RU2804953C2 - Vector based on adeno-associated virus for therapeutic delivery to central nervous system - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method of enhancing neurocognitive function in a mammal having a lysosomal storage disease is described, comprising: intrathecal administration to the mammal of a composition containing an amount of recombinant adeno-associated virus (rAAV) containing an open reading frame encoding alpha-L-iduronidase or iduronate-2-sulfatase effective to enhance neurocognitive function in a mammal compared to a mammal having a lysosomal storage disease that has not been administered rAAV, wherein the rAAV has capsid rAAV9 or rAAVrh10.

EFFECT: invention expands the arsenal of means for enhancing neurocognitive function in a mammal.

21 cl, 42 dwg, 8 ex

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявкиCross references to related applications

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/162174, поданной 15 мая 2015 года, с серийным номером 62/252055, поданной 6 ноября 2015 года, с серийным номером 62/301980, поданной 1 марта 2016 года и с серийным номером 62/331156, поданной 3 мая 2016 года, раскрытие каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.This application claims benefit from US Provisional Patent Application Serial No. 62/162174, filed May 15, 2015, Serial No. 62/252055, filed November 6, 2015, Serial No. 62/301980, filed March 1, 2016, and Serial No. 62/331156, filed May 3, 2016, the disclosures of each of which are incorporated herein by reference.

Заявление по вопросу прав ПравительстваStatement on the Rights of the Government

Данное изобретение было сделано при поддержке правительства в рамках грантов Национального института здоровья HD032652 и DK094538. Правительство имеет определенные права на изобретение.This invention was made with government support under National Institutes of Health grants HD032652 and DK094538. The government has certain rights to an invention.

Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for creating the invention

Мукополисахаридозы (MPS) представляют собой группу из 11 болезней накопления, обусловленных нарушениями катаболизма гликозаминогликанов (GAG), что приводит к их накоплению в лизосомах (Muenzer, 2004; Munoz-Rojas et al., 2008). Манифестации различной степени тяжести включают органомегалию, дисплазию скелета, сердечную и легочную обструкцию и неврологическое ухудшение. Для мукополисахаридоза MPS I, характеризующегося дефицитом идуронидазы (IDUA), степень тяжести изменяется от слабой (синдром Шейе) до умеренной (Гурлер-Шейе) и до тяжелой (синдром Гурлер), при этом тяжелая форма приводит к неврологическому дефициту и смерти в возрасте до 15 лет (Muenzer, 2004; Munoz-Rojas et al., 2008). Существующие методы лечения MPS по большей части являются паллиативными. Однако для некоторых заболеваний MPS, включая синдром Гурлер, аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) показала эффективность (Krivit, 2004; Orchard et al., 2007; Peters et al., 2003). К тому же, ферментная заместительная терапия (ERT) становится доступной для все большего числа заболеваний MPS (Brady, 2006). Как правило, HSCT и ERT обеспечивают очистку материалов накопления и улучшение периферических состояний, хотя некоторые проблемы сохраняются после лечения (скелетные, сердечные, помутнение роговицы). Основной проблемой этих клеточных и ферментных терапий является отсутствие эффективности в отношении неврологических манифестаций, так как периферически вводимый фермент не проникает через гематоэнцефалический барьер, и было обнаружено, что HSCT является полезной для некоторых, но не для всех заболеваний MPS.Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of 11 storage diseases caused by defects in glycosaminoglycan (GAG) catabolism, resulting in their accumulation in lysosomes (Muenzer, 2004; Munoz-Rojas et al., 2008). Manifestations of varying severity include organomegaly, skeletal dysplasia, cardiac and pulmonary obstruction, and neurological deterioration. For mucopolysaccharidosis MPS I, characterized by iduronidase deficiency (IDUA), the severity ranges from mild (Scheie syndrome) to moderate (Hurler-Scheie syndrome) to severe (Hurler syndrome), with the severe form leading to neurological deficits and death before age 15 years (Muenzer, 2004; Munoz-Rojas et al., 2008). Current treatments for MPS are largely palliative. However, for some MPS diseases, including Hurler syndrome, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has shown efficacy (Krivit, 2004; Orchard et al., 2007; Peters et al., 2003). In addition, enzyme replacement therapy (ERT) is becoming available for an increasing number of MPS diseases (Brady, 2006). Generally, HSCT and ERT provide clearance of accumulation materials and improvement of peripheral conditions, although some problems persist after treatment (skeletal, cardiac, corneal opacities). The main problem with these cell and enzyme therapies is the lack of efficacy against neurological manifestations since the peripherally administered enzyme does not cross the blood-brain barrier, and HSCT has been found to be beneficial for some but not all MPS diseases.

Мукополисахаридоз I типа (MPS I) является одним из наиболее широко изученных заболеваний MPS для разработки клеточных и молекулярных методов лечения. Эффективность аллогенной HSCT, скорее всего, является результатом метаболической кросс-коррекции, в результате которой отсутствующий фермент высвобождается из клеток, полученных от доноров, а затем поглощается клетками-хозяевами и переносится в лизосомы, где фермент способствует лизосомному метаболизму (Fratantoni et al., 1968). Очистка материалов накопления GAG последовательно наблюдается в периферических органах, таких как печень и селезенка, происходит облегчение сердечно-легочной обструкции и улучшение помутнения роговицы (Orchard et al., 2007). Особенно важным является эффект аллогенной трансплантации стволовых клеток на возникновение неврологических манифестаций в заболеваниях MPS. В этой связи, для нескольких заболеваний MPS имеется подтверждение того, что индивидуумы, подвергнутые аллогенной трансплантации стволовых клеток, показали улучшенный результат по сравнению с пациентами, не подвергнутыми трансплантации (Bjoraker et al., 2006; Krivit, 2004; Orchard et al., 2007; Peters et al., 2003). Главная гипотеза, объясняющая неврологическую пользу аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, состоит в проникновении донорских гемопоэтических клеток (наиболее вероятно микроглии) (Hess et al., 2004; Unger et al., 1993) в центральную нервную систему, где отсутствующий фермент экспрессируется приживленными клетками, после чего диффундирует в ткани CNS и участвует в очистке материалов накопления. Таким образом, уровень фермента, поступающего в ткани CNS, ограничивается таким количеством, которое экспрессируется и высвобождается из донорских клеток, приживленных в головном мозге. Хотя такое приживление является полезным для MPS I, реципиенты, тем не менее, продолжают демонстрировать IQ ниже нормального и нарушенную нейрокогнитивную способность (Ziegler and Shapiro, 2007).Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is one of the most widely studied MPS diseases for the development of cellular and molecular therapies. The effectiveness of allogeneic HSCT most likely results from metabolic cross-correction, whereby the missing enzyme is released from donor cells and then taken up by host cells and transferred to lysosomes, where the enzyme contributes to lysosomal metabolism (Fratantoni et al., 1968 ). Clearance of GAG accumulation materials is consistently observed in peripheral organs such as the liver and spleen, with relief of cardiopulmonary obstruction and improvement of corneal opacity (Orchard et al., 2007). Particularly important is the effect of allogeneic stem cell transplantation on the occurrence of neurological manifestations in MPS diseases. In this regard, for several MPS diseases there is evidence that individuals who received allogeneic stem cell transplantation showed improved outcome compared with patients who did not undergo transplantation (Bjoraker et al., 2006; Krivit, 2004; Orchard et al., 2007 ;Peters et al., 2003). The main hypothesis explaining the neurological benefit of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the penetration of donor hematopoietic cells (most likely microglia) (Hess et al., 2004; Unger et al., 1993) into the central nervous system, where the missing enzyme is expressed by engrafted cells, after which it diffuses into the CNS tissue and participates in the clearance of accumulation materials. Thus, the level of enzyme supplied to CNS tissue is limited to that expressed and released from donor cells engrafted in the brain. Although such engraftment is beneficial for MPS I, recipients nevertheless continue to demonstrate subnormal IQ and impaired neurocognitive ability (Ziegler and Shapiro, 2007).

Явление метаболической кросс-коррекции также объясняет эффективность ERT для нескольких лизосомных болезней накопления (Brady, 2006), в первую очередь, MPS I. Однако эффективность ферментной терапии в отношении неврологических манифестаций лизосомной болезни накопления (LSD) не наблюдалась из-за необходимости проникновения через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) фермента, отсутствующего в конкретной лизосомной болезни накопления (LSD), для эффективного достижения CNS (Brady, 2006). Ферменты почти всегда имеют слишком большой размер и обычно слишком заряжены для эффективного пересечения ВВВ. Это послужило толчком для изучения инвазивного интратекального введения фермента (Dickson et al., 2007), эффективность которого была продемонстрирована на собачьей модели MPS I (Kakkis et al., 2004) и начались клинические исследования с участием людей с MPS I (Pastores, 2008; Munoz-Rojas et al., 2008). К числу основных недостатков ферментной терапии относятся высокие затраты (>200000 долл. США в год) и необходимость повторных вливаний рекомбинантного белка. Проводимые в настоящее время клинические исследования интратекального введения IDUA предусматривают введение фермента только раз в три месяца, поэтому эффективность этого режима дозирования остается неопределенной.The phenomenon of metabolic cross-correction also explains the effectiveness of ERT for several lysosomal storage diseases (Brady, 2006), most notably MPS I. However, the effectiveness of enzyme therapy against neurological manifestations of lysosomal storage disease (LSD) has not been observed due to the requirement for blood-brain penetration. barrier (BBV) of an enzyme missing in a specific lysosomal storage disease (LSD) to effectively reach the CNS (Brady, 2006). Enzymes are almost always too large and usually too charged to effectively cross the BBB. This prompted the study of invasive intrathecal enzyme administration (Dickson et al., 2007), the effectiveness of which was demonstrated in a canine model of MPS I (Kakkis et al., 2004) and clinical trials began in humans with MPS I (Pastores, 2008; Munoz-Rojas et al., 2008). Major disadvantages of enzyme therapy include high costs (>$200,000 per year) and the need for repeated infusions of recombinant protein. Current clinical studies of intrathecal IDUA involve administration of the enzyme only once every three months, so the effectiveness of this dosing regimen remains uncertain.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Векторы AAV, используемые в способах согласно изобретению, являются полезными для доставки генов в CNS. В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает интраназальную доставку в CNS терапевтических белков посредством AAV, например, для предупреждения, ингибирования или лечения нейрокогнитивной дисфункции или неврологического заболевания. Как описано здесь, интраназальная доставка вектора приводит к трансдукции переднего мозга (обонятельной луковицы) и экспрессии терапевтического белка. Белок диффундирует во все области головного мозга. Таким образом, использование интраназальной доставки векторов AAV для экспрессии, например, секретируемого белка, позволяет осуществлять лечение многих различных неврологических нарушений, например, MPS I, MPS II, MPS III, других метаболических заболеваний, включая болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера, и т.п. Например, анализ экстрактов из всех подвергнутых микродиссекции отделов головного мозга показал широкое распределение по всему головному мозгу альфа-L-идуронидазы, доставляемой посредством rAAV.AAV vectors used in the methods of the invention are useful for delivering genes to the CNS. In one embodiment, the invention provides intranasal delivery of therapeutic proteins to the CNS via AAV, for example, to prevent, inhibit or treat neurocognitive dysfunction or neurological disease. As described here, intranasal delivery of the vector results in forebrain (olfactory bulb) transduction and expression of the therapeutic protein. The protein diffuses into all areas of the brain. Thus, the use of intranasal delivery of AAV vectors to express, for example, a secreted protein allows for the treatment of many different neurological disorders, for example, MPS I, MPS II, MPS III, other metabolic diseases including Parkinson's disease and Alzheimer's disease, etc. . For example, analysis of extracts from all microdissected brain regions showed a widespread distribution of alpha-L-iduronidase delivered by rAAV throughout the brain.

В одном варианте осуществления rAAV доставляют млекопитающему интратекально (IT), эндоваскулярно (IV), церебровентрикулярно (ICV) или интраназально (IN) для предупреждения, ингибирования или лечения нейрокогнитивной дисфункции или неврологического заболевания. В одном варианте осуществления интраназальное введение приводит к неинвазивному прямому введению в CNS с метаболической кросс-коррекцией. В одном варианте осуществления млекопитающее подвергают иммуносупрессии. В одном варианте осуществления млекопитающего подвергают индукции иммунологической толерантности.In one embodiment, rAAV is delivered to a mammal intrathecally (IT), endovascularly (IV), cerebroventricularly (ICV), or intranasally (IN) to prevent, inhibit, or treat neurocognitive dysfunction or neurological disease. In one embodiment, intranasal administration results in non-invasive direct administration into the CNS with metabolic cross-correction. In one embodiment, the mammal is immunosuppressed. In one embodiment, the mammal is subjected to immunotolerance induction.

В одном варианте осуществления заболевание, подлежащее предупреждению, ингибированию или лечению с помощью конкретного гена, включает, но без ограничения, MPS I (IDUA), MPS II (IDS), MPS ΠΙΑ (renapaH-N-сульфатаза; сульфамидаза), MPS ШВ (альфа-М-ацетил-глюкозаминидаза), MPS ШС (ацетил-СоА: альфа-М-глюкозаминид-ацетилтрансфераза), MPS HID (N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза), MPS VII (бета-глюкуронидаза), болезнь Гоше (кислая бета-гликозидаза), альфа-маннозидоз (альфа-маннозидаза), бета-маннозидоз (бета-маннозидаза), альфа-фукозидоз (альфа-фукозидаза), сиалидоз (альфа-сиалидаза), галактосиалидоз (катепсин А), аспартилглюкозаминурия (аспартилглюкозаминидаза), GMl-ганглиозидоз (бета-галактозидаза), болезнь Тея-Сакса (альфа-субъединица бета-гексозаминидазы), синдром Сандхоффа (бета-субъединица бета-гексозаминидазы), ОМ2-ганглиозидоз/вариант АВ (белок-активатор GM2), болезнь Краббе (галактоцереброзидаза), метахроматическая лейкодистрофия (арилсульфатаза А) и другие неврологические нарушения, включая, но без ограничения, болезнь Альцгеймера (экспрессия антитела, такого как антитело к бета-амилоиду, или фермент, который атакует бляшки и фибриллы, связанные с болезнью Альцгеймера), или болезни Альцгеймера и Паркинсона (экспрессия нейропротекторных белков, включая, но без ограничения, GDNF или нейротурин).In one embodiment, the disease to be prevented, inhibited or treated by a particular gene includes, but is not limited to, MPS I (IDUA), MPS II (IDS), MPS ΠΙΑ (renapaH-N-sulfatase; sulfamidase), MPS SW ( alpha-M-acetyl-glucosaminidase), MPS SHS (acetyl-CoA: alpha-M-glucosaminid acetyltransferase), MPS HID (N-acetylglucosamine-6-sulfatase), MPS VII (beta-glucuronidase), Gaucher disease (acid beta -glycosidase), alpha-mannosidosis (alpha-mannosidase), beta-mannosidosis (beta-mannosidase), alpha-fucosidosis (alpha-fucosidase), sialidosis (alpha-sialidase), galactosialidosis (cathepsin A), aspartylglucosaminuria (aspartylglucosaminidase), GMl -gangliosidosis (beta-galactosidase), Tay-Sachs disease (beta-hexosaminidase alpha subunit), Sandhoff syndrome (beta-hexosaminidase beta subunit), OM2 gangliosidosis/AB variant (GM2 activator protein), Krabbe disease (galactocerebrosidase) , metachromatic leukodystrophy (arylsulfatase A) and other neurological disorders, including, but not limited to, Alzheimer's disease (expression of an antibody such as amyloid beta antibody, or an enzyme that attacks plaques and fibrils associated with Alzheimer's disease), or Alzheimer's disease and Parkinson's (expression of neuroprotective proteins including, but not limited to, GDNF or neuroturin).

Таким образом, описаны способы предупреждения, ингибирования и/или лечения, например, одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием центральной нервной системы (CNS), у млекопитающего, нуждающегося в этом. Способы включают доставку в CNS млекопитающего, нуждающегося в лечении, композиции, содержащей эффективное количество рекомбинантного вектора на основе аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, например, продукт терапевтического гена. Целевые генные продукты, которые могут быть кодированы вектором rAAV, включают, но без ограничения, альфа-L-идуронидазу, идуронат-2-сульфатазу, гепарансульфат-сульфатазу, N-ацетил-альфа-О-глюкозаминидазу, бета-гексозаминидазу, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, бета-глюкуронидазу или глюкоцереброзидазу, а также те, которые описаны выше. Заболевания, которые можно предупредить, ингибировать или лечить с использованием описанных здесь способов, включают, но без ограничения, нарушение мукополисахаридоз I типа, нарушение мукополисахаридоз II типа или нарушение мукополисахаридоз VII типа, а также нарушения, указанные выше. Вектор AAV может быть введен различными способами для того, чтобы гарантировать его доставку в CNS/головной мозг и успешную трансдукцию трансгена в CNS/головном мозге субъекта. Пути доставки в CNS/головной мозг включают, но без ограничения, интратекальное введение, интракраниальное введение, например, интрацеребровентрикулярное введение или латеральное церебровентрикулярное введение, интраназальное введение, эндоваскулярное введение и интрапаренхимальное введение.Thus, methods are described for preventing, inhibiting and/or treating, for example, one or more symptoms associated with a central nervous system (CNS) disease in a mammal in need thereof. The methods include delivering to the CNS of a mammal in need of treatment a composition containing an effective amount of a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector containing an open reading frame encoding a gene product, such as a therapeutic gene product. Target gene products that may be encoded by the rAAV vector include, but are not limited to, alpha-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, heparan sulfate sulfatase, N-acetyl-alpha-O-glucosaminidase, beta-hexosaminidase, alpha-galactosidase , beta-galactosidase, beta-glucuronidase or glucocerebrosidase, as well as those described above. Diseases that can be prevented, inhibited or treated using the methods described herein include, but are not limited to, mucopolysaccharidosis disorder type I, mucopolysaccharidosis disorder type II or mucopolysaccharidosis disorder type VII, as well as the disorders listed above. The AAV vector can be administered in a variety of ways to ensure its delivery to the CNS/brain and successful transduction of the transgene in the subject's CNS/brain. Routes of delivery to the CNS/brain include, but are not limited to, intrathecal administration, intracranial administration, such as intracerebroventricular administration or lateral cerebroventricular administration, intranasal administration, endovascular administration, and intraparenchymal administration.

В одном варианте осуществления способы включают доставку в CNS взрослого млекопитающего, нуждающегося в лечении, композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV серотипа 9 (rAAV9), содержащего открытую рамку считывания, кодирующую ген. В одном варианте осуществления способы включают доставку в CNS взрослого млекопитающего, нуждающегося в лечении, композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV9, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую IDUA. Эти способы отчасти основаны на открытии того, что вектор AAV9 может эффективно трансдуцировать терапевтический трансген в головной мозг/CNS взрослых субъектов, восстанавливая уровни фермента до уровней, наблюдаемых у животных дикого типа (см. ниже фигуру 15). Результаты, полученные с использованием AAV9, являются неожиданными, принимая во внимание предыдущую работу, в которой было продемонстрировано, что интраваскулярная доставка AAV9 взрослым мышам не достигает широкого прямого нацеливания на нейроны (см. Foust et al., 2009), а также дополнительные данные, свидетельствующие о том, что прямая инъекция AAV8-IDUA в CNS взрослых ШиА-дефицитных мышей приводит к слабой экспрессии трансгена (фигура 18). В примерах, описанных в настоящем документе, использована доклиническая модель для лечения MPS1, наследственного метаболического нарушения, обусловленного дефицитом лизосомного фермента альфа-L-идуронидазы (IDUA). В этих примерах продемонстрировано, что непосредственное применение AAV9-IDUA в CNS иммунокомпетентных взрослых Ши А-дефицитных мышей приводит к экспрессии и активности фермента IDUA, которые являются такими же или более высокими, чем экспрессия и активность фермента IDUA у взрослых мышей дикого типа (см. ниже фигуру 15).In one embodiment, the methods include delivering to the CNS of an adult mammal in need of treatment a composition comprising an effective amount of an rAAV serotype 9 (rAAV9) vector containing an open reading frame encoding the gene. In one embodiment, the methods include delivering to the CNS of an adult mammal in need of treatment a composition comprising an effective amount of an rAAV9 vector containing an open reading frame encoding IDUA. These methods are based in part on the discovery that the AAV9 vector can effectively transduce a therapeutic transgene into the brain/CNS of adult subjects, restoring enzyme levels to those observed in wild-type animals (see Figure 15 below). The results obtained using AAV9 are surprising given previous work demonstrating that intravascular delivery of AAV9 to adult mice did not achieve broad direct neuronal targeting (see Foust et al., 2009) and additional data indicating that direct injection of AAV8-IDUA into the CNS of adult ShiA-deficient mice results in weak transgene expression (Figure 18). The examples described herein utilize a preclinical model for the treatment of MPS1, an inherited metabolic disorder caused by deficiency of the lysosomal enzyme alpha-L-iduronidase (IDUA). These examples demonstrate that direct application of AAV9-IDUA to the CNS of immunocompetent adult Shi A-deficient mice results in IDUA enzyme expression and activity that is the same as or greater than IDUA enzyme expression and activity in adult wild-type mice (see below figure 15).

В дополнительном варианте осуществления изобретения в примерах также продемонстрировано, что совместная терапия для индукции иммуносупрессии или иммунологической толерантности, или лечение иммунодефицитных животных может обеспечивать даже более высокие уровни экспрессии и активности фермента IDUA. В одном варианте осуществления пациентов с генотипами, которые стимулируют иммунный ответ, нейтрализующий активность фермента (см., например, Barbier et al., 2013), подвергают лечению иммуносупрессантом в дополнение к вектору rAAV, содержащему открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, такой как как IDUA.In a further embodiment, the Examples also demonstrate that concomitant therapy to induce immunosuppression or immunological tolerance, or treatment of immunodeficient animals, can provide even higher levels of IDUA enzyme expression and activity. In one embodiment, patients with genotypes that stimulate an immune response that neutralizes enzyme activity (see, e.g., Barbier et al., 2013) are treated with an immunosuppressant in addition to an rAAV vector containing an open reading frame encoding a gene product, such as like IDUA.

Новорожденные IDUA"" мыши являются иммунологически интактными. Введение AAV8-IDUA новорожденным IDUA"'" мышам привело к экспрессии IDUA (Wolf et al., 2011), таким образом, вызывая у животных толерантность к IDUA. Как описано здесь, применимость AAV-опосредованного переноса генов у взрослых (иммунокомпетентных) мышей путем прямой инфузии AAV в центральную нервную систему была продемонстрирована с использованием различных путей введения. Например, AAV9-IDUA вводили путем прямой инъекции в боковые желудочки взрослых IDAA-дефицитных мышей, которые были либо иммунокомпетентными, иммунодефицитными (NODSCID/IDUA-/-), подвергнутыми иммуносупрессии циклофосфамидом (CP), либо подвергнутыми индукции иммунологической толерантности путем еженедельной инъекции человеческого белка идуронидазы (Альдуразим), начиная с рождения. Подвергнутым иммуносупрессии циклофосфамидом (CP) животным также вводили AAV9-IDUA путем интраназальной инфузии, путем интратекальной инъекции и путем эндоваскулярной инфузии с маннитом для разрушения гематоэнцефалического барьера и без него. Животных умерщвляли через 8 недель после введения вектора, и головной мозг извлекали и подвергали микродессекции для оценки активности фермента IDUA, гликозаминогликанов ткани и векторных последовательностей IDUA по сравнению с нормальными и пораженными контрольными мышами. Результаты этих исследований показали, что могут быть использованы различные способы введения AAV-вектора непосредственно в CNS, например, для достижения более высоких уровней доставки белка и/или активности фермента в CNS. Кроме того, несмотря на то, что головной мозг является иммунологически привилегированной областью, введение иммуносупрессанта или индукция иммунологической толерантности может повысить активность в головном мозге после введения AAV. Более высокие уровни экспрессии на введение и/или менее инвазивные пути введения клинически являются более приемлемыми для пациентов.Newborn IDUA"" mice are immunologically intact. Administration of AAV8-IDUA to neonatal IDUA"'" mice resulted in the expression of IDUA (Wolf et al., 2011), thereby inducing tolerance to IDUA in the animals. As described here, the utility of AAV-mediated gene transfer in adult (immunocompetent) mice by direct infusion of AAV into the central nervous system has been demonstrated using various routes of administration. For example, AAV9-IDUA was administered by direct injection into the lateral ventricles of adult IDAA-deficient mice that were either immunocompetent, immunodeficient (NODSCID/IDUA-/-), immunosuppressed with cyclophosphamide (CP), or subjected to immunotolerance induction by weekly injection of human protein iduronidase (Aldurazym), starting at birth. Cyclophosphamide (CP) immunosuppressed animals were also administered AAV9-IDUA by intranasal infusion, by intrathecal injection, and by endovascular infusion with and without mannitol to disrupt the blood-brain barrier. Animals were sacrificed 8 weeks after vector administration, and brains were removed and microdissected to assess IDUA enzyme activity, tissue glycosaminoglycans, and IDUA vector sequences compared to normal and lesioned control mice. The results of these studies indicated that various methods of administering the AAV vector directly to the CNS could be used, for example, to achieve higher levels of protein delivery and/or enzyme activity to the CNS. Additionally, although the brain is an immunologically privileged region, administration of an immunosuppressant or induction of immunological tolerance may increase activity in the brain following AAV administration. Higher expression levels per administration and/or less invasive routes of administration are clinically more acceptable to patients.

Таким образом, изобретение включает применение рекомбинантных векторов AAV (rAAV), которые кодируют генный продукт, обладающий терапевтическими эффектами при экспрессии в CNS млекопитающего. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой иммунокомпетентное млекопитающее, имеющее заболевание или нарушение CNS (неврологическое заболевание). Используемое здесь «иммунокомпетентное» млекопитающее представляет собой млекопитающее, находящееся в возрасте, когда как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы вызываются под воздействием антигенного стимула, путем апрегуляции функций Thl или продукции IFN-γ в ответ на поликлональные стимулы, в отличие от новорожденного млекопитающего, имеющего врожденный иммунитет и иммунитет, полученный от матери, например, в период беременности или посредством грудного кормления. Взрослое млекопитающее, которое не имеет иммунодефицитное заболевание, является примером иммунокомпетентного млекопитающего. Например, иммунокомпетентный человек, как правило, находится в возрасте по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев и включает взрослых людей, не имеющих иммунодефицитного заболевания. В одном варианте осуществления AAV вводят интратекально. В одном варианте осуществления AAV вводят интракраниально (например, интрацеребровентрикулярно). В одном варианте осуществления AAV вводят интраназально, с усилителем проницаемости или без него. В одном варианте осуществления AAV вводят эндоваскулярно, например, в сонную артерию с усилителем проницаемости или без него. В одном варианте осуществления млекопитающее, которому вводят AAV, является иммунодефицитным или же подвергнутым индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии, например, для индукции более высоких уровней экспрессии терапевтического белка по сравнению с соответствующим млекопитающим, которому вводили AAV, но не подвергали индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии, В одном варианте осуществления иммуносупрессорный агент вводят для индукции иммуносупрессии. В одном варианте осуществления млекопитающее, которому вводят AAV, не подвергается индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии (например, терапевтический эффект обеспечивается введением только AAV).Thus, the invention includes the use of recombinant AAV vectors (rAAV) that encode a gene product having therapeutic effects when expressed in the CNS of a mammal. In one embodiment, the mammal is an immunocompetent mammal having a CNS disease or disorder (neurological disease). As used herein, an "immunocompetent" mammal is one that is at an age when both cellular and humoral immune responses are induced by an antigenic stimulus, by upregulating Thl functions or producing IFN-γ in response to polyclonal stimuli, as opposed to a newborn mammal, having innate immunity and immunity received from the mother, for example, during pregnancy or through breastfeeding. An adult mammal that does not have an immunodeficiency disorder is an example of an immunocompetent mammal. For example, an immunocompetent person is typically at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 months of age and includes adults who do not have an immunodeficiency disease. In one embodiment, the AAV is administered intrathecally. In one embodiment, the AAV is administered intracranially (eg, intracerebroventricularly). In one embodiment, the AAV is administered intranasally, with or without a permeation enhancer. In one embodiment, the AAV is administered endovascularly, eg, into the carotid artery with or without a permeability enhancer. In one embodiment, the mammal to which the AAV is administered is immunodeficient or has been subjected to induction of immunological tolerance or immunosuppression, for example, to induce higher levels of expression of the therapeutic protein compared to the corresponding mammal that has been administered the AAV but has not been subjected to induction of immunological tolerance or immunosuppression, In one embodiment, an immunosuppressive agent is administered to induce immunosuppression. In one embodiment, the mammal to which the AAV is administered is not subject to induction of immunological tolerance or immunosuppression (eg, the therapeutic effect is provided by administration of the AAV alone).

В одном варианте осуществления в изобретении предлагается способ увеличения концентрации секретируемого белка в центральной нервной системе млекопитающего, имеющего неврологическое заболевание, которое может включать нейрокогнитивную дисфункцию. Способ включает интраназальное введение млекопитающему композиции, содержащей эффективное количество рекомбинантного вектора на основе аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего открытую рамку считывания, кодирующую секретируемый белок, экспрессия которого у млекопитающего уменьшает невропатологию и/или усиливает нейрокогнитивные функции по всему головному мозгу по сравнению с млекопитающим, имеющим заболевание или дисфункцию, но которому не вводили rAAV. В одном варианте осуществления кодируемый белок представляет собой нейропротекторный белок, например, GDNF (глиальный нейротрофический фактор) или Neurturin (нейротурин). В одном варианте осуществления кодируемый белок представляет собой антитело, например, антитело, которое связывает бета-амилоид. В одном варианте осуществления белок представляет собой фермент, который расщепляет бляшки или фибриллы, связанные с болезнью Альцгеймера. В одном варианте осуществления млекопитающее не подвергают лечению иммуносупрессантом. В другом варианте осуществления, например, у субъектов, которые могут генерировать иммунный ответ, нейтрализующий активность терапевтического белка, млекопитающее подвергают лечению иммуносупрессантом, например, глюкокортикоидом, цитостатическими агентами, включая алкилирующий агент, антиметаболит, цитотоксический антибиотик, антитело или агент, связывающийся с иммунофилином, такой как азотистый иприт, нитрозомочевина, соединения платины, метотрексат, азатиоприн, меркаптопурин, фторурацил, дактиномицин, антрациклин, митомицин С, блеомицин, митрамицин, направленные на рецептор IL-2 (CD25-) или CD3-антитела, антитела к IL-2, циклоспорин, такролимус, сиролимус, IFN-β, IFN-γ, опиоид или связывающее TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа) средство. В одном варианте осуществления rAAV и иммуносупрессант вводят совместно или иммуносупрессант вводят после rAAV. В одном варианте осуществления иммуносупрессант вводят интратекально. В одном варианте осуществления иммуносупрессант вводят интрацребровентрикулярно. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор rAAVl, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAA rhlO или rAAV9. В одном варианте осуществления млекопитающее подвергают индукции иммунологической толерантности до введения композиции.In one embodiment, the invention provides a method of increasing the concentration of a secreted protein in the central nervous system of a mammal having a neurological disease, which may include neurocognitive dysfunction. The method includes intranasally administering to a mammal a composition containing an effective amount of a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector containing an open reading frame encoding a secreted protein, the expression of which in the mammal reduces neuropathology and/or enhances neurocognitive functions throughout the brain compared to the mammal, with disease or dysfunction but who have not received rAAV. In one embodiment, the encoded protein is a neuroprotective protein, such as GDNF (glial-derived neurotrophic factor) or Neuroturin. In one embodiment, the encoded protein is an antibody, for example, an antibody that binds amyloid beta. In one embodiment, the protein is an enzyme that breaks down plaques or fibrils associated with Alzheimer's disease. In one embodiment, the mammal is not treated with an immunosuppressant. In another embodiment, for example, in subjects that can generate an immune response that neutralizes the activity of the therapeutic protein, the mammal is treated with an immunosuppressant, e.g., a glucocorticoid, a cytotoxic agent, including an alkylating agent, an antimetabolite, a cytotoxic antibiotic, an antibody, or an immunophilin binding agent, such as nitrogen mustard, nitrosourea, platinum compounds, methotrexate, azathioprine, mercaptopurine, fluorouracil, dactinomycin, anthracycline, mitomycin C, bleomycin, mithramycin, IL-2 receptor (CD25-) or CD3 antibodies, anti-IL-2 antibodies, cyclosporine, tacrolimus, sirolimus, IFN-β, IFN-γ, opioid, or TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) binding agent. In one embodiment, the rAAV and the immunosuppressant are administered together, or the immunosuppressant is administered after the rAAV. In one embodiment, the immunosuppressant is administered intrathecally. In one embodiment, the immunosuppressant is administered intracrebroventricularly. In one embodiment, the rAAV vector is a rAAVl, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAA rhlO, or rAAV9 vector. In one embodiment, the mammal is subjected to immunotolerance induction prior to administration of the composition.

В одном варианте осуществления в изобретении предлагается способ предупреждения, ингибирования или лечения неврологического заболевания, которое может включать нейрокогнитивную дисфункцию у млекопитающего. Способ включает интраназальное введение млекопитающему композиции, содержащей эффективное количество рекомбинантного вектора на основе аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего открытую рамку считывания, кодирующую белок, экспрессия которого у млекопитающего предупреждает, ингибирует или лечит невропатологию и/или нейрокогнитивную дисфункцию. В одном варианте осуществления кодируемый белок представляет собой нейропротекторный белок, например, GDNF или нейротурин. В одном варианте осуществления кодируемый белок представляет собой антитело, например, антитело, которое связывает бета-амилоид. В одном варианте осуществления белок представляет собой фермент, который расщепляет бляшки или фибриллы, связанные с болезнью Альцгеймера. В одном варианте осуществления млекопитающее не подвергают лечению иммуносупрессантом. В другом варианте осуществления, например, у субъектов, которые могут генерировать иммунный ответ, нейтрализующий активность терапевтического белка, млекопитающее подвергают лечению иммуносупрессантом, например, глюкокортикоидом, цитостатическими агентами, включая алкилирующий агент, антиметаболит, цитотоксический антибиотик, антитело или агент, связывающийся с иммунофилином, такой как азотистый иприт, нитрозомочевина, соединение платины, метотрексат, азатиоприн, меркаптопурин, фторурацил, дактиномицин, антрациклин, митомицин С, блеомицин, митрамицин, направленные на рецептор IL-2 (CD25-) или CD3-антитела, антитела к IL-2, циклоспорин, такролимус, сиролимус, IFN-β, IFN-γ, опиоид или связывающее TNF-a (фактор некроза опухоли-альфа) средство. В одном варианте осуществления rAAV и иммуносупрессант вводят совместно или иммуносупрессант вводят после rAAV. В одном варианте осуществления иммуносупрессант вводят интратекально. В одном варианте осуществления иммуносупрессант вводят интрацребровентрикулярно. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор rAAVl, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAA rh10 или rAAV9. В одном варианте осуществления млекопитающее подвергают индукции иммунологической толерантности перед введением композиции. В одном варианте осуществления млекопитающее имеет болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона. В одном варианте осуществления в изобретении предлагается способ обеспечения кросс-коррекции секретируемого белка в центральной нервной системе у млекопитающего, имеющего неврологическое заболевание, которое может включать нейрокогнитивную дисфункцию. Способ включает: интраназальное, интратекальное, интрацеребровентрикулярное или внутривенное введение млекопитающему эффективного количества композиции, содержащей эффективное количество рекомбинантного вектора на основе аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего открытую рамку считывания, кодирующую секретируемый белок, экспрессия которого у млекопитающего обеспечивает кросс-коррекцию. В одном варианте осуществления кодируемый белок представляет собой нейропротекторный белок, например, GDNF или нейротурин. В одном варианте осуществления кодируемый белок представляет собой антитело, например, антитело, которое связывает бета-амилоид. В одном варианте осуществления белок представляет собой фермент, который расщепляет бляшки или фибриллы, связанные с болезнью Альцгеймера. В одном варианте осуществления млекопитающее не подвергают лечению иммуносупрессантом. В одном варианте осуществления, например, у субъектов, которые могут генерировать иммунный ответ, нейтрализующий активность терапевтического белка, млекопитающее подвергают лечению иммуносупрессантом, например, глюкокортикоидом, цитостатическими агентами, включая алкилирующий агент, антиметаболит, цитотоксический антибиотик, антитело или агент, связывающийся с иммунофилином, такой как азотистый иприт, нитрозомочевина, соединение платины, метотрексат, азатиоприн, меркаптопурин, фторурацил, дактиномицин, антрациклин, митомицин С, блеомицин, митрамицин, направленные на рецептор IL-2 (CD25-) или CD3-антитела, антитела к IL-2, циклоспорин, такролимус, сиролимус, IFN-β, IFN-γ, опиоид или связывающее TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа) свредство. В одном варианте осуществления rAAV и иммуносупрессант вводят совместно или иммуносупрессант вводят после rAAV. В одном варианте осуществления иммуносупрессант вводят интратекально. В одном варианте осуществления иммуносупрессант вводят интрацребровентрикулярно. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор rAAV1, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAA rh10 или rAAV9. В одном варианте осуществления млекопитающее подвергают индукции иммунологической толерантности перед введением композиции.In one embodiment, the invention provides a method for preventing, inhibiting or treating a neurological disease, which may include neurocognitive dysfunction in a mammal. The method involves intranasally administering to a mammal a composition containing an effective amount of a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector containing an open reading frame encoding a protein whose expression in the mammal prevents, inhibits or treats neuropathology and/or neurocognitive dysfunction. In one embodiment, the encoded protein is a neuroprotective protein, such as GDNF or neuroturin. In one embodiment, the encoded protein is an antibody, for example, an antibody that binds amyloid beta. In one embodiment, the protein is an enzyme that breaks down plaques or fibrils associated with Alzheimer's disease. In one embodiment, the mammal is not treated with an immunosuppressant. In another embodiment, for example, in subjects that can generate an immune response that neutralizes the activity of the therapeutic protein, the mammal is treated with an immunosuppressant, e.g., a glucocorticoid, a cytotoxic agent, including an alkylating agent, an antimetabolite, a cytotoxic antibiotic, an antibody, or an immunophilin binding agent, such as nitrogen mustard, nitrosourea, platinum compound, methotrexate, azathioprine, mercaptopurine, fluorouracil, dactinomycin, anthracycline, mitomycin C, bleomycin, mithramycin, IL-2 receptor (CD25-) or CD3 antibodies, anti-IL-2 antibodies, cyclosporine, tacrolimus, sirolimus, IFN-β, IFN-γ, opioid or TNF-a (tumor necrosis factor-alpha) binding agent. In one embodiment, the rAAV and the immunosuppressant are administered together, or the immunosuppressant is administered after the rAAV. In one embodiment, the immunosuppressant is administered intrathecally. In one embodiment, the immunosuppressant is administered intracrebroventricularly. In one embodiment, the rAAV vector is a rAAVl, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAA rh10, or rAAV9 vector. In one embodiment, the mammal is subjected to immunotolerance induction prior to administration of the composition. In one embodiment, the mammal has Alzheimer's disease or Parkinson's disease. In one embodiment, the invention provides a method of providing cross-correction of a secreted protein in the central nervous system of a mammal having a neurological disease, which may include neurocognitive dysfunction. The method includes: intranasal, intrathecal, intracerebroventricular or intravenous administration to a mammal of an effective amount of a composition containing an effective amount of a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector containing an open reading frame encoding a secreted protein, the expression of which in the mammal provides cross-correction. In one embodiment, the encoded protein is a neuroprotective protein, such as GDNF or neuroturin. In one embodiment, the encoded protein is an antibody, for example, an antibody that binds amyloid beta. In one embodiment, the protein is an enzyme that breaks down plaques or fibrils associated with Alzheimer's disease. In one embodiment, the mammal is not treated with an immunosuppressant. In one embodiment, for example, in subjects that can generate an immune response that neutralizes the activity of the therapeutic protein, the mammal is treated with an immunosuppressant, e.g., a glucocorticoid, a cytotoxic agent, including an alkylating agent, an antimetabolite, a cytotoxic antibiotic, an antibody, or an immunophilin binding agent, such as nitrogen mustard, nitrosourea, platinum compound, methotrexate, azathioprine, mercaptopurine, fluorouracil, dactinomycin, anthracycline, mitomycin C, bleomycin, mithramycin, IL-2 receptor (CD25-) or CD3 antibodies, anti-IL-2 antibodies, cyclosporine, tacrolimus, sirolimus, IFN-β, IFN-γ, opioid or TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) binding agent. In one embodiment, the rAAV and the immunosuppressant are administered together, or the immunosuppressant is administered after the rAAV. In one embodiment, the immunosuppressant is administered intrathecally. In one embodiment, the immunosuppressant is administered intracrebroventricularly. In one embodiment, the rAAV vector is a rAAV1, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAA rh10, or rAAV9 vector. In one embodiment, the mammal is subjected to immunotolerance induction prior to administration of the composition.

В изобретении предлагается способ предупреждения, ингибирования или лечения нейрокогнитивной дисфункции, связанной с заболеванием или нарушением центральной нервной системы у млекопитающего, нуждающегося в этом. Способ включает интратекальное, например, в поясничную область, или интрацеребровентрикулярное, например, в боковой желудочек, введение млекопитающему композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, экспрессия которого в центральной нервной системе млекопитающего предупреждает, ингибирует или лечит нейрокогнитивную дисфункцию. В одном варианте осуществления генный продукт представляет собой лизосомной фермент накопления. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой иммунокомпетентное взрослое млекопитающее. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10 или AAV9. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека. В одном варианте осуществления вводят многократные дозы. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю, раз в месяц, или раз в два или более месяцев.The invention provides a method for preventing, inhibiting or treating neurocognitive dysfunction associated with a disease or disorder of the central nervous system in a mammal in need thereof. The method includes intrathecal, for example, in the lumbar region, or intracerebroventricular, for example, in the lateral ventricle, administration to a mammal of a composition containing an effective amount of an rAAV vector containing an open reading frame encoding a gene product, the expression of which in the central nervous system of the mammal prevents, inhibits or treats neurocognitive dysfunction. In one embodiment, the gene product is a lysosomal storage enzyme. In one embodiment, the mammal is an immunocompetent adult mammal. In one embodiment, the rAAV vector is an AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, or AAV9 vector. In one embodiment, the mammal is a human. In one embodiment, multiple doses are administered. In one embodiment, the composition is administered once a week, once a month, or once every two or more months.

В одном варианте осуществления способ включает интратекальное, например, в поясничную область, введение млекопитающему композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, экспрессия которого в центральной нервной системе млекопитающего предупреждает, ингибирует или лечит нейрокогнитивную дисфункцию, и, необязательно, введение усилителя проницаемости. В одном варианте осуществления усилитель проницаемости вводят до введения композиции. В одном варианте осуществления композиция содержит усилитель проницаемости. В одном варианте осуществления усилитель проницаемости вводят после введения композиции. В одном варианте осуществления генный продукт представляет собой лизосомный фермент, связанный с лизосомной болезнью накопления. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой иммунокомпетентное взрослое млекопитающее. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор AAV-1, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV rh10 или AAV-9. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека. В одном варианте осуществления вводят многократные дозы. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю, раз в месяц, или раз в два или более месяцев. В одном варианте осуществления млекопитающее, которому интратекально вводят AAV, не подвергают индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии (например, терапевтический эффект обеспечивает введение только AAV). В одном варианте осуществления млекопитающее, которому интратекально вводят AAV, является иммунодефицитным или подвергается индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии, например, для индукции более высоких уровней экспрессии терапевтического белка по сравнению с соответствующим млекопитающим, которому интратекально вводили AAV, но не подвергали индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии.In one embodiment, the method includes intrathecal, for example, in the lumbar region, administration to a mammal of a composition containing an effective amount of an rAAV vector containing an open reading frame encoding a gene product, the expression of which in the central nervous system of the mammal prevents, inhibits or treats neurocognitive dysfunction, and, optionally, introduction of a permeability enhancer. In one embodiment, the penetration enhancer is administered prior to administration of the composition. In one embodiment, the composition contains a penetration enhancer. In one embodiment, the penetration enhancer is administered after administration of the composition. In one embodiment, the gene product is a lysosomal enzyme associated with a lysosomal storage disease. In one embodiment, the mammal is an immunocompetent adult mammal. In one embodiment, the rAAV vector is an AAV-1, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV rh10, or AAV-9 vector. In one embodiment, the mammal is a human. In one embodiment, multiple doses are administered. In one embodiment, the composition is administered once a week, once a month, or once every two or more months. In one embodiment, a mammal to which AAV is administered intrathecally is not subjected to immunotolerance induction or immunosuppression (eg, administration of AAV alone provides therapeutic benefit). In one embodiment, the mammal to which the AAV is administered intrathecally is immunodeficient or has been subjected to immunotolerance induction or immunosuppression, for example, to induce higher levels of therapeutic protein expression compared to a corresponding mammal that has been intrathecally administered the AAV but has not been subjected to immunotolerance induction or immunosuppression .

В одном варианте осуществления способ включает интрацеребровентрикулярное, например, в боковой желудочек, введение иммунокомпетентному млекопитающему композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, экспрессия которого в центральной нервной системе млекопитающего предупреждает, ингибирует или лечит нейрокогнитивную дисфункцию. В одном варианте осуществления генный продукт представляет собой лизосомный фермент, связанный с лизосомной болезнью накопления. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10 или AAV9. В одном варианте осуществления вектор rAAV не является вектором rAAV5. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека. В одном варианте осуществления вводят многократные дозы. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю, раз в месяц, или раз в два или более месяцев. В одном варианте осуществления млекопитающего, которому интрацеребровентрикулярно вводят AAV, не подвергают индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии (например, терапевтический эффект обеспечивает введение только AAV). В одном варианте осуществления млекопитающее, которому интрацеребровентрикулярно вводят AAV, является иммунодефицитным, или подвергается индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии, например, для индукции более высоких уровней экспрессии терапевтического белка по сравнению с соответствующим млекопитающим, которому интрацеребровентрикулярно вводили AAV, но не подвергали индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии. В одном варианте осуществления млекопитающее подвергали индукции иммунологической толерантности к генному продукту до введения композиции, содержащей AAV.In one embodiment, the method includes intracerebroventricularly, for example, in the lateral ventricle, administering to an immunocompetent mammal a composition comprising an effective amount of an rAAV vector containing an open reading frame encoding a gene product, the expression of which in the central nervous system of the mammal prevents, inhibits or treats neurocognitive dysfunction. In one embodiment, the gene product is a lysosomal enzyme associated with a lysosomal storage disease. In one embodiment, the rAAV vector is an AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, or AAV9 vector. In one embodiment, the rAAV vector is not a rAAV5 vector. In one embodiment, the mammal is a human. In one embodiment, multiple doses are administered. In one embodiment, the composition is administered once a week, once a month, or once every two or more months. In one embodiment, the mammal to which AAV is intracerebroventricularly administered is not subjected to immunotolerance induction or immunosuppression (eg, administration of AAV alone provides therapeutic benefit). In one embodiment, the mammal to which the AAV is intracerebroventricularly administered is immunodeficient, or is undergoing immunotolerance induction or immunosuppression, for example, to induce higher levels of therapeutic protein expression compared to a corresponding mammal that is intracerebroventricularly administered with the AAV but is not undergoing immunotolerance induction, or immunosuppression. In one embodiment, the mammal is subjected to induction of immunological tolerance to the gene product prior to administration of the AAV-containing composition.

Кроме того, предлагается способ предупреждения, ингибирования или лечения нейрокогнитивной дисфункции, связанной с заболеванием или нарушением центральной нервной системы, у млекопитающего, нуждающегося в этом. Способ включает эндоваскулярное введение млекопитающему композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, экспрессия которого в центральной нервной системе млекопитающего предупреждает, ингибирует или лечит дисфункцию, и эффективное количество усилителя проницаемости. В одном варианте осуществления композиция содержит усилитель проницаемости. В одном варианте осуществления усилитель проницаемости включает маннит, гликохолат натрия, таурохолат натрия, дезоксихолат натрия, салицилат натрия, каприлат натрия, капрат натрия, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир или ЭДТА. В одном варианте осуществления генный продукт представляет собой лизосомный фермент, связанный с лизосомной болезнью накопления. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой иммунокомпетентное взрослое млекопитающее. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10 или AAV9. В одном варианте осуществления вектор rAAV не является вектором rAAV5. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека. В одном варианте осуществления вводят многократные дозы. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю, раз в месяц, или раз в два или более месяцев. В одном варианте осуществления млекопитающего, которому эндоваскулярно вводят AAV, не подвергают индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии (например, терапевтический эффект обеспечивает введение только AAV). В одном варианте осуществления млекопитающее, которому эндоваскулярно вводят AAV, является иммунодефицитным или подвергается индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии, например, для индукции более высоких уровней экспрессии терапевтического белка по сравнению с соответствующим млекопитающим, которому эндоваскулярно вводили AAV, но не подвергали индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии.In addition, a method is provided for preventing, inhibiting or treating neurocognitive dysfunction associated with a disease or disorder of the central nervous system in a mammal in need thereof. The method includes endovascular administration to a mammal of a composition containing an effective amount of an rAAV vector containing an open reading frame encoding a gene product whose expression in the central nervous system of the mammal prevents, inhibits or treats dysfunction, and an effective amount of a permeation enhancer. In one embodiment, the composition contains a penetration enhancer. In one embodiment, the penetration enhancer includes mannitol, sodium glycocholate, sodium taurocholate, sodium deoxycholate, sodium salicylate, sodium caprylate, sodium caprate, sodium lauryl sulfate, polyoxyethylene-9-lauryl ether or EDTA. In one embodiment, the gene product is a lysosomal enzyme associated with a lysosomal storage disease. In one embodiment, the mammal is an immunocompetent adult mammal. In one embodiment, the rAAV vector is an AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, or AAV9 vector. In one embodiment, the rAAV vector is not a rAAV5 vector. In one embodiment, the mammal is a human. In one embodiment, multiple doses are administered. In one embodiment, the composition is administered once a week. In one embodiment, the composition is administered once a week, once a month, or once every two or more months. In one embodiment, the mammal to which AAV is endovascularly administered is not subjected to immunotolerance induction or immunosuppression (eg, administration of AAV alone provides therapeutic benefit). In one embodiment, the mammal to which the AAV is endovascularly administered is immunocompromised or has been subjected to immunotolerance induction or immunosuppression, for example, to induce higher levels of expression of the therapeutic protein compared to a corresponding mammal that has been endovascularly administered the AAV but has not been subjected to immunotolerance induction or immunosuppression .

В одном варианте осуществления способ включает интраназальное введение млекопитающему композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV9, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, экспрессия которого в центральной нервной системе млекопитающего предупреждает, ингибирует или лечит нейрокогнитивную дисфункцию, и, необязательно, введение усилителя проницаемости. В одном варианте осуществления интраназальная доставка может быть осуществлена, как описано в патенте США 8609088, раскрытие которого включено здесь посредством ссылки. В одном варианте осуществления усилитель проницаемости вводят до введения композиции. В одном варианте осуществления композиция содержит усилитель проницаемости. В одном варианте осуществления усилитель проницаемости вводят после введения композиции. В одном варианте осуществления генный продукт представляет собой лизосомный фермент, связанный с лизосомной болезнью накопления.In one embodiment, the method includes intranasally administering to a mammal a composition comprising an effective amount of an rAAV9 vector containing an open reading frame encoding a gene product whose expression in the central nervous system of the mammal prevents, inhibits or treats neurocognitive dysfunction, and optionally administering a permeation enhancer. In one embodiment, intranasal delivery can be accomplished as described in US Pat. No. 8,609,088, the disclosure of which is incorporated herein by reference. In one embodiment, the penetration enhancer is administered prior to administration of the composition. In one embodiment, the composition contains a penetration enhancer. In one embodiment, the penetration enhancer is administered after administration of the composition. In one embodiment, the gene product is a lysosomal enzyme associated with a lysosomal storage disease.

В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой иммунокомпетентное взрослое млекопитающее. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека. В одном варианте осуществления вводят многократные дозы. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю, раз в месяц, или раз в два или более месяцев. В одном варианте осуществления млекопитающего, которому интраназально вводят AAV, не подвергают индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии. В одном варианте осуществления млекопитающего, которому интраназально вводят AAV, подвергают индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии, например, для индукции более высоких уровней экспрессии белка IDUA по сравнению с соответствующим млекопитающим, которому интраназально вводили AAV, но не подвергали индукции иммунологической толерантности или иммуносупрессии.In one embodiment, the mammal is an immunocompetent adult mammal. In one embodiment, the mammal is a human. In one embodiment, multiple doses are administered. In one embodiment, the composition is administered once a week, once a month, or once every two or more months. In one embodiment, the mammal to which AAV is administered intranasally is not subjected to immunotolerance induction or immunosuppression. In one embodiment, a mammal that is intranasally administered AAV is subjected to immunotolerance induction or immunosuppression, for example, to induce higher levels of IDUA protein expression compared to a corresponding mammal that is intranasally administered AAV but not immunotolerance induction or immunosuppression.

Также, предлагается способ предупреждения, ингибирования или лечения нейрокогнитивной дисфункции, связанной с заболеванием центральной нервной системы, у млекопитающего, нуждающегося в этом. Способ включает введение млекопитающему композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, экспрессия которого в центральной нервной системе млекопитающего предупреждает, ингибирует или лечит, и иммуносупрессант.В одном варианте осуществления иммуносупрессант представляет собой циклофосфамид. В одном варианте осуществления иммуносупрессант представляет собой глюкокортикоид, цитостатические агенты, включая алкилирующий агент или антиметаболит, такой как метотрексат, азатиоприн, меркаптопурин или цитотоксический антибиотик, антитело или агент, связывающийся с иммунофилином. В одном варианте осуществления иммуносупрессант представляет собой азотистый иприт, нитрозомочевину, соединение платины, метотрексат, азатиоприн, меркаптопурин, фторурацил, дактиномицин, антрациклин, митомицин С, блеомицин, митрамицин, направленные на рецептор IL-2 (CD25-) или СО3-антитела, антитела к IL-2, циклоспорин, такролимус, сиролимус, IFN-β, IFN-γ, опиоид или связывающие TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа) средства, такие как инфликсимаб (Ремикейд), этанерцепт (Энбрел) или адалимумаб (Хумира). В одном варианте осуществления rAAV и иммунодепрессант вводят совместно. В одном варианте осуществления rAAV вводят до и, необязательно, после введения иммуносупрессанта. В одном варианте осуществления иммуносупрессант вводят до введения rAAV. В одном варианте осуществления rAAV и иммунодепрессант вводят интратекально. В одном варианте осуществления rAAV и иммунодепрессант вводят интрацребровентрикулярно. В одном варианте осуществления rAAV вводят интратекально и иммунодепрессант вводят внутривенно. В одном варианте осуществления генный продукт представляет собой лизосомный фермент, связанный с лизосомной болезнью накопления. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой взрослое млекопитающее. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrhlO или AAV9. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека. В одном варианте осуществления вводят многократные дозы. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю, раз в месяц, или раз в два или более месяцев.Also provided is a method of preventing, inhibiting or treating neurocognitive dysfunction associated with a disease of the central nervous system in a mammal in need thereof. The method includes administering to a mammal a composition containing an effective amount of an rAAV vector containing an open reading frame encoding a gene product whose expression in the central nervous system of the mammal prevents, inhibits or treats, and an immunosuppressant. In one embodiment, the immunosuppressant is cyclophosphamide. In one embodiment, the immunosuppressant is a glucocorticoid, a cytotoxic agent including an alkylating agent or an antimetabolite such as methotrexate, azathioprine, mercaptopurine or a cytotoxic antibiotic, antibody or immunophilin binding agent. In one embodiment, the immunosuppressant is nitrogen mustard, nitrosourea, platinum compound, methotrexate, azathioprine, mercaptopurine, fluorouracil, dactinomycin, anthracycline, mitomycin C, bleomycin, mithramycin, IL-2 receptor (CD25-) or CO3 antibodies, antibodies IL-2, cyclosporine, tacrolimus, sirolimus, IFN-β, IFN-γ, opioid, or TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) binding agents such as infliximab (Remicade), etanercept (Enbrel), or adalimumab (Humira) . In one embodiment, the rAAV and the immunosuppressant are administered together. In one embodiment, rAAV is administered before and optionally after administration of the immunosuppressant. In one embodiment, the immunosuppressant is administered prior to administration of the rAAV. In one embodiment, the rAAV and the immunosuppressant are administered intrathecally. In one embodiment, the rAAV and the immunosuppressant are administered intracrebroventricularly. In one embodiment, the rAAV is administered intrathecally and the immunosuppressant is administered intravenously. In one embodiment, the gene product is a lysosomal enzyme associated with a lysosomal storage disease. In one embodiment, the mammal is an adult mammal. In one embodiment, the rAAV vector is an AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrhlO, or AAV9 vector. In one embodiment, the mammal is a human. In one embodiment, multiple doses are administered. In one embodiment, the composition is administered once a week. In one embodiment, the composition is administered once a week, once a month, or once every two or more months.

В изобретении также предлагается способ предупреждения, ингибирования или лечения нейрокогнитивной дисфункции, связанной с заболеванием центральной нервной системы, у млекопитающего, нуждающегося в этом. Млекопитающему, подвергшемуся индукции иммунологической толерантности к генному продукту, который связан с заболеванием, вводили композицию, содержащую эффективное количество вектора rAAV, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую генный продукт, экспрессия которого в центральной нервной системе млекопитающего предупреждает, ингибирует или лечит один или несколько симптомов. В одном варианте осуществления генный продукт представляет собой лизосомный фермент, связанный с лизосомной болезнью накопления. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой взрослое млекопитающее. В одном варианте осуществления вектор rAAV представляет собой вектор AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrhlO или AAV9. В одном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека. В одном варианте осуществления вводят многократные дозы. В одном варианте осуществления композицию вводят раз в неделю.The invention also provides a method for preventing, inhibiting or treating neurocognitive dysfunction associated with a disease of the central nervous system in a mammal in need thereof. A mammal that has undergone the induction of immunological tolerance to a gene product that is associated with a disease is administered a composition containing an effective amount of an rAAV vector containing an open reading frame encoding a gene product, the expression of which in the central nervous system of the mammal prevents, inhibits or treats one or more symptoms. In one embodiment, the gene product is a lysosomal enzyme associated with a lysosomal storage disease. In one embodiment, the mammal is an adult mammal. In one embodiment, the rAAV vector is an AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrhlO, or AAV9 vector. In one embodiment, the mammal is a human. In one embodiment, multiple doses are administered. In one embodiment, the composition is administered once a week.

Генные продукты, которые могут быть кодированы векторами rAAV, включают, но без ограничения, альфа-Ь-идуронидазу, идуронат-2-сульфатазу, гепарансульфат-сульфатазу, 1М-ацетил-альфа-0-глюкозаминидазу, бета-гексозаминидазу, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, бета-глюкуронидазу, глюкоцереброзидазу, фактор рост фибробластов-2 (FGF-2), мозговой фактор роста (BDGF), нейротурин, глиальный фактор роста (GDGF), тирозингидроксилазу, допаминдекарбоксилазу или декарбоксилазу глутаминовой кислоты.Gene products that may be encoded by rAAV vectors include, but are not limited to, alpha-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, heparan sulfate sulfatase, 1M-acetyl-alpha-O-glucosaminidase, beta-hexosaminidase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucuronidase, glucocerebrosidase, fibroblast growth factor-2 (FGF-2), brain-derived growth factor (BDGF), neuroturin, glial growth factor (GDGF), tyrosine hydroxylase, dopamine decarboxylase or glutamic acid decarboxylase.

Заболевания, которые могут проявлять неврологические симптомы или нейрокогнитивную дисфункцию, которые можно предупреждать, ингибировать или лечить с использованием способов, описанных в настоящем документе, включают, но без ограничения, адренолейкодистрофию, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, синдром Ангельмана, телеангиоэктатическую атаксию, синдром Шарко-Мари-Тута, синдром Коккейна, тугоухость, миодистрофию Дюшенна, эпилепсию, эссенциальный тремор, синдром фрагильной Х-хромосомы, наследственную атаксию Фридрейха, болезнь Гоше, болезнь Хантингтона, синдром Леша-Найхана, болезнь кленового сиропа, синдром Менкеса, миотоническую дистрофию, нарколепсию, нейрофиброматоз, болезнь Ниманна-Пика, болезнь Паркинсона, фенилкетонурию, синдром Прадера-Вилли, болезнь Рефсума, синдром Ретта, спинальную мышечную атрофию, спинально-церебеллярную атаксию, танжерскую болезнь, болезнь Тея-Сакса, туберозный склероз, синдром фон Геппеля-Линдау, болезнь Вильямса, болезнь Вильсона или синдром Цельвегера. В одном варианте осуществления заболевание представляет собой лизосомную болезнь накопления, например, отсутствие или дефицит лизосомного фермента, связанного с лизосомной болезнью накопления. Лизосомные болезни накопления включают, но без ограничения, мукополисахаридоз (MPS), например, мукополисахаридоз I типа, например, синдром Гурлер и варианты синдрома Шейе и синдром Гурлер-Шейе (дефицит альфа-Ь-идуронидазы); синдром Хантера (дефицит идуронат-2-сульфатазы); мукополисахаридоз III типа, например, болезнь Санфилиппо (А, В, С или D, дефицит гепарансульфатсульфатазы,]ЧТ-ацетил-альфа-0-глюкозаминидазы, ацетил-СоА: альфа-глюкозаминидазы N-ацетилтрансферазы или N-ацетилглюкозамин-6-сульфатсульфатазы); мукополисахаридоз IV типа, например, синдром Моркио (дефицит галактозамин-6-сульфатсульфатазы или бета-галактозидазы); мукополисахаридоз VI типа, например, синдром Марото-Лами (дефицит арилсульфатазы В); мукополисахаридоз II типа; мукополисахаридоз III типа (А, В, С или D; дефицит гепарансульфатсульфатазы, N-ацетил-альфа-О-глюкозаминидазы, ацетил-СоА: альфа-глюкозаминидазы N-ацетилтрансферазы или N-ацетилглюкозамин-6-сульфатсульфатазы); мукополисахаридоз IV типа (А или В; дефицит галактозамин-6-сульфатазы и бета-галатакозидазы); мукополисахаридоз VI типа (дефицит арилсульфатазы В); мукополисахаридоз VII типа (дефицит бета-глюкуронидазы); мукополисахаридоз VIII типа (дефицит глюкозамин-6-сульфатсульфатазы); мукополисахаридоз ГХ типа (дефицит гиалуронидазы); болезнь Тея-Сакса (дефицит альфа-субъединицы бета-гексозаминидазы); синдром Сандгоффа (дефицит альфа- и бета-субъединиц бета-гексозаминидазы); II болезнь Сандгоффа (тип I или тип II); Болезнь Фабри (дефицит альфа-галактозидазы); метахроматическую лейкодистрофию (дефицит арилсульфатазы А); болезнь Помпе (дефицит кислой мальтазы); фукозидоз (дефицит фукозидазы); альфа-маннозидоз (дефицит альфа-маннозидазы); бета-маннозидоз (дефицит бета-маннозидазы), нейронный восковидный липофусциноз и болезнь Гоше (I, II и III типов; дефицит глюкоцереброзидазы), а также расстройства, такие как синдром Германского-Пудлака; амавротическую идиотию; танжерскую болезнь; аспартилглюкозаминурию; врожденное нарушение гликозилирования, тип 1а; Синдром Чедиака-Хигаши; макулярную дистрофию роговицы, 1; нефропатический цистиноз; синдром Фанкони-Биккеля; липогранулематоз Фарбера; фиброматоз; гелеофизическую дисплазию; болезнь накопления гликогена I; болезнь накопления гликогена lb; болезнь накопления гликогена 1 с; болезнь накопления гликогена III; болезнь накопления гликогена IV; болезнь накопления гликогена V; болезнь накопления гликогена VI; болезнь накопления гликогена VII; болезнь накопления гликогена 0; иммуно-остеоидную дисплазию, тип Шимке; липидоз; дефицит липазы Ь; муколипидоз II; муколипидоз II, включая вариантную форму; муколипидоз IV; дефицит нейраминидазы с дефицитом бета-галактозидазы; муколипидоз I; болезнь Ниманна-Пика (дефицит сфингомиелиназы); болезнь Ниманна-Пика без дефицита сфингомиелиназы (дефицит гена npcl, кодирующего фермента, метаболизирующий холестерин); болезнь Рефсума; болезнь голубых гистиоцитов; болезнь накопления сиаловой кислоты; сиалурию; множественную сульфатазную недостаточность; болезнь накопления триглицеридов с нарушенным окислением длинноцепочечных жирных кислот; синдром Винчестера; болезнь Вольмана (дефицит кислой гидролазы эфиров холестерина); нарушение, связанное дезоксирибонуклеазой I (Deoxyribonuclease I-like 1); нарушение, связанное с арилсульфатазой Е; нарушение, связанное с субъединицей 1 лисзосомной Н+-АТФазы; болезнь накопления гликогена lib; Ras-пссоциированное нарушение белка гаЬ9; точечную эпифизарную дисплазию 1, рецессивное расстройство, связанной с X-хромосомой; болезнь накопления гликогена VIII; связанные с лизосомой нарушение мембранного белка 2; синдром Менкеса; врожденное нарушение гликозилирования, тип Ic; и сиалурию. Изменение, составляющее менее чем 20%, например, менее чем 10% или около 1%-5% от уровней лизосомного фермента, связанного с болезнью лизосомного накопления, у здоровых млекопитающих, может предупреждать, ингибировать или лечить неврологические симптомы, такие как неврологическая дегенерация у млекопитающих.Diseases that may exhibit neurological symptoms or neurocognitive dysfunction that may be prevented, inhibited or treated using the methods described herein include, but are not limited to, adrenoleukodystrophy, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Angelman's syndrome, telangiectatic ataxia, Charcot's syndrome -Marie-Tooth, Cockayne syndrome, hearing loss, Duchenne muscular dystrophy, epilepsy, essential tremor, fragile X syndrome, Friedreich's hereditary ataxia, Gaucher disease, Huntington disease, Lesch-Nyhan syndrome, maple syrup disease, Menkes syndrome, myotonic dystrophy, narcolepsy , neurofibromatosis, Niemann-Pick disease, Parkinson's disease, phenylketonuria, Prader-Willi syndrome, Refsum disease, Rett syndrome, spinal muscular atrophy, spinocerebellar ataxia, Tangier disease, Tay-Sachs disease, tuberous sclerosis, von Heppel-Lindau syndrome, Williams disease, Wilson disease or Zellweger syndrome. In one embodiment, the disease is a lysosomal storage disease, eg, absence or deficiency of a lysosomal enzyme associated with a lysosomal storage disease. Lysosomal storage diseases include, but are not limited to, mucopolysaccharidosis (MPS), eg, mucopolysaccharidosis type I, eg, Hurler syndrome and variants of Scheie syndrome and Hurler-Scheie syndrome (alpha-L-iduronidase deficiency); Hunter syndrome (iduronate-2-sulfatase deficiency); mucopolysaccharidosis type III, e.g. Sanfilippo disease (A, B, C or D, deficiency of heparan sulfate sulfatase, [HT-acetyl-alpha-O-glucosaminidase, acetyl-CoA:alpha-glucosaminidase N-acetyltransferase or N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase) ; mucopolysaccharidosis type IV, for example, Morquio syndrome (galactosamine-6-sulfatesulfatase or beta-galactosidase deficiency); mucopolysaccharidosis type VI, for example, Maroteaux-Lamy syndrome (arylsulfatase B deficiency); mucopolysaccharidosis type II; mucopolysaccharidosis type III (A, B, C or D; deficiency of heparan sulfate sulfatase, N-acetyl-alpha-O-glucosaminidase, acetyl-CoA: alpha-glucosaminidase N-acetyltransferase or N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase); mucopolysaccharidosis type IV (A or B; deficiency of galactosamine-6-sulfatase and beta-galatacosidase); mucopolysaccharidosis type VI (arylsulfatase B deficiency); mucopolysaccharidosis type VII (beta-glucuronidase deficiency); mucopolysaccharidosis type VIII (glucosamine-6-sulfate sulfatase deficiency); mucopolysaccharidosis HC type (hyaluronidase deficiency); Tay-Sachs disease (beta-hexosaminidase alpha subunit deficiency); Sandhoff syndrome (deficiency of alpha and beta subunits of beta hexosaminidase); II Sandhoff disease (type I or type II); Fabry disease (alpha-galactosidase deficiency); metachromatic leukodystrophy (arylsulfatase A deficiency); Pompe disease (acid maltase deficiency); fucosidosis (fucosidase deficiency); alpha-mannosidosis (alpha-mannosidase deficiency); beta-mannosidosis (beta-mannosidase deficiency), neural waxy lipofuscinosis and Gaucher disease (types I, II and III; glucocerebrosidase deficiency), as well as disorders such as Hermansky-Pudlak syndrome; amaurotic idiocy; Tangier disease; aspartylglucosaminuria; congenital disorder of glycosylation, type 1a; Chediak-Higashi syndrome; macular degeneration of the cornea, 1; nephropathic cystinosis; Fanconi-Bickel syndrome; Farber lipogranulomatosis; fibromatosis; geleophysical dysplasia; glycogen storage disease I; glycogen storage disease lb; glycogen storage disease 1s; glycogen storage disease III; glycogen storage disease IV; glycogen storage disease V; glycogen storage disease VI; glycogen storage disease VII; glycogen storage disease 0; immuno-osteoid dysplasia, Schimke type; lipidosis; lipase b deficiency; mucolipidosis II; mucolipidosis II, including variant form; mucolipidosis IV; neuraminidase deficiency with beta-galactosidase deficiency; mucolipidosis I; Niemann-Pick disease (sphingomyelinase deficiency); Niemann-Pick disease without sphingomyelinase deficiency (deficiency of the npcl gene, which encodes an enzyme that metabolizes cholesterol); Refsum's disease; blue histiocyte disease; sialic acid storage disease; sialuria; multiple sulfatase deficiency; triglyceride storage disease with impaired oxidation of long-chain fatty acids; Winchester syndrome; Wolman's disease (cholesterol ester acid hydrolase deficiency); Deoxyribonuclease I-like 1 disorder; arylsulfatase E disorder; lyssosomal H+-ATPase subunit 1 disorder; glycogen storage disease lib; Ras-associated disorder of the rAb9 protein; punctate epiphyseal dysplasia 1, an X-linked recessive disorder; glycogen storage disease VIII; lysosome-associated membrane protein 2 disorder; Menkes syndrome; congenital disorder of glycosylation, type Ic; and sialuria. A change of less than 20%, such as less than 10% or about 1% to 5%, of lysosomal enzyme levels associated with lysosomal storage disease in healthy mammals may prevent, inhibit or treat neurological symptoms such as neurological degeneration in mammals.

В одном варианте осуществления способы, описанные здесь, включают доставку в CNS иммунокомпетентного человека, нуждающегося в лечении, композиции, содержащей эффективное количество вектора rAAV9, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую IDUA. Пути введения в CNS/головной мозг включают, но без ограничения, интратекальное введение, интракраниальное введение, например,In one embodiment, the methods described herein include delivering to the CNS of an immunocompetent individual in need of treatment a composition comprising an effective amount of an rAAV9 vector containing an open reading frame encoding IDUA. Routes of administration to the CNS/brain include, but are not limited to, intrathecal administration, intracranial administration, e.g.

интрацеребровентрикулярное введение или боковое церебровентрикулярное введение, интраназальное введение, эндоваскулярное введение и интрапаренхимальное введение.intracerebroventricular administration or lateral cerebroventricular administration, intranasal administration, endovascular administration and intraparenchymal administration.

Другие вирусные векторы могут быть использованы в способах согласно изобретению, например, вирусные векторы, такие как векторы на основе ретровируса, лентивируса, аденовируса, вируса леса Семлики или вируса простого герпеса.Other viral vectors may be used in the methods of the invention, for example viral vectors such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, Semliki Forest virus or herpes simplex virus vectors.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

Фигура 1. Дизайн эксперимента для идуронидаза-дефицитных мышей, которым интрацеребровентрикулярно (ICV) или интратекально вводили AAV9-IDUA. Для предотвращения иммунного ответа животных либо подвергали иммуносупрессии циклофосфамидом (CP), индукции иммунологической толерантности при рождении путем внутривенного введения человеческого белка идуронидазы (альдуразим), или инъекции выполняли у иммунодефицитных мышей NOD-SCID, которые также были дефицитными по идуронидазе. Животных умерщвляли в указанное время после лечения, головной мозг подвергали микродессекции и экстракты анализировали на активность идуронидазы.Figure 1. Experimental design for iduronidase-deficient mice intracerebroventricularly (ICV) or intrathecally administered AAV9-IDUA. To prevent an immune response, animals were either immunosuppressed with cyclophosphamide (CP), immunotolerance induced at birth by intravenous administration of human iduronidase protein (aldurazyme), or injections were performed in immunodeficient NOD-SCID mice that were also iduronidase-deficient. Animals were sacrificed at the indicated times after treatment, the brains were microdissected, and extracts were analyzed for iduronidase activity.

Фигура 2. Активность IDUA у иммунодефицитных, IDUA-дефицитных животных.Figure 2. IDUA activity in immunodeficient, IDUA-deficient animals.

Фигура 3. Активность IDUA у иммуносупрессированных животных, которым вводили вектор AAV путем ICV-введения.Figure 3. IDUA activity in immunosuppressed animals that received the AAV vector by ICV administration.

Фигура 4. Активность IDUA у иммуносупрессированных животных, которым вводили вектор AAV путем ГГ-введения.Figure 4. IDUA activity in immunosuppressed animals that received the AAV vector by GG administration.

Фигура 5. Активность IDUA у животных, подвергнутых индукции иммунологической толерантности, которым вводили вектор AAV путем ICV-введения.Figure 5. IDUA activity in animals subjected to immunotolerance induction that were administered the AAV vector by ICV administration.

Фигура 6. Компиляция всех средних уровней активности IDUA для параллельного сравнения.Figure 6. Compilation of all average IDUA activity levels for side-by-side comparison.

Фигура 7. Данные сгруппированы в соответствии с областью головного мозга.Figure 7. Data grouped according to brain region.

Фигура 8. Анализ на материал накопления GAG в различных отделах головного мозга для всех четырех тестируемых групп.Figure 8. Material analysis of GAG accumulation in different brain regions for all four tested groups.

Фигура 9. Схема дизайна эксперимента.Figure 9. Experimental design diagram.

Фигура 10. Интракраниальная инфузия AAV9-IDUA иммунодефицитным мышам с MPS I. Взрослым животным инъецировали 10¹¹ геномов вектора и оценивали на экспрессию идуронидазы в головном мозге через 10 недель. Уровни активности фермента в головном мозге были значительно более высокими, чем в головном мозге животных дикого типа, то есть в 30-300 раз выше по сравнению с диким типом.Figure 10. Intracranial infusion of AAV9-IDUA into immunodeficient MPS I mice. Adult animals were injected with 10 ¹¹ vector genomes and assessed for brain iduronidase expression after 10 weeks. Levels of enzyme activity in the brain were significantly higher than in the brains of wild-type animals, i.e., 30-300 times higher compared to wild type.

Фигура 11. Интракраниальное введение AAV9-IDUA иммунокомпетентным, IDUA-дефицитным мышам. Взрослым животным инъецировали 10¹¹ геномов вектора и подвергали иммунодепрессии путем еженедельной инъекции циклофосфамида (CP). Инъекции CP прекращали через 6 недель после инъекции вектора из-за слабого здоровья, и животных умерщвляли через 8 недель после инъекции. Головной мозг подвергали микродессекции и анализировали на активность фермента IDUA.Figure 11. Intracranial administration of AAV9-IDUA to immunocompetent, IDUA-deficient mice. Adult animals were injected with 10 ¹¹ vector genomes and immunosuppressed by weekly injections of cyclophosphamide (CP). CP injections were stopped 6 weeks after vector injection due to poor health, and animals were sacrificed 8 weeks after injection. Brains were microdissected and analyzed for IDUA enzyme activity.

Фигура 12. Интракраниальная инфузия AAV9-IDUA подвергнутым индукции иммунологической толерантности мышам с MPS I. У мышей с MPS I индуцировали иммунологическую толерантность с помощью однократной дозы Альдуразима при рождении или многократных доз, вводимых еженедельно, начиная с рождения. Мышам инфузировали вектор в возрасте 4-х месяцев и умерщвляли через 11 недель после введения. Головной мозг подвергали микродессекции и анализировали на экспрессию идуронидазы. Активность фермента в среднем от 10 до 1000 раз была более высокой по сравнению с уровнями у мышей дикого типа.Figure 12. Intracranial infusion of AAV9-IDUA into immunotolerance-induced MPS I mice. MPS I mice were immunotolerized with a single dose of Aldurazyme at birth or multiple doses administered weekly starting at birth. Mice were infused with the vector at 4 months of age and sacrificed 11 weeks after administration. Brains were microdissected and analyzed for iduronidase expression. Enzyme activity was on average 10 to 1000 times higher than levels in wild-type mice.

Фигура 13. Интратекальное введение AAV9-IDUA иммунокомпетентным, IDUA-дефицитным животным. Взрослым мышам с MPS I интратекально инъецировали AAV9-IDUA с последующим еженедельным режимом иммунодепрессии циклофосфамидом. Животных умерщвляли через 11 недель после инъекции, а затем головной мозг и спинной мозг анализировали на активность фермента IDUA.Figure 13. Intrathecal administration of AAV9-IDUA to immunocompetent, IDUA-deficient animals. Adult MPS I mice were injected intrathecally with AAV9-IDUA followed by a weekly regimen of cyclophosphamide immunosuppression. Animals were sacrificed 11 weeks after injection, and then the brain and spinal cord were analyzed for IDUA enzyme activity.

Фигура 14. Интратекальная инфузия AAV9-IDUA мышам с MPS I, подвергнутым индукции иммунологической толерантности. У IDUA-дефицитных животных индуцировали иммунологическую толерантность при рождении с помощью однократной дозы Альдуразима или многократных доз, вводимых еженедельно, начиная с рождения. В возрасте 4 -х месяцев животным инфузировали интратекально вектор AAV9-IDUA, и через 10 недель после введения животных умерщвляли, головной мозг подвергали микродиссекции и анализировали на активность идуронидазы. Наблюдалось восстановление активности фермента во всех отделах головного мозга, при этом активности в мозжечке были от 200 до 1500 раз более высокими по сравнению с уровнями активности у животных дикого типа. Уровни активности фермента в обонятельной луковице и мозжечке (справа от пунктирной линии) относятся к правой оси Y.Figure 14. Intrathecal infusion of AAV9-IDUA into MPS I mice subjected to immunotolerance induction. IDUA-deficient animals were induced into immunological tolerance at birth using a single dose of Aldurazyme or multiple doses administered weekly starting at birth. At 4 months of age, animals were infused intrathecally with the AAV9-IDUA vector, and 10 weeks after administration, animals were sacrificed and the brains were microdissected and analyzed for iduronidase activity. There was a restoration of enzyme activity in all parts of the brain, with activity in the cerebellum being 200 to 1500 times higher than activity levels in wild-type animals. Enzyme activity levels in the olfactory bulb and cerebellum (to the right of the dotted line) refer to the right Y-axis.

Фигура 15. Интратекальная инфузия AAV9-IDUA иммунокомпетентным животным с MPS I. Контрольным животным с MPS I инъецировали вектор AAV9-IDUA, но не подвергали иммуносупрессии или индукции иммунологической толерантности. Животных умерщвляли через 11 недель после инъекции вектора, а затем их головной мозг анализировали на активность идуронидазы. Уровни фермента были восстановлены до уровней у животных дикого типа во всех отделах головного мозга, но были значительно ниже, чем у животных, которые были подвергнуты иммуносупрессии или индукции иммунологической толерантности.Figure 15. Intrathecal infusion of AAV9-IDUA into immunocompetent MPS I animals. MPS I control animals were injected with the AAV9-IDUA vector but were not immunosuppressed or immunotolerized. Animals were sacrificed 11 weeks after vector injection and their brains were then analyzed for iduronidase activity. Enzyme levels were restored to levels in wild-type animals in all brain regions, but were significantly lower than in animals that had been immunosuppressed or immunotolerized.

Фигура 16. Нормализация уровней гликозаминогликанов (GAG) после интракраниальной или интратекальной инфузии AAV9. AAV9 - IDUA инъецировали интракраниально или интратекально иммунодефицитным, подвергнутым иммуносупрессии или индукции иммунологической толерантности мышам с MPS I, как указано. Животных умерщвляли через 8-11 недель после инъекции, затем головной мозг подвергали микродиссекции и анализировали на уровни GAG. Накопление GAG восстановилось до уровней у животных дикого типа или уровней, близких к уровням у животных дикого типа, во всех подвергнутых анализу группах.Figure 16. Normalization of glycosaminoglycan (GAG) levels after intracranial or intrathecal infusion of AAV9. AAV9 - IDUA was injected intracranially or intrathecally into immunodeficient, immunosuppressed, or immune tolerance-induced MPS I mice as indicated. Animals were sacrificed 8–11 weeks after injection, and the brains were then microdissected and analyzed for GAG levels. GAG accumulation was restored to levels in wild-type animals or levels similar to those in wild-type animals in all groups analyzed.

Фигура 17. Копии вектора IDUA в головном мозге. Подвергнутый микродиссекции головной мозг анализировали на последовательности вектора IDUA с помощью QPCR. Число копий у интракраниально и интратекально инъецированных мышей коррелирует с уровнями активности фермента, показанными на фигурах 11 и 13.Figure 17. Copies of the IDUA vector in the brain. Microdissected brains were analyzed for IDUA vector sequences using QPCR. Copy number in intracranially and intrathecally injected mice correlates with enzyme activity levels shown in Figures 11 and 13.

Фигура 18. ICV-инфузия AAV8-MCI взрослым животным.Figure 18. ICV infusion of AAV8-MCI into adult animals.

Фигура 19. Интраназальное введение AAV9-IDUA иммунокомпетентным, IDUA-дефицитным животным. Взрослым мышам с MPS I интраназально инфузировали AAV9-IDUA с последующим еженедельным режимом иммуносупрессии циклофосфамидом. Животных умерщвляли через 12 недель после введения и головной мозг анализировали на активность фермента IDUA.Figure 19. Intranasal administration of AAV9-IDUA to immunocompetent, IDUA-deficient animals. Adult MPS I mice were infused intranasally with AAV9-IDUA followed by a weekly immunosuppression regimen with cyclophosphamide. Animals were sacrificed 12 weeks after administration and the brains were analyzed for IDUA enzyme activity.

Фигура 20. Копии вектора IDUA в головном мозге. Подвергнутый микродиссекции головной мозг анализировали на последовательности вектора IDUA с помощью QPCR. Число копий у интраназально инъецированных мышей коррелирует с уровнями фермента на фигуре 19.Figure 20. Copies of the IDUA vector in the brain. Microdissected brains were analyzed for IDUA vector sequences using QPCR. Copy number in intranasally injected mice correlates with enzyme levels in Figure 19.

Фигура 21. Протокол с иммунодепрессантом или индукцией иммунологической толерантности с использованием IN-доставки AAV9-IDUA.Figure 21. Immunosuppressant or immunotolerance induction protocol using IN delivery of AAV9-IDUA.

Фигура 22. Восстановление активности IDUA после IN-доставки AAV9-IDUA.Figure 22. Recovery of IDUA activity after IN delivery of AAV9-IDUA.

Фигура 23. Активность GAG после IN-доставки AAV9-IDUA.Figure 23. GAG activity after IN delivery of AAV9-IDUA.

Фигура 24. Иммунофлуоресценция IDUA в головном мозге после IN-доставки AAV9-IDUA.Figure 24. Immunofluorescence of IDUA in the brain after IN delivery of AAV9-IDUA.

Фигура 25. Иммунофлуоресценция GFP в головном мозге после IN-доставки AAV9-GFP.Figure 25. GFP immunofluorescence in the brain after IN delivery of AAV9-GFP.

Фигуры 26A-D. А) Окрашивание толуидиновым синим. В) Сводные данные по патологии ткани у контрольных гетерозиготных и гомозиготных мышей с MPS I и мышей, подвергнутых лечению путем IN-доставки IDUA AAV9-MCI. С) Лабиринт Барнеса. D) Данные по лабиринту Барнеса.Figures 26A-D. A) Toluidine blue staining. B) Summary of tissue pathology data in control heterozygous and homozygous MPS I mice and mice treated with IDUA AAV9-MCI IN delivery. C) Barnes' Labyrinth. D) Data on the Barnes maze.

Фигуры 27А-В. А) Схематическое изображение векторов AAV9. В) Краткое описание in vivo тестируемых групп для IT- и IV-доставки векторов AAV9.hIDS.Figures 27A-B. A) Schematic representation of AAV9 vectors. B) Summary of in vivo test groups for IT and IV delivery of AAV9.hIDS vectors.

Фигура 28. Активность IDS в плазме мышей, которым вводили векторы AAV9.hIDS путем IT- и IV-введения.Figure 28. IDS activity in the plasma of mice treated with AAV9.hIDS vectors by IT and IV administration.

Фигура 29. Активность IDS в CNS после ГГ-инъекции AAV9-hIDS. Для каждой группы мышей данные для следующих тканей представлены слева направо: спинной мозг, таламус/ствол головного мозга, мозжечок, кора головного мозга, гиппокамп и стриатум.Figure 29. IDS activity in the CNS after GG injection of AAV9-hIDS. For each group of mice, data for the following tissues are presented from left to right: spinal cord, thalamus/brainstem, cerebellum, cerebral cortex, hippocampus, and striatum.

Фигуры 30A-D. А) Активность ffiS в CNS после ICV-инъекции AAV9-hIDS. Для каждой группы мышей данные для следующих тканей представлены слева направо: спинной мозг; таламус/ствол головного мозга, мозжечок, кора головного мозга, гиппокамп, стриатум, обонятельная луковица левой стороны и обонятельная луковица, стриатум, гиппокамп, кора головного мозг, мозжечок и таламус/ствол головного мозга правой стороны. В) Активность IDS в плазме после ICV-инъекции AAV9-hIDS. С) Активность IDS в периферических органах после ICV-инъекции AAV9-hIDS. Для каждой группы мышей данные для следующих органов представлены слева направо: печень, сердце, легкое, селезенка и почки. D) Содержание GAG после ICV-инъекции. Для каждой группы мышей данные для следующих тканей представлены слева направо: спинной мозг, остальные отделы, мозжечок, кора головного мозга, гиппокамп, стриатум и обонятельная луковица.Figures 30A-D. A) ffiS activity in the CNS after ICV injection of AAV9-hIDS. For each group of mice, data for the following tissues are presented from left to right: spinal cord; thalamus/brain stem, cerebellum, cerebral cortex, hippocampus, striatum, left olfactory bulb and right olfactory bulb, striatum, hippocampus, cerebral cortex, cerebellum and right thalamus/brain stem. B) IDS activity in plasma after ICV injection of AAV9-hIDS. C) IDS activity in peripheral organs after ICV injection of AAV9-hIDS. For each group of mice, data for the following organs are presented from left to right: liver, heart, lung, spleen, and kidney. D) GAG content after ICV injection. For each group of mice, data for the following tissues are presented from left to right: spinal cord, remainder, cerebellum, cerebral cortex, hippocampus, striatum, and olfactory bulb.

Фигуры 31А-В. А) Лабиринт Барнеса. В) Выполнение на 1-й день и 4-й день. Фигура 32. Сравнение неврологической функции у мышей дикого типа и мышей с MPS П.Figures 31A-B. A) Barnes' Labyrinth. C) Execution on the 1st day and 4th day. Figure 32. Comparison of neurological function between wild-type and MPS P mice.

Фигура 33. Дизайн эксперимента для IV-доставки генов с использованием AAV9 или AAVrhlO.Figure 33. Experimental design for IV gene delivery using AAV9 or AAVrhlO.

Фигуры 34А-С. Восстановление активности IDUA в плазме (А), периферических тканях (В) и CNS (С) и после IV-введения.Figures 34A-C. Restoration of IDUA activity in plasma (A), peripheral tissues (B) and CNS (C) and after IV administration.

Фигуры 35А-С. Активность GAG в моче (А), периферических тканях (В) и CNSFigures 35A-C. GAG activity in urine (A), peripheral tissues (B) and CNS

(С).(WITH).

Фигуры 36A-F. Иммунофлуоресценция IDUA в срезах тканей. А) Печень. В) Сердце. С) Легкое. D) Таламус.Е) Гиппокамп.F) Мозжечок.Figures 36A-F. Immunofluorescence of IDUA in tissue sections. A) Liver. In heart. C) Light. D) Thalamus. E) Hippocampus. F) Cerebellum.

Фигура 37. Уровни активности фермента IDUA после IN-инфузии AAV9-IDUA. Высокие уровни активности фермента IDUA наблюдался в обонятельной луковице (в 10-100 раз выше, чем у нормального животного) и нормализованные (масс.) уровни в других отделах головного мозга.Figure 37. IDUA enzyme activity levels following IN infusion of AAV9-IDUA. High levels of IDUA enzyme activity were observed in the olfactory bulb (10-100 times higher than in a normal animal) and normalized (mass) levels in other parts of the brain.

Фигура 38. Сокращение материала накопления у подвергнутых лечению мышей.Figure 38. Reduction of accumulation material in treated mice.

Фигуры 39A-D. IDUA (A), GFP (В); и иммунофлуоресценция обонятельной луковицы (С). (D) Совместное окрашивание с обонятельным маркерным белком (Olfactory Marker Protein) в обонятельной луковице.Figures 39A-D. IDUA (A), GFP (B); and immunofluorescence of the olfactory bulb (C). (D) Co-staining with Olfactory Marker Protein in the olfactory bulb.

Фигура 40. Улучшенная нейрокогнитивная функция у мышей, подвергнутых лечению путем IN-введения.Figure 40. Improved neurocognitive function in mice treated with IN administration.

Фигуры 41А-В. Нейрохимические профили в мозжечке (А) и гиппокампе (В). Контрольные мыши (CTR) представлены левым столбцом, мыши с MPS I (не подвергнутые лечению) представлены столбцом в середине, и подвергнутые лечению мыши с MPS I представлены правым столбцом для каждого нейрохимического профиля.Figures 41A-B. Neurochemical profiles in the cerebellum (A) and hippocampus (B). Control mice (CTR) are represented by the left column, MPS I mice (untreated) are represented by the middle column, and treated MPS I mice are represented by the right column for each neurochemical profile.

Фигура 42. Окрашивание хороидного сплетения после IN-доставки AAVrh10-GFP.Figure 42. Choroid plexus staining after IN delivery of AAVrh10-GFP.

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

ОпределенияDefinitions

Используемый здесь термин «индивидуум» (как в субъекте лечения) означает млекопитающее. Млекопитающие включают, например, человека; не относящихся к человеку приматов, например, человекообразных обезьян и мартышек; и не относящихся к приматам млекопитающих, например, собак, кошек, крыс, мышей, крупный рогатый скот, лошадей, овец и коз. Не млекопитающие включают, например, рыб и птиц.As used herein, the term "individual" (as in subject of treatment) means a mammal. Mammals include, for example, humans; non-human primates, such as apes and monkeys; and non-primate mammals, such as dogs, cats, rats, mice, cattle, horses, sheep and goats. Non-mammals include, for example, fish and birds.

Термины «заболевание» и «нарушение» используются взаимозаменяемо и означают заболевания или состояния, в которых отсутствие или пониженное содержание специфического генного продукта, например, лизосомного фермента, связанного с лизосомной болезнью накопления, обуславливает заболевание таким образом, что терапевтически благоприятный эффект может быть достигнут путем восполнения, например, по меньшей мере до 1% от нормальных уровней.The terms "disease" and "disorder" are used interchangeably and mean diseases or conditions in which the absence or reduction of a specific gene product, for example, a lysosomal enzyme associated with lysosomal storage disease, causes the disease in such a way that a therapeutically beneficial effect can be achieved by replenishment, for example, to at least 1% of normal levels.

Используемый здесь термин «по существу» означает полностью или почти полностью; например, композиция является «по существу свободной» от компонента, когда не содержит этот компонент или содержит такое следовое количество, присутствие которого не нарушает любое важное функциональное свойство композиции, или соединение является «по существу чистым», когда присутствуют лишь незначительные (следовые) количества примесей.As used herein, the term “substantially” means completely or almost completely; for example, a composition is "substantially free" of a component when it does not contain that component or contains such a trace amount the presence of which does not interfere with any important functional property of the composition, or a compound is "substantially pure" when only minor (trace) amounts are present impurities.

Термин «подвергание лечению» или «лечение» в том смысле, в котором он используется здесь, относится к ослаблению симптомов, связанных с нарушением или заболеванием, «ингибирование» означает замедление дальнейшего прогрессирования или ухудшения симптомов, связанных с нарушением или заболеванием, и «предупреждение» относится к предупреждению возникновения симптомов, связанных с нарушением или заболеванием.The term “treating” or “treating” as used herein refers to reducing symptoms associated with a disorder or disease, “inhibiting” means slowing further progression or worsening of symptoms associated with a disorder or disease, and “preventing ” refers to preventing the occurrence of symptoms associated with a disorder or disease.

Используемое здесь «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» агента согласно изобретению, например, рекомбинантного AAV, кодирующего генный продукт, означает количество агента, которое полностью или частично ослабляет симптомы, связанные с нарушением или состоянием; или останавливает или замедляет дальнейшее прогрессирование или ухудшение этих симптомов; или предупреждает или обеспечивает профилактику нарушения или состояния; например, количество, которое является эффективным для предупреждения, ингибирования или лечения одного или нескольких неврологических симптомов у индивидуума.As used herein, an "effective amount" or a "therapeutically effective amount" of an agent of the invention, for example, a recombinant AAV encoding a gene product, means an amount of the agent that completely or partially alleviates the symptoms associated with the disorder or condition; or stops or slows further progression or worsening of these symptoms; or prevents or provides prevention of a disorder or condition; for example, an amount that is effective to prevent, inhibit or treat one or more neurological symptoms in an individual.

В частности, «терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству, которое в назначенной дозировке и в течение определенного промежутка времени позволяет достичь желательного терапевтического результата. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается также такое количество, при котором любые токсические или вредные эффекты соединений согласно изобретению перевешиваются их полезными терапевтическими эффектами.In particular, a “therapeutically effective amount” refers to that amount which, in the prescribed dosage and for a specified period of time, achieves the desired therapeutic result. By a therapeutically effective amount is also meant an amount such that any toxic or harmful effects of the compounds of the invention are outweighed by their beneficial therapeutic effects.

Используемый здесь термин «вектор» относится к макромолекуле или ассоциации макромолекул, которая содержит или ассоциирует с полинуклеотидом, и может быть использована с целью опосредования доставки полинуклеотида в клетку, in vitro или in vivo. Иллюстративные векторы включают, например, плазмиды, вирусные векторы, липосомы и другие носители для доставки генов. Полинуклеотид, подлежащий доставке, иногда называемый как «целевой полинуклеотид» или «трансген», может содержать кодирующую последовательность, представляющую интерес для генной терапии (например, кодирующий белок ген, представляющий терапевтический интерес), и/или селектируемый или детектируемый маркер.As used herein, the term “vector” refers to a macromolecule or association of macromolecules that contains or associates with a polynucleotide, and can be used to mediate delivery of the polynucleotide into a cell, in vitro or in vivo. Exemplary vectors include, for example, plasmids, viral vectors, liposomes, and other gene delivery vehicles. The polynucleotide to be delivered, sometimes referred to as a “target polynucleotide” or “transgene,” may contain a coding sequence of interest for gene therapy (eg, a protein-coding gene of therapeutic interest) and/or a selectable or detectable marker.

Аббревиатура «AAV» обозначает аденоассоциированный вирус и может быть использована для обозначения самого вируса или его производных. Термин охватывает все подтипы, серотипы и псевдотипы, и как природные, так и рекомбинантные формы, за исключением случаев, когда указано иное. Используемый здесь термин «серотип» относится к AAV, который идентифицирован и отличается от других AAV исходя из его свойств связывания, например, существует одиннадцать серотипов AAV1-AAV11, включая AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 и AAVrhlO, и термин охватывает псевдотипы с такими же свойствами связывания. Так, например, серотипы AAV9 включают AAV со свойствами связывания AAV9, например, псевдотипированный AAV, содержащий капсид AAV9 и геном rAAV, который не происходит или не получен из AAV9, или геном которого является химерным. Аббревиатура «rAAV» относится к рекомбинантному аденоассоциированному вирусу, также называемому рекомбинантным вектором AAV (или «вектор rAAV»).The abbreviation "AAV" stands for adeno-associated virus and can be used to refer to the virus itself or its derivatives. The term covers all subtypes, serotypes and pseudotypes, and both natural and recombinant forms, except where otherwise noted. As used herein, the term "serotype" refers to an AAV that is identified and distinguished from other AAVs based on its binding properties, for example, there are eleven serotypes AAV1-AAV11, including AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 and AAVrhlO, and the term covers pseudotypes with the same binding properties. For example, AAV9 serotypes include AAVs with AAV9-binding properties, for example, a pseudotyped AAV containing an AAV9 capsid and an rAAV genome that is not derived from or derived from AAV9, or whose genome is chimeric. The abbreviation "rAAV" refers to recombinant adeno-associated virus, also called recombinant AAV vector (or "rAAV vector").

«Вирус AAV» относится к частице вируса, состоящей из по меньшей мере одного капсидного белка AAV и инкапсидированного полинуклеотида. Если частица содержит гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, отличный от полинуклеотида генома AAV дикого типа, такой как трансген, подлежащий доставке в клетку млекопитающего), то указанная частица обычно называется как «rAAV». «Капсидный белок» AAV включает капсидный белок AAV дикого типа, а также модифицированные формы капсидного белка AAV, которые структурно и/или функционально способны упаковывать геном rAAV и связываются по меньшей мере с одним специфическим клеточным рецептором, который может отличаться от рецептора, используемого AAV дикого типа. Модифицированный капсидный белок AAV включает химерный капсидный белок AAV, например, содержащий аминокислотные последовательности от двух или более серотипов AAV; например, капсидный белок, образованный из части капсидного белка от AAV9, слитой или связанной с частью капсидного белка от AAV-2; и капсидный белок AAV, имеющий метку или другой детектируемый не-AAV капсидный пептид или белок, слитый или связанный с капсидным белком AAV, например, часть молекулы антитела, которая связывается с рецептором, отличными от рецептора для AAV9, таким как рецептор трансферрина, может быть рекомбинантно слита с капсидным белком AAV9."AAV virus" refers to a viral particle consisting of at least one AAV capsid protein and an encapsidated polynucleotide. If the particle contains a heterologous polynucleotide (ie, a polynucleotide different from a wild-type AAV genome polynucleotide, such as a transgene to be delivered into a mammalian cell), then the particle is generally referred to as "rAAV". AAV "capsid protein" includes wild-type AAV capsid protein, as well as modified forms of AAV capsid protein that are structurally and/or functionally capable of packaging the rAAV genome and bind to at least one specific cellular receptor, which may be different from the receptor used by wild-type AAV type. The modified AAV capsid protein includes a chimeric AAV capsid protein, for example, containing amino acid sequences from two or more AAV serotypes; for example, a capsid protein formed from a portion of the capsid protein from AAV9 fused or linked to a portion of the capsid protein from AAV-2; and an AAV capsid protein having a tag or other detectable non-AAV capsid peptide or protein fused to or linked to an AAV capsid protein, for example, a portion of an antibody molecule that binds to a receptor other than the receptor for AAV9, such as a transferrin receptor, may be recombinantly fused to the AAV9 capsid protein.

«Псевдотипированный» rAAV представляет собой инфекционный вирус, содержащий любую комбинацию капсидного белка AAV и генома AAV. Капсидные белки из любого серотипа AAV могут быть использованы с геномом rAAV, который происходит или может быть получен из генома AAV дикого типа другого серотипа, или который является химерным геномом, то есть образованным из ДНК AAV от двух или более различных серотипов, например, химерным геномом, содержащим 2 инвертированных концевых повтора (ITR), при этом каждый ITR происходит от различных серотипов или химерных ITR. Использование химерных геномов, таких как химерные геномы, содержащие ITR от двух серотипов AAV или химерные ITR, может привести к направленной рекомбинации, которая может дополнительно повысить продукцию транскрипционно активных межмолекулярных конкатамеров. Таким образом, 5' и 3' инвертированные концевые повторы (ITR) в пределах вектора rAAV согласно изобретению могут быть гомологичными, то есть от одного и того же серотипа, гетерологичными, т.е. от различных серотипов, или химерными, то есть инвертированный концевой повтор (ITR), который имеет последовательности ITR от более чем одного серотипа AAV.A "pseudotyped" rAAV is an infectious virus containing any combination of the AAV capsid protein and the AAV genome. Capsid proteins from any AAV serotype can be used with an rAAV genome that is derived from, or can be derived from, a wild-type AAV genome of another serotype, or that is a chimeric genome, that is, formed from AAV DNA from two or more different serotypes, e.g., a chimeric genome , containing 2 inverted terminal repeats (ITRs), with each ITR derived from a different serotype or chimeric ITR. The use of chimeric genomes, such as chimeric genomes containing ITRs from two AAV serotypes or chimeric ITRs, can lead to directed recombination, which can further enhance the production of transcriptionally active intermolecular concatamers. Thus, the 5' and 3' inverted terminal repeats (ITRs) within the rAAV vector of the invention may be homologous, i.e. from the same serotype, heterologous, i.e. from different serotypes, or chimeric, that is, an inverted terminal repeat (ITR) that has ITR sequences from more than one AAV serotype.

Векторы rAAVVectors rAAV

Аденоассоциированные вирусы любого серотипа являются подходящими для получения rAAV, так как различные серотипы являются функционально и структурно родственными, даже на генетическом уровне. Все серотипы AAV, по-видимому, проявляют сходные свойства репликации, опосредованной гомологичными генами rep; и все, как правило, несут три родственных капсидных белка, таких, которые экспрессируются в AAV2. Степень родства дополнительно подтверждается гетеродуплексным анализом, который показал широкую перекрестную гибридизацию между серотипами по длине генома; и присутствием схожих самоотжигаемых сегментов на концах, которые соответствуют инвертированным концевым повторам (ITR). Аналогичные паттерны инфекционности также позволяют предположить, что функции репликации в каждом серотипе находятся под аналогичным регуляторным контролем. Среди различных серотипов AAV чаще всего используют AAV2.Adeno-associated viruses of any serotype are suitable for the production of rAAV, since the different serotypes are functionally and structurally related, even at the genetic level. All AAV serotypes appear to exhibit similar replication properties mediated by homologous rep genes; and all typically carry three related capsid proteins, such as those expressed in AAV2. The degree of relatedness is further supported by heteroduplex analysis, which showed extensive cross-hybridization between serotypes along the genome length; and the presence of similar self-annealing segments at the ends that correspond to inverted terminal repeats (ITRs). Similar patterns of infectivity also suggest that replication functions in each serotype are under similar regulatory control. Among the various AAV serotypes, AAV2 is the most commonly used.

Вектор AAV согласно изобретению обычно содержит полинуклеотид, который является гетерологичным AAV. Полинуклеотид, как правило, представляет интерес из-за способности обеспечить клетку-мишень функцией в контексте генной терапии, такой как ап- или даунрегулирование экспрессии определенного фенотипа. Такой гетерологичный полинуклеотид или «трансген», как правило, имеет достаточную длину для обеспечения желательной функции или кодирующей последовательности.The AAV vector of the invention typically contains a polynucleotide that is heterologous to AAV. A polynucleotide is generally of interest because of its ability to provide a target cell with a function in the context of gene therapy, such as up- or down-regulation of the expression of a particular phenotype. Such a heterologous polynucleotide or “transgene” is typically of sufficient length to provide the desired function or coding sequence.

Когда транскрипция гетерологичного полинуклеотида является желательной в предполагаемой клетке-мишени, он может быть функционально связан со своим собственным или гетерологичным промотором, в зависимости, например, от желаемого уровня и/или специфичности транскрипции в клетках-мишенях, как известно в данной области. Различные типы промоторов и энхансеров являются подходящими для использования в этом контексте. Конститутивные промоторы обеспечивают постоянный уровень транскрипции гена, и может быть предпочтительным, когда это желательно, чтобы экспрессия терапевтического или профилактического полинуклеотида происходила на постоянной основе. Как правило, индуцируемые промоторы обладают низкой активностью в отсутствие индуктора, и апрегулированы в присутствии индуктора. Они могут быть предпочтительными, когда экспрессия желательна только в определенные моменты времени или в определенных локализациях, или когда желательно регулировать уровень экспрессии с использованием индуктора. Промоторы и энхансеры могут быть также тканеспецифическими: то есть они проявляют свою активность только в определенных типах клеток, что предположительно обусловлено регуляторными элементами гена, обнаруживаемыми исключительно в этих клетках.When transcription of a heterologous polynucleotide is desired in the intended target cell, it may be operably linked to its own or a heterologous promoter, depending, for example, on the desired level and/or specificity of transcription in the target cells, as is known in the art. Various types of promoters and enhancers are suitable for use in this context. Constitutive promoters provide a constant level of gene transcription, and may be preferred when it is desired that expression of a therapeutic or prophylactic polynucleotide occur on a continuous basis. Typically, inducible promoters have low activity in the absence of the inducer, and are upregulated in the presence of the inducer. They may be preferred when expression is desired only at certain times or in certain locations, or when it is desirable to regulate the level of expression using an inducer. Promoters and enhancers can also be tissue specific: that is, they are active only in certain types of cells, presumably due to gene regulatory elements found exclusively in those cells.

Примерами промоторов являются поздний промотор SV40 вируса обезьян 40, полиэдронный энхансерный/промоторный элемент бакуловируса, тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSV tk), сверхранний промотор цитомегаловируса (CMV) и различные ретровирусные промоторы, включая элементы LTR. Индуцируемые промоторы включают промоторы, индуцируемые ионами тяжелых металлов (такие как промотор мышиного вируса рака молочной железы (mMTV) или различные промоторы гормона роста), а также промоторы фага Т7, активные в присутствии РНК-полимеразы фага Т7. В качестве иллюстрации, примеры тканеспецифических промоторов включают различные промоторы сурфактина (для экспрессии в легком), промоторы миозина (для экспрессии в мышцах), а также промоторы альбумина (для экспрессии в печени). Множество других различных промоторов известно и, как правило, доступно в данной области, и последовательности многих таких промоторов содержатся в базах данных последовательностей, таких как база данных GenBank.Examples of promoters are the simian virus 40 late promoter SV40, the baculovirus polyhedron enhancer/promoter element, herpes simplex virus thymidine kinase (HSV tk), the cytomegalovirus (CMV) ultra-early promoter, and various retroviral promoters, including LTR elements. Inducible promoters include heavy metal ion-inducible promoters (such as the murine mammary tumor virus (mMTV) promoter or various growth hormone promoters) as well as T7 phage promoters that are active in the presence of T7 phage RNA polymerase. By way of illustration, examples of tissue-specific promoters include various surfactin promoters (for expression in the lung), myosin promoters (for expression in muscle), and albumin promoters (for expression in liver). Many other different promoters are known and generally available in the art, and the sequences of many such promoters are contained in sequence databases such as the GenBank database.

В случае, когда трансляция также желательна в предполагаемой клетке-мишени, гетерологичный полинуклеотид будет также предпочтительно содержать контрольные элементы, которые содействуют трансляции (такие как сайт связывания с рибосомой или «RBS» и сигнал полиаденилирования). Соответственно, гетерологичный полинуклеотид обычно содержит по меньшей мере один кодирующий участок, функционально связанный с подходящим промотором, и может также содержать, например, функционально связанный энхансер, сайт связывания с рибосомой и сигнал полиаденилирования. Гетерологичный полинуклеотид может содержать один кодирующий участок или несколько кодирующих участков, находящихся под контролем одного и того же или различных промоторов. Вся структурная единица, содержащая комбинацию контрольных элементов и кодирующего участка, часто называется как экспрессионная кассета.In the case where translation is also desired in the intended target cell, the heterologous polynucleotide will also preferably contain control elements that facilitate translation (such as a ribosome binding site or "RBS" and a polyadenylation signal). Accordingly, the heterologous polynucleotide typically contains at least one coding region operably linked to a suitable promoter, and may also contain, for example, an operably linked enhancer, a ribosome binding site, and a polyadenylation signal. A heterologous polynucleotide may contain one coding region or several coding regions under the control of the same or different promoters. The entire structural unit containing the combination of control elements and coding region is often referred to as an expression cassette.

Гетерологичный полинуклеотид интегрируют с помощью рекомбинантных технологий внутрь или вместо кодирующего участка генома AAV (т.е., вместо генов rep и cap AAV), но, как правило, является фланкированным с каждой стороны инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV. Это означает, что инвертированные концевые повторы (ITR) расположены на 5' и 3' концах кодирующих последовательностей, либо в непосредственной близости, например (хотя и не обязательно) без какой-либо встраиваемой последовательности AAV-происхождения для уменьшения вероятности рекомбинации, которая может регенерировать компетентный по репликации геном AAV. Тем не менее, может быть достаточно одного инвертированного концевого повтора (ITR) для осуществления функций, которые обычно связаны с конфигурациями, содержащими два ITR (см., например, WO 94/13788), и, таким образом, векторные конструкции, содержащие только один ITR, могут быть использованы в сочетании со способами упаковки и получения согласно настоящему изобретению.The heterologous polynucleotide is integrated by recombinant technology into or in place of the coding region of the AAV genome (ie, in place of the AAV rep and cap genes), but is typically flanked on each side by AAV inverted terminal repeats (ITRs). This means that inverted terminal repeats (ITRs) are located at the 5' and 3' ends of the coding sequences, or in close proximity, for example (though not necessarily) without any inserted sequence of AAV origin to reduce the likelihood of recombination that may regenerate replication competent AAV genome. However, a single inverted terminal repeat (ITR) may be sufficient to perform functions typically associated with configurations containing two ITRs (see e.g. WO 94/13788), and thus vector designs containing only one ITRs can be used in combination with the packaging and production methods of the present invention.

Нативные промоторы для rep являются саморегулируемыми и могут ограничивать количество продуцируемых частиц AAV. Ген rep может быть также функционально связан с гетерологичным промотором, независимо от того, является ли rep частью векторной конструкции, или расположен отдельно. Любой гетерологичный промотор, который сильно не даунрегулирован экспрессией гена rep, является подходящим; но индуцируемые промоторы могут быть предпочтительными, поскольку непрерывная экспрессия гена rep может оказаться гибельной для клетки-хозяина. Большое разнообразие индуцируемых промоторов известно в данной области; включая, в качестве иллюстрации, промоторы, индуцируемые ионами тяжелых металлов (например, промоторы металлотионеина); промоторы, индуцируемые стероидным гормоном (такие как промотор MMTV или промоторы гормона роста); и промоторы, такие как промоторы фага Т7, которые являются активными в присутствии РНК-полимеразы Т7. Один подкласс индуцируемых промоторов включает промоторы, которые индуцируются вирусом-помощником, который используют для дополнения репликации и упаковки вектора rAAV. Описан целый ряд индуцируемых вирусом-помощником промоторов, включая промотор ранних генов аденовируса, индуцируемый белком Е1А аденовируса; главный поздний промотор аденовируса; промотор вируса герпеса, индуцируемый белками вируса герпеса, такими как VP 16 или 1СР4; а также промоторы, индуцируемые осповакциной или поксвирусом.Native promoters for rep are self-regulating and can limit the number of AAV particles produced. The rep gene can also be operably linked to a heterologous promoter, whether rep is part of a vector construct or located separately. Any heterologous promoter that is not highly downregulated by rep gene expression is suitable; but inducible promoters may be preferred because continued expression of the rep gene may be lethal to the host cell. A wide variety of inducible promoters are known in the art; including, by way of illustration, heavy metal ion-inducible promoters (eg, metallothionein promoters); steroid hormone inducible promoters (such as the MMTV promoter or growth hormone promoters); and promoters, such as the T7 phage promoters, which are active in the presence of T7 RNA polymerase. One subclass of inducible promoters includes promoters that are induced by a helper virus that is used to complement the replication and packaging of the rAAV vector. A number of helper virus-inducible promoters have been described, including the adenovirus early gene promoter, induced by the adenovirus E1A protein; adenovirus major late promoter; a herpes virus promoter induced by herpes virus proteins such as VP 16 or 1CP4; and promoters induced by vaccinia or poxvirus.

Описаны способы идентификации и тестирования промоторов, индуцируемых вирусом-помощником (см., например, WO 96/17947). Таким образом, в данной области известны способы определения, являются или нет промоторы-кандидаты индуцируемыми вирусом-помощником, и будут ли они полезными для генерации клеток с высокой эффективностью упаковки. Вкратце, один такой способ включает замену промотора р5 гена rep AAV на предполагаемый промотор, индуцируемый вирусом-помощником (известным в данной области или идентифицированным с использованием хорошо известных методов, таких как соединение с «репортерными» генами, не несущими промотор). Гены rep-cap AAV (с заменой р5), например, соединенные с положительным селектируемым маркером, таким как ген устойчивости к антибиотикам, затем стабильно интегрировали в подходящую клетку-хозяина (такую как клетки HeLa или А549, проиллюстрированные ниже). Клетки, обладающие способностью расти относительно хорошо в условиях отбора (например, в присутствии антибиотика), затем тестировали на их способность экспрессировать гены rep и cap после добавления вируса-помощника. В качестве начального тестирования на экспрессию rep и/или cap, клетки могут быть легко подвергнуты скринингу с использованием иммунофлуоресценции для детекции белков Rep и/или Сар. Подтверждение способностей к упаковке и эффективности может быть затем получено с помощью функциональных тестов на репликацию и упаковку экзогенных векторов rAAV. С использованием этой методологии индуцируемый вирусом-помощником промотор гена мышиного металлотионеина был идентифицирован в качестве подходящей замены для промотора р5, и использован для продукции частиц rAAV в высоких титрах (как описано в WO 96/17947).Methods for identifying and testing helper virus-inducible promoters have been described (see, for example, WO 96/17947). Thus, methods are known in the art to determine whether or not candidate promoters are inducible by a helper virus and whether they will be useful for generating cells with high packaging efficiency. Briefly, one such method involves replacing the p5 promoter of the AAV rep gene with a putative promoter inducible by a helper virus (known in the art or identified using well-known methods such as coupling to promoter-less reporter genes). AAV rep-cap genes (with p5 substitution), for example, coupled to a positive selectable marker such as an antibiotic resistance gene, are then stably integrated into a suitable host cell (such as HeLa or A549 cells, illustrated below). Cells that were able to grow relatively well under selection conditions (eg, in the presence of an antibiotic) were then tested for their ability to express the rep and cap genes after the addition of a helper virus. As an initial test for rep and/or cap expression, cells can be easily screened using immunofluorescence to detect Rep and/or Cap proteins. Confirmation of packaging capabilities and efficiency can then be obtained using functional tests for replication and packaging of exogenous rAAV vectors. Using this methodology, the helper virus-inducible murine metallothionein gene promoter was identified as a suitable replacement for the p5 promoter, and used to produce high-titer rAAV particles (as described in WO 96/17947).

Удаление одного или нескольких генов AAV в любом случае желательно для уменьшения вероятности образования компетентного по репликации AAV («RCA»). Соответственно, кодирующие или промоторные последовательности для rep, cap или обоих могут быть удалены, поскольку функции, обеспечиваемые этими генами, могут быть обеспечены in trans, например, в стабильной линии или посредством котрансфекции.Deletion of one or more AAV genes is in any case desirable to reduce the likelihood of the formation of replication competent AAV (“RCA”). Accordingly, coding or promoter sequences for rep, cap, or both may be removed because the functions provided by these genes may be provided in trans, for example, in a stable line or through cotransfection.

Полученный вектор называется как «дефектный» по этим функциям. Для репликации и упаковки вектора отсутствующие функции дополняются пакующим геном или множеством пакующих генов, которые вместе кодируют необходимые функции для различных отсутствующих продуктов гена rep и/или cap.Пакующие гены или генные кассеты в одном варианте осуществления не фланкированы инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV и в одном варианте осуществления не проявляют какой-либо существенной гомологии с геномом rAAV. Таким образом, для того, чтобы свести к минимуму гомологичную рекомбинацию, происходящую в ходе процесса репликации, между последовательностью вектора и отдельно обеспеченными пакующими генами, желательно избежать перекрытия двух полинуклеотидных последовательностей. Уровень гомологии и соответствующая частота рекомбинации увеличиваются с увеличением длины гомологичных последовательностей и их уровня общей идентичности. Уровень гомологии, который будет представлять проблему в данной системе, может быть определен теоретически и подтвержден экспериментально, как известно в данной области. Однако обычно рекомбинации может быть значительно уменьшена или устранена, если перекрывающаяся последовательность представляет собой последовательность из менее чем около 25 нуклеотидов, если она по меньшей мере на 80% идентична по всей свой длине, или последовательность из менее чем около 50 нуклеотидов, если она по меньшей мере на 70% идентична по всей своей длине. Конечно, даже более низкие уровни гомологии являются предпочтительными, так как они будут дополнительно уменьшать вероятность рекомбинации. Оказалось, что, даже при отсутствии какой-либо гомологии перекрывающихся последовательностей, имеется некоторая остаточная частота генерации RCA. Даже дополнительные сокращения частоты генерации RCA (например, путем негомологичной рекомбинации) могут быть получены путем «расщепления» функций репликации и инкапсидирования AAV, как описано в WO 98/27204 автора Allen et al.The resulting vector is called “defective” based on these functions. For vector replication and packaging, the missing functions are supplemented by a packaging gene or multiple packaging genes that together encode the necessary functions for the various missing rep and/or cap gene products. The packaging genes or gene cassettes in one embodiment are not flanked by AAV and inverted terminal repeats (ITRs). in one embodiment, do not exhibit any significant homology to the rAAV genome. Thus, in order to minimize homologous recombination that occurs during the replication process between the vector sequence and the separately provided packaging genes, it is desirable to avoid overlap of two polynucleotide sequences. The level of homology and the corresponding frequency of recombination increases with the length of homologous sequences and their level of shared identity. The level of homology that will be a problem in a given system can be determined theoretically and confirmed experimentally, as is known in the art. Typically, however, recombination can be significantly reduced or eliminated if the overlapping sequence is a sequence of less than about 25 nucleotides if it is at least 80% identical over its entire length, or a sequence of less than about 50 nucleotides if it is at least at least 70% identical along its entire length. Of course, even lower levels of homology are preferred as they will further reduce the likelihood of recombination. It turned out that, even in the absence of any homology of overlapping sequences, there is some residual frequency of RCA generation. Even further reductions in the frequency of RCA generation (eg, by non-homologous recombination) can be achieved by “uncoupling” the AAV replication and encapsidation functions, as described in WO 98/27204 by Allen et al.

Векторная конструкция на основе rAAV и комплементарные упаковывающие генетические конструкции могут быть реализованы в данном изобретении в ряде различных форм. Вирусные частицы, плазмиды и стабильно трансформированные клетки-хозяева могут быть использованы для введения таких конструкций в упаковывающую клетку, временно или стабильно.The rAAV vector construct and complementary packaging genetic constructs can be implemented in the present invention in a number of different forms. Viral particles, plasmids and stably transformed host cells can be used to introduce such constructs into the packaging cell, either transiently or stably.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вектор AAV и комплементарный упаковывающий ген(ы), если таковые имеются, представлены в форме бактериальных плазмид, частиц AAV или любой их комбинации. В других вариантах осуществления последовательность вектора AAV, упаковывающий ген(ы), или и то и другое, представлены в форме генетически измененных (предпочтительно наследственно измененных) эукариотических клеток. Разработка клеток-хозяев, наследственно измененных для экспрессии последовательности вектора AAV, упаковывающих AAV генов, или того и другого, обеспечивает получение источника материала, который экспрессируется на надежном уровне.In some embodiments of the present invention, the AAV vector and complementary packaging gene(s), if any, are in the form of bacterial plasmids, AAV particles, or any combination thereof. In other embodiments, the AAV vector sequence, packaging gene(s), or both are presented in the form of genetically modified (preferably genetically modified) eukaryotic cells. The development of host cells genetically modified to express AAV vector sequences, AAV packaging genes, or both provides a source of material that is expressed at reliable levels.

Таким образом, множество различных генетически измененных клеток может быть использовано в контексте настоящего изобретения. В качестве иллюстрации, клетка-хозяин млекопитающего может быть использована по меньшей мере с одной интактной копией стабильно интегрированного вектора rAAV. Упаковывающая AAV плазмида, содержащая, по меньшей мере ген rep AAV, функционально связанный с промотором, может быть использована для обеспечения функций репликации (как описано в патенте США 5658776). Альтернативно, стабильная линия клеток млекопитающих с геном rep AAV, функционально связанным с промотором, может быть использована для обеспечения функций репликации (см., например, Trempe et al., WO 95/13392); Burstein et al. (WO 98/23018); и Johnson et al. (патент США 5656785). Ген cap AAV, обеспечивающий капсидирование белков, как описаны выше, может быть обеспечен вместе с геном rep AAV или отдельно (см., например, вышеуказанные заявки и патенты, а также Allen et al. (WO 98/27204). Другие комбинации возможны и включены в объем настоящего изобретения.Thus, a variety of different genetically modified cells can be used in the context of the present invention. By way of illustration, a mammalian host cell may be used with at least one intact copy of a stably integrated rAAV vector. An AAV packaging plasmid containing at least an AAV rep gene operably linked to a promoter can be used to provide replication functions (as described in US Pat. No. 5,658,776). Alternatively, a stable mammalian cell line with the AAV rep gene operably linked to the promoter can be used to provide replication functions (see, for example, Trempe et al., WO 95/13392); Burstein et al. (WO 98/23018); and Johnson et al. (US Patent 5656785). The AAV cap gene, which provides encapsidation of proteins as described above, can be provided together with the AAV rep gene or separately (see, for example, the above applications and patents, and Allen et al. (WO 98/27204). Other combinations are possible and included within the scope of the present invention.

Пути доставкиDelivery routes

Несмотря на огромную мозговую сосудистую сеть, системная доставка терапевтических средств к центральной нервной системе (CNS) является неэффективной для более 98% малых молекул и почти 100% крупных молекул (Partridge, 2005). Отсутствие эффективности обусловлено присутствием гематоэнцефалического барьера (ВВВ), который препятствует поступлению в головной мозг большинства чужеродных веществ, даже многих полезных терапевтических средств из циркулирующей крови. Несмотря на то, что некоторые низкомолекулярные, пептидные и белковые терапевтические средства, вводимые системно, достигают паренхимы головного мозга путем пересечения ВВВ (Banks, 2008), как правило, высокие системные дозы требуются для достижения терапевтических уровней, что может привести к возникновению неблагоприятных эффектов в организме. Терапевтические средства могут быть введены непосредственно в CNS путем интрацеребровентрикулярных или интрапаренхимальных инъекций. Интраназальная доставка обходит ВВВ и нацеливает терапевтические средства непосредственно на CNS, используя пути вдоль обонятельного и тройничного нервов, иннервирующих носовые проходы (Frey II, 2002; Thorne et al., 2004; Dhanda et al., 2005).Despite the enormous cerebral vasculature, systemic delivery of therapeutics to the central nervous system (CNS) is ineffective for more than 98% of small molecules and nearly 100% of large molecules (Partridge, 2005). The lack of effectiveness is due to the presence of the blood-brain barrier (BBB), which prevents most foreign substances, even many beneficial therapeutics, from entering the brain from the circulating blood. Although some systemically administered small molecule, peptide, and protein therapeutics reach the brain parenchyma by crossing the VVV (Banks, 2008), generally high systemic doses are required to achieve therapeutic levels, which may result in adverse effects in the brain. body. Therapeutics can be administered directly to the CNS by intracerebroventricular or intraparenchymal injections. Intranasal delivery bypasses the VVC and targets therapeutics directly to the CNS using pathways along the olfactory and trigeminal nerves innervating the nasal passages (Frey II, 2002; Thorne et al., 2004; Dhanda et al., 2005).

Любой путь введения rAAV может быть использован при условии, что этот путь и введенное количество являются профилактически или терапевтически полезными. В одном примере пути введения в CNS включают интратекальное и интракраниальное введение. Интракраниальное введение может представлять собой введение в мозжечково-мозговую цистерну или желудочек. Термин «мозжечково-мозговая цистерна» включает доступ к пространству вокруг и под мозжечком через отверстие между черепом и верхней частью позвоночника. Термин «желудочек мозга» включает полости в головном мозге, которые являются продолжением центрального канала спинного мозга. Интракраниальное введение осуществляют путем инъекции или инфузии, и подходящие диапазоны доз для интракраниального введения, как правило, составляют около 10³-10¹⁵ Any route of administration of rAAV may be used as long as the route and amount administered are prophylactically or therapeutically beneficial. In one example, routes of administration to the CNS include intrathecal and intracranial administration. Intracranial administration may be administration into the mesocerebellar cistern or ventricle. The term "cerebellomedullary cistern" includes access to the space around and below the cerebellum through the opening between the skull and the upper part of the spine. The term "ventricle" includes cavities in the brain that are an extension of the central canal of the spinal cord. Intracranial administration is by injection or infusion, and suitable dose ranges for intracranial administration are generally about 10 ³ -10 ¹⁵

инфекционных единиц вирусного вектора на микролитр, доставляемых в 1-3000 микролитрах объема единичной инъекции. Например, геномы вируса или инфекционные единицы вектора на микролитр, как правило, будут содержать около 10⁴, 10⁵, ΙΟ⁶, ΙΟ⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, ΙΟ¹², 10¹³, 10 м, 10¹⁵, 10¹⁶, или 10¹⁷ геномов вируса или инфекционных единиц вирусного вектора, доставляемых в около 10, 50, 100, 200, 500, 1000 или 2000 микролитрах. Следует понимать, что вышеуказанная дозировка является лишь иллюстративной и специалистам в данной области будет понятно, что эта дозировка может варьировать. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных в тестовых системах in vitro или in vivo.infectious units of viral vector per microliter, delivered in 1-3000 microliters of single injection volume. For example, virus genomes or infectious vector units per microliter will typically contain about 10 ⁴ , 10 ⁵ , ΙΟ ⁶ , ΙΟ ⁷ , 10 ⁸ , 10 ⁹ , 10 ¹⁰ , 10 ¹¹ , ΙΟ ¹² , 10 ¹³ , 10 m, 10 ¹⁵ , 10 ¹⁶ , or 10 ¹⁷ viral genomes or viral vector infectious units, delivered in about 10, 50, 100, 200, 500, 1000 or 2000 microliters. It should be understood that the above dosage is illustrative only and those skilled in the art will appreciate that this dosage may vary. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves obtained in in vitro or in vivo test systems.

AAV, доставляемый в интратекальных способах лечения согласно настоящему изобретению, можно вводить любым общепринятым путем, обычно используемым для интратекального введения. Например, интратекальное введение может быть осуществлено посредством медленной инфузии препарата в течение приблизительно одного часа. Интратекальное введение осуществляют посредством инъекции или инфузии, и подходящие диапазоны доз для интратекального введения, как правило, составляют около 10³-10¹⁵ инфекционных единиц вирусного вектора на микролитр, доставляемых, например, в 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 или 100 миллилитрах или более, например, 1-10000 миллилитрах или 0,5-15 миллилитрах объема единичной инъекции. Например, геномы вируса или инфекционные единицы вектора на микролитр, как правило, будут содержать около 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ или 10¹⁴ геномов вируса или инфекционных единиц вирусного вектора.AAV delivered in the intrathecal methods of treatment according to the present invention can be administered by any conventional route commonly used for intrathecal administration. For example, intrathecal administration can be accomplished by slow infusion of the drug over approximately one hour. Intrathecal administration is by injection or infusion, and suitable dose ranges for intrathecal administration are typically about 10 ³ -10 ¹⁵ infectious units of viral vector per microliter, delivered, for example, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 or 100 milliliters or more, for example 1-10,000 milliliters or 0.5-15 milliliters of unit injection volume. For example, virus genomes or infectious vector ^units per microliter will typically contain about 10 ⁴ , 10 ⁵ , 10 ⁶ , 10 7 , 10 ⁸ , 10 ⁹ , 10 ¹⁰ , 10 ¹¹ , 10 ¹² , 10 ¹³ or 10 ¹⁴ genomes virus or infectious units of a viral vector.

AAV, доставляемый в интраназальных способах лечения согласно настоящему изобретению, может быть введен в дозах, находящихся в подходящих диапазонах, как правило, около 10³-10¹⁵ инфекционных единиц вирусного вектора на микролитр, доставляемых, например, в 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 или 100 миллилитрах или более, например, 1-10000 миллилитрах или 0,5-15 миллилитрах. Например, геномы вируса или инфекционные единицы вектора на микролитр, как правило, будут содержать около 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10 м, 10¹⁵, 10¹⁶ или 10¹⁷ геномов вируса или инфекционных единиц вирусного вектора, например, по меньшей мере 1,2×10¹ Геномов или инфекционных единиц, например, по меньшей мере от 2×10¹¹ до около 2×10¹² геномов или инфекционных единиц, или от около 1×10¹³ до около 5×10¹⁶ геномов или инфекционных единиц. В одном варианте осуществления AAV, используемый для интраназальной доставки, представляет собой такой AAV, который связывается с гликанами, содержащими концевые остатки галактозы, и в одном варианте осуществления доза в 2-8 раз превышает дозу, составляющую от 9×10¹⁰ до менее чем 1 χ 10¹¹ геномов AAV8 или инфекционных единиц вирусного вектора.AAV delivered in intranasal treatments according to the present invention can be administered in doses falling within suitable ranges, typically about 10 ³ -10 ¹⁵ infectious units of viral vector per microliter delivered, for example, 1, 2, 5, 10 , 25, 50, 75 or 100 milliliters or more, for example 1-10000 milliliters or 0.5-15 milliliters. For example, viral genomes or infectious vector ^units per microliter will typically contain about 10 ⁴ , 10 ⁵ , 10 ⁶ , 10 7 , 10 ⁸ , 10 ⁹ , 10 ¹⁰ , 10 ¹¹ , 10 ¹² , 10 ¹³ , 10 m ^{or _ _ _ _ _} infectious units, or from about 1x10 ¹³ to about 5x10 ¹⁶ genomes or infectious units. In one embodiment, the AAV used for intranasal delivery is one that binds to glycans containing terminal galactose residues, and in one embodiment, the dose is 2-8 times the dose, ranging from 9x10 ¹⁰ to less than 1 χ 10 ¹¹ AAV8 genomes or viral vector infectious units.

Терапия, в случае экспрессии лизосомного фермента, связанного с лизосомной болезнью накопления, такого как IDUA, приводит к нормализации лизосомных гранул накопления в нейрональной и/или менингеальной ткани субъектов, как обсуждалась выше. Предполагается, что осаждение гранул накопления из нейрональной и глиальной ткани уменьшается, тем самым ослабляя задержку и регрессию развития, наблюдаемую у индивидуумов, страдающих лизосомной болезнью накопления. Другие эффекты терапии могут включать нормализацию лизосомных гранул накопления в оболочках головного мозга вблизи арахноидальной грануляции, присутствие которой в лизосомной болезни накопления приводит к гидроцефалии с высоким давлением. Способы согласно изобретению можно также применять для лечения компрессии спинного мозга позвоночника, возникшей вследствие присутствия лизосомных гранул накопления в шейных сегментах спинного мозга С1-С5 или где-либо в других местах в спинном мозге. Способы согласно изобретению также направлены на лечение кист, которые вызваны периваскулярным накоплением лизосомных гранул накопления вокруг сосудов головного мозга. В других вариантах осуществления терапия может также успешно приводить к нормализации объема печени и экскреции гликозаминогликанов с мочой, уменьшению размера селезенки и событий апноэ/гипопноэ, увеличению длины тела и скорости роста у субъектов в препубертатный период, увеличению сгибания рук в плечевом суставе и увеличению разгибания в локтевом и коленном суставах, и уменьшению трикуспидальной регургитации или легочной регургитации.Therapy, in the case of expression of a lysosomal enzyme associated with lysosomal storage disease, such as IDUA, leads to normalization of lysosomal storage granules in the neuronal and/or meningeal tissue of the subjects, as discussed above. It is hypothesized that deposition of storage granules from neuronal and glial tissue is reduced, thereby attenuating the developmental delay and regression observed in individuals suffering from lysosomal storage disease. Other effects of therapy may include normalization of lysosomal storage granules in the meninges near the arachnoid granulation, the presence of which in lysosomal storage disease results in high-pressure hydrocephalus. The methods of the invention can also be used to treat vertebral spinal cord compression resulting from the presence of lysosomal storage granules in the C1-C5 cervical segments of the spinal cord or elsewhere in the spinal cord. The methods of the invention are also directed to the treatment of cysts that are caused by perivascular accumulation of lysosomal storage granules around brain vessels. In other embodiments, the therapy may also successfully result in normalization of liver volume and urinary glycosaminoglycan excretion, reduction of spleen size and apnea/hypopnea events, increase in length and growth rate in prepubertal subjects, increase in shoulder flexion, and increase in shoulder extension. elbow and knee joints, and a decrease in tricuspid regurgitation or pulmonary regurgitation.

Интратекальное введение согласно настоящему изобретению может включать введение композиции в поясничную область. Любое такое введение может быть осуществлено посредством болюсной инъекции. В зависимости от тяжести симптомов и отвечаемости субъекта на терапию, болюсную инъекцию можно вводить раз в неделю, раз в месяц, раз в 6 месяцев или ежегодно. В других вариантах осуществления интратекальное введение достигается за счет использования инфузионного насоса. Специалистам в данной области техники известны устройства, которые могут быть использованы для осуществления интратекального введения композиции. Композицию можно вводить интратекально, например, путем единичной инъекции или непрерывной инфузии. Следует понимать, что режим дозирования может представлять собой схему на основе однократной дозы или многократных доз.Intrathecal administration according to the present invention may include administration of the composition to the lumbar region. Any such administration may be accomplished by bolus injection. Depending on the severity of symptoms and the subject's response to therapy, a bolus injection may be administered once weekly, once monthly, once every 6 months, or annually. In other embodiments, intrathecal administration is achieved through the use of an infusion pump. Those skilled in the art are aware of devices that can be used to effect intrathecal administration of the composition. The composition can be administered intrathecally, for example, by a single injection or continuous infusion. It should be understood that the dosage regimen may be a single dose or multiple dose regimen.

Используемый здесь термин «интратекальное введение» включает доставку фармацевтической композиции непосредственно в спинномозговую жидкость субъекта способами, включающими латеральную церебровентрикулярную инъекцию через трепанационное отверстие или посредством цистернальной или люмбальной пункции, или т.п.Термин «поясничная область» предусматривает включение области между третьим и четвертым поясничными позвонками (позвонками нижнего отдела спины) и, в частности, L2-S1 область позвоночника.As used herein, the term "intrathecal administration" includes delivery of a pharmaceutical composition directly into the cerebrospinal fluid of a subject by methods including lateral cerebroventricular injection through a burr hole or by cisternal or lumbar puncture, or the like. The term "lumbar region" is intended to include the area between the third and fourth lumbar vertebrae (vertebrae of the lower back) and, in particular, the L2-S1 region of the spine.

Введение композиции в соответствии с настоящим изобретением в любой из вышеуказанных участков может быть достигнуто путем прямой инъекции композиции или путем использования инфузионных насосов. Для инъекции композиция может быть составлена в виде жидких растворов, например, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или фосфатный буфер. Кроме того, фермент может быть составлен в твердой форме и повторно растворен или суспендирован непосредственно перед применением. Лиофилизированные формы также включены. Инъекция может быть осуществлена, например, в форме болюсной инъекции или непрерывной инфузии (например, с использованием инфузионных насосов) фермента.Administration of the composition according to the present invention to any of the above sites can be achieved by direct injection of the composition or by the use of infusion pumps. For injection, the composition can be formulated as liquid solutions, for example, in physiologically compatible buffers such as Hanks' solution, Ringer's solution or phosphate buffer. In addition, the enzyme can be formulated in solid form and re-dissolved or suspended immediately before use. Lyophilized forms are also included. The injection may be carried out, for example, in the form of a bolus injection or a continuous infusion (eg using infusion pumps) of the enzyme.

В одном варианте осуществления изобретения rAAV вводят путем латеральной церебровентрикулярной инъекции в головной мозг субъекта. Инъекция может быть проведена, например, через трепанационное отверстие, сделанное в черепе субъекта. В другом варианте осуществления фермент и/или другой фармацевтический препарат вводят через хирургический введенный шунт в желудочке головного мозга субъекта. Например, инъекция может быть сделана в латеральные желудочки, которые больше по размеру, хотя может быть выполнена также инъекция путем введения в третий и четвертый, меньшие по размеру, желудочки. В еще одном варианте осуществления композиции, используемые в настоящем изобретении, вводят путем инъекции в мозжечково-мозговую цистерну или поясничную область субъекта.In one embodiment of the invention, rAAV is administered by lateral cerebroventricular injection into the brain of a subject. The injection may be carried out, for example, through a burr hole made in the subject's skull. In another embodiment, the enzyme and/or other pharmaceutical is administered through a surgically inserted shunt into a ventricle of the subject's brain. For example, the injection can be made into the lateral ventricles, which are larger, although the injection can also be made into the third and fourth, smaller ventricles. In yet another embodiment, the compositions used in the present invention are administered by injection into the cerebellomedullary cistern or lumbar region of a subject.

Несмотря на отсутствие полного понимания конкретных механизмов, лежащих в основе интраназальной доставки лекарственного средства в CNS, накопленный объем данных показывает, что пути, в которые вовлечены нервы, соединяющие носовые проходы с головным мозгом и спинным мозгом, являются важными. Кроме того, пути, в которые вовлечена васкулатура, спинномозговая жидкость и лимфатическая система, задействованы в транспорте молекул из носовой полости в CNS. Вероятно, что сочетание этих путей, хотя в зависимости от свойств терапевтического средства один путь может преобладать, обуславливает характеристики используемого препарата и устройства для доставки.Although there is no complete understanding of the specific mechanisms underlying intranasal drug delivery to the CNS, accumulating evidence suggests that pathways involving nerves connecting the nasal passages to the brain and spinal cord are important. In addition, pathways involving the vasculature, cerebrospinal fluid, and lymphatic system are involved in the transport of molecules from the nasal cavity to the CNS. It is likely that the combination of these pathways, although depending on the properties of the therapeutic agent one pathway may predominate, determines the characteristics of the drug and delivery device used.

Терапевтические средства могут быстро получать доступ к CNS после интраназального введения вдоль путей обонятельных нервов, ведущих из носовой полости непосредственно в CNS. Пути обонятельных нервов являются основным компонентом интраназальной доставки, что подтверждается тем, что флуоресцентные метки связываются с обонятельными нервами, так только они пересекают решетчатую пластину (Jansson и др., 2002), при этом концентрации лекарственного средства в обонятельных луковицах обычно являются одними из самых высоких концентраций, наблюдаемых в CNS (Thorne et al., 2004; Banks et al., 2004; Graff et al., 2005a); Nonaka et al., 2008; Ross et al., 2004; Ross et al., 2008; Thorne et al., 2008), и существует сильная положительная корреляция между концентрациями в обонятельном эпителии и обонятельных луковицах (Dhuria et al., 2009а).Therapeutics can quickly access the CNS after intranasal administration along the olfactory nerve pathways leading from the nasal cavity directly to the CNS. The olfactory nerve pathway is a major component of intranasal delivery, as evidenced by the fact that fluorescent tags bind to the olfactory nerves as soon as they cross the lamina cribrosa (Jansson et al., 2002), with drug concentrations in the olfactory bulb typically being among the highest concentrations observed in the CNS (Thorne et al., 2004; Banks et al., 2004; Graff et al., 2005a); Nonaka et al., 2008; Ross et al., 2004; Ross et al., 2008; Thorne et al., 2008), and there is a strong positive correlation between concentrations in the olfactory epithelium and olfactory bulbs (Dhuria et al., 2009a).

Обонятельные пути начинаются в верхней части носовых проходов, в обонятельной области, где обонятельные рецепторные нейроны (ORN) располагаются между вспомогательными клетками (поддерживающими клетками), микровиллярными клетками и базальными клетками. Обонятельные рецепторные нейроны (ORN) опосредуют обоняние путем передачи чувствительной информации с периферии в CNS (Clerico et al., 2003). Под эпителием собственная пластинка содержит выделяющие секрет железы Боумена, аксоны, кровеносные сосуды, лимфатические сосуды и соединительную ткань. Дендриты ORN погружены в слой слизи, покрывающий обонятельный эпителий, при этом аксоны этих биполярных нейронов проходят в полость черепа через собственную пластинку и через отверстия в продырявленной пластине решетчатой кости, которая отделяет носовую полость от полости черепа. Аксоны ORN проходят через субарахноидальное пространство, содержащее CSF, и оканчиваются на митральных клетках в обонятельных луковицах. Оттуда нейронные проекции распространяются на множество областей головного мозга, включая обонятельный тракт, переднее обонятельное ядро, грушевидную кору, миндалину и гипоталамус (Buck, 2000). В дополнении к ORN, хемосенсорные нейроны, расположенные на переднем конце носовой полости в ганглионе Грюнеберга, ведут в обонятельные луковицы (Fuss et al., 2005; Koos et al., 2005).The olfactory pathways begin at the top of the nasal passages, in the olfactory region, where olfactory receptor neurons (ORNs) are located between the supporting cells (supporting cells), microvilli cells, and basal cells. Olfactory receptor neurons (ORNs) mediate olfaction by transmitting sensory information from the periphery to the CNS ( Clerico et al., 2003 ). Beneath the epithelium, the lamina propria contains secreting Bowman's glands, axons, blood vessels, lymphatic vessels, and connective tissue. The dendrites of the ORN are embedded in a layer of mucus covering the olfactory epithelium, with the axons of these bipolar neurons extending into the cranial cavity through the lamina propria and through openings in the lamina perforatum of the ethmoid bone, which separates the nasal cavity from the cranial cavity. ORN axons pass through the subarachnoid space containing CSF and terminate on mitral cells in the olfactory bulbs. From there, neural projections extend to multiple brain regions, including the olfactory tract, anterior olfactory nucleus, piriform cortex, amygdala, and hypothalamus (Buck, 2000). In addition to the ORN, chemosensory neurons located at the anterior end of the nasal cavity in the Gruneberg ganglion lead to the olfactory bulb (Fuss et al., 2005; Koos et al., 2005).

Уникальные характеристики обонятельных рецепторных нейронов (ORN) способствуют динамическому клеточному окружению, важному для интраназальной доставки в CNS. Из-за непосредственного контакта с токсинами во внешней среде, обонятельные рецепторные нейроны (ORN) регенерируют каждые 3-4 недели из базальных клеток, находящихся в обонятельном эпителии (Mackay-Sim, 2003). Специальные клетки, подобные шванновской клетке, называемые обкладочными нейроэпителиальными клетками (ОЕС), обволакивают аксоны обонятельных рецепторных нейронов (ORN) и играют важную роль в регенерации, возобновлении роста и ремиелинизации аксонов (Field et al., 2003; Li et al., 2005a; Li et al., 2005b). Обкладочные нейроэпителиальные клетки ОЕС создают непрерывные, заполненные жидкостью периневральные каналы, которые, что примечательно, остаются открытыми, несмотря на дегенерацию и регенерацию обонятельных рецепторных нейронов (ORN) (Williams et al., 2004).The unique characteristics of olfactory receptor neurons (ORNs) contribute to a dynamic cellular environment important for intranasal delivery to the CNS. Due to direct contact with toxins in the external environment, olfactory receptor neurons (ORNs) regenerate every 3–4 weeks from basal cells found in the olfactory epithelium (Mackay-Sim, 2003). Specialized Schwann cell-like cells called parietal neuroepithelial cells (OECs) envelop the axons of olfactory receptor neurons (ORNs) and play important roles in axonal regeneration, regrowth, and remyelination (Field et al., 2003; Li et al., 2005a; Li et al., 2005b). The paring neuroepithelial cells of the OEC create continuous, fluid-filled perineural canals that, remarkably, remain open despite degeneration and regeneration of olfactory receptor neurons (ORNs) (Williams et al., 2004).

Благодаря уникальному окружению обонятельного эпителия, интраназально вводимые терапевтические средства могут достигать CNS посредством внеклеточных или внутриклеточных механизмов транспорта по обонятельным нервам. Механизмы внеклеточного транспорта включают быстрое движение молекул между клетками в назальном эпителии, требующее лишь от нескольких минут до 30 минут для достижения лекарственным средством обонятельных луковиц и других областей CNS после интраназального введения (Frey II, 2002; Balin et al., 1986). Транспорт, по всей вероятности, включает механизмы объемного потока (Thorne et al., 2004; Thorne et al., 2001) в каналах, образованных обкладочными нейроэпителиальными клетками (ОЕС). Лекарственные средства могут также перемещаться по этим каналам за счет структурных изменений, которые происходят во время деполяризации и аксонального распространения потенциала действия в соседних аксонах (Luzzati et al., 2004). Механизмы внутриклеточного транспорта включают поглощение молекул обонятельными рецепторными нейронами (ORN) путем пассивной диффузии, рецептор-опосредованного эндоцитоза или адсорбционного эндоцитоза с последующим более медленным аксональным транспортом, при этом требуется от нескольких часов до нескольких дней для появления лекарственного средства в обонятельных луковицах и других областях головного мозга (Baker et al., 1986; Broadwell et al., 1985; Kristensson et al., 1971). Внутриклеточный транспорт в ORN был продемонстрирован для малых липофильных молекул, таких как частицы золота (de Lorenzo, 1970; Gopinath et al., 1978), соли алюминия (Perl et al., 1987), а также для веществ с рецепторами на ORN, таких как WGA-HRP (Thorne et al., 1995; Baker et al., 1986; Itaya et al., 1986; Shipley, 1985). Несмотря на то, что внутриклеточные механизмы являются важными для определенных терапевтических средств, маловероятно, что они будут являться преобладающим механизмом транспорта в CNS. В то время как некоторые крупные молекулы, такие как галанин-подобный пептид (GALP), проявляют пути насыщаемого транспорта в CNS (Nonaka et al., 2008), для других крупных молекул, таких как фактор роста нервов (NGF) и инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I), интраназальная доставка в головной мозг является ненасыщаемой и не опосредованной рецептором (Thorne et al., 2004; Chen et al., 1998; Zhao et al., 2004).Due to the unique environment of the olfactory epithelium, intranasally administered therapeutics can reach the CNS via extracellular or intracellular transport mechanisms along the olfactory nerves. Extracellular transport mechanisms involve the rapid movement of molecules between cells in the nasal epithelium, requiring only a few minutes to 30 minutes for the drug to reach the olfactory bulb and other areas of the CNS after intranasal administration (Frey II, 2002; Balin et al., 1986). Transport likely involves bulk flow mechanisms (Thorne et al., 2004; Thorne et al., 2001) in channels formed by parietal neuroepithelial cells (OPCs). Drugs can also move along these channels due to structural changes that occur during depolarization and axonal propagation of action potentials in adjacent axons (Luzzati et al., 2004). Mechanisms of intracellular transport include uptake of molecules by olfactory receptor neurons (ORNs) by passive diffusion, receptor-mediated endocytosis, or adsorption endocytosis followed by slower axonal transport, requiring hours to days for the drug to appear in the olfactory bulbs and other areas of the brain. brain (Baker et al., 1986; Broadwell et al., 1985; Kristensson et al., 1971). Intracellular transport into the ORN has been demonstrated for small lipophilic molecules such as gold particles (de Lorenzo, 1970; Gopinath et al., 1978), aluminum salts (Perl et al., 1987), as well as for substances with receptors on the ORN, such as WGA-HRP (Thorne et al., 1995; Baker et al., 1986; Itaya et al., 1986; Shipley, 1985). Although intracellular mechanisms are important for certain therapeutic agents, they are unlikely to be the predominant mechanism of transport into the CNS. While some large molecules such as galanin-like peptide (GALP) exhibit saturable transport pathways in the CNS (Nonaka et al., 2008), other large molecules such as nerve growth factor (NGF) and insulin-like growth factor -I (IGF-I), intranasal delivery to the brain is non-saturable and non-receptor mediated (Thorne et al., 2004; Chen et al., 1998; Zhao et al., 2004).

Часто игнорируемый, но важный путь, соединяющий носовые проходы с CNS, включает тройничный нерв, который обеспечивает иннервацию дыхательного и обонятельного эпителия носовых проходов и входит в CNS на уровне варолиева моста (Clerico et al., 2003; Graff et al., 2003). Примечательно, что небольшая часть тройничного нерва также оканчивается в обонятельных луковицах (Schaefer et al., 2002). Клеточный состав дыхательной области носовых проходов отличается от клеточного состава обонятельной области тем, что клетки ресничного эпителия распределены среди продуцирующих слизь бокаловидных клеток. Эти клетки способствуют механизмам мукоцилиарного клиренса, обеспечивающим удаление слизи, а также чужеродных субстанций из носовой полости в носоглотку. Тройничный нерв передает сенсорную информацию из носовой полости, ротовой полости, век и роговицы в CNS через глазную ветвь (VI), верхнечелюстную ветвь (V2) или нижнечелюстную ветвь (V3) тройничного нерва (Clerico et al., 2003; Gray, 1978). Ветви глазного нерва, являющегося ветвью тройничного нерва, обеспечивают иннервацию слизистой оболочки дорсального носового хода и передней части носа, при этом верхнечелюстная ветвь обеспечивают иннервацию боковых стенок слизистой оболочки носа. Нижнечелюстная ветвь тройничного нерва проходит к нижней челюсти и зубам без прямых входов нейронов в носовую полость. Три ветви тройничного нерва сходятся в ганглии тройничного нерва, который входит в головной мозг в области варолиева моста, заканчиваясь в спинномозговом ядре тройничного нерва в стволе головного мозга. Уникальная особенность тройничного нерва состоит в том, что он входит в головной мозг из респираторного эпителия носовых проходов в двух местах: (1) через переднее рваное отверстие вблизи варолиева моста и (2) через решетчатую пластинку вблизи обонятельных луковиц, создавая точки входа в хвостовые и ростральные области головного мозга после интраназального введения. Кроме того, вероятно, что другие нервы, которые иннервируют лицо и голову, такие как лицевой нерв, или другие сенсорные структуры в полости носа, такие как ганглии Грюнеберга, могут обеспечить точки входа для интраназально применяемых терапевтических средств в CNS.An often overlooked but important pathway connecting the nasal passages to the CNS involves the trigeminal nerve, which supplies the respiratory and olfactory epithelium of the nasal passages and enters the CNS at the level of the pons (Clerico et al., 2003; Graff et al., 2003). Notably, a small portion of the trigeminal nerve also terminates in the olfactory bulbs (Schaefer et al., 2002). The cellular composition of the respiratory region of the nasal passages differs from the cellular composition of the olfactory region in that ciliated epithelial cells are distributed among mucus-producing goblet cells. These cells contribute to mucociliary clearance mechanisms that remove mucus as well as foreign substances from the nasal cavity into the nasopharynx. The trigeminal nerve transmits sensory information from the nasal cavity, oral cavity, eyelids, and cornea to the CNS via the ophthalmic branch (VI), maxillary branch (V2), or mandibular branch (V3) of the trigeminal nerve (Clerico et al., 2003; Gray, 1978). The branches of the ophthalmic nerve, which is a branch of the trigeminal nerve, provide innervation to the mucous membrane of the dorsal nasal passage and the anterior part of the nose, while the maxillary branch provides innervation to the lateral walls of the nasal mucosa. The mandibular branch of the trigeminal nerve passes to the lower jaw and teeth without direct neuronal inputs into the nasal cavity. The three branches of the trigeminal nerve converge at the trigeminal ganglion, which enters the brain at the pons, ending at the spinal trigeminal nucleus in the brain stem. A unique feature of the trigeminal nerve is that it enters the brain from the respiratory epithelium of the nasal passages in two places: (1) through the anterior foramen lacerum near the pons and (2) through the cribriform plate near the olfactory bulbs, creating entry points into the caudal and rostral areas of the brain after intranasal administration. In addition, it is likely that other nerves that innervate the face and head, such as the facial nerve, or other sensory structures in the nasal cavity, such as the Gruneberg ganglia, may provide entry points for intranasally administered therapeutics into the CNS.

Обычно интраназальный путь введения используют для доставки лекарственных средств в большой круг кровообращения посредством абсорбции в капиллярных кровеносных сосудах, выстилающих слизистую оболочку полости носа. Слизистая оболочка полости носа является высоковаскулярной, получающей кровоснабжение из ветвей верхнечелюстной, глазной и лицевой артерий, которые выходят из сонной артерии (Clerico et al., 2003; Cauna, 1982). Обонятельная слизистая оболочка получает кровь из малых ветвей глазной артерии, тогда как дыхательная слизистая оболочка получает кровь из артериальной ветви крупного калибра верхнечелюстной артерии (DeSesso, 1993). Относительная плотность кровеносных сосудов является более высокой в респираторной слизистой оболочке по сравнению с обонятельной слизистой оболочкой, что делает первую область идеальным участком абсорбции в крови (DeSesso, 1993). Васкулатура в дыхательной области содержит смесь непрерывного и фенестрированного эндотелия (Grevers et al., 1987; Van Diest et al., 1979), что позволяет как малым, так и крупным молекулам входить в большой круг кровообращения после назального введения.Typically, the intranasal route of administration is used to deliver drugs into the systemic circulation through absorption in the capillary blood vessels lining the nasal mucosa. The nasal mucosa is highly vascular, receiving its blood supply from branches of the maxillary, ophthalmic and facial arteries, which arise from the carotid artery (Clerico et al., 2003; Cauna, 1982). The olfactory mucosa receives blood from the minor branches of the ophthalmic artery, while the respiratory mucosa receives blood from the large arterial branch of the maxillary artery (DeSesso, 1993). The relative density of blood vessels is higher in the respiratory mucosa compared to the olfactory mucosa, making the former an ideal site of absorption in the blood (DeSesso, 1993). The vasculature in the respiratory region contains a mixture of continuous and fenestrated endothelium (Grevers et al., 1987; Van Diest et al., 1979), which allows both small and large molecules to enter the systemic circulation after nasal administration.

Доставка в CNS после абсорбции в большом круге кровообращения и последующего транспорта через ВВВ являются возможной, особенно для низкомолекулярных липофильных лекарственных средств, которые легче входят в кровоток и пересекают ВВВ по сравнению с высокомолекулярными гидрофильными терапевтическими средствами, такими как пептиды и белки.Delivery to the CNS following absorption into the systemic circulation and subsequent transport through the VVV is possible, especially for small molecule lipophilic drugs that more easily enter the bloodstream and cross the VVV compared to high molecular weight hydrophilic therapeutics such as peptides and proteins.

Появляется все больше данных, позволяющих предположить, что механизмы, в которые вовлечены каналы, связанные с кровеносными сосудами, или периваскулярные каналы, задействованы в интраназальной доставке лекарственных средств в CNS. Периваскулярные пространства расположены между наружным слоем кровеносных сосудов и базальной мембраной окружающей ткани (Pollock et al., 1997). Эти периваскулярные пространства действуют в качестве лимфатической системы для головного мозга, при этом субстанции, происходящие из нейронов, выводятся из интерстициальной жидкости головного мозга путем вхождения в периваскулярные каналы, связанные с кровеносными сосудами головного мозга. Периваскулярный транспорт обусловлен механизмами объемного потока, в отличие от взятой в отдельности диффузии (Cserr et al., 1981; Groothuis et al., 2007), и пульсации артерий также являются движущей силой для периваскулярного транспорта (Rennels et al., 1985; Rennels et al., 1985). Интраназально применяемые лекарственные средства могут перемещаться в периваскулярные пространства в носовых проходах или после достижения головного мозга, и широкое распределение, наблюдаемое в CNS, может быть обусловлено механизмами периваскулярного транспорта (Thorne et al., 2004).There is increasing evidence to suggest that mechanisms involving blood vessel-related or perivascular channels are involved in intranasal drug delivery to the CNS. Perivascular spaces are located between the outer layer of blood vessels and the basement membrane of the surrounding tissue (Pollock et al., 1997). These perivascular spaces act as a lymphatic system for the brain, with neuronal-derived substances being cleared from the interstitial fluid of the brain by entering perivascular channels connected to the blood vessels of the brain. Perivascular transport is driven by bulk flow mechanisms, as opposed to diffusion alone (Cserr et al., 1981; Groothuis et al., 2007), and arterial pulsatility is also the driving force for perivascular transport (Rennels et al., 1985; Rennels et al., 1985). al., 1985). Intranasally administered drugs may move into perivascular spaces in the nasal passages or after reaching the brain, and the wide distribution observed in the CNS may be due to perivascular transport mechanisms (Thorne et al., 2004).

Пути, соединяющие субарахноидальное пространство, содержащее CSF, периневральные пространства, охватывающие обонятельные нервы, и лимфатические сосуды носовой полости, являются важными для дренажа CSF, и эти же самые пути обеспечивают доступ интраназально применяемых терапевтических средств к CSF и другим областям CNS. Несколько исследований подтверждают, что метки, введенные в CSF в желудочках мозга или субарахноидальном пространстве, дренируют в нижнюю часть обонятельных луковиц в каналы, связанные с обонятельными нервами, пересекающими решетчатую пластинку, и достигают лимфатической системы носовой полости и шейных лимфатических узлов (Bradbury et al., 1983; Hatterer et al., 2006; Johnston et al., 2004a); Kida et al., 1993; Walter et al., 2006a; Walter et al., 2006b). Лекарственные средства могут получить доступ к CNS посредством этих же путей после интраназального введения, двигаясь от носовых проходов к CSF в интерстициальные пространства головного мозга и периваскулярные пространства для распределения по всему головному мозгу. Эти дренажные пути являются важными у животных некоторых видов (овцы, кролики и крысы), составляя приблизительно 50% клиренса CSF (Bradbury et al., 1981; Boulton et al., 1999; Boulton et al., 1996; Cserr et al., 1992). Пути между носовыми проходами и CSF все еще являются важными и функциональными у человека, о чем свидетельствует тот факт, что терапевтические средства непосредственно доставляются в CSF после интраназальной доставки без поступления в значительной степени в кровь (Born et al., 2002). Ряд исследований интраназальной доставки показывает, что лекарственные средства получают прямой доступ к CSF из носовой полости с последующим распределением в головном и спинном мозге. Многие интраназально введенные молекулы быстро входят в CSF, и этот транспорт зависит от липофильности, молекулярной массы и степени ионизации молекул (Dhanda et al., 2005; Born et al., 2002; Kumar et al., 1974; Sakane et al., 1995; Sakane et al., 1994; Wang et al., 2007). Оценка распределения в CSF может дать информацию о механизме интраназальной доставки.Pathways connecting the subarachnoid space containing CSF, the perineural spaces enclosing the olfactory nerves, and the lymphatic vessels of the nasal cavity are important for the drainage of CSF, and these same pathways allow intranasally administered therapeutic agents to access the CSF and other areas of the CNS. Several studies confirm that tags injected into the CSF in the cerebral ventricles or subarachnoid space drain into the inferior portion of the olfactory bulbs into canals associated with the olfactory nerves crossing the cribriform plate and reach the lymphatic system of the nasal cavity and cervical lymph nodes (Bradbury et al. , 1983; Hatterer et al., 2006; Johnston et al., 2004a); Kida et al., 1993; Walter et al., 2006a; Walter et al., 2006b). Drugs can access the CNS through these same pathways after intranasal administration, moving from the nasal passages to the CSF into the interstitial spaces of the brain and perivascular spaces for distribution throughout the brain. These drainage pathways are important in several animal species (sheep, rabbits and rats), accounting for approximately 50% of CSF clearance (Bradbury et al., 1981; Boulton et al., 1999; Boulton et al., 1996; Cserr et al., 1996). 1992). The pathways between the nasal passages and the CSF are still important and functional in humans, as evidenced by the fact that therapeutics are directly delivered to the CSF after intranasal delivery without entering the blood to a significant extent (Born et al., 2002). A number of intranasal delivery studies show that drugs gain direct access to CSF from the nasal cavity with subsequent distribution to the brain and spinal cord. Many intranasally administered molecules enter the CSF rapidly, and this transport depends on the lipophilicity, molecular weight, and degree of ionization of the molecules (Dhanda et al., 2005; Born et al., 2002; Kumar et al., 1974; Sakane et al., 1995 ; Sakane et al., 1994; Wang et al., 2007). Assessment of CSF distribution may provide information about the mechanism of intranasal delivery.

Оптимальная доставка в CNS вдоль нервных путей связана с доставкой агента в верхнюю треть полости носа (Hanson et al., 2008). Хотя положение «лежа на спине» может быть использовано, другим положением для нацеливания на обонятельную область является положение «praying to Месса», когда голова направлена вниз и вперед. Положение «лежа на спине» с головой, наклоненной под углом 70° или 90°, может быть подходящим для эффективной доставки в CSF с использованием трубки, вставленной в ноздри для доставки лекарственного средства посредством интраназального введения (van den Berg et al., (2002)).Optimal delivery to the CNS along neural pathways involves delivery of the agent to the upper third of the nasal cavity (Hanson et al., 2008). Although the supine position can be used, another position for targeting the olfactory area is the praying to mass position, where the head is directed downward and forward. The supine position with the head tilted at 70° or 90° may be suitable for effective delivery to the CSF using a tube inserted into the nostrils to deliver drug via intranasal administration (van den Berg et al., (2002) )).

Для интраназального введения лекарственного средства назальные капли можно вводить в течение 10-20 минут попеременно в каждую ноздрю каждые 1-2 минуты для обеспечения абсорбции раствора в назальном эпителии (Thorne et al., 2004; Capsoni et al., 2002; Ross et al., 2004; Ross et al., 2008; Dhuria et al., 2009a; Dhuria et al., 2009b; Francis et al., 2008; Martinez et al., 2008). Этот неинвазивный способ не включает помещение устройства в ноздри. Вместо этого капли помещают у открытия ноздри, позволяя индивидууму вдыхать каплю в носовую полость. Другие способы введения у подвергнутого анестезии индивидуума включают блокирование пищевода и вставку дыхательной трубки в трахею, чтобы предотвратить проглатывание назального препарата и устранить проблемы, связанные с дыхательной недостаточностью (Chow et al., 1999; Chow et al., 2001; Fliedner et al., 2006; Dahlin et al., 2001). Гибкая трубка может быть вставлена в ноздри для локализованной доставки небольшого объема раствора лекарственного средства в дыхательный или обонятельный эпителий, в зависимости от длины трубки (Chow et al., 1999; Van den Berg et al., 2003; van den Berg et al., 2004a; Banks et al., 2004; van den Berg et al., 2002; Vyas et al., 2006a; Charlton et al., 2007a; Gao et al., 2007a).For intranasal administration of the drug, nasal drops can be administered over 10-20 minutes alternately into each nostril every 1-2 minutes to ensure absorption of the solution into the nasal epithelium (Thorne et al., 2004; Capsoni et al., 2002; Ross et al. , 2004; Ross et al., 2008; Dhuria et al., 2009a; Dhuria et al., 2009b; Francis et al., 2008; Martinez et al., 2008). This non-invasive method does not involve placing the device in the nostrils. Instead, the drops are placed at the opening of the nostril, allowing the individual to inhale the drop into the nasal cavity. Other methods of administration in the anesthetized individual include blocking the esophagus and inserting a breathing tube into the trachea to prevent ingestion of the nasal drug and eliminate problems associated with respiratory failure (Chow et al., 1999; Chow et al., 2001; Fliedner et al., 2006; Dahlin et al., 2001). A flexible tube can be inserted into the nostrils to locally deliver a small volume of drug solution to the respiratory or olfactory epithelium, depending on the length of the tube (Chow et al., 1999; Van den Berg et al., 2003; van den Berg et al., 2004a; Banks et al., 2004; van den Berg et al., 2002; Vyas et al., 2006a; Charlton et al., 2007a; Gao et al., 2007a).

Устройства для назальной доставки, такие как спреи, капли для носа или безыгольные шприцы, могут быть использованы для нацеливания агента в различные области носовой полости. OptiMist представляет собой активируемое вдохом устройство, которое нацеливает жидкие или порошкообразные назальные препараты в носовую полость, включая обонятельную область, без осаждения в легких или пищеводе (Djupesland et al., 2006). Устройство ViaNase™ также может быть использовано для нацеливания назального спрея в обонятельный и дыхательный эпителий носовой полости. Назальные капли имеют тенденцию к осаждению на носовой перегородке и подвергаются быстрому мукоцилиарному клиренсу, тогда как назальные спреи распределяются в среднюю часть носового хода слизистой оболочки носа (Scheibe et al., 2008).Nasal delivery devices such as sprays, nasal drops, or needleless syringes can be used to target the agent to different areas of the nasal cavity. The OptiMist is a breath-activated device that targets liquid or powder nasal medications into the nasal cavity, including the olfactory region, without deposition in the lungs or esophagus (Djupesland et al., 2006). The ViaNase™ device can also be used to target a nasal spray to the olfactory and respiratory epithelium of the nasal cavity. Nasal drops tend to deposit on the nasal septum and undergo rapid mucociliary clearance, whereas nasal sprays are distributed into the midnasal mucosa (Scheibe et al., 2008).

Иммуносупрессант или агент, индуцирующий иммунологическую толерантность, может быть введен любым путем, включая парентеральный. В одном варианте осуществления иммуносупрессант или агент, индуцирующий иммунологическую толерантность, может быть введен путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции, перорально, интратекально, интракраниально или интраназально, или путем замедленного высвобождения, например, путем использования подкожного имплантата. Иммуносупрессант или агент, индуцирующий иммунологическую толерантность, может быть растворен или диспергирован в жидком носителе. Для парентерального введения активное вещество может быть подходящим образом смешано с приемлемым носителем, например, на основе различных растительных масел, таких как арахисовое масло, хлопковое масло и т.п. Могут быть также использованы другие носители для парентерального введения, такие как органические композиции с использованием солкеталя, глицерина, формаля, и водные препараты для парентерального введения. Для парентерального введения путем инъекции композиции могут содержать водный раствор водорастворимой фармацевтически приемлемой соли активных кислот в соответствии с изобретением, предпочтительно при концентрации 0,01-10%, и, необязательно, также стабилизирующий агент и/или буферные вещества в водном растворе. Единицы дозирования раствора могут быть удобным образом заключены в ампулы.The immunosuppressant or immunotolerance inducing agent may be administered by any route, including parenteral. In one embodiment, the immunosuppressant or immunotolerance inducing agent may be administered by subcutaneous, intramuscular or intravenous injection, orally, intrathecally, intracranial or intranasally, or by sustained release, such as through the use of a subcutaneous implant. The immunosuppressant or immunotolerance inducing agent may be dissolved or dispersed in a liquid carrier. For parenteral administration, the active substance may be suitably mixed with a suitable carrier, for example based on various vegetable oils such as peanut oil, cottonseed oil and the like. Other parenteral carriers may also be used, such as organic compositions using solketal, glycerol, formal, and aqueous parenteral formulations. For parenteral administration by injection, the compositions may contain an aqueous solution of a water-soluble pharmaceutically acceptable salt of the active acids according to the invention, preferably at a concentration of 0.01-10%, and optionally also a stabilizing agent and/or buffering agents in aqueous solution. Dosage units of the solution can be conveniently contained in ampoules.

Композиция, например, rAAV-содержащая композиция, содержащая иммуносупрессант композиция или композиция, индуцирующая иммунологическую толерантность, может быть представлена в форме единичной инъекционной дозы. Примеры носителей или разбавителей, подходящих для изготовления таких инъекционных доз, включают разбавители, такие как вода, этиловый спирт, макрогол, пропиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксилированный изостеариловый спирт и эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, агенты или буферы, регулирующие рН, такие как цитрат натрия, ацетат натрия и фосфат натрия, стабилизаторы, такие как пиросульфит натрия, EDTA, тиогликолевая кислота и тиомолочная кислота, изотонические агенты, такие как хлорид натрия и глюкоза, местные анестетики, такие как прокаина гидрохлорид и лидокаина гидрохлорид. Кроме того, могут быть добавлены обычные солюбилизирующие агенты и анальгетики. Инъекционные лекарственные формы могут быть изготовлены путем добавления таких носителей к ферменту или другому активному веществу в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам в данной области. Подробное описание фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ содержится в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991). Фармацевтически приемлемые препараты могут быть легко суспендированы в водных носителях и введены с помощью обычных игл для подкожных инъекций или с использованием инфузионных насосов. Перед введением препараты могут быть простерилизованы предпочтительно гамма-облучением или стерилизацией пучком электронов.The composition, for example, an rAAV-containing composition, an immunosuppressant-containing composition, or an immunotolerance-inducing composition, may be presented in the form of a unit injection dose. Examples of carriers or diluents suitable for the preparation of such injectable dosages include diluents such as water, ethyl alcohol, macrogol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, pH adjusting agents or buffers such as citrate sodium, sodium acetate and sodium phosphate, stabilizers such as sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid and thiolactic acid, isotonic agents such as sodium chloride and glucose, local anesthetics such as procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride. In addition, conventional solubilizing agents and analgesics may be added. Injectable dosage forms can be prepared by adding such carriers to an enzyme or other active substance in accordance with procedures well known to those skilled in the art. A detailed description of pharmaceutically acceptable excipients is contained in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991). Pharmaceutically acceptable drugs can be easily suspended in aqueous vehicles and administered using conventional hypodermic needles or using infusion pumps. Before administration, preparations may be sterilized, preferably by gamma irradiation or electron beam sterilization.

Когда иммуносупрессант или агент, индуцирующий иммунологическую толерантность, вводят в форме подкожного имплантата, соединение суспендируют или растворяют в медленно диспергируемом материале, известном специалистам в данной области, или вводят в устройство, которое медленно высвобождает активное вещество посредством использования постоянной движущей силы, такой как осмотический насос.В таких случаях возможно введение в течение продолжительного периода времени.When an immunosuppressant or immunotolerance inducing agent is administered in the form of a subcutaneous implant, the compound is suspended or dissolved in a slowly dispersible material known to those skilled in the art or introduced into a device that slowly releases the active agent through the use of a constant driving force such as an osmotic pump In such cases, administration over an extended period of time is possible.

Дозы, при которых вводят композицию, содержащую иммуносупрессант или агент, индуцирующий иммунологическую толерантность, могут изменяться в широком диапазоне и зависят от различных факторов, таких как тяжесть заболевания, возраст пациента и т.д., и могут быть индивидуально скорректированы. Возможный диапазон для количества, которое может быть введено в день, составляет примерно от 0,1 мг до примерно 2000 мг или примерно от 1 мг до примерно 2000 мг.Композиции, содержащие иммуносупрессант или агент, индуцирующий иммунологическую толерантность, могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечивать дозы в пределах этих диапазонов в виде единичных дозированной формы или множества дозированных форм. Дополнительно к содержанию иммуносупрессанта, рассматриваемые препараты могут содержать один или несколько rAAV, кодирующих терапевтический генный продукт.The dosage at which a composition containing an immunosuppressant or an immunotolerance-inducing agent is administered can vary widely and depend on various factors such as the severity of the disease, the age of the patient, etc., and can be individually adjusted. A possible range for the amount that may be administered per day is from about 0.1 mg to about 2000 mg, or from about 1 mg to about 2000 mg. Compositions containing an immunosuppressant or immunotolerance inducing agent can be formulated such that to provide doses within these ranges in a single dosage form or multiple dosage forms. In addition to containing an immunosuppressant, subject preparations may contain one or more rAAVs encoding a therapeutic gene product.

Композиции, описанные здесь, можно применять в комбинации с другим лекарственным средством. Композиции могут быть представлены в стандартных формах, например, в виде аэрозолей, растворов, суспензий, или композиций для местного применения, или в лиофилизированной форме.The compositions described herein may be used in combination with another drug. The compositions may be presented in standard forms, for example, as aerosols, solutions, suspensions, or topical compositions, or in lyophilized form.

Типичные композиции включают rAAV, иммуносупрессант, усилитель проницаемости или их комбинацию и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое может представлять собой носитель или разбавитель. Например, активный агент(ы) может быть смешан с носителем или разбавлен носителем, или заключен в носитель. Когда активный агент смешан с носителем, или когда носитель служит в качестве разбавителя, он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, который действует в качестве носителя, вспомогательного вещества или среды для активного агента. Некоторые примеры подходящих носителей включают воду, растворы солей, спирты, полиэтиленгликоли, полигидроксиэтоксилированное касторовое масло, арахисовое масло, оливковое масло, желатин, лактозу, каолин, сахарозу, декстрин, карбонат магния, сахар, циклодекстрин, амилозу, стеарат магния, тальк, желатин, агар, пектин, аравийскую камедь, стеариновую кислоту или низшие алкиловые эфиры целлюлозы, кремниевую кислоту, жирные кислоты, амины жирных кислот, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, сложные эфиры пентаэритритола и жирных кислот, полиоксиэтилен, гидроксиметилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Аналогично, носитель или разбавитель может включать любое вещество с замедленным высвобождением, известное в данной области, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, взятый в отдельности или в смеси с воском.Typical compositions include rAAV, an immunosuppressant, a penetration enhancer, or a combination thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient, which may be a carrier or diluent. For example, the active agent(s) may be mixed with the carrier or diluted with the carrier, or enclosed in the carrier. When the active agent is mixed with a carrier, or when the carrier serves as a diluent, it may be a solid, semi-solid or liquid material that acts as a carrier, excipient or vehicle for the active agent. Some examples of suitable carriers include water, saline solutions, alcohols, polyethylene glycols, polyhydroxyethoxylated castor oil, peanut oil, olive oil, gelatin, lactose, kaolin, sucrose, dextrin, magnesium carbonate, sugar, cyclodextrin, amylose, magnesium stearate, talc, gelatin, agar, pectin, gum acacia, stearic acid or lower alkyl cellulose esters, silicic acid, fatty acids, fatty acid amines, fatty acid monoglycerides and diglycerides, pentaerythritol fatty acid esters, polyoxyethylene, hydroxymethylcellulose and polyvinylpyrrolidone. Likewise, the carrier or diluent may include any sustained release agent known in the art, such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate, alone or mixed with a wax.

Препараты могут быть смешаны со вспомогательными веществами, которые не взаимодействуют пагубным образом с активным агентом(ами). Такие добавки могут включать смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, соли для влияния на осмотическое давление, буферы и/или окрашивающие вещества, консервирующие агенты, подслащивающие агенты или ароматизирующие агенты. Композиции также могут быть стерилизованы, по необходимости.The drugs may be mixed with excipients that do not interact in a detrimental manner with the active agent(s). Such additives may include wetting agents, emulsifying and suspending agents, salts to influence osmotic pressure, buffers and/or coloring agents, preservatives, sweetening agents or flavoring agents. The compositions may also be sterilized, if necessary.

При использовании жидкого носителя препарат может быть представлен в форме жидкости, такой как водная жидкая суспензия или раствор. Приемлемые растворители или носители включают стерилизованную воду, раствор Рингера или изотонический водный солевой раствор.When using a liquid carrier, the drug may be presented in the form of a liquid, such as an aqueous liquid suspension or solution. Acceptable solvents or carriers include sterilized water, Ringer's solution or isotonic aqueous saline solution.

Агент(ы) может быть представлен в форме порошка, подходящего для восстановления с помощью соответствующего раствора, описанного выше. Примеры включают, но без ограничения, порошки, полученные путем сушки замораживанием, ротационной сушки, сушки распылением, аморфные порошки, гранулы, осадки или твердые частицы. Композиция может необязательно содержать стабилизаторы, модификаторы рН, поверхностно-активные вещества, модификаторы биологической доступности и их комбинации. Стандартная лекарственная форма может содержаться в индивидуальных контейнерах или в контейнерах, рассчитанных на множество доз.The agent(s) may be in powder form suitable for reconstitution with the appropriate solution described above. Examples include, but are not limited to, powders obtained by freeze drying, rotary drying, spray drying, amorphous powders, granules, sludge or particulate matter. The composition may optionally contain stabilizers, pH modifiers, surfactants, bioavailability modifiers, and combinations thereof. The unit dosage form may be contained in individual containers or in multi-dose containers.

Композиции, рассматриваемые в настоящем изобретении, могут включать, например, мицеллы или липосомы, или какую-либо другую инкапсулированную форму, или могут быть введены в виде лекарственной формы с пролонгированным высвобождением для обеспечения длительного хранения и/или длительного эффекта доставки, например, с использованием биоразлагаемых полимеров, например, полилактид-полигликолида. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают сложные поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды).The compositions contemplated by the present invention may include, for example, micelles or liposomes, or some other encapsulated form, or may be administered as a sustained release dosage form to provide long-term storage and/or long-term delivery effect, e.g. biodegradable polymers, for example, polylactide-polyglycolide. Examples of other biodegradable polymers include poly(orthoesters) and poly(anhydrides).

Полимерные наночастицы, например, состоящие из гидрофобного ядра полимолочной кислоты (PLA) и гидрофильной оболочки метокси-поли(этиленгликоля) (MPEG), могут обладать улучшенной растворимостью и нацеливать на CNS. Региональные различия в нацеливании между композициями в виде микроэмульсий и наночастиц могут быть обусловлены различиями в размерах частиц.Polymeric nanoparticles, such as those composed of a hydrophobic polylactic acid (PLA) core and a hydrophilic methoxy-poly(ethylene glycol) (MPEG) shell, may have improved solubility and CNS targeting. Regional differences in targeting between microemulsion and nanoparticle formulations may be due to differences in particle size.

Липосомы представляют собой очень простые структуры, состоящие из одного или более липидных бислоев амфифильных липидов, т.е. фосфолипидов или холестерина. Липофильные фрагменты бислоев направлены по отношению друг к другу и образуют внутреннюю гидрофобную среду в мембране. Липосомы являются подходящими носителями для некоторых липофильных лекарственных средств, которые могут быть связаны с неполярными частями липидных бислоев, если они подходят по размеру и геометрии. Размер липосом варьирует от 20 нм до нескольких мкм.Liposomes are very simple structures consisting of one or more lipid bilayers of amphiphilic lipids, i.e. phospholipids or cholesterol. The lipophilic fragments of the bilayers are directed towards each other and form an internal hydrophobic environment in the membrane. Liposomes are suitable carriers for some lipophilic drugs, which can be associated with non-polar parts of lipid bilayers if they are suitable in size and geometry. The size of liposomes varies from 20 nm to several microns.

Смешанные мицеллы являются эффективными структурами детергента, которые состоят из солей желчных кислот, фосфолипидов, три-, ди- и моноглицеридов, жирных кислот, свободного холестерина и жирорастворимых питательных микроэлементов. Так как длинноцепочечные фосфолипиды, как известны, образуют бислой при диспергировании в воде, предпочтительной фазой короткоцепочечных аналогов является сферическая мицеллярная фаза. Мицеллярный раствор представляет собой термодинамически стабильную систему, образованную спонтанно в воде и органических растворителях. Взаимодействие между мицеллами и гидрофобными/липофильными лекарственными средствами приводит к образованию смешанных мицелл (ММ), часто называемых также «набухаемыми» мицеллами. В человеческом организме они включают гидрофобные соединения с низкой растворимостью в воде и действуют в качестве резервуара для продуктов пищеварения, например, моноглицеридов.Mixed micelles are effective detergent structures that are composed of bile salts, phospholipids, tri-, di- and monoglycerides, fatty acids, free cholesterol and fat-soluble micronutrients. Since long-chain phospholipids are known to form a bilayer when dispersed in water, the preferred phase of the short-chain analogues is the spherical micellar phase. A micellar solution is a thermodynamically stable system formed spontaneously in water and organic solvents. The interaction between micelles and hydrophobic/lipophilic drugs results in the formation of mixed micelles (MM), often also called “swellable” micelles. In the human body, they comprise hydrophobic compounds with low water solubility and act as a reservoir for digestive products such as monoglycerides.

Липидные микрочастицы включают липидные нано- и микросферы. Микросферы, как правило, определяются как малые сферические частицы, изготовленные из любого материала, имеющие размер примерно 0,2-100 мкм. Сферы с меньшим размером, составляющим менее 200 нм, как правило, называются наносферами. Липидные микросферы представляют собой гомогенные микроэмульсии масло в воде, подобные коммерчески доступным жировым эмульсиям, и получены с помощью интенсивной ультразвуковой обработки или эмульгированием при высоком давлении (методы измельчения). Лецитин, природное поверхностно-активное вещество, снижает поверхностное натяжение жидкости, таким образом, действуя в качестве эмульгатора для образования стабильной эмульсии. Структура и состав липидных наносфер схожи с липидными микросферами, но имеют меньший диаметр.Lipid microparticles include lipid nano- and microspheres. Microspheres are generally defined as small spherical particles made from any material, ranging in size from approximately 0.2-100 microns. Spheres with a smaller size of less than 200 nm are generally called nanospheres. Lipid microspheres are homogeneous oil-in-water microemulsions, similar to commercially available fat emulsions, and are prepared by intense ultrasonication or high-pressure emulsification (grinding techniques). Lecithin, a natural surfactant, reduces the surface tension of a liquid, thereby acting as an emulsifier to form a stable emulsion. The structure and composition of lipid nanospheres are similar to lipid microspheres, but have a smaller diameter.

Полимерные наночастицы служат в качестве носителей различных ингредиентов. Активные компоненты могут быть растворены в полимерной матрице или же захвачены или адсорбированы на поверхности частицы. Полимеры, подходящие для изготовления органических наночастиц, включают производные целлюлозы и сложные полиэфиры, такие как поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) и их сополимеры. Благодаря их малому размеру, высокому соотношению площади поверхности к объему и возможности функционализации поверхности раздела полимерные наночастицы являются идеальными носителями и системами высвобождения. Если размер частиц составляет менее 50 нм, они не распознаются как частицы многими биологическими, а также синтетическими барьерными слоями, но действуют аналогично молекулярным дисперсным системам.Polymer nanoparticles serve as carriers for various ingredients. The active components can be dissolved in the polymer matrix or captured or adsorbed on the surface of the particle. Polymers suitable for making organic nanoparticles include cellulose derivatives and polyesters such as poly(lactic acid), poly(glycolic acid) and their copolymers. Due to their small size, high surface area to volume ratio, and the ability to functionalize the interface, polymer nanoparticles are ideal carriers and release systems. If the particle size is less than 50 nm, they are not recognized as particles by many biological as well as synthetic barrier layers, but act similarly to molecular disperse systems.

Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению может быть составлена для обеспечения быстрого, замедленного, контролируемого или отсроченного высвобождения, или любой их комбинации, активного агента после введения индивидууму с использованием процедур, хорошо известных в данной области. В одном варианте осуществления фермент содержится в изотоническом или гипотоническом растворе. В одном варианте осуществления для ферментов, которые не растворимы в воде, могут быть использованы носители для доставки на основе липидов, например, микроэмульсии, описанной в WO 2008/049588, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки, или липосомы.Thus, the composition of the present invention can be formulated to provide rapid, sustained, controlled or delayed release, or any combination thereof, of the active agent after administration to an individual using procedures well known in the art. In one embodiment, the enzyme is contained in an isotonic or hypotonic solution. In one embodiment, for enzymes that are insoluble in water, lipid-based delivery vehicles, for example, microemulsions described in WO 2008/049588, the disclosure of which is incorporated herein by reference, or liposomes, can be used.

В одном варианте осуществления препарат может содержать агент, растворенный или суспендированный в жидком носителе, таком как водный носитель, для применения в виде аэрозоля. Носитель может содержать добавки, такие как солюбилизирующие агенты, например пропиленгликоль, поверхностно-активные вещества, усилители абсорбции, такие как лецитин (фосфатидилхолин) или циклодекстрин, или консерванты, такие как парабены. Например, дополнительно к растворимости, эффективная доставка в CNS после интраназального введения может зависеть от проницаемости мембраны. Для ферментов, парацеллюлярный транспорт которых затруднен из-за размера и полярности, улучшение проницаемости мембран может улучшить механизмы внеклеточного транспорта в CNS вдоль обонятельного и тройничного нервов. Один из подходов к модификации проницаемости мембран внутри назального эпителия состоит в использовании усилителей проницаемости, такие как поверхностно-активные вещества, например, лауроилкарнитин (LC), соли желчных кислот, липиды, циклодекстрины, полимеры или модификаторы плотного сочлененияIn one embodiment, the formulation may contain the agent dissolved or suspended in a liquid carrier, such as an aqueous vehicle, for use as an aerosol. The carrier may contain additives such as solubilizing agents such as propylene glycol, surfactants, absorption enhancers such as lecithin (phosphatidylcholine) or cyclodextrin, or preservatives such as parabens. For example, in addition to solubility, effective delivery to the CNS after intranasal administration may depend on membrane permeability. For enzymes whose paracellular transport is hampered by size and polarity, improving membrane permeability may improve extracellular transport mechanisms in the CNS along the olfactory and trigeminal nerves. One approach to modifying membrane permeability within the nasal epithelium is to use permeability enhancers such as surfactants such as lauroylcarnitine (LC), bile salts, lipids, cyclodextrins, polymers or tight junction modifiers.

Как правило, активные агенты вносят в виде стандартной лекарственной формы, включающей активный ингредиент вместе с фармацевтически приемлемым носителем на стандартную дозу. Обычно лекарственные формы, пригодные для назального введения, включают примерно от 125 мкг до 125 мг, например, примерно от 250 мкг до 50 мг, или примерно от 2,5 мг до 25 мг соединений, смешанных с фармацевтически приемлемым носителем или разбавитедем.Typically, the active agents are administered in a unit dosage form comprising the active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier per unit dose. Typically, dosage forms suitable for nasal administration include about 125 μg to 125 mg, such as about 250 μg to 50 mg, or about 2.5 mg to 25 mg of the compounds admixed with a pharmaceutically acceptable carrier or diluted.

Лекарственные формы можно вводить ежедневно или несколько раз в день, например, два или три раза в день. Кроме того, лекарственные формы можно вводить реже, чем ежедневно, например, через день или раз в неделю, если это является целесообразным по мнению лечащего врача.The dosage forms can be administered daily or several times a day, for example, two or three times a day. In addition, the dosage forms may be administered less frequently than daily, such as every other day or once a week, as deemed appropriate by the attending physician.

Изобретение будет описано с помощью следующих не ограничивающих примеров.The invention will be described using the following non-limiting examples.

Пример IExample I

Опосредованная вектором AAV доставка гена идуронидазы в мышиной модели мукополисахаридоза I типа: сравнение различных путей доставки в CNSAAV vector-mediated delivery of the iduronidase gene in a mouse model of mucopolysaccharidosis type I: comparison of different delivery routes to the CNS

Мукополисахаридоз I типа (MPS I) представляет собой наследственное заболевание обмена веществ, обусловленное дефицитом лизосомного фермента альфа-Ь-идуронидазы (IDUA). Системное и аномальное накопление гликозаминогликанов связано с задержкой роста, органомегалией, дисплазией скелета и заболеванием сердца и легких. Индивидуумы с наиболее тяжелой формой заболевания (синдром Гурлер) страдают нейродегенерацией, задержкой умственного развития и преждевременно умирают.Разработанные на сегодняшний день два метода лечения MPS I (трансплантация гемопоэтических стволовых клеток и ферментная заместительная терапия) не могут эффективно лечить все проявления заболевания со стороны центральной нервной системы (CNS)Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is an inherited metabolic disease caused by deficiency of the lysosomal enzyme alpha-L-iduronidase (IDUA). Systemic and abnormal accumulation of glycosaminoglycans is associated with growth retardation, organomegaly, skeletal dysplasia, and heart and lung disease. Individuals with the most severe form of the disease (Hurler syndrome) suffer from neurodegeneration, mental retardation, and premature death. The two treatments developed to date for MPS I (hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapy) cannot effectively treat all central nervous system manifestations of the disease. systems (CNS)

Что касается генной терапии, ранее было продемонстрировано, что интраваскулярная доставка AAV9 у взрослых мышей не достигает широкого прямого нацеливания на нейроны (см. Foust et al, 2009). В предыдущих работах также было показано, что прямая инъекция AAV8-IDUA в CNS взрослых IDUA-дефицитных мышей приводит к низкой частоте или низкому уровню экспрессии трансгена (см. фигуру 18).With regard to gene therapy, it has previously been demonstrated that intravascular delivery of AAV9 in adult mice does not achieve broad direct neuronal targeting (see Foust et al, 2009). Previous work has also shown that direct injection of AAV8-IDUA into the CNS of adult IDUA-deficient mice results in low frequency or low level expression of the transgene (see Figure 18).

Следующие примеры, в которых использованы доклинические модели для лечения MPS1, неожиданно показали, что прямая инъекция AAV9-IDUA в CNS иммунокомпетентных взрослых ШиА-дефицитных мышей приводит к экспрессии и активности фермента IDUA, которые являются такими же или более высокими, чем экспрессия и активность фермента IDUA у взрослых мышей дикого типа (см. фигуру 15 ниже). СпособыThe following examples, using preclinical models for the treatment of MPS1, unexpectedly showed that direct injection of AAV9-IDUA into the CNS of immunocompetent adult ShiA-deficient mice results in IDUA enzyme expression and activity that is the same as or higher than IDUA in adult wild-type mice (see Figure 15 below). Methods

Получение AAV9-IDUA. Векторная конструкция AAV-IDUA (MCI) описана ранее (Wolf et al., 2011) (промотор mCags). Плазмидная ДНК AAV-IDUA упакована в вирионы AAV9 в лаборатории University of Florida Vector Core, с получением титра 3×ΙΟ¹³ геномов вектора на миллилитр.Obtaining AAV9-IDUA. The AAV-IDUA vector construct (MCI) was described previously (Wolf et al., 2011) (mCags promoter). AAV-IDUA plasmid DNA is packaged into AAV9 virions at the University of Florida Vector Core laboratory, yielding a titer of 3×ΙΟ ¹³ vector genomes per milliliter.

ICV-инфузии. Взрослых Idua-/- мышей анестезировали смесью кетамина и ксилазина (100 мг кетамина+10 мг ксилазина на кг) и помещали на стереотаксическую рамку. Десять микролитров AAV9-IDUA вводили путем инфузии в правый боковой желудочек (стереотаксические координаты АР 0.4, ML 0.8, DV 2.4 мм от брегмы), используя шприц Гамильтона. Животных возвращали в их клетки на грелки-подушки для восстановления.ICV infusions. Adult Idua −/− mice were anesthetized with a mixture of ketamine and xylazine (100 mg ketamine + 10 mg xylazine per kg) and placed on a stereotaxic frame. Ten microliters of AAV9-IDUA was infused into the right lateral ventricle (stereotaxic coordinates AP 0.4, ML 0.8, DV 2.4 mm from bregma) using a Hamilton syringe. Animals were returned to their cages on heating pads for recovery.

Интратекальные инфузии. Инфузии молодым взрослым мышам проводили путем инъекции 10 мкл раствора, содержащего вектор AAV, между позвонками L5 и L6 через 20 минут после внутривенной инъекции 0,2 мл 25% маннита.Intrathecal infusions. Infusions into young adult mice were performed by injecting 10 μl of a solution containing the AAV vector between the L5 and L6 vertebrae 20 minutes after an intravenous injection of 0.2 ml of 25% mannitol.

Индукция иммунологической толерантности. Новорожденным IDUA-дефицитным мышам через лицевую височную вену инъецировали 5 мкл, содержащих 5,8 мкг рекомбинантного белка идуронидазы (Альдуразим), а затем животных возвращали в их клетки.Induction of immunological tolerance. Neonatal IDUA-deficient mice were injected via the facial temporal vein with 5 μl containing 5.8 μg of recombinant iduronidase protein (Aldurazyme) and the animals were then returned to their cages.

Иммуносупрессия циклофосфамидом. Для индукции иммуносупрессии животным вводили циклофосфамид раз в неделю в дозе 120 мг/кг, начиная со следующего дня после инфузии вектора AAV9-IDUA.Immunosuppression with cyclophosphamide. To induce immunosuppression, animals were administered cyclophosphamide once a week at a dose of 120 mg/kg, starting the next day after infusion of the AAV9-IDUA vector.

Животные. Животных анестезировали смесью кетамина/ксилазина (100 мг кетамина+10 мг ксилазина на кг) и транскардиально перфузировали 70 мл PBS перед умерщвлением. Головной мозг извлекали и подвергали микродиссекции на льду на мозжечок, гиппокамп, стриатум, кору головного мозга и ствол головного мозга/таламус («остальные отделы»). Образцы замораживали на сухом льду и затем хранили при температуре -80°С. Образцы оттаивали и гомогенизировали в присутствии 1 мл буфера PBS с помощью автоматического пестика и пермеабилизировали в 0,1%-ном растворе Triton Х-100. Активность IDUA определяли с помощью флуориметрического анализа с использованием в качестве субстрата 4Ми-идуронида. Активность выражали в единицах (процент превращения субстрата в продукт в минуту) на мг белка, как определено с помощью анализа методом Бредфорда (BioRad).Animals. Animals were anesthetized with a ketamine/xylazine mixture (100 mg ketamine+10 mg xylazine per kg) and transcardially perfused with 70 ml PBS before sacrifice. The brain was removed and microdissected on ice into the cerebellum, hippocampus, striatum, cerebral cortex, and brainstem/thalamus (“rest”). Samples were frozen on dry ice and then stored at -80°C. Samples were thawed and homogenized in the presence of 1 ml PBS buffer using an automatic pestle and permeabilized in 0.1% Triton X-100 solution. IDUA activity was determined using a fluorimetric assay using 4Mi-iduronide as a substrate. Activity was expressed in units (percentage of substrate converted to product per minute) per mg protein as determined by Bradford assay (BioRad).

Ткани. Гомогенаты тканей осветляли путем центрифугирования в течение 3 мин при 13000 об/мин на настольной центрифуге Eppendorf 5415D (Eppendorf) и инкубировали в течение ночи с протеиназой К, ДНКазой 1 и РНКазой. Концентрацию GAG определяли методом Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan Assay (Accurate Chemical) в соответствии с инструкциями изготовителя.Fabrics. Tissue homogenates were cleared by centrifugation for 3 min at 13,000 rpm in an Eppendorf 5415D benchtop centrifuge (Eppendorf) and incubated overnight with proteinase K, DNase 1, and RNase. GAG concentration was determined by the Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan Assay (Accurate Chemical) according to the manufacturer's instructions.

Результатыresults

На фигуре 1 показан дизайн эксперимента для идуронидаза-дефицитных мышей, которым вводили AAV интрацеребровентрикулярно (ICV) или интратекально (IT). Для предотвращения иммунного ответа животных подвергали иммуносупрессии циклофосфамидом (CP), индуцировали иммунологическую толерантность при рождении путем внутривенного введения человеческого белка идуронидазы (Альдуразим) или инъекции проводили у иммунодефицитных мышей NOD-SCID, которые были также дефицитными по идуронидазе. Животных умерщвляли в указанное время после лечения, головной мозг подвергали микродиссекции и экстракты анализировали на активность идуронидазы.Figure 1 shows the experimental design for iduronidase-deficient mice that were administered AAV intracerebroventricularly (ICV) or intrathecally (IT). To prevent an immune response, animals were immunosuppressed with cyclophosphamide (CP), immunotolerance was induced at birth by intravenous injection of human iduronidase protein (Aldurazyme), or injections were given to immunodeficient NOD-SCID mice that were also iduronidase-deficient. Animals were sacrificed at the indicated times after treatment, the brains were microdissected, and extracts were analyzed for iduronidase activity.

На фигуре 2 представлены данные для иммунодефицитных, IDUA-дефицитных животных, которым инъецировали ICV вектор AAV-IDUA. Эти животные показали высокие уровни экспрессии IDUA (в 10-100 раз выше по сравнению с диким типом) во всех областях головного мозга, при этом самый высокий уровень наблюдался в стволе головного мозга и таламуса («остальные отделы»).Figure 2 presents data for immunodeficient, IDUA-deficient animals injected with the ICV vector AAV-IDUA. These animals showed high levels of IDUA expression (10- to 100-fold higher compared to wild type) in all brain regions, with the highest levels observed in the brainstem and thalamus (“remaining regions”).

Иммуносупрессированные животные, которым вводили вектор AAV ICV-путем, имели относительно более низкий уровень фермента в головном мозге по сравнению с иммунодефицитными животными (фигура 3). Следует отметить, что иммуносупрессия может быть ослаблена у этих животных из-за отмены циклофосфамида (CP) за 2 недели до умерщвления по причине слабого здоровья.Immunosuppressed animals administered the AAV vector via the ICV route had relatively lower levels of the enzyme in the brain compared to immunodeficient animals (Figure 3). It should be noted that immunosuppression may be reduced in these animals by discontinuation of cyclophosphamide (CP) 2 weeks before sacrifice due to poor health.

На фигуре 4 представлены данные для иммуносупрессированных животных, которым вводили вектор AAV IT-путем. Животные, подвергнутые индукции иммунологической толерантности, которым вводили вектор AAV ICV-путем, проявили широкую активность IDUA во всех отделах головного мозга (фигура 5), аналогичную активности, наблюдаемой у иммунодефицитных животных, что указывает на эффективность процедуры индукции иммунологической толерантности.Figure 4 presents data for immunosuppressed animals that received the AAV vector via the IT route. Animals subjected to immunotolerance induction, administered the AAV vector via the ICV route, exhibited widespread IDUA activity throughout the brain (Figure 5), similar to that observed in immunodeficient animals, indicating the effectiveness of the immunotolerance induction procedure.

Фигура 6 представляет собой компиляцию всех средних уровней активности IDUA для параллельного сравнения, и на фигуре 7 показаны данные, сгруппированные в соответствии с областью головного мозга.Figure 6 is a compilation of all mean IDUA activity levels for side-by-side comparison, and Figure 7 shows the data grouped according to brain region.

Материал накопления GAG анализировали в различных срезах головного мозга у всех четырех тестируемых групп.Для каждой группы среднее значение для каждого отдела головного мозга показано слева, значения для каждого индивидуального животного показаны справа (фигура 8). IDUA-дефицитные животные (крайние слева) содержали высокие уровни GAG по сравнению с животными дикого типа (пурпурный столбец). Уровни GAG были на уровне дикого типа или ниже дикого типа для всех отделов головного мозга во всех группах AAV-обработанных животных. Уровни GAG были немного, хотя и не значительно выше, чем у дикого типа в коре головного мозга и стволе головного мозга животных, которым вводили AAV9-IDUA интратекально.GAG accumulation material was analyzed in different brain sections from all four groups tested. For each group, the average value for each brain region is shown on the left, values for each individual animal are shown on the right (Figure 8). IDUA-deficient animals (far left) contained high levels of GAG compared to wild-type animals (magenta bar). GAG levels were at or below wild-type levels for all brain regions in all groups of AAV-treated animals. GAG levels were slightly, although not significantly, higher than wild type in the cerebral cortex and brainstem of animals treated with AAV9-IDUA intrathecally.

Выводыconclusions

Результаты показали высокое и широкое распределение IDUA в головном мозге независимо от пути доставки (ICV или IT), хотя экспрессия IDUA в стриатуме и гиппокампе была более низкой у животных, инъецированных IT, по сравнению с ICV. По-видимому, присутствует иммунный ответ, поскольку иммунодефицитные мыши имеют более высокие уровни экспрессии по сравнению с иммунокомпетентными мышами. Что касается ICV инъекции, в случае преждевременной отмены CP экспрессия IDUA является более низкой. Кроме того, индукция иммунологической толерантности была эффективной в отношении восстановления высоких уровней активности фермента. Кроме того, уровни GAG были восстановлены до нормальных уровней во всех подвергнутых лечению экспериментальных группах мышей.The results showed a high and widespread distribution of IDUA in the brain regardless of delivery route (ICV or IT), although IDUA expression in the striatum and hippocampus was lower in IT-injected animals compared to ICV. An immune response appears to be present, as immunodeficient mice have higher expression levels compared to immunocompetent mice. Regarding ICV injection, IDUA expression is lower in case of premature CP withdrawal. In addition, the induction of immunological tolerance was effective in restoring high levels of enzyme activity. In addition, GAG levels were restored to normal levels in all treated experimental groups of mice.

Пример IIExample II

СпособыMethods

Получение AAV9 - IDUA. Плазмиду AAV-IDUA упаковывали в вирионы AAV9 в лаборатории University of Florida vector core или в лаборатории University of Pennsylvania vector core, получая титр 1-3×10¹³ геномов вектора на миллилитр.Getting AAV9 - IDUA. The AAV-IDUA plasmid was packaged into AAV9 virions at the University of Florida vector core laboratory or the University of Pennsylvania vector core laboratory, yielding a titer of 1-3×10 ¹³ vector genomes per milliliter.

ICV-инфузии. См. пример I.ICV infusions. See example I.

Интратекальные инфузии. См. пример I.Intrathecal infusions. See example I.

Индукция иммунологической толерантности. Как в примере I, за исключением следующего: для многократной индукции иммунологической толерантности новорожденным IDUA-дефицитным мышам в лицевую височную вену инъецировали первую дозу Альдуразима с последующими 6 еженедельными инъекциями, вводимыми интраперитонеально.Induction of immunological tolerance. As in Example I, except for the following: to repeatedly induce immunological tolerance, newborn IDUA-deficient mice were injected into the facial temporal vein with a first dose of Aldurazyme, followed by 6 weekly injections administered intraperitoneally.

Иммуносупрессия циклофосфамидом. См. пример I.Immunosuppression with cyclophosphamide. See example I.

Животные. Животные анестезировали смесью кетамина/ксилазина (100 мг кетамина+10 мг ксилазина на кг) и транскардиально перфузировали 70 мл PBS перед умерщвлением. Головной мозг извлекали и подвергали микродиссекции на льду на мозжечок, гиппокамп, стриатум, кору и ствол головного мозга/таламус («остальные отделы»). Образцы замораживали на сухом льду и хранили при температуре -80°С.Animals. Animals were anesthetized with a ketamine/xylazine mixture (100 mg ketamine+10 mg xylazine per kg) and transcardially perfused with 70 ml PBS before sacrifice. The brain was removed and microdissected on ice into the cerebellum, hippocampus, striatum, cortex, and brainstem/thalamus (“rest”). Samples were frozen on dry ice and stored at -80°C.

Активность IDUA в тканях. Образцы тканей оттаивали и гомогенизировали в водном растворе хлорида натрия в гомогенизаторе тканей. Гомогенаты тканей осветляли путем центрифугирования при 15000 об/мин на настольной центрифуге Эппендорфа при температуре 4°С в течение 15 минут.Лизаты тканей (супернатант) собирали и анализировали на уровни активности IDUA и накопления GAG.IDUA activity in tissues. Tissue samples were thawed and homogenized in an aqueous sodium chloride solution in a tissue homogenizer. Tissue homogenates were cleared by centrifugation at 15,000 rpm in a benchtop Eppendorf centrifuge at 4°C for 15 minutes. Tissue lysates (supernatant) were collected and analyzed for levels of IDUA activity and GAG accumulation.

Уровни GAG в тканях. Лизаты тканей инкубировали в течение ночи с протеиназой К, РНКазой и ДНКазой. Уровни GAG определяли методом Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan Assay в соответствии с инструкциями изготовителя.Tissue GAG levels. Tissue lysates were incubated overnight with proteinase K, RNase, and DNase. GAG levels were determined by the Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan Assay according to the manufacturer's instructions.

Копии вектора IDUA. Гомогенаты тканей использовали для выделения ДНК и последующей QPCR, как описано в работе Wolf et al. (2011).Copies of the IDUA vector. Tissue homogenates were used for DNA extraction and subsequent QPCR as described by Wolf et al. (2011).

Результатыresults

На фигуре 9 показан дизайн эксперимента и группы. Животным вводили вектор AAV9-IDUA путем интрацеребровентрикулярной (ICV) или интратекальной (IT) инфузии. Введение вектора осуществляли у иммунодефицитных (ID) мышей NOD-SCID, которые были также дефицитными по IDUA, или у Ши А-дефицитных мышей, которые были подвергнуты иммуносупрессии циклофосфамидом (CP) или индукции иммунологической толерантности при рождении путем однократной инъекции или многократных инъекций человеческого белка идуронидазы (Альдуразим). На фигуре 9 показаны моменты времени, в которые проводили лечение вектором и умерщвление. Все введения вектора проводили у взрослых животных в возрасте 3-4,5 месяцев. Животным инъецировали 10 мкл вектора в дозе 3 χ 10¹¹ геномов вектора на 10 микролитров.Figure 9 shows the experimental and group design. Animals were administered the AAV9-IDUA vector by intracerebroventricular (ICV) or intrathecal (IT) infusion. Vector administration was performed in immunodeficient (ID) NOD-SCID mice that were also deficient in IDUA, or in Shi A-deficient mice that were immunosuppressed with cyclophosphamide (CP) or immunotolerized at birth by a single injection or multiple injections of human protein. Iduronidase (Aldurazyme). Figure 9 shows the time points at which vector treatment and killing were performed. All vector injections were carried out in adult animals aged 3-4.5 months. Animals were injected with 10 μl of vector at a dose of 3 χ 10 ¹¹ vector genomes per 10 microliters.

На фигуре 10 показаны активности фермента IDUA у интракраниально инфузированных, иммунодефицитных, Ши А-дефицитных мышей. Во всех областях головного мозга наблюдались высокие уровни активности фермента, которые в 30-300 раз превышали уровни активности, наблюдаемые у мышей дикого типа. Наиболее высокие уровни экспрессии фермента наблюдались в таламусе и стволе мозга, а также в гиппокампе.Figure 10 shows IDUA enzyme activities in intracranially infused, immunodeficient, Shi A-deficient mice. All areas of the brain showed high levels of enzyme activity that were 30 to 300 times higher than the activity levels observed in wild-type mice. The highest levels of enzyme expression were observed in the thalamus and brainstem, as well as in the hippocampus.

Животные, которые были инъецированы интракраниально и подвергнуты иммуносупрессии циклофосфамидом (CP), показали значительно более низкие уровни активности фермента по сравнению с другими группами (фигура 11). Однако введение CP в этом случае вынуждены были отменить за 2 недели до умерщвления из-за слабого здоровья животных.Animals that were injected intracranially and immunosuppressed with cyclophosphamide (CP) showed significantly lower levels of enzyme activity compared to other groups (Figure 11). However, the administration of CP in this case had to be stopped 2 weeks before killing due to the poor health of the animals.

Уровни фермента IDUA у животных, подвергнутых индукции толерантности при рождении с помощью белка IDUA (Альдуразим), и которым интракраниально вводили вектор, показаны на фигуре 12. Все животные показали во всех отделах головного мозга высокие уровни фермента, которые в 10-1000 раз превышали уровни, наблюдаемые у мышей дикого типа, аналогично уровням, достигнутым у иммунодефицитных животных, что указывает на эффективность процедуры индукции иммунологической толерантности.Levels of IDUA enzyme in animals that had been tolerized at birth with the IDUA protein (Aldurazyme) and intracranially injected with the vector are shown in Figure 12. All animals showed high enzyme levels in all brain regions, which were 10-1000 times higher than , observed in wild-type mice, are similar to the levels achieved in immunodeficient animals, indicating the effectiveness of the procedure for inducing immunological tolerance.

На фигуре 13 показаны уровни фермента IDUA у мышей, которые были интратекально инъецированы и которым вводили CP на еженедельной основе. Повышенные уровни IDUA наблюдались во всех частях головного мозга, особенно в мозжечке и спинном мозге. Уровни фермента были самыми низкими в стриатуме и гиппокампе, при этом значения активности находились на уровнях, наблюдаемых у животных дикого типа.Figure 13 shows IDUA enzyme levels in mice that were intrathecally injected and treated with CP on a weekly basis. Elevated levels of IDUA were observed in all parts of the brain, especially in the cerebellum and spinal cord. Enzyme levels were lowest in the striatum and hippocampus, with activity values at levels observed in wild-type animals.

IDUA-дефицитных мышей подвергали индукции иммунологической толерантности Альдуразимом, как описано, и инъецировали интратекально вектором (фигура 14). Наблюдалась широкая активность фермента IDUA во всех отделах головного мозга, при этом самые высокие уровни активности наблюдались в стволе мозга и таламусе, обонятельной луковице, спинном мозге и мозжечке. Аналогично данным, представленным на фигуре 13, самые низкие уровни активности фермента наблюдались в стриатуме, коре головного мозга и гиппокампе.IDUA-deficient mice were immunotolerized with Aldurazyme as described and injected intrathecally with the vector (Figure 14). Widespread IDUA enzyme activity was observed throughout all brain regions, with the highest levels of activity observed in the brainstem and thalamus, olfactory bulb, spinal cord, and cerebellum. Similar to the data presented in Figure 13, the lowest levels of enzyme activity were observed in the striatum, cerebral cortex and hippocampus.

Контрольным иммунокомпетентным IDUA-дефицитным животным инфузировали интратекально вектор, без иммуносупрессии или индукции иммунологической толерантности (фигура 15). Полученные результаты свидетельствуют о том, что хотя показатели активности фермента соответствовали или немного превышали уровни активности у мышей дикого типа, они были значительно ниже показателей активности, наблюдаемых у животных, подвергнутых иммуномодулированию. Снижения уровней фермента были особенно значительными в мозжечке, обонятельной луковице и таламусе, а также стволе мозга, то есть областях, которые экспрессировали самые высокие уровни фермента у иммуномодулированных животных.Control immunocompetent IDUA-deficient animals were infused intrathecally with the vector, without immunosuppression or induction of immunological tolerance (Figure 15). The results indicate that although enzyme activity levels were similar to or slightly greater than those observed in wild-type mice, they were significantly lower than those observed in immunomodulated animals. Reductions in enzyme levels were particularly significant in the cerebellum, olfactory bulb and thalamus, and brainstem, areas that expressed the highest levels of the enzyme in immunomodulated animals.

Животных анализировали на материал накопления GAG, как показано на фигуре 16. Все группы продемонстрировали клиренс накопления GAG, при этом уровни GAG были сходными с уровнями, наблюдаемыми у животных дикого типа. Животные, подвергнутые иммуносупрессии и интратекально инъецированные вектором AAV9-IDUA, показали уровни GAG в коре головного мозга, которые были немного более высокими по сравнению с диким типом, но все еще гораздо более низкими по сравнению с IDUA-дефицитными мышами, не подвергнутыми лечению.Animals were assayed for GAG accumulation material as shown in Figure 16. All groups demonstrated clearance of GAG accumulation, with GAG levels being similar to those observed in wild-type animals. Animals immunosuppressed and intrathecally injected with the AAV9-IDUA vector showed cortical GAG levels that were slightly higher compared to wild type, but still much lower compared to untreated IDUA-deficient mice.

Присутствие вектора AAV9-IDUA у животных, подвергнутых индукции иммунологической толерантности и инъецированных интракраниально или интратекально вектором, оценивали с помощью QPCR, как показано на фигуре 16. Число копий IDUA на клетку было выше у животных, инфузированных интракраниально, по сравнению с животными, инфузированными интратекально, что согласуется с более высоким уровнем активности фермента, наблюдаемым у животных, инъецированных интракраниально.The presence of the AAV9-IDUA vector in animals subjected to immunotolerance induction and injected intracranially or intrathecally with the vector was assessed by QPCR, as shown in Figure 16. The number of IDUA copies per cell was higher in animals infused intracranially compared with animals infused intrathecally. , which is consistent with the higher level of enzyme activity observed in animals injected intracranially.

Выводыconclusions

Высокие, широко распространенные и терапевтические уровни IDUA наблюдались во всех областях головного мозга после введения интрацеребровентрикулярным и интратекальным путем AAV9-IDUA взрослым мышам. Показатели активности фермента восстановились до уровней, наблюдаемых у животных дикого типа, или немного более высокого уровня у иммунокомпетентных IDUA-дефицитных животных, интратекально инфузированных AAV-IDUA. Наблюдались значительно более высокие уровни фермента IDUA для обоих путей введения вектора у животных, подвергнутых индукции иммунологической толерантности при рождении путем введения белка IDUA.High, widespread, and therapeutic levels of IDUA were observed in all brain regions following intracerebroventricular and intrathecal administration of AAV9-IDUA to adult mice. Enzyme activity levels were restored to levels observed in wild-type animals or slightly higher levels in immunocompetent IDUA-deficient animals intrathecally infused with AAV-IDUA. Significantly higher levels of IDUA enzyme were observed for both routes of vector administration in animals subjected to immunotolerance induction at birth by administration of IDUA protein.

Пример IIIExample III

Взрослых иммунокомпетентных Ши А-дефицитных мышей (в возрасте 12 недель) анестезировали смесью кетамина/ксилазина с последующей интраназальной инфузией вектора AAV9-IDUA. Вектор вводили путем внесения восьми капель по 3 мкл с помощью микропипетки в носовую полость, попеременно в каждую ноздрю, с 2-минутными интервалами между каждым внесением. В общей сложности каждому взрослому животному вводили 2,4-7×10¹¹ геномов вектора, в зависимости от источника вектора. Для подавления иммунного ответа у мышей на человеческий IDUA, продуцируемый вектором AAV9-IDUA, животных подвергали иммуносупрессии путем еженедельного введения 120 мг/кг циклофосфамида, начиная со следующего дня после введения вектора. Однако иммуносупрессия у субъектов-людей необязательна и специалист в данной области будет знать, в каких случаях ее необходимо применять в соответствии с надлежащей/стандартной медицинской практикой. Мышей умерщвляли через 12 недель после инфузии вектора, животных анализировали на экспрессию фермента IDUA и копии вектора в головном мозге (фигуры 19 и 20).Adult immunocompetent Shi A-deficient mice (12 weeks of age) were anesthetized with a ketamine/xylazine mixture followed by intranasal infusion of the AAV9-IDUA vector. The vector was administered by placing eight drops of 3 μl using a micropipette into the nasal cavity, alternately into each nostril, with 2-minute intervals between each application. A total of 2.4-7×10 ¹¹ vector genomes were injected into each adult animal, depending on the vector source. To suppress the immune response in mice to human IDUA produced by the AAV9-IDUA vector, animals were immunosuppressed by weekly administration of 120 mg/kg cyclophosphamide starting the day after vector administration. However, immunosuppression in human subjects is not necessary and one skilled in the art will know when it should be used in accordance with good/standard medical practice. Mice were sacrificed 12 weeks after vector infusion, and animals were analyzed for expression of the IDUA enzyme and vector copies in the brain (Figures 19 and 20).

Пример IVExample IV

Идуронидаза-дефицитным мышам, модели человеческого мукополисахаридоза I типа (MPS I), интраназально вводили приблизительно 10¹¹ копий вектора AAV9-IDUA. Через четыре недели животных умерщвляли, и головной мозг подвергали микродиссекции и экстрагировали для анализа на фермент идуронидазу. Как показано на фигуре 22 (среднее значение+Z-SD показано слева, индивидуальные животные показаны справа), высокий уровень активности фермента IDUA (почти в 100 раз более высокий по сравнению с диким типом) наблюдался в обонятельной луковице, при этом во всех других областях головного мозга наблюдались уровни фермента, соответствующие животным дикого типа. На фигуре 23 показана активность GAG.Iduronidase-deficient mice, a model of human mucopolysaccharidosis type I (MPS I), were administered intranasally with approximately 10 ¹¹ copies of the AAV9-IDUA vector. After four weeks, the animals were sacrificed and the brains were microdissected and extracted for analysis of the enzyme iduronidase. As shown in Figure 22 (mean+Z-SD shown on the left, individual animals shown on the right), high levels of IDUA enzyme activity (almost 100 times higher than wild type) were observed in the olfactory bulb, with all other regions brain, levels of the enzyme were observed corresponding to wild-type animals. Figure 23 shows GAG activity.

Аналогично обработанных животных умерщвляли, и срезы тканей окрашивали на присутствие человеческого белка IDUA, используя антитело к IDUA. Как показано на фигуре 24 слева, сильное окрашивание белка IDUA наблюдается в назальном эпителии и обонятельной луковице у четырех животных, подвергнутых интраназальному лечению вектором, при этом справа отсутствует окрашивание у контрольных нормальных или IDUA-дефицитных животных, которым не вводили вектор. Окрашивание не наблюдалось в других отделах головного мозга (гиппокамп, мозжечок, кора головного мозга, стриатум, таламус и ствол мозга) животных, подвергнутых лечению AAV-MCI, демонстрируя, что трансдукции была ограничена обонятельной луковицей и назальным эпителием.Similarly treated animals were sacrificed, and tissue sections were stained for the presence of human IDUA protein using an anti-IDUA antibody. As shown in Figure 24 on the left, strong IDUA protein staining is observed in the nasal epithelium and olfactory bulb of four animals treated intranasally with vector, while on the right there is no staining in control normal or IDUA-deficient animals that were not treated with vector. Staining was not observed in other brain regions (hippocampus, cerebellum, cerebral cortex, striatum, thalamus, and brainstem) of AAV-MCI-treated animals, demonstrating that transduction was limited to the olfactory bulb and nasal epithelium.

Животных обрабатывали интраназально приблизительно 10¹¹ геномами вектора AAV9-GFP в качестве репортерной системы для идентификации локализации трансдуцированной клетки. Через две недели животных умерщвляли, собирали ткани, и срезы окрашивали на экспрессию GFP, используя антитело к GFP (зеленый), а также окрашивали DAPI (синий) для идентификации клеточных ядер (фигура 25). Наблюдалось сильное окрашивание белка GFP в обонятельном эпителии (левые две панели) и обонятельной луковице (верхние две панели) у подвергнутых лечению животных по сравнению с не подвергнутыми лечению контрольными животными (правые панели для обонятельного эпителия и нижняя панель для обонятельной луковицы). Окрашивания GFP не наблюдалось в других отделах головного мозга. Эти результаты согласуются с результатами окрашивания на IDUA, демонстрируя, что опосредованный AAV перенос гена и экспрессия ограничивается назальным эпителием и обонятельной луковицей после интраназального введения вектора AAV9-MCI. Эти результаты позволяют рассматривать диффузию IDUA, экспрессирующегося на высоких уровнях в переднем мозге, в качестве механизма, посредством которого уровни IDUA, соответствующие уровням IDUA у животных дикого типа, достигаются во всех областях головного мозга после интраназального введения вектора AAV9-MCI. Этот подход к достижению высокого уровня экспрессии терапевтического белка в переднем мозге, то есть неинвазивное интраназальное введение вектора AAV с последующим его распространением в головном мозге, применим не только для лечения MPS и связанных метаболических заболеваний, но и других более распространенных неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера.Animals were treated intranasally with approximately 10 ¹¹ AAV9-GFP vector genomes as a reporter system to identify the location of the transduced cell. After two weeks, animals were sacrificed, tissues were collected, and sections were stained for GFP expression using an anti-GFP antibody (green) and also stained with DAPI (blue) to identify cell nuclei (Figure 25). Strong GFP protein staining was observed in the olfactory epithelium (left two panels) and olfactory bulb (top two panels) of treated animals compared to untreated control animals (right panels for olfactory epithelium and bottom panel for olfactory bulb). GFP staining was not observed in other brain regions. These results are consistent with the IDUA staining results, demonstrating that AAV-mediated gene transfer and expression is restricted to the nasal epithelium and olfactory bulb following intranasal administration of the AAV9-MCI vector. These results suggest diffusion of IDUA, which is expressed at high levels in the forebrain, as a mechanism by which IDUA levels corresponding to those in wild-type animals are achieved in all brain regions following intranasal administration of the AAV9-MCI vector. This approach to achieving high levels of therapeutic protein expression in the forebrain, i.e. non-invasive intranasal administration of the AAV vector followed by propagation in the brain, is applicable not only to the treatment of MPS and related metabolic diseases, but also other more common neurological disorders such as Parkinson's and Alzheimer's disease.

Пример V.Example V

Мукополисахаридоз II типа (MPS II; синдром Хантера) представляет собой лизосомную болезнь накопления с Х-сцепленным рецессивным типом наследования, обусловленную дефицитом идуронат-2-сульфатазы (IDS), приводящим к накоплению гликозаминогликанов (GAG) дерматан- и гепарансульфата. Пораженные индивидуумы проявляют манифестации различной степени тяжести физически, неврологически, и укороченную продолжительность жизни. Например, пораженные индивидуумы проявляют манифестации различной степени тяжести, такие как органомегалия, дисплазия скелета, сердечно-легочная обструкция, нейрокогнитивный дефицит и укороченная продолжительность жизни. На сегодняшний день лечение для MPS II отсутствует.Существующим на сегодняшний день стандартом лечения является ферментная заместительная терапия (ELAPSRASE; идурсульфаза), которую применяют для контроля прогрессирования заболевания. Тем не менее, ферментная заместительная терапия (ERT) не приводит к неврологическому улучшению. Так как трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) не показала неврологического эффекта для MPS II, в настоящее время не существует клинической возможности для пациентов, проявляющих неврологические манифестации данного заболевания, и крайне необходимы новые методы лечения.Mucopolysaccharidosis type II (MPS II; Hunter syndrome) is a lysosomal storage disorder with an X-linked recessive pattern of inheritance caused by iduronate-2-sulfatase (IDS) deficiency, leading to the accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) of dermatan and heparan sulfate. Affected individuals exhibit manifestations of varying degrees of severity physically, neurologically, and a shortened life span. For example, affected individuals exhibit manifestations of varying severity, such as organomegaly, skeletal dysplasia, cardiopulmonary obstruction, neurocognitive deficits, and shortened life expectancy. There is currently no treatment for MPS II. The current standard of care is enzyme replacement therapy (ELAPSRASE; idursulfase), which is used to control disease progression. However, enzyme replacement therapy (ERT) does not result in neurological improvement. Since hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has shown no neurological benefit for MPS II, there is currently no clinical option for patients exhibiting neurological manifestations of this disease, and new treatments are urgently needed.

AAV9 векторы разработаны для доставки последовательности, кодирующей IDS человека (AAV9-hIDS), в центральную нервную систему мышей с MPS II для восстановления уровней IDS в головном мозге и предупреждения возникновения нейрокогнитивных дефицитов у подвергнутых лечению животных (фигура 27А). В частности, создавали серии векторов, кодирующих IDS человека с модифицирующим сульфатазу фактором-1 (SUMF-1) человека или без него, требуемым для активации активного центра сульфатазы. В этих экспериментах использовали три пути введения: интратекальное (IT) (фигуры 28-29), интрацеребровентрикулярное (ICV) (фигуры 30A-D) и внутривенное (IV) (фигуры 28-29). Существенных различий в уровне фермента не было обнаружено между мышами, которым вводили вектор AAV9, трансдуцирующий только hIDS, и мышами, которым вводили вектор AAV9, кодирующий IDS и SUMF-1 человека, независимо от пути введения. Мыши NOD.SCID (IDS Y+) и C57BL/6 (IDS Y+), подвергнутые IT-введению, не показали повышенной активности IDS в головном мозге и спинном мозге по сравнению с животными, не подвергнутыми лечению, при этом уровни в плазме в десять раз (NOD.SCID) и 150 раз (C57BL/6) превышали уровни, наблюдаемые у животных, не подвергнутых лечению. IDS-дефицитные мыши, которым внутривенно вводили AAV9-hIDS, показали активности IDS во всех органах, сопоставимые с активностями, наблюдаемыми у животных дикого типа. Кроме того, активность фермента в плазме IV-инъецированных животных в 100 раз превышала активность, наблюдаемую у животных дикого типа. IDS-дефицитные мыши, которым ICV-путем вводили AAV9-hlDUA, показали сопоставимые с диким типом активности IDS в большинстве областей головного мозга и периферических тканях, при этом некоторые отделы головного мозга показали активность, которая в два-четыре раза превышала активность, наблюдаемую у животных дикого типа. Кроме того, активность IDS в плазме была в 200 раз выше, чем у животных дикого типа. Удивительно, что активность фермента IDS в плазме у всех подвергнутых лечению животных показала устойчивость в течение по меньшей мере 12 недель после инъекции; следовательно, фермент IDS не был иммуногенными по меньшей мере на мышах C57BL/6. Дополнительное тестирование нейроповеденческих функций проводили с использованием лабиринта Барнеса, чтобы дифференцировать нейрокогнитивные дефициты не подвергнутых лечению животных с MPS II от нейрокогнитивных дефицитов однопометных животных дикого типа. Было обнаружено, что способность к обучению пораженных животных заметно медленнее, чем способность к обучению, наблюдаемая у однопометных животных. Таким образом, лабиринт Барнеса использовали для определения благоприятного эффекта этих методов лечения в мышиной модели MPS II (фигуры 31А-В и 32). Эти результаты указывают на возможный терапевтический эффект ААУ9-опосредованного переноса гена IDS человека в CNS для предотвращения неврологического дефицита в MPS П.AAV9 vectors are designed to deliver human IDS coding sequence (AAV9-hIDS) into the central nervous system of MPS II mice to restore IDS levels in the brain and prevent the onset of neurocognitive deficits in treated animals (Figure 27A). Specifically, a series of vectors were generated encoding human IDS with or without human sulfatase modifying factor-1 (SUMF-1) required for activation of the sulfatase active site. Three routes of administration were used in these experiments: intrathecal (IT) (Figures 28-29), intracerebroventricular (ICV) (Figures 30A-D) and intravenous (IV) (Figures 28-29). No significant differences in enzyme levels were found between mice injected with an AAV9 vector transducing hIDS alone and mice injected with an AAV9 vector encoding human IDS and SUMF-1, regardless of route of administration. IT-treated NOD.SCID (IDS Y+) and C57BL/6 (IDS Y+) mice showed no increased IDS activity in the brain and spinal cord compared to untreated animals, with plasma levels tenfold (NOD.SCID) and 150-fold (C57BL/6) were higher than levels observed in untreated animals. IDS-deficient mice intravenously injected with AAV9-hIDS showed IDS activities in all organs comparable to those observed in wild-type animals. In addition, enzyme activity in the plasma of IV-injected animals was 100 times higher than that observed in wild-type animals. IDS-deficient mice injected with AAV9-hlDUA via the ICV route showed IDS activity comparable to wild type in most brain regions and peripheral tissues, with some brain regions showing activity that was two to four times greater than that observed in wild type animals. In addition, IDS activity in plasma was 200-fold higher than in wild-type animals. Surprisingly, plasma IDS enzyme activity in all treated animals showed stability for at least 12 weeks after injection; therefore, the IDS enzyme was not immunogenic at least in C57BL/6 mice. Additional neurobehavioral testing was performed using the Barnes maze to differentiate the neurocognitive deficits of untreated MPS II animals from the neurocognitive deficits of wild-type littermates. The learning ability of affected animals was found to be markedly slower than the learning ability observed in littermates. Thus, the Barnes maze was used to determine the beneficial effect of these treatments in the MPS II mouse model (Figures 31A-B and 32). These results indicate a possible therapeutic effect of AAU9-mediated human IDS gene transfer into the CNS to prevent neurological deficits in MPS P.

В целом, интрацеребровентрикулярная (ICV) инъекция AAV9-hIDS привела к системной коррекции дефицита фермента IDS, включая уровни IDS в головном мозге, соответствующие уровням IDS у животных дикого типа. Совместная доставка hIDS с hSUMF-Ι не повысила активность IDS в тканях. Экспрессия hIDS была неиммуногенной у мышей C57BL/6 дикого типа (WT) и имеющих MPS П.Overall, intracerebroventricular (ICV) injection of AAV9-hIDS resulted in systemic correction of IDS enzyme deficiency, including brain IDS levels consistent with IDS levels in wild-type animals. Co-delivery of hIDS with hSUMF-Ι did not increase IDS activity in tissues. hIDS expression was non-immunogenic in C57BL/6 wild-type (WT) and MPS P mice.

Пример VIExample VI

Мукополисахаридоз типа I (MPS I) представляет собой метаболическое заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, обусловленное дефицитом α -L-идуронидазы (IDUA), что приводит к накоплению гликозаминогликанов (GAG) гепарина и дерматансульфата. Индивидуумы с наиболее тяжелой формой заболевания (синдром Гурлер) страдают нейродегенерацией, задержкой умственного развития и смерть наступает к 10 годам. Современные методы лечения этого заболевания включают в аллогенную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) и ферментную заместительную терапию (ERT). Однако, эти методы лечения недостаточно эффективны в отношении лечения манифестаций заболевания в CNS.Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a metabolic disease with an autosomal recessive pattern of inheritance caused by α-L-iduronidase (IDUA) deficiency, which leads to the accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparin and dermatan sulfate. Individuals with the most severe form of the disease (Hurler syndrome) suffer neurodegeneration, mental retardation, and death occurs by age 10. Current treatments for this disease include allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and enzyme replacement therapy (ERT). However, these treatments are not effective enough to treat disease manifestations in the CNS.

Целью является улучшение терапии для тяжелого MPS I путем дополнения существующих на сегодняшний день ERT и HSCT переносом гена IDUA в CNS, тем самым предотвращая неврологические манифестации заболевания. В этом исследовании тестировали способность внутривенно вводимых векторов AAV серотипов 9 и rhlO (AAV9 и AAVrhlO) пересекать гематоэнцефалический барьер для доставки и экспрессии гена IDUA в CNS (фигура 33). Животным в возрасте 4-5 месяцев, имеющим MPS I, внутривенно инфузировали через хвостовую вену вектор AAV9 или вектор AAVrhlO, кодирующий ген IDUA человека. Образцы крови и мочи собирали на еженедельной основе до момента умерщвления животных на 10 неделе после инъекции. Активности IDUA в плазме у подвергнутых лечению животных были почти в 1 ООО раз более высокими по сравнению с гетерозиготными контролями через 3 недели после инъекции (фигура 34). Головной мозг, спинной мозг и периферические органы анализировали на активность IDUA, клиренс накопления GAG и иммунофлуоресценцию IDUA в срезах тканей (фигуры 34-36). Подвергнутые лечению животные продемонстрировали широкое восстановление активности фермента IDUA во всех органах, включая CNS. Эти данные демонстрируют эффективность системной инфузии вектора AAV9 и AAVrhlO в отношении противодействия манифестациям MPS I в CNS.The goal is to improve therapy for severe MPS I by complementing current ERT and HSCT with IDUA gene transfer to the CNS, thereby preventing neurological manifestations of the disease. This study tested the ability of intravenously administered AAV serotypes 9 and rhlO vectors (AAV9 and AAVrhlO) to cross the blood-brain barrier to deliver and express the IDUA gene in the CNS (Figure 33). Animals aged 4-5 months with MPS I were infused intravenously through the tail vein with the AAV9 vector or the AAVrhlO vector encoding the human IDUA gene. Blood and urine samples were collected on a weekly basis until the animals were sacrificed at 10 weeks post-injection. Plasma IDUA activities in treated animals were nearly 1,000-fold higher compared to heterozygous controls 3 weeks post-injection (Figure 34). Brain, spinal cord and peripheral organs were analyzed for IDUA activity, clearance of GAG accumulation and IDUA immunofluorescence in tissue sections (Figures 34-36). Treated animals demonstrated widespread restoration of IDUA enzyme activity in all organs, including the CNS. These data demonstrate the effectiveness of systemic infusion of AAV9 vector and AAVrhlO in counteracting MPS I manifestations in the CNS.

Пример VIIExample VII

Мукополисахаридоз I типа (MPS I) представляет собой прогрессирующее, мультисистемное, наследственное метаболическое заболевание, обусловленное дефицитом α -L-идуронидазы (IDUA). Наиболее тяжелая форма этого заболевания (синдром Гурлер) приводит к смерти в возрасте 10. Существующие на сегодняшний день методы лечения этого заболевания являются неэффективными в отношении лечения заболевания CNS из-за неспособности лизосомных ферментов пересекать гематоэнцефалический барьер. Целью является дополнение существующей на сегодняшний день терапии и лечение манифестаций заболевания в CNS путем AAV-опосредованной доставки и экспрессии гена IDUA.Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a progressive, multisystem, inherited metabolic disease caused by α-L-iduronidase (IDUA) deficiency. The most severe form of this disease (Hurler syndrome) causes death by age 10. Current treatments for this disease are ineffective in treating CNS disease due to the inability of lysosomal enzymes to cross the blood-brain barrier. The goal is to complement current therapy and treat disease manifestations in the CNS through AAV-mediated delivery and expression of the IDUA gene.

Неинвазивный и эффективный подход к лечению заболевания CNS состоял в интраназальном введении IDUA-кодирующего вектора AAV9. Взрослых IDUA-дефицитных мышей подвергали индукции иммунологической толерантности при рождении с помощью человеческой идуронидазы для предотвращения анти-IDUA иммунного ответа, и в возрасте 3-х месяцев интраназально инфузировали вектором AAV9-IDUA, регулируемым С AGS (энхансер CMV/промотор бета-актина/интрон глобина). Животные, умерщвленные через 3 месяца после инфузии, показали уровни активности фермента IDUA, которые в 100 раз превышали уровни активности, наблюдаемые у животных дикого типа, в обонятельной луковице, при этом уровни фермента у животных дикого типа восстанавливались во всех других отделах головного мозга (фигура 37). Интраназальное лечение AAV9-IDUA также привело к сокращению материалов накопления GAG в тканях во всех отделах головного мозга (фигура 38). Тестирование нейрокогнитивной функции с использованием лабиринта Барнса показало, что подвергнутые лечению IDUA-дефицитные мыши не отличались от нормальных контрольных животных, тогда как не подвергнутые лечению IDUA-дефицитные мыши показали значительный дефицит научения (фигура 40). Непораженные гетерозиготные животные показали улучшенное выполнение в этом тесте, тогда как мыши с MPS I проявили дефицит в поиске отверстия. Примечательно, что мыши с MPS I, подвергнутые интраназальному введению AAV9-IDUA, показали поведение, сходное с гетерозиготными контролями, демонстрируя предотвращение нейрокогнитивного дефицита, наблюдаемого у не подвергнутых лечению животных с MPS I (фигура 40D).A non-invasive and effective approach to treat CNS disease has been the intranasal administration of the IDUA-encoding AAV9 vector. Adult IDUA-deficient mice were immunotolerized at birth with human iduronidase to prevent anti-IDUA immune response, and at 3 months of age were intranasally infused with the C AGS (CMV enhancer/beta-actin promoter/intron) regulated AAV9-IDUA vector globin). Animals sacrificed 3 months after infusion showed levels of IDUA enzyme activity that were 100 times higher than those observed in wild-type animals in the olfactory bulb, with enzyme levels in wild-type animals being restored in all other brain regions (Figure 37). Intranasal treatment with AAV9-IDUA also resulted in a reduction in tissue accumulation of GAG materials in all brain regions (Figure 38). Neurocognitive function testing using the Barnes maze showed that treated IDUA-deficient mice were no different from normal controls, whereas untreated IDUA-deficient mice showed significant learning deficits (Figure 40). Unaffected heterozygous animals showed improved performance in this test, whereas MPS I mice showed deficits in hole finding. Notably, MPS I mice treated with intranasal AAV9-IDUA exhibited behavior similar to heterozygous controls, demonstrating a prevention of the neurocognitive deficits observed in untreated MPS I animals (Figure 40D).

Наблюдалось сильное иммунофлуоресцентное окрашивание IDUA в срезах тканей назального эпителия и обонятельной луковицы, при этом окрашивание не наблюдалось в других отделах головного мозга (фигуры 39А-В). Это указывает на то, что широкое распределение фермента IDUA, скорее всего, является результатом диффузии фермента из участков трансдукции и экспрессии IDUA в обонятельной луковице и назальном эпителий в более глубоких областях головного мозга. Для увеличения доступа, доставки и распределения вектора по всему головному мозгу, IDUA-дефицитных животных предварительно подвергали интраназальным инфузиям усилителя абсорбции. В разные моменты времени после предварительной обработки животным интраназально инфузировали вектор AAV9 или AAVrhlO, кодирующий IDUA. Животных умерщвляли через 2 месяца после инфузии, головной мозг подвергали микродиссекции и анализировали на активность фермента IDUA, клиренс гликозаминогликанов и иммунофлюоресцентное окрашивание на IDUA и GFP. Эту новую неинвазивную стратегию интраназального введения AAV9-IDUA потенциально можно применять для лечения манифестаций MPS I в CNS и других лизосомных болезней.Strong immunofluorescence staining for IDUA was observed in tissue sections of the nasal epithelium and olfactory bulb, with no staining observed in other brain regions (Figures 39A-B). This indicates that the widespread distribution of IDUA enzyme is most likely the result of enzyme diffusion from sites of IDUA transduction and expression in the olfactory bulb and nasal epithelium to deeper regions of the brain. To increase vector access, delivery, and distribution throughout the brain, IDUA-deficient animals were pretreated with intranasal infusions of an absorption enhancer. At various time points after pretreatment, animals were intranasally infused with the AAV9 or AAVrhlO vector encoding IDUA. Animals were sacrificed 2 months after infusion, and the brains were microdissected and analyzed for IDUA enzyme activity, glycosaminoglycan clearance, and immunofluorescence staining for IDUA and GFP. This novel noninvasive strategy for intranasal administration of AAV9-IDUA has the potential to be used to treat CNS manifestations of MPS I and other lysosomal diseases.

Пример VIIIExample VIII

Мукополисахаридоз I типа (MPS I) представляет собой аутосомно-рецессивную лизосомную болезнь накопления, обусловленную дефицитом альфа-Ь-идуронидазы (IDUA), что приводит к накоплению гликозаминогликанов. Манифестации заболевания включают мультисистемные расстройства и в случае тяжелой формы заболевания (синдром Гурлер) приводят к смерти в возрасте до 10 лет.Существующие на сегодняшний день методы лечения, такие как ферментная заместительная терапия и аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, оказались неэффективными для лечения CNS. В данном исследовании использовали интратекальную доставку вектора на основе аденоассоциированного вируса серотипа 9, трансдуцирующего ген IDUA (AAV9-IDUA), в CNS в мышиной нокаутной модели MPS I. Целью данного исследования является оценка способности AAV-опосредованной генной терапии предотвращать патологические нейрохимические изменения, связанные с болезнью MPS I.Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by alpha-L-iduronidase (IDUA) deficiency, which results in the accumulation of glycosaminoglycans. Manifestations of the disease include multisystem disorders and, in the severe form of the disease (Hurler syndrome), lead to death before the age of 10 years. Current treatments, such as enzyme replacement therapy and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, have been ineffective for the treatment of CNS. This study used intrathecal delivery of an adeno-associated virus serotype 9 vector transducing the IDUA gene (AAV9-IDUA) to the CNS in an MPS I knockout mouse model. The purpose of this study is to evaluate the ability of AAV-mediated gene therapy to prevent pathological neurochemical changes associated with MPS I disease.

СпособыMethods

В качестве хорошо изученной модели синдрома Гурлер использовали нокаутных мышей C57BL/6, дефицитных по IDUA. Вектор AAV9 -IDUA доставляли интратекально мышам с MPS I в возрасте 12 недель. Перед введением AAV мышам инъецировали маннит для открытия гематоэнцефалического барьера и подвергали индукции иммунологической толерантности с помощью ларонидазы для предотвращения анти-IDUA иммунного ответа. ^!Н MP-спектры получали in vivo в гиппокампе и мозжечке мышей с MPS I, подвергнутых лечению геном AAV9-IDUA (подвергнутые лечению, имеющие MPS I, N=11), мышей с MPS I, не подвергнутых лечению (MPS I, N=12) и гетерозиготных однопометных мышей (контроль, N=12) в возрасте 9 месяцев. Все протонные спектры ^!Н МРС получали при 9.4Т с помощью методики FastMap и с помощью пространственно локализованной одновоксельной спектроскопии методом STEAM (stimulated echo acquisition mode) с параметрами импульсной последовательности ТЕ=2 мс в сочетании с подавлением сигнала воды в спектрах. Для определения количественного состава метаболитов использовался программный пакет LCModel со спектром макромолекул с быстрой релаксацией, включенных в основной набор. Дышащих самостоятельно животных анестезировали 1,0 - 1,5% изофлураном.IDUA-deficient C57BL/6 knockout mice were used as a well-studied model of Hurler syndrome. The AAV9 -IDUA vector was delivered intrathecally to MPS I mice at 12 weeks of age. Before AAV administration, mice were injected with mannitol to open the blood-brain barrier and subjected to immunotolerance induction with laronidase to prevent anti-IDUA immune response. ^! H MP spectra were obtained in vivo in the hippocampus and cerebellum of MPS I mice treated with the AAV9-IDUA gene (treated with MPS I, N=11), untreated MPS I mice (MPS I, N=12 ) and heterozygous littermate mice (control, N=12) at the age of 9 months. All proton spectra ^! H MRS was obtained at 9.4T using the FastMap technique and using spatially localized single-voxel spectroscopy using the STEAM (stimulated echo acquisition mode) method with pulse sequence parameters TE=2 ms in combination with suppression of the water signal in the spectra. To determine the quantitative composition of metabolites, the LCModel software package was used with a spectrum of macromolecules with fast relaxation included in the main set. Spontaneously breathing animals were anesthetized with 1.0–1.5% isoflurane.

Результатыresults

Спектральный состав, полученный в данном исследовании, позволил произвести количественную оценку пятнадцати метаболитов головного мозга. Небольшие, но значимые увеличения концентраций аскорбата (Asc,+0,6 мкмоль/г, ρ=0,003) и Ν-ацетиласпартилглутамата (NAAG,+0,3 моль/г, ρ=0,015) наблюдались в гиппокампе не подвергнутых лечению мышей с MPS I относительно контролей. Кроме того, наблюдалась тенденция к увеличению уровня глутатиона (GSH,+0,2 мкмоль/г, ρ=0,054). Различия между нейрохимическими профилями мозжечка у не подвергнутых лечению мышей с MPS I и контролей включали увеличение NAAG (0,25 мкмоль/г, ρ=0,026) и уменьшение фосфоэтаноламина (РЕ, -0,44 мкмоль/г, ρ=0,04). Нейрохимические профили мышей с MPS I, подвергнутых лечению AAV9-IDUA, показали значительное сходство с нейрохимическими профилями контрольных мышей (фигуры 42А-В). В гиппокампе подвергнутых лечению мышей с MPS I уровни Asc, NAAG и GSH нормализовались; только лактат (Lac) показал небольшое различие относительно контроля. В мозжечке подвергнутых лечению мышей с MPS I уровень РЕ, но не NAAG, нормализовался. Небольшие, но значимые различия между подвергнутыми лечению и контрольными мышами наблюдались для Asc, Lac, таурина (Таи) и общего креатина (Cr+РСг). За исключением Asc, изменения в концентрациях метаболитов у подвергнутых лечению мышей с MPS I были всегда противоположны изменениям, наблюдаемым у не подвергнутой лечению группы. Кроме того, для ряда метаболитов, которые не показали существенных изменений между не подвергнутыми лечению мышами с MPS I и контролями (например, глюкоза, глутамат, NAA), оказалось, что уровни метаболитов, обнаруженные у подвергнутых лечению мышей с MPS I, были более близкими контролям, чем не подвергнутым лечению мышам с MPS I. ОбсуждениеThe spectral composition obtained in this study allowed the quantification of fifteen brain metabolites. Small but significant increases in ascorbate (Asc, +0.6 μmol/g, ρ = 0.003) and N-acetylaspartyl glutamate (NAAG, +0.3 mol/g, ρ = 0.015) concentrations were observed in the hippocampus of untreated MPS mice. I relative to controls. In addition, there was a trend toward increased glutathione levels (GSH, +0.2 μmol/g, ρ = 0.054). Differences between cerebellar neurochemical profiles in untreated MPS I mice and controls included an increase in NAAG (0.25 μmol/g, ρ = 0.026) and a decrease in phosphoethanolamine (PE, -0.44 μmol/g, ρ = 0.04). . The neurochemical profiles of MPS I mice treated with AAV9-IDUA showed significant similarity to the neurochemical profiles of control mice (Figures 42A-B). In the hippocampus of treated MPS I mice, Asc, NAAG, and GSH levels normalized; only lactate (Lac) showed little difference relative to control. In the cerebellum of treated MPS I mice, levels of PE, but not NAAG, normalized. Small but significant differences between treated and control mice were observed for Asc, Lac, taurine (Tau), and total creatine (Cr+RSg). With the exception of Asc, changes in metabolite concentrations in treated MPS I mice were always opposite to those observed in the untreated group. Additionally, for a number of metabolites that did not show significant changes between untreated MPS I mice and controls (eg, glucose, glutamate, NAA), the metabolite levels found in treated MPS I mice were more similar controls than untreated MPS I mice. Discussion

Значительно увеличенные концентрации Asc и тенденция к увеличению GSH в гиппокампе у не подвергнутых лечению мышей с MPS I указывают на защитную реакцию против окислительного стресса, наблюдаемого в лизосомных болезнях. В свою очередь, пониженный уровень РЕ в мозжечке и повышенный уровень NAAG в обеих областях головного мозга у не подвергнутых лечению мышей с MPS I может указывать на демиелинизацию. Аналогичная картина пониженного уровня РЕ и повышенного уровня NAAG наблюдалась в модели с дефицитом железа, в которой была подтверждена измененная миелинизация. Сравнение нейрохимических профилей гиппокампа и мозжечка у подвергнутых лечению мышей с MPS I против не подвергнутых лечению мышей с MPS I и контрольных мышей ясно демонстрирует, что прямой перенос отсутствующего гена IDUA в CNS с использованием интратекальной доставки AAV9 (в возрасте 12 недель) предотвращает нейрохимические изменения (в возрасте 9 месяцев), связанные с нейродегенеративными процессами, в этой мышиной модели MPS I. Эти нейрохимические результаты согласуются с аналогичными подходами генной терапии, апробированными на мышиной модели MPS I.Significantly increased Asc concentrations and a trend toward increased GSH in the hippocampus of untreated MPS I mice indicate a protective response against oxidative stress observed in lysosomal diseases. In turn, decreased PE levels in the cerebellum and increased NAAG levels in both brain regions in untreated MPS I mice may indicate demyelination. A similar pattern of decreased PE and increased NAAG levels was observed in an iron deficiency model in which altered myelination was confirmed. Comparison of hippocampal and cerebellar neurochemical profiles in treated MPS I mice versus untreated MPS I mice and control mice clearly demonstrates that direct transfer of the missing IDUA gene into the CNS using intrathecal delivery of AAV9 (at 12 weeks of age) prevents neurochemical changes ( at 9 months of age) associated with neurodegenerative processes in this MPS I mouse model. These neurochemical results are consistent with similar gene therapy approaches tested in the MPS I mouse model.

Генная терапия, основанная на прямой доставке AAV9-IDUA в CNS, показала, что окислительный стресс и демиелинизация, связанные с этой мышиной моделью MPS I, могут быть предотвращены.Gene therapy based on direct delivery of AAV9-IDUA to the CNS showed that oxidative stress and demyelination associated with this MPS I mouse model could be prevented.

Все публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеизложенном описании данное изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами его осуществления, и многие детали представлены в целях иллюстрации, специалистам в данной области будет очевидно, что могут быть предложены дополнительные варианты осуществления, и что определенные детали, описанные здесь, могут значительно варьировать без отступления от основных принципов изобретения.All publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference. Although the foregoing description has described the invention in connection with specific preferred embodiments thereof and many details have been presented for purposes of illustration, those skilled in the art will appreciate that additional embodiments may be provided and that certain details described herein may vary significantly. without departing from the basic principles of the invention.

Claims (21)

1. Способ усиления нейрокогнитивной функции у млекопитающего, имеющего лизосомную болезнь накопления, включающий: интратекальное введение млекопитающему композиции, содержащей количество рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего открытую рамку считывания, кодирующую альфа-L-идуронидазу или идуронат-2-сульфатазу, эффективное для усиления нейрокогнитивной функции у млекопитающего по сравнению с млекопитающим, имеющим лизосомную болезнь накопления, которому не вводили rAAV, где rAAV имеет капсид rAAV9 или rAAVrh10.1. A method of enhancing neurocognitive function in a mammal having a lysosomal storage disease, comprising: intrathecal administration to the mammal of a composition containing an amount of recombinant adeno-associated virus (rAAV) containing an open reading frame encoding alpha-L-iduronidase or iduronate-2-sulfatase effective for enhancing neurocognitive function in a mammal compared to a mammal having a lysosomal storage disease that has not been administered rAAV, wherein the rAAV has a capsid rAAV9 or rAAVrh10. 2. Способ по п. 1, в котором млекопитающее не подвергают лечению иммуносупрессантом.2. The method of claim 1, wherein the mammal is not treated with an immunosuppressant. 3. Способ по п. 1, в котором млекопитающее подвергают лечению иммуносупрессантом.3. The method of claim 1, wherein the mammal is treated with an immunosuppressant. 4. Способ по п. 3, в котором иммуносупрессант представляет собой циклофосфамид.4. The method according to claim 3, wherein the immunosuppressant is cyclophosphamide. 5. Способ по п. 3, в котором иммуносупрессант представляет собой глюкокортикоид, цитостатические агенты, включая алкилирующий агент, антиметаболит, цитотоксический антибиотик, антитело или агент, связывающийся с иммунофилином. 5. The method of claim 3, wherein the immunosuppressant is a glucocorticoid, a cytostatic agent including an alkylating agent, an antimetabolite, a cytotoxic antibiotic, an antibody or an immunophilin binding agent. 6. Способ по п. 3, в котором иммуносупрессант представляет собой азотистый иприт, нитрозомочевину, соединение платины, метотрексат, азатиоприн, меркаптопурин, фторурацил, дактиномицин, антрациклин, митомицин С, блеомицин, митрамицин, направленные на рецептор IL-2 (CD25-) или CD3-антитела, антитела к IL-2, циклоспорин, такролимус, сиролимус, IFN-β, IFN-γ, опиоид или связывающее TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа) средство.6. The method according to claim 3, in which the immunosuppressant is nitrogen mustard, nitrosourea, a platinum compound, methotrexate, azathioprine, mercaptopurine, fluorouracil, dactinomycin, anthracycline, mitomycin C, bleomycin, mithramycin, aimed at the IL-2 receptor (CD25-) or CD3 antibodies, anti-IL-2 antibodies, cyclosporine, tacrolimus, sirolimus, IFN-β, IFN-γ, opioid, or TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) binding agent. 7. Способ по любому из пп. 4-6, в котором rAAV и иммуносупрессант вводят совместно или иммуносупрессант вводят после rAAV.7. Method according to any one of paragraphs. 4-6, in which rAAV and an immunosuppressant are administered together or the immunosuppressant is administered after rAAV. 8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором млекопитающее не подвергают индукции иммунологической толерантности до введения rAAV.8. Method according to any one of paragraphs. 1-7, wherein the mammal is not subjected to immunotolerance induction prior to rAAV administration. 9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором млекопитающее подвергают индукции иммунологической толерантности до введения rAAV.9. Method according to any one of paragraphs. 1-8, wherein the mammal is subjected to immunotolerance induction prior to administration of rAAV. 10. Способ по п. 1, в котором млекопитающее представляет собой иммунокомпетентное взрослое млекопитающее.10. The method of claim 1, wherein the mammal is an immunocompetent adult mammal. 11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором rAAV имеет капсид rAAV9.11. Method according to any one of paragraphs. 1-10, in which rAAV has the rAAV9 capsid. 12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором открытая рамка считывания, кодирует идуронат-2-сульфатазу.12. Method according to any one of paragraphs. 1-11, in which the open reading frame encodes iduronate-2-sulfatase. 13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором млекопитающее представляет собой человека.13. Method according to any one of paragraphs. 1-12, in which the mammal is a human. 14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором млекопитающее является дефицитным по идуронат-2-сульфатазе.14. Method according to any one of paragraphs. 1-13, in which the mammal is deficient in iduronate-2-sulfatase. 15. Способ по любому из пп. 1-13, в котором млекопитающее имеет нарушение микополисахаридоз I типа.15. Method according to any one of paragraphs. 1-13, in which the mammal has the disorder mycopolysaccharidosis type I. 16. Способ по любому из пп. 1–11, в котором открытая рамка считывания, кодирует альфа-L-идуронидазу. 16. Method according to any one of paragraphs. 1–11, in which the open reading frame encodes alpha-L-iduronidase. 17. Способ по любому из пп. 1–11, в котором млекопитающее имеет нарушение микополисахаридоз II типа.17. Method according to any one of paragraphs. 1–11, in which the mammal has the disorder mycopolysaccharidosis type II. 18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором вводят многократные дозы.18. Method according to any one of paragraphs. 1-17, in which multiple doses are administered. 19. Способ по любому из пп. 1-17, в котором композицию вводят раз в неделю.19. Method according to any one of paragraphs. 1-17, in which the composition is administered once a week. 20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором определенное количество ингибирует задержку роста, ингибирует гепатоспленомегалию, ингибирует заболевание сердца и легких или ингибирует дисплазию скелета, или любую их комбинацию.20. Method according to any one of paragraphs. 1-19, wherein the specified amount inhibits growth retardation, inhibits hepatosplenomegaly, inhibits heart and lung disease, or inhibits skeletal dysplasia, or any combination thereof. 21. Способ по любому из пп. 1-20, в котором rAAV имеет капсид rAAVrh10.21. Method according to any one of paragraphs. 1-20, in which rAAV has a capsid rAAVrh10.