RU2805085C2 - Target genes for targeted impact on nitrogen fixation to improve plant quality - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and agriculture and is a genetically engineered diazotrophic bacterium capable of increasing the amount of atmospheric nitrogen in a plant, having increased rpoN expression, and rpoN expression is increased by deleting the native rpoN promoter and replacing it with a constitutive promoter.

EFFECT: invention allows to increase the amount of nitrogen obtained from the atmosphere in a plant by bringing the plant into contact with a plurality of the said genetically engineered diazotrophic bacteria.

21 cl, 41 dwg, 8 tbl, 28 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКАCROSS REFERENCE

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/577149, поданной 25 октября 2017 г., полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки. [0001] This application claims benefit from U.S. Provisional Patent Application No. 62/577149, filed October 25, 2017, which is incorporated herein by reference in its entirety.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[0002] Растения связаны с микробиомом посредством общего метаболома. Многоплановая связь между определенным качеством сельскохозяйственной культуры и соответствующим метаболомом характеризуется ландшафтом с множеством локальных максимумов. Оптимизация от более низкого локального максимума до другого, представляющего собой лучшее качество, путем изменения влияния микробиома на метаболом может быть желательна по ряду причин, например, для оптимизации сельскохозяйственной культуры. Для удовлетворения потребностей растущего мирового населения необходимы экономически, экологически и социально рациональные подходы к сельскому хозяйству и производству продуктов питания. Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН прогнозирует, что к 2050 году совокупное производство продуктов питания должно возрасти на 70% для удовлетворения потребностей растущего населения - задача, сложность которой усугубляется множеством факторов, в том числе сокращением ресурсов пресной воды, усилением конкуренции за пахотные земли, ростом цен на энергоносители, растущими затратами на сырье и вероятной потребностью к адаптации сельскохозяйственных культур к воздействиям более сухого, жаркого и экстремального глобального климата. [0002] Plants are connected to the microbiome through a shared metabolome. The multidimensional relationship between a given crop quality and the corresponding metabolome is characterized by a landscape with many local maxima. Optimization from a lower local maximum to another representing better quality by changing the influence of the microbiome on the metabolome may be desirable for a number of reasons, such as crop optimization. Meeting the needs of a growing global population requires economically, environmentally and socially sustainable approaches to agriculture and food production. The UN's Food and Agriculture Organization predicts that total food production will need to increase by 70% by 2050 to meet the needs of a growing population - a challenge compounded by multiple factors, including dwindling freshwater resources, increased competition for arable land, and rising prices. on energy, rising raw material costs and the likely need for crops to adapt to the impacts of a drier, hotter and more extreme global climate.

[0003] Одной из областей, представляющих интерес, является улучшение азотфиксации. Газообразный азот (N₂) является основным компонентом атмосферы Земли. Кроме того, элементарный азот (N) является важным компонентом многих химических соединений, из которых состоят живые организмы. Однако многие организмы не могут непосредственно использовать N₂ для синтеза химических веществ, используемых в физиологических процессах, таких как рост и размножение. Для использования N₂ должен быть объединен с водородом. Объединение водорода с N₂ называют азотфиксацией. Азотфиксация, независимо от того, осуществляется она химически или биологически, требует больших затрат энергии. В биологических системах фермент, известный как нитрогеназа, катализирует реакцию, которая приводит к азотфиксации. Важной целью исследования азотфиксации является распространение этого фенотипа на небобовые растения, особенно на такие важные в сельском хозяйстве злаковые, как пшеница, рис и кукуруза. Несмотря на огромный прогресс в понимании развития азотфиксирующего симбиоза между клубеньковыми бактериями и бобовыми, путь к использованию этих знаний для индукции азотфиксирующих клубеньков на небобовых сельскохозяйственных культурах остается неясным. Между тем проблема обеспечения достаточного объема дополнительных источников азота, таких как удобрения, будет по-прежнему расти с ростом потребности в увеличении производства продуктов питания. [0003] One area of interest is improving nitrogen fixation. Nitrogen gas (N ₂ ) is the main component of the Earth's atmosphere. In addition, elemental nitrogen (N) is an important component of many chemical compounds that make up living organisms. However, many organisms cannot directly use _N2 to synthesize chemicals used in physiological processes such as growth and reproduction. To be used _{, N2} must be combined with hydrogen. The combination of hydrogen with _N2 is called nitrogen fixation. Nitrogen fixation, regardless of whether it is carried out chemically or biologically, requires large amounts of energy. In biological systems, an enzyme known as nitrogenase catalyzes the reaction that leads to nitrogen fixation. An important goal of nitrogen fixation research is to extend this phenotype to non-legume plants, especially the agriculturally important cereals such as wheat, rice and corn. Despite enormous progress in understanding the development of nitrogen-fixing symbiosis between nodule bacteria and legumes, the path to using this knowledge to induce nitrogen-fixing nodules on non-legume crops remains unclear. Meanwhile, the challenge of ensuring sufficient supply of additional nitrogen sources, such as fertilizers, will continue to grow with the growing need for increased food production.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0004] Настоящее изобретение относится к генетически сконструированной бактерии, содержащей модификацию в glnD, где указанная модификация выбрана из группы, состоящей из делеции всего гена, делеции по существу всего гена, делеции домена ACT, делеции более 50% домена ACT, инактивации домена ACT и инактивации домена UTase. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в glnA, приводящую к изменению экспрессии или активности glnA. В некоторых вариантах осуществления указанная модификация приводит к снижению экспрессии glnA. В некоторых вариантах осуществления указанная модификация включает замену нативного промотора glnA промотором с более низкой активностью. В некоторых вариантах осуществления указанная модификация включает замену нативного промотора glnA промотором, выбранным из группы, состоящей из промотора glnB, промотора glnD и промотора glnE. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в glnA, приводящую к снижению экспрессии или активности glnA.[0004] The present invention relates to a genetically engineered bacterium containing a modification in glnD, wherein said modification is selected from the group consisting of deletion of the entire gene, deletion of substantially the entire gene, deletion of the ACT domain, deletion of more than 50% of the ACT domain, inactivation of the ACT domain, and inactivation of the UTase domain. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification in glnA resulting in a change in the expression or activity of glnA. In some embodiments, the modification results in decreased expression of glnA. In some embodiments, the modification includes replacing the native glnA promoter with a promoter with lower activity. In some embodiments, the modification includes replacing the native glnA promoter with a promoter selected from the group consisting of a glnB promoter, a glnD promoter, and a glnE promoter. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification in glnA resulting in decreased expression or activity of glnA.

[0005] Настоящее изобретение относится к генетически сконструированной бактерии, обладающей измененной экспрессией rpoN. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия обладает повышенной экспрессией rpoN. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия обладает повышенной экспрессией rpoN. В некоторых вариантах осуществления предложена генетически сконструированная бактерия по любому из пп. 1-7 формулы изобретения, где указанная генетически сконструированная бактерия представляет собой генетически сконструированную диазотрофную бактерию. В некоторых вариантах осуществления экспрессию rpoN повышают путем делеции нативного промотора rpoN и замены сильным конститутивным промотором. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия является межродовой. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия способна фиксировать атмосферный азот в присутствии экзогенного азота. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в генетической сети азотфиксации. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в NifA. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, которая приводит к повышению экспрессии NifA. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в NifL. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, которая приводит к снижению экспрессии NifL. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в NifH. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, которая приводит к повышению экспрессии NifH. В некоторых вариантах осуществления указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, которая приводит к повышению экспрессии генов кластера Nif. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в генетической сети ассимиляции азота. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в GlnE. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, которая приводит к снижению активности GlnE. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, которая приводит к снижению активности amtB. [0005] The present invention relates to a genetically engineered bacterium having altered expression of rpoN. In some embodiments, the genetically engineered bacterium has increased expression of rpoN. In some embodiments, the genetically engineered bacterium has increased expression of rpoN. In some embodiments, a genetically engineered bacterium according to any one of claims is provided. 1-7 of the claims, where said genetically engineered bacterium is a genetically engineered diazotrophic bacterium. In some embodiments, rpoN expression is increased by deleting the native rpoN promoter and replacing it with a strong constitutive promoter. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is intergeneric. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is capable of fixing atmospheric nitrogen in the presence of exogenous nitrogen. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification in the nitrogen fixation genetic network. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification in NifA. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification that results in increased expression of NifA. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification in NifL. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification that results in decreased expression of NifL. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification in NifH. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification that results in increased expression of NifH. In some embodiments, said genetically engineered bacterium contains a modification that results in increased expression of Nif cluster genes. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification in the nitrogen assimilation genetic network. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification in GlnE. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification that results in decreased GlnE activity. In some embodiments, the genetically engineered bacterium contains a modification that results in decreased amtB activity.

[0006] Настоящее изобретение относится к способу увеличения количества получаемого из атмосферы азота в растении, включающему приведение указанного растения в контакт с множеством указанных генетически сконструированных бактерий, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к семени указанного растения. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к проростку указанного растения. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в составе жидкого препарата. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению после посадки, но до сбора урожая указанного растения. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в качестве подкормки. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в период от одного месяца до восьми месяцев после прорастания. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в период от двух месяцев до восьми месяцев после прорастания. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в период от одного месяца до трех месяцев после прорастания. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в период от трех месяцев до шести месяцев после прорастания. В некоторых вариантах осуществления растение представляет собой растение зерновой культуры. В некоторых вариантах осуществления растение представляет собой растение кукурузы. В некоторых вариантах осуществления растение представляет собой растение риса. В некоторых вариантах осуществления растение представляет собой растение пшеницы. В некоторых вариантах осуществления растение представляет собой растение сои. [0006] The present invention relates to a method of increasing the amount of atmospheric nitrogen in a plant, comprising bringing said plant into contact with a variety of said genetically engineered bacteria described herein. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to a seed of said plant. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to a seedling of said plant. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to the plant in a liquid formulation. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to said plant after planting but before harvesting of said plant. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to the plant as a nutritional supplement. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to the plant between one month and eight months after germination. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to the plant between two months and eight months after germination. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to the plant between one month and three months after germination. In some embodiments, the genetically engineered bacterium is applied to the plant between three months and six months after germination. In some embodiments, the plant is a cereal plant. In some embodiments, the plant is a corn plant. In some embodiments, the plant is a rice plant. In some embodiments, the plant is a wheat plant. In some embodiments, the plant is a soybean plant.

[0007] Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей семя и семени; причем указанное покрытие семени содержит множество указанных генетически сконструированных бактерий, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления семя представляет собой семя зерновой культуры. В некоторых вариантах осуществления семя выбрано из группы, состоящей из семени кукурузы, семени пшеницы, семени риса, семени сои, семени ржи и семени сорго. Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей растение и множество указанных генетически сконструированных бактерий, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления растение представляет собой проросток. В некоторых вариантах осуществления семя представляет собой семя зерновой культуры. В некоторых вариантах осуществления семя выбрано из группы, состоящей из кукурузы, риса, пшеницы, сои, ржи и сорго.[0007] The present invention relates to a composition containing a seed and a seed; wherein said seed coating contains a plurality of said genetically engineered bacteria as described herein. In some embodiments, the seed is a cereal seed. In some embodiments, the seed is selected from the group consisting of corn seed, wheat seed, rice seed, soybean seed, rye seed, and sorghum seed. The present invention relates to a composition containing a plant and a variety of specified genetically engineered bacteria described herein. In some embodiments, the plant is a seedling. In some embodiments, the seed is a cereal seed. In some embodiments, the seed is selected from the group consisting of corn, rice, wheat, soybean, rye, and sorghum.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИINCLUSION BY REFERENCE

[0008] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и по отдельности указаны как включенные посредством ссылки.[0008] All publications, patents and patent applications mentioned in this specification are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication, patent or patent application had been specifically and individually indicated as being incorporated by reference.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS

[0009] Новые признаки изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Более полное понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения будет получено со ссылкой на следующее подробное описание, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы изобретения, и прилагаемые графические материалы, где:[0009] The new features of the invention are set out in detail in the accompanying claims. A more complete understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained with reference to the following detailed description, which sets forth illustrative embodiments employing the principles of the invention and the accompanying drawings, wherein:

[0010] На фигуре 1A-B изображено обогащение и выделение азотфиксирующих бактерий. (A) Чашку со средой Nfb, содержащей агар, использовали для выделения одиночных колоний азотфиксирующих бактерий. (B) Полутвердая среда Nfb с агаром, отлитая в пробирку Балча. Стрелкой обозначена пленка обогащенных азотфиксирующих бактерий. [0010] Figure 1A-B depicts the enrichment and isolation of nitrogen-fixing bacteria. (A) A plate of Nfb medium containing agar was used to isolate single colonies of nitrogen-fixing bacteria. (B) Semisolid Nfb agar medium poured into a Balch tube. The arrow indicates a film of enriched nitrogen-fixing bacteria.

[0011] На фигуре 2 изображен иллюстративный ПЦР-скрининг nifH. В этом скрининге позитивные полосы наблюдались при ~350 п.н. для двух колоний. Нижние полосы представляют собой праймер-димеры.[0011] Figure 2 depicts an exemplary PCR screen for nifH. In this screen, positive bands were observed at ~350 bp. for two colonies. The lower bands represent primer dimers.

[0012] На фигуре 3 изображен пример ПЦР-скрининга колоний из отобранного по CRISPR-Cas мутагенеза. Колонии CI006 подвергали скринингу с использованием праймеров, специфичных для локуса nifL. Продукт ПЦР дикого типа ожидается при ~2,2 тыс. п.н., тогда как мутант ожидается при ~1,1 тыс. п.н. Семь из десяти подвергшихся скринингу колоний однозначно демонстрируют желаемую делецию.[0012] Figure 3 depicts an example of PCR screening of colonies from CRISPR-Cas-selected mutagenesis. CI006 colonies were screened using primers specific for the nifL locus. The wild-type PCR product is expected at ∼2.2 kb, whereas the mutant is expected at ∼1.1 kb. Seven out of ten colonies screened clearly showed the desired deletion.

[0013] На фигурах 4A-D изображены in vitro фенотипы различных штаммов. Активности мутантов штамма CI010 (фигура 4A) и мутантов штамма CI006 (фигура 4B), выращенных в азотфиксирующей среде с добавкой от 0 до 10 мМ глутамина, в анализе восстановления ацетилена (ARA). Активности в ARA дополнительных штаммов показаны на фигуре 4C, а профиль экскреции аммония во времени для двух штаммов показан на фигуре 4D.[0013] Figures 4A-D depict the in vitro phenotypes of the various strains. Activities of strain CI010 mutants (Figure 4A) and strain CI006 mutants (Figure 4B) grown in nitrogen-fixing medium supplemented with 0 to 10 mM glutamine in an acetylene reduction assay (ARA). The ARA activities of additional strains are shown in Figure 4C, and the ammonium excretion profile over time for the two strains is shown in Figure 4D.

[0014] На фигуре 5 показан профиль экспрессии в культуре 9 различных генов в штаммах CI006, участвующих в диазотрофной азотфиксации. Числа представляют собой число каждого транскрипта. Указаны различные условия (0, 1, 10 мМ глутамина и 0%, 10%, 20% N₂ в атмосферном воздухе). [0014] Figure 5 shows the culture expression profile of 9 different genes in CI006 strains involved in diazotrophic nitrogen fixation. The numbers represent the abundance of each transcript. Various conditions are indicated (0, 1, 10 mM glutamine and 0%, 10%, 20% N ₂ in ambient air).

[0015] На фигуре 6 изображена колонизация CI006 корней кукурузы. Проростки кукурузы инокулировали CI006, несущим плазмиду экспрессии RFP. Спустя две недели роста и поддержания плазмиды путем полива подходящим антибиотиком корни собирали и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Наблюдается колонизации межклеточного пространства корня. [0015] Figure 6 depicts CI006 colonization of corn roots. Maize seedlings were inoculated with CI006 carrying the RFP expression plasmid. After two weeks of growth and maintenance of the plasmid by watering with an appropriate antibiotic, roots were harvested and visualized using fluorescence microscopy. Colonization of the intercellular space of the root is observed.

[0016] На фигуре 7 изображен азот, полученный на уровне микроорганизмов в штамме дикого типа (CI050) и оптимизированном (CM002) штамме. [0016] Figure 7 depicts nitrogen produced at the microbial level in the wild type strain (CI050) and the optimized strain (CM002).

[0017] На фигуре 8 показаны условия эксперимента для анализа массы плодов Micro-Tom. [0017] Figure 8 shows the experimental conditions for Micro-Tom fruit weight analysis.

[0018] На фигуре 9 показан скрининг 10 штаммов на предмет увеличения массы плодов растения Micro-Tom. Представлены результаты шести параллельных анализов. Для столбца 3 р=0,07. Для столбца 7 р=0,05.[0018] Figure 9 shows the screening of 10 strains for increased fruit weight of the Micro-Tom plant. Results from six parallel analyzes are presented. For column 3 p=0.07. For column 7 p=0.05.

[0019] На фигурах 10A-C показаны дополнительные результаты для активности в ARA микроорганизмов-кандидатов и соответствующих мутантов-кандидатов, выращенных в азотфиксирующих средах с добавкой от 0 до 10 мМ глутамина.[0019] Figures 10A-C show additional results for the ARA activity of candidate microorganisms and corresponding candidate mutants grown in nitrogen-fixing media supplemented with 0 to 10 mM glutamine.

[0020] На фигуре 11 изображен двойной мутант, который демонстрирует более высокую экскрецию аммиака, чем одиночный мутант, из которого он был получен.[0020] Figure 11 depicts a double mutant that exhibits higher ammonia excretion than the single mutant from which it was derived.

[0021] На фигуре 12 показано значение NDFA, полученное в эксперименте по поглощению газообразного 15N (экстраполированный назад на основании дней воздействия) для измерения NDFA у растений кукурузы в удобренном состоянии.[0021] Figure 12 shows the NDFA value obtained from the 15N gas uptake experiment (extrapolated back based on days of exposure) to measure NDFA in fertilized corn plants.

[0022] На фигуре 13 показано значение NDFA, полученное в эксперименте по поглощению газообразного 15N (экстраполированный назад на основании дней воздействия) для измерения NDFA у растений сетарии в удобренном состоянии.[0022] Figure 13 shows the NDFA value obtained from the 15N gas uptake experiment (extrapolated back based on days of exposure) to measure NDFA in setaria plants in the fertilized state.

[0023] На фигуре 14А показана степень включения газообразного 15N. Растения, инокулированные эволюционировавшим штаммом, показали увеличение включения газообразного 15N по сравнению с неинокулированными растениями.[0023] Figure 14A shows the degree of inclusion of 15N gas. Plants inoculated with the evolved strain showed an increase in 15N gas incorporation compared to non-inoculated plants.

[0024] На фигуре 14В показано, что через 4 недели после посадки до 7% азота в растениях, инокулированных эволюционировавшим штаммом, происходит из фиксируемого микроорганизмами азота.[0024] Figure 14B shows that 4 weeks after planting, up to 7% of the nitrogen in plants inoculated with the evolved strain comes from microbially fixed nitrogen.

[0025] На фигуре 14C показано, что площадь листа (и другие измерения биомассы, данные не показаны) увеличена у растений, инокулированных эволюционировавшим штаммом, по сравнению с ненокулированными или инокулированными диким типом растениями.[0025] Figure 14C shows that leaf area (and other biomass measurements, data not shown) is increased in plants inoculated with the evolved strain compared to unnoculated or wild-type inoculated plants.

[0026] На фигуре 15А изображены эволюционировавшие штаммы, демонстрирующие значительно более высокую продукцию nifH в ткани корня, согласно результатам транскриптомного исследования in planta.[0026] Figure 15A depicts evolved strains showing significantly higher nifH production in root tissue as determined by an in planta transcriptomic study.

[0027] На фигуре 15В показано, что уровень фиксированного азота, обнаруженного в растительной ткани, коррелирует со степенью, в которой это конкретное растение колонизировано штаммом, оптимизированным посредством HoME.[0027] Figure 15B shows that the level of fixed nitrogen found in plant tissue correlates with the extent to which that particular plant is colonized by the HoME optimized strain.

[0028] На фигуре 16А изображена карта структуры почвы для различных полевых почв, испытанных на колонизацию. Почвы, из которых изначально были получены некоторые микроорганизмы, обозначены звездочками.[0028] Figure 16A depicts a soil texture map for various field soils tested for colonization. The soils from which some microorganisms were originally obtained are indicated by asterisks.

[0029] На фигуре 16B показана степень колонизации штамма 1 и штамма 5, которые были протестированы на четырех разных типах почв (кружки). Оба штамма показали относительно устойчивый профиль колонизации на разных типах почв.[0029] Figure 16B shows the colonization rates of strain 1 and strain 5, which were tested on four different soil types (circles). Both strains showed a relatively consistent colonization profile in different soil types.

[0030] На фигуре 16C показана колонизация штамма 1, протестированная в полевых испытаниях в течение периода вегетации. Штамм 1 сохраняется в ткани кукурузы вплоть до 12 недели после посадки и по прошествии этого времени начинает демонстрировать снижение колонизации.[0030] Figure 16C shows the colonization of strain 1 tested in field trials during the growing season. Strain 1 persists in corn tissue up to 12 weeks after planting and after this time begins to show decreased colonization.

[0031] На фигуре 17 изображена схема селекции микроорганизмов в соответствии с вариантами осуществления.[0031] Figure 17 depicts a diagram of microorganism selection in accordance with embodiments.

[0032] На фигуре 18 изображен развернутый вид измерения состава микробиома, как показано на фигуре 17.[0032] Figure 18 depicts an expanded view of the microbiome composition measurement as shown in Figure 17.

[0033] На фигурах 19А и 19В показано повышение нитрогеназной активности и экскреции аммония у мутантов штамма К. sacchari CI006 с модификациями в гене синтеза гликогена glgA.[0033] Figures 19A and 19B show increased nitrogenase activity and ammonium excretion in mutants of the K. sacchari strain CI006 with modifications in the glycogen synthesis gene glgA.

[0034] На фигурах 20А и 20В показано повышение нитрогеназной активности и экскреции аммония у мутантов штамма К. variicola CI137 с модификациями в гене синтеза гликогена glgA по сравнению с родительскими штаммами с идентичными генотипами, но без модификации glgA.[0034] Figures 20A and 20B show increased nitrogenase activity and ammonium excretion in mutants of the K. variicola strain CI137 with modifications in the glycogen synthesis gene glgA compared to parental strains with identical genotypes but without the glgA modification.

[0035] На фигуре 21 проиллюстрирована схема гена glnE, на которой показаны области, соответствующие функциональным доменам белка GlnE. [0035] Figure 21 illustrates a diagram of the glnE gene, showing regions corresponding to the functional domains of the GlnE protein.

[0036] На фигуре 22 показано повышение экскреции аммония в минимальных средах, не содержащих азота, у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями в гене glnD. [0036] Figure 22 shows increased ammonium excretion in minimal nitrogen-free media in K. variicola CI137 mutants with modifications in the glnD gene.

[0037] На фигуре 23 показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма K. sacchari CI006 с модификациями в гене glnD. [0037] Figure 23 shows increased ammonium excretion in mutants of the K. sacchari strain CI006 with modifications in the glnD gene.

[0038] На фигуре 24A показано повышение экскреции аммония в минимальных средах, не содержащих азота, у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями в гене glnK. [0038] Figure 24A shows increased ammonium excretion in minimal nitrogen-free media in K. variicola CI137 mutants with modifications in the glnK gene.

[0039] На фигуре 24B показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями в гене glnA, созданными путем вставки промотора из гена, конститутивно экспрессируемого на низком уровне (glnE, glnD или glnB), в направлении против хода транскрипции, и мутирования старт-кодона ATG в GTG в штамме с мутацией glnE_KO2 в минимальной среде с добавкой 5 мМ глутамина. [0039] Figure 24B shows increased ammonium excretion in mutants of K. variicola strain CI137 with modifications in the glnA gene created by inserting a promoter from a gene constitutively expressed at a low level (glnE, glnD or glnB) upstream of transcription, and mutation of the start codon ATG to GTG in a strain with the glnE_KO2 mutation in minimal medium supplemented with 5 mM glutamine.

[0040] На фигуре 25 показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями в гене glnA, созданными путем вставки промотора из гена, конститутивно экспрессируемого на низком уровне (glnE, glnD или glnB), в направлении против хода транскрипции, и мутирования старт-кодона ATG в GTG в штамме с мутацией glnE_KO2 и ΔnifL::Prm1.2 в минимальной среде с добавкой 5 мМ глутамина. [0040] Figure 25 shows increased ammonium excretion in mutants of K. variicola strain CI137 with modifications in the glnA gene created by inserting a promoter from a gene constitutively expressed at a low level (glnE, glnD or glnB) upstream of transcription, and mutation of the ATG start codon to GTG in a strain with the glnE_KO2 mutation and ΔnifL::Prm1.2 in minimal medium supplemented with 5 mM glutamine.

[0041] На фигуре 26 показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма K. sacchari CI006 с модификациями в гене glnA, созданными путем вставки промотора из гена, конститутивно экспрессируемого на низком уровне (glnE, glnD или glnB), в направлении против хода транскрипции, и мутирования старт-кодона ATG в GTG в штамме с мутацией glnE_KO2 и ΔnifL::Prm1.2 в минимальной среде, не содержащей азота. [0041] Figure 26 shows increased ammonium excretion in mutants of K. sacchari strain CI006 with modifications in the glnA gene created by inserting a promoter from a gene constitutively expressed at a low level (glnE, glnD or glnB) upstream of transcription, and mutation of the ATG start codon to GTG in a strain with the glnE_KO2 mutation and ΔnifL::Prm1.2 in nitrogen-free minimal medium.

[0042] На фигуре 27 показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями оперона, кодирующего GOGAT (glnBD), созданными путем вставки промотора glnD против хода транскрипции от оперона в родительском штамме 137-2084.[0042] Figure 27 shows increased ammonium excretion in mutants of K. variicola strain CI137 with modifications to the GOGAT-encoding operon (glnBD) created by insertion of the glnD promoter upstream of the operon in the parental strain 137-2084.

[0043] На фигуре 28 показано повышение нитрогеназной активности, измеренное с помощью ARA, у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями в опероне, кодирующем GOGAT (glnBD), созданными путем вставки промотора glnD против хода транскрипции от оперона, по сравнению с родительским штаммом 137-2084.[0043] Figure 28 shows the increase in nitrogenase activity, as measured by ARA, in mutants of K. variicola strain CI137 with modifications in the GOGAT-encoding operon (glnBD) created by insertion of the glnD promoter upstream of the operon, compared to the parental strain 137-2084.

[0044] На фигуре 29 показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма K. sacchari CI006 с модификациями в экспрессии фермента глутаминазы glsA2, созданными путем вставки сильного промотора против хода транскрипции от гена glsA2, по сравнению с родительским контролем. [0044] Figure 29 shows increased ammonium excretion in mutants of K. sacchari strain CI006 with modifications in the expression of the glutaminase enzyme glsA2, created by insertion of a strong promoter upstream of the glsA2 gene, compared to the parental control.

[0045] На фигуре 30 показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями в экспрессии фермента глутаминазы glsA2, созданными путем вставки сильного промотора против хода транскрипции от гена glsA2, по сравнению с родительским контролем.[0045] Figure 30 shows increased ammonium excretion in mutants of K. variicola strain CI137 with modifications in the expression of the glutaminase enzyme glsA2, created by insertion of a strong promoter upstream of the glsA2 gene, compared to the parental control.

[0046] На фигуре 31 показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма К. variicola CI137 с модификациями в гене asnB по сравнению с родительским контрольным штаммом. [0046] Figure 31 shows increased ammonium excretion in mutants of the K. variicola strain CI137 with modifications in the asnB gene compared to the parental control strain.

[0047] На фигуре 32 показано повышение нитрогеназной активности у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями rpoN по сравнению с родительским контролем.[0047] Figure 32 shows the increase in nitrogenase activity in mutants of the K. variicola strain CI137 with rpoN modifications compared to the parental control.

[0048] На фигуре 33 показано повышение экскреция азота у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями rpoN по сравнению с родительским контролем. [0048] Figure 33 shows increased nitrogen excretion in K. variicola CI137 mutants with rpoN modifications compared to the parental control.

[0049] На фигуре 34 показано повышение нитрогеназной активности у мутантов штамма K. sacchari CI006 с измененной экспрессией гена otsB по сравнению с родительским контролем.[0049] Figure 34 shows an increase in nitrogenase activity in mutants of the K. sacchari strain CI006 with altered expression of the otsB gene compared to the parental control.

[0050] На фигуре 35 показано повышение экскреции азота у мутантов штамма K. sacchari CI006 с измененной экспрессией гена otsB по сравнению с родительским контролем.[0050] Figure 35 shows increased nitrogen excretion in mutants of the K. sacchari strain CI006 with altered expression of the otsB gene compared to the parental control.

[0051] На фигурах 36А и 36В показана не подвергшаяся изменениям экскреция азота и повышенная колонизация у мутантов штамма K. variicola CI137 с модификациями в phoB по сравнению с родительским контролем. [0051] Figures 36A and 36B show unaffected nitrogen excretion and increased colonization in K. variicola CI137 mutants with modifications in phoB compared to the parental control.

[0052] На фигуре 37 показано повышение колонизации у мутантов штамма K. sacchari CI006 с модификациями в yjbE по сравнению с родительским контролем.[0052] Figure 37 shows increased colonization in K. sacchari strain CI006 mutants with modifications in yjbE compared to the parental control.

[0053] На фигурах 38A и B показано повышение нитрогеназной активности и экскреции азота у мутантов штамма K. sacchari CI006 с модификациями экспрессии гена транспорта сульфатов otsB, созданными путем вставки промотора непосредственно против хода транскрипции от указанного гена, по сравнению с родительским штаммом. [0053] Figures 38A and B show increased nitrogenase activity and nitrogen excretion in mutants of K. sacchari strain CI006 with modifications in the expression of the sulfate transport gene otsB, created by insertion of a promoter immediately upstream of the gene, compared to the parental strain.

[0054] На фигурах 39А и 39В показано повышение нитрогеназной активности у мутантов штамма K. sacchari CI006 с модификациями экспрессии гена транспорта сульфатов cysZ, созданными путем вставки промотора непосредственно против хода транскрипции от указанного гена, по сравнению с родительским штаммом. [0054] Figures 39A and 39B show increased nitrogenase activity in mutants of K. sacchari strain CI006 with modifications in the expression of the sulfate transport gene cysZ, created by insertion of a promoter immediately upstream of the gene, compared to the parental strain.

[0055] На фигурах 40А и 40В показано повышение экскреции аммония у мутантов штамма К. variicola CI137 с модификациями в dctA1 и dctA2.[0055] Figures 40A and 40B show increased ammonium excretion in mutants of the K. variicola strain CI137 with modifications in dctA1 and dctA2.

На фигурах 41А и 41В проиллюстрировано отношение транскрипта nifH к транскрипту nifA в нескольких штаммах с различными промоторами и последовательностями RBS, вставленными против хода транскрипции от nifA. Figures 41A and 41B illustrate the ratio of the nifH transcript to the nifA transcript in several strains with different promoters and RBS sequences inserted upstream of nifA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0056] Термины «полинуклеотид», «нуклеотид», «нуклеотидная последовательность», «нуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид» используются взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, либо их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: кодирующие или некодирующие области гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенные из анализа сцепления, экзоны, интроны, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомная РНК (рРНК), короткая интерферирующая РНК (киРНК), короткая шпилечная РНК (кшРНК), микроРНК (мкРНК), рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать один или более модифицированных нуклеотидов, таких как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги. Модификация структуры нуклеотида, если она имеет место, может быть внесена до или после сборки полинуклеотида. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с метящим компонентом.[0056] The terms "polynucleotide", "nucleotide", "nucleotide sequence", "nucleic acid" and "oligonucleotide" are used interchangeably. They refer to the polymeric form of nucleotides of any length, either deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or their analogues. Polynucleotides can have any three-dimensional structure and can perform any function, known or unknown. The following are non-limiting examples of polynucleotides: coding or non-coding regions of a gene or gene fragment, loci (locus) determined from linkage analysis, exons, introns, messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), short interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA), ribozymes, cDNAs, recombinant polynucleotides, branched polynucleotides, plasmids, vectors, isolated DNA of any sequence, isolated RNA of any sequence, nucleic acid probes and primers. A polynucleotide may contain one or more modified nucleotides, such as methylated nucleotides and nucleotide analogues. Modification of the nucleotide structure, if any, can be made before or after assembly of the polynucleotide. The nucleotide sequence can be interrupted by non-nucleotide components. The polynucleotide may be further modified after polymerization, for example, by conjugation with a labeling moiety.

[0057] «Гибридизация» относится к реакции, в которой один или более полинуклеотидов реагируют с образованием комплекса, который стабилизируется посредством водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Водородная связь может происходить путем спаривания оснований по Уотсону-Крику, связывания по Хугстину или любым другим специфичным для последовательности образом в соответствии с комплементарностью оснований. Комплекс может содержать две цепи, образующие дуплексную структуру, три или более цепей, образующих многоцепочечный комплекс, одну самогибридизирующуюся цепь или любую их комбинацию. Реакция гибридизации может представлять собой стадию в более широкомасштабном процессе, таком как инициация ПЦР или ферментативное расщепление полинуклеотида эндонуклеазой. Вторая последовательность, которая является комплементарной первой последовательности, называется «комплементом» первой последовательности. Термин «гибридизуемый» применительно к полинуклеотиду относится к способности полинуклеотида образовывать комплекс, который стабилизируется посредством водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков в реакции гибридизации. [0057] "Hybridization" refers to a reaction in which one or more polynucleotides react to form a complex that is stabilized by hydrogen bonds between the bases of the nucleotide residues. Hydrogen bonding can occur by Watson-Crick base pairing, Hoogsteen bonding, or any other sequence-specific manner according to base complementarity. The complex may contain two chains forming a duplex structure, three or more chains forming a multistrand complex, one self-hybridizing chain, or any combination thereof. The hybridization reaction may represent a step in a larger process, such as initiation of PCR or enzymatic cleavage of a polynucleotide by an endonuclease. The second sequence, which is complementary to the first sequence, is called the "complement" of the first sequence. The term "hybridizable" when applied to a polynucleotide refers to the ability of the polynucleotide to form a complex that is stabilized by hydrogen bonding between the bases of nucleotide residues in the hybridization reaction.

[0058] «Комплементарность» относится к способности нуклеиновой кислоты образовывать водородную связь (связи) с другой последовательностью нуклеиновой кислоты либо традиционного типа по Уотсону-Крику, либо других нетрадиционных типов. Процент комплементарности обозначает процент остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (например, спаривание оснований по Уотсону-Крику) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 составляет 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100%, соответственно). «Совершенно комплементарный» означает, что все смежные остатки последовательности нуклеиновой кислоты будут иметь водородную связь с таким же количеством смежных остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. «По существу комплементарный» в контексте настоящего документа относится к степени комплементарности, составляющей по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% в пределах области из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более нуклеотидов, или относится к двум нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в жестких условиях. Идентичность последовательностей, например, для оценки процента комплементарности, может быть измерена с помощью любого подходящего алгоритма выравнивания, включая, не ограничиваясь перечисленным, алгоритм Нидлмана-Вунша (см., например, средство для выравнивания EMBOSS Needle, доступное по адресу www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, необязательно с настройками по умолчанию), алгоритм BLAST (см., например, инструмент для выравнивания BLAST, доступный по адресу blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, необязательно с настройками по умолчанию) или алгоритм Смита-Уотермана (см., например, средство для выравнивания EMBOSS Water, доступное по адресу www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html, необязательно с настройками по умолчанию). Оптимальное выравнивание может быть оценено с использованием любых подходящих параметров выбранного алгоритма, включая параметры по умолчанию. [0058] “Complementarity” refers to the ability of a nucleic acid to form hydrogen bond(s) with another nucleic acid sequence, either of the traditional Watson-Crick type or other non-traditional types. Percent complementarity refers to the percentage of residues in a nucleic acid molecule that can form hydrogen bonds (e.g., Watson-Crick base pairing) with a second nucleic acid sequence (e.g., 5, 6, 7, 8, 9, 10 out of 10 is 50%, 60%, 70%, 80%, 90% and 100%, respectively). “Perfectly complementary” means that all contiguous residues in a nucleic acid sequence will have a hydrogen bond with the same number of contiguous residues in a second nucleic acid sequence. “Substantially complementary” as used herein refers to a degree of complementarity of at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% or 100% within the area of 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 , 50 or more nucleotides, or refers to two nucleic acids that hybridize under stringent conditions. Sequence identity, for example to estimate percent complementarity, can be measured using any suitable alignment algorithm, including, but not limited to, the Needleman-Wunsch algorithm (see, for example, the EMBOSS Needle alignment tool, available at www.ebi.ac .uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, optional with default settings), BLAST algorithm (see for example the BLAST alignment tool available at blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, optional with default settings) or Smith-Waterman algorithm (see for example the EMBOSS Water alignment tool, available at www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html, optional with default settings) . Optimal alignment can be assessed using any appropriate parameters of the selected algorithm, including default parameters.

[0059] В целом «жесткие условия» гибридизации относятся к условиям, при которых нуклеиновая кислота, обладающая комплементарностью целевой последовательности, преимущественно гибридизуется с целевой последовательностью и по существу не гибридизуется с нецелевыми последовательностями. Жесткие условия, как правило, зависят от последовательности и варьируются в зависимости от ряда факторов. Как правило, чем длиннее последовательность, тем выше температура, при которой последовательность специфично гибридизуется с ее целевой последовательностью. Неограничивающие примеры жестких условий подробно описаны в Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes, часть I, вторая глава “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”, Elsevier, N.Y.[0059] In general, “stringent conditions” of hybridization refer to conditions under which a nucleic acid having complementarity to a target sequence preferentially hybridizes to the target sequence and substantially does not hybridize to non-target sequences. Severe conditions are generally sequence dependent and vary depending on a number of factors. In general, the longer the sequence, the higher the temperature at which the sequence specifically hybridizes to its target sequence. Non-limiting examples of stringent conditions are described in detail in Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter Two, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay,” Elsevier, N.Y.

[0060] В целом «идентичность последовательностей» относится к точному соответствию нуклеотидов или аминокислот двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, соответственно. Как правило, способы определения идентичности последовательностей включают определение нуклеотидной последовательности полинуклеотида и/или определение кодируемой ими аминокислотной последовательности и сравнение этих последовательностей со второй нуклеотидной или аминокислотной последовательностью. Две или более последовательностей (полинуклеотидные или аминокислотные) можно сравнивать, определяя их «процент идентичности». Процент идентичности двух последовательностей, будь то последовательности нуклеиновых кислот или аминокислотные последовательности, может быть рассчитан как количество точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, разделенное на длину более коротких последовательностей и умноженное на 100. В некоторых случаях процент идентичности исследуемой последовательности и референсной последовательности, последовательности нуклеиновых кислот или аминокислотные последовательности, может быть рассчитан как число точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, разделенное на длину референсной последовательности и умноженное на 100. Процент идентичности также может быть определен, например, путем сравнения информации о последовательности с использованием усовершенствованной компьютерной программы BLAST, включая версию 2.2.9, доступную от National Institutes of Health. Программа BLAST основана на алгоритме выравнивания Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990) и как обсуждается в Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin And Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); и Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). Вкратце, в программе BLAST идентичность определена как количество идентичных выровненных символов (обычно нуклеотидов или аминокислот), деленное на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Данная программа может быть использована для определения процента идентичности по всей длине сравниваемых белков. Параметры по умолчанию предоставляются для оптимизации поиска с короткими искомыми последовательностями, например, в программе blastp. Программа также позволяет использовать фильтр SEG для маскировки сегментов искомых последовательностей, как определено в программе SEG, описанной Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17: 149-163 (1993). Диапазоны желаемых степеней идентичности последовательностей составляют примерно от 80% до 100%, включая целочисленные значения между ними. Как правило, процент идентичности между раскрытой последовательностью и заявленной последовательностью составляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.[0060] In general, “sequence identity” refers to the exact nucleotide or amino acid match of two polynucleotide or polypeptide sequences, respectively. Typically, methods for determining sequence identity include determining the nucleotide sequence of a polynucleotide and/or determining the amino acid sequence it encodes and comparing these sequences to a second nucleotide or amino acid sequence. Two or more sequences (polynucleotide or amino acid) can be compared by determining their "percentage of identity". The percentage identity of two sequences, whether nucleic acid sequences or amino acid sequences, can be calculated as the number of exact matches between the two aligned sequences divided by the length of the shorter sequences and multiplied by 100. In some cases, the percentage identity of the test sequence and the reference sequence, nucleic acid sequence acids or amino acid sequences, can be calculated as the number of exact matches between two aligned sequences divided by the length of the reference sequence and multiplied by 100. Percent identity can also be determined, for example, by comparing sequence information using the advanced computer program BLAST, including version 2.2.9, available from the National Institutes of Health. The BLAST program is based on the alignment algorithm of Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990) and as discussed in Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin And Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); and Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389–3402 (1997). Briefly, in the BLAST program, identity is defined as the number of identical aligned characters (usually nucleotides or amino acids) divided by the total number of characters in the shorter of two sequences. This program can be used to determine the percent identity across the entire length of proteins being compared. Default parameters are provided to optimize searches with short search sequences, such as in the blastp program. The program also allows the SEG filter to be used to mask segments of search sequences, as defined in the SEG program described by Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17: 149-163 (1993). Ranges of desired degrees of sequence identity are from approximately 80% to 100%, including integer values in between. Typically, the percentage identity between the disclosed sequence and the claimed sequence is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

[0061] В контексте настоящего документа термин «экспрессия» относится к процессу, посредством которого полинуклеотид транскрибируется с ДНК-матрицы (например, в мРНК или другой РНК-транскрипт) и/или процессу, посредством которого транскрибированная мРНК впоследствии транслируется в пептиды, полипептиды или белки. Транскрипты и кодируемые полипептиды могут в совокупности называться «продуктом гена». Если полинуклеотид получен из геномной ДНК, экспрессия может включать сплайсинг мРНК в эукариотической клетке.[0061] As used herein, the term “expression” refers to the process by which a polynucleotide is transcribed from a DNA template (e.g., into mRNA or other RNA transcript) and/or the process by which the transcribed mRNA is subsequently translated into peptides, polypeptides, or proteins. The transcripts and encoded polypeptides may be collectively referred to as the "gene product". If the polynucleotide is derived from genomic DNA, expression may involve splicing of the mRNA in the eukaryotic cell.

[0062] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может прерываться сегментами, отличными от аминокислот. Данные термины также включают полимер аминокислот, который был модифицирован; например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любыми другими манипуляциями, такими как конъюгация с метящим компонентом. В контексте настоящего документа термин «аминокислота» относится к природным и/или неприродным или синтетическим аминокислотам, включая глицин и как оптические D- или L-изомеры, так и аналоги аминокислот и пептидомиметики.[0062] The terms "polypeptide", "peptide" and "protein" are used interchangeably herein to refer to polymers of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, it may contain modified amino acids, and it may be interrupted by segments other than amino acids. These terms also include an amino acid polymer that has been modified; for example, by disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation such as conjugation with a labeling moiety. As used herein, the term “amino acid” refers to natural and/or non-natural or synthetic amino acids, including glycine and both optical D- or L-isomers, amino acid analogues and peptidomimetics.

[0063] В контексте настоящего документа термин «приблизительно» используется в качестве синонима термину «примерно». В качестве иллюстрации, использование термина «приблизительно» применительно к количеству означает, что значения немного выходят за пределы приведенных значений, например, плюс или минус 0,1-10%.[0063] As used herein, the term "about" is used synonymously with the term "about". By way of illustration, the use of the term “about” in relation to quantities means that the values are slightly outside the values given, for example, plus or minus 0.1-10%.

[0064] Термин «биологически чистая культура» или «по существу чистая культура» относится к культуре видов бактерий, описанных в настоящем документе, не содержащей других видов бактерий в количествах, достаточных для того, чтобы препятствовать репликации культуры или быть обнаруженными обычными бактериологическими методами. [0064] The term “biologically pure culture” or “substantially pure culture” refers to a culture of the bacterial species described herein that does not contain other bacterial species in quantities sufficient to interfere with the replication of the culture or to be detected by conventional bacteriological methods.

[0065] «Продуктивность растения» в общем относится к любому аспекту роста или развития растения, который является причиной, по которой растение выращивают. Для пищевых сельскохозяйственных культур, таких как зерновые или овощи, «продуктивность растения» может относиться к урожайности зерна или плодов, собираемых с определенной сельскохозяйственной культуры. В контексте настоящего документа улучшение продуктивности растения в целом относится к улучшению урожайности зерна, плодов, цветов или других частей растения, собираемых для различных целей, улучшению роста частей растения, включая стебли, листья и корни, стимулированию роста растений, поддержанию высокого содержания хлорофилла в листьях, увеличению количества плодов или семян, увеличению массы единицы плода или семени, сокращению выбросов NO₂ из-за сокращения использования азотных удобрений и аналогичным улучшениям в части роста и развития растений. [0065] “Plant productivity” generally refers to any aspect of the growth or development of a plant that is the reason why the plant is grown. For food crops such as grains or vegetables, "plant productivity" may refer to the grain or fruit yield harvested from a particular crop. As used herein, improving plant productivity generally refers to improving the yield of grains, fruits, flowers or other plant parts harvested for various purposes, improving the growth of plant parts including stems, leaves and roots, promoting plant growth, maintaining high chlorophyll content in leaves , increased number of fruits or seeds, increased unit weight of fruit or seeds, reduced NO ₂ emissions due to reduced use of nitrogen fertilizers and similar improvements in plant growth and development.

[0066] Микроорганизмы внутри и вокруг пищевых сельскохозяйственных культур могут влиять на качества этих культур. Качества растений, на которые могут влиять микроорганизмы, включают: урожайность (например, производство зерна, продукция биомассы, развитие плодов, цветение); питание (например, усвоение азота, фосфора, калия, железа, микроэлементов); контроль абиотического стресса (например, засухоустойчивость, солеустойчивость, жароустойчивость); и контроль биотического стресса (например, сельскохозяйственных вредителей, сорных растений, насекомых, грибов и бактерий). Стратегии изменения качеств сельскохозяйственных культур включают: повышение концентрации ключевых метаболитов; изменение временной динамики влияния микроорганизмов на ключевые метаболиты; связывание продукции/разложения метаболитов микроорганизмов с новыми факторами окружающей среды; снижение нежелательных метаболитов; и улучшение баланса метаболитов или исходных белков. [0066] Microorganisms in and around food crops can influence the quality of those crops. Plant qualities that can be influenced by microorganisms include: yield (e.g. grain production, biomass production, fruit development, flowering); nutrition (for example, absorption of nitrogen, phosphorus, potassium, iron, microelements); control of abiotic stress (e.g. drought tolerance, salt tolerance, heat tolerance); and control of biotic stress (eg, pests, weeds, insects, fungi and bacteria). Strategies for changing crop quality include: increasing the concentration of key metabolites; changes in the time dynamics of the influence of microorganisms on key metabolites; linking the production/decomposition of microbial metabolites with new environmental factors; reduction of unwanted metabolites; and improving the balance of metabolites or parent proteins.

[0067] В контексте настоящего документа термин «контрольная последовательность» относится к оператору, промотору, сайленсеру или терминатору.[0067] As used herein, the term “control sequence” refers to an operator, promoter, silencer, or terminator.

[0068] В некоторых вариантах осуществления нативные или эндогенные контрольные последовательности генов согласно настоящему изобретению заменены одной или более внутриродовыми контрольными последовательностями. [0068] In some embodiments, the native or endogenous control sequences of genes according to the present invention are replaced by one or more infrageneric control sequences.

[0069] В контексте настоящего документа термин «введенный» относится к введению посредством современной биотехнологии, а не к введению, произошедшему естественным путем. [0069] As used herein, the term “administered” refers to introduction through modern biotechnology, rather than introduction that occurs naturally.

[0070] В некоторых вариантах осуществления бактерии согласно настоящему изобретению были модифицированы таким образом, что они не являются встречающимися в природе бактериями.[0070] In some embodiments, the bacteria of the present invention have been modified such that they are not naturally occurring bacteria.

[0071] В некоторых вариантах осуществления бактерии согласно настоящему изобретению присутствуют в растении в количестве по меньшей мере 10³ КОЕ, 10⁴ КОЕ, 10⁵ КОЕ, 10⁶ КОЕ, 10⁷ КОЕ, 10⁸ КОЕ, 10⁹ КОЕ, 10¹⁰ КОЕ, 10¹¹ КОЕ или 10¹² КОЕ на грамм сырой или сухой массы растения. В некоторых вариантах осуществления бактерии согласно настоящему изобретению присутствуют в растении в количестве по меньшей мере приблизительно 10³ КОЕ, приблизительно 10⁴ КОЕ, приблизительно 10⁵ КОЕ, приблизительно 10⁶ КОЕ, приблизительно 10⁷ КОЕ, приблизительно 10⁸ КОЕ, приблизительно 10⁹ КОЕ, приблизительно 10¹⁰ КОЕ, приблизительно 10¹¹ КОЕ или приблизительно 10¹² КОЕ на грамм сырой или сухой массы растения. В некоторых вариантах осуществления бактерии согласно настоящему изобретению присутствуют в растении в количестве по меньшей мере от 10³ до 10⁹, от 10³ до 10⁷, от 10³ до 10⁵, от 10⁵ до 10⁹, от 10⁵ до 10⁷, от 10⁶ до 10¹⁰, от 10⁶ до 10⁷ КОЕ на грамм сырой или сухой массы растения.[0071] In some embodiments, the bacteria of the present invention are present in the plant in quantities of at least 10 ³ CFU, 10 ⁴ CFU, 10 ⁵ CFU, 10 ⁶ CFU, 10 ⁷ CFU, 10 ⁸ CFU, 10 ⁹ CFU, 10 ¹⁰ CFU , 10 ¹¹ CFU or 10 ¹² CFU per gram of fresh or dry weight of the plant. In some embodiments, the bacteria of the present invention are present in the plant in an amount of at least about 10 ³ CFU, about 10 ⁴ CFU, about 10 ⁵ CFU, about 10 ⁶ CFU, about 10 ⁷ CFU, about 10 ⁸ CFU, about 10 ⁹ CFU , approximately 10 ¹⁰ CFU, approximately 10 ¹¹ CFU, or approximately 10 ¹² CFU per gram of fresh or dry weight of the plant. In some embodiments, the bacteria of the present invention are present in the plant in an amount of at least 10 ³ to 10 ⁹ , 10 ³ to 10 ⁷ , 10 ³ to 10 ⁵ , 10 ⁵ to 10 ⁹ , 10 ⁵ to 10 ⁷ , from 10 ⁶ to 10 ¹⁰ , from 10 ⁶ to 10 ⁷ CFU per gram of fresh or dry weight of the plant.

[0072] Удобрения и экзогенный азот согласно настоящему изобретению могут содержать следующие азотсодержащие молекулы: аммоний, нитрат, нитрит, аммиак, глутамин и т.д. Источники азота согласно настоящему изобретению могут включать безводный аммиак, сульфат аммония, мочевину, диаммонийфосфат, формальдегидмочевину, моноаммонийфосфат, нитрат аммония, аммиачную воду, нитрат кальция, нитрат калия, нитрат натрия и т.д. [0072] Fertilizers and exogenous nitrogen according to the present invention may contain the following nitrogen-containing molecules: ammonium, nitrate, nitrite, ammonia, glutamine, etc. The nitrogen sources of the present invention may include anhydrous ammonia, ammonium sulfate, urea, diammonium phosphate, formaldehyde urea, monoammonium phosphate, ammonium nitrate, ammonia water, calcium nitrate, potassium nitrate, sodium nitrate, etc.

[0073] В контексте настоящего документа термин «экзогенный азот» относится к неатмосферному азоту, легко доступному в почве, поле или питательной среде, который присутствует в нелимитирующих условиях по азоту, включая аммиак, аммоний, нитрат, нитрит, мочевину, мочевую кислоту, кислый аммоний и т.д.[0073] As used herein, the term "exogenous nitrogen" refers to non-atmospheric nitrogen readily available in soil, field or growing media, which is present under non-limiting nitrogen conditions, including ammonia, ammonium, nitrate, nitrite, urea, uric acid, acid ammonium, etc.

[0074] В контексте настоящего документа термин «нелимитирующие условия по азоту» относится к доступности неатмосферного азота в почве, поле, среде в концентрациях, превышающих приблизительно 4 мМ азота, как описано в источнике Kant et al. (2010). J. Exp. Biol. 62(4):1499-1509), включенном в настоящий документ посредством сслыки. [0074] As used herein, the term “non-limiting nitrogen conditions” refers to the availability of non-atmospheric nitrogen in a soil, field, or environment at concentrations greater than approximately 4 mM nitrogen as described in Kant et al. (2010). J. Exp. Biol. 62(4):1499-1509), incorporated herein by reference.

[0075] В контексте настоящего документа термин «введенный генетический материал» означает генетический материал, который был добавлен в геном реципиента и остается его компонентом. [0075] As used herein, the term “introduced genetic material” means genetic material that has been added to and remains a component of the recipient's genome.

[0076] В некоторых вариантах осуществления генетическая регуляторная сеть фиксации и ассимиляции азота включает полинуклеотиды, кодирующие гены, и некодирующие последовательности, которые направляют, модулируют и/или регулируют фиксацию и/или ассимиляцию азота микроорганизмом и могут содержать полинуклеотидные последовательности кластера nif (например, nifA, nifB, nifC,…….nifZ), полинуклеотиды, кодирующие регуляторный белок C азота, полинуклеотиды, кодирующие регуляторный белок B азота, полинуклеотидные последовательности кластера gln (например, glnA и glnD), draT и транспортеры/пермеазы аммиака. В некоторых случаях кластер Nif может включать NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa и NifV. В некоторых случаях кластер Nif может содержать часть из NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa и NifV.[0076] In some embodiments, the genetic regulatory network for nitrogen fixation and assimilation includes polynucleotides encoding genes and non-coding sequences that direct, modulate, and/or regulate nitrogen fixation and/or assimilation by a microorganism and may comprise nif cluster polynucleotide sequences (e.g., nifA , nifB, nifC,…….nifZ), polynucleotides encoding nitrogen regulatory protein C, polynucleotides encoding nitrogen regulatory protein B, gln cluster polynucleotide sequences (eg, glnA and glnD), draT and ammonia transporters/permeases. In some cases, the Nif cluster may include NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa, and NifV. In some cases, the Nif cluster may contain part of NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa and NifV.

[0077] В некоторых вариантах осуществления удобрение согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 5 масс. %, 6 масс. %, 7 масс. %, 8 масс. %, 9 масс. %, 10 масс. %, 11 масс. %, 12 масс. %, 13 масс. %, 14 масс. %, 15 масс. %, 16 масс. %, 17 масс. %, 18 масс. %, 19 масс. %, 20 масс. %, 21 масс. %, 22 масс. %, 23 масс. %, 24 масс. %, 25 масс. %, 26 масс. %, 27 масс. %, 28 масс. %, 29 масс. %, 30 масс. %, 31 масс. %, 32 масс. %, 33 масс. %, 34 масс. %, 35 масс. %, 36 масс. %, 37 масс. %, 38 масс. %, 39 масс. %, 40 масс. %, 41 масс. %, 42 масс. %, 43 масс. %, 44 масс. %, 45 масс. %, 46 масс. %, 47 масс. %, 48 масс. %, 49 масс. %, 50 масс. %, 51 масс. %, 52 масс. %, 53 масс. %, 54 масс. %, 55 масс. %, 56 масс. %, 57 масс. %, 58 масс. %, 59 масс. %, 60 масс. %, 61 масс. %, 62 масс. %, 63 масс. %, 64 масс. %, 65 масс. %, 66 масс. %, 67 масс. %, 68 масс. %, 69 масс. %, 70 масс. %, 71 масс. %, 72 масс. %, 73 масс. %, 74 масс. %, 75 масс. %, 76 масс. %, 77 масс. %, 78 масс. %, 79 масс. %, 80 масс. %, 81 масс. %, 82 масс. %, 83 масс. %, 84 масс. %, 85 масс. %, 86 масс. %, 87 масс. %, 88 масс. %, 89 масс. %, 90 масс. %, 91 масс. %, 92 масс. %, 93 масс. %, 94 масс. %, 95 масс. %, 96 масс. %, 97 масс. %, 98 масс. %, 99 масс. % азота.[0077] In some embodiments, the fertilizer according to the present invention contains at least 5 wt. %, 6 wt. %, 7 wt. %, 8 wt. %, 9 wt. %, 10 wt. %, 11 wt. %, 12 wt. %, 13 wt. %, 14 wt. %, 15 wt. %, 16 wt. %, 17 wt. %, 18 wt. %, 19 wt. %, 20 wt. %, 21 wt. %, 22 wt. %, 23 wt. %, 24 wt. %, 25 wt. %, 26 wt. %, 27 wt. %, 28 wt. %, 29 wt. %, 30 wt. %, 31 wt. %, 32 wt. %, 33 wt. %, 34 wt. %, 35 wt. %, 36 wt. %, 37 wt. %, 38 wt. %, 39 wt. %, 40 wt. %, 41 wt. %, 42 wt. %, 43 wt. %, 44 wt. %, 45 wt. %, 46 wt. %, 47 wt. %, 48 wt. %, 49 wt. %, 50 wt. %, 51 wt. %, 52 wt. %, 53 wt. %, 54 wt. %, 55 wt. %, 56 wt. %, 57 wt. %, 58 wt. %, 59 wt. %, 60 wt. %, 61 wt. %, 62 wt. %, 63 wt. %, 64 wt. %, 65 wt. %, 66 wt. %, 67 wt. %, 68 wt. %, 69 wt. %, 70 wt. %, 71 wt. %, 72 wt. %, 73 wt. %, 74 wt. %, 75 wt. %, 76 wt. %, 77 wt. %, 78 wt. %, 79 wt. %, 80 wt. %, 81 wt. %, 82 wt. %, 83 wt. %, 84 wt. %, 85 wt. %, 86 wt. %, 87 wt. %, 88 wt. %, 89 wt. %, 90 wt. %, 91 wt. %, 92 wt. %, 93 wt. %, 94 wt. %, 95 wt. %, 96 wt. %, 97 wt. %, 98 wt. %, 99 wt. % nitrogen.

[0078] В некоторых вариантах осуществления удобрение согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере приблизительно 5 масс. %, приблизительно 6 масс. %, приблизительно 7 масс. %, приблизительно 8 масс. %, приблизительно 9 масс. %, приблизительно 10 масс. %, приблизительно 11 масс. %, приблизительно 12 масс. %, приблизительно 13 масс. %, приблизительно 14 масс. %, приблизительно 15 масс. %, приблизительно 16 масс. %, приблизительно 17 масс. %, приблизительно 18 масс. %, приблизительно 19 масс. %, приблизительно 20 масс. %, приблизительно 21 масс. %, приблизительно 22 масс. %, приблизительно 23 масс. %, приблизительно 24 масс. %, приблизительно 25 масс. %, приблизительно 26 масс. %, приблизительно 27 масс. %, приблизительно 28 масс. %, приблизительно 29 масс. %, приблизительно 30 масс. %, приблизительно 31 масс. %, приблизительно 32 масс. %, приблизительно 33 масс. %, приблизительно 34 масс. %, приблизительно 35 масс. %, приблизительно 36 масс. %, приблизительно 37 масс. %, приблизительно 38 масс. %, приблизительно 39 масс. %, приблизительно 40 масс. %, приблизительно 41 масс. %, приблизительно 42 масс. %, приблизительно 43 масс. %, приблизительно 44 масс. %, приблизительно 45 масс. %, приблизительно 46 масс. %, приблизительно 47 масс. %, приблизительно 48 масс. %, приблизительно 49 масс. %, приблизительно 50 масс. %, приблизительно 51 масс. %, приблизительно 52 масс. %, приблизительно 53 масс. %, приблизительно 54 масс. %, приблизительно 55 масс. %, приблизительно 56 масс. %, приблизительно 57 масс. %, приблизительно 58 масс. %, приблизительно 59 масс. %, приблизительно 60 масс. %, приблизительно 61 масс. %, приблизительно 62 масс. %, приблизительно 63 масс. %, приблизительно 64 масс. %, приблизительно 65 масс. %, приблизительно 66 масс. %, приблизительно 67 масс. %, приблизительно 68 масс. %, приблизительно 69 масс. %, приблизительно 70 масс. %, приблизительно 71 масс. %, приблизительно 72 масс. %, приблизительно 73 масс. %, приблизительно 74 масс. %, приблизительно 75 масс. %, приблизительно 76 масс. %, приблизительно 77 масс. %, приблизительно 78 масс. %, приблизительно 79 масс. %, приблизительно 80 масс. %, приблизительно 81 масс. %, приблизительно 82 масс. %, приблизительно 83 масс. %, приблизительно 84 масс. %, приблизительно 85 масс. %, приблизительно 86 масс. %, приблизительно 87 масс. %, приблизительно 88 масс. %, приблизительно 89 масс. %, приблизительно 90 масс. %, приблизительно 91 масс. %, приблизительно 92 масс. %, приблизительно 93 масс. %, приблизительно 94 масс. %, приблизительно 95 масс. %, приблизительно 96 масс. %, приблизительно 97 масс. %, приблизительно 98 масс. % или приблизительно 99 масс. % азота.[0078] In some embodiments, the fertilizer of the present invention contains at least about 5 wt. %, approximately 6 wt. %, approximately 7 wt. %, approximately 8 wt. %, approximately 9 wt. %, approximately 10 wt. %, approximately 11 wt. %, approximately 12 wt. %, approximately 13 wt. %, approximately 14 wt. %, approximately 15 wt. %, approximately 16 wt. %, approximately 17 wt. %, approximately 18 wt. %, approximately 19 wt. %, approximately 20 wt. %, approximately 21 wt. %, approximately 22 wt. %, approximately 23 wt. %, approximately 24 wt. %, approximately 25 wt. %, approximately 26 wt. %, approximately 27 wt. %, approximately 28 wt. %, approximately 29 wt. %, approximately 30 wt. %, approximately 31 wt. %, approximately 32 wt. %, approximately 33 wt. %, approximately 34 wt. %, approximately 35 wt. %, approximately 36 wt. %, approximately 37 wt. %, approximately 38 wt. %, approximately 39 wt. %, approximately 40 wt. %, approximately 41 wt. %, approximately 42 wt. %, approximately 43 wt. %, approximately 44 wt. %, approximately 45 wt. %, approximately 46 wt. %, approximately 47 wt. %, approximately 48 wt. %, approximately 49 wt. %, approximately 50 wt. %, approximately 51 wt. %, approximately 52 wt. %, approximately 53 wt. %, approximately 54 wt. %, approximately 55 wt. %, approximately 56 wt. %, approximately 57 wt. %, approximately 58 wt. %, approximately 59 wt. %, approximately 60 wt. %, approximately 61 wt. %, approximately 62 wt. %, approximately 63 wt. %, approximately 64 wt. %, approximately 65 wt. %, approximately 66 wt. %, approximately 67 wt. %, approximately 68 wt. %, approximately 69 wt. %, approximately 70 wt. %, approximately 71 wt. %, approximately 72 wt. %, approximately 73 wt. %, approximately 74 wt. %, approximately 75 wt. %, approximately 76 wt. %, approximately 77 wt. %, approximately 78 wt. %, approximately 79 wt. %, approximately 80 wt. %, approximately 81 wt. %, approximately 82 wt. %, approximately 83 wt. %, approximately 84 wt. %, approximately 85 wt. %, approximately 86 wt. %, approximately 87 wt. %, approximately 88 wt. %, approximately 89 wt. %, approximately 90 wt. %, approximately 91 wt. %, approximately 92 wt. %, approximately 93 wt. %, approximately 94 wt. %, approximately 95 wt. %, approximately 96 wt. %, approximately 97 wt. %, approximately 98 wt. % or approximately 99 wt. % nitrogen.

[0079] В некоторых вариантах осуществления удобрение согласно настоящему изобретению содержит приблизительно от 5 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 5 масс. % до 75 масс. %, приблизительно от 10 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 10 масс. % до 75 масс. %, приблизительно от 15 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 15 масс. % до 75 масс. %, приблизительно от 20 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 20 масс. % до 75 масс. %, приблизительно от 25 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 25 масс. % до 75 масс. %, приблизительно от 30 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 30 масс. % до 75 масс. %, приблизительно от 35 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 35 масс. % до 75 масс. %, приблизительно от 40 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 40 масс. % до 75 масс. %, приблизительно от 45 масс. % до 50 масс. %, приблизительно от 45 масс. % до 75 масс. % или приблизительно от 50 масс. % до 75 масс. % азота.[0079] In some embodiments, the fertilizer according to the present invention contains from about 5 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 5 wt. % up to 75 wt. %, from approximately 10 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 10 wt. % up to 75 wt. %, from approximately 15 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 15 wt. % up to 75 wt. %, from approximately 20 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 20 wt. % up to 75 wt. %, from approximately 25 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 25 wt. % up to 75 wt. %, from approximately 30 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 30 wt. % up to 75 wt. %, from approximately 35 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 35 wt. % up to 75 wt. %, from approximately 40 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 40 wt. % up to 75 wt. %, from approximately 45 wt. % up to 50 wt. %, from approximately 45 wt. % up to 75 wt. % or approximately 50 wt. % up to 75 wt. % nitrogen.

[0080] В некоторых вариантах осуществления повышение азотфиксации и/или продукции 1% или более азота в растении измеряют относительно контрольных растений, которые не подвергались воздействию бактерий согласно настоящему изобретению. Все повышения или снижения у бактерий измеряют относительно контрольных бактерий. Все повышения или снижения у растений измеряют относительно контрольных растений.[0080] In some embodiments, the increase in nitrogen fixation and/or production of 1% or more nitrogen in the plant is measured relative to control plants that were not exposed to the bacteria of the present invention. All increases or decreases in bacteria are measured relative to control bacteria. Any increases or decreases in plants are measured relative to control plants.

[0081] В контексте настоящего документа «конститутивный промотор» представляет собой промотор, активный при большинстве условий и/или на большинстве стадий развития. Существует несколько преимуществ, связанных с использованием конститутивных промоторов в векторах экспрессии, используемых в биотехнологии, таких как: высокий уровень продукции белков, используемых для отбора трансгенных клеток или организмов; высокий уровень экспрессии репортерных белков или селективных маркеров, что обеспечивает простоту обнаружения и количественного определения; высокий уровень продукции транскрипционного фактора, который является частью регуляторной системы транскрипции; продуцирование соединений, требующее универсальной активности в организме; и продуцирование соединений, требуемых на всех стадиях развития. Неограничивающие примеры конститутивных промоторов включают промотор CaMV 35S, опиновые промоторы, промотор убиквитина, промотор алкогольдегидрогеназы и т.д. [0081] As used herein, a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most conditions and/or at most stages of development. There are several advantages associated with the use of constitutive promoters in expression vectors used in biotechnology, such as: high levels of protein production used to select transgenic cells or organisms; high level of expression of reporter proteins or selectable markers, which ensures ease of detection and quantification; high level of production of a transcription factor, which is part of the transcription regulatory system; production of compounds requiring universal activity in the body; and production of compounds required at all stages of development. Non-limiting examples of constitutive promoters include the CaMV 35S promoter, opine promoters, ubiquitin promoter, alcohol dehydrogenase promoter, etc.

[0082] В контексте настоящего документа «неконститутивный промотор» представляет собой промотор, активный в определенных условиях, в определенных типах клеток и/или на определенных стадиях развития. Например, тканеспецифические, тканепредпочтительные, клеточноспецифические, клеточнопредпочтительные, индуцибельные промоторы и промоторы, контролируемые стадией развития, являются неконститутивными промоторами. Примеры промоторов, контролируемых стадией развития, включают промоторы, которые избирательно инициируют транскрипцию в определенных тканях.[0082] As used herein, a “non-constitutive promoter” is a promoter that is active under certain conditions, in certain cell types and/or at certain stages of development. For example, tissue-specific, tissue-preferred, cell-specific, cell-preferred, inducible, and developmental stage-controlled promoters are non-constitutive promoters. Examples of developmental stage-controlled promoters include promoters that selectively initiate transcription in certain tissues.

[0083] В контексте настоящего документа «индуцибельный» или «репрессируемый» промотор представляет собой промотор, который находится под контролем химических факторов или факторов окружающей среды. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию индуцибельными промоторами, включают анаэробные условия, определенные химические вещества, присутствие света, кислотные или основные условия и т.д.[0083] As used herein, an "inducible" or "repressible" promoter is a promoter that is under the control of chemical or environmental factors. Examples of environmental conditions that can influence transcription by inducible promoters include anaerobic conditions, certain chemicals, the presence of light, acidic or basic conditions, etc.

[0084] В контексте настоящего документа «тканеспецифический» промотор представляет собой промотор, который инициирует транскрипцию только в определенных тканях. В отличие от конститутивной экспрессии генов, тканеспецифическая экспрессия представляет собой результат взаимодействия нескольких уровней генной регуляции. Соответственно, в данной области техники иногда предпочтительно применение промоторов из гомологичного или близкородственного вида для достижения эффективной и надежной экспрессии трансгенов в определенных тканях. Это одна из основных причин значительного количества тканеспецифических промоторов, выделенных из определенных тканей, описанных как в научной, так и в патентной литературе.[0084] As used herein, a “tissue-specific” promoter is a promoter that initiates transcription only in certain tissues. In contrast to constitutive gene expression, tissue-specific expression is the result of the interaction of several levels of gene regulation. Accordingly, it is sometimes preferred in the art to use promoters from a homologous or closely related species to achieve efficient and reliable expression of transgenes in certain tissues. This is one of the main reasons for the significant number of tissue-specific promoters isolated from certain tissues described in both the scientific and patent literature.

[0085] В контексте настоящего документа термин «функционально связанный» относится к связи последовательностей нуклеиновых кислот на одном фрагменте нуклеиновой кислоты таким образом, что функцию одной регулирует другая. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он способен регулировать экспрессию указанной кодирующей последовательности (т.е. кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем указанного промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации. Согласно еще одному примеру комплементарные области РНК согласно описанию могут быть функционально связаны, прямо или опосредованно, с 5'-концом целевой мРНК, или с 3'-концом целевой мРНК, или внутри целевой мРНК, или первая комплементарная область является 5'-концевой, а ее комплемент является 3'-концевым относительно целевой мРНК.[0085] As used herein, the term “operably linked” refers to the linkage of nucleic acid sequences on one nucleic acid fragment such that the function of one is controlled by the other. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if it is capable of regulating the expression of said coding sequence (ie, the coding sequence is under the transcriptional control of said promoter). Coding sequences may be operably linked to regulatory sequences in sense or antisense orientation. In another example, complementary regions of the RNA as described may be operably linked, directly or indirectly, to the 5' end of the target mRNA, or to the 3' end of the target mRNA, or within the target mRNA, or the first complementary region is 5' terminal, and its complement is 3'-terminal relative to the target mRNA.

Регуляция азотфиксацииRegulation of nitrogen fixation

[0086] Одним из качеств, на которое может быть направлена регуляция описанными в настоящем документе способами, является азотфиксация. Азотные удобрения являются крупнейшим операционным расходом на ферме и основным стимулятором более высоких урожайностей таких пропашных сельскохозяйственных культур, как кукуруза и пшеница. В настоящем документе описаны продукты на основе микроорганизмов, которые могут доставлять возобновляемые формы азота в небобовые культуры. Хотя некоторые эндофиты обладают генетикой, необходимой для азотфиксации в чистой культуре, фундаментальная техническая проблема заключается в том, что эндофиты дикого типа зерновых и злаковых перестают фиксировать азот в удобренных полях. Применение химических удобрений и остаточные уровни азота в полевых почвах сигнализирует микроорганизму о необходимости остановить биохимический путь азотфиксации.[0086] One quality that may be targeted for regulation by the methods described herein is nitrogen fixation. Nitrogen fertilizer is the largest operating expense on a farm and a major driver of higher yields in row crops such as corn and wheat. This document describes microbial-based products that can deliver renewable forms of nitrogen to non-legume crops. Although some endophytes have the genetics necessary to fix nitrogen in pure crops, a fundamental technical problem is that wild-type endophytes of grains and cereals fail to fix nitrogen in fertilized fields. The use of chemical fertilizers and residual levels of nitrogen in field soils signal the microorganism to stop the biochemical nitrogen fixation pathway.

[0087] Для разработки микроорганизма, способного фиксировать и переносить азот в кукурузу в присутствии удобрения, необходимы изменения в транскрипционном и посттрансляционном уровнях регуляторной сети азотфиксации. С этой целью в настоящем документе описана технология Эволюции Хозяин-Микроорганизм (Host-Microbe Evolution, HoME) для точного развития регуляторных сетей и выявления новых фенотипов. В настоящем документе также описаны уникальные, запатентованные библиотеки азотфиксирующих эндофитов, выделенных из кукурузы, в сочетании с обширными данными омики, касающимися взаимодействия микроорганизмов и растения-хозяина при различных условиях окружающей среды, таких как недостаток и избыток азота. Эта технология обеспечивает точное развитие генетической регуляторной сети эндофитов для получения микроорганизмов, которые активно фиксируют азот даже в присутствии удобрений в поле. В настоящем документе также описаны оценки технического потенциала разрабатываемых микроорганизмов, которые колонизируют ткани корня кукурузы и продуцируют азот, для удобренных растений, а также оценки совместимости эндофитов со стандартными методами приготовления препаратов и разнообразными почвами, чтобы определить возможность интеграции микроорганизмов в современные стратегии контроля азота.[0087] To develop a microorganism capable of fixing and transferring nitrogen to corn in the presence of fertilizer, changes in the transcriptional and post-translational levels of the nitrogen fixation regulatory network are required. To this end, this paper describes the technology of Host-Microbe Evolution (HoME) for the precise evolution of regulatory networks and the identification of new phenotypes. This paper also describes unique, proprietary libraries of nitrogen-fixing endophytes isolated from maize, coupled with extensive omics data on microbial-host interactions under various environmental conditions such as nitrogen deficiency and excess. This technology enables precise development of the genetic regulatory network of endophytes to produce microorganisms that actively fix nitrogen even in the presence of fertilizers in the field. This paper also describes evaluations of the technical potential of developing microorganisms that colonize corn root tissue and produce nitrogen for fertilized crops, as well as evaluations of endophyte compatibility with standard formulation methods and a variety of soils to determine the feasibility of integrating microorganisms into modern nitrogen management strategies.

[0088] Чтобы использовать элементарный азот (N) для химического синтеза, формы жизни объединяют газообразный азот (N₂), доступный из атмосферы, с водородом в процессе, известном как азотфиксация. Из-за энергоемкой природы биологической азотфиксации у диазотрофов (бактерий и архей, которые фиксируют атмосферный газообразный азот) развилась сложная и жесткая регуляция кластера генов nif в ответ на кислород окружающей среды и доступный азот. Гены nif кодируют ферменты, участвующие в азотфиксации (такие как комплекс нитрогеназы), и белки, регулирующие азотфиксацию. В источнике Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8(4):84-94) приведены подробные описания генов nif и их продуктов, и он включен в настоящий документ посредством ссылки. В настоящем документе описаны способы получения растения с улучшенным качеством, включающие выделение бактерий из первого растения, введение генетического изменения в ген nif выделенных бактерий, подвергание второго растения воздействию вариантных бактерий, выделение бактерий из второго растения, обладающего улучшенным качеством относительно первого растения, и повторение стадий с бактериями, выделенными из второго растения.[0088] To use elemental nitrogen (N) for chemical synthesis, life forms combine nitrogen gas (N ₂ ) available from the atmosphere with hydrogen in a process known as nitrogen fixation. Due to the energy-intensive nature of biological nitrogen fixation, diazotrophs (bacteria and archaea that fix atmospheric nitrogen gas) have evolved complex and tight regulation of the nif gene cluster in response to environmental oxygen and available nitrogen. The nif genes encode enzymes involved in nitrogen fixation (such as the nitrogenase complex) and proteins that regulate nitrogen fixation. Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8(4):84-94) provides detailed descriptions of the nif genes and their products and is incorporated herein by reference. Disclosed herein are methods for producing a plant with improved quality, comprising isolating bacteria from a first plant, introducing a genetic change in the nif gene of the isolated bacteria, exposing a second plant to the variant bacteria, isolating bacteria from a second plant having improved quality relative to the first plant, and repeating the steps with bacteria isolated from the second plant.

[0089] У Proteobacteria регуляция азотфиксации сосредоточена вокруг σ₅₄-зависимого энхансер-связывающего белка NifA, положительного регулятора транскрипции кластера nif. Внутриклеточные уровни активного NifA контролируются двумя ключевыми факторами: транскрипцией оперона nifLA и ингибированием активности NifA межбелковым взаимодействием с NifL. Оба этих процесса восприимчивы к внутриклеточным уровням глутамина посредством сигнального каскада белка PII. Этот каскад опосредован GlnD, который непосредственно распознает глутамин и катализирует уридилирование или деуридилирование двух регуляторных белков PII - GlnB и GlnK - в ответ на отсутствие или присутствие, соответственно, связанного глутамина. В условиях избытка азота немодифицированный GlnB сигнализирует об инактивации промотора nifLA. Однако в лимитированных по азоту условиях GlnB является посттрансляционно модифицированным, что ингибирует его активность и приводит к транскрипции оперона nifLA. Таким образом, транскрипция nifLA строго контролируется в ответ на азот в окружающей среде посредством сигнального каскада белка PII. На посттрансляционном уровне регуляции NifA GlnK ингибирует взаимодействие NifL/NifA в зависимости от общего уровня свободного GlnK в клетке. [0089] In Proteobacteria, regulation of nitrogen fixation is centered around the _σ54 -dependent enhancer-binding protein NifA, a positive regulator of nif cluster transcription. Intracellular levels of active NifA are controlled by two key factors: transcription of the nifLA operon and inhibition of NifA activity by protein-protein interaction with NifL. Both of these processes are responsive to intracellular glutamine levels through the PII protein signaling cascade. This cascade is mediated by GlnD, which directly recognizes glutamine and catalyzes the uridylation or deuridylation of two PII regulatory proteins, GlnB and GlnK, in response to the absence or presence, respectively, of bound glutamine. Under excess nitrogen conditions, unmodified GlnB signals inactivation of the nifLA promoter. However, under nitrogen-limited conditions, GlnB is posttranslationally modified, which inhibits its activity and leads to transcription of the nifLA operon. Thus, nifLA transcription is tightly controlled in response to environmental nitrogen through the PII protein signaling cascade. At the post-translational level of regulation, NifA GlnK inhibits the NifL/NifA interaction depending on the total level of free GlnK in the cell.

[0090] NifA транскрибируется с оперона nifLA, промотор которого активируется фосфорилированным NtrC, еще одним σ₅₄-зависимым регулятором. Состояние фосфорилирования NtrC опосредовано гистидинкиназой NtrB, которая взаимодействует с деуридилированным GlnB, но не уридилированным GlnB. В условиях избытка азота высокий внутриклеточный уровень глутамина приводит к деуридилированию GlnB, который затем взаимодействует с NtrB, инактивируя его фосфорилирующую активность и активируя его фосфатазную активность, что приводит к дефосфорилированию NtrC и инактивации промотора nifLA. Однако в лимитированных по азоту условиях низкий уровень внутриклеточного глутамина приводит к уридилированию GlnB, что ингибирует его взаимодействие с NtrB и позволяет осуществлять фосфорилирование NtrC и транскрипцию оперона nifLA. Таким образом, экспрессия nifLA строго контролируется в ответ на азот в окружающей среде посредством сигнального каскада белка PII. Все из nifA, ntrB, ntrC и glnB представляют собой гены, которые могут быть мутированы в описанных в настоящем документе способах. Эти процессы могут также быть восприимчивыми к внутриклеточным уровням аммиака, мочевины или нитратов. [0090] NifA is transcribed from the nifLA operon, the promoter of which is activated by phosphorylated NtrC, another _σ54 -dependent regulator. The phosphorylation state of NtrC is mediated by the histidine kinase NtrB, which interacts with deuridylated GlnB but not uridylated GlnB. Under excess nitrogen conditions, high intracellular levels of glutamine lead to deuridylation of GlnB, which then interacts with NtrB, inactivating its phosphorylation activity and activating its phosphatase activity, resulting in dephosphorylation of NtrC and inactivation of the nifLA promoter. However, under nitrogen-limited conditions, low levels of intracellular glutamine lead to uridylation of GlnB, which inhibits its interaction with NtrB and allows phosphorylation of NtrC and transcription of the nifLA operon. Thus, nifLA expression is tightly controlled in response to environmental nitrogen through the PII protein signaling cascade. nifA, ntrB, ntrC and glnB are all genes that can be mutated in the methods described herein. These processes may also be susceptible to intracellular levels of ammonia, urea, or nitrate.

[0091] Активность NifA также регулируется посттрансляционно в ответ на азот окружающей среды, чаще всего посредством опосредованного NifL ингибирования активности NifA. Как правило, на взаимодействие NifL и NifA влияет сигнальный каскад белка PII посредством GlnK, хотя характер взаимодействий между GlnK и NifL/NifA значительно варьируется между диазотрофами. У Klebsiella pneumoniae обе формы GlnK ингибируют взаимодействие NifL/NifA, а взаимодействие между GlnK и NifL/NifA определяется общим уровнем свободного GlnK в клетке. В условиях избытка азота деуридилированный GlnK взаимодействует с транспортером аммония AmtB, который служит как для блокирования поглощения аммония AmtB, так и для секвестрации GlnK в мембрану, что позволяет ингибировать NifA посредством NifL. С другой стороны, у Azotobacter vinelandii взаимодействие с деурилилированным GlnK необходимо для взаимодействия NifL/NifA и ингибирования NifA, тогда как уридилирование GlnK ингибирует его взаимодействие с NifL. Существуют свидетельства того, что у диазотрофов, не имеющих гена nifL, активность NifA ингибируется непосредственно при взаимодействии с деуридилированными формами как GlnK, так и GlnB в условиях избытка азота. У некоторых бактерий кластер Nif может регулироваться посредством glnR, и, кроме того, в некоторых случаях это может включать отрицательную регуляцию. Независимо от механизма посттрансляционное ингибирование NifA является важным регулятором кластера nif у большинства известных диазотрофов. Кроме того, nifL, amtB, glnK и glnR являются генами, которые могут быть мутированы в описанных в настоящем документе способах. [0091] NifA activity is also regulated post-translationally in response to environmental nitrogen, most commonly through NifL-mediated inhibition of NifA activity. In general, the interaction between NifL and NifA is influenced by the PII protein signaling cascade through GlnK, although the nature of the interactions between GlnK and NifL/NifA varies significantly between diazotrophs. In Klebsiella pneumoniae, both forms of GlnK inhibit the NifL/NifA interaction, and the interaction between GlnK and NifL/NifA is determined by the total level of free GlnK in the cell. Under conditions of excess nitrogen, deuridylated GlnK interacts with the ammonium transporter AmtB, which serves to both block ammonium uptake by AmtB and sequester GlnK into the membrane, allowing inhibition of NifA by NifL. On the other hand, in Azotobacter vinelandii, interaction with deurilylated GlnK is required for NifL/NifA interaction and NifA inhibition, whereas uridylation of GlnK inhibits its interaction with NifL. There is evidence that in diazotrophs lacking the nifL gene, NifA activity is inhibited directly by interaction with deuridylated forms of both GlnK and GlnB under conditions of excess nitrogen. In some bacteria, the Nif cluster may be regulated by glnR, and in addition, in some cases this may involve negative regulation. Regardless of the mechanism, posttranslational inhibition of NifA is an important regulator of the nif cluster in most known diazotrophs. In addition, nifL, amtB, glnK and glnR are genes that can be mutated in the methods described herein.

[0092] Помимо регуляции транскрипции генов кластера nif у многих диазотрофов развился механизм для прямой посттрансляционной модификации и ингибирования самого фермента нитрогеназы, известный как выключение нитрогеназы. Этот процесс опосредуется АДФ-рибозилированием Fe-белка (NifH) в условиях избытка азота, что нарушает его взаимодействие с белковым комплексом MoFe (NifDK) и ликвидирует нитрогеназную активность. DraT катализирует АДФ-рибозилирование Fe-белка и выключение нитрогеназы, тогда как DraG катализирует удаление АДФ-рибозы и повторную активацию нитрогеназы. Как и в случае транскрипции nifLA и ингибирования NifA, выключение нитрогеназы также регулируется посредством сигнального каскада белка PII. В условиях избытка азота деуридилированный GlnB взаимодействует с DraT и активирует его, а деуридилированный GlnK взаимодействует как с DraG, так и с AmtB с образованием комплекса, секвестрируя DraG в мембрану. В лимитированных по азоту условиях уридилированные формы GlnB и GlnK не взаимодействуют с DraT и DraG, соответственно, что приводит к инактивации DraT и диффузии DraG к Fe-белку, где он удаляет АДФ-рибозу и активирует нитрогеназу. Способы, описанные в настоящем документе, также предусматривают введение генетического изменения в гены nifH, nifD, nifK и draT. [0092] In addition to regulating the transcription of nif cluster genes, many diazotrophs have evolved a mechanism for direct post-translational modification and inhibition of the nitrogenase enzyme itself, known as nitrogenase shutdown. This process is mediated by ADP-ribosylation of Fe protein (NifH) under conditions of excess nitrogen, which disrupts its interaction with the MoFe protein complex (NifDK) and eliminates nitrogenase activity. DraT catalyzes ADP-ribosylation of Fe protein and shutdown of nitrogenase, whereas DraG catalyzes removal of ADP-ribose and reactivation of nitrogenase. As with nifLA transcription and NifA inhibition, nitrogenase shutdown is also regulated through the PII protein signaling cascade. Under conditions of excess nitrogen, deuridylated GlnB interacts with and activates DraT, and deuridylated GlnK interacts with both DraG and AmtB to form a complex, sequestering DraG into the membrane. Under nitrogen-limited conditions, the uridylated forms of GlnB and GlnK do not interact with DraT and DraG, respectively, resulting in inactivation of DraT and diffusion of DraG to the Fe protein, where it removes ADP-ribose and activates nitrogenase. The methods described herein also involve introducing a genetic change in the nifH, nifD, nifK and draT genes.

[0093] Хотя некоторые эндофиты обладают способностью фиксировать азот in vitro, часто генетика подавляется в полевых условиях высокими уровнями экзогенных химических удобрений. Можно отделить восприятие экзогенного азота от экспрессии фермента нитрогеназы, чтобы способствовать азотфиксации в полевых условиях. Улучшение интегральной нитрогеназной активности во времени дополнительно способствует повышению продукции азота для использования сельскохозяйственной культурой. Конкретные мишени для генетического изменения для способствования азотфиксации в полевых условиях с использованием описанных в настоящем документе способов включают один или более генов, выбранных из группы, состоящей из nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ.[0093] Although some endophytes have the ability to fix nitrogen in vitro, often the genetics are suppressed in the field by high levels of exogenous chemical fertilizers. It is possible to decouple exogenous nitrogen sensing from nitrogenase enzyme expression to promote nitrogen fixation under field conditions. Improvement in integral nitrogenase activity over time further contributes to increased nitrogen production for use by the crop. Specific targets for genetic modification to promote nitrogen fixation in the field using the methods described herein include one or more genes selected from the group consisting of nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB and nifQ.

[0094] Дополнительной мишенью для генетического изменения для способствования азотфиксации в полевых условиях с использованием описанных в настоящем документе способов является белок NifA. Белок NifA обычно является активатором для экспрессии генов азотфиксации. Повышение продукции NifA (либо конститутивно, либо в условиях высокого содержания аммиака) позволяет обойти природный путь восприятия аммиака. Кроме того, снижение продукции белков NifL, известного ингибитора NifA, также приводит к повышению уровня свободно активного NifA. Кроме того, повышение уровня транскрипции оперона nifAL (либо конститутивно, либо в условиях высокого содержания аммиака) также приводит к общему повышению уровня белков NifA. Повышенный уровень экспрессии nifAL достигается путем изменения самого промотора или путем снижения экспрессии NtrB (часть сигнального каскада ntrB и ntrC, которая первоначально приводила к выключению оперона nifAL в условиях высокого содержания азота). Высокий уровень NifA, достигнутый этими или любыми другими способами, описанными в настоящем документе, повышает азотфиксирующую активность эндофитов. [0094] An additional target for genetic modification to promote nitrogen fixation in the field using the methods described herein is the NifA protein. The NifA protein is usually an activator for the expression of nitrogen fixation genes. Increased NifA production (either constitutively or under high ammonia conditions) bypasses the natural ammonia sensing pathway. In addition, decreased protein production of NifL, a known inhibitor of NifA, also leads to increased levels of free active NifA. In addition, increased transcription levels of the nifAL operon (either constitutively or under high ammonia conditions) also lead to an overall increase in NifA protein levels. Increased levels of nifAL expression are achieved by altering the promoter itself or by reducing NtrB expression (part of the ntrB and ntrC signaling cascade that initially led to the shutdown of the nifAL operon under high nitrogen conditions). High levels of NifA achieved by these or any other methods described herein enhance the nitrogen-fixing activity of endophytes.

[0095] Другой мишенью для генетического изменения для способствования азотфиксации в полевых условиях с использованием описанных в настоящем документе способов является сигнальный каскад GlnD/GlnB/GlnK PII. Внутриклеточный уровень глутамина воспринимается через сигнальный каскад GlnD/GlnB/GlnK PII. Мутации активного сайта в GlnD, которые ликвидируют уридилил-удаляющую активность GlnD, нарушают каскад восприятия азота. Кроме того, снижение концентрации GlnB вызывает сбой в каскаде восприятия глутамина. Эти мутации «обманывают» клетки, создавая видимость лимитированного по азоту состояния, тем самым повышая уровень азотфиксирующей активности. Эти процессы могут также быть восприимчивыми к внутриклеточным, или внеклеточным, уровням аммиака, мочевины или нитратов. [0095] Another target for genetic modification to promote nitrogen fixation in the field using the methods described herein is the GlnD/GlnB/GlnK PII signaling cascade. Intracellular glutamine levels are sensed through the GlnD/GlnB/GlnK PII signaling cascade. Active site mutations in GlnD that abolish the uridylyl scavenging activity of GlnD disrupt the nitrogen sensing cascade. In addition, a decrease in GlnB concentration causes a disruption in the glutamine sensing cascade. These mutations “trick” the cells into appearing to be in a nitrogen-limited state, thereby increasing the level of nitrogen-fixing activity. These processes may also be susceptible to intracellular, or extracellular, levels of ammonia, urea, or nitrate.

[0096] Белок amtB также является мишенью для генетического изменения для способствования азотфиксации в полевых условиях с использованием описанных в настоящем документе способов. Поглощение аммиака из окружающей среды может быть уменьшено путем снижения уровня экспрессии белка amtB. Без внутриклеточного аммиака эндофит неспособен воспринимать высокий уровень аммиака, что предотвращает подавление генов азотфиксации. Любой аммиак, попадающий во внутриклеточный компартмент, превращается в глутамин. Внутриклеточный уровень глутамина является основным источником восприятия азота. Снижение внутриклеточного уровня глутамина предотвращает восприятие клетками высоких уровней аммония в окружающей среде. Этот эффект может быть достигнут путем повышения уровня экспрессии глутаминазы - фермента, превращающего глутамин в глутамат. Кроме того, внутриклеточный уровень глутамина также может быть снижен путем уменьшения глутаминсинтазы (фермента, превращающего аммиак в глутамин). У диазотрофов фиксированный аммиак быстро ассимилируется в глутамин и глутамат для использования в клеточных процессах. Нарушение ассимиляции аммиака может позволить перенаправить фиксированный азот, который будет экспортироваться из клетки в виде аммиака. Фиксированный аммиак преимущественно ассимилируется в глутамин глутаминсинтетазой (GS), кодируемой glnA, а затем в глутамин глутамин-оксоглутарат-аминотрансферазой (GOGAT). В некоторых примерах glnS кодирует глутаминсинтетазу. GS регулируется посттрансляционно GS-аденилилтрансферазой (GlnE) - бифункциональным ферментом, кодируемым glnE, который катализирует как аденилирование, так и деаденилирование GS посредством активности его аденилилтрансферазного (AT) и аденилил-удаляющего (AR) доменов, соответственно. В лимитированных по азоту условиях glnA экспрессируется, а AR-домен GlnE деаденилирует GS, обеспечивая ее активность. В условиях избытка азота экспрессия glnA выключается, и AT-домен GlnE аллостерически активируется глутамином, вызывая аденилирование и инактивацию GS. [0096] The amtB protein is also a target for genetic modification to promote nitrogen fixation in the field using the methods described herein. Ammonia uptake from the environment can be reduced by reducing amtB protein expression levels. Without intracellular ammonia, the endophyte is unable to perceive high levels of ammonia, which prevents the suppression of nitrogen fixation genes. Any ammonia that enters the intracellular compartment is converted to glutamine. Intracellular glutamine levels are the primary source of nitrogen sensing. Reducing intracellular glutamine levels prevents cells from accepting high levels of ammonium in the environment. This effect can be achieved by increasing the expression level of glutaminase, an enzyme that converts glutamine into glutamate. Additionally, intracellular glutamine levels can also be reduced by reducing glutamine synthase (the enzyme that converts ammonia to glutamine). In diazotrophs, fixed ammonia is rapidly assimilated into glutamine and glutamate for use in cellular processes. Disruption of ammonia assimilation may allow redirection of fixed nitrogen to be exported from the cell as ammonia. Fixed ammonia is preferentially assimilated into glutamine by glutamine synthetase (GS), encoded by glnA, and then into glutamine by glutamine oxoglutarate aminotransferase (GOGAT). In some examples, glnS encodes glutamine synthetase. GS is regulated posttranslationally by GS adenylyltransferase (GlnE), a bifunctional enzyme encoded by glnE that catalyzes both adenylation and deadenylation of GS through the activities of its adenylyltransferase (AT) and adenylyl-removing (AR) domains, respectively. Under nitrogen-limited conditions, glnA is expressed and the AR domain of GlnE deadenylates GS, mediating its activity. Under excess nitrogen conditions, glnA expression is turned off and the AT domain of GlnE is allosterically activated by glutamine, causing adenylation and inactivation of GS.

[0097] Кроме того, ген draT также может быть мишенью для генетического изменения для способствования азотфиксации в полевых условиях с использованием описанных в настоящем документе способов. После продуцирования клеткой азотфиксирующих ферментов выключение нитрогеназы представляет собой еще один уровень, на котором клетка подавляет азотфиксирующую активность в условиях высокого содержания азота. Это выключение можно убрать, снизив уровень экспрессии DraT.[0097] In addition, the draT gene can also be targeted for genetic modification to promote nitrogen fixation in the field using the methods described herein. After the cell produces nitrogen-fixing enzymes, nitrogenase shutdown is another level at which the cell suppresses nitrogen-fixing activity under high nitrogen conditions. This switch-off can be reversed by reducing the expression level of DraT.

[0098] Способы придания микроорганизмам новых фенотипов могут быть осуществлены на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях. Транскрипционный уровень включает изменения в промоторе (такие как изменение аффинности сигма-фактора или сайтов связывания для транскрипционных факторов, включая делецию всего или части промотора) или изменение терминаторов и аттенюаторов транскрипции. Трансляционный уровень включает изменения в сайтах связывания рибосомы и изменения сигналов деградации мРНК. Посттрансляционный уровень включает мутирование активного сайта фермента и изменение межбелковых взаимодействий. Эти изменения могут быть достигнуты множеством способов. Снижение уровня экспрессии (или ее полная ликвидация) может быть достигнуто путем замены нативного сайта связывания рибосомы (RBS) или промотора на другой с более низкой силой/эффективностью. Стартовые сайты ATG могут быть заменены старт-кодоном GTG, TTG или CTG, что приводит к снижению трансляционной активности кодирующей области. Полная ликвидация экспрессии может быть осуществлена путем нокаута (делеции) кодирующей области гена. Сдвиг открытой рамки считывания (ORF), вероятно, приведет к преждевременному стоп-кодону вдоль ORF, обеспечивая таким образом нефункциональный усеченный продукт. Вставка стоп-кодонов внутрь рамки считывания также обеспечит нефункциональный усеченный продукт. Для снижения эффективной концентрации определенного гена также может быть осуществлено добавление метки деградации на N- или C-конце.[0098] Methods for imparting new phenotypes to microorganisms can be carried out at the transcriptional, translational and post-translational levels. The transcriptional level includes changes in the promoter (such as changes in sigma factor affinity or binding sites for transcription factors, including deletion of all or part of the promoter) or changes in transcription terminators and attenuators. The translational level includes changes in ribosome binding sites and changes in mRNA degradation signals. The post-translational level includes mutation of the active site of the enzyme and changes in protein-protein interactions. These changes can be achieved in many ways. Reducing the expression level (or completely eliminating it) can be achieved by replacing the native ribosome binding site (RBS) or promoter with one of lower strength/efficiency. ATG start sites may be replaced by a GTG, TTG, or CTG start codon, resulting in decreased translational activity of the coding region. Complete elimination of expression can be achieved by knockout (deletion) of the coding region of the gene. An open reading frame (ORF) shift is likely to result in a premature stop codon along the ORF, thus providing a nonfunctional truncated product. Insertion of stop codons within the reading frame will also provide a non-functional truncated product. To reduce the effective concentration of a particular gene, the addition of a degradation tag at the N- or C-terminus can also be carried out.

[0099] И наоборот, уровень экспрессии генов, описанных в настоящем документе, может быть достигнут с использованием более сильного промотора. Для обеспечения высокой активности промотора в условиях высокого уровня азота (или в любых других условиях) можно получить профиль транскрипции всего генома в условиях высокого уровня азота, и из этого набора данных могут быть выбраны активные промоторы с желаемым уровнем транскрипции для замены слабого промотора. Слабые старт-кодоны могут быть заменены старт-кодоном ATG для лучшей эффективности инициации трансляции. Слабые сайты связывания рибосомы (RBS) также могут быть заменены другими RBS с более высокой эффективностью инициации трансляции. Кроме того, для изменения активности фермента также может быть проведен сайт-специфический мутагенез.[0099] Conversely, the level of expression of the genes described herein can be achieved using a stronger promoter. To ensure high promoter activity under high nitrogen conditions (or any other conditions), a genome-wide transcriptional profile under high nitrogen conditions can be obtained, and from this data set, active promoters with the desired level of transcription can be selected to replace the weak promoter. Weak start codons can be replaced with an ATG start codon for better translation initiation efficiency. Weak ribosome binding sites (RBS) can also be replaced by other RBS with higher translation initiation efficiency. In addition, site-directed mutagenesis can also be performed to change enzyme activity.

[00100] Повышение уровня азотфиксации, которое происходит в растении, может привести к уменьшению количества химических удобрений, необходимых для производства сельскохозяйственных культур, и снижению выбросов парниковых газов (например, окислов азота). [00100] Increasing the level of nitrogen fixation that occurs in a plant can lead to a reduction in the amount of chemical fertilizers needed for crop production and a reduction in greenhouse gas emissions (eg, nitrogen oxides).

Повышение азотфиксирующей активностиIncreased nitrogen-fixing activity

[00101] Нитрогеназы представляют собой ферменты, ответственные за катализ азотфиксации. Существует три типа нитрогеназы, обнаруженных в различных азотфиксирующих бактериях: молибден-содержащая (Мо) нитрогеназа, ванадий-содержащая (V) нитрогеназа и содержащая только железо (Fe) нитрогеназа. Нитрогеназы представляют собой двухкомпонентные системы, состоящие из компонента I (также известного как динитрогеназа) и компонента II (также известного как редуктаза динитрогеназы). Компонент I представляет собой белок MoFe в молибден-содержащей нитрогеназе, белок VFe в ванадий-содержащей нитрогеназе и белок Fe в содержащей только железо нитрогеназе. Компонент II представляет собой Fe-белок, содержащий железосерный кластер (Fe-S). [00101] Nitrogenases are enzymes responsible for catalyzing nitrogen fixation. There are three types of nitrogenase found in various nitrogen-fixing bacteria: molybdenum-containing (Mo) nitrogenase, vanadium-containing (V) nitrogenase, and iron-only (Fe) nitrogenase. Nitrogenases are two-component systems consisting of component I (also known as dinitrogenase) and component II (also known as dinitrogenase reductase). Component I is the MoFe protein in molybdenum-containing nitrogenase, the VFe protein in vanadium-containing nitrogenase, and the Fe protein in iron-only nitrogenase. Component II is an Fe protein containing an iron-sulfur cluster (Fe-S).

[00102] В некоторых случаях изменение количества поступающих кофакторов может привести к повышению азотфиксации. Например, увеличение поглощения серы может обеспечить больший пул кофакторов для ферментов нитрогеназ, таким образом повышая количество функциональных комплексов нитрогеназы. В некоторых случаях поглощение серы может быть увеличено путем активации генов транспорта сульфатов. В качестве примеров генов транспорта сульфатов можно привести, не ограничиваясь перечисленным, cysPTWA, sbp, sbp, cysZK. [00102] In some cases, changing the amount of cofactors supplied can lead to increased nitrogen fixation. For example, increased sulfur uptake may provide a larger pool of cofactors for nitrogenase enzymes, thereby increasing the number of functional nitrogenase complexes. In some cases, sulfur uptake can be increased by activating sulfate transport genes. Examples of sulfate transport genes include, but are not limited to, cysPTWA, sbp, sbp, cysZK.

[00103] В некоторых случаях изменение количества поступающих кофакторов может привести к повышению азотфиксации. Например, увеличение поглощения молибдена (Мо) может обеспечить повышение количества функциональных комплексов нитрогеназы. В некоторых случаях поглощение Mo может быть увеличено путем активации генов транспорта Mo. В качестве примеров генов транспорта Mo можно привести, не ограничиваясь перечисленным, modEBA, modEB и modA.[00103] In some cases, changing the amount of cofactors supplied can lead to increased nitrogen fixation. For example, increased molybdenum (Mo) uptake may provide increased amounts of functional nitrogenase complexes. In some cases, Mo uptake can be increased by activating Mo transport genes. Examples of Mo transport genes include, but are not limited to, modEBA, modEB, and modA.

[00104] В некоторых случаях на поступление кофактора может оказывать влияние поглощение железа. На поглощение железа может оказывать влияние система транспорта tonB. В некоторых случаях влияние на поглощение железа может быть оказано путем активации генов системы транспорта tonB. В качестве примеров генов транспорта tonB можно привести, не ограничиваясь перечисленным, tonB и exbAB. В некоторых случаях на поглощение железа могут влиять сидерофоры, которые увеличивают поглощение железа микроорганизмами и растениями. В некоторых случаях влияние на поглощение железа может быть оказано путем активации генов биосинтеза сидерофоров. В качестве примеров генов биосинтеза сидерофоров можно привести, не ограничиваясь перечисленным, yhfA, yusV, sbnA, fiu, yfiZ и fur.[00104] In some cases, cofactor supply may be influenced by iron absorption. Iron absorption may be influenced by the tonB transport system. In some cases, iron absorption can be influenced by activating the genes of the tonB transport system. Examples of tonB transport genes include, but are not limited to, tonB and exbAB. In some cases, iron absorption can be influenced by siderophores, which increase iron uptake by microorganisms and plants. In some cases, iron absorption can be influenced by activating siderophore biosynthetic genes. Examples of siderophore biosynthesis genes include, but are not limited to, yhfA, yusV, sbnA, fiu, yfiZ, and fur.

[00105] Изменение метаболического потока в АТФ может привести к повышению азотфиксации. Например, метаболический поток в АТФ может быть увеличен посредством направленного воздействия на биосинтез гликогена. На биосинтез гликогена может оказывать влияние перенаправление углерода на гликолиз, цикл ТСА (трикарбоновых кислот) и/или окислительное фосфорилирование, а не синтез гликогена. В некоторых случаях на биосинтез гликогена можно влиять, удаляя или подавляя соответствующий ген для гликогенсинтазы. В качестве примера гена гликогенсинтазы можно привести, не ограничиваясь перечисленным, glgA. [00105] A change in metabolic flux to ATP can lead to increased nitrogen fixation. For example, metabolic flux to ATP can be increased by targeting glycogen biosynthesis. Glycogen biosynthesis may be influenced by carbon redirection to glycolysis, the TCA (tricarboxylic acid) cycle, and/or oxidative phosphorylation rather than glycogen synthesis. In some cases, glycogen biosynthesis can be influenced by deleting or suppressing the corresponding gene for glycogen synthase. An example of a glycogen synthase gene may include, but is not limited to, glgA.

[00106] К повышению азотфиксации может привести изменение количества ферментов нитрогеназ на клетку. Например, на количество ферментов нитрогеназ на клетку может оказывать влияние дерепрессия nif. Дерепрессия nif может быть достигнута путем конститутивной передачи сигналов о нехватке азота. В некоторых случаях дерепрессия nif может быть достигнута путем делеции UR-домена соответствующих генов. В качестве примера гена, который может выступать в качестве мишени для дерепрессии генов nif, можно привести, не ограничиваясь перечисленным, glnD. В некоторых случаях транскрипция кластера(ов) nif может быть повышена путем введения сильных промоторов против хода транскрипции от оперона nifHDK или nifDK.[00106] Increased nitrogen fixation can be caused by changes in the amount of nitrogenase enzymes per cell. For example, the amount of nitrogenase enzymes per cell may be affected by nif derepression. Derepression of nif may be achieved through constitutive nitrogen deficiency signaling. In some cases, nif derepression can be achieved by deleting the UR domain of the corresponding genes. An example of a gene that may act as a target for derepression of nif genes includes, but is not limited to, glnD. In some cases, transcription of the nif cluster(s) can be enhanced by introducing strong promoters upstream of the nifHDK or nifDK operon.

[00107] Еще одним способом повышения азотфиксации может быть повышение количества ферментов нитрогеназ на клетку путем повышения транскрипции кластера nif. Транскрипция кластера nif может быть повышена путем повышения транскрипции NIFA. В некоторых случаях на транскрипцию кластера nif может оказывать влияние повышение числа копий гена nifA в геноме. [00107] Another way to increase nitrogen fixation would be to increase the amount of nitrogenase enzymes per cell by increasing transcription of the nif cluster. Transcription of the nif cluster can be increased by increasing transcription of NIFA. In some cases, transcription of the nif cluster may be influenced by an increase in the number of copies of the nifA gene in the genome.

[00108] Транскрипция кластера nif также может быть повышена путем повышения трансляции NifA. В некоторых случаях трансляция NifA может быть повышена путем повышения силы сайта связывания рибосомы в гене nifA.[00108] Transcription of the nif cluster can also be increased by increasing translation of NifA. In some cases, NifA translation can be increased by increasing the strength of the ribosome binding site in the nifA gene.

[00109] К повышению азотфиксации может привести изменение чувствительности нитрогеназы к кислороду. На чувствительность к кислороду может повлиять снижение восприятия кислорода. В некоторых случаях снижение восприятия кислорода может быть обеспечено нарушением генов восприятия кислорода. В качестве примеров генов восприятия кислорода можно привести, не ограничиваясь перечисленным, nifT/fixU, fixJ и fixL. [00109] Increased nitrogen fixation may result from changes in the sensitivity of nitrogenase to oxygen. Oxygen sensitivity may be affected by decreased oxygen perception. In some cases, decreased oxygen perception may be caused by a disorder in oxygen-sensing genes. Examples of oxygen sensing genes include, but are not limited to, nifT/fixU, fixJ, and fixL.

[00110] В некоторых случаях на чувствительность к кислороду может оказывать влияние поддержание низкого уровня цитозольного кислорода посредством стимуляции цитохром-bd-опосредованного дыхания. В некоторых случаях на чувствительность к кислороду может оказывать влияние активация генов, кодирующих цитохром-bd-оксидазу, и/или нокаутирование альтернативных систем цитохрома. В качестве примеров генов, кодирующих гены цитохром-bd, можно привести, не ограничиваясь перечисленным, cydABX, cydAB и cydX. В некоторых случаях нитрогеназа может быть защищена от окисления путем изменения окислительно-восстановительного равновесия в клетке. Окислительно-восстановительное равновесие может быть изменено посредством поглощения АФК (активных форм кислорода). Одной из стратегий для осуществления поглощения АФК является активация соответствующих генов. В качестве примеров генов поглощения АФК можно привести, не ограничиваясь перечисленным, grxABCD, trxA, trxC и tpx.[00110] In some cases, oxygen sensitivity may be influenced by maintaining low levels of cytosolic oxygen through stimulation of cytochrome bd-mediated respiration. In some cases, oxygen sensitivity may be affected by activation of genes encoding cytochrome bd oxidase and/or knockout of alternative cytochrome systems. Examples of genes encoding cytochrome bd genes include, but are not limited to, cydABX, cydAB, and cydX. In some cases, nitrogenase can be protected from oxidation by changing the redox balance in the cell. The redox balance can be altered through the uptake of ROS (reactive oxygen species). One strategy to achieve ROS scavenging is to activate the corresponding genes. Examples of ROS scavenging genes include, but are not limited to, grxABCD, trxA, trxC, and tpx.

[00111] В некоторых случаях на чувствительность к кислороду может оказывать влияние поглощение свободного кислорода. В некоторых случаях поглощение свободного кислорода может быть достигнуто путем активации генов бактериального гемоглобина. В качестве примера гена гемоглобина можно привести, не ограничиваясь перечисленным, glbN. В некоторых случаях поглощение свободного кислорода может быть достигнуто путем активации генов fixNOPQ, кодирующих высокоаффинную гем-медную оксидазу типа cbb3. [00111] In some cases, oxygen sensitivity may be affected by free oxygen uptake. In some cases, uptake of free oxygen can be achieved by activating bacterial hemoglobin genes. An example of a hemoglobin gene is, but is not limited to, glbN. In some cases, the uptake of free oxygen can be achieved by activating the fixNOPQ genes encoding the high-affinity heme-copper oxidase type cbb3.

[00112] К повышению экспрессии нитрогеназы может привести модификация IHFa. В некоторых случаях экспрессия нитрогеназы может быть повышена путем облегчения взаимодействия между nifA и σ54 в последовательности активации, расположенной против хода транскрипции от определенных генов. В частности, активация IHF может повысить транскрипцию нитрогеназы. В некоторых случаях активация IHF в сочетании с nifA и σ54 может усиливать транскрипцию оперона нитрогеназы. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экспрессии азота, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и/или Klebsiella variicola. В некоторых случаях активация оперона нитрогеназы может быть более эффективной, если она сочетается с мутацией в гене, кодирующем σ54.[00112] Modification of IHFa can lead to increased expression of nitrogenase. In some cases, nitrogenase expression can be increased by facilitating the interaction between nifA and σ54 at an activation sequence located upstream of certain genes. In particular, IHF activation can increase nitrogenase transcription. In some cases, activation of IHF in combination with nifA and σ54 can enhance transcription of the nitrogenase operon. In some cases, strains that may be used in this nitrogen expression enhancement process may include, but are not limited to, Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari, and/or Klebsiella variicola strains. In some cases, activation of the nitrogenase operon may be more effective if it is combined with a mutation in the gene encoding σ54.

[00113] К повышению экспрессии нитрогеназы может привести модификация гена, кодирующего σ54. В некоторых случаях активация гена, кодирующего σ54, может привести к повышению транскрипции нитрогеназы. В качестве примера гена, кодирующего σ54, можно привести, не ограничиваясь перечисленным, rpoN. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экспрессии азота, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и/или Klebsiella variicola. В некоторых случаях активация σ54 в сочетании с nifA и IHF может усиливать транскрипцию оперона нитрогеназы. В некоторых случаях транскрипция оперона нитрогеназы может быть дополнительно улучшена путем сочетания активации σ54 с мутацией IHF.[00113] Modification of the gene encoding σ54 can lead to increased expression of nitrogenase. In some cases, activation of the gene encoding σ54 can lead to increased transcription of nitrogenase. An example of a gene encoding σ54 includes, but is not limited to, rpoN. In some cases, strains that may be used in this nitrogen expression enhancement process may include, but are not limited to, Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari, and/or Klebsiella variicola strains. In some cases, activation of σ54 in combination with nifA and IHF can enhance transcription of the nitrogenase operon. In some cases, transcription of the nitrogenase operon can be further improved by combining σ54 activation with IHF mutation.

[00114] В некоторых случаях удаление белка, такого как DraT, из штамма, такого как штамм kosakonia, может повысить нитрогеназную активность. В некоторых случаях DraT может посттрансляционно модифицировать фермент нитрогеназу, ингибируя его активность. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения нитрогеназной активности, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы kosakonia. [00114] In some cases, removing a protein, such as DraT, from a strain, such as a kosakonia strain, can increase nitrogenase activity. In some cases, DraT can post-translationally modify the nitrogenase enzyme, inhibiting its activity. In some cases, strains that may be used in this process of increasing nitrogenase activity may include, but are not limited to, kosakonia strains.

[00115] В некоторых случаях модификация гена asnB может повысить экскрецию аммония. В частности, усечение и активация гена asnB могут превращать глутамин обратно в аммоний. Ферменты AsnB содержат два домена; один может дезаминировать глутамин с высвобождением аммония, а другой использует аммоний для выработки аспарагина. Усечение AsnB для делеции домена аспарагинсинтазы и/или активация домена глутаминдезаминазы может способствовать обратному превращению клеточного глутамина в аммоний, тем самым повышая экскрецию аммония. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola.[00115] In some cases, modification of the asnB gene can increase ammonium excretion. In particular, truncation and activation of the asnB gene can convert glutamine back to ammonium. AsnB enzymes contain two domains; one can deaminate glutamine to release ammonium, and the other uses ammonium to produce asparagine. Truncation of AsnB to delete the asparagine synthase domain and/or activation of the glutamine deaminase domain may promote the reconversion of cellular glutamine to ammonium, thereby increasing ammonium excretion. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00116] В некоторых случаях модификация гена asnB может повысить экскрецию аммония. В частности, делеция гена asnB может уменьшить поглощение аммония в клетке. asnB может использовать цитозольный аммоний вместо глутамина в качестве донора азота. В некоторых случаях делеция, усечение или активация asnB может повысить количество аммония, выделяемого из клетки. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00116] In some cases, modification of the asnB gene can increase ammonium excretion. In particular, deletion of the asnB gene can reduce ammonium uptake in the cell. asnB can use cytosolic ammonium instead of glutamine as a nitrogen donor. In some cases, deletion, truncation, or activation of asnB can increase the amount of ammonium released from the cell. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

В некоторых случаях модификация glnD может быть полезна для изменения регуляции ассимиляции азота. В частности, модификации glnD могут быть использованы для оптимизации регуляции путей ассимиляции азота через сигнальный путь белка PII. Фермент, кодируемый glnD, модифицирует белки PII GlnK и GlnB. Фермент GlnD обратимо уридилирует и деуридилирует белки PII в условиях лимитирования и избытка азота, соответственно. Белки PII сообщают сигнальные каскады путям азотного метаболизма. Примеры генов метаболизма азота, на которые оказывает влияние передача сигналов белком PII, включают, не ограничиваясь перечисленным, glnA, кодирующий глутаминсинтетазу, ntrB/glnL, кодирующий сенсорную гистидинкиназу/фосфатазу ntrB, glnG/ntrC ДНК-связывающий регулятор транскрипции ntrC и оперон nifLA. В некоторых случаях glnD может быть подвергнут делеции, чтобы снизить транскрипцию генов ассимиляции азота и количество азота, ассимилируемого в клетке. В некоторых случаях glnD может быть модифицирован путем делеции области ACT12, делеции области UR и/или путем инактивации области UR путем мутирования определенных аминокислотных остатков (например, остатков 90, 91 и/или 104). В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе снижения ассимиляции азота, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. In some cases, modification of glnD may be useful for altering the regulation of nitrogen assimilation. In particular, glnD modifications can be used to optimize the regulation of nitrogen assimilation pathways through the PII protein signaling pathway. The enzyme encoded by glnD modifies the PII proteins GlnK and GlnB. The GlnD enzyme reversibly uridylates and deuridylates PII proteins under nitrogen-limiting and nitrogen-abundant conditions, respectively. PII proteins communicate signaling cascades to nitrogen metabolic pathways. Examples of nitrogen metabolism genes affected by PII protein signaling include, but are not limited to, glnA encoding glutamine synthetase, ntrB/glnL encoding the sensor histidine kinase/phosphatase ntrB, glnG/ntrC DNA-binding transcriptional regulator ntrC, and the nifLA operon. In some cases, glnD can be deleted to reduce the transcription of nitrogen assimilation genes and the amount of nitrogen assimilated into the cell. In some cases, glnD may be modified by deletion of the ACT12 region, deletion of the UR region, and/or by inactivation of the UR region by mutating certain amino acid residues (eg, residues 90, 91, and/or 104). In some cases, strains that may be used in this nitrogen assimilation reduction process may include, but are not limited to, Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari, and Klebsiella variicola strains.

[00117] В некоторых случаях модификация glnD может быть полезна для повышения нитрогеназной активности, экскреции аммония и/или роста растения. В частности, удаление восприимчивой к азоту области может повысить нитрогеназную активность и/или рост растения. В некоторых случаях домен ACT glnD может быть подвергнут делеции. В некоторых случаях домен ACT участвует в определении азотного статуса посредством аллостерической регуляции глутамином. Удаление домена ACT может снизить активность уридилилтрансферазы, тем самым сигнализируя об избытке азота и подавляя гены ассимиляции азота, что приводит к повышению экскреции аммония. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения нитрогеназной активности, экскреции аммония и/или роста растения, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00117] In some cases, modification of glnD may be useful for increasing nitrogenase activity, ammonium excretion and/or plant growth. In particular, removing a nitrogen-receptive area may increase nitrogenase activity and/or plant growth. In some cases, the ACT domain of glnD may be deleted. In some cases, the ACT domain is involved in determining nitrogen status through allosteric regulation by glutamine. Deletion of the ACT domain can reduce uridylyl transferase activity, thereby signaling excess nitrogen and suppressing nitrogen assimilation genes, leading to increased ammonium excretion. In some cases, strains that can be used in this process of increasing nitrogenase activity, ammonium excretion and/or plant growth may include, but are not limited to, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola strains.

[00118] В некоторых случаях модификация glnD может быть полезна для повышения нитрогеназной активности, экскреции аммония и/или роста растения. В частности, удаление или инактивация области уридилилтрансферазы (UT) в домене glnD может повысить нитрогеназную активность, экскрецию аммония и/или рост растения. Удаление или инактивация домена UT может снизить активность уридилилтрансферазы, тем самым сигнализируя об избытке азота и подавляя гены ассимиляции азота, что приводит к повышению экскреции аммония. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения нитрогеназной активности, экскреции аммония и/или роста растения, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola.[00118] In some cases, modification of glnD may be useful for increasing nitrogenase activity, ammonium excretion and/or plant growth. In particular, deletion or inactivation of the uridylyltransferase (UT) region in the glnD domain can increase nitrogenase activity, ammonium excretion and/or plant growth. Removal or inactivation of the UT domain can reduce uridylyl transferase activity, thereby signaling excess nitrogen and suppressing nitrogen assimilation genes, resulting in increased ammonium excretion. In some cases, strains that can be used in this process of increasing nitrogenase activity, ammonium excretion and/or plant growth may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00119] В некоторых случаях модификация GlnB может быть полезна для повышения экскреции соединений азота. В некоторых случаях домен уридилилтрансферазы (UTase) GlnD модифицирует GlnB по тирозину-51. В некоторых случаях путем модификации домена UTase GlnD продукция GlnB-UMP может быть снижена. В некоторых случаях путем удаления домена UTase GlnD продукция GlnB-UMP может быть снижена. В некоторых случаях путем изменения домена UTase GlnD продукция GlnB-UMP может быть предотвращена. В некоторых случаях путем удаления домена UTase GlnD продукция GlnB-UMP может быть предотвращена. В некоторых случаях GlnB может быть модифицирован путем делеции тирозина-51. В некоторых случаях GlnB может быть модифицирован путем модификации GlnB по тирозину-51. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00119] In some cases, modification of GlnB may be useful for increasing the excretion of nitrogen compounds. In some cases, the uridylyltransferase (UTase) domain of GlnD modifies GlnB at tyrosine-51. In some cases, by modifying the UTase domain of GlnD, GlnB-UMP production can be reduced. In some cases, by removing the UTase domain of GlnD, GlnB-UMP production can be reduced. In some cases, by altering the UTase domain of GlnD, GlnB-UMP production can be prevented. In some cases, by removing the UTase domain of GlnD, GlnB-UMP production can be prevented. In some cases, GlnB can be modified by deletion of tyrosine-51. In some cases, GlnB can be modified by modifying GlnB at tyrosine-51. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00120] В некоторых случаях модификация GlnK может быть полезна для повышения экскреции аммония. В некоторых случаях GlnK в штамме может функционировать как аналог GlnB из-за сходства структур GlnK и GlnB. В некоторых случаях модификация GlnK может повысить экскрецию аммония путем устранения ингибирующих действий, которые могут быть обусловлены GlnK. В некоторых случаях путем изменения GlnK ингибирующие действия на экскрецию аммония могут быть снижены. В некоторых случаях путем удаления GlnK ингибирующие действия на экскрецию аммония могут быть снижены. В некоторых случаях путем изменения GlnK ингибирующие действия на экскрецию аммония, обусловленные GlnK, могут быть предотвращены. В некоторых случаях путем удаления гена glnK ингибирующие действия на экскрецию аммония, обсуловленные GlnK, могут быть предотвращены. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00120] In some cases, modification of GlnK may be useful for increasing ammonium excretion. In some cases, GlnK in a strain may function as a GlnB analogue due to the similarity in the structures of GlnK and GlnB. In some cases, modification of GlnK may increase ammonium excretion by eliminating inhibitory effects that may be due to GlnK. In some cases, by changing GlnK, the inhibitory effects on ammonium excretion can be reduced. In some cases, by removing GlnK, the inhibitory effects on ammonium excretion can be reduced. In some cases, by altering GlnK, the inhibitory effects on ammonium excretion due to GlnK can be prevented. In some cases, by deleting the glnK gene, the inhibitory effects on ammonium excretion caused by GlnK can be prevented. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00121] В некоторых случаях модификация glnK может быть полезна для повышения экскреции аммония. В некоторых случаях домен UTase GlnD модифицирует glnK по тирозину-51. В некоторых случаях путем модификации домена UTase GlnD продукция glnK-UMP может быть снижена. В некоторых случаях путем удаления домена UTase GlnD продукция glnK-UMP может быть снижена. В некоторых случаях путем изменения домена UTase GlnD продукция glnK-UMP может быть предотвращена. В некоторых случаях путем удаления домена UTase GlnD продукция glnK-UMP может быть предотвращена. В некоторых случаях GlnK может быть модифицирован путем делеции тирозина-51. В некоторых случаях GlnK может быть модифицирован путем модификации GlnK по тирозину-51. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00121] In some cases, modification of glnK may be useful for increasing ammonium excretion. In some cases, the UTase domain of GlnD modifies glnK at tyrosine-51. In some cases, by modifying the UTase domain of GlnD, glnK-UMP production can be reduced. In some cases, by removing the UTase domain of GlnD, glnK-UMP production can be reduced. In some cases, by altering the UTase domain of GlnD, glnK-UMP production can be prevented. In some cases, by removing the UTase domain of GlnD, glnK-UMP production can be prevented. In some cases, GlnK can be modified by deletion of tyrosine-51. In some cases, GlnK can be modified by modifying GlnK at tyrosine-51. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00122] В некоторых случаях модификация glnL, кодирующего белок NtrB, может быть полезна для повышения экскреции аммония. В частности, модификация NtrB может быть полезна для контроля транскрипции glnA независимо от азотного статуса. В некоторых случаях модификация ntrB может быть достигнута путем делеции определенных остатков для дозирования активности. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00122] In some cases, modification of glnL, which encodes the NtrB protein, may be useful to increase ammonium excretion. In particular, modification of NtrB may be useful for controlling glnA transcription independent of nitrogen status. In some cases, modification of ntrB can be achieved by deleting certain residues to dose activity. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00123] В некоторых случаях модификация glnA может быть полезна для повышения экскреции аммония. В некоторых случаях модификация NtrC может быть полезна для модификации уровня белка GlnA в клетке. В частности, модификация NtrC может быть полезна вследствие предотвращения фосфорилизации NtrC. Фосфорилированный NtrC может привести к транскрипционной активации glnA. Как таковая, модификация ntrC для предотвращения фосфорилизации ntrC может быть полезной для снижения транскрипции glnA. В некоторых случаях модификация NtrC может быть достигнута путем замены аспарата 54. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00123] In some cases, modification of glnA may be useful to increase ammonium excretion. In some cases, modification of NtrC may be useful for modifying the level of GlnA protein in the cell. In particular, modification of NtrC may be beneficial by preventing NtrC phosphorylation. Phosphorylated NtrC can lead to transcriptional activation of glnA. As such, modification of ntrC to prevent phosphorylation of ntrC may be beneficial in reducing glnA transcription. In some cases, modification of NtrC can be achieved by replacing aspartate 54. In some cases, strains that can be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00124] В некоторых случаях модификация глутаминазы B может быть полезна для повышения экскреции аммония. В частности, в некоторых случаях превращение глутамина обратно в глутамат и аммиак посредством глутаминазы B может активироваться с повышением экскреции аммония. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции азота, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00124] In some cases, modification of glutaminase B may be useful to increase ammonium excretion. In particular, in some cases the conversion of glutamine back to glutamate and ammonia by glutaminase B may be activated to increase ammonium excretion. In some cases, strains that can be used in this process of increasing nitrogen excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00125] В некоторых случаях модификация nifA может быть полезна для повышения экспрессии нитрогеназы. В некоторых случаях может быть полезно модифицировать nifA, чтобы увеличить количество копий гена nifA в клетке. Количество копий гена nifA может быть увеличено путем вставки нескольких копий гена nifA перед конститутивно экспрессирующими промоторами. В некоторых случаях прикрепление копии гена nifA к одному или более оперонам «домашнего хозяйства» может увеличить общее количество генов nifA в клетке. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экспрессии нитрогеназы, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis и Klebsiella variicola. [00125] In some cases, modification of nifA may be useful to increase nitrogenase expression. In some cases, it may be useful to modify nifA to increase the number of copies of the nifA gene in the cell. The copy number of the nifA gene can be increased by inserting multiple copies of the nifA gene upstream of constitutively expressing promoters. In some cases, attaching a copy of the nifA gene to one or more housekeeping operons can increase the total number of nifA genes in the cell. In some cases, strains that may be used in this process of increasing nitrogenase expression may include, but are not limited to, Rahnella aquatilis and Klebsiella variicola strains.

[00126] В некоторых случаях модификация оперона нитрогеназы может быть полезна для повышения экспрессии нитрогеназы. В некоторых случаях может быть полезным активировать опероны нитрогеназы для повышения транскрипции нитрогеназы. В некоторых случаях промоторы из бактерии, активные при колонизации бактерией ризосферы, могут быть вставлены перед оперонами нитрогеназы для активации оперонов нитрогеназы. В некоторых случаях nifL из оперонов нитрогеназы может быть подвергунт делеции для активации оперонов нитрогеназы. В некоторых случаях nifA из оперонов нитрогеназы может быть подвергнут делеции для активации оперонов нитрогеназы. В некоторых случаях nifA и nifL из оперонов нитрогеназы могут быть подвергнуты делеции для активации оперонов нитрогеназы. В некоторых случаях несколько промоторов могут быть размещены непосредственно перед генами nifHDK, чтобы обойти контроль транскрипции nifA. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экспрессии нитрогеназы, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis и Klebsiella variicola. [00126] In some cases, modification of the nitrogenase operon may be useful to increase nitrogenase expression. In some cases, it may be useful to activate nitrogenase operons to increase nitrogenase transcription. In some cases, promoters from the bacterium that are active when the bacterium colonizes the rhizosphere can be inserted before the nitrogenase operons to activate the nitrogenase operons. In some cases, nifL from the nitrogenase operons may be deleted to activate the nitrogenase operons. In some cases, nifA from the nitrogenase operons can be deleted to activate the nitrogenase operons. In some cases, nifA and nifL from the nitrogenase operons can be deleted to activate the nitrogenase operons. In some cases, multiple promoters can be placed immediately upstream of nifHDK genes to bypass nifA transcriptional control. In some cases, strains that may be used in this process of increasing nitrogenase expression may include, but are not limited to, Rahnella aquatilis and Klebsiella variicola strains.

[00127] В некоторых случаях модификация glnE может быть полезна для повышения экскреции аммония. В некоторых случаях консервативный мотив аспартат-аминокислота-аспартат (DXD) на AR-домене glnE может быть изменен. В некоторых случаях изменение консервативного остатка DXD в AR-домене glnE может быть использовано для лишения glnE деаденилирующей активности. В некоторых случаях в DXD-мотиве в AR-области glnE может быть заменен остаток D. В некоторых случаях замена остатка D в мотиве DXD в AR-области glnE может не затрагивать сайт связывания GlnB, что позволяет регулировать активность аденилирования при снижении или предотвращении AR-активности. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00127] In some cases, modification of glnE may be useful to increase ammonium excretion. In some cases, the conserved aspartate-amino acid-aspartate (DXD) motif on the AR domain of glnE can be altered. In some cases, alteration of the conserved DXD residue in the AR domain of glnE can be used to abolish glnE deadenylation activity. In some cases, residue D in the DXD motif in the AR region of glnE may be replaced. In some cases, replacement of residue D in the DXD motif in the AR region of glnE may not affect the GlnB binding site, allowing regulation of adenylation activity while reducing or preventing AR. activity. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00128] В некоторых случаях модификация glnA может быть полезна для повышения экскреции AMM. В некоторых случаях glnA может быть подавлен путем вставки промоторов glnB, glnD и/или glnE против хода транскрипции от гена glnA. В некоторых случаях модификация glnA может позволить отделить экспрессию glnA от сигнального каскада N-статуса и снизить экспрессию до базального уровня, так что большее количество фиксированного азота остается неассимилированным. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00128] In some cases, modification of glnA may be useful to increase AMM excretion. In some cases, glnA can be suppressed by inserting glnB, glnD, and/or glnE promoters upstream of the glnA gene. In some cases, modification of glnA may allow glnA expression to be uncoupled from the N-status signaling cascade and reduce expression to basal levels so that more fixed nitrogen remains unassimilated. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00129] В некоторых случаях модификация GOGAT может быть полезна для повышения экскреции аммония. В некоторых случаях GOGAT может быть подавлен путем вставки против хода транскрипции от генов GOGAT промотора, контролирующего glnB, glnD и/или glnE. Подавление GOGAT может, в свою очередь, привести к снижению экспрессии глутамин-оксиглутарат-аминотрансферазы. В некоторых случаях модификация GOGAT может позволить отделить экспрессию GOGAT от сигнального каскада N-статуса и снизить экспрессию до базального уровня, так что большее количество фиксированного азота остается неассимилированным. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00129] In some cases, modification of GOGAT may be useful to increase ammonium excretion. In some cases, GOGAT can be suppressed by insertion upstream of the GOGAT genes of the promoter controlling glnB, glnD and/or glnE. Suppression of GOGAT may in turn lead to decreased expression of glutamine oxyglutarate aminotransferase. In some cases, modification of GOGAT may allow GOGAT expression to be uncoupled from the N-status signaling cascade and reduce expression to basal levels so that more fixed nitrogen remains unassimilated. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

[00130] В некоторых случаях модификация GDH может быть полезна для повышения экскреции аммония. В некоторых случаях GDH может быть подавлен путем вставки против хода транскрипции от гена GDH промотора, контролирующего glnB, glnD и/или glnE. Подавление GDH может, в свою очередь, привести к снижению экспрессии НАД-специфической глутаматдегидрогеназы. В некоторых случаях модификация GDH может позволить отделить экспрессию GDH от сигнального каскада N-статуса и снизить экспрессию до базального уровня, так что большее количество фиксированного азота остается неассимилированным. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения экскреции аммония, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00130] In some cases, modification of GDH may be useful to increase ammonium excretion. In some cases, GDH can be suppressed by insertion upstream of the GDH promoter gene controlling glnB, glnD and/or glnE. Suppression of GDH may, in turn, lead to decreased expression of NAD-specific glutamate dehydrogenase. In some cases, modification of GDH may allow GDH expression to be uncoupled from the N-status signaling cascade and reduce expression to basal levels so that more fixed nitrogen remains unassimilated. In some cases, strains that may be used in this process of increasing ammonium excretion may include, but are not limited to, strains of Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari and Klebsiella variicola.

Повышение азотфиксации за счет ассимиляцииIncreasing nitrogen fixation due to assimilation

[00131] Количество азота, предоставляемого растению, связанному с микроорганизмами, может быть увеличено путем снижения ассимиляции азота в микроорганизме. В этом случае на ассимиляцию может оказывать влияние скорость экскреции аммиака. Посредством направленного воздействия на ассимиляцию аммиака возможно увеличить доступность азота. В некоторых случаях влияние на ассимиляцию аммиака может быть оказано путем снижения степени обратного поглощения аммиака после экскреции. Для снижения степени обратного поглощения аммиака после экскреции может быть осуществлен нокаут любого соответствующего гена. В качестве примера генов обратного поглощения аммиака можно привести, не ограничиваясь перечисленным, amtB.[00131] The amount of nitrogen provided to the plant associated with the microorganisms can be increased by reducing the assimilation of nitrogen into the microorganism. In this case, assimilation may be influenced by the rate of ammonia excretion. By targeting ammonia assimilation, it is possible to increase nitrogen availability. In some cases, ammonia assimilation can be influenced by reducing the rate of ammonia reuptake after excretion. To reduce the degree of ammonia reuptake after excretion, any corresponding gene can be knocked out. An example of ammonia reuptake genes is, but is not limited to, amtB.

[00132] В некоторых случаях на ассимиляцию может оказывать влияние интенсивность поглощения растением. Посредством направленного воздействия на гены и пути, ответственные за ассимиляцию азота в растениях, доступность азота может быть увеличена. В некоторых случаях ассимиляция аммиака растением может быть изменена путем инокуляции микроорганизмами, способствующими росту N-фиксирующих растений. Может быть проведен скрининг для идентификации микроорганизмов, вызывающих ассимиляцию аммиака в растениях. [00132] In some cases, assimilation may be influenced by the rate of uptake by the plant. By targeting genes and pathways responsible for nitrogen assimilation in plants, nitrogen availability can be increased. In some cases, plant ammonia assimilation can be altered by inoculation with microorganisms that promote the growth of N-fixing plants. Screening can be carried out to identify microorganisms causing ammonia assimilation in plants.

Повышение азотфиксации за счет колонизацииIncreased nitrogen fixation due to colonization

[00133] Повышение колонизационной способности микроорганизмов может позволить увеличить количество фиксированного азота, предоставляемого растению. На колонизацию может оказывать влияние изменение переносимого объема (распространенности микроорганизмов на поверхности корня) и/или приспособляемости микроорганизмов. В некоторых случаях влияние на переносимый объем и приспособляемость микроорганизмов может быть оказано путем изменения транспорта органических кислот. Транспорт органических кислот может быть улучшен путем активации соответствующих генов. В качестве примера гена транспорта органических кислот можно привести, не ограничиваясь перечисленным, dctA.[00133] Increasing the colonization ability of microorganisms may allow an increase in the amount of fixed nitrogen provided to the plant. Colonization may be influenced by changes in transportable volume (the prevalence of microorganisms on the root surface) and/or the adaptability of microorganisms. In some cases, the transport volume and adaptability of microorganisms can be influenced by changing the transport of organic acids. The transport of organic acids can be improved by activating the corresponding genes. An example of an organic acid transport gene is, but is not limited to, dctA.

[00134] Например, на колонизационную способность может оказывать влияние экспрессия агглютининов. Повышенная экспрессия агглютининов может способствовать прилипанию микроорганизмов к корням растений. Примеры генов агглютининов могут включать, не ограничиваясь перечисленным, fhaB и fhaC.[00134] For example, colonization ability may be influenced by the expression of agglutinins. Increased expression of agglutinins may promote adherence of microorganisms to plant roots. Examples of agglutinin genes may include, but are not limited to, fhaB and fhaC.

[00135] На колонизационную способность может оказывать влияние увеличение проникновения эндофитов. Например, на проникновение эндофитов могут оказывать влияние ферменты, разрушающие клеточные стенки растений (CDWE). Повышение экспрессии и/или секреции CDWE может увеличивать колонизацию и проникновение эндофитных микроорганизмов. В качестве примеров CDWE можно привести, не ограничиваясь перечисленным, полигалактуроназы и целлюлазы. Примером гена полигалактуроназ является pehA. В некоторых случаях экспорт полигалактуроназ и целлюлаз может быть увеличен путем обеспечения сигнала экспорта вместе с ферментами.[00135] Colonization ability may be affected by increased endophyte infiltration. For example, endophyte penetration may be influenced by plant cell wall degrading enzymes (CDWE). Increased expression and/or secretion of CDWE may increase colonization and penetration of endophytic microorganisms. Examples of CDWE include, but are not limited to, polygalacturonases and cellulases. An example of a polygalacturonase gene is pehA. In some cases, the export of polygalacturonases and cellulases can be increased by providing an export signal together with the enzymes.

[00136] Изменение переносимого объема может привести к увеличению количества азота, предоставляемого соответствующему растению. На переносимый объем может оказывать влияние образование биопленки. В некоторых случаях на переносимый объем может оказывать влияние малая РНК rsmZ. Малая РНК rsmZ является отрицательным регулятором образования биопленки. В некоторых случаях образованию биопленки может способствовать делеция или подавление rsmZ, что приводит к повышению трансляции rsmA (положительного регулятора вторичного метаболизма) и образованию биопленки. [00136] A change in the volume transferred can result in an increase in the amount of nitrogen provided to the corresponding plant. The volume carried may be affected by biofilm formation. In some cases, the volume transferred may be influenced by the small RNA rsmZ. The small RNA rsmZ is a negative regulator of biofilm formation. In some cases, biofilm formation may be promoted by deletion or suppression of rsmZ, leading to increased translation of rsmA (a positive regulator of secondary metabolism) and biofilm formation.

[00137] В некоторых случаях на образование биопленки может оказывать влияние усиление способности штаммов прилипать к поверхности корня. В некоторых случаях образованию биопленки может способствовать активация крупных адгезивных белков. В качестве примера крупного адгезивного белка можно привести, не ограничиваясь перечисленным, lapA.[00137] In some cases, biofilm formation may be influenced by increasing the ability of strains to adhere to the root surface. In some cases, biofilm formation may be facilitated by activation of large adhesion proteins. An example of a large adhesion protein includes, but is not limited to, lapA.

[00138] В некоторых случаях на переносимый объем может оказывать влияние чувство кворума. В некоторых случаях чувство кворума может быть усилено путем увеличения числа копий генов биосинтеза АГЛ. [00138] In some cases, the volume carried may be affected by quorum sensing. In some cases, quorum sensing can be enhanced by increasing the copy number of AHL biosynthetic genes.

[00139] В некоторых случаях на колонизацию ризосферы может оказывать влияние масса корня. Например, на массу корня может оказывать влияние биосинтез ИУК (индол-3-уксусной кислоты) микроорганизмами. Повышение биосинтеза ИУК микроорганизмом может стимулировать образование корневой биомассы. В некоторых случаях влияние на биосинтеза ИУК может быть оказано путем активации (на разных уровнях) генов биосинтеза ИУК. В качестве примера гена биосинтеза ИУК можно привести, не ограничиваясь перечисленным, ipdC.[00139] In some cases, rhizosphere colonization may be influenced by root mass. For example, root mass may be influenced by the biosynthesis of IAA (indole-3-acetic acid) by microorganisms. An increase in IAA biosynthesis by a microorganism can stimulate the formation of root biomass. In some cases, IAA biosynthesis can be influenced by activating (at different levels) IAA biosynthesis genes. An example of an IAA biosynthesis gene is, but is not limited to, ipdC.

[00140] В некоторых случаях этиленовая сигнализация может вызывать системную резистентность растения и влиять на колонизационную способность микроорганизма. Этилен является сигнальной молекулой растения, которая вызывает широкий спектр реакций в зависимости от растительной ткани и уровня этилена. Преобладающая модель реакции на этилен в корне состоит в том, что растения, подвергшиеся стрессу, быстро реагируют, вырабатывая небольшой пик этилена, который инициирует защитную реакцию растения, например, транскрипцию генов, кодирующих защитные белки. Если стресс сохраняется или является интенсивным, возникает второй, гораздо больший пик этилена, часто через несколько дней. Этот второй пик этилена вызывает такие процессы, как старение, хлороз и опадание, которые могут привести к значительному угнетению роста и выживания растения. В некоторых случаях бактерии, способствующие росту растений, могут стимулировать рост корней, продуцируя ауксин ИУК, который стимулирует небольшой этиленовый ответ в корнях. В то же время бактерии могут предотвращать второй большой пик этилена, вырабатывая фермент (АЦК-деаминазу), замедляющий выработку этилена в растении, тем самым поддерживая уровень этилена, способствующий стимулированию роста корней. На индукцию системной резистентности у растения могут влиять бактериальные ИУК. В некоторых случаях стимуляция биосинтеза ИУК может быть достигнута путем активации (на разных уровнях) генов биосинтеза ИУК. В качестве примера гена биосинтеза можно привести, не ограничиваясь перечисленным, ipdC.[00140] In some cases, ethylene signaling can cause systemic plant resistance and affect the colonization ability of the microorganism. Ethylene is a plant signaling molecule that causes a wide range of reactions depending on the plant tissue and ethylene level. The predominant model of root response to ethylene is that stressed plants respond quickly by producing a small peak of ethylene that initiates a plant defense response, such as the transcription of genes encoding defense proteins. If the stress persists or is intense, a second, much larger ethylene peak occurs, often several days later. This second peak of ethylene causes processes such as senescence, chlorosis and leaf drop, which can lead to significant inhibition of plant growth and survival. In some cases, plant growth promoting bacteria can stimulate root growth by producing the auxin IAA, which stimulates a small ethylene response in the roots. At the same time, bacteria can prevent the second major ethylene peak by producing an enzyme (ACC deaminase) that slows down the plant's ethylene production, thereby maintaining ethylene levels that help stimulate root growth. The induction of systemic resistance in plants can be influenced by bacterial IAA. In some cases, stimulation of IAA biosynthesis can be achieved by activating (at different levels) IAA biosynthesis genes. An example of a biosynthesis gene may include, but is not limited to, ipdC.

[00141] В некоторых случаях на колонизацию может оказывать влияние АЦК-деаминаза. АЦК-дезаминаза может снижать выработку этилена в корне путем перенаправления АЦК в побочный продукт. В некоторых случаях влияние на АЦК-деаминазу может быть оказано путем активации генов АЦК-деаминазы. В качестве примеров генов АЦК-деаминазы можно привести, не ограничиваясь перечисленным, dcyD.[00141] In some cases, colonization may be influenced by ACC deaminase. ACC deaminase can reduce ethylene production downstream by redirecting ACC into a byproduct. In some cases, ACC deaminase can be influenced by activating ACC deaminase genes. Examples of ACC deaminase genes include, but are not limited to, dcyD.

[00142] В некоторых случаях на колонизацию могут влиять переносимый объем и/или приспособляемость микроорганизмов. Например, на переносимый объем и/или приспособляемость микроорганизмов может оказывать влияние избыточная продукция трегалозы. Избыточная продукция трегалозы может повысить засухоустойчивость. В некоторых случаях влияние на избыточную продукцию трегалозы может быть оказано путем активации (на разных уровнях) генов биосинтеза трегалозы. В качестве примеров генов биосинтеза трегалозы можно привести, не ограничиваясь перечисленным, otsA, otsB, treZ и treY. В некоторых случаях активация otsB также может повышать азотфиксирующую активность.[00142] In some cases, colonization may be influenced by the volume tolerated and/or the adaptability of the microorganisms. For example, the tolerable volume and/or fitness of microorganisms may be affected by excess trehalose production. Excess trehalose production can increase drought tolerance. In some cases, excess trehalose production can be influenced by activating (at different levels) trehalose biosynthesis genes. Examples of trehalose biosynthetic genes include, but are not limited to, otsA, otsB, treZ, and treY. In some cases, activation of otsB can also increase nitrogen-fixing activity.

[00143] В некоторых случаях на переносимый объем может оказывать влияние прикрепление к корням. На прикрепление к корням может оказывать влияние секреция экзополисахаридов. В некоторых случаях влияние на секрецию экзополисахаридов может быть оказано путем повышения экспрессии белков, продуцирующих экзополисахариды. В качестве примеров белков, продуцирующих экзополисахариды, можно привести, не ограничиваясь перечисленным, yjbE и pssM. В некоторых случаях влияние на секрецию экзополисахаридов может быть оказано путем активации биосинтеза целлюлозы. В качестве примеров генов биосинтеза целлюлозы можно привести, не ограничиваясь перечисленным, гены acs и кластеры генов bcs.[00143] In some cases, the volume transferred may be influenced by root attachment. Attachment to roots may be influenced by the secretion of exopolysaccharides. In some cases, exopolysaccharide secretion can be influenced by increasing the expression of exopolysaccharide-producing proteins. Examples of exopolysaccharide-producing proteins include, but are not limited to, yjbE and pssM. In some cases, the secretion of exopolysaccharides can be influenced by activating cellulose biosynthesis. Examples of cellulose biosynthesis genes include, but are not limited to, the acs genes and the bcs gene clusters.

[00144] В некоторых случаях на переносимый объем и/или приспособляемость микроорганизмов может оказывать влияние ингибирование грибов. На ингибирование грибов могут влиять хитиназы, которые могут разрушать клеточные стенки грибов и могут приводить к биоконтролю ризосферных грибов. В некоторых случаях влияние на ингибирование грибов может быть оказано путем активации генов хитиназы. В качестве примеров генов хитиназы можно привести, не ограничиваясь перечисленным, хитиназу класса 1 и chiA.[00144] In some cases, the volume tolerated and/or adaptability of microorganisms may be affected by fungal inhibition. Fungal inhibition may be influenced by chitinases, which can degrade fungal cell walls and may lead to biocontrol of rhizosphere fungi. In some cases, fungal inhibition can be influenced by activating chitinase genes. Examples of chitinase genes include, but are not limited to, class 1 chitinase and chiA.

[00145] В некоторых случаях эффективное поглощение железа может способствовать выживанию микроорганизмов в ризосфере, где им приходится конкурировать с другими почвенными микроорганизмами и растением за поглощение железа. В некоторых случаях высокоаффинное хелатирование (сидерофоры) и системы транспорта могут способствовать компетентности в ризосфере путем: 1) обеспечения получения микроорганизмами достаточного количества железа, и 2) уменьшения доступного железа для конкурирующих видов. Увеличение способности микроорганизма осуществлять эти действия может повысить его конкурентоспособность в ризосфере. В некоторых случаях влияние на поглощение железа может быть оказано путем активации генов сидерофоров. В качестве примеров генов сидерофоров можно привести, не ограничиваясь перечисленным, yhfA, yusV, sbnA, fiu, yfiZ и fur. В некоторых случаях на поглощение железа может оказывать влияние система транспорта tonB. В некоторых случаях влияние на поглощение железа может быть оказано путем активации генов системы транспорта tonB. В качестве примеров генов транспорта tonB можно привести, не ограничиваясь перечисленным, tonB и exbAB. [00145] In some cases, efficient iron uptake can promote the survival of microorganisms in the rhizosphere, where they must compete with other soil microorganisms and the plant for iron uptake. In some cases, high-affinity chelation (siderophores) and transport systems may promote rhizosphere competence by 1) ensuring that microorganisms obtain sufficient iron, and 2) reducing the available iron for competing species. Increasing the ability of a microorganism to carry out these actions can increase its competitiveness in the rhizosphere. In some cases, iron absorption can be influenced by activating siderophore genes. Examples of siderophore genes include, but are not limited to, yhfA, yusV, sbnA, fiu, yfiZ, and fur. In some cases, iron absorption may be influenced by the tonB transport system. In some cases, iron absorption can be influenced by activating the genes of the tonB transport system. Examples of tonB transport genes include, but are not limited to, tonB and exbAB.

[00146] В некоторых случаях на переносимый объем и/или приспособляемость микроорганизмов может оказывать влияние окислительно-восстановительное равновесие и/или поглощение АФК. На окислительно-восстановительное равновесие и/или поглощение АФК может оказывать влияние биосинтез бактериального глутатиона (GSH). В некоторых случаях влияние на биосинтез бактериального глутатиона (GSH) может быть оказано путем активации генов биосинтеза бактериального глутатиона. В качестве примеров генов биосинтеза бактериального глутатиона можно привести, не ограничиваясь перечисленным, gshA, gshAB и gshB.[00146] In some cases, the volume tolerated and/or adaptability of microorganisms may be influenced by redox equilibrium and/or ROS scavenging. Redox equilibrium and/or ROS scavenging may be influenced by bacterial glutathione (GSH) biosynthesis. In some cases, bacterial glutathione (GSH) biosynthesis can be influenced by activating bacterial glutathione biosynthetic genes. Examples of bacterial glutathione biosynthesis genes include, but are not limited to, gshA, gshAB, and gshB.

[00147] В некоторых случаях на окислительно-восстановительное равновесие может оказывать влияние поглощение АФК. В некоторых случаях влияние на поглощение АФК может быть оказано путем активации каталаз. В качестве примеров генов каталаз можно привести, не ограничиваясь перечисленным, katEG и Mn-каталазу.[00147] In some cases, redox equilibrium may be affected by ROS uptake. In some cases, ROS scavenging can be influenced by activation of catalases. Examples of catalase genes include, but are not limited to, katEG and Mn-catalase.

[00148] В некоторых случаях на образование биопленки может оказывать влияние фосфорная сигнализация. В некоторых случаях влияние на фосфорную сигнализацию может быть оказано путем изменения экспрессии генов, ответственных за фосфорную сигнализацию. В качестве примеров генов, ответственных за фосфорную сигнализацию, можно привести, не ограничиваясь перечисленным, phoR и phoB.[00148] In some cases, biofilm formation may be influenced by phosphorus signaling. In some cases, phosphorus signaling can be influenced by changing the expression of genes responsible for phosphorus signaling. Examples of genes responsible for phosphorus signaling include, but are not limited to, phoR and phoB.

[00149] В некоторых случаях на переносимый объем может оказывать влияние прикрепление к корням. На прикрепление к корням может оказывать влияние биосинтез сурфактина. В некоторых случаях влияние на биосинтез сурфактина может быть оказано путем активации биосинтеза сурфактина для улучшения образования биопленки. В качестве примера гена биосинтеза сурфактина можно привести, не ограничиваясь перечисленным, srfAA.[00149] In some cases, the volume transferred may be influenced by root attachment. Attachment to roots may be influenced by surfactin biosynthesis. In some cases, surfactin biosynthesis can be influenced by activating surfactin biosynthesis to improve biofilm formation. An example of a surfactin biosynthesis gene includes, but is not limited to, srfAA.

[00150] В некоторых случаях на колонизацию и/или приспособляемость микроорганизмов может оказывать переносимый объем, конкуренция с другими микроорганизмами и/или защита сельскохозяйственной культуры от других микроорганизмов. В некоторых случаях на конкуренцию с другими микроорганизмами и/или защиту сельскохозяйственной культуры от других микроорганизмов может оказывать влияние чувство кворума и/или гашение кворума. Гашение кворума может оказывать влияние на колонизацию путем подавления чувства кворума потенциальных патогенных/конкурирующих бактерий. В некоторых случаях влияние на гашение кворума может быть оказано путем вставки и/или активации генов, кодирующих ферменты гашения кворума. В качестве примеров генов, ответственных за гашение кворума, можно привести, не ограничиваясь перечисленным, ahlD, Y2-aiiA, aiiA, ytnP и attM. В некоторых случаях модификация ферментов, участвующих в гашении кворума, таких как Y2-aiiA и/или ytnP, может быть полезной для колонизации. В некоторых случаях активация Y2-aiiA и/или ytnP может привести к гидролизу внеклеточного ацил-гомосеринлактона (АГЛ). aiiA представляет собой N-ацил-гомосерин-лактоназу, которая является ферментом, расщепляющим лактон гомосерина. Расщепление АГЛ может остановить или замедлить способность сигнализировать о кворуме конкурирующих грамотрицательных бактерий. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения колонизации, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00150] In some cases, colonization and/or fitness of microorganisms may be affected by the volume carried, competition with other microorganisms, and/or protection of the crop from other microorganisms. In some cases, competition with other microorganisms and/or defense of the crop against other microorganisms may be affected by quorum sensing and/or quorum quenching. Quorum quenching may influence colonization by suppressing quorum sensing of potential pathogenic/competing bacteria. In some cases, quorum quenching can be influenced by insertion and/or activation of genes encoding quorum quenching enzymes. Examples of genes responsible for quorum quenching include, but are not limited to, ahlD, Y2-aiiA, aiiA, ytnP, and attM. In some cases, modification of enzymes involved in quorum quenching, such as Y2-aiiA and/or ytnP, may be beneficial for colonization. In some cases, activation of Y2-aiiA and/or ytnP can lead to hydrolysis of extracellular acyl-homoserine lactone (AHL). aiiA is an N-acyl-homoserine lactonase, which is an enzyme that cleaves homoserine lactone. AHL cleavage can stop or slow down the quorum signaling ability of competing Gram-negative bacteria. In some cases, strains that may be used in this colonization enhancement process may include, but are not limited to, Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari, and Klebsiella variicola strains.

[00151] В некоторых случаях на переносимый объем и/или приспособляемость микроорганизмов может оказывать влияние биосинтез ризобитоксина. Биосинтез ризобитоксина может снижать продукцию этилена в корне путем ингибирования АЦК-синтазы. В некоторых случаях влияние на биосинтез ризобитоксина может быть оказано путем активации генов биосинтеза ризобитоксина. [00151] In some cases, the tolerable volume and/or adaptability of microorganisms may be influenced by the biosynthesis of rhizobitoxin. Biosynthesis of rhizobitoxin can reduce ethylene production in the root by inhibiting ACC synthase. In some cases, rhizobitoxin biosynthesis can be influenced by activating rhizobitoxin biosynthesis genes.

[00152] В некоторых случаях на переносимый объем может оказывать влияние прикрепление к корням. На прикрепление к корням может оказывать влияние секреция экзополисахаридов. В некоторых случаях влияние на секрецию экзополисахарида может быть оказано путем создания гипермукоидных мутантов путем удаления mucA. [00152] In some cases, the volume transferred may be influenced by root attachment. Attachment to roots may be influenced by the secretion of exopolysaccharides. In some cases, exopolysaccharide secretion can be influenced by creating hypermucoid mutants by deleting mucA.

[00153] В некоторых случаях на прикрепление к корням может оказывать влияние биосинтез феназина. В некоторых случаях влияние на биосинтез феназина может быть оказано путем активации генов биосинтеза феназина для улучшения образования биопленки.[00153] In some cases, root attachment may be influenced by phenazine biosynthesis. In some cases, phenazine biosynthesis can be influenced by activating phenazine biosynthesis genes to improve biofilm formation.

[00154] В некоторых случаях на прикрепление к корням может оказывать влияние биосинтез циклических липопептидов (CLP). В некоторых случаях влияние на биосинтез циклических липопептидов (CLP) может быть оказано путем активации биосинтеза CLP для улучшения образования биопленки.[00154] In some cases, root attachment may be influenced by cyclic lipopeptide (CLP) biosynthesis. In some cases, cyclic lipopeptide (CLP) biosynthesis can be influenced by activating CLP biosynthesis to improve biofilm formation.

В некоторых случаях на переносимый объем и/или конкуренцию может оказывать влияние синтез антибиотиков. Синтез антибиотиков может повышать продукцию антибиотиков для уничтожения конкурирующих микроорганизмов. В некоторых случаях повышение продукции антибиотиков может быть достигнуто путем исследования геномов на предмет путей биосинтеза антибиотиков и активации. In some cases, the volume tolerated and/or competition may be influenced by antibiotic synthesis. Antibiotic synthesis can increase the production of antibiotics to kill competing microorganisms. In some cases, increased antibiotic production can be achieved by examining genomes for antibiotic biosynthesis and activation pathways.

[00155] В некоторых случаях на колонизацию может оказывать влияние устойчивость к высушиванию. В некоторых случаях модификация rpoE может быть полезна для колонизации. В некоторых случаях активация rpoE может приводить к повышению экспрессии генов и путей, ответственных за устойчивость к стрессу. В некоторых случаях rpoE может быть активирован с помощью уникального переключаемого промотора. В некоторых случаях rpoE может быть активирован с использованием промотора арабинозы. rpoE является сигма-фактором, схожим с phyR. При экспрессии rpoE может вызывать активацию множества генов, ответственных за устойчивость к стрессу. Поскольку ферменты, ответственные за устойчивость к стрессу, могут быть бесполезны во время цикла колонизации, может быть использован переключаемый промотор. В некоторых случаях промотор может быть активным во время роста биомассы и/или во время нанесения покрытия на семена. В некоторых случаях может быть использован переключаемый промотор, где в течение логарифмической фазы роста биомассы может быть внесена добавка сахара или химического вещества, но где также во время одного или нескольких других применений микроорганизма промотор может быть не включен. В некоторых случаях rpoE может быть активирован при одновременном подавлении rseA. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения колонизации, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00155] In some cases, colonization may be influenced by desiccation resistance. In some cases, modification of rpoE may be beneficial for colonization. In some cases, activation of rpoE can lead to increased expression of genes and pathways responsible for stress resistance. In some cases, rpoE can be activated by a unique switchable promoter. In some cases, rpoE can be activated using the arabinose promoter. rpoE is a sigma factor similar to phyR. When expressed, rpoE can cause the activation of multiple genes responsible for stress resistance. Since enzymes responsible for stress resistance may not be useful during the colonization cycle, a switchable promoter can be used. In some cases, the promoter may be active during biomass growth and/or during seed coating. In some cases, a switchable promoter may be used, where during the logarithmic growth phase of the biomass a sugar or chemical additive may be added, but where also during one or more other uses of the microorganism the promoter may not be switched on. In some cases, rpoE can be activated while rseA is suppressed. In some cases, strains that may be used in this colonization enhancement process may include, but are not limited to, Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari, and Klebsiella variicola strains.

[00156] В некоторых случаях на колонизацию может оказывать влияние устойчивость к высушиванию. В некоторых случаях модификация rseA может быть полезна для колонизации. В некоторых случаях rseA может быть подавлен с помощью уникального переключаемого промотора. В некоторых случаях rseA может быть подавлен с использованием промотора арабинозы. rseA является анти-сигма-фактором, экспрессируемым совместно с rpoE. В некоторых случаях ферменты остаются связанными друг с другом, что может снизить способность rpoE действовать в качестве транскрипционного фактора или лишить его этой способности. Однако в условиях стресса resA может отщепляться и rpoE может свободно активировать/подавлять гены, ответственные за устойчивость к стрессу. Путем нарушения ко-транскрипции с rpoE уровни rpoE и resA могут быть дозированы независимо, что может быть полезным для оптимизации колонизации сконструированных штаммов. В некоторых случаях штаммы, которые могут быть использованы в этом процессе повышения колонизации, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, штаммы Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari и Klebsiella variicola. [00156] In some cases, colonization may be influenced by desiccation resistance. In some cases, modification of rseA may be beneficial for colonization. In some cases, rseA can be repressed by a unique switchable promoter. In some cases, rseA can be repressed using the arabinose promoter. rseA is an anti-sigma factor coexpressed with rpoE. In some cases, the enzymes remain associated with each other, which can reduce or eliminate the ability of rpoE to act as a transcription factor. However, under stress conditions, resA can be cleaved off and rpoE can freely activate/repress genes responsible for stress resistance. By disrupting co-transcription with rpoE, rpoE and resA levels can be dosed independently, which may be useful for optimizing colonization of engineered strains. In some cases, strains that may be used in this colonization enhancement process may include, but are not limited to, Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari, and Klebsiella variicola strains.

Получение бактериальных популяцийObtaining bacterial populations

Выделение бактерийIsolation of bacteria

[00157] Микроорганизмы, пригодны для способов и композиций, раскрытых в настоящем документе, могут быть получены путем извлечения микроорганизмов с поверхностей или тканей нативных растений. Микроорганизмы могут быть получены путем измельчения семян для выделения микроорганизмов. Микроорганизмы могут быть получены путем посадки семян в различные образцы почвы и извлечения микроорганизмов из тканей. Кроме того, микроорганизмы могут быть получены путем инокуляции растений экзогенными микроорганизмами и определения того, какие микроорганизмы появляются в растительных тканях. Неограничивающие примеры растительных тканей могут включать семя, проросток, лист, срез, растение, луковицу или клубень.[00157] Microorganisms useful for the methods and compositions disclosed herein can be obtained by extracting microorganisms from the surfaces or tissues of native plants. Microorganisms can be obtained by grinding the seeds to isolate the microorganisms. Microorganisms can be obtained by planting seeds in various soil samples and extracting microorganisms from tissues. In addition, microorganisms can be obtained by inoculating plants with exogenous microorganisms and determining which microorganisms appear in plant tissues. Non-limiting examples of plant tissues may include a seed, seedling, leaf, cut, plant, bulb or tuber.

[00158] Способ получения микроорганизмов может быть осуществлен посредством выделения бактерий из почв. Бактерии могут быть собраны из различных типов почв. В некоторых примерах почва может характеризоваться такими качествами, как высокое или низкое плодородие, уровень влажности, уровень минералов и различные методы земледелия. Например, почва может быть вовлечена в севооборот, когда различные сельскохозяйственные культуры высаживают в одну и ту же почву в ходе поочередных сезонов посадки. Последовательное выращивание разных сельскохозяйственных культур в одной и той же почве может предотвратить непропорциональное истощение запасов определенных минералов. Бактерии могут быть выделены из растений, произрастающих в выбранных почвах. Проростки растений могут быть собраны через 2-6 недель роста. Например, за один цикл уборки урожая могут быть собраны по меньшей мере 400 изолятов. Типы почв и растений свидетельствуют как о фенотипе растения, так и об условиях, которые впоследствии обеспечивают обогащение определенных фенотипов. [00158] The method for obtaining microorganisms can be carried out by isolating bacteria from soils. Bacteria can be collected from various types of soils. In some examples, soil may be characterized by qualities such as high or low fertility, moisture levels, mineral levels, and different farming practices. For example, soil may be involved in crop rotation, where different crops are planted in the same soil during alternating planting seasons. Consistently growing different crops in the same soil can prevent disproportionate depletion of certain minerals. Bacteria can be isolated from plants growing in selected soils. Plant seedlings can be harvested after 2-6 weeks of growth. For example, at least 400 isolates can be collected in one harvest cycle. Soil and plant types are indicative of both the plant's phenotype and the conditions that subsequently provide enrichment for certain phenotypes.

[00159] Микроорганизмы могут быть выделены из растительных тканей для оценки качеств микроорганизмов. Параметры для обработки образцов тканей могут варьировать для выделения различных типов ассоциированных микроорганизмов, таких как ризосферные бактерии, эпифиты или эндофиты. Изоляты могут быть культивированы в не содержащей азота среде для обогащения бактериями, осуществляющими азотфиксацию. В качестве альтернативы, микроорганизмы могут быть получены из мировых банков штаммов.[00159] Microorganisms can be isolated from plant tissues to evaluate the qualities of the microorganisms. Parameters for processing tissue samples can be varied to isolate different types of associated microorganisms, such as rhizosphere bacteria, epiphytes, or endophytes. Isolates can be cultured in nitrogen-free media to enrich for nitrogen-fixing bacteria. Alternatively, microorganisms can be obtained from global strain banks.

[00160] Для оценки качеств микроорганизмов проводят аналитику in planta. В некоторых вариантах осуществления растительная ткань может быть обработана для скрининга путем высокопроизводительной обработки ДНК и РНК. Кроме того, могут быть использованы неинвазивные измерения для оценки характеристик растений, таких как колонизация. Измерения диких микроорганизмах могут быть получены на каждом отдельном растении поочередно. Измерения диких микроорганизмов также могут быть сделаны в полевых условиях с помощью методов средней производительности. Измерения могут быть выполнены последовательно с течением времени. Может быть использована модельная растительная система, включая, но не ограничиваясь этим, сетарию (Setaria).[00160] To assess the qualities of microorganisms, in planta analytics are performed. In some embodiments, plant tissue may be processed for screening by high-throughput processing of DNA and RNA. In addition, non-invasive measurements can be used to assess plant characteristics such as colonization. Measurements of wild microorganisms can be obtained on each individual plant in turn. Measurements of wild microorganisms can also be made in the field using mid-throughput methods. Measurements can be taken sequentially over time. A model plant system may be used, including, but not limited to, Setaria.

[00161] Микроорганизмы в растительной системе могут быть подвергнуты скринингу с помощью транскрипционного профилирования микроорганизма в растительной системе. Примерами скрининга с помощью транскрипционного профилирования являются методы количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), молекулярные штрих-коды для выявления транскриптов, секвенирование нового поколения и мечение микроорганизмов флуоресцентными маркерами. Для оценки колонизации в теплице могут быть измерены влияющие факторы, включая, не ограничиваясь перечисленным, микробиом, абиотические факторы, состояние почвы, кислород, влажность, температуру, условия инокулята и локализацию корней. Азотфиксация может быть оценена у бактерий путем измерения газообразного 15N/в составе удобрения (разбавления) с помощью IRMS (изотопной масс-спектрометрии) или NanoSIMS, как описано в настоящем документе. NanoSIMS представляет собой масс-спектрометрию вторичных ионов высокого разрешения. Метод NanoSIMS представляет собой способ исследования химической активности биологических образцов. Катализ реакций восстановления и окисления, которые управляют метаболизмом микроорганизмов, может быть исследован на клеточном, субклеточном, молекулярном и элементном уровнях. NanoSIMS может обеспечить высокое пространственное разрешение, превышающее 0,1 мкм. NanoSIMS способен обнаруживать использование изотопных индикаторов, таких как ¹³C, ¹⁵N и ¹⁸O. Поэтому NanoSIMS может быть использован для анализа химической активности азота в клетке.[00161] Microorganisms in a plant system can be screened using transcriptional profiling of the microorganism in the plant system. Examples of screening using transcriptional profiling include quantitative polymerase chain reaction (qPCR) techniques, molecular barcodes for transcript detection, next-generation sequencing, and tagging of microorganisms with fluorescent markers. To assess colonization in a greenhouse, influencing factors may be measured including, but not limited to, the microbiome, abiotic factors, soil conditions, oxygen, moisture, temperature, inoculum conditions, and root location. Nitrogen fixation can be assessed in bacteria by measuring 15N gas/in the fertilizer (dilution) using IRMS (isotope mass spectrometry) or NanoSIMS, as described herein. NanoSIMS is high-resolution secondary ion mass spectrometry. The NanoSIMS method is a method for studying the chemical activity of biological samples. Catalysis of the reduction and oxidation reactions that control the metabolism of microorganisms can be studied at the cellular, subcellular, molecular and elemental levels. NanoSIMS can provide high spatial resolution greater than 0.1 μm. NanoSIMS is capable of detecting the use of isotopic tracers such as ¹³ C, ¹⁵ N and ¹⁸ O. Therefore, NanoSIMS can be used to analyze the chemical activity of nitrogen in the cell.

[00162] Автоматизированные теплицы могут быть использованы для аналитики растений. Измеряемые контрольные показатели растений в ответ на воздействие микроорганизмов включают, не ограничиваясь перечисленным, биомассу, анализ хлоропластов, ПЗС ((прибор с зарядовой связью)-камеру, измерения объемной томографии.[00162] Automated greenhouses can be used for plant analytics. Measured plant controls in response to microorganisms include, but are not limited to, biomass, chloroplast analysis, CCD (charge-coupled device) camera, volumetric tomography measurements.

[00163] Одним из способов обогащения популяции микроорганизмов является обогащение в соответствии с генотипом. Например, анализ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целевым праймером или специфичным праймером. Праймеры, разработанные для гена nifH, могут быть использованы для идентификации диазотрофов, поскольку диазотрофы экспрессируют ген nifH в процессе азотфиксации. Популяция микроорганизмов также может быть обогащена с помощью подходов, не зависящих от культуры из одной клетки, и подходов к выделению, основанных на хемотаксисе. В качестве альтернативы, целевое выделение микроорганизмов может быть осуществлено путем культивирования микроорганизмов на селективных средах. Спланированные подходы к обогащению популяций микроорганизмов желаемыми качествами могут основываться на данных биоинформатики и описаны в настоящем документе.[00163] One way to enrich a population of microorganisms is to enrich according to genotype. For example, polymerase chain reaction (PCR) analysis with a target primer or a specific primer. Primers designed for the nifH gene can be used to identify diazotrophs, since diazotrophs express the nifH gene during nitrogen fixation. Microbial populations can also be enriched using single-cell culture-independent and chemotaxis-based isolation approaches. Alternatively, targeted isolation of microorganisms can be accomplished by culturing the microorganisms on selective media. Designed approaches to enrich microbial populations with desired traits can be based on bioinformatics data and are described herein.

Обогащение микроорганизмами со способностью к азотфиксации с использованием биоинформатикиEnrichment of microorganisms with nitrogen-fixing ability using bioinformatics

[00164] Биоинформационные инструменты могут быть использованы для идентификации и выделения ризобактерий, способствующих росту растений (PGPR), которые выбирают на основе их способности осуществлять азотфиксацию. Микроорганизмы с высокой азотфиксирующей способностью могут способствовать появлению у растений благоприятных качеств. Биоинформационные способы анализа для идентификации PGPR включают, не ограничиваясь перечисленным, геномику, метагеномику, целевое выделение, секвенирование генов, секвенирование транскриптома и моделирование.[00164] Bioinformatics tools can be used to identify and isolate plant growth promoting rhizobacteria (PGPR), which are selected based on their ability to fix nitrogen. Microorganisms with a high nitrogen-fixing ability can contribute to the appearance of favorable qualities in plants. Bioinformatic analysis methods for identifying PGPR include, but are not limited to, genomics, metagenomics, targeted isolation, gene sequencing, transcriptome sequencing, and modeling.

[00165] Геномный анализ может быть использован для идентификации PGPR и подтверждения наличия мутаций с помощью методов секвенирования нового поколения, как описано в настоящем документе, и контроля версий микроорганизмов.[00165] Genomic analysis can be used to identify PGPRs and confirm the presence of mutations using next generation sequencing techniques as described herein and microbial version control.

[00166] Метагеномика может быть использована для идентификации и выделения PGPR с использованием алгоритма прогнозирования для колонизации. Метаданные также могут быть использованы для выявления присутствия сконструированного штамма в пробах из окружающей среды и теплицы.[00166] Metagenomics can be used to identify and isolate PGPR using a predictive algorithm for colonization. Metadata can also be used to detect the presence of an engineered strain in environmental and greenhouse samples.

[00167] Секвенирование транскриптома может быть использовано для прогнозирования генотипов, приводящих к фенотипам PGPR. Кроме того, транскриптомные данные используются для идентификации промоторов для изменения экспрессии генов. Транскриптомные данные могут быть проанализированы в сочетании с последовательностью всего генома (WGS) для создания моделей метаболизма и регуляторных сетей генов.[00167] Transcriptome sequencing can be used to predict genotypes leading to PGPR phenotypes. In addition, transcriptomic data are used to identify promoters to alter gene expression. Transcriptomic data can be analyzed in combination with whole genome sequence (WGS) to generate models of metabolism and gene regulatory networks.

Одомашнивание микроорганизмовDomestication of microorganisms

[00168] Микроорганизмы, выделенные из природы, могут подвергаться процессу одомашнивания, при котором микроорганизмы преобразуют в форму, которая является генетически отслеживаемой и идентифицируемой. Одним из способов одомашнивания микроорганизма является придание ему устойчивости к антибиотикам. Процесс придания устойчивости к антибиотикам может быть начат с определения чувствительности к антибиотикам в штамме микроорганизма дикого типа. Если бактерии чувствительны к антибиотику, то антибиотик может быть хорошим кандидатом для придания устойчивости к антибиотикам. Затем ген устойчивости к антибиотикам или суицидный вектор отрицательного отбора может быть включен в геном микроорганизма с использованием методов рекомбинационной инженерии. Суицидный вектор отрицательного отбора может состоять из делеции представляющего интерес гена, селектируемого маркера и маркера отрицательного отбора sacB. Отрицательный отбор может быть использован для обмена нативных последовательностей ДНК микроорганизма на гены, устойчивые к антибиотикам. Метод средней пропускной способности может использоваться для оценки нескольких микроорганизмов одновременно, что позволяет проводить параллельное одомашнивание. Альтернативные способы одомашнивания включают использование хоминг-нуклеаз для предотвращения петлеобразования последовательностей суицидного вектора или получения промежуточных векторных последовательностей.[00168] Microorganisms isolated from nature may undergo a domestication process in which the microorganisms are converted into a form that is genetically traceable and identifiable. One way to domesticate a microorganism is to make it resistant to antibiotics. The process of conferring antibiotic resistance can begin by testing the antibiotic susceptibility of a wild-type strain of the microorganism. If bacteria are sensitive to an antibiotic, then the antibiotic may be a good candidate for conferring antibiotic resistance. The antibiotic resistance gene or negative selection suicide vector can then be inserted into the genome of the microorganism using recombination engineering techniques. The negative selection suicide vector may consist of a deletion of the gene of interest, a selectable marker, and the negative selection marker sacB. Negative selection can be used to exchange native DNA sequences of a microorganism for genes that are resistant to antibiotics. The average throughput method can be used to evaluate multiple microorganisms simultaneously, allowing for parallel domestication. Alternative domestication methods include the use of homing nucleases to prevent suicide vector sequences from looping or to produce intermediate vector sequences.

[00169] ДНК-векторы могут быть введены в бактерии несколькими способами, включая электропорацию и химические трансформации. Для трансформаций может быть использована стандартная библиотека векторов. Примером способа редактирования генов является CRISPR, которому предшествует тестирование на Cas9, чтобы удостовериться в активности Cas9 в микроорганизмах.[00169] DNA vectors can be introduced into bacteria by several methods, including electroporation and chemical transformations. For transformations, the standard vector library can be used. An example of a gene editing technique is CRISPR, which is preceded by Cas9 testing to ensure Cas9 activity in microorganisms.

Нетрансгенное конструирование микроорганизмовNon-transgenic construction of microorganisms

[00170] Популяция микроорганизмов с благоприятными качествами может быть получена путем направленной эволюции. Направленная эволюция - это подход, при котором имитируется процесс естественного отбора для эволюции белков или нуклеиновых кислот в направлении определенной пользователем цели. Примером направленной эволюции является введение случайных мутаций в популяцию микроорганизмов, отбор микроорганизмов с наиболее благоприятными качествами и продолжение выращивания выбранных микроорганизмов. Наиболее благоприятные качества у способствующих росту ризобактерий (PGPR) могут состоять в азотфиксации. Метод направленной эволюции может быть итеративным и адаптивным, основанным на процессе выбора после каждой итерации. [00170] A population of microorganisms with favorable qualities can be obtained through directed evolution. Directed evolution is an approach that mimics the process of natural selection to evolve proteins or nucleic acids toward a user-defined goal. An example of directed evolution is introducing random mutations into a population of microorganisms, selecting microorganisms with the most favorable qualities, and continuing to grow the selected microorganisms. The most favorable qualities of growth promoting rhizobacteria (PGPR) may be nitrogen fixation. The directed evolution method can be iterative and adaptive, based on a selection process after each iteration.

[00171] Могут быть получены ризобактерии, способствующие росту растений (PGPR), с высокой способностью к азотфиксации. Эволюция PGPR может быть осуществлена путем введения генетического изменения. Генетическое изменение может быть введено посредством мутагенеза с помощью полимеразной цепной реакции, олигонуклеотид-направленного мутагенеза, насыщающего мутагенеза, мутагенеза с перестановкой фрагментов, гомологичной рекомбинации, систем CRISPR/Cas9, химического мутагенеза и их комбинаций. Эти подходы позволяют вводить случайные мутации в популяцию микроорганизмов. Например, мутанты могут быть получены с использованием синтетической ДНК или РНК посредством олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Мутанты могут быть получены с использованием инструментов, содержащихся в плазмидах, которые впоследствии устраняются. Представляющие интерес гены могут быть идентифицированы с использованием библиотек, полученных от других видов с улучшенными качествами, включающими, не ограничиваясь перечисленным, улучшенные свойства PGPR, улучшенную колонизацию зерновых, повышенную чувствительность к кислороду, повышенную азотфиксацию и повышенную экскрецию аммиака. Внутриродовые гены могут быть разработаны на основе этих библиотек с использованием такого программного обеспечения, как программное обеспечение для разработки Genious или Platypus. Мутации могут быть разработаны с помощью машинного обучения. Мутации могут быть разработаны с помощью метаболической модели. Автоматическая разработка мутации может быть выполнена по образцу Platypus и будет направлять РНК для Cas-направленного мутагенеза.[00171] Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) with high nitrogen fixation ability can be obtained. Evolution of PGPR can be accomplished by introducing a genetic change. The genetic change can be introduced through polymerase chain reaction mutagenesis, oligonucleotide-directed mutagenesis, saturation mutagenesis, fragment shuffling mutagenesis, homologous recombination, CRISPR/Cas9 systems, chemical mutagenesis, and combinations thereof. These approaches allow the introduction of random mutations into a population of microorganisms. For example, mutants can be generated using synthetic DNA or RNA through oligonucleotide-directed mutagenesis. Mutants can be generated using tools contained in plasmids, which are subsequently eliminated. Genes of interest can be identified using libraries derived from other species with improved properties, including, but not limited to, improved PGPR properties, improved cereal colonization, increased oxygen sensitivity, increased nitrogen fixation, and increased ammonia excretion. Intragenus genes can be designed from these libraries using software such as Genious or Platypus development software. Mutations can be developed using machine learning. Mutations can be designed using a metabolic model. Automated mutation engineering can be modeled after Platypus and will guide the RNA for Cas-directed mutagenesis.

[00172] Внутриродовые гены могут быть перенесены в микроорганизм-хозяин. Кроме того, в микроорганизм также могут быть перенесены репортерные системы. Репортерные системы характеризуют промоторы, определяют успешность трансформации, осуществляют скрининг мутантов и выступают в качестве инструментов отрицательного скрининга.[00172] Intrageneric genes can be transferred into a host microorganism. In addition, reporter systems can also be transferred into the microorganism. Reporter systems characterize promoters, determine the success of transformation, screen for mutants, and act as negative screening tools.

[00173] Микроорганизмы, несущие мутацию, могут быть культивированы посредством последовательного пассирования. Колония микроорганизма содержит один вариант микроорганизма. Колонии микроорганизмов проверяют с помощью автоматического сборщика колоний и жидкостного манипулятора. Мутанты с дупликацией генов и увеличенным числом копий экспрессируют более высокий генотип желаемого качества.[00173] Microorganisms carrying the mutation can be cultured through serial passaging. A colony of a microorganism contains one variant of the microorganism. Microbial colonies are checked using an automatic colony picker and a liquid handler. Mutants with gene duplication and increased copy number express a higher genotype of the desired quality.

Отбор микроорганизмов, способствующих росту растений, на основе азотфиксацииSelection of microorganisms that promote plant growth based on nitrogen fixation

[00174] Колонии микроорганизмов могут быть подвергнуты скринингу с использованием различных анализов для оценки азотфиксации. Одним из способов измерения азотфиксации является проведение одного ферментативного анализа, в котором измеряется экскреция азота. Альтернативным способом является анализ восстановления ацетилена (ARA) со встроенным отбором проб с течением времени. ARA может быть проведен в высокопроизводительных планшетах из массивов микропробирок. ARA может быть проведен с живыми растениями и растительными тканями. Состав сред и концентрация кислорода в средах в анализах ARA могут варьироваться. Еще один способ скрининга вариантов микроорганизмов состоит в использовании биосенсоров. Использование NanoSIMS и Рамановской микроспектроскопии может быть использовано для исследования активности микроорганизмов. В некоторых случаях бактерии также могут быть культивированы и размножены с использованием методов ферментации в биореакторах. Биореакторы предназначены для повышения стойкости роста бактерий и снижения чувствительности бактерий к кислороду. Микроферментеры на основе планшетов с производительностью от средней до высокой используют для оценки чувствительности к кислороду, потребностей в питании, азотфиксации и экскреции азота. Бактерии могут также быть совместно культивированы с конкурентными или полезными микроорганизмами для исследования скрытых путей. Проточная цитометрия может быть использована для скрининга бактерий, продуцирующих высокие уровни азота, с использованием химических, колориметрических или флуоресцентных индикаторов. Бактерии могут быть культивированы в присутствии или в отсутствие источника азота. Например, бактерии могут быть культивированы с глутамином, аммиаком, мочевиной или нитратами.[00174] Microbial colonies can be screened using various assays to assess nitrogen fixation. One way to measure nitrogen fixation is to perform a single enzymatic assay that measures nitrogen excretion. An alternative method is the acetylene reduction assay (ARA) with built-in sampling over time. ARA can be performed in high-throughput microtube array plates. ARA can be performed on living plants and plant tissues. Media composition and media oxygen concentration in ARA assays may vary. Another way to screen variants of microorganisms is to use biosensors. The use of NanoSIMS and Raman microspectroscopy can be used to study the activity of microorganisms. In some cases, bacteria can also be cultured and propagated using bioreactor fermentation techniques. Bioreactors are designed to increase the persistence of bacterial growth and reduce the sensitivity of bacteria to oxygen. Plate-based microfermenters with medium to high throughput are used to assess oxygen sensitivity, nutritional requirements, nitrogen fixation, and nitrogen excretion. Bacteria can also be co-cultured with competitive or beneficial microorganisms to explore hidden pathways. Flow cytometry can be used to screen for bacteria that produce high levels of nitrogen using chemical, colorimetric, or fluorescent indicators. Bacteria can be cultured in the presence or absence of a nitrogen source. For example, bacteria can be cultured with glutamine, ammonia, urea or nitrates.

Селекция микроорганизмовSelection of microorganisms

[00175] Селекция микроорганизмов представляет собой метод систематической идентификации и улучшения роли видов в микробиоме сельскохозяйственной культуры. Метод состоит из трех стадий: 1) отбор видов-кандидатов путем картирования взаимодействий растений и микроорганизмов и прогнозирования регуляторных сетей, связанных с конкретным фенотипом, 2) прагматическое и прогнозируемое улучшение фенотипов микроорганизмов посредством внутривидового скрещивания регуляторных сетей и кластеров генов, и 3) скрининг и отбор новых генотипов микроорганизмов, обеспечивающих желаемые фенотипы сельскохозяйственных культур. Для систематической оценки улучшения штаммов создана модель, которая связывает динамику колонизации сообщества микроорганизмов с генетической активностью посредством ключевых видов. Эта модель используется для прогнозирования селекции генетических мишеней и повышения частоты отбора улучшений в кодируемых микробиомами качествах, имеющих агрономическую значимость.[00175] Microbial breeding is a method for systematically identifying and improving the role of species in the microbiome of a crop. The method consists of three stages: 1) selection of candidate species by mapping plant-microbe interactions and predicting regulatory networks associated with a particular phenotype, 2) pragmatic and predictive improvement of microbial phenotypes through intraspecific crossing of regulatory networks and gene clusters, and 3) screening and selection of new genotypes of microorganisms that provide the desired phenotypes of crops. To systematically evaluate strain improvement, a model is created that relates microbial community colonization dynamics to genetic activity through key species. This model is used to predict selection of genetic targets and increase the frequency of selection for improvements in microbiome-encoded traits of agronomic relevance.

[00176] Получение бактерий для улучшения качеств растений (например, азотфиксации) может быть достигнуто посредством последовательного пассирования. Получение этих бактерий может быть осуществлено путем отбора растений, обладающих определенным улучшенным качеством, на которое влияет микробиологическая флора, а также идентификации бактерий и/или композиций, способных придать одно или более улучшенных качеств одному или более растениям. Один из способов получения бактерий для улучшения качества растения включает следующие стадии: (a) выделение бактерий из ткани или почвы первого растения; (b) внесение генетического изменения в одну или несколько бактерий для получения одной или более вариантных бактерий; (c) воздействие на множество растений вариантными бактериями; (d) выделение бактерий из ткани или почвы одного из множества растений, где растение, из которого выделены бактерии, имеет улучшенное качество по сравнению с другими растениями во множестве растений; и (e) повторение стадий (b)-(d) с бактериями, выделенными из растения с улучшенным качеством (стадия (d)). Стадии (b)-(d) могут повторяться любое количество раз (например, один, два, три раза, четыре раза, пять раз, десять раз или более), пока улучшенное качество в растении не достигнет желаемого уровня. Кроме того, множество растений может представлять собой более двух растений, например, 10-20 растений или 20 или более, 50 или более, 100 или более, 300 или более, 500 или более или 1000 или более растений. [00176] The production of bacteria to improve plant qualities (eg, nitrogen fixation) can be achieved through sequential passaging. The production of these bacteria can be accomplished by selecting plants that have a particular improved quality that is influenced by the microbiological flora, as well as identifying bacteria and/or compositions capable of imparting one or more improved qualities to one or more plants. One method of obtaining bacteria for plant improvement involves the following steps: (a) isolating the bacteria from the tissue or soil of the first plant; (b) introducing a genetic change into one or more bacteria to produce one or more variant bacteria; (c) exposure of multiple plants to variant bacteria; (d) isolating bacteria from the tissue or soil of one of the plurality of plants, wherein the plant from which the bacteria are isolated is of improved quality compared to other plants in the plurality of plants; and (e) repeating steps (b)-(d) with bacteria isolated from the improved plant (step (d)). Steps (b)-(d) may be repeated any number of times (eg, once, twice, three times, four times, five times, ten times or more) until the improved quality in the plant reaches the desired level. In addition, the plurality of plants may be more than two plants, such as 10-20 plants, or 20 or more, 50 or more, 100 or more, 300 or more, 500 or more, or 1000 or more plants.

[00177] Помимо получения растения с улучшенным качеством получают бактериальную популяцию, содержащую бактерии, содержащие одно или более генетических изменений, введенных в один или более генов (например, генов, регулирующих азотфиксацию). Повторяя стадии, описанные выше, можно получить популяцию бактерий, включающую наиболее подходящих представителей этой популяции, которые соотносятся с представляющим интерес качеством растения. Бактерии в этой популяции могут быть идентифицированы и могут быть определены их полезные свойства, например, с помощью генетического и/или фенотипического анализа. Генетический анализ может быть проведен на выделенных бактериях на стадии (a). Фенотипическая и/или генотипическая информация может быть получена с использованием таких методов, как: высокопроизводительный скрининг химических компонентов растительного происхождения, методы секвенирования, включая высокопроизводительное секвенирование генетического материала, методы дифференциального дисплея (включая DDRT-PCR и DD-PCR), методы микрочипов нуклеиновых кислот, РНК-секвенирование (шотган-секвенирование всего транскриптома) и qRT-ПЦР (количественная ПЦР в реальном времени). Полученная информация может быть использована для профилирования сообщества в отношении идентификации и активности присутствующих бактерий, такого как филогенетический анализ или скрининг на основе микрочипов нуклеиновых кислот, кодирующих компоненты оперонов рРНК или других содержащих таксономические сведения локусов. Примеры содержащих таксономические сведения локусов включают ген 16S рРНК, ген 23S рРНК, ген 5S рРНК, ген 5.8S рРНК, ген 12S рРНК, ген 18S рРНК, ген 28S рРНК, ген gyrB, ген rpoB, ген fusA, ген recA, ген coxl, ген nifD. Примеры процессов таксономического профилирования для определения таксонов, присутствующих в популяции, описаны в US 20140155283. Идентификация бактерий может включать характеристику активности одного или более генов или одного или более сигнальных путей, таких как гены, связанные с путем азотфиксации. В бактериальных популяциях также могут присутствовать синергетические взаимодействия (когда два компонента благодаря своей комбинации увеличивают желаемый эффект более чем на аддитивную величину) между различными видами бактерий. [00177] In addition to obtaining improved quality plants, a bacterial population is obtained containing bacteria containing one or more genetic changes introduced into one or more genes (eg, genes regulating nitrogen fixation). By repeating the steps described above, it is possible to obtain a population of bacteria comprising the most suitable members of that population that correlate with the plant quality of interest. Bacteria in this population can be identified and their beneficial properties can be determined, for example, using genetic and/or phenotypic analysis. Genetic analysis can be performed on the isolated bacteria in step (a). Phenotypic and/or genotypic information can be obtained using methods such as: high-throughput screening of plant chemical components, sequencing methods including high-throughput sequencing of genetic material, differential display methods (including DDRT-PCR and DD-PCR), nucleic acid microarray methods , RNA-sequencing (shotgun sequencing of the entire transcriptome) and qRT-PCR (quantitative real-time PCR). The information obtained can be used for community profiling regarding the identity and activity of the bacteria present, such as phylogenetic analysis or microarray-based screening of nucleic acids encoding components of rRNA operons or other taxonomically informative loci. Examples of loci containing taxonomic information include the 16S rRNA gene, 23S rRNA gene, 5S rRNA gene, 5.8S rRNA gene, 12S rRNA gene, 18S rRNA gene, 28S rRNA gene, gyrB gene, rpoB gene, fusA gene, recA gene, coxl gene, nifD gene. Examples of taxonomic profiling processes to determine the taxa present in a population are described in US 20140155283. Identification of bacteria may involve characterizing the activity of one or more genes or one or more signaling pathways, such as genes associated with the nitrogen fixation pathway. In bacterial populations, there may also be synergistic interactions (where two components, through their combination, increase the desired effect by more than an additive amount) between different bacterial species.

[00178] Генетическое изменение может представлять собой ген, выбранный из группы, состоящей из: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ. Генетическое изменение может представлять собой изменение в гене, кодирующем белок с функциональностью, выбранной из группы, состоящей из: глутаминсинтетазы, глутаминазы, глутаминсинтетазы-аденилилтрансферазы, транскрипционного активатора, анти-транскрипционного активатора, пируват:флаводоксин-оксидоредуктазы, флаводоксина или АДФ-D-рибозилтрансферазы НАД+:динитрогеназоредуктазы. Генетическое изменение может представлять собой мутацию, приводящую к одному или более из: повышенной экспрессии или активности NifA или глутаминазы; сниженной экспрессии или активности NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; сниженной аденилат-удаляющей активности GlnE; или сниженной уридилил-удаляющей активности GlnD. Введение генетического изменения может включать вставку и/или делецию одного или более нуклеотидов в сайте-мишени, например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 или более нуклеотидов. Генетическое изменение, введенное в одну или более бактерий в способах, раскрытых в настоящем документе, может представлять собой нокаутирующую мутацию (например, делецию промотора, вставку или делецию для получения преждевременного стоп-кодона, делецию целого гена), или оно может представлять собой устранение или ликвидацию активности белкового домена (например, точечную мутацию, затрагивающую активный сайт, или делецию части гена, кодирующего соответствующую часть белкового продукта), или оно может изменить или ликвидировать регуляторную последовательность гена-мишени. Также может быть вставлена одна или более регуляторных последовательностей, включая гетерологичные регуляторные последовательности и регуляторные последовательности, содержащиеся в геноме вида или рода бактерий, соответствующего бактериям, в которые вводится генетическое изменение. Кроме того, регуляторные последовательности могут быть выбраны на основе уровня экспрессии гена в бактериальной культуре или в растительной ткани. Генетическое изменение может представлять собой предопределенное генетическое изменение, намеренно вводимое в сайт-мишень. Генетическое изменение может представлять собой случайную мутацию в пределах сайта-мишени. Генетическое изменение может представлять собой вставку или делецию одного или более нуклеотидов. В некоторых случаях множество различных генетических изменений (например, 2, 3, 4, 5, 10 или более) вводят в одну или более выделенных бактерий перед тем, как подвергнуть растения воздействию бактерий для оценки улучшения качеств. Множество генетических изменений может иметь любой из вышеуказанных типов, одинаковых или разных типов и в любой комбинации. В некоторых случаях множество различных генетических изменений вводят последовательно, вводя первое генетическое изменение после первой стадии выделения, второе генетическое изменение после второй стадии выделения и так далее, чтобы накопить в бактериях множество генетических изменений, придающих связанным растениям последовательно улучшающиеся качества.[00178] The genetic change may be a gene selected from the group consisting of: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE , nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB and nifQ. The genetic change may be a change in a gene encoding a protein with functionality selected from the group consisting of: glutamine synthetase, glutaminase, glutamine synthetase-adenylyltransferase, transcriptional activator, anti-transcriptional activator, pyruvate:flavodoxin oxidoreductase, flavodoxin or ADP-D-ribosyltransferase NAD+:dinitrogenase reductase. The genetic change may be a mutation resulting in one or more of: increased expression or activity of NifA or glutaminase; decreased expression or activity of NifL, NtrB, glutamine synthetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; reduced adenylate-removing activity of GlnE; or reduced uridylyl scavenging activity of GlnD. Introduction of a genetic change may involve the insertion and/or deletion of one or more nucleotides at the target site, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 or more nucleotides. The genetic change introduced into one or more bacteria in the methods disclosed herein may be a knockout mutation (eg, promoter deletion, insertion or deletion to produce a premature stop codon, deletion of an entire gene), or it may be an elimination or eliminating the activity of a protein domain (eg, a point mutation affecting the active site, or deletion of part of a gene encoding the corresponding part of the protein product), or it may alter or eliminate the regulatory sequence of the target gene. One or more regulatory sequences may also be inserted, including heterologous regulatory sequences and regulatory sequences contained in the genome of the bacterial species or genus corresponding to the bacteria into which the genetic change is introduced. In addition, regulatory sequences can be selected based on the level of gene expression in the bacterial culture or plant tissue. The genetic change may be a predetermined genetic change intentionally introduced into a target site. The genetic change may be a random mutation within the target site. The genetic change may be an insertion or deletion of one or more nucleotides. In some cases, many different genetic changes (eg, 2, 3, 4, 5, 10 or more) are introduced into one or more isolated bacteria before exposing the plants to the bacteria to evaluate improvement. The plurality of genetic changes may be of any of the above types, the same or different types, and in any combination. In some cases, a plurality of different genetic changes are introduced sequentially, introducing a first genetic change after the first isolation step, a second genetic change after the second isolation step, and so on, to accumulate in the bacteria a plurality of genetic changes that impart successively improved qualities to the associated plants.

[00179] В целом термин «генетическое изменение» относится к любому изменению, введенному в полинуклеотидную последовательность относительно референсного полинуклеотида, такого как референсный геном или его часть, или референсный ген или его часть. Генетическое изменение может называться «мутацией», а последовательность или организм, содержащий генетическое изменение, может называться «генетическим вариантом» или «мутантом». Генетические изменения могут оказывать любое количество эффектов, таких как повышение или снижение некоторой биологической активности, включая экспрессию генов, метаболизм и клеточную сигнализацию. Генетические изменения могут быть намеренно введены в сайт-мишень или введены случайным образом. Для введения генетического изменения доступен целый ряд молекулярных инструментов и методов. Например, генетическое изменение может быть введено посредством мутагенеза с помощью полимеразной цепной реакции, олигонуклеотид-направленного мутагенеза, насыщающего мутагенеза, мутагенеза с перестановкой фрагментов, гомологичной рекомбинации, рекомбинационной инженерии, лямбда Red-зависимой рекомбинации, систем CRISPR/Cas9, химического мутагенеза и их комбинаций. Химические методы введения генетического изменения включают воздействие на ДНК химического мутагена, например, этилметансульфоната (EMS), метилметансульфоната (MMS), N-нитрозомочевины (EN U), N-метил-N-нитро-N'-нитрозогуанидина, 4-нитрохинолин-N-оксида, диэтилсульфата, бензопирена, циклофосфамида, блеомицина, триэтилмеламина, акриламидного мономера, азотистого иприта, винкристина, диэпоксиалканов (например, диэпоксибутана), ICR-170, формальдегида, прокарбазина гидрохлорида, этиленоксида, диметилнитрозамина, 7,12-диметилбенз(а)антрацена, хлорамбуцила, гексаметилфосфорамида, бисульфана и тому подобного. Агенты, вызывающие радиационные мутации, включают ультрафиолетовое излучение, γ-облучение, рентгеновское излучение и бомбардировку быстрыми нейтронами. Генетическое изменение также может быть введено в нуклеиновую кислоту с использованием, например, триметилпсоралена с ультрафиолетовым излучением. Случайная или направленная вставка мобильного элемента ДНК, например, транспозируемого элемента, является еще одним подходящим способом получения генетического изменения. Генетические изменения могут быть введены в нуклеиновую кислоту во время амплификации в бесклеточной системе in vitro, например, с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), такого как подверженная ошибкам ПЦР. Генетические изменения могут быть введены в нуклеиновую кислоту in vitro с использованием методов перестановки в ДНК (например, перестановки экзонов, обмена доменами и тому подобного). Генетические изменения также могут быть введены в нуклеиновую кислоту в результате дефицита фермента репарации ДНК в клетке, например, ожидается, что присутствие в клетке мутантного гена, кодирующего мутантный фермент репарации ДНК, будет генерировать мутации с высокой частотой (т. е. приблизительно 1 мутацию/100 генов-1 мутацию/10000 генов) в геноме клетки. Примеры генов, кодирующих ферменты репарации ДНК, включают, не ограничиваясь перечисленным, Mut H, Mut S, Mut L и Mut U и их гомологи у других видов (например, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 и тому подобное). Иллюстративные описания различных способов введения генетических изменений содержатся, например, в Stemple (2004) Nature 5:1-7; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2(3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; и патентах США №№ 6,033,861 и 6,773,900.[00179] In general, the term “genetic change” refers to any change introduced into a polynucleotide sequence relative to a reference polynucleotide, such as a reference genome or part thereof, or a reference gene or part thereof. A genetic change may be called a "mutation", and the sequence or organism containing the genetic change may be called a "genetic variant" or "mutant". Genetic changes can have any number of effects, such as increasing or decreasing some biological activity, including gene expression, metabolism, and cell signaling. Genetic changes can be intentionally introduced into a target site or introduced randomly. A range of molecular tools and techniques are available to introduce a genetic change. For example, the genetic change can be introduced through polymerase chain reaction mutagenesis, oligonucleotide-directed mutagenesis, saturation mutagenesis, fragment shuffling mutagenesis, homologous recombination, recombination engineering, lambda Red-dependent recombination, CRISPR/Cas9 systems, chemical mutagenesis, and combinations thereof. . Chemical methods of introducing a genetic change include exposing the DNA to a chemical mutagen, such as ethyl methane sulfonate (EMS), methyl methane sulfonate (MMS), N-nitrosourea (EN U), N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine, 4-nitroquinoline-N -oxide, diethyl sulfate, benzopyrene, cyclophosphamide, bleomycin, triethylmelamine, acrylamide monomer, nitrogen mustard, vincristine, diepoxyalkanes (e.g. diepoxybutane), ICR-170, formaldehyde, procarbazine hydrochloride, ethylene oxide, dimethylnitrosamine, 7,12-dimethylbenz(a)anthracene , chlorambucil, hexamethylphosphoramide, bisulfan and the like. Agents that cause radiation mutations include ultraviolet radiation, γ-irradiation, X-rays, and fast neutron bombardment. A genetic change can also be introduced into the nucleic acid using, for example, trimethylpsoralen with ultraviolet light. Random or targeted insertion of a transposable DNA element, such as a transposable element, is another suitable method for producing a genetic change. Genetic changes can be introduced into the nucleic acid during amplification in a cell-free in vitro system, for example, using a polymerase chain reaction (PCR) technique such as error-prone PCR. Genetic changes can be introduced into nucleic acid in vitro using DNA shuffling techniques (eg, exon shuffling, domain swapping, and the like). Genetic changes can also be introduced into the nucleic acid as a result of a deficiency of a DNA repair enzyme in the cell; for example, the presence in a cell of a mutant gene encoding a mutant DNA repair enzyme is expected to generate mutations at a high frequency (i.e., approximately 1 mutation/ 100 genes - 1 mutation/10,000 genes) in the cell genome. Examples of genes encoding DNA repair enzymes include, but are not limited to, Mut H, Mut S, Mut L, and Mut U and their homologs in other species (e.g., MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 etc). Illustrative descriptions of various methods for introducing genetic changes are contained, for example, in Stemple (2004) Nature 5:1-7; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2(3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; and US Patent Nos. 6,033,861 and 6,773,900.

[00180] Генетические изменения, введенные в микроорганизмы, могут быть классифицированы как трансгенные, цисгенные, внутригеномные, внутриродовые, межродовые, синтетические, сформировавшиеся в процессе эволюции, перегруппированные или SNP (однонуклеотидные полиморфизмы).[00180] Genetic changes introduced into microorganisms can be classified as transgenic, cisgenic, intragenomic, intrageneric, intergeneric, synthetic, evolved, rearranged, or SNP (single nucleotide polymorphisms).

[00181] Генетическое изменение может быть введено во множество метаболических путей в микроорганизмах для выявления улучшений в качествах, описанных выше. Иллюстративные пути включают пути поглощения серы, биосинтез гликогена, путь регуляции глутамина, путь поглощения молибдена, путь азотфиксации, ассимиляцию аммиака, экскрецию или секрецию аммиака, поглощение азота, биосинтез глутамина, аннамокс, солюбилизацию фосфатов, транспорт органических кислот, продуцирование органических кислот, продуцирование агглютининов, гены, поглощающие активные кислородные радикалы, биосинтез индолилуксусной кислоты, биосинтез трегалозы, ферменты или пути, ответственные за разрушение клеточной стенки растений, гены, ответственные за прикрепление к корням, секрецию экзополисахаридов, путь глутаматсинтазы, пути поглощения железа, путь сидерофоров, путь хитиназы, АЦК-дезаминазу, биосинтез глутатиона, гены, ответственные за фосфорную сигнализацию, путь гашения кворума, пути цитохрома, путь гемоглобина, бактериальный гемоглобиноподобный путь, малая РНК rsmZ, биосинтез ризобитоксина, адгезионный белок lapA, путь чувства кворума АГЛ, биосинтез феназина, биосинтез циклических липопептидов и продуцирование антибиотиков.[00181] A genetic change can be introduced into a variety of metabolic pathways in microorganisms to produce improvements in the qualities described above. Exemplary pathways include sulfur uptake pathway, glycogen biosynthesis, glutamine regulatory pathway, molybdenum uptake pathway, nitrogen fixation pathway, ammonia assimilation, ammonia excretion or secretion, nitrogen uptake, glutamine biosynthesis, annamox, phosphate solubilization, organic acid transport, organic acid production, agglutinin production , reactive oxygen radical scavenging genes, indolylacetic acid biosynthesis, trehalose biosynthesis, enzymes or pathways responsible for plant cell wall breakdown, genes responsible for root attachment, exopolysaccharide secretion, glutamate synthase pathway, iron uptake pathways, siderophore pathway, chitinase pathway, ACC deaminase, glutathione biosynthesis, genes responsible for phosphorus signaling, quorum quenching pathway, cytochrome pathways, hemoglobin pathway, bacterial hemoglobin-like pathway, small RNA rsmZ, rhizobitoxin biosynthesis, adhesion protein lapA, AHL quorum sensing pathway, phenazine biosynthesis, cyclic lipopeptide biosynthesis and production of antibiotics.

[00182] Для введения желаемых мутаций могут быть использованы системы CRISPR/Cas9 (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)/CRISPR-ассоциированные (Cas). CRISPR/Cas9 обеспечивают бактерии и археи адаптивным иммунитетом против вирусов и плазмид, используя РНК CRISPR (крРНК) для управления сайленсингом инвазивных нуклеиновых кислот. Белок Cas9 (или его функциональный эквивалент и/или вариант, т. е. Cas9-подобный белок) по своей природе обладает активностью ДНК-эндонуклеазы, зависящей от ассоциации белка с двумя природными или синтетическими молекулами РНК, называемыми крРНК и тракрРНК (также называемыми гидовыми РНК). В некоторых случаях указанные две молекулы ковалентно связаны, образуя единую молекулу (также называемую одногидовой РНК («огРНК»). Таким образом, Cas9 или Cas9-подобный белок связывается с ДНК-нацеливающей РНК (этот термин включает в себя как двухмолекулярную конфигурацию гидовой РНК, так и одномолекулярную конфигурацию гидовой РНК), которая активирует Cas9 или Cas9-подобный белок и направляет белок к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Если Cas9 или Cas9-подобный белок сохраняет свою естественную ферментативную функцию, он расщепит ДНК-мишень, создавая двухцепочечный разрыв, который может привести к изменению генома (т. е. редактированию: делеции, вставке (когда присутствует донорный полинуклеотид), замене и т.д.), тем самым изменяя экспрессию генов. Некоторые варианты Cas9 (которые охватываются термином Cas9-подобный) были изменены таким образом, что они обладают сниженной активностью расщепления ДНК (в некоторых случаях они расщепляют одну цепь вместо обеих цепей ДНК-мишени, тогда как в других случаях они имеют активность расщепления ДНК в диапазоне от значительно сниженной до отсутствующей). Дополнительные иллюстративные описания систем CRISPR для введения генетического изменения содержатся, например, в US8795965.[00182] CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CRISPR-associated (Cas) systems can be used to introduce desired mutations. CRISPR/Cas9 provides bacteria and archaea with adaptive immunity against viruses and plasmids by using CRISPR RNA (crRNA) to drive the silencing of invasive nucleic acids. The Cas9 protein (or its functional equivalent and/or variant, i.e., a Cas9-like protein) inherently possesses DNA endonuclease activity dependent on the association of the protein with two natural or synthetic RNA molecules called crRNA and tracrRNA (also called guide RNA). In some cases, the two molecules are covalently linked to form a single molecule (also called single guide RNA (“sgRNA”). Thus, Cas9 or Cas9-like protein binds to DNA-targeting RNA (this term includes both the two-molecule configuration of guide RNA, and a single-molecule guide RNA configuration) that activates Cas9 or Cas9-like protein and directs the protein to the target nucleic acid sequence. If Cas9 or Cas9-like protein retains its natural enzymatic function, it will cleave the target DNA, creating a double-strand break that may result in genome modification (i.e. editing: deletion, insertion (when a donor polynucleotide is present), substitution, etc.), thereby altering gene expression.Some Cas9 variants (which are covered by the term Cas9-like) have been modified to such such that they have reduced DNA cleavage activity (in some cases they cleave one strand instead of both strands of the target DNA, while in other cases they have DNA cleavage activity ranging from greatly reduced to absent). Additional illustrative descriptions of CRISPR systems for introducing a genetic change are contained, for example, in US8795965.

[00183] В качестве метода циклической амплификации в мутагенезе с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для введения желаемых мутаций используются мутагенные праймеры. ПЦР включает циклы денатурации, отжига и удлинения. После амплификации с помощью ПЦР отбор мутантной ДНК и удаление родительской плазмидной ДНК может быть осуществлен путем: 1) замены dCTP гидроксиметилированным-dCTP в ходе ПЦР с последующим расщеплением рестриктазами для удаления только негидроксиметилированной родительской ДНК; 2) одновременного мутагенеза как гена устойчивости к антибиотику, так и изучаемого гена, изменяющего плазмиду на другую устойчивость к антибиотику, причем новая устойчивость к антибиотику затем облегчает отбор желаемой мутации; 3) после введения желаемой мутации, расщепления родительской метилированной матричной ДНК рестриктазой Dpnl, которая расщепляет только метилированную ДНК, с помощью которой обнаруживают подвергнутые мутагенезу неметилированные цепи; или 4) циркуляризации мутированных продуктов ПЦР в дополнительной реакции лигирования для повышения эффективности трансформации мутированной ДНК. Дополнительное описание иллюстративных способов содержится, например, в US 7132265, US 6713285, US 6673610, US 6391548, US 5789166, US 5780270, US 5354670, US 5071743 и US 20100267147.[00183] As a cyclic amplification method in polymerase chain reaction (PCR) mutagenesis, mutagenic primers are used to introduce desired mutations. PCR involves cycles of denaturation, annealing, and extension. After PCR amplification, selection of mutant DNA and removal of parental plasmid DNA can be accomplished by: 1) replacing dCTP with hydroxymethylated-dCTP during PCR followed by restriction enzyme digestion to remove only non-hydroxymethylated parental DNA; 2) simultaneous mutagenesis of both the antibiotic resistance gene and the gene under study, changing the plasmid to another antibiotic resistance, with the new antibiotic resistance then facilitating the selection of the desired mutation; 3) after introducing the desired mutation, cleavage of the parent methylated template DNA with the restriction enzyme Dpnl, which cleaves only methylated DNA, with the help of which mutagenized unmethylated chains are detected; or 4) circularization of mutated PCR products in an additional ligation reaction to increase the efficiency of transformation of mutated DNA. Additional description of illustrative methods is contained, for example, in US 7132265, US 6713285, US 6673610, US 6391548, US 5789166, US 5780270, US 5354670, US 5071743 and US 20100267147.

[00184] В олигонуклеотид-направленном мутагенезе, также называемом сайт-направленным мутагенезом, обычно используется синтетический ДНК-праймер. Этот синтетический праймер содержит желаемую мутацию и комплементарен матричной ДНК вокруг сайта мутации, так что он может гибридизоваться с ДНК в представляющем интерес гене. Мутация может представлять собой изменение одного основания (точечная мутация), изменения множества оснований, делецию или вставку, или их комбинацию. Затем одноцепочечный праймер удлиняют с использованием ДНК-полимеразы, которая копирует остальную часть гена. Скопированный таким образом ген содержит мутированный сайт и затем может быть введен в клетку-хозяина в качестве вектора и клонирован. Наконец, мутанты могут быть отобраны путем секвенирования ДНК, чтобы проверить, что они содержат желаемую мутацию.[00184] Oligonucleotide-directed mutagenesis, also called site-directed mutagenesis, typically uses a synthetic DNA primer. This synthetic primer contains the desired mutation and is complementary to the template DNA around the mutation site so that it can hybridize with DNA in the gene of interest. The mutation may be a single base change (point mutation), a multiple base change, a deletion or insertion, or a combination thereof. The single-stranded primer is then extended using DNA polymerase, which copies the rest of the gene. The gene thus copied contains the mutated site and can then be introduced into a host cell as a vector and cloned. Finally, mutants can be selected by DNA sequencing to verify that they contain the desired mutation.

[00185] Генетические изменения могут быть введены с использованием подверженной ошибкам ПЦР. В этой методике представляющий интерес ген амплифицируют с использованием ДНК-полимеразы в условиях, которые являются недостаточными для точности репликации последовательности. В результате продукты амплификации содержат по меньшей мере одну ошибку в последовательности. Когда ген амплифицируется и полученный(ые) продукт(ы) реакции содержат одно или более изменений в последовательности по сравнению с матричной молекулой, полученные продукты являются мутированными по сравнению с матрицей. Еще одним средством введения случайных мутаций является воздействие на клетки химического мутагена, такого как нитрозогуанидин или этилметансульфонат (Nestmann, Mutat Res 1975 June; 28(3):323-30), и вектор, содержащий ген, затем выделяют из хозяина.[00185] Genetic changes can be introduced using error-prone PCR. In this technique, the gene of interest is amplified using DNA polymerase under conditions that are insufficient for fidelity of sequence replication. As a result, the amplification products contain at least one sequence error. When a gene is amplified and the resulting reaction product(s) contain one or more changes in sequence from the template molecule, the resulting products are mutated from the template. Another means of introducing random mutations is to expose the cells to a chemical mutagen such as nitrosoguanidine or ethyl methane sulfonate (Nestmann, Mutat Res 1975 June; 28(3):323-30), and the vector containing the gene is then isolated from the host.

[00186] Насыщающий мутагенез является еще одной формой случайного мутагенеза, при котором пытаются генерировать все или почти все возможные мутации в конкретном сайте или узкой области гена. В общем смысле насыщающий мутагенез заключается в подвергании мутагенезу полного набора мутагенных кассет (где каждая кассета имеет длину, например, 1-500 оснований) в определенной полинуклеотидной последовательности, подлежащей мутированию (где последовательность, подлежащая мутированию, имеет длину, например, от 15 до 100 000 оснований). Следовательно, в каждую кассету, подлежащую мутированию, вводится группа мутаций (например, в диапазоне от 1 до 100 мутаций). Группировка мутаций, подлежащих введению в одну кассету, может отличаться или совпадать со второй группой мутаций, подлежащих введению во вторую кассету во время применения одного цикла насыщающего мутагенеза. Примерами таких группировок являются делеции, добавления, группировки определенных кодонов и группировки определенных нуклеотидных кассет.[00186] Saturation mutagenesis is another form of random mutagenesis that attempts to generate all or nearly all possible mutations at a specific site or narrow region of a gene. In general, saturation mutagenesis involves subjecting to mutagenesis the entire set of mutagen cassettes (where each cassette is, for example, 1-500 bases in length) at a specific polynucleotide sequence to be mutated (wherein the sequence to be mutated is, for example, 15 to 100 bases in length) 000 bases). Therefore, a group of mutations (eg, ranging from 1 to 100 mutations) is introduced into each cassette to be mutated. The group of mutations to be introduced into one cassette may be different from or the same as a second group of mutations to be introduced into a second cassette during the application of one cycle of saturating mutagenesis. Examples of such groupings are deletions, additions, groupings of certain codons, and groupings of certain nucleotide cassettes.

[00187] Мутагенез перестановки фрагментов, также называемый перестановкой в ДНК, является способом быстрого распространения полезных мутаций. В примере процесса перестановки используют ДНКазу для фрагментации набора родительских генов на участки длиной, например, приблизительно 50-100 п.н. Затем проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) без праймеров - фрагменты ДНК с достаточной перекрывающейся гомологичной последовательностью будут отжигаться друг с другом и затем удлиняться ДНК-полимеразой. Допускается несколько циклов этого удлинения методом ПЦР после того, как некоторые молекулы ДНК достигнут размера родительских генов. Эти гены могут быть затем амплифицированы с помощью другой ПЦР, на этот раз с добавлением праймеров, сконструированных таким образом, чтобы они были комплементарны концам цепей. Праймеры могут иметь дополнительные последовательности, добавленные к их 5'-концам, такие как последовательности сайтов распознавания рестриктаз, необходимые для лигирования в клонирующий вектор. Дополнительные примеры методик перестановки приведены в US 20050266541.[00187] Fragment shuffling mutagenesis, also called DNA shuffling, is a method for the rapid spread of beneficial mutations. An example shuffling process uses DNase to fragment a set of parental genes into sections of, for example, approximately 50-100 bp in length. A polymerase chain reaction (PCR) is then carried out without primers - DNA fragments with sufficient overlapping homologous sequence will anneal to each other and then be extended by DNA polymerase. Several cycles of this PCR extension are allowed after some DNA molecules have reached the size of the parent genes. These genes can then be amplified by another PCR, this time adding primers designed to be complementary to the ends of the strands. Primers may have additional sequences added to their 5' ends, such as restriction enzyme recognition site sequences necessary for ligation into a cloning vector. Additional examples of permutation techniques are provided in US 20050266541.

[00188] Гомологичный рекомбинационный мутагенез включает рекомбинацию между экзогенным фрагментом ДНК и полинуклеотидной последовательностью-мишенью. После того, как происходит двухцепочечный разрыв, участки ДНК вокруг 5'-концов разрыва обрезаются в ходе процесса, называемого резекцией. На следующей стадии инвазии цепей выступающий 3'-конец сломанной молекулы ДНК затем «внедряется» в схожую или идентичную молекулу ДНК, не являющуюся сломанной. Этот метод может быть использован для делеции гена, удаления экзонов, добавления гена и введения точечных мутаций. Гомологичный рекомбинационный мутагенез может быть постоянным или зависящим от определенных условий. Как правило, также предоставляется матрица рекомбинации. Матрица рекомбинации может представлять собой компонент другого вектора, содержаться в отдельном векторе или предоставляться в виде отдельного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления матрица рекомбинации предназначена для использования в качестве матрицы в гомологичной рекомбинации, например, внутри или вблизи последовательности-мишени, никованной или расщепленной сайт-специфической нуклеазой. Матричный полинуклеотид может иметь любую подходящую длину, например, приблизительно 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 нуклеотидов или более. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид является комплементарным части полинуклеотида, содержащего последовательность-мишень. При оптимальном выравнивании матричный полинуклеотид может перекрываться с одним или более нуклеотидами последовательностей-мишеней (например, приблизительно с 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 нуклеотидами или более). В некоторых вариантах осуществления, когда матричная последовательность и полинуклеотид, содержащий последовательность-мишень, оптимально выровнены, ближайший нуклеотид матричного полинуклеотида находится в пределах примерно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 или более нуклеотидов от последовательности-мишени. Неограничивающие примеры сайт-направленных нуклеаз, применимых в способах гомологичной рекомбинации, включают нуклеазы «цинковые пальцы», нуклеазы CRISPR, нуклеазы TALE и мегануклеазу. Более подробное описание применения таких нуклеаз см., например, в US 8795965 и US 20140301990.[00188] Homologous recombination mutagenesis involves recombination between an exogenous DNA fragment and a target polynucleotide sequence. After a double-strand break occurs, sections of DNA around the 5' ends of the break are trimmed in a process called resection. In the next stage of strand invasion, the protruding 3' end of the broken DNA molecule is then “incorporated” into a similar or identical DNA molecule that is not broken. This method can be used for gene deletion, exon removal, gene addition, and introduction of point mutations. Homologous recombination mutagenesis can be constant or dependent on certain conditions. Typically, a recombination matrix is also provided. The recombination template may be a component of another vector, contained in a separate vector, or provided as a separate polynucleotide. In some embodiments, the recombination template is for use as a template in homologous recombination, for example, within or near a target sequence nicked or cleaved by a site-specific nuclease. The template polynucleotide may be of any suitable length, for example, about 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 nucleotides or more. In some embodiments, the template polynucleotide is complementary to a portion of the polynucleotide containing the target sequence. When optimally aligned, the template polynucleotide may overlap one or more nucleotides of the target sequences (e.g., approximately 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 nucleotides or more). In some embodiments, when the template sequence and the polynucleotide containing the target sequence are optimally aligned, the closest nucleotide of the template polynucleotide is within about 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 , 500, 1000, 5000, 10000 or more nucleotides from the target sequence. Non-limiting examples of site-directed nucleases useful in homologous recombination methods include zinc finger nucleases, CRISPR nucleases, TALE nucleases and meganuclease. For a more detailed description of the use of such nucleases, see, for example, US 8795965 and US 20140301990.

[00189] Для создания генетических изменений могут быть использованы мутагены, создающие в основном точечные мутации и короткие делеции, вставки, трансверсии и/или транзиции, включая химические мутагены или излучение. Мутагены включают, не ограничиваясь перечисленным, этилметансульфонат, метилметансульфонат, N-этил-N-нитрозомочевину, триэтилмеламин, N-метил-N-нитрозомочевину, прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамид, диэтилсульфат, акриламидный мономер, мелфалан, азотистый иприт, винкристин, диметилнитрозамин, N-метил-N'-нитро-нитрозогуанидин, нитрозогуанидин, 2-аминопурин, 7,12-диметилбенз(а)антрацен, этиленоксид, гексаметилфосфорамид, бисульфан, диэпоксиалканы (диэпоксиоктан, диэпоксибутан и тому подобное), 2-метокси-6-хлор-9[3-(этил-2-хлорэтил)аминопропиламино]акридина дигидрохлорид и формальдегид. [00189] Mutagens can be used to create genetic changes, creating primarily point mutations and short deletions, insertions, transversions and/or transitions, including chemical mutagens or radiation. Mutagens include, but are not limited to, ethyl methane sulfonate, methyl methane sulfonate, N-ethyl-N-nitrosourea, triethylmelamine, N-methyl-N-nitrosourea, procarbazine, chlorambucil, cyclophosphamide, diethyl sulfate, acrylamide monomer, melphalan, nitrogen mustard, vincristine, dimethylnitrosamine, N -methyl-N'-nitro-nitrosoguanidine, nitrosoguanidine, 2-aminopurine, 7,12-dimethylbenz(a)anthracene, ethylene oxide, hexamethylphosphoramide, bisulfane, diepoxyalkanes (diepoxyoctane, diepoxybutane and the like), 2-methoxy-6-chloro- 9[3-(ethyl-2-chloroethyl)aminopropylamino]acridine dihydrochloride and formaldehyde.

[00190] Введение генетического изменения может представлять собой незавершенный процесс, так что некоторые бактерии в популяции обработанных бактерий несут желаемую мутацию, а другие - нет. В некоторых случаях желательно применять давление отбора для обогащения бактериями, несущими желаемое генетическое изменение. Традиционно отбор успешных генетических вариантов включал отбор по или против определенной функциональности, придаваемой или ликвидируемой генетическим изменением, например, в случае вставки гена устойчивости к антибиотику или ликвиации метаболической активности, способной превращать нелетальное соединение в летальный метаболит. Также возможно применять давление отбора на основе самой полинуклеотидной последовательности, так что необходимо введение только желаемого генетического изменения (например, без одновременной необходимости в селектируемом маркере). В этом случае давление отбора может включать расщепление геномов, лишенных генетического изменения, введенного в сайт-мишень, так что отбор эффективно направлен против референсной последовательности, в которую необходимо ввести генетическое изменение. Как правило, расщепление происходит в пределах 100 нуклеотидов от сайта-мишени (например, в пределах 75, 50, 25, 10 или менее нуклеотидов от сайта-мишени, включая расщепление рядом с сайтом-мишенью или внутри него). Расщепление может быть направлено сайт-специфической нуклеазой, выбранной из группы, состоящей из нуклеазы «цинкового пальца», нуклеазы CRISPR, нуклеазы TALE (TALEN) или мегануклеазы. Такой процесс аналогичен процессам усиления гомологичной рекомбинации в сайте-мишени, за исключением того, что не предоставляется матрица для гомологичной рекомбинации. В результате бактерии, лишенные желаемого генетического изменения, с большей вероятностью подвергаются расщеплению, которое, если его не восстанавливать, приводит к гибели клеток. Затем выжившие после отбора бактерии могут быть выделены для использования для воздействия на растения для оценки придания улучшенного качества.[00190] Introduction of a genetic change may be an incomplete process such that some bacteria in the population of treated bacteria carry the desired mutation and others do not. In some cases, it is desirable to apply selection pressure to enrich for bacteria carrying the desired genetic variation. Traditionally, selection for successful genetic variants has involved selection for or against a specific functionality conferred or eliminated by a genetic change, such as the insertion of an antibiotic resistance gene or the elimination of a metabolic activity capable of converting a non-lethal compound into a lethal metabolite. It is also possible to apply selection pressure based on the polynucleotide sequence itself, such that only the desired genetic change needs to be introduced (eg, without the simultaneous need for a selectable marker). In this case, selection pressure may involve the segregation of genomes lacking the genetic change introduced at the target site, so that selection is effectively directed against the reference sequence into which the genetic change is to be introduced. Typically, cleavage occurs within 100 nucleotides of the target site (eg, within 75, 50, 25, 10 or less nucleotides of the target site, including cleavage adjacent to or within the target site). Cleavage may be directed by a site-specific nuclease selected from the group consisting of a zinc finger nuclease, a CRISPR nuclease, a TALE nuclease (TALEN), or a meganuclease. This process is similar to processes for enhancing homologous recombination at a target site, except that no template for homologous recombination is provided. As a result, bacteria lacking the desired genetic change are more likely to undergo breakdown, which, if not repaired, results in cell death. The bacteria that survive the selection can then be isolated for use on plants to evaluate for improved quality.

[00191] Нуклеаза CRISPR может быть использована в качестве сайт-специфической нуклеазы для направления расщепления на сайт-мишень. Улучшенный отбор мутантных микроорганизмов может быть достигнут при использовании Cas9 для уничтожения немутированных клеток. Затем растения инокулируют мутированными микроорганизмами, чтобы повторно подтвердить симбиоз и создать давление эволюционного отбора для отбора эффективных симбионтов. Затем микроорганизмы могут быть повторно выделены из растительных тканей. В системах нуклеаз CRISPR, используемых для отбора против невариантных организмов, могут использоваться элементы, аналогичные описанным выше в отношении введения генетического изменения, за исключением того, что не предоставляется матрица для гомологичной рекомбинации. Расщепление, направленное на сайт-мишень, таким образом, усиливает гибель пораженных клеток.[00191] A CRISPR nuclease can be used as a site-specific nuclease to direct cleavage to a target site. Improved selection of mutant microorganisms can be achieved by using Cas9 to kill unmutated cells. The plants are then inoculated with the mutated microorganisms to reaffirm the symbiosis and create evolutionary selection pressure to select for effective symbionts. The microorganisms can then be re-isolated from plant tissues. CRISPR nuclease systems used for selection against non-variant organisms may use elements similar to those described above for introducing a genetic change, except that no template for homologous recombination is provided. Cleavage directed at the target site thus enhances the death of affected cells.

[00192] Доступны другие варианты специфичного индуцирования расщепления в сайте-мишени, такие как нуклеазы «цинковые пальцы», системы нуклеаз TALE (TALEN) и мегануклеаза. Нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN) представляют собой искусственные ДНК-эндонуклеазы, полученные путем слияния ДНК-связывающего домена цинкового пальца с ДНК-расщепляющим доменом. ZFN могут быть сконструированы для нацеливания на желаемые последовательности ДНК, и это позволяет нуклеазам «цинковые пальцы» расщеплять уникальные последовательности-мишени. При введении в клетку ZFN могут быть использованы для редактирования ДНК-мишени в указанной клетке (например, генома клетки) путем индукции двухцепочечных разрывов. Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), представляют собой искусственные ДНК-эндонуклеазы, полученные путем слияния эффекторного ДНК-связывающего домена TAL (подобного активатору транскрипции) с доменом расщепления ДНК. TALEN могут быть быстро сконструированы так, чтобы связывать практически любую желаемую последовательность ДНК, и при введении в клетку TALEN могут быть использованы для редактирования ДНК-мишени в указанной клетке (например, генома клетки) путем индукции двухцепочечных разрывов. Мегануклеазы (хоминг-эндонуклеаза) представляют собой эндодезоксирибонуклеазы, характеризующиеся большим сайтом распознавания (двухцепочечные последовательности ДНК из 12-40 пар нуклеотидов). Мегануклеазы могут быть использованы для замены, устранения или модификации последовательностей с высокой направленностью. Модифицируя их последовательность распознавания посредством белковой инженерии, можно изменять последовательность-мишень. Мегануклеазы могут быть использованы для модификации всех типов генома, будь то бактериальный, растительный или животный, и обычно они группируются в четыре семейства: семейство LAGLIDADG, семейство GIY-YIG, семейство His-Cyst box и семейство HNH. Иллюстративные хоминг-эндонуклеазы включают I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII. [00192] Other options for specifically inducing target site cleavage are available, such as zinc finger nucleases, TALE nuclease (TALEN) systems, and meganuclease. Zinc finger nucleases (ZFNs) are artificial DNA endonucleases produced by fusing the DNA binding domain of a zinc finger with a DNA cleavage domain. ZFNs can be designed to target desired DNA sequences, and this allows zinc finger nucleases to cleave unique target sequences. When introduced into a cell, ZFNs can be used to edit target DNA in the cell (eg, the cell's genome) by inducing double-strand breaks. Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) are artificial DNA endonucleases produced by fusing the TAL effector DNA-binding domain (transcription activator-like) with a DNA cleavage domain. TALENs can be rapidly engineered to bind virtually any desired DNA sequence, and when introduced into a cell, TALENs can be used to edit target DNA in a specified cell (eg, the cell's genome) by inducing double-strand breaks. Meganucleases (homing endonuclease) are endodeoxyribonucleases characterized by a large recognition site (double-stranded DNA sequences of 12-40 nucleotide pairs). Meganucleases can be used to replace, eliminate or modify highly targeted sequences. By modifying their recognition sequence through protein engineering, the target sequence can be altered. Meganucleases can be used to modify all types of genome, be it bacterial, plant or animal, and they are generally grouped into four families: LAGLIDADG family, GIY-YIG family, His-Cyst box family and HNH family. Exemplary homing endonucleases include I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I -TevI, I-TevII and I-TevIII.

[00193] Способы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для введения или улучшения одного или более из множества желательных качеств. Примеры качеств, которые могут быть введены или улучшены, включают: биомассу корня, длину корня, высоту, длину побега, число листьев, эффективность водопотребления, общую биомассу, урожайность, размер плодов, размер зерна, интенсивность фотосинтеза, засухоустойчивость, жароустойчивость, солеустойчивость, устойчивость к стрессу, вызванному нематодами, устойчивость к грибковому патогену, устойчивость к бактериальному патогену, устойчивость к вирусному патогену, уровень метаболита и экспрессию протеома. Желательные качества, включая высоту, общую биомассу, биомассу корня и/или побегов, всхожесть семян, выживаемость проростков, эффективность фотосинтеза, интенсивность транспирации, количество или массу семян/плодов, урожайность зерна или плодов растения, содержание хлорофилла в листьях, интенсивность фотосинтеза, длину корня или любую их комбинацию, могут быть использованы для измерения роста и сравнены со скоростью роста контрольных сельскохозяйственных растений (например, растений без улучшенных качеств), выращиваемых в идентичных условиях. [00193] The methods of the present invention can be used to introduce or improve one or more of a variety of desirable qualities. Examples of traits that can be introduced or improved include: root biomass, root length, height, shoot length, leaf number, water efficiency, total biomass, yield, fruit size, grain size, photosynthetic rate, drought tolerance, heat tolerance, salt tolerance, tolerance to nematode stress, fungal pathogen resistance, bacterial pathogen resistance, viral pathogen resistance, metabolite level and proteome expression. Desirable qualities including height, total biomass, root and/or shoot biomass, seed germination, seedling survival, photosynthetic efficiency, transpiration rate, seed/fruit number or weight, grain or fruit yield of the plant, leaf chlorophyll content, photosynthetic rate, length roots, or any combination thereof, can be used to measure growth and compared with the growth rate of control crop plants (eg plants without improved traits) grown under identical conditions.

[00194] Предпочтительным качеством, подлежащим введению или улучшению, является азотфиксация, как описано в настоящем документе. В некоторых случаях растение, полученное способами, описанными в настоящем документе, демонстрирует разницу в качестве, которая по меньшей мере приблизительно на 5%, например, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 8%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере на 100%, по меньшей мере приблизительно на 200%, по меньшей мере приблизительно на 300%, по меньшей мере приблизительно на 400% или более, превышает контрольное сельскохозяйственное растение, выращенное в тех же условиях почвы. В дополнительных примерах растение, полученное способами, описанными в настоящем документе, демонстрирует разницу в качестве, которая по меньшей мере приблизительно на 5% превышает, например, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 8%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере на 100%, по меньшей мере приблизительно на 200%, по меньшей мере приблизительно на 300%, по меньшей мере приблизительно на 400% или более, превышает контрольное сельскохозяйственное растение, выращенное в схожих условиях почвы.[00194] A preferred quality to be introduced or improved is nitrogen fixation, as described herein. In some cases, a plant produced by the methods described herein exhibits a difference in quality that is at least about 5%, e.g., at least about 5%, at least about 8%, at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50% by at least about 60%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 80%, at least about 90%, or at least 100%, according to at least about 200%, at least about 300%, at least about 400% or more greater than a control crop plant grown under the same soil conditions. In additional examples, a plant produced by the methods described herein exhibits a difference in quality that is at least about 5% greater, such as at least about 5%, at least about 8%, at least about by 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50 %, at least about 60%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 80%, at least about 90%, or at least 100%, at least about 200%, at least about 300%, at least about 400% or more greater than a control crop plant grown under similar soil conditions.

[00195] Качество, подлежащее улучшению, может быть оценено в условиях, включающих применение одного или более биотических или абиотических факторов, вызывающих стресс. Примеры факторов, вызывающих стресс, включают абиотические стрессы (такие как тепловой стресс, солевой стресс, стресс, вызванный засухой, стресс, вызванный холодом, и стресс, вызванный низким содержанием питательных веществ) и биотические стрессы (такие как стресс, вызванный нематодами, стресс, вызванный насекомым-вредителем, стресс, вызванный грибковым патогеном, стресс, вызванный бактериальным патогеном, и стресс, вызванный вирусным патогеном).[00195] The quality to be improved may be assessed under conditions involving the application of one or more biotic or abiotic stressors. Examples of stressors include abiotic stresses (such as heat stress, salt stress, drought stress, cold stress, and nutrient stress) and biotic stresses (such as nematode stress, stress, insect pest stress, fungal pathogen stress, bacterial pathogen stress, and viral pathogen stress).

Качество, улучшаемое способами и композициями согласно настоящему изобретению, может заключаться в азотфиксации, в том числе у растения, ранее не способного к азотфиксации. В некоторых случаях бактерии, выделенные в соответствии с описанным в настоящем документе способом, продуцируют 1% или более (например, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% или более) азота растения, что может представлять собой повышение способности к азотфиксации по меньшей мере в 2 раза (например, в 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 20 раз, 50 раз, 100 раз, 1000 раз или более) по сравнению с бактериями, выделенными из первого растения до введения каких-либо генетических изменений. В некоторых случаях бактерии продуцируют 5% или более азота растения. Желаемый уровень азотфиксации может быть достигнут после повторения стадий введения генетического изменения, оказания воздействия на множество растений и выделения бактерий из растений с улучшенным качеством один или более раз (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 или более раз). В некоторых случаях повышенные уровни азотфиксации достигаются в присутствии удобрения с добавкой глутамина, аммиака или другого химического источника азота. Известны способы оценки степени азотфиксации, примеры которых описаны в настоящем документе.The quality improved by the methods and compositions of the present invention may be nitrogen fixation, including in a plant previously incapable of nitrogen fixation. In some cases, bacteria isolated in accordance with the method described herein produce 1% or more (e.g., 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% or more) of plant nitrogen, which may represent an increase in nitrogen fixation capacity of at least 2 times (e.g., 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 20 times, 50 times, 100 times, 1000 times or more) compared to bacteria isolated from the first plant before any genetic changes were introduced. In some cases, bacteria produce 5% or more of the plant's nitrogen. The desired level of nitrogen fixation can be achieved after repeating the steps of introducing a genetic change, exposing multiple plants, and isolating bacteria from the plants with improved quality one or more times (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 or more once). In some cases, increased levels of nitrogen fixation are achieved in the presence of a fertilizer supplemented with glutamine, ammonia, or another chemical source of nitrogen. There are known methods for assessing the degree of nitrogen fixation, examples of which are described herein.

[00196] Селекция микроорганизмов представляет собой метод систематической идентификации и улучшения роли видов в микробиоме сельскохозяйственной культуры. Метод состоит из трех стадий: 1) отбор видов-кандидатов путем картирования взаимодействий растений и микроорганизмов и прогнозирования регуляторных сетей, связанных с конкретным фенотипом, 2) прагматическое и прогнозируемое улучшение фенотипов микроорганизмов посредством внутривидового скрещивания регуляторных сетей и кластеров генов, и 3) скрининг и отбор новых генотипов микроорганизмов, обеспечивающих желаемые фенотипы сельскохозяйственных культур. Для систематической оценки улучшения штаммов создана модель, которая связывает динамику колонизации сообщества микроорганизмов с генетической активностью посредством ключевых видов. Эта модель используется для прогнозирования селекции генетических мишеней и повышения частоты отбора улучшений в кодируемых микробиомами качествах, имеющих агрономическую значимость.[00196] Microbial breeding is a method for systematically identifying and improving the role of species in the microbiome of a crop. The method consists of three stages: 1) selection of candidate species by mapping plant-microbe interactions and predicting regulatory networks associated with a particular phenotype, 2) pragmatic and predictive improvement of microbial phenotypes through intraspecific crossing of regulatory networks and gene clusters, and 3) screening and selection of new genotypes of microorganisms that provide the desired phenotypes of crops. To systematically evaluate strain improvement, a model is created that relates microbial community colonization dynamics to genetic activity through key species. This model is used to predict selection of genetic targets and increase the frequency of selection for improvements in microbiome-encoded traits of agronomic relevance.

Азотфиксация Nitrogen fixation

[00197] В настоящем документе описаны способы повышения азотфиксации у растения, включающие воздействие на растение бактерий, содержащих одно или более генетических изменений, введенных в один или более генов, регулирующих азотфиксацию, где бактерии продуцируют 1% или более азота в растении (например, 2%, 5%, 10% или более), что может представлять собой повышение способности к азотфиксации по меньшей мере в 2 раза по сравнению с растением в отсутствие бактерий. Бактерии могут продуцировать азот в присутствии удобрения с добавкой глутамина, мочевины, нитратов или аммиака. Генетические изменения могут представлять собой любые генетические изменения, описанные в настоящем документе, включая примеры, представленные выше, в любом количестве и любой комбинации. Генетическое изменение может быть введено в собой ген, выбранный из группы, состоящей из nifA, nifL, ntrB, ntrC, глутаминсинтетазы, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, глутаминазы, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK , nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ. Генетическое изменение может представлять собой мутацию, приводящую к одному или более из: повышенной экспрессии или активности nifA или глутаминазы; сниженной экспрессии или активности nifL, ntrB, глутаминсинтетазы, glnB, glnK, draT, amtB; сниженной аденилат-удаляющей активности GlnE; или сниженной уридилил-удаляющей активности GlnD. Генетическое изменение, введенное в одну или более бактерий в способах, описанных в настоящем документе, может представлять собой нокаутирующую мутацию, или она может ликвидировать регуляторную последовательность гена-мишени, или она может включать вставку гетерологичной регуляторной последовательности, например, вставку регуляторной последовательности, содержащейся в геноме того же вида или рода бактерий. Регуляторная последовательность может быть выбрана на основе уровня экспрессии гена в бактериальной культуре или в растительной ткани. Генетическое изменение может быть вызвано химическим мутагенезом. Растения, выращенные на стадии (c), могут быть подвергнуты воздействию биотических или абиотических факторов, вызывающих стресс.[00197] Described herein are methods for increasing nitrogen fixation in a plant, comprising exposing the plant to bacteria containing one or more genetic changes introduced into one or more nitrogen fixation regulating genes, wherein the bacteria produce 1% or more of the plant's nitrogen (e.g., 2 %, 5%, 10% or more), which may represent an increase in nitrogen fixation capacity of at least 2 times compared to the plant in the absence of bacteria. Bacteria can produce nitrogen in the presence of fertilizer containing glutamine, urea, nitrates or ammonia. Genetic changes may be any of the genetic changes described herein, including the examples presented above, in any number and in any combination. The genetic change may be introduced into a gene selected from the group consisting of nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamine synthetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY , nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB and nifQ. The genetic change may be a mutation resulting in one or more of: increased expression or activity of nifA or glutaminase; decreased expression or activity of nifL, ntrB, glutamine synthetase, glnB, glnK, draT, amtB; reduced adenylate-removing activity of GlnE; or reduced uridylyl scavenging activity of GlnD. The genetic change introduced into one or more bacteria in the methods described herein may be a knockout mutation, or it may eliminate the regulatory sequence of the target gene, or it may involve the insertion of a heterologous regulatory sequence, for example, the insertion of a regulatory sequence contained in genome of the same species or genus of bacteria. The regulatory sequence may be selected based on the level of gene expression in the bacterial culture or plant tissue. Genetic change can be caused by chemical mutagenesis. Plants grown in stage (c) may be exposed to biotic or abiotic stressors.

[00198] Величина азотфиксации, происходящей в растениях, описанных в настоящем документе, может быть измерена несколькими способами, например, с помощью анализа восстановления ацетилена (AR). Анализ восстановления ацетилена может быть проведен in vitro или in vivo. Свидетельства того, что определенная бактерия обеспечивает растение фиксированным азотом, могут включать: 1) общее количество N растения значительно увеличивается при инокуляции, предпочтительно с сопутствующим увеличением концентрации N в растении; 2) симптомы дефицита азота снижаются в условиях лимитирования N при инокуляции (что должно включать увеличение сухой массы); 3) фиксация N₂ документируется с использованием подхода ¹⁵N (который может представлять собой эксперименты по изотопному разведению, анализы восстановления ¹⁵N₂ или анализы распространенности ¹⁵N в природе); 4) фиксированный N включен в растительный белок или метаболит; и 5) все эти эффекты не наблюдаются у неинокулированных растений или у растений, инокулированных мутантом штамма инокулята. [00198] The amount of nitrogen fixation occurring in the plants described herein can be measured in several ways, for example, using an acetylene reduction (AR) assay. The acetylene reduction assay can be performed in vitro or in vivo. Evidence that a particular bacterium is providing fixed nitrogen to the plant may include: 1) the plant's total N supply increases significantly upon inoculation, preferably with a concomitant increase in plant N concentration; 2) symptoms of nitrogen deficiency are reduced under N-limiting conditions during inoculation (which should include an increase in dry mass); 3) _N2 fixation is documented using a ^15N approach ( _which may be isotope dilution experiments, ^15N2 reduction assays, or ^15N natural abundance assays); 4) fixed N is included in the plant protein or metabolite; and 5) all of these effects are not observed in uninoculated plants or in plants inoculated with a mutant inoculum strain.

[00199] Каскад регуляции азотфиксации дикого типа может быть представлен в виде цифровой логической цепи, где поступающие O₂ и NH₄ ⁺ проходят через вентиль NOR, выходящий поток из которого поступает в вентиль AND в дополнение к АТФ. В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в настоящем документе, нарушают влияние NH₄ ⁺ на эту цепь в нескольких точках регуляторного каскада, так что микроорганизмы могут продуцировать азот даже на удобренных полях. Однако способы, раскрытые в настоящем документе, также предусматривают изменение влияния АТФ или O₂ на цепь или замену цепи другими регуляторными каскадами в клетке, или изменение генетических цепей, отличных от азотфиксации. Кластеры генов могут быть перестроены для создания функциональных продуктов под контролем гетерологичной регуляторной системы. Путем устранения нативных регуляторных элементов вне и внутри кодирующих последовательностей кластеров генов и замены их альтернативными регуляторными системами можно контролировать и/или перемещать в гетерологичные клетки функциональные продукты сложных генетических оперонов и других кластеров генов, включая клетки различных видов, кроме видов, из которых были получены нативные гены. После перестройки синтетические кластеры генов могут контролироваться генетическими цепями или другими индуцибельными регуляторными системами, тем самым контролируя экспрессию продуктов желаемым образом. Кассеты экспрессии могут быть спроектированы для работы в качестве логических вентилей, генераторов импульсов, генераторов колебаний, переключателей или запоминающих устройств. Управляющая кассета экспрессии может быть связана с промотором, так что кассета экспрессии выполняет функцию датчика окружающей среды, такого как датчик кислорода, температуры, тактильный сенсор, сенсор осмотического стресса, мембранного стресса или окислительно-восстановительный датчик. [00199] The wild-type nitrogen fixation regulatory cascade can be represented as a digital logic circuit where incoming O ₂ and NH ₄ ⁺ pass through the NOR gate, the effluent of which enters the AND gate in addition to ATP. In some embodiments, the methods disclosed herein disrupt the influence of NH ₄ ⁺ on this chain at multiple points in the regulatory cascade so that microorganisms can produce nitrogen even in fertilized fields. However, the methods disclosed herein also involve changing the influence of ATP or O ₂ on the chain, or replacing the chain with other regulatory cascades in the cell, or changing genetic circuits other than nitrogen fixation. Gene clusters can be rearranged to create functional products under the control of a heterologous regulatory system. By eliminating native regulatory elements outside and within the coding sequences of gene clusters and replacing them with alternative regulatory systems, the functional products of complex genetic operons and other gene clusters can be controlled and/or translocated into heterologous cells, including cells of different species other than the species from which the native ones were derived. genes. Once rearranged, synthetic gene clusters can be controlled by genetic circuits or other inducible regulatory systems, thereby controlling the expression of products in the desired manner. Expression cassettes can be designed to function as logic gates, pulse generators, oscillators, switches, or storage devices. The control expression cassette may be coupled to a promoter such that the expression cassette functions as an environmental sensor, such as an oxygen sensor, a temperature sensor, a tactile sensor, an osmotic stress sensor, a membrane stress sensor, or a redox sensor.

[00200] Например, гены nifL, nifA, nifT и nifX могут быть удалены из кластера генов nif. Синтетические гены могут быть сконструированы путем рандомизации кодонов ДНК, кодирующей каждую аминокислотную последовательность. Выполняют отбор кодонов так, чтобы использование кодонов было максимально отличным от использования кодонов в нативном гене. Предложенные последовательности сканируют на наличие любых нежелательных признаков, таких как сайты распознавания рестриктаз, сайты распознавания транспозонов, повторяющиеся последовательности, промоторы сигма-54 и сигма-70, криптические сайты связывания рибосомы и rho-независимые терминаторы. Синтетические сайты связывания рибосомы выбирают так, чтобы они соответствовали силе каждого соответствующего нативного сайта связывания рибосомы, например, путем конструирования флуоресцентной репортерной плазмиды, в которой 150 п.н., окружающие старт-кодон гена (от -60 до +90), слиты с флуоресцентным геном. Эта химера может быть экспрессирована под контролем промотора Ptac, и флуоресценция может быть измерена с помощью проточной цитометрии. Для создания синтетических сайтов связывания рибосомы генерируют библиотеку репортерных плазмид с использованием 150 п.н. (от -60 до +90) синтетической кассеты экспрессии. Вкратце, синтетическая кассета экспрессии может состоять из случайного ДНК спейсера, вырожденной последовательности, кодирующей библиотеку RBS, и кодирующей последовательности для каждого синтетического гена. Несколько клонов подвергают скринингу для идентификации синтетического сайта связывания рибосомы, который наилучшим образом соответствует нативному сайту связывания рибосомы. Таким образом конструируют синтетические опероны, состоящие из тех же генов, что и нативные опероны, и тестируют их на функциональную комплементацию. Более подробное иллюстративное описание синтетических оперонов приведено в US 20140329326.[00200] For example, the nifL, nifA, nifT, and nifX genes may be deleted from the nif gene cluster. Synthetic genes can be constructed by randomizing the codons of the DNA encoding each amino acid sequence. Codon selection is performed so that codon usage is as different as possible from codon usage in the native gene. The proposed sequences are scanned for any undesirable features such as restriction enzyme recognition sites, transposon recognition sites, repetitive sequences, sigma-54 and sigma-70 promoters, cryptic ribosome binding sites and rho-independent terminators. Synthetic ribosome binding sites are selected to match the strength of each corresponding native ribosome binding site, for example by constructing a fluorescent reporter plasmid in which the 150 bp surrounding the gene start codon (-60 to +90) is fused to fluorescent gene. This chimera can be expressed under the control of the Ptac promoter and fluorescence can be measured by flow cytometry. To create synthetic ribosome binding sites, a reporter plasmid library is generated using 150 bp. (-60 to +90) synthetic expression cassette. Briefly, a synthetic expression cassette may consist of a random DNA spacer, a degenerate sequence encoding an RBS library, and a coding sequence for each synthetic gene. Several clones are screened to identify a synthetic ribosome binding site that best matches the native ribosome binding site. In this way, synthetic operons consisting of the same genes as native operons are constructed and tested for functional complementation. A more detailed illustrative description of synthetic operons is provided in US 20140329326.

Виды бактерийTypes of bacteria

[00201] Микроорганизмы, пригодные для способов и композиций, раскрытых в настоящем документе, могут быть получены из любого источника. В некоторых случаях микроорганизмы могут представлять собой бактерии, археи, простейших или грибы. Микроорганизмы согласно настоящему изобретению могут представлять собой азотфиксирующие микроорганизмы, например, азотфиксирующие бактерии, азотфиксирующие археи, азотфиксирующие грибы, азотфиксирующие дрожжи или азотфиксирующих простейших. Микроорганизмы, используемые в способах и композициях, раскрытых в настоящем документе, могут представлять собой спорообразующие микроорганизмы, например, спорообразующие бактерии. В некоторых случаях бактерии, пригодные для способов и композиций, раскрытых в настоящем документе, могут представлять собой грамположительные бактерии или грамотрицательные бактерии. В некоторых случаях бактерии могут представлять собой бактерии, образующие эндоспоры, принадлежащие к типу Firmicute. В некоторых случаях бактерии могут представлять собой диазотрофа. В некоторых случаях бактерии могут не представлять собой диазотрофа. [00201] Microorganisms useful in the methods and compositions disclosed herein can be obtained from any source. In some cases, the microorganisms may be bacteria, archaea, protozoa, or fungi. The microorganisms of the present invention may be nitrogen-fixing microorganisms, such as nitrogen-fixing bacteria, nitrogen-fixing archaea, nitrogen-fixing fungi, nitrogen-fixing yeasts or nitrogen-fixing protozoa. The microorganisms used in the methods and compositions disclosed herein may be spore-forming microorganisms, such as spore-forming bacteria. In some cases, bacteria suitable for the methods and compositions disclosed herein may be gram-positive bacteria or gram-negative bacteria. In some cases, the bacteria may be endospore-forming bacteria belonging to the phylum Firmicute. In some cases, the bacteria may be diazotrophic. In some cases, the bacteria may not be diazotrophic.

[00202] Способы и композиции согласно данному изобретению могут быть использованы с археями, такими как, например, Methanothermobacter thermoautotrophicus.[00202] The methods and compositions of this invention can be used with archaea, such as, for example, Methanothermobacter thermoautotrophicus.

[00203] В некоторых случаях бактерии, которые могут быть пригодными, включают, но не ограничиваясь перечисленным, Agrobacterium radiobacter, Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminoglucosidicus, Bacillus aminovorans, Bacillus amylolyticus (также известная как Paenibacillus amylolyticus) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus cereus (синонимы: Bacillus endorhythmos, Bacillus medusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus (также известная как Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus maroccanus, Bacillus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus nigrum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus uniflagellatus, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (ранее - Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus popilliae (ранее - Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (ранее - Bacillus penetrans), Pasteuria usgae, Pectobacterium carotovorum (ранее - Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas cepacia (ранее известная как Burkholderia cepacia), Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xenorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus globerulus AQ719 (регистрационный номер NRRL B-21663), Bacillus sp. AQ175 (регистрационный номер ATCC 55608), Bacillus sp. AQ 177 (регистрационный номер ATCC 55609), Bacillus sp. AQ178 (регистрационный номер ATCC 53522) и штамм Streptomyces sp., регистрационный номер NRRL B-30145. В некоторых случаях бактерия может представлять собой Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klesiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobcter palustris, Rhodosporillum rubrum, Rhizobium leguminosarum или Rhizobium etli.[00203] In some cases, bacteria that may be suitable include, but are not limited to, Agrobacterium radiobacter, Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminoglucosidicus, Bacillus aminovorans, Bacillus amylolyticus (also known as Paenibacillus amylolyticus) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus cereus (synonyms: Bacillus endorhythmos, Bacillus medusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagul ans, Bacillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus (also known as Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus maroccanus, Bacillus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus nigrum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus uniflagellatus, Bradyrhizobium jap onicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (formerly - Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus popilliae (formerly Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (formerly Bacillus penetrans), Pasteur ia usgae, Pectobacterium carotovorum (formerly Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas cepacia (formerly known as Burkholderia cepacia), Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas sy ringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xenorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus globerulus AQ719 (register NRRL accession number B-21663), Bacillus sp. AQ175 (registration number ATCC 55608), Bacillus sp. AQ 177 (registration number ATCC 55609), Bacillus sp. AQ178 (ATCC registration number 53522) and Streptomyces sp. strain, NRRL registration number B-30145. In some cases, the bacterium may be Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klesiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobcter palustris, Rhodosporillum rubrum, Rhizobium leguminosarum or Rhizobium etli.

[00204] В некоторых случаях бактерия может представлять собой вид Clostridium, например, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutylicum. [00204] In some cases, the bacterium may be a Clostridium species, for example, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutylicum.

[00205] В некоторых случаях бактерии, используемые в способах и композициях согласно настоящему изобретению, могут представлять собой цианобактерии. Примеры родов цианобактерий включают Anabaena (например, Anagaena sp. PCC7120), Nostoc (например, Nostoc punctiforme) или Synechocystis (например, Synechocystis sp. PCC6803).[00205] In some cases, the bacteria used in the methods and compositions of the present invention may be cyanobacteria. Examples of cyanobacterial genera include Anabaena (eg Anagaena sp. PCC7120), Nostoc (eg Nostoc punctiforme) or Synechocystis (eg Synechocystis sp. PCC6803).

[00206] В некоторых случаях бактерии, используемые в способах и композициях согласно настоящему изобретению, могут принадлежать к типу Chlorobi, например, Chlorobium tepidum.[00206] In some cases, the bacteria used in the methods and compositions of the present invention may be of the Chlorobi phylum, such as Chlorobium tepidum.

[00207] В некоторых случаях микроорганизмы, используемые в способах и композициях согласно настоящему изобретению, могут содержать ген, гомологичный известному гену NifH. Последовательности известных генов NifH можно найти, например, в базе данных NifH лаборатории Zehr (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 апреля 2014 г.) или в базе данных NifH лаборатории Бакли (http://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm, а также в Gaby, John Christian, and Daniel H. Buckley. "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria." Database 2014 (2014): bau001.). В некоторых случаях микроорганизмы, используемые в способах и композициях согласно настоящему изобретению, могут содержать последовательность, кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% или более чем 99% идентичностью последовательностью из базы данных NifH лаборатории Zehr (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 апреля 2014 г.). В некоторых случаях микроорганизмы, используемые в способах и композициях согласно настоящему изобретению, могут содержать последовательность, кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% или более чем 99% идентичностью последовательности из базы данных NifH лаборатории Buckley (Gaby, John Christian, and Daniel H. Buckley. "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria." Database 2014 (2014): bau001.).[00207] In some cases, microorganisms used in the methods and compositions of the present invention may contain a gene homologous to the known NifH gene. Sequences of known NifH genes can be found, for example, in the Zehr laboratory NifH database (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, April 4, 2014) or in the Buckley laboratory NifH database (http://www .css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm, and Gaby, John Christian, and Daniel H. Buckley, "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria." Database 2014 (2014): bau001.). In some cases, microorganisms used in the methods and compositions of the present invention may contain a sequence encoding a polypeptide having at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98 %, 99%, or greater than 99% sequence identity from the Zehr laboratory NifH database (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, April 4, 2014). In some cases, microorganisms used in the methods and compositions of the present invention may contain a sequence encoding a polypeptide having at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98 %, 99%, or greater than 99% sequence identity from the NifH database of the Buckley laboratory (Gaby, John Christian, and Daniel H. Buckley. "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria." Database 2014 (2014): bau001.).

[00208] Микроорганизмы, пригодны для описанных в настоящем документе способов и композиций, могут быть получены путем извлечения микроорганизмов с поверхностей или тканей нативных растений; измельчения семян для выделения микроорганизмов; посадки семян в различных образцах почвы и выделения микроорганизмов из тканей; или инокулирования растений экзогенными микроорганизмами и определения того, какие микроорганизмы появляются в растительных тканях. Неограничивающие примеры растительных тканей включают семя, проросток, лист, срез, растение, луковицу или клубень. В некоторых случаях бактерии выделяют из семени. Параметры для обработки образцов могут варьировать для выделения различных типов ассоциированных микроорганизмов, таких как ризосферные микроорганизмы, эпифиты или эндофиты. Бактерии также могут быть получены из хранилища, такого как коллекции штаммов из окружающей среды, вместо первоначального выделения из первого растения. Микроорганизмы могут быть генотипированы и фенотипированы путем секвенирования геномов выделенных микроорганизмов; профилирования сообществ in planta; определения характеристик транскриптомной функциональности сообществ или выделенных микроорганизмов; или скрининга признаков микроорганизмов с использованием селективных или фенотипических сред (например, фенотипов азотфиксации или солюбилизации фосфатов). Отобранные штаммы- или популяции-кандидаты могут быть получены с помощью данных о последовательности; данные о фенотипе; данных о растениях (например, данных о геноме, фенотипе и/или урожайности); данных о почве (например, pH, содержании N/P/K и/или основных биотических сообществах почвы); или любой их комбинации. [00208] Microorganisms useful for the methods and compositions described herein can be obtained by extracting microorganisms from the surfaces or tissues of native plants; grinding seeds to isolate microorganisms; planting seeds in various soil samples and isolating microorganisms from tissues; or inoculating plants with exogenous microorganisms and determining which microorganisms appear in plant tissues. Non-limiting examples of plant tissues include a seed, seedling, leaf, cut, plant, bulb or tuber. In some cases, bacteria are isolated from the seed. Parameters for sample processing can be varied to isolate different types of associated microorganisms, such as rhizosphere microorganisms, epiphytes, or endophytes. Bacteria can also be obtained from a repository, such as collections of environmental strains, rather than initially being isolated from the first plant. Microorganisms can be genotyped and phenotyped by sequencing the genomes of isolated microorganisms; in planta community profiling; characterization of transcriptomic functionality of communities or isolated microorganisms; or screening for microbial traits using selective or phenotypic media (e.g., nitrogen fixation or phosphate solubilization phenotypes). Selected strains or candidate populations can be obtained using sequence data; phenotypic data; plant data (e.g. genomic, phenotypic and/or yield data); soil data (e.g. pH, N/P/K content and/or major soil biotic communities); or any combination thereof.

[00209] Бактерии и способы получения бактерий, описанные в настоящем документе, могут применяться к бактериям, способным эффективно самостоятельно размножаться на поверхности листьев, поверхности корней или внутри растительных тканей, не вызывая разрушительной защитной реакции растений, или к бактериям, устойчивых к защитным реакциям растений. Описанные в настоящем документе бактерии могут быть выделены путем культивирования экстракта растительной ткани или смыва с поверхности листа в среде без добавления азота. Однако бактерии могут быть некультивируемыми, то есть, может быть неизвестно, являются ли они культивируемыми или трудными для культивирования с использованием стандартных способов, известных в данной области техники. Описанные в настоящем документе бактерии могут представлять собой эндофита, эпифита или бактерию, населяющую ризосферу растения (ризосферные бактерии). Бактерии, полученные после повторения стадий введения генетического изменения, оказания воздействия на множество растений и выделения бактерий из растений с улучшенным качеством один или более раз (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 или более раз), могут быть эндофитными, эпифитными или ризосферными. Эндофиты представляют собой организмы, которые попадают внутрь растений, не вызывая симптомов заболевания и не вызывая образования симбиотических структур, и представляют агрономический интерес, поскольку они могут усиливать рост растений и улучшать питание растений (например, путем азотфиксации). Бактерии могут представлять собой эндофита, переносимого семенами. К переносимым семенами эндофитам относятся бактерии, связанные с семенами травы или растения или полученные из них, такие как переносимый семенами бактериальный эндофит, встречающихся в зрелых, сухих, неповрежденных (например, без трещин, видимых грибковых инфекций или преждевременно прорастания) семенах. Переносимый семенами бактериальный эндофит может быть связан с поверхностью семени или получен из нее; в качестве альтернативы или в дополнение, он может быть связан с внутренней частью семени или получен из нее (например, из семени со стерилизованной поверхностью). В некоторых случаях переносимый семенами бактериальный эндофит способен размножаться в растительной ткани, например, внутри семени. Кроме того, в некоторых случаях переносимый семенами бактериальный эндофит способен выживать после высушивания. [00209] The bacteria and methods for producing bacteria described herein can be applied to bacteria that can effectively self-propagate on leaf surfaces, root surfaces, or within plant tissues without causing a destructive plant defense response, or to bacteria that are resistant to plant defense responses . The bacteria described herein can be isolated by culturing a plant tissue extract or leaf surface wash in a medium without added nitrogen. However, the bacteria may be non-culturable, that is, it may not be known whether they are culturable or difficult to culture using standard methods known in the art. The bacteria described herein may be an endophyte, an epiphyte, or a bacterium that inhabits the rhizosphere of a plant (rhizosphere bacteria). Bacteria obtained after repeating the steps of introducing a genetic change, affecting a plurality of plants, and isolating bacteria from plants with improved quality one or more times (for example, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 or more times), may be endophytic, epiphytic or rhizosphere. Endophytes are organisms that enter plants without causing disease symptoms or causing the formation of symbiotic structures, and are of agronomic interest because they can enhance plant growth and improve plant nutrition (e.g., through nitrogen fixation). The bacteria may be a seed-borne endophyte. Seed-borne endophytes include bacteria associated with or derived from grass or plant seeds, such as seed-borne bacterial endophytes, found in mature, dry, intact (e.g., no cracks, visible fungal infections, or premature germination) seeds. The seed-borne bacterial endophyte may be associated with or derived from the seed surface; alternatively or in addition, it may be associated with or derived from the interior of the seed (eg, from a surface-sterilized seed). In some cases, a seed-borne bacterial endophyte is able to multiply in plant tissue, such as inside a seed. Additionally, in some cases, the seed-borne bacterial endophyte is able to survive desiccation.

[00210] Бактерия, выделенная в соответствии со способами согласно изобретению, или используемая в способах или композициях согласно изобретению, может содержать множество различных бактериальных таксонов в комбинации. В качестве примера, бактерии могут включать Proteobacteria (такие как Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium и Halomonas), Firmicutes (такие как Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma и Acetabacterium) и Actinobacteria (такие как Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium и Curtobacterium). Бактерии, используемые в способах и композициях согласно изобретению, могут включать азотфиксирующие бактериальные консорциумы двух или более видов бактерий. В некоторых случаях один или более видов бактерий в составе бактериальных консорциумов могут быть способны фиксировать азот. В некоторых случаях один или более видов в составе бактериальных консорциумов могут способствовать способности других бактерий фиксировать азот или усиливать ее. Бактерии, фиксирующие азот, и бактерии, усиливающие способность других бактерий фиксировать азот, могут быть одинаковыми или разными. В некоторых примерах бактериальный штамм может быть способен фиксировать азот в сочетании с другим бактериальным штаммом или в определенных бактериальных консорциумах, но может быть неспособен фиксировать азот в монокультуре. Примеры родов бактерий, которые могут встречаться в азотфиксирующих бактериальных консорциумах, включают, не ограничиваясь перечисленным, Herbaspirillum , Azospirillum, Enterobacter и Bacillus.[00210] The bacterium isolated in accordance with the methods of the invention, or used in the methods or compositions of the invention, may contain many different bacterial taxa in combination. By way of example, bacteria may include Proteobacteria (such as Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium and Halomonas), Firmicutes (such as Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma and Acetabacterium) and Actinobacteria (such as Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium and Curtobacterium). The bacteria used in the methods and compositions of the invention may include nitrogen-fixing bacterial consortia of two or more bacterial species. In some cases, one or more bacterial species in bacterial consortia may be capable of nitrogen fixation. In some cases, one or more species within bacterial consortia may promote or enhance the nitrogen-fixing ability of other bacteria. Nitrogen-fixing bacteria and bacteria that enhance the nitrogen-fixing ability of other bacteria may be the same or different. In some examples, a bacterial strain may be able to fix nitrogen in combination with another bacterial strain or in certain bacterial consortia, but may be unable to fix nitrogen in a monoculture. Examples of bacterial genera that may occur in nitrogen-fixing bacterial consortia include, but are not limited to, Herbaspirillum, Azospirillum, Enterobacter, and Bacillus.

Бактерии, которые могут быть получены способами, раскрытыми в настоящем документе, включают Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp. и Sinorhizobium sp. В некоторых случаях бактерии могут быть выбраны из группы, состоящей из: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae и Sinorhizobium meliloti. В некоторых случаях бактерии могут принадлежать к роду Enterobacter или Rahnella. В некоторых случаях бактерии могут принадлежать к роду Frankia или Clostridium. Примеры бактерий рода Clostridium включают, не ограничиваясь перечисленным, Clostridium acetobutilicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens и Clostridium tetani. В некоторых случаях бактерии могут принадлежать к роду Paenibacillus, например, Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus borealis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae, подвид Larvae, Paenibacillus larvae, подвид Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae или Paenibacillus polymyxa.Bacteria that can be produced by the methods disclosed herein include Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp. and Sinorhizobium sp. In some cases, the bacteria may be selected from the group consisting of: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae and Sinorhizobium meliloti. In some cases, the bacteria may belong to the genus Enterobacter or Rahnella. In some cases, the bacteria may belong to the genus Frankia or Clostridium. Examples of bacteria of the genus Clostridium include, but are not limited to, Clostridium acetobutilicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens and Clostridium tetani. In some cases, the bacteria may belong to the genus Paenibacillus, for example Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus borealis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae, subspecies Larvae , Paenibacillus larvae, subspecies Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae or Paenibacillus polymyxa.

[00211] В некоторых примерах бактерии, выделенные в соответствии со способами согласно изобретению, могут принадлежать к одному или более из следующих таксонов: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter, Polynucleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, род WPS-2 incertae sedis, Xanthomonas и Zimmermannella.[00211] In some examples, bacteria isolated in accordance with the methods of the invention may belong to one or more of the following taxa: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus , Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia , Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum , Hymenobacter , Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Pa enibacillus, Panteoa , Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter, Polynucleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sedi minibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella , Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, genus WPS-2 incertae sedis, Xanthomonas and Zimmermannella.

[00212] Бактерия может быть получена из любой общей среды суши, включая ее почвы, растения, грибы, животных (включая беспозвоночных) и другую биоту, включая донные отложения, воду и биоту озер и рек; из морской среды, ее биоты и донных отложений (например, морской воды, морских грязей, морских растений, морских беспозвоночных (например, губок), морских позвоночных (например, рыб)); геосферы суши и морей (реголита и камня, например, измельченных подземных пород, песков и глин); криосферы и ее талых вод; атмосферы (например, отфильтрованной взвешенной пыли, облаков и дождевых капель); городских, промышленных и других искусственных сред (например, накопленных органических и минеральных веществ на бетоне, придорожных канавах, поверхностях крыш и дорожных покрытиях).[00212] The bacterium can be obtained from any general terrestrial environment, including its soils, plants, fungi, animals (including invertebrates) and other biota, including sediments, water and biota of lakes and rivers; from the marine environment, its biota and sediments (e.g. seawater, sea mud, marine plants, marine invertebrates (e.g. sponges), marine vertebrates (e.g. fish)); geosphere of land and seas (regolith and stone, for example, crushed underground rocks, sands and clays); cryosphere and its meltwater; atmosphere (eg filtered airborne dust, clouds and raindrops); urban, industrial and other artificial environments (for example, accumulated organic and mineral substances on concrete, roadside ditches, roof surfaces and road surfaces).

[00213] Растения, из которых получены бактерии, могут представлять собой растение, имеющее одно или более желательных качеств, например, растение, которое естественным образом произрастает в определенной среде или при определенных условиях, представляющих интерес. Например, определенное растение может естественным образом произрастать в песчаной почве или песке с высоким содержанием солей, или при экстремальных температурах, или с небольшим количеством воды, или оно может быть устойчивым к определенным сельскохозяйственным вредителям или болезням, присутствующим в окружающей среде, и это может быть желательно для выращивания промышленной сельскохозяйственной культуры в таких условиях, особенно если они являются, например, единственными условиями, доступными в определенном географическом местоположении. В качестве еще одного примера, бактерии могут быть собраны из промышленных сельскохозяйственных культур, выращиваемых в таких условиях окружающей среды, или, более конкретно, из отдельных растений сельскохозяйственной культуры, лучше всего демонстрирующих представляющее интерес качество среди сельскохозяйственной культуры, выращиваемой в любой конкретной среде: например, наиболее быстро растущих растений среди сельскохозяйственной культуры, выращиваемой в лимитированных по солям почвах, или наименее поврежденных растений в сельскохозяйственных культурах, подверженных серьезному повреждению насекомыми или эпидемическому заболеванию, или растений, имеющие желаемые количества определенных метаболитов и других соединений, включая содержание клетчатки, содержание масла и тому подобное, или растений, демонстрирующих желательные цвета, вкус или запах. Бактерии могут быть собраны из представляющего интерес растения или любого материала, встречающегося в представляющей интерес окружающей среде, включая грибы и другую животную и растительную биоту, почву, воду, донные отложения и другие элементы окружающей среды, как упоминалось ранее. [00213] The plants from which the bacteria are derived may be a plant that has one or more desirable qualities, for example, a plant that grows naturally in a particular environment or under certain conditions of interest. For example, a particular plant may grow naturally in sandy soil or sand with high salt content, or in extreme temperatures, or with little water, or it may be resistant to certain pests or diseases present in the environment, and this may be desirable for growing a commercial crop under such conditions, especially if they are, for example, the only conditions available in a particular geographic location. As another example, bacteria may be collected from industrial crops grown in such environmental conditions, or more specifically from individual plants of the crop that best demonstrate the quality of interest among the crop grown in any particular environment: e.g. , the fastest growing plants in a crop grown in salt-limited soils, or the least damaged plants in crops susceptible to severe insect damage or epidemic disease, or plants that have desired amounts of certain metabolites and other compounds, including fiber content, oil content and the like, or plants exhibiting desirable colors, tastes or odors. The bacteria can be collected from the plant of interest or any material found in the environment of interest, including fungi and other animal and plant biota, soil, water, sediment and other environmental elements, as mentioned previously.

[00214] Бактерии могут быть выделены из растительной ткани. Это выделение может происходить из любой подходящей ткани растения, включая, например, корень, стебель и листья, а также репродуктивные ткани растения. Например, традиционные способы выделения из растений обычно включают стерильное отделение представляющего интерес растительного материала (например, длины корня или стебля, листьев), стерилизацию поверхности подходящим раствором (например, 2% гипохлоритом натрия), после чего растительный материал помещают на питательную среду для выращивания микроорганизмов. В качестве альтернативы, растительный материал, поверхность которого была стерилизована, может быть измельчен в стерильной жидкости (обычно в воде), и жидкая суспензия, включающая небольшие кусочки измельченного растительного материала, может быть распределена по поверхности подходящей твердой агаровой среды или сред, которые могут быть или не быть селективными (например, содержать только фитиновую кислоту в качестве источника фосфора). Этот подход особенно подходит для бактерий, которые образуют изолированные колонии, и они могут быть собраны по отдельности на отдельные чашки с питательной средой и дополнительно очищены до одного вида хорошо известными способами. В качестве альтернативы, образцы корней или листвы растений могут не быть подвергнуты стерилизации поверхности, а лишь тщательно промыты, что позволяет включать в процесс выделения живущие на поверхности эпифитные микроорганизмы, или же эпифитные микроорганизмы могут быть выделены отдельно путем отпечатывания кусочков корней, стебля или листьев растения на поверхности агаровой среды и их снятия, после чего выделяют отдельные колонии, как указано выше. Этот подход особенно подходит, например, для бактерий. В качестве альтернативы, корни могут быть обработаны без смывания небольших количеств почвы, прилипшей к корням, что позволяет включать микроорганизмы, колонизирующие ризосферу растения. В противном случае почва, прилипшая к корням, может быть удалена, разбавлена и распределена на подходящих селективных и неселективных агаровых средах для выделения отдельных колоний ризосферных бактерий. [00214] Bacteria can be isolated from plant tissue. This release may occur from any suitable plant tissue, including, for example, the root, stem and leaves, as well as the reproductive tissues of the plant. For example, traditional isolation methods from plants typically involve sterile separation of the plant material of interest (e.g., root or stem length, leaves), sterilization of the surface with a suitable solution (e.g., 2% sodium hypochlorite), and then placing the plant material on a microbial growth medium. . Alternatively, the plant material, the surface of which has been sterilized, can be ground in a sterile liquid (usually water), and a liquid suspension comprising small pieces of ground plant material can be spread over the surface of a suitable solid agar medium or media, which may be or not be selective (for example, contain only phytic acid as a source of phosphorus). This approach is particularly suitable for bacteria that form isolated colonies, and these can be collected individually on separate culture plates and further purified to a single species by well known methods. Alternatively, samples of plant roots or foliage may not be subjected to surface sterilization, but only thoroughly washed to allow surface-dwelling epiphytic microorganisms to be included in the isolation process, or epiphytic microorganisms may be isolated separately by imprinting pieces of plant roots, stems, or leaves. on the surface of the agar medium and removing them, after which individual colonies are isolated as described above. This approach is particularly suitable for bacteria, for example. Alternatively, the roots can be treated without washing away small amounts of soil adhering to the roots, allowing the inclusion of microorganisms that colonize the plant's rhizosphere. Otherwise, soil adhering to the roots can be removed, diluted and spread on suitable selective and non-selective agar media to isolate individual colonies of rhizosphere bacteria.

[00215] Биологически чистые культуры Rahnella aquatilis и Enterobacter sacchari были депонированы 14 июля 2015 г. в Американской коллекции типовых культур (ATCC; международный орган по депонированию), Манассас, Виргиния, США, и им были присвоены номера для целей патентного депонирования PTA-122293 и PTA-122294, соответственно. Эти депонирования были осуществлены в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и Инструкции к нему (Будапештский договор).[00215] Biologically pure cultures of Rahnella aquatilis and Enterobacter sacchari were deposited on July 14, 2015 at the American Type Culture Collection (ATCC; international depository authority), Manassas, Virginia, USA, and were assigned patent deposit number PTA-122293 and PTA-122294, respectively. These deposits were made in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and its Regulations (Budapest Treaty).

КомпозицииCompositions

[00216] Композиции, содержащие бактерии или бактериальные популяции, полученные в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, и/или имеющие характеристики, описанные в настоящем документе, могут быть в форме жидкости, пены или сухого продукта. В некоторых примерах композиция, содержащая бактериальные популяции, может быть в форме сухого порошка, суспензии порошка и воды, или текучего состава для обработки семян. [00216] Compositions containing bacteria or bacterial populations prepared in accordance with the methods described herein and/or having the characteristics described herein may be in the form of a liquid, foam or dry product. In some examples, the composition containing the bacterial populations may be in the form of a dry powder, a suspension of powder and water, or a fluid seed treatment composition.

[00217] Композиция может быть изготовлена в биореакторах, таких как реакторы непрерывного действия с перемешиванием, реакторы периодического действия, а также на ферме. В некоторых примерах композиции могут храниться в контейнере, таком как бутыль, или небольшим нефасованными партиями. В некоторых примерах композиции могут храниться в объекте, выбранном из группы, состоящей из бутылки, банки, ампулы, упаковочной тары, сосуда, пакета, коробки, бункера, конверта, картонной тары, контейнера, силоса, транспортировочного контейнера, платформы грузовика и/или упаковки. [00217] The composition can be manufactured in bioreactors such as continuous stirred tank reactors, batch reactors, and on a farm. In some examples, the compositions may be stored in a container, such as a bottle, or in small bulk quantities. In some examples, the compositions may be stored in an object selected from the group consisting of a bottle, a can, an ampoule, a packaging container, a vessel, a bag, a box, a bin, an envelope, a carton, a container, a silo, a shipping container, a truck bed, and/or packaging .

[00218] Композиции также могут быть использованы для улучшения качеств растений. В некоторых примерах одна или более композиций могут быть нанесены в качестве покрытия на семя. В некоторых примерах одна или более композиций могут быть нанесены в качестве покрытия на проросток. В некоторых примерах одна или более композиций могут быть нанесены в качестве покрытия на поверхность семени. В некоторых примерах одна или несколько более могут быть нанесены в качестве слоя над поверхностью семени. В некоторых примерах композиция, нанесенная в качестве покрытия на семя, может быть в жидкой форме, в форме сухого продукта, в форме пены, в форме суспензии порошка и воды или текучего состава для обработки семян. В некоторых примерах одна или более композиций могут быть нанесены на семя и/или проросток путем распыления, погружения, нанесения покрытия, инкапсулирования и/или обсыпки семени и/или проростка одной или более композициями. В некоторых примерах множество бактерий или бактериальных популяций могут быть нанесены в качестве покрытия на семя и/или проросток растения. В некоторых примерах по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять или более десяти бактерий в составе комбинации бактерий могут быть выбраны из одного из следующих родов: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas и Stenotrophomonas. [00218] The compositions can also be used to improve plant performance. In some examples, one or more compositions may be applied as a coating to the seed. In some examples, one or more compositions may be applied as a coating to the sprout. In some examples, one or more compositions may be applied as a coating to the surface of the seed. In some examples, one or more may be applied as a layer above the surface of the seed. In some examples, the composition applied as a coating to the seed may be in liquid form, in dry product form, in foam form, in the form of a powder and water suspension, or a flowable seed treatment composition. In some examples, one or more compositions may be applied to the seed and/or sprout by spraying, dipping, coating, encapsulating and/or coating the seed and/or sprout with one or more compositions. In some examples, a plurality of bacteria or bacterial populations may be coated on a plant seed and/or seedling. In some examples, at least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight, at least nine, at least ten, or more than ten bacteria in the bacterial combination may be selected from one of the following genera: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas and Stenotrophomonas.

[00219] В некоторых примерах по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять или более десяти бактерий и бактериальных популяций в составе комбинации эндофитов выбраны из одного из следующих семейств: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae и Pleosporaceae.[00219] In some examples, at least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight, at least nine, at least ten or more than ten bacteria and bacterial populations in a combination of endophytes selected from one of the following families: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomon iaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae , Netriaceae and Pleosporaceae.

[00220] В некоторых примерах по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять или более десяти бактерий и бактериальных популяций в составе комбинации эндофитов выбраны из одного из следующих семейств: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.[00220] In some examples, at least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight, at least nine, at least ten or more than ten bacteria and bacterial populations in a combination of endophytes selected from one of the following families: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomon iaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae , Netriaceae, Pleosporaceae.

[00221] Примеры композиций могут включать покрытия семян для коммерчески важных сельскохозяйственных культур, например, сорго, канолы, томатов, клубники, ячменя, риса, маиса и пшеницы. Примеры композиций также могут включать покрытия семян для кукурузы, сои, канолы, сорго, картофеля, риса, овощей, зерновых и масличных культур. Семена, предложенные в настоящем документе, могут быть генетически модифицированными организмами (ГМО), не ГМО, органическими или обычными. В некоторых примерах композиции могут быть распылены на надземные части растения или нанесены на корни путем введения в борозды, в которые посеяны семена растений, полива почвы или погружения корней в суспензию композиции. В некоторых примерах композиции могут быть обезвожены подходящим способом, сохраняющим жизнеспособность клеток и способность искусственно инокулировать и колонизировать растения-хозяева. Виды бактерий могут присутствовать в композициях в концентрации от 10⁸ до 10¹⁰ КОЕ/мл. В некоторых примерах композиции могут быть дополнены ионами микроэлементов, такими как ионы молибдена, ионы железа, ионы марганца или комбинации этих ионов. Концентрация ионов в примерах композиций, как описано в настоящем документе, может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мМ. Некоторые примеры композиций также могут включать носитель, такой как бета-глюкан, карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), бактериальное внеклеточное полимерное вещество (EPS), сахар, молоко животного происхождения или другие подходящие носители. В некоторых примерах в качестве носителя могут быть использованы торф или посадочные материалы, или в качестве носителя могут быть использованы биополимеры, в которых заключена композиция. [00221] Examples of the compositions may include seed coatings for commercially important crops, such as sorghum, canola, tomatoes, strawberries, barley, rice, maize and wheat. Examples of the compositions may also include seed coatings for corn, soybeans, canola, sorghum, potatoes, rice, vegetables, grains and oilseeds. The seeds offered herein may be genetically modified organism (GMO), non-GMO, organic, or conventional. In some examples, the compositions may be sprayed onto aerial parts of the plant or applied to the roots by insertion into furrows in which plant seeds are sown, watering the soil, or dipping the roots into a suspension of the composition. In some examples, the compositions may be dehydrated in a suitable manner that preserves cell viability and the ability to artificially inoculate and colonize host plants. Bacterial species may be present in the compositions at concentrations ranging from 10 ⁸ to 10 ¹⁰ CFU/ml. In some examples, the compositions may be supplemented with micronutrient ions, such as molybdenum ions, iron ions, manganese ions, or combinations of these ions. The ion concentration in example compositions as described herein can range from about 0.1 to about 50 mM. Some examples of compositions may also include a carrier such as beta-glucan, carboxymethylcellulose (CMC), bacterial extracellular polymeric substance (EPS), sugar, animal milk, or other suitable carriers. In some examples, peat or planting materials may be used as the carrier, or biopolymers in which the composition is embedded may be used as the carrier.

[00222] Композиции, содержащие бактериальные популяции, описанные в настоящем документе, могут быть нанесены в качестве покрытия на поверхность семени. Как таковые также рассматриваются композиции, содержащие семена, покрытые одной или более бактериями, описанными в настоящем документе. Покрытие семян может быть сформировано путем смешивания бактериальной популяции с пористым, химически инертным гранулированным носителем. В качестве альтернативы, композиции могут быть вставлены непосредственно в борозды, в которые посеяны семена, или распылены на листья растений, или нанесены путем погружения корней в суспензию композиции. Эффективное количество композиции может быть использовано для заселения подпочвенного слоя, прилегающего к корням растения, жизнеспособными размножающимися бактериями, или для заселения листьев растения жизнеспособными размножающимися бактериями. Как правило, эффективное количество представляет собой количество, достаточное для получения растений с улучшенными качествами (например, желаемым уровнем азотфиксации).[00222] Compositions containing the bacterial populations described herein can be applied as a coating to the surface of the seed. Also contemplated as such are compositions containing seeds coated with one or more of the bacteria described herein. The seed coating can be formed by mixing the bacterial population with a porous, chemically inert granular carrier. Alternatively, the compositions may be inserted directly into the furrows in which the seeds are sown, or sprayed onto the leaves of plants, or applied by dipping the roots into a suspension of the composition. An effective amount of the composition can be used to colonize the subsoil adjacent to the roots of a plant with viable, reproducing bacteria, or to colonize the leaves of a plant with viable, reproducing bacteria. Generally, an effective amount is an amount sufficient to produce plants with improved qualities (eg, a desired level of nitrogen fixation).

[00223] Описанные в настоящем документе бактериальные композиции могут быть приготовлены с использованием приемлемого в сельском хозяйстве носителя. Препарат, пригодный для этих вариантов осуществления, может включать по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из вещества, повышающего клейкость, микробиологического стабилизатора, фунгицида, антибактериального агента, консерванта, стабилизатора, поверхностно-активного вещества, агента против комкования, гербицида, нематоцида, инсектицида, регулятора роста растений, удобрения, родентицида, осушителя, бактерицида, питательного вещества или любой их комбинации. В некоторых примерах композиции могут быть пригодны для длительного хранения. Например, любая из описанных в настоящем документе композиций может включать приемлемый в сельском хозяйстве носитель (например, одно или более из удобрения, такого как удобрение неприродного происхождения, связывающего вещества, такого как связывающее вещество неприродного происхождения, и пестицида, такого как пестицид неприродного происхождения). Связывающее вещество неприродного происхождения может представлять собой, например, полимер, сополимер или синтетический воск. Например, любой из семян, проростков или растений с покрытием, описанных в настоящем документе, может содержать такой приемлемый в сельском хозяйстве носитель в покрытии семян. В любой из композиций или способов, описанных в настоящем документе, приемлемый в сельском хозяйстве носитель может представлять собой или может включать соединение неприродного происхождения (например, удобрение неприродного происхождения, связывающее вещество неприродного происхождения, такое как полимер, сополимер или синтетический воск, пестицид неприродного происхождения). Неограничивающие примеры приемлемых в сельском хозяйстве носителей описаны ниже. Дополнительные примеры приемлемых в сельском хозяйстве носителей известны в данной области техники.[00223] The bacterial compositions described herein can be formulated using an agriculturally acceptable carrier. A formulation suitable for these embodiments may include at least one component selected from the group consisting of a tackifier, a microbiological stabilizer, a fungicide, an antibacterial agent, a preservative, a stabilizer, a surfactant, an anti-caking agent, a herbicide, a nematicide, insecticide, plant growth regulator, fertilizer, rodenticide, desiccant, bactericide, nutrient or any combination thereof. In some examples, the compositions may be suitable for long-term storage. For example, any of the compositions described herein may include an agriculturally acceptable carrier (e.g., one or more of a fertilizer, such as a non-natural fertilizer, a binder, such as a non-natural binder, and a pesticide, such as a non-natural pesticide) . The non-natural binder may be, for example, a polymer, copolymer or synthetic wax. For example, any of the seeds, seedlings or coated plants described herein may contain such an agriculturally acceptable carrier in the seed coating. In any of the compositions or methods described herein, the agriculturally acceptable carrier may be or may include a non-natural compound (e.g., a non-natural fertilizer, a non-natural binder such as a polymer, copolymer or synthetic wax, a non-natural pesticide ). Non-limiting examples of agriculturally acceptable carriers are described below. Additional examples of agriculturally acceptable carriers are known in the art.

[00224] В некоторых случаях бактерии смешивают с приемлемым в сельском хозяйстве носителем. Носитель может представлять собой твердый носитель или жидкий носитель и присутствовать в различных формах, включая микросферы, порошки, эмульсии и тому подобное. Носитель может представлять собой любой один или более носителей, придающих различные свойства, такие как повышенная стабильность, смачиваемость или диспергируемость. В композицию могут быть включены смачивающие агенты, такие как природные или синтетические поверхностно-активные вещества, которые могут представлять собой неионогенные или ионогенные поверхностно-активные вещества, или их комбинация. Эмульсии вода-в-масле также могут быть использованы для приготовления композиции, включающей выделенные бактерии (см., например, патент США № 7,485,451). Подходящие препараты, которые могут быть приготовлены, включают смачивающиеся порошки, гранулы, гели, агаровые пластинки или пеллеты, загустители и тому подобное, микроинкапсулированные частицы и тому подобное, жидкости, такие как водные текучие среды, водные суспензии, эмульсии вода-в-масле и т.д. Препарат может включать зерновые или бобовые продукты, например, измельченное зерно или бобы, бульон или муку, полученную из зерна или бобов, крахмал, сахар или масло.[00224] In some cases, the bacteria are mixed with an agriculturally acceptable carrier. The carrier may be a solid carrier or a liquid carrier and be present in various forms, including microspheres, powders, emulsions and the like. The carrier may be any one or more carriers imparting various properties such as increased stability, wettability or dispersibility. Wetting agents may be included in the composition, such as natural or synthetic surfactants, which may be nonionic or ionic surfactants, or a combination thereof. Water-in-oil emulsions can also be used to prepare a composition comprising isolated bacteria (see, for example, US Pat. No. 7,485,451). Suitable preparations that may be formulated include wettable powders, granules, gels, agar plates or pellets, thickeners and the like, microencapsulated particles and the like, liquids such as aqueous fluids, aqueous suspensions, water-in-oil emulsions and etc. The preparation may include grain or legume products, such as ground grains or beans, broth or flour made from grains or beans, starch, sugar or oil.

[00225] В некоторых вариантах осуществления сельскохозяйственный носитель может представлять собой почву или питательную среду для роста растений. Другие сельскохозяйственные носители, которые могут быть использованы, включают воду, удобрения, масла растительного происхождения, увлажняющие вещества или их комбинации. В качестве альтернативы, сельскохозяйственный носитель может представлять собой твердое вещество, такое как диатомовая земля, суглинок, диоксид кремния, альгинат, глина, бентонит, вермикулит, семенные коробочки, другие продукты растительного и животного происхождения или их комбинации, включая гранулы, пеллеты или суспензии. Смеси любых из вышеупомянутых ингредиентов также рассматриваются в качестве носителей, таких как, не ограничиваясь перечисленным, pesta (мука и каолиновая глина), агар или гранулы на основе муки в суглинке, песке или глине, и т.д. Препараты могут включать источники питания для бактерий, такие как ячмень, рис или другие биологические материалы, такие как семена, части растений, жом сахарного тростника, шелуха или стебли от переработки зерна, измельченный растительный материал или древесина от строительного мусора, древесные опилки или мелкие волокна от переработки бумаги, ткани или дерева.[00225] In some embodiments, the agricultural carrier may be soil or a growing medium for plant growth. Other agricultural carriers that may be used include water, fertilizers, vegetable oils, wetting agents, or combinations thereof. Alternatively, the agricultural carrier may be a solid such as diatomaceous earth, loam, silica, alginate, clay, bentonite, vermiculite, bolls, other plant and animal products, or combinations thereof, including granules, pellets or slurries. Mixtures of any of the above ingredients are also contemplated as carriers, such as, but not limited to, pesta (flour and kaolin clay), agar or flour-based granules in loam, sand or clay, etc. Preparations may include bacterial food sources such as barley, rice or other biological materials such as seeds, plant parts, sugar cane bagasse, husks or stems from grain processing, shredded plant material or wood from construction waste, sawdust or fine fibers from recycling paper, fabric or wood.

[00226] Например, удобрение может быть использовано для способствования росту или обеспечения питательными веществами семени, проростка или растения. Неограничивающие примеры удобрений включают азот, фосфор, калий, кальций, серу, магний, бор, хлорид, марганец, железо, цинк, медь, молибден и селен (или их соли). Дополнительные примеры удобрений включают одну или более аминокислот, соли, углеводы, витамины, глюкозу, NaCl, дрожжевой экстракт, NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, глицерин, валин, L-лейцин, молочную кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту, яблочную кислоту, лимонную кислоту, гидротартрат калия, ксилозу, ликсозу и лецитин. В одном из вариантов осуществления препарат может включать вещество, повышающее клейкость, или клейкое вещество (называемое связывающим веществом), чтобы помочь связать другие активные агенты с веществом (например, с поверхностью семени). Такие агенты используют для объединения бактерий с носителями, которые могут содержать другие соединения (например, средства для контроля, которые не являются биологическими), с получением композиции покрытия. Такие композиции помогают создавать покрытия вокруг растения или семени для поддержания контакта микроорганизма и других агентов с растением или частью растения. В одном из вариантов осуществления связывающие вещества выбраны из группы, состоящей из: альгината, камедей, крахмалов, лецитинов, формононетина, поливинилового спирта, формононетината щелочного металла, гесперетина, поливинилацетата, цефалинов, гуммиарабика, ксантановой камеди, минерального масла, полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилпирролидона (PVP), арабиногалактана, метилцеллюлозы, ПЭГ-400, хитозана, полиакриламида, полиакрилата, полиакрилонитрила, глицерина, триэтиленгликоля, винилацетата, геллановой камеди, полистирола, поливинила, карбоксиметилцеллюлозы, камеди гхатти и блок-сополимеров полиоксиэтилена и полиоксибутилена. [00226] For example, a fertilizer may be used to promote growth or provide nutrients to a seed, seedling, or plant. Non-limiting examples of fertilizers include nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, sulfur, magnesium, boron, chloride, manganese, iron, zinc, copper, molybdenum and selenium (or salts thereof). Additional examples of fertilizers include one or more amino acids, salts, carbohydrates, vitamins, glucose, NaCl, yeast extract, NH ₄ H ₂ PO ₄ , (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , glycerol, valine, L-leucine, lactic acid, propionic acid , succinic acid, malic acid, citric acid, potassium hydrogen tartrate, xylose, lyxose and lecithin. In one embodiment, the formulation may include a tackifier or sticky substance (called a binder) to help bind other active agents to the substance (eg, the surface of the seed). Such agents are used to combine bacteria with carriers, which may contain other compounds (eg, control agents that are not biological), to produce a coating composition. Such compositions help create coatings around the plant or seed to maintain contact of the microorganism and other agents with the plant or plant part. In one embodiment, the binders are selected from the group consisting of: alginate, gums, starches, lecithins, formononetin, polyvinyl alcohol, alkali metal formononetinate, hesperetin, polyvinyl acetate, cephalins, gum arabic, xanthan gum, mineral oil, polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone (PVP), arabinogalaktan, methyl cellulose, PAG-400, chitosan, polyacrylamide, polyacrylate, polyacrylonitril, glycerin, trietilenlycol, vinyl acetate, gelllan gellania, polyvinyl, polyvinyl, polyvinil, gkhatti and block-pllock-polymosopolim moat polyoxyethylene and polyoxbulene.

[00227] В некоторых вариантах осуществления связывающие вещества могут представлять собой, например, воск, такой как карнаубский воск, пчелиный воск, китайский воск, шеллачный воск, спермацетовый воск, канделильский воск, касторовый воск, воск оурикури и воск из рисовых отрубей, полисахарид (например, крахмал, декстрины, мальтодекстрины, альгинат и хитозаны), жир, масло, белок (например, желатин и зеины), аравийские камеди и шеллаки. Связывающие вещества могут представлять собой соединения неприродного происхождения, например, полимеры, сополимеры и воски. Например, неограничивающие примеры полимеров, которые могут быть использованы в качестве связывающего вещества, включают: поливинилацетаты, поливинилацетатные сополимеры, этиленвинилацетатные (EVA) сополимеры, поливиниловые спирты, сополимеры поливиниловых спиртов, целлюлозы (например, этилцеллюлозы, метилцеллюлозы, гидроксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы), поливинилпирролидоны, винилхлорид, сополимеры винилиденхлорида, лигносульфонаты кальция, акриловые сополимеры, поливинилакрилаты, полиэтиленоксид, ациламидные полимеры и сополимеры, полигидроксиэтилакрилат, метилакриламидные мономеры и полихлоропрен.[00227] In some embodiments, the binders may be, for example, a wax such as carnauba wax, beeswax, Chinese wax, shellac wax, spermaceti wax, candelilla wax, castor wax, ouricuri wax and rice bran wax, polysaccharide ( eg starch, dextrins, maltodextrins, alginate and chitosans), fat, oil, protein (eg gelatin and zeins), acacias and shellacs. Binders may be non-natural compounds, such as polymers, copolymers and waxes. For example, non-limiting examples of polymers that can be used as a binder include: polyvinyl acetates, polyvinyl acetate copolymers, ethylene vinyl acetate (EVA) copolymers, polyvinyl alcohols, polyvinyl alcohol copolymers, celluloses (e.g., ethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, and carboxymethylcellulose), polyvinylpyrrolidones, vinyl chloride, vinylidene chloride copolymers, calcium lignosulfonates, acrylic copolymers, polyvinyl acrylates, polyethylene oxide, acylamide polymers and copolymers, polyhydroxyethyl acrylate, methyl acrylamide monomers and polychloroprene.

[00228] В некоторых примерах один или более из связывающих веществ, противогрибковых агентов, агентов, регулирующих рост, и пестицидов (например, инсектицид) представляют собой соединения неприродного происхождения (например, в любой комбинации). Дополнительные примеры приемлемых в сельском хозяйстве носителей включают диспергаторы (например, поливинилпирролидон/винилацетат PVPIVA S-630), поверхностно-активные вещества, вяжущие и наполнители.[00228] In some examples, one or more of the binders, antifungal agents, growth-regulating agents, and pesticides (eg, insecticide) are non-naturally occurring compounds (eg, in any combination). Additional examples of agriculturally acceptable carriers include dispersants (eg, polyvinylpyrrolidone/vinyl acetate PVPIVA S-630), surfactants, binders and fillers.

[00229] Препарат также может содержать поверхностно-активное вещество. Неограничивающие примеры поверхностно-активных веществ включают смеси азота и поверхностно-активного вещества, такие как Prefer 28 (Cenex), Surf-N(US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) и Patrol (Helena); этерифицированные растительные масла включают Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) и Mes-100 (Drexel); и органосиликоновые поверхностно-активные вещества включают Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) и Century (Precision). В одном из вариантов осуществления поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от 0,01 об. % до 10 об. %. В еще одном варианте осуществления поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от 0,1 об. % до 1 об. %.[00229] The formulation may also contain a surfactant. Non-limiting examples of surfactants include nitrogen/surfactant mixtures such as Prefer 28 (Cenex), Surf-N(US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) and Patrol (Helena); esterified vegetable oils include Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm), and Mes-100 (Drexel); and organosilicone surfactants include Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis), and Century (Precision). In one embodiment, the surfactant is present at a concentration of 0.01 vol. % up to 10 vol. %. In yet another embodiment, the surfactant is present at a concentration of 0.1 vol. % up to 1 vol. %.

[00230] В отдельных случаях препарат включает микробиологический стабилизатор. Такой агент может включать осушитель, который может включать любое соединение или смесь соединений, которые могут быть классифицированы как осушитель, независимо от того, используются ли соединение или соединения в таких концентрациях, что они фактически оказывают осушающее действие на жидкий инокулянт. Такие осушители идеально совместимы с используемой бактериальной популяцией и должны способствовать способности популяции микроорганизмов выживать при нанесении на семена и выживать после высушивания. Примеры подходящих осушителей включают одно или более из трегалозы, сахарозы, глицерина и метиленгликоля. Другие подходящие осушители включают, не ограничиваясь перечисленным, невосстанавливающие сахара и сахарные спирты (например, маннит или сорбит). Количество осушителя, вводимого в препарат, может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 50% (масс./об.), например, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 15% до приблизительно 35% или от приблизительно 20% до приблизительно 30%. В некоторых случаях предпочтительно, чтобы препарат содержал такие агенты, как фунгицид, антибактериальный агент, гербицид, нематицид, инсектицид, регулятор роста растений, родентицид, бактерицид или питательное вещество. В некоторых примерах агенты могут включать защитные средства, обеспечивающие защиту от патогенов на поверхности семян. В некоторых примерах защитные средства могут обеспечивать определенный уровень контроля над почвенными патогенами. В некоторых примерах защитные средства могут быть эффективными преимущественно на поверхности семян. [00230] In some cases, the drug includes a microbiological stabilizer. Such agent may include a drying agent, which may include any compound or mixture of compounds that can be classified as a drying agent, regardless of whether the compound or compounds are used in such concentrations that they actually have a drying effect on the liquid inoculum. Such desiccants are ideally compatible with the bacterial population used and should promote the ability of the microbial population to survive application to the seed and survive drying. Examples of suitable drying agents include one or more of trehalose, sucrose, glycerol and methylene glycol. Other suitable drying agents include, but are not limited to, non-reducing sugars and sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol). The amount of drying agent included in the formulation may be from about 5% to about 50% (w/v), such as from about 10% to about 40%, from about 15% to about 35%, or from about 20% to approximately 30%. In some cases, it is preferred that the formulation contains agents such as a fungicide, antibacterial agent, herbicide, nematicide, insecticide, plant growth regulator, rodenticide, bactericide, or nutrient. In some examples, the agents may include protectants that provide protection against pathogens on the surface of the seeds. In some examples, controls may provide some level of control of soil-borne pathogens. In some examples, protectants may be effective primarily on the surface of the seed.

[00231] В некоторых примерах фунгицид может включать соединение или агент, химический или биологический, который может ингибировать рост гриба или уничтожать гриб. В некоторых примерах фунгицид может включать соединения, которые могут быть фунгистатическими или фунгицидными. В некоторых примерах фунгицид может представлять собой защитное средство, или агенты, эффективные преимущественно на поверхности семян, обеспечивая защиту от патогенов на поверхности семян и обеспечивая некоторый уровень контроля над почвенными патогенами. Неограничивающие примеры защитных фунгицидов включают каптан, манеб, тирам или флудиоксонил.[00231] In some examples, the fungicide may include a compound or agent, chemical or biological, that can inhibit the growth of a fungus or kill a fungus. In some examples, the fungicide may include compounds that may be fungistatic or fungicidal. In some examples, the fungicide may be a protectant, or agents, that are effective primarily on the seed surface, providing protection against pathogens on the seed surface and providing some level of control of soil-borne pathogens. Non-limiting examples of protective fungicides include captan, maneb, thiram or fludioxonil.

[00232] В некоторых примерах фунгицид может представлять собой системный фунгицид, который может всасываться появляющимся проростком и ингибировать или уничтожать гриб внутри тканей растения-хозяина. Системные фунгициды, используемые для обработки семян, включают, не ограничиваясь перечисленным, следующие: азоксистробин, карбоксин, мефеноксам, металаксил, тиабендазол, трифлоксистробин и различные триазольные фунгициды, включая дифеноконазол, ипконазол, тебуконазол и тритиконазол. Мефеноксам и металаксил в основном используются для борьбы с водными плесневыми грибами Pythium и Phytophthora. Некоторые фунгициды являются более предпочтительными, в зависимости от вида растения, либо из-за незначительных различий в чувствительности патогенных видов грибов, либо из-за различий в распределении фунгицидов или чувствительности растений. В некоторых примерах фунгицид может представлять собой средство биологической борьбы, такое как бактерия или грибок. Такие организмы могут паразитировать на патогенных грибах или секретировать токсины или другие вещества, которые могут уничтожать или иным образом препятствовать росту грибов. Любой тип фунгицидов, особенно фунгициды, обычно используемые на растениях, могут быть использованы в качестве средства для контроля в составе для семян.[00232] In some examples, the fungicide may be a systemic fungicide that can be taken up by the emerging seedling and inhibit or kill the fungus within the tissues of the host plant. Systemic fungicides used for seed treatment include, but are not limited to, the following: azoxystrobin, carboxin, mefenoxam, metalaxyl, thiabendazole, trifloxystrobin, and various triazole fungicides including difenoconazole, ipconazole, tebuconazole, and triticonazole. Mefenoxam and metalaxyl are mainly used to control the aquatic molds Pythium and Phytophthora. Some fungicides are preferred depending on the plant species, either due to minor differences in the sensitivity of pathogenic fungal species or differences in fungicide distribution or plant sensitivity. In some examples, the fungicide may be a biological control agent such as a bacterium or fungus. Such organisms may parasitize pathogenic fungi or secrete toxins or other substances that may kill or otherwise interfere with fungal growth. Any type of fungicide, especially fungicides commonly used on plants, can be used as a control agent in a seed formulation.

[00233] В некоторых примерах композиция для покрытия семян содержит средство для контроля, обладающее антибактериальными свойствами. В одном из вариантов осуществления средство для контроля с антибактериальными свойствами выбрано из соединений, описанных в других местах настоящего документа. В еще одном варианте осуществления соединение представляет собой стрептомицин, окситетрациклин, оксолиновую кислоту или гентамицин. Другие примеры антибактериальных соединений, которые могут быть использованы в составе композиции для покрытия семян, включают соединения, основанные на дихлорфене и полуформале бензилового спирта (Proxel® от ICI или Acticide® RS от Thor Chemie и Kathon® MK 25 от Rohm & Haas), и производные изотиазолинона такие как алкилизотиазолиноны и бензизотиазолиноны (Acticide® MBS от Thor Chemie). [00233] In some examples, the seed coating composition contains a control agent having antibacterial properties. In one embodiment, the control agent with antibacterial properties is selected from compounds described elsewhere herein. In yet another embodiment, the compound is streptomycin, oxytetracycline, oxolinic acid, or gentamicin. Other examples of antibacterial compounds that can be used in a seed coating composition include compounds based on dichlorophen and benzyl alcohol semiformal (Proxel® from ICI or Acticide® RS from Thor Chemie and Kathon® MK 25 from Rohm & Haas), and isothiazolinone derivatives such as alkyl isothiazolinones and benzisothiazolinones (Acticide® MBS from Thor Chemie).

[00234] В некоторых примерах регулятор роста выбран из группы, состоящей из: абсцизовой кислоты, амидохлора, анцимидола, 6-бензиламинопурина, брассинолида, бутралина, хлормеквата (хлормекватхлорида), холинхлорида, цикланилида, даминозида, дикегулака, диметипина, 2,6-диметилпуридина, этефона, флуметралина, флурпримидола, флутиацета, форхлорфенурона, гибберелловой кислоты, инабенфида, индол-3-уксусной кислоты, гидразида малеиновой кислоты, мефлуидида, мепиквата (мепикватхлорида), нафтилуксусной кислоты, N-6-бензиладенина, паклобутразола, прогексадион тритиофосфата, 2,3,5-три-иодбензойной кислоты, тринексапак-этила и униконазола. Дополнительные неограничивающие примеры регуляторов роста включают брассиностероиды, цитокинины (например, кинетин и зеатин), ауксины (например, индолилуксусную кислоту и индолилацетиласпартат), флавоноиды и изофлаваноиды (например, формононетин и диосметин), фитоалексины (например, глицеоллин) и фитоалексин-индуцирующие олигосахариды (например, пектин, хитин, хитозан, полигалакуроновая кислота и олигогалактуроновая кислота), и гибеллерины. Такие агенты идеально совместимы с сельскохозяйственными семенами или проростками, на которые наносят препарат (например, они не должны оказывать пагубного действия на рост или здоровье растения). Кроме того, агент, в идеале не вызывает угроз безопасности при применении у человека, животных или в промышленности (например, отсутствуют угрозы безопасности, или соединение является достаточно неустойчивым, чтобы товарный растительный продукт, полученный из растения, содержал незначительные количества соединения).[00234] In some examples, the growth regulator is selected from the group consisting of: abscisic acid, amidochlor, ancymidol, 6-benzylaminopurine, brassinolide, butralin, chlormequat (chlormequat chloride), choline chloride, cyclanilide, daminozide, dikegulac, dimetipine, 2,6-dimethylpuridine , ethephon, flumetraline, flurprimidol, flutiacet, forchlorfenuron, gibberellic acid, inabenfide, indole-3-acetic acid, maleic acid hydrazide, mefluidide, mepiquat (mepiquat chloride), naphthylacetic acid, N-6-benzyladenine, paclobutrazol, prohexadione triti ophosphate, 2, 3,5-tri-iodobenzoic acid, trinexapac-ethyl and uniconazole. Additional non-limiting examples of growth regulators include brassinosteroids, cytokinins (e.g., kinetin and zeatin), auxins (e.g., indolylacetic acid and indolylacetylaspartate), flavonoids and isoflavonoids (e.g., formononetin and diosmetin), phytoalexins (e.g., glyceollin), and phytoalexin-inducing oligosaccharides (e.g., formononetin and diosmetin). e.g. pectin, chitin, chitosan, polygalacuronic acid and oligogalacturonic acid), and gibellerins. Such agents are ideally compatible with the agricultural seeds or sprouts to which the drug is applied (for example, they should not have a detrimental effect on the growth or health of the plant). In addition, the agent ideally does not pose safety concerns when used in humans, animals, or industry (e.g., there are no safety concerns or the compound is sufficiently unstable that a commercial herbal product derived from the plant will contain negligible amounts of the compound).

[00235] Некоторые примеры средств биологической борьбы-антагонистов нематод включают ARF18; 30 Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; везикулярно-арбускулярные микоризные грибы, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; и Rhizobacteria. Особенно предпочтительные средства биологической борьбы-антагонисты нематод включают ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium vixens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, везикулярно-арбускулярные микоризные грибы, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, Pastrueia usage, Brevibacillus laterosporus strain G4, Pseudomonas fluorescens и Rhizobacteria.[00235] Some examples of nematode antagonist biological control agents include ARF18; 30 Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; and Rhizobacteria. Particularly preferred nematode antagonist biocontrol agents include ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium vix ens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, Pastrueia usage , Brevibacillus laterosporus strain G4, Pseudomonas fluorescens and Rhizobacteria.

[00236] В качестве примера, питательные вещества могут быть выбраны из группы, состоящей из азотного удобрения, включая, не ограничиваясь перечисленным, мочевину, нитрат аммония, сульфат аммония, растворы азота, полученные не под давлением, аммиачную воду, безводный аммиак, тиосульфат аммония, покрытую серой мочевин, формальдегидмочевину, IBDU (изобутилидендимочевину), мочевину с полимерным покрытием, нитрат кальция, формальдегидмочевину и метиленмочевину, фосфорные удобрения, такие как диаммонийфосфат, моноаммонийфосфат, полифосфат аммония, концентрированный суперфосфат и тройной суперфосфат, и калийные удобрения, такие как хлорид калия, сульфат калия, сульфат калия-магния, нитрат калия. Такие композиции могут существовать в виде свободных солей или ионов в композиции покрытия семян. В качестве альтернативы, питательные вещества/удобрения могут быть связанными в комплекс или хелат, чтобы обеспечить длительное высвобождение с течением времени.[00236] By way of example, the nutrients may be selected from the group consisting of nitrogen fertilizer, including, but not limited to, urea, ammonium nitrate, ammonium sulfate, non-pressurized nitrogen solutions, ammonia water, anhydrous ammonia, ammonium thiosulfate , sulfur coated urea, formaldehyde urea, IBDU (isobutylidene diurea), polymer coated urea, calcium nitrate, formaldehyde urea and methylene urea, phosphate fertilizers such as diammonium phosphate, monoammonium phosphate, ammonium polyphosphate, concentrated superphosphate and triple superphosphate, and potassium fertilizers such as potassium chloride , potassium sulfate, potassium magnesium sulfate, potassium nitrate. Such compositions may exist as free salts or ions in the seed coating composition. Alternatively, the nutrients/fertilizers can be complexed or chelated to provide sustained release over time.

[00237] Некоторые примеры родентицидов могут включать вещества, выбранные из группы, состоящей из 2-изовалерилиндан-1,3-диона, 4-(хиноксалин-2-иламино)бензолсульфонамида, альфа-хлоргидрина, фосфата алюминия, aльфа-нафтилтиомочевины, триоксида мышьяка, карбоната бария, бистиосеми, бродифакума, бромадиолона, брометалина, цианида кальция, хлоралозы, хлорофацинона, холекальциферола, кумахлора, кумафурила, куматетралила, кримидина, дифенакума, дифетиалона, дифацинона, эргокальциферола, флокумафена, фторацетамида, флупропадина, флупропадина гидрохлорида, цианида водорода, иодметана, линдана, фосфида магния, метилбромида, норбормида, фосацетима, фосфина, фосфора, пиндона, арсенита калия, пиринурона, сциллирозида, арсенита натрия, цианида натрия, фторацетата натрия, стрихнина, сульфата таллия, варфарина и фосфида цинка.[00237] Some examples of rodenticides may include substances selected from the group consisting of 2-isovalerylindane-1,3-dione, 4-(quinoxalin-2-ylamino)benzenesulfonamide, alpha-chlorohydrin, aluminum phosphate, alpha-naphthylthiourea, arsenic trioxide , barium carbonate, bisthiosem, brodifacoum, bromadiolone, bromethalin, calcium cyanide, chloralose, chlorophacinone, cholecalciferol, coumachlor, coumafuryl, coumatetral, crimidine, difenacoum, difethialone, diphacinone, ergocalciferol, flocumafen, fluoroacetamide, flupropadine, flupropadine hydrox chloride, hydrogen cyanide, iodomethane , lindane, magnesium phosphide, methyl bromide, norbormide, fosacetim, phosphine, phosphorus, pindone, potassium arsenite, pyrinuron, scyliroside, sodium arsenite, sodium cyanide, sodium fluoroacetate, strychnine, thallium sulfate, warfarin and zinc phosphide.

[00238] В жидкой форме, например, растворов или суспензий, бактериальные популяции могут быть смешаны или суспендированы в воде или в водных растворах. Подходящие жидкие разбавители или носители включают воду, водные растворы, нефтяные дистилляты или другие жидкие носители.[00238] In liquid form, such as solutions or suspensions, bacterial populations can be mixed or suspended in water or aqueous solutions. Suitable liquid diluents or carriers include water, aqueous solutions, petroleum distillates or other liquid carriers.

[00239] Твердые композиции могут быть получены путем диспергирования бактериальных популяций в и на подходящим образом разделенном твердом носителе, таком как торф, пшеница, отруби, вермикулит, глина, тальк, бентонит, диатомовая земля, фуллерова земля, пастеризованная почва и тому подобное. Когда такие препараты используются в виде смачиваемых порошков, могут быть использованы биологически совместимые диспергирующие агенты, такие как неионные, анионные, амфотерные или катионные диспергирующие и эмульгирующие агенты.[00239] Solid compositions can be prepared by dispersing bacterial populations in and on a suitably partitioned solid carrier such as peat, wheat, bran, vermiculite, clay, talc, bentonite, diatomaceous earth, Fuller's earth, pasteurized soil, and the like. When such preparations are used in the form of wettable powders, biocompatible dispersing agents such as nonionic, anionic, amphoteric or cationic dispersing and emulsifying agents may be used.

[00240] Твердые носители, используемые при приготовлении препаратов, включают, например, минеральные носители, такие как каолиновая глина, пирофиллит, бентонит, монтмориллонит, диатомовая земля, кислая светлая почва, вермикулит и перлит, и неорганические соли, такие как сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, мочевина, хлорид аммония и карбонат кальция. Также могут быть использованы органические мелкие порошки, такие как пшеничная мука, пшеничные отруби и рисовые отруби. Жидкие носители включают растительные масла, такие как соевое масло и хлопковое масло, глицерин, этиленгликоль, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, полипропиленгликоль и т.д.[00240] Solid carriers used in the preparation of preparations include, for example, mineral carriers such as kaolin clay, pyrophyllite, bentonite, montmorillonite, diatomaceous earth, acid light soil, vermiculite and perlite, and inorganic salts such as ammonium sulfate, phosphate ammonium, ammonium nitrate, urea, ammonium chloride and calcium carbonate. Organic fine powders such as wheat flour, wheat bran and rice bran can also be used. Liquid carriers include vegetable oils such as soybean oil and cottonseed oil, glycerin, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, polypropylene glycol, etc.

Применение бактериальных популяций на сельскохозяйственных культурахApplication of bacterial populations on crops

[00241] Композиция бактерий или бактериальной популяции, описанная в настоящем документе, может применяться в борозде, в тальке или в виде состава для обработки семян. Композиция может применяться к массе семян в виде нефасованной партии, в виде небольшой нефасованной партии, в пакете или в тальке. [00241] The bacterial or bacterial population composition described herein can be applied in-furrow, in talc, or as a seed treatment formulation. The composition may be applied to the seed mass as a bulk batch, as a small bulk batch, in a bag, or in talcum powder.

[00242] Сеятель может посеять обработанные семена и выращивать сельскохозяйственную культуру в соответствии с традиционными способами, двухстрочным посевом или способами, не требующими обработки почвы. Семена могут быть распределены с использованием контрольного высевающего аппарата или отдельного высевающего аппарата. Семена также могут быть распределены с помощью сжатого воздуха или вручную. Посев семян может быть выполнен с использованием технологий переменного нормирования. Кроме того, применение бактерий или бактериальных популяций, описанных в настоящем документе, может быть осуществлено с использованием технологий переменного нормирования. В некоторых примерах бактерии могут быть применены к семенам кукурузы, сои, канолы, сорго, картофеля, риса, овощей, зерновых, псевдозерновых и масличных культур. Примеры зерновых могут включать ячмень, фонио, овес, щетинник, рожь, африканское просо, сорго, полбу, теф, тритикале и пшеницу. Примеры псевдозерновых могут включать бросимум напитковый, гречиху обыкновенную, рогоз, чиа, лен, амарантовую крупу, босцию сенегальскую, киноа и кунжут. В некоторых примерах семена могут быть генетически модифицированными организмами (ГМО), не ГМО, органическими или обычными. [00242] The sower can sow the treated seeds and grow the crop according to traditional methods, double row planting or no-till methods. Seed can be distributed using a control seed meter or a separate seed meter. Seeds can also be distributed using compressed air or by hand. Sowing seeds can be done using variable rate technology. In addition, the use of bacteria or bacterial populations described herein can be accomplished using variable rate techniques. In some examples, the bacteria can be applied to the seeds of corn, soybeans, canola, sorghum, potatoes, rice, vegetables, grains, pseudocereals and oilseeds. Examples of grains may include barley, fonio, oats, bristles, rye, pearl millet, sorghum, spelt, teff, triticale and wheat. Examples of pseudograins may include brosimum, buckwheat, cattail, chia, flax, amaranth, boscia senegal, quinoa, and sesame. In some examples, the seeds may be genetically modified organism (GMO), non-GMO, organic, or conventional.

[00243] Для обработки сельскохозяйственных культур могут быть дополнительно использованы добавки, такие как микроудобрение, PGR (регулятор роста растений), гербицид, инсектицид и фунгицид. Примеры добавок включают средства защиты растений, такие как инсектициды, нематициды, фунгициды, усилители, такие как красители, полимеры, агенты для гранулирования, прайминг и дезинфицирующие средства, и другие агенты, такие как инокулянт, PGR, смягчитель и микроэлементы. PGR могут представлять собой природные или синтетические растительные гормоны, влияющие на рост корней, цветение или удлинение стебля. PGR могут включать ауксины, гиббереллины, цитокинины, этилен и абсцизовую кислоту (АБК). [00243] Additional additives such as microfertilizer, PGR (Plant Growth Regulator), herbicide, insecticide and fungicide can be used to treat crops. Examples of additives include crop protection agents such as insecticides, nematicides, fungicides, enhancers such as dyes, polymers, granulating agents, priming and disinfectants, and other agents such as inoculant, PGR, softener and trace elements. PGRs can be natural or synthetic plant hormones that affect root growth, flowering, or stem elongation. PGRs may include auxins, gibberellins, cytokinins, ethylene, and abscisic acid (ABA).

[00244] Композиция может быть применена в борозде в сочетании с жидким удобрением. В некоторых примерах жидкое удобрение может храниться в резервуарах. NPK удобрения содержат макроэлементы натрий, фосфор и калий. [00244] The composition can be applied in a furrow in combination with a liquid fertilizer. In some examples, liquid fertilizer may be stored in tanks. NPK fertilizers contain macroelements sodium, phosphorus and potassium.

[00245] Композиция может улучшать качества растений, например, стимулировать рост растений, поддерживать высокое содержание хлорофилла в листьях, увеличивать количество плодов или семян и увеличивать массу плодов или семян. Способы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для введения или улучшения одного или более из множества желательных качеств. Примеры качеств, которые могут быть введены или улучшены, включают: биомассу корня, длину корня, высоту, длину побега, число листьев, эффективность водопотребления, общую биомассу, урожайность, размер плодов, размер зерна, интенсивность фотосинтеза, засухоустойчивость, жароустойчивость, солеустойчивость, устойчивость к стрессу, вызванному низким уровнем азота, эффективность использования азота, устойчивость к стрессу, вызванному нематодами, устойчивость к грибковому патогену, устойчивость к бактериальному патогену, устойчивость к вирусному патогену, уровень метаболита, модуляцию уровня метаболита и экспрессию протеома. Желательные качества, включая высоту, общую биомассу, биомассу корня и/или побегов, всхожесть семян, выживаемость проростков, эффективность фотосинтеза, интенсивность транспирации, количество или массу семян/плодов, урожайность зерна или плодов растения, содержание хлорофилла в листьях, интенсивность фотосинтеза, длину корня или любую их комбинацию, могут быть использованы для измерения роста и сравнены со скоростью роста контрольных сельскохозяйственных растений (например, растений без введенных и/или улучшенных качеств), выращиваемых в идентичных условиях. В некоторых примерах желательные качества, включая высоту, общую биомассу, биомассу корня и/или побегов, всхожесть семян, выживаемость проростков, эффективность фотосинтеза, интенсивность транспирации, количество или массу семян/плодов, урожайность зерна или плодов растения, содержание хлорофилла в листьях, интенсивность фотосинтеза, длину корня или любую их комбинацию, могут быть использованы для измерения роста и сравнены со скоростью роста контрольных сельскохозяйственных растений (например, растений без улучшенных и/или введенных качеств), выращиваемых в схожих условиях. [00245] The composition can improve plant qualities, such as promoting plant growth, maintaining high chlorophyll content in leaves, increasing the number of fruits or seeds, and increasing the weight of fruits or seeds. The methods of the present invention can be used to introduce or improve one or more of a variety of desirable qualities. Examples of traits that can be introduced or improved include: root biomass, root length, height, shoot length, leaf number, water efficiency, total biomass, yield, fruit size, grain size, photosynthetic rate, drought tolerance, heat tolerance, salt tolerance, tolerance to low nitrogen stress, nitrogen use efficiency, nematode stress resistance, fungal pathogen resistance, bacterial pathogen resistance, viral pathogen resistance, metabolite level, metabolite level modulation and proteome expression. Desirable qualities including height, total biomass, root and/or shoot biomass, seed germination, seedling survival, photosynthetic efficiency, transpiration rate, seed/fruit number or weight, grain or fruit yield of the plant, leaf chlorophyll content, photosynthetic rate, length roots, or any combination thereof, can be used to measure growth and compared with the growth rate of control crop plants (eg, plants without the introduced and/or improved traits) grown under identical conditions. In some examples, desirable qualities including height, total biomass, root and/or shoot biomass, seed germination, seedling survival, photosynthetic efficiency, transpiration rate, seed/fruit number or weight, grain or fruit yield of the plant, leaf chlorophyll content, intensity photosynthesis, root length, or any combination thereof, can be used to measure growth and compared with the growth rate of control crop plants (e.g., plants without the improved and/or introduced traits) grown under similar conditions.

[00246] Агрономическое качество растения-хозяина может включать, не ограничиваясь перечисленным, следующие: измененное содержание масла, измененное содержание белка, измененная композиция углеводов в семенах, измененная композиция масла семян и измененная композиция белков семян, химическая устойчивость, устойчивость к холоду, задержка старения, устойчивость к болезням, засухоустойчивость, масса колоса, улучшение роста, улучшение здоровья, жароустойчивость, устойчивость к гербицидам, устойчивость к травоядным животным, улучшенная азотфиксация, улучшенное использование азота, улучшенная архитектура корня, улучшенная эффективность использования воды, увеличение биомассы, увеличение длины корня, увеличение массы семян, увеличение длины побега, повышенная урожайность, повышенная урожайность в условиях нехватки воды, масса зерна, содержание влаги в зерне, металлоустойчивость, количество колосьев, количество зерен на колос, количество стручков, улучшение питания, устойчивость к патогенам, устойчивость к сельскохозяйственным вредителям, улучшение фотосинтезирующей способности, солеустойчивость, задержка старения листьев, улучшение мощности, увеличение сухой массы зрелых семян, увеличение сырой массы зрелых семян, увеличение количества зрелых семян на растение, увеличение содержания хлорофилла, увеличение количества стручков на растение, увеличение длины стручков на растение, уменьшение количества увядших листьев на растение, уменьшение количества значительно увядших листьев на растение и увеличение количества неувядших листьев на растение, обнаружимая модуляция уровня метаболита, обнаружимая модуляция уровня транскрипта и обнаружимая модуляция протеома, по сравнению с растением той же линии, выращенным из семян без использования указанного препарата для обработки семян.[00246] Agronomic quality of the host plant may include, but is not limited to, the following: altered oil content, altered protein content, altered seed carbohydrate composition, altered seed oil composition, and altered seed protein composition, chemical resistance, cold tolerance, delayed senescence , disease resistance, drought tolerance, ear weight, improved growth, improved health, heat tolerance, herbicide resistance, herbivore resistance, improved nitrogen fixation, improved nitrogen utilization, improved root architecture, improved water use efficiency, increased biomass, increased root length, increase in seed weight, increase in shoot length, increased yield, increased yield under conditions of water shortage, grain weight, grain moisture content, metal resistance, number of ears, number of grains per ear, number of pods, improved nutrition, pathogen resistance, pest resistance , improved photosynthetic capacity, salt tolerance, delayed leaf senescence, improved vigor, increased dry weight of mature seeds, increased wet weight of mature seeds, increased number of mature seeds per plant, increased chlorophyll content, increased number of pods per plant, increased length of pods per plant, decreased number of wilted leaves per plant, decrease in the number of significantly wilted leaves per plant and increase in the number of non-wilted leaves per plant, detectable modulation of metabolite level, detectable modulation of transcript level and detectable modulation of proteome, compared with a plant of the same line grown from seeds without the use of the indicated drug for seed treatment.

[00247] В некоторых случаях растения инокулируют бактериями или бактериальными популяциями, которые выделены из того же вида растений, что и растительный элемент инокулируемого растения. Например, бактерия или бактериальная популяция, которая обычно встречается у одного сорта маиса (кукурузы), связана с растительным элементом растения другого сорта маиса, который в своем естественном состоянии лишен указанных бактерий и бактериальных популяций. В одном из вариантов осуществления бактерии и бактериальные популяции получают из растения родственного вида в качестве растительного элемента инокулируемого растения. Например, бактерии и популяции бактерий, которые обычно встречаются у Zea diploperennis (Iltis et al.), (Diploperennial teosinte), применяют к маису (кукурузе), или наоборот. В некоторых случаях растения инокулируют бактериями и бактериальными популяциями, гетерологичными растительному элементу инокулируемого растения. В одном из вариантов осуществления бактерии и бактериальные популяции получают из растения другого вида. Например, бактерии и бактериальные популяции, которые обычно встречаются у двудольных растений, применяют к однодольному растению (например, для инокуляции кукурузы бактериями и бактериальными популяциями, полученными из соевых бобов), или наоборот. В других случаях бактерии и бактериальные популяции, которые должны быть инокулированы на растение, получают из видов, родственных инокулируемому растению. В одном из вариантов осуществления бактерии и бактериальные популяции получены из родственного таксона, например, из родственных видов. Растение другого вида может представлять собой сельскохозяйственное растение. В еще одном варианте осуществления бактерии и бактериальные популяции являются частью разработанной композиции, инокулированной в любой элемент растения-хозяина.[00247] In some cases, plants are inoculated with bacteria or bacterial populations that are isolated from the same plant species as the plant element of the plant being inoculated. For example, a bacterium or bacterial population that is commonly found in one variety of maize (corn) is associated with a plant element of a plant of another variety of maize that in its natural state lacks said bacteria and bacterial populations. In one embodiment, the bacteria and bacterial populations are obtained from a plant of a related species as a plant element of the plant being inoculated. For example, bacteria and bacterial populations that are commonly found in Zea diploperennis (Iltis et al.), (Diploperennial teosinte) are applied to maize, or vice versa. In some cases, plants are inoculated with bacteria and bacterial populations heterologous to the plant element of the plant being inoculated. In one embodiment, the bacteria and bacterial populations are obtained from a plant of another species. For example, bacteria and bacterial populations that are typically found in dicotyledonous plants are applied to a monocotyledonous plant (eg, to inoculate corn with bacteria and bacterial populations derived from soybeans), or vice versa. In other cases, the bacteria and bacterial populations to be inoculated onto the plant are obtained from species related to the plant being inoculated. In one embodiment, the bacteria and bacterial populations are derived from a related taxon, such as a related species. The plant of another species may be an agricultural plant. In yet another embodiment, the bacteria and bacterial populations are part of the formulated composition inoculated into any element of the host plant.

[00248] В некоторых примерах бактерия или бактериальная популяция является экзогенной, где бактерии и бактериальная популяция выделены из растения, отличного от инокулиуемого растения. Например, в одном из вариантов осуществления бактерии или бактериальная популяция могут быть выделены из другого растения того же вида, что и инокулируемое растение. В некоторых случаях бактерии или бактериальная популяция могут быть выделены из вида, родственного инокулируемому растению.[00248] In some examples, the bacterium or bacterial population is exogenous, where the bacteria and bacterial population are isolated from a plant other than the plant being inoculated. For example, in one embodiment, the bacteria or bacterial population may be isolated from another plant of the same species as the plant being inoculated. In some cases, the bacteria or bacterial population may be isolated from a species related to the plant being inoculated.

[00249] В некоторых примерах бактерии и бактериальные популяции, описанные в настоящем документе, способны перемещаться из одного типа ткани в другой. Например, обнаружение и выделение бактерий и бактериальных популяций в зрелых тканях растений согласно настоящему изобретению после нанесения покрытия на внешнюю поверхность семян демонстрирует их способность перемещаться с внешней поверхности семени в вегетативные ткани созревающего растения. Следовательно, в одном из вариантов осуществления популяция бактерий и бактериальных популяций способна перемещаться с внешней поверхности семени в вегетативные ткани растения. В одном из вариантов осуществления бактерии и бактериальные популяции, нанесенные в качестве покрытия на семя растения, способны при прорастании семени в состояние вегетации сосредотачиваться в другой ткани растения. Например, бактерии и бактериальные популяции могут быть способны сосредотачиваться в любой из тканей растения, включая корень, придаточный корень, зародышевый корень, корневой волосок, побег, лист, цветок, почку, метелку, меристему, пыльцу, пестик, завязь, тычинку, плод, ползучий побег, корневище, узелок, клубень, трихом, устьичные клетки, гидатоду, лепесток, чашелистик, чешую, ость, сосудистый камбий, флоэму и ксилему. В одном из вариантов осуществления бактерии и бактериальные популяции способны сосредотачиваться в корне и/или корневых волосках растения. В еще одном варианте осуществления бактерии и бактериальные популяции способны сосредотачиваться в фотосинтезирующих тканях, например, листьях и побегах растения. В других случаях бактерии и бактериальные популяции сосредотачиваются в проводящих тканях растения, например, в ксилеме и флоэме. В еще одном варианте осуществления бактерии и бактериальные популяции способны сосредотачиваться в репродуктивных тканях (цветке, пыльце, пестике, завязи, тычинке, плоде) растения. В еще одном варианте осуществления бактерии и бактериальные популяции способны сосредотачиваться в корне, побегах, листьях и репродуктивных тканях растения. В еще одном варианте осуществления бактерии и бактериальные популяции колонизируют плод или ткань семени растения. В еще одном варианте осуществления бактерии и бактериальные популяции способны колонизировать растение таким образом, что они присутствуют на поверхности растения (т. е. их присутствие может быть обнаружено на внешней поверхности растения или в эписфере растения). В других вариантах осуществления бактерии и бактериальные популяции способны сосредотачиваться практически во всех или во всех тканях растения. В отдельных вариантах осуществления бактерии и бактериальные популяции не сосредотачиваются в корне растения. В других случаях бактерии и бактериальные популяции не сосредотачиваются в фотосинтезирующих тканях растения.[00249] In some examples, bacteria and bacterial populations described herein are capable of moving from one tissue type to another. For example, the detection and isolation of bacteria and bacterial populations in mature plant tissues of the present invention after coating the outer surface of seeds demonstrates their ability to move from the outer surface of the seed into the vegetative tissues of the maturing plant. Therefore, in one embodiment, the population of bacteria and bacterial populations are capable of moving from the outer surface of the seed into the vegetative tissues of the plant. In one embodiment, the bacteria and bacterial populations coated on a plant seed are capable of becoming concentrated in another tissue of the plant when the seed germinates into the vegetative state. For example, bacteria and bacterial populations may be able to concentrate in any of the plant tissues, including root, adventitious root, embryonic root, root hair, shoot, leaf, flower, bud, panicle, meristem, pollen, pistil, ovary, stamen, fruit, creeping shoot, rhizome, nodule, tuber, trichome, stomatal cells, hydathodes, petal, sepal, scale, awn, vascular cambium, phloem and xylem. In one embodiment, the bacteria and bacterial populations are able to concentrate in the root and/or root hairs of the plant. In yet another embodiment, the bacteria and bacterial populations are capable of concentrating in photosynthetic tissues, such as leaves and shoots of a plant. In other cases, bacteria and bacterial populations are concentrated in the conducting tissues of the plant, such as the xylem and phloem. In yet another embodiment, the bacteria and bacterial populations are capable of concentrating in the reproductive tissues (flower, pollen, pistil, ovary, stamen, fruit) of the plant. In yet another embodiment, the bacteria and bacterial populations are capable of concentrating in the root, shoots, leaves, and reproductive tissues of the plant. In yet another embodiment, the bacteria and bacterial populations colonize the fruit or seed tissue of the plant. In yet another embodiment, the bacteria and bacterial populations are capable of colonizing a plant such that they are present on the surface of the plant (ie, their presence can be detected on the outer surface of the plant or in the episphere of the plant). In other embodiments, the bacteria and bacterial populations are capable of being concentrated in substantially all or all tissues of the plant. In certain embodiments, the bacteria and bacterial populations are not concentrated in the root of the plant. In other cases, bacteria and bacterial populations are not concentrated in photosynthetic plant tissues.

[00250] Эффективность композиций также может быть оценена путем измерения относительной зрелости сельскохозяйственной культуры или единиц накопления тепла (CHU). Например, бактериальная популяция может быть применена к кукурузе, и рост кукурузы может быть оценен согласно относительной зрелости зерна кукурузы или времени, когда зерно кукурузы достигает максимальной массы. Единицы накопления тепла (CHU) также могут быть использованы для прогнозирования созревания урожая кукурузы. CHU определяют количество накопленного тепла путем измерения максимальных суточных температур в ходе роста растений.[00250] The effectiveness of the compositions can also be assessed by measuring the relative maturity of the crop or heat storage units (CHU). For example, the bacterial population may be applied to corn, and corn growth may be assessed according to the relative maturity of the corn grain or the time at which the corn grain reaches maximum weight. Heat storage units (CHU) can also be used to predict corn crop maturity. CHUs determine the amount of heat stored by measuring maximum daily temperatures during plant growth.

[00251] Например, бактерии могут сосредотачиваться в любой из тканей растения, включая корень, придаточный корень, зародышевый корень, корневой волосок, побег, лист, цветок, почку, метелку, меристему, пыльцу, пестик, завязь, тычинку, плод, ползучий побег, корневище, узелок, клубень, трихом, устьичные клетки, гидатоду, лепесток, чашелистик, чешую, ость, сосудистый камбий, флоэму и ксилему. В еще одном варианте осуществления бактерии или бактериальная популяция способны сосредотачиваться в фотосинтезирующих тканях, например, листьях и побегах растения. В других случаях бактерии и бактериальные популяции сосредотачиваются в проводящих тканях растения, например, в ксилеме и флоэме. В еще одном варианте осуществления бактерии или бактериальная популяция способны сосредотачиваться в репродуктивных тканях (цветке, пыльце, пестике, завязи, тычинке или плоде) растения. В еще одном варианте осуществления бактерии и бактериальные популяции способны сосредотачиваться в корне, побегах, листьях и репродуктивных тканях растения. В еще одном варианте осуществления бактерии или бактериальная популяция колонизируют плод или ткань семени растения. В еще одном варианте осуществления бактерии или бактериальная популяция способны колонизировать растение так, что они присутствуют на поверхности растения. В еще одном варианте осуществления бактерии или бактериальная популяция способны сосредотачиваться практически во всех или во всех тканях растения. В отдельных вариантах осуществления бактерии или бактериальная популяция не сосредотачиваются в корне растения. В других случаях бактерии и бактериальные популяции не сосредотачиваются в фотосинтезирующих тканях растения.[00251] For example, bacteria can be concentrated in any of the plant tissues, including root, adventitious root, embryonic root, root hair, shoot, leaf, flower, bud, panicle, meristem, pollen, pistil, ovary, stamen, fruit, creeper , rhizome, node, tuber, trichome, stomatal cells, hydathodes, petal, sepal, scale, awn, vascular cambium, phloem and xylem. In yet another embodiment, the bacteria or bacterial population is capable of concentrating in photosynthetic tissues, such as leaves and shoots of a plant. In other cases, bacteria and bacterial populations are concentrated in the conducting tissues of the plant, such as the xylem and phloem. In yet another embodiment, the bacteria or bacterial population is capable of concentrating in the reproductive tissues (flower, pollen, pistil, ovary, stamen or fruit) of the plant. In yet another embodiment, the bacteria and bacterial populations are capable of concentrating in the root, shoots, leaves, and reproductive tissues of the plant. In yet another embodiment, the bacteria or bacterial population colonizes the fruit or seed tissue of the plant. In yet another embodiment, the bacteria or bacterial population is capable of colonizing the plant such that it is present on the surface of the plant. In yet another embodiment, the bacteria or bacterial population is capable of being concentrated in substantially all or all tissues of the plant. In certain embodiments, the bacteria or bacterial population is not concentrated in the root of the plant. In other cases, bacteria and bacterial populations are not concentrated in photosynthetic plant tissues.

[00252] Эффективность бактериальных композиций, применяемых к сельскохозяйственным культурам, может быть оценена путем измерения различных характеристик роста сельскохозяйственных культур, включая, не ограничиваясь перечисленным, норму посадки, мощность всходов, силу корней, засухоустойчивость, высоту растения, высушивание и натурную массу.[00252] The effectiveness of bacterial compositions applied to crops can be assessed by measuring various crop growth characteristics, including, but not limited to, planting rate, emergence vigor, root vigor, drought tolerance, plant height, drying, and bulk weight.

Виды растенийPlant species

[00253] Способы и бактерии, описанные в настоящем документе, подходят для любого из множества растений, таких как растения родов Hordeum, Oryza, Zea и Triticeae. Другие неограничивающие примеры подходящих растений включают мхи, лишайники и водоросли. В некоторых случаях растения имеют экономическую, социальную и/или экологическую ценность, такие как продовольственные культуры, текстильные культуры, масличные культуры, растения в лесной или целлюлозно-бумажной промышленности, сырье для производства биотоплива и/или декоративные растения. В некоторых примерах растения могут использоваться для производства экономически ценных продуктов, таких как зерно, кормовая мука, крахмал, сироп, мука, масло, пленка, упаковка, нутрицевтический продукт, мякоть, корм для животных, корм для рыб, основной материал для промышленных химикатов, зерновой продукт, обработанный продукт питания для человека, сахар, спирт и/или белок. Неограничивающие примеры сельскохозяйственных культур включают маис, рис, пшеницу, ячмень, сорго, просо, овес, тритикале, гречиху обыкновенную, сахарную кукурузу, сахарный тростник, лук, томаты, клубнику и спаржу. [00253] The methods and bacteria described herein are suitable for any of a variety of plants, such as plants of the genera Hordeum, Oryza, Zea and Triticeae. Other non-limiting examples of suitable plants include mosses, lichens and algae. In some cases, plants have economic, social and/or environmental value, such as food crops, textile crops, oilseeds, forestry or pulp and paper plants, biofuel feedstocks and/or ornamental plants. In some examples, plants can be used to produce economically valuable products such as grain, feed meal, starch, syrup, flour, oil, film, packaging, nutraceutical product, pulp, animal feed, fish feed, base material for industrial chemicals, grain product, processed human food, sugar, alcohol and/or protein. Non-limiting examples of crops include maize, rice, wheat, barley, sorghum, millet, oats, triticale, buckwheat, sweet corn, sugar cane, onions, tomatoes, strawberries and asparagus.

[00254] В некоторых примерах растения, которые могут быть получены или улучшены с использованием способов и композиции, раскрытых в настоящем документе, могут включать растения, которые являются важными или представляют интерес для сельского хозяйства, садоводства, биомассы для производства молекул биотоплива и других химических веществ и/или лесного хозяйства. Некоторые примеры этих растений могут включать ананас, банан, кокос, лилию, чину посевную, люцерну, томатильо, дыню, нут, цикорий, клевер, кудрявую капусту, чечевицу, сою, табак, картофель, сладкий картофель, редьку, капусту, рапс, яблони, виноград, хлопок, подсолнечник, арабидопсис, канолу, цитрусовые (включая апельсин, мандарин, кумкват, лимон, лайм, грейпфрут, танжерин, танжело, цитрон и помело), перец, фасоль, латук, Panicum virgatum (просо прутьевидное), Sorghum bicolor (сорго суданское), Miscanthus giganteus (мискантус), Saccharum sp. (энергетический тростник), Populus balsamifera (тополь), Zea mays (кукуруза), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопок), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла), Pennisetum glaucum (африканское просо), Panicum spp. Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (рожь), Salix spp. (ива), Eucalyptus spp. (эвкалипт), Triticosecale spp. (гибрид triticum - пшеницы и ржи), бамбук, Carthamus tinctorius (сафлор), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина), Elaeis guineensis (масличная пальма), Phoenix dactylifera (финиковая пальма), Archontophoenix cunninghamiana (королевская пальма), Syagrus romanzoffiana (сиагрус Румянцева), Linum usitatissimum (лен), Brassica juncea, Manihot esculenta (кассава), Lycopersicon esculentum (томат), Lactuca saliva (латук), Musa paradisiaca (банан), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста), Camellia sinensis (чай), Fragaria ananassa (клубника), Theobroma cacao (какао), Coffea arabica (кофе), Vitis vinifera (виноград), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (острый и сладкий перец), Allium cepa (лук), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква), Cucurbita moschata (тыква), Spinacea oleracea (шпинат), Citrullus lanatus (арбуз), Abelmoschus esculentus (окра), Solanum melongena (баклажан), Papaver somniferum (опийный мак), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (гваюла), Hevea spp. (гевея), Mentha spicata (мята), Mentha piperita (мята), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (роза), Dianthus caryophyllus (carnation), Petunia spp. (петуния), Poinsettia pulcherrima (пуансеттия), Nicotiana tabacum (табак), Lupinus albus (люпин), Uniola paniculata (овес), Hordeum vulgare (ячмень) и Lolium spp. (рожь). [00254] In some examples, plants that can be produced or improved using the methods and compositions disclosed herein may include plants that are important or of interest to agriculture, horticulture, biomass for the production of biofuel molecules, and other chemicals and/or forestry. Some examples of these plants may include pineapple, banana, coconut, lily, china, alfalfa, tomatillo, melon, chickpeas, chicory, clover, kale, lentils, soybeans, tobacco, potatoes, sweet potatoes, radishes, cabbage, canola, apple trees , grapes, cotton, sunflowers, Arabidopsis, canola, citrus fruits (including orange, tangerine, kumquat, lemon, lime, grapefruit, tangerine, tangelo, citron and pomelo), pepper, beans, lettuce, Panicum virgatum, Sorghum bicolor (sorghum sudanese), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (energy cane), Populus balsamifera (poplar), Zea mays (corn), Glycine max (soybean), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (wheat), Gossypium hirsutum (cotton), Oryza sativa (rice), Helianthus annuus ( sunflower), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (sugar beet), Pennisetum glaucum (millet), Panicum spp. Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (rye), Salix spp. (willow), Eucalyptus spp. (eucalyptus), Triticosecale spp. (hybrid triticum - wheat and rye), bamboo, Carthamus tinctorius (safflower), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (castor oil), Elaeis guineensis (oil palm), Phoenix dactylifera (date palm), Archontophoenix cunninghamiana (king palm), Syagrus romanzoffiana (Rumyantsev's siagrus), Linum usitatissimum (flax), Brassica juncea, Manihot esculenta (cassava), Lycopersicon esculentum (tomato), Lactuca saliva (lettuce), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (potato), Brassica oleracea (broccoli , cauliflower, Brussels sprouts), Camellia sinensis (tea), Fragaria ananassa (strawberry), Theobroma cacao (cocoa), Coffea arabica (coffee), Vitis vinifera (grape), Ananas comosus (pineapple), Capsicum annum (spicy and sweet pepper), Allium cepa (onion), Cucumis melo (melon), Cucumis sativus (cucumber), Cucurbita maxima (pumpkin), Cucurbita moschata (pumpkin), Spinacea oleracea (spinach), Citrullus lanatus (watermelon), Abelmoschus esculentus (okra) , Solanum melongena (eggplant), Papaver somniferum (opium poppy), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp. ., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (hevea), Mentha spicata (mint), Mentha piperita (mint), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rose), Dianthus caryophyllus (carnation), Petunia spp. (petunia), Poinsettia pulcherrima (poinsettia), Nicotiana tabacum (tobacco), Lupinus albus (lupin), Uniola paniculata (oats), Hordeum vulgare (barley) and Lolium spp. (rye).

[00255] В некоторых примерах может быть использовано однодольное растение. Однодольные растения принадлежат к порядкам Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales и Zingiberales. Растения, принадлежащие к классу Gymnospermae, представляют собой Cycadales, Ginkgoales, Gnetales и Pinales. В некоторых примерах однодольное растение может быть выбрано из группы, состоящей из маиса, риса, пшеницы, ячменя и сахарного тростника. [00255] In some examples, a monocotyledonous plant may be used. Monocots belong to the orders Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales and Zingiberales. Plants belonging to the class Gymnospermae are Cycadales, Ginkgoales, Gnetales and Pinales. In some examples, the monocotyledonous plant may be selected from the group consisting of maize, rice, wheat, barley, and sugarcane.

[00256] В некоторых примерах может быть использовано двудольное растение, в том числе растения, принадлежащие к отрядам Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales и Violates. В некоторых примерах двудольное растение может быть выбрано из группы, состоящей из хлопка, сои, перца и томата.[00256] In some examples, a dicotyledonous plant may be used, including plants belonging to the orders Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemonia les, Polygalales , Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales and Violates. In some examples, the dicotyledonous plant may be selected from the group consisting of cotton, soybean, pepper, and tomato.

[00257] В некоторых случаях подлежащее улучшению растение не всегда с легкостью поддается экспериментальным условиям. Например, выращивание сельскохозяйственного растения в достаточной степени, чтобы была возможна оценка улучшенного качества последовательно в течение нескольких итераций, может занять слишком много времени. Соответственно, первое растение, из которого первоначально выделены бактерии, и/или множество растений, к которым применяют генетически модифицированные бактерии, может представлять собой модельное растение, такое как растение, лучше поддающееся оценке в желаемых условиях. Неограничивающие примеры модельных растений включают Setaria, Brachypodium и Arabidopsis. Способность бактерий, выделенных в соответствии со способом согласно изобретению с использованием модельного растения, затем может быть применена к растению другого типа (например, к сельскохозяйственному растению), чтобы подтвердить придание улучшенного качества.[00257] In some cases, the plant to be improved does not always readily respond to experimental conditions. For example, growing a crop plant sufficiently to allow improved quality to be assessed consistently over multiple iterations may take too long. Accordingly, the first plant from which the bacteria are initially isolated, and/or the plurality of plants to which the genetically modified bacteria are applied, may be a model plant, such as a plant better suited to evaluation under the desired conditions. Non-limiting examples of model plants include Setaria, Brachypodium and Arabidopsis. The ability of bacteria isolated according to the method of the invention using a model plant can then be applied to a different type of plant (eg a crop plant) to confirm the conferment of improved quality.

[00258] Качества, которые могут быть улучшены способами, раскрытыми в настоящем документе, включают любую наблюдаемую характеристику растения, включая, например, скорость роста, высоту, массу, цвет, вкус, запах, изменения в продукции растением одного или более соединений (включая, например, метаболиты, белки, лекарственные вещества, углеводы, масла и любые другие соединения). Предусматривается также отбор растений на основе генотипической информации (например, включая профиль экспрессии растительных генов в ответ на бактерии или идентификацию наличия генетических маркеров, таких как маркеры, связанные с повышенной азотфиксацией). Растения также могут быть отобраны на основе отсутствия, подавления или ингибирования определенного признака или качества (такого как нежелательный признак или качество), а не на основе наличия определенного признака или качество (такого как желательный признак или качество).[00258] Qualities that can be improved by the methods disclosed herein include any observable characteristic of the plant, including, for example, growth rate, height, weight, color, taste, odor, changes in the plant's production of one or more compounds (including, e.g. metabolites, proteins, drugs, carbohydrates, oils and any other compounds). It is also contemplated to select plants based on genotypic information (eg, including the expression profile of plant genes in response to bacteria or identifying the presence of genetic markers, such as markers associated with increased nitrogen fixation). Plants may also be selected based on the absence, suppression or inhibition of a particular trait or quality (such as an undesirable trait or quality) rather than on the basis of the presence of a certain trait or quality (such as a desirable trait or quality).

ПРИМЕРЫEXAMPLES

[00259] В приведенных в настоящем документе примерах описаны способы выделения бактерий, анализа бактерий и растений и улучшения качеств растений. Примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие изобретение каким-либо образом. [00259] The examples provided herein describe methods for isolating bacteria, analyzing bacteria and plants, and improving plant qualities. The examples are provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the invention in any way.

Пример 1. Выделение микроорганизмов из растительной ткани Example 1. Isolation of microorganisms from plant tissue

[00260] Плодородный слой почвы был получен из различных сельскохозяйственных районов Центральной Калифорнии. Было собрано двадцать видов почв с различными структурными характеристиками, в том числе тяжелая глина, торфянистый глинистый суглинок, пылеватая глина и песчаный суглинок. В каждый вид почвы были посеяны семена различной полевой кукурузы, сладкой кукурузы, негибридной кукурузы и томатов, как показано в таблице 1. [00260] Topsoil was obtained from various agricultural areas of Central California. Twenty soil types with varying structural characteristics were collected, including heavy clay, peaty clay loam, silty clay and sandy loam. Seeds of a variety of field corn, sweet corn, non-hybrid corn, and tomatoes were sown in each soil type, as shown in Table 1.

Тип сельскохозяйственной культурыType of crop Полевая кукурузаField corn Сладкая кукурузаSweet corn Негибридная кукурузаNon-hybrid corn ТоматTomato СортаVarieties Mo17Mo17 'Golden Cross Bantam T-51' от Ferry-Morse'Golden Cross Bantam T-51' by Ferry-Morse 'Moseby Prolific' от Victory Seeds'Moseby Prolific' by Victory Seeds Roma VF от Ferry-MorseRoma VF by Ferry-Morse B73B73 'Silver Queen Hybrid' от Ferry-Morse'Silver Queen Hybrid' by Ferry-Morse 'Reid's Yellow Dent' от Victory Seeds'Reid's Yellow Dent' by Victory Seeds Stover RomaStover Roma DKC 66-40DKC 66-40 'Sugar Dots' от Ferry-Morse'Sugar Dots' by Ferry-Morse 'Hickory King' от Victory Seeds'Hickory King' by Victory Seeds 'Micro Tom Hybrid' от Totally Tomatoes'Micro Tom Hybrid' from Totally Tomatoes DKC 67-07DKC 67-07 Heinz 1015Heinz 1015 DKC 70-01DKC 70-01 Heinz 2401Heinz 2401 Heinz 3402Heinz 3402 Heinz 5508Heinz 5508 Heinz 5608Heinz 5608 Heinz 8504Heinz 8504

Таблица 1. Тип сельскохозяйственной культуры и сорта, посаженные в почву с различными характеристикамиTable 1. Crop type and varieties planted in different soil characteristics

[00261] Растения выкапывали через 2-4 недели выращивания, и избыток почвы удаляли с поверхности корней деионизированной водой. После удаления почвы поверхность растений стерилизовали дезинфицирующим раствором и энергично промывали в стерильной воде. Очищенный отрезок корня размером 1 см отрезали от растения и помещали в забуференный фосфатом физиологический раствор, содержащий стальные шарики размером 3 мм. Получали суспензию путем энергичного встряхивания раствора с помощью TissueLyser II от Qiagen.[00261] Plants were dug up after 2-4 weeks of growth and excess soil was removed from the root surfaces with deionized water. After removing the soil, the surface of the plants was sterilized with a disinfectant solution and washed vigorously in sterile water. A cleaned 1 cm section of root was cut from the plant and placed in phosphate buffered saline containing 3 mm steel beads. A suspension was prepared by vigorously shaking the solution using a TissueLyser II from Qiagen.

[00262] Суспензию корня и физиологического раствора разводили и инокулировали на различные типы питательных сред для выделения ризосферных, эндофитных, эпифитных и других связанных с растением микроорганизмов. Агаровые среды R2A и Nfb использовали для получения одиночных колоний, а полутвердые скошенные среды Nfb использовали для получения популяций азотфиксирующих бактерий. Через 2-4 недели инкубации в полутвердых скошенных средах Nfb популяции микроорганизмов собирали и делали посевы штрихами для получения одиночных колоний на агаре R2A, как показано на фигурах 1A-B. Одиночные колонии повторно суспендировали в смеси R2A и глицерина, подвергали анализу методом ПЦР и замораживали при -80°C для последующего анализа. Было получено примерно 1000 отдельных колоний, которые были обозначены как «выделенные микроорганизмы». [00262] A suspension of root and saline solution was diluted and inoculated onto various types of culture media to isolate rhizosphere, endophytic, epiphytic and other plant-associated microorganisms. R2A and Nfb agar media were used to obtain single colonies, and Nfb semisolid slants were used to obtain populations of nitrogen-fixing bacteria. After 2-4 weeks of incubation in semi-solid Nfb slants, microbial populations were harvested and streaked to obtain single colonies on R2A agar as shown in Figures 1A-B. Single colonies were resuspended in a mixture of R2A and glycerol, subjected to PCR analysis, and frozen at -80°C for subsequent analysis. Approximately 1000 individual colonies were obtained and designated as “isolated microorganisms.”

[00263] Затем изоляты подвергали ПЦР-скринингу колоний для выявления присутствия гена nifH с целью идентификации диазотрофов. Для исследования присутствия кластера nif в каждом изоляте использовали ранее описанный набор праймеров Ueda 19F/388R, который, как было показано, позволяет обнаруживать более 90% диазотрофов в ходе скрининга (Ueda et al. 1995; J. Bacteriol. 177: 1414-1417). Одиночные колонии очищенных изолятов отбирали, повторно суспендировали в PBS и использовали в качестве матрицы для ПЦР колоний, как показано на фигуре 2. Колонии изолятов, которые давали позитивные полосы в ПЦР, подвергали повторному посеву штрихами, и процесс ПЦР и повторного посева штрихами колонии повторяли дважды, чтобы предотвратить ложноположительную идентификацию диазотрофов. Очищенные изоляты затем были названы «микроорганизмами-кандидатами».[00263] The isolates were then subjected to colony PCR screening to detect the presence of the nifH gene to identify diazotrophs. The previously described Ueda 19F/388R primer set, which has been shown to detect more than 90% of diazotrophs in screens, was used to examine the presence of the nif cluster in each isolate (Ueda et al. 1995; J. Bacteriol. 177: 1414-1417) . Single colonies of purified isolates were picked, resuspended in PBS, and used as a template for colony PCR, as shown in Figure 2. Colonies of isolates that produced positive bands in the PCR were streaked again, and the process of PCR and streaked colonies was repeated twice. to prevent false positive identification of diazotrophs. The purified isolates were then named “candidate microorganisms.”

Пример 2. Определение характеристик выделенных микроорганизмов Example 2. Determination of characteristics of isolated microorganisms

Секвенирование, анализ и филогенетическая характеристикаSequencing, analysis and phylogenetic characterization

[00264] Для создания предварительных филогенетических идентификаторов для выделенных и кандидатных микроорганизмов использовали секвенирование 16S рДНК с набором праймеров 515f-806r (см., например, Vernon et al.; BMC Microbiol. 23 декабря 2002 г.;2:39.). Микроорганизмы включают различные роды, в том числе: Enterobacter, Burkholderia, Klebsiella, Bradyrhizobium, Rahnella, Xanthomonas, Raoultella, Pantoea, Pseudomonas, Brevundimonas, Agrobacterium и Paenibacillus, как показано в таблице 2. [00264] 16S rDNA sequencing with primer set 515f-806r was used to generate tentative phylogenetic identifiers for the isolated and candidate microorganisms (see, e.g., Vernon et al.; BMC Microbiol. Dec. 23, 2002;2:39.). Microorganisms include various genera, including: Enterobacter, Burkholderia, Klebsiella, Bradyrhizobium, Rahnella, Xanthomonas, Raoultella, Pantoea, Pseudomonas, Brevundimonas, Agrobacterium, and Paenibacillus, as shown in Table 2.

РодGenus ИзолятыIsolates РодGenus ИзолятыIsolates AchromobacterAchromobacter 77 PaenibacillusPaenibacillus 11 AgrobacteriumAgrobacterium 117117 PaenisporosarcinaPaenisporosarcina 33 AgromycesAgromyces 11 PantoeaPantoea 1414 AlicyclobacillusAlicyclobacillus 11 PedobacterPedobacter 1616 AsticcacaulisAsticcacaulis 66 PimelobacterPimelobacter 22 BacillusBacillus 131131 PseudomonasPseudomonas 212212 BradyrhizobiumBradyrhizobium 22 RhizobiumRhizobium 44 BrevibacillusBrevibacillus 22 RhodoferaxRhodoferax 11 BurkholderiaBurkholderia 22 SphingobacteriumSphingobacterium 1313 CaulobacterCaulobacter 1717 SphingobiumSphingobium 2323 ChryseobacteriumChryseobacterium 4242 SphingomonasSphingomonas 33 ComamonasComamonas 11 SphingopyxisSphingopyxis 11 DyadobacterDyadobacter 22 StenotrophomonasStenotrophomonas 5959 FlavobacteriumFlavobacterium 4646 StreptococcusStreptococcus 33 HalomonasHalomonas 33 VariovoraxVariovorax 3737 LeptothrixLeptothrix 33 XylanimicrobiumXylanimicrobium 11 LysobacterLysobacter 22 неустановленныеunidentified 7575 NeisseriaNeisseria 1313

Таблица 2. Разнообразие микроорганизмов, выделенных из растений томата, по данным глубокого секвенирования 16S рДНК. Table 2. Diversity of microorganisms isolated from tomato plants, according to deep sequencing of 16S rDNA.

[00265] Затем геномы 39 микроорганизмов-кандидатов были секвенированы с использованием платформы Illumina Miseq. Геномную ДНК из чистых культур экстрагировали с использованием мини-набора QIAmp DNA (QIAGEN), а библиотеки тотальной ДНК для секвенирования готовили через стороннего поставщика (SeqMatic, Hayward). Затем осуществляли сборку генома с помощью конвейера A5 (Tritt et al. 2012; PLoS One 7(9):e42304). Гены были идентифицированы и аннотированы, и гены, связанные с регуляцией и экспрессией азотфиксации, были отмечены в качестве мишеней для мутагенеза. [00265] The genomes of 39 candidate microorganisms were then sequenced using the Illumina Miseq platform. Genomic DNA from pure cultures was extracted using the QIAmp DNA mini kit (QIAGEN), and total DNA libraries for sequencing were prepared through a third party supplier (SeqMatic, Hayward). The genome was then assembled using the A5 pipeline (Tritt et al. 2012; PLoS One 7(9):e42304). Genes were identified and annotated, and genes associated with the regulation and expression of nitrogen fixation were annotated as targets for mutagenesis.

Транскриптомное профилирование микроорганизмов-кандидатовTranscriptomic profiling of candidate microorganisms

[00266] Было проведено транскриптомное профилирование штамма CI010 для идентификации промоторов, активных в присутствии азота окружающей среды. Штамм CI010 культивировали в среде определенного состава, не содержащей азота, с добавкой 10 мМ глутамина. Из этих культур экстрагировали тотальную РНК (набор QIAGEN RNeasy) и подвергали секвенированию RNASeq с помощью Illumina HiSeq (SeqMatic, Фримонт, Калифорния). Чтения секвенирования картировали с данными генома CI010 с использованием Geneious, и были идентифицированы высокоэкспрессируемые гены под контролем проксимальных транскрипционных промоторов. В таблицах 3A-C перечислены гены и их относительный уровень экспрессии, измеренный с помощью секвенирования RNASeq тотальной РНК. Последовательности проксимальных промоторов записывали для использования в мутагенезе путей nif, путей, связанных с использованием азота, или других генов с желаемым уровнем экспрессии. [00266] Transcriptomic profiling of strain CI010 was performed to identify promoters active in the presence of environmental nitrogen. Strain CI010 was cultivated in a nitrogen-free medium with a specific composition and supplemented with 10 mM glutamine. Total RNA was extracted from these cultures (QIAGEN RNeasy kit) and subjected to RNASeq sequencing using Illumina HiSeq (SeqMatic, Fremont, CA). Sequencing reads were mapped to CI010 genome data using Geneious, and highly expressed genes under the control of proximal transcriptional promoters were identified. Tables 3A–C list the genes and their relative expression levels as measured by RNASeq sequencing of total RNA. Proximal promoter sequences were recorded for use in mutagenesis of nif pathways, nitrogen utilization pathways, or other genes with the desired level of expression.

Оценка удобства генетического манипулирования Assessing the ease of genetic manipulation

[00267] Микроорганизмы-кандидаты были охарактеризованы на основе трансформируемости и удобства генетического манипулирования. Во-первых, определяли оптимальное использование источника углерода по росту на небольшой панели соответствующих сред, а также по кривой роста как в среде без азота, так и в обогащенной среде. Во-вторых, определяли естественную устойчивость к антибиотикам каждого штамма путем точечного посева и выращивания в жидкой культуре, содержащей панель антибиотиков, используемых в качестве селективных маркеров мутагенеза. В-третьих, проверяли каждый штамм на его трансформируемость путем электропорации набора плазмид. Набор плазмид включает комбинированную экспансию семи точек начала репликации, т. е. p15a, pSC101, CloDF, colA, RK2, pBBR1 и pRO1600, и четырех маркеров устойчивости к антибиотикам, т. е. CmR, KmR, SpecR и TetR. Эта систематическая оценка совместимости точек начала репликации и маркеров устойчивости была использована для идентификации векторов для плазмидного мутагенеза у микроорганизмов-кандидатов.[00267] Candidate microorganisms have been characterized on the basis of transformability and ease of genetic manipulation. First, optimal carbon source utilization was determined by growth on a small panel of appropriate media, as well as the growth curve in both nitrogen-free and enriched media. Second, the natural antibiotic resistance of each strain was determined by spot plating and growth in liquid culture containing a panel of antibiotics used as selective mutagenesis markers. Third, each strain was tested for its transformability by electroporation of a set of plasmids. The plasmid set includes a combined expansion of seven origins of replication, i.e., p15a, pSC101, CloDF, colA, RK2, pBBR1, and pRO1600, and four antibiotic resistance markers, i.e., CmR, KmR, SpecR, and TetR. This systematic assessment of the compatibility of origins of replication and resistance markers was used to identify vectors for plasmid mutagenesis in candidate microorganisms.

Пример 3. Мутагенез микроорганизмов-кандидатов Example 3: Mutagenesis of Candidate Microorganisms

Лямбда Red-зависимые нокаутыLambda Red-dependent knockouts

[00268] Было получено несколько мутантов микроорганизмов-кандидатов с использованием плазмиды pKD46 или производного, содержащего маркер устойчивости к канамицину (Datsenko et al. 2000; PNAS 97(12): 6640-6645). Нокаутные кассеты были сконструированы с гомологией 250 п.н., фланкирующей ген-мишень, и получены с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами. Микроорганизмы-кандидаты были трансформированы pKD46, культивированы в присутствии арабинозы для индукции экспрессии механизма лямбда Red, подготовлены для электропорации и трансформированы нокаутными кассетами с получением мутантных штаммов-кандидатов. Четыре микроорганизма-кандидата и один лабораторный штамм, Klebsiella oxytoca M5A1, были использованы для создания тринадцати мутантов-кандидатов регуляторных генов азотфиксации nifL, glnB и amtB, как показано в таблице 4.[00268] Several candidate microbial mutants have been generated using plasmid pKD46 or a derivative containing a kanamycin resistance marker (Datsenko et al. 2000; PNAS 97(12): 6640-6645). Knockout cassettes were designed with 250 bp of homology flanking the target gene and generated by PCR with overlapping primers. Candidate microorganisms were transformed with pKD46, cultured in the presence of arabinose to induce expression of the lambda Red machinery, prepared for electroporation, and transformed with knockout cassettes to generate candidate mutant strains. Four candidate microorganisms and one laboratory strain, Klebsiella oxytoca M5A1, were used to generate thirteen candidate mutants of the nitrogen fixation regulatory genes nifL, glnB, and amtB, as shown in Table 4.

ШтаммStrain nifLnifL glnBglnB amtBamtB M5A1M5A1 XX XX XX CI006CI006 XX XX XX CI010CI010 XX XX XX CI019CI019 XX XX CI028CI028 XX XX

Таблица 4. Список мутантов с одним нокаутом, созданных с помощью лямбда Red-зависимого мутагенеза Table 4. List of single-knockout mutants generated by lambda Red-dependent mutagenesis

Олиго-направленный мутагенез с отбором с помощью Cas9Oligo-directed mutagenesis with Cas9 selection

[00269] Олиго-направленный мутагенез использовали для нацеливания геномных изменений на ген rpoB в E.coli DH10B, и отбирали мутантов с помощью системы CRISPR-Cas. Был сконструирован мутагенный олигонуклеотид (ss1283: “G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGACATACGCGACCGTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC”, где * означает тиофосфатную связь) для придания устойчивости к рифампицину посредством мутации величиной 4 п.н. в гене rpoB. Клетки, содержащие плазмиду, кодирующую Cas9, индуцировали для экспрессии Cas9, подготавливали для электропорации и затем электропорировали как мутагенным олигонуклеотидом, так и плазмидой, кодирующей конститутивную экспрессию гидовой РНК (гРНК), нацеливающей Cas9 на расщепление последовательности rpoB дикого типа. Электропорированные клетки извлекали в неселективной среде в течение ночи, чтобы обеспечить достаточную сегрегацию полученных мутантных хромосом. После посева для отбора плазмиды, кодирующей гРНК, было показано, что две из десяти прошедших скрининг колоний содержали желаемую мутацию, в то время как остальные, как было показано, являлись «ускользнувшими» мутантами, сгенерированными посредством мутации протоспейсера в плазмиде гРНК или потери плазмиды Cas9.[00269] Oligo-directed mutagenesis was used to target genomic changes to the rpoB gene in E. coli DH10B, and mutants were selected using the CRISPR-Cas system. A mutagenic oligonucleotide (ss1283: “G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGACATACGCGACCGTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC”, where * denotes a thiophosphate linkage) was designed to confer rifampicin resistance via a 4-bp mutation. in the rpoB gene. Cells containing a plasmid encoding Cas9 were induced to express Cas9, prepared for electroporation, and then electroporated with both a mutagenic oligonucleotide and a plasmid encoding the constitutive expression of a guide RNA (gRNA) targeting Cas9 for cleavage of the wild-type rpoB sequence. Electroporated cells were recovered in nonselective medium overnight to ensure sufficient segregation of the resulting mutant chromosomes. After plating to select a plasmid encoding a gRNA, two of the ten colonies screened contained the desired mutation, while the remainder were shown to be escape mutants generated by protospacer mutation in the gRNA plasmid or loss of the Cas9 plasmid .

Лямбда Red-зависимый мутагенез с селекцией с помощью Cas9Lambda Red-dependent mutagenesis with selection by Cas9

[00270] Мутанты микроорганизмов-кандидатов CI006 и CI010 были получены с помощью лямбда Red-зависимого мутагенеза с селекцией с помощью CRISPR-Cas. Нокаутные кассеты содержали эндогенный промотор, идентифицированный посредством транскрипционного профилирования (как описано в примере 2 и показано в таблице 3), и области гомологии величиной ~250 п.н., фланкирующие мишень для делеции. CI006 и CI010 трансформировали плазмидами, кодирующими систему лямбда Red-зависимой рекомбинации (гены exo, beta, gam) под контролем индуцибельного промотора арабинозы и Cas9 под контролем индуцибельного промотора IPTG. В полученных трансформантах индуцировали системы Red-зависимой рекомбинации и Cas9, и штаммы подготавливали для электропорации. Затем нокаутные кассеты и кодируемую плазмидой выбранную гРНК трансформировали в компетентные клетки. После посева на антибиотики, селективные как для плазмиды Cas9, так и для плазмиды гРНК, в 7 из 10 прошедших скрининг колоний была обнаружена предполагаемая нокаутирующая мутация, как показано на фигуре 3.[00270] Candidate microbial mutants CI006 and CI010 were generated by lambda Red-dependent mutagenesis with CRISPR-Cas selection. The knockout cassettes contained an endogenous promoter identified by transcriptional profiling (as described in Example 2 and shown in Table 3) and ~250 bp homology regions flanking the deletion target. CI006 and CI010 were transformed with plasmids encoding the lambda Red-dependent recombination system (exo, beta, gam genes) under the control of the inducible arabinose promoter and Cas9 under the control of the inducible IPTG promoter. Red-dependent recombination and Cas9 systems were induced in the resulting transformants, and the strains were prepared for electroporation. The knockout cassettes and the plasmid-encoded gRNA of choice were then transformed into competent cells. After plating with antibiotics selective for both the Cas9 plasmid and the gRNA plasmid, a putative knockout mutation was detected in 7 of 10 colonies screened, as shown in Figure 3 .

Пример 4. Фенотипирование молекул-кандидатов in vitro Example 4 In Vitro Phenotyping of Candidate Molecules

[00271] Было оценено влияние экзогенного азота на биосинтез и активность нитрогеназы у различных мутантов. Для измерения нитрогеназной активности в условиях чистой культуры использовали анализ восстановления ацетилена (ARA) (Temme et al. 2012; 109(18): 7085-7090). Штаммы выращивали в герметичных пробирках и количественно оценивали восстановление ацетилена до этилена с помощью газового хроматографа Agilent 6890. Активность микроорганизмов-кандидатов и соответствующих мутантов-кандидатов, выращенных в азотфиксирующих средах с добавкой от 0 до 10 мМ глутамина, в анализе ARA показана на фигурах 4A-B и фигурах 10A-C. [00271] The effect of exogenous nitrogen on nitrogenase biosynthesis and activity in various mutants was assessed. An acetylene reduction assay (ARA) was used to measure nitrogenase activity under pure culture conditions (Temme et al. 2012; 109(18): 7085-7090). Strains were grown in sealed tubes and the reduction of acetylene to ethylene was quantified using an Agilent 6890 gas chromatograph. The activity of candidate microorganisms and corresponding candidate mutants grown in nitrogen-fixing media supplemented with 0 to 10 mM glutamine in the ARA assay is shown in Figures 4A- B and Figures 10A-C.

[00272] В анаэробных условиях культивирования тестировали диапазон концентраций глутамина и аммиака, чтобы количественно оценить влияние на азотфиксирующую активность. В клетках дикого типа активность быстро снижалась по мере увеличения концентрации глутамина. Однако в серии первоначальных нокаутирующих мутаций был подтвержден класс мутаций, позволяющий экспрессировать гены, ответственные за азотфиксацию, при концентрациях глутамина, которые в противном случае выключали бы активность у дикого типа. Этот профиль был создан у четырех различных видов диазотрофов, как можно видеть на фигуре 4C. Кроме того, перенастройка регуляторной сети с использованием идентифицированных генетических частей позволила прогнозируемо настроить уровень азотфиксирующей активности. Это можно видеть на фигуре 4B, где проиллюстрированы штаммы CM023, CM021, CM015 и CI006. Штамм CM023 представляет собой эволюционировавший штамм низкого уровня; штамм CM021 представляет собой эволюционировавший штамм высокого уровня; штамм CM015 представляет собой эволюционировавший штамм среднего уровня; штамм CI006 представляет собой дикий тип (штамм 2). Аммиак, экскретируемый в культуральные супернатанты, анализировали с использованием анализа на основе ферментов (MEGAZYME). В анализе было измерено количество НАДФH, потребляемое при поглощении 340 нм. Анализ проводили на бактериальных культурах, выращенных в не содержащей азот анаэробной среде с начальной плотностью 1E9 КОЕ/мл. На панели из шести эволюционировавших штаммов один штамм экскретировал до 100 мкМ аммиака в течение 48 часов, как можно видеть на фигуре 4D. Кроме того, двойной мутант показал более высокую экскрецию аммиака, чем одиночный мутант, из которого он был получен, как показано на фигуре 11. Это демонстрирует способность микроорганизмов продуцировать аммиак сверх их физиологических потребностей. [00272] A range of glutamine and ammonia concentrations were tested under anaerobic culture conditions to quantify the effect on nitrogen-fixing activity. In wild-type cells, activity decreased rapidly as glutamine concentration increased. However, in a series of initial knockout mutations, a class of mutations was confirmed that allows genes responsible for nitrogen fixation to be expressed at glutamine concentrations that would otherwise abolish activity in the wild type. This profile was generated in four different diazotroph species, as can be seen in Figure 4C. In addition, reconfiguring the regulatory network using identified genetic parts allowed for predictable tuning of the level of nitrogen-fixing activity. This can be seen in Figure 4B, which illustrates strains CM023, CM021, CM015 and CI006. Strain CM023 is a low-level evolved strain; strain CM021 is a high-level evolved strain; strain CM015 is an evolved mid-level strain; strain CI006 is wild type (strain 2). Ammonia excreted into the culture supernatants was analyzed using an enzyme-based assay (MEGAZYME). The assay measured the amount of NADPH consumed at 340 nm absorbance. The analysis was performed on bacterial cultures grown in a nitrogen-free anaerobic environment with an initial density of 1E9 CFU/ml. In a panel of six evolved strains, one strain excreted up to 100 μM ammonia within 48 hours, as can be seen in Figure 4D. In addition, the double mutant showed higher ammonia excretion than the single mutant from which it was derived, as shown in Figure 11. This demonstrates the ability of microorganisms to produce ammonia beyond their physiological requirements.

Транскрипционное профилирование чистых культур Transcriptional profiling of pure cultures

[00273] Транскрипционную активность CI006 измеряли с использованием платформы Nanostring Elements. Клетки выращивали в среде, не содержащей азот, и 10E8 клеток собирали после 4-часовой инкубации. Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора Qiagen RNeasy. Очищенная РНК была отправлена в Core Diagnostics в Пало-Альто, Калифорния, для гибридизации зондов и анализа с помощью цифрового анализатора, как показано на фигуре 5.[00273] CI006 transcriptional activity was measured using the Nanostring Elements platform. Cells were grown in nitrogen-free medium, and 10E8 cells were harvested after 4-hour incubation. Total RNA was extracted using the Qiagen RNeasy kit. Purified RNA was sent to Core Diagnostics in Palo Alto, California, for probe hybridization and digital analyzer analysis as shown in Figure 5.

Пример 5. Фенотипирование микроорганизмов-кандидатов in planta Example 5 Phenotyping of candidate microorganisms in planta

Колонизация растений микроорганизмами-кандидатамиColonization of plants by candidate microorganisms

[00274] Колонизацию желаемых растений-хозяев микроорганизмом-кандидатом количественно оценивали с помощью краткосрочных экспериментов по выращиванию растений. Растения кукурузы инокулировали штаммами, экспрессирующими RFP (красный флуоресцентный белок), либо из плазмиды, либо из Tn5-интегрированной кассеты экспрессии RFP. Растения выращивали как в стерилизованном песке, так и в нестерильной торфяной среде, и инокуляцию проводили путем капания из пипетки 1 мл клеточной культуры непосредственно над формирующимся колеоптилем растения через три дня после прорастания. Плазмиды поддерживали путем полива растений раствором, содержащим подходящий антибиотик. Через три недели корни растений собирали, трижды промывали стерильной водой для удаления видимой почвы и разделяли на два образца. Один образец корня проанализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы определить закономерности локализации микроорганизмов-кандидатов. Микроскопию проводили на самых тонких интактных корнях растения длиной 10 мм, как показано на фигуре 6. [00274] Colonization of desired plant hosts by a candidate microorganism was quantified using short-term plant growth experiments. Maize plants were inoculated with strains expressing RFP (red fluorescent protein), either from a plasmid or from a Tn5-integrated RFP expression cassette. Plants were grown in both sterilized sand and non-sterile peat media, and inoculation was carried out by pipetting 1 ml of cell culture directly over the developing coleoptile of the plant three days after germination. Plasmids were maintained by watering the plants with a solution containing a suitable antibiotic. After three weeks, plant roots were harvested, washed three times with sterile water to remove visible soil, and divided into two samples. One root sample was analyzed using fluorescence microscopy to determine localization patterns of candidate microorganisms. Microscopy was carried out on the thinnest intact roots of the plant, 10 mm long, as shown in Figure 6.

[00275] Был разработан второй количественный метод оценки колонизации. Количественный анализ методом ПЦР проводили на препаратах цельной ДНК из корней растений, инокулированных эндофитами. Семена кукурузы (Dekalb DKC-66-40) проращивали в предварительно стерилизованном в автоклаве песке в горшке размером 2,5 на 2,5 дюйма на 10 дюймов. Через один день после посадки 1 мл культивированной в течение ночи культуры эндофита (среда SOB) выливали прямо в то место, где располагалось семя. 1 мл этой культивированной в течение ночи культуры примерно эквивалентно приблизительно 10⁹ КОЕ, различаясь в пределах 3 раз в зависимости от используемого штамма. Каждый проросток удобряли 3 раза в неделю 50 мл модифицированного раствора Хогланда с добавкой либо 2,5 мМ, либо 0,25 мМ нитрата аммония. Через четыре недели после посадки собирали образцы корней для экстракции ДНК. Остатки почвы смывали струей воды под давлением. Затем эти образцы тканей гомогенизировали с использованием QIAGEN Tissuelyzer, после чего экстрагировали ДНК с использованием мини-набора QIAmp DNA (QIAGEN) в соответствии с рекомендованным протоколом. На этих экстрактах ДНК проводили анализ методом кПЦР с использованием RT-PCR Stratagene Mx3005P с праймерами, сконструированными так (с использованием Primer BLAST от NCBI), чтобы они были специфичными к локусам в геноме каждого эндофита. Наличие геномных копий эндофитов количественно оценивали. Для дальнейшего подтверждения идентичности эндофитов продукты ПЦР-амплификации секвенировали, было и подтверждено, что они имели правильную последовательность. Краткое описание профиля колонизации штаммов CI006 и CI008 из микроорганизмов-кандидатов представлено в таблице 5. У штамма CI008 была продемонстрирована степень колонизации вплоть до 10⁷ КОЕ/г сырой массы корня.[00275] A second quantitative method for assessing colonization has been developed. Quantitative PCR analysis was performed on whole DNA preparations from plant roots inoculated with endophytes. Corn seeds (Dekalb DKC-66-40) were germinated in pre-autoclaved sand in a 2.5-by-2.5-inch by 10-inch pot. One day after planting, 1 ml of overnight cultured endophyte (SOB medium) was poured directly into the seed location. 1 ml of this overnight culture is approximately equivalent to approximately 10 ⁹ CFU, varying by up to 3 times depending on the strain used. Each seedling was fertilized 3 times a week with 50 ml of modified Hoagland's solution supplemented with either 2.5 mM or 0.25 mM ammonium nitrate. Four weeks after planting, root samples were collected for DNA extraction. The remaining soil was washed off with a jet of water under pressure. These tissue samples were then homogenized using the QIAGEN Tissuelyzer, followed by DNA extraction using the QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) according to the recommended protocol. These DNA extracts were analyzed by qPCR using RT-PCR Stratagene Mx3005P with primers designed (using Primer BLAST from NCBI) to be specific to loci in the genome of each endophyte. The presence of endophyte genomic copies was quantified. To further confirm the identity of the endophytes, the PCR amplification products were sequenced and confirmed to have the correct sequence. A summary of the colonization profile of strains CI006 and CI008 from candidate microorganisms is presented in Table 5. Strain CI008 has demonstrated colonization rates of up to 10 ⁷ CFU/g root fresh weight.

ШтаммStrain Степень колонизации (КОЕ/г сырой массы)Colonization rate (CFU/g wet weight) CI006CI006 1,45×10⁵ 1.45×10 ⁵ CI008CI008 1,24×10⁷ 1.24×10 ⁷

Таблица 5. Колонизация кукурузы, измеренная с помощью кПЦРTable 5. Colonization of maize measured by qPCR

Профилирование РНК in plantaRNA profiling in planta

[00276] Биосинтез компонентов пути nif in planta оценивали путем измерения транскрипции генов nif. Тотальная РНК была получена из ткани корня растения, инокулированного CI006 (способы посадки, как описано ранее). Экстракцию РНК проводили с использованием мини-набора RNEasy в соответствии с рекомендуемым протоколом (QIAGEN). Затем тотальную РНК из этих растительных тканей анализировали с использованием наборов Nanostring Elements (NanoString Technologies, Inc.) с использованием зондов, которые специфичных для генов nif в геноме штамма CI006. Сводные данные по экспрессии гена nif in planta приведены в таблице 6. Экспрессия генов nifH была обнаружена у растений, инокулированных штаммами CM013, тогда как экспрессия nifH не была обнаружена у растений, инокулированных CI006. Штамм CM013 является производным штамма CI006, в котором ген nifL был нокаутирован.[00276] Biosynthesis of nif pathway components in planta was assessed by measuring transcription of nif genes. Total RNA was obtained from root tissue of plants inoculated with CI006 (planting methods as described previously). RNA extraction was performed using the RNEasy mini kit according to the recommended protocol (QIAGEN). Total RNA from these plant tissues was then analyzed using Nanostring Elements kits (NanoString Technologies, Inc.) using probes that are specific for the nif genes in the genome of strain CI006. A summary of nif gene expression in planta is given in Table 6. Expression of nifH genes was detected in plants inoculated with strains CM013, whereas nifH expression was not detected in plants inoculated with CI006. Strain CM013 is a derivative of strain CI006, in which the nifL gene was knocked out.

[00277] Высокоэкспрессируемые гены CM011, ранжированные по транскриптам на т. п.н. на миллион (ТРМ), были измерены in planta в условиях внесения удобрения. Промоторы, контролирующие экспрессию некоторых из этих высокоэкспрессируемых генов, использовали в качестве матриц для гомологичной рекомбинации в локусы-мишени фиксации и ассимиляции азота. Образцы РНК из инокулированного CM011 растения, выращенного в теплице, экстрагировали, рРНК удаляли с использованием набора Ribo-Zero, секвенировали с использованием платформы Truseq от Illumina и картировали обратно на геном CM011. Высокоэкспрессируемые гены из CM011 перечислены в таблице 7.[00277] Highly expressed CM011 genes ranked by transcript per kb. per million (TPM) were measured in planta under fertilized conditions. The promoters that control the expression of some of these highly expressed genes have been used as templates for homologous recombination into target loci for nitrogen fixation and assimilation. RNA samples from a CM011-inoculated greenhouse-grown plant were extracted, rRNA was removed using a Ribo-Zero kit, sequenced using Illumina's Truseq platform, and mapped back to the CM011 genome. Highly expressed genes from CM011 are listed in Table 7.

ШтаммыStrains Относительная экспрессия транскриптаRelative transcript expression CI006CI006 9,49.4 CM013CM013 103,25103.25

Таблица 6. Экспрессия nifH in plantaTable 6. Expression of nifH in planta

Наименование генаGene name Локализация генаGene localization НаправлениеDirection Необработанное число чтенийRaw number of reads TPM (транскрипты на т.п.н. на миллион)TPM (transcripts per kb per million) CDS rpsH CDS rpsH 18196-1858818196-18588 обратноеthe opposite 4841,54841.5 27206,427206.4 CDS rplQ CDS rplQ 11650-1203911650-12039 обратноеthe opposite 43334333 24536,224536.2 CDS rpsJ CDS rpsJ 25013-2532425013-25324 обратноеthe opposite 34233423 2422924229 CDS rplV CDS rplV 21946-2227821946-22278 обратноеthe opposite 3367,53367.5 2233322333 CDS rpsN CDS rpsN 18622-1892718622-18927 обратноеthe opposite 27922792 20150,120150.1 CDS rplN CDS rplN 19820-2019119820-20191 обратноеthe opposite 33173317 19691,819691.8 CDS rplF CDS rplF 17649-1818217649-18182 обратноеthe opposite 4504,54504.5 18628,918628.9 CDS rpsD CDS rpsD 13095-1371513095-13715 обратноеthe opposite 5091,55091.5 18106,618106.6 CDS rpmF CDS rpmF 8326-84938326-8493 прямоеdirect 1363,51363.5 17923,817923.8 CDS rplW CDS rplW 23429-2373123429-23731 обратноеthe opposite 22522252 16413,816413.8 CDS rpsM CDS rpsM 14153-1450914153-14509 обратноеthe opposite 22692269 14036,214036.2 CDS rplR CDS rplR 17286-1763917286-17639 обратноеthe opposite 2243,52243.5 13996,113996.1 CDS rplC CDS rplC 24350-2497924350-24979 обратноеthe opposite 39853985 13969,213969.2 CDS rplK CDS rplK 25526-2595425526-25954 обратноеthe opposite 2648,52648.5 13634,113634.1 CDS rplP CDS rplP 20807-2121720807-21217 обратноеthe opposite 24232423 13019,513019.5 CDS rplX CDS rplX 19495-1980919495-19809 обратноеthe opposite 18241824 12787,812787.8 CDS rpsQ CDS rpsQ 20362-2061620362-20616 обратноеthe opposite 1460,51460.5 12648,712648.7 CDS bhsA 3CDS bhsA 3 79720-7997779720-79977 обратноеthe opposite 14641464 12531,512531.5 CDS rpmC CDS rpmC 20616-2080720616-20807 обратноеthe opposite 998,5998.5 1148511485 CDS rpoA CDS rpoA 12080-1306912080-13069 обратноеthe opposite 48554855 10830,210830.2 CDS rpoA CDS rpoA 23728-2433323728-24333 обратноеthe opposite 2916,52916.5 10628,510628.5 CDS bhsA 1CDS bhsA 1 78883-7914078883-79140 обратноеthe opposite 10681068 9141,99141.9 CDS rpsS CDS rpsS 22293-2257122293-22571 обратноеthe opposite 1138,51138.5 9011,89011.8 CDS rpmA CDS rpmA 2210-24672210-2467 прямоеdirect 1028,51028.5 8803,78803.7 CDS rpmD CDS rpmD 16585-1676416585-16764 обратноеthe opposite 694,5694.5 8520,88520.8 CDS rplB CDS rplB 22586-2341022586-23410 обратноеthe opposite 31323132 83848384 CDS rpsC CDS rpsC 21230-2192821230-21928 обратноеthe opposite 2574,52574.5 8133,98133.9 CDS rplE CDS rplE 18941-1948018941-19480 обратноеthe opposite 1972,51972.5 8066,98066.9 CDS rplO CDS rplO 16147-1658116147-16581 обратноеthe opposite 15511551 7874,27874.2 CDS субъединицы SecY препротеин-транслоказы CDS subunit of SecY preprotein translocase 14808-1613914808-16139 обратноеthe opposite 46574657 7721,27721.2 rpsM CDS rpsM CDS 16771-1727116771-17271 обратноеthe opposite 1671,51671.5 73687368 CDS rpsKCDS rpsK 13746-1413513746-14135 обратноеthe opposite 1223,51223.5 6928,26928.2 CDS tufA CDS tufA 27318-2822927318-28229 обратноеthe opposite 28502850 6901,36901.3 CDS rpmI CDS rpmI 38574-3877138574-38771 прямоеdirect 615615 6859,56859.5 CDS rplU CDS rplU 1880-21911880-2191 прямоеdirect 935,5935.5 6621,76621.7 CDS rplT CDS rplT 38814-3917038814-39170 прямоеdirect 10451045 6464,46464.4 CDS bhsA 2 CDS bhsA 2 79293-7955079293-79550 обратноеthe opposite 754754 6454,16454.1 CDS rpmB CDS rpmB 8391-86278391-8627 обратноеthe opposite 682682 6355,16355.1 CDS rplJ CDS rplJ 23983-2448023983-24480 обратноеthe opposite 14081408 6243,96243.9 CDS fusA 2CDS fusA 2 481-2595481-2595 обратноеthe opposite 58325832 6089,66089.6 CDS rpsA CDS rpsA 25062-2677125062-26771 обратноеthe opposite 46134613 5957,65957.6 CDS rpmJ CDS rpmJ 14658-1477414658-14774 обратноеthe opposite 314314 5926,95926.9 CDS rpsR CDS rpsR 52990-5321752990-53217 прямоеdirect 603603 5840,75840.7 CDS rpsG CDS rpsG 2692-31622692-3162 обратноеthe opposite 12431243 5828,25828.2 CDS rpsI CDS rpsI 11354-1174611354-11746 обратноеthe opposite 980,5980.5 5509,85509.8 CDS cspC 1 CDS cspC 1 8091-83008091-8300 обратноеthe opposite 509509 5352,85352.8 CDS rpsF CDS rpsF 52270-5266252270-52662 прямоеdirect 916916 5147,45147.4 CDS rpsT CDS rpsT 55208-5547155208-55471 обратноеthe opposite 602602 5035,95035.9 CDS infC CDS infC 38128-3847838128-38478 прямоеdirect 755755 4750,34750.3 CDS cspG CDS cspG 30148-3036030148-30360 прямоеdirect 446446 4624,24624.2

Таблица 7. Высокоэкспрессируемые гены из CM011Table 7. Highly expressed genes from CM011

Анализ ¹⁵NAnalysis ¹⁵ N

[00278] В основном способе демонстрации фиксации используется изотоп азота 15N, который содержится в атмосфере в фиксированном соотношении относительно 14N. Внося в удобрение либо в атмосферу повышенные уровни 15N, можно наблюдать фиксацию в растительных тканях либо непосредственно, в виде повышенных количеств 15N, фиксированных из атмосферы с добавкой газообразного 15N2 (Yoshida 1980), либо в обратной зависимости посредством разбавления обогащенного удобрения газообразным N2 из атмосферы (Iniguez 2004). Метод разбавления позволяет наблюдать кумулятивный фиксированный азот в течение роста растения, в то время как метод с использованием газообразного 15N₂ ограничен измерением фиксации, которая происходит в течение короткого интервала, в течение которого растение можно выращивать в изолированной атмосфере (измерение интенсивности). Следовательно, метод с использованием газа обладает большей специфичностью (поскольку любые повышенные уровни 15N₂ в растении выше атмосферного уровня могут быть однозначно отнесены к фиксации), но он не может показать кумулятивную активность. [00278] The primary method for demonstrating fixation uses the nitrogen isotope 15N, which is present in the atmosphere at a fixed ratio relative to 14N. By introducing elevated levels of 15N into fertilizer or into the atmosphere, fixation in plant tissues can be observed either directly, in the form of increased amounts of 15N fixed from the atmosphere with the addition of 15N2 gas (Yoshida 1980), or inversely through dilution of the enriched fertilizer with N2 gas from the atmosphere ( Iniguez 2004). The dilution method allows observation of the cumulative fixed nitrogen during plant growth, while the _15N2 gas method is limited to measuring fixation that occurs during the short interval during which the plant can be grown in an isolated atmosphere (intensity measurement). Therefore, the gas method has greater specificity (since any elevated levels of _15N2 in the plant above atmospheric levels can be clearly attributed to fixation), but it cannot show cumulative activity.

[00279] Были проведены оба вида анализа для измерения активности фиксации улучшенных штаммов относительно растений кукурузы дикого типа и не подвергшихся инокуляции, и наблюдались повышенные степени фиксации in planta для нескольких из улучшенных штаммов (фигура 12, фигура 14A и фигура 14B). Эти анализы позволяют продемонстрировать, что активность штаммов, наблюдаемая in vitro, транслируется в результаты in vivo. Кроме того, эти анализы позволяют измерять влияние удобрений на активность штамма и дали основания полагать о подходящей функциональности штамма для сельскохозяйственных условий. Аналогичные результаты наблюдались при инокуляции растений сетарии дикими типами и улучшенными штаммами (фигура 13). Фиксирующая активность in planta, показанная на фигурах 14A-14C, дополнительно подтверждаются транскриптомными данными. Эволюционировавшие штаммы демонстрируют повышенный уровень транскрипта nifH по сравнению с аналогами дикого типа. Кроме того, уровень азота, полученного из микроорганизмов, in planta, также коррелирует с уровнем колонизации для каждого отдельного растения. Эти результаты (фигура 12, фигура 13, фигуры 14A-14C, фигура 15A и фигура 15B) подтверждают гипотезу о том, что микроорганизм благодаря улучшенной регуляции кластера генов nif является вероятной причиной увеличения уровня атмосферного азота, наблюдаемого в растительной ткани. Помимо непосредственного измерения фиксации было измерено влияние инокуляции растений улучшенными штаммами в анализе биомассы растений, подвергнутых воздействию стресса, вызванному недостатком азота. Хотя биомасса растения может быть связана со многими возможными взаимодействиями микроорганизма с растением, можно ожидать, что добавление фиксированного азота повлияет на фенотип растения, когда содержание азота лимитировано. Инокулированные растения выращивали при полном отсутствии азота, и у инокулированных растений наблюдалось значительное увеличение площади листьев, сырой и сухой массы побегов, а также сырой и сухой массы корней по сравнению с необработанными контролями (фигура 14C). Хотя эти различия не могут быть отнесены исключительно к азотфиксации, они подтверждают вывод о том, что улучшенные штаммы активно обеспечивают растение азотом. Растения кукурузы и сетарии выращивали и инокулировали, как описано выше. Растения регулярно снабжали удобрением, содержащим 1,2% ¹⁵N, посредством полива. Фиксацию азота микроорганизмами определяли путем измерения уровня ¹⁵N в растительной ткани. Ткань четвертого листа собирали и высушивали через 4 недели после посадки. Образцы высушенных листьев гомогенизировали с использованием шариков (QIAGEN Tissuelyzer) и отбирали аликвоты в оловянные капсулы для проведения IRMS (Лаборатория стабильных изотопов MBL в The Ecosystems Center, Вудс-Хол, Массачусетс). Рассчитывали азот, полученный из атмосферы (NDFA),и продукция азота CI050 и CM002 показана на фигуре 7.[00279] Both assays were performed to measure the fixation activity of the improved strains relative to wild-type and uninoculated corn plants, and increased in planta fixation rates were observed for several of the improved strains (Figure 12, Figure 14A and Figure 14B). These assays demonstrate that strain activity observed in vitro translates to in vivo results. In addition, these assays allow the measurement of the effect of fertilizers on the activity of the strain and provide evidence for the appropriate functionality of the strain for agricultural conditions. Similar results were observed when setaria plants were inoculated with wild types and improved strains (Figure 13). The in planta fixation activity shown in Figures 14A-14C is further supported by transcriptomic data. The evolved strains exhibit increased levels of nifH transcript compared to their wild-type counterparts. Additionally, the level of microbially derived nitrogen in planta also correlates with the level of colonization for each individual plant. These results (Figure 12, Figure 13, Figures 14A-14C, Figure 15A and Figure 15B) support the hypothesis that the microorganism, through improved regulation of the nif gene cluster, is the likely cause of the increase in atmospheric nitrogen levels observed in plant tissue. In addition to directly measuring fixation, the effect of plant inoculation with improved strains was measured in a biomass assay of plants exposed to nitrogen deficiency stress. Although plant biomass can be related to many possible microorganism-plant interactions, addition of fixed nitrogen can be expected to affect plant phenotype when nitrogen is limited. Inoculated plants were grown in the complete absence of nitrogen, and inoculated plants showed significant increases in leaf area, shoot fresh and dry weight, and root fresh and dry weight compared to untreated controls (Figure 14C). Although these differences cannot be attributed solely to nitrogen fixation, they support the conclusion that the improved strains actively provide nitrogen to the plant. Corn and setaria plants were grown and inoculated as described above. Plants were regularly supplied with fertilizer containing 1.2% ¹⁵ N through irrigation. Microbial nitrogen fixation was determined by measuring ^15N levels in plant tissue. Fourth leaf tissue was collected and dried 4 weeks after planting. Dried leaf samples were homogenized using beads (QIAGEN Tissuelyzer) and aliquoted into tin capsules for IRMS (MBL Stable Isotope Laboratory at The Ecosystems Center, Woods Hole, MA). Nitrogen derived from atmosphere (NDFA) was calculated, and the nitrogen production of CI050 and CM002 is shown in Figure 7.

Анализ продукции фитогормоновAnalysis of phytohormone production

[00280] Сорт карликовых томатов (Solanum lycopersicum) 'Micro-Tom' ранее использовался для изучения влияния индол-3-уксусной кислоты на созревание плодов в in vitro анализе (Cohen 1996; J Am Soc Hortic Sci 121: 520-524). Для оценки продукции и секреции фитогормонов микроорганизмами-кандидатами был разработан скрининговый анализ на основе планшетов с использованием незрелых плодов Micro-Tom. Планшеты для тканевых культур с двенадцатью лунками подготавливали, заполняя лунки агаровой средой, позволяя ей затвердеть, и точечно высевая 10 мкл культур микроорганизмов, культивированных в течение ночи, на поверхность агара, как показано на фигуре 8. Лунки с агаром, содержащие возрастающие количества гибберелловой кислоты (GA), но без бактериальной культуры, использовали в качестве положительного контроля и стандартов. Цветы на следующий день после расцветания, срезанные с растущих растений Micro-Tom, вставляли стеблем в агар в точке бактериальной точечной культуры. За этими цветами наблюдали в течение 2-3 недель, после чего собирали и взвешивали плоды. Увеличение массы плодов в нескольких параллельных анализах свидетельствует о выработке растительного гормона инокулирующим микроорганизмом, как показано на фигуре 9.[00280] The dwarf tomato (Solanum lycopersicum) cultivar 'Micro-Tom' has previously been used to study the effects of indole-3-acetic acid on fruit ripening in an in vitro assay (Cohen 1996; J Am Soc Hortic Sci 121: 520-524). To evaluate the production and secretion of phytohormones by candidate microorganisms, a plate-based screening assay was developed using Micro-Tom immature fruits. Twelve-well tissue culture plates were prepared by filling the wells with agar medium, allowing it to solidify, and spot-plating 10 μl of overnight cultures of microorganisms onto the agar surface as shown in Figure 8. Agar wells containing increasing amounts of gibberellic acid (GA), but without bacterial culture, were used as positive controls and standards. Flowers the day after bloom, cut from growing Micro-Tom plants, were inserted stem-wise into agar at the point of a bacterial spot culture. These flowers were observed for 2-3 weeks, after which the fruits were collected and weighed. An increase in fruit weight in several parallel assays indicates production of a plant hormone by the inoculating microorganism, as shown in Figure 9.

Пример 6. Циклическая эволюция хозяин-микроорганизмExample 6. Cyclic evolution of host-microorganism

[00281] Растения кукурузы инокулировали CM013 и выращивали в течение 4 недель приблизительно до стадии роста V5. Растения, демонстрирующие улучшенное накопление азота из микробиологических источников в анализе ¹⁵N, выкапывали и корни промывали водой под давлением для удаления основной массы почвы. Отрезок корня массой 0,25 г разрезали и промывали в растворе PBS для удаления мелких частиц почвы и неприлипших микроорганизмов. Образцы тканей гомогенизировали с использованием стальных шариков размером 3 мм в QIAGEN TissueLyser II. Гомогенат разбавляли и высевали на агаровую среду SOB. Одиночные колонии повторно суспендировали в жидких средах и подвергали анализу методом ПЦР 16s рДНК и мутаций, уникальных для инокулирующего штамма. Процесс выделения, мутагенеза, инокуляции и повторного выделения микроорганизмов может быть повторен многократно для улучшения качеств микроорганизмов, качеств растений и колонизационной способности микроорганизма.[00281] Corn plants were inoculated with CM013 and grown for 4 weeks to approximately V5 growth stage. Plants showing improved nitrogen accumulation from microbial sources in the ^15N assay were dug up and the roots were pressure washed with water to remove the bulk of the soil. A 0.25 g root segment was cut and washed in PBS to remove fine soil particles and non-adherent microorganisms. Tissue samples were homogenized using 3 mm steel beads in a QIAGEN TissueLyser II. The homogenate was diluted and plated on SOB agar medium. Single colonies were resuspended in liquid media and subjected to PCR analysis of 16s rDNA and mutations unique to the inoculating strain. The process of isolation, mutagenesis, inoculation and re-isolation of microorganisms can be repeated many times to improve the quality of the microorganism, the quality of the plant and the colonization ability of the microorganism.

Пример 7. Совместимость с различной географиейExample 7: Cross-Geography Compatibility

[00282] Способность улучшенных микроорганизмов колонизировать инокулированное растение имеет решающее значение для успеха растения в полевых условиях. Хотя описанные способы выделения предназначены для отбора из почвенных микроорганизмов, которые могут иметь тесную связь с сельскохозяйственными растениями, такими как кукуруза, многие штаммы могут неэффективно осуществлять колонизацию в случае различных генотипов растений, сред, типов почв или условий инокуляции. Поскольку колонизация представляет собой сложный процесс, требующий ряда взаимодействий между штаммом микроорганизма и растением-хозяином, скрининг на компетентность к колонизации стал центральным способом отбора приоритетных штаммов для дальнейшей разработки. В ранних попытках оценить колонизацию использовалось флуоресцентное мечение штаммов, которое было эффективным, но занимало много времени и не масштабировалось для каждого штамма. Поскольку колонизационная активность не поддается прямому улучшению, крайне важно, чтобы потенциальные продукты-кандидаты были выбраны из штаммов, которые являются естественными колонизаторами. [00282] The ability of improved microorganisms to colonize an inoculated plant is critical to the plant's success in the field. Although the isolation methods described are designed to select from soil microorganisms that may have close associations with crop plants such as corn, many strains may not colonize effectively under different plant genotypes, environments, soil types, or inoculation conditions. Because colonization is a complex process requiring a series of interactions between the microorganism strain and the host plant, screening for colonization competence has become a central way to select priority strains for further development. Early attempts to assess colonization used fluorescent labeling of strains, which was effective but time-consuming and did not scale to each strain. Since colonization activity cannot be directly improved, it is critical that potential product candidates are selected from strains that are natural colonizers.

[00283] Был разработан анализ для тестирования на устойчивую колонизацию штаммов дикого типа в любом отдельно взятом растении-хозяине с использованием кПЦР и праймеров, сконструированных таким образом, чтобы они были специфичными для штамма в образце сообщества. Этот анализ предназначен для быстрого измерения степени колонизации микроорганизмов в образцах ткани кукурузы. Первоначальные тесты с использованием штаммов, оцененных как вероятные колонизаторы, с использованием флуоресцентной микроскопии и методик на основе планшетов, показали, что подход с использованием кПЦР был бы как количественным, так и масштабируемым. [00283] An assay has been developed to test for persistent colonization of wild-type strains in any single host plant using qPCR and primers designed to be specific for the strain in the community sample. This assay is designed to quickly measure the degree of microbial colonization in maize tissue samples. Initial tests using strains assessed as likely colonizers using fluorescence microscopy and plate-based techniques indicated that a qPCR approach would be both quantitative and scalable.

[00284] Типичный анализ проводится следующим образом: растения, в основном сорта кукурузы и пшеницы, выращивают в торфяной почевнной смеси для выращивания в теплице в шести параллельных анализах на штамм. Через четыре или пять дней после посадки пипеткой на формирующийся колеоптиль из пипетки капают дозу 1 мл культур бактерий в ранней стационарной фазе, разбавленных до оптической плотности при 590 нм, равной 0,6-1,0 (примерно 5E+08 КОЕ/мл). Растения поливают только водопроводной водой и позволяют им расти в течение четырех недель перед отбором проб, после чего растения выкапывают и корни тщательно промывают для удаления большинства остатков торфа. Образцы чистых корней отрезают и гомогенизируют, чтобы создать суспензию детрита растительных клеток и связанных бактериальных клеток. Авторы разработали протокол высокопроизводительной экстракции ДНК, эффективно обеспечивавший смесь растительной и бактериальной ДНК для использования в качестве матрицы для кПЦР. Основанный на экспериментах с добавками бактериальных клеток, этот процесс экстракции ДНК обеспечивает количественный образец бактериальной ДНК относительно сырой массы корней. Каждый штамм оценивают с использованием штамм-специфичных праймеров, сконструированных с использованием Primer BLAST (Ye 2012), и сравнивают с фоновой амплификацией из неинокулированных растений. Поскольку некоторые праймеры демонстрируют нецелевую амплификацию у неинокулированных растений, колонизацию определяют либо по наличию амплификации либо повышенной амплификации правильного продукта по сравнению с фоновым уровнем.[00284] A typical assay is conducted as follows: plants, primarily corn and wheat varieties, are grown in a peat-based greenhouse soil mixture in six parallel assays per strain. Four or five days after planting, a 1 ml dose of early stationary phase bacterial cultures diluted to an optical density at 590 nm of 0.6-1.0 (approximately 5E+08 CFU/ml) is pipetted onto the developing coleoptile. Plants are watered only with tap water and allowed to grow for four weeks before sampling, after which the plants are dug up and the roots are thoroughly washed to remove most peat residues. Clean root samples are cut and homogenized to create a suspension of plant cell detritus and associated bacterial cells. The authors developed a high-throughput DNA extraction protocol that efficiently provided a mixture of plant and bacterial DNA for use as a template for qPCR. Based on experiments with bacterial cell additions, this DNA extraction process provides a quantitative sample of bacterial DNA relative to root wet weight. Each strain is evaluated using strain-specific primers designed using Primer BLAST (Ye 2012) and compared to background amplification from uninoculated plants. Because some primers exhibit off-target amplification in uninoculated plants, colonization is determined by either the presence of amplification or increased amplification of the correct product compared to background levels.

[00285] Этот анализ использовали для измерения совместимости микробиологического продукта с различной географией почвы. Качества полевой почвы и полевые условия могут оказать огромное влияние на воздействие микробиологического продукта. pH почвы, водоудерживающая способность и конкурентоспособные микроорганизмы представляют собой лишь несколько примеров факторов в почве, которые могут влиять на выживаемость инокулята и колонизационную способность. Анализ колонизации был проведен с использованием трех различных типов почв, отобранных с сельскохозяйственных полей в Калифорнии, в качестве среды для выращивания растений (фигура 16А). Для имитации реалистичных сельскохозяйственных условий использовали промежуточную плотность инокуляции. В течение 3 недель штамм 5 колонизировал все растения при от 1E+06 до 1E+07 КОЕ/г сырой массы. Через 7 недель выращивания растений эволюционировавшая версия штамма 1 показывала высокую степень колонизации (1E+06 КОЕ/г сырой массы) во всех типах почв. (фигура 16B). [00285] This assay was used to measure the compatibility of a microbiological product with different soil geographies. Field soil qualities and field conditions can have a huge impact on the impact of a microbial product. Soil pH, water holding capacity, and competitive microorganisms are just a few examples of soil factors that can influence inoculum survival and colonization ability. Colonization assays were conducted using three different soil types collected from agricultural fields in California as plant growing media (Figure 16A). Intermediate inoculation densities were used to simulate realistic agricultural conditions. Within 3 weeks, strain 5 colonized all plants at 1E+06 to 1E+07 CFU/g fresh weight. After 7 weeks of plant growth, the evolved version of strain 1 showed a high degree of colonization (1E+06 CFU/g fresh weight) in all soil types. (Figure 16B).

[00286] Кроме того, для оценки колонизации при сложности полевых условий было начато полевое испытание на площади 1 акр в Сан-Луис-Обиспо в июне 2015 года для оценки воздействия и колонизации семи штаммов дикого типа на две разновидности полевой кукурузы. Агротехническое планирование и выполнение испытания были выполнены подрядной полевой исследовательской организацией Pacific Ag Research. Для инокуляции использовалась та же технология нанесения покрытия на семена торфяных культур, которая была испытана в эксперименте с методами инокуляции. В течение вегетационного периода собирали образцы растений для оценки колонизации внутри корня и стебля. Образцы собирали с трех параллельных анализов каждой обработки через четыре и восемь недель после посадки и со всех шести параллельных анализов каждой обработки незадолго до сбора урожая через 16 недель. Дополнительные образцы собирали со всех шести параллельных анализов обработки, инокулированных штаммом 1 и штаммом 2, а также необработанными контролями, через 12 недель. Количество клеток на грамм сырой массы отмытых корней оценивали как при других анализах колонизации с использованием кПЦР и штамм-специфичных праймеров. Два штамма, штамм 1 и штамм 2, показали согласованную и широко распространенную колонизацию корней, которая достигла пика через 12 недель, а затем резко снизилась (фигура 16C). Хотя штамм 2, по-видимому, присутствовал в количестве на порядок ниже, чем штамм 1, он был обнаружен в более согласующихся количествах у разных растений. По-видимому, ни один из штаммов не осуществлял эффективную колонизацию внутренней части стебля. В подтверждение данных о колонизации, полученных методом кПЦР, оба штамма были успешно повторно выделены из образцов корней с использованием посева и секвенирования 16S для идентификации изолятов, имеющих совпадающие последовательности.[00286] Additionally, to evaluate colonization under complex field conditions, a 1-acre field trial was initiated in San Luis Obispo in June 2015 to evaluate the impact and colonization of seven wild-type strains on two varieties of field corn. Agricultural planning and trial execution were performed by contracted field research organization Pacific Ag Research. For inoculation, the same peat seed coating technology was used that was tested in the inoculation methods experiment. Plant samples were collected throughout the growing season to assess colonization within the root and stem. Samples were collected from three parallel assays of each treatment at four and eight weeks after planting and from all six parallel assays of each treatment shortly before harvest at 16 weeks. Additional samples were collected from all six parallel treatment assays inoculated with strain 1 and strain 2, as well as untreated controls, after 12 weeks. The number of cells per gram of fresh weight of washed roots was assessed as in other colonization assays using qPCR and strain-specific primers. Two strains, strain 1 and strain 2, showed consistent and widespread root colonization that peaked at 12 weeks and then declined sharply (Figure 16C). Although strain 2 appeared to be present in quantities an order of magnitude lower than strain 1, it was found in more consistent quantities across different plants. Apparently, none of the strains efficiently colonized the interior of the stem. In support of the colonization data obtained by qPCR, both strains were successfully reisolated from root samples using culture and 16S sequencing to identify isolates having matching sequences.

[00287] Примеры селекции микроорганизмов можно обобщить на схеме, приведенной на фигуре 17 и фигуре 18. На фигуре 17 изображена селекция микроорганизмов, где сначала может быть измерен состав микробиома и идентифицированы интересующие виды. Метаболизм микробиома может быть картирован и связан с генетикой. После этого можно ввести целевое генетическое изменение, используя методы, включающие, не ограничиваясь перечисленным, конъюгацию и рекомбинацию, химический мутагенез, адаптивную эволюцию и редактирование генов. Производные микроорганизмы используют для инокуляции сельскохозяйственных культур. В некоторых примерах отбирают сельскохозяйственные культуры с лучшими фенотипами.[00287] Examples of microbial selection can be summarized in the diagram shown in Figure 17 and Figure 18. Figure 17 depicts microbial selection where the composition of the microbiome can first be measured and species of interest identified. Microbiome metabolism can be mapped and linked to genetics. The targeted genetic change can then be introduced using techniques including, but not limited to, conjugation and recombination, chemical mutagenesis, adaptive evolution, and gene editing. Derived microorganisms are used to inoculate crops. In some examples, crops with better phenotypes are selected.

[00288] Как показано на фигуре 17, сначала может быть измерен состав микробиома и идентифицированы интересующие виды. Метаболизм микробиома может быть картирован и связан с генетикой. Метаболизм азота может включать в себя поступление аммиака (NH₄ ⁺) из ризосферы в цитозоль бактерий посредством транспортера AmtB. Аммиак и L-глутамат (L-Glu) катализируются глутаминсинтетазой и АТФ в глутамин. Глутамин может привести к образованию биомассы (росту растений), а также может ингибировать экспрессию оперона nif. После этого можно ввести целевое генетическое изменение, используя методы, включающие, не ограничиваясь перечисленным, конъюгацию и рекомбинацию, химический мутагенез, адаптивную эволюцию и редактирование генов. Производные микроорганизмы используют для инокуляции сельскохозяйственных культур. Отбирают сельскохозяйственные культуры с лучшими фенотипами.[00288] As shown in Figure 17, the composition of the microbiome can first be measured and species of interest identified. Microbiome metabolism can be mapped and linked to genetics. Nitrogen metabolism may involve the entry of ammonia (NH ₄ ⁺ ) from the rhizosphere into the bacterial cytosol via the AmtB transporter. Ammonia and L-glutamate (L-Glu) are catalyzed by glutamine synthetase and ATP into glutamine. Glutamine can lead to biomass production (plant growth) and can also inhibit the expression of the nif operon. The targeted genetic change can then be introduced using techniques including, but not limited to, conjugation and recombination, chemical mutagenesis, adaptive evolution, and gene editing. Derived microorganisms are used to inoculate crops. Crops with the best phenotypes are selected.

[00289] В контексте описания изобретения (особенно в контексте нижеследующей формулы изобретения) термины в единственном числе относятся как к единственному, так и множественному числу, если иное не указано, указано в настоящем документе или это явно противоречит контексту. Термины «содержащий», «имеющий» и «включающий» следует толковать как неограничивающие (т.е. означающие «включающий, не ограничиваясь перечисленным»), если не указано иное. Приведение диапазонов значений в настоящем документе предназначено исключительно с целью упростить ссылку по отдельности на каждое значение внутри диапазона, если в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было упомянуто отдельно. Например, если раскрыт диапазон 10-15, то также раскрыты 11, 12, 13 и 14. Все описанные в настоящем документе способы могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если не указано иное или это явно не противоречит контексту. Любые возможные примеры или приведение в качестве примера (например, «такой как») в настоящем документе предназначено исключительно для лучшего раскрытия изобретения и не накладывает ограничений на объем настоящего изобретения, если в формуле изобретения не заявлено иное. Никакую формулировку в описании не следует толковать как указывающую на какой-либо отсутствующий в формуле изобретения элемент как на элемент, существенный для практического осуществления изобретения.[00289] As used herein (especially in the context of the following claims), the singular terms refer to both the singular and plural unless otherwise indicated, indicated herein, or clearly contrary to the context. The terms “comprising,” “having,” and “including” are to be construed as non-limiting (i.e., to mean “including but not limited to”) unless otherwise noted. The reference to ranges of values herein is intended solely for the purpose of facilitating individual reference to each value within the range, unless otherwise indicated herein, and each individual value is included in the description as if it were mentioned separately. For example, if the range 10-15 is disclosed, then 11, 12, 13 and 14 are also disclosed. All methods described herein can be performed in any suitable order unless otherwise indicated or clearly inconsistent with context. Any possible examples or exemplary references (eg, “such as”) herein are intended solely to better disclose the invention and do not limit the scope of the present invention unless otherwise stated in the claims. Nothing in the specification should be construed as indicating any element missing from the claims as being essential to the practice of the invention.

[00290] Хотя в настоящем документе были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что такие варианты осуществления предоставлены только в качестве примера. Множество вариаций, изменений и замен без выхода за рамки изобретения будут понятны специалистам в данной области техники. Следует понимать, что при практическом осуществлении изобретения могут быть использованы различные альтернативы вариантам осуществления изобретения, описанным в настоящем документе. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем изобретения и, таким образом, охватывает способы и структуры в пределах объема этой формулы изобретения и их эквиваленты.[00290] Although preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, those skilled in the art will appreciate that such embodiments are provided by way of example only. Many variations, changes and substitutions will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope of the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments described herein may be used in the practice of the invention. The following claims are intended to define the scope of the invention and thus cover methods and structures within the scope of these claims and their equivalents.

[00291] Таблица 3А[00291] Table 3A

НаименованиеName Минимальное значениеMinimum value Максимальное значениеMaximum value ДлинаLength НаправлениеDirection CDS муреин-липопротеинаMurein lipoprotein CDS 2 929 8982 929 898 2 930 1342 930 134 237237 прямоеdirect CDS мембранного белка membrane protein CDS 5 217 5175 217 517 5 217 8435 217 843 327327 прямоеdirect CDS цинк/кадмий-связывающего белкаCDS of zinc/cadmium binding protein 3 479 9793 479 979 3 480 6263 480 626 648648 прямоеdirect CDS ацильного белка-носителя CDS of acyl carrier protein 4 563 3444 563 344 4 563 5804 563 580 237237 обратноеthe opposite CDS ompX CDS ompX 4 251 0024 251 002 4 251 5144 251 514 513513 прямоеdirect CDS ДНК-связывающего белка HU-бета CDS of DNA binding protein HU-beta 375 156375 156 375 428375 428 273273 прямоеdirect CDS sspACDS sspA 629 998629 998 630 636630 636 639639 обратноеthe opposite CDS tatECDS tatE 3 199 4353 199 435 3 199 6383,199,638 204204 обратноеthe opposite CDS репрессора LexA LexA repressor CDS 1 850 4571 850 457 1 851 0651 851 065 609609 прямоеdirect CDS hisS CDS hisS <3999979<3999979 4 001 2234 001 223 >1245>1245 прямоеdirect

[00292] Таблица 3В[00292] Table 3B

НаименованиеName Абсолютная достоверность дифференциальной экспрессииAbsolute confidence in differential expression Отношение дифференциальной экспрессииDifferential expression ratio RNASeq_nifL - необработанное число чтенийRNASeq_nifL - raw read count RNASeq_nifL - необработанное число транскриптовRNASeq_nifL - raw number of transcripts RNASeq_WT - необработанное число чтенийRNASeq_WT - raw read count RNASeq_WT - необработанное число трансриптовRNASeq_WT - raw number of transcripts CDS муреин-липопротеинаMurein lipoprotein CDS 10001000 -1,8-1.8 12950,512950.5 10078,910078.9 5151,55151.5 4106,84106.8 CDS мембранного белка membrane protein CDS 10001000 -1,3-1.3 9522,59522.5 5371,35371.3 54005400 31203120 CDS цинк/кадмий-связывающего белкаCDS of zinc/cadmium binding protein 3,33.3 1,11.1 64616461 1839,11839.1 53185318 1550,61550.6 CDS ацильного белка-носителя CDS of acyl carrier protein 25,625.6 1,61.6 1230,51230.5 957,6957.6 1473,51473.5 1174,71174.7 CDS ompX CDS ompX 1,71.7 1,11.1 20422042 734,2734.2 1687,51687.5 621,5621.5 CDS ДНК-связывающего белка HU-бета CDS of DNA binding protein HU-beta 6,96.9 -1,3-1.3 13051305 881,7881.7 725725 501,8501.8 CDS sspACDS sspA 0,20.2 11 654654 188,8188.8 504,5504.5 149,2149.2 CDS tatECDS tatE 1,41.4 1,31.3 131131 118,4118.4 125125 115,8115.8 CDS репрессора LexA LexA repressor CDS 0,10.1 -1,1-1.1 248248 75,175.1 164164 50,950.9 CDS hisS CDS hisS 00 -1,1-1.1 467467 69,269.2 325325 49,349.3

Пример 8. Делеция glgA повышает экскрецию азотаExample 8: Deletion of glgA increases nitrogen excretion

[00293] Синтез гликогена перенаправляет углерод от гликолиза и цикла TCA. Снижение или ликвидация синтеза гликогена может привести к увеличению потока углерода в направлении гликолиза и цикла TCA, что приводит к большей доступности АТФ в клетке. Это может привести к повышению нитрогеназной активности, так как в азотфиксации требуется 16 АТФ для восстановления одной молекулы N2, и она может быть ограничена доступностью АТФ. Гликогенсинтаза кодируется геном glgA. Подавление или делеция glgA может привести к повышению азотфиксирующей активности. [00293] Glycogen synthesis redirects carbon away from glycolysis and the TCA cycle. Decreased or eliminated glycogen synthesis can result in increased carbon flux toward glycolysis and the TCA cycle, resulting in greater ATP availability in the cell. This may lead to increased nitrogenase activity since nitrogen fixation requires 16 ATP to reduce one molecule of N2 and may be limited by ATP availability. Glycogen synthase is encoded by the glgA gene. Suppression or deletion of glgA may result in increased nitrogen-fixing activity.

[00294] Для этого были сконструированы штаммы Kosakonia sacchari CI006 и Klebsiella variicola, в которых glgA был подвергнут делеции. Штаммы 6-1694, 6-1744 и 137-1893 подвергали анализу экскреции аммония (AMM), в котором измеряли экскрецию аммиака с течением времени в условиях азотфиксации путем культивирования клеток в среде, не содержащей азот, осаждения клеток центрифугированием и измерения свободного аммония в бесклеточном бульоне; более высокие уровни экскреции аммония свидетельствуют о более высокой фиксации и экскреции азота. Штаммы 6-1681 и 137-1893 подвергали анализу ARA, как описано ранее, в среде с добавкой 5 мМ фосфата аммония. Штамм 6-1694 соответствует родительскому штамму 6-342. Штамм 6-1744 соответствует родительскому штамму 6-923. Штамм 6-1681 соответствует родительскому штамму 6-346. Штамм 137-1893 соответствует родительскому штамму 137-1586. [00294] To this end, Kosakonia sacchari CI006 and Klebsiella variicola strains were constructed in which glgA was deleted. Strains 6-1694, 6-1744, and 137-1893 were subjected to an ammonium excretion assay (AMM), which measures ammonia excretion over time under nitrogen-fixation conditions by culturing cells in nitrogen-free media, pelleting the cells by centrifugation, and measuring free ammonium in cell-free media. broth; higher levels of ammonium excretion indicate higher nitrogen fixation and excretion. Strains 6-1681 and 137-1893 were subjected to the ARA assay as previously described in medium supplemented with 5 mM ammonium phosphate. Strain 6-1694 corresponds to the parent strain 6-342. Strain 6-1744 corresponds to the parent strain 6-923. Strain 6-1681 corresponds to the parent strain 6-346. Strain 137-1893 corresponds to the parent strain 137-1586.

[00295] Данные анализа AMM показаны на фигурах 19А-20В. Штаммы 6-1694 и 6-1744 демонстрируют повышенную способность экскреции азота по сравнению с их родительскими штаммами (фигура 19А). Штамм 6-1681 показал повышенную активность в ARA по сравнению с его родительским штаммом (фигура 19B). Штамм 137-1893 показал как повышенную экскрецию аммония (фигура 20А), так и повышенную нитрогеназную активность по результатам ARA (фигура 20В). Таким образом, уменьшая или исключая синтез гликогена у бактерий, можно увеличить количество экскретируемого азота. Подробные сведения о штаммах, описанных в настоящем документе, содержатся в таблицах 8 и 9.[00295] AMM analysis data is shown in Figures 19A-20B. Strains 6-1694 and 6-1744 exhibit increased nitrogen excretion capacity compared to their parent strains (Figure 19A). Strain 6-1681 showed increased activity in ARA compared to its parent strain (Figure 19B). Strain 137-1893 showed both increased ammonium excretion (Figure 20A) and increased nitrogenase activity by ARA (Figure 20B). Thus, by reducing or eliminating glycogen synthesis in bacteria, the amount of nitrogen excreted can be increased. Details of the strains described herein are contained in Tables 8 and 9.

Пример 9. Мутации glnD повышают экскрецию азота Example 9: glnD Mutations Increase Nitrogen Excretion

[00296] GlnD является бифункциональным уридилилтрансфераза/уридилил-удаляющим ферментом, который служит центральным «переключателем» для восприятия азота в клетке. Он содержит три отдельных домена: домен UTase, который уридилирует белки PII GlnB и GlnK; уридилил-удаляющий домен (UR), также известный как домен HD, который удаляет уридильную группу из белков PII; и два домена ACT, которые регулируют активность двух других доменов в ответ на связывание глутамина (фигура 21). При избытке азота глутамин связывает домен ACT, а UR-домен активируется; при азотном голодании ACT не связан, а домен UTase активен. Последующая передача сигналов белком PII влияет на транскрипцию нескольких кластеров генов, включая гены нитрогеназы и ассимиляции азота.[00296] GlnD is a bifunctional uridylyl transferase/uridylyl scavenging enzyme that serves as a central "switch" for nitrogen sensing in the cell. It contains three distinct domains: a UTase domain that uridylates the PII proteins GlnB and GlnK; uridylyl-removing domain (UR), also known as the HD domain, which removes the uridylyl group from PII proteins; and two ACT domains that regulate the activity of two other domains in response to glutamine binding (Figure 21). When there is excess nitrogen, glutamine binds the ACT domain and the UR domain is activated; during nitrogen starvation, ACT is not bound and the UTase domain is active. Subsequent PII protein signaling influences the transcription of several gene clusters, including nitrogenase and nitrogen assimilation genes.

[00297] Были выполнены различные усечения и делеции, чтобы увидеть, как они влияют на фиксацию и экскрецию азота. Несколько мутаций glnD, модифицирующих домены UTase, UR и ACT1/2 (восприимчивые к глутамину), привели к повышению активности согласно результатам анализов ARA и экскреции аммония. На фигуре 22 продемонстрировано несколько модификаций glnD, приводящих к повышению экскреции аммония у K. variicola CI137; на фигуре 23 продемонстрировано несколько модификаций glnD, приводящих к повышению экскреции аммония у K. sacchari.[00297] Various truncations and deletions were performed to see how they affected nitrogen fixation and excretion. Several glnD mutations modifying the UTase, UR, and ACT1/2 (glutamine-responsive) domains resulted in increased activity in ARA and ammonium excretion assays. Figure 22 demonstrates several glnD modifications resulting in increased ammonium excretion in K. variicola CI137; Figure 23 demonstrates several glnD modifications leading to increased ammonium excretion in K. sacchari.

Пример 10. Делеция glnK повышает экскрецию азотаExample 10: Deletion of glnK increases nitrogen excretion

[00298] GlnK является белком PII, который может выступать в качестве посттрансляционного регулятора и может участвовать в синтезе глутамина, что может представлять собой конкурирующий путь экскреции аммония. Более высокие уровни GlnK могут снизить количество экскретируемого NH4. Удаление glnK может снизить или устранить ингибирующее действие на экскрецию NH4. [00298] GlnK is a PII protein that may act as a post-translational regulator and may be involved in glutamine synthesis, which may represent a competing pathway for ammonium excretion. Higher levels of GlnK may reduce the amount of NH4 excreted. Removal of glnK may reduce or eliminate the inhibitory effect on NH4 excretion.

[00299] GlnK был подвергнут делеции в штамме, который уже содержал делецию nifL::1.2 и делецию glnE. Таким образом, делеция glnK была введена в штамм, который уже обладал повышенной способностью фиксировать азот. Штамм с делецией glnK обозначен как 137-2225, а родительский штамм обозначен как 137-2084 на фигуре 24А. На этих клетках был проведен анализ AMM, в котором было измерено количество NH4+, экскретируемого на оптическую плотность в час (в мМ). В этом анализе большая экскреция NH4+ может свидетельствовать о более высокой азотфиксирующей активности. В частности, штамм 137-2225 проявлял азотфиксирующую активность, которая была в 1,32 раза выше, чем у родительского штамма, согласно результатам анализа AMM. [00299] GlnK was deleted in a strain that already contained a nifL::1.2 deletion and a glnE deletion. Thus, the glnK deletion was introduced into a strain that already had an increased ability to fix nitrogen. The glnK deletion strain is designated 137-2225 and the parent strain is designated 137-2084 in Figure 24A. An AMM assay was performed on these cells, in which the amount of NH4+ excreted per OD per hour (in mM) was measured. In this assay, greater NH4+ excretion may indicate higher nitrogen-fixing activity. Specifically, strain 137-2225 exhibited nitrogen-fixing activity that was 1.32-fold higher than that of the parent strain, as determined by AMM assay.

Пример 11. Подавление гена glnA повышает экскрецию аммонияExample 11: Suppression of the glnA gene increases ammonium excretion

[00300] Глутаминсинтетаза (GS) кодируется геном glnA. Снижение активности GS может приводить к снижению степени ассимиляции азота. В условиях азотфиксации это может привести к накоплению внутриклеточного аммония и экскреции аммония. [00300] Glutamine synthetase (GS) is encoded by the glnA gene. A decrease in GS activity may lead to a decrease in the degree of nitrogen assimilation. Under conditions of nitrogen fixation, this can lead to intracellular ammonium accumulation and ammonium excretion.

[00301] Было сконструировано несколько штаммов, в которых нативный промотор для glnA был заменен промотором, о котором известно, что он конститутивно экспрессируется на низком уровне: промотором из генов glnB, glnD либо glnE. Ожидается, что это приведет к снижению транскрипции glnA. В некоторых случаях старт-кодон ATG гена glnA был также мутирован в GTG, чтобы снизить степень инициации трансляции белка GS. На фигуре 24B, фигуре 25 и фигуре 26 описано несколько мутантов CI137 и CI006, у которых подавление гена glnA привело к повышению экскреции аммония.[00301] Several strains have been constructed in which the native promoter for glnA has been replaced with a promoter known to be constitutively expressed at low levels: a promoter from the glnB, glnD, or glnE genes. This is expected to result in decreased glnA transcription. In some cases, the ATG start codon of the glnA gene has also been mutated to GTG to reduce the extent of translation initiation of the GS protein. Figure 24B, Figure 25 and Figure 26 describe several mutants CI137 and CI006 in which suppression of the glnA gene resulted in increased ammonium excretion.

Пример 12. Подавление глутаматсинтазы приводит к повышению экскреции аммонияExample 12: Inhibition of glutamate synthase results in increased ammonium excretion

[00302] Глутамат служит основным источником азота в клетке, а путь GS-GOGAT является основным путем ассимиляции азота. Оперон gltBD кодирует GOGAT. Был сконструирован штамм (137-2215), в котором нативный промотор для оперона gltBD был подвергнут делеции и заменен сильным конститутивным промотором. На фигуре 27 продемонстрировано, как 137-2215 проявляет повышенную экскрецию аммония по сравнению с родительским контролем; на фигуре 28 продемонстрировано, что 137-2215 проявили повышенную азотфиксирующую активность согласно результатам анализа ARA.[00302] Glutamate serves as the main source of nitrogen in the cell, and the GS-GOGAT pathway is the main pathway for nitrogen assimilation. The gltBD operon encodes GOGAT. A strain (137-2215) was constructed in which the native promoter for the gltBD operon was deleted and replaced with a strong constitutive promoter. Figure 27 demonstrates how 137-2215 exhibits increased ammonium excretion compared to parental control; Figure 28 demonstrates that 137-2215 exhibited increased nitrogen-fixing activity according to the ARA assay.

Пример 13. Активация гена глутаминазы glsA2 приводит к повышению экскреции аммонияExample 13. Activation of the glutaminase gene glsA2 leads to increased excretion of ammonium

[00303] Ферменты глутаминазы расщепляют связь C-N в глутамине, высвобождая аммоний и глутамат. Повышение глутаминазной активности в клетке может привести к повышению высвобождения аммония из глутамина и экскреции аммония. Ген glsA2 кодирует глутаминазу. Были сконструированы штаммы, в которых нативный промотор гена glsA2 был подвергнут делеции и заменен последовательностью сильного промотора. На фигуре 29 и фигуре 30 продемонстрирована повышенная экскреция аммония этими штаммами по сравнению с контрольными родительскими штаммами. [00303] Glutaminase enzymes cleave the C-N bond in glutamine, releasing ammonium and glutamate. Increased glutaminase activity in the cell can lead to increased release of ammonium from glutamine and excretion of ammonium. The glsA2 gene encodes glutaminase. Strains were constructed in which the native promoter of the glsA2 gene was deleted and replaced with a strong promoter sequence. Figure 29 and Figure 30 demonstrate increased ammonium excretion by these strains compared to control parental strains.

Пример 14. Активация глутаминазного домена asnB приводит к повышению экскреции аммонияExample 14 Activation of the glutaminase domain of asnB leads to increased ammonium excretion

[00304] Ген asnB кодирует фермент трансаминазу, который имеет два домена: домен глутаминазы и домен аспарагинсинтазы. На фигуре 31 показано, как делеция домена аспарагинсинтазы или активация гена asnB могут привести к повышению экскреции аммония.[00304] The asnB gene encodes a transaminase enzyme that has two domains: a glutaminase domain and an asparagine synthase domain. Figure 31 shows how deletion of the asparagine synthase domain or activation of the asnB gene can lead to increased ammonium excretion.

Пример 15. Активация rpoN повышает азотфиксациюExample 15: Activation of rpoN increases nitrogen fixation

[00305] rpoN (сигма-54) представляет собой фактор инициации, используемый для стимулирования прикрепления РНК-полимеразы к определенным сайтам инициации. Наряду с nifA и ihfA/B он транскрибирует nifH. Активация rpoN может привести к повышению уровней nifH, что может привести к повышению азотфиксации. [00305] rpoN (sigma-54) is an initiation factor used to promote the attachment of RNA polymerase to specific initiation sites. Along with nifA and ihfA/B, it transcribes nifH. Activation of rpoN may lead to increased levels of nifH, which may lead to increased nitrogen fixation.

[00306] Были сконструированы два штамма K. variicola CI137, в которых rpoN был активирован путем делеции его нативного промотора и замены сильным конститутивным промотором. Данные показаны на фигуре 32 и фигуре 33. Штаммы с модификацией rpoN обозначены как 137-2251 и 137-2285, а родительский штамм обозначен как 137-2084. [00306] Two strains of K. variicola CI137 were constructed in which rpoN was activated by deleting its native promoter and replacing it with a strong constitutive promoter. The data are shown in Figure 32 and Figure 33. The rpoN modified strains are designated 137-2251 and 137-2285, and the parent strain is designated 137-2084.

[00307] На фигуре 32 данные представлены в виде десятичного логарифма количества этилена, образовавшегося на колониеобразующую единицу в час, так что более высокое количество образовавшегося этилена свидетельствует о большей азотфиксации. Анализ проводили с 5 мМ фосфата аммония, предоставляемого в качестве источника азота. Штамм 137-2251 фиксировал азот в 1,23 раза лучше, чем родительский штамм (р=0,028), тогда как штамм 137-2285 фиксировал азот в 1,95 раз лучше, чем родительский штамм (р=0,031). [00307] In Figure 32, the data is plotted as the decimal logarithm of the amount of ethylene produced per colony forming unit per hour, such that a higher amount of ethylene produced indicates greater nitrogen fixation. The assay was performed with 5 mM ammonium phosphate provided as a nitrogen source. Strain 137-2251 fixed nitrogen 1.23 times better than the parent strain (p=0.028), while strain 137-2285 fixed nitrogen 1.95 times better than the parent strain (p=0.031).

[00308] Эти результаты позволяют предположить, что азотфиксация может быть усилена путем увеличения количества полимеразы, ответственной за транскрипцию РНК, кодирующей фермент nifH.[00308] These results suggest that nitrogen fixation can be enhanced by increasing the amount of the polymerase responsible for transcription of the RNA encoding the nifH enzyme.

[00309] [00309]

Пример 16. Активация otsB приводит к повышению азотфиксирующей активностиExample 16: Activation of otsB leads to increased nitrogen-fixing activity

[00310] otsB участвует в биосинтезе трегалозы в клетке, и модификации otsB могут улучшать устойчивость штамма. В данном примере были созданы и протестированы модификации otsB, чтобы определить, оказывали ли эти модификации отрицательное влияние на азотфиксацию в клетках. [00310] otsB is involved in trehalose biosynthesis in the cell, and modifications to otsB can improve strain stability. In this example, modifications to otsB were created and tested to determine whether these modifications had a negative effect on nitrogen fixation in cells.

[00311] Три штамма азотфиксирующих бактерий были модифицированы для повышения экспрессии гена otsB. Нативный промотор гена otsB был подвергнут делеции и заменен сильным конститутивным промотором. Модифицированные штаммы представляли собой 6-921 и 6-922 (родительский штамм 6-435) и 6-1697 (родительский штамм 6-923). Анализ ARA проводили на модифицированных штаммах 6-921 и 6-922 (фигура 34). Данные представлены в виде десятичного логарифма количества этилена, образовавшегося на колониеобразующую единицу в час, так что более высокое количество образовавшегося этилена свидетельствует о большей азотфиксации. Анализ проводили с 5 мМ фосфата аммония, предоставляемого в качестве источника азота. CI006 использовали в качестве отрицательного контроля. Неожиданно, азотфиксирующая активность модифицированного штамма была повышена по сравнению с родительским. [00311] Three strains of nitrogen-fixing bacteria have been modified to increase expression of the otsB gene. The native promoter of the otsB gene was deleted and replaced by a strong constitutive promoter. The modified strains were 6-921 and 6-922 (parent strain 6-435) and 6-1697 (parent strain 6-923). The ARA assay was performed on modified strains 6-921 and 6-922 (Figure 34). Data are presented as the decimal logarithm of the amount of ethylene formed per colony-forming unit per hour, so that higher amounts of ethylene formed indicate greater nitrogen fixation. The assay was performed with 5 mM ammonium phosphate provided as a nitrogen source. CI006 was used as a negative control. Unexpectedly, the nitrogen-fixing activity of the modified strain was increased compared to the parent strain.

[00312] Анализ экскреции аммония проводили на штамме 6-1697. Данные представлены в виде количества экскретированного NH4+ (мМ/оптическую плотность) в час, так что более высокое значение свидетельствует о большей экскреции азота. Данные относятся к экспериментам, проведенным в разные дни. Данные показаны на фигуре 35. Активность экскреции азота была выше по сравнению с родительской. Неожиданно, активность экскреции аммония модифицированного штамма была повышена по сравнению с родительским.[00312] Ammonium excretion assay was performed on strain 6-1697. Data are presented as NH4+ excreted (mM/OD) per hour, such that a higher value indicates greater nitrogen excretion. Data refer to experiments performed on different days. The data is shown in Figure 35. The nitrogen excretion activity was higher compared to the parent. Surprisingly, the ammonium excretion activity of the modified strain was increased compared to the parent strain.

Пример 17. phoB может быть модифицирован для увеличения колонизации ризосферыExample 17: phoB can be modified to increase rhizosphere colonization

[00313] Колонизация некоторых штаммов может быть связана с образованием биопленки, на которое может влиять фосфорная сигнализация, на которую в некоторых случаях может влиять изменение экспрессии генов, ответственных за фосфорную сигнализацию, таких как phoB. Таким образом, изменения в phoB могут повлиять на колонизацию некоторых штаммов бактерий. [00313] Colonization of some strains may be associated with biofilm formation, which may be influenced by phosphorus signaling, which in some cases may be influenced by changes in the expression of genes responsible for phosphorus signaling, such as phoB. Thus, changes in phoB may affect the colonization of some bacterial strains.

[00314] Модификация phoB (штамм 137-1901) была создана в бактериальном штамме с высокой экскрецией азота согласно результатам анализа AMM. Родительский штамм был обозначен как 137-1586. [00314] A modification of phoB (strain 137-1901) was created in a bacterial strain with high nitrogen excretion according to the results of the AMM analysis. The parent strain was designated 137-1586.

[00315] На клетках проводили анализ AMM, чтобы определить, оказывали ли модификации отрицательное влияние на активность экскреции азота клетками. Модификации не снижали активность экскреции азота клетками (фигура 36А). Таким образом, phoB может быть модифицирован без снижения экскреции азота.[00315] An AMM assay was performed on the cells to determine whether the modifications had a negative effect on the nitrogen excretion activity of the cells. The modifications did not reduce cellular nitrogen excretion activity (Figure 36A). Thus, phoB can be modified without reducing nitrogen excretion.

[00316] Был проведен анализ колонизации корней кукурузы, чтобы определить, влияли ли модификации на способность штамма колонизировать корни растений. Вкратце, растения после проращивания инокулировали приблизительно 109 клеток и давали им расти в течение 4 недель, после чего их собирали. Образцы объединенного зародышевого корня и первого узла были взяты примерно на 1-2 дюйма ниже кроны растения. После сбора образцы лизировали и проводили кПЦР для определения количества клеток, присутствующих на грамм ткани корня (КОЕ/г сырой массы). Штамм 137-1901 показал повышенную колонизацию по сравнению с родительским штаммом 137-1586, как можно видеть на фигуре 36B. Таким образом, модификации phoB могут повышать колонизацию клеток, поскольку колонизация корня мутантным штаммом в этом случае была выше, чем у родительского штамма. [00316] A corn root colonization assay was conducted to determine whether modifications affected the strain's ability to colonize plant roots. Briefly, germinated plants were inoculated with approximately 109 cells and allowed to grow for 4 weeks before being harvested. The combined embryonic root and first node were sampled approximately 1 to 2 inches below the plant canopy. After collection, samples were lysed and qPCR was performed to determine the number of cells present per gram of root tissue (CFU/g fresh weight). Strain 137-1901 showed increased colonization compared to parental strain 137-1586, as can be seen in Figure 36B. Thus, phoB modifications may increase cell colonization, since root colonization by the mutant strain was higher in this case than that of the parental strain.

Пример 18. yjbE2 может быть модифицирован для увеличения колонизации ризосферыExample 18: yjbE2 can be modified to increase rhizosphere colonization

[00317] Гены yjbE могут стимулировать секрецию экзополисахаридов, что может усиливать прикрепление к корням определенных штаммов. [00317] The yjbE genes can stimulate the secretion of exopolysaccharides, which may enhance root attachment of certain strains.

[00318] Был проведен анализ колонизации корней кукурузы, чтобы определить, влияли ли модификации yjbE на способность штамма колонизировать корни растений. Вкратце, растения после проращивания инокулировали приблизительно 10⁹ клеток и давали им расти в течение 4 недель, после чего их собирали. Образцы объединенного зародышевого корня и первого узла были взяты примерно на 1-2 дюйма ниже кроны растения. После сбора образцы лизировали и проводили кПЦР для определения количества клеток, присутствующих на грамм ткани корня (КОЕ/г сырой массы). Штамм 6-1779 показал повышенную колонизацию по сравнению с родительским штаммом 6-848, как можно видеть на фигуре 37.[00318] A maize root colonization assay was performed to determine whether modifications to yjbE affected the strain's ability to colonize plant roots. Briefly, germinated plants were inoculated with approximately 10 ⁹ cells and allowed to grow for 4 weeks before being harvested. The combined embryonic root and first node were sampled approximately 1 to 2 inches below the plant canopy. After collection, samples were lysed and qPCR was performed to determine the number of cells present per gram of root tissue (CFU/g fresh weight). Strain 6-1779 showed increased colonization compared to parental strain 6-848, as can be seen in Figure 37.

Пример 19. otsB Example 19. otsB

otsB участвует в биосинтезе трегалозы в клетке, и модификации otsB могут улучшать устойчивость штамма. В данном примере были созданы и протестированы модификации otsB, чтобы определить, оказывали ли эти модификации отрицательное влияние на азотфиксацию в клетках. otsB is involved in trehalose biosynthesis in the cell, and modifications to otsB can improve strain stability. In this example, modifications to otsB were created and tested to determine whether these modifications had a negative effect on nitrogen fixation in cells.

[00319] Штамм азотфиксирующих бактерий был модифицирован для повышения экспрессии гена otsB. На модифицированных клетках проводили анализ ARA. Данные представлены в виде десятичного логарифма количества этилена, образовавшегося на колониеобразующую единицу в час, так что более высокое количество образовавшегося этилена свидетельствует о большей азотфиксации. Анализ проводили с 0 мМ (верхняя секция) или 5 мМ (нижняя секция) фосфата аммония, предоставляемого в качестве источника азота. Модифицированные штаммы 6-1697 и 6-1698 (родительский штамм 6-923). CI006 использовали в качестве отрицательного контроля. Данные показаны на фигуре 38A. Азотфиксирующая активность модифицированного штамма была повышена по сравнению с родительским. Таким образом, модификации otsB могут быть выполнены без отрицательного воздействия на азотфиксирующую активность клеток. [00319] A strain of nitrogen-fixing bacteria has been modified to increase expression of the otsB gene. ARA assay was performed on modified cells. Data are presented as the decimal logarithm of the amount of ethylene formed per colony-forming unit per hour, so that higher amounts of ethylene formed indicate greater nitrogen fixation. The assay was performed with 0 mM (top section) or 5 mM (bottom section) ammonium phosphate provided as a nitrogen source. Modified strains 6-1697 and 6-1698 (parental strain 6-923). CI006 was used as a negative control. The data is shown in Figure 38A. The nitrogen-fixing activity of the modified strain was increased compared to the parent strain. Thus, modifications to otsB can be made without negatively affecting the nitrogen-fixing activity of cells.

[00320] На модифицированных клетках проводили анализ экскреции аммония. Данные представлены в виде количества экскретированного NH4+ (мМ/оптическую плотность) в час, так что более высокое значение свидетельствует о большей экскреции азота. Данные относятся к экспериментам, проведенным в разные дни. Данные показаны на фигуре 38B. Активность экскреции азота была выше по сравнению с родительской. Таким образом, модификации otsB могут быть выполнены без отрицательного воздействия на азотфиксирующую активность клеток. [00320] An ammonium excretion assay was performed on the modified cells. Data are presented as NH4+ excreted (mM/OD) per hour, such that a higher value indicates greater nitrogen excretion. Data refer to experiments performed on different days. The data is shown in Figure 38B. The activity of nitrogen excretion was higher compared to the parent. Thus, modifications to otsB can be made without negatively affecting the nitrogen-fixing activity of cells.

Пример 20. Мутация cysZ повышает азотфиксациюExample 20. CysZ mutation increases nitrogen fixation

[00321] CysZ опосредует поглощение сульфатов, обеспечивая серу, которая затем используется для синтеза серосодержащих соединений в бактериальных клетках, включая кофакторы, необходимые для нитрогеназной активности. Повышение экспрессии гена транспорта серы, такого как cysZ, может увеличить количество функциональных комплексов нитрогеназы. Для этого были созданы два штамма Kosakonia sacchari с модификациями cysZ, которые обозначены как 6-1691 и 6-916. Были проведены анализы восстановления ацетилена (ARA), и данные были сравнены с родительским штаммом без мутаций в cysZ (штаммы 6-346 и 6-435 были родителями для 6-1691 и 6-916, соответственно). Штамм CI006 использовали в качестве отрицательного контроля, и анализы ARA были проведены одинаковым образом для обоих штаммов, за исключением того, что 6-1691 и его родитель были проанализированы в 5 мМ фосфата аммония (фигура 39А), в то время как 6-916 и его родитель были проанализированы в 5 мМ глутамина (фигура 39B). Оба штамма проявляют повышенную нитрогеназную активность по сравнению со штаммом дикого типа и родительскими штаммами. Увеличение, продемонстрированное 6-1691, было приблизительно 14-кратным, в то время как штамм 6-916 имел азотфиксирующую активность приблизительно в 6 раз выше, чем у его родителя. [00321] CysZ mediates sulfate uptake, providing sulfur, which is then used to synthesize sulfur-containing compounds in bacterial cells, including cofactors required for nitrogenase activity. Increasing the expression of a sulfur transport gene such as cysZ may increase the number of functional nitrogenase complexes. For this purpose, two Kosakonia sacchari strains with cysZ modifications were created, designated 6-1691 and 6-916. Acetylene reduction assays (ARAs) were performed and data were compared to a parental strain without mutations in cysZ (strains 6-346 and 6-435 were the parents of 6-1691 and 6-916, respectively). Strain CI006 was used as a negative control, and ARA assays were performed in the same manner for both strains, except that 6-1691 and its parent were assayed in 5 mM ammonium phosphate (Figure 39A), while 6-916 and its parent was analyzed in 5 mM glutamine (Figure 39B). Both strains exhibit increased nitrogenase activity compared to the wild type and parental strains. The increase demonstrated by 6-1691 was approximately 14-fold, while strain 6-916 had a nitrogen-fixing activity approximately 6-fold higher than its parent.

Пример 21. Образование биопленкиExample 21 Biofilm Formation

[00322] Образование биопленки может влиять на количество азота, предоставляемого связанному растению. Увеличение образования биопленки на корне растения может увеличить количество азота, предоставляемого растению. [00322] Biofilm formation can influence the amount of nitrogen provided to the associated plant. Increasing biofilm formation on the plant root can increase the amount of nitrogen provided to the plant.

[00323] Некоторые гены могут регулировать образование биопленки. Например, smZ может выступать отрицательным регулятором регуляции биопленки. Мутация smZ, приводящая к уменьшению или устранению функции smZ, может увеличить образование биопленки в бактериях. Может быть осуществлен мутагенез для мутации smZ в штаммах с повышенной активностью экскреции и фиксации азота для создания библиотеки бактерий, мутантных по smZ. [00323] Certain genes may regulate biofilm formation. For example, smZ may act as a negative regulator of biofilm regulation. An smZ mutation that results in a reduction or elimination of smZ function can increase biofilm formation in bacteria. Mutagenesis can be performed to mutate smZ in strains with increased nitrogen excretion and nitrogen fixation activities to create a library of smZ mutant bacteria.

[00324] Некоторые белки могут способствовать образованию биопленки. Например, большие адгезивные белки, включая lapA, могут способствовать образованию биопленки. Один или более промоторов, регулирующих экспрессию lapA, могут быть активированы, так что вырабатывается больше lapA, согласно результатам вестерн-блоттинга. [00324] Certain proteins may promote biofilm formation. For example, large adhesion proteins, including lapA, may contribute to biofilm formation. One or more of the promoters that regulate lapA expression may be activated so that more lapA is produced, as determined by Western blot analysis.

[00325] Могут быть генерированы штаммы с мутациями smZ и активацией lapA для создания библиотеки штаммов smZ/lapA для тестирования. Штаммы smZ/LapA могут характеризоваться повышенным образованием биопленки и могут обладать способностью образования биопленки, превышающей штаммы только с мутацией smZ или мутацией lapA. [00325] Strains with smZ mutations and lapA activation can be generated to create a library of smZ/lapA strains for testing. smZ/LapA strains may be characterized by increased biofilm formation and may have biofilm formation capabilities greater than strains with only the smZ mutation or the lapA mutation.

[00326] Штаммы могут быть выращены в лизогенном буфере (LB) и инокулированы в почву с проростком. Проросток, почва и бактериальный штамм могут находиться в горшке, в поле, в помещении или на улице. Проросток может быть посажен весной, летом, осенью или зимой. Воздух может иметь влажность приблизительно 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Погода может быть дождливой, туманной, облачной или солнечной. Температура может составлять приблизительно 4°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C или 45°C. Проросток может быть посажен на рассвете, утром, в полдень, во второй половине дня, в сумерках, вечером или ночью. Проросток может выращиваться в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 или 30 дней. По прошествии времени можно выкопать растение и измерить количество биопленки на корнях. [00326] Strains can be grown in lysogeny buffer (LB) and inoculated into soil with the seedling. The seedling, soil, and bacterial strain may be in a pot, in a field, indoors, or outdoors. The seedling can be planted in spring, summer, autumn or winter. The air may have a humidity of approximately 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100%. The weather may be rainy, foggy, cloudy or sunny. The temperature may be approximately 4°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C or 45°C. The seedling can be planted at dawn, morning, noon, afternoon, dusk, evening or night. The seedling can be grown for approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 or 30 days. After time has passed, you can dig up the plant and measure the amount of biofilm on the roots.

Пример 22. Чувствительность к кислородуExample 22: Oxygen Sensitivity

[00327] Чувствительность к кислороду ферментов нитрогеназ может влиять на азотфиксацию, экскрецию азота, или на то и другое. Снижение чувствительности к кислороду фермента нитрогеназы может повысить азотфиксирующую активность, повысить активность экскреции азота, или и то, и другое. Может быть создан штамм бактерий, содержащий один или более ферментов нитрогеназ с пониженным содержанием кислорода, таким образом, чтобы штамм проявлял повышенную азотфиксирующую активность или повышенную активность экскреции азота. [00327] The oxygen sensitivity of nitrogenase enzymes may affect nitrogen fixation, nitrogen excretion, or both. Decreasing the oxygen sensitivity of the nitrogenase enzyme may increase nitrogen-fixing activity, increase nitrogen excretion activity, or both. A bacterial strain can be created containing one or more nitrogenase enzymes with a reduced oxygen content, such that the strain exhibits increased nitrogen-fixing activity or increased nitrogen excretion activity.

[00328] В бактериальных клетках с диким типом или генетически улучшенной азотфиксирующей активностью, азотсодержащей активностью, или обоими, могут быть проведены генетические модификации. Генетические модификации могут быть введены в клетки таким образом, что один или более генов фермента нитрогеназ были мутированы по протоколу мутагенеза, и может быть создана библиотека таких штаммов. [00328] Bacterial cells with wild type or genetically improved nitrogen-fixing activity, nitrogen-containing activity, or both, can be genetically modified. Genetic modifications can be introduced into cells such that one or more nitrogenase enzyme genes are mutated through a mutagenesis protocol, and a library of such strains can be generated.

[00329] Каждый штамм в библиотеке может быть подвергнут анализу чувствительности к кислороду. Для этого могут быть проведены анализы AMM и ARA в условиях с различными концентрациями кислорода. Концентрация кислорода может варьироваться от 1 мкМ до 6 мкМ. Данные могут быть проанализированы, чтобы определить, проявляют ли штаммы пониженную экскрецию азота или азотфиксирующую активность в зависимости от концентрации кислорода. Некоторые штаммы с модифицированными ферментами нитрогеназами могут демонстрировать незначительное снижение или вообще не снижать экскрецию азота или азотфиксирующую активность при увеличении концентрации кислорода. [00329] Each strain in the library can be subjected to an oxygen sensitivity assay. To achieve this, AMM and ARA assays can be performed under conditions with different oxygen concentrations. The oxygen concentration can vary from 1 µM to 6 µM. Data can be analyzed to determine whether strains exhibit reduced nitrogen excretion or nitrogen-fixing activity as a function of oxygen concentration. Some strains with modified nitrogenase enzymes may show little or no reduction in nitrogen excretion or nitrogen-fixing activity when oxygen concentrations increase.

Пример 23. Изменение modA, modB, modEExample 23. Changing modA, modB, modE

[00330] Путь поглощения молибдена может относиться к метаболическому пути у бактерий, который обеспечивает поглощение молибдена в клетку. Молибден может выступать в качестве кофактора при азотфиксации. Увеличение поглощения молибдена клетками может повысить азотфиксацию, экскрецию азота, или и то, и другое. [00330] The molybdenum uptake pathway may refer to a metabolic pathway in bacteria that allows the uptake of molybdenum into the cell. Molybdenum can act as a cofactor in nitrogen fixation. Increasing cellular uptake of molybdenum may increase nitrogen fixation, nitrogen excretion, or both.

[00331] Ключевые ферменты в пути транспорта молибдена могут включать modA, modB и modE. Модификация или активация любого одного, двух или трех из этих генов в бактериальном штамме может увеличить поглощение молибдена в клетках и может повысить азотфиксацию, экскрецию азота, или то, и другое, в клетках. [00331] Key enzymes in the molybdenum transport pathway may include modA, modB and modE. Modification or activation of any one, two, or three of these genes in a bacterial strain can increase molybdenum uptake into cells and can increase nitrogen fixation, nitrogen excretion, or both, in cells.

[00332] В отношении этих генов в бактериальных клетках могут быть выполнены генетические модификации, приводящие к увеличению транспорта молибдена. Чтобы идентифицировать такие модификации, мутагенез может быть проведен внутри и вокруг активных сайтов генов, кодирующих modA, modB или modC. Для каждого гена может быть сконструирована библиотека мутантов. Затем эти библиотеки могут быть подвергнуты скринингу на повышенную активность поглощения молибдена. Эти библиотеки могут быть созданы из клеток дикого типа или из клеток, которые уже были модифицированы для проявления повышенной азотфиксации, повышенной экскреции азота, или и того, и другого. [00332] Genetic modifications can be made to these genes in bacterial cells to increase molybdenum transport. To identify such modifications, mutagenesis can be carried out in and around the active sites of genes encoding modA, modB or modC. For each gene, a library of mutants can be constructed. These libraries can then be screened for increased molybdenum scavenging activity. These libraries can be generated from wild-type cells or from cells that have already been modified to exhibit increased nitrogen fixation, increased nitrogen excretion, or both.

[00333] Генетические модификации могут быть выполнены в этих клетках так, что активируются один или более генов в пути поглощения молибдена. Библиотека вариантов также может быть сконструирована так, что повышается активность промотора для одного или более генов в пути поглощения молибдена. Например, промотор modABC можно генетически настроить для повышения транскрипции. Вестерн-блоттинг может быть использован для определения того, какие штаммы имеют повышенную экспрессию одного или более генов поглощения молибдена, и эти штаммы могут представлять интерес в качестве вариантов. [00333] Genetic modifications can be made in these cells such that one or more genes in the molybdenum uptake pathway are activated. A library of variants can also be constructed to increase promoter activity for one or more genes in the molybdenum uptake pathway. For example, the modABC promoter can be genetically tuned to increase transcription. Western blotting can be used to determine which strains have increased expression of one or more molybdenum uptake genes, and these strains may be of interest as variants.

[00334] Для скрининга на повышенную активность поглощения молибдена каждый представляющий интерес мутант или вариант, а также немутированный родительский штамм для каждого штамма может быть инокулирован и выращен в трех лунках 96-луночного планшета в среде LB. Как только клетки достигают оптической плотности, равной 0,8, может быть собран материал из одной из лунок для каждого мутанта, при этом клетки осаждают центрифугированием, избыток LB смывают и клетки повторно суспендируют, лизируют и готовят для спектроскопии в 96-луночном планшете. Содержание молибдена может быть измерено с помощью спектроскопии для определения исходного содержания молибдена в образцах. В остальные образцы могут быть введены добавки молибдена в виде тетраоксианиона молибдата только в LB или LB, так что добавляемое количество составляет 10% или менее от общего объема в каждой лунке. Конечная концентрация молибдена в каждой лунке в анализе может быть представлять собой одну из 10 пМ, 100 пМ, 1 нМ, 10 нМ или 100 нМ, и может быть проанализировано более одной концентрации. Анализ может проводиться в течение одной или более из 1 секунд, 10 секунд, 30 секунд, 1 минуты, 2 минут, 3 минут, 4 минут, 5 минут, 10 минут, 20 минут, 30 минут и 60 минут. [00334] To screen for increased molybdenum scavenging activity, each mutant or variant of interest, as well as the unmutated parent strain for each strain, can be inoculated and grown in three wells of a 96-well plate in LB medium. Once the cells reach an optical density of 0.8, material from one of the wells for each mutant can be collected, the cells are pelleted by centrifugation, excess LB is washed off, and the cells are resuspended, lysed, and prepared for spectroscopy in a 96-well plate. Molybdenum content can be measured using spectroscopy to determine the original molybdenum content of samples. The remaining samples may be supplemented with molybdenum in the form of molybdate tetraoxyanion in LB or LB only, so that the amount added is 10% or less of the total volume in each well. The final concentration of molybdenum in each well in the assay may be one of 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, or 100 nM, and more than one concentration may be assayed. The assay may be conducted for one or more of 1 second, 10 seconds, 30 seconds, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, and 60 minutes.

[00335] Во-первых, для каждой концентрации может быть построен график зависимости количества молибдена, транспортируемого в каждую клетку, от времени для определения оптимальной продолжительности анализа. Оптимальной продолжительностью может быть временной интервал, в котором установившееся состояние не было достигнуто, а скорость реакции остается линейной. Затем для оптимальной продолжительности может быть построен график зависимости количества молибдена, транспортируемого в каждую клетку, от концентрации, и может быть выполнен анализ Михаэлиса-Ментен. Представляющие интерес мутантные штаммы или варианты, демонстрирующие значительное увеличение (р<0,05) транспорта молибдена по сравнению с немутированным и немодифицированным родительским штаммом, как определено сравнением Km, могут быть выбраны для дальнейших анализов. [00335] First, for each concentration, the amount of molybdenum transported into each cell can be plotted against time to determine the optimal duration of the assay. The optimal duration may be a time interval in which steady state has not been reached and the reaction rate remains linear. The amount of molybdenum transported into each cell can then be plotted against concentration for the optimal duration and a Michaelis-Menten analysis can be performed. Mutant strains of interest or variants showing a significant increase (p<0.05) in molybdenum transport compared to the unmutated and unmodified parental strain, as determined by Km comparison, can be selected for further analyses.

[00336] Затем каждый штамм, выбранный для дальнейших анализов, может быть подвергнут анализу AMM, а также анализу ARA, как описано в настоящем документе, для измерения экскреции и фиксации азота, соответственно. Одна или более из этих мутаций или вариантов могут увеличивать AMM, ARA или оба, одного или более из этих бактериальных штаммов. [00336] Each strain selected for further analyzes can then be subjected to an AMM assay as well as an ARA assay as described herein to measure nitrogen excretion and nitrogen fixation, respectively. One or more of these mutations or variants may increase AMM, ARA, or both, of one or more of these bacterial strains.

Пример 24. Увеличение транспорта железа может повысить азотфиксациюExample 24: Increasing Iron Transport Can Increase Nitrogen Fixation

[00337] Путь поглощения железа может относиться к метаболическому пути у бактерий, который обеспечивает поглощение железа в клетку. Железо может выступать в качестве кофактора для стимуляции азотфиксации. Увеличение поглощения железа клетками может повысить азотфиксацию, экскрецию азота, или и то, и другое. [00337] The iron uptake pathway may refer to a metabolic pathway in bacteria that mediates the uptake of iron into the cell. Iron may act as a cofactor to stimulate nitrogen fixation. Increasing cellular iron uptake may increase nitrogen fixation, nitrogen excretion, or both.

[00338] Ключевые ферменты в пути транспорта железа могут включать exbA, exbB и tonB. Модификация или активация любого одного, двух или трех из этих генов в бактериальном штамме может увеличить поглощение железа в клетках и может повысить азотфиксацию, экскрецию азота, или то, и другое, в клетках. [00338] Key enzymes in the iron transport pathway may include exbA, exbB and tonB. Modification or activation of any one, two or three of these genes in a bacterial strain can increase iron uptake into cells and can increase nitrogen fixation, nitrogen excretion, or both, in cells.

[00339] В отношении этих генов в бактериальных клетках могут быть выполнены генетические модификации, приводящие к увеличению транспорта железа. Чтобы идентифицировать такие модификации, мутагенез может быть проведен внутри и вокруг активных сайтов генов, кодирующих exbA, exbB или tonB. Для каждого гена может быть сконструирована библиотека мутантов. Затем эти библиотеки могут быть подвергнуты скринингу на повышенную активность поглощения железа. Эти библиотеки могут быть созданы из клеток дикого типа или из клеток, которые уже были модифицированы для проявления повышенной азотфиксации, повышенной экскреции азота, или и того, и другого. [00339] Genetic modifications can be made to these genes in bacterial cells to increase iron transport. To identify such modifications, mutagenesis can be performed in and around the active sites of genes encoding exbA, exbB, or tonB. For each gene, a library of mutants can be constructed. These libraries can then be screened for increased iron uptake activity. These libraries can be generated from wild-type cells or from cells that have already been modified to exhibit increased nitrogen fixation, increased nitrogen excretion, or both.

[00340] Генетические модификации могут быть выполнены в этих клетках так, что активируются один или более генов в пути поглощения железа. Библиотека вариантов также может быть сконструирована так, что повышается активность промотора для одного или более генов в пути поглощения железа. Вестерн-блоттинг может быть использован для определения того, какие штаммы имеют повышенную экспрессию одного или более генов поглощения железа, и эти штаммы могут представлять интерес в качестве вариантов. [00340] Genetic modifications can be made in these cells such that one or more genes in the iron uptake pathway are activated. The library of variants can also be constructed to increase promoter activity for one or more genes in the iron uptake pathway. Western blotting can be used to determine which strains have increased expression of one or more iron uptake genes, and these strains may be of interest as variants.

[00341] Для скрининга на повышенную активность поглощения железа каждый представляющий интерес мутант или вариант, а также немутированный родительский штамм для каждого штамма может быть инокулирован и выращен в трех лунках 96-луночного планшета в среде LB. Как только клетки достигают оптической плотности, равной 0,8, может быть собран материал из одной из лунок для каждого мутанта, при этом клетки осаждают центрифугированием, избыток LB смывают и клетки повторно суспендируют, лизируют и готовят для спектроскопии в 96-луночном планшете. Содержание железа может быть измерено с помощью спектроскопии для определения исходного содержания железа в образцах. В остальные образцы могут быть введены добавки железа в виде FeSO₄ только в LB или LB, так что добавляемое количество составляет 10% или менее от общего объема в каждой лунке. Может быть добавлено 0,1 мМ уксусной кислоты (конечная концентрация), чтобы улучшить растворимость железа. Конечная концентрация железа в каждой лунке в анализе может быть представлять собой одну из 10 пМ, 100 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ или 100 мкМ, и может быть проанализировано более одной концентрации. Анализ может проводиться в течение одной или более из 1 секунд, 10 секунд, 30 секунд, 1 минуты, 2 минут, 3 минут, 4 минут, 5 минут, 10 минут, 20 минут, 30 минут и 60 минут. [00341] To screen for increased iron uptake activity, each mutant or variant of interest, as well as the unmutated parent strain for each strain, can be inoculated and grown in three wells of a 96-well plate in LB medium. Once the cells reach an optical density of 0.8, material from one of the wells for each mutant can be collected, the cells are pelleted by centrifugation, excess LB is washed off, and the cells are resuspended, lysed, and prepared for spectroscopy in a 96-well plate. Iron content can be measured using spectroscopy to determine the initial iron content of samples. The remaining samples may be supplemented with iron in the form of FeSO ₄ in LB or LB only, so that the amount added is 10% or less of the total volume in each well. 0.1 mM acetic acid (final concentration) may be added to improve iron solubility. The final concentration of iron in each well in the assay may be one of 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, or 100 μM, and more than one concentration may be assayed. The assay may be conducted for one or more of 1 second, 10 seconds, 30 seconds, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, and 60 minutes.

[00342] Сначала для каждой концентрации может быть построен график зависимости количества железа, транспортируемого в каждую клетку, от времени для определения оптимальной продолжительности анализа. Оптимальной продолжительностью может быть временной интервал, в котором установившееся состояние не было достигнуто, а скорость реакции остается линейной. Затем для оптимальной продолжительности может быть построен график зависимости количества железа, транспортируемого в каждую клетку, от концентрации, и может быть выполнен анализ Михаэлиса-Ментен. Представляющие интерес мутантные штаммы или варианты, демонстрирующие значительное увеличение (р<0,05) транспорта железа по сравнению с немутированным и немодифицированным родительским штаммом, как определено сравнением Km, могут быть выбраны для дальнейших анализов. [00342] First, the amount of iron transported into each cell can be plotted against time for each concentration to determine the optimal duration of the assay. The optimal duration may be a time interval in which steady state has not been reached and the reaction rate remains linear. The amount of iron transported into each cell can then be plotted against concentration for the optimal duration and a Michaelis-Menten analysis can be performed. Mutant strains of interest or variants showing a significant increase (p<0.05) in iron transport compared to the unmutated and unmodified parental strain, as determined by Km comparison, can be selected for further analyses.

[00343] Затем каждый штамм, выбранный для дальнейших анализов, может быть подвергнут анализу AMM, а также анализу ARA, как описано в настоящем документе, для измерения экскреции и фиксации азота, соответственно. Одна или более из этих мутаций или вариантов могут увеличивать AMM, ARA или оба, одного или более из этих бактериальных штаммов. [00343] Each strain selected for further analyzes can then be subjected to an AMM assay as well as an ARA assay as described herein to measure nitrogen excretion and nitrogen fixation, respectively. One or more of these mutations or variants may increase AMM, ARA, or both, of one or more of these bacterial strains.

Пример 25. Увеличение количества генов биосинтеза сидерофоров может повысить азотфиксациюExample 25. Increasing the number of siderophore biosynthetic genes can increase nitrogen fixation

[00344] Сидрофоры yhf, или молекулы, образующие хелаты с железом, могут влиять на поглощение железа бактериями. Повышение продукции сидерофоров yhf может повышать поглощение железа бактериями. Модификации генов сидерофоров, в том числе yhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu и fur, могут повысить продукцию сидерофоров yhf, что, в свою очередь, может повысить поглощение железа клетками. Эти модификации могут привести к повышению фиксации или экскреции азота. [00344] Yhf sidrophores, or iron chelate molecules, can influence iron uptake by bacteria. Increased production of yhf siderophores may enhance iron uptake by bacteria. Modifications of siderophore genes, including yhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu, and fur, can increase the production of siderophores yhf, which in turn can increase cellular iron uptake. These modifications may result in increased nitrogen fixation or excretion.

[00345] В отношении этих генов в бактериальных клетках могут быть выполнены генетические модификации, приводящие к повышению продукции сидерофоров. Чтобы идентифицировать такие модификации, мутагенез может быть проведен внутри и вокруг активных сайтов генов, кодирующих yhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu или fur. Для каждого гена может быть сконструирована библиотека мутантов. Затем эти библиотеки могут быть подвергнуты скринингу на предмет повышения продукции сидерофоров. Эти библиотеки могут быть созданы из клеток дикого типа или из клеток, которые уже были модифицированы для проявления повышенной азотфиксации, повышенной экскреции азота, или и того, и другого. Для скрининга на предмет повышения продукции сидерофоров каждый мутант может быть выращен до оптической плотности, равное 0,8, а затем может быть добавлен избыток, но не токсичное количество предшественников сидерофоров, и осуществлена инкубация в течение 30 минут или 60 минут. Количество сидерофоров, продуцированных после назначенного периода времени, может быть нормировано, и штаммы, демонстрирующие повышенную продукцию сидерофоров, могут быть подвергнуты скринингу на предмет увеличения транспорта железа. [00345] Genetic modifications can be made to these genes in bacterial cells to increase siderophore production. To identify such modifications, mutagenesis can be carried out in and around the active sites of genes encoding yhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu or fur. For each gene, a library of mutants can be constructed. These libraries can then be screened for increased siderophore production. These libraries can be generated from wild-type cells or from cells that have already been modified to exhibit increased nitrogen fixation, increased nitrogen excretion, or both. To screen for increased siderophore production, each mutant can be grown to an optical density of 0.8 and then an excess, but not toxic, amount of siderophore precursors can be added and incubated for 30 minutes or 60 minutes. The amount of siderophores produced after a designated period of time can be normalized, and strains exhibiting increased siderophore production can be screened for increased iron transport.

[00346] Для скрининга на повышенную активность поглощения железа каждый представляющий интерес мутант или вариант, а также немутированный родительский штамм для каждого штамма может быть инокулирован и выращен в трех лунках 96-луночного планшета в среде LB. Как только клетки достигают оптической плотности, равной 0,8, может быть собран материал из одной из лунок для каждого мутанта, при этом клетки осаждают центрифугированием, избыток LB смывают и клетки повторно суспендируют, лизируют и готовят для спектроскопии в 96-луночном планшете. Содержание железа может быть измерено с помощью спектроскопии для определения исходного содержания железа в образцах. В остальные образцы могут быть введены добавки железа в виде FeSO₄ только в LB или LB, так что добавляемое количество составляет 10% или менее от общего объема в каждой лунке. Может быть добавлено 0,1 мМ уксусной кислоты (конечная концентрация), чтобы улучшить растворимость железа. Конечная концентрация железа в каждой лунке в анализе может быть представлять собой одну из 10 пМ, 100 пМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ или 100 мкМ, и может быть проанализировано более одной концентрации. Анализ может проводиться в течение одной или более из 1 секунд, 10 секунд, 30 секунд, 1 минуты, 2 минут, 3 минут, 4 минут, 5 минут, 10 минут, 20 минут, 30 минут и 60 минут. [00346] To screen for increased iron uptake activity, each mutant or variant of interest, as well as the unmutated parent strain for each strain, can be inoculated and grown in three wells of a 96-well plate in LB medium. Once the cells reach an optical density of 0.8, material from one of the wells for each mutant can be collected, the cells are pelleted by centrifugation, excess LB is washed off, and the cells are resuspended, lysed, and prepared for spectroscopy in a 96-well plate. Iron content can be measured using spectroscopy to determine the initial iron content of samples. The remaining samples may be supplemented with iron in the form of FeSO ₄ in LB or LB only, so that the amount added is 10% or less of the total volume in each well. 0.1 mM acetic acid (final concentration) may be added to improve iron solubility. The final concentration of iron in each well in the assay may be one of 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, or 100 μM, and more than one concentration may be assayed. The assay may be conducted for one or more of 1 second, 10 seconds, 30 seconds, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, and 60 minutes.

[00347] Сначала для каждой концентрации может быть построен график зависимости количества железа, транспортируемого в каждую клетку, от времени для определения оптимальной продолжительности анализа. Оптимальной продолжительностью может быть временной интервал, в котором установившееся состояние не было достигнуто, а скорость реакции остается линейной. Затем для оптимальной продолжительности может быть построен график зависимости количества железа, транспортируемого в каждую клетку, от концентрации, и может быть выполнен анализ Михаэлиса-Ментен. Представляющие интерес мутантные штаммы или варианты, демонстрирующие значительное увеличение (р<0,05) транспорта железа по сравнению с немутированным и немодифицированным родительским штаммом, как определено сравнением Km, могут быть выбраны для дальнейших анализов. [00347] First, the amount of iron transported into each cell can be plotted against time for each concentration to determine the optimal duration of the assay. The optimal duration may be a time interval in which steady state has not been reached and the reaction rate remains linear. The amount of iron transported into each cell can then be plotted against concentration for the optimal duration and a Michaelis-Menten analysis can be performed. Mutant strains of interest or variants showing a significant increase (p<0.05) in iron transport compared to the unmutated and unmodified parental strain, as determined by Km comparison, can be selected for further analyses.

[00348] Затем каждый штамм, выбранный для дальнейших анализов, может быть подвергнут анализу AMM, а также анализу ARA, как описано в настоящем документе, для измерения экскреции и фиксации азота, соответственно. Одна или более из этих мутаций или вариантов могут увеличивать AMM, ARA или оба, одного или более из этих бактериальных штаммов. [00348] Each strain selected for further analyzes can then be subjected to an AMM assay as well as an ARA assay as described herein to measure nitrogen excretion and nitrogen fixation, respectively. One or more of these mutations or variants may increase AMM, ARA, or both, of one or more of these bacterial strains.

Пример 26. dctA1 и dctA2Example 26. dctA1 and dctA2

[00349] dctA1 и dctA2 ответственны за аэробный транспорт дикарбоксилатов фумарата, L- и D-малата и, в меньшей степени, сукцината, из периплазмы через внутреннюю мембрану. Модификации этих генов могут влиять на колонизацию микроорганизмов. [00349] dctA1 and dctA2 are responsible for the aerobic transport of the dicarboxylates fumarate, L- and D-malate and, to a lesser extent, succinate, from the periplasm across the inner membrane. Modifications of these genes can influence the colonization of microorganisms.

Модификации в dctA1 (штамм 137-1861) и dctA2 (штамм 137-1905) были созданы в штамме с высокой экскрецией азота согласно результатам анализа AMM. Родительский штамм был обозначен как 137-1905. Modifications in dctA1 (strain 137-1861) and dctA2 (strain 137-1905) were created in a strain with high nitrogen excretion as determined by AMM analysis. The parent strain was designated 137-1905.

[00350] На клетках проводили анализ AMM, чтобы определить, оказывали ли модификации отрицательное влияние на активность экскреции азота клетками. Модификации не снижали активность экскреции азота клетками (фигура 40А). Таким образом, dctA1 и dctA2 могут быть модифицированы без снижения экскреции азота.[00350] An AMM assay was performed on the cells to determine whether the modifications had a negative effect on the nitrogen excretion activity of the cells. The modifications did not reduce cellular nitrogen excretion activity (Figure 40A). Thus, dctA1 and dctA2 can be modified without reducing nitrogen excretion.

[00351] Анализ образования колоний проводили на клетках с использованием кПЦР, чтобы определить, оказывали ли модификации влияние на колониеобразующие свойства клеток. Вкратце, растения после проращивания инокулировали приблизительно 10⁹ клеток и давали им расти в течение 4 недель, после чего их собирали. Образцы объединенного зародышевого корня и первого узла были взяты примерно на 1-2 дюйма ниже кроны растения. После сбора образцы лизировали и проводили кПЦР для определения КОЕ/г сырой массы. Данные показаны на фигуре 40B. Оба штамма показали повышенную колонизацию. Таким образом, модификации dctA1 и dctA2 могут повышать колонизацию в клетках. [00351] Colony formation assays were performed on cells using qPCR to determine whether the modifications had an effect on the colony-forming properties of the cells. Briefly, germinated plants were inoculated with approximately 10 ⁹ cells and allowed to grow for 4 weeks before being harvested. The combined embryonic root and first node were sampled approximately 1 to 2 inches below the plant canopy. After collection, samples were lysed and qPCR was performed to determine CFU/g fresh weight. The data is shown in Figure 40B. Both strains showed increased colonization. Thus, modifications of dctA1 and dctA2 may increase colonization in cells.

Пример 27. Повышение устойчивости к высушиваниюExample 27. Increasing resistance to drying

[00352] Улучшение устойчивости к высушиванию может повысить колонизацию штамма, используемого для покрытия семян, или другого применения в сухом виде для растения или поля. Будет создан генетически сконструированный микроорганизм, содержащий промотор арабинозы, функционально связанный с геном rpoE. Указанный генетически сконструированный микроорганизм и несконструированный родительский контроль будут культивированы в среде с добавкой арабинозы в течение 48 часов, а затем высушены. После высушивания часть каждого из сконструированного и несконструированного штаммов будет регенерирована в среде, не содержащей арабинозы, и будет проанализировано количество микроорганизмов в среде через 24 часа. Среда, содержащая сконструированный штамм, будет содержать больше микроорганизмов, чем среда, содержащий несконструированный родительский штамм.[00352] Improving desiccation tolerance may enhance colonization of a strain used for seed coating or other dry application to a plant or field. A genetically engineered microorganism will be created containing an arabinose promoter functionally linked to the rpoE gene. The specified genetically engineered microorganism and non-engineered parental control will be cultured in arabinose supplemented medium for 48 hours and then dried. After drying, a portion of each of the engineered and unengineered strains will be regenerated in arabinose-free medium, and the number of microorganisms in the medium will be analyzed after 24 hours. A medium containing the engineered strain will contain more microorganisms than a medium containing the non-engineered parent strain.

[00353] Высушенные микроорганизмы будут нанесены на семена кукурузы и посажены в почву, лишенную арабинозы, в теплице в условиях, подходящих для прорастания семян кукурузы. Через 4 недели проростки будут собраны, и будет оценено количество колониеобразующих единиц как сконструированных, так и несконструированных микроорганизмов на корнях растений. Растения, подвергшиеся воздействию сконструированных микроорганизмов, будут связаны с большим количеством микроорганизмов, чем растения, подвергшиеся воздействию несконструированного родительского штамма.[00353] The dried microorganisms will be applied to corn seeds and planted in arabinose-free soil in a greenhouse under conditions suitable for corn seed germination. After 4 weeks, the seedlings will be harvested and the number of colony forming units of both engineered and non-engineered microorganisms on the plant roots will be assessed. Plants exposed to engineered microorganisms will associate with more microorganisms than plants exposed to the nonengineered parent strain.

Пример 28. Изменение RBS nifA повышает транскрипцию nifHExample 28: Alteration of the nifA RBS increases nifH transcription

[00354] Последовательности промотор-RBS, вставленные против хода транскрипции от nifA, приводят к повышению соотношений транскрипции nifH: nifA, что свидетельствует об увеличении количества активного белка NifA из-за повышенной силы вставленного RBS, что приводит к более высокой скорости инициации трансляции NifA.[00354] Promoter-RBS sequences inserted upstream of nifA result in increased nifH:nifA transcription ratios, indicating an increase in the amount of active NifA protein due to the increased strength of the inserted RBS, resulting in a higher rate of NifA translation initiation.

[00355] [00355]

Таблица 8. Штаммы, описанные в настоящем документеTable 8. Strains described herein

РазновидностьVariety Первое упоминаниеFirst mention Текущее наименованиеCurrent name Универсальное наименованиеUniversal name ЛинияLine Описание мутагенной ДНКDescription of mutagenic DNA ГенотипGenotype 11 Текст заявкиApplication text CI006CI006 CI006CI006 Выделенный штамм из рода EnterobacterIsolated strain from the genus Enterobacter ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 22 Текст заявкиApplication text CI008CI008 CI008CI008 Выделенный штамм из рода BurkholderiaIsolated strain from the genus Burkholderia ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 33 Текст заявкиApplication text CI010CI010 CI010CI010 Выделенный штамм из рода Klebsiella Isolated strain from the genus Klebsiella ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 44 Текст заявкиApplication text CI019CI019 CI019CI019 Выделенный штамм из рода Rahnella Isolated strain from the genus Rahnella ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 55 Текст заявкиApplication text CI028CI028 CI028CI028 Выделенный штамм из рода EnterobacterIsolated strain from the genus Enterobacter ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 66 Текст заявкиApplication text CI050CI050 CI050CI050 Выделенный штамм из рода Klebsiella Isolated strain from the genus Klebsiella ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 77 Текст заявкиApplication text CM002CM002 CM002CM002 Мутант CI050Mutant CI050 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид-O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the nifL gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔnifL::KanRΔnifL::KanR 88 Текст заявкиApplication text CM011CM011 CM011CM011 Мутант CI019Mutant CI019 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей ген стрептомицин 3''-O-аденилилтрансферазы aadA.Disruption of the nifL gene by an inserted spectinomycin resistance expression cassette (SpecR), encoding the streptomycin 3''-O-adenylyltransferase gene aadA. ΔnifL::SpecRΔnifL::SpecR 99 Текст заявкиApplication text CM013CM013 CM013CM013 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид-O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the nifL gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔnifL::KanRΔnifL::KanR 1010 Фигура 4AFigure 4A CM004CM004 CM004CM004 Мутант CI010Mutant CI010 Нарушение гена amtB вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the amtB gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔamtB::KanRΔamtB::KanR 11eleven Фигура 4AFigure 4A CM005CM005 CM005CM005 Мутант CI010Mutant CI010 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид-O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the nifL gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔnifL::KanRΔnifL::KanR 1212 Фигура 4BFigure 4B CM015CM015 CM015CM015 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5). ΔnifL::Prm5ΔnifL::Prm5 1313 Фигура 4BFigure 4B CM021CM021 CM021CM021 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от неаннотированного гена и первых 73 п.н. этого гена (Prm2).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the unannotated gene and the first 73 bp. this gene (Prm2). ΔnifL::Prm2ΔnifL::Prm2 1414 Фигура 4BFigure 4B CM023CM023 CM023CM023 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена acpP и первых 121 п.н. гена acpP (Prm4).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the acpP gene and the first 121 bp. acpP gene (Prm4). ΔnifL::Prm4ΔnifL::Prm4 1515 Фигура 10AFigure 10A CM014CM014 CM014CM014 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp и первых 29 п.н. гена lpp (Prm1).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the lpp gene and the first 29 bp. lpp gene (Prm1). ΔnifL::Prm1ΔnifL::Prm1 1616 Фигура 10AFigure 10A CM016CM016 CM016CM016 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lexA 3 и первых 21 п.н. гена lexA 3 (Prm9).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the lexA gene 3 and the first 21 bp. lexA 3 gene (Prm9). ΔnifL::Prm9ΔnifL::Prm9 1717 Фигура 10AFigure 10A CM022CM022 CM022CM022 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена mntP 1 и первых 53 п.н. гена mntP 1 (Prm3).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the mntP 1 gene and the first 53 bp. mntP 1 (Prm3) gene. ΔnifL::Prm3ΔnifL::Prm3 1818 Фигура 10AFigure 10A CM024CM024 CM024CM024 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена sspA (Prm7).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the sspA gene (Prm7). ΔnifL::Prm7ΔnifL::Prm7 1919 Фигура 10AFigure 10A CM025CM025 CM025CM025 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена hisS и первых 52 п.н. гена hisS (Prm10).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the hisS gene and the first 52 bp. hisS gene (Prm10). ΔnifL::Prm10ΔnifL::Prm10 2020 Фигура 10BFigure 10B CM006CM006 CM006CM006 Мутант CI010Mutant CI010 Нарушение гена glnB вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид-O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the glnB gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔglnB::KanRΔglnB::KanR 2121 Фигура 10CFigure 10C CI028 nifL:KanRCI028 nifL:KanR CM017CM017 Мутант CI028Mutant CI028 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид-O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the nifL gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔnifL::KanRΔnifL::KanR 2222 Фигура 10CFigure 10C CI019 nifL:SpecRCI019 nifL:SpecR CM011CM011 Мутант CI019Mutant CI019 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей ген стрептомицин 3''-O-аденилилтрансферазы aadA.Disruption of the nifL gene by an inserted spectinomycin resistance expression cassette (SpecR), encoding the streptomycin 3''-O-adenylyltransferase gene aadA. ΔnifL::SpecRΔnifL::SpecR 2323 Фигура 10CFigure 10C CI006 nifL:KanRCI006 nifL:KanR CM013CM013 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид-O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the nifL gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔnifL::KanRΔnifL::KanR 2424 Фигура 10CFigure 10C CI010 nifL:KanRCI010 nifL:KanR CM005CM005 Мутант CI010Mutant CI010 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид-O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the nifL gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔnifL::KanRΔnifL::KanR 2525 Фигура 4CFigure 4C Штамм 2Strain 2 CI006CI006 Выделенный штамм из рода EnterobacterIsolated strain from the genus Enterobacter ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 2626 Фигура 4CFigure 4C Штамм 4Strain 4 CI010CI010 Выделенный штамм из рода Klebsiella Isolated strain from the genus Klebsiella ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 2727 Фигура 4CFigure 4C Штамм 1Strain 1 CI019CI019 Выделенный штамм из рода Rahnella Isolated strain from the genus Rahnella ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 2828 Фигура 4CFigure 4C Штамм 3Strain 3 CI028CI028 Выделенный штамм из рода EnterobacterIsolated strain from the genus Enterobacter ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 2929 Фигура 4BFigure 4B Штамм 2Strain 2 CI006CI006 Выделенный штамм из рода EnterobacterIsolated strain from the genus Enterobacter ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 30thirty Фигура 4BFigure 4B ВысокийHigh CM014CM014 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp и первых 29 п.н. гена lpp (Prm1).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the lpp gene and the first 29 bp. lpp gene (Prm1). ΔnifL::Prm1ΔnifL::Prm1 3131 Фигура 4BFigure 4B СреднийAverage CM015CM015 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5). ΔnifL::Prm5ΔnifL::Prm5 3232 Фигура 4BFigure 4B НизкийShort CM023CM023 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена acpP и первых 121 п.н. гена acpP (Prm4).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the acpP gene and the first 121 bp. acpP gene (Prm4). ΔnifL::Prm4ΔnifL::Prm4 3333 Фигура 4D4D figure Штамм 2Strain 2 CI006CI006 Выделенный штамм из рода EnterobacterIsolated strain from the genus Enterobacter ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 3434 Фигура 4D4D figure ЭволюционировавшийEvolved CM029CM029 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) и делецией 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the ompX gene (Prm5) and a deletion of 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1 3535 Фигура 14CFigure 14C ДикийWild CI006CI006 Выделенный штамм из рода EnterobacterIsolated strain from the genus Enterobacter ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 3636 Фигура 14CFigure 14C ЭволюционировавшийEvolved CM014CM014 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp и первых 29 п.н. гена lpp (Prm1).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the lpp gene and the first 29 bp. lpp gene (Prm1). ΔnifL::Prm1ΔnifL::Prm1 3737 Фигура 14BFigure 14B ДикийWild CI019CI019 Выделенный штамм из рода Rahnella Isolated strain from the genus Rahnella ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 3838 Фигура 14BFigure 14B ЭволюционировавшийEvolved CM011CM011 Мутант CI019Mutant CI019 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей ген стрептомицин 3''-O-аденилилтрансферазы aadA.Disruption of the nifL gene by an inserted spectinomycin resistance expression cassette (SpecR), encoding the streptomycin 3''-O-adenylyltransferase gene aadA. ΔnifL::SpecRΔnifL::SpecR 3939 Фигура 14AFigure 14A ЭволюционировавшийEvolved CM011CM011 Мутант CI019Mutant CI019 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей ген стрептомицин 3''-O-аденилилтрансферазы aadA.Disruption of the nifL gene by an inserted spectinomycin resistance expression cassette (SpecR), encoding the streptomycin 3''-O-adenylyltransferase gene aadA. ΔnifL::SpecRΔnifL::SpecR 4040 Фигура 15AFigure 15A ДикийWild CI006CI006 Выделенный штамм из рода EnterobacterIsolated strain from the genus Enterobacter ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 4141 Фигура 15AFigure 15A ЭволюционировавшийEvolved CM013CM013 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей ген аминогликозид-O-фосфотрансферазы aph1.Disruption of the nifL gene by an inserted kanamycin resistance (KanR) expression cassette encoding the aminoglycoside O-phosphotransferase gene aph1. ΔnifL::KanRΔnifL::KanR 4242 Фигура 15BFigure 15B Не имеет названияHas no name CM011CM011 Мутант CI019Mutant CI019 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей ген стрептомицин 3''-O-аденилилтрансферазы aadA.Disruption of the nifL gene by an inserted spectinomycin resistance expression cassette (SpecR), encoding the streptomycin 3''-O-adenylyltransferase gene aadA. ΔnifL::SpecRΔnifL::SpecR 4343 Фигура 16BFigure 16B Штамм 5Strain 5 CI008CI008 Выделенный штамм из рода BurkholderiaIsolated strain from the genus Burkholderia ОтсутствуетAbsent Дикий типWild type 4444 Фигура 16BFigure 16B Штамм 1Strain 1 CM011CM011 Мутант CI019Mutant CI019 Нарушение гена nifL вставленной кассетой экспрессии устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей ген стрептомицин 3''-O-аденилилтрансферазы aadA.Disruption of the nifL gene by an inserted spectinomycin resistance expression cassette (SpecR), encoding the streptomycin 3''-O-adenylyltransferase gene aadA. ΔnifL::SpecRΔnifL::SpecR 3434 Фигура 4D4D figure ЭволюционировавшийEvolved CM029CM029 утант CI006Utant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) и делецией 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the ompX gene (Prm5) and a deletion of 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1

Таблица 9. Другие штаммы, описанные в настоящем документеTable 9. Other strains described herein

Идентификатор штаммаStrain ID Линия Line Описание мутагенной ДНКDescription of mutagenic DNA Хромосомный генотипChromosomal genotype Статус излеченияCure status CI006CI006 CI006CI006 Родительский Kosakonia saccari, дикий типParent Kosakonia saccari, wild type Дикий типWild type Н/ДN/A CI137CI137 CI137CI137 Родительский K. variicola, дикий типParental K. variicola, wild type Дикий типWild type Н/ДN/A 137-1036137-1036 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). ΔnifL::PinfCΔnifL::PinfC неизлеченныйuncured 6-4126-412 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1 ИзлеченныйHealed 6-4356-435 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtBΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB 6-16916-1691 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция 150 п.н. против хода транскрипции от гена cysZ и вставка Prm1 непосредственно против хода транскрипции от cysZ. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion 150 bp. upstream of the cysZ gene and the Prm1 insertion directly upstream of cysZ. ΔnifL::Prm,1 ΔglnE-AR_KO1, cysZ::Prm1ΔnifL::Prm,1 ΔglnE-AR_KO1, cysZ::Prm1 НеизлеченныйUncured 6-3466-346 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1 НеизлеченныйUncured 6-9236-923 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB. Делеция нативного промотора treZ и вставка фрагмента (Prm2) из области против хода транскрипции от PROKKA_04751 (гипотетического белка), непосредственно против хода транскрипции от treZ. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. Deletion of the native treZ promoter and insertion of a fragment (Prm2) from the region upstream of PROKKA_04751 (a hypothetical protein), immediately upstream of treZ. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, treZ::Prm2ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, treZ::Prm2 НеизлеченныйUncured 6-16946-1694 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1, ΔglgAΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1, ΔglgA НеизлеченныйUncured 6-3426-342 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) и делецией 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of the region upstream of the ompX gene (Prm5) and a deletion of 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1 НеизлеченныйUncured 6-16816-1681 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔglgAΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔglgA НеизлеченныйUncured 6-4046-404 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1 ИзлеченныйHealed 6-9216-921 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB. Делеция нативного промотора otsB и вставка Prm1 непосредственно против хода транскрипции от ostB.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. Deletion of the native otsB promoter and insertion of Prm1 immediately upstream of ostB. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, otsB::Prm1ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, otsB::Prm1 НеизлеченныйUncured 6-9226-922 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB. Делеция нативного промотора otsB и вставка фрагмента (Prm2) из области против хода транскрипции от PROKKA_04751 (гипотетического белка), непосредственно против хода транскрипции от otsB. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. Deletion of the native otsB promoter and insertion of a fragment (Prm2) from the region upstream of PROKKA_04751 (a hypothetical protein), immediately upstream of otsB. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, otsB::Prm2ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, otsB::Prm2 НеизлеченныйUncured 6-17446-1744 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB. Делеция всего CDS amtB. Делеция нативного промотора treZ и вставка фрагмента (Prm2) из области против хода транскрипции от PROKKA_04751 (гипотетического белка), непосредственно против хода транскрипции от treZ. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. Deletion of the entire amtB CDS. Deletion of the native treZ promoter and insertion of a fragment (Prm2) from the region upstream of PROKKA_04751 (a hypothetical protein), immediately upstream of treZ. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, ΔglgA, treZ::Prm2ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, ΔglgA, treZ::Prm2 неизлеченныйuncured 6-3226-322 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. ΔnifL::Prm1ΔnifL::Prm1 неизлеченныйuncured 6-4006-400 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. ΔnifL::Prm1ΔnifL::Prm1 излеченныйhealed 6-8486-848 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция всего CDS amtB.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the entire amtB CDS. ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO2, ΔamtBΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO2, ΔamtB ИзлеченныйHealed 137-2084137-2084 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2 излеченныйhealed 137-2251137-2251 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора rpoN и вставка фрагмента (Prm8.2), находящегося через от 77 п.н. после старт-кодона nlpI до 376 п.н. после старт-кодона nlpI, непосредственно против хода транскрипции от rpoN.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native rpoN promoter and insertion of a fragment (Prm8.2) located from 77 bp. after the nlpI start codon up to 376 bp. after the nlpI start codon, immediately upstream of rpoN. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, rpoN::Prm8.2ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, rpoN::Prm8.2 излеченныйhealed 137-2285137-2285 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора rpoN и вставка фрагмента (Prm1.2) непосредственно против хода транскрипции от CDS rpoN.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native rpoN promoter and insertion of a fragment (Prm1.2) immediately upstream of the rpoN CDS. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, rpoN::Prm1.2ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, rpoN::Prm1.2 излеченныйhealed 137-2225137-2225 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция всего CDS glnK.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the entire glnK CDS. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnKΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnK излеченныйhealed 137-1586137-1586 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2).Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). ΔnifL::PinfC, ΔglnE-AR_KO2ΔnifL::PinfC, ΔglnE-AR_KO2 излеченныйhealed 137-1860137-1860 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора dctA1 и вставка фрагмента (Prm8.2), находящегося через от 77 п.н. после старт-кодона nlpI до 376 п.н. после старт-кодона nlpI, непосредственно против хода транскрипции от dctA1. Нативный старт-кодон dctA1 также был изменен с GTG на ATG.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native dctA1 promoter and insertion of a fragment (Prm8.2) located from 77 bp. after the nlpI start codon up to 376 bp. after the nlpI start codon, immediately upstream of dctA1. The native start codon of dctA1 was also changed from GTG to ATG. ΔnifL::PinfC, ΔglnE-AR_KO2, dctA1::Prm8.2_ATG-startΔnifL::PinfC, ΔglnE-AR_KO2, dctA1::Prm8.2_ATG-start излеченныйhealed 137-1905137-1905 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора dctA1 и вставка фрагмента (Prm1.2) непосредственно против хода транскрипции от dctA1. Нативный старт-кодон dctA1 также был изменен с GTG на ATG.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native dctA1 promoter and insertion of a fragment (Prm1.2) immediately upstream of dctA1. The native start codon of dctA1 was also changed from GTG to ATG. ΔnifL::PinfC, ΔglnE-AR_KO2, dctA1::Prm1.2_ATG-startΔnifL::PinfC, ΔglnE-AR_KO2, dctA1::Prm1.2_ATG-start неизлеченныйuncured 6-16976-1697 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB. Делеция нативного промотора treZ и вставка фрагмента (Prm2) из области против хода транскрипции от PROKKA_04751 (гипотетического белка), непосредственно против хода транскрипции от treZ. Делеция нативного промотора otsB и вставка Prm1 непосредственно против хода транскрипции от ostB. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. Deletion of the native treZ promoter and insertion of a fragment (Prm2) from the region upstream of PROKKA_04751 (a hypothetical protein), immediately upstream of treZ. Deletion of the native otsB promoter and insertion of Prm1 immediately upstream of ostB. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, treZ::Prm2, otsB::Prm1ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, treZ::Prm2, otsB::Prm1 НеизлеченныйUncured 137-1901137-1901 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора phoB1 и вставка фрагмента (Prm1.2) непосредственно против хода транскрипции от CDS phoB1.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native phoB1 promoter and insertion of a fragment (Prm1.2) immediately upstream of the phoB1 CDS. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, phoB1::Prm1.2ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, phoB1::Prm1.2 ИзлеченныйHealed 6-17796-1779 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция всего CDS amtB. Делеция нативного промотора bcsII и вставка фрагмента (Prm2) из области против хода транскрипции от PROKKA_04751 (гипотетического белка), непосредственно против хода транскрипции от bcsII. Делеция нативного промотора yjbE2 и вставка Prm1 непосредственно против хода транскрипции от yjbE2. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the entire amtB CDS. Deletion of the native bcsII promoter and insertion of a fragment (Prm2) from the region upstream of PROKKA_04751 (a hypothetical protein), immediately upstream of bcsII. Deletion of the native yjbE2 promoter and insertion of Prm1 immediately upstream of yjbE2. ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO2, ΔamtB, bcsII::Prm2, yjbE2::Prm1ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO2, ΔamtB, bcsII::Prm2, yjbE2::Prm1 НеизлеченныйUncured 6-17826-1782 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnB) из области против хода транскрипции от гена glnB, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnB) from a region upstream of the glnB gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_ATG-startΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_ATG-start НеизлеченныйUncured 6-17836-1783 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnB) из области против хода транскрипции от гена glnB, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Нативный старт-кодон glnA также был изменен с ATG на GTG. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnB) from a region upstream of the glnB gene, immediately upstream of glnA. The native glnA start codon was also changed from ATG to GTG. ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_GTG-startΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_GTG-start НеизлеченныйUncured 6-19066-1906 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnB) из области против хода транскрипции от гена glnB, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Нативный старт-кодон glnA также был изменен с ATG на GTG. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnB) from a region upstream of the glnB gene, immediately upstream of glnA. The native glnA start codon was also changed from ATG to GTG. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_GTG-startΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_GTG-start НеизлеченныйUncured 6-19076-1907 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnE) из области против хода транскрипции от гена glnE, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnE) from a region upstream of the glnE gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnE_ATG-startΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnE_ATG-start НеизлеченныйUncured 6-19086-1908 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnE) из области против хода транскрипции от гена glnE, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Нативный старт-кодон glnA также был изменен с ATG на GTG. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnE) from a region upstream of the glnE gene, immediately upstream of glnA. The native glnA start codon was also changed from ATG to GTG. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnE_GTG-startΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnE_GTG-start НеизлеченныйUncured 6-19126-1912 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnE) из области против хода транскрипции от гена glnE, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnE) from a region upstream of the glnE gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm1, glnA::PrmglnE_ATG-startΔnifL::Prm1, glnA::PrmglnE_ATG-start НеизлеченныйUncured 137-2656137-2656 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnB) из области против хода транскрипции от гена glnB, непосредственно против хода транскрипции от glnA.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnB) from a region upstream of the glnB gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnB_ATG-startΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnB_ATG-start ИзлеченныйHealed 137-2657137-2657 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnB) из области против хода транскрипции от гена glnB, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Нативный старт-кодон glnA также был изменен с ATG на GTG. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnB) from a region upstream of the glnB gene, immediately upstream of glnA. The native glnA start codon was also changed from ATG to GTG. ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnB_GTG-startΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnB_GTG-start ИзлеченныйHealed 137-2658137-2658 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnD) из области против хода транскрипции от гена glnD, непосредственно против хода транскрипции от glnA.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnD) from a region upstream of the glnD gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnD_ATG-startΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnD_ATG-start ИзлеченныйHealed 137-2659137-2659 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnD) из области против хода транскрипции от гена glnD, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Нативный старт-кодон glnA также был изменен с ATG на GTG. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnD) from a region upstream of the glnD gene, immediately upstream of glnA. The native glnA start codon was also changed from ATG to GTG. ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnD_GTG-startΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnD_GTG-start ИзлеченныйHealed 137-2660137-2660 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnE) из области против хода транскрипции от гена glnE, непосредственно против хода транскрипции от glnA.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnE) from a region upstream of the glnE gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnE_ATG-startΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnE_ATG-start ИзлеченныйHealed 137-2661137-2661 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnE) из области против хода транскрипции от гена glnE, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Нативный старт-кодон glnA также был изменен с ATG на GTG. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnE) from a region upstream of the glnE gene, immediately upstream of glnA. The native glnA start codon was also changed from ATG to GTG. ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnE_GTG-startΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnE_GTG-start ИзлеченныйHealed 137-2257137-2257 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnB) из области против хода транскрипции от гена glnB, непосредственно против хода транскрипции от glnA.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnB) from a region upstream of the glnB gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnB_ATG-startΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnB_ATG-start ИзлеченныйHealed 137-2259137-2259 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnB) из области против хода транскрипции от гена glnB, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Нативный старт-кодон glnA также был изменен с ATG на GTG. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnB) from a region upstream of the glnB gene, immediately upstream of glnA. The native glnA start codon was also changed from ATG to GTG. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnB_GTG-startΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnB_GTG-start ИзлеченныйHealed 137-2261137-2261 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnD) из области против хода транскрипции от гена glnD, непосредственно против хода транскрипции от glnA.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnD) from a region upstream of the glnD gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnD_ATG-startΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnD_ATG-start ИзлеченныйHealed 137-2263137-2263 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnD) из области против хода транскрипции от гена glnD, непосредственно против хода транскрипции от glnA. Нативный старт-кодон glnA также был изменен с ATG на GTG. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnD) from a region upstream of the glnD gene, immediately upstream of glnA. The native glnA start codon was also changed from ATG to GTG. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnD_GTG-startΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnD_GTG-start ИзлеченныйHealed 137-2281137-2281 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора glnA и вставка фрагмента (PrmglnE) из области против хода транскрипции от гена glnE, непосредственно против хода транскрипции от glnA.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native glnA promoter and insertion of a fragment (PrmglnE) from a region upstream of the glnE gene, immediately upstream of glnA. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnE_ATG-startΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnE_ATG-start ИзлеченныйHealed 137-2219137-2219 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция 546 п.н. перед стоп-кодоном гена glnD, содержащего домен ACT1/2 бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-ACT12_truncation)Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion 546 bp. before the stop codon of the glnD gene containing the ACT1/2 domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-ACT12_truncation) ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_ACT12_truncationΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_ACT12_truncation ИзлеченныйHealed 137-2221137-2221 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция 975 п.н. после старт-кодона гена glnD, содержащего домен уридилилтрансферазы (UT) бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-UT_truncation)Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion 975 bp. after the start codon of the glnD gene containing the uridylyltransferase (UT) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-UT_truncation) ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_UT_truncationΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_UT_truncation ИзлеченныйHealed 137-2223137-2223 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция всего CDS glnD.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the entire glnD CDS. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnDΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD ИзлеченныйHealed 137-2245137-2245 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция 66 п.н., начиная с пары нуклеотидов 1519 до пары нуклеотидов 1586 гена glnD, содержащего уридилил-удаляющий (UR) домен бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-UR_truncation)Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of 66 bp, starting from nucleotide pair 1519 to nucleotide pair 1586 of the glnD gene containing the uridylyl-removing (UR) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-UR_truncation) ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_UR_truncationΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_UR_truncation ИзлеченныйHealed 137-2227137-2227 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Делеция 546 п.н. перед стоп-кодоном гена glnD, содержащего домен ACT1/2 бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-ACT12_truncation)Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Deletion 546 bp. before the stop codon of the glnD gene containing the ACT1/2 domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-ACT12_truncation) ΔnifL::PinfC, ΔglnD_ACT12_truncationΔnifL::PinfC, ΔglnD_ACT12_truncation ИзлеченныйHealed 137-2229137-2229 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Делеция всего CDS glnD.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Deletion of the entire glnD CDS. ΔnifL::PinfC, ΔglnDΔnifL::PinfC, ΔglnD ИзлеченныйHealed 137-2253137-2253 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Делеция 975 п.н. после старт-кодона гена glnD, содержащего домен уридилилтрансферазы (UT) бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-UT_truncation)Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Deletion 975 bp. after the start codon of the glnD gene containing the uridylyltransferase (UT) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-UT_truncation) ΔnifL::PinfC, ΔglnD_UT_truncationΔnifL::PinfC, ΔglnD_UT_truncation ИзлеченныйHealed 137-2283137-2283 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Инактивация домена уридилилтрансферазы (UT) бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента, glnD, путем мутирования аминокислотных остатков 90 и 91 из GG в DV, а также остатка 104 из D в A. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Inactivation of the uridylyltransferase (UT) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl scavenging enzyme, glnD, by mutating amino acid residues 90 and 91 from GG to DV and residue 104 from D to A. ΔnifL::PinfC, ΔglnD_UT_deactivationΔnifL::PinfC, ΔglnD_UT_deactivation ИзлеченныйHealed 137-2237137-2237 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора glsA2 и вставка фрагмента (Prm1.2) непосредственно против хода транскрипции от CDS glsA2.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native glsA2 promoter and insertion of a fragment (Prm1.2) immediately upstream of the glsA2 CDS. ΔnifL::Prm1.2, ΔglnE-AR_KO2, glsaA2::Prm1.2ΔnifL::Prm1.2, ΔglnE-AR_KO2, glsaA2::Prm1.2 ИзлеченныйHealed 6-25526-2552 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция 549 п.н. перед стоп-кодоном гена glnD, содержащего домен ACT1/2 бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-ACT12_truncation) Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion 549 bp. before the stop codon of the glnD gene containing the ACT1/2 domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-ACT12_truncation) ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD-ACT12_truncationΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD-ACT12_truncation ИзлеченныйHealed 6-25976-2597 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция 987 п.н. после старт-кодона гена glnD, содержащего домен уридилилтрансферазы (UT) бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-UT_truncation) Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion 987 bp. after the start codon of the glnD gene containing the uridylyltransferase (UT) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-UT_truncation) ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_truncationΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_truncation ИзлеченныйHealed 6-25876-2587 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS glnD. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire glnD CDS. ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnDΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD ИзлеченныйHealed 6-26366-2636 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Инактивация домена уридилилтрансферазы (UT) бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента, glnD, путем мутирования аминокислотных остатков 90 и 91 из GG в DV, а также остатка 104 из D в A. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Inactivation of the uridylyltransferase (UT) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl scavenging enzyme, glnD, by mutating amino acid residues 90 and 91 from GG to DV and residue 104 from D to A. ΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_deactivationΔnifL::Prm1, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_deactivation ИзлеченныйHealed 6-20906-2090 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция 549 п.н. перед стоп-кодоном гена glnD, содержащего домен ACT1/2 бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-ACT12_truncation)Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion 549 bp. before the stop codon of the glnD gene containing the ACT1/2 domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-ACT12_truncation) ΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD-ACT12_truncationΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD-ACT12_truncation ИзлеченныйHealed 6-21226-2122 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS glnD. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire glnD CDS. ΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnDΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD ИзлеченныйHealed 6-24116-2411 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция 987 п.н. после старт-кодона гена glnD, содержащего домен уридилилтрансферазы (UT) бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента (ΔglnD-UT_truncation)Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion 987 bp. after the start codon of the glnD gene containing the uridylyltransferase (UT) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme (ΔglnD-UT_truncation) ΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_truncationΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_truncation ИзлеченныйHealed 6-26156-2615 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Инактивация домена уридилилтрансферазы (UT) бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента, glnD, путем мутирования аминокислотных остатков 90 и 91 из GG в DV, а также остатка 104 из D в A. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Inactivation of the uridylyltransferase (UT) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl scavenging enzyme, glnD, by mutating amino acid residues 90 and 91 from GG to DV and residue 104 from D to A. ΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_deactivationΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_deactivation ИзлеченныйHealed 6-26276-2627 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена ompX (Prm5) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Инактивация уридилил-удаляющего (UR) домена бифункционального уридилилтрансфераза/уридил-удаляющего фермента, glnD путем мутирования аминокислотных остатков 515 и 516 из HD в AA. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the ompX gene (Prm5) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Inactivation of the uridylyl-removal (UR) domain of the bifunctional uridylyltransferase/uridyl-removing enzyme, glnD, by mutating amino acid residues 515 and 516 from HD to AA. ΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UR_deactivationΔnifL::Prm5, ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UR_deactivation ИзлеченныйHealed 6-9166-916 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO1). Делеция всего CDS amtB. Делеция нативного промотора cysZ и вставка Prm1 непосредственно против хода транскрипции от cysZ. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion 1287 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO1). Deletion of the entire amtB CDS. Deletion of the native cysZ promoter and insertion of Prm1 directly upstream of cysZ. ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, cysZ::Prm1ΔnifL::Prm1 ΔglnE-AR_KO1, ΔamtB, cysZ::Prm1 излеченныйhealed 137-1893137-1893 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена infC (PinfC) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция всего CDS amtB. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the infC gene (PinfC) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the entire amtB CDS. ΔnifL::PinfC, ΔglnE-AR_KO2, ΔglgAΔnifL::PinfC, ΔglnE-AR_KO2, ΔglgA излеченныйhealed 6-21186-2118 Мутант CI006Mutant CI006 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена lpp (Prm1) против хода транскрипции от nifA. Делеция нативного промотора glsA2 и вставка Prm1 непосредственно против хода транскрипции от glsA2. Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the lpp gene (Prm1) upstream of nifA. Deletion of the native glsA2 promoter and insertion of Prm1 immediately upstream of glsA2. ΔnifL::Prm1, glsA2::Prm1ΔnifL::Prm1, glsA2::Prm1 излеченныйhealed 137-2502137-2502 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция 1011 п.н. перед стоп-кодоном гена asnB, кодирующего аспарагинсинтетазу B.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion 1011 bp. before the stop codon of the asnB gene, encoding asparagine synthetase B. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔasnB-truncationΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, ΔasnB-truncation излеченныйhealed 137-2504137-2504 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора asnB и вставка фрагмента (Prm1.2) непосредственно против хода транскрипции от CDS asnB.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native asnB promoter and insertion of a fragment (Prm1.2) immediately upstream of the asnB CDS. ΔnifL::Prm1.2, ΔglnE-AR_KO2, asnB::Prm1.2ΔnifL::Prm1.2, ΔglnE-AR_KO2, asnB::Prm1.2 излеченныйhealed 137-2215137-2215 Мутант CI137Mutant CI137 Нарушение гена nifL вставленным фрагментом области против хода транскрипции от гена cspE (Prm1.2) против хода транскрипции от nifA. Делеция 1647 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилил-удаляющий домен глутамат-аммоний-лигазы аденилилтрансферазы (ΔglnE-AR_KO2). Делеция нативного промотора оперона gltBD и вставка фрагмента (PrmglnD) из области против хода транскрипции от гена glnD, непосредственно против хода транскрипции от оперона gltBD.Disruption of the nifL gene by an inserted fragment of a region upstream of the cspE gene (Prm1.2) upstream of nifA. Deletion 1647 bp. after the start codon of the glnE gene containing the adenylyl-removing domain of glutamate ammonium ligase adenylyltransferase (ΔglnE-AR_KO2). Deletion of the native promoter of the gltBD operon and insertion of a fragment (PrmglnD) from the region upstream of the glnD gene, immediately upstream of the gltBD operon. ΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, gltBD::PrmglnD_ATG-startΔnifL::Prm1.2 ΔglnE-AR_KO2, gltBD::PrmglnD_ATG-start излеченныйhealed

Безотносительно прилагаемой формулы изобретения изобретение, изложенное в настоящем документе, также определяется следующими пунктами:Notwithstanding the appended claims, the invention set forth herein is also defined by the following paragraphs:

1. Штамм микроорганизма с улучшенной устойчивостью к высушиванию.1. A strain of microorganism with improved resistance to desiccation.

2. Штамм микроорганизма, где экспрессия rpoE регулируется переключаемым промотором.2. A microorganism strain where the expression of rpoE is regulated by a switchable promoter.

3. Штамм микроорганизма согласно пункту 2, где указанный переключаемый промотор представляет собой промотор арабинозы.3. The microorganism strain according to paragraph 2, wherein said switchable promoter is an arabinose promoter.

4. Штамм микроорганизма согласно пункту 2, где ген rseA является подавленным.4. The microorganism strain according to point 2, where the rseA gene is suppressed.

5. Штамм микроорганизма согласно пункту 2, где указанный переключаемый промотор представляет собой промотор, который может быть активирован химическим веществом.5. A strain of microorganism according to paragraph 2, wherein said switchable promoter is a promoter that can be activated by a chemical substance.

6. Штамм микроорганизма согласно пункту 2, где указанный переключаемый промотор представляет собой промотор, который может быть активирован сахаром.6. The microorganism strain according to paragraph 2, wherein said switchable promoter is a promoter that can be activated by sugar.

7. Штамм микроорганизма согласно пункту 2, где указанный переключаемый промотор представляет собой промотор, который может быть активирован арабинозой.7. The microorganism strain according to paragraph 2, wherein said switchable promoter is a promoter that can be activated by arabinose.

8. Способ повышения устойчивости микроорганизма к высушиванию, включающий конструирование указанного микроорганизма таким образом, чтобы он содержал ген rpoE, функционально связанный с переключаемым промотором, активацию указанного переключаемого промотора во время логарифмической фазы роста биомассы, повышая таким образом устойчивость указанного микроорганизма к высушиванию.8. A method for increasing the resistance of a microorganism to desiccation, comprising designing said microorganism so that it contains the rpoE gene operably linked to a switchable promoter, activating said switchable promoter during the logarithmic phase of biomass growth, thereby increasing the resistance of said microorganism to desiccation.

9. Способ повышения устойчивости микроорганизма к высушиванию во время нанесения покрытия на семена, включающий конструирование указанного микроорганизма таким образом, чтобы он содержал ген rpoE, функционально связанный с переключаемым промотором, активацию указанного переключаемого промотора перед высушиванием, повышая таким образом устойчивость указанного микроорганизма к высушиванию.9. A method of increasing the resistance of a microorganism to desiccation during seed coating, comprising designing said microorganism to contain an rpoE gene operably linked to a switchable promoter, activating said switchable promoter before drying, thereby increasing the resistance of said microorganism to desiccation.

10. Способ согласно пункту 9, где указанный переключаемый промотор представляет собой промотор, который может быть активирован химическим веществом.10. The method according to paragraph 9, wherein said switchable promoter is a promoter that can be activated by a chemical substance.

11. Способ согласно пункту 9, где указанный переключаемый промотор представляет собой промотор, который может быть активирован сахаром.11. The method according to paragraph 9, wherein said switchable promoter is a promoter that can be activated by sugar.

12. Способ согласно пункту 9, где указанный переключаемый промотор представляет собой промотор, который может быть активирован арабинозой.12. The method according to paragraph 9, wherein said switchable promoter is a promoter that can be activated by arabinose.

13. Способ согласно пункту 9, где указанный переключаемый промотор активируют во время логарифмической фазы роста биомассы.13. The method according to paragraph 9, wherein said switchable promoter is activated during the logarithmic phase of biomass growth.

14. Способ согласно пункту 9, где указанный переключаемый промотор активируют во время нанесения покрытия на семена.14. The method according to paragraph 9, wherein said switchable promoter is activated during seed coating.

15. Способ согласно пункту 9, где указанный микроорганизм также сконструирован для снижения экспрессии rseA.15. The method according to paragraph 9, wherein said microorganism is also designed to reduce the expression of rseA.

16. Генетически сконструированная бактерия, содержащая гетерологичный регуляторный элемент, функционально связанный с cysP.16. A genetically engineered bacterium containing a heterologous regulatory element functionally associated with cysP.

17. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 16, где указанный гетерологичный регуляторный элемент представляет собой промотор.17. A genetically engineered bacterium according to paragraph 16, wherein said heterologous regulatory element is a promoter.

18. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 16, где указанный гетерологичный регуляторный элемент является нативным для указанной генетически сконструированной бактерии.18. The genetically engineered bacterium according to claim 16, wherein said heterologous regulatory element is native to said genetically engineered bacterium.

19. Генетически сконструированная бактерия, содержащая генетическое изменение, которое приводит к повышению экспрессии белка, катализирующего транспорт компонентов кофакторов нитрогеназы в клетку.19. A genetically engineered bacterium containing a genetic change that results in increased expression of a protein that catalyzes the transport of nitrogenase cofactor components into the cell.

20. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 19, где указанный белок, катализирующий транспорт компонентов кофакторов нитрогеназы в клетку, представляет собой ген транспортера серы.20. A genetically engineered bacterium according to paragraph 19, where said protein, which catalyzes the transport of nitrogenase cofactor components into the cell, is a sulfur transporter gene.

21. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 20, где указанный ген транспортера серы представляет собой cysZ.21. The genetically engineered bacterium according to paragraph 20, wherein said sulfur transporter gene is cysZ.

22. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 20, где указанный ген транспортера серы представляет собой cysK.22. The genetically engineered bacterium according to claim 20, wherein said sulfur transporter gene is cysK.

23. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 20, где указанный ген транспортера серы представляет собой cysT.23. The genetically engineered bacterium according to paragraph 20, wherein said sulfur transporter gene is cysT.

24. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 20, где указанный ген транспортера серы представляет собой cysW.24. The genetically engineered bacterium according to claim 20, wherein said sulfur transporter gene is cysW.

25. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 20, где указанный ген транспортера серы представляет собой cysA.25. The genetically engineered bacterium according to claim 20, wherein said sulfur transporter gene is cysA.

26. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 20, где указанный ген транспортера серы представляет собой sbp.26. The genetically engineered bacterium according to claim 20, wherein said sulfur transporter gene is sbp.

27. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 19, где указанное генетическое изменение приводит к повышению экспрессии оперона cysZK.27. A genetically engineered bacterium according to paragraph 19, where the specified genetic change leads to increased expression of the cysZK operon.

28. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 19, где указанное генетическое изменение приводит к повышению экспрессии оперона cysPTWA.28. A genetically engineered bacterium according to paragraph 19, where the specified genetic change leads to increased expression of the cysPTWA operon.

29. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 19, где указанный белок, катализирующий транспорт компонентов кофакторов нитрогеназы в клетку, представляет собой ген транспортера молибдена.29. A genetically engineered bacterium according to paragraph 19, where said protein, which catalyzes the transport of nitrogenase cofactor components into the cell, is a molybdenum transporter gene.

30. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 29, где указанный ген транспортера молибдена представляет собой modE.30. The genetically engineered bacterium according to paragraph 29, wherein said molybdenum transporter gene is modE.

31. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 29, где указанный ген транспортера молибдена представляет собой modB.31. The genetically engineered bacterium according to claim 29, wherein said molybdenum transporter gene is modB.

32. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 29, где указанный ген транспортера молибдена представляет собой modA.32. The genetically engineered bacterium according to paragraph 29, wherein said molybdenum transporter gene is modA.

33. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 19, где указанное генетическое изменение приводит к повышению экспрессии оперона modEB.33. A genetically engineered bacterium according to paragraph 19, where the specified genetic change leads to increased expression of the modEB operon.

34. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 19, где указанное генетическое изменение приводит к повышению экспрессии оперона modEBA.34. A genetically engineered bacterium according to paragraph 19, where the specified genetic change leads to increased expression of the modEBA operon.

35. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 19, где указанный белок, катализирующий транспорт компонентов кофакторов нитрогеназы в клетку, представляет собой ген транспортера железа.35. A genetically engineered bacterium according to paragraph 19, where said protein, which catalyzes the transport of nitrogenase cofactor components into the cell, is an iron transporter gene.

36. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 35, где указанный ген транспортера железа представляет собой exbA.36. The genetically engineered bacterium according to claim 35, wherein said iron transporter gene is exbA.

37. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 35, где указанный ген транспортера железа представляет собой exbB.37. The genetically engineered bacterium according to claim 35, wherein said iron transporter gene is exbB.

38. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 35, где указанный ген транспортера железа представляет собой tonB.38. The genetically engineered bacterium according to claim 35, wherein said iron transporter gene is tonB.

39. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 19, где указанное генетическое изменение приводит к повышению экспрессии оперона exbAB.39. A genetically engineered bacterium according to paragraph 19, where said genetic change results in increased expression of the exbAB operon.

40. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-39, где указанное генетическое изменение включает вставку промотора.40. A genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-39, wherein said genetic change involves insertion of a promoter.

41. Генетически сконструированная бактерия, обладающая измененной экспрессией гена биосинтеза сидерофора.41. A genetically engineered bacterium with altered expression of the siderophore biosynthesis gene.

42. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 41, где указанный ген биосинтеза сидерофора представляет собой yhfA.42. The genetically engineered bacterium according to claim 41, wherein said siderophore biosynthesis gene is yhfA.

43. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 41, где указанный ген биосинтеза сидерофора представляет собой yusV. 43. The genetically engineered bacterium according to claim 41, wherein said siderophore biosynthesis gene is yusV.

44. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 41, где указанный ген биосинтеза сидерофора представляет собой sbnA.44. The genetically engineered bacterium according to claim 41, wherein said siderophore biosynthesis gene is sbnA.

45. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 41, где указанный ген биосинтеза сидерофора представляет собой yfiZ.45. The genetically engineered bacterium according to claim 41, wherein said siderophore biosynthesis gene is yfiZ.

46. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 41, где указанный ген биосинтеза сидерофора представляет собой fiu.46. The genetically engineered bacterium according to paragraph 41, wherein said siderophore biosynthesis gene is fiu.

47. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 41, где указанный ген биосинтеза сидерофора представляет собой fur.47. The genetically engineered bacterium according to paragraph 41, wherein said siderophore biosynthesis gene is fur.

48. Генетически сконструированная бактерия, содержащая генетическое изменение в glgA; где указанная генетически сконструированная бактерия обладает повышенной азотфиксирующей активностью по сравнению с бактерией того же вида без указанного генетического изменения в glgA.48. A genetically engineered bacterium containing a genetic change in glgA; wherein said genetically engineered bacterium has increased nitrogen-fixing activity compared to a bacterium of the same species without said genetic change in glgA.

49. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 47, где указанное генетическое изменение приводит к снижению экспрессии glgA.49. A genetically engineered bacterium according to paragraph 47, where the specified genetic change leads to a decrease in the expression of glgA.

50. Генетически сконструированная бактерия, содержащая ненативный сайт связывания рибосомы, приводящий к повышению трансляции NifA.50. A genetically engineered bacterium containing a non-native ribosome binding site, resulting in increased translation of NifA.

51. Генетически сконструированная бактерия, содержащая по меньшей мере две копии гена NifA.51. A genetically engineered bacterium containing at least two copies of the NifA gene.

52. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 51, содержащая по меньшей мере три копии гена NifA.52. A genetically engineered bacterium according to paragraph 51, containing at least three copies of the NifA gene.

53. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 51, содержащая по меньшей мере четыре копии гена NifA.53. A genetically engineered bacterium according to paragraph 51, containing at least four copies of the NifA gene.

54. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 51, содержащая по меньшей мере пять копий гена NifA.54. A genetically engineered bacterium according to paragraph 51, containing at least five copies of the NifA gene.

55. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 51, содержащая по меньшей мере шесть копий гена NifA.55. A genetically engineered bacterium according to paragraph 51, containing at least six copies of the NifA gene.

56. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 51, содержащая по меньшей мере семь копий гена NifA.56. A genetically engineered bacterium according to paragraph 51, containing at least seven copies of the NifA gene.

57. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 51, содержащая более десяти копий гена NifA.57. A genetically engineered bacterium according to paragraph 51, containing more than ten copies of the NifA gene.

58. Генетически сконструированная бактерия, содержащая гетерологичный промотор, функционально связанный с по меньшей мере одним геном, выбранным из группы, состоящей из nifH, nifD и nifK; где указанный гетерологичный промотор получен из генетического материала микроорганизма-хозяина.58. A genetically engineered bacterium containing a heterologous promoter operably linked to at least one gene selected from the group consisting of nifH, nifD and nifK; wherein said heterologous promoter is derived from the genetic material of the host microorganism.

59. Генетически сконструированная бактерия, содержащая генетический вариант в гене, ответственном за поглощение активных форм кислорода.59. A genetically engineered bacterium that contains a genetic variant in the gene responsible for the uptake of reactive oxygen species.

60. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 59, где указанный ген, ответственный за поглощение активных форм кислорода, представляет собой grxA.60. The genetically engineered bacterium according to paragraph 59, wherein said gene responsible for the uptake of reactive oxygen species is grxA.

61. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 59, где указанный ген, ответственный за поглощение активных форм кислорода, представляет собой grxB.61. The genetically engineered bacterium according to claim 59, wherein said gene responsible for scavenging reactive oxygen species is grxB.

62. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 59, где указанный ген, ответственный за поглощение активных форм кислорода, представляет собой grxC.62. The genetically engineered bacterium according to paragraph 59, wherein said gene responsible for the uptake of reactive oxygen species is grxC.

63. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 59, где указанный ген, ответственный за поглощение активных форм кислорода, представляет собой grxD.63. The genetically engineered bacterium according to paragraph 59, wherein said gene responsible for the uptake of reactive oxygen species is grxD.

64. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 59, где указанный ген, ответственный за поглощение активных форм кислорода, представляет собой trxA.64. The genetically engineered bacterium according to paragraph 59, wherein said gene responsible for the uptake of reactive oxygen species is trxA.

65. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 59, где указанный ген, ответственный за поглощение активных форм кислорода, представляет собой trxC.65. The genetically engineered bacterium according to claim 59, wherein said gene responsible for scavenging reactive oxygen species is trxC.

66. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 59, где указанный ген, ответственный за поглощение активных форм кислорода, представляет собой tpx.66. The genetically engineered bacterium according to paragraph 59, wherein said gene responsible for the uptake of reactive oxygen species is tpx.

67. Генетически сконструированная бактерия, содержащая генетическую структуру, приводящую к изменению экспрессии оперона grxABCD.67. A genetically engineered bacterium containing a genetic structure that results in altered expression of the grxABCD operon.

68. Генетически сконструированная бактерия, содержащая генетический вариант, приводящий к повышению уровня нитрогеназной активности в условиях по меньшей мере 0,05% кислорода по сравнению с несконструированной диазотрофной бактерией того же вида.68. A genetically engineered bacterium containing a genetic variant that results in increased levels of nitrogenase activity under conditions of at least 0.05% oxygen compared to a non-engineered diazotrophic bacterium of the same species.

69. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к повышению уровня нитрогеназной активности в условиях по меньшей мере 0,1% кислорода по сравнению с несконструированной диазотрофной бактерией того же вида.69. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, wherein said genetic variant results in increased levels of nitrogenase activity under conditions of at least 0.1% oxygen compared to a non-engineered diazotrophic bacterium of the same species.

70. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к повышению уровня нитрогеназной активности в условиях по меньшей мере 0,5% кислорода по сравнению с несконструированной диазотрофной бактерией того же вида.70. A genetically engineered bacterium as defined in paragraph 68, wherein said genetic variant results in increased levels of nitrogenase activity under conditions of at least 0.5% oxygen compared to a non-engineered diazotrophic bacterium of the same species.

71. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к повышению уровня нитрогеназной активности в условиях по меньшей мере 1% кислорода по сравнению с несконструированной диазотрофной бактерией того же вида.71. A genetically engineered bacterium as defined in paragraph 68, wherein said genetic variant results in increased levels of nitrogenase activity under conditions of at least 1% oxygen compared to a non-engineered diazotrophic bacterium of the same species.

72. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии оперона cydABX.72. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the cydABX operon.

73. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии оперона cydAB.73. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the cydAB operon.

74. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена cydX.74. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the cydX gene.

75. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена cydA.75. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the cydA gene.

76. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена cydB.76. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the cydB gene.

77. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена glbN.77. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the glbN gene.

78. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии оперона fixNOPQ.78. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the fixNOPQ operon.

79. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена fixN.79. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the fixN gene.

80. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена fixO.80. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the fixO gene.

81. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена fixP.81. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the fixP gene.

82. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 68, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена fixQ.82. A genetically engineered bacterium according to paragraph 68, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the fixQ gene.

83. Генетически сконструированная бактерия, содержащая модификацию в asnB.83. Genetically engineered bacterium containing a modification in asnB.

84. Генетически сконструированная бактерия, содержащая модификацию в гене, выбранном из группы, состоящей из asnB, asnA, glnL, уридилилтрансферазы, amtB и GDH.84. A genetically engineered bacterium containing a modification in a gene selected from the group consisting of asnB, asnA, glnL, uridylyltransferase, amtB and GDH.

85. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 84, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена asnB.85. A genetically engineered bacterium according to paragraph 84, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the asnB gene.

86. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 84, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена asnA.86. A genetically engineered bacterium according to paragraph 84, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the asnA gene.

87. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 84, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена glnL.87. A genetically engineered bacterium according to paragraph 84, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the glnL gene.

88. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 84, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена уридилилтрансферазы.88. A genetically engineered bacterium according to paragraph 84, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the uridylyl transferase gene.

89. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 84, где указанный генетический вариант приводит к изменению экспрессии гена GDH. 89. A genetically engineered bacterium according to paragraph 84, where the specified genetic variant leads to a change in the expression of the GDH gene.

90. Генетически сконструированная бактерия, содержащая модификацию в glnK, где указанная модификация выбрана из группы, состоящей из делеции всего гена, делеции по существу всего гена, делеции домена ACT, делеции более 50% домена ACT, инактивации домена ACT и инактивации домена UTase.90. A genetically engineered bacterium containing a modification in glnK, wherein said modification is selected from the group consisting of deletion of the entire gene, deletion of substantially the entire gene, deletion of the ACT domain, deletion of more than 50% of the ACT domain, inactivation of the ACT domain, and inactivation of the UTase domain.

91. Генетически сконструированная бактерия, содержащая модификацию в glnD, где указанная модификация выбрана из группы, состоящей из делеции всего гена, делеции по существу всего гена, делеции домена ACT, делеции более 50% домена ACT, инактивации домена ACT и инактивации домена UTase.91. A genetically engineered bacterium containing a modification in glnD, wherein said modification is selected from the group consisting of deletion of the entire gene, deletion of substantially the entire gene, deletion of the ACT domain, deletion of more than 50% of the ACT domain, inactivation of the ACT domain, and inactivation of the UTase domain.

92. Генетически сконструированная бактерия с улучшенной выживаемостью в ризосфере по сравнению с несконструированной бактерией того же вида, где указанная бактерия содержит генетическое изменение, приводящее к повышению экспрессии транспортера сахара.92. A genetically engineered bacterium with improved survival in the rhizosphere compared to a non-engineered bacterium of the same species, wherein the bacterium contains a genetic change resulting in increased expression of a sugar transporter.

93. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 92, где указанный транспортер сахара представляет собой dctA.93. The genetically engineered bacterium according to claim 92, wherein said sugar transporter is dctA.

94. Генетически сконструированная бактерия, содержащая генетическое изменение, приводящее к повышению экспрессии транспортера сахара.94. A genetically engineered bacterium that contains a genetic change that results in increased expression of a sugar transporter.

95. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 94, где указанный транспортера сахара представляет собой dctA.95. The genetically engineered bacterium according to claim 94, wherein said sugar transporter is dctA.

96. Генетически сконструированная бактерия с улучшенной выживаемостью в ризосфере по сравнению с несконструированной бактерией того же вида, где указанная бактерия содержит генетическое изменение, приводящее к изменению сигнализации о кворуме.96. A genetically engineered bacterium with improved survival in the rhizosphere compared to a non-engineered bacterium of the same species, where the bacterium contains a genetic change that results in altered quorum signaling.

97. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 96, где указанное генетическое изменение, приводящее к изменению сигнализации о кворуме, приводит к изменению гашения кворума.97. The genetically engineered bacterium of claim 96, wherein said genetic change resulting in a change in quorum signaling results in a change in quorum quenching.

98. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 96, где указанное генетическое изменение, приводящее к изменению сигнализации о кворуме, приводит к изменению экспрессии Y2-aiiA.98. The genetically engineered bacterium of claim 96, wherein said genetic change resulting in an alteration in quorum signaling results in an alteration in the expression of Y2-aiiA.

99. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 96, где указанное генетическое изменение, приводящее к изменению сигнализации о кворуме, приводит к изменению экспрессии ytnP.99. The genetically engineered bacterium of claim 96, wherein said genetic change resulting in an alteration in quorum signaling results in an alteration in the expression of ytnP.

100. Генетически сконструированная бактерия с улучшенной выживаемостью в ризосфере по сравнению с несконструированной бактерией того же вида, где указанная бактерия содержит генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням.100. A genetically engineered bacterium with improved survival in the rhizosphere compared to a non-engineered bacterium of the same species, where the bacterium contains a genetic change resulting in increased root attachment.

101. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящая к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению биосинтеза феназина.101. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in phenazine biosynthesis.

102. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению биосинтеза циклических липопептидов.102. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the biosynthesis of cyclic lipopeptides.

103. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии агглютининов.103. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of agglutinins.

104. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии fhaB.104. The genetically engineered bacterium of claim 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of fhaB.

105. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии fhaC.105. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of fhaC.

106. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии yjbE. 106. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of yjbE.

107. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии pssM.107. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of pssM.

108. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии генов acs.108. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of acs genes.

109. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии otsA.109. The genetically engineered bacterium of claim 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of otsA.

110. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии оперона, содержащего otsA.110. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of the otsA-containing operon.

111. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии treY.111. The genetically engineered bacterium of claim 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in altered expression of treY.

112. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 100, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению прикрепления к корням, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии оперона, содержащего treY.112. The genetically engineered bacterium of paragraph 100, wherein said genetic change resulting in increased root attachment includes a genetic change resulting in a change in the expression of the treY-containing operon.

113. Генетически сконструированная бактерия, содержащая генетическое изменение, приводящее к повышению образования биопленки.113. A genetically engineered bacterium containing a genetic change that results in increased biofilm formation.

114. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 113, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению образования биопленки, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии smZ.114. The genetically engineered bacterium of claim 113, wherein said genetic change resulting in increased biofilm formation includes a genetic change resulting in altered expression of smZ.

115. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 113, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению образования биопленки, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии lapA.115. The genetically engineered bacterium of claim 113, wherein said genetic change resulting in increased biofilm formation includes a genetic change resulting in altered expression of lapA.

116. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 113, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению образования биопленки, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии генов биосинтеза АГЛ.116. The genetically engineered bacterium of paragraph 113, wherein said genetic change resulting in increased biofilm formation includes a genetic change resulting in a change in the expression of AHL biosynthetic genes.

117. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 113, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению образования биопленки, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии phoB.117. The genetically engineered bacterium of claim 113, wherein said genetic change resulting in increased biofilm formation includes a genetic change resulting in altered expression of phoB.

118. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 113, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению образования биопленки, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии phoR.118. The genetically engineered bacterium of claim 113, wherein said genetic change resulting in increased biofilm formation includes a genetic change resulting in altered expression of phoR.

119. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 113, где указанное генетическое изменение, приводящее к повышению образования биопленки, включает генетическое изменение, приводящее к изменению экспрессии MucA.119. The genetically engineered bacterium of claim 113, wherein said genetic change that results in increased biofilm formation includes a genetic change that results in a change in the expression of MucA.

120. Генетически сконструированная бактерия с улучшенной выживаемостью в ризосфере по сравнению с несконструированной бактерией того же вида, где указанная бактерия содержит генетическое изменение, приводящее к повышению экспрессии фермента, разрушающего клеточную стенку.120. A genetically engineered bacterium with improved survival in the rhizosphere compared to a non-engineered bacterium of the same species, wherein the bacterium contains a genetic change resulting in increased expression of a cell wall degrading enzyme.

121. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 120, где указанный фермент, разрушающий клеточную стенку, включает полигалактуроназу.121. The genetically engineered bacterium according to paragraph 120, wherein said cell wall degrading enzyme includes polygalacturonase.

122. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 120, где указанный фермент, разрушающий клеточную стенку, включает целлюлазу.122. The genetically engineered bacterium according to paragraph 120, wherein said cell wall degrading enzyme includes cellulase.

123. Генетически сконструированная бактерия согласно пункту 120, где указанный фермент, разрушающий клеточную стенку, включает pehA. 123. The genetically engineered bacterium of claim 120, wherein said cell wall degrading enzyme includes pehA.

124. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, представляющая собой генетически сконструированную диазотрофную бактерию.124. A genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, which is a genetically engineered diazotrophic bacterium.

125. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия не является межродовой.125. A genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein said genetically engineered bacterium is not intergeneric.

126. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия является межродовой.126. A genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein said genetically engineered bacterium is intergeneric.

127. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия способна фиксировать атмосферный азот в присутствии экзогенного азота.127. A genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein said genetically engineered bacterium is capable of fixing atmospheric nitrogen in the presence of exogenous nitrogen.

128. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в генетической сети азотфиксации.128. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification in the nitrogen fixation genetic network.

129. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в NifA.129. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification in NifA.

130. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, приводящую к повышению экспрессии NifA.130. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification that results in increased expression of NifA.

131. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в NifL.131. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification in NifL.

132. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, приводящую к снижению экспрессии NifL.132. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification resulting in decreased expression of NifL.

133. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в NifH.133. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification in NifH.

134. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, приводящую к повышению экспрессии NifH.134. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification resulting in increased expression of NifH.

135. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, приводящую к повышению экспрессии кластера генов Nif.135. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification resulting in increased expression of the Nif gene cluster.

136. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в генетической сети ассимиляции азота.136. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification in the nitrogen assimilation genetic network.

137. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию в GlnE.137. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification in GlnE.

138. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, приводящую к снижению активности GlnE.138. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification resulting in decreased GlnE activity.

139. Генетически сконструированная бактерия согласно любому из положений 19-123, где указанная генетически сконструированная бактерия содержит модификацию, приводящую к снижению активности amtB. 139. The genetically engineered bacterium according to any one of provisions 19-123, wherein the genetically engineered bacterium contains a modification that results in reduced amtB activity.

140. Способ увеличения количества получаемого из атмосферы азота в растении, включающий приведение указанного растения в контакт с множеством указанных генетически сконструированных бактерий согласно любому из положений 19-139.140. A method of increasing the amount of atmospheric nitrogen in a plant, comprising bringing said plant into contact with a plurality of said genetically engineered bacteria according to any one of provisions 19-139.

141. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к семени указанного растения.141. The method according to paragraph 140, wherein said genetically engineered bacterium is applied to the seed of said plant.

142. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к проростку указанного растения.142. The method according to paragraph 140, wherein said genetically engineered bacterium is applied to a seedling of said plant.

143. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в составе жидкого препарата.143. The method according to paragraph 140, where the specified genetically engineered bacterium is applied to the specified plant in the composition of a liquid preparation.

144. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению после посадки, но до сбора урожая указанного растения.144. The method of claim 140, wherein said genetically engineered bacterium is applied to said plant after planting but before harvesting of said plant.

145. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в качестве подкормки.145. The method according to paragraph 140, where the specified genetically engineered bacterium is applied to the specified plant as a fertilizer.

146. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в период от одного месяца до восьми месяцев после прорастания.146. The method according to paragraph 140, wherein said genetically engineered bacterium is applied to said plant within a period of one month to eight months after germination.

147. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в период от двух месяцев до восьми месяцев после прорастания.147. The method according to paragraph 140, wherein said genetically engineered bacterium is applied to said plant within a period of two months to eight months after germination.

148. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в период от одного месяца до трех месяцев после прорастания.148. The method according to paragraph 140, wherein said genetically engineered bacterium is applied to said plant within a period of one month to three months after germination.

149. Способ согласно пункту 140, где указанную генетически сконструированную бактерию применяют к указанному растению в период от трех месяцев до шести месяцев после прорастания.149. The method according to paragraph 140, wherein said genetically engineered bacterium is applied to said plant within a period of three months to six months after germination.

150. Способ согласно пункту 140, где указанное растение представляет собой растение зерновой культуры.150. The method according to paragraph 140, wherein said plant is a cereal plant.

151. Способ согласно пункту 140, где указанное растение представляет собой растение кукурузы.151. The method according to paragraph 140, wherein said plant is a corn plant.

152. Способ согласно пункту 140, где указанное растение представляет собой растение риса.152. The method according to paragraph 140, wherein said plant is a rice plant.

153. Способ согласно пункту 140, где указанное растение представляет собой растение пшеницы.153. The method according to paragraph 140, wherein said plant is a wheat plant.

154. Способ согласно пункту 140, где указанное растение представляет собой растение сои. 154. The method according to paragraph 140, wherein said plant is a soybean plant.

155. Композиция, содержащая семя и покрытие семени, где указанное покрытие семени содержит множество указанных генетически сконструированных бактерий согласно любому из положений 19-39.155. A composition comprising a seed and a seed coating, wherein said seed coating contains a plurality of said genetically engineered bacteria according to any one of provisions 19-39.

156. Композиция согласно пункту 155, где указанное семя представляет собой семя зерновой культуры.156. The composition according to paragraph 155, wherein said seed is a cereal seed.

157. Композиция согласно пункту 155, где указанное семя выбрано из группы, состоящей из семени кукурузы, семени пшеницы, семени риса, семени сои, семени ржи и семени сорго.157. The composition of claim 155, wherein said seed is selected from the group consisting of corn seed, wheat seed, rice seed, soybean seed, rye seed and sorghum seed.

158. Композиция, содержащая растение и множество указанных генетически сконструированных бактерий согласно любому из положений 19-39.158. A composition comprising a plant and a plurality of said genetically engineered bacteria according to any one of provisions 19-39.

159. Композиция согласно пункту 158, где указанное растение представляет собой проросток.159. The composition according to paragraph 158, wherein said plant is a seedling.

160. Композиция согласно пункту 158, где указанное семя представляет собой семя зерновой культуры.160. The composition according to paragraph 158, wherein said seed is a cereal seed.

161. Композиция согласно пункту 158, где указанное семя выбрано из группы, состоящей из кукурузы, риса, пшеницы, сои, ржи и сорго.161. The composition of claim 158, wherein said seed is selected from the group consisting of corn, rice, wheat, soybean, rye and sorghum.

162. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности транспортера серы.162. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the activity of the sulfur transporter.

163. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена транспорта серы.163. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the sulfur transport gene.

164. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности транспортера молибдена. 164. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of the molybdenum transporter.

165. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена транспорта молибдена. 165. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the molybdenum transport gene.

166. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности транспортера железа. 166. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of the iron transporter.

167. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена транспорта железа. 167. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the iron transport gene.

168. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению биосинтеза сидерофоров. 168. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the biosynthesis of siderophores.

169. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, контролирующего биосинтез сидерофоров. 169. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene that controls the biosynthesis of siderophores.

170. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности поглотителя активных форм кислорода. 170. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a scavenger of reactive oxygen species.

171. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за поглощение активных форм кислорода. 171. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for the absorption of reactive oxygen species.

172. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка, участвующего в сигнализации о кворуме. 172. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a protein involved in quorum signaling.

173. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за сигнализацию о кворуме. 173. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for quorum signaling.

174. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности агглютининов.174. A method of increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the activity of agglutinins.

175. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии агглютининов. 175. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the expression of agglutinins.

176. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка, участвующего в образовании биопленки.176. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a protein involved in the formation of a biofilm.

177. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за образование биопленки. 177. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for the formation of biofilm.

178. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка биосинтеза АГЛ. 178. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of the AHL biosynthesis protein.

179. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена биосинтеза АГЛ. 179. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the AHL biosynthesis gene.

180. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности фермента, разрушающего клеточную стенку. 180. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of an enzyme that destroys the cell wall.

181. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена фермента, разрушающего клеточную стенку. 181. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene for an enzyme that destroys the cell wall.

182. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению генетической сети азотфиксации.182. A method for increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the genetic network of nitrogen fixation.

183. Способ повышения азотфиксации у микроорганизма, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению генетической сети ассимиляции азота. 183. A method of increasing nitrogen fixation in a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the genetic network of nitrogen assimilation.

184. Способ повышения азотфиксации микроорганизмом, включающий введение генетической модификации в ген из группы, состоящей из rpoE, rseA, cysP, cysZ, cysK, cysT, cysW, cysA, sbp, оперона cysZK, оперона cysPTWA, modE, modB, modA, оперона modEB, оперона modEBA, exbA, exbB, tonB, оперона exbAB, isyhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu, fur, glgA, NifA, nifH, nifD, nifK, grxA, grxB, grxC, grxD, trxA, trxC, tpx, оперона grxABCD, оперона cydABX, cydX из оперона cydAB, cydA, cyddB, glbN, fixNOPQ, fixN, fixO, foxP, fixQ, asnB, asnA, glnL, уридилилтрансферазы, amtB, glnK, GDH и glnD.184. A method for increasing nitrogen fixation by a microorganism, including introducing a genetic modification into a gene from the group consisting of rpoE, rseA, cysP, cysZ, cysK, cysT, cysW, cysA, sbp, cysZK operon, cysPTWA operon, modE, modB, modA, modEB operon , operon modEBA, exbA, exbB, tonB, operon exbAB, isyhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu, fur, glgA, NifA, nifH, nifD, nifK, grxA, grxB, grxC, grxD, trxA, trxC, tpx, operon grxABCD, cydABX operon, cydX from the cydAB operon, cydA, cyddB, glbN, fixNOPQ, fixN, fixO, foxP, fixQ, asnB, asnA, glnL, uridylyltransferase, amtB, glnK, GDH and glnD.

186. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности транспортера серы.186. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of the sulfur transporter.

187. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена транспорта серы.187. A method for increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the sulfur transport gene.

188. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности транспортера молибдена. 188. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of the molybdenum transporter.

189. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена транспорта молибдена. 189. A method for increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the molybdenum transport gene.

190. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности транспортера железа. 190. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of the iron transporter.

191. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена транспорта железа. 191. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the iron transport gene.

192. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению биосинтеза сидерофоров. 192. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the biosynthesis of siderophores.

193. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, контролирующего биосинтез сидерофоров. 193. A method for increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of a gene that controls the biosynthesis of siderophores.

194. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности поглотителя активных форм кислорода. 194. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a scavenger of reactive oxygen species.

195. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за поглощение активных форм кислорода. 195. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for the absorption of reactive oxygen species.

196. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка, участвующего в сигнализации о кворуме. 196. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a protein involved in quorum signaling.

197. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за сигнализацию о кворуме. 197. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for quorum signaling.

198. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности агглютининов. 198. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of agglutinins.

199. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии агглютининов. 199. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of agglutinins.

200. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка, участвующего в образовании биопленки. 200. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a protein involved in the formation of a biofilm.

201. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за образование биопленки. 201. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for the formation of biofilm.

202. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка биосинтеза АГЛ. 202. A method for increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of the AHL biosynthesis protein.

203. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена биосинтеза АГЛ. 203. A method for increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the AHL biosynthesis gene.

204. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности фермента, разрушающего клеточную стенку. 204. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of an enzyme that destroys the cell wall.

205. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена фермента, разрушающего клеточную стенку. 205. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene for an enzyme that destroys the cell wall.

206. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению генетической сети азотфиксации. 206. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the genetic network of nitrogen fixation.

207. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению генетической сети ассимиляции азота. 207. A method of increasing ammonium excretion by a microorganism, including the introduction of genetic modification leading to a change in the genetic network of nitrogen assimilation.

208. Способ повышения экскреции аммония микроорганизмом, включающий введение генетической модификации в ген из группы, состоящей из rpoE, rseA, cysP, cysZ, cysK, cysT, cysW, cysA, sbp, оперона cysZK, оперона cysPTWA, modE, modB, modA, оперона modEB, оперона modEBA, exbA, exbB, tonB, оперона exbAB, isyhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu, fur, glgA, NifA, nifH, nifD, nifK, grxA, grxB, grxC, grxD, trxA, trxC, tpx, оперона grxABCD, оперона cydABX, cydX из оперона cydAB, cydA, cyddB, glbN, fixNOPQ, fixN, fixO, foxP, fixQ, asnB, asnA, glnL, уридилилтрансферазы, amtB, glnK, GDH и glnD.208. A method for increasing ammonium excretion by a microorganism, including introducing a genetic modification into a gene from the group consisting of rpoE, rseA, cysP, cysZ, cysK, cysT, cysW, cysA, sbp, cysZK operon, cysPTWA operon, modE, modB, modA, operon modEB, modEBA operon, exbA, exbB, tonB, exbAB operon, isyhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu, fur, glgA, NifA, nifH, nifD, nifK, grxA, grxB, grxC, grxD, trxA, trxC, tpx, grxABCD operon, cydABX operon, cydX from the cydAB operon, cydA, cyddB, glbN, fixNOPQ, fixN, fixO, foxP, fixQ, asnB, asnA, glnL, uridylyltransferases, amtB, glnK, GDH and glnD.

209. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка, участвующего в прикреплении к корням. 209. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a protein involved in attachment to roots.

210. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена белка, участвующего в прикреплении к корням. 210. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of a protein gene involved in attachment to roots.

211. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности транспортера молибдена. 211. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the activity of the molybdenum transporter.

212. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена транспорта молибдена. 212. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the expression of the molybdenum transport gene.

213. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности транспортера железа. 213. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the activity of the iron transporter.

214. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена транспорта железа. 214. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the expression of the iron transport gene.

215. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению биосинтеза сидерофоров. 215. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the biosynthesis of siderophores.

216. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, контролирующего биосинтез сидерофоров. 216. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the expression of the gene that controls the biosynthesis of siderophores.

217. Способ повышения выживаемости микроорганизма в рихосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности поглотителя активных форм кислорода.217. A method of increasing the survival of a microorganism in the richosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the activity of the absorber of reactive oxygen species.

218. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за поглощение активных форм кислорода. 218. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for the absorption of reactive oxygen species.

219. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка, участвующего в сигнализации о кворуме. 219. A method for increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a protein involved in quorum signaling.

220. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за сигнализацию о кворуме.220. A method for increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for quorum signaling.

221. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности агглютининов. 221. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the activity of agglutinins.

222. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии агглютининов. 222. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the expression of agglutinins.

223. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка, участвующего в образовании биопленки.223. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of a protein involved in the formation of a biofilm.

224. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена, ответственного за образование биопленки. 224. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the expression of the gene responsible for the formation of biofilm.

225. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности белка биосинтеза АГЛ. 225. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the activity of the AHL biosynthesis protein.

226. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена биосинтеза АГЛ. 226. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the expression of the AHL biosynthesis gene.

227. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению активности фермента, разрушающего клеточную стенку. 227. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the activity of an enzyme that destroys the cell wall.

228. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению экспрессии гена фермента, разрушающего клеточную стенку. 228. A method for increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of a genetic modification leading to a change in the expression of the gene for an enzyme that destroys the cell wall.

229. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению генетической сети азотфиксации. 229. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the genetic network of nitrogen fixation.

230. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации, приводящей к изменению генетической сети ассимиляции азота. 230. A method of increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including the introduction of genetic modification leading to a change in the genetic network of nitrogen assimilation.

231. Способ повышения выживаемости микроорганизма в ризосфере, включающий введение генетической модификации в ген из группы, состоящей из fhaB, fhaC, yjbE, pssM, otsA, treY, smZ, lapA, phoB, phoR, MucA и pehA.231. A method for increasing the survival of a microorganism in the rhizosphere, including introducing a genetic modification into a gene from the group consisting of fhaB, fhaC, yjbE, pssM, otsA, treY, smZ, lapA, phoB, phoR, MucA and pehA.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> PIVOT BIO, INC.<110> PIVOT BIO, INC.

<120> ГЕНЫ-МИШЕНИ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА АЗОТФИКСАЦИЮ<120> TARGETED GENES FOR DIRECTED INFLUENCE ON NITROGEN FIXATION

ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВ РАСТЕНИЙ TO IMPROVE PLANT QUALITY

<130> 47736-715.601<130> 47736-715.601

<140> PCT/US18/57613<140> PCT/US18/57613

<141> 2018-10-25<141> 2018-10-25

<150> 62/577,149<150> 62/577.149

<151> 2017-10-25<151> 2017-10-25

<160> 2<160> 2

<170> PatentIn версии 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212>PRT

<213> Неизвестное<213> Unknown

<220><220>

<223> Описание неизвестного:<223> Description of the unknown:

Последовательность мотива белка семейства "LAGLIDADG"Sequence of the "LAGLIDADG" family protein motif

<400> 1<400> 1

Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp GlyLeu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly

1. 515

<210> 2<210> 2

<211> 90<211> 90

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> Description of artificial sequence: Synthetic

олигонуклеотид oligonucleotide

<400> 2<400> 2

gttgatcaga ccgatgttcg gaccttccaa ggtttcgatc ggacatacgc gaccgtagtg 60gttgatcaga ccgatgttcg gaccttccaa ggtttcgatc ggacatacgc gaccgtagtg 60

ggtcgggtgt acgtctcgaa cttcaaagcc 90ggtcgggtgt acgtctcgaa cttcaaagcc 90

<---<---

Claims (23)

1. Генетически сконструированная диазотрофная бактерия, способная увеличивать количество атмосферного азота в растении, имеющая повышенную экспрессию rpoN, причем экспрессия rpoN повышена путем делеции нативного промотора rpoN и замены конститутивным промотором.1. A genetically engineered diazotrophic bacterium capable of increasing the amount of atmospheric nitrogen in a plant, having increased expression of rpoN, and the expression of rpoN is increased by deletion of the native rpoN promoter and replacement with a constitutive promoter. 2. Генетически сконструированная диазотрофная бактерия по п.1, где указанная генетически сконструированная диазотрофная бактерия дополнительно содержит генетическую модификацию в glnD, где указанная генетическая модификация выбрана из группы, состоящей из: делеции всего гена, делеции по существу всего гена, делеции домена ACT, делеции более 50% домена ACT, инактивации домена ACT, снижения уридил-удаляющей активности glnD по сравнению с бактерией дикого типа, удаления уридил-удаляющей активности glnD и инактивации домена Utase.2. The genetically engineered diazotrophic bacterium according to claim 1, wherein said genetically engineered diazotrophic bacterium further comprises a genetic modification in glnD, wherein said genetic modification is selected from the group consisting of: a deletion of the entire gene, a deletion of substantially the entire gene, a deletion of the ACT domain, a deletion more than 50% of the ACT domain, inactivation of the ACT domain, reduction of the uridyl scavenging activity of glnD compared to the wild type bacterium, removal of the uridyl scavenging activity of glnD and inactivation of the Utase domain. 3. Генетически сконструированная диазотрофная бактерия по п.2, где указанная генетическая модификация в glnD включает делецию домена ACT, делецию более 50% домена ACT или инактивацию домена ACT.3. The genetically engineered diazotrophic bacterium of claim 2, wherein said genetic modification to glnD includes deletion of the ACT domain, deletion of more than 50% of the ACT domain, or inactivation of the ACT domain. 4. Генетически сконструированная диазотрофная бактерия по любому из пп. 1-3, где указанная генетически сконструированная диазотрофная бактерия является межродовой.4. Genetically engineered diazotrophic bacterium according to any one of paragraphs. 1-3, wherein said genetically engineered diazotrophic bacterium is intergeneric. 5. Генетически сконструированная диазотрофная бактерия по любому из пп. 1-3, где указанная генетически сконструированная диазотрофная бактерия дополнительно содержит модификацию в генетической сети азотфиксации или модификацию в генетической сети ассимиляции азота.5. Genetically engineered diazotrophic bacterium according to any one of paragraphs. 1-3, wherein said genetically engineered diazotrophic bacterium further comprises a modification in the nitrogen fixation genetic network or a modification in the nitrogen assimilation genetic network. 6. Генетически сконструированная диазотрофная бактерия по любому из пп. 1-3, где указанная генетически сконструированная диазотрофная бактерия дополнительно содержит генетическую модификацию, приводящую к повышенной экспрессии NifA, генетическую модификацию, которая приводит к сниженной экспрессии NifL, генетическую модификацию, которая приводит к повышенной экспрессии NifH, генетическую модификацию, которая приводит к сниженной активности GlnE или генетическую модификацию, приводящую к сниженной активности AmtB. 6. Genetically engineered diazotrophic bacterium according to any one of paragraphs. 1-3, wherein said genetically engineered diazotrophic bacterium further comprises a genetic modification that results in increased expression of NifA, a genetic modification that results in decreased expression of NifL, a genetic modification that results in increased expression of NifH, a genetic modification that results in decreased GlnE activity or a genetic modification that results in decreased AmtB activity. 7. Генетически сконструированная диазотрофная бактерия по любому из пп. 1-3, где указанная генетически сконструированная диазотрофная бактерия дополнительно содержит:7. Genetically engineered diazotrophic bacterium according to any one of paragraphs. 1-3, where said genetically engineered diazotrophic bacterium additionally contains: генетическая модификация, которая приводит к повышенной экспрессии NifA; иa genetic modification that results in increased expression of NifA; And генетическую модификацию, которая приводит к сниженной экспрессии NifL.a genetic modification that results in decreased expression of NifL. 8. Способ увеличения количества получаемого из атмосферы азота в растении, включающий приведение указанного растения в контакт с множеством указанных генетически сконструированных диазотрофных бактерий по любому из пп. 1-7.8. A method for increasing the amount of nitrogen obtained from the atmosphere in a plant, comprising bringing said plant into contact with a plurality of said genetically engineered diazotrophic bacteria according to any one of claims. 1-7. 9. Способ по п.8, где указанную генетически сконструированную диазотрофную бактерию применяют к семени указанного растения, проростку указанного растения, растению после посадки, но до сбора урожая указанного растения или растению в качестве подкормки.9. The method of claim 8, wherein said genetically engineered diazotrophic bacterium is applied to a seed of said plant, a seedling of said plant, a plant after planting but before harvesting of said plant, or the plant as a top dressing. 10. Способ по п.8, где указанную генетически сконструированную диазотрофную бактерию применяют к указанному растению в качестве жидкого препарата или применяют в период от одного месяца до восьми месяцев, в период от двух месяцев до восьми месяцев, в период от одного месяца до трех месяцев, или в период от трех месяцев до шести месяцев после прорастания.10. The method according to claim 8, where the specified genetically engineered diazotrophic bacterium is applied to the specified plant as a liquid preparation or is applied in a period from one month to eight months, in a period from two months to eight months, in a period from one month to three months , or in the period from three months to six months after germination. 11. Способ по п.8, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из: растения зерновой культуры, растения кукурузы, растения риса, растения пшеницы или растения сои. 11. The method of claim 8, wherein said plant is selected from the group consisting of: a cereal plant, a corn plant, a rice plant, a wheat plant or a soybean plant. 12. Композиция для нанесения на семя, где композиция содержит множество указанных генетически сконструированных диазотрофных бактерий по любому из пп. 1-7.12. A composition for application to a seed, where the composition contains a plurality of the specified genetically engineered diazotrophic bacteria according to any one of paragraphs. 1-7. 13. Композиция по п.12, где указанное семя представляет собой семя зерновой культуры, семя кукурузы, семя пшеницы, семя риса, семя сои, семя ржи или семя сорго.13. The composition of claim 12, wherein said seed is a cereal seed, a corn seed, a wheat seed, a rice seed, a soybean seed, a rye seed, or a sorghum seed. 14. Композиция для нанесения на растение, где композиция содержит множество указанных генетически сконструированных диазотрофных бактерий по любому из пп. 1-7, необязательно, где указанное растение представляет собой растение зерновой культуры, растение кукурузы, растение риса, растения пшеницы, растения сои, растения ржи или растения сорго.14. A composition for application to a plant, where the composition contains a plurality of the specified genetically engineered diazotrophic bacteria according to any one of paragraphs. 1-7, optionally, wherein said plant is a cereal plant, a corn plant, a rice plant, a wheat plant, a soybean plant, a rye plant, or a sorghum plant. 15. Композиция по п.14, где указанное растение представляет собой проросток.15. The composition according to claim 14, wherein said plant is a seedling. 16. Семя для получения растения, имеющего увеличенное количество атмосферного азота, где указанное семя покрыто композицией по п.12.16. A seed for producing a plant having an increased amount of atmospheric nitrogen, wherein said seed is coated with the composition of claim 12. 17. Семя по п.16, отличающееся тем, что указанное семя представляет собой семя зерновой культуры, кукурузы, пшеницы, риса, сои, ржи или сорго.17. The seed according to claim 16, characterized in that said seed is a seed of a cereal crop, corn, wheat, rice, soybean, rye or sorghum. 18. Растение с увеличенным количеством атмосферного азота, содержащее множество генетически сконструированных диазотрофных бактерий по любому из пп.1-7.18. A plant with an increased amount of atmospheric nitrogen, containing a variety of genetically engineered diazotrophic bacteria according to any one of claims 1-7. 19. Растение, имеющее увеличенное количество атмосферного азота, где указанное растение покрыто композицией по п.14.19. A plant having an increased amount of atmospheric nitrogen, wherein said plant is coated with the composition of claim 14. 20. Растение по п.18 или 19, где указанное растение представляет собой всход.20. The plant according to claim 18 or 19, wherein said plant is a shoot. 21. Растение по любому из пп.18-20, где указанное растение представляет собой растение зерновой культуры, растение кукурузы, растение риса, растение пшеницы, растение сои, растение ржи или растение сорго.21. The plant according to any one of claims 18 to 20, wherein said plant is a cereal plant, a corn plant, a rice plant, a wheat plant, a soybean plant, a rye plant or a sorghum plant.

Images