RU2802259C2 - Capsid protein assembly inhibitor containing n-heterocyclic five-membered ring, its pharmaceutical composition and use - Google Patents

Abstract

FIELD: pharmaceuticals.

SUBSTANCE: invention relates to a compound of formulas I and II or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutical composition, use in the treatment of diseases in which a capsid protein assembly inhibitor is useful, in particular diseases caused by hepatitis B virus (HBV) infection.

EFFECT: new compounds of formulas I and II, effective inhibitors of capsid protein assembly, which can be useful for the treatment of diseases caused by hepatitis B virus (HBV) infection, have been obtained.

9 cl, 10 tbl, 6 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

Настоящая заявка относится к соединению формулы I или II, его стереоизомеру, таутомеру, геометрическому изомеру, сольвату, активному метаболиту, гидрату, пролекарству или фармацевтически приемлемой соли, и к способу его получения, к фармацевтической композиции, содержащей его, и его применению для предупреждения или лечения заболевания (такого как заболевание, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка, например, в качестве лекарственного средства для лечения вирусной инфекции гепатита В).The present application relates to a compound of formula I or II, its stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug or pharmaceutically acceptable salt, and to a method for its preparation, to a pharmaceutical composition containing it, and its use for the prevention or treatment of a disease (such as a disease in which inhibition of capsid protein assembly is useful, for example, as a drug for the treatment of hepatitis B virus infection).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИPRIOR ART

В настоящее время хронический гепатит В невозможно вылечить, а можно только контролировать, и это ограничивается двумя типами лекарственных средств (интерфероны и нуклеозидные аналоги/ингибиторы вирусных полимераз). Более низкая частота излечения от HBV (вирус гепатита В) частично обусловлена присутствием и персистентностью ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (кзкДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота)) в ядре инфицированных гепатоцитов. Существующие в настоящее время протоколы лечения непригодны для удаления кзкДНК из депо, но, как ожидается, некоторые новые объекты исследования для борьбы с HBV, такие как ингибиторы ядра (такие как ингибиторы образования или сборки вирусного капсидного белка, ингибиторы кзкДНК, активаторы стимулируемых интерфероном генов и так далее) дадут надежду на излечение гепатита В (Mayur Brahmania, et al. New therapeutic agents for chronic hepatitis B).Currently, chronic hepatitis B cannot be cured, but only controlled, and this is limited to two types of drugs (interferons and nucleoside analogs/viral polymerase inhibitors). The lower cure rate for HBV (hepatitis B virus) is partly due to the presence and persistence of covalently closed circular DNA (cccDNA (deoxyribonucleic acid)) in the nucleus of infected hepatocytes. Current treatment protocols are unsuitable for removing cccDNA from the depot, but some new targets for HBV control are expected, such as nuclear inhibitors (such as inhibitors of viral capsid protein formation or assembly, cccDNA inhibitors, interferon-stimulated gene activators, and etc.) will give hope for a cure for hepatitis B (Mayur Brahmania, et al. New therapeutic agents for chronic hepatitis B).

Капсид HBV собирается из ядерного белка. Необходимо, чтобы обратная транскриптаза HBV и пгРНК (прегеномная РНК (рибонуклеиновая кислота)) были должным образом инкапсулированы перед обратной транскрипцией. Поэтому блокирование сборки капсидного белка или ускорение разрушения капсидного белка будут блокировать процесс сборки капсидного белка и тем самым воздействовать на вирусную репликацию. В последние годы исследователи начали изучать ингибиторы, направленно воздействующие на сборку капсидного белка, например, в WO 2014184350, WO 2015011281, WO 2017156255 и так далее раскрыт ряд родственных соединений. Однако большинство из них находятся на ранней стадии клинических исследований, или исследования были прекращены, и существует потребность в данной области в большем количестве альтернативных эффективных ингибиторов сборки капсидного белка для лечения, ослабления или предупреждения HBV-инфекции.The HBV capsid is assembled from a nuclear protein. It is necessary that HBV reverse transcriptase and pgRNA (pregenomic RNA (ribonucleic acid)) be properly encapsulated before reverse transcription. Therefore, blocking the assembly of the capsid protein or accelerating the degradation of the capsid protein will block the assembly process of the capsid protein and thus affect viral replication. In recent years, researchers have begun to study inhibitors that target the assembly of the capsid protein, for example, in WO 2014184350, WO 2015011281, WO 2017156255 and so on, a number of related compounds are disclosed. However, most of these are in the early stages of clinical research or have been discontinued, and there is a need in the art for more alternative effective capsid protein assembly inhibitors to treat, ameliorate, or prevent HBV infection.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к соединению формулы I, его стереоизомеру, таутомеру, геометрическому изомеру, сольвату, активному метаболиту, гидрату, пролекарству или фармацевтически приемлемой соли,The present invention relates to a compound of formula I, its stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug or pharmaceutically acceptable salt,

Настоящее изобретение также относится к соединению формулы II, его стереоизомеру, таутомеру, геометрическому изомеру, сольвату, активному метаболиту, гидрату, пролекарству или фармацевтически приемлемой соли,The present invention also relates to a compound of formula II, its stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug or pharmaceutically acceptable salt,

В другом аспекте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или II или его фармацевтически приемлемую соль по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент.In another aspect, the invention provides a pharmaceutical composition comprising a compound of formula I or II, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, of the present invention. In some embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка, включающий введение млекопитающему, предпочтительно человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения вышеуказанной формулы I или II, его фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции.In another aspect, the present invention provides a method of treating a disease wherein inhibition of capsid protein assembly is beneficial, comprising administering to a mammal, preferably a human in need of such treatment, a therapeutically effective amount of a compound of formula I or II above, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition thereof.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение соединения вышеуказанной формулы I или II, его фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention also provides the use of a compound of the above formula I or II, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition thereof in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a disease in which inhibition of capsid protein assembly is beneficial.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено применение соединения вышеуказанной формулы I или II, его фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention provides the use of a compound of formula I or II as defined above, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition thereof, for the prevention or treatment of a disease in which inhibition of capsid protein assembly is beneficial.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено соединение вышеуказанной формулы I или II, его фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции для применения в предупреждении или лечении заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention provides a compound of formula I or II as defined above, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition thereof, for use in the prevention or treatment of a disease in which inhibition of capsid protein assembly is beneficial.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или II, его стереоизомер, таутомер, геометрический изомер, сольват, активный метаболит, гидрат, пролекарство или фармацевтически приемлемую соль по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a compound of formula I or II, a stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug or pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention. In some embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ ингибирования сборки капсидного белка, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы I или II, его стереоизомера, таутомера, геометрического изомера, сольвата, активного метаболита, гидрата, пролекарства, фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях указанным субъектом является млекопитающее; в некоторых воплощениях указанным субъектом является человек.In another aspect, the present invention provides a method for inhibiting capsid protein assembly, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound of formula I or II, a stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug, pharmaceutically acceptable salt thereof. or its pharmaceutical composition of the present invention. In some embodiments, the specified subject is a mammal; in some embodiments, said subject is a human.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ предупреждения или лечения заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы I или II, его стереоизомера, таутомера, геометрического изомера, сольвата, активного метаболита, гидрата, пролекарства, фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях указанным субъектом является млекопитающее; в некоторых воплощениях указанным субъектом является человек.In another aspect, the present invention provides a method for preventing or treating a disease wherein inhibition of capsid protein assembly is beneficial, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound of formula I or II, its stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite , hydrate, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or pharmaceutical composition thereof of the present invention. In some embodiments, the specified subject is a mammal; in some embodiments, said subject is a human.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено применение соединения формулы I или II, его стереоизомера, таутомера, геометрического изомера, сольвата, активного метаболита, гидрата, пролекарства или фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции по настоящему изобретению для ингибирования сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention provides the use of a compound of formula I or II, a stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug, or pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition thereof of the present invention, for inhibiting capsid protein assembly.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение соединения формулы I или II, его стереоизомера, таутомера, геометрического изомера, сольвата, активного метаболита, гидрата, пролекарства, фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для ингибирования сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention also provides the use of a compound of formula I or II, a stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or pharmaceutical composition thereof of the present invention in the manufacture of a medicament for inhibiting capsid assembly. squirrel.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение соединения формулы I или II, его стереоизомера, таутомера, геометрического изомера, сольвата, активного метаболита, гидрата, пролекарства, фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтической композиции по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention also provides the use of a compound of formula I or II, its stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or pharmaceutical composition of the present invention in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a disease in which inhibition of capsid protein assembly is beneficial.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение соединения формулы I или II, его стереоизомера, таутомера, геометрического изомера, сольвата, активного метаболита, гидрата, пролекарства или фармацевтически приемлемой соли, или его фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention also provides the use of a compound of formula I or II, a stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug or pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition thereof, for the prevention or treatment of a disease in which inhibition is beneficial. capsid protein assembly.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено соединение формулы I или II, его стереоизомер, таутомер, геометрический изомер, сольват, активный метаболит, гидрат, пролекарство или фармацевтически приемлемая соль, или его фармацевтическая композиция по настоящему изобретению для применения в ингибировании сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention provides a compound of formula I or II, a stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug, or pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition thereof of the present invention, for use in inhibiting capsid protein assembly.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено соединение вышеуказанной формулы I или II, его стереоизомер, таутомер, геометрический изомер, сольват, активный метаболит, гидрат, пролекарство, фармацевтически приемлемая соль или его фармацевтическая композиция для применения в предупреждении или лечении заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка.In another aspect, the present invention provides a compound of the above formula I or II, its stereoisomer, tautomer, geometric isomer, solvate, active metabolite, hydrate, prodrug, pharmaceutically acceptable salt, or pharmaceutical composition thereof, for use in the prevention or treatment of a disease in which inhibition is beneficial. capsid protein assembly.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения заболевание, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка, представляет собой заболевание, вызванное инфицированием вирусом гепатита В (HBV).In some embodiments of the present invention, the disease in which inhibition of capsid protein assembly is beneficial is a disease caused by hepatitis B virus (HBV) infection.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения заболевание, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка, представляет собой заболевание печени, вызванное инфицированием вирусом гепатита В (HBV).In some embodiments of the present invention, the disease in which inhibition of capsid protein assembly is beneficial is a liver disease caused by hepatitis B virus (HBV) infection.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения лечение заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка, заключается в контролировании, сокращении или устранении HBV для предупреждения, ослабления или излечения заболевания печени у инфицированного пациента.In some embodiments of the present invention, the treatment of a disease in which inhibition of capsid protein assembly is beneficial is to control, reduce, or eliminate HBV to prevent, alleviate, or cure liver disease in an infected patient.

ОпределенияDefinitions

Если не оговорено особо, термины и фразы, использованные здесь, имеют нижеследующие значения. Конкретный термин или фразу не следует рассматривать как неопределенную или неясную, когда это конкретно не определено, а следует понимать в соответствии с ее обычным значением. Торговые наименования, использованные здесь, относятся к соответствующим продуктам или их ингредиентам.Unless otherwise stated, the terms and phrases used herein have the following meanings. A particular term or phrase should not be considered vague or obscure when not specifically defined, but should be understood according to its ordinary meaning. Trade names used here refer to the respective products or their ingredients.

Термин "возможный" или "возможно" означает, что описываемое затем событие или ситуация может происходить или нет, и описание включает случаи, когда событие или ситуация имеет место, и случаи, когда событие или ситуация не возникает.Например, этильная группа, "возможно" замещенная галогеном, означает, что этильная группа может быть незамещенной (СН₂СН₃), монозамещенной (например, CH₂CH₂F), полизамещенной (например, CHFCH₂F, CH₂CHF и так далее) или полностью замещенной (CF₂CF₃). Специалисту в данной области техники будет понятно, что для любой группы, содержащей один или более чем один заместитель, не предусматривается модель незамещения или замещения, которая стерически невозможна и/или которая не может быть синтезирована.The term "possible" or "possible" means that the event or situation then described may or may not occur, and the description includes cases where the event or situation occurs and cases where the event or situation does not occur. For example, an ethyl group, "possibly "substituted with halogen means that the ethyl group may be unsubstituted (CH ₂ CH ₃ ), monosubstituted (for example, CH ₂ CH ₂ F), polysubstituted (for example, CHFCH ₂ F, CH ₂ CHF, etc.) or fully substituted (CF _{2CF3 )} . One skilled in the art will appreciate that for any group containing one or more substituents, no non-substitution or substitution pattern is provided that is sterically impossible and/or that cannot be synthesized.

Термин "проведение лечения" или "лечение" относится к введению соединения или препарата, описанного в настоящем изобретения, для ослабления или устранения заболевания или одного или более чем одного симптома, связанного с заболеванием, и включает:The term "treatment" or "treatment" refers to the administration of a compound or preparation described in the present invention to reduce or eliminate a disease or one or more symptoms associated with a disease, and includes:

I) подавление заболевания или болезненного состояния, то есть сдерживание его развития;I) suppression of the disease or disease state, that is, containment of its development;

II) облегчение заболевания или болезненного состояния, то есть регрессирование заболевания или болезненного состояния.ii) alleviation of the disease or disease state, ie regression of the disease or disease state.

Термин "предупреждение" означает введение соединения или препарата по настоящему изобретению, для предупреждения заболевания или одного или более чем одного симптома, связанного с заболеванием, и включает: предупреждение возникновения заболевания или болезненного состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к болезненному состоянию, но еще не диагностировано, что страдает болезненным состоянием.The term "prevention" means administering a compound or preparation of the present invention to prevent a disease or one or more symptoms associated with a disease, and includes: preventing the onset of a disease or disease state in a mammal, in particular when such mammal is predisposed to the disease state , but has not yet been diagnosed as suffering from a disease state.

Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению для (I) лечения или предупреждения конкретного заболевания, состояния или расстройства, (II) облегчения, ослабления или устранения одного или более чем одного симптома конкретного заболевания, состояния или расстройства или (III) предупреждения или задержки возникновения одного или более чем одного симптома заболевания, состояния или расстройства, описанных здесь. "Терапевтически эффективное количество" соединения согласно настоящему изобретению варьирует в зависимости от соединения, болезненного состояния и его тяжести, режима введения и возраста млекопитающего, которого лечат, но может быть определено согласно обычной практике специалистами в данной области техники в соответствии с их собственными знаниями и настоящим описанием изобретения.The term "therapeutically effective amount" means an amount of a compound of the present invention for (I) treating or preventing a particular disease, condition or disorder, (II) alleviating, ameliorating or eliminating one or more symptoms of a particular disease, condition or disorder, or (III) preventing or delaying the onset of one or more of the symptoms of the disease, condition, or disorder described herein. A "therapeutically effective amount" of a compound of the present invention varies depending on the compound, the disease state and its severity, the mode of administration, and the age of the mammal being treated, but may be determined according to normal practice by those skilled in the art according to their own knowledge and the present description of the invention.

Термин "фармацевтически приемлемый" относится к тем соединениям, веществам, композициям и/или лекарственным формам, которые в рамках здравого медицинского суждения являются подходящими для применения в контакте с тканями человека и животного без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергических реакций или других проблем или осложнений, и соизмеримы с разумным соотношением польза/риск.The term "pharmaceutically acceptable" refers to those compounds, substances, compositions and/or dosage forms which, within the limits of sound medical judgment, are suitable for use in contact with human and animal tissues without undue toxicity, irritation, allergic reactions, or other problems or complications, and commensurate with a reasonable benefit/risk ratio.

В качестве фармацевтически приемлемой соли могут быть упомянуты, например, соль металла, соль аммония, соль органического основания, соль неорганической кислоты, соль органической кислоты, соль основной или кислой аминокислотой, или тому подобные.As the pharmaceutically acceptable salt, for example, a metal salt, an ammonium salt, an organic base salt, an inorganic acid salt, an organic acid salt, a basic or acidic amino acid salt, or the like can be mentioned.

Термин "фармацевтическая композиция" относится к смеси одного или более чем одного соединения по настоящему изобретению или его соли и фармацевтически приемлемого эксципиента. Назначение фармацевтической композиции заключается в облегчении введения соединений по настоящему изобретению субъекту.The term "pharmaceutical composition" refers to a mixture of one or more compounds of the present invention, or a salt thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient. The purpose of the pharmaceutical composition is to facilitate the administration of the compounds of the present invention to a subject.

Термин "сольват" относится к веществу, образованному путем объединения соединения по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым растворителем. Фармацевтически приемлемые растворители включают воду, этанол, уксусную кислоту и тому подобное. Сольваты включают стехиометрические сольваты и нестехиометрические сольваты.The term "solvate" refers to a substance formed by combining a compound of the present invention with a pharmaceutically acceptable solvent. Pharmaceutically acceptable solvents include water, ethanol, acetic acid, and the like. Solvates include stoichiometric solvates and non-stoichiometric solvates.

Термин "гидрат" относится к сольвату, содержащему раскрытое или заявленное соединение и стехиометрическое или нестехиометрическое количество воды.The term "hydrate" refers to a solvate containing the disclosed or claimed compound and a stoichiometric or non-stoichiometric amount of water.

Соединения по настоящему изобретению также могут быть получены в виде пролекарств, таких как фармацевтически приемлемые пролекарства. Поскольку известно, что пролекарства улучшают многие желательные свойства лекарственного средства (например, растворимость, биодоступность, приготовление лекарственной формы и так далее), соединения по настоящему изобретению могут быть доставлены в форме пролекарства. Соответственно, предусмотрено, что настоящее изобретение включает пролекарства заявленных здесь соединений, способы их доставки и композиции, содержащие пролекарства.The compounds of the present invention may also be prepared as prodrugs, such as pharmaceutically acceptable prodrugs. Because prodrugs are known to improve many desirable properties of a drug (eg, solubility, bioavailability, formulation, and so on), the compounds of the present invention can be delivered in the form of a prodrug. Accordingly, the present invention is intended to include prodrugs of the compounds claimed herein, methods for their delivery, and compositions containing prodrugs.

Термин "пролекарство" включает любое ковалентно связанный носитель, который при введении субъекту-млекопитающему высвобождает активное исходное лекарственное средство по настоящему изобретению in vivo. Пролекарства по настоящему изобретению получают путем модифицирования функциональной группы, присутствующей в соединении, таким образом, что модифицированная группа расщепляется с образованием исходного соединения обычной манипуляцией или in vivo.The term "prodrug" includes any covalently linked carrier which, when administered to a mammalian subject, releases the active parent drug of the present invention in vivo. The prodrugs of the present invention are prepared by modifying a functional group present on a compound such that the modified group is cleaved to form the parent compound by conventional manipulation or in vivo.

В настоящей заявке термин "субъект" включает людей и животных, например, млекопитающих (например приматов, коров, лошадей, свиней, собак, кошек, мышей, крыс, кроликов, коз, овец, птиц и так далее).In this application, the term "subject" includes humans and animals, such as mammals (eg, primates, cows, horses, pigs, dogs, cats, mice, rats, rabbits, goats, sheep, birds, and so on).

Термин "активный метаболит" относится к биологически активному производному соединения, которое образуется, когда соединение метаболизируется.The term "active metabolite" refers to a biologically active derivative of a compound that is formed when the compound is metabolized.

Термин "фармацевтически приемлемый эксципиент" относится к тем эксципиентам, которые не оказывают значительного раздражающего воздействия на организм и не ухудшают биологическую активность и свойства активного соединения. Специалистам в данной области техники хорошо известны подходящие эксципиенты, такие как углеводы, воски, водорастворимые и/или водонабухающие полимеры, гидрофильные или гидрофобные вещества, желатин, масла, растворители, вода и тому подобное.The term "pharmaceutically acceptable excipient" refers to those excipients that do not have a significant irritant effect on the body and do not impair the biological activity and properties of the active compound. Suitable excipients are well known to those skilled in the art, such as carbohydrates, waxes, water-soluble and/or water-swellable polymers, hydrophilic or hydrophobic substances, gelatin, oils, solvents, water, and the like.

Слово "содержать" и его варианты, такие как "содержит" или "содержащий" следует понимать в открытом, неисключающем смысле, то есть "включающий, но не ограничивающийся ими".The word "comprise" and its variants such as "comprises" or "comprising" should be understood in an open, non-exclusive sense, that is, "including, but not limited to".

Соединения и промежуточные соединения по настоящему изобретению могут также существовать в разных таутомерных формах, и все такие формы охвачены объемом настоящей заявки. Термин "таутомер" или "таутомерная форма" относится к структурным изомерам с разными энергиями, которые способны к взаимопревращению через низкий энергетический барьер. Например, протонные таутомеры (также известные как таутомеры протонного переноса) включают взаимопревращения посредством переноса протона, такие как кето-енольная и имин-енаминная изомеризация. Конкретным примером протонного таутомера является имидазольная группировка, в которой протон может мигрировать между двумя кольцевыми атомами азота. Валентные таутомеры включают таутомеры перегруппировки за счет некоторых связеобразующих электронов.The compounds and intermediates of the present invention may also exist in various tautomeric forms, and all such forms are embraced by the scope of this application. The term "tautomer" or "tautomeric form" refers to structural isomers with different energies that are capable of interconversion across a low energy barrier. For example, proton tautomers (also known as proton transfer tautomers) include proton transfer interconversions such as keto-enol and imine-enamine isomerization. A specific example of a protic tautomer is the imidazole moiety, in which a proton can migrate between two ring nitrogen atoms. Valence tautomers include rearrangement tautomers at the expense of some bond-forming electrons.

Некоторые соединения по настоящему изобретению могут иметь асимметрические атомы углерода (стереоцентры) или двойные связи. Таким образом, рацематы, диастереомеры, энантиомеры, геометрический изомеры и отдельные изомеры входят в объем настоящего изобретения.Some compounds of the present invention may have asymmetric carbon atoms (stereocenters) or double bonds. Thus, racemates, diastereomers, enantiomers, geometric isomers and individual isomers are within the scope of the present invention.

Если не оговорено особо, когда соединения по настоящему изобретению содержат олефиновые двойные связи или другие центры геометрической асимметрии, они включают Е и Z геометрические изомеры.Unless otherwise stated, when the compounds of the present invention contain olefinic double bonds or other centers of geometric asymmetry, they include E and Z geometric isomers.

Соединения по настоящему изобретению могут существовать в конкретной геометрический форме или стереоизомерной форме. Настоящее изобретение предусматривает все такие соединения, включая таутомеры, цис- и транс-изомеры, (-)- и (+)-энантиомеры, (R)- и (8)-энантиомеры, диастереоизомеры, (D)-изомеры, (L)-изомеры и их рацемические смеси, и другие смеси, такие как энантиомерно- или диастереомерно-обогащенные смеси, все из которых входят в объем настоящего изобретения. Дополнительные асимметрические атомы углерода могут присутствовать в таких заместителях, как алкил и так далее. Все эти изомеры и их смеси входят в объем настоящего изобретения.The compounds of the present invention may exist in a particular geometric form or stereoisomeric form. The present invention contemplates all such compounds, including tautomers, cis and trans isomers, (-)- and (+)-enantiomers, (R)- and (8)-enantiomers, diastereoisomers, (D)-isomers, (L) -isomers and racemic mixtures thereof, and other mixtures such as enantiomerically or diastereomeric enriched mixtures, all of which are within the scope of the present invention. Additional asymmetric carbon atoms may be present on substituents such as alkyl and so on. All of these isomers and mixtures thereof are within the scope of the present invention.

Оптически активные (R)- и (S)-изомеры, а также D- и L-изомеры могут быть получены в результате хирального синтеза или с использованием хиральных реагентов, или посредством других обычных способов. Энантиомер определенного соединения по настоящему изобретению может быть получен посредством асимметрического синтеза или дериватизации с использованием хирального вспомогательного вещества, где полученную диастереомерную смесь разделяют, и вспомогательную группу отщепляют с получением чистых требуемых энантиомеров. Альтернативно, когда молекула содержит основную функциональную группу (такую как амино) или кислотную функциональную группу (такую как карбоксил), образуют соль диастереомера с подходящей оптически активной кислотой или основанием и затем проводят разделение диастереомеров посредством обычного способа, хорошо известного в данной области техники, затем выделяют чистый энантиомер. Кроме того, разделение энантиомеров и диастереомеров обычно осуществляют с использованием хроматографии с хиральной стационарной фазой и возможно в комбинации с методом химической дериватизации (например образованием карбаматов из аминов).Optically active (R)- and (S)-isomers, as well as D- and L-isomers can be obtained by chiral synthesis or using chiral reagents, or by other conventional methods. An enantiomer of a particular compound of the present invention can be obtained by asymmetric synthesis or derivatization using a chiral auxiliary, where the resulting diastereomeric mixture is separated and the auxiliary group is cleaved off to obtain the pure desired enantiomers. Alternatively, when the molecule contains a basic functional group (such as amino) or an acidic functional group (such as carboxyl), the diastereomer is salted with an appropriate optically active acid or base, and then separation of the diastereomers is carried out by a conventional method well known in the art, then isolate the pure enantiomer. In addition, the separation of enantiomers and diastereomers is usually carried out using chiral stationary phase chromatography and possibly in combination with a chemical derivatization technique (eg formation of carbamates from amines).

Настоящее изобретение также включает меченые изотопами соединения по настоящему изобретению, которые идентичны соединениям, описанным здесь, но в которых один или более чем один атом заменен атомами, имеющими атомную массу или массовое число, отличающиеся от атомной массы или массового числа, обычно встречающихся в природе. Примеры изотопов, которые могут быть введены в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, серы, фтора, иода и хлора, такие как ²Н, ³Н, ¹¹С, ¹³С, ¹⁴С, ¹³N, ¹⁵N, ¹⁵O, ¹⁷O, ¹⁸O,³¹Р, ³²Р, ³⁵S, ¹⁸F, ¹²³I, ¹²⁵I, ³⁶Cl и тому подобные, соответственно.The present invention also includes isotopically labeled compounds of the present invention, which are identical to the compounds described herein, but in which one or more than one atom is replaced by atoms having an atomic mass or mass number different from the atomic mass or mass number normally found in nature. Examples of isotopes that can be introduced into the compounds of the present invention include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, iodine and chlorine, such as ² H, ³ H, ¹¹ C, ¹³ C, ¹⁴ C, ¹³ N, ¹⁵ N, ¹⁵ O, ¹⁷ O, ¹⁸ O, ³¹ P, ³² P, ³⁵ S, ¹⁸ F, ¹²³ I, ¹²⁵ I, ³⁶ Cl and the like, respectively.

Некоторые меченные изотопами соединения по настоящему изобретению (такие как соединения, меченные ³Н и ¹⁴С) могут быть использованы в анализах распределения соединения и/или субстрата в тканях. Изотопы дейтерий (то есть ³Н) и углерод-14 (то есть ¹⁴С) особенно предпочтительны благодаря легкости их получения и детектирования. Позитрон-излучающие изотопы, такие как ¹⁵O, ¹³N, ¹¹С и ¹⁸F, могут быть использованы в исследованиях методом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) для определения занятости субстратом. Меченные изотопами соединения по настоящему изобретению обычно могут быть получены посредством замены немеченого реагента реагентом, меченным изотопом, согласно методикам, аналогичным методикам, раскрытым на схемах и/или в примерах, раскрытых ниже.Certain isotopically labeled compounds of the present invention (such as ³ H and ¹⁴ C labeled compounds) can be used in compound and/or substrate tissue distribution assays. The isotopes deuterium (ie ³ H) and carbon-14 (ie ¹⁴ C) are particularly preferred due to their ease of preparation and detection. Positron emitting isotopes such as ¹⁵ O, ¹³ N, ¹¹ C and ¹⁸ F can be used in positron emission tomography (PET) studies to determine substrate occupancy. Isotopically labeled compounds of the present invention can generally be prepared by replacing an unlabeled reagent with an isotopically labeled reagent according to procedures similar to those disclosed in the Schemes and/or the Examples disclosed below.

Кроме того, замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий (то есть ²Н), может давать некоторые терапевтические преимущества, обусловленные более высокой метаболической стабильностью (например увеличенный период полувыведения in vivo или сниженные требования к дозировке), и поэтому может быть предпочтительным в некоторых случаях, причем замещение дейтерием может быть частичным или полным, и частичное замещение дейтерием означает, что по меньшей мере один атом водорода замещен по меньшей мере одним атомом дейтерия, и все такие формы соединений охвачены объемом настоящего изобретения.In addition, substitution with heavier isotopes such as deuterium (i.e., ² H) may confer some therapeutic advantages due to higher metabolic stability (e.g., increased in vivo half-life or reduced dosage requirements) and may therefore be preferred in some cases where substitution with deuterium may be partial or complete, and partial substitution with deuterium means that at least one hydrogen atom is replaced by at least one deuterium atom, and all such forms of compounds are covered by the scope of the present invention.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена посредством объединения соединения по настоящему изобретению с подходящим фармацевтически приемлемым эксципиентом и может быть приготовлена в виде, например, твердых, полутвердых, жидких или газообразных препаратов, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, пасты, эмульсии, суспензии, суппозитории, инъекции, средства для ингаляций, гели, микросферы, аэрозоли и тому подобное.The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by combining the compound of the present invention with a suitable pharmaceutically acceptable excipient and may be formulated into, for example, solid, semi-solid, liquid or gaseous preparations such as tablets, pills, capsules, powders, granules, pastes , emulsions, suspensions, suppositories, injections, inhalants, gels, microspheres, aerosols and the like.

Типичные пути введения соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей их, включают пероральное, ректальное, местное, ингаляционное, парентеральное, сублингвальное, интравагинальное, интраназальное, внутриглазное, интраперитонеальное, внутримышечное, подкожное или внутривенное введение, но не ограничиваются ими.Typical routes of administration for a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition containing them, include oral, rectal, topical, inhalation, parenteral, sublingual, intravaginal, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, or intravenous administration, but not limited to them.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена посредством общеизвестных в данной области техники способов, таких как традиционный способ смешивания, способ растворения, способ гранулирования, способ изготовления пилюль с сахарным покрытием, способ измельчения, способ эмульгирования и способ сублимационной сушки и так далее.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by methods generally known in the art, such as a conventional blending method, a dissolving method, a granulating method, a sugar-coated pill manufacturing method, a pulverizing method, an emulsifying method, and a freeze-drying method, and so on.

В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция находится в форме для перорального введения. Для перорального введения активное соединение может быть смешано с фармацевтически приемлемыми носителями, общеизвестными в данной области техники, с получением фармацевтической композиции. С этими эксципиентами соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде таблеток, пилюль, облаток, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропа или суспензий и тому подобного для перорального введения пациентам.In some embodiments, the pharmaceutical composition is in a form for oral administration. For oral administration, the active compound may be mixed with pharmaceutically acceptable carriers well known in the art to form a pharmaceutical composition. With these excipients, the compounds of the present invention can be formulated into tablets, pills, cachets, dragees, capsules, liquids, gels, syrup or suspensions, and the like, for oral administration to patients.

Твердая пероральная композиция может быть получена посредством традиционного способа смешивания, заполнения или таблетирования. Например, она может быть получена посредством следующего способа: смешивание активного соединения с твердым эксципиентом; возможно измельчение полученной смеси; добавление других подходящих эксципиентов при необходимости; и затем переработка смеси в гранулы с получением ядер таблеток или драже. Подходящие эксципиенты включают связующие вещества, разбавители, разрыхлители, смазывающие вещества, скользящие агенты, подсластители и/или ароматизаторы и так далее, но не ограничиваются ими.The solid oral composition can be prepared by conventional mixing, filling or tableting techniques. For example, it can be obtained by the following method: mixing the active compound with a solid excipient; it is possible to grind the resulting mixture; adding other suitable excipients as needed; and then processing the mixture into granules to obtain tablet or dragee cores. Suitable excipients include, but are not limited to, binders, diluents, disintegrants, lubricants, lubricants, sweeteners and/or flavors, and so on.

Фармацевтическая композиция также подходит для парентерального введения, такого как в виде стерильных растворов, суспензий или подвергнутых сублимационной сушке продуктов в соответствующей стандартной лекарственной форме.The pharmaceutical composition is also suitable for parenteral administration, such as in the form of sterile solutions, suspensions or freeze-dried products in an appropriate unit dosage form.

Терапевтическая доза соединений по настоящему изобретению может быть определена в соответствии, например, с конкретно применяемым лечением, путем введения соединения, здоровьем и состоянием пациента и заключением лечащего врача. Доля или концентрация соединений по настоящему изобретению в фармацевтической композиции может изменяться в зависимости от множества факторов, включая дозировку, химические свойства (например гидрофобность) и путь введения. Например, соединение по настоящему изобретению может быть представлено в физиологически забуференном водном растворе, содержащем примерно от 0,1 до 10% (мас./об.) соединения, для парентерального введения. Некоторые типичные дозы находятся в диапазоне от примерно 1 мкг/кг до примерно 1 г/кг массы тела в сутки. В некоторых воплощениях диапазон доз составляет от примерно 0,01 мг/кг до примерно 100 мг/кг массы тела в сутки. Дозировка, по всей вероятности, будет зависеть от таких переменных, как тип и степень прогрессирования заболевания или состояния, общее состояние здоровья конкретного пациента, относительной биологической эффективности выбранного соединения, состава эксципиента и пути введения. Эффективная доза может быть получена путем экстраполяции из кривой зависимости «доза-эффект», полученной в результате тестирования in vitro или в системе тестирования на животных.The therapeutic dose of the compounds of the present invention may be determined in accordance with, for example, the particular treatment employed, by the administration of the compound, the health and condition of the patient, and the judgment of the attending physician. The proportion or concentration of the compounds of the present invention in a pharmaceutical composition may vary depending on a variety of factors, including dosage, chemical properties (eg hydrophobicity) and route of administration. For example, a compound of the present invention may be provided in a physiologically buffered aqueous solution containing from about 0.1 to 10% (w/v) of the compound for parenteral administration. Some typical doses are in the range of about 1 μg/kg to about 1 g/kg of body weight per day. In some embodiments, the dosage range is from about 0.01 mg/kg to about 100 mg/kg of body weight per day. The dosage will likely depend on such variables as the type and extent of progression of the disease or condition, the general health of the particular patient, the relative biological potency of the compound chosen, the formulation of the excipient, and the route of administration. An effective dose can be obtained by extrapolation from a dose-response curve obtained from in vitro testing or from an animal testing system.

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены посредством различных способов синтеза, хорошо известных специалистам в данной области техники, включая конкретные воплощения, перечисленные ниже, воплощения, полученные путем комбинирования конкретных воплощений с другими способами химического синтеза и эквивалентными альтернативами, известными специалистам в данной области техники. Предпочтительные воплощения включают демонстрационные примеры по настоящему изобретению, но не ограничиваются ими.The compounds of the present invention may be prepared by various synthetic routes well known to those skilled in the art, including the specific embodiments listed below, embodiments obtained by combining specific embodiments with other chemical synthesis methods and equivalent alternatives known to those skilled in the art. Preferred embodiments include, but are not limited to, the illustrative examples of the present invention.

Химическое взаимодействие в соответствии с конкретным воплощением по настоящему изобретению проводят в подходящем растворителе, который должен быть подходящим для химических превращений по настоящему изобретению и реагентов и веществ, необходимых в настоящей заявке. Для того чтобы получить соединения по настоящему изобретению, специалисту в данной области техники иногда необходимо модифицировать или выбрать стадию синтеза или реакционный процесс, основываясь на существующих воплощениях.Chemical interaction in accordance with a specific embodiment of the present invention is carried out in a suitable solvent, which should be suitable for chemical transformations of the present invention and the reagents and substances required in this application. In order to obtain the compounds of the present invention, it is sometimes necessary for one skilled in the art to modify or select a synthetic step or reaction process based on existing embodiments.

Важным фактором при разработке путей синтеза в данной области техники является выбор подходящей защитной группы для реакционноспособной функциональной группы (такой как аминогруппа в данной заявке); например, можно сделать ссылку на Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (4th Ed). Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. Все источники информации, процитированные в настоящей заявке, включены в нее во всей своей полноте.An important factor in developing synthetic routes in the art is the selection of an appropriate protecting group for a reactive functional group (such as the amino group in this application); for example, reference may be made to Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (4th Ed). Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. All sources of information cited in this application are incorporated herein in their entirety.

В настоящей заявке использованы следующие сокращения:The following abbreviations are used in this application:

ЕА означает этилацетат; МеОН означает метанол; DMF означает N,N-диметилформамид; HATU означает гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония; DIPEA означает N,N-диизопропилэтиламин; РО означает пероральное введение; IV означает внутривенную инъекцию; DMSO означает диметилсульфоксид.EA means ethyl acetate; MeOH means methanol; DMF means N,N-dimethylformamide; HATU means O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate; DIPEA means N,N-diisopropylethylamine; PO means oral administration; IV means intravenous injection; DMSO means dimethyl sulfoxide.

Для ясности настоящая заявка дополнительно проиллюстрирована следующими примерами, но эти примеры не ограничивают объем настоящей заявки. Все реагенты, использованные в данной заявке, имеются в продаже и могут быть использованы без дополнительной очистки.For clarity, the present application is further illustrated by the following examples, but these examples do not limit the scope of the present application. All reagents used in this application are commercially available and can be used without further purification.

ПримерыExamples

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) по настоящему изобретению регистрировали на спектрометре ядерного магнитного резонанса BRUKER-300 и BRUKER-500, и тетраметилсилан (TMS = δ 0.00) использовали в качестве внутреннего стандарта химического сдвига, и данные ядерного магнитного резонанса записывали в следующем виде: число протонов, тип пика(s, синглет; d, дублет; t, триплет; q, квартет; m, мультиплет), константа взаимодействия (в Гц). АВ SCTEX Triple TOF 4600 или АВ SCTEX 3200QTRAP использовали в качестве прибора для масс-спектрометрии.The nuclear magnetic resonance (NMR) of the present invention was recorded on a BRUKER-300 and BRUKER-500 nuclear magnetic resonance spectrometer, and tetramethylsilane (TMS = δ 0.00) was used as an internal chemical shift standard, and the nuclear magnetic resonance data was recorded as: number protons, peak type (s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; m, multiplet), interaction constant (in Hz). AB SCTEX Triple TOF 4600 or AB SCTEX 3200QTRAP was used as a mass spectrometry instrument.

Пример 1Example 1

(S)-N-(3-Циано-4-фторфенил)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)-амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоксамид(S)-N-(3-Cyano-4-fluorophenyl)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)-amino)acetyl) -1Н-pyrrole-3-carboxamide

Стадия А: этил-2-хлор-2-оксоацетат (40,8 г) и оксид цинка (1,22 г) последовательно добавляли в реакционную колбу на ледяной бане в защитной атмосфере N₂ с последующим добавлением этил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоксилата (5 г). После добавления смесь перемешивали в течение 10 минут на ледяной бане, а затем перемешивали при комнатной температуре после снятия с ледяной бани. После завершения взаимодействия реакционный раствор медленно по каплям добавляли в 200 мл смеси воды со льдом с последующим добавлением ЕА (200 мл). Полученную смесь разделяли. Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия, концентрировали и подвергали колоночной хроматографии с получением этил-5-(2-этокси-2-оксоацетил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоксилата (4,5 г). МС (масс-спектрометрия) (ИЭР+ (ионизация электрораспылением), [M+Na]⁺) m/z: 290,07.Step A: Ethyl 2-chloro-2-oxoacetate (40.8 g) and zinc oxide (1.22 g) were added successively to the reaction flask in an ice bath under N ₂ protective atmosphere, followed by the addition of ethyl 2,4-dimethyl -1H-pyrrole-3-carboxylate (5 g). After the addition, the mixture was stirred for 10 minutes in an ice bath and then stirred at room temperature after being removed from the ice bath. After completion of the interaction, the reaction solution was slowly added dropwise to 200 ml of ice water, followed by the addition of EA (200 ml). The resulting mixture was separated. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated and subjected to column chromatography to give ethyl 5-(2-ethoxy-2-oxoacetyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylate (4.5 g). MS (mass spectrometry) (ESI+ (electrospray ionization), [M+Na] ⁺ ) m/z: 290.07.

Стадия В: этил-5 -(2-этокси-2-оксоацетил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоксилат (3,5 г) и МеОН (40 мл) последовательно добавляли в реакционную колбу. Затем по каплям добавляли раствор гидроксида натрия (1,05 г) в воде (20 мл) на ледяной бане, и смесь перемешивали при комнатной температуре. После завершения взаимодействия рН водной фазы доводили 2 н водным раствором соляной кислоты до значения 3-4 и затем экстрагировали ЕА (100 мл × 2). Органическую фазу промывали водой (30 мл) и концентрировали с получением 2-(4-(этоксикарбонил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-ил)-2-оксоуксусной кислоты (2,7 г). МС (ИЭР-, [М-Н]^-) m/z: 238,1.Step B: Ethyl 5-(2-ethoxy-2-oxoacetyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylate (3.5 g) and MeOH (40 ml) were added sequentially to the reaction flask. Then, a solution of sodium hydroxide (1.05 g) in water (20 ml) was added dropwise in an ice bath, and the mixture was stirred at room temperature. After completion of the interaction, the pH of the aqueous phase was adjusted to 3-4 with 2N aqueous hydrochloric acid, and then extracted with EA (100 ml×2). The organic phase was washed with water (30 ml) and concentrated to give 2-(4-(ethoxycarbonyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-yl)-2-oxoacetic acid (2.7 g). MS (ESI-, [M-H] ^- ) m/z: 238.1.

Стадия С: 2-(4-(этоксикарбонил)-3,5-диметил-1 Н-пиррол-2-ил)-2-оксоуксусную кислоту (1 г), DMF (20 мл), HATU (2,07 г) и DIPEA (1,08 г) последовательно добавляли в реакционную колбу при комнатной температуре. После добавления реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут с последующим добавлением гидрохлорида (S)-1,1,1-трифторпропан-2-амина (0,63 г). После завершения взаимодействия реакционный раствор выливали в 50 мл воды и затем экстрагировали ЕА (50 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным водным раствором сульфата натрия (50 мл × 3), сушили над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Фильтрат собирали, концентрировали и затем очищали посредством колоночной хроматографии с получением этил-(S)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоксилата (0,5 г). МС (ИЭР-, [М-Н]^-) m/z: 333,4.Stage C: 2-(4-(ethoxycarbonyl)-3,5-dimethyl-1 H-pyrrol-2-yl)-2-oxoacetic acid (1 g), DMF (20 ml), HATU (2.07 g) and DIPEA (1.08 g) were added sequentially to the reaction flask at room temperature. After the addition, the reaction solution was stirred at room temperature for 10 minutes, followed by the addition of (S)-1,1,1-trifluoropropane-2-amine hydrochloride (0.63 g). After completion of the interaction, the reaction solution was poured into 50 ml of water, and then extracted with EA (50 ml × 3). The organic phase was washed with saturated aqueous sodium sulfate (50 ml×3), dried over anhydrous sodium sulfate and then filtered. The filtrate was collected, concentrated and then purified by column chromatography to give ethyl-(S)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl )-1H-pyrrole-3-carboxylate (0.5 g). MS (ESI-, [M-H] ^- ) m/z: 333.4.

Стадия D: этил-(S)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)-ацетил)-1 Н-пиррол-3-карбоксилат (300 мг) и МеОН (2 мл) добавляли в реакционную колбу с последующим добавлением раствора NaOH (72 мг) в воде (1 мл). После добавления реакционный раствор нагревали до 80°С и подвергали взаимодействию в течение ночи. После завершения взаимодействия полученную смесь концентрировали и затем добавляли в нее воду (20 мл) и ЕА (60 мл). Водный слой разделяли. Органическую фазу промывали водой (30 мл), и слои разделяли. Водные фазы объединяли, рН доводили 2 н соляной кислотой до значения приблизительно 3, экстрагировали посредством добавления ЕА (100 мл × 2), и затем слои разделяли. Органическую фазу концентрировали с получением (S)-2,4-диметил-5- (2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (230 мг). МС (ИЭР-,[М-Н]^-) m/z: 305,4.Stage D: ethyl-(S)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)-acetyl)-1 H-pyrrole-3 α-carboxylate (300 mg) and MeOH (2 ml) were added to the reaction flask followed by a solution of NaOH (72 mg) in water (1 ml). After the addition, the reaction solution was heated to 80° C. and reacted overnight. After completion of the interaction, the resulting mixture was concentrated and then added to it water (20 ml) and EA (60 ml). The aqueous layer was separated. The organic phase was washed with water (30 ml) and the layers were separated. The aqueous phases were combined, the pH was adjusted to approximately 3 with 2N hydrochloric acid, extracted by adding EA (100 ml x 2), and then the layers were separated. The organic phase was concentrated to give (S)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl)-1H-pyrrole-3-carboxylic acids (230 mg). MS (ESI-,[M-H] ^- ) m/z: 305.4.

Стадия Е: (S)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1H-пиррол-3-карбоновую кислоту (230 мг), DMF (5 мл), HATU (428 мг) и DIPEA (194 мг) последовательно добавляли в реакционную колбу при комнатной температуре. После добавления реакционный раствор перемешивали в течение 10 минут с последующим добавлением 5-амино-2-фторбензонитрила (123 мг). Полученную смесь нагревали до 40°С и перемешивали для проведения взаимодействия в течение 20 часов. После завершения взаимодействия добавляли воду (20 мл) и ЕА (60 мл), и смесь разделяли. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и затем фильтровали. Фильтрат собирали, подвергали выпариванию на ротационном испарителе досуха, отбирали пробу и очищали посредством колоночной хроматографии с получением (S)-N-(3-циано-4-фторфенил)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоксамида (180 мг). ¹Н ЯМР (500 МГц, DMSO-d₆) δ 12.05 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 9.49 (d, J=9,0 Гц, 1H), 8.20 (dd, J=6,0, 2,5 Гц, 1H), 7.98-7.91 (m, 1Н),7.53 (t, J=9,0 Гц, 1H), 4.78-4.67 (m, 1Н),2.40 (s, 3Н), 2.32 (s, 3Н), 1.34 (d, J=7,0 Гц, 3Н). МС (ИЭР-, [М-Н]^-) m/z: 423,0.Step E: (S)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl)-1H-pyrrole-3-carboxylic acid ( 230 mg), DMF (5 ml), HATU (428 mg) and DIPEA (194 mg) were sequentially added to the reaction flask at room temperature. After the addition, the reaction solution was stirred for 10 minutes, followed by the addition of 5-amino-2-fluorobenzonitrile (123 mg). The resulting mixture was heated to 40°C and stirred to carry out the interaction for 20 hours. After completion of the interaction, water (20 ml) and EA (60 ml) were added and the mixture was separated. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then filtered. The filtrate was collected, rotary evaporated to dryness, sampled and purified by column chromatography to give (S)-N-(3-cyano-4-fluorophenyl)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2- ((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl)-1H-pyrrole-3-carboxamide (180 mg). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.05 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 9.49 (d, J=9.0 Hz, 1H), 8.20 (dd, J=6.0 , 2.5 Hz, 1H), 7.98-7.91 (m, 1H), 7.53 (t, J=9.0 Hz, 1H), 4.78-4.67 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.32 ( s, 3H), 1.34 (d, J=7.0 Hz, 3H). MS (ESI-, [M-H] ^- ) m/z: 423.0.

Пример 2Example 2

(R)-N-(3-Циано-4-фторфенил)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)-амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоксамид(R)-N-(3-Cyano-4-fluorophenyl)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)-amino)acetyl) -1Н-pyrrole-3-carboxamide

Стадия А: в соответствии с примером 1, гидрохлорид (S)-1,1,1-трифторпропан-2-амина заменяли на гидрохлорид (R)-1,1,1-трифторпропан-2-амина на стадии С с получением этил-(R)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1H-пиррол-3-карбоксилата. МС (ИЭР-, [М-Н]^-) m/z: 333,2.Stage A: in accordance with example 1, hydrochloride (S)-1,1,1-trifluoropropane-2-amine was replaced by hydrochloride (R)-1,1,1-trifluoropropan-2-amine in stage C to obtain ethyl (R)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl)-1H-pyrrole-3-carboxylate. MS (ESI-, [M-H] ^- ) m/z: 333.2.

Стадия В: в соответствии с примером 1, этил-(S)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоксилат заменяли на этил-(R)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоксилат на стадии D с получением (R)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)-амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты. МС (ИЭР-, [М-Н]^-) m/z: 305,4.Stage B: in accordance with example 1, ethyl-(S)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl)-1H -pyrrole-3-carboxylate was replaced by ethyl-(R)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl)-1H- pyrrole-3-carboxylate in step D to give (R)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)-amino)acetyl)-1H -pyrrole-3-carboxylic acid. MS (ESI-, [M-H] ^- ) m/z: 305.4.

Стадия С: в соответствии с примером 1, (S)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоновую кислоту заменяли на (R)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1-трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоновую кислоту на стадии Е с получением (R)-N-(3-циано-4-фторфенил)-2,4-диметил-5-(2-оксо-2-((1,1,1 -трифторпроп-2-ил)амино)ацетил)-1Н-пиррол-3-карбоксамида. ¹Н ЯМР (500 МГц, DMSO-d₆): δ 12.03 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 9.48 (d, J=8,5 Гц, 1H), 8.20 (dd, J=6,0, 2,5 Гц, 1H), 8.00-7.90 (m, 1H), 7.52 (t, J=9,0 Гц, 1H), 4.90-4.65 (m, 1H), 2.40 (s, 3Н), 2.33 (s, 3Н), 1.34 (d, J=7,5 Гц, 3Н). МС (ИЭР-, [М-Н]^-) m/z: 423,2.Step C: according to example 1, (S)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl)-1H-pyrrole -3-carboxylic acid was replaced by (R)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2-yl)amino)acetyl)-1H-pyrrole-3 -carboxylic acid in step E to give (R)-N-(3-cyano-4-fluorophenyl)-2,4-dimethyl-5-(2-oxo-2-((1,1,1-trifluoroprop-2 -yl)amino)acetyl)-1H-pyrrole-3-carboxamide. ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 12.03 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 9.48 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.20 (dd, J=6, 0, 2.5 Hz, 1H), 8.00-7.90 (m, 1H), 7.52 (t, J=9.0 Hz, 1H), 4.90-4.65 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.34 (d, J=7.5 Hz, 3H). MS (ESI-, [M-H] ^- ) m/z: 423.2.

Экспериментальный пример 1: исследование активности in vitroExperimental Example 1: In Vitro Activity Study

1.1. Ингибирующая активность в отношении ДНК HBV в клетках in vitro Брали флакон с клетками HepG2.2.15 (Wuhan Institute of Virology) или HepAD38 в стадии хорошего экспоненциального роста, однократно промывали посредством добавления 5 мл PBS (забуференный фосфатами физиологический раствор) и затем туда добавляли 3 мл трипсина. После ферментативного расщепления при комнатной температуре в течение 5 минут 2 мл трипсина удаляли, и затем образец помещали в инкубатор для клеточных культур и подвергали ферментативному расщеплению в течение 10 минут. Клетки извлекали и наблюдали под микроскопом (были ли клетки разъединенными и круглыми, и не было ли адгезии между клетками). Добавляли 10 мл полной среды для остановки ферментативного расщепления. После пипетирования в суспензию отдельных клеток 10 мкл клеточной суспензии отбирали для подсчета клеток с использованием счетчика клеток и затем разводили в полной среде и доводили до плотности клеток 1×10⁵ клеток/мл. Затем клеточную суспензию высевали в количестве 1 мл на лунку в 24-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки (24-луночный планшет предварительно покрывали раствором коллагена I типа в концентрации 50 мкг/мл) и культивировали при постоянной температуре в СО₂ инкубаторе в течение 48 часов.1.1. Inhibitory activity against HBV DNA in cells in vitro Take a flask with HepG2.2.15 (Wuhan Institute of Virology) or HepAD38 cells in good exponential growth stage, wash once by adding 5 ml of PBS (phosphate buffered saline), and then add 3 ml thereto trypsin. After enzymatic digestion at room temperature for 5 minutes, 2 ml of trypsin was removed, and then the sample was placed in a cell culture incubator and subjected to enzymatic digestion for 10 minutes. The cells were removed and observed under a microscope (whether the cells were disjointed and round, and whether there was adhesion between the cells). 10 ml of complete medium was added to stop enzymatic degradation. After pipetting into the single cell suspension, 10 μl of the cell suspension was taken for cell counting using a cell counter and then diluted in complete medium and adjusted to a cell density of 1×10 ⁵ cells/ml. Then, the cell suspension was seeded at 1 ml per well in a 24-well plate using a multi-channel pipette (24-well plate was pre-coated with type I collagen solution at a concentration of 50 μg/ml) and cultured at a constant temperature in a CO ₂ incubator for 48 hours .

Соединения, растворенные в DMSO, подвергали двукратному серийному разведению (всего 10 концентраций) в полной среде. Добавляли соединение, и каждые 72 часа использовали свежую среду, содержащую соединение, для замены истощенной среды. Клетки обрабатывали соединением в течение 6 суток. После сифонирования надосадочной жидкости 300 мкл лизата (10 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 1% NP-40 (детергент)) добавляли в каждую лунку. После лизирования при комнатной температуре в течение 10 минут ДНК экстрагировали, и ДНК HBV во внутриклеточном вирусном капсиде измеряли с помощью метода флуоресцентной количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция) в режиме реального времени. Скорость ингибирования вычисляли на основании величины Ct, а величину ЕС₅₀ вычисляли с помощью четырехпараметрического метода. Результаты показаны в таблицах 1 и 2.Compounds dissolved in DMSO were subjected to a two-fold serial dilution (total 10 concentrations) in complete medium. Compound was added and fresh medium containing compound was used every 72 hours to replace depleted medium. Cells were treated with compound for 6 days. After siphoning the supernatant, 300 μl of lysate (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and 1% NP-40 (detergent)) was added to each well. After lysing at room temperature for 10 minutes, the DNA was extracted, and the HBV DNA in the intracellular viral capsid was measured by real-time fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction). The inhibition rate was calculated based on the Ct value, and the EC ₅₀ value was calculated using a four parameter method. The results are shown in tables 1 and 2.

1.2. Цитотоксичность in vitro1.2. Cytotoxicity in vitro

Брали флакон с клетками HepG2.2.15 (Wuhan Institute of Virology) в стадии хорошего экспоненциального роста, однократно промывали посредством добавления 5 мл PBS и затем туда добавляли 2 мл трипсина. Образец подвергали ферментативному расщеплению в инкубаторе для клеточных культур, и периодически извлекали, и наблюдали под микроскопом. Как только клетки распадались, 1 мл трипсина удаляли. Остаточную жидкость помещали в инкубатор для клеточных культур при 37°С и подвергали ферментативному расщеплению в течение 8-15 минут. Клетки извлекали и наблюдали под микроскопом (были ли клетки разъединенными и круглыми и не было ли адгезии между клетками). 5 мл среды MEM (минимальная поддерживающая среда) добавляли для ресуспендирования клеток. Затем клетки подсчитывали с помощью счетчика клеток, разводили в полной среде и доводили до плотности клеток 2×10⁵ клеток/мл. Затем клетки высевали в количестве 100 мкл на лунку в 96-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки (96-луночный планшет предварительно покрывали раствором коллагена I типа в концентрации 50 мкг/мл) и культивировали при постоянной температуре в СО₂ инкубаторе в течение 24 часов. Клетки обрабатывали путем введения лекарственного средства, и свежую среду, содержащую соединение, использовали для замены истощенной среды каждые 3 суток. Для контроля в лунки добавляли не содержащую лекарственного средства среду, но содержащую 0,5% DMSO, и создавали контрольную лунку, содержащую обычную среду. Через 6 суток после введения добавляли ССК-8 в количестве 10 мкл на лунку. Через 1-2 часа регистрировали поглощение с помощью ридера для микропланшет при 450 нм и вычисляли степень ингибирования и СС₅₀. Результаты показаны в таблице 3.A vial of HepG2.2.15 cells (Wuhan Institute of Virology) in a good exponential growth stage was taken, washed once by adding 5 ml of PBS, and then 2 ml of trypsin was added thereto. The sample was subjected to enzymatic digestion in a cell culture incubator, and periodically removed and observed under a microscope. As soon as the cells disintegrated, 1 ml of trypsin was removed. The residual liquid was placed in a cell culture incubator at 37° C. and subjected to enzymatic digestion for 8-15 minutes. Cells were removed and observed under a microscope (whether the cells were disjointed and round and whether there was adhesion between cells). 5 ml MEM medium (minimal maintenance medium) was added to resuspend the cells. Cells were then counted with a cell counter, diluted in complete medium and adjusted to a cell density of 2×10 ⁵ cells/ml. The cells were then seeded at 100 μl per well in a 96-well plate using a multichannel pipette (the 96-well plate was pre-coated with a 50 μg/ml type I collagen solution) and cultured at a constant temperature in a CO ₂ incubator for 24 hours. Cells were treated by drug administration and fresh medium containing the compound was used to replace depleted medium every 3 days. As a control, media containing no drug but containing 0.5% DMSO was added to the wells and a control well containing normal media was created. 6 days after administration, CCK-8 was added in an amount of 10 μl per well. After 1-2 hours, absorbance was recorded with a microplate reader at 450 nm and the degree of inhibition and CC ₅₀ were calculated. The results are shown in Table 3.

1.3. Изучение ингибирования фермента СУР4501.3. Study of CYP450 enzyme inhibition

500 мкл конечной инкубационной системы содержат 50 мкл микросом печени человека (концентрация белка: 0,2 мг/мл, Corning), 1 мкл смешанных специфичных субстратов СУР450 (CYP1A2, CYP 2В6, CYP 2С9, CYP2C19, CYP 2D6 и CYP 3А4), 398 мкл PBS буфера (рН 7,4), 1 мкл специфичного положительного ингибитора (положительная контрольная группа) или тестируемого соединения (приготовленного с ацетонитрилом) и 50 мкл NADPH (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный) + MgCl₂. Дублированные инкубационные системы по 0,5 мл каждая были приготовлены для каждого подтипа СУР450. Общий объем 450 мкл однородно перемешанного раствора субстрата и фермента был приготовлен в каждой пробирке, и раствор и NADPH предварительно инкубировали при 37°С в течение 5 минут соответственно. Затем 50 мкл смешанного раствора NADPH + MgCl₂ добавляли для осуществления взаимодействия. 50 мкл реакционного раствора отбирали через 30 минут, и взаимодействие останавливали с помощью 300 мкл ледяного ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт. Дополнительно, две контрольные группы по 500 мкл каждая без NADPH были приготовлены параллельно в качестве отрицательной контрольной группы.500 µl final incubation system contains 50 µl human liver microsomes (protein concentration: 0.2 mg/ml, Corning), 1 µl mixed CYP450 specific substrates (CYP1A2, CYP 2B6, CYP 2C9, CYP2C19, CYP 2D6 and CYP 3A4), 398 µl PBS buffer (pH 7.4), 1 µl specific positive inhibitor (positive control group) or test compound (prepared with acetonitrile) and 50 µl NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced) + MgCl ₂ . Duplicate incubation systems of 0.5 ml each were prepared for each CYP450 subtype. A total volume of 450 µl of a uniformly mixed substrate and enzyme solution was prepared in each tube, and the solution and NADPH were pre-incubated at 37° C. for 5 minutes, respectively. Then, 50 μl of a mixed solution of NADPH + MgCl ₂ was added to carry out the interaction. 50 μl of the reaction solution was withdrawn after 30 minutes, and the interaction was stopped with 300 μl of ice-cold acetonitrile containing an internal standard. Additionally, two control groups of 500 µl each without NADPH were prepared in parallel as a negative control group.

Предварительная обработка образцов: к 50 мкл инкубированного образца добавляли 300 мкл ледяного ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт, и затем осаждали. После перемешивания на вортексе в течение 5 минут образец центрифугировали (12000 об/мин, 4°С) в течение 10 минут. Пипетировали 75 мкл надосадочной жидкости, и 75 мкл ультрачистой воды добавляли в нее для разведения и смешивали до однородного состояния. 1 мкл полученного раствора впрыскивали для анализа. Результаты показаны в таблице 4.Pre-treatment of samples: 300 µl of ice-cold acetonitrile containing an internal standard was added to 50 µl of the incubated sample and then precipitated. After vortexing for 5 minutes, the sample was centrifuged (12,000 rpm, 4° C.) for 10 minutes. 75 µl of the supernatant was pipetted, and 75 µl of ultrapure water was added to it for dilution and mixed until homogeneous. 1 μl of the resulting solution was injected for analysis. The results are shown in Table 4.

1.4. Анализ связывания белков плазмы крови1.4. Plasma protein binding assay

Приготовление образцов плазмы крови: отбирали 495 мкл пустой плазмы соответствующего вида (мыши, крысы, собаки, обезьяны и человека), соответственно, и в них добавляли 5 мкл раствора соответствующего тестируемого соединения или положительного контроля с получением растворов образцов плазмы, имеющих концентрацию в плазме лекарственного соединения 1 мкМ и 10 мкМ соответственно (приготовленного с ацетонитрилом).Preparation of blood plasma samples: 495 μl of blank plasma of the appropriate species (mice, rats, dogs, monkeys and humans), respectively, was collected and 5 μl of the solution of the corresponding test compound or positive control was added to obtain solutions of plasma samples having a plasma concentration of the drug compounds 1 μM and 10 μM, respectively (prepared with acetonitrile).

Предварительно обработанную диализную мембрану помещали в устройство для равновесного диализа с высокой пропускной способностью, и отбирали по 100 мкл раствора образца плазмы и буферного раствора PBS, и добавляли соответственно с обеих сторон диализной мембраны (сторона образца и сторона буфера) (n=3). После того, как устройство уравновешивания было герметизировано пленкой, его инкубировали при 37°С в течение ночи (100 об/мин). После достижения уравновешивания диализа образцы по 50 мкл отбирали со стороны образца и со стороны буфера соответственно, и взаимодействие останавливали посредством добавления ледяного ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт.The pretreated dialysis membrane was placed in a high-throughput equilibration dialysis device, and 100 µl of plasma sample solution and PBS buffer solution were taken and added respectively to both sides of the dialysis membrane (sample side and buffer side) (n=3). After the balancer was sealed with film, it was incubated at 37° C. overnight (100 rpm). After dialysis equilibration was reached, 50 μl samples were taken from the sample side and the buffer side, respectively, and the reaction was stopped by adding ice-cold acetonitrile containing an internal standard.

Предварительная обработка образцов: К 50 мкл образца со стороны плазмы добавляли 450 мкл ледяного ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт, и затем осаждали. После перемешивания на вортексе в течение 5 минут образец центрифугировали (12000 об/мин, 4°С) в течение 10 минут.75 мкл надосадочной жидкости пипетировали, и 75 мкл ультрачистой воды добавляли к ней для разведения и смешивали до однородного состояния. 1 мкл полученного раствора впрыскивали для анализа. К 50 мкл образца со стороны PBS буфера добавляли 250 мкл ледяного ацетонитрила с внутренним стандартом и осаждали. После перемешивания на вортексе в течение 5 минут образец центрифугировали (12000 об/мин, 4°С) в течение 10 мин. 75 мкл надосадочной жидкости пипетировали, и 75 мкл ультрачистой воды добавляли к ней для разведения и смешивали до однородного состояния. 2 мкл полученного раствора впрыскивали для анализа. Результаты показаны в таблице 5.Pre-treatment of samples: 450 µl of ice-cold acetonitrile containing an internal standard was added to 50 µl of the sample from the plasma side, and then precipitated. After vortexing for 5 minutes, the sample was centrifuged (12,000 rpm, 4°C) for 10 minutes. 75 µl of the supernatant was pipetted, and 75 µl of ultrapure water was added to it to dilute and mixed until homogeneous. 1 μl of the resulting solution was injected for analysis. 250 µl of ice-cold acetonitrile with an internal standard was added to 50 µl of the sample from the PBS buffer side and precipitated. After vortexing for 5 minutes, the sample was centrifuged (12,000 rpm, 4°C) for 10 minutes. 75 μl of the supernatant was pipetted, and 75 μl of ultrapure water was added thereto for dilution and mixed until homogeneous. 2 μl of the resulting solution was injected for analysis. The results are shown in Table 5.

Экспериментальный пример 2: стабильность микросом печени in vitroExperimental Example 2: Stability of liver microsomes in vitro

300 мкл конечной инкубационной системы содержат 30 мкл микросом печени (концентрация белка: 0,15 мг/мл, Corning), 30 мкл NADPH + MgCl₂, 3 мкл субстрата (приготовленного с ацетонитрилом) и 237 мкл PBS буфера. Дублированные инкубационные системы по 0,3 мл каждая были приготовлены для каждого вида. Общий объем 270 мкл однородно перемешанного раствора субстрата и фермента был приготовлен в каждой пробирке, раствор и NADPH предварительно инкубировали при 37°С в течение 5 минут соответственно. Затем 30 мкл смешанного раствора NADPH + MgCl₂ добавляли для осуществления взаимодействия. 50 мкл реакционного раствора отбирали через 0, 10, 30 и 60 минут, и взаимодействие останавливали с помощью 300 мкл ледяного ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт.300 µl final incubation system contains 30 µl liver microsomes (protein concentration: 0.15 mg/ml, Corning), 30 µl NADPH + MgCl ₂ , 3 µl substrate (prepared with acetonitrile) and 237 µl PBS buffer. Duplicate incubation systems of 0.3 ml each were prepared for each species. A total volume of 270 µl of a uniformly mixed substrate and enzyme solution was prepared in each tube, the solution and NADPH were pre-incubated at 37° C. for 5 minutes, respectively. Then, 30 μl of a mixed solution of NADPH + MgCl ₂ was added to carry out the interaction. 50 µl of the reaction solution was withdrawn after 0, 10, 30 and 60 minutes and the reaction was stopped with 300 µl of ice-cold acetonitrile containing an internal standard.

Предварительная обработка образцов: к 50 мкл инкубированного образца добавляли 300 мкл ледяного ацетонитрила, содержащего диазепам в качестве внутреннего стандарта, и затем осаждали. После перемешивания на вортексе в течение 5 минут образец центрифугировали (12000 об/мин, 4°С) в течение 10 минут.75 мкл надосадочной жидкости пипетировали в 96-луночный планшет, и затем разбавляли с помощью 75 мкл ультрачистой воды и смешивали до однородного состояния. 0,5 мкл полученного раствора впрыскивали и анализировали методом ЖХ-МС/МС (жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия). Результаты показаны в таблице 6.Pre-treatment of samples: 300 µl of ice-cold acetonitrile containing diazepam as an internal standard was added to 50 µl of the incubated sample, and then precipitated. After vortexing for 5 minutes, the sample was centrifuged (12,000 rpm, 4°C) for 10 minutes. . 0.5 μl of the resulting solution was injected and analyzed by LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry). The results are shown in Table 6.

Экспериментальный пример 3: эффективность на животных in vivoExperimental Example 3: In Vivo Animal Efficacy

3.1. Оценка противовирусного эффекта в мышиной модели AAV (адено-ассоциированный вирус)3.1. Evaluation of the antiviral effect in the mouse model of AAV (adeno-associated virus)

Самцам мышей C57BL/6 (Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.) в возрасте 6-8 недель вводили вирус rAAV8-1.3HBV (Beijing FivePlus Gene Technology Ltd., подтип adr) посредством инъекции в хвостовую вену в дозе 1×10¹¹ гв (геномов вектора). Кровь собирали из глазниц мышей через 2 и 4 недели после введения вируса. Выделяли сыворотку и определяли уровни экспрессии HBeAg и HBsAg в сыворотке и число копий ДНК HBV, чтобы оценить, успешно ли создана модель. Согласно результатам количественного определения серологических HBeAg, HBsAg и ДНК HBV были отобраны мыши, имеющие уровень экспрессии ДНК HBV выше 1x104 МЕ/мл, уровень экспрессии HBeAg выше 1×103 NCU (национальная клиническая единица)/мл и уровень экспрессии HBsAg выше 1×103 нг/мл. Мышей распределяли в группу пустого контроля, группу контроля-носителя и группу тестируемых соединений. Мышам в каждой группе непрерывно вводили внутрижелудочно один раз в сутки в течение 2-3 недель, и затем введение приостанавливали на 1 неделю. Во время эксперимента кровь собирали из глазниц каждые две недели, выделяли сыворотку, и содержание ДНК определяли с помощью метода флуоресцентной количественной ПНР. Результаты показаны в таблицах 7 и 8.Male C57BL/6 mice (Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.) aged 6-8 weeks were injected with rAAV8-1.3HBV (Beijing FivePlus Gene Technology Ltd., adr subtype) by tail vein injection at a dose of 1×10 ¹¹ gv (vector genomes). Blood was collected from the eye sockets of mice 2 and 4 weeks after virus injection. Serum was isolated and serum HBeAg and HBsAg expression levels and HBV DNA copy number were determined to assess whether the model was successful. According to the results of quantitative determination of serological HBeAg, HBsAg and HBV DNA, mice were selected with an expression level of HBV DNA above 1x104 IU/ml, an HBeAg expression level above 1x103 NCU (national clinical unit)/ml and an HBsAg expression level above 1x103 ng /ml Mice were divided into a blank control group, a vehicle control group, and a test compound group. Mice in each group were continuously injected intragastrically once a day for 2-3 weeks, and then the administration was suspended for 1 week. During the experiment, blood was collected from the eye sockets every two weeks, the serum was isolated, and the DNA content was determined using the method of fluorescent quantitative PNR. The results are shown in tables 7 and 8.

3.2. Экспериментальный метод на модели pAAV/HBV3.2. Experimental method on the pAAV/HBV model

Использовали самцов мышей C57BL/6 (Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.) в возрасте 6-8 недель, и каждой мыши вводили посредством инъекции очищенную рекомбинантную плазмиду pAAV/HBV1.2 (10 мкг), растворенную в PBS в объеме, эквивалентном примерно 10% от ее массы тела, через хвостовую вену в пределах периода времени 3-8 секунд. Кровь собирали из глазниц мышей через 3 суток после введения плазмиды для определения сывороточной ДНК HBV. Отбирали модельных мышей, имеющих однородную сывороточную ДНК, и распределяли в: модельную контрольную группу, группу контроля-носителя и группу тестируемых соединений. Мышам в каждой группе непрерывно вводили внутрижелудочно один раз в сутки в течение 10 суток в дозе 3 мг/кг. Мышиную сыворотку отбирали на 0, 4, 7 и 10 сутки после введения, и мышей умерщвляли на 10 сутки для взятия образцов ткани печени. Число копий ДНК HBV в сыворотке и печени мышей определяли с помощью метода флуоресцентной количественной ПНР. Результаты показаны в таблице 9.Male C57BL/6 mice (Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.) aged 6-8 weeks were used, and each mouse was injected with purified pAAV/HBV1.2 recombinant plasmid (10 μg) dissolved in PBS in a volume equivalent to about 10% of her body weight, via the tail vein within a time period of 3-8 seconds. Blood was collected from the eye sockets of mice 3 days after the injection of the plasmid to determine serum HBV DNA. Model mice having homogenous serum DNA were selected and divided into: a model control group, a vehicle control group, and a test compound group. Mice in each group were continuously injected intragastrically once a day for 10 days at a dose of 3 mg/kg. Mouse serum was collected on days 0, 4, 7 and 10 after administration, and mice were sacrificed on day 10 for liver tissue sampling. The number of copies of HBV DNA in the serum and liver of mice was determined using the method of fluorescent quantitative PNR. The results are shown in Table 9.

Экспериментальный пример 4: фармакокинетика in vivoExperimental Example 4: In Vivo Pharmacokinetics

Исследование фармакокинетики (ФК) у крыс in vivoPharmacokinetic (PK) study in rats in vivo

Крыс линии SD (Shanghai Xipuer-Bikai Laboratory Animal Co., Ltd.) с массой тела 180-220 грамм произвольным образом распределяли в группы по три животных в каждой после 3-5 суток акклиматизации, и серию соединений вводили внутрижелудочно в каждой группе в дозе 20 мг/кг.Rats of the SD line (Shanghai Xipuer-Bikai Laboratory Animal Co., Ltd.) with a body weight of 180-220 grams were randomly divided into groups of three animals each after 3-5 days of acclimatization, and a series of compounds were administered intragastrically in each group at a dose of 20 mg/kg.

Подопытных животных (крысы SD) не кормили в течение 12 часов до введения и кормили через 4 часа после введения. Они имели свободный доступ к воде до и после эксперимента.The test animals (SD rats) were not fed for 12 hours prior to administration and were fed 4 hours after administration. They had free access to water before and after the experiment.

После введения собирали приблизительно 0,2 мл крови из глазниц через 0 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 24 часа, 30 часов и 48 часов. Не позднее чем через 30 минут после антикоагуляции с использованием EDTA-K2 плазму отделяли посредством центрифугирования при 4°С и 4000 об/мин в течение 10 минут. Сразу после сбора всей плазмы ее хранили при -20°С для тестирования.After administration, approximately 0.2 ml blood was collected from the eye sockets at 0 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 10 hours, 24 hours, 30 hours and 48 hours. No later than 30 minutes after anticoagulation using EDTA-K2, plasma was separated by centrifugation at 4°C and 4000 rpm for 10 minutes. Immediately after collecting all the plasma, it was stored at -20°C for testing.

50 мкл образца плазмы, подлежащего тестированию, и стандартного образца для калибровочной кривой пипетировали и затем туда добавляли 500 мкл раствора ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт (диазепам, 20 мг/мл). Полученную смесь встряхивали и перемешивали до однородного состояния в течение 5 минут и затем центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин. 75 мкл надосадочной жидкости пипетировали, и 75 мкл ультрачистой воды добавляли в нее для разведения, и равномерно перемешивали. 1 мкл полученного раствора пипетировали для определения с помощью метода ЖХ-МС/МС. Результаты показаны в таблице 10.50 μl of the plasma sample to be tested and the standard sample for the calibration curve were pipetted, and then 500 μl of an acetonitrile solution containing an internal standard (diazepam, 20 mg/ml) was added thereto. The resulting mixture was shaken and stirred until homogeneous for 5 minutes and then centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes. 75 μl of the supernatant was pipetted, and 75 μl of ultrapure water was added to it for dilution, and mixed evenly. 1 μl of the resulting solution was pipetted for determination using the LC-MS/MS method. The results are shown in Table 10.

Claims (10)

1. Соединение формулы I или II или его фармацевтически приемлемая соль1. A compound of formula I or II, or a pharmaceutically acceptable salt thereof 2. Фармацевтическая композиция, обладающая анти-HBV активностью, содержащая эффективное количество соединения формулы I или II или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1; причем фармацевтическая композиция, возможно, дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент.2. Pharmaceutical composition with anti-HBV activity, containing an effective amount of a compound of formula I or II or a pharmaceutically acceptable salt according to claim 1; wherein the pharmaceutical composition optionally further comprises a pharmaceutically acceptable excipient. 3. Способ предупреждения или лечения заболевания, вызванного инфицированием вирусом гепатита В (HBV), включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы I или II или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2.3. A method for preventing or treating a disease caused by hepatitis B virus (HBV) infection, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound of formula I or II or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to claim 2. 4. Применение соединения формулы I или II или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания, вызванного инфицированием вирусом гепатита В (HBV).4. The use of a compound of formula I or II or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to claim 2 in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a disease caused by hepatitis B virus (HBV) infection. 5. Применение соединения формулы I или II или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 для предупреждения или лечения заболевания, вызванного инфицированием вирусом гепатита В (HBV).5. The use of a compound of formula I or II or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to claim 2 for the prevention or treatment of a disease caused by hepatitis B virus (HBV) infection. 6. Соединение формулы I или II или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1 или фармацевтическая композиция по п. 2 для применения в предупреждении или лечении заболевания, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка; причем, возможно, заболевание, при котором полезно ингибирование сборки капсидного белка, представляет собой заболевание, вызванное инфицированием вирусом гепатита В (HBV).6. A compound of formula I or II or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to claim 2 for use in the prevention or treatment of a disease in which inhibition of capsid protein assembly is useful; and possibly a disease in which inhibition of capsid protein assembly is beneficial is a disease caused by hepatitis B virus (HBV) infection. 7. Способ ингибирования сборки капсидного белка, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы I или II или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2.7. A method for inhibiting capsid protein assembly, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound of formula I or II or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to claim 2. 8. Применение соединения формулы I или II или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 для ингибирования сборки капсидного белка.8. The use of a compound of formula I or II or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to claim 2 for inhibiting capsid protein assembly. 9. Соединение формулы I или II или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1 или фармацевтическая композиция по п. 2 для применения в ингибировании сборки капсидного белка.9. A compound of formula I or II or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to claim 2 for use in inhibiting capsid protein assembly.