RU2802349C1 - Method of decellularization of a cardiovascular system homograft with supercritical carbon dioxide - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine; cardiac surgery.

SUBSTANCE: invention relates to a method of creating biological prostheses, namely homografts. The following is proposed: a method of decellularization of the homograft of the cardiovascular system by hybrid processing with preconditioning in a solution of detergents, washing in distilled water and subsequent extraction in supercritical CO₂ under the following thermostatically controlled conditions: 37±0.2°C, a pressure of 25 MPa and a flow rate of 3±0.5 ml/min with the placement of a wet aortic root in a high-pressure reactor, filling the CO₂ chamber at a pressure of 6–7 MPa, then turning on the thermostat, setting and maintaining the medium at a temperature of 37°C and pressure of 25 MPa. As a decellularizing agent, supercritical carbon dioxide, a section of the outflow tract of the right or left ventricle of the heart, the mitral or aortic valve of the heart, or a fragment of the aorta is used, the component is taken while maintaining the non-functional area adjacent to it, designed to ensure, during the implementation of the method, non-contact with the component and ready-made homograft, manipulations by capturing this area with tweezers, decellularization is carried out no later than 4–6 hours after the removal of valve-containing fragments of the aorta using glass containers with a volume of 250 ml and an orbital shaker, before decellularization, the aortic homograft is washed with a solution of povidone-iodine, the isolated valves are preconditioned in detergent solution of 0.5 vol.% of sodium dodecyl sulfate and 0.5 vol.% of sodium deoxycholate for 24 hours and washed in distilled water for 12 hours at room temperature under sterile conditions and constant stirring at a speed of 200 rpm, decellularization is carried out under the following thermostatic conditions: 37±0.2°C, a pressure of 25 MPa and a flow rate of 3±0.5 ml/min with the placement of a wet aortic root in a high-pressure reactor, and subsequent filling of the CO₂ chamber at a pressure of 6–7 MPa, then turning on the thermostat, setting the temperature to 37°C and a pressure to 25 MPa, using a fine adjustment valve, setting the flow rate to 3 ml/min, and under such conditions, the samples are kept for 3 hours, after which the thermostat is turned off and the pressure is slowly reduced over 30 minutes.

EFFECT: invention provides the possibility of simultaneous decellularization and sterilization of the homograft of the cardiovascular system, as well as increasing its service life.

1 cl

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиохирургии, касается способа создания биологических протезов, а именно гомографтов, методом децеллюляризации сверхкритическим диоксидом углерода (скСО₂), и может быть использовано при операциях по протезированию на сердечно- сосудистой системе после проведения доклинических исследований на животной модели.The invention relates to medicine, in particular to cardiac surgery, relates to a method for creating biological prostheses, namely homografts, by the method of decellularization with supercritical carbon dioxide (scCO ₂ ), and can be used in prosthetics operations on the cardiovascular system after preclinical studies on an animal model .

Известен способ получения гомографта сердечно - сосудистой системы (ГССС) в виде участка магистрального сосуда или выходных трактов левого и правого желудочков сердца, в котором гомографт получают химической обработкой биологического тканевого компонента (БТК) средами, содержащими гентамицин, дифлюкан, цефалоспорин, метрогил и стабилизатор рН, а метод криоконсервации применяют для подготовки готового ГССС к хранению в режиме криоконсервации, для чего ГССС помещают в стерильный полимерный пакет с криопротекторной смесью, охлажденной до температуры (2±2°С), содержащей альбумин, диметилсульфоксид и DMEM/F12, пакет герметично запаивают и выдерживают в холодильнике с температурой (-150±2°С) или в криоконтейнере, содержащем пары жидкого азота, в течение не менее 120 минут (RU 2525197, МПК A 61F 2/06, A 01 N 1/02, A 01K 31/7036, A 61 PA known method of obtaining a homograft of the cardiovascular system (GSSS) in the form of a section of the main vessel or the output tracts of the left and right ventricles of the heart, in which the homograft is obtained by chemical treatment of a biological tissue component (BTK) with media containing gentamicin, diflucan, cephalosporin, metrogyl and a pH stabilizer , and the cryopreservation method is used to prepare ready-made GSS for storage in cryopreservation mode, for which GSS is placed in a sterile polymer bag with a cryoprotective mixture cooled to a temperature (2±2°C) containing albumin, dimethyl sulfoxide and DMEM/F12, the bag is hermetically sealed and kept in a refrigerator with a temperature (-150 ± 2 ° C) or in a cryocontainer containing liquid nitrogen vapor for at least 120 minutes (RU 2525197, IPC A 61F 2/06, A 01 N 1/02, A 01K 31 /7036, A 61 P

43/00, опубл. 10.08.2014. Бюл. №22. Гомографт сердечно-сосудистой системы (варианты). Способ получения гомографта. Среда для воздействия на ткани гомографта (варианты)).43/00, publ. 08/10/2014. Bull. No. 22. Homograft of the cardiovascular system (options). Method for obtaining a homograft. Medium for influencing homograft tissues (options)).

Ниже перечислены недостатки данного способа:The disadvantages of this method are listed below:

• излишняя кросс-сшивка коллагеновых волокон сосудистой ткани в результате предложенной обработки большим количеством реагентов, содержащих токсичные бактерицидные препараты, что негативно сказывается на долгосрочном функционировании гомографта после имплантации;• excessive cross-linking of vascular tissue collagen fibers as a result of the proposed treatment with a large amount of reagents containing toxic bactericidal preparations, which negatively affects the long-term functioning of the homograft after implantation;

• низкая прочность на разрыв ГССС• low tensile strength GSSS

• длительное время прекондиционирования• long preconditioning time

• дороговизна детергентов• high cost of detergents

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка более простого и эффективного способа получения ГССС методом децеллюляризации в среде скСО₂.The problem to which the invention is directed is the development of a simpler and more efficient method for obtaining GSS by the decellularization method in a scCO ₂ medium.

Результат, который может быть получен при использовании изобретения, заключается в возможности одновременной децеллюляризации и стерилизации ГССС, а также увеличении его срока службы.The result that can be obtained by using the invention is the possibility of simultaneous decellularization and sterilization of the GSS, as well as increasing its service life.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного результата, при децеллюляризации ГССС использовалась гибридная обработка с прекондиционированием в растворе детергентов 0.5% додецилсульфата натрия и 0.5% дезоксихолата натрия, отмывкой в дистиллированной воде и последующей экстракцией в скСО_2. Процедура сверхкритической флюидной экстракции проводится в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин. Влажный корень аорты помещают в реактор высокого давления (рабочий объем 100 мл), СО₂-камеру заполняют при давлении 6-7 МПа, затем включают термостат, устанавливают температуру 37°С и давление 25 МПа (выход на рабочие параметры составляет около 20 мин).To solve the task and achieve the indicated result, during the decellularization of GSSS, a hybrid treatment was used with preconditioning in a solution of detergents 0.5% sodium dodecyl sulfate and 0.5% sodium deoxycholate, washing in distilled water and subsequent extraction in scCO _2. The procedure of supercritical fluid extraction is carried out under thermostatically controlled conditions: 37±0.2°С, pressure 25 MPa and flow rate 3±0.5 ml/min. The wet aortic root is placed in a high-pressure reactor (working volume 100 ml), the CO ₂ chamber is filled at a pressure of 6-7 MPa, then the thermostat is turned on, the temperature is set to 37°C and the pressure is 25 MPa (the output to operating parameters is about 20 min) .

Отличительными от прототипа признаками заявленного способа, обеспечивающими получение результата во всех случаях, являются следующие:Distinctive features of the prototype of the claimed method, providing a result in all cases, are the following:

• в качестве децеллюляризирующего агента выступает среда скСО₂,• SCCO ₂ medium acts as a decellularizing agent,

• обработка производится в условиях определенной температуры и давления• processing is carried out under conditions of a certain temperature and pressure

• время цикла не превышает 48 часов• cycle time does not exceed 48 hours

Указанные отличительные признаки, каждый в отдельности и все вместе, направлены на достижение заявленного результата и являются существенными. В предшествующем уровне техники представленная в формуле изобретения совокупность известных и отличительных признаков не известна.These distinguishing features, each individually and collectively, are aimed at achieving the stated result and are essential. In the prior art, the set of known and distinctive features presented in the claims is not known.

Описание способа.Description of the method.

Выполняют забор БТК: участка магистрального сосуда (артерии или вены) или участка органа сердечно-сосудистой системы: выходного тракта правого или левого желудочков сердца, митрального или аортального клапанов сердца или фрагмента аорты. Забор выполняют с сохранением прилежащего к выбранному БТК нефункционального участка, предназначенного для обеспечения в процессе осуществления способа, бесконтактных с БТК и готовым ГССС, манипуляций путем захвата этого участка инструментом, например пинцетом или зажимом, подходящим для этой цели. Для получения нефункционального участка увеличивают длину участка изымаемого БТК магистрального сосуда и используют участок биологической ткани, прилежащий к БТК органов сердечно-сосудистой системы.BTK sampling is performed: a section of the main vessel (artery or vein) or a section of an organ of the cardiovascular system: the output tract of the right or left ventricles of the heart, the mitral or aortic valves of the heart, or a fragment of the aorta. The sampling is carried out with the preservation of the non-functional area adjacent to the selected BTX, designed to ensure, during the implementation of the method, non-contact with the BTX and the finished GSSS, manipulations by capturing this area with a tool, such as tweezers or a clamp suitable for this purpose. To obtain a non-functional site, the length of the section of the removed BTC of the main vessel is increased and a section of biological tissue adjacent to the BTC of the organs of the cardiovascular system is used.

На месте изъятия проводят морфометрию изъятого БТК и оценку уровня его инициальной контаминации. Децеллюляризацию проводят не позднее, чем через 4-6 часов после изъятия клапаносодержащих фрагментов аорты, с использованием стеклянных емкостей объемом 250 мл и орбитального шейкера, обеспечивающего максимальное перемешивание жидкости в сосуде. Чтобы исключить риск нежелательной контаминации, перед децеллюляризацией аортальный гомографт (АГ) промывают раствором повидон-йода. Выделенные клапаны прекондиционируют в растворе детергентов 0.5% додецилсульфата натрия и 0.5% дезоксихолата натрия в течение 24 часов и отмывают в дистиллированной воде в течение 12 часов при комнатной температуре в условиях стерильности и постоянного перемешивания со скоростью 200 об/мин. Децеллюляризация проводится в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин. Влажный корень аорты помещают в реактор высокого давления (рабочий объем 100 мл), СО₂-камеру заполняют при давлении 6-7 МПа, затем включают термостат, устанавливают температуру 37°С и давление 25 МПа (выход на рабочие параметры составляет около 20 мин). Затем при помощи клапана точной регулировки устанавливают скорость потока 3 мл/мин. В таких условиях образцы выдерживают в течение 3 часов, после чего выключают термостат и медленно, в течение 30 мин, снижают давление, чтобы избежать набухания и выраженных структурных изменений при резком сбросе давления.At the place of withdrawal, the morphometry of the withdrawn BTK is carried out and the level of its initial contamination is assessed. Decellularization is carried out no later than 4-6 hours after the removal of valve-containing aortic fragments, using glass containers with a volume of 250 ml and an orbital shaker that provides maximum mixing of the liquid in the vessel. To eliminate the risk of unwanted contamination, before decellularization, the aortic homograft (AG) is washed with a solution of povidone-iodine. The isolated valves are preconditioned in a detergent solution of 0.5% sodium dodecyl sulfate and 0.5% sodium deoxycholate for 24 hours and washed in distilled water for 12 hours at room temperature under sterile conditions and constant stirring at a speed of 200 rpm. Decellularization is carried out under thermostatically controlled conditions: 37±0.2°С, pressure 25 MPa and flow rate 3±0.5 ml/min. The wet aortic root is placed in a high-pressure reactor (working volume 100 ml), the CO ₂ chamber is filled at a pressure of 6-7 MPa, then the thermostat is turned on, the temperature is set to 37°C and the pressure is 25 MPa (the output to operating parameters is about 20 min) . The flow rate is then adjusted to 3 ml/min using the fine adjustment valve. Under such conditions, the samples are kept for 3 hours, after which the thermostat is turned off and the pressure is slowly reduced over 30 min to avoid swelling and pronounced structural changes during a sharp pressure release.

Предложенный способ получения ГССС по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами:The proposed method for obtaining GSSS in comparison with the prototype has the following advantages:

1. Разработанная методика заготовки и получения децеллюляризированного АГ является простой и воспроизводимой.1. The developed technique for harvesting and obtaining decellularized AG is simple and reproducible.

2. Предложенный способ обработки в среде скСО₂ способствует практически полному элиминированию из матрицы аортального клапана маркеров иммуногенности (ДНК, фрагменты клеток) и удалению факторов контаминации (бактерий, вирусов, грибов), сохраняя структурную целостность внеклеточного матрикса.2. The proposed method of processing in the scCO ₂ medium contributes to the almost complete elimination of immunogenicity markers (DNA, cell fragments) from the aortic valve matrix and the removal of contamination factors (bacteria, viruses, fungi), while maintaining the structural integrity of the extracellular matrix.

3. Экстракция в среде скСО₂ позволяет снизить цитотоксичность аортальных клапанов, прекондиционированных в растворе детергентов, то есть способствует репопуляции створок матрицы клетками потенциального реципиента in vitro.3. Extraction in the scCO ₂ medium makes it possible to reduce the cytotoxicity of aortic valves preconditioned in a detergent solution, that is, it promotes repopulation of the matrix cusps by the cells of a potential recipient in vitro.

4. Включение скСО₂ в протоколы децеллюляризации не ухудшает механические и гидродинамические свойства створок АГ, что подтверждено результатами механических испытаний и сохранением запирательной функции клапанного аппарата в пульсирующем потоке в ходе стендовых испытаний.4. The inclusion of scCO ₂ in the decellularization protocols does not impair the mechanical and hydrodynamic properties of the AG leaflets, which is confirmed by the results of mechanical tests and the preservation of the obturator function of the valve apparatus in a pulsating flow during bench tests.

5. Децеллюляризированный по оригинальной методике АГ обладает низкой иммуногенностью и высоким потенциалом регенерации, что подтверждено отсутствием кальцификации и заселением матрицы клетками реципиента в хроническом хирургическом эксперименте.5. AG decellularized according to the original method has low immunogenicity and high potential for regeneration, which is confirmed by the absence of calcification and colonization of the matrix by recipient cells in a chronic surgical experiment.

Примеры экспериментального осуществления заявленного способа.Examples of experimental implementation of the claimed method.

Имплантацию проводили половозрелым крысам-самцам линии Wistar весом 230±20 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, по 3-4 особи в клетке, обеспечивали комплексным гранулированным лабораторным кормом и постоянным доступом к воде. Для исследования острого, субхронического и хронического воздействия имплантата на окружающие ткани были определены следующие контрольные временные точки: 14, 60 и 90 дней после имплантации (n=6). Крысам под общим наркозом (золетил 1.5 мг/кг и ксилазин 0.2 мг/кг внутримышечно) в асептических условиях в предварительно выстриженной межлопаточной области скальпелем производили разрез кожи до 2 см длиной. Тупым путем рассекали подкожно-жировую клетчатку по направлению к правой и левой лопатке, формировали 2 кармана глубиной 2-2.5 см. Полость промывали водным раствором хлоргексидина. В карманы помещали стерилизованные в течение 3-х часов в 0.1% надуксусной кислоте комплексы «аорта-створка клапана» размером 0.5×1.5 см и фиксировали к подлежащим тканям парой одинарных швов. Операционную рану ушивали наглухо с захватом мышечного слоя. Послеоперационную рану обрабатывали йодопироном. С целью профилактики гнойно-септических осложнений в течение 7 дней вводили байтрил 0.1 мл внутримышечно, послеоперационную рану обрабатывали мазью левомеколь. В установленные сроки животные были подвергнуты эвтаназии путем передозировки средства для наркоза. В сыворотке крови определяли активность ферментов и концентрацию веществ, рекомендованных к биохимическому анализу согласно ГОСТ Р ИСО 10993.11-2009. Для установления структурных особенностей кальциевых депозитов проводили гистологический анализ эксплантатов.Implantation was performed in mature male Wistar rats weighing 230 ± 20 g. Animals were kept under standard vivarium conditions, 3-4 individuals per cage, provided with complex granulated laboratory food and constant access to water. To study the acute, subchronic and chronic effects of the implant on the surrounding tissues, the following control time points were determined: 14, 60 and 90 days after implantation (n=6). Rats under general anesthesia (zoletil 1.5 mg/kg and xylazine 0.2 mg/kg intramuscularly) under aseptic conditions in the pre-trimmed interscapular region with a scalpel made a skin incision up to 2 cm long. The subcutaneous fat was dissected bluntly towards the right and left scapula, 2 pockets 2-2.5 cm deep were formed. The cavity was washed with an aqueous solution of chlorhexidine. Aorta-valve leaflets, 0.5×1.5 cm in size, sterilized for 3 hours in 0.1% peracetic acid, were placed in the pockets and fixed to the underlying tissues with a pair of single sutures. The surgical wound was sutured tightly with the capture of the muscle layer. The postoperative wound was treated with iodopyrone. In order to prevent purulent-septic complications, baytril 0.1 ml was injected intramuscularly for 7 days, the postoperative wound was treated with levomekol ointment. The animals were euthanized within the stipulated time by overdose of the anesthetic. In blood serum, the activity of enzymes and the concentration of substances recommended for biochemical analysis according to GOST R ISO 10993.11-2009 were determined. To establish the structural features of calcium deposits, a histological analysis of the explants was performed.

Первые опыты применения заявленного способа децеллюляризации ГССС с применением скСО2 в качестве децеллюляризирующего агента демонстрируют его перспективность, так как он позволяет упростить и ускорить получение высококачественного ГССС и повысить эффективность его имплантации.The first experiments on the application of the claimed method of decellularization of HCCC using scCO2 as a decellularizing agent demonstrate its promise, since it allows to simplify and speed up the production of high-quality HCCC and increase the efficiency of its implantation.

Неоднократное воспроизведение предложенного способа получения гомографтов сердечно-сосудистой системы возможно в целевых лабораториях исследовательских центров, а после клинических испытаний станет возможным во всех отделениях сердечно-сосудистой хирургии.Repeated reproduction of the proposed method for obtaining homografts of the cardiovascular system is possible in target laboratories of research centers, and after clinical trials it will become possible in all departments of cardiovascular surgery.

Claims (1)

Способ децеллюляризации гомографта сердечно-сосудистой системы методом гибридной обработки с прекондиционированием в растворе детергентов, отмывкой в дистиллированной воде и последующей экстракцией в сверхкритическом СО₂ в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин с помещением влажного корня аорты в реактор высокого давления, заполнением СО₂-камеры при давлении 6-7 МПа, последующим включением термостата, с устанавкой и поддержанием среды с температурой 37°С и давлением 25 МПа, отличающийся тем, что в качестве децеллюляризирующего агента используют сверхкритический диоксид углерода, участок выходного тракта правого или левого желудочка сердца, митрального или аортального клапана сердца или фрагмент аорты, забор компонента выполняют с сохранением прилежащего к нему нефункционального участка, предназначенного для обеспечения в процессе осуществления способа, бесконтактных с компонентом и готовым гомографтом, манипуляций путем захвата этого участка пинцетом, децеллюляризацию проводят не позднее чем через 4-6 часов после изъятия клапаносодержащих фрагментов аорты с использованием стеклянных емкостей объемом 250 мл и орбитального шейкера, перед децеллюляризацией аортальный гомографт промывают раствором повидон-йода, выделенные клапаны прекондиционируют в растворе детергентов 0,5 об.% додецилсульфата натрия и 0,5 об.% дезоксихолата натрия в течение 24 часов и отмывают в дистиллированной воде в течение 12 часов при комнатной температуре в условиях стерильности и постоянного перемешивания со скоростью 200 об/мин, проводят децеллюляризацию в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин с помещением влажного корня аорты в реактор высокого давления и последующим заполнением СО₂-камеры при давлении 6-7 МПа, затем включают термостат, устанавливают температуру 37°С и давление 25 МПа, при помощи клапана точной регулировки устанавливают скорость потока 3 мл/мин и в таких условиях образцы выдерживают в течение 3 часов, после чего выключают термостат и медленно, в течение 30 мин, снижают давление. The method of decellularization of a homograft of the cardiovascular system by the method of hybrid processing with preconditioning in a solution of detergents, washing in distilled water and subsequent extraction in supercritical CO ₂ under thermostatically controlled conditions: 37±0.2°C, a pressure of 25 MPa and a flow rate of 3±0.5 ml/min s by placing the wet aortic root in a high-pressure reactor, filling the CO ₂ chamber at a pressure of 6-7 MPa, then turning on the thermostat, setting and maintaining an environment with a temperature of 37 ° C and a pressure of 25 MPa, characterized in that supercritical carbon dioxide, a section of the outflow tract of the right or left ventricle of the heart, the mitral or aortic valve of the heart or a fragment of the aorta, the sampling of the component is performed with the preservation of the non-functional area adjacent to it, designed to ensure, during the implementation of the method, non-contact with the component and the finished homograft, manipulations by capturing of this area with tweezers, decellularization is carried out no later than 4-6 hours after the removal of valve-containing aortic fragments using glass containers with a volume of 250 ml and an orbital shaker, before decellularization, the aortic homograft is washed with a solution of povidone-iodine, the isolated valves are preconditioned in a solution of detergents 0.5 vol .% sodium dodecyl sulfate and 0.5 vol.% sodium deoxycholate for 24 hours and washed in distilled water for 12 hours at room temperature under sterile conditions and constant stirring at a speed of 200 rpm, decellularization is carried out under thermostatically controlled conditions: 37 ± 0.2°C, a pressure of 25 MPa and a flow rate of 3±0.5 ml/min with the placement of a wet aortic root in a high pressure reactor and subsequent filling of the CO ₂ chamber at a pressure of 6-7 MPa, then turn on the thermostat, set the temperature to 37°C and set the pressure 25 MPa, using a fine adjustment valve, set the flow rate to 3 ml/min and in such conditions the samples are kept for 3 hours, after which the thermostat is turned off and the pressure is slowly reduced over 30 minutes.