RU2804207C1 - Method for predicting male infertility based on sperm dna fragmentation analysis - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: relates to andrology, laboratory research methods in the field of biochemistry, pathological physiology, reproductive medicine, and can be used to clarify the causes of male infertility, as well as to predict the outcome of the IVF/ICSI procedure in assisted reproductive clinics. The ejaculate obtained by masturbation is stained. Terminal transferase is added to the ejaculate in a volume of 0.5 μl with an activity of 20-40 units/μl, the mixture is incubated in a thermostat at +37°C for 60 minutes, then add 0.1 ml of 0.05% buffered Trypan blue dye. Then, using fluorescence microscopy, the degree of DNA fragmentation of sperm is determined by counting the number of intact sperm and sperm with disturbances in the form of DNA fragmentation, calculating the ratio of damaged to undamaged sperm in %. When the degree of fragmentation is 15% or less, a low degree of DNA fragmentation is determined and male fertility is predicted with a high chance of fertilization naturally, from 16 to 30% - the average degree of DNA defragmentation is determined, male fertility is predicted with a reduced chance of fertilization naturally, more than 30% - determine a high degree of DNA defragmentation and predict male infertility.

EFFECT: improving the accuracy of infertility prognosis by determining the degree of sperm DNA fragmentation.

1 cl, 1 tbl, 4 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к андрологии, лабораторным методам исследования в области биохимии, патологической физиологии, репродуктивной медицине, может быть использовано для уточнения причин мужского бесплодия, а также прогноза исхода процедуры ЭКО/ИКСИ в клиниках вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).The proposed invention relates to medicine, namely andrology, laboratory research methods in the field of biochemistry, pathological physiology, reproductive medicine, and can be used to clarify the causes of male infertility, as well as to predict the outcome of the IVF/ICSI procedure in assisted reproductive technology (ART) clinics.

Увеличение случаев бесплодия, сопровождающегося снижением качества спермы, объясняет повышенный интерес научного сообщества к этой проблеме для поиска основных причин и разработки эффективных вариантов профилактики и лечения [Лебедев Г.С, 2019; Houston В. et al., 2021]. Мужское бесплодие - многофакторная форма патологии, включающая широкий спектр расстройств [Aitken R., 2020; Павлов В.Н. и др., 2020]. В большинстве случаев причины снижения фертильности у конкретного пациента остаются неизвестными и, по различным оценкам, от 20 до 75% диагностированного мужского бесплодия считаются идиопатическими [Agarwal A. et al., 2021]. Одним из факторов, способным снижать мужскую фертильность, - это гиперпродукция активных форм кислорода (АФК). Способность генерировать АФК - фундаментальное свойство сперматозоидов млекопитающих и основная причина окислительного стресса, ответственного за нарушение их функции. В небольших количествах АФК необходимы для нормальной регуляции функции сперматозоидов, их гиперактивации и акросомальной реакции. Избыточная продукция АФК приводит к повреждению мембраны сперматозоидов, снижению их подвижности и нарушению оплодотворяющей способности. Результатом гиперпродукции АФК является повреждение митохондрий, ДНК и инициация апоптоза, в результате чего сперматозоиды теряют подвижность и жизнеспособность. Этот путь приводит также к экстернализации фосфатидилсерина, который способствует фагоцитозу сперматозоидов после оплодотворения, что предопределяет иммунный ответ на спермальные антигены и прогноз фертильности [Божедомов В.А., Сухих Г.Т., 2017, Галимов Ш.Н., и др. 2020]. Окислительный стресс и фрагментация ДНК сперматозоидов непосредственно и тесно связаны с мужским фактором бесплодия, включая идиопатическое. Несмотря на чувствительность к окислительному стрессу, функция сперматозоидов зависит от генерации АФК, необходимых для активации сигнальных путей, связанных с капацитацией. Некоторая степень контролируемого разрыва ДНК необходима для адекватной компактизации ДНК, однако, чрезмерная фрагментация одно- или двухцепочечные ДНК, сопровождается снижением качества спермы, уменьшением числа оплодотворенных яйцеклеток и частоты наступления беременности, снижением качество эмбрионов, высокий риск развития самопроизвольных абортов и не эффективности выполнения ВРТ. Образование окисленных аддуктов ДНК, уровень которых коррелирует с плотностью упаковки, степенью протаминирования и фрагментации хроматина, - частое явление в сперматозоидах при различной патологии. В этой связи актуальна разработка и внедрение новых технологий, направленных на совершенствование методов лабораторной диагностики бесплодия. Качество сперматозоидов важно для формирования общей фертильности мужчины.The increase in cases of infertility, accompanied by a decrease in sperm quality, explains the increased interest of the scientific community in this problem to find the main causes and develop effective options for prevention and treatment [Lebedev G.S., 2019; Houston V. et al., 2021]. Male infertility is a multifactorial form of pathology, including a wide range of disorders [Aitken R., 2020; Pavlov V.N. et al., 2020]. In most cases, the reasons for decreased fertility in a particular patient remain unknown and, according to various estimates, from 20 to 75% of diagnosed male infertility are considered idiopathic [Agarwal A. et al., 2021]. One of the factors that can reduce male fertility is the overproduction of reactive oxygen species (ROS). The ability to generate ROS is a fundamental property of mammalian sperm and the main cause of oxidative stress responsible for impaired sperm function. In small quantities, ROS are necessary for the normal regulation of sperm function, their hyperactivation and the acrosomal reaction. Excessive production of ROS leads to damage to the sperm membrane, a decrease in their motility and impaired fertilizing ability. The result of overproduction of ROS is damage to mitochondria, DNA and initiation of apoptosis, as a result of which sperm lose motility and viability. This pathway also leads to the externalization of phosphatidylserine, which promotes phagocytosis of sperm after fertilization, which determines the immune response to sperm antigens and fertility prognosis [Bozhedomov V.A., Sukhikh G.T., 2017, Galimov Sh.N., et al. 2020 ]. Oxidative stress and sperm DNA fragmentation are directly and closely related to male factor infertility, including idiopathic infertility. Despite sensitivity to oxidative stress, sperm function depends on the generation of ROS, which is necessary for the activation of signaling pathways associated with capacitation. A certain degree of controlled DNA breakage is necessary for adequate DNA compaction, however, excessive fragmentation of single- or double-stranded DNA is accompanied by decreased sperm quality, a decrease in the number of fertilized eggs and pregnancy rates, decreased embryo quality, a high risk of spontaneous abortions and ineffective ART. The formation of oxidized DNA adducts, the level of which correlates with the packing density, the degree of protamination and chromatin fragmentation, is a common phenomenon in spermatozoa under various pathologies. In this regard, the development and implementation of new technologies aimed at improving methods for laboratory diagnosis of infertility is relevant. Sperm quality is important for a man's overall fertility.

Одним из критериев диагностики мужского бесплодия является анализ спермограммы [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO (Geneva), 2010. Vol. 270; Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макаровой под научн. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. М.: Изд-во "Капитал принт", 2012]. Однако он имеет недостатки и не всегда по данному анализу можно оценить фертильность пациентов.One of the criteria for diagnosing male infertility is spermogram analysis [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO (Geneva), 2010. Vol. 270; WHO guidelines for the examination and processing of human ejaculate. Per. from English N.P. Makarova under scientific. ed. L.F. Smoked. 5th ed. M.: Publishing house "Capital print", 2012]. However, it has disadvantages and it is not always possible to assess the fertility of patients using this analysis.

Недостатки классической спермограммы:Disadvantages of the classical spermogram:

1. Анализ основан лишь на визуальном исследовании функционально-морфологических критериев сперматозоидов и не дает возможность выявить биохимические и патофизиологические нарушения в мужских половых клетках.1. The analysis is based only on a visual examination of the functional and morphological criteria of sperm and does not make it possible to identify biochemical and pathophysiological disorders in male germ cells.

2. Имеет субъективный характер, зависящий от лабораторных навыков лаборанта.2. Has a subjective nature, depending on the laboratory skills of the laboratory assistant.

3. От 30 до 50% анализов спермограммы соответствуют критериям ВОЗ, что не позволяет выявить патологию при идиопатическом бесплодии у мужчин.3. From 30 to 50% of spermogram analyzes meet WHO criteria, which does not allow identifying pathology in idiopathic infertility in men.

4. Нормальные результаты спермограммы не гарантируют зачатие. Многочисленные данные указывают на роль фрагментации ДНК в развитии патоспермии [Ahmed Т. Alahmar et al., 2022; Aitken R.J. et al., 2021; Park Y.J., et al., 2021 и др.].4. Normal spermogram results do not guarantee conception. Numerous data indicate the role of DNA fragmentation in the development of pathospermia [Ahmed T. Alahmar et al., 2022; Aitken R.J. et al., 2021; Park Y.J., et al., 2021, etc.].

Известен способ диагностики мужского бесплодия, включающий изучение степени компактизации хроматина сперматозоидов, относительного содержания дефектных клеток в эякуляте, уровня ингибина В в сыворотке крови. На основании полученных данных вычисляют диагностический индекс DI, исходя из значения которого, диагностируют бесплодие у мужчин или отсутствие патологии [патент RU 2362167, 2009]. Степень компактизации хроматина сперматозоидов оценивают на основании сравнения гистограмм распределения клеток до и после насильственной деконденсации гепарином по уровню специфической флуоресценции, используя статистический метод Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия двух кривых п. 1. характеризует нарушение компактизации хроматина и незрелое состояние сперматозоидов. Относительное содержание дефектных клеток определяют по уровню неспецифической флуоресценции (М).There is a known method for diagnosing male infertility, including studying the degree of compaction of sperm chromatin, the relative content of defective cells in the ejaculate, and the level of inhibin B in the blood serum. Based on the data obtained, the diagnostic index DI is calculated, based on the value of which, infertility in men or the absence of pathology is diagnosed [patent RU 2362167, 2009]. The degree of compaction of sperm chromatin is assessed based on comparison of histograms of cell distribution before and after forced decondensation with heparin according to the level of specific fluorescence, using the Kolmogorov-Smirnov statistical method with determination of the similarity index of two curves, point 1. Characterizes the violation of chromatin compaction and the immature state of sperm. The relative content of defective cells is determined by the level of nonspecific fluorescence (M).

Недостатки данного способа: 1) демонстрирует только совокупность полученных лабораторных показателей;The disadvantages of this method: 1) demonstrates only the totality of the obtained laboratory indicators;

2) эффективность данного метода не достигает 100% (84,5%);2) the effectiveness of this method does not reach 100% (84.5%);

3) нет качественного показателя оценки фрагментации сперматозоидов при бесплодии.3) there is no qualitative indicator for assessing sperm fragmentation in infertility.

Известен способ прогнозирования высокой степени фрагментации ДНК и невынашивания беременности в паре, включающий сбор и исследование эякулята на содержание триклозана, с использованием метода газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. При обнаружении концентрации триклозана >0,11 нг/мл в семенной жидкости прогнозируют высокий риск фрагментации ДНК сперматозоидов и невынашивания беременности в паре [патент RU 2703455, 2019]. Недостатками данного технического решения являются:There is a known method for predicting a high degree of DNA fragmentation and miscarriage in a couple, including the collection and examination of ejaculate for triclosan content, using gas chromatography with mass spectrometric detection. If a triclosan concentration of >0.11 ng/ml is detected in the seminal fluid, a high risk of sperm DNA fragmentation and miscarriage in a couple is predicted [patent RU 2703455, 2019]. The disadvantages of this technical solution are:

1) предлагаемый способ является косвенным с определением точки разделения (cut-off) для концентраций триклозана в семенной жидкости у мужчин с фрагментацией ДНК сперматозоидов;1) the proposed method is indirect with the determination of the cut-off point for triclosan concentrations in seminal fluid in men with sperm DNA fragmentation;

2) данный способ реализуется методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией. Метод дорогостоящий и не является экспресс-методом;2) this method is implemented by gas chromatography with mass spectrometry. The method is expensive and is not an express method;

3) чувствительность и специфичность прототипа не достигает значений 100%, и составила 85% и 77% соответственно.3) the sensitivity and specificity of the prototype does not reach 100%, and amounted to 85% and 77%, respectively.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ определения индекса фрагментации ДНК, заключающийся в том, что проводят окрашивание эякулята акридиновым оранжевым, определяют количество поврежденных сперматозоидов: с фрагментированными ДНК и с незрелым ядром. Способ основан на метахроматических свойствах акридинового оранжевого, который изменяет флуоресценцию с зеленого на красный при связывании с одно цепочечной ДНК или РНК [Schlegel P.N., Paduch D.A., 2005 [Yet another test of sperm chromatin structure. Fertil Steril 2005; 84: 4: 854-859]. В качестве показателя фертильности мужчины указано значение степени фрагментации ДНК сперматозоидов ниже 15%.The closest analogue of the invention is a method for determining the DNA fragmentation index, which consists in staining the ejaculate with acridine orange and determining the number of damaged sperm: with fragmented DNA and with an immature nucleus. The method is based on the metachromatic properties of acridine orange, which changes fluorescence from green to red when binding to single-stranded DNA or RNA [Schlegel P.N., Paduch D.A., 2005 [Yet another test of sperm chromatin structure. Fertil Steril 2005; 84: 4: 854-859]. The degree of sperm DNA fragmentation below 15% is indicated as an indicator of a man's fertility.

Недостатком данного исследования является отсутствие диапазона показателей фрагментации ДНК сперматозоида и оценки вероятности наступления беременности у партнерши.The disadvantage of this study is the lack of a range of sperm DNA fragmentation indicators and an assessment of the likelihood of pregnancy in the partner.

Задачей изобретения является разработка способа диагностики мужского бесплодия на основе выявления наличия фрагментации ДНК сперматозоидов у бесплодных мужчин.The objective of the invention is to develop a method for diagnosing male infertility based on identifying the presence of sperm DNA fragmentation in infertile men.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогноза бесплодия за счет определения степеней фрагментации ДНК сперматозоидов.The technical result when using the invention is to increase the accuracy of infertility prognosis by determining the degree of sperm DNA fragmentation.

Предлагаемый способ оценки фертильности при мужском бесплодии осуществляется следующим образом: проводят окрашивание мазков эякулята на стекле. В качестве красителя используют витальный краситель отечественного производителя трипановый синий (Trypan blue 0,05%-ный буферизированный краситель), разработанный ЗАО «Оптимедсервис» (Россия). Витальные красители являются эффективным инструментом для визуализации и контрастирования различных биологических тканей, в том числе мужских гамет.Витальный краситель обеспечивает оптимальную визуализацию как патологически фрагментированных сперматозоидов, так и не измененных мужских гамет. Проводят сбор эякулята, полученного путем мастурбации. В образцы спермы добавляют терминальную трансферазу в объеме 0,5 мкл фермента с активностью 20-40 ед./мкл для связывания с «порванными», именными участками ДНК. Полученную смесь инкубируют в термостате при +37°С в течение 60 мин. После завершения инкубации добавляют 0,1 мл 0,05%-ного буферизированного красителя Trypan blue, обладающего высокой окрашивающей способностью. В состав Trypan blue 0,05%-ный буферизированный входят следующие компоненты в соотношении на 1 мл раствора: (краситель Trypan blue - 1,3 мг; краситель BBG - 0,2 мг; динатрий фосфат - 3,1 мг; дигидрофосфат натрия - 0,3 мг; натрий хлористый - 7,6 мг; полиэтиленгликоль (ПЭГ) - 20 мг; гиалуронат натрия - 3 мг; Дистиллированная вода - до 1 мл. Соотношения компонентов на 1 мл раствора получены в результате экспериментального подбора и протестированы испытаниями. Данный раствор витального красителя создан ЗАО «Оптимедсервис», Россия по ТУ 9393-019-29792921-2015. Подсчет результата идет с помощью универсального инвертированного микроскопа Olympus СКХ53 с флуоресцентным осветителем U-HGTGPS с программным обеспечением для ввода и анализа изображения в чашках Петри. Для каждого образца считают 2000 сперматозоидов. Из них определяют % сперматозоидов, имеющих нарушения в виде фрагментации ДНК. Сперматозоиды, имеющие нарушения в виде фрагментации ДНК, окрашиваются и подсвечиваются в мерцающий зелено-голубоватый цвет, здоровые сперматозоиды с целым ДНК не прокрашиваются витальным красителем.The proposed method for assessing fertility in male infertility is carried out as follows: staining smears of ejaculate on glass. The vital dye used as a dye is domestically produced trypan blue (Trypan blue 0.05% buffered dye), developed by Optimedservice JSC (Russia). Vital dyes are an effective tool for visualizing and contrasting various biological tissues, including male gametes. The vital dye provides optimal visualization of both pathologically fragmented sperm and intact male gametes. The ejaculate obtained through masturbation is collected. Terminal transferase is added to sperm samples in a volume of 0.5 μl of an enzyme with an activity of 20-40 units/μl to bind to “broken” DNA sections. The resulting mixture is incubated in a thermostat at +37°C for 60 minutes. After incubation is complete, add 0.1 ml of 0.05% buffered Trypan blue dye, which has high staining power. Trypan blue 0.05% buffered contains the following components in the ratio per 1 ml of solution: (Trypan blue dye - 1.3 mg; BBG dye - 0.2 mg; disodium phosphate - 3.1 mg; sodium dihydrogen phosphate - 0.3 mg; sodium chloride - 7.6 mg; polyethylene glycol (PEG) - 20 mg; sodium hyaluronate - 3 mg; Distilled water - up to 1 ml. The ratios of components per 1 ml of solution were obtained as a result of experimental selection and tested by tests. This vital dye solution was created by JSC "Optimedservice", Russia according to TU 9393-019-29792921-2015. The result is calculated using a universal inverted microscope Olympus SKH53 with a fluorescent illuminator U-HGTGPS with software for entering and analyzing images in Petri dishes. For everyone 2000 sperm are counted in a sample. Of these, the percentage of sperm that have abnormalities in the form of DNA fragmentation is determined. Spermatozoa that have abnormalities in the form of DNA fragmentation are painted and highlighted in a shimmering green-bluish color, healthy sperm with intact DNA are not stained with a vital dye.

При значении степени фрагментации 15% и менее определяют низкую степень фрагментации ДНК и прогнозируют мужскую фертильность с высоким шансом оплодотворения естественным путем, при данных лабораторных показателях лечение не требуется.If the degree of fragmentation is 15% or less, a low degree of DNA fragmentation is determined and male fertility with a high chance of natural fertilization is predicted; with these laboratory indicators, treatment is not required.

От 16 до 30% - определяют среднюю степень фрагментации ДНК, прогнозируют мужскую фертильность со сниженным шансом оплодотворения естественным путем и повышенной вероятностью возникновения выкидышей.From 16 to 30% - determine the average degree of DNA fragmentation, predict male fertility with a reduced chance of fertilization naturally and an increased likelihood of miscarriages.

Более 30% - определяют высокую степень фрагментации ДНК, прогнозируют мужское бесплодие. Наступление беременности естественным путем практически невозможно, успех проведения ЭКО под вопросом.More than 30% determine a high degree of DNA fragmentation and predict male infertility. Getting pregnant naturally is almost impossible; the success of IVF is questionable.

Оценку показателей фрагментации ДНК сперматозоидов проводили в когорте бесплодных мужчин с нормоспермией и патоспермией. Разброс значений фрагментации ДНК сперматозоидов в группе пациентов с нормоспермией колебался от 6%> до 15%>, в группе пациентов с патоспермией от 16% до 49%>, т.е. фрагментация ДНК сперматозоидов в обеих группах колебалась в интервале от 6% до 49%. Средний показатель составил 28,9±8,4%. При сравнительном анализе в изучаемых группах пациентов с патоспермией, по показателю уровня фрагментации ДНК сперматозоидов достоверных различий между ними не выявлено. У пациентов с патоспермией фрагментация ДНК сперматозоидов встречалась значительно чаще (таблица).The assessment of sperm DNA fragmentation indicators was carried out in a cohort of infertile men with normospermia and pathospermia. The spread of sperm DNA fragmentation values in the group of patients with normospermia ranged from 6%> to 15%>, in the group of patients with pathospermia from 16% to 49%>, i.e. Sperm DNA fragmentation in both groups ranged from 6% to 49%. The average figure was 28.9±8.4%. In a comparative analysis in the studied groups of patients with pathospermia, no significant differences were revealed between them in terms of the level of sperm DNA fragmentation. In patients with pathospermia, sperm DNA fragmentation was significantly more common (table).

При значении степени фрагментации 15% и менее определяют количество сперматозоидов с поврежденной ДНК минимальным, низкую степень фрагментации ДНК и прогнозируют мужскую фертильность с высоким шансом оплодотворения естественным путем, лечение не требуется. От 16 до 30% - средняя степень фрагментации ДНК, снижены шансы оплодотворения естественным путем, повышенная вероятностьIf the degree of fragmentation is 15% or less, the number of sperm with damaged DNA is minimal, the degree of DNA fragmentation is low and male fertility is predicted with a high chance of fertilization naturally; treatment is not required. From 16 to 30% - average degree of DNA fragmentation, reduced chances of fertilization naturally, increased probability

возникновения выкидышей. Более 30% - высокая степень фрагментации. Наступление беременности естественным путем практически невозможна, успех проведения ЭКО под вопросом.occurrence of miscarriages. More than 30% - a high degree of fragmentation. Getting pregnant naturally is almost impossible, and the success of IVF is questionable.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.The essence of the invention is illustrated by the following examples.

Пример 1Example 1

Пациент В., возраст 34 лет, супруга А., возраст 29 лет, состояли в бесплодном браке в течение 5 лет, обратились в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу бесплодия. При обследовании супруги патологических нарушений со стороны репродуктивной системы выявлено не было. При проведении обследования эякулята супруга выявлена астенотерато-зооспермия. Время разжижения эякулята составило 13 минут. Объем эякулята 6,4 мл. Концентрация сперматозоидов - 14,5 млн/мл, подвижных сперматозоидов 27,0%, нежизнеспособных 25,6%, атипичных форм 47,4%. У пациента проведен анализ на выявления наличия фрагментации ДНК сперматозоидов методом окраски витальным красителем трипановый синий. Степень фрагментации ДНК в пределах 16%.Patient V., age 34 years, wife A., age 29 years, were in an infertile marriage for 5 years, went to the ART clinic “Semya” in Ufa regarding infertility. When examining the wife, no pathological disorders of the reproductive system were identified. An examination of the husband's ejaculate revealed asthenoteratozoospermia. The ejaculate liquefaction time was 13 minutes. Ejaculate volume 6.4 ml. Sperm concentration - 14.5 million/ml, motile sperm 27.0%, non-viable 25.6%, atypical forms 47.4%. The patient was analyzed to detect the presence of sperm DNA fragmentation using the vital dye trypan blue. The degree of DNA fragmentation is within 16%.

Заключение: Показатели спермограммы соответствуют предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме, за исключением снижения показателей подвижности сперматозоидов. Женский фактор без патологии. У пациента средняя степень дефрагментации ДНК, предложена схема лечения. Через год после проведенной терапии произошло оплодотворение, и наступила беременность.Conclusion: The spermogram indicators correspond to the requirements of the WHO expert group for fertile sperm, with the exception of a decrease in sperm motility indicators. Female factor without pathology. The patient has an average degree of DNA defragmentation; a treatment regimen has been proposed. A year after the therapy, fertilization occurred and pregnancy occurred.

Пример 2Example 2

Пациент С., возраст 30 лет, в браке состоит в течение 2-х лет, обратился в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного профилактического осмотра и запланировать рождение малыша. При проведении обследования эякулята - время разжижения 15 минут. Объем эякулята - 4,2 мл, общее количество сперматозоидов 44 млн, концентрация - 14,3 млн/мл, подвижных сперматозоидов 43,9%, нежизнеспособных 26,4%, атипичных форм 29,7%. Проведен анализ на выявления наличия фрагментации ДНК сперматозоидов методом окраски витальным красителем трипановый синий. Степень фрагментации ДНК в пределах 15%.Patient S., age 30 years old, married for 2 years, contacted the ART clinic “Semya” in Ufa for a primary preventive examination and to plan the birth of a baby. When examining ejaculate, the liquefaction time is 15 minutes. Ejaculate volume - 4.2 ml, total number of sperm 44 million, concentration - 14.3 million/ml, motile sperm 43.9%, non-viable 26.4%, atypical forms 29.7%. An analysis was carried out to detect the presence of sperm DNA fragmentation by staining with the vital dye trypan blue. The degree of DNA fragmentation is within 15%.

Заключение: Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Параметры проведенного анализа спермограммы в пределах нормы. Низкая степень фрагментации ДНК. Сделан прогноз на реализацию нормальной фертильной функции. Нарушений не выявлено. В течение года произошло зачатие у супруги с последующим нормальным течением беременности.Conclusion: The spermogram indicators meet the criteria set by the WHO expert group for fertile sperm. The parameters of the spermogram analysis were within normal limits. Low degree of DNA fragmentation. A forecast was made for the implementation of normal fertile function. No violations were found. Within a year, the wife conceived, followed by a normal pregnancy.

Пример 3Example 3

Пациент М., возраст 34 год, супруга А., возраст 24 лет, состояли в бесплодном браке в течение 3 лет, обратились в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы. При обследовании патологических нарушений со стороны репродуктивной системы супруги выявлено не было. Время разжижения эякулята составило 10 минут. Объем эякулята 6 мл. Концентрация сперматозоидов - 10 млн/мл, подвижных сперматозоидов 30,0%, нежизнеспособных 29,5%, атипичных форм 40,5%. Была диагностирована олигоастенотератоспермия. У пациента проведен анализ фрагментации ДНК - 31%. Через год при повторном обращении беременность в браке не наступила, несмотря на проведенную терапию.Patient M., age 34 years old, wife A., age 24 years old, were in an infertile marriage for 3 years, went to the ART clinic “Family” in Ufa. An examination of the wife revealed no pathological abnormalities in her reproductive system. The ejaculate liquefaction time was 10 minutes. Ejaculate volume 6 ml. Sperm concentration - 10 million/ml, motile sperm 30.0%, non-viable 29.5%, atypical forms 40.5%. Oligoasthenoteratospermia was diagnosed. The patient underwent DNA fragmentation analysis - 31%. A year later, when re-applying, pregnancy did not occur in the marriage, despite the therapy.

Заключение: Прогноз высокого риска бесплодия в виде олигоастенотератоспермии. Выявленный вариант анализа фрагментации ДНК коррелировал с развитием олигоастенотератоспермии.Conclusion: Prognosis of high risk of infertility in the form of oligoasthenoteratospermia. The identified variant of DNA fragmentation analysis correlated with the development of oligoasthenoteratospermia.

Пример 4Example 4

Пациент К., возраст 40 лет, в браке состоит 4 года, обратился в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного профилактического осмотра. Детей в браке нет. При проведении обследования эякулята - время разжижения 15 минут. Объем эякулята - 3,4 мл, общее количество сперматозоидов 42 млн, концентрация - 14,2 млн/мл, подвижных сперматозоидов 46,9%), нежизнеспособных 25,3%, атипичных форм 27,8%. У пациента проведен анализ фрагментации ДНК - 30%. После проведенной терапии произошло зачатие у супруги с последующим нормальным течением беременности.Patient K., age 40 years old, married for 4 years, contacted the ART clinic “Semya” in Ufa for a primary preventive examination. There are no children in the marriage. When examining ejaculate, the liquefaction time is 15 minutes. Ejaculate volume - 3.4 ml, total number of sperm 42 million, concentration - 14.2 million/ml, motile sperm 46.9%), non-viable 25.3%, atypical forms 27.8%. The patient underwent DNA fragmentation analysis - 30%. After the therapy, the wife conceived, followed by a normal pregnancy.

Заключение: Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Параметры проведенного анализа спермограммы в пределах нормы. У пациента средняя степень дефрагментации ДНК, предложена схема лечения. Через 6 месяцев после проведенной терапии произошло оплодотворение, и наступила беременность.Conclusion: The spermogram indicators meet the criteria set by the WHO expert group for fertile sperm. The parameters of the spermogram analysis were within normal limits. The patient has an average degree of DNA defragmentation; a treatment regimen has been proposed. 6 months after the therapy, fertilization occurred and pregnancy occurred.

Преимущества заявляемого способа:Advantages of the proposed method:

1. Применение анализа степени фрагментации ДНК в качестве биомаркера риска развития идиопатического бесплодия может быть использовано в андрологии и репродуктивной медицине.1. The use of analysis of the degree of DNA fragmentation as a biomarker of the risk of developing idiopathic infertility can be used in andrology and reproductive medicine.

2. Предлагаемый способ прогнозирования является перспективным методом раннего выявления репродуктивной патологии с возможностью его использования для коррекции нарушений гаметогенеза и оплодотворения.2. The proposed forecasting method is a promising method for the early detection of reproductive pathology with the possibility of its use for the correction of disorders of gametogenesis and fertilization.

3. Определение степени фрагментации ДНК является надежным и важным способом для выявления прогноза наступления беременности естественным путем.3. Determining the degree of DNA fragmentation is a reliable and important way to determine the prognosis of natural pregnancy.

Claims (1)

Способ прогнозирования мужского бесплодия, включающий сбор эякулята, полученного путем мастурбации, окрашивание его и определение методом флуоресцентной микроскопии степени фрагментации ДНК сперматозоидов путем подсчета количества неповрежденных сперматозоидов и сперматозоидов, имеющих нарушения в виде фрагментации ДНК, вычисления соотношения поврежденных сперматозоидов к неповрежденным в %, отличающийся тем, что к эякуляту добавляют терминальную трансферазу в объеме 0,5 мкл с активностью 20-40 ед./мкл, смесь инкубируют в термостате при +37°С в течение 60 минут, затем добавляют 0,1 мл 0,05%-ного буферизированного красителя Trypan blue, при значении степени фрагментации 15% и менее определяют низкую степень фрагментации ДНК и прогнозируют мужскую фертильность с высоким шансом оплодотворения естественным путем, от 16 до 30% – определяют среднюю степень дефрагментации ДНК, прогнозируют мужскую фертильность со сниженным шансом оплодотворения естественным путем, более 30% – определяют высокую степень дефрагментации ДНК, прогнозируют мужское бесплодие.A method for predicting male infertility, including collecting ejaculate obtained by masturbation, staining it and determining by fluorescence microscopy the degree of DNA fragmentation of sperm by counting the number of intact sperm and sperm with disturbances in the form of DNA fragmentation, calculating the ratio of damaged to undamaged sperm in %, characterized in that that terminal transferase in a volume of 0.5 μl with an activity of 20-40 units/μl is added to the ejaculate, the mixture is incubated in a thermostat at +37°C for 60 minutes, then 0.1 ml of 0.05% buffered Trypan blue dye, when the degree of fragmentation is 15% or less, a low degree of DNA fragmentation is determined and male fertility is predicted with a high chance of fertilization naturally, from 16 to 30% - the average degree of DNA defragmentation is determined, male fertility is predicted with a reduced chance of fertilization naturally, more than 30% – determine a high degree of DNA defragmentation and predict male infertility.