RU2800859C1 - Method of correction of oxidative status in parkinson's disease in experiment - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention is the use of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline (hydroxy-THC) for the correction of oxidative status in modeling Parkinson's disease. The method includes intraperitoneal administration of hydroxy-THC for 10 days at a dose of 50 mg/kg of rat body weight in the form of an aqueous solution containing 0.9 wt. % of sodium chloryl and 5 vol. % of dimethyl sulfoxide, at the rate of 0.5 ml of solution per 0.2 kg of animal body weight.

EFFECT: invention provides improvement of motor-coordination parameters and reduction of parameters of free radical oxidation intensity in the brain and blood serum of animals.

1 cl, 1 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине и заключается в способе использования гидроксипроизводного гидрохинолина для коррекции оксидативного статуса при экспериментальной болезни Паркинсона (БП).SUBSTANCE: invention relates to medicine and consists in a method for using hydroquinoline hydroxy derivative for correction of oxidative status in experimental Parkinson's disease (PD).

БП оказывает значительное влияние на общество и является распространенным заболеванием: в 2016 году в мире насчитывалось около 6,1 миллиона человек с данной патологией. По причинам, которые еще не до конца понятны, распространенность этого заболевания быстро росла в последние два десятилетия [Bloem B.R., Okun M.S., Klein С.Parkinson's disease. Lancet. 2021; 397: 2284-303].PD has a significant impact on society and is a common disease: in 2016, there were about 6.1 million people with this pathology in the world. For reasons that are not yet fully understood, the prevalence of this disease has grown rapidly in the past two decades [Bloem B.R., Okun M.S., Klein C. Parkinson's disease. Lancet. 2021; 397: 2284-303].

Известно, что у пациентов с БП наблюдается потеря нейронов в substantia nigra par compacta, locus ceruleus и других отделов головного мозга. Среди ключевых механизмов патогенеза БП в настоящее время выделяют агрегацию α-синуклеина, дисфункцию митохондрий, нарушение протеостаза, нейровоспаление и окислительный стресс [Jankovic J., Tan Е.К. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808].It is known that in patients with PD there is a loss of neurons in the substantia nigra par compacta, locus ceruleus and other parts of the brain. Among the key mechanisms of the pathogenesis of PD, α-synuclein aggregation, mitochondrial dysfunction, impaired proteostasis, neuroinflammation, and oxidative stress are currently distinguished [Jankovic J., Tan E.K. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808].

Окислительный стресс является одним из основных факторов нейродегенерации при БП. В ходе патогенеза активные формы кислорода (АФК) образуются в результате работы электрон-транспортной цепи митохондрий, метаболизма дофамина и других окислительно-восстановительных реакций. Катаболизм дофамина обеспечивает моноаминоксидаза, которая в качестве побочного продукта образует Н₂О₂. Кроме того, окисление дофамина может происходить спонтанно в присутствии железа с образованием 6-гидроксидофамина, который впоследствии превращается в присутствии кислорода в реактивную электрофильную молекулу - р-хинон. Дофамин также может быть окислен до хинона дофамина, проявляющего токсическое действие посредством реакции с сульфгидрильными группами цистеина. Таким образом, в дофаминергических нейронах в результате ферментативного и неферментативного метаболизма дофамина АФК образуются в достаточно большом количестве. Следовательно, данные нейроны более чувствительны к различным стрессовым факторам по сравнению с нейронами других отделов мозга. В нормальных дофаминергических нейронах уровень АФК строго контролируется компонентами антиокислительной защиты. Однако, у пациентов с БП, как правило, наблюдается угнетение антиоксидантной системы. В условиях повышенного содержания АФК значительно ухудшается функционирование протеасом, что способствует агрегации окисленных или иным образом поврежденных белков в клетке и прогрессированию БП [Dorszewska J., Kowalska М., Prendecki М., Piekut Т., Kozlowska J., Kozubski W. Oxidative stress factors in Parkinson's disease. Neural Regen Res. 2021; 16(7): 1383-1391].Oxidative stress is one of the main factors of neurodegeneration in PD. During pathogenesis, reactive oxygen species (ROS) are formed as a result of the operation of the mitochondrial electron transport chain, dopamine metabolism, and other redox reactions. Dopamine catabolism is provided by monoamine oxidase, which forms H ₂ O ₂ as a by-product. In addition, the oxidation of dopamine can occur spontaneously in the presence of iron to form 6-hydroxydopamine, which is subsequently converted in the presence of oxygen into a reactive electrophilic molecule, p-quinone. Dopamine can also be oxidized to dopamine quinone, which exhibits toxic effects through reaction with cysteine sulfhydryl groups. Thus, in dopaminergic neurons, as a result of the enzymatic and nonenzymatic metabolism of dopamine, ROS are formed in a sufficiently large amount. Consequently, these neurons are more sensitive to various stress factors compared to neurons in other parts of the brain. In normal dopaminergic neurons, the level of ROS is strictly controlled by the components of the antioxidant defense. However, in patients with PD, as a rule, inhibition of the antioxidant system is observed. Under conditions of increased ROS content, the functioning of the proteasomes significantly deteriorates, which contributes to the aggregation of oxidized or otherwise damaged proteins in the cell and the progression of PD [Dorszewska J., Kowalska M., Prendecki M., Piekut T., Kozlowska J., Kozubski W. Oxidative stress factors in Parkinson's disease. Neural Regen Res. 2021; 16(7): 1383-1391].

Известно, что терапия БП включает фармакологические (с применением препаратов леводопы, назначаемых сочетанно с другими лекарствами или отдельно) и нефармакологические подходы (физические упражнения и физическая, трудовая и речевая терапия) [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].It is known that PD therapy includes pharmacological (with the use of levodopa drugs prescribed in combination with other drugs or separately) and non-pharmacological approaches (physical exercises and physical, occupational and speech therapy) [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].

Фармакологическое лечение двигательных симптомов БП в основном направлено на коррекцию действия дофамина. При этом, более 40% лиц, получающих пероральные агонисты дофамина, испытывают расстройства контроля социального поведения. Лица, прекращающие прием агонистов дофамина, испытывают симптомы отмены в 15-20% случаев [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].Pharmacological treatment of motor symptoms of PD is mainly aimed at correcting the action of dopamine. At the same time, more than 40% of people receiving oral dopamine agonists experience social behavior control disorders. Individuals who stop taking dopamine agonists experience withdrawal symptoms in 15-20% of cases [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].

Симптоматическое лечение немоторных симптомов БП аналогично лечению этих симптомов в общей популяции. Прием антихолинергических препаратов, таких как тригексифенидил и бензтропин, может быть связан с различными побочными эффектами, включая когнитивные нарушения, спутанность сознания, галлюцинации, нечеткость зрения, сухость во рту, запор и задержка мочи [Jankovic J., Tan Е.К. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808]. Бензодиазепины способствуют улучшению сна или снижению тревоги, но могут ухудшить когнитивные функции [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].Symptomatic treatment of non-motor symptoms of PD is similar to the treatment of these symptoms in the general population. Taking anticholinergic drugs such as trihexyphenidyl and benztropine may be associated with various side effects, including cognitive impairment, confusion, hallucinations, blurred vision, dry mouth, constipation and urinary retention [Jankovic J., Tan E.K. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808]. Benzodiazepines help improve sleep or reduce anxiety, but may impair cognitive function [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].

Несмотря на то, что в настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании этиопатогенеза БП и его симптоматическом лечении, до сих пор не существует эффективных нейропротективных или модифицирующих болезнь методов терапии, которые могли бы замедлить прогрессирование заболевания [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560; Jankovic J., Tan E.K. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808]. В связи с этим, активно проводятся исследования потенциальных протекторов, способных замедлить развитие БП, в том числе посредством торможения окислительного стресса [Chang К-Н., Chen С-М. The Role of Oxidative Stress in Parkinson's Disease. Antioxidants. 2020; 9(7):597].Despite the fact that significant progress has been made in understanding the etiopathogenesis of PD and its symptomatic treatment, there are still no effective neuroprotective or disease-modifying therapies that could slow the progression of the disease [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560; Jankovic J., Tan E.K. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808]. In this regard, research is being actively conducted on potential protectors that can slow down the development of PD, including through inhibition of oxidative stress [Chang K-N., Chen C-M. The Role of Oxidative Stress in Parkinson's Disease. Antioxidants. 2020; 9(7):597].

Задача, на решение которой направлено данное изобретение, заключается в снижении в тканях головного мозга интенсивности свободнорадикального окисления, которое является ключевым фактором прогрессирования БП. В данном приложении хинолин и его производные привлекают внимание благодаря своим разнообразным химическим и фармакологическим свойствам. Хинолиновая группировка встречается в различных природных соединениях, особенно в алкалоидах, и часто используется для дизайна многих синтетических соединений с разнообразными фармакологическими свойствами. Для синтезированных хинолиновых производных были показаны противораковая, антимикозная, антимикробная, противосудорожная, противовоспалительная и кардиопротекторная активность [Kumar S., Bawa S., Gupta H. Biological activities of quinoline derivatives. Mini Rev Med Chem. 2009; 9(14): 1648-1654].The problem to be solved by this invention is to reduce the intensity of free radical oxidation in brain tissues, which is a key factor in the progression of PD. In this application, quinoline and its derivatives are attracting attention due to their diverse chemical and pharmacological properties. The quinoline moiety occurs in various natural compounds, especially alkaloids, and is often used in the design of many synthetic compounds with diverse pharmacological properties. For the synthesized quinoline derivatives, anticancer, antimycotic, antimicrobial, anticonvulsant, anti-inflammatory and cardioprotective activity was shown [Kumar S., Bawa S., Gupta H. Biological activities of quinoline derivatives. Mini Rev Med Chem. 2009; 9(14): 1648-1654].

Многие из новых синтезированных хинолиновых соединений представляют интерес в связи с наличием антиоксидантных свойств. Исследования показывают, что наличие таких заместителей, как CF3, ОСН3, СН3 и галогенов на хинолиновом кольце играет важную роль в проявлении антиоксидантной активности [Orhan Piiskullii М., Tekiner В., Suzen S. Recent studies of antioxidant quinoline derivatives. Mini Rev Med Chem. 2013; 13(3): 365-372].Many of the newly synthesized quinoline compounds are of interest due to their antioxidant properties. Studies show that the presence of substituents such as CF3, OCH3, CH3 and halogens on the quinoline ring plays an important role in the manifestation of antioxidant activity [Orhan Piiskullii M., Tekiner B., Suzen S. Recent studies of antioxidant quinoline derivatives. Mini Rev Med Chem. 2013; 13(3): 365-372].

Одним из производных хинолина является 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (гидрокси-ТГХ) - структурный аналог 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,-дигидрохинолина, для которого ранее была показана антиоксидантная и нейропротекторная активность при ишемии/реперфузии головного мозга [Kryl'skii E.D., Chupandina Е.Е., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Mittova V.O., Popov S.S., Verevkin A.N., Filin A.A. Neuroprotective effect of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2-dihydroquinoline mediated via regulation of antioxidant system and inhibition of inflammation and apoptosis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. Biochimie. 2021; 186: 130-146]. Авторами данной работы раскрывается способ снижения параметров интенсивности свободнорадикального окисления в мозге и сыворотке крови животных путем введения 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2-дигидрохинолина в физиологическом растворе в дозе 50 мг/кг массы тела в течение трех дней. Однако протекторные свойства соединения были продемонстрированы на модели ишемии/реперфузии головного мозга, а подтверждения о положительном влиянии данного вещества на моторно-координационные показатели не приводится. Кроме того, гидрокси-ТГХ по сравнению с 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,-дигидрохинолином имеет более гидрированное гетероциклическое кольцо, что увеличило число вариантов конформации молекулы и способствовало лучшему ее проникновению через биологические барьеры.One of the quinoline derivatives is 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline (hydroxy-THC) - a structural analogue of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2, -dihydroquinoline, for which antioxidant and neuroprotective activity was previously shown during cerebral ischemia/reperfusion [Kryl'skii E.D., Chupandina E.E., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Mittova V.O., Popov S.S., Verevkin A.N., Filin A.A. Neuroprotective effect of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2-dihydroquinoline mediated via regulation of antioxidant system and inhibition of inflammation and apoptosis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. biochemie. 2021; 186: 130-146]. The authors of this work disclose a method for reducing the parameters of the intensity of free radical oxidation in the brain and blood serum of animals by introducing 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2-dihydroquinoline in saline at a dose of 50 mg/kg of body weight for three days . However, the protective properties of the compound have been demonstrated in a model of cerebral ischemia/reperfusion, and no evidence of a positive effect of this substance on motor-coordination parameters has been provided. In addition, hydroxy-THC, compared to 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2,-dihydroquinoline, has a more hydrogenated heterocyclic ring, which increased the number of conformational variants of the molecule and contributed to its better penetration through biological barriers.

Известен способ снижения степени развития окислительного стресса при БП, заключающийся в пероральном приеме пациентами N-ацетилцистеина в дозе 6000 мг в день, на протяжении 4 недель. Прием данного соединения способствовал улучшению активности каталазы, однако содержание продуктов пероксидного окисления липидов и уровень восстановленного глутатиона не изменялись [Coles, L.D., Tuite, P.J., Oz, G., Mishra, U.R., Kartha, R.V., Sullivan, K.M., Cloyd, J.C. and Terpstra, M. (2018), Repeated-Dose Oral N-Acetylcysteine in Parkinson's Disease: Pharmacokinetics and Effect on Brain Glutathione and Oxidative Stress. The Journal of Clinical Pharmacology, 58: 158-167]. Внутрибрюшинное введение эллаговой кислоты в дозе 10 мг/кг, один раз в день, на протяжении 1 недели мышам с экспериментальной БП приводило к снижению концентрации продуктов пероксидного окисления липидов и нормализации активности ряда антиоксидантных ферментов. В то же время, полученные результаты не были подтверждены поведенческо-координационными тестами [Ardah МТ, Bharathan G, Kitada Т, Haque ME. Ellagic Acid Prevents Dopamine Neuron Degeneration from Oxidative Stress and Neuroinflammation in MPTP Model of Parkinson's Disease. Biomolecules. 2020; 10(11):1519].A known method of reducing the degree of development of oxidative stress in PD, which consists in oral administration of N-acetylcysteine by patients at a dose of 6000 mg per day for 4 weeks. The intake of this compound improved the activity of catalase, however, the content of lipid peroxidation products and the level of reduced glutathione did not change [Coles, L.D., Tuite, P.J., Oz, G., Mishra, U.R., Kartha, R.V., Sullivan, K.M., Cloyd, J.C. and Terpstra, M. (2018), Repeated-Dose Oral N-Acetylcysteine in Parkinson's Disease: Pharmacokinetics and Effect on Brain Glutathione and Oxidative Stress. The Journal of Clinical Pharmacology, 58: 158-167]. Intraperitoneal administration of ellagic acid at a dose of 10 mg/kg once a day for 1 week to mice with experimental PD led to a decrease in the concentration of lipid peroxidation products and normalization of the activity of a number of antioxidant enzymes. At the same time, the results obtained were not confirmed by behavioral-coordination tests [Ardah MT, Bharathan G, Kitada T, Haque ME. Ellagic Acid Prevents Dopamine Neuron Degeneration from Oxidative Stress and Neuroinflammation in MPTP Model of Parkinson's Disease. biomolecules. 2020; 10(11):1519].

Наиболее близким по совокупности признаков к заявленному изобретению является способ, заключающийся в пероральном приеме 1 мг разагилина на вес тела человека в сутки. Разагилин представляет из себя селективный ингибитор моноаминоксидазы В, благодаря чему способствует повышению уровня дофамина и снижению интенсивности образования свободных радикалов в ходе его метаболизма. Вместе с тем, данный препарат обладает обширным спектром побочных действий и может вызывать серотониновый синдром при взаимодействии с рядом лекарственных средств [Hayes М.Т. Parkinson's Disease and Parkinsonism. Am J Med. 2019;1 32(7): 802-807].The closest in terms of the totality of features to the claimed invention is a method consisting in oral administration of 1 mg of rasagiline per human body weight per day. Rasagiline is a selective inhibitor of monoamine oxidase B, which helps to increase the level of dopamine and reduce the formation of free radicals during its metabolism. However, this drug has a wide range of side effects and can cause serotonin syndrome when interacting with a number of drugs [Hayes M.T. Parkinson's Disease and Parkinsonism. Am J Med. 2019;1 32(7): 802-807].

Технический результат заключается в снижении показателей свободнорадикального окисления у крыс с экспериментальной болезнью Паркинсона под действием 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина, выражающееся в уменьшении концентрации диеновых конъюгатов в сыворотке крови и мозге в 1,7 и 1,6 раза по сравнению с группой животных, которым моделировали болезнь Паркинсона, соответственно, в восстановлении активности аконитатгидратазы до значений контрольной группы и изменении содержания лимонной кислоты в направлении значений контрольной группы; технический результат также заключается в улучшении моторно-координационных показателей, состоящем в возрастании силы хвата на 64% и баллов, набранных в тесте прохода по перекладине, в 7,3 раза, сокращении времени отклеивания бирки в 2,1 раза по сравнению с группой животных, которым моделировали болезнь Паркинсона.The technical result is to reduce the free radical oxidation in rats with experimental Parkinson's disease under the influence of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline, which is expressed in a decrease in the concentration of diene conjugates in the blood serum and brain in 1.7 and 1.6 times compared with the group of animals, which simulated Parkinson's disease, respectively, in the restoration of the activity of aconitate hydratase to the values of the control group and the change in the content of citric acid in the direction of the values of the control group; the technical result also consists in an improvement in motor-coordination indicators, consisting in an increase in grip strength by 64% and points scored in the test of passing along the crossbar by 7.3 times, a reduction in the time for peeling off the tag by 2.1 times compared to the group of animals, who modeled Parkinson's disease.

Технический результат достигается тем, что в способе коррекции оксидативного статуса при болезни Паркинсона в эксперименте, включающем введение вещества, обладающего нейропротекторной активностью, однократно в сутки, согласно изобретению, используют внутрибрюшинное введение на протяжении 10 дней 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина в дозе 50 мг/кг массы тела крыс в виде водного раствора, содержащего 0,9 масс. % хлорида натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, из расчета 0,5 мл раствора на 0,2 кг массы тела животного.The technical result is achieved by the fact that in the method for correcting the oxidative status in Parkinson's disease in the experiment, including the introduction of a substance with neuroprotective activity, once a day, according to the invention, intraperitoneal administration for 10 days of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl -1,2,3,4-tetrahydroquinoline at a dose of 50 mg/kg body weight in rats in the form of an aqueous solution containing 0.9 wt. % sodium chloride and 5 vol. % dimethyl sulfoxide, at the rate of 0.5 ml of solution per 0.2 kg of animal body weight.

ПримерExample

Гидрокси-ТГХ синтезировали дезалкилированием 6-этокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина при действии бромоводородной кислоты по известной методике [Иванов Ю.А., Зайченко Н.Л., Рыков С.В., Гринберг О.Я., Дубинский А.А., Пирожков С.Д., Розанцев Е.Г., Покровская И.Е., Шапиро А.Б. // Синтез окси-, ацилокси, оксо-, N-окисей оксо- и морфолиллоксопроизводныхгидрированных хинолинов и изучение их радикальных аналогов методом ЭПР / Изв. АН СССР, Сер. хим. - 1979. - Т. 8 - С. 1800-1807] (выход 76%, Т_пл=186-187°С; лит. выход 55%, Т_пл=184-186°С).Hydroxy-THC was synthesized by dealkylation of 6-ethoxy-2,2,4-trimethyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline under the action of hydrobromic acid according to a known method [Ivanov Yu.A., Zaichenko N.L., Rykov S.V. ., Grinberg O.Ya., Dubinsky A.A., Pirozhkov S.D., Rozantsev E.G., Pokrovskaya I.E., Shapiro A.B. // Synthesis of hydroxy-, acyloxy, oxo-, N-oxides of oxo- and morpholyloxo derivatives of hydrogenated quinolines and the study of their radical analogs by the EPR method / Izv. USSR Academy of Sciences, Ser. chem. - 1979. - T. 8 - S. 1800-1807] (yield 76%, T _pl =186-187°C; lit. yield 55%, T _pl =184-186°C).

Для получения технического результата использовали крыс-самцов возрастом 4-6 месяцев и массой 200-250 г, содержащиеся при 12-часовом световом дне и доступе к еде и пище ad libitum. Работа выполнялась с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации. Моделирование БП осуществляли путем подкожного введения крысам ротенона в дозе 2,5 мг/кг массы тела крысы однократно в сутки в виде раствора, из расчета 100 мкл инъекции на 0,1 кг массы тела животного, на протяжении 10 дней. Ротенон растворяли в смеси, содержащей 98 об. % очищенного оливкового масла и 2 об. % диметилсульфоксида [Ablat N., Lv D., Ren R., Xiaokaiti Y., Ma X., Zhao X., Sun Y., Lei H., Xu J., Ma Y., Qi X., Ye M., Xu F., Han H., Pu X. Neuroprotective Effects of a Standardized Flavonoid Extract from Safflower against a Rotenone-Induced Rat Model of Parkinson's Disease. Molecules. 2016; 21 (9): 1107]. Животные были случайным образом разделены на 4 экспериментальные группы численностью в 12 особей. 1-ю (контрольную) группу составляли животные, которые получали 1 раз в сутки на протяжении 10 дней инъекции носителя, содержащего 98 об. % очищенного оливкового масла и 2 об. % диметилсульфоксида, в объеме 100 мкл инъекции на 0,1 кг массы тела животного, подкожно; во 2-ю группу входили крысы, которым моделировали БП; 3-ю группу составляли крысы, которые параллельно с подкожным введением однократно в сутки, на протяжении 10 дней ротенона в дозе 2,5 мг/кг массы тела крысы, растворенного в смеси, содержащей 98 об. % очищенного оливкового масла и 2 об. % диметилсульфоксида, в объеме 100 мкл инъекции на 0,1 кг массы тела животного, получали однократно в сутки на протяжении 10 дней внутрибрюшинные инъекции, из расчета 0,5 мл на 0,2 кг массы тела животного, в виде водного раствора, содержащего гидрокси-ТГХ в дозе 50 мг/кг массы тела животного, 0,9 масс. % хлорида натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, за один час до введения ротенона; крысам 4-й группы вместе с подкожным введением однократно в сутки, на протяжении 10 дней ротенона в дозе 2,5 мг/кг массы тела крысы, растворенного в смеси, содержащей 98 об. % очищенного оливкового масла и 2 об. % диметилсульфоксида, в объеме 100 мкл инъекции на 0,1 кг массы тела животного, в течение 10 дней за один час до администрации ротенона вводили внутрибрюшинно разагилин. Препарат разагилин вводился однократно в сутки из расчета 0,5 мл на 0,2 кг массы тела животного, в виде водного раствора, содержащего 0,9 масс. % хлорида натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, в дозировке, указанной в инструкции к применению [https://www.vidal.ru/drugs/rasagiline-medisorb. Дата обращения: 10.03.2023], скорректированной на вес тела животных с учетом коэффициента пересчета - 0,09 мг/кг [Доклиническое изучение лекарственных средств (промышленная фармация): [учебник для студентов высших учебных заведений] / Ж. И. Аладышева, В. В. Береговых, Н. Н. Вольхин [и др.]; редакторы: А. Л. Хохлов, Н. В. Пятигорская; Российская академия наук. - Москва: Группа Ремедиум, 2021. - 395 с.: цв. ил., табл.; 25 см.; ISBN 978-5-906499-72-1].To obtain a technical result, male rats aged 4-6 months and weighing 200-250 g were used, kept at 12-hour daylight hours and with access to food and food ad libitum. The work was carried out in accordance with the principles of humanity set out in the European Community Directives (86/609/EEC) and the Declaration of Helsinki. Modeling of PD was carried out by subcutaneous administration of rotenone to rats at a dose of 2.5 mg/kg of rat body weight once a day in the form of a solution, at the rate of 100 μl of injection per 0.1 kg of animal body weight, for 10 days. Rotenone was dissolved in a mixture containing 98 vol. % refined olive oil and 2 vol. % dimethyl sulfoxide [Ablat N., Lv D., Ren R., Xiaokaiti Y., Ma X., Zhao X., Sun Y., Lei H., Xu J., Ma Y., Qi X., Ye M. , Xu F., Han H., Pu X. Neuroprotective Effects of a Standardized Flavonoid Extract from Safflower against a Rotenone-Induced Rat Model of Parkinson's Disease. Molecules. 2016; 21 (9): 1107]. Animals were randomly divided into 4 experimental groups of 12 individuals. The 1st (control) group consisted of animals that received 1 time per day for 10 days of injection of a carrier containing 98 vol. % refined olive oil and 2 vol. % dimethyl sulfoxide, in a volume of 100 μl of injection per 0.1 kg of animal body weight, subcutaneously; the 2nd group included rats that were modeled with PD; The 3rd group consisted of rats, which, in parallel with subcutaneous administration once a day, for 10 days, rotenone at a dose of 2.5 mg/kg of rat body weight, dissolved in a mixture containing 98 vol. % refined olive oil and 2 vol. % of dimethyl sulfoxide, in a volume of 100 μl of injection per 0.1 kg of animal body weight, received intraperitoneal injections once a day for 10 days, at the rate of 0.5 ml per 0.2 kg of animal body weight, in the form of an aqueous solution containing hydroxy -THC at a dose of 50 mg/kg of animal body weight, 0.9 wt. % sodium chloride and 5 vol. % dimethyl sulfoxide, one hour before the introduction of rotenone; rats of the 4th group, together with subcutaneous administration once a day, for 10 days, rotenone at a dose of 2.5 mg/kg of rat body weight, dissolved in a mixture containing 98 vol. % refined olive oil and 2 vol. % dimethyl sulfoxide, in a volume of 100 μl of injection per 0.1 kg of animal body weight, rasagiline was administered intraperitoneally for 10 days one hour before the administration of rotenone. The drug rasagiline was administered once a day at the rate of 0.5 ml per 0.2 kg of animal body weight, in the form of an aqueous solution containing 0.9 wt. % sodium chloride and 5 vol. % dimethyl sulfoxide, at the dosage indicated in the instructions for use [https://www.vidal.ru/drugs/rasagiline-medisorb. Date of access: 03/10/2023], adjusted for body weight of animals, taking into account the conversion factor - 0.09 mg / kg [Preclinical study of drugs (industrial pharmacy): [textbook for students of higher educational institutions] / Zh. I. Aladysheva, V V. Beregovykh, N. N. Volkhin [and others]; editors: A. L. Khokhlov, N. V. Pyatigorskaya; The Russian Academy of Sciences. - Moscow: Remedium Group, 2021. - 395 p.: color. ill., tab.; 25 cm; ISBN 978-5-906499-72-1].

Дозировка гидрокси-ТГХ была взята на основе предыдущих исследований, продемонстрировавших нейропротекторную эффективность структурных аналогов данного соединения [Kryl'skii E.D., Chupandina Е.Е., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Mittova V.O., Popov S.S., Verevkin A.N., Filin A.A. Neuroprotective effect of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l,2-dihydroquinoline mediated via regulation of antioxidant system and inhibition of inflammation and apoptosis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. Biochimie. 2021; 186: 130-146; Kryl'skii E.D., Chupandina E.E., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Medvedeva S.M., Verevkin A.N., Popov S.S.,Mittova V.O. l-benzoyl-6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l,2-dihydroquinoline exerts a neuroprotective effect and normalises redox homeostasis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. Metab Brain Dis. 2022; 37(4): 1271-1282]. Через 24 часа после последней инъекции у крыс анализировали моторные показатели, после чего умерщвляли и забирали исследуемый материал.The dosage of hydroxy-THC was taken on the basis of previous studies that demonstrated the neuroprotective efficacy of structural analogs of this compound [Kryl'skii E.D., Chupandina E.E., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Mittova V.O., Popov S.S., Verevkin A.N., Filin A.A. Neuroprotective effect of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l,2-dihydroquinoline mediated via regulation of antioxidant system and inhibition of inflammation and apoptosis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. biochemie. 2021; 186:130-146; Kryl'skii E.D., Chupandina E.E., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Medvedeva S.M., Verevkin A.N., Popov S.S., Mittova V.O. l-benzoyl-6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l,2-dihydroquinoline exerts a neuroprotective effect and normalises redox homeostasis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. Metab BrainDis. 2022; 37(4): 1271-1282]. 24 hours after the last injection, motor parameters were analyzed in rats, after which they were sacrificed and the test material was taken.

Для оценки моторики и координации животных применялись следующие тесты: 1) удерживая крысу, ей давали зацепиться передними лапками за скобу электронных весов. Весы оттягивали и регистрировали максимальную величину показателя [Sharma S., Kumar P., Deshmukh R. Neuroprotective potential of spermidine against rotenone induced Parkinson's disease in rats. Neurochemistry International. 2018; 116: 104-111]. 2) животное помещали в прозрачную клетку и наклеивали на голову кусочек липкой бумаги. Регистрировали время, за которое крыса воспримет раздражитель и снимет бумагу с головы [Park H.J., Lee Р.Н., Bang O.Y., Lee G., Ann Y.H. Mesenchymal stem cells therapy exerts neuroprotection in a progressive animal model of Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 2008; 107(1): 141-151]. 3) Крысы ходили по деревянной балке, подвешенной между стартовой платформой и домашней клеткой на высоте 50 см. Соскальзывание лапок оценивалось по 6-бальной системе следующим образом: 0 - крыса не смогла удержаться на перекладине; 1 - крыса не двигалась, но смогла удержаться на перекладине; 2 - крыса пыталась преодолеть перекладину, но упала; 3 - крыса преодолела перекладину, но задние конечности волочились; 4 - крыса преодолела перекладину с несколькими соскальзываниями лап (более 3); 5 -крыса преодолела перекладину с 1-3 соскальзыванием задней конечности; 6 -крыса преодолела перекладину без соскальзываний конечности [Miyanishi К., Choudhury М.Е., Watanabe М., Kubo М., Nomoto М., Yano Н., Tanaka J. Behavioral tests predicting striatal dopamine level in a rat hemi-Parkinson's disease model. Neurochem Int. 2019; 122: 38-46]. Все тесты проводили в трехкратной повторности, брали среднее значение показателей.The following tests were used to assess the motility and coordination of the animals: 1) while holding the rat, it was allowed to hook its forepaws on the bracket of an electronic scale. Scales delayed and recorded the maximum value of the indicator [Sharma S., Kumar P., Deshmukh R. Neuroprotective potential of spermidine against rotenone induced Parkinson's disease in rats. Neurochemistry International. 2018; 116: 104-111]. 2) the animal was placed in a transparent cage and a piece of sticky paper was glued to the head. The time during which the rat perceives the stimulus and removes the paper from the head was recorded [Park H.J., Lee P.N., Bang O.Y., Lee G., Ann Y.H. Mesenchymal stem cells therapy renders neuroprotection in a progressive animal model of Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 2008; 107(1): 141-151]. 3) The rats walked on a wooden beam suspended between the starting platform and the home cage at a height of 50 cm. Leg slippage was evaluated on a 6-point scale as follows: 0 - the rat could not stay on the crossbar; 1 - the rat did not move, but was able to stay on the crossbar; 2 - the rat tried to overcome the crossbar, but fell; 3 - the rat overcame the crossbar, but the hind limbs dragged; 4 - the rat overcame the crossbar with several paw slips (more than 3); 5 - the rat overcame the crossbar with 1-3 sliding of the hind limb; 6 - the rat overcame the crossbar without slipping of the limb [Miyanishi K., Choudhury M.E., Watanabe M., Kubo M., Nomoto M., Yano N., Tanaka J. Behavioral tests predicting striatal dopamine level in a rat hemi-Parkinson's disease model. Neurochem Int. 2019; 122: 38-46]. All tests were performed in triplicate, taking the average value of the indicators.

Для анализа концентрации диеновых конъюгатов (ДК) к исследуемому образцу добавляли гептан и изопропанол, перемешивали и осаждали центрифугированием при 3000g. Гептановую фазу супернатанта разбавляли этанолом и анализировали спектрофотометрически при 233 нм [Recknagel R.O., Ghoshal А.К. Lipoperoxidation of rat liver microsomal lipids induced by carbon tetrachloride. Nature. 1966; 210: 1162-1163]. Активность аконитатгидратазы (АГ) оценивали в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,8), содержащем 4 мМ цитрата натрия ("PanReac", Spain). Концентрацию лимонной кислоты оценивали по методу Нательсона [Афанасьев В.Г., Зайцев B.C., Вольфсон Т.И. // Лаб. дело. 1973; 4: 115-116]. Содержание белка анализировали биуретовым методом.To analyze the concentration of diene conjugates (DC), heptane and isopropanol were added to the test sample, mixed, and precipitated by centrifugation at 3000g. The heptane phase of the supernatant was diluted with ethanol and analyzed spectrophotometrically at 233 nm [Recknagel R.O., Ghoshal A.K. Lipoperoxidation of rat liver microsomal lipids induced by carbon tetrachloride. Nature. 1966; 210: 1162-1163]. The activity of aconitate hydratase (AH) was assessed in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 4 mM sodium citrate (PanReac, Spain). The concentration of citric acid was assessed by the Natelson method [Afanasiev V.G., Zaitsev B.C., Wolfson T.I. // Lab. case. 1973; 4: 115-116]. The protein content was analyzed by the biuret method.

Результаты исследований обрабатывали с применением дисперсионного анализа ANOVA. Различия считали достоверными при р<0,05. Все количественные данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.The results of the studies were processed using ANOVA analysis of variance. Differences were considered significant at p<0.05. All quantitative data are presented as mean ± standard deviation.

На фиг.1 приведена таблица, показывающая воздействие 6-гидроксй-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина на координационные показатели и параметры оксидативного статуса у крыс с экспериментальной болезнью Паркинсона, где * - р<0,05 по сравнению с контролем; # - р<0,05 по сравнению с БП; ^∧ - р<0,05 по сравнению с БП+разагилинFigure 1 shows a table showing the effect of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline on the coordination parameters and parameters of the oxidative status in rats with experimental Parkinson's disease, where * - p<0 .05 compared to control; # - p<0.05 compared to BP; ^∧ - p<0.05 compared to BP + rasagiline

Результаты работы показали, что у крыс с экспериментальной БП наблюдалось развитие моторно-координационных нарушений, о чем свидетельствовало увеличение времени, затрачиваемого на отклеивание бирки с головы, а также снижение силы хвата и баллов, набранных в тесте прохода по перекладине (фиг.1). Кроме этого, в сыворотке крови и мозге крыс с БП наблюдалось возрастание концентрации ДК - первичных продуктов пероксидного окисления липидов, и снижение активности АГ, являющейся чувствительной мишенью для действия АФК [Матасова Л.В., Попова Т.Н. Аконитаза млекопитающих при окислительном стрессе. Биохимия. 2008; 73(9): 1189-1198]. Угнетение активности АГ сопровождалось накоплением субстрата данного фермента - лимонной кислоты, способной снижать интенсивность образования АФК путем хелатирования ионов металлов переменной валентности [Бражникова Д. А., Попова Т. Н., Крыльский Е. Д., Шульгин К. К., Матасова Л. В., Шихалиев X. С, Попов С.С. Воздействие 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2-дигидро-хинолина на интенсивность свободнорадикальных процессов и активность ферментов окислительного метаболизма при токсическом поражении печени у крыс.Биомедицинская химия. 2019; 65(4): 331-338]. Введение гидрокси-ТГХ крысам с БП приводило к возрастанию силы хвата на 64% и баллов, набранных в тесте прохода по перекладине, в 7,3 раза, по сравнению с группой животных с патологией. Время отклеивания бирки при этом сократилось в 2,1 раза. На моторно-координационные показатели гидрокси-ТГХ оказывал достоверно более существенное воздействие, чем разагилин.The results of the work showed that in rats with experimental PD, the development of motor-coordination disorders was observed, as evidenced by an increase in the time spent on peeling off the tag from the head, as well as a decrease in grip strength and points scored in the crossbar test (figure 1). In addition, in the blood serum and brain of rats with PD, there was an increase in the concentration of DC - the primary products of lipid peroxidation, and a decrease in the activity of AG, which is a sensitive target for the action of ROS [Matasova L.V., Popova T.N. Mammalian aconitase under oxidative stress. Biochemistry. 2008; 73(9): 1189-1198]. The inhibition of AG activity was accompanied by the accumulation of the substrate of this enzyme - citric acid, which can reduce the intensity of ROS formation by chelating metal ions of variable valence [Brazhnikova D. A., Popova T. N., Krylsky E. D., Shulgin K. K., Matasova L. V., Shikhaliev Kh.S., Popov S.S. The effect of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2-dihydro-quinoline on the intensity of free radical processes and the activity of oxidative metabolism enzymes in toxic liver damage in rats. Biomedical chemistry. 2019; 65(4): 331-338]. The administration of hydroxy-THC to rats with PD led to an increase in grip strength by 64% and a 7.3-fold increase in points scored in the crossbar test compared to the group of animals with pathology. At the same time, the tag peeling time was reduced by 2.1 times. Hydroxy-THC had a significantly more significant effect on motor-coordination parameters than rasagiline.

Введение гидрокси-ТГХ крысам с БП приводило к уменьшению концентрации ДК в сыворотке крови и мозге в 1,7 и 1,6 раза, в то время как использование разагилина способствовало снижению данного показателя на 17 и 10% относительно животных с патологией. Наряду с этим, под действием гидрокси-ТГХ у крыс с БП наблюдалось восстановление активности АГ и изменение содержания лимонной кислоты в направлении контрольных значений. Введение разагилина приводило к увеличению активности АГ выше контрольных значений, а также снижению концентрации лимонной кислоты ниже контроля. По-видимому, наблюдаемые изменения были связаны со специфическим активирующим действием препарата на фермент.Известно, что разагилин способен влиять на экспрессию широкого ряда генов. Так, было показано, что инкубация клеток нейробластомы SH-SY5Y с разагилином приводила, помимо прочего, к увеличению мРНК генов, вовлеченных в синтез АТФ - цитохром с оксидазы, NADH-оксидоредуктазы, АТФ синтазы и АГ [Naoi М., Maruyama W., Yi Н., Akao Y., Yamaoka Y., Shamoto-Nagai M. Neuroprotection by propargylamines in Parkinson's disease: intracellular mechanism underlying the anti-apoptotic function and search for clinical markers. J Neural Transm. 2007; Suppl 72: 121-131].The administration of hydroxy-THC to rats with PD led to a decrease in the concentration of DC in the blood serum and brain by 1.7 and 1.6 times, while the use of rasagiline contributed to a decrease in this indicator by 17 and 10% relative to animals with pathology. Along with this, under the action of hydroxy-THC in rats with PD, restoration of AG activity and a change in the content of citric acid in the direction of control values were observed. The introduction of rasagiline led to an increase in AG activity above the control values, as well as a decrease in the concentration of citric acid below the control. Apparently, the observed changes were associated with the specific activating effect of the drug on the enzyme. It is known that rasagiline is able to influence the expression of a wide range of genes. Thus, it was shown that the incubation of SH-SY5Y neuroblastoma cells with rasagiline led, among other things, to an increase in the mRNA of genes involved in the synthesis of ATP - cytochrome c oxidase, NADH-oxidoreductase, ATP synthase and AG [Naoi M., Maruyama W., Yi H, Akao Y, Yamaoka Y, Shamoto-Nagai M. Neuroprotection by propargylamines in Parkinson's disease: intracellular mechanism underlying the anti-apoptotic function and search for clinical markers. J Neural Transm. 2007; Suppl 72: 121-131].

Получаемый при осуществлении изобретения результат заключался в снижении показателей свободнорадикального окисления под действием гидрокси-ТГХ, что сопровождалось улучшением моторно-координационных показателей у крыс с экспериментальной БП. По отношению к тестируемым параметрам гидрокси-ТГХ оказался более эффективным, чем разагилин. Полученные данные представляют интерес для разработки новых способов коррекции нарушений обмена веществ при БП.The result obtained in the implementation of the invention consisted in a decrease in free radical oxidation under the action of hydroxy-THC, which was accompanied by an improvement in motor-coordination parameters in rats with experimental PD. In relation to the parameters tested, hydroxy-THC was found to be more effective than rasagiline. The data obtained are of interest for the development of new methods for correcting metabolic disorders in PD.

Claims (1)

Способ коррекции оксидативного статуса при болезни Паркинсона в эксперименте, включающий введение вещества, обладающего нейропротекторной активностью, однократно в сутки, отличающийся тем, что используют внутрибрюшинное введение на протяжении 10 дней 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина в дозе 50 мг/кг массы тела крыс в виде водного раствора, содержащего 0,9 масс. % хлорида натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, из расчета 0,5 мл раствора на 0,2 кг массы тела животного.A method for correcting the oxidative status in Parkinson's disease in an experiment, including the administration of a substance with neuroprotective activity once a day, characterized in that intraperitoneal administration for 10 days of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2,3 is used ,4-tetrahydroquinoline at a dose of 50 mg/kg body weight in rats in the form of an aqueous solution containing 0.9 wt. % sodium chloride and 5 vol. % dimethyl sulfoxide, at the rate of 0.5 ml of solution per 0.2 kg of animal body weight.

Images