγR1a грызуна.[0751] Exemplary embodiment 457 herein provides a rodent ES cell of embodiment 450, wherein the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcγR1a replaces the endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcγR1a.

[0752] В типовом варианте осуществления 458 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–457, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcγR1a грызуна.[0752] In exemplary embodiment 458, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 450-457, wherein the rodent does not express rodent FcγR1a.

[0753] В типовом варианте осуществления 459 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–458, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.[0753] In an exemplary embodiment 459 provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 450-458, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR1a locus.

[0754] В типовом варианте осуществления 460 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–458, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.[0754] Exemplary embodiment 460 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 450-458, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR1a locus.

[0755] В типовом варианте осуществления 461 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–460, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2a человека.[0755] Exemplary embodiment 461 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-460, further comprising in the genome an engineered Fc gamma receptor 2a (FcγR2a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2a polypeptide .

[0756] В типовом варианте осуществления 462 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 461, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0756] In exemplary embodiment 462, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 461, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2a polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus.

[0757] В типовом варианте осуществления 463 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 462, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0757] Exemplary embodiment 463 herein provides a rodent ES cell of embodiment 462, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR2a polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[0758] В типовом варианте осуществления 464 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 461–463, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.[0758] Exemplary embodiment 464 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 461-463, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2a locus.

[0759] В типовом варианте осуществления 465 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 461–463, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.[0759] Exemplary embodiment 465 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 461-463, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2a locus.

[0760] В типовом варианте осуществления 466 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–465, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2b человека.[0760] Exemplary embodiment 466 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304 to 465, further comprising in the genome an engineered Fc gamma receptor 2b (FcγR2b) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2b polypeptide .

[0761] В типовом варианте осуществления 467 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 466, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0761] In exemplary embodiment 467, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 466, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2b polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus.

[0762] В типовом варианте осуществления 468 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 467, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0762] In exemplary embodiment 468, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 467, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR2b polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[0763] В типовом варианте осуществления 469 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 466–468, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.[0763] In exemplary embodiment 469, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 466-468, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2b locus.

[0764] В типовом варианте осуществления 470 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 466–468, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.[0764] Exemplary embodiment 470 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 466-468, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2b locus.

[0765] В типовом варианте осуществления 471 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–470, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3a человека.[0765] Exemplary embodiment 471 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304 to 470, further comprising in the genome an engineered Fc gamma receptor 3a (FcγR3a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR3a polypeptide .

[0766] В типовом варианте осуществления 472 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 471, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0766] In exemplary embodiment 472, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 471, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcγR3a polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus.

[0767] В типовом варианте осуществления 473 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 472, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0767] In exemplary embodiment 473, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 472, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR3a polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[0768] В типовом варианте осуществления 474 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 471–473, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.[0768] In exemplary embodiment 474, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 471-473, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR3a locus.

[0769] В типовом варианте осуществления 475 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 471–473, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.[0769] Exemplary embodiment 475 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 471-473, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR3a locus.

[0770] В типовом варианте осуществления 476 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–475, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3b человека.[0770] Exemplary embodiment 476 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-475, further comprising in the genome an engineered Fc gamma receptor 3b (FcγR3b) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR3b polypeptide .

[0771] В типовом варианте осуществления 477 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 476, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0771] In exemplary embodiment 477, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 476, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR3b polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus.

[0772] В типовом варианте осуществления 478 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 477, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0772] In exemplary embodiment 478, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 477, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR3b polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[0773] В типовом варианте осуществления 479 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 476–478, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.[0773] In an exemplary embodiment 479 provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 476-478, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR3b locus.

[0774] В типовом варианте осуществления 480 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 476–478, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.[0774] Exemplary embodiment 480 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 476-478, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR3b locus.

[0775] В типовом варианте осуществления 481 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–480, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2c человека.[0775] Exemplary embodiment 481 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304-480, further comprising in the genome an engineered Fc gamma receptor 2c (FcγR2c) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2c polypeptide .

[0776] В типовом варианте осуществления 482 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 481, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0776] In exemplary embodiment 482, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 481, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2c polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus.

[0777] В типовом варианте осуществления 483 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 482, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0777] In exemplary embodiment 483, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 482, wherein a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2c polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[0778] В типовом варианте осуществления 484 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 481–483, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcγR2c грызуна.[0778] Exemplary embodiment 484 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 481-483, wherein the rodent does not express rodent FcγR2c.

[0779] В типовом варианте осуществления 485 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 481–484, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.[0779] Exemplary embodiment 485 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 481-484, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2c locus.

[0780] В типовом варианте осуществления 486 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 481–484, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.[0780] Exemplary embodiment 486 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 481-484, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2c locus.

[0781] В типовом варианте осуществления 487 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.[0781] In an exemplary embodiment 487 provided herein is a rodent ES cell comprising a genomically engineered neonatal Fc receptor (FcRn) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcRn polypeptide.

[0782] В типовом варианте осуществления 488 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 487, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0782] In exemplary embodiment 488, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 487, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0783] В типовом варианте осуществления 489 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 487, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0783] In exemplary embodiment 489, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 487, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0784] В типовом варианте осуществления 490 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–489, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0784] Exemplary embodiment 490 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 487-489, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0785] В типовом варианте осуществления 491 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–489, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0785] Exemplary embodiment 491 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 487-489, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0786] В типовом варианте осуществления 492 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–491, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.[0786] Exemplary embodiment 492 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 487-491, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide is located at an endogenous rodent FcRn locus.

[0787] В типовом варианте осуществления 493 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 492, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.[0787] In exemplary embodiment 493, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 492, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent FcRn gene.

[0788] В типовом варианте осуществления 494 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 493, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.[0788] Exemplary embodiment 494 herein provides a rodent ES cell of embodiment 493, wherein a nucleic acid sequence encoding a human FcRn extracellular domain replaces an endogenous nucleic acid sequence encoding a rodent FcRn extracellular domain.

[0789] В типовом варианте осуществления 495 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–494, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.[0789] Exemplary embodiment 495 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 487-494, wherein the rodent does not express a rodent FcRn.

[0790] В типовом варианте осуществления 496 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–495, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0790] Exemplary embodiment 496 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 487-495, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcRn locus.

[0791] В типовом варианте осуществления 497 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–495, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0791] Exemplary embodiment 497 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 487-495, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcRn locus.

[0792] В типовом варианте осуществления 498 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–497, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).[0792] Exemplary embodiment 498 provided herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 487 to 497, further comprising in the genome an engineered β-2-microglobulin (β2M) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human or humanized polypeptide β-2-microglobulin (β2M).

[0793] В типовом варианте осуществления 499 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 498, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.[0793] In exemplary embodiment 499, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 498, wherein the nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide is located at the endogenous rodent β2M locus.

[0794] В типовом варианте осуществления 500 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 499, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.[0794] Exemplary Embodiment 500 herein provides a rodent ES cell of Embodiment 499, wherein a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent β2M gene.

[0795] В типовом варианте осуществления 501 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 498–500, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2–4 гена β2M человека.[0795] Exemplary embodiment 501 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 498-500, wherein the nucleic acid sequence comprises exons 2-4 of the human β2M gene.

[0796] В типовом варианте осуществления 502 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 498–501, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.[0796] Exemplary embodiment 502 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 498 to 501, wherein the rodent does not express a rodent β2M polypeptide.

[0797] В типовом варианте осуществления 503 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 498–502, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0797] Exemplary embodiment 503 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 498-502, wherein the rodent is heterozygous for the engineered β2M locus.

[0798] В типовом варианте осуществления 504 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 498–502, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0798] Exemplary embodiment 504 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 498-502, wherein the rodent is homozygous for the engineered β2M locus.

[0799] В типовом варианте осуществления 505 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.[0799] In exemplary embodiment 505, provided herein is a rodent ES cell comprising in its genome an engineered Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcεR1α polypeptide.

[0800] В типовом варианте осуществления 506 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 505, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0800] In exemplary embodiment 506, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 505, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0801] В типовом варианте осуществления 507 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 505, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0801] In exemplary embodiment 507, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 505, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0802] В типовом варианте осуществления 508 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–507, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0802] In exemplary embodiment 508, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 505-507, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0803] В типовом варианте осуществления 509 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–507, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0803] In exemplary embodiment 509, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 505-507, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0804] В типовом варианте осуществления 510 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–509, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.[0804] Exemplary embodiment 510 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 505-509, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide is located at the endogenous rodent FcεR1α locus.

[0805] В типовом варианте осуществления 511 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 510, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.[0805] Exemplary embodiment 511 herein provides a rodent ES cell of embodiment 510, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent FcεR1α gene.

[0806] В типовом варианте осуществления 512 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 511, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.[0806] In exemplary embodiment 512, provided herein is a rodent ES cell of embodiment 511, wherein the FcεR1α polypeptide comprises a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain.

[0807] В типовом варианте осуществления 513 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 505, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.[0807] Exemplary embodiment 513 herein provides a rodent ES cell of embodiment 505, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcεR1α replaces an endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcεR1α.

[0808] В типовом варианте осуществления 514 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–513, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.[0808] Exemplary embodiment 514 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 505-513, wherein the rodent does not express rodent FcεR1α.

[0809] В типовом варианте осуществления 515 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–514, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0809] Exemplary embodiment 515 herein provides a rodent ES cell according to any one of embodiments 505-514, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0810] В типовом варианте осуществления 516 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–514, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0810] In exemplary embodiment 516, provided herein is a rodent ES cell according to any one of embodiments 505-514, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0811] В типовом варианте осуществления 517 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–516, отличающаяся тем, что грызун представляет собой мышь.[0811] Exemplary embodiment 517 herein provides a rodent ES cell of any one of embodiments 304 to 516, wherein the rodent is a mouse.

[0812] В типовом варианте осуществления 518 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–516, отличающаяся тем, что грызун представляет собой крысу.[0812] Exemplary embodiment 518 herein provides a rodent ES cell as in any one of embodiments 304-516, wherein the rodent is a rat.

[0813] В типовом варианте осуществления 519 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0813] In exemplary embodiment 519, this document provides a method for creating a rodent that contains in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a V _H gene segment, a D _H gene segment, and gene segment _JH ; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, an IgG transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. IgG, wherein the method includes modifying the rodent genome so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a _VH gene segment, a _DH gene segment and a _JH gene segment; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human hinge region, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, an IgG transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. IgG, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region such that the rodent produces IgG antibodies comprising variable domains derived from a V _H gene segment, a _DH gene segment, and a J _H gene segment, and heavy chain constant domains , derived from a modified _CH gene segment.

[0814] В типовом варианте осуществления 520 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 519, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна.[0814] Exemplary embodiment 520 herein provides the method of embodiment 519, wherein the IgG transmembrane domain is a rodent IgG transmembrane domain.

[0815] В типовом варианте осуществления 521 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 519, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG человека.[0815] Exemplary Embodiment 521 herein provides the method of Embodiment 519, wherein the IgG transmembrane domain is a human IgG transmembrane domain.

[0816] В типовом варианте осуществления 522 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–521, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна.[0816] Exemplary embodiment 522 herein provides the method of any one of embodiments 519-521, wherein the IgG cytoplasmic domain is a rodent IgG cytoplasmic domain.

[0817] В типовом варианте осуществления 523 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–521, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG человека.[0817] Exemplary embodiment 523 herein provides the method of any one of embodiments 519-521, wherein the cytoplasmic domain of the IgG is a cytoplasmic domain of human IgG.

[0818] В типовом варианте осуществления 524 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–523, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG1.[0818] Exemplary embodiment 524 herein provides a method as in any one of embodiments 519-523, wherein the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are domains IgG1.

[0819] В типовом варианте осуществления 525 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 524, отличающийся тем, что домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05.[0819] Exemplary embodiment 525 herein provides the method of embodiment 524, wherein the IgG1 domain is encoded by an allele selected from IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04, and IGHG1*05.

[0820] В типовом варианте осуществления 526 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–523, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG2.[0820] Exemplary embodiment 526 herein provides the method of any one of embodiments 519-523, wherein the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are domains IgG2.

[0821] В типовом варианте осуществления 527 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 526, отличающийся тем, что домен IgG2 кодируется аллелем, выбранным из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06.[0821] Exemplary embodiment 527 herein provides the method of embodiment 526, wherein the IgG2 domain is encoded by an allele selected from IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05, and IGHG2 *06.

[0822] В типовом варианте осуществления 528 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–523, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG3.[0822] Exemplary embodiment 528 herein provides a method as in any one of embodiments 519-523, wherein the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are domains IgG3.

[0823] В типовом варианте осуществления 529 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 528, отличающийся тем, что домен IgG3 кодируется аллелем, выбранным из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19.[0823] Exemplary embodiment 529 herein provides the method of embodiment 528, wherein the IgG3 domain is encoded by an allele selected from IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3 *06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 and IGHG3*19.

[0824] В типовом варианте осуществления 530 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–523, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG4.[0824] Exemplary embodiment 530 herein provides the method of any one of embodiments 519-523, wherein the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain are domains IgG4.

[0825] В типовом варианте осуществления 531 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 530, отличающийся тем, что домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04.[0825] Exemplary embodiment 531 herein provides the method of embodiment 530, wherein the IgG4 domain is encoded by an allele selected from IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03, and IGHG4*04.

[0826] В типовом варианте осуществления 532 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 524–531, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a или C_γ2c.[0826] Exemplary embodiment 532 herein provides the method of any one of embodiments 524 to 531, wherein a _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain, and a C domain Human _H 3 is located at the locus of the endogenous gene segment C _γ2a or C _γ2c .

[0827] В типовом варианте осуществления 533 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 532, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2a или C_γ2c.[0827] Exemplary Embodiment 533 herein provides the method of Embodiment 532, wherein the C _H gene segment encoding the human C _H 1 domain, the human hinge region, the human C _H 2 domain, and the human C _H 3 domain replaces the endogenous gene segment C _γ2a or C _γ2c .

[0828] В типовом варианте осуществления 534 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 524–531, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1.[0828] Exemplary embodiment 534 herein provides the method of any one of embodiments 524-531, wherein the _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain, and a C domain Human _H 3, located in the locus of the endogenous gene segment C _γ1 .

[0829] В типовом варианте осуществления 535 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 534, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ1.[0829] Exemplary embodiment 535 herein provides the method of embodiment 534, wherein the _CH gene segment encoding the human _CH 1 domain, the human hinge region, the human _CH 2 domain, and the human _CH 3 domain replaces the endogenous gene segment C _γ1 .

[0830] В типовом варианте осуществления 536 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 524–531, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b.[0830] Exemplary embodiment 536 herein provides the method of any one of embodiments 524-531, wherein the _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain, and a C domain Human _H 3, located in the locus of the endogenous gene segment C _γ2b .

[0831] В типовом варианте осуществления 537 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 536, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2b.[0831] Exemplary embodiment 537 herein provides the method of embodiment 536, wherein the _CH gene segment encoding the human _CH 1 domain, the human hinge region, the human _CH 2 domain, and the human _CH 3 domain replaces the endogenous gene segment C _γ2b .

[0832] В типовом варианте осуществления 538 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 524–531, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ3.[0832] Exemplary embodiment 538 herein provides the method of any one of embodiments 524-531, wherein the _CH gene segment encoding a human _CH 1 domain, a human hinge region, a human _CH 2 domain, and a C domain Human _H 3 is located at the locus of the endogenous gene segment C _γ3 .

[0833] В типовом варианте осуществления 539 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 538, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ3.[0833] In exemplary embodiment 539, the method of embodiment 538 is provided herein, wherein the _CH gene segment encoding the human _CH 1 domain, the human hinge region, the human _CH 2 domain, and the human _CH 3 domain replaces the endogenous C _γ3 gene segment.

[0834] В типовом варианте осуществления 540 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–539, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_µ грызуна.[0834] Exemplary embodiment 540 herein provides the method of any one of embodiments 519-539, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cμ gene segment.

[0835] В типовом варианте осуществления 541 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–539, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_µ человека.[0835] Exemplary embodiment 541 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 539, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cμ gene segment.

[0836] В типовом варианте осуществления 542 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–541, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ грызуна.[0836] Exemplary embodiment 542 herein provides the method of any one of embodiments 519-541, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cδ gene segment.

[0837] В типовом варианте осуществления 543 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–541, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.[0837] Exemplary embodiment 543 herein provides the method of any one of embodiments 519-541, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cδ gene segment.

[0838] В типовом варианте осуществления 544 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–543, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 грызуна.[0838] Exemplary embodiment 544 herein provides the method of any one of embodiments 519-543, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cγ1 gene segment.

[0839] В типовом варианте осуществления 545 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–544, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна.[0839] Exemplary embodiment 545 herein provides the method of any one of embodiments 519-544, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent C _γ2a and/or C _γ2c gene segment.

[0840] В типовом варианте осуществления 546 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–545, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2b грызуна.[0840] Exemplary embodiment 546 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 545, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _γ2b C gene segment.

[0841] В типовом варианте осуществления 547 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-546, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 грызуна.[0841] Exemplary embodiment 547 herein provides the method of any one of embodiments 519-546, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent C _γ3 gene segment.

[0842] В типовом варианте осуществления 548 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-547, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε грызуна.[0842] Exemplary embodiment 548 herein provides the method of any one of embodiments 519-547, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cε gene segment.

[0843] В типовом варианте осуществления 549 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-548, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0843] In exemplary embodiment 549, the method of any one of embodiments 519-548 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0844] В типовом варианте осуществления 550 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–549, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α грызуна.[0844] Exemplary embodiment 550 herein provides the method of any one of embodiments 519-549, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a rodent _Cα gene segment.

[0845] В типовом варианте осуществления 551 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–549, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0845] Exemplary embodiment 551 herein provides the method of any one of embodiments 519-549, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0846] В типовом варианте осуществления 552 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–539, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.[0846] Exemplary embodiment 552 herein provides the method of any one of embodiments 519-539, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region comprises a human _Cμ gene segment, a human _Cδ gene segment, a human _Cγ3 gene segment, and human C _γ1 gene segment.

[0847] В типовом варианте осуществления 553 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 552, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.[0847] Exemplary Embodiment 553 herein provides the method of Embodiment 552, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment.

[0848] В типовом варианте осуществления 554 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 552 или варианту осуществления 553, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0848] In exemplary embodiment 554, the method of embodiment 552 or embodiment 553 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0849] В типовом варианте осуществления 555 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 552–554, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0849] Exemplary embodiment 555 herein provides the method of any one of embodiments 552 to 554, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0850] В типовом варианте осуществления 556 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgM, содержащий домен C_H1 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, домен C_H4 человека, трансмембранный домен IgM человека и цитоплазматический домен IgM человека, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgM, содержащий домен C_H1 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, домен C_H4 человека, трансмембранный домен IgM человека и цитоплазматический домен IgM человека, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgM, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.[0850] In exemplary embodiment 556, this document provides a method for creating a rodent that contains in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a V _H gene segment, a D _H gene segment, and gene segment _JH ; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgM constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, a human C _H 4 domain, and a human IgM transmembrane domain. and a human IgM cytoplasmic domain, the method comprising modifying the rodent genome to contain an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a V _H gene segment, a D _H gene segment, and a J gene segment _H ; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgM constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, a human C _H 4 domain, and a human IgM transmembrane domain. and a cytoplasmic domain of human IgM, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgM antibodies comprising variable domains derived from a V _H gene segment, a _DH gene segment, and a J _H gene segment, and heavy chain constant domains derived from the _CH gene segment.

[0851] В типовом варианте осуществления 557 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 556, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.[0851] In exemplary embodiment 557, the method of embodiment 556 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cδ gene segment.

[0852] В типовом варианте осуществления 558 в данном документе предложен способ по вариантам осуществления 556 или 557, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 человека.[0852] In exemplary embodiment 558, the method of embodiment 556 or 557 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _γ3 C gene segment.

[0853] В типовом варианте осуществления 559 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 556–558, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 человека.[0853] Exemplary embodiment 559 herein provides the method of any one of embodiments 556-558, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ1 gene segment.

[0854] В типовом варианте осуществления 560 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 556–559, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека.[0854] Exemplary embodiment 560 herein provides the method of any one of embodiments 556-559, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment.

[0855] В типовом варианте осуществления 561 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 556–560, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ4 человека.[0855] Exemplary embodiment 561 herein provides the method of any one of embodiments 556-560, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ4 gene segment.

[0856] В типовом варианте осуществления 562 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 556–561, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.[0856] Exemplary embodiment 562 herein provides the method of any one of embodiments 556-561, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region comprises a human _Cμ gene segment, a human _Cδ gene segment, a human _Cγ3 gene segment, and human C _γ1 gene segment.

[0857] В типовом варианте осуществления 563 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 562, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.[0857] Exemplary Embodiment 563 herein provides the method of Embodiment 562, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment.

[0858] В типовом варианте осуществления 564 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 562 или варианту осуществления 563, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0858] Exemplary embodiment 564 herein provides the method of embodiment 562 or embodiment 563, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0859] В типовом варианте осуществления 565 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 562–564, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0859] Exemplary embodiment 565 herein provides the method of any one of embodiments 562-564, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0860] В типовом варианте осуществления 566 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgD, содержащий домен C_H1 человека, шарнирный домен H1 человека, шарнирный домен H2 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgD человека и цитоплазматический домен IgD человека, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgD, содержащий домен C_H1 человека, шарнирный домен H1 человека, шарнирный домен H2 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgD человека и цитоплазматический домен IgD человека, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgD, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0860] In exemplary embodiment 566, this document provides a method of creating a rodent that contains in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a V _H gene segment, a D _H gene segment, and gene segment _JH ; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgD constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human H1 hinge domain, a human H2 hinge domain, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, a transmembrane domain of human IgD and a cytoplasmic domain of human IgD, wherein the method includes modifying the rodent genome so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a V _H gene segment, a D _H gene segment and the _JH gene segment; and (ii) an immunoglobulin heavy chain constant region comprising a C _H gene segment encoding an IgD constant domain comprising a human C _H 1 domain, a human H1 hinge domain, a human H2 hinge domain, a human C _H 2 domain, a human C _H 3 domain, a human IgD transmembrane domain and a human IgD cytoplasmic domain, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgD antibodies containing variable domains derived from the V _H gene segment, the D _{H gene segment, and the D H} gene segment _JH , and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0861] В типовом варианте осуществления 567 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 566, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_µ человека.[0861] In exemplary embodiment 567, the method of embodiment 566 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cμ gene segment.

[0862] В типовом варианте осуществления 568 в данном документе предложен способ по вариантам осуществления 566 или 567, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 человека.[0862] Exemplary embodiment 568 herein provides the method of embodiment 566 or 567, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _γ3 C gene segment.

[0863] В типовом варианте осуществления 569 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 566–568, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 человека.[0863] In exemplary embodiment 569, the method of any one of embodiments 566-568 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ1 gene segment.

[0864] В типовом варианте осуществления 570 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 566–569, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека.[0864] Exemplary embodiment 570 herein provides the method of any one of embodiments 566-569, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment.

[0865] В типовом варианте осуществления 571 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 566–570, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ4 человека.[0865] Exemplary embodiment 571 herein provides the method of any one of embodiments 566-570, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _γ4 C gene segment.

[0866] В типовом варианте осуществления 572 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 566–571, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.[0866] Exemplary embodiment 572 herein provides the method of any one of embodiments 566-571, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region comprises a human _Cμ gene segment, a human _Cδ gene segment, a human _Cγ3 gene segment, and human C _γ1 gene segment.

[0867] В типовом варианте осуществления 573 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 572, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.[0867] Exemplary Embodiment 573 herein provides the method of Embodiment 572, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment.

[0868] В типовом варианте осуществления 574 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 572 или варианту осуществления 573, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.[0868] Exemplary embodiment 574 herein provides the method of embodiment 572 or embodiment 573, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _α gene segment.

[0869] В типовом варианте осуществления 575 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 572–574, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.[0869] Exemplary embodiment 575 herein provides the method of any one of embodiments 572 to 574, wherein the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human _Cε gene segment.

[0870] В типовом варианте осуществления 576 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–575, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) грызуна.[0870] Exemplary embodiment 576 herein provides the method of any one of embodiments 519-575, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent intronic enhancer (E _i ).

[0871] В типовом варианте осуществления 577 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–575, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) человека.[0871] Exemplary embodiment 577 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 575, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human intronic enhancer (E _i ).

[0872] В типовом варианте осуществления 578 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–577, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3' регуляторную область (3' РО) грызуна.[0872] Exemplary embodiment 578 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 577, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent 3' regulatory region (3' RO).

[0873] В типовом варианте осуществления 579 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–577, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3' регуляторную область (3' РО) человека.[0873] In exemplary embodiment 579, the method provided herein is as in any one of embodiments 519-577, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human 3' regulatory region (3' RO).

[0874] В типовом варианте осуществления 580 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_µ грызуна.[0874] Exemplary embodiment 580 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 579, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sμ switch site.

[0875] В типовом варианте осуществления 581 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–580, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 грызуна.[0875] Exemplary embodiment 581 herein provides the method of any one of embodiments 519-580, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _γ3 switch site.

[0876] В типовом варианте осуществления 582 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–581, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 грызуна.[0876] Exemplary embodiment 582 herein provides the method of any one of embodiments 519-581, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sγ1 switch site.

[0877] В типовом варианте осуществления 583 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-582, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2b грызуна.[0877] Exemplary embodiment 583 herein provides the method of any one of embodiments 519-582, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _γ2b switch site.

[0878] В типовом варианте осуществления 584 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-583, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2a и/или S_γ2c грызуна.[0878] Exemplary embodiment 584 herein provides the method of any one of embodiments 519-583, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sγ2a and/or _Sγ2c switch site.

[0879] В типовом варианте осуществления 585 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-584, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε грызуна.[0879] Exemplary embodiment 585 herein provides the method of any one of embodiments 519-584, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent _Sε switch site.

[0880] В типовом варианте осуществления 586 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-585, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α грызуна.[0880] Exemplary embodiment 586 herein provides the method of any one of embodiments 519-585, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent S _α switch site.

[0881] В типовом варианте осуществления 587 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_µ человека.[0881] In exemplary embodiment 587, the method provided herein is as in any one of embodiments 519-579, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sμ switch site.

[0882] В типовом варианте осуществления 588 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 человека.[0882] Exemplary embodiment 588 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 579 and 587, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human S _γ3 switch site.

[0883] В типовом варианте осуществления 589 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587–588, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 человека.[0883] Exemplary embodiment 589 herein provides the method of any one of embodiments 519-579 and 587-588, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ1 switch site.

[0884] В типовом варианте осуществления 590 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587-589, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2 человека.[0884] Exemplary embodiment 590 herein provides the method of any one of embodiments 519-579 and 587-589, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ2 switch site.

[0885] В типовом варианте осуществления 591 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587-590, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ4 человека.[0885] Exemplary embodiment 591 herein provides the method of any one of embodiments 519-579 and 587-590, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sγ4 switch site.

[0886] В типовом варианте осуществления 592 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587–591, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε человека.[0886] Exemplary embodiment 592 herein provides the method of any one of embodiments 519-579 and 587-591, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human _Sε switch site.

[0887] В типовом варианте осуществления 593 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587–592, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α человека.[0887] Exemplary embodiment 593 herein provides the method of any one of embodiments 519-579 and 587-592, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus further comprises a human S _α switch site.

[0888] В типовом варианте осуществления 594 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–593, отличающийся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H грызуна, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H грызуна.[0888] Exemplary embodiment 594 herein provides the method of any one of embodiments 519-593, wherein the V _H gene segment is a rodent V _H gene segment, the D _H gene segment is a rodent D _H gene segment, and the J _H gene segment is a rodent J _H gene segment.

[0889] В типовом варианте осуществления 595 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 594, отличающийся тем, что генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты грызуна.[0889] Exemplary embodiment 595 herein provides the method of embodiment 594, wherein the rodent _VH gene segment, rodent _DH gene segment, and rodent _JH gene segment are endogenous rodent gene segments.

[0890] В типовом варианте осуществления 596 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–593, отличающийся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H человека, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H человека.[0890] Exemplary embodiment 596 herein provides the method of any one of embodiments 519-593, wherein the V _H gene segment is a human V _H gene segment, the D _H gene segment is a human D _H gene segment, and the J _H gene segment is a human J _H gene segment.

[0891] В типовом варианте осуществления 597 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 596, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере 3 генных сегмента V_H человека.[0891] In exemplary embodiment 597, herein provided is the method of embodiment 596, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region contains at least 3 human _VH gene segments.

[0892] В типовом варианте осуществления 598 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 596 или варианту осуществления 597, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты D_H человека.[0892] In exemplary embodiment 598, the method of embodiment 596 or embodiment 597 is provided herein, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region contains all human D _H gene segments.

[0893] В типовом варианте осуществления 599 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 596–598, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_H человека.[0893] Exemplary embodiment 599 herein provides the method of any one of embodiments 596-598, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region comprises all human _JH gene segments.

[0894] В типовом варианте осуществления 600 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 596–599, отличающийся тем, что в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна. [0894] Exemplary embodiment 600 herein provides the method of any one of embodiments 596-599, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region lacks a functional endogenous rodent Adam6 gene.

[0895] В типовом варианте осуществления 601 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 596–600, отличающийся тем, что геном зародышевой линии дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный полипептид Adam6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент.[0895] Exemplary embodiment 601 herein provides the method of any one of embodiments 596-600, wherein the germline genome further comprises a nucleotide sequence encoding a functional rodent Adam6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof.

[0896] В типовом варианте осуществления 602 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 601, отличающийся тем, что происходит экспрессия функционального полипептида Adam6 грызуна, его функционального ортолога, функционального гомолога или функционального фрагмента. [0896] Exemplary embodiment 602 herein provides the method of embodiment 601, characterized in that the functional rodent Adam6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof is expressed.

[0897] В типовом варианте осуществления 603 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 601 или варианту осуществления 602, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в той же хромосоме, что и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина.[0897] Exemplary embodiment 603 herein provides the method of embodiment 601 or embodiment 602, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is located on the same chromosome, same as the variable region of the immunoglobulin heavy chain.

[0898] В типовом варианте осуществления 604 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601–603, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в сконструированном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.[0898] Exemplary embodiment 604 herein provides the method of any one of embodiments 601 to 603, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof is located at an engineered heavy chain locus immunoglobulin.

[0899] В типовом варианте осуществления 605 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601-604, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится на месте псевдогена Adam6 человека.[0899] Exemplary embodiment 605 herein provides the method of any one of embodiments 601-604, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is located at the site of a human Adam6 pseudogene .

[0900] В типовом варианте осуществления 606 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601–605, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, замещает псевдоген Adam6 человека.[0900] Exemplary embodiment 606 herein provides the method of any one of embodiments 601-605, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homolog, or a functional fragment thereof replaces the human Adam6 pseudogene.

[0901] В типовом варианте осуществления 607 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601–606, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между первым генным сегментом V_H человека и вторым генным сегментом V_H человека.[0901] Exemplary embodiment 607 herein provides the method of any one of embodiments 601 to 606, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is located between the first gene segment V human _H and a second human V _H gene segment.

[0902] В типовом варианте осуществления 608 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 607, отличающийся тем, что первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1–2, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6–1.[0902] Exemplary embodiment 608 herein provides the method of embodiment 607, wherein the first human V _H gene segment is V _H 1-2 and the second human V _H gene segment is V _H 6-1 .

[0903] В типовом варианте осуществления 609 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601–604, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.[0903] Exemplary embodiment 609 herein provides the method of any one of embodiments 601-604, wherein the nucleotide sequence encoding a rodent ADAM6 polypeptide, a functional ortholog, a functional homologue, or a functional fragment thereof is located between a V _H gene segment human and the human D _H gene segment.

[0904] В типовом варианте осуществления 610 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–609, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.[0904] Exemplary embodiment 610 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 609, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus is located at an endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0905] В типовом варианте осуществления 611 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 610, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0905] Exemplary embodiment 611 herein provides the method of embodiment 610, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0906] В типовом варианте осуществления 612 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–611, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0906] Exemplary embodiment 612 herein provides the method of any one of embodiments 519-611, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0907] В типовом варианте осуществления 613 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–611, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0907] Exemplary embodiment 613 herein provides the method of any one of embodiments 519-611, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0908] В типовом варианте осуществления 614 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:[0908] Exemplary embodiment 614 herein provides a method of creating a rodent that contains in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing:

(a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.(a) rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of rodent IgG2a, and the cytoplasmic domain of rodent IgG2a; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a V _H gene segment human, human D _H gene segment and human J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of rodent IgG2a, and the cytoplasmic domain of rodent IgG2a; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, gene human _DH segment and human _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0909] В типовом варианте осуществления 615 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент VH человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент VH человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0909] Exemplary embodiment 615 herein provides a method of creating a rodent containing in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human VH gene segment, a human _DH gene segment and human _JH gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of human IgG1, and the cytoplasmic domain of human IgG1; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a human VH gene segment , human D _H gene segment and human J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of human IgG1, and the cytoplasmic domain of human IgG1; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, gene human _DH segment and human _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0910] В типовом варианте осуществления 616 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0910] Exemplary embodiment 616 herein provides a method of creating a rodent containing in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of rodent IgG1, and the cytoplasmic domain of rodent IgG1; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) rodent _Cγ2a and/or _Cγ2c gene segment; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a V _H gene segment human, human D _H gene segment and human J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of rodent IgG1, and the cytoplasmic domain of rodent IgG1; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) rodent _Cγ2a and/or _Cγ2c gene segment; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, gene human _DH segment and human _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0911] В типовом варианте осуществления 617 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.[0911] In exemplary embodiment 617, this document provides a method of creating a rodent containing in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of human IgG4, and the cytoplasmic domain of human IgG4; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) rodent _Cγ2a and/or _Cγ2c gene segment; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a V _H gene segment human, human D _H gene segment and human J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a rodent _Cμ gene segment; (b) rodent _Cδ gene segment; (c) rodent C _γ3 gene segment; (d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of human IgG4, and the cytoplasmic domain of human IgG4; (e) rodent C _γ2b gene segment; (f) rodent _Cγ2a and/or _Cγ2c gene segment; (g) rodent _Cε gene segment; and (h) a rodent _Cα gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, gene human _DH segment and human _JH gene segment, and heavy chain constant domains derived from a modified _CH gene segment.

[0912] В типовом варианте осуществления 618 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие полностью человеческую тяжелую цепь. [0912] Exemplary embodiment 618 herein provides a method of creating a rodent that contains in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a V _H gene segment human, human D _H gene segment and human J _H gene segment; (ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies comprising a fully human heavy chain.

[0913] В типовом варианте осуществления 619 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие полностью человеческую тяжелую цепь. [0913] Exemplary embodiment 619 herein provides a method of creating a rodent containing in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human V _H gene segment, a D _H gene segment human and human _JH gene segment; (ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; (c) human C _γ2 gene segment; (d) human _γ4 C gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a V _H gene segment human, human D _H gene segment and human J _H gene segment; (ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; (c) human C _γ2 gene segment; (d) human _γ4 C gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies comprising a fully human heavy chain.

[0914] В типовом варианте осуществления 620 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека. [0914] Exemplary embodiment 620 herein provides a method of creating a rodent containing in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a rodent V _H gene segment, a D _H gene segment rodent and rodent J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a V _H gene segment rodent, rodent D _H gene segment and rodent J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies comprising a heavy chain comprising the rodent variable domain and the human constant domain.

[0915] В типовом варианте осуществления 621 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.[0915] Exemplary embodiment 621 herein provides a method of creating a rodent containing in its genome: an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a rodent V _H gene segment, a D _H gene segment rodent and rodent J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; (c) human C _γ2 gene segment; (d) human _γ4 C gene segment; and (iv) a 3' regulatory region (3' RO) of a rodent, the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains an engineered immunoglobulin heavy chain locus that contains: (i) an immunoglobulin heavy chain variable region containing a V _H gene segment rodent, rodent D _H gene segment and rodent J _H gene segment; (ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) a human _Cμ gene segment; (b) human _Cδ gene segment; (c) human _γ3 C gene segment; (d) human _Cγ1 gene segment; (c) human C _γ2 gene segment; (d) human _γ4 C gene segment; and (iv) a rodent 3' regulatory region (3' RO), wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region so that the rodent produces IgG antibodies comprising a heavy chain comprising the rodent variable domain and the human constant domain.

[0916] В типовом варианте осуществления 622 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 614–621, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.[0916] Exemplary embodiment 622 herein provides the method of any one of embodiments 614-621, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus is located at an endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0917] В типовом варианте осуществления 623 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 622, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0917] Exemplary embodiment 623 herein provides the method of embodiment 622, wherein the engineered immunoglobulin heavy chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin heavy chain locus.

[0918] В типовом варианте осуществления 624 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 614–623, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0918] Exemplary embodiment 624 herein provides the method of any one of embodiments 614-623, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0919] В типовом варианте осуществления 625 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 614–623, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.[0919] Exemplary embodiment 625 herein provides the method of any one of embodiments 614-623, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin heavy chain locus.

[0920] В типовом варианте осуществления 626 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–625, дополнительно включающий модификацию генома грызуна так, чтобы он дополнительно содержал в геноме: сконструированный локус цепи каппа (κ) иммуноглобулина, который содержит: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_κ человека и генный сегмент J_κ человека; и (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_κ человека, причем вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_κ человека.[0920] Exemplary embodiment 626 herein provides the method of any one of embodiments 519-625, further comprising modifying the rodent genome to further contain in the genome: an engineered immunoglobulin kappa (κ) chain locus that contains: (1 ) an immunoglobulin κ chain variable region containing a human V _κ gene segment and a human J _κ gene segment; and (2) an immunoglobulin κ chain constant region comprising a human _κ C gene segment, wherein the immunoglobulin κ chain variable region is operably linked to the immunoglobulin κ constant region such that the rodent produces antibodies comprising light chain variable domains derived from the V _κ gene segment human and human _Jκ gene segment, and light chain constant domains derived from human _Cκ gene segment.

[0921] В типовом варианте осуществления 627 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 626, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) грызуна.[0921] Exemplary embodiment 627 herein provides the method of embodiment 626, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a rodent κ intronic enhancer (E _κi ).

[0922] В типовом варианте осуществления 628 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 626, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) человека.[0922] Exemplary embodiment 628 herein provides the method of embodiment 626, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a human κ intronic enhancer (E _κi ).

[0923] В типовом варианте осуществления 629 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–628, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер κ (E_κ3') грызуна.[0923] Exemplary embodiment 629 herein provides the method of any one of embodiments 626-628, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a rodent κ 3' enhancer (E _κ3' ).

[0924] В типовом варианте осуществления 630 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–628, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер κ (E_κ3') человека.[0924] Exemplary embodiment 630 herein provides the method of any one of embodiments 626-628, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus further comprises a human κ 3' enhancer (E _κ3' ).

[0925] В типовом варианте осуществления 631 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–630, отличающийся тем, что вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 6 генных сегментов V_κ человека.[0925] Exemplary embodiment 631 herein provides the method of any one of embodiments 626-630, wherein the immunoglobulin κ chain variable region contains at least 6 human V _κ gene segments.

[0926] В типовом варианте осуществления 632 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–631, отличающийся тем, что вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_κ человека.[0926] Exemplary embodiment 632 herein provides the method of any one of embodiments 626-631, wherein the immunoglobulin κ chain variable region contains all human J _κ gene segments.

[0927] В типовом варианте осуществления 633 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–632, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина.[0927] Exemplary embodiment 633 herein provides the method of any one of embodiments 626-632, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin κ chain locus.

[0928] В типовом варианте осуществления 634 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 633, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0928] In exemplary embodiment 634, the method of embodiment 633 is provided herein, wherein the engineered immunoglobulin κ chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin κ chain locus.

[0929] В типовом варианте осуществления 635 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–634, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0929] Exemplary embodiment 635 herein provides the method of any one of embodiments 626-634, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin κ chain locus.

[0930] В типовом варианте осуществления 636 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–634, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.[0930] Exemplary embodiment 636 herein provides the method of any one of embodiments 626-634, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin κ chain locus.

[0931] В типовом варианте осуществления 637 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–636, дополнительно содержащий в геноме: сконструированный локус цепи лямбда (λ) иммуноглобулина, который содержит: генный сегмент V_λ человека, генный сегмент J_λ человека и генный сегмент C_λ человека, причем генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом C_λ человека так, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_λ человека.[0931] Exemplary embodiment 637 herein provides the method of any one of embodiments 519-636, further comprising in the genome: an engineered immunoglobulin lambda (λ) chain locus that contains: a human V _λ gene segment, a human J _λ gene segment and a human _Cλ gene segment, wherein the human _Vλ gene segment and the human _Jλ gene segment are operably linked to the human _Cλ gene segment such that the rodent produces antibodies comprising light chain variable domains derived from the human _Vλ gene segment and the human Cλ gene segment Human _Jλ , and light chain constant domains derived from the human _Cλ gene segment.

[0932] В типовом варианте осуществления 638 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ1 человека.[0932] Exemplary embodiment 638 herein provides the method of embodiment 637, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ1 gene segment.

[0933] В типовом варианте осуществления 639 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 638, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ1 человека. [0933] In exemplary embodiment 639, the method of embodiment 638 is provided herein, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ1 gene segment.

[0934] В типовом варианте осуществления 640 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ2 человека.[0934] Exemplary embodiment 640 herein provides the method of embodiment 637, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ2 gene segment.

[0935] В типовом варианте осуществления 641 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 640, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ2 человека.[0935] Exemplary embodiment 641 herein provides the method of embodiment 640, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ2 gene segment.

[0936] В типовом варианте осуществления 642 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ3 человека.[0936] Exemplary embodiment 642 herein provides the method of embodiment 637, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ3 gene segment.

[0937] В типовом варианте осуществления 643 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 642, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ3 человека.[0937] Exemplary embodiment 643 herein provides the method of embodiment 642, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ3 gene segment.

[0938] В типовом варианте осуществления 644 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ6 человека.[0938] In exemplary embodiment 644, the method of embodiment 637 is provided herein, wherein the human _Cλ gene segment is a human _Cλ6 gene segment.

[0939] В типовом варианте осуществления 645 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 644, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ6 человека.[0939] Exemplary embodiment 645 herein provides the method of embodiment 644, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ6 gene segment.

[0940] В типовом варианте осуществления 646 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ7 человека.[0940] Exemplary embodiment 646 herein provides the method of embodiment 637, wherein the human _Jλ gene segment is a human _Jλ7 gene segment.

[0941] В типовом варианте осуществления 647 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–646, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент C_λ1 человека, генный сегмент C_λ2 человека, генный сегмент C_λ3 человека, генный сегмент C_λ6 человека и генный сегмент C_λ1 грызуна.[0941] Exemplary embodiment 647 herein provides the method of any one of embodiments 637-646, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus comprises a human C _λ1 gene segment, a human C _λ2 gene segment, a human C _λ3 gene segment, human C _λ6 gene segment and rodent C _λ1 gene segment.

[0942] В типовом варианте осуществления 648 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 647, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент J_λ1 человека, генный сегмент J_λ2 человека, генный сегмент J_λ3 человека, генный сегмент J_λ6 человека и генный сегмент J_λ7 человека.[0942] Exemplary embodiment 648 herein provides the method of embodiment 647, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus comprises a human J _λ1 gene segment, a human J _λ2 gene segment, a human J _λ3 gene segment, a J _λ6 gene segment human and human J _λ7 gene segment.

[0943] В типовом варианте осуществления 649 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 648, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ содержит кластер генных сегментов J_λ1 – C_λ1 человека, кластер генных сегментов J_λ2 – C_λ2 человека, кластер генных сегментов J_λ3 – C_λ3 человека, кластер генных сегментов J_λ6 – C_λ6 человека и кластер генных сегментов J_λ7 человека – C_λ1 грызуна.[0943] In exemplary embodiment 649, a rodent ES cell of embodiment 648 is provided herein, wherein the engineered λ chain locus contains a human J _λ1 - C _λ1 gene segment cluster, a human J _λ2 - C _λ2 gene segment cluster, human J _λ3 – C _λ3 gene segment cluster, human J _λ6 – C _λ6 gene segment cluster, and rodent J _λ7 gene segment cluster – C _{λ1 gene} segment.

[0944] В типовом варианте осуществления 650 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–649, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 7 генных сегментов V_λ человека.[0944] Exemplary embodiment 650 herein provides the method of any one of embodiments 637 to 649, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus contains at least 7 human V _λ gene segments.

[0945] В типовом варианте осуществления 651 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–650, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 2.4 λ грызуна.[0945] Exemplary embodiment 651 herein provides the method of any one of embodiments 637-650, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent 2.4 λ enhancer.

[0946] В типовом варианте осуществления 652 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–651, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер λ грызуна.[0946] Exemplary embodiment 652 herein provides the method of any one of embodiments 637 to 651, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent λ 3' enhancer.

[0947] В типовом варианте осуществления 653 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–652, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 3.1 λ грызуна.[0947] Exemplary embodiment 653 herein provides the method of any one of embodiments 637 to 652, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a rodent λ 3.1 enhancer.

[0948] В типовом варианте осуществления 654 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–653, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер λ человека.[0948] Exemplary embodiment 654 herein provides the method of any one of embodiments 637 to 653, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus further comprises a human λ 3' enhancer.

[0949] В типовом варианте осуществления 655 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–654, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина.[0949] Exemplary embodiment 655 herein provides the method of any one of embodiments 637 to 654, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin λ chain locus.

[0950] В типовом варианте осуществления 656 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 655, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0950] Exemplary embodiment 656 herein provides the method of embodiment 655, wherein the engineered immunoglobulin λ chain locus replaces all or a portion of the endogenous immunoglobulin λ chain locus.

[0951] В типовом варианте осуществления 657 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–656, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0951] Exemplary embodiment 657 herein provides the method of any one of embodiments 637 to 656, wherein the rodent is heterozygous for the engineered immunoglobulin λ chain locus.

[0952] В типовом варианте осуществления 658 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–656, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.[0952] Exemplary embodiment 658 herein provides the method of any one of embodiments 637 to 656, wherein the rodent is homozygous for the engineered immunoglobulin λ chain locus.

[0953] В типовом варианте осуществления 659 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–658, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.[0953] Exemplary embodiment 659 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 658, further comprising a genomically engineered neonatal Fc receptor (FcRn) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcRn polypeptide.

[0954] В типовом варианте осуществления 660 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 659, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0954] In exemplary embodiment 660, the method of embodiment 659 is provided herein, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0955] В типовом варианте осуществления 661 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 659, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0955] Exemplary embodiment 661 herein provides the method of embodiment 659 wherein the FcRn polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0956] В типовом варианте осуществления 662 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–661, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0956] Exemplary embodiment 662 herein provides the method of any one of embodiments 659-661, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0957] В типовом варианте осуществления 663 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–661, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0957] Exemplary embodiment 663 herein provides the method of any one of embodiments 659-661, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0958] В типовом варианте осуществления 664 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–663, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.[0958] Exemplary embodiment 664 herein provides the method of any one of embodiments 659-663, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcRn polypeptide is located at an endogenous rodent FcRn locus.

[0959] В типовом варианте осуществления 665 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 664, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.[0959] Exemplary embodiment 665 herein provides the method of embodiment 664, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent FcRn gene.

[0960] В типовом варианте осуществления 666 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 665, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.[0960] Exemplary embodiment 666 herein provides the method of embodiment 665, wherein the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of the FcRn replaces the endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of the rodent FcRn.

[0961] В типовом варианте осуществления 667 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–666, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.[0961] Exemplary embodiment 667 herein provides the method of any one of embodiments 659-666, wherein the rodent does not express the rodent FcRn.

[0962] В типовом варианте осуществления 668 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–667, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0962] Exemplary embodiment 668 herein provides the method of any one of embodiments 659-667, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcRn locus.

[0963] В типовом варианте осуществления 669 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–667, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[0963] Exemplary embodiment 669 herein provides the method of any one of embodiments 659 to 667, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcRn locus.

[0964] В типовом варианте осуществления 670 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–669, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).[0964] Exemplary embodiment 670 herein provides the method of any one of embodiments 659 to 669, further comprising a genomically engineered β-2-microglobulin (β2M) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β-2 polypeptide -microglobulin (β2M).

[0965] В типовом варианте осуществления 671 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 670, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.[0965] Exemplary embodiment 671 herein provides the method of embodiment 670, wherein the nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide is located at an endogenous rodent β2M locus.

[0966] В типовом варианте осуществления 672 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 671, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.[0966] Exemplary embodiment 672 herein provides the method of embodiment 671, wherein a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent β2M gene.

[0967] В типовом варианте осуществления 673 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 670–672, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2–4 гена β2M человека.[0967] Exemplary embodiment 673 herein provides the method of any one of embodiments 670-672, wherein the nucleic acid sequence comprises exons 2-4 of the human β2M gene.

[0968] В типовом варианте осуществления 674 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 670–673, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.[0968] Exemplary embodiment 674 herein provides the method of any one of embodiments 670-673, wherein the rodent does not express the rodent β2M polypeptide.

[0969] В типовом варианте осуществления 675 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 560–674, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0969] Exemplary embodiment 675 herein provides the method of any one of embodiments 560-674, wherein the rodent is heterozygous for the engineered β2M locus.

[0970] В типовом варианте осуществления 676 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 560–674, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[0970] Exemplary embodiment 676 herein provides the method of any one of embodiments 560-674, wherein the rodent is homozygous for the engineered β2M locus.

[0971] В типовом варианте осуществления 677 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–676, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.[0971] Exemplary embodiment 677 herein provides the method of any one of embodiments 519-676, further comprising a genomically engineered Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide containing an extracellular human domain.

[0972] В типовом варианте осуществления 678 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 677, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0972] In exemplary embodiment 678, the method of embodiment 677 is provided herein, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0973] В типовом варианте осуществления 679 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 677, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0973] In exemplary embodiment 679, the method of embodiment 677 is provided herein, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0974] В типовом варианте осуществления 680 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–679, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0974] Exemplary embodiment 680 herein provides the method of any one of embodiments 677-679, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0975] В типовом варианте осуществления 681 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–679, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0975] Exemplary embodiment 681 herein provides the method of any one of embodiments 677 to 679, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0976] В типовом варианте осуществления 682 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–681, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.[0976] Exemplary embodiment 682 herein provides the method of any one of embodiments 677-681, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide is located at an endogenous rodent FcεR1α locus.

[0977] В типовом варианте осуществления 683 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 682, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.[0977] Exemplary embodiment 683 herein provides the method of embodiment 682, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent FcεR1α gene.

[0978] В типовом варианте осуществления 684 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 683, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.[0978] Exemplary embodiment 684 herein provides the method of embodiment 683, wherein the FcεR1α polypeptide comprises a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain.

[0979] В типовом варианте осуществления 685 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 677, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.[0979] Exemplary embodiment 685 herein provides the method of embodiment 677, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcεR1α replaces an endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcεR1α.

[0980] В типовом варианте осуществления 686 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–685, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.[0980] Exemplary embodiment 686 herein provides the method of any one of embodiments 677 to 685, wherein the rodent does not express rodent FcεR1α.

[0981] В типовом варианте осуществления 687 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–686, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0981] Exemplary embodiment 687 herein provides the method of any one of embodiments 677 to 686, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0982] В типовом варианте осуществления 688 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–686, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[0982] Exemplary embodiment 688 herein provides the method of any one of embodiments 677 to 686, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcεR1α locus.

[0983] В типовом варианте осуществления 689 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–688, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 1a (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека.[0983] Exemplary embodiment 689 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 688, further comprising a genomically engineered Fc gamma receptor 1a (FcγR1a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide containing an extracellular domain person.

[0984] В типовом варианте осуществления 690 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 689, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[0984] In exemplary embodiment 690, the method of embodiment 689 is provided herein, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[0985] В типовом варианте осуществления 691 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 689, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[0985] In exemplary embodiment 691, the method of embodiment 689 is provided herein, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[0986] В типовом варианте осуществления 692 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–691, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[0986] Exemplary embodiment 692 herein provides the method of any one of embodiments 689-691, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[0987] В типовом варианте осуществления 693 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–691, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[0987] Exemplary embodiment 693 herein provides the method of any one of embodiments 689-691, wherein the FcγR1a polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[0988] В типовом варианте осуществления 694 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–693, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна.[0988] Exemplary embodiment 694 herein provides the method of any one of embodiments 689-693, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR1a polypeptide is located at an endogenous rodent FcγR1a locus.

[0989] В типовом варианте осуществления 695 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 694, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, замещает весь или часть эндогенного гена FcγR1a грызуна.[0989] Exemplary embodiment 695 herein provides the method of embodiment 694, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent FcγR1a gene.

[0990] В типовом варианте осуществления 696 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 689, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcγR1a человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcγR1a грызуна.[0990] Exemplary embodiment 696 herein provides the method of embodiment 689, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcγR1a replaces an endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcγR1a.

[0991] В типовом варианте осуществления 697 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–696, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcγR1a грызуна.[0991] Exemplary embodiment 697 herein provides the method of any one of embodiments 689-696, wherein the rodent does not express rodent FcγR1a.

[0992] В типовом варианте осуществления 698 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–697, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.[0992] Exemplary embodiment 698 herein provides the method of any one of embodiments 689-697, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR1a locus.

[0993] В типовом варианте осуществления 699 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689-697, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.[0993] Exemplary embodiment 699 herein provides the method of any one of embodiments 689-697, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR1a locus.

[0994] В типовом варианте осуществления 700 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–699, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2a человека.[0994] Exemplary embodiment 700 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 699, further comprising a genomically engineered Fc gamma receptor 2a (FcγR2a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2a polypeptide.

[0995] В типовом варианте осуществления 701 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 700, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0995] Exemplary embodiment 701 herein provides the method of embodiment 700, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2a polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus.

[0996] В типовом варианте осуществления 702 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 701, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0996] Exemplary embodiment 702 herein provides the method of embodiment 701, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR2a polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[0997] В типовом варианте осуществления 703 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 700–702, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.[0997] Exemplary embodiment 703 herein provides the method of any one of embodiments 700-702, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2a locus.

[0998] В типовом варианте осуществления 704 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 700–702, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.[0998] Exemplary embodiment 704 herein provides the method of any one of embodiments 700-702, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2a locus.

[0999] В типовом варианте осуществления 705 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–704, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2b человека.[0999] Exemplary embodiment 705 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 704, further comprising a genomically engineered Fc gamma receptor 2b (FcγR2b) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2b polypeptide.

[0100] В типовом варианте осуществления 706 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 705, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0100] Exemplary embodiment 706 herein provides the method of embodiment 705, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2b polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus.

[0101] В типовом варианте осуществления 707 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 706, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0101] Exemplary embodiment 707 herein provides the method of embodiment 706, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR2b polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[0102] В типовом варианте осуществления 708 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 705–707, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.[0102] Exemplary embodiment 708 herein provides the method of any one of embodiments 705-707, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2b locus.

[0103] В типовом варианте осуществления 709 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 705–707, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.[0103] Exemplary embodiment 709 herein provides the method of any one of embodiments 705-707, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2b locus.

[0104] В типовом варианте осуществления 710 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–709, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3a человека.[0104] Exemplary embodiment 710 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 709, further comprising a genomically engineered Fc gamma receptor 3a (FcγR3a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR3a polypeptide.

[0105] В типовом варианте осуществления 711 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 710, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[0105] Exemplary embodiment 711 herein provides the method of embodiment 710, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR3a polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus.

[0106] В типовом варианте осуществления 712 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 711, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[0106] Exemplary embodiment 712 herein provides the method of embodiment 711, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR3a polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[0107] В типовом варианте осуществления 713 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 710–712, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.[0107] Exemplary embodiment 713 herein provides the method of any one of embodiments 710-712, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR3a locus.

[0108] В типовом варианте осуществления 714 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 710–712, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.[0108] Exemplary embodiment 714 herein provides the method of any one of embodiments 710-712, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR3a locus.

[0109] В типовом варианте осуществления 715 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–714, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3b человека.[0109] Exemplary embodiment 715 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 714, further comprising a genomically engineered Fc gamma receptor 3b (FcγR3b) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR3b polypeptide.

[01010] В типовом варианте осуществления 716 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 715, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[01010] Exemplary embodiment 716 herein provides the method of embodiment 715, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR3b polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus.

[01011] В типовом варианте осуществления 717 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 716, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.[01011] Exemplary embodiment 717 herein provides the method of embodiment 716, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR3b polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[01012] В типовом варианте осуществления 718 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 715–717, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.[01012] Exemplary embodiment 718 herein provides the method of any one of embodiments 715-717, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR3b locus.

[01013] В типовом варианте осуществления 719 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 715–717, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.[01013] Exemplary embodiment 719 herein provides the method of any one of embodiments 715 to 717, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR3b locus.

[01014] В типовом варианте осуществления 720 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–719, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2c человека.[01014] Exemplary embodiment 720 herein provides the method of any one of embodiments 519 to 719, further comprising a genomically engineered Fc gamma receptor 2c (FcγR2c) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2c polypeptide.

[01015] В типовом варианте осуществления 721 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 720, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.[01015] Exemplary embodiment 721 herein provides the method of embodiment 720, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2c polypeptide is located at an endogenous rodent low-affinity FcγR locus.

[01016] В типовом варианте осуществления 722 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 721, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна. [01016] Exemplary embodiment 722 herein provides the method of embodiment 721, wherein the nucleic acid sequence encoding a human FcγR2c polypeptide replaces all or a portion of an endogenous low-affinity rodent FcγR gene.

[01017] В типовом варианте осуществления 723 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 720–722, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcγR2c грызуна.[01017] In exemplary embodiment 723, the method provided herein is as in any one of embodiments 720-722, wherein the rodent does not express rodent FcγR2c.

[01018] В типовом варианте осуществления 724 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 720–723, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.[01018] Exemplary embodiment 724 herein provides the method of any one of embodiments 720-723, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcγR2c locus.

[01019] В типовом варианте осуществления 725 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 720–723, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.[01019] Exemplary embodiment 725 herein provides the method of any one of embodiments 720-723, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcγR2c locus.

[01020] В типовом варианте осуществления 726 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека,.[01020] Exemplary embodiment 726 herein provides a method of creating a rodent containing in its genome an engineered neonatal Fc receptor (FcRn) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcRn polypeptide, the method comprising modifying the genome of the rodent so that it contains a neonatal Fc receptor (FcRn) locus containing a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcRn polypeptide.

[01021] В типовом варианте осуществления 727 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 726, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[01021] In exemplary embodiment 727, the method provided herein is according to embodiment 726, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[01022] В типовом варианте осуществления 728 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 726, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[01022] In exemplary embodiment 728, the method of embodiment 726 is provided herein, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[01023] В типовом варианте осуществления 729 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–728, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[01023] In exemplary embodiment 729, the method of any one of embodiments 726-728 is provided herein, wherein the FcRn polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[01024] В типовом варианте осуществления 730 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–728, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[01024] Exemplary embodiment 730 herein provides the method of any one of embodiments 726-728, wherein the FcRn polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[01025] В типовом варианте осуществления 731 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–730, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.[01025] Exemplary embodiment 731 herein provides the method of any one of embodiments 726-730, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcRn polypeptide is located at an endogenous rodent FcRn locus.

[01026] В типовом варианте осуществления 732 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 731, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.[01026] Exemplary embodiment 732 herein provides the method of embodiment 731, wherein the nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent FcRn gene.

[01027] В типовом варианте осуществления 733 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 732, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.[01027] Exemplary embodiment 733 herein provides the method of embodiment 732, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of a human FcRn replaces an endogenous nucleic acid sequence encoding an extracellular domain of a rodent FcRn.

[01028] В типовом варианте осуществления 734 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–733, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.[01028] In exemplary embodiment 734, the method provided herein is as in any one of embodiments 726-733, wherein the rodent does not express the rodent FcRn.

[01029] В типовом варианте осуществления 735 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–734, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[01029] Exemplary embodiment 735 herein provides the method of any one of embodiments 726-734, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcRn locus.

[01030] В типовом варианте осуществления 736 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–734, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.[01030] Exemplary embodiment 736 herein provides the method of any one of embodiments 726-734, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcRn locus.

[01031] В типовом варианте осуществления 737 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–736, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).[01031] Exemplary embodiment 737 herein provides the method of any one of embodiments 726 to 736, further comprising a genomically engineered β-2 microglobulin (β2M) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β-2 polypeptide -microglobulin (β2M).

[01032] В типовом варианте осуществления 738 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 737, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.[01032] In exemplary embodiment 738, the method of embodiment 737 is provided herein, wherein the nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide is located at an endogenous rodent β2M locus.

[01033] В типовом варианте осуществления 739 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 738, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.[01033] In exemplary embodiment 739, the method of embodiment 738 is provided herein, wherein a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide replaces all or a portion of an endogenous rodent β2M gene.

[01034] В типовом варианте осуществления 740 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 737–739, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2–4 гена β2M человека.[01034] In exemplary embodiment 740, the method provided herein is as in any one of embodiments 737-739, wherein the nucleic acid sequence comprises exons 2-4 of the human β2M gene.

[01035] В типовом варианте осуществления 741 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 737–740, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.[01035] Exemplary embodiment 741 herein provides the method of any one of embodiments 737-740, wherein the rodent does not express the rodent β2M polypeptide.

[01036] В типовом варианте осуществления 742 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 737–741, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[01036] Exemplary embodiment 742 herein provides the method of any one of embodiments 737-741, wherein the rodent is heterozygous for the engineered β2M locus.

[01037] В типовом варианте осуществления 743 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 737–741, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.[01037] Exemplary embodiment 743 herein provides the method of any one of embodiments 737-741, wherein the rodent is homozygous for the engineered β2M locus.

[01038] В типовом варианте осуществления 744 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус FcεR1α, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека,.[01038] In an exemplary embodiment 744, this document provides a method for generating a rodent containing in its genome an engineered Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcεR1α polypeptide, the method comprising modifying the rodent genome so that it contains an engineered FcεR1α locus containing a nucleic acid sequence encoding a human extracellular domain-containing FcεR1α polypeptide.

[01039] В типовом варианте осуществления 745 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 744, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.[01039] In exemplary embodiment 745, the method of embodiment 744 is provided herein, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent transmembrane domain.

[01040] В типовом варианте осуществления 746 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 744, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.[01040] In exemplary embodiment 746, the method of embodiment 744 is provided herein, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human transmembrane domain.

[01041] В типовом варианте осуществления 747 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–746, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.[01041] In exemplary embodiment 747, the method provided herein is as in any one of embodiments 744-746, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a rodent cytoplasmic domain.

[01042] В типовом варианте осуществления 748 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–746, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.[01042] In exemplary embodiment 748, the method provided herein is as in any one of embodiments 744-746, wherein the FcεR1α polypeptide further comprises a human cytoplasmic domain.

[01043] В типовом варианте осуществления 749 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–748, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcγR1 грызуна.[01043] In exemplary embodiment 749, the method provided herein is as in any one of embodiments 744-748, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide is located at the endogenous rodent FcγR1 locus.

[01044] В типовом варианте осуществления 750 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 749, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.[01044] Exemplary embodiment 750 herein provides the method of embodiment 749, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcεR1α polypeptide replaces all or a portion of the endogenous rodent FcεR1α gene.

[01045] В типовом варианте осуществления 751 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 750, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.[01045] Exemplary embodiment 751 herein provides the method of embodiment 750, wherein the FcεR1α polypeptide comprises a human extracellular domain, a human transmembrane domain, and a human cytoplasmic domain.

[01046] В типовом варианте осуществления 752 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 744, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.[01046] Exemplary embodiment 752 herein provides the method of embodiment 744, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of human FcεR1α replaces an endogenous nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of rodent FcεR1α.

[01047] В типовом варианте осуществления 753 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–752, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.[01047] In exemplary embodiment 753, the method provided herein is as in any one of embodiments 744-752, wherein the rodent does not express rodent FcεR1α.

[01048] В типовом варианте осуществления 754 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–753, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[01048] Exemplary embodiment 754 herein provides the method of any one of embodiments 744-753, wherein the rodent is heterozygous for the engineered FcεR1α locus.

[01049] В типовом варианте осуществления 755 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–753, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.[01049] Exemplary embodiment 755 herein provides the method of any one of embodiments 744-753, wherein the rodent is homozygous for the engineered FcεR1α locus.

[01050] В типовом варианте осуществления 756 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–755, отличающийся тем, что грызун представляет собой мышь.[01050] In exemplary embodiment 756, the method provided herein is as in any one of embodiments 519-755, wherein the rodent is a mouse.

[01051] В типовом варианте осуществления 757 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–755, отличающийся тем, что грызун представляет собой крысу.[01051] In exemplary embodiment 757, the method provided herein is as in any one of embodiments 519-755, wherein the rodent is a rat.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1: Генетическое конструирование мышей, содержащих гуманизированные константные области иммуноглобулинаExample 1: Genetic Engineering of Mice Containing Humanized Immunoglobulin Constant Regions

[01052] Данный пример иллюстрирует типовые способы конструирования ряда нацеленных векторов для вставки в геном отличного от человека животного, такого как грызун (например, мышь). Описанные в данном примере способы демонстрируют получение отличных от человека животных, чьи геномы содержат сконструированную константную область тяжелой цепи иммуноглобулина и/или сконструированную константную область легкой цепи (каппа или лямбда). В частности, данный пример демонстрирует конструкцию нацеленных векторов для конструирования константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы отличные от человека животные экспрессировали и/или вырабатывали антитела, которые содержат тяжелые цепи иммуноглобулина, имеющие вариабельные домены человека и константные домены, которые являются человеческими, полностью или частично (например, содержат часть, принадлежащую человеку, и часть, принадлежащую грызуну). Также он демонстрирует конструкцию нацеленных векторов для конструирования константных областей легкой цепи иммуноглобулина так, чтобы отличные от человека животные экспрессировали и/или вырабатывали антитела, которые содержат легкие цепи иммуноглобулина, имеющие вариабельные домены человека и константные домены, которые являются человеческими, полностью или частично (например, содержат часть, принадлежащую человеку, и часть, принадлежащую грызуну). Кроме того, предполагается, что такие антитела образуют функциональные B-клеточные рецепторы на поверхности B-клеток в организме отличного от человека животного. Схематическое обобщение различных линий грызунов, содержащих выбранные сконструированные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, приведено на Фиг. 1A, а содержащих выбранные сконструированные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, приведено на Фиг. 2A. Для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных V(D)J смотрите на imgt.org; в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001); Lefranc, M.-P. и Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001); патентах США №№ 8642835 и 8697940; или Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152, которые все в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.[01052] This example illustrates exemplary methods for constructing a number of targeting vectors for insertion into the genome of a non-human animal, such as a rodent (eg, a mouse). The methods described in this example demonstrate the production of non-human animals whose genomes contain an engineered immunoglobulin heavy chain constant region and/or an engineered light chain constant region (kappa or lambda). In particular, this example demonstrates the construction of targeting vectors for constructing immunoglobulin heavy chain constant regions so that non-human animals express and/or produce antibodies that contain immunoglobulin heavy chains having human variable domains and constant domains that are fully or completely human. partially (for example, contain a human part and a rodent part). It also demonstrates the construction of targeting vectors for constructing immunoglobulin light chain constant regions so that non-human animals express and/or produce antibodies that contain immunoglobulin light chains having human variable domains and constant domains that are human, in whole or in part (eg , contain a human part and a rodent part). In addition, such antibodies are expected to form functional B cell receptors on the surface of B cells in a non-human animal. A schematic summary of the various rodent strains containing selected engineered immunoglobulin heavy chain constant regions is shown in FIG. 1A and containing selected engineered immunoglobulin heavy chain constant regions are shown in FIG. 2A. For simplicity, human _VH gene segments are not shown; only a small number of gene segments are represented schematically; For a complete repertoire of possible gene V(D)Js present, see imgt.org; in Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001); Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 pages (2001); US Patent Nos. 8642835 and 8697940; or Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111(14):5147-5152, all of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[01053] ДНК-конструкции и нацеленные векторы, содержащие последовательности, кодирующие константную область иммуноглобулина человека, для вставки в выбранные константные области иммуноглобулина грызунов, создавали из человеческих и мышиных бактериальных искусственных хромосом (BAC, англ. «bacterial artificial chromosome»), используя технологию VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9; включенные в данный документ посредством ссылки) и методики молекулярной биологии, известные в данной области техники. Способы, описанные в данном примере можно использовать для применения любой кодирующей последовательности константной области иммуноглобулина человека или комбинации кодирующих последовательностей (или фрагментов последовательностей) при необходимости.[01053] DNA constructs and targeting vectors containing human immunoglobulin constant region coding sequences for insertion into selected rodent immunoglobulin constant regions were generated from human and murine bacterial artificial chromosomes (BAC) using bacterial artificial chromosome technology VELOCIGENE® (see, for example, US Pat. No. 6,586,251 and Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9; incorporated herein by reference) and molecular biology techniques known in the art. The methods described in this example can be used to use any human immunoglobulin constant region coding sequence or combination of coding sequences (or sequence fragments) as desired.

[01054] Нацеленную ДНК BAC использовали для электропорации мышиных ЭС-клеток для создания модифицированных ЭС-клеток для создания мышей, которые экспрессируют последовательности, кодирующие человеческую или химерную мышиную/человеческую константную область иммуноглобулина, как проиллюстрировано на Фиг. 1A и 2A. ЭС-клетки, содержащие соответствующие модификации, идентифицировали с помощью количественного анализа TAQMAN™ (смотрите, например, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, включенную в данный документ посредством ссылки). Разрабатывали специальные наборы праймеров и зонды для обнаружения вставки человеческих последовательностей (приобретение аллели, ПА) и удаления мышиных последовательностей (утрата аллели, УА).[01054] Targeted BAC DNA was used to electroporate murine ES cells to create modified ES cells to create mice that express human or chimeric mouse/human immunoglobulin constant region coding sequences, as illustrated in FIG. 1A and 2A. ES cells containing the appropriate modifications were identified using the TAQMAN™ quantitative assay (see, for example, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, incorporated herein by reference). Special primer sets and probes were designed to detect insertion of human sequences (gain of allele, PA) and deletion of mouse sequences (loss of allele, LA).

[01055] Целевые ЭС-клетки использовали в качестве донорских ЭС-клеток и вносили в мышиный эмбрион на 8-клеточной стадии методом VELOCIMOUSE® (смотрите, например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). Мышей VELOCIMICE® (мышей F0, полностью полученных из донорских ЭС-клеток), независимо несущих модифицированную аллель, идентифицировали с помощью генотипирования, используя анализ модификации аллели, который позволяет обнаруживать наличие уникальных генных последовательностей, например, человеческих генных последовательностей. Отобранных гетерозиготных мышей, несущих модифицированную аллель, скрещивали до гомозиготности.[01055] The target ES cells were used as donor ES cells and introduced into the 8-cell stage mouse embryo using the VELOCIMOUSE® method (see, for example, US Patent No. 7294754 and Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyzes Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® mice (F0 mice derived entirely from donor ES cells) independently carrying the modified allele were identified by genotyping using an allele modification assay, which detects the presence of unique gene sequences, such as human gene sequences. Selected heterozygous mice carrying the modified allele were crossed to homozygosity.

Пример 1.1: Генетическое конструирование мышей, содержащих человеческие вариабельные области тяжелой цепи и химерные или полностью человеческие константные области тяжелой цепиExample 1.1: Genetic Engineering of Mice Containing Human Heavy Chain Variable Regions and Chimeric or Fully Human Heavy Chain Constant Regions

[01056] Для создания грызунов, которых можно использовать для тестирования человеческих антител (например, для исследований фармакокинетики и доз терапевтических антител), применяли несколько подходов. В первом подходе создавали мышей, которые содержали человеческие вариабельные области тяжелой цепи и константные области тяжелой цепи, которые содержали химерные (последовательности, кодирующие C_H1-H-C_H2-C_H3 человека, и последовательности, кодирующие M1-M2 мыши) или полностью человеческие (последовательности, кодирующие C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2) генные сегменты константных областей тяжелой цепи. Таких мышей можно использовать, например, для тестирования терапевтических антител, совпадающих по изотипу с константным доменом иммуноглобулина (т. е. частью C_H1-H-C_H2-C_H3 константного домена), который кодируется модифицированным генным сегментом (например, тестирования антител IgG1 на мышах, содержащих генетически сконструированную константную область IgG1).[01056] Several approaches have been used to generate rodents that can be used to test human antibodies (eg, pharmacokinetics and dosage studies of therapeutic antibodies). In the first approach, mice were created that contained human heavy chain variable regions and heavy chain constant regions that contained chimeric (sequences encoding human C _H 1-HC _H 2-C _H 3 and sequences encoding mouse M1-M2) or completely human (sequences encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2) heavy chain constant region gene segments. Such mice can be used, for example, to test therapeutic antibodies that are isotype-matched to the immunoglobulin constant domain (i.e., part of the C _H 1-HC _H 2-C _H 3 constant domain) that is encoded by a modified gene segment (for example, antibody testing IgG1 in mice containing a genetically engineered IgG1 constant region).

[01057] В одном примере создавали мышей, которые содержали последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи и химерную последовательность константной области (C_H1-H-C_H2-C_H3 человека) человека – (M1-M2 мыши) мыши, причем кодирующая C_H1-H-C_H2-C_H3 последовательность IgG1 человека была функционально связана с кодирующей M1-M2 последовательностью IgG2a мыши в эндогенном локусе IgG2a (Фиг. 1A, мышиный локус 1). Вкратце, конструировали плазмиду, используя фрагмент ДНК, который содержал синтетический ген C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека от Blue Heron и фланкировался областями, перекрывающимися с геном константной области IgG2a мыши. Полученную в результате плазмиду клонировали посредством нескольких этапов расщепления/лигирования/изотермической сборки CRIPSR-Cas9 для создания BAC-клона так, чтобы последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека была функционально связана с последовательностями, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены (т. е. экзонами M1 и M2) гена константной области IgG2a мыши. BAC-клон также содержал область переключения IgG2a мыши (Sγ2a) и область переключения IgE мыши (Sε), а также генный сегмент константной области IgE мыши. Этот клон посредством электропорации вносили в мышиные ЭС-клетки для создания модифицированных ЭС-клеток, которые можно было использовать для создания мышей, содержащих локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, локус 1, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточную часть константного домена IgG1 человека, функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей соединительную, трансмембранную и цитоплазматическую части константного домена IgG2a мыши в эндогенном локусе IgG2a мыши. Оставшиеся изотипические последовательности константной области тяжелой цепи были полностью мышиными. Мышиные ЭС-клетки, используемые для электропорации, содержали вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека (вариабельные генные сегменты V_H, D и J_H человека), функционально связанные с константной областью тяжелой цепи мыши, включая вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6; смотрите, например, патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки.[01057] In one example, mice were generated that contained human heavy chain variable region sequences and a chimeric human (CH ₁ -HC _H 2-C _H 3)-(mouse) (mouse) (M1-M2) constant region sequence, wherein encoding C _H The 1-HC _H 2-C _H 3 sequence of human IgG1 was operably linked to the M1-M2 coding sequence of mouse IgG2a at the endogenous IgG2a locus (Fig. 1A, mouse locus 1). Briefly, a plasmid was constructed using a DNA fragment that contained the synthetic human IgG1 C _H 1-HC _H 2-C _H 3 gene from Blue Heron and was flanked by regions overlapping with the mouse IgG2a constant region gene. The resulting plasmid was cloned through multiple CRIPSR-Cas9 cleavage/ligation/isothermal assembly steps to create a BAC clone so that the human IgG1 C _H 1-HC _H 2-C _H 3 sequence was operably linked to the sequences encoding the transmembrane and cytoplasmic domains (i.e. exons M1 and M2) of the mouse IgG2a constant region gene. The BAC clone also contained a mouse IgG2a switch region (Sγ2a) and a mouse IgE switch region (Sε), as well as a mouse IgE constant region gene segment. This clone was introduced into mouse ES cells by electroporation to create modified ES cells that could be used to create mice containing the immunoglobulin locus illustrated in FIG. 1A, locus 1, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular portion of the human IgG1 constant domain is operably linked to a nucleic acid sequence encoding the junctional, transmembrane, and cytoplasmic portions of the mouse IgG2a constant domain at the endogenous mouse IgG2a locus. The remaining heavy chain constant region isotype sequences were entirely murine. The murine ES cells used for electroporation contained human heavy chain variable gene segments (human _VH , D, and _JH variable gene segments) operably linked to the mouse heavy chain constant region, including an inserted sequence encoding mouse Adam6; see, for example, US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, incorporated herein by reference.

[01058] В другом примере создавали мышей, которые содержали последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи и полностью человеческую последовательность константной области IgG1 (C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 человека) в эндогенном локусе IgG2a мыши (Фиг. 1A, мышиный локус 2). Вкратце, человеческие последовательности M1-M2 амплифицировали, используя BAC-клон RP11-448n5 (Thermo Fisher Scientific) в качестве матрицы, и за несколько этапов генетического конструирования вносили в BAC-клон, используемый для создания мышиного локуса 1, описанного выше, вместо эндогенной последовательности M1-M2 IgG2a мыши. Полученный в результате BAC-клон для использования при внесении в ЭС-клетки содержал фрагмент ДНК, который содержал последовательности, кодирующие C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, области переключения IgG2a (Sγ2a) и IgE (Sε) мыши и генный сегмент константной области IgE мыши. Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, локус 2, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая константный домен IgG1 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенный константный домен IgG2a мыши в локусе эндогенного генного сегмента IgG2a мыши. Оставшиеся изотипические последовательности константной области тяжелой цепи были полностью мышиными. Мышиные ЭС-клетки, используемые в данном случае, содержали вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека (вариабельные генные сегменты V_H, D и J_H человека), функционально связанные с константной областью тяжелой цепи мыши, включая вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6; смотрите, например, патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки. [01058] In another example, mice were generated that contained human heavy chain variable region sequences and fully human IgG1 constant region sequences (human C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2) at the endogenous mouse IgG2a locus (FIG. 1A, mouse locus 2). Briefly, human M1-M2 sequences were amplified using BAC clone RP11-448n5 (Thermo Fisher Scientific) as a template and, through several genetic engineering steps, introduced into the BAC clone used to create the mouse locus 1 described above, in place of the endogenous sequence M1-M2 mouse IgG2a. The resulting BAC clone for use in ES cells contained a DNA fragment that contained sequences encoding CH ₁ -HC _H 2-C _H 3-M1-M2 human IgG1, IgG2a (Sγ2a) and IgE switch regions ( Sε) mouse and mouse IgE constant region gene segment. Mice generated from genetically modified ES cells contained the immunoglobulin locus illustrated in FIG. 1A, locus 2, wherein the nucleic acid sequence encoding the human IgG1 constant domain replaced the nucleic acid sequence encoding the endogenous mouse IgG2a constant domain at the endogenous mouse IgG2a gene segment locus. The remaining heavy chain constant region isotype sequences were entirely murine. The murine ES cells used herein contained human heavy chain variable gene segments (human _VH , D, and _JH variable gene segments) operably linked to the mouse heavy chain constant region, including an inserted sequence encoding murine Adam6; see, for example, US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, incorporated herein by reference.

[01059] В другом примере создавали мышей, которые содержали последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи и химерную последовательность константной области (C_H1-H-C_H2-C_H3 человека) человека – (M1-M2 мыши) мыши, причем кодирующая C_H1-H-C_H2-C_H3 последовательность IgG4 человека была функционально связана с кодирующей M1-M2 последовательностью IgG1 мыши в эндогенном локусе IgG1 (Фиг. 1A, мышиный локус 3). Вкратце, используя BAC CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) в качестве матрицы, конструировали плазмиду, которая содержала фрагмент ДНК, кодирующий C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, фланкируемый областями, перекрывающимися с геном константной области IgG1 мыши. Полученную в результате плазмиду клонировали посредством нескольких этапов расщепления/лигирования/изотермической сборки CRIPSR-Cas9 в BMQ-263J18 (The Sanger Centre) для создания BAC-клона так, чтобы последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека была функционально связана с последовательностями, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены (т. е. экзонами M1 и M2) гена константной области IgG1 мыши. Этот BAC-клон также содержал область переключения IgG1 (Sγ1) мыши и генный сегмент константной области IgG2b мыши. Этот клон посредством электропорации вносили в мышиные ЭС-клетки для создания модифицированных ЭС-клеток для создания мышей, содержащих локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, локус 3, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточную часть константного домена IgG4 человека, функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей трансмембранную часть константного домена IgG1 мыши в локусе эндогенного генного сегмента IgG1 мыши. Оставшиеся изотипические последовательности константной области тяжелой цепи были полностью мышиными. Мышиные ЭС-клетки, используемые для электропорации, содержали вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека (вариабельные генные сегменты V_H, D и J_H человека), функционально связанные с константной областью тяжелой цепи мыши, включая вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6; смотрите, например, патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки. [01059] In another example, mice were generated that contained human heavy chain variable region sequences and a chimeric human (CH ₁ -HC _H 2-C _H 3)-human (mouse) (M1-M2) constant region sequence, wherein encoding C _H The 1-HC _H 2-C _H 3 sequence of human IgG4 was operably linked to the M1-M2 coding sequence of mouse IgG1 at the endogenous IgG1 locus (Fig. 1A, mouse locus 3). Briefly, using BAC CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) as a template, a plasmid was constructed that contained a DNA fragment encoding human IgG4 CH ₁ -HC _H 2-C _H 3 flanked by regions overlapping with the mouse IgG1 constant region gene. The resulting plasmid was cloned through multiple CRIPSR-Cas9 cleavage/ligation/isothermal assembly steps into BMQ-263J18 (The Sanger Center) to generate a BAC clone so that the human IgG4 C _H 1-HC _H 2-C _H 3 sequence was functional is associated with sequences encoding the transmembrane and cytoplasmic domains (i.e., exons M1 and M2) of the mouse IgG1 constant region gene. This BAC clone also contained the mouse IgG1 (Sγ1) switch region and the mouse IgG2b constant region gene segment. This clone was introduced into mouse ES cells by electroporation to create modified ES cells to create mice containing the immunoglobulin locus illustrated in FIG. 1A, locus 3, wherein a nucleic acid sequence encoding the extracellular portion of the human IgG4 constant domain is operably linked to a nucleic acid sequence encoding the transmembrane portion of the mouse IgG1 constant domain at a mouse endogenous IgG1 gene segment locus. The remaining heavy chain constant region isotype sequences were entirely murine. The murine ES cells used for electroporation contained human heavy chain variable gene segments (human _VH , D, and _JH variable gene segments) operably linked to the mouse heavy chain constant region, including an inserted sequence encoding mouse Adam6; see, for example, US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, incorporated herein by reference.

[01060] В другом примере создавали мышей, которые содержали последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи и полностью человеческую последовательность константной области IgG4 (C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 человека) в эндогенном локусе IgG1 мыши (Фиг. 1A, мышиный локус 4). Вкратце, человеческие последовательности C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 амплифицировали, используя BAC-клон CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) в качестве матрицы, и за несколько этапов генетического конструирования вносили в BAC-клон BMQ-263J18 (The Sanger Centre) вместо эндогенной последовательности C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 мыши. Полученный в результате BAC-клон для использования при внесении в ЭС-клетки содержал фрагмент ДНК, который содержал последовательности, кодирующие C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, и область переключения IgG1 (Sγ1) мыши и генный сегмент константной области IgG2b мыши. Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, 4, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая константный домен IgG4 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенный константный домен IgG1 мыши в локусе эндогенного генного сегмента IgG1 мыши. Оставшиеся изотипические последовательности константной области тяжелой цепи были полностью мышиными. Мышиные ЭС-клетки, используемые для электропорации, содержали вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека (вариабельные генные сегменты V_H, D и J_H человека), функционально связанные с константной областью тяжелой цепи мыши, включая вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6; смотрите, например, патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки.[01060] In another example, mice were generated that contained human heavy chain variable region sequences and a fully human IgG4 constant region sequence (human C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2) at the endogenous mouse IgG1 locus (Fig. 1A, mouse locus 4). Briefly, human C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 sequences were amplified using the BAC clone CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) as a template and introduced into the BAC clone BMQ- through several genetic engineering steps. 263J18 (The Sanger Centre) instead of the endogenous C _H 1-HC _H 2-C _H 3-M1-M2 mouse IgG1 sequence. The resulting BAC clone for use in ES cells contained a DNA fragment that contained sequences encoding human IgG4 _CH1 - _HCH2 - _CH3 -M1-M2 and the mouse IgG1 (Sγ1) switch region and mouse IgG2b constant region gene segment. Mice generated from genetically modified ES cells contained the immunoglobulin locus illustrated in FIG. 1A, 4, wherein the nucleic acid sequence encoding the human IgG4 constant domain replaced the nucleic acid sequence encoding the endogenous mouse IgG1 constant domain at the endogenous mouse IgG1 gene segment locus. The remaining heavy chain constant region isotype sequences were entirely murine. The murine ES cells used for electroporation contained human heavy chain variable gene segments (human _VH , D, and _JH variable gene segments) operably linked to the mouse heavy chain constant region, including an inserted sequence encoding mouse Adam6; see, for example, US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, incorporated herein by reference.

[01061] Также создавали мышей, которые содержали человеческую вариабельную область тяжелой цепи и константную область, содержащую полностью человеческие генные сегменты IgM, IgD, IgG3 и IgG1 в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши (Фиг. 1A, мышиный 5). [01061] Mice were also generated that contained a human heavy chain variable region and a constant region containing fully human IgM, IgD, IgG3 and IgG1 gene segments at the endogenous mouse immunoglobulin heavy chain locus (Figure 1A, mouse 5).

[01062] Чтобы создать конструкцию для нацеливания на мышиные ЭС-клетки, которые содержали человеческие вариабельные области тяжелой цепи и человеческие константные области тяжелой цепи, сначала создавали конструкцию, которая содержала делецию целой константной области IgH мыши (IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE и IgA) между интронным энхансером (Eμ) и 3’ регуляторной областью (3’РО), которую после этого нацеливали на ЭС-клетки VELOCIMMUNE®. [01062] To create a construct for targeting murine ES cells that contained human heavy chain variable regions and human heavy chain constant regions, a construct was first created that contained a deletion of the entire mouse IgH constant region (IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b , IgG2a, IgE and IgA) between the intronic enhancer (Eμ) and the 3' regulatory region (3'RO), which was then targeted to VELOCIMMUNE® ES cells.

[01063] Вкратце, BAC, обозначенную 3hVh BACvec, ранее описанную в Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152 (включенной в данный документ посредством ссылки), модифицировали путем удаления 3’ гена IgM мыши из 3hVH с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации (БГР) и замены кассеты отбора, и удаления 5’ плеча гомологии мыши. 3’ плечо гомологии мыши создавали путем двух БГР-модификаций BAC RP23-351j19 (Thermo Fisher Scientific), которые включали удаление генов IgG2b, IgG2a, IgE и IgA из 5’ конца RP23-351j19, и включение уникальных рестрикционных сайтов. Рестрикционный фрагмент этой второй конструкции лигировали в первую конструкцию для создания конечного LTVEC (MAID6022). MAID6022 содержал от 5’ к 3’: кассету EM7 hyg, IGHD/IGHJ человека, энхансер IgM мыши из BAC CT7-302a07, синтетический линкер, уникальный сайт I-CeuI, кассету lox2372-ub-neo-lox2372 с уникальным сайтом AscI, расположенным 5’ относительно 3’ сайта lox2372, 40,5 т. п. о. область локуса IgH мыши, начинающуюся в 3’ НТО гена IgA и заканчивающуюся ниже 3’ РО, и уникальный сайт PI-SceI.[01063] Briefly, BAC, designated 3hVh BACvec, previously described in Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111(14):5147-5152 (incorporated herein by reference), was modified by removing the 3' mouse IgM gene from 3hVH by bacterial homologous recombination (BHR) and replacing the selection cassette, and removing the 5' mouse homology arm. The 3′ arm of mouse homology was created by two BHR modifications of BAC RP23-351j19 (Thermo Fisher Scientific), which included the removal of the IgG2b, IgG2a, IgE, and IgA genes from the 5′ end of RP23-351j19, and the inclusion of unique restriction sites. The restriction fragment of this second construct was ligated into the first construct to create the final LTVEC (MAID6022). MAID6022 contained 5' to 3': EM7 hyg cassette, human IGHD/IGHJ, mouse IgM enhancer from BAC CT7-302a07, synthetic linker, unique I-CeuI site, lox2372-ub-neo-lox2372 cassette with unique AscI site located 5' relative to the 3' lox2372 site, 40.5 kb. a region of the mouse IgH locus starting at the 3' UTR of the IgA gene and ending downstream of the 3' PO, and a unique PI-SceI site.

[01064] Этот вектор обозначили MAID6022 (Фиг. 1B) и использовали для внесения последовательностей вариабельной области тяжелой цепи человека на следующем этапе конструирования.[01064] This vector was designated MAID6022 (Figure 1B) and was used to introduce human heavy chain variable region sequences in the next design step.

[01065] После этого человеческую ДНК из BAC RP11-448n5 (Thermo Fisher Scientific) модифицировали путем БГР для обрезки 3’ конца BAC и вставки кассеты lox2372-ub-hyg-lox2372. Эта кассета содержала уникальный сайт AscI, расположенный 5’ относительно 3’ сайта lox2372. Соединение человеческая область-lox2372 находилось на 3,7 т. п. о. ниже сигнала полиА IgG1. Эту конструкцию обозначили VI694. 3’ плечо гомологии мыши получали из мышиной BAC RP23-351j19 Thermo Fisher Scientific посредством нескольких этапов БГР и лигировали в человеческую BAC. Полученный в результате BAC-клон содержал следующие последовательности, перечисленные в Таблице 1:[01065] Human DNA from BAC RP11-448n5 (Thermo Fisher Scientific) was then modified by BHR to trim the 3' end of the BAC and insert the lox2372-ub-hyg-lox2372 cassette. This cassette contained a unique AscI site located 5′ to the 3′ lox2372 site. The human region-lox2372 junction was located at 3.7 kb. downstream of the IgG1 polyA signal. This design was designated VI694. The mouse homology 3′ arm was prepared from Thermo Fisher Scientific mouse BAC RP23-351j19 through multiple BHR steps and ligated into human BAC. The resulting BAC clone contained the following sequences listed in Table 1:

Таблица 1: Геномные координаты для нацеленного вектора, используемого для создания мышиного локуса 5 (MAID 6993)Table 1: Genomic coordinates for the targeting vector used to create mouse locus 5 (MAID 6993)

Область Region Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38)Genomic coordinates (mouse: GRCm38, or human: GRCh38) т. п. о.t.p.o. 5’ плечо гомологии человека5' arm human homology 14: 105888576 - 105862976 (- нить)14: 105888576 - 105862976 (- thread) ~ 33~33 Человек Human 14: 105862975-105732864 (- нить)14: 105862975-105732864 (- thread) ~ 130~130 3’ плечо гомологии мыши3' arm mouse homology 12: 113215726 -113256185 (- нить)12: 113215726 -113256185 (- thread) ~ 40,4~40.4

[01066] Полученный в результате нацеленный вектор электропорировали в ЭС-клетки, содержащие вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека, вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6, и 170 т. п. о. делецию последовательности константной области тяжелой цепи мыши (смотрите Фиг. 1B). После внесения последовательностей константной области человека кассету отбора удаляли, используя рекомбиназу Cre. Варианты соединения различных последовательностей модифицированной аллели мышиного локуса 5 с Фиг. 1A перед удалением кассеты отбора приведены в Таблице 2 ниже.[01066] The resulting targeting vector was electroporated into ES cells containing human heavy chain variable gene segments, an inserted murine Adam6 coding sequence, and 170 kb. deletion of the mouse heavy chain constant region sequence (see Fig. 1B). After introducing human constant region sequences, the selection cassette was removed using Cre recombinase. Options for connecting various sequences of the modified allele of mouse locus 5 with Fig. 1A before removing the selection cassette are shown in Table 2 below.

Таблица 2: Варианты соединения генетически модифицированной аллели мышиного локуса 5Table 2: Connection options for the genetically modified allele of the mouse locus 5

СоединениеCompound ПоследовательностьSubsequence SEQ ID NO:SEQ ID NO: 5’ плечо гомологии человека/ген IgM человека 5’ arm of human homology/human IgM gene TGGGACTCAGGTTGGGTGCGTCTGATGGAGTAACTGAGCC
TGGGGGCTTGGGGAGCCACATTTGGACGAGATGCCTGAACTGGGACTCAGGTTGGGTGCGTCTGATGGAGTAACTGAGCC
TGGGGGCTTGGGGAGCCACATTTGGACGAGATGCCTGAAC 11 Последовательность гена IgG1 человека/AgeI/5’ lox2372Human IgG1 gene sequence/AgeI/5’ lox2372 TAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC ACCGGTATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTATTAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC ACCGGT ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT 22 AscI/3’ lox2372/XhoI/3’ последовательность мышиAscI/3' lox2372/XhoI/3' mouse sequence GGCGCGCCATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTATCTCGAG
AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGC GGCGCGCC ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT CTCGAG
AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGC 33

Обычным шрифтом представлены мышиные последовательности, жирным шрифтом представлены человеческие последовательности, сайты рестрикционных ферментов/последовательности векторов подчеркнуты, а сайты loxp выделены курсивом. Regular font represents mouse sequences, bold font represents human sequences, restriction enzyme sites/vector sequences are underlined, and loxp sites are italicized.

[0100] Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, 5, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая генные сегменты константной области IgM, IgD, IgG3, IgG1 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенные генные сегменты константной области тяжелой цепи мыши в эндогенном локусе константной области тяжелой цепи мыши.[0100] Mice generated from genetically modified ES cells contained the immunoglobulin locus illustrated in FIG. 1A, 5, wherein a nucleic acid sequence encoding human IgM, IgD, IgG3, IgG1 constant region gene segments replaced a nucleic acid sequence encoding endogenous mouse heavy chain constant region gene segments at an endogenous mouse heavy chain constant region locus.

[0101] Также создавали мышей, которые содержали дополнительные последовательности константной области тяжелой цепи человека, такие как последовательности IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, в эндогенном локусе тяжелой цепи. Эти мыши, проиллюстрированные на Фиг. 1A, мышиный локус 6, содержали человеческую вариабельную область тяжелой цепи и полностью человеческие последовательности IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.[0101] Mice were also generated that contained additional human heavy chain constant region sequences, such as human IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, and IgG4 sequences, at the endogenous heavy chain locus. These mice, illustrated in FIG. 1A, mouse locus 6, contained a human heavy chain variable region and fully human IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 and IgG4 sequences at the endogenous mouse immunoglobulin heavy chain locus.

[0102] Вкратце, 42,9 т. п. о. человеческой последовательности ДНК, содержащей последовательности IgG2 и IgG4, получали из человеческой BAC CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) и модифицировали посредством нескольких этапов бактериальной гомологичной рекомбинации, расщепления и лигирования для добавления 5’ и 3’ плеч гомологии человека. Геномные координаты для полученного в результате BAC-клона перечислены в Таблице 3 ниже.[0102] Briefly, 42.9 kb. human DNA sequence containing IgG2 and IgG4 sequences was obtained from human BAC CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) and modified through several steps of bacterial homologous recombination, cleavage, and ligation to add 5′ and 3′ human homology arms. The genomic coordinates for the resulting BAC clone are listed in Table 3 below.

Таблица 3: Геномные координаты для нацеленного вектора, используемого для создания мышиного локуса 6 (MAID 20168)Table 3: Genomic coordinates for the targeting vector used to create mouse locus 6 (MAID 20168)

Область Region Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38)Genomic coordinates (mouse: GRCm38, or human: GRCh38) т. п. о.t.p.o. 5’ плечо гомологии человека5' arm human homology 14:105732663 – 105751156 (- нить)14:105732663 – 105751156 (- thread) ~ 18,5~18.5 Ген IGG2 и IGG4 человекаHuman IGG2 and IGG4 gene 14: 105614742 – 105657695 (- нить)14: 105614742 – 105657695 (- thread) ~ 42,9~42.9 3’ плечо гомологии мыши3' arm mouse homology 12:113215726 – 113256185 (- нить)12:113215726 – 113256185 (- thread) ~ 40,4~40.4

[01067] Полученный в результате нацеленный вектор электропорировали в ЭС-клетки, содержащие генные сегменты вариабельных областей тяжелой цепи человека и константной области тяжелой цепи IgM, IgD, IgG3 и IgG1 человека мышиного локуса 5, описанного выше (смотрите Фиг. 1C). Различные варианты соединения полученной в результате аллели описаны в Таблице 4 ниже. Кассету отбора удаляли, используя рекомбиназу Cre.[01067] The resulting targeting vector was electroporated into ES cells containing the human heavy chain variable region and human heavy chain constant region IgM, IgD, IgG3 and human IgG1 gene segments of the murine locus 5 described above (see Fig. 1C). The various combinations of the resulting allele are described in Table 4 below. The selection cassette was removed using Cre recombinase.

Таблица 4: Варианты соединения генетически модифицированной аллели мышиного локуса 6Table 4: Connection options for the genetically modified allele of the mouse locus 6

СоединениеCompound ПоследовательностьSubsequence SEQ ID NO:SEQ ID NO: 5’ плечо гомологии человека/Mre1/ген IGG2 человека5' arm of human homology/Mre1/human IGG2 gene TCTGTGCCTAGTTAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC CGCCGGCG ACTCATCACCAAGGGGAAGATGCTCAATCATTCATGAGGGATCTGCCCCCTCTGTGCCTAGTTAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC CGCCGGCG ACTCATCACCAAGGGGAAGATGCTCAATCATTCATGAGGGATCTGCCCCC 44 Ген IGG4 человека/Age1/5’ lox2372Human IGG4 gene/Age1/5’ lox2372 ATGCTCTTTATCTTATTAACTAAGGTGTCGTAACCAGTTCAAAGTGGAATT ACCGGT
ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTATATGCTCTTTATCTTATTAACTAAGGTGTCGTAACCAGTTCAAAGTGGAATT ACCGGT
ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT 55 3’ lox2372/Not1/3’ РО мыши3’ lox2372/Not1/3’ PO mice ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT
CTCGAGGCGGCCGC AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGCAGGGGCACTCATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT
CTCGAGGCGGCCGC AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGCAGGGGCACTC 66

Обычным шрифтом представлены мышиные последовательности, жирным шрифтом представлены человеческие последовательности, сайты рестрикционных ферментов/последовательности векторов подчеркнуты, а сайты loxp выделены курсивом. Regular font represents mouse sequences, bold font represents human sequences, restriction enzyme sites/vector sequences are underlined, and loxp sites are italicized.

[01068] Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, 6, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая генные сегменты константной области IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенные генные сегменты константной области тяжелой цепи мыши в эндогенном локусе константной области тяжелой цепи мыши.[01068] Mice generated from genetically modified ES cells contained the immunoglobulin locus illustrated in FIG. 1A, 6, wherein a nucleic acid sequence encoding human IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 and IgG4 constant region gene segments replaced a nucleic acid sequence encoding endogenous mouse heavy chain constant region gene segments at an endogenous mouse heavy chain constant region locus.

[01069] Все генетически модифицированные ЭС-клетки, содержащие человеческие вариабельные области тяжелой цепи и химерные или полностью человеческие константные области тяжелой цепи, в этом примере использовали для создания генетически модифицированных мышей, используя описанный выше метод VELOCIMOUSE®. [01069] All genetically modified ES cells containing human heavy chain variable regions and chimeric or fully human heavy chain constant regions in this example were used to create genetically modified mice using the VELOCIMOUSE® method described above.

Пример 1.2: Генетическое конструирование мышей, содержащих мышиные вариабельные области тяжелой цепи и человеческие константные области тяжелой цепиExample 1.2: Genetic Engineering of Mice Containing Mouse Heavy Chain Variable Regions and Human Heavy Chain Constant Regions

[01070] Чтобы создать конструкцию для нацеливания на мышиные ЭС-клетки, которые содержали мышиные вариабельные области тяжелой цепи и человеческие константные области тяжелой цепи, сначала создавали конструкцию, которая содержала делецию целой константной области IgH мыши (IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE и IgA) между интронным энхансером (Eμ) и 3’ регуляторной областью (3’РО). [01070] To create a construct for targeting murine ES cells that contained murine heavy chain variable regions and human heavy chain constant regions, we first created a construct that contained a deletion of the entire mouse IgH constant region (IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b , IgG2a, IgE and IgA) between the intronic enhancer (Eμ) and the 3' regulatory region (3'RO).

[01071] Вкратце, 5,2 т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши амплифицировали методом ПЦР из BAC-клона BMQ-451A16 (The Sanger Centre) и клонировали, используя изотермическую сборку, в плазмиду с точкой начала репликации R6K и кассетой lox2372-ub-neo. Полученная в результате плазмида содержит от 5’ к 3’: 392 п. о. R6K ori, уникальный сайт I-CeuI, 5,2 т. п. о. область локуса IgH мыши, включая DQ52, JH1-4 и Eµ, уникальный сайт NotI, кассету lox2372-ub-neo и уникальный сайт AscI. Эту плазмиду расщепляли, а фрагмент I-CeuI-AscI плазмиды лигировали в вектор, полученный из мышиного BAC-клона RP23-351j19 (Thermo Fisher Scientific), который содержал от 5’ к 3’: уникальный сайт I-CeuI, кассету lox2372-ub-hyg-lox2372 с уникальным сайтом AscI, расположенным 5’ относительно 3’ сайта lox2372, 40,5 т. п. о. область локуса IgH мыши, начинающуюся в 3’ НТО гена IgA и заканчивающуюся ниже 3’ РО, уникальный сайт PI-SceI и кассету устойчивости к спектиномицину (Spec). Полученный в результате вектор содержал от 5’ к 3’: уникальный сайт I-CeuI, 5,2 т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши (включая DQ52, JH1-4 и Eµ), уникальный сайт NotI, кассету lox2372-ub-neo-lox2372, 40,5 т. п. о. 3’ плечо гомологии мыши (включая 3’РО IgH), уникальный сайт PI-SceI и кассету Spec. Этот вектор (проиллюстрированный как MAID6577 на Фиг. 1D) использовали для внесения последовательностей вариабельной области тяжелой цепи человека на следующем этапе конструирования, а также для электропорации в мышиные ЭС-клетки для создания ЭС-клеток с делецией целой константной области IgH мыши. [01071] Briefly, 5.2 kb. The 5' arm of mouse homology was amplified by PCR from BAC clone BMQ-451A16 (The Sanger Centre) and cloned using isothermal assembly into a plasmid with an R6K origin of replication and a lox2372-ub-neo cassette. The resulting plasmid contains 5' to 3': 392 bp. R6K ori, unique I-CeuI site, 5.2 kb. region of the mouse IgH locus, including DQ52, JH1-4, and Eµ, a unique NotI site, the lox2372-ub-neo cassette, and a unique AscI site. This plasmid was digested and the I-CeuI-AscI fragment of the plasmid was ligated into a vector derived from the mouse BAC clone RP23-351j19 (Thermo Fisher Scientific), which contained a 5' to 3': unique I-CeuI site, lox2372-ub cassette -hyg-lox2372 with a unique AscI site located 5′ to the 3′ site of lox2372, 40.5 kb. a region of the mouse IgH locus starting at the 3' UTR of the IgA gene and ending downstream of the 3' PO, a unique PI-SceI site, and a spectinomycin resistance cassette (Spec). The resulting vector contained a 5' to 3' unique I-CeuI site, 5.2 kb. 5' arm of mouse homology (including DQ52, JH1-4 and Eµ), unique NotI site, lox2372-ub-neo-lox2372 cassette, 40.5 kb. 3' arm of mouse homology (including 3'PO IgH), unique PI-SceI site and Spec cassette. This vector (illustrated as MAID6577 in Fig. 1D) was used to introduce human heavy chain variable region sequences in the next design step and was also electroporated into mouse ES cells to generate ES cells with deletion of the entire mouse IgH constant region.

[01072] На следующем этапе конструирования человеческий BAC-клон RP11-448n5 модифицировали с помощью БГР для замещения 5,3 т. п. о. человеческой вставки плюс кассета CM кассетой lox2372-ub-hyg-lox2372. Эта кассета содержала уникальный сайт AscI, расположенный 5’ относительно 3’ сайта lox2372. Соединение человеческая область-lox2372 находилось на 3,7 т. п. о. ниже сигнала полиА IgG1. Эту конструкцию обозначили VI694. После этого VI694 модифицировали с помощью БГР для замещения 34,3 т. п. о. человеческой вставки кассетой CM и уникальным сайтом NotI site. Соединение NotI-человеческая последовательность находилось 3’ относительно Eµ и 5’ относительно области переключения IgM (Sµ). Эту конструкцию обозначили VI695. 131,7 т. п. о. фрагмент NotI-AscI из VI695 (человеческая вставка и кассета lox2372-ub-hyg) лигировали в MAID6577, чтобы получить конечный нацеленный вектор MAID6739 (мышиный локус 7 на Фиг. 1A). MAID6739 содержит от 5’ к 3’: уникальный сайт I-CeuI, 5,2 т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши (включая DQ52, JH1-4 и Eµ), уникальный сайт NotI, 130 т. п. о. область локуса константного гена IgH человека (включая гены IgM, IgD, IgG3 и IgG1), кассету lox2372-ub-hyg-lox2372, a 40,5 т. п. о. 3’ плечо гомологии мыши (с началом в 3’ НТО IgA и концом в 3’ от 3’ РО), уникальный сайт PI-SceI и кассету Spec. Геномные координаты для нацеленного вектора приведены в Таблице 5, а соединительные последовательности модифицированной аллели перечислены в Таблице 6.[01072] In the next step of construction, the human BAC clone RP11-448n5 was modified with BHR for a 5.3 kb substitution. human insert plus CM cassette cassette lox2372-ub-hyg-lox2372. This cassette contained a unique AscI site located 5′ to the 3′ lox2372 site. The human region-lox2372 junction was located at 3.7 kb. downstream of the IgG1 polyA signal. This design was designated VI694. VI694 was then modified with BHR to replace 34.3 kb. human insert with a CM cassette and a unique NotI site. The NotI-human sequence junction was 3′ to Eµ and 5′ to the IgM switch region (Sµ). This design was designated VI695. 131.7 kbp the NotI-AscI fragment from VI695 (human insert and lox2372-ub-hyg cassette) was ligated into MAID6577 to generate the final targeting vector MAID6739 (mouse locus 7 in Fig. 1A). MAID6739 contains a 5' to 3': unique I-CeuI site, 5.2 kb. 5' arm of mouse homology (including DQ52, JH1-4 and Eµ), unique NotI site, 130 kb. region of the human IgH constant gene locus (including the IgM, IgD, IgG3 and IgG1 genes), cassette lox2372-ub-hyg-lox2372, a 40.5 kb. 3' mouse homology arm (starting at the 3' IgA UTR and ending 3' from the 3' PO), a unique PI-SceI site and a Spec cassette. The genomic coordinates for the targeting vector are listed in Table 5, and the junction sequences of the modified allele are listed in Table 6.

Таблица 5: Геномные координаты для нацеленного вектора, используемого для создания мышиного локуса 7 (MAID 6739)Table 5: Genomic coordinates for the targeting vector used to create mouse locus 7 (MAID 6739)

Область Region Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38)Genomic coordinates (mouse: GRCm38, or human: GRCh38) т. п. о.t.p.o. 5’ плечо гомологии мыши5' arm mouse homology Chr12: 113432184 – 113426948 (- нить)Chr12: 113432184 – 113426948 (- thread) ~ 5,2~5.2 Область IgHC человекаHuman IgHC region Chr14: 105861617 – 105732663 (- нить)Chr14: 105861617 – 105732663 (- thread) ~ 130~130 3’ плечо гомологии мыши3' arm mouse homology Chr12: 113256185 – 113215726 (- нить)Chr12: 113256185 – 113215726 (- thread) ~ 40,5~40.5

Таблица 6: Варианты соединения генетически модифицированной аллели мышиного локуса 7Table 6: Connection options for the genetically modified allele of the mouse locus 7

СоединениеCompound ПоследовательностьSubsequence SEQ ID NOSEQ ID NO 5’ плечо мыши/IgHC человека5' arm mouse/human IgHC TTAAATGAATGCAATTATCTAGACTTATTTCAGTTGAACATGCTGGTTGG
GCGGCCGC
TGGCATAAGAGAAAACTCAATCAGATAGTGCTGAAGACAGGACTGTGGAGTTAAATGAATGCAATTATCTAGACTTATTTCAGTTGAACATGCTGGTTGG
GCGGCCGC
TGGCATAAGAGAAAACTCAATCAGATAGTGCTGAAGACAGGACTGTGGAG 77 IgHC человека/5’ lox2372 Human IgHC/5’ lox2372 TCTGTGCCTAGTTAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC
ACCGGT
ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTATTCTGTGCCTAGTTAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC
ACCGGT
ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT 88 3’ lox2372/3’ плечо мыши3’ lox2372/3’ mouse shoulder ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT
CTCGAG
AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGCAGGGGCACTCATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT
CTCGAG
AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGCAGGGGCACTC 99

Обычным шрифтом представлены мышиные последовательности, жирным шрифтом представлены человеческие последовательности, сайты рестрикционных ферментов/последовательности векторов подчеркнуты, а сайты loxp выделены курсивом. Regular font represents mouse sequences, bold font represents human sequences, restriction enzyme sites/vector sequences are underlined, and loxp sites are italicized.

[01073] Полученный в результате нацеленный вектор электропорировали в мышиные ЭС-клетки, которые содержали делецию целой константной области IgH мыши (MAID 6577), чтобы вставить генные сегменты IgM, IgD, IgG3 и IgG1. Кассету отбора удаляли с помощью рекомбиназы Cre. [01073] The resulting targeting vector was electroporated into mouse ES cells that contained a deletion of the entire mouse IgH constant region (MAID 6577) to insert the IgM, IgD, IgG3, and IgG1 gene segments. The selection cassette was removed using Cre recombinase.

[01074] Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, 7, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая генные сегменты константной области IgM, IgD, IgG3, IgG1 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенные генные сегменты константной области тяжелой цепи мыши в эндогенном локусе константной области тяжелой цепи мыши.[01074] Mice generated from genetically modified ES cells contained the immunoglobulin locus illustrated in FIG. 1A, 7, wherein the nucleic acid sequence encoding human IgM, IgD, IgG3, IgG1 constant region gene segments replaced the nucleic acid sequence encoding endogenous mouse heavy chain constant region gene segments at the endogenous mouse heavy chain constant region locus.

[01075] После создания ЭС-клеток и мышей, содержащих мышиный локус, проиллюстрированные на Фиг. 1A, локус 7, создавали мышей, которые содержали дополнительные последовательности константной области тяжелой цепи человека, такие как последовательности IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, в эндогенном локусе тяжелой цепи. Эти мыши, проиллюстрированные на Фиг. 1A, локус 8, содержали мышиную вариабельную область тяжелой цепи и полностью человеческие генные сегменты IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Для создания этих мышей использовали те же нацеленные векторы и протоколы, которые описаны выше, для конструирования мышиного локуса 6, как проиллюстрировано на Фиг. 1E.[01075] After generating ES cells and mice containing the murine locus illustrated in FIG. 1A, locus 7, generated mice that contained additional human heavy chain constant region sequences, such as human IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, and IgG4 sequences, at the endogenous heavy chain locus. These mice, illustrated in FIG. 1A, locus 8, contained the mouse heavy chain variable region and fully human IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 and IgG4 gene segments at the endogenous mouse immunoglobulin heavy chain locus. To create these mice, the same targeting vectors and protocols as described above were used to construct mouse locus 6, as illustrated in FIG. 1E.

[01076] Все генетически модифицированные ЭС-клетки, содержащие мышиные вариабельные области тяжелой цепи и химерные или человеческие константные области тяжелой цепи, в этом примере использовали для создания генетически модифицированных мышей, используя описанный выше метод VELOCIMOUSE®. [01076] All genetically modified ES cells containing murine heavy chain variable regions and chimeric or human heavy chain constant regions in this example were used to create genetically modified mice using the VELOCIMOUSE® method described above.

Пример 1.3: Генетическое конструирование мышей, содержащих человеческие константные области легкой цепи Example 1.3: Genetic Engineering of Mice Containing Human Light Chain Constant Regions

[01077] Генетически сконструированных мышей, содержащих человеческие константные области легкой цепи, создавали следующим образом. [01077] Genetically engineered mice containing human light chain constant regions were created as follows.

[01078] Сначала для создания мыши, содержащей константную область легкой цепи каппа человека, синтезировали 0,5 т. п. о. человеческого гена IGKC с помощью BlueHeron, который содержал геномную последовательность нуклеиновой кислоты от 5’ НТО в дистальном конце гена IGKC до 3’ конца ниже хвоста полиА. Кассету отбора loxP-Ub-Neo-loxP добавляли в 3’ конец этой последовательности. Использовали технологии CRISPR/Cas9 и изотермической сборки для внесения последовательности IGKC человека в мышиную BAC BMQ-126m16 (The Sanger Centre). После этого 5’ кассету CM и мышиные IgKJ удаляли путем БГР, используя кассету отбора spec. Геномные координаты полученного в результате BAC-клона приведены в Таблице 7, а соединительные последовательности модифицированной аллели перечислены в Таблице 8.[01078] First, 0.5 kb was synthesized to create a mouse containing the human kappa light chain constant region. human IGKC gene using BlueHeron, which contained the genomic nucleic acid sequence from the 5' UTR at the distal end of the IGKC gene to the 3' end downstream of the polyA tail. The loxP-Ub-Neo-loxP selection cassette was added to the 3′ end of this sequence. CRISPR/Cas9 and isothermal assembly technologies were used to introduce the human IGKC sequence into the mouse BAC BMQ-126m16 (The Sanger Centre). The 5' CM cassette and mouse IgKJ were then removed by BHR using the spec selection cassette. The genomic coordinates of the resulting BAC clone are listed in Table 7, and the junction sequences of the modified allele are listed in Table 8.

Таблица 7: Геномные координаты для нацеленного вектора, используемого для создания мышей, содержащих IgKC человекаTable 7: Genomic coordinates for the targeting vector used to generate mice containing human IgKC

Область Region Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38)Genomic coordinates (mouse: GRCm38, or human: GRCh38) т. п. о.t.p.o. 5’ плечо гомологии мыши5' arm mouse homology 6:70724056 – 70726317 (+ нить)6:70724056 – 70726317 (+ thread) ~ 2,3~2.3 Человеческий ген (5’ НТО–полиА)Human gene (5’ UTR–polyA) 2:88 857 079-88 857 800 (- нить)2:88 857 079-88 857 800 (- thread) ~ 0,7~ 0.7 3’ плечо гомологии мыши3' arm mouse homology 6:70727061 – 70756817 (+ нить)6:70727061 – 70756817 (+ thread) ~ 29,7~29.7

Таблица 8: Варианты соединения генетически модифицированной мышиной аллели, содержащей IgKC человекаTable 8: Connection options for a genetically modified mouse allele containing human IgKC

СоединениеCompound ПоследовательностьSubsequence SEQ ID NO:SEQ ID NO: 5’ НТО мыши/5’ НТО человека5’ mouse UTR/5’ human UTR AAACAACAAGATTGTATATATGTGCATCCTGGCCCCATTGTTCCTTATCT GGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCAAACAACAAGATTGTATATATGTGCATCCTGGCCCCATTGTTCCTTATCT GGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATC 1010 человек/5’ loxpperson/5’ loxp TCTGTTGTTTTACCAACTACTCAATTTCTCTTATAAGGGACTAAATATGTACCGGT
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCTGTTGTTTTACCAACTACTCAATTTCTCTTATAAGGGACTAAATATGT ACCGGT
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT 11eleven 3’ loxp/I-CeuI/3’ НТО мыши3’ loxp/I-CeuI/3’ NTO mouse ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
GTCGACCTCGAG
AATCCACCACACTTAAAGGATAAATAAAACCCTCCACTTGCCCTGGTTGGCTGTCCACTAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
GTCGACCTCGAG
AATCCACCACACTTAAAGGATAAATAAAACCCTCCACTTGCCCTGGTTGGCTGTCCACTA 1212

Обычным шрифтом представлены мышиные последовательности, жирным шрифтом представлены человеческие последовательности, сайты рестрикционных ферментов/последовательности векторов подчеркнуты, а сайты loxp выделены курсивом. Regular font represents mouse sequences, bold font represents human sequences, restriction enzyme sites/vector sequences are underlined, and loxp sites are italicized.

[01079] Как показано на Фиг. 2B, полученный в результате нацеленный вектор, содержащий последовательность области IgKC человека, электропорировали в ЭС-клетки, содержащие локус иммуноглобулина с генными сегментами вариабельной области легкой цепи каппа, функционально связанными с мышиной константной областью каппа (смотрите, например, Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152, включенную в данный документ посредством ссылки). Кассету отбора удаляли, используя рекомбиназу Cre. Генетически модифицированные ЭС-клетки использовали для создания генетически модифицированных мышей, используя описанный выше метод VELOCIMOUSE®. [01079] As shown in FIG. 2B, the resulting targeting vector containing the human IgKC region sequence was electroporated into ES cells containing an immunoglobulin locus with kappa light chain variable region gene segments operably linked to the mouse kappa constant region (see, for example, Macdonald et al. PNAS ( 2014) volume 111 (14):5147-5152, incorporated herein by reference). The selection cassette was removed using Cre recombinase. Genetically modified ES cells were used to create genetically modified mice using the VELOCIMOUSE® method described above.

[01080] И наконец, в другом примере, мышь, содержащая последовательности константной области лямбда человека, описана в US 15/803513, поданной 3 ноября 2017 г. (Опубликованной как US 2008/0125043), в полном объеме включенной в данный документ посредством ссылки. [01080] Finally, in another example, a mouse containing human lambda constant region sequences is described in US 15/803513, filed November 3, 2017 (Published as US 2008/0125043), incorporated herein by reference in its entirety .

Пример 1.4: Создание мышей, содержащих константные области тяжелой и легкой цепи человекаExample 1.4: Generation of Mice Containing Human Heavy and Light Chain Constant Regions

[01081] Мышей, несущих сконструированную константную область тяжелой цепи, например, содержащую полностью человеческие или химерные последовательности константной области тяжелой цепи в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, описанных, например, в примерах 1.1–1.2, скрещивают с мышами, содержащими последовательность константной области IgK человека и/или последовательность константной области IgL человека, описанными в примере 1.3. Скрещивание проводят с помощью стандартных методик, известных в данной области техники. Проводят скрининг линий мышей, несущих необходимые сконструированные локусы, в отношении наличия последовательностей константной области тяжелой цепи человека или последовательностей константной области легкой цепи человека. Таким образом, мышей, содержащих человеческие последовательности генного сегмента вариабельной области тяжелой цепи и человеческие или химерные человеческие/мышиные последовательности константной области тяжелой цепи в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, скрещивают с мышами, содержащими человеческие последовательности генного сегмента вариабельной области легкой цепи каппа и человеческие последовательности константной области легкой цепи каппа и/или человеческие последовательности генного сегмента вариабельной области легкой цепи лямбда и человеческие последовательности константной области легкой цепи лямбда, описанные в этом примере.[01081] Mice carrying an engineered heavy chain constant region, such as those containing fully human or chimeric heavy chain constant region sequences at the endogenous mouse immunoglobulin heavy chain locus, described, for example, in Examples 1.1 to 1.2, are crossed with mice containing the constant region sequence Human IgK and/or the human IgL constant region sequence described in Example 1.3. Crossing is carried out using standard techniques known in the art. Mouse strains carrying the required engineered loci are screened for the presence of human heavy chain constant region sequences or human light chain constant region sequences. Thus, mice containing human heavy chain variable region gene segment sequences and human or chimeric human/mouse heavy chain constant region sequences at the endogenous immunoglobulin heavy chain locus are crossed with mice containing human kappa light chain variable region gene segment sequences and human sequences kappa light chain constant region and/or human lambda light chain variable region gene segment sequences and human lambda light chain constant region sequences described in this example.

Пример 2: Мышиные модели для исследований фармакокинетики и дозирования человеческих терапевтических средствExample 2: Mouse Models for Pharmacokinetics and Dosing Studies of Human Therapeutics

[01082] Мышиное антитело против человеческих антител (MAHA), иммунный ответ, вырабатываемый мышами против человеческого антитела, может приводить к быстрому выведению из циркуляции человеческих моноклональных антител, которые вводят для экспериментов по фармакокинетике и/или эффективности. Чтобы провести более релевантные исследования ФК и дозирования полностью человеческих антител на мышиных моделях, мышей, содержащих константные области IgH человека, описанных в примере 1 выше, тестировали в отношении способности «обходить» ответ MAHA. Мыши, гетерозиготные в отношении константных областей IgH человека, демонстрировали нормальное развитие B-клеток, экспрессировали IgM/IgD человека и мыши и демонстрировали интактное аллельное исключение.[01082] Mouse anti-human antibody (MAHA), an immune response produced by mice against a human antibody, can result in rapid clearance from circulation of human monoclonal antibodies that are administered for pharmacokinetics and/or efficacy experiments. To conduct more relevant PK and dosing studies of fully human antibodies in murine models, mice containing the human IgH constant regions described in Example 1 above were tested for the ability to bypass the MAHA response. Mice heterozygous for human IgH constant regions exhibited normal B cell development, expressed human and mouse IgM/IgD, and exhibited intact allelic exclusion.

[01083] В одном примере, мышей, гомозиготных в отношении вариабельной области тяжелой цепи человека и гетерозиготных в отношении генных сегментов константной области IgM, IgD, IgG3 и IgG1 человека, как проиллюстрировано на Фиг. 1A, локус 5, тестировали в отношении снижения ответа MAHA. Для этих экспериментов всех мышей содержали и скрещивали в стерильном помещении в Regeneron Pharmaceuticals. Наивных контрольных мышей VELOCIMMUNE® (возраст - 16 недель, самцы, n = 2) и наивных мышей hVs, hIgM, hIgD, hIgG3 и hIgG1 (локус 5 на Фиг. 1A, возраст - 20 недель, самцы, n = 4) умерщвляли и получали образцы крови и тканей селезенки. Ткани селезенки лизировали в лизисном буфере ACK с последующей промывкой средой RPMI с 5 % ФБС. Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки (BD, кат. № 365956), а сыворотку собирали в соответствии с инструкциями производителя. Нормальную человеческую сыворотку (Quidel, кат. № A113) использовали в качестве положительного контроля для ELISA. [01083] In one example, mice homozygous for the human heavy chain variable region and heterozygous for the human IgM, IgD, IgG3, and IgG1 constant region gene segments, as illustrated in FIG. 1A, locus 5, was tested for decreased MAHA response. For these experiments, all mice were housed and bred in a sterile facility at Regeneron Pharmaceuticals. Naive control VELOCIMMUNE® mice (16 weeks old, male, n = 2) and naive hVs, hIgM, hIgD, hIgG3, and hIgG1 mice (locus 5 in Figure 1A, 20 weeks old, male, n = 4) were sacrificed and samples of blood and spleen tissue were obtained. Spleen tissues were lysed in ACK lysis buffer followed by washing with RPMI with 5% FBS. Blood was collected into serum separator tubes (BD, cat. no. 365956), and serum was collected according to the manufacturer's instructions. Normal human serum (Quidel, cat. no. A113) was used as a positive control for the ELISA.

[01084] Анализ на общие антитела IgM человека проводили, используя ELISA, следующим образом. Планшеты покрывали на ночь при 4 градусах C 2 мкг/мл кроличьего антитела против IgM человека (Jackson ImmunoResearch, кат. № 309-005-095), промывали, блокировали 1 % БСА в ФСБ-Т. Стандарт IgM человека ChromPure (Jackson ImmunoResearch, кат. № 009-000-012) серийно разводили от 600 нг/мл до 0,823 нг/мл в ФСБ-Т и добавляли в лунки. Лунки инкубировали с разведенными образцами сыворотки, промывали и инкубировали с HRP-конъюгированным антителом против IgM человека (Jackson ImmunoResearch, № 309-035-095). Планшеты промывали и обрабатывали набором реагентов для ТМБ-субстрата Opt EIA (BD кат. № 555214). Реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли ОП с коррекцией на холостой опыт на 450 нм с помощью микропланшетного ридера Molecular Devices Spectramax M5 и программного обеспечения SoftMax Pro. Данные анализировали, используя программное обеспечение Prism. Представленные данные соответствуют двум повторностям. Кроме того, проводили ELISA для IgG1 человека и IgG3 человека в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, кат. № BMS2092 и BMS2094, соответственно). Результаты для изотипа Ig, показанные на Фиг. 3A, демонстрируют, что внесенные изотипы константной области тяжелой цепи человека экспрессировались в сыворотке генетически модифицированных мышей мышиного локуса 5. [01084] Human total IgM antibody testing was performed using ELISA as follows. The plates were coated overnight at 4 degrees C with 2 μg/ml rabbit anti-human IgM antibody (Jackson ImmunoResearch, cat. no. 309-005-095), washed, and blocked with 1% BSA in PBS-T. ChromPure human IgM standard (Jackson ImmunoResearch, cat. no. 009-000-012) was serially diluted from 600 ng/ml to 0.823 ng/ml in PBS-T and added to the wells. Wells were incubated with diluted serum samples, washed, and incubated with HRP-conjugated anti-human IgM antibody (Jackson ImmunoResearch, no. 309-035-095). The plates were washed and treated with the Opt EIA TMB Substrate Reagent Kit (BD Cat. No. 555214). The reaction was stopped by adding 1 N sulfuric acid and the blank-corrected OD was measured at 450 nm using a Molecular Devices Spectramax M5 microplate reader and SoftMax Pro software. Data were analyzed using Prism software. The data presented correspond to two replicates. In addition, human IgG1 and human IgG3 ELISAs were performed according to the manufacturer's instructions (Invitrogen, cat. no. BMS2092 and BMS2094, respectively). The Ig isotype results shown in FIG. 3A demonstrate that the introduced human heavy chain constant region isotypes were expressed in the serum of genetically modified murine locus 5 mice.

[01085] Для экспериментов методом проточной цитометрии 1x10⁶ клеток инкубировали с антителом против мышиного CD16/CD32 (2.4G2, BD) на льду в течение 10 минут. После этого клетки метили в течение 30 минут на льду следующей панелью антител: антитело против мышиного CD3, конъюгированное с FITC (17A2, BD), A700-CD19 (1D3, BD), Pe-Cy7-IgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), антитело против человеческого IgD, конъюгированное с PE (IA6-2, BioLegend), и BV421-IgM (G20-127, BD). После окрашивания клетки промывали и фиксировали в 2 % формальдегиде. Сбор данных проводили на проточном цитометре BD LSRFortessa, а их анализ проводили с помощью программного обеспечения FlowJo. Графики количества B-клеток (CD19+) строили для hIgM в сравнении с mIgM и hIgD в сравнении с mIgD, чтобы проиллюстрировать использование аллелей и наличие аллельного исключения (Фиг. 3B).[01085] For flow cytometry experiments, 1x10 ⁶ cells were incubated with anti-mouse CD16/CD32 antibody (2.4G2, BD) on ice for 10 minutes. Cells were then labeled for 30 minutes on ice with the following panel of antibodies: FITC-conjugated anti-mouse CD3 (17A2, BD), A700-CD19 (1D3, BD), Pe-Cy7-IgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), PE-conjugated anti-human IgD (IA6-2, BioLegend), and BV421-IgM (G20-127, BD). After staining, cells were washed and fixed in 2% formaldehyde. Data acquisition was performed on a BD LSRFortessa flow cytometer and analysis was performed using FlowJo software. B cell counts (CD19+) were plotted for hIgM versus mIgM and hIgD versus mIgD to illustrate allelic usage and the presence of allelic exclusion ( Fig. 3B ).

[01086] Молекулярную массу антител в сыворотке, полученной от нескольких версий мышей, гетерозиготных в отношении константной области иммуноглобулина человека (например, мышей с локусом 1, 4, 6 и 8, проиллюстрированных на Фиг. 1A), анализировали методом вестерн-блоттинга. Образцы проводили через 4–12 % Трис-глициновый гель (Invitrogen), переносили на мембрану, блокировали в течение ночи при 4 градусах C, а после этого проводили обнаружение антител, используя HRP-конъюгированные антитела против IgG человека (Thermo, № 31412) и HRP-конъюгированные антитела против IgG мыши (Thermo, 31439), и обрабатывали реагентами для обнаружения для вестерн-блоттинга ELC (GE Health Care, № RPN2106). Вестерн-блоттинг показал, что молекулярная масса антител, содержащих константную область иммуноглобулина человека, обнаруженных с помощью антитела против IgG человека в сыворотке гетерозиготных в отношении константной области Ig человека мышей, была сходной с молекулярной массой антител в нормальной человеческой сыворотке (данные не приведены). Молекулярная масса антител, содержащих константную область иммуноглобулина мыши, обнаруженных с помощью антитела против IgG мыши в сыворотке гетерозиготных в отношении константной области Ig человека мышей, также была сходной в сравнении с молекулярной массой антител в мышиной сыворотке дикого типа и обратно-химерными мышами VELOCIMMUNE® (данные не приведены). [01086] The molecular weight of antibodies in sera obtained from several versions of mice heterozygous for the human immunoglobulin constant region (eg, locus 1, 4, 6, and 8 mice illustrated in FIG. 1A) was analyzed by Western blotting. Samples were run on a 4-12% Tris-glycine gel (Invitrogen), transferred to a membrane, blocked overnight at 4 degrees C, and antibody detection was performed using HRP-conjugated anti-human IgG (Thermo, #31412) and HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody (Thermo, 31439) and treated with ELC Western blot detection reagents (GE Health Care, no. RPN2106). Western blotting showed that the molecular weight of antibodies containing the human immunoglobulin constant region detected with anti-human IgG antibody in the sera of mice heterozygous for the human Ig constant region was similar to the molecular weight of antibodies in normal human serum (data not shown). The molecular weight of antibodies containing the mouse immunoglobulin constant region detected by anti-mouse IgG antibody in the sera of mice heterozygous for the human Ig constant region was also similar when compared with the molecular weight of antibodies in wild-type mouse sera and VELOCIMMUNE® reverse chimeric mice ( data not shown).

[01087] При тестировании в отношении ответов MAHA против релевантного по изотипу антитела, мыши, гетерозиготные в отношении hIgM, hIgD, hIgG3 и hIgG1 (локус 5), демонстрировали ответы MAHA, сравнимые с контрольными мышами (данные не приведены).[01087] When tested for MAHA responses against an isotype-relevant antibody, mice heterozygous for hIgM, hIgD, hIgG3, and hIgG1 (locus 5) exhibited MAHA responses comparable to control mice (data not shown).

[01088] В другом примере мышей, гомозиготных в отношении вариабельной области тяжелой цепи человека и гетерозиготных в отношении константных областей IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, как проиллюстрировано на Фиг. 1A, локус 6, или гомозиготных в отношении вариабельной области тяжелой цепи мыши и гетерозиготных в отношении константных областей IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, как проиллюстрировано на Фиг. 1A, локус 8, тестировали в отношении снижения ответа MAHA. Для этих экспериментов всех мышей содержали и скрещивали в специальном стерильном помещении в Regeneron Pharmaceuticals. Мыши, содержащие как (1) вариабельную область тяжелой цепи мыши и константную область тяжелой цепи человека (mVs-hFC; мышиный локус 8 на Фиг. 1A), так и (2) вариабельную область тяжелой цепи человека и константную область тяжелой цепи человека (hVs-hFC; мышиный локус 6 на Фиг. 1A), были гомозиготными в отношении вариабельной области мыши или человека, соответственно, и гетерозиготными в отношении константной области тяжелой цепи человека. Мыши VELOCIMMUNE® (hVs-mFc; смотрите патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки) были гомозиготными в отношении вариабельной области тяжелой цепи человека и гомозиготными в отношении константной области тяжелой цепи мыши. У наивных контрольный мышей ДТ (возраст - 15 недель, самки, n = 6); мышей hVs-mFc (возраст - 14 недель, самцы, n = 5); мышей hVs-hFc: вариабельные области человека, мышей hIgM, hIgD, hIgG3, hIgG1, hIgG2 и hIgG4 (возраст - 11 недель, самцы, n = 6); и mVs-hFc: вариабельные области мыши, мышей hIgM, hIgD, hIgG3, hIgG1, hIgG2 и hIgG4 (возраст - 11 недель, самки, n = 6) брали кровь перед инъекцией антител, чтобы определить концентрации изотипов антител в сыворотке (Фиг. 3C) и исходные мышиные титры против человеческих антител (Фиг. 3D, сутки 0). Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки (BD, кат. № 365956), а сыворотку собирали в соответствии с инструкциями производителя. Полностью человеческое антитело IgG4 вводили подкожно в концентрации 1 мг/кг, разведенным в ФСБ Дульбекко. У мышей брали кровь через 7 суток, 15 суток, 22 суток и 34 суток после инъекции для теста на MAHA (Фиг. 3D; приведены данные только для 34 суток).[01088] In another example of mice homozygous for the human heavy chain variable region and heterozygous for the human IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2, and IgG4 constant regions, as illustrated in FIG. 1A, locus 6, or homozygous for the mouse heavy chain variable region and heterozygous for the human IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 and IgG4 constant regions, as illustrated in FIG. 1A, locus 8, was tested for decreased MAHA response. For these experiments, all mice were housed and bred in a special sterile facility at Regeneron Pharmaceuticals. Mice containing both (1) a mouse heavy chain variable region and a human heavy chain constant region (mVs-hFC; mouse locus 8 in Fig. 1A) and (2) a human heavy chain variable region and a human heavy chain constant region (hVs -hFC; mouse locus 6 in Fig. 1A) were homozygous for the mouse or human variable region, respectively, and heterozygous for the human heavy chain constant region. VELOCIMMUNE® mice (hVs-mFc; see US Pat. Nos. 8,642,835 and 8,697,940, incorporated herein by reference) were homozygous for the human heavy chain variable region and homozygous for the mouse heavy chain constant region. In naïve control mice, DT (age - 15 weeks, females, n = 6); hVs-mFc mice (14 weeks old, males, n = 5); hVs-hFc mice: human variable regions, hIgM, hIgD, hIgG3, hIgG1, hIgG2 and hIgG4 mice (age - 11 weeks, males, n = 6); and mVs-hFc: mouse variable regions, hIgM, hIgD, hIgG3, hIgG1, hIgG2, and hIgG4 mice (11 weeks old, female, n = 6) were bled before antibody injection to determine serum antibody isotype concentrations (Figure 3C ) and baseline mouse anti-human antibody titers (Fig. 3D, day 0). Blood was collected into serum separator tubes (BD, cat. no. 365956), and serum was collected according to the manufacturer's instructions. Fully human IgG4 antibody was administered subcutaneously at a concentration of 1 mg/kg diluted in Dulbecco's PBS. Mice were bled at 7 days, 15 days, 22 days, and 34 days post-injection for MAHA testing (Figure 3D; data for 34 days only).

[01089] Измерения ELISA общего количества изотипа антитела (IgM мыши, общего IgG человека, IgM человека и IgG1 человека, и IgG4 человека) проводили в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, mIgM: 88-50470-88, общий mIgG: 88-50400-88, hIgM: 8850620-88, hIgG1: 88-50560-22, hIgG4: 88-50590-22). Обобщенные характеристики для большинства мышей приведены на Фиг. 3C (некоторые данные не приведены). В целом, наблюдали сходные сывороточные уровни для IgM и IgG мыши между мышами с гуманизированным Fc и мышами дикого типа, а уровни hIgM, hIgG1 и hIgG4 были сходными между двумя версиями мышей с гуманизированной константной областью тяжелой цепи (mVs-hFc: локус 8 и hVs-hFc: локус 6). [01089] ELISA measurements of total antibody isotype (mouse IgM, total human IgG, human IgM and human IgG1, and human IgG4) were performed according to the manufacturer's instructions (Invitrogen, mIgM: 88-50470-88, total mIgG: 88-50400 -88, hIgM: 8850620-88, hIgG1: 88-50560-22, hIgG4: 88-50590-22). Summarized characteristics for most mice are shown in Fig. 3C (some data not shown). Overall, similar serum levels were observed for mouse IgM and IgG between humanized Fc and wild-type mice, and levels of hIgM, hIgG1, and hIgG4 were similar between the two versions of humanized heavy chain constant region mice (mVs-hFc: locus 8 and hVs -hFc: locus 6).

[01090] Для исследований MAHA гетерозиготным мышам проводили одну подкожную инъекцию антитела hIgG4, после чего проводили ELISA на MAHA, как описано ниже. Планшеты Maxisorb (Nunc, кат. № 430341) покрывали на ночь при 4 градусах C антителом IgG4 человека в дозе 1 мкг/мл, блокировали и инкубировали в течение ночи с разведенными образцами сыворотки, с последующей инкубацией с HRP-конъюгированным антителом против IgG мыши (Jackson ImmunoResearch, код № 115-035-164) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты обрабатывали набором реагентов для ТМБ-субстрата Opt EIA (BD, кат. № 555214). Реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли ОП на 450 нм с помощью микропланшетного ридера Molecular Devices Spectramax M5 и программного обеспечения SoftMax Pro. Данные анализировали, используя программное обеспечение Prism. [01090] For MAHA studies, heterozygous mice were given a single subcutaneous injection of hIgG4 antibody followed by a MAHA ELISA as described below. Maxisorb plates (Nunc, cat. no. 430341) were coated overnight at 4 degrees C with human IgG4 antibody at a dose of 1 μg/ml, blocked and incubated overnight with diluted serum samples, followed by incubation with HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody ( Jackson ImmunoResearch, code no. 115-035-164) for 1 hour at room temperature. The plates were treated with the Opt EIA TMB Substrate Reagent Kit (BD, cat. no. 555214). The reaction was stopped by adding 1 N sulfuric acid and the OD was measured at 450 nm using a Molecular Devices Spectramax M5 microplate reader and SoftMax Pro software. Data were analyzed using Prism software.

[01091] Как показано на Фиг. 3D, мыши с гуманизированными вариабельными областями IgH и константными областями IgH (hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1-hIgG2-hIgG4; локус 6) имеют существенно меньшие титры MAHA против полностью человеческого антитела IgG4 на 34 сутки после инъекции по сравнению с любыми из остальных трех вариантов тестируемых мышей. Снижение ответов MAHA также наблюдали у других мышей (например, других мышей, проиллюстрированных на Фиг. 1A), содержащих человеческие вариабельные области тяжелой цепи и химерную мышиную-человеческую (когда вводимое антитело было таким же, как и гуманизированный константный ген) или полностью человеческую константную область тяжелой цепи (данные не приведены). [01091] As shown in FIG. 3D, mice with humanized IgH variable regions and IgH constant regions (hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1-hIgG2-hIgG4; locus 6) have significantly lower MAHA titers against the fully human IgG4 antibody at 34 days post-injection compared to either the remaining three variants of the tested mice. Reduced MAHA responses were also observed in other mice (eg, the other mice illustrated in Fig. 1A) containing human heavy chain variable regions and a chimeric mouse-human (when the administered antibody was the same as the humanized constant gene) or a fully human constant gene. heavy chain region (data not shown).

[01092] Концентрацию введенного антитела, сохранявшуюся в сыворотке, определяли методом ELISA на 0 сутки, 2 сутки, 7 сутки, 15 сутки, 22 сутки и 34 сутки для тех же мышей, которые описаны на Фиг. 3D выше. Планшеты Maxisorb (Nunc, кат. № 430341) покрывали на ночь при 4 градусах C 1 мкг/мл антигена, блокировали БСА в ФСБ и инкубировали с разведенными образцами сыворотки, с последующей инкубацией с HRP-конъюгированным антителом против IgG человека (Jackson ImmunoResearch, код № 109-035-098) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты обрабатывали набором реагентов для ТМБ-субстрата Opt EIA (BD, кат. № 555214). Реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли ОП на 450 нм с помощью микропланшетного ридера Molecular Devices Spectramax M5 и программного обеспечения SoftMax Pro. Данные анализировали, используя программное обеспечение Prism. Концентрацию определяли, используя вводимое антитело в качестве стандарта.[01092] The concentration of administered antibody retained in the serum was determined by ELISA on day 0, day 2, day 7, day 15, day 22, and day 34 for the same mice described in FIG. 3D is higher. Maxisorb plates (Nunc, cat. no. 430341) were coated overnight at 4 degrees C with 1 μg/ml antigen, blocked with BSA in PBS and incubated with diluted serum samples, followed by incubation with HRP-conjugated anti-human IgG antibody (Jackson ImmunoResearch, code No. 109-035-098) for 1 hour at room temperature. The plates were treated with the Opt EIA TMB Substrate Reagent Kit (BD, cat. no. 555214). The reaction was stopped by adding 1 N sulfuric acid and the OD was measured at 450 nm using a Molecular Devices Spectramax M5 microplate reader and SoftMax Pro software. Data were analyzed using Prism software. The concentration was determined using the administered antibody as a standard.

[01093] У мышей, которые имели сильный ответ MAHA, наблюдалось более быстрое выведение вводимого антитела по сравнению с мышами без ответа MAHA (Фиг. 3E). Число мышей, которые имели ответ MAHA, для каждого генотипа было следующим: 5 из 6 мышей с mVs-hFc, 0 из 6 мышей с hVs-hFC, 4 из 5 мышей с hVs-mFc и 4 из 6 мышей с mVs-mFc. Мыши без ответа MAHA все еще имели обнаруживаемые уровни вводимого антитела в сыворотке на 34 сутки. [01093] Mice that had a strong MAHA response showed faster clearance of the administered antibody compared to mice without a MAHA response (Figure 3E). The number of mice that had a MAHA response for each genotype was as follows: 5 of 6 mVs-hFc mice, 0 of 6 hVs-hFC mice, 4 of 5 hVs-mFc mice, and 4 of 6 mVs-mFc mice. Mice without a MAHA response still had detectable levels of administered antibody in their serum at day 34.

Пример 3: Мыши, содержащие гуманизированный неонатальный Fc-рецептор (FcRn) в качестве in vivo модели для исследования рециклинга человеческих антителExample 3: Mice containing a humanized neonatal Fc receptor (FcRn) as an in vivo model for studying human antibody recycling

[01094] Мышиный локус FcRn, расположенный в мышиной хромосоме 7, гуманизировали путем конструирования уникальных нацеленных векторов из ДНК человеческих и мышиных бактериальных искусственных хромосом (BAC), используя технологию VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al. (2003)), High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659, включенные в данный документ посредством ссылки). ДНК из мышиной BAC RP23-19D22 (Invitrogen-Thermo Fisher) модифицировали путем гомологичной рекомбинации, чтобы удалить 8,3 т. п. о. мышиной геномной ДНК, кодирующей внеклеточную часть мышиного FcRn и после этого вставить 11,5 т. п. о. соответствующей последовательности человеческого FcRn. Таким образом, мышиные экзоны, кодирующие домены альфа 1, альфа 2 и альфа 3 (экзоны 3, 4 и 5) гена FcRn мыши, замещали человеческими экзонами, кодирующими домены альфа 1, альфа 2 и альфа 3 (экзоны 3, 4 и 5) гена FcRn человека (смотрите Фиг. 4). Полученный в результате ген FcRn содержал мышиный экзон 1 (некодирующий экзон), мышиный экзон 2 (содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид), человеческие экзоны 3–6, мышиные экзоны 6 и 7 (кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены).[01094] The mouse FcRn locus, located on mouse chromosome 7, was humanized by constructing unique targeting vectors from human and mouse bacterial artificial chromosome (BAC) DNA using VELOCIGENE® technology (see, for example, US Pat. No. 6,586,251 and Valenzuela et al. ( 2003)), High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659, incorporated herein by reference). DNA from mouse BAC RP23-19D22 (Invitrogen-Thermo Fisher) was modified by homologous recombination to remove 8.3 kb. mouse genomic DNA encoding the extracellular part of the mouse FcRn and then insert 11.5 kb. corresponding sequence of human FcRn. Thus, the mouse exons encoding the alpha 1, alpha 2 and alpha 3 domains (exons 3, 4 and 5) of the mouse FcRn gene were replaced with human exons encoding the alpha 1, alpha 2 and alpha 3 domains (exons 3, 4 and 5) human FcRn gene (see Fig. 4). The resulting FcRn gene contained mouse exon 1 (non-coding exon), mouse exon 2 (containing the nucleic acid sequence encoding the signal peptide), human exons 3–6, mouse exons 6 and 7 (encoding the transmembrane and cytoplasmic domains).

[01095] В частности, чтобы создать мышей с гуманизированным FcRn, большой нацеленный вектор, используемый при конструировании химерного гена, содержал последовательности нуклеиновой кислоты, перечисленные в Таблице 9 ниже. Кассету LoxP-Ub-Neo-LoxP вставляли в интрон 5 вектора.[01095] Specifically, to create humanized FcRn mice, the large targeting vector used in constructing the chimeric gene contained the nucleic acid sequences listed in Table 9 below. The LoxP-Ub-Neo-LoxP cassette was inserted into intron 5 of the vector.

Таблица 9: Геномные координаты для ДНК большого нацеленного вектора FcRnTable 9: Genomic coordinates for FcRn large targeting vector DNA

Область Region Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38)Genomic coordinates (mouse: GRCm38, or human: GRCh38) т. п. о.t.p.o. 5’ плечо гомологии мыши5' arm mouse homology 7: 45 165 536-45 102 749 (- нить)7: 45 165 536-45 102 749 (- thread) ~ 63~ 63 Человеческая область (эктодомен)Human region (ectodomain) 19: 49513756 – 49525253 (+ нить)19: 49513756 – 49525253 (+ thread) ~ 11,5~11.5 3’ плечо гомологии мыши3' arm mouse homology 7: 45094477 – 449742257: 45094477 – 44974225 ~ 120~ 120

[01096] Нацеленную ДНК BAC использовали для электропорации мышиных ЭС-клеток, содержащих делецию в экзонах мышиного FcRn, для создания модифицированных ЭС-клеток для создания мышей, которые экспрессируют гуманизированный FcRn (Фиг. 4). ЭС-клетки, содержащие вставки последовательностей экзонов человеческого FcRn, идентифицировали с помощью количественного анализа TAQMAN™ (смотрите, например, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, включенную в данный документ посредством ссылки). Разрабатывали специальные наборы праймеров и зонды для обнаружения вставки человеческих последовательностей (приобретение аллели, ПА) и удаления мышиных последовательностей (утрата аллели, УА) (не показано). [01096] Targeted BAC DNA was used to electroporate murine ES cells containing a deletion in exons of murine FcRn to create modified ES cells to create mice that express humanized FcRn (Figure 4). ES cells containing insertions of human FcRn exon sequences were identified using the TAQMAN™ quantitative assay (see, for example, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, incorporated herein by reference). Special primer sets and probes were designed to detect insertion of human sequences (gain of allele, PA) and deletion of mouse sequences (loss of allele, LA) (not shown).

[01097] Кассету отбора можно удалять методами, известными специалисту в данной области техники. Например, ЭС-клетки, несущие гуманизированный локус FcRn, можно трансфицировать конструкцией, которая экспрессирует Cre, чтобы удалить кассету flox. Необязательно, кассету отбора можно удалять путем скрещивания с мышами, которые экспрессируют рекомбиназу Cre. Необязательно, кассету отбора оставляют у мышей. Варианты соединения аллели гуманизированного FcRn перед удалением кассеты отбора представлены в Таблице 10 ниже.[01097] The selection cassette can be removed by methods known to one skilled in the art. For example, ES cells harboring a humanized FcRn locus can be transfected with a construct that expresses Cre to remove the flox cassette. Optionally, the selection cassette can be removed by crossing with mice that express Cre recombinase. Optionally, the selection cassette is left in the mice. Options for connecting the humanized FcRn allele before removing the selection cassette are presented in Table 10 below.

Таблица 10: Варианты соединения аллели гуманизированного FcRnTable 10: Humanized FcRn Allele Connection Options

СоединениеCompound ПоследовательностьSubsequence SEQ ID NO:SEQ ID NO: мышь/человек (интрон 2)mouse/human (intron 2) CTTTCTGGGTGTCTGTCCCCTTCTCTCTGGAGGATCATGGCACTTCAGAT
CTGTCCCCTCTCTCTGAATCTGTCCCCCTCCCTCCATAATAGATTCTTCT CTTTCTGGGTGTCTGTCCCCTTCTCTCTGGAGGATCATGGCACTTCAGAT
CTGTCCCCTCTCTCTGAATCTGTCCCCCTCCTCCATAATAGATTCTTCT 1313 человек/5’ loxp (интрон 5)human/5’ loxp (intron 5) TCTCCCCACTGCACTGGCACAGCCCCGCCTTGCCGCTGCTGATCCATTGCCGGTGTGACC
CGGGCTCGATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGACTCGAG
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCTCCCCACTGCACTGGCACAGCCCCGCCTTGCCGCTGCTGATCCATTGCCGGTGTGACC
CGGGCTCGATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGACTCGAG
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT 1414 3’ loxp/мышь (интрон 5)3’ loxp/mouse (intron 5) ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
CCTAGGTTGGAGCTC
GTGTGAGAGGGGAGAGCAGAGGTGAGTCTGTGCCATGGGATACTTGTGGCGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
CCTAGGTTGGAGCTC
GTGTGGAGAGGGAGAGCAGAGGTGAGTCTGTGCCATGGGATACTTGTGGCG 1515

Выделенные жирным последовательности представляют человеческую ДНК, подчеркнутые последовательности представляют сайты рестрикционных ферментов, выделенные курсивом последовательности представляют последовательности сайтов loxP. Bold sequences represent human DNA, underlined sequences represent restriction enzyme sites, and italicized sequences represent loxP site sequences.

[01098] Целевые ЭС-клетки, описанные выше, использовали в качестве донорских ЭС-клеток и вносили в мышиный эмбрион на 8-клеточной стадии методом VELOCIMOUSE® (смотрите, например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). Мышей VELOCIMICE® (мышей F0, полностью полученных из донорских ЭС-клеток), независимо несущих гуманизированный FcRn, идентифицировали с помощью генотипирования, используя анализ модификации аллели (смотрите выше), который позволяет обнаруживать наличие уникальных генных последовательностей FcRn человека. Гетерозиготных мышей, несущих химерный ген FcRn, скрещивали до гомозиготности.[01098] The target ES cells described above were used as donor ES cells and introduced into the 8-cell stage mouse embryo using the VELOCIMOUSE® method (see, for example, US patent No. 7294754 and Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyzes Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® mice (F0 mice derived entirely from donor ES cells) independently carrying humanized FcRn were identified by genotyping using an allele modification assay (see above), which detects the presence of unique human FcRn gene sequences. Heterozygous mice carrying the chimeric FcRn gene were bred to homozygosity.

[01099] Ниже приведена последовательность полученного в результате химерного белка FcRn, экспрессируемого генетически модифицированными мышами (SEQ ID NO:16) с выделенными курсивом доменами альфа 1, 2 и 3 и сигнальным пептидом и выделенным жирным шрифтом и подчеркиванием трансмембранным доменом. Зрелый химерный белок начинается в аминокислоте 22 последовательности, приведенной ниже, а границы последовательностей мыши – человека и человека – мыши обозначены звездочкой (*). В качестве справочной информации ниже в Таблице 11 приведены номера доступа Genbank для последовательностей белка и мРНК человека и мыши. [01099] The sequence of the resulting chimeric FcRn protein expressed in genetically modified mice (SEQ ID NO:16) with the alpha 1, 2 and 3 domains and signal peptide in italics and the transmembrane domain in bold and underlining is shown below. The mature chimeric protein begins at amino acid 22 of the sequence given below, and the mouse-human and human-mouse sequence boundaries are indicated by an asterisk (*). For reference, Table 11 below provides Genbank accession numbers for human and mouse protein and mRNA sequences.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ХИМЕРНОГО БЕЛКА (SEQ ID NO:16)CHIMERIC PROTEIN SEQUENCE (SEQ ID NO:16)

MGMPLPWALS LLLVLLPQTW GS*ESHLSLLY HLTAVSSPAP GTPAFWVSGW LGPQQYLSYN SLRGEAEPCG AWVWENQVSW YWEKETTDLR IKEKLFLEAF KALGGKGPYT LQGLLGCELG PDNTSVPTAK FALNGEEFMN FDLKQGTWGG DWPEALAISQ RWQQQDKAAN KELTFLLFSC PHRLREHLER GRGNLEWKEP PSMRLKARPS SPGFSVLTCS AFSFYPPELQ LRFLRNGLAA GTGQGDFGPN SDGSFHASSS LTVKSGDEHH YCCIVQHAGL AQPLRVEL*DS SARSSVPVVG IVLGLLLVVV AIAGGVLLWG RMRSGLPAPW LSLSGDDSGD LLPGGNLPPE AEPQGANAFP ATS MGMPLPWALS LLLVLLPQTW G S*ESHLSLLY HLTAVSSPAP GTPAFWVSGW LGPQQYLSYN SLRGEAEPCG AWVWENQVSW YWEKETTDLR IKEKLFLEAF KALGGKGPYT LQGLLGCELG PDNTSVPTAK FALNGEEFMN FDLKQGTWGG DWPEALAISQ RWQQQDKAAN KELTFLLFSC PHRLREHLER GRGNLEWKEP PSMRLKARPS SPGFSVLTCS AFSFYPPELQ LRFLRNGLAA GTGQGDFGPN SDGSFHASSS LTVKSGDEHH YCCIVQHAGL AQPLRVEL*DS SARSS VPVVG IVLGLLLVVV AIAGGVLLW G RMRSGLPAPW LSLSGDDSGD LLPGGNLPPE AEPQGANAFP ATS

Таблица 11: Номера доступа Genbank для FcRn (FCGRT)Table 11: Genbank accession numbers for FcRn (FCGRT)

ВидView БелокProtein мРНКmRNA мышьmouse NP_034319NP_034319 NM_010189NM_010189 человекHuman NP_001129491NP_001129491 NM_001136019NM_001136019

[01100] Мышей, содержащих химерный ген FcRn, скрещивали с мышами, содержащими гуманизированный ген B2M в эндогенном локусе B2M мыши (Фиг. 5), подробно описанными в публикации заявки на патент США № 2013/0111617, в полном объеме включенной в данный документ посредством ссылки. Мышей скрещивали до гомозиготности в обоих локусах. [01100] Mice containing the chimeric FcRn gene were crossed with mice containing the humanized B2M gene at the endogenous mouse B2M locus (Figure 5), described in detail in US Patent Application Publication No. 2013/0111617, incorporated herein in its entirety by links. Mice were bred to homozygosity at both loci.

[01101] Для обнаружения экспрессии химерного FcRn и гуманизированного B2M мышей умерщвляли и получали ткани селезенки. После обработки лизисным буфером ACK (Gibco) ткани селезенки диссоциировали, клетки центрифугировали, промывали, помещали в планшеты, фиксировали фиксирующим буфером IC (eBioscience) и пермеабилизировали буфером, содержащим Fc-блок (BD), чтобы подготовить к окрашиванию. Чтобы обнаружить FcRn, клетки окрашивали внутрилабораторным первичным антителом против FcRn человека или первичным антителом против FcRn мыши (R&D AF6775) с последующим окрашиванием соответствующим вторичным антителом (ThermoFisher 1885920 или ThermoFisher 1915848). Клетки промывали и анализировали образцы на приборе FACS LSRFortessa X-20 (BD). Чтобы обнаружить B2M, клетки окрашивали PE-меченным антителом против B2M мыши (BioLegend, клон A16041A) или PE-меченным антителом против B2M человека (BioLegend, клон 2M2). Клетки промывали и анализировали образцы на приборе FACS LSRFortessa X-20 (BD). [01101] To detect the expression of chimeric FcRn and humanized B2M, mice were sacrificed and spleen tissues were obtained. After treatment with ACK lysis buffer (Gibco), spleen tissues were dissociated, cells were centrifuged, washed, plated, fixed with IC fixation buffer (eBioscience), and permeabilized with Fc block buffer (BD) to prepare for staining. To detect FcRn, cells were stained with in-house anti-human FcRn primary antibody or anti-mouse FcRn primary antibody (R&D AF6775), followed by staining with the corresponding secondary antibody (ThermoFisher 1885920 or ThermoFisher 1915848). Cells were washed and samples were analyzed on an LSRFortessa X-20 FACS instrument (BD). To detect B2M, cells were stained with PE-labeled anti-mouse B2M antibody (BioLegend, clone A16041A) or PE-labeled anti-human B2M antibody (BioLegend, clone 2M2). Cells were washed and samples were analyzed on an LSRFortessa X-20 FACS instrument (BD).

[01102] Гуманизированные мыши FcRn/B2M экспрессировали обнаруживаемые уровни химерного белка (данные не приведены). Однако, поскольку человеческий FcRn не может связывать мышиный IgG, определили, что мыши, гомозиготные в отношении человеческого FcRn и гуманизированного B2M, демонстрировали существенно сниженные уровни мышиного IgG в крови (данные не приведены). Гуманизированные мыши FcRn/B2M экспрессировали гуманизированный белок B2M (данные не приведены).[01102] Humanized FcRn/B2M mice expressed detectable levels of the chimeric protein (data not shown). However, since human FcRn cannot bind mouse IgG, it was determined that mice homozygous for human FcRn and humanized B2M exhibited significantly reduced blood levels of mouse IgG (data not shown). Humanized FcRn/B2M mice expressed humanized B2M protein (data not shown).

[01103] Известно, что мышиный FcRn связывает человеческий Ig с более высокой аффинностью, чем человеческий FcRn. Чтобы исследовать, демонстрировали ли мыши, экспрессирующие химерный мышиный/человеческий FcRn, свойства рециклинга человеческих антител, сходные с наблюдаемыми у человека, трем животным из мышей дикого типа и мышей, гомозиготных в отношении химерного FcRn и гуманизированного B2M, описанных выше, подкожно вводили человеческое антитело IgG4 в дозе 1 мг/кг и измеряли уровни лекарственного антитела в сыворотке через 6 часов, 1, 2, 3, 8, 10, 14, 22 и 30 суток после инъекции, используя иммуноанализ Gyros. Как показано на Фиг. 6, мыши, гомозиготные в отношении химерного FcRn (FcRn hu/hu) и гуманизированного B2M (B2M hu/hu), демонстрировали более быстрое выведение антитела, чем мыши дикого типа, которые не экспрессировали человеческие белки. Следовательно, мыши, экспрессирующие химерный FcRn и гуманизированный B2M, служат в качестве модели для исследования рециклинга человеческих терапевтических антител, который больше похож на человеческий, и, следовательно, служат прекрасной моделью для исследования фармакокинетического и фармакодинамического профиля терапевтического средства. [01103] Mouse FcRn is known to bind human Ig with higher affinity than human FcRn. To investigate whether mice expressing the chimeric mouse/human FcRn exhibited human antibody recycling properties similar to those observed in humans, three animals from the wild-type mice and mice homozygous for the chimeric FcRn and humanized B2M described above were injected subcutaneously with the human antibody IgG4 at a dose of 1 mg/kg and serum drug antibody levels were measured at 6 hours, 1, 2, 3, 8, 10, 14, 22 and 30 days after injection using the Gyros immunoassay. As shown in FIG. 6, mice homozygous for chimeric FcRn (FcRn hu/hu) and humanized B2M (B2M hu/hu) exhibited faster antibody clearance than wild-type mice that did not express human proteins. Therefore, mice expressing chimeric FcRn and humanized B2M serve as a model to study the recycling of human therapeutic antibodies, which is more human-like, and therefore serve as an excellent model to study the pharmacokinetic and pharmacodynamic profile of a therapeutic agent.

Пример 4: Мыши, содержащие гуманизированные высоко- и низкоаффинные Fc-гамма-рецепторы и человеческие константные области тяжелой цепи иммуноглобулинаExample 4: Mice containing humanized high- and low-affinity Fc-gamma receptors and human immunoglobulin heavy chain constant regions

[01104] Создавали гуманизированных мышей, содержащих высоко- и низкоаффинные Fcγ-рецепторы и гуманизированные константные области. Для этих экспериментов мышей, содержащих высокоаффинные Fcγ-рецепторы и низкоаффинные Fcγ-рецепторы (создание этих мышей описано в патентах США №№ 8658154; 9056130; 8658853; 8883496; 9687566; 9089599; 9221894 и 9474255, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки), комбинировали с мышами, содержащими человеческие константные области тяжелой цепи (например, мышиный локус 7 на Фиг. 1A), путем скрещивания или перенацеливания ЭС-клеток в соответствии с методиками, известными в данной области техники. Полученных в результате мышей скрещивали до гомозиготности. Различные типовые варианты осуществления описанных в данном документе гуманизированных локусов представлены на Фиг. 7. [01104] Humanized mice were created containing high- and low-affinity Fcγ receptors and humanized constant regions. For these experiments, mice containing high affinity Fcγ receptors and low affinity Fcγ receptors (the creation of these mice are described in US patent Nos. 8658154; 9056130; 8658853; 8883496; 9687566; 9089599; 9221894 and 9474255, which are incorporated herein in their entirety by references) were combined with mice containing human heavy chain constant regions (eg, mouse locus 7 in Fig. 1A) by crossing or retargeting ES cells according to techniques known in the art. The resulting mice were bred to homozygosity. Various exemplary embodiments of the humanized loci described herein are presented in FIG. 7.

[01105] После завершения генного нацеливания проводили скрининг ЭС-клеток или генетически модифицированных отличных от человека животных для подтверждения успешного включения представляющей интерес экзогенной нуклеотидной последовательности или экспрессии экзогенного полипептида. Специалистам в данной области техники известны многочисленные методики, которые включают (но не ограничиваются этим) саузерн-блоттинг, ПЦР длинных фрагментов, количественную ПЦР (например, ПЦР в режиме реального времени с использованием TAQMAN), флуоресцентную гибридизацию in situ , нозерн-блоттинг, проточную цитометрию, вестерн-блоттинг, иммуноцитохимию, иммуногистохимию и т. д. Например, мышей, несущих представляющую интерес генетическую модификацию, т. е. человеческий высокоаффинный FcgR и низкоаффинный FcgR и человеческие константные области тяжелой цепи, можно идентифицировать путем скрининга в отношении приобретения человеческой аллели, используя анализ модификации аллели, описанный в Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Специалистам в данной области техники известны другие методы анализа, которые позволяют идентифицировать нуклеотидные или аминокислотные последовательности у генетически модифицированных животных.[01105] Once gene targeting is completed, ES cells or genetically modified non-human animals are screened to confirm successful incorporation of the exogenous nucleotide sequence of interest or expression of the exogenous polypeptide. Numerous techniques are known to those skilled in the art, which include, but are not limited to, Southern blotting, long-fragment PCR, quantitative PCR (e.g., real-time PCR using TAQMAN), fluorescence in situ hybridization, Northern blotting, flow cytometry, Western blotting, immunocytochemistry, immunohistochemistry, etc. For example, mice carrying a genetic modification of interest, i.e., human high-affinity FcgR and low-affinity FcgR and human heavy chain constant regions, can be identified by screening for acquisition of the human allele , using the allele modification assay described in Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Other methods of analysis are known to those skilled in the art that allow the identification of nucleotide or amino acid sequences in genetically modified animals.

[01106] После завершения скрещивания или перенацеливания ЭС-клеток, как описано на Фиг. 7, изучали характеристики полученных в результате мышей. Для этих экспериментов всех мышей содержали и скрещивали в специальном стерильном помещении в Regeneron Pharmaceuticals. Наивных контрольных мышей ДТ (возраст - 26–36 недель, самцы и самки, n = 2) и наивных мышей, содержащих высоко- и низкоаффинный hFcgR, hIgM, hIgD, hIgG3 и hIgG1 (локус 7 на Фиг. 1A, возраст - 19–22 недель, самцы и самки, n = 5), умерщвляли и получали образцы крови и тканей селезенки. Красные кровяные клетки из крови и селезенки лизировали в лизисном буфере ACK с последующей промывкой средой RPMI с 5 % ФБС. Кровь также собирали в пробирки для отделения сыворотки (BD, кат. № 365956), а сыворотку собирали в соответствии с инструкциями производителя. Нормальную человеческую сыворотку (Quidel, кат. № A113) использовали в качестве положительного контроля для ELISA. [01106] Once the crossing or retargeting of ES cells is completed, as described in FIG. 7, studied the characteristics of the resulting mice. For these experiments, all mice were housed and bred in a special sterile facility at Regeneron Pharmaceuticals. Naïve control WT mice (age - 26–36 weeks, males and females, n = 2) and naive mice containing high and low affinity hFcgR, hIgM, hIgD, hIgG3 and hIgG1 (locus 7 in Fig. 1A, age - 19– 22 weeks, males and females, n = 5), were sacrificed and blood and spleen tissue samples were obtained. Red blood cells from blood and spleen were lysed in ACK lysis buffer followed by washing with RPMI with 5% FBS. Blood was also collected into serum separator tubes (BD, cat. no. 365956), and serum was collected according to the manufacturer's instructions. Normal human serum (Quidel, cat. no. A113) was used as a positive control for the ELISA.

[01107] Анализ на общие антитела IgM человека проводили, используя ELISA, следующим образом. Планшеты покрывали на ночь при 4 градусах C 2 мкг/мл ослиного антитела против IgM человека (Jackson ImmunoResearch, кат. № 709-005-073), промывали, блокировали 1 % БСА в ФСБ-Т. Стандарт IgM человека ChromPure (Jackson ImmunoResearch, кат. № 009-000-012) серийно разводили от 500 нг/мл до 0,49 нг/мл в ФСБ-Т и добавляли в лунки. Лунки инкубировали с разведенными образцами сыворотки, промывали и инкубировали с HRP-конъюгированным антителом против IgM человека (Jackson ImmunoResearch, № 009-035-073). Планшеты промывали и обрабатывали набором реагентов для ТМБ-субстрата Opt EIA (BD кат. № 555214). Реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли ОП с коррекцией на холостой опыт на 450 нм с помощью микропланшетного ридера Molecular Devices Spectramax M5 и программного обеспечения SoftMax Pro. Данные анализировали, используя программное обеспечение Prism. Представленные данные соответствуют двум повторностям. Кроме того, проводили ELISA для IgG1 человека и IgG3 человека в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, кат. № BMS2092 и BMS2094, соответственно). (Фиг. 8C)[01107] Human total IgM antibody testing was performed using ELISA as follows. The plates were coated overnight at 4 degrees C with 2 μg/ml donkey anti-human IgM antibody (Jackson ImmunoResearch, cat. no. 709-005-073), washed, blocked with 1% BSA in PBS-T. ChromPure human IgM standard (Jackson ImmunoResearch, cat. no. 009-000-012) was serially diluted from 500 ng/ml to 0.49 ng/ml in PBS-T and added to the wells. Wells were incubated with diluted serum samples, washed, and incubated with HRP-conjugated anti-human IgM antibody (Jackson ImmunoResearch, no. 009-035-073). The plates were washed and treated with the Opt EIA TMB Substrate Reagent Kit (BD Cat. No. 555214). The reaction was stopped by adding 1 N sulfuric acid and the blank-corrected OD was measured at 450 nm using a Molecular Devices Spectramax M5 microplate reader and SoftMax Pro software. Data were analyzed using Prism software. The data presented correspond to two replicates. In addition, human IgG1 and human IgG3 ELISAs were performed according to the manufacturer's instructions (Invitrogen, cat. no. BMS2092 and BMS2094, respectively). (Fig. 8C)

[01108] Для экспериментов методом проточной цитометрии 1x10⁶ клеток окрашивали фиксируемым красителем для определения жизнеспособности eFluor 455UV (ThermoFisher, кат. № 65-0868-14) и после промывания инкубировали с антителом против мышиного CD16/CD32 (2.4G2, BD) на льду в течение 10 минут. После этого клетки метили в течение 30 минут на льду следующей панелью антител: антитело против мышиного CD3, конъюгированное с FITC (17A2, BD), A700-CD19 (1D3, BD), Pe-Cy7-IgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), антитело против человеческого IgD, конъюгированное с PE (IA6-2, BioLegend), и BV421-IgM (G20-127, BD). После окрашивания клетки промывали и фиксировали в 2 % формальдегиде. Сбор данных проводили на проточном цитометре BD LSRFortessa, а их анализ проводили с помощью программного обеспечения FlowJo. B-клетки (CD19+), зрелые B-клетки (CD19+ IgD-выс. IgM-сред.), переходные/незрелые B-клетки (CD19+ IgD-сред. IgM-выс.). (Фиг. 8A и 8B). [01108] For flow cytometry experiments, 1x10 ⁶ cells were stained with eFluor 455UV fixable viability dye (ThermoFisher, cat. no. 65-0868-14) and, after washing, incubated with anti-mouse CD16/CD32 antibody (2.4G2, BD) on ice within 10 minutes. Cells were then labeled for 30 minutes on ice with the following panel of antibodies: FITC-conjugated anti-mouse CD3 (17A2, BD), A700-CD19 (1D3, BD), Pe-Cy7-IgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), PE-conjugated anti-human IgD (IA6-2, BioLegend), and BV421-IgM (G20-127, BD). After staining, cells were washed and fixed in 2% formaldehyde. Data acquisition was performed on a BD LSRFortessa flow cytometer and analysis was performed using FlowJo software. B cells (CD19+), mature B cells (CD19+ IgD-high IgM-medium), transitional/immature B cells (CD19+ IgD-medium IgM-high). (Figures 8A and 8B).

[01109] Как обобщено на Фиг. 8A, 8B и 8C, наблюдается существенное повышение поверхностной экспрессии человеческого IgM и человеческого IgD в B-клетках мышей, содержащих гуманизированные высоко- и низкоаффинные Fcγ-рецепторы и гуманизированные IgM, IgD, IgG3 и IgG1. Кроме того, эти мыши демонстрировали нормальную B-клеточную популяцию в селезенке и нормальные уровни антител в сыворотке. Эти мыши, которые демонстрируют точную гуманизацию высоко- и низкоаффинного hFCγR и гуманизацию константных областей тяжелой цепи, представляют новую модель для исследования эффекторной функции человеческих Fc-рецепторов.[01109] As summarized in FIG. 8A, 8B and 8C, there is a significant increase in the surface expression of human IgM and human IgD in B cells of mice containing humanized high- and low-affinity Fcγ receptors and humanized IgM, IgD, IgG3 and IgG1. In addition, these mice exhibited a normal B cell population in the spleen and normal serum antibody levels. These mice, which demonstrate precise humanization of high- and low-affinity hFCγR and humanization of heavy chain constant regions, provide a new model for studying the effector function of human Fc receptors.

Пример 5: Мыши, содержащие гуманизированный Fcε-эпсилон рецептор (FcεRα), для изучения взаимодействия человеческого антитела IgEExample 5: Mice containing a humanized Fcε epsilon receptor (FcεRα) to study human IgE antibody interaction

[01110] Белок FcεR состоит из одной α-субъединицы, β-субъединицы и двух γ-субъединиц. Внеклеточная честь α-субъединицы, FcεRIα, содержит два иммуноглобулин-подобных домена и связывает IgE с высокой аффинностью даже в отсутствие других субъединиц. Соответственно, в нижеизложенной стратегии проводили гуманизацию FcεRIα, α-субъединицы FcεR.[01110] The FcεR protein consists of one α subunit, a β subunit, and two γ subunits. The extracellular α subunit, FcεRIα, contains two immunoglobulin-like domains and binds IgE with high affinity even in the absence of other subunits. Accordingly, in the following strategy, FcεRIα, the α-subunit of FcεR, was humanized.

[01111] Мышиный локус FcεRIα, расположенный в мышиной хромосоме 1, гуманизировали путем конструирования уникальных нацеленных векторов из ДНК человеческих и мышиных бактериальных искусственных хромосом (BAC), используя технологию VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al. (2003)), High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659, включенные в данный документ посредством ссылки). ДНК из мышиной BAC RP23-332i14 (Invitrogen-Thermo Fisher) модифицировали путем гомологичной рекомбинации, чтобы удалить 5,7 т. п. о. мышиной геномной ДНК, кодирующей кодирующую область мышиного FcεRIα, и после этого вставить 6,1 т. п. о. кодирующей последовательности человеческого FcεRIα и человеческой 3’ нетранслируемой области из BAC CTD-3064h17 (Invitrogen-Thermo Fisher) (Фиг. 9). Таким образом, часть мышиного кодирующего экзона 1, кодирующего экзона 2, кодирующего экзона 3, кодирующего экзона 4 и кодирующего экзона 5 FcεRIα мыши замещали частью человеческого кодирующего экзона 1, кодирующего экзона 2, кодирующего экзона 3, кодирующего экзона 4 и кодирующего экзона 5 гена FcεRIα человека. Полученный в результате химерный ген FcεRIα содержал химерный мышиный/человеческий экзон 1 (содержащий мышиный промотор и 5’ НТО), человеческие кодирующие экзоны 2–5 до стоп-кодона, человеческие 3’ НТО и полиА, за которыми идут мышиные 3’ НТО и полиА. Экзоны 1 (частично) и 2 химерного гена кодируют сигнальный пептид, экзоны 3 и 4 кодируют два Ig-подобных домена FcεRIα, которые, как считается, взаимодействуют с IgE, а экзон 5 кодирует цитоплазматический и трансмембранный домены белка (смотрите Фиг. 9). [01111] The mouse FcεRIα locus, located on mouse chromosome 1, was humanized by constructing unique targeting vectors from human and mouse bacterial artificial chromosome (BAC) DNA using VELOCIGENE® technology (see, for example, US Pat. No. 6,586,251 and Valenzuela et al. ( 2003)), High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659, incorporated herein by reference). DNA from mouse BAC RP23-332i14 (Invitrogen-Thermo Fisher) was modified by homologous recombination to remove 5.7 kb. mouse genomic DNA encoding the coding region of mouse FcεRIα, and then insert 6.1 kb. coding sequence of human FcεRIα and human 3' untranslated region from BAC CTD-3064h17 (Invitrogen-Thermo Fisher) (Fig. 9). Thus, part of mouse coding exon 1, coding exon 2, coding exon 3, coding exon 4 and coding exon 5 of mouse FcεRIα was replaced with part of human coding exon 1, coding exon 2, coding exon 3, coding exon 4 and coding exon 5 of the FcεRIα gene person. The resulting chimeric FcεRIα gene contained chimeric mouse/human exon 1 (containing the mouse promoter and 5' UTR), human coding exons 2–5 up to the stop codon, human 3' UTR and polyA, followed by mouse 3' UTR and polyA . Exons 1 (partially) and 2 of the chimeric gene encode the signal peptide, exons 3 and 4 encode two Ig-like domains of FcεRIα, which are thought to interact with IgE, and exon 5 encodes the cytoplasmic and transmembrane domains of the protein (see Fig. 9).

[01112] В частности, чтобы создать мышей с гуманизированным FcεRIα, большой нацеленный вектор, используемый при конструировании химерного гена, содержал последовательности нуклеиновой кислоты, перечисленные в Таблице 12 ниже. Самоудаляющуюся кассету устойчивости к неомицину вставляли 3’ относительно последнего кодирующего экзона.[01112] Specifically, to create humanized FcεRIα mice, the large targeting vector used in constructing the chimeric gene contained the nucleic acid sequences listed in Table 12 below. A self-removing neomycin resistance cassette was inserted 3′ to the last coding exon.

Таблица 12: Геномные координаты для ДНК большого нацеленного вектора FcεRIαTable 12: Genomic coordinates for FcεRIα large targeting vector DNA

Область Region Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38)Genomic coordinates (mouse: GRCm38, or human: GRCh38) т. п. о.t.p.o. 5’ плечо гомологии мыши5' arm of mouse homology 1: 173309806-173227174 (- нить)1: 173309806-173227174 (- thread) ~ 82,6~82.6 Человеческий ген (ATG–полиА)Human gene (ATG-polyA) 1: 159302358 – 159308425 (+ нить)1: 159302358 – 159308425 (+ thread) ~ 6,1~6.1 3’ плечо гомологии мыши3' arm mouse homology 1: 173221426-173138062 (- нить)1: 173221426-173138062 (- thread) ~ 83,4~83.4

[01113] Нацеленную ДНК BAC использовали для электропорации мышиных ЭС-клеток, содержащих делецию в экзонах мышиного FcεRIα, для создания модифицированных ЭС-клеток для создания мышей, которые экспрессируют гуманизированный FcεRIα (Фиг. 9). ЭС-клетки, содержащие вставки последовательностей экзонов человеческого FcεRIα, идентифицировали с помощью количественного анализа TAQMAN™ (смотрите, например, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, включенную в данный документ посредством ссылки). Разрабатывали специальные наборы праймеров и зонды для обнаружения вставки человеческих последовательностей (приобретение аллели, ПА) и удаления мышиных последовательностей (утрата аллели, УА) (не показано). [01113] Targeted BAC DNA was used to electroporate murine ES cells containing a deletion in exons of murine FcεRIα to create modified ES cells to create mice that express humanized FcεRIα (Figure 9). ES cells containing insertions of human FcεRIα exon sequences were identified using the TAQMAN™ quantitative assay (see, for example, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, incorporated herein by reference). Special primer sets and probes were designed to detect insertion of human sequences (gain of allele, PA) and deletion of mouse sequences (loss of allele, LA) (not shown).

[01114] Варианты соединения аллели гуманизированного FcεRIα перед удалением кассеты отбора представлены в Таблице 13 ниже.[01114] Options for connecting the humanized FcεRIα allele before removing the selection cassette are presented in Table 13 below.

Таблица 13: Варианты соединения аллели гуманизированного FcεRIαTable 13: Humanized FcεRIα Allele Connection Options

СоединениеCompound ПоследовательностьSubsequence SEQ ID NO:SEQ ID NO: 5’ НТО мыши/ATG человека5’ UTR mouse/human ATG TTTTCGAAGCCATAGCTCTCTGGTGCAGTTAGCACCTGAAGGTGCAGGGGCG
ATGAAGAAGATGGCTCCTGCCATGGAATCCCCTACTCTACTGTGTGTAGCCTTTTTCGAAGCCATAGCTCTCTGGTGCAGTTAGCACCTGAAGGTGCAGGGGCG
ATGAAGAAGATGGCTCCTGCCATGGAATCCCCTACTCTACTGTGTGTAGCCT 1717 человек/5’ loxpperson/5’ loxp TCTTCTTCAGCTTACTAAATATGAACTTTCAGTTCTTGGCAGAATCAGGG
CTCGAG
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCTTCTTCAGCTTACTAAATATGAACTTTCAGTTCTTGGCAGAATCAGGG
CTCGAG
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT 1818 3’ loxp/I-CeuI/3’ НТО мыши3’ loxp/I-CeuI/3’ NTO mouse ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
GCTAGGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGCTAGC
CCTCAATAGCTTCTCCACTGTCAAAGGCCACTCATGTGATCCCTAGAAAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
GCTAGGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGCTAGC
CCTCAATAGCTTCTCCACTGTCAAAGGCCACTCATGTGATCCCCTAGAAAA 1919

Выделенные жирным последовательности представляют человеческую ДНК, подчеркнутые последовательности представляют сайты рестрикционных ферментов, выделенные курсивом последовательности представляют последовательности сайтов loxP. Bold sequences represent human DNA, underlined sequences represent restriction enzyme sites, and italicized sequences represent loxP site sequences.

[01115] Целевые ЭС-клетки, описанные выше, использовали в качестве донорских ЭС-клеток и вносили в мышиный эмбрион на 8-клеточной стадии методом VELOCIMOUSE® (смотрите, например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). Мышей VELOCIMICE® (мышей F0, полностью полученных из донорских ЭС-клеток), независимо несущих гуманизированный FcεRIα, идентифицировали с помощью генотипирования, используя анализ модификации аллели (смотрите выше), который позволяет обнаруживать наличие уникальных генных последовательностей FcεRIα человека. Гетерозиготных мышей, несущих химерный ген FcεRIα, скрещивали до гомозиготности.[01115] The target ES cells described above were used as donor ES cells and introduced into the 8-cell stage mouse embryo using the VELOCIMOUSE® method (see, for example, US Patent No. 7294754 and Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyzes Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® mice (F0 mice derived entirely from donor ES cells) independently carrying humanized FcεRIα were identified by genotyping using an allele modification assay (see above), which detects the presence of unique human FcεRIα gene sequences. Heterozygous mice carrying the chimeric FcεRIα gene were bred to homozygosity.

[01116] Полученный в результате белок FcεRIα, экспрессируемый мышами, является полностью человеческим, а ниже приведена последовательность человеческого белка FcεRIα, экспрессируемого генетически модифицированными мышами (SEQ ID NO:20) с выделенными курсивом Ig-подобными доменами и сигнальным пептидом и выделенным жирным шрифтом и подчеркиванием трансмембранным доменом. Зрелый белок начинается в аминокислоте 26 последовательности, приведенной ниже. В качестве справочной информации ниже в Таблице 14 приведены номера доступа Genbank для последовательностей белка и мРНК человека и мыши.[01116] The resulting mouse-expressed FcεRIα protein is fully human, and below is the sequence of the human genetically modified mouse-expressed FcεRIα protein (SEQ ID NO:20) with the Ig-like domains and signal peptide in italics and in bold and underlining the transmembrane domain. The mature protein begins at amino acid 26 of the sequence given below. For reference, Table 14 below provides Genbank accession numbers for human and mouse protein and mRNA sequences.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БЕЛКА (SEQ ID NO:20)HUMAN PROTEIN SEQUENCE (SEQ ID NO:20)

MAPAMESPTL LCVALLFFAP DGVLAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQFFIPL LVVILFAVDT GLFISTQQQV TFLLKIKRTR KGFRLLNPHP MAPAMESPTL LCVALLFFAP DGVLA VPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQ FFIPL LVVILFAVDT GLFI STQQQV TFLLKIKRTR KGFRLLNPHP

KPNPKNNKPNPKNN

Таблица 14: Номера доступа Genbank для FCER1ATable 14: Genbank accession numbers for FCER1A

ВидView БелокProtein мРНКmRNA МышьMouse NP_034314NP_034314 NM_010184NM_010184 ЧеловекHuman NP_001992NP_001992 NM_002001NM_002001

[01117] Чтобы подтвердить экспрессию гуманизированного FcεRIα на поверхности базофилов селезенки мышей с гуманизированным FcεRIα, мышей дикого типа (ДТ) или гомозиготных в отношении гуманизированного FcεRIα мышей умерщвляли, получали ткани селезенки и готовили суспензии из одиночных клеток после лизиса красных кровяных клеток (Sigma). После этого клетки окрашивали маркером в отношении живых/мертвых клеток, блокировали Fc-блоком с последующим окрашиванием одной из двух смесей антител: (1) смесь 1: антитело против мышиного CD49b (PECy7-конъюгированное, клон EBioscience DX5), против мышиного TCRβ (APC-конъюгированное, клон BD H57-597), против мышиного B220 (BUV395-конъюгированное, клон BD RA3-682) и против мышиного FcεRIα (eFluor 450-конъюгированное, клон EBioscience MAR-1), или (2) смесь 2: антитело против мышиного CD49b (PECy7-конъюгированное, клон EBioscience DX5), против мышиного TCRβ (APC-конъюгированное, клон BD H57-597), против мышиного B220 (BUV395-конъюгированное, клон BD RA3-682) и против мышиного FcεRIα (eFluor 450-конъюгированное, клон EBioscience AER-37(CRA1)). Данные по клеткам получали с помощью прибора LSRFortessa и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo. Базофилы идентифицировали как TCRβ- B220- CD49b+ FcεRIα+. На графиках FACS на Фиг. 10 показана популяция TCRβ- B220- с указанной стрелками популяцией базофилов. Эта популяция положительна в отношении мышиного FcεRIα только у мышей ДТ и положительной в отношении человеческого FcεRIα только у мышей с гуманизированным FcεRIα. На графиках проиллюстрирована количественная оценка человеческих или мышиных базофилов FceR1α+ в виде процента живых клеток в селезенке 5 мышей каждого генотипа (Фиг. 10). [01117] To confirm the expression of humanized FcεRIα on the surface of spleen basophils from mice with humanized FcεRIα, wild-type (WT) or homozygous for humanized FcεRIα mice were sacrificed, spleen tissues were obtained, and single-cell suspensions were prepared after red blood cell lysis (Sigma). Cells were then stained with a live/dead cell marker, blocked with Fc block, followed by staining with one of two antibody mixtures: (1) mixture 1: anti-mouse CD49b (PECy7-conjugated, clone EBioscience DX5), anti-mouse TCRβ (APC -conjugated, clone BD H57-597), anti-mouse B220 (BUV395-conjugated, clone BD RA3-682) and anti-mouse FcεRIα (eFluor 450-conjugated, clone EBioscience MAR-1), or (2) mixture 2: antibody against mouse CD49b (PECy7-conjugated, clone EBioscience DX5), anti-mouse TCRβ (APC-conjugated, clone BD H57-597), anti-mouse B220 (BUV395-conjugated, clone BD RA3-682) and anti-mouse FcεRIα (eFluor 450-conjugated , clone EBioscience AER-37(CRA1)). Cell data were acquired using an LSRFortessa instrument and analyzed using FlowJo software. Basophils were identified as TCRβ- B220- CD49b+ FcεRIα+. In the FACS plots in Fig. 10 shows the TCRβ-B220- population with the basophil population indicated by arrows. This population is positive for mouse FcεRIα only in WT mice and positive for human FcεRIα only in mice with humanized FcεRIα. The graphs illustrate the quantification of human or murine FceR1α+ basophils as a percentage of live cells in the spleens of 5 mice of each genotype (Figure 10).

[01118] Мышей с гуманизированным FcεRIα подтверждали в модели пассивной кожной анафилаксии (ПКА). На 1 сутки группам ДТ или гуманизированных мышей проводили интрадермальную инъекцию коктейля из двух аллерген-специфических человеческих антител IgE или нерелевантного антитела IgG (отрицательный контроль) в правое и левое ухо, соответственно, таким образом, обеспечивая возможность связывания аллерген-специфического IgE с FcεR на тучных клетках. Через двадцать четыре часа мышей стимулировали внутривенной (в/в) инъекцией 1 мкг аллергена, разведенного в 0,5 % красителя Эванса синего. Через один час после стимуляции аллергеном мышей умерщвляли, краситель Эванса синий экстрагировали из ушной ткани и оценивали спектрофотометрическим методом, используя стандартную кривую. Затем уши сушили и взвешивали. Результаты демонстрируют экстравазацию красителя Эванса синего в ткани, количественно выраженную в нг Эванса синего/мг ткани, в качестве показателя локальной дегрануляции тучных клеток. Данные, приведенные на Фиг. 11, демонстрируют, что человеческий аллерген-специфический IgE может опосредовать локальный анафилактический ответ у мышей с гуманизированным FcεRIα, но не у мышей ДТ. [01118] Humanized FcεRIα mice were validated in a model of passive cutaneous anaphylaxis (SCA). On day 1, groups of WT or humanized mice received an intradermal injection of a cocktail of two allergen-specific human IgE antibodies or an irrelevant IgG antibody (negative control) into the right and left ears, respectively, thereby allowing allergen-specific IgE to bind to FcεR on obese mice. cells. Twenty-four hours later, mice were stimulated with an intravenous (IV) injection of 1 μg of allergen diluted in 0.5% Evans blue. One hour after allergen stimulation, mice were sacrificed and Evans blue dye was extracted from ear tissue and assessed spectrophotometrically using a standard curve. The ears were then dried and weighed. The results demonstrate extravasation of Evans blue dye into tissue, quantified as ng Evans blue/mg tissue, as an indicator of local mast cell degranulation. The data shown in Fig. 11 demonstrate that human allergen-specific IgE can mediate a local anaphylactic response in humanized FcεRIα mice but not in WT mice.

[01119] Мышей с гуманизированным FcεRIα также подтверждали в модели пассивной системной анафилаксии (ПСА). На 1 сутки группам мышей с гуманизированным FcεRIα проводили внутривенную (в/в) инъекцию коктейля из двух аллерген-специфических человеческих антител IgE или нерелевантного антитела IgG (отрицательный контроль), обеспечивая возможность системного связывания аллерген-специфического IgE с FcεR1-экспрессирующими клетками. Через двадцать четыре часа для всех мышей проводили измерения исходной внутренней температуры с последующей в/в инъекцией 1 мкг аллергена. После этого измерения внутренней температуры проводили для всех мышей через 30, 60, 120 и 240 минут после стимуляции аллергеном и рассчитывали изменения внутренней температуры относительно исходной температуры в каждый момент времени. Снижение внутренней температуры является показателем системной анафилаксии. Данные, приведенные на Фиг. 12, демонстрируют, что человеческий аллерген-специфический IgE может опосредовать системный анафилактический ответ у мышей с гуманизированным FcεRIα, определяемый по существенному снижению внутренней температуры через 30–60 минут после стимуляции. [01119] Humanized FcεRIα mice have also been validated in a passive systemic anaphylaxis (PSA) model. On day 1, groups of FcεRIα humanized mice were given an intravenous (IV) injection of a cocktail of two allergen-specific human IgE antibodies or an irrelevant IgG antibody (negative control), allowing systemic binding of allergen-specific IgE to FcεR1-expressing cells. Twenty-four hours later, all mice underwent baseline core temperature measurements followed by an intravenous injection of 1 μg of allergen. Core temperature measurements were then taken for all mice at 30, 60, 120, and 240 min after allergen stimulation, and changes in core temperature relative to baseline temperature at each time point were calculated. A decrease in core temperature is an indicator of systemic anaphylaxis. The data shown in Fig. 12 demonstrate that human allergen-specific IgE can mediate a systemic anaphylactic response in humanized FcεRIα mice, as determined by a significant decrease in core temperature 30 to 60 minutes after stimulation.

Пример 6: Основные мыши для изучения взаимодействий человеческих Fc-рецепторов и эффективности человеческих терапевтических антителExample 6: Key Mice for Studying Human Fc Receptor Interactions and Efficacy of Human Therapeutic Antibodies

[01120] Чтобы получить лучшую модель для изучения полностью человеческих моноклональных антител в мышиной модели эффекторной функции человеческих Fc-рецепторов, мышей A (гуманизированный hβ2M; смотрите пример 3), мышей B (hFCER1A; смотрите пример 5), мышей C (hFCRN; смотрите пример 3), мышей D (hFCGR1), мышей E (hFCGR2/3) и мышей F (mVs, hIgM, hIgD, IgG3 и IgG1; мышиный локус 7 на Фиг. 1A) или, в альтернативном варианте, мышей F’ (hVs, hIgM, hIgD, IgG3 и IgG1; мышиный локус 5 на Фиг. 1A), проиллюстрированных на Фиг. 13, комбинируют путем скрещивания или перенацеливания ЭС-клеток в соответствии с методиками, описанными в данном документе и известными в данной области техники. Полученные в результате мыши могут быть гетерозиготными или гомозиготными в отношении любых или всех из этих генов. Различные типовые варианты осуществления описанных в данном документе гуманизированных локусов проиллюстрированы на Фиг. 13. Других мышей с человеческими константными областями тяжелой цепи, проиллюстрированными на Фиг. 1A, можно скрещивать с оставшимися мышами (мышами A–E) на Фиг. 13. Таким образом, мышей A (гуманизированный hb2M; смотрите пример 3), мышей B (hFCER1A; смотрите пример 5), мышей C (hFCRN; смотрите пример 3), мышей D (hFCGR1), мышей E (hFCGR2/3) и мышей (mVs, hIgM, hIgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4; мышиный локус 8 на Фиг. 1A) или, в альтернативном варианте, мышей (hVs, hIgM, hIgD, IgG3 IgG1, IgG2 и IgG4; мышиный локус 6 на Фиг. 1A) комбинируют путем скрещивания или перенацеливания ЭС-клеток в соответствии с методиками, описанными в данном документе и известными в данной области техники. Их также можно скрещивать до получения мышей с легкой цепью, проиллюстрированной на Фиг. 2A.Дополнительные человеческие константные области иммуноглобулина добавляют с помощью методик генетического конструирования, описанных в примере 1 и известных в данной области техники.[01120] To obtain a better model for studying fully human monoclonal antibodies in a mouse model of human Fc receptor effector function, A mice (humanized hβ2M; see Example 3), B mice (hFCER1A; see Example 5), C mice (hFCRN; see example 3), D mice (hFCGR1), E mice (hFCGR2/3) and F mice (mVs, hIgM, hIgD, IgG3 and IgG1; mouse locus 7 in Fig. 1A) or, alternatively, F' mice (hVs , hIgM, hIgD, IgG3 and IgG1; mouse locus 5 in Fig. 1A), illustrated in Fig. 13 are combined by crossing or retargeting ES cells in accordance with the techniques described herein and known in the art. The resulting mice may be heterozygous or homozygous for any or all of these genes. Various exemplary embodiments of the humanized loci described herein are illustrated in FIG. 13. Other mice with human heavy chain constant regions illustrated in FIG. 1A can be crossed with the remaining mice (mice A–E) in FIG. 13. Thus, mice A (humanized hb2M; see example 3), mice B (hFCER1A; see example 5), mice C (hFCRN; see example 3), mice D (hFCGR1), mice E (hFCGR2/3) and mice (mVs, hIgM, hIgD, IgG3, IgG1, IgG2 and IgG4; mouse locus 8 in Fig. 1A) or, alternatively, mice (hVs, hIgM, hIgD, IgG3 IgG1, IgG2 and IgG4; mouse locus 6 in Fig. 1A) are combined by crossing or retargeting ES cells in accordance with the procedures described herein and known in the art. They can also be crossed to produce the light chain mice illustrated in FIG. 2A. Additional human immunoglobulin constant regions are added using genetic engineering techniques described in Example 1 and known in the art.

Включение путем ссылкиIncorporation by reference

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упоминаемые в данном документе, в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки в той же мере, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были специально и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки. В случае противоречий, данная заявка, включая любые определения в данном документе, имеет приоритет.All publications, patents and patent applications referenced herein are hereby incorporated by reference in their entirety to the same extent as if each individual publication, patent or patent application had been specifically and individually identified as being incorporated by reference. In the event of any conflict, this application, including any definitions herein, shall control.

ЭквивалентыEquivalents

Специалистам в данной области станет понятно или они смогут установить, используя лишь рутинные эксперименты, существование многочисленных эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанного в данном документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охвачены нижеприведенной формулой изобретения.Those skilled in the art will recognize or be able to determine, using only routine experimentation, that there are numerous equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. Such equivalents are intended to be covered by the following claims.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES

<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

<120> ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ ГРЫЗУНЫ ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ <120> HUMANIZED RODENTS FOR THERAPEUTIC TESTING

АГЕНТОВAGENTS

<130> RPB-01925 (28744-01925)<130> RPB-01925 (28744-01925)

<140><140>

<141><141>

<150> 62/689628<150> 62/689628

<151> 2018-06-25<151> 2018-06-25

<150> 62/648197<150> 62/648197

<151> 26.03.2018<151> 03/26/2018

<160> 20<160> 20

<170> PatentIn, версия 3.5<170> PatentIn, version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 80<211> 80

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 1<400> 1

tgggactcag gttgggtgcg tctgatggag taactgagcc tgggggcttg gggagccaca tgggactcag gttgggtgcg tctgatggag taactgagcc tggggggcttg gggagccaca

60 60

tttggacgag atgcctgaac tttggacgag atgcctgaac

80 80

<210> 2<210> 2

<211> 78<211> 78

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 2<400> 2

taacagagaa tggagaatgg cgatgacttc taccaagcac cggtataact tcgtataagg taacagagaa tggagaatgg cgatgacttc taccaagcac cggtataact tcgtataagg

60 60

tatcctatac gaagttat tatcctatac gaagttat

78 78

<210> 3<210> 3

<211> 88<211> 88

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 3<400> 3

ggcgcgccat aacttcgtat aaggtatcct atacgaagtt atctcgagag gtggcagtca ggcgcgccat aacttcgtat aaggtatcct atacgaagtt atctcgagag gtggcagtca

60 60

tggagatggt ggggtacagg gtgggggc tggagatggt ggggtacagg gtggggggc

88 88

<210> 4<210> 4

<211> 108<211> 108

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 4<400> 4

tctgtgccta gttaacagag aatggagaat ggcgatgact tctaccaagc cgccggcgac tctgtgccta gttaacagag aatggagaat ggcgatgact tctaccaagc cgccggcgac

60 60

tcatcaccaa ggggaagatg ctcaatcatt catgagggat ctgccccc tcatcaccaa ggggaagatg ctcaatcatt catgagggat ctgccccc

108 108

<210> 5<210> 5

<211> 91<211> 91

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 5<400> 5

atgctcttta tcttattaac taaggtgtcg taaccagttc aaagtggaat taccggtata atgctcttta tcttattaac taaggtgtcg taaccagttc aaagtggaat taccggtata

60 60

acttcgtata aggtatccta tacgaagtta t acttcgtata aggtatccta tacgaagtta t

91 91

<210> 6<210> 6

<211> 98<211> 98

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 6<400> 6

ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag gcggccgcag gtggcagtca ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag gcggccgcag gtggcagtca

60 60

tggagatggt ggggtacagg gtgggggcag gggcactc tggagatggt ggggtacagg gtggggggcag gggcactc

98 98

<210> 7<210> 7

<211> 108<211> 108

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 7<400> 7

ttaaatgaat gcaattatct agacttattt cagttgaaca tgctggttgg gcggccgctg ttaaatgaat gcaattatct agacttattt cagttgaaca tgctggttgg gcggccgctg

60 60

gcataagaga aaactcaatc agatagtgct gaagacagga ctgtggag gcataagaga aaactcaatc agatagtgct gaagacagga ctgtggag

108 108

<210> 8<210> 8

<211> 90<211> 90

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 8<400> 8

tctgtgccta gttaacagag aatggagaat ggcgatgact tctaccaagc accggtataa tctgtgccta gttaacagag aatggagaat ggcgatgact tctaccaagc accggtataa

60 60

cttcgtataa ggtatcctat acgaagttat cttcgtataa ggtatcctat acgaagttat

90 90

<210> 9<210> 9

<211> 90<211> 90

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 9<400> 9

ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag aggtggcagt catggagatg ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag aggtggcagt catggagatg

60 60

gtggggtaca gggtgggggc aggggcactc gtggggtaca gggtgggggc aggggcactc

90 90

<210> 10<210> 10

<211> 100<211> 100

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 10<400> 10

aaacaacaag attgtatata tgtgcatcct ggccccattg ttccttatct gggataagca aaacaacaag attgtatata tgtgcatcct ggccccattg ttccttatct gggataagca

60 60

tgctgttttc tgtctgtccc taacatgccc tgtgattatc tgctgttttc tgtctgtccc taacatgccc tgtgattatc

100 100

<210> 11<210> 11

<211> 90<211> 90

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 11<400> 11

tctgttgttt taccaactac tcaatttctc ttataaggga ctaaatatgt accggtataa tctgttgttt taccaactac tcaatttctc ttataaggga ctaaatatgt accggtataa

60 60

cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat

90 90

<210> 12<210> 12

<211> 106<211> 106

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 12<400> 12

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgtcgac ctcgagaatc caccacactt ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgtcgac ctcgagaatc caccacactt

60 60

aaaggataaa taaaaccctc cacttgccct ggttggctgt ccacta aaaggataaa taaaaccctc cacttgccct ggttggctgt cacta

106 106

<210> 13<210> 13

<211> 100<211> 100

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 13<400> 13

ctttctgggt gtctgtcccc ttctctctgg aggatcatgg cacttcagat ctgtcccctc ctttctgggt gtctgtcccc ttctctctgg aggatcatgg cacttcagat ctgtcccctc

60 60

tctctgaatc tgtccccctc cctccataat agattcttct tctctgaatc tgtccccctc cctccataat agattcttct

100 100

<210> 14<210> 14

<211> 135<211> 135

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 14<400> 14

tctccccact gcactggcac agccccgcct tgccgctgct gatccattgc cggtgtgacc tctccccact gcactggcac agccccgcct tgccgctgct gatccattgc cggtgtgacc

60 60

cgggctcgat aactataacg gtcctaaggt agcgactcga gataacttcg tataatgtat cgggctcgat aactataacg gtcctaaggt agcgactcga gataacttcg tataatgtat

120 120

gctatacgaa gttat gctatacgaa gttat

135 135

<210> 15<210> 15

<211> 100<211> 100

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 15<400> 15

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcctagg ttggagctcg tgtgagaggg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcctagg ttggagctcg tgtgagagg

60 60

gagagcagag gtgagtctgt gccatgggat acttgtggcg gagagcagag gtgagtctgt gccatgggat acttgtggcg

100 100

<210> 16<210> 16

<211> 363<211> 363

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полипептид» polypeptide"

<400> 16<400> 16

Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu LeuMet Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu

1 5 10 151 5 10 15

Pro Gln Thr Trp Gly Ser Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His LeuPro Gln Thr Trp Gly Ser Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val SerThr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser

35 40 45 35 40 45

Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg GlyGly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly

50 55 60 50 55 60

Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser TrpGlu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp

65 70 75 8065 70 75 80

Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu PheTyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe

85 90 95 85 90 95

Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu GlnLeu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln

100 105 110 100 105 110

Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro ThrGly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr

115 120 125 115 120 125

Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu LysAla Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys

130 135 140 130 135 140

Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser GlnGln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln

145 150 155 160145 150 155 160

Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe LeuArg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu

165 170 175 165 170 175

Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly ArgLeu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg

180 185 190 180 185 190

Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala ArgGly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg

195 200 205 195 200 205

Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser PhePro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe

210 215 220 210 215 220

Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala AlaTyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala

225 230 235 240225 230 235 240

Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe HisGly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His

245 250 255 245 250 255

Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr CysAla Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys

260 265 270 260 265 270

Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu LeuCys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu

275 280 285 275 280 285

Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val Leu GlyAsp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val Leu Gly

290 295 300 290 295 300

Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu Trp GlyLeu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu Trp Gly

305 310 315 320305 310 315 320

Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser Gly AspArg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser Gly Asp

325 330 335 325 330 335

Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu Ala GluAsp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu Ala Glu

340 345 350 340 345 350

Pro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr SerPro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser

355 360 355 360

<210> 17<210> 17

<211> 104<211> 104

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 17<400> 17

ttttcgaagc catagctctc tggtgcagtt agcacctgaa ggtgcagggg cgatgaagaa ttttcgaagc catagctctc tggtgcagtt agcacctgaa ggtgcagggg cgatgaagaa

60 60

gatggctcct gccatggaat cccctactct actgtgtgta gcct gatggctcct gccatggaat cccctactct actgtgtgta gcct

104 104

<210> 18<210> 18

<211> 90<211> 90

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

олигонуклеотид» oligonucleotide"

<400> 18<400> 18

tcttcttcag cttactaaat atgaactttc agttcttggc agaatcaggg ctcgagataa tcttcttcag cttactaaat atgaactttc agttcttggc agaatcaggg ctcgagataa

60 60

cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat

90 90

<210> 19<210> 19

<211> 122<211> 122

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<221> источник<221> source

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: <223> /note=“Description of the artificial sequence:

СинтетическийSynthetic

полинуклеотид» polynucleotide"

<400> 19<400> 19

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagg taactataac ggtcctaagg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagg taactataac ggtcctaagg

60 60

tagcgagcta gccctcaata gcttctccac tgtcaaaggc cactcatgtg atccctagaa tagcgagcta gccctcaata gcttctccac tgtcaaaggc cactcatgtg atccctagaa

120 120

aa aa

122 122

<210> 20<210> 20

<211> 257<211> 257

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 20<400> 20

Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu LeuMet Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu

1 5 10 151 5 10 15

Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys ValPhe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val

20 25 30 20 25 30

Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val ThrSer Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr

35 40 45 35 40 45

Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys TrpLeu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp

50 55 60 50 55 60

Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn IlePhe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile

65 70 75 8065 70 75 80

Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His GlnVal Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln

85 90 95 85 90 95

Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp TrpGln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp

100 105 110 100 105 110

Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro LeuLeu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu

115 120 125 115 120 125

Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val IlePhe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile

130 135 140 130 135 140

Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His AsnTyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn

145 150 155 160145 150 155 160

Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr CysIle Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys

165 170 175 165 170 175

Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn IleThr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile

180 185 190 180 185 190

Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Phe Phe IleThr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Phe Phe Ile

195 200 205 195 200 205

Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Phe IlePro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Phe Ile

210 215 220 210 215 220

Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile Lys Arg Thr ArgSer Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile Lys Arg Thr Arg

225 230 235 240225 230 235 240

Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn Pro Lys AsnLys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn Pro Lys Asn

245 250 255 245 250 255

AsnAsn

<---<---

Claims (163)

1. Способ использования генетически модифицированной мыши для определения терапевтического эффекта человеческого антитела, включающий введение человеческого антитела мыши, содержащей в своем геноме:1. A method of using a genetically modified mouse to determine the therapeutic effect of a human antibody, including the introduction of a human antibody to a mouse containing in its genome: локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина; и(i) an immunoglobulin heavy chain variable region; And (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую один или более генный сегмент C_H, содержащий:(ii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing one or more _CH gene segments containing: (a) генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG; и/или(a) a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human IgG1 C _H 1 domain, a human IgG1 hinge region, a human IgG1 C _H 2 domain, a human IgG1 C _H 3 domain, an IgG transmembrane domain, and an IgG cytoplasmic domain; and/or (b) генный сегмент C_H , кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG2 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, и, необязательно,(b) a C _H gene segment encoding an IgG constant domain comprising a human IgG4 C _H 1 domain, a human IgG4 hinge region, a human IgG4 C _H 2 domain, a human IgG2 C _H 3 domain, an IgG transmembrane domain, and an IgG cytoplasmic domain, and, not necessary, при этом константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит: генный сегмент С_γ2 человека, генный сегмент С_γ3 человека, генный сегмент С_μ человека или грызуна, генный сегмент С_δ человека или грызуна, генный сегмент С_ε человека или грызуна и/или генный сегмент С_α человека или грызуна,wherein the constant region of the heavy chain of the immunoglobulin additionally contains: human C _γ2 gene segment, human C _γ3 gene segment, human or rodent C _μ gene segment, human or rodent C _δ gene segment, human or rodent C _ε gene segment and/or gene segment From _α human or rodent, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, и константные домены тяжелой цепи, полученные из одного или более генных сегментов C_H,wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region to produce in a mouse IgG antibodies containing variable domains derived from the immunoglobulin heavy chain variable region and heavy chain constant domains derived from one or more C _H gene segments, причем вводимое человеческое антитело содержит домен С_Н1 человека, домен С_Н2 человека и домен С_Н3 человека изотипа человека, который присущ константной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши; иwherein the administered human antibody contains a human C _H 1 domain, a human C _H 2 domain and a human C _H 3 domain of the human isotype, which is inherent in the mouse immunoglobulin heavy chain constant region; And определение терапевтической эффективности введенного человеческого антитела.determining the therapeutic effectiveness of the administered human antibody. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG, кодируемый одним или более генными сегментами C_H, представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна или человека.2. The method according to claim 1, characterized in that the transmembrane domain of the IgG encoded by one or more gene segments of _CH is a transmembrane domain of a rodent or human IgG. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG, кодируемый одним или более генными сегментами C_H, представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна или человека.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the cytoplasmic domain of IgG encoded by one or more _CH gene segments is a cytoplasmic domain of rodent or human IgG. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что4. Method according to claim 1, characterized in that (a) домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05;(a) the IgG1 domain is encoded by an allele selected from IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 and IGHG1*05; (b) домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04;(b) the IgG4 domain is encoded by an allele selected from IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 and IGHG4*04; (c) генный сегмент С_γ2 представляет собой аллель, выбранный из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06;(c) the _γ2 gene segment C is an allele selected from IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 and IGHG2*06; (с) генный сегмент С_γ3 представляет собой аллель, выбранный из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19,(c) gene segment C _γ3 is an allele selected from IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3 *10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 and IGHG3*19, и при этом константный домен тяжелой цепи человеческого антитела кодируется той же аллелью.and wherein the heavy chain constant domain of the human antibody is encoded by the same allele. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что5. Method according to claim 1, characterized in that (a) один из генных сегментов C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a или C_γ2c и, необязательно, замещает эндогенный генный сегмент С_γ2а или С_γ2с;(a) one of the C _H gene segments is located at the locus of an endogenous C _γ2a or C _γ2c gene segment and optionally replaces an endogenous C _γ2a or C _γ2c gene segment; (b) один из генных сегментов C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1 и, необязательно, замещает эндогенный генный сегмент C_γ1;(b) one of the C _H gene segments is located at the endogenous C _γ1 gene segment locus and optionally replaces the endogenous C _γ1 gene segment; (c) один из генных сегментов C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ3 и, необязательно, замещает эндогенный генный сегмент C_γ3; и/или(c) one of the C _H gene segments is located at the endogenous C _γ3 gene segment locus and optionally replaces the endogenous C _γ3 gene segment; and/or (d) один из генных сегментов C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b и, необязательно, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2b.(d) one of the C _H gene segments is located at the endogenous C _γ2b gene segment locus and optionally replaces the endogenous C _γ2b gene segment. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент С_μ человека, генный сегмент С_δ человека, генный сегмент С_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.6. The method according to claim 1, characterized in that the immunoglobulin heavy chain constant region contains a human _Cμ gene segment, a human _Cδ gene segment, a human _Cγ3 gene segment and a human _Cγ1 gene segment. 7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент С_γ2 человека и генный сегмент С_γ4 человека.7. The method according to claim 6, characterized in that the immunoglobulin heavy chain constant region further comprises a human C _γ2 gene segment and a human C _γ4 gene segment. 8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) грызуна или человека и/или 3' регуляторную область (3' РО) грызуна или человека.8. The method according to any of the previous claims, characterized in that the immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent or human intronic enhancer (E _i ) and/or a rodent or human 3' regulatory region (3' RO). 9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ грызуна или человека, сайт переключения S_γ3 грызуна или человека, сайт переключения S_γ1 грызуна или человека, сайт переключения S_γ2b грызуна, сайт переключения S_γ2a грызуна, сайт переключения S_γ2c грызуна, сайт переключения S_γ2 человека, сайт переключения S_γ4 человека, сайт переключения S_ε грызуна или человека и/или сайт переключения S_α грызуна или человека.9. The method according to any of the previous claims, characterized in that the immunoglobulin heavy chain locus further comprises a rodent or human S _μ switch site, a rodent or human S _γ3 switch site, a rodent or human S γ1 switch site, a rodent or S _γ2b switch site, a rodent or human S _γ1 switch site, rodent S _γ2a switch site, rodent S _γ2c switch site, human S _γ2 switch site, human S _γ4 switch site, rodent or human S _ε switch site, and/or rodent or human S _α switch site. 10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна, необязательно, при этом генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты мыши.10. The method according to any of the previous claims, characterized in that the variable region of the immunoglobulin heavy chain comprises a rodent V _H gene segment, a rodent D _H gene segment and a rodent J _H gene segment, optionally, wherein the rodent V _H gene segment, D gene segment Rodent _H and rodent J _H gene segments are endogenous mouse gene segments. 11. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека.11. Method according to any one of paragraphs. 1-9, characterized in that the variable region of the immunoglobulin heavy chain contains a human V _H gene segment, a human D _H gene segment and a human J _H gene segment. 12. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, необязательно, при этом локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.12. The method of any of the preceding claims, wherein the immunoglobulin heavy chain locus is located at an endogenous immunoglobulin heavy chain locus, optionally wherein the immunoglobulin heavy chain locus replaces all or part of the endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:13. The method according to claim 1, characterized in that the genetically modified mouse contains in its genome: эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:endogenous immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;(i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;(ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:(iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) генный сегмент С_μ грызуна;(a) rodent _Cμ gene segment; (b) генный сегмент С_δ грызуна;(b) rodent _Cδ gene segment; (c) генный сегмент С_γ3 грызуна;(c) rodent _γ3 gene segment C; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна;(d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) генный сегмент С_γ2b грызуна;(e) rodent _γ2b gene segment C; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна;(f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of rodent IgG2a, and the cytoplasmic domain of rodent IgG2a; (g) генный сегмент С_ε грызуна; и(g) rodent _Cε gene segment; And (h) генный сегмент С_α грызуна; и(h) rodent C _α gene segment; And (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,(iv) rodent 3' regulatory region (3' RO), причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region to produce in a mouse IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment, and heavy chain constant domains, derived from a modified _CH gene segment. 14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:14. The method according to claim 1, characterized in that the genetically modified mouse contains in its genome: эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:endogenous immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;(i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;(ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:(iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) генный сегмент С_μ грызуна;(a) rodent _Cμ gene segment; (b) генный сегмент C_δ грызуна;(b) rodent _Cδ gene segment; (c) генный сегмент С_γ3 грызуна;(c) rodent _γ3 gene segment C; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна;(d) rodent _Cγ1 gene segment; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна;(e) rodent C _γ2b gene segment; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека;(f) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG1, the hinge region of human IgG1, the C _H 2 domain of human IgG1, the C _H 3 domain of human IgG1, the transmembrane domain of human IgG1, and the cytoplasmic domain of human IgG1; (g) генный сегмент С_ε грызуна; и(g) rodent _Cε gene segment; And (h) генный сегмент С_α грызуна; и(h) rodent _Cα gene segment; And (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,(iv) rodent 3' regulatory region (3' RO), причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region to produce in a mouse IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment, and heavy chain constant domains, derived from a modified _CH gene segment. 15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в геноме:15. The method according to claim 1, characterized in that the genetically modified mouse contains in its genome: эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:endogenous immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;(i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;(ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:(iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) генный сегмент С_μ грызуна;(a) rodent _Cμ gene segment; (b) генный сегмент С_δ грызуна;(b) rodent _Cδ gene segment; (c) генный сегмент С_γ3 грызуна;(c) rodent _γ3 gene segment C; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна;(d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of rodent IgG1, and the cytoplasmic domain of rodent IgG1; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна;(e) rodent C _γ2b gene segment; (f) генный сегмент С_γ2а и/или С_γ2с грызуна;(f) rodent C _γ2a and/or C _γ2c gene segment; (g) генный сегмент С_ε грызуна; и(g) rodent _Cε gene segment; And (h) генный сегмент С_α грызуна; и(h) rodent C _α gene segment; And (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,(iv) rodent 3' regulatory region (3' RO), причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region to produce in a mouse IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment, and heavy chain constant domains, derived from a modified _CH gene segment. 16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:16. The method according to claim 1, characterized in that the genetically modified mouse contains in its genome: эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:endogenous immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;(i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;(ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:(iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) генный сегмент С_μ грызуна;(a) rodent _Cμ gene segment; (b) генный сегмент С_δ грызуна;(b) rodent _Cδ gene segment; (c) генный сегмент С_γ3 грызуна;(c) rodent _γ3 gene segment C; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека;(d) a modified C _H gene segment encoding the C _H 1 domain of human IgG4, the hinge region of human IgG4, the C _H 2 domain of human IgG4, the C _H 3 domain of human IgG4, the transmembrane domain of human IgG4, and the cytoplasmic domain of human IgG4; (e) генный сегмент С_γ2b грызуна;(e) rodent _γ2b gene segment C; (f) генный сегмент С_γ2а и/или С_γ2с грызуна;(f) rodent C _γ2a and/or C _γ2c gene segment; (g) генный сегмент С_ε грызуна; и(g) rodent _Cε gene segment; And (h) генный сегмент С_α грызуна; и(h) rodent _Cα gene segment; And (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,(iv) rodent 3' regulatory region (3' RO), причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region to produce in a mouse IgG antibodies containing variable domains derived from a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment, and heavy chain constant domains, derived from a modified _CH gene segment. 17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:17. The method according to claim 1, characterized in that the genetically modified mouse contains in its genome: эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:endogenous immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;(i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment; (ii) интронный энхансер (E_i) человека;(ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:(iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) генный сегмент С_μ человека;(a) human _Cμ gene segment; (b) генный сегмент С_δ человека;(b) human _Cδ gene segment; (c) генный сегмент С_γ3 человека; и(c) human _γ3 C gene segment; And (d) генный сегмент C_γ1 человека; и(d) human _Cγ1 gene segment; And (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,(iv) rodent 3' regulatory region (3' RO), причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих полностью человеческую тяжелую цепь.wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region to produce IgG antibodies containing a fully human heavy chain in the mouse. 18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:18. The method according to claim 1, characterized in that the genetically modified mouse contains in its genome: эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:endogenous immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;(i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a human _VH gene segment, a human _DH gene segment and a human _JH gene segment; (ii) интронный энхансер (E_i) человека;(ii) human intronic enhancer (E _i ); (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:(iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) генный сегмент С_μ человека;(a) human _Cμ gene segment; (b) генный сегмент С_δ человека;(b) human _Cδ gene segment; (c) генный сегмент С_γ3 человека;(c) human _γ3 C gene segment; (d) генный сегмент C_γ1 человека;(d) human _Cγ1 gene segment; (e) генный сегмент С_γ2 человека; и(e) human _γ2 C gene segment; And (f) генный сегмент С_γ4 человека; и(f) human _γ4 C gene segment; And (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,(iv) rodent 3' regulatory region (3' RO), причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих полностью человеческую тяжелую цепь.wherein the immunoglobulin heavy chain variable region is operably linked to the immunoglobulin heavy chain constant region to produce IgG antibodies containing a fully human heavy chain in the mouse. 19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:19. The method according to claim 1, characterized in that the genetically modified mouse contains in its genome: эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:endogenous immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна;(i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a rodent _VH gene segment, a rodent _DH gene segment and a rodent _JH gene segment; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;(ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:(iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) генный сегмент С_μ человека;(a) human _Cμ gene segment; (b) генный сегмент С_δ человека;(b) human _Cδ gene segment; (c) генный сегмент С_γ3 человека; и(c) human _γ3 C gene segment; And (d) генный сегмент C_γ1 человека; и(d) human _Cγ1 gene segment; And (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,(iv) rodent 3' regulatory region (3' RO), причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.wherein the variable region of the immunoglobulin heavy chain is operably linked to the constant region of the immunoglobulin heavy chain to produce in a mouse an IgG antibody containing a heavy chain containing a rodent variable domain and a human constant domain. 20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:20. The method according to claim 1, characterized in that the genetically modified mouse contains in its genome: эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:endogenous immunoglobulin heavy chain locus, which contains: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна;(i) an immunoglobulin heavy chain variable region comprising a rodent _VH gene segment, a rodent _DH gene segment and a rodent _JH gene segment; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;(ii) rodent intronic enhancer (E _i ); (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:(iii) an immunoglobulin heavy chain constant region containing: (a) генный сегмент С_μ человека;(a) human _Cμ gene segment; (b) генный сегмент С_δ человека;(b) human _Cδ gene segment; (c) генный сегмент С_γ3 человека;(c) human _γ3 C gene segment; (d) генный сегмент C_γ1 человека;(d) human _Cγ1 gene segment; (e) генный сегмент С_γ2 человека; и(e) human _γ2 C gene segment; And (f) генный сегмент С_γ4 человека; и(f) human _γ4 C gene segment; And (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,(iv) rodent 3' regulatory region (3' RO), причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.wherein the variable region of the immunoglobulin heavy chain is operably linked to the constant region of the immunoglobulin heavy chain to produce in a mouse an IgG antibody containing a heavy chain containing a rodent variable domain and a human constant domain. 21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь дополнительно содержит в своем геноме:21. Method according to any one of paragraphs. 1-20, characterized in that the genetically modified mouse additionally contains in its genome: локус цепи каппа (κ) иммуноглобулина, который содержит:The immunoglobulin kappa (κ) chain locus, which contains: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_κ человека и генный сегмент J_κ человека; и(1) an immunoglobulin κ chain variable region comprising a human _κ V gene segment and a human _κ J gene segment; And (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент С_κ человека,(2) an immunoglobulin κ chain constant region containing the human _κ C gene segment, причем вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител, содержащих вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента С_κ человека,wherein the immunoglobulin κ chain variable region is operably linked to the immunoglobulin κ chain constant region for production in a mouse of antibodies containing light chain variable domains derived from the human _κ gene segment V and the human _κ gene segment J, and light chain constant domains derived from the C gene segment _κ person, при этом тестируемое человеческое антитело содержит легкую цепь κ.wherein the human antibody tested contains a κ light chain. 22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина, и, необязательно, при этом локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина.22. The method of claim 21, wherein the immunoglobulin κ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin κ chain locus, and optionally, the immunoglobulin κ chain locus replaces all or part of the endogenous immunoglobulin κ chain locus. 23. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь дополнительно содержит в своем геноме:23. Method according to any one of paragraphs. 1-20, characterized in that the genetically modified mouse additionally contains in its genome: локус цепи лямбда (λ) иммуноглобулина, который содержит:The immunoglobulin lambda (λ) chain locus, which contains: генный сегмент V_λ человека, генный сегмент J_λ человека и генный сегмент С_λ человека,human V _λ gene segment, human J _λ gene segment and human C _λ gene segment, причем генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом С_λ человека для вырабатывания мышью антител, содержащих вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента С_λ человека,wherein the human V _λ gene segment and the human J _λ gene segment are operably linked to the human C _λ gene segment to produce in a mouse antibodies containing light chain variable domains derived from the human V _λ gene segment and the human J _λ gene segment, and light chain constant domains , obtained from the human C _λ gene segment, при этом тестируемое человеческое антитело содержит легкую цепь λ.wherein the human antibody tested contains the λ light chain. 24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина, и, необязательно, при этом локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина.24. The method of claim 23, wherein the immunoglobulin λ chain locus is located at an endogenous immunoglobulin λ chain locus, and optionally, the immunoglobulin λ chain locus replaces all or part of the endogenous immunoglobulin λ chain locus. 25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь дополнительно содержит в своем геноме:25. Method according to any one of paragraphs. 1-24, characterized in that the genetically modified mouse additionally contains in its genome: (a) локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека или грызуна и цитоплазматический домен человека или грызуна, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна;(a) a neonatal Fc receptor (FcRn) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcRn polypeptide comprising a human extracellular domain, a human or rodent transmembrane domain, and a human or rodent cytoplasmic domain, optionally, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcRn polypeptide, located in the endogenous rodent FcRn locus; (b) локус β-2-микроглобулина (β2М), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2М), необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2М, расположена в эндогенном локусе β2М грызуна;(b) a β-2-microglobulin (β2M) locus comprising a nucleic acid sequence encoding a human or humanized β-2-microglobulin (β2M) polypeptide, optionally wherein the nucleic acid sequence encoding a human or humanized β2M polypeptide is located in an endogenous rodent β2M locus; (c) локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека или грызуна и цитоплазматический домен человека или грызуна, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна;(c) an Fc epsilon receptor 1 alpha (FcεR1α) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcεR1α polypeptide comprising a human extracellular domain, a human or rodent transmembrane domain, and a human or rodent cytoplasmic domain, optionally, wherein the nucleic acid sequence encoding FcεR1α polypeptide, located in the endogenous rodent FcεR1α locus; (d) локус Fc-гамма-рецептора 1а (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека или грызуна и цитоплазматический домен человека или грызуна, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна;(d) an Fc gamma receptor 1a (FcγR1a) locus comprising a nucleic acid sequence encoding an FcγR1a polypeptide comprising a human extracellular domain, a human or rodent transmembrane domain, and a human or rodent cytoplasmic domain, optionally, the nucleic acid sequence encoding the polypeptide FcγR1a, located in the endogenous rodent FcγR1a locus; (e) локус Fc-гамма-рецептора 2а (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2a человека, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a, расположена в эндогенном локусе FcγR2a грызуна;(e) an Fc gamma receptor 2a (FcγR2a) locus, optionally comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2a polypeptide, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2a polypeptide is located in an endogenous rodent FcγR2a locus; (f) локус Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3a человека, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна;(f) an Fc gamma receptor 3a (FcγR3a) locus, optionally comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR3a polypeptide, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR3a polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus; (g) локус Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3b человека, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна; и/или(g) an Fc gamma receptor 3b (FcγR3b) locus, optionally comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR3b polypeptide, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR3b polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus; and/or (h) локус Fc-гамма-рецептора 2с (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2c человека, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.(h) an Fc gamma receptor 2c (FcγR2c) locus, optionally comprising a nucleic acid sequence encoding a human FcγR2c polypeptide, wherein the nucleic acid sequence encoding the FcγR2c polypeptide is located at an endogenous low-affinity rodent FcγR locus. 26. Способ по любому из пп. 1-25, дополнительно включающий определение одного или более фармакокинетических свойств вводимого человеческого антитела.26. Method according to any one of paragraphs. 1-25, further comprising determining one or more pharmacokinetic properties of the administered human antibody. 27. Способ по любому из пп. 1-25, дополнительно включающий введение некоторого количества доз человеческого антитела и определение терапевтической эффективности, безопасности и/или переносимости каждой дозы человеческого антитела.27. Method according to any one of paragraphs. 1-25, further comprising administering a number of doses of a human antibody and determining the therapeutic efficacy, safety and/or tolerability of each dose of the human antibody. 28. Способ по любому из пп. 1-25, дополнительно включающий определение иммунного ответа, вырабатываемого мышью против человеческого антитела.28. Method according to any one of paragraphs. 1-25, further comprising determining an immune response produced by a mouse against a human antibody.