RU2799454C2 - Therapeutic drug for the treatment of neurodegenerative diseases and its use - Google Patents
Therapeutic drug for the treatment of neurodegenerative diseases and its use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799454C2 RU2799454C2 RU2020128178A RU2020128178A RU2799454C2 RU 2799454 C2 RU2799454 C2 RU 2799454C2 RU 2020128178 A RU2020128178 A RU 2020128178A RU 2020128178 A RU2020128178 A RU 2020128178A RU 2799454 C2 RU2799454 C2 RU 2799454C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- compound
- neurodegenerative diseases
- formula
- pharmaceutically acceptable
- diseases characterized
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к фармацевтической области, а именно, к новым терапевтическим препаратам, применяемых при лечении нейродегенеративных заболеваний.The present invention relates to the pharmaceutical field, namely, to new therapeutic drugs used in the treatment of neurodegenerative diseases.
Уровень техники State of the art
Нейродегенеративные заболевания относятся к общей группе заболеваний, вызванных хронической прогрессирующей нейродегенерацией центральной нервной ткани. К таким заболеваниям относятся Болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Хантингтона (БГ), боковой амиотрофический склероз (БАС) и др.Neurodegenerative diseases belong to the general group of diseases caused by chronic progressive neurodegeneration of the central nervous tissue. Such diseases include Parkinson's disease (PD), Alzheimer's disease (BA), Huntington's disease (HD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), etc.
Болезнь Альцгеймера, также известная как пресенильная деменция, является хроническим прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся прогрессирующим снижением способности к запоминанию, когнитивной дисфункцией и потерей способности к самостоятельному уходу за собой. Из года в год с увеличением числа стареющего населения заболеваемость БА растет, и среди вопросов здравоохранения БА стала самой важной проблемой для беспокойства в обществе. Alzheimer's disease, also known as presenile dementia, is a chronic, progressive neurodegenerative disease characterized by progressive memory loss, cognitive dysfunction, and loss of self-care ability. From year to year, with an increase in the aging population, the incidence of asthma is increasing, and among health issues, asthma has become the most important problem for concern in society.
Патология БА в первую очередь характеризуется наличием амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков. Амилоидные бляшки являются характерными признаками патологических изменений при болезни Альцгеймера и в основном образуются в результате внеклеточного накопления бета-амилоидного белка (Аβ), который вырабатывается в клетках в аномально большом количестве. В настоящее время существует ряд теорий, которые пытаются объяснить патогенетический механизм амилоидных бляшек. "Гипотеза Аβ", предложенная Харди и Селко, является широко принятой теорией. Эта теория предполагает, что под длительным воздействием сложных генетических и экологических факторов нервные клетки продуцируют аномально большое количество Аβ, которое накапливается с образованием олигомеров и амилоидных бляшек. Через серию каскадных реакций (включая реакцию свободных радикалов, митохондриальное окислительное повреждение, воспалительную реакцию и т.д.), Аβ (в частности, олигомеризованные Аβ) прямо или косвенно воздействуют на нейроны и глиальные клетки, приводя к синаптической дисфункции и повреждению нейронов, а также активируя клетки микроглии и астроцитов, что ускоряет образование нейрофибриллярных клубков и впоследствии приводит к когнитивным нарушениям. В последнее время большое количество исследований предоставляют различные доказательства в поддержку “гипотезы Аβ”, предполагающей центральную роль Аβ в патогенезе болезни Альцгеймера.The pathology of AD is primarily characterized by the presence of amyloid plaques and neurofibrillary tangles. Amyloid plaques are characteristic features of the pathological changes in Alzheimer's disease and are mainly formed as a result of extracellular accumulation of beta-amyloid protein (Aβ), which is produced in abnormally large amounts in cells. Currently, there are a number of theories that try to explain the pathogenetic mechanism of amyloid plaques. The "Aβ hypothesis" proposed by Hardy and Selko is a widely accepted theory. This theory suggests that, under long-term exposure to complex genetic and environmental factors, nerve cells produce abnormally large amounts of Aβ, which accumulate to form oligomers and amyloid plaques. Through a series of cascade reactions (including free radical reaction, mitochondrial oxidative damage, inflammatory response, etc.), Aβ (in particular, oligomerized Aβ) directly or indirectly affect neurons and glial cells, leading to synaptic dysfunction and neuronal damage, and also activating microglial and astrocyte cells, which accelerates the formation of neurofibrillary tangles and subsequently leads to cognitive impairment. Recently, a large number of studies have provided various evidence in support of the "Aβ hypothesis" suggesting a central role for Aβ in the pathogenesis of Alzheimer's disease.
Болезнь Паркинсона - это распространенное нейродегенеративное заболевание. Клинически оно в основном проявляется такими симптомами как: замедленная реакция, тремор, скованность тела и дальнейший дисбаланс. Исследования на мозговой ткани пациентов с БП показали, что у пациентов с этим заболеванием наблюдалась утрата дофаминергических нейронов в черной субстанции головного мозга. Тельца Леви являются одним из опознавательных признаков дегенерации нейронов при болезни Паркинсона. Исследования показали, что тела Леви образуются в тканях головного мозга пациентов с различными нейродегенеративными заболеваниями, в том числе болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, ДЛБ-болезнью (деменцией с тельцами Леви) и др. Кроме того, некоторые результаты исследований подтверждают, что трансплантация нервных стволовых клеток может способствовать лечению болезни Хантингтона и бокового амиотрофического склероза.Parkinson's disease is a common neurodegenerative disease. Clinically, it is mainly manifested by such symptoms as: delayed reaction, tremor, body stiffness and further imbalance. Studies on the brain tissue of patients with PD have shown that patients with this disease have a loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra of the brain. Lewy bodies are one of the hallmarks of neuronal degeneration in Parkinson's disease. Studies have shown that Lewy bodies are formed in the brain tissues of patients with various neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease, Parkinson's disease, DLB disease (dementia with Lewy bodies), etc. In addition, some research results confirm that nerve stem transplantation cells may contribute to the treatment of Huntington's disease and amyotrophic lateral sclerosis.
В головном мозге млекопитающих пролиферация и самообновление нервных стволовых клеток (нейральных клеток-предшественников, NPC) продолжаются на протяжении всей жизни, это необходимо для нейрогенеза. В условиях старения, длительного стресса и заболеваний нервной системы, таких как болезнь Альцгеймера (БА), способность нейронных стволовых клеток к пролиферации и самообновлению снижается, что приводит к нарушению когнитивных функций. Стимулирование нейрорегенерации считается потенциальным методом лечения нейродегенеративных заболеваний связанных со старением. Поэтому одним из возможных решений является трансплантация эмбриональных нейронных стволовых клеток или нейронных стволовых клеток, индуцированных in vitro, для клеточной заместительной терапии. Однако до сих пор существуют некоторые разногласия по поводу этой новой сложной технологии, особенно по вопросам безопасности, источникам этих клеток и т.д. Другим решением для достижения цели при лечении нейродегенеративного заболевания является активация эндогенных нервных стволовых клеток с помощью фармакологических средств. Фармакологические средства просты в эксплуатации и могут специфически воздействовать на определенные функции нервных стволовых клеток, и поэтому активация эндогенных нервных стволовых клеток является не только целесообразным подходом к лечению, но и может быть использована в качестве профилактического подхода. Однако специалистам в этой области все еще необходимо найти подходящее лекарственное средство, которое может лучше преодолевать барьеры in-vivo для эффективной активации эндогенных нервных стволовых клеток, чтобы добиться эффективного лечения.In the mammalian brain, neural stem cells (neural progenitor cells, NPCs) continue to proliferate and self-renewal throughout life, essential for neurogenesis. Under conditions of aging, prolonged stress and diseases of the nervous system, such as Alzheimer's disease (AD), the ability of neural stem cells to proliferate and self-renewal is reduced, which leads to impaired cognitive functions. Stimulation of neuroregeneration is considered a potential treatment for neurodegenerative diseases associated with aging. Therefore, one possible solution is the transplantation of embryonic neural stem cells or in vitro induced neural stem cells for cell replacement therapy. However, there is still some controversy about this new complex technology, especially on safety issues, the sources of these cells, etc. Another solution to achieve the goal in the treatment of neurodegenerative disease is the activation of endogenous neural stem cells using pharmacological agents. Pharmacological agents are easy to use and can specifically affect certain functions of neural stem cells, and therefore the activation of endogenous neural stem cells is not only a reasonable treatment approach, but can also be used as a preventive approach. However, those skilled in the art still need to find a suitable drug that can better overcome in-vivo barriers to effectively activate endogenous neural stem cells to achieve effective treatment.
Область настоящего изобретенияScope of the present invention
Задача настоящего изобретения заключается в обеспечении новых терапевтических препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и их применении.The aim of the present invention is to provide new therapeutic agents for the treatment of neurodegenerative diseases and their use.
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложено соединение формулы (I) или его изомер, сольват или предшественник, или их фармацевтически приемлемые соли,According to a first aspect of the present invention there is provided a compound of formula (I), or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof,
(I)(I)
где 
Y независимо выбирают из O и N;Y is independently selected from O and N;
когда Y представляет собой O, соединение находится в конфигурации β или представляет собой смесь конфигураций α и β в любом соотношении; и когда Y представляет N, соединение находится в конфигурации α, конфигурации β или представляет собой смесь конфигураций α и β в любом соотношении.when Y is O, the compound is in the β configuration or is a mixture of the α and β configurations in any ratio; and when Y is N, the compound is in the α configuration, the β configuration, or a mixture of the α and β configurations in any ratio.
Каждый из R1-R4 независимо выбирают из водорода, гидроксила, С1-С4-алкила, С2-С4-алкенила, С2-С4-алкинила и галогена, или из две смежные группы из R1-R4 связаны друг с другом с образованием кольцевой структуры совместно с основным кольцом.Each of R1-R4 is independently selected from hydrogen, hydroxyl, C1-C4 alkyl, C2-C4 alkenyl, C2-C4 alkynyl and halogen, or two adjacent groups of R1-R4 are bonded to each other to form a ring structure together with the main ring.
В предпочтительном варианте осуществления в соединении формулы (I) или его изомере, сольвате или предшественнике или их фармацевтически приемлемых солях каждый из R1-R4 независимо выбирают из водорода, гидроксила и алкила C1-C2.In a preferred embodiment, in a compound of formula (I) or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, each R1-R4 is independently selected from hydrogen, hydroxyl and C1-C2 alkyl.
В другом предпочтительном варианте осуществления соединение представляет собой
В другом предпочтительном варианте осуществления соединение представляет собой 
В другом предпочтительном варианте осуществления соединение представляет собой 
В другом предпочтительном варианте осуществления соединение не представляет собой 
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или изомера, сольвата или его предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения лекарственного средства или лекарственного средства в виде набора для профилактики, облегчения или лечения нейродегенеративных заболеваний, депрессии или инсульта.In another aspect, the present invention relates to the use of a compound of formula (I) or an isomer, a solvate or a precursor thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the preparation of a medicament or a kit medicament for the prevention, alleviation or treatment of neurodegenerative diseases, depression or stroke.
В предпочтительном варианте осуществления нейродегенеративными заболеваниями являются:In a preferred embodiment, the neurodegenerative diseases are:
нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся возникновением нейровоспаления в головном мозге; илиneurodegenerative diseases characterized by the occurrence of neuroinflammation in the brain; or
нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся значительным увеличением синтезируемого Аβ; илиneurodegenerative diseases characterized by a significant increase in the synthesized Aβ; or
нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся значительным снижением способности к обучению и запоминанию; илиneurodegenerative diseases characterized by a significant decrease in the ability to learn and remember; or
нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся снижением функционирования нервных стволовых клеток; илиneurodegenerative diseases characterized by a decrease in the functioning of neural stem cells; or
нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся снижением координационной способности движений; илиneurodegenerative diseases characterized by a decrease in the coordination ability of movements; or
нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся снижением количества дофаминергических нейронов в черной субстанции; илиneurodegenerative diseases characterized by a decrease in the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra; or
нейродегенеративные заболевания характеризуются снижением уровня стриатальных дофаминергических нервных волокон.neurodegenerative diseases are characterized by a decrease in the level of striatal dopaminergic nerve fibers.
В другом предпочтительном варианте осуществления возникновение нейровоспаления в головном мозге характеризуется значительным повышением экспрессии воспалительных факторов; воспалительными факторами являются, например, TNF-α и IL-1β.In another preferred embodiment, the occurrence of neuroinflammation in the brain is characterized by a significant increase in the expression of inflammatory factors; inflammatory factors are, for example, TNF-α and IL-1β.
В другом предпочтительном варианте осуществления, нейродегенеративные заболевания включают болезнь Альцгеймера, Болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви (DLB), болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз.In another preferred embodiment, neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia (DLB), Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или изомера, сольвата или его предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для ингибирования нейровоспаления.In another aspect, the present invention relates to the use of a compound of formula (I) or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for inhibiting neuroinflammation.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для улучшения функционирования нервных стволовых клеток.In another aspect, the present invention relates to the use of a compound of formula (I), or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for improving neural stem cell function.
В другом аспекте настоящее изобретение относится применению соединения формулы (I) или изомера, сольвата или его предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для снижения синтеза Aβ.In another aspect, the present invention relates to the use of a compound of formula (I) or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for reducing Aβ synthesis.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или изомера, сольвата или его предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для увеличения числа дофаминергических нейронов в черной субстанции.In another aspect, the present invention relates to the use of a compound of formula (I) or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for increasing the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для повышения уровня стриатальных дофаминергических нервных волокон.In another aspect, the present invention relates to the use of a compound of formula (I), or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for increasing striatal dopaminergic nerve fiber levels.
В другом предпочтительном варианте осуществления соединение представляет собой:In another preferred embodiment, the compound is:
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей: соединение формулы (I) или его изомер, сольват или предшественник, или их фармацевтически приемлемые соли; и фармацевтически приемлемый носитель.In another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising: a compound of formula (I) or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof; and a pharmaceutically acceptable carrier.
В предпочтительном варианте осуществления соединение формулы (I) или изомер, сольват или его предшественник, или их фармацевтически приемлемые соли находятся в эффективном количестве в фармацевтической композиции; предпочтительно, эффективное количество составляет 0,01% -50% по массе, например, но не ограничиваясь этим, 0,01%-5%, 0,03%-3%, 0,05%-1%, 20%-30%, и 40%-50% по массе; особенно предпочтительно 0,03%-30% по массе; в частности, 0,05%-10% по массе.In a preferred embodiment, a compound of formula (I) or an isomer, solvate or precursor thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is present in an effective amount in a pharmaceutical composition; preferably, the effective amount is 0.01%-50% by weight, for example, but not limited to 0.01%-5%, 0.03%-3%, 0.05%-1%, 20%-30 %, and 40%-50% by weight; particularly preferably 0.03%-30% by weight; in particular 0.05%-10% by weight.
В другом аспекте настоящего изобретения лекарственная форма указанной фармацевтической композиции представляет собой порошок, пульву, таблетку, капсулу, препарат замедленного высвобождения, препарат контролируемого высвобождения, инъекцию, инфузионную жидкость и суспензию.In another aspect of the present invention, the dosage form of said pharmaceutical composition is a powder, pulva, tablet, capsule, sustained release preparation, controlled release preparation, injection, infusion liquid and suspension.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к лекарственному средству в виде набора, содержащего: соединение формулы (I) или его изомер, сольват или предшественник, или их фармацевтически приемлемые соли; или фармацевтическую композицию.In another aspect, the present invention relates to a drug in the form of a kit containing: a compound of formula (I) or its isomer, solvate or precursor, or their pharmaceutically acceptable salts; or a pharmaceutical composition.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики, облегчения или лечения нейродегенеративных заболеваний, депрессии или инсульта, включающему введение нуждающемуся субъекту эффективного количества соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника или их фармацевтически приемлемых солей.In another aspect, the present invention relates to a method for preventing, alleviating or treating neurodegenerative diseases, depression or stroke, comprising administering to a subject in need an effective amount of a compound of formula (I) or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы III, IV или V, включающему стадию: взаимодействия β-рамнозида, α-1-аминорамнозида или β - 1-аминорамнозида с тетрабутиламмонийфторидом соответственно для получения соединений формул III - V имеющих следующие структуры:In another aspect, the present invention relates to a process for the preparation of a compound of formula III, IV or V comprising the step of reacting β-rhamnoside, α-1-aminoramnoside or β-1-aminoramnoside with tetrabutylammonium fluoride, respectively, to obtain compounds of formulas III-V having the following structures:
В другом предпочтительном варианте осуществления β-рамнозид получают взаимодействием 2,3,4-O-триацетилрамнозы с ацилхлоридом (4-О-трет-бутилдиметилсилил) - феруловой кислоты.In another preferred embodiment, β-rhamnoside is prepared by reacting 2,3,4-O-triacetyl rhamnose with (4- O -tert-butyldimethylsilyl)-ferulic acid acyl chloride.
В другом предпочтительном варианте осуществления α-1-аминорамнозид и/или β-1-аминорамнозид получают взаимодействием 2,3,4-о-триацетил-1-аминорамнозы с ацилхлоридом (4-О-трет-бутилдиметилсилил)-феруловой кислоты.In another preferred embodiment, α-1-aminoramnoside and/or β-1-aminoramnoside is prepared by reacting 2,3,4-o-triacetyl-1-aminoramnose with (4-O-tert-butyldimethylsilyl)-ferulic acid acyl chloride.
Другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны для специалистов данной области техники с учетом настоящего раскрытия.Other aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art in light of the present disclosure.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фиг. 1. PL201 улучшает показатель теста мыши с БА в водном лабиринте Морриса.Fig. 1. PL201 improves AD mouse test score in the Morris water maze.
Фиг. 2. PL201 способствует нейрогенезу in vivo.Fig. 2. PL201 promotes neurogenesis in vivo .
Фиг. 3. PL201 облегчает ингибирование Aβ при пролиферации нервных стволовых клеток in vitro.Fig. 3. PL201 facilitates Aβ inhibition in neural stem cell proliferation in vitro .
Фиг. 4. PL201 ингибирует нейровоспаления.Fig. 4. PL201 inhibits neuroinflammation.
Фиг. 5. PL201 уменьшает количество Аβ-бляшек in vivo.Fig. 5. PL201 reduces Aβ plaques in vivo .
Фиг. 6. PL201 снижает синтез Аβ in vitro.Fig. 6. PL201 reduces Aβ synthesis in vitro .
Фиг. 7. PL201 увеличивает потенциал митохондриальной мембраны.Fig. 7. PL201 increases mitochondrial membrane potential.
Фиг. 8. PL201 улучшает уровень фосфорилирования AMPK.Fig. 8. PL201 improves AMPK phosphorylation.
Фиг. 9. PL201 улучшает исполнение мышей в тесте при восхождении на шест.Fig. 9. PL201 improves the performance of mice in the pole climb test.
Фиг. 10. PL201 повышает уровень стриатальных дофаминергических нервных волокон.Fig. 10. PL201 increases the level of striatal dopaminergic nerve fibers.
Фиг. 11. PL202 снижает синтез Аβ.Fig. 11. PL202 reduces Aβ synthesis.
Фиг. 12. PL202 снижает экспрессию воспалительных факторов IL-1β и iNOS.Fig. 12. PL202 reduces the expression of inflammatory factors IL-1β and iNOS.
Фиг. 13. PL171 снижает синтез Аβ.Fig. 13. PL171 reduces Aβ synthesis.
Фиг. 14. PL172 снижает синтез Аβ.Fig. 14. PL172 reduces Aβ synthesis.
Фиг. 15 иллюстрируют спектры ядерного магнитного резонанса и 1D NOE для PL202, где на фиг. (а) показан спектр ядерного магнитного резонанса и фиг (б) спектра 1D NOE.Fig. 15 illustrate the NMR and 1D NOE spectra for PL202, where FIG. (a) shows the spectrum of nuclear magnetic resonance and Fig (b) the spectrum of 1D NOE.
Фиг. 16 - иллюстрирует спектр ядерного магнитного резонанса, 1D NOE спектр и 1h-1H COSY спектр PL171, где на фиг. (а) представлен спектр ядерного магнитного резонанса, на фиг. (б) и (в) - спектры 1D NOE, а на фиг. (г) - спектр 1H-1H COSY.Fig. 16 illustrates the nuclear magnetic resonance spectrum, 1D NOE spectrum and 1h-1H COZY spectrum of PL171, where FIG. (a) shows the nuclear magnetic resonance spectrum, FIG. (b) and (c) 1D NOE spectra, and in Fig. (d) 1H-1H COZY spectrum.
Фиг. 17 иллюстрирует спектр ядерного магнитного резонанса PL172.Fig. 17 illustrates the nuclear magnetic resonance spectrum of PL172.
Фиг. 18 - иллюстрирует TH диаграмму окрашивания черной субстанции, фиг. (а) - для H2O + NS, фиг. (б) - для PL201 + NS, фиг. (в) - для H2O + MPTP и фиг. (г) - для PL201 + MPTP.Fig. 18 illustrates the TH staining pattern of the substantia nigra, FIG. (a) - for H 2 O + NS, fig. (b) - for PL201 + NS, fig. (c) for H 2 O + MPTP and FIG. (d) - for PL201 + MPTP.
Подробное описание предпочтительного варианта реализации изобретенияDetailed description of the preferred embodiment of the invention
В результате проведения широких исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение формулы (I) может существенно облегчить симптомы нейродегенеративных заболеваний. Как в экспериментах in vitro, так и в in vivo соединение формулы (I) может эффективно усиливать функционирование нервных стволовых клеток. Соединение формулы (I) может не только предотвратить заболевание, но также может быть применено в рамках лечебного подхода для улучшения нейрорегенерации для борьбы с когнитивным упадком, связанным с процессами старения или нейродегенеративным заболеванием.As a result of extensive research, the authors of the present invention found that the compound of formula (I) can significantly alleviate the symptoms of neurodegenerative diseases. Both in vitro and in vivo experiments, the compound of formula (I) can effectively enhance the functioning of neural stem cells. The compound of formula (I) can not only prevent disease, but can also be used as part of a therapeutic approach to improve neuroregeneration to combat cognitive decline associated with aging or neurodegenerative disease.
ТерминыTerms
В настоящей заявке термин "алкил", используемый здесь, относится к линейным или разветвленным, насыщенным алифатическим углеводородным группам, содержащим от 1 до 4 атомов углерода (предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода). Например, алкил помимо прочих включает метил, этил, n-пропил, изопропил, n-бутил, изобутил и Т-бутил.As used herein, the term "alkyl" as used herein refers to linear or branched, saturated aliphatic hydrocarbon groups containing 1 to 4 carbon atoms (preferably 1 to 2 carbon atoms). For example, alkyl includes, among others, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, and T-butyl.
Термин "алкенил", используемый здесь, включает линейные или разветвленные углеводородные группы, содержащие по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь и 2-4 атома углерода (предпочтительно 2-3 атома углерода).The term "alkenyl" as used herein includes straight or branched hydrocarbon groups containing at least one carbon-carbon double bond and 2-4 carbon atoms (preferably 2-3 carbon atoms).
Термин "алкинил", используемый здесь, включает линейные или разветвленные углеводородные группы, содержащие по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод и 2-4 атома углерода (предпочтительно 2-3 атома углерода).The term "alkynyl" as used herein includes linear or branched hydrocarbon groups containing at least one carbon-carbon triple bond and 2-4 carbon atoms (preferably 2-3 carbon atoms).
Термин " галоген”, используемый здесь, относится к F, Cl, Br или I.The term "halogen" as used herein refers to F, Cl, Br, or I.
Термин "изомер", используемый здесь, включает геометрический изомер, энантиомеры и диастереомеры (такие как цис-транс-изомер и конформационный изомер).The term "isomer" as used herein includes the geometric isomer, enantiomers, and diastereomers (such as the cis-trans isomer and the conformational isomer).
Используемый здесь способ выражения “
Специалисту в данной области хорошо известен используемый здесь способ выражения “
Термин "сольват", в настоящей заявке, представляет собой соединение, несущее молекулу растворителя, например, сольват может быть гидратом.The term "solvate", in this application, is a compound bearing a solvent molecule, for example, the solvate may be a hydrate.
В настоящем изобретении термин "содержит/содержащий/содержащийся" означает, что различные ингредиенты могут быть включены совместно в смесь или композицию согласно настоящему изобретению. Поэтому термины "по существу состоит из” и “состоит из ”охватываются термином "содержит".In the present invention, the term "comprising/comprising/comprising" means that the various ingredients may be included together in a mixture or composition according to the present invention. Therefore, the terms "substantially consists of" and "consists of" are covered by the term "comprises".
В настоящем изобретении “фармацевтически приемлемым" компонентом является вещество, пригодное для человека и/или животного без чрезмерных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергия), т.е. с разумным соотношением польза/риск.In the present invention, a "pharmaceutically acceptable" ingredient is one that is useful to humans and/or animals without undue side effects (such as toxicity, irritation, and allergy), i.e., with a reasonable benefit/risk ratio.
В настоящем изобретении “фармацевтически приемлемым носителем" является фармацевтический или пищевой приемлемый растворитель, суспендирующий агент или эксципиент, используемый для доставки соединения формулы (I), его изомера, сольвата, предшественника или их фармацевтически приемлемых солей животным или людям. Носитель может быть жидким или твердым.In the present invention, a "pharmaceutically acceptable carrier" is a pharmaceutically or food acceptable solvent, suspending agent, or excipient used to deliver a compound of formula (I), its isomer, solvate, precursor, or pharmaceutically acceptable salts thereof, to animals or humans. The carrier may be liquid or solid .
СоединениеCompound
Настоящее изобретение, во-первых, относится к соединению, соответствующему структурной формуле (I):The present invention, firstly, relates to a compound corresponding to the structural formula (I):
(I)(I)
Следует понимать, что положение заместителя X в формуле (I) является иллюстративным положением, которое не ограничивается взаимным расположением по отношению к R1 в указанной формуле (положение между R1 и 
Где
В качестве предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения каждый из R1 - R4 независимо выбирают из водорода, гидроксила и алкила C1-C2.As a preferred embodiment of the present invention, each R1-R4 is independently selected from hydrogen, hydroxyl and C1-C2 alkyl.
Настоящее изобретение дополнительно включает изомер, сольват, предшественник вышеуказанного соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, если они имеют ту же или по существу ту же функцию, что и соединение формулы (I). "Фармацевтически приемлемые соли" относятся к солям, полученным в результате реакции соединения с неорганической кислотой, органической кислотой, щелочным металлом или щелочноземельным металлом. Эти соли включают, но не ограничиваются ими: (1) соли, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, серная кислота, азотная кислота и фосфорная кислота; (2) соли, образованные органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, винная кислота, метансульфоновая кислота, малеиновая кислота и аргинин. Другие соли включают: соли, образованные щелочными металлами или щелочноземельными металлами (такими как натрий, калий, кальций или магний) в форме сложных эфиров, карбаматов или других обычных “лекарственных форм". Соединения имеют один или несколько асимметричных центров. Поэтому эти соединения могут существовать в виде рацемических смесей, отдельных энантиомеров, отдельных диастереомеров, смесей диастереомеров или цис- или транс-изомеров.The present invention further includes an isomer, solvate, precursor of the above compound of formula (I), or pharmaceutically acceptable salts thereof, as long as they have the same or substantially the same function as the compound of formula (I). "Pharmaceutical salts" refers to salts obtained by reacting a compound with an inorganic acid, an organic acid, an alkali metal, or an alkaline earth metal. These salts include, but are not limited to: (1) salts formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid; (2) salts formed with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, succinic acid, tartaric acid, methanesulfonic acid, maleic acid and arginine. Other salts include: salts formed with alkali metals or alkaline earth metals (such as sodium, potassium, calcium, or magnesium) in the form of esters, carbamates, or other common "dosage forms". Compounds have one or more asymmetric centers. Therefore, these compounds may exist as racemic mixtures, individual enantiomers, individual diastereomers, mixtures of diastereomers or cis or trans isomers.
"Предшественник соединения" относится к соединению, которое после введения пациенту соответствующим способом подвергается метаболическим или химическим реакциям в организме пациента, до дальнейшего преобразования в соединение структурной формулы (I) или соль или раствор, состоящий из соединения структурной формулы (I)."Compound precursor" refers to a compound which, after administration to a patient in an appropriate manner, undergoes metabolic or chemical reactions in the body of the patient, before being further converted into a compound of structural formula (I) or a salt or solution consisting of a compound of structural formula (I).
В качестве предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения соединение относится к соединениям формулы II (PL201), формулы III (PL202), формулы IV (PL172) и Формулы V (PL171). Соединения формулы III и формулы V особенно предпочтительны.As a preferred embodiment of the present invention, the compound refers to compounds of formula II (PL201), formula III (PL202), formula IV (PL172) and Formula V (PL171). Compounds of formula III and formula V are particularly preferred.
Соединение формулы II представляет собой (α-L-рамнопиранозил) сложный эфир феруловой кислоты, включая помимо прочихThe compound of formula II is a (α-L-rhamnopyranosyl) ester of ferulic acid, including but not limited to
Соединение формулы III представляет собой (β-L-рамнопиранозил) сложный эфир феруловой кислоты, включая помимо прочих,The compound of formula III is a (β-L-rhamnopyranosyl) ester of ferulic acid, including but not limited to,
соединение формулы IV представляет собой (1-амино-α-L-рамнопиранозил) феруламид, но не ограниченный этим,the compound of formula IV is (1-amino-α-L-rhamnopyranosyl) ferulamide, but not limited to this,
соединение формулы ⅳ представляет собой (1-амино-β-L-рамнопиранозил) феруламид, но не ограниченный этим,the compound of formula ⅳ is (1-amino-β-L-rhamnopyranosyl) ferulamide, but not limited to this,
В варианте осуществления настоящего изобретения способ получения соединения формулы III включает следующие стадии:In an embodiment of the present invention, the process for preparing a compound of formula III comprises the following steps:
Стадия 1: 2,3,4-о-триацетилрамнозу и ацилхлорид (4-О-трет-бутилдиметилсилил) -феруловой кислоты смешивали для получения реакции с выходом продукта β-гликозилирования, имеющего структуру формулы VI;Stage 1: 2,3,4-o-triacetylrhamnose and acyl chloride (4-O-tert-butyldimethylsilyl)-ferulic acid were mixed to obtain a reaction with the yield of a β-glycosylation product having the structure of formula VI;
Стадия 2: продукт β-гликозилирования, имеющий структуру формулы VI, и фторид тетрабутиламмония смешивали для получения продукта, не защищенного трет-бутилдиметилсилилом (TBS); иStep 2: The β-glycosylation product having the structure of formula VI and tetrabutylammonium fluoride were mixed to obtain a product not protected by t-butyldimethylsilyl (TBS); And
Стадия 3, продукт не защищенный трет-бутилдиметилсилилом (TBS) гидролизовали с получением соединения формулы III
В одном варианте осуществления настоящего изобретения на стадии 1, описанной выше, 2,3,4-о-триацетилрамнозу в ледяной ванне по каплям добавляли в ацилхлорид (4-О-трет-бутилдиметилсилил) -феруловой кислоты.In one embodiment of the present invention, in
В варианте осуществления настоящего изобретения вышеуказанную реакцию стадии 1 проводили при комнатной температуре. Комнатная температура составляет 10°C-40°C, предпочтительно 15°C-30°C, в частности 20°C-25°C.In an embodiment of the present invention, the
В одном варианте осуществления настоящего изобретения вышеуказанная стадия 1 дополнительно включает операции получения продуктов α- и β-гликозилирования соответственно с помощью колоночной хроматографии.In one embodiment of the present invention, the
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения на вышеуказанной стадии 2, смешивание осуществляли путем капельного добавления фторида тетрабутиламмония в продукт β-гликозилирования при комнатной температуре.According to one embodiment of the present invention in the
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения соединения формулы III включает следующие стадии:In one embodiment of the present invention, the process for preparing a compound of formula III comprises the following steps:
на стадии 1: 2,3,4-о-триацетилрамнозу и ацилхлорид (4-О-трет-бутилдиметилсилил)-феруловой кислоты смешивали для проведения реакции с получением продукта β-гликозилирования, имеющего структуру формулы VI; на стадии 2: продукт β-гликозилирования, имеющий структуру формулы VIII и фторид тетрабутиламмония смешивали для получения не защищенного трет-бутилдиметилсилилом (ТБС) продукта; иin step 1: 2,3,4-o-triacetyl rhamnose and (4-O-tert-butyldimethylsilyl)-ferulic acid acyl chloride were mixed to react to obtain a β-glycosylation product having the structure of formula VI; in step 2: a β-glycosylation product having the structure of formula VIII and tetrabutylammonium fluoride were mixed to obtain a non-tert-butyldimethylsilyl (TBS) protected product; And
на стадии 3, не защищенный трет-бутилдиметилсилилом (TBS) продукт гидролизовали с получением соединения формулыⅣin
В одном варианте осуществления настоящего изобретения на стадии 1, описанной выше, к 1 амино-2,3,4-о-триацетилрамнозу в ледяной ванне по каплям добавляли в ацилхлорид (4-О-трет-бутилдиметилсилил) -феруловой кислоты.In one embodiment of the present invention, in
В одном варианте осуществления настоящего изобретения вышеуказанную реакцию стадии 1 проводили при комнатной температуре. Комнатная температура составляет 10°C-40°C, предпочтительно 15°C-30°C, в частности 20°C-25°C.In one embodiment of the present invention, the
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения вышеуказанная стадия 1 дополнительно включает этап получения продукта α-гликозилирования с помощью колоночной хроматографии.According to one embodiment of the present invention, the
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения на вышеуказанной стадии 2, смешивание осуществляли путем капельного добавления фторида тетрабутиламмония в продукт α-гликозилирования при комнатной температуре.According to one embodiment of the present invention, in the
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения способ получения соединения формулы Ⅴ включает следующие стадии:According to one embodiment of the present invention, a process for preparing a compound of formula Ⅴ includes the following steps:
на стадии 1, 1-амино-2,3,4-о-триацетилрамнозу и ацилхлорид (4-О-трет-бутилдиметилсилил) - феруловой кислоты смешивают для проведения реакции с получением продукта β-гликозилирования, имеющего структуру формулы IX;in
на стадии 2, продукт β-гликозилирования, имеющий структуру формулы IX, и фторид тетрабутиламмония смешивают для получения не защищенного β-трет-бутилдиметилсилилом (TBS) продукта; иin
на стадии 3, не защищенный β-трет-бутилдиметилсилилом (TBS) продукт гидролизовали с получением соединения формулы V. in
В одном варианте осуществления настоящего изобретения на стадии 1, описанной выше, к 1-амино-2,3,4-О-триацетилрамнозу в ледяной ванне по каплям добавляли в ацилхлорид (4-О-трет-бутилдиметилсилил)-феруловой кислоты.In one embodiment of the present invention, in
В одном варианте осуществления настоящего изобретения вышеуказанную реакцию стадии 1 проводили при комнатной температуре. Комнатная температура составляет 10°C-40°C, предпочтительно 15°C-30°C, в частности 20°C-25°C.In one embodiment of the present invention, the
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения вышеуказанная стадия 1 дополнительно включает операцию получения продукта β-гликозилирования с помощью колоночной хроматографии.According to an embodiment of the present invention, the
На вышеуказанной стадии 2, осуществления настоящего изобретения смешивание осуществляли путем капельного добавления фторида тетрабутиламмония к продукту β-гликозилирования при комнатной температуре.In the
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что с учетом структур полученных соединений согласно настоящему изобретению, что соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены различными способами, хорошо известными в данной области с использованием хорошо известных исходных реагентов, включая способы химического синтеза или экстракции из организмов (животных или растений), и указанные способы включены в объем настоящего изобретения.One skilled in the art will recognize that, given the structures of the compounds of the present invention, that the compounds of the present invention may be prepared by various methods well known in the art using well known starting materials, including methods of chemical synthesis or extraction from organisms. (animals or plants), and these methods are included in the scope of the present invention.
Синтезированное соединение может быть дополнительно очищено методом колоночной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и др.The synthesized compound can be further purified by column chromatography, high performance liquid chromatography, etc.
ПрименениеApplication
В ходе исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение формулы (I) настоящего изобретения может существенно облегчить симптомы нейродегенеративных заболеваний. Соединение настоящего изобретения может ингибировать нейровоспаление, снижать продукцию Аβ и усиливать функции нервных стволовых клеток и дофаминергических нейронов. После экспериментальной демонстрации соединение согласно настоящему изобретению значительно улучшило способности животных к обучаемости и запоминанию. Согласно механизму действия соединения согласно настоящему изобретению, соединение может усиливать функцию нервных стволовых клеток, и поэтому эффективно при болезни Хантингтона и боковом амиотрофическом склерозе. Согласно механизму действия соединения согласно настоящему изобретению, соединение также эффективно при депрессии и инсульте. Во время начала депрессии или инсульта также происходит возникновение нейровоспалений в головном мозге, что, в свою очередь, приводит к уменьшению количества нервных стволовых клеток и изменению нервной функции. Соединение формулы (I) настоящего изобретения может усиливать функцию нервных стволовых клеток, из чего можно понять, что соединение эффективно при депрессии и инсульте.In the course of research, the authors of the present invention found that the compound of formula (I) of the present invention can significantly alleviate the symptoms of neurodegenerative diseases. The compound of the present invention can inhibit neuroinflammation, reduce Aβ production, and enhance the functions of neural stem cells and dopaminergic neurons. After experimental demonstration, the compound of the present invention significantly improved the learning and memory abilities of animals. According to the mechanism of action of the compound of the present invention, the compound can enhance the function of neural stem cells and is therefore effective in Huntington's disease and amyotrophic lateral sclerosis. According to the mechanism of action of the compound of the present invention, the compound is also effective in depression and stroke. During the onset of depression or stroke, neuroinflammation also occurs in the brain, which in turn leads to a decrease in the number of neural stem cells and changes in nerve function. The compound of formula (I) of the present invention can enhance the function of neural stem cells, from which it can be understood that the compound is effective in depression and stroke.
На основе новых данных полученных авторами настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения лекарственного средства или лекарственного средства в виде набора для профилактики, облегчения или лечения нейродегенеративных заболеваний, депрессии или инсульта.On the basis of new data obtained by the authors of the present invention, the present invention relates to the use of a compound of formula (I) or its isomer, solvate or precursor, or their pharmaceutically acceptable salts for the preparation of a drug or drug in the form of a kit for the prevention, alleviation or treatment of neurodegenerative diseases , depression or stroke.
Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для ингибирования нейровоспаления.The present invention also relates to the use of a compound of formula (I), or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for inhibiting neuroinflammation.
Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для стимулирования выработки нервных стволовых клеток.The present invention also relates to the use of a compound of formula (I) or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for stimulating the production of neural stem cells.
Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для снижения синтеза Аβ.The present invention also relates to the use of a compound of formula (I), or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for reducing Aβ synthesis.
Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для увеличения числа дофаминергических нейронов в черной субстанции.The present invention also relates to the use of a compound of formula (I), or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for increasing the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra.
Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его изомера, сольвата или предшественника, или их фармацевтически приемлемых солей для получения композиции, набора или лекарственного средства в виде набора для повышения уровня стриатальных дофаминергических нервных волокон.The present invention also relates to the use of a compound of formula (I), or an isomer, solvate or precursor thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a composition, kit or kit medicament for increasing striatal dopaminergic nerve fiber levels.
Соединение формулы (II) (PL201), соединение формулы (Ⅲ) (PL202), соединение формулы (Ⅳ) (PL172) и соединение формулы (Ⅴ) (PL172), согласно настоящему изобретению обладают превосходными эффектами в вышеуказанных применениях, причем соединения формулы (III) и формулы (V) являются особенно эффективными.The compound of formula (II) (PL201), the compound of formula (Ⅲ) (PL202), the compound of formula (Ⅳ) (PL172) and the compound of formula (Ⅴ) (PL172) according to the present invention have excellent effects in the above applications, and the compounds of formula ( III) and formulas (V) are particularly effective.
Фармацевтическая композицияpharmaceutical composition
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей (а) эффективное количество соединения формулы (I) или его изомер, сольват, предшественник или их фармацевтически приемлемые соли; и (Б) фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing (a) an effective amount of a compound of formula (I) or an isomer, solvate, precursor or pharmaceutically acceptable salts thereof; and (B) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению соединение формулы (I) или его изомер, сольват или предшественник, или их фармацевтически приемлемые соли находятся в эффективном количестве. Например, соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль может содержаться в массовом отношении 0,001-50%. Фармацевтическая композиция содержит соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль предпочтительно в массовом отношении 0,01% -20%.In the pharmaceutical composition according to the present invention, the compound of formula (I), or an isomer, solvate or precursor thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is present in an effective amount. For example, a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be present in a weight ratio of 0.001-50%. The pharmaceutical composition contains a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, preferably in a weight ratio of 0.01% -20%.
Лекарственная форма фармацевтической композиции настоящего изобретения может быть различной до тех пор, пока она может эффективно доставлять активный ингредиент в организм млекопитающего. Например, она может быть выбрана из порошка, пульвы, таблетки, капсулы, препарата с замедленным высвобождением, препарата с контролируемым высвобождением, инъекции, инфузионной жидкости и суспензии. В соответствии с типами заболеваний подлежащих лечению соединением согласно настоящему изобретению, специалист в данной области может подобрать удобные для применения лекарственные формы.The dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention may be varied as long as it can effectively deliver the active ingredient to the body of a mammal. For example, it may be selected from a powder, a pulva, a tablet, a capsule, a sustained release preparation, a controlled release preparation, an injection, an infusion liquid, and a suspension. In accordance with the types of diseases to be treated with the compound of the present invention, a person skilled in the art can select dosage forms convenient for use.
С точки зрения простоты приготовления и хранения, предпочтительной фармацевтической композицией является твердая композиция, в частности таблетка, заполненная твердым веществом, или капсула, заполненная жидкостью. Предпочтительной фармацевтической композицией, с точки зрения размера и простоты введения, является пероральный препарат. Соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтическая композиция также могут храниться в стерильном устройстве, пригодном для инъекций или инфузий.From the viewpoint of ease of preparation and storage, the preferred pharmaceutical composition is a solid composition, in particular a solid-filled tablet or a liquid-filled capsule. The preferred pharmaceutical composition, in terms of size and ease of administration, is an oral preparation. The compound according to the present invention or its pharmaceutical composition can also be stored in a sterile device suitable for injection or infusion.
Эффективная дозировка введения соединения формулы (I) в качестве активного ингредиента может варьироваться в зависимости от способа введения и тяжести заболевания, подлежащего лечению. Тем не менее, как правило, соединение настоящего изобретения может показывать удовлетворительные результаты при введении в дозе около 0,01-100 мг/кг массы животного ежедневно, предпочтительно вводится в 1-3 разделенных дозах ежедневно или вводится в форме пролонгированного высвобождения. Режим дозирования может быть скорректирован таким образом, чтобы обеспечить наилучший терапевтический ответ. Например, в зависимости от срочной ситуативной потребности в лечении, несколько разделенных доз могут быть введены ежедневно, или доза также может быть уменьшена пропорционально.The effective dosage for administering a compound of formula (I) as an active ingredient may vary depending on the route of administration and the severity of the disease being treated. However, in general, the compound of the present invention can show satisfactory results when administered at a dose of about 0.01-100 mg/kg animal body weight daily, preferably administered in 1-3 divided doses daily or administered in a sustained release form. The dosage regimen may be adjusted to provide the best therapeutic response. For example, depending on the urgent situational need for treatment, several divided doses may be administered daily, or the dose may also be reduced proportionately.
Дополнительно настоящее изобретение описано ниже, в сочетании с конкретными примерами. Следует понимать, приведенные ниже примеры являются исключительно иллюстративными и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. В следующих примерах экспериментальные методы без указания конкретных условий обычно выполняют в обычных условиях, например, описанных в J. Sambr°°k et al., M°lecular Cl°ning: A Lab°rat°ry Manual, the third editi°n, Science Press, 2002, или в условиях рекомендованных производителем.Additionally, the present invention is described below in conjunction with specific examples. It should be understood that the following examples are illustrative only and do not limit the present invention in any way. In the following examples, the experimental methods without specifying specific conditions are usually performed under conventional conditions, such as those described in J. Sambr°°k et al., M°lecular Cl°ning: A Lab°rat°ry Manual, the third editi°n, Science Press, 2002, or under conditions recommended by the manufacturer.
Статистический анализ данныхStatistical data analysis
Все экспериментальные данные выражены в виде среднего значения «±стандартная ошибка». Т-тест использовался для сравнения между различными лечебными группами. Для анализа результатов нескольких групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (one way ANOVA). После испытаний проводили тест наименьшей значимой разности Фишера или тест Бонферрони, или Т-тест, или двусторонний дисперсионный анализ (two way ANOVA), который также был использован для анализа после испытаний с использованием апостериорного теста Тьюки. При р<0,05 наблюдалась достоверная разница между группами.All experimental data are expressed as the mean value "±standard error". The t-test was used to compare between different treatment groups. One way analysis of variance (one way ANOVA) was used to analyze the results of several groups. After testing, Fisher's least significant difference test or Bonferroni's test, or T-test, or two-way ANOVA was performed, which was also used for post-test analysis using Tukey's post hoc test. At p<0.05, there was a significant difference between the groups.
Пример 1. PL201 улучшает обучаемость и память мышей с БАExample 1 PL201 Improves Learning and Memory in AD Mice
Тест "Водный лабиринт Морриса"Morris Water Maze Test
В возрасте двадцати 5-6 месяцев были отобраны самцы трансгенных мышей APP/PS1 (мыши с БА), которые были разделены на модельную группу и группу введения полисахаридов случайным образом с использованием метода таблицы случайных чисел. Соединение PL201 вводили внутрижелудочно ежедневно (10 мг/кг массы тела мыши), в то время как 10 нетрансгенных мышей использовали в качестве отрицательной контрольной группы (без введения PL201). После 90 дней последовательного введения использовали тест водного лабиринта Морриса для выявления влияния PL201 на обучение и когнитивные функции мышей APP/PS1.At the age of twenty 5-6 months, male APP/PS1 transgenic mice (AD mice) were selected and randomly divided into a model group and a polysaccharide administration group using a random number table method. The PL201 compound was administered intragastrically daily (10 mg/kg mouse body weight), while 10 non-transgenic mice were used as a negative control group (no PL201 administration). After 90 days of sequential administration, the Morris water maze test was used to determine the effect of PL201 on learning and cognitive function in APP/PS1 mice.
В тесте использовалась классическая процедура испытания водного лабиринта Морриса, которая включает в себя две части: задачу навигации по месту и задачу пространственного зондирования. Тест длился 7 дней, и на 4-й и 7-й день была добавлена задача пространственного зондирования.The test used the classic Morris water maze test procedure, which includes two parts: a site navigation task and a spatial sensing task. The test lasted 7 days, and on the 4th and 7th day the task of spatial sensing was added.
Из результатов испытаний представленных на фиг. 1? видно, что в задаче навигации по месту после 3 дней обучения латентное время спасения было сокращено у всех трех групп животных, иллюстрируя, что мыши в каждой группе могли успешно выполнить задачу пространственного обучения водного лабиринта. Латентное время спасения использовалось в качестве тестового индикатора.From the test results shown in Fig. 1? It can be seen that in the place navigation task, after 3 days of training, the escape latency time was reduced in all three groups of animals, illustrating that the mice in each group could successfully complete the water maze spatial learning task. The latent rescue time was used as a test indicator.
Результаты показали, что мыши в отрицательной контрольной группе быстро реагировали и могли быстро найти платформу после входа в воду. С увеличением времени обучения время задержки поиска платформы сокращалось. Мыши в эталонной группе реагировали медленно, после входа в воду у них наблюдалось зацикленное поведение вдоль стенки бочки, но не было никаких проявлений поведения спасения. После вспомогательного вывода мышей на платформу вручную, они снова прыгали в воду. После многократных тренировок они, наконец, находили платформу, но время задержки поиска платформы было значительно увеличено. С увеличением времени обучения способность поиска платформы мышей в тестовых группах непрерывно улучшалась. Все мыши в вышеперечисленных трех группах обладали определенной способностью к пространственной памяти, причем мыши в эталонной группе имели худшие показатели латентного времени спасения, чем мыши в контрольной группе, что позволяет предположить, что способность к обучению и запоминанию мышей в эталонной группе были снижены, а расстройство обучения и памяти при БА было хорошо смоделировано в эталонной группе мышей. По сравнению с эталонной группой латентность мышей в группе введения была значительно иной. Видно, что способность к обучению и запоминанию у мышей AD после введения PL201 была значительно улучшена.The results showed that the mice in the negative control group responded quickly and were able to quickly find the platform after entering the water. As the training time increased, the platform search delay time decreased. Mice in the reference group responded slowly, after entering the water, they showed a looping behavior along the wall of the barrel, but there were no manifestations of rescue behavior. After manually bringing the mice onto the platform, they jumped into the water again. After repeated training, they finally found the platform, but the platform search delay time was greatly increased. With increasing training time, the platform-finding ability of the mice in the test groups improved continuously. All mice in the above three groups had some spatial memory ability, with mice in the reference group having worse escape latency than mice in the control group, suggesting that the learning and memory abilities of mice in the reference group were reduced and the disorder learning and memory in AD was well modeled in the reference group of mice. Compared to the reference group, the latency of mice in the administration group was significantly different. It can be seen that the learning and memory ability of AD mice was significantly improved after administration of PL201.
Пример 2. PL201 стимулирует нейрогенез Example 2 PL201 Stimulates Neurogenesis in vivoin vivo
Аномальный нейрогенез, нейровоспаление и отложение Аβ-бляшек тесно связаны со снижением когнитивных способностей при БА. Таким образом, в этом примере дополнительно исследуется, влияет ли PL201 на нейрогенез.Abnormal neurogenesis, neuroinflammation, and Aβ plaque deposition are strongly associated with cognitive decline in AD. Thus, this example further investigates whether PL201 influences neurogenesis.
Авторы настоящего изобретения провели эксперименты по введению PL201 на мышах c БА (были отобраны мыши с БА в возрасте 5-6 месяцев). Каждой мыши внутрижелудочно вводили 100 мкл PL201, дозировка составляла 10 мг/кг массы тела мыши. Кроме того, мышам контрольной группы вводили 100 мкл воды один раз в день в течение 90 дней, а с 60-го дня внутрибрюшинно вводили 5-бром-2’-дезоксиуридин (БрдУ) в дозе 50 мг/кг массы тела мыши один раз в день в течение 7 дней. После 90 дней введения мышам анестезии их перфузировали с ПФД, и весь мозг брали для дальнейших экспериментов.The authors of the present invention conducted experiments on the introduction of PL201 mice with AD (were selected mice with AD at the age of 5-6 months). Each mouse was intragastrically injected with 100 μl of PL201, the dosage was 10 mg/kg mouse body weight. In addition, mice of the control group were injected with 100 μl of water once a day for 90 days, and from the 60th day, 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) was administered intraperitoneally at a dose of 50 mg/kg of mouse body weight once a day. day within 7 days. After 90 days of anesthesia, the mice were perfused with PFD and the whole brain was taken for further experiments.
Для полученного цельного мозга был обнаружен зрелый нейронный маркер NeuN в гиппокампе мышей: мозг мыши, который был перфузирован ПФД, затем фиксировали в 4% ПФД в течение 24 часов, а затем выдерживали в течение 72 часов в 30% сахарозе для криопротекции. После завершения лечения область мозжечка удаляли, а обонятельную луковицу помещали вертикально на фильтровальную бумагу и замораживали при температуре -80°C не менее 24 часов. Резка производилось в замороженном состоянии вертикально и продольно толщиной 30 мкм. В общей сложности 8×9=72 среза (2,16 мм), включая часть DG, были разрезаны и расположены в порядке нарезки. Из каждых 8 срезов выбирался один и затем объединялся в группу срезов мозга для окрашивания. Нарезанные срезы мозга помещали в раствор защищающий ткани (30% сахарозы, 30% этиленгликоля, 0,1M PB), полученные таким образом срезы мозга можно было хранить при температуре -20°C не менее полугода. Во время окрашивания группу срезов мозга брали и блокировали в блокирующем растворе (10% ослиная сыворотка, 0,3% TritonX-100, PBS) в течение 45 минут при комнатной температуре, а затем добавляли первичные антитела и инкубировали в течение ночи при 4°C (соотношение разведения первичных антител составляло: крысиный анти-BrdU, 1 : 2000; кроличий анти-Ki67, 1:1000; козий анти-Dcx, 1 : 200; мышиный анти-NeuN, 1 : 200; и козий анти-SOx2, 1 : 60), а затем инкубировали с подходящее флуоресцентное вторичное антитело в течение 1 часа при комнатной температуре. Ядерное окрашивание проводили с помощью DAPI. Затем изображения окрашенных срезов мозга снимались с помощью °Olympus FV100i или Leica SP-8. Количество одиночных или двойных положительных клеток анализировалось с помощью программного обеспечения Image Pro Plus. Для извлечения антигена срезы мозга обрабатывали в растворе для извлечения антигена (10 мм цитрата натрия, рН 6,5)при 95°C в течение 20 минут перед тем как происходила бы блокировка сывороткой. Для окрашивания BrdU перед тем как происходила бы блокировка сывороткой срезы мозга обрабатывали 2 м соляной кислотой при 37°C в течение 30 минут, а затем промывали 0,1 м буфером борной кислоты (рН 8,5).For the resulting whole brain, a mature neuronal marker NeuN was detected in the mouse hippocampus: mouse brain that had been perfused with PFD was then fixed in 4% PFD for 24 hours and then incubated for 72 hours in 30% sucrose for cryoprotection. After completion of treatment, the cerebellar region was removed, and the olfactory bulb was placed vertically on filter paper and frozen at -80°C for at least 24 hours. Cutting was carried out in a frozen state vertically and longitudinally with a thickness of 30 microns. A total of 8×9=72 slices (2.16 mm), including the DG part, were cut and arranged in cutting order. From every 8 sections, one was selected and then combined into a group of brain sections for staining. Sliced brain sections were placed in a tissue-protecting solution (30% sucrose, 30% ethylene glycol, 0.1M PB), thus obtained brain sections could be stored at -20°C for at least six months. During staining, a group of brain sections were taken and blocked in blocking solution (10% donkey serum, 0.3% TritonX-100, PBS) for 45 minutes at room temperature, and then added with primary antibodies and incubated overnight at 4°C (primary antibody dilution ratio was: rat anti-BrdU, 1:2000; rabbit anti-Ki67, 1:1000; goat anti-Dcx, 1:200; mouse anti-NeuN, 1:200; and goat anti-SOx2, 1 : 60) and then incubated with a suitable fluorescent secondary antibody for 1 hour at room temperature. Nuclear staining was performed with DAPI. The stained brain sections were then imaged using the °Olympus FV100i or Leica SP-8. The number of single or double positive cells was analyzed using Image Pro Plus software. For antigen retrieval, brain sections were treated in antigen retrieval solution (10 mM sodium citrate, pH 6.5) at 95° C. for 20 minutes before serum blocking occurred. For BrdU staining, prior to serum blocking, brain sections were treated with 2 M hydrochloric acid at 37° C. for 30 minutes and then washed with 0.1 M boric acid buffer (pH 8.5).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что по сравнению с мышами контрольной группы гиппокамп у мышей, которым вводили PL201, имел больше двойноположительных новорожденных нейронов BrdU/NeuN, см. фиг. 2.The present inventors found that, compared to control mice, the hippocampus of mice injected with PL201 had more BrdU/NeuN double positive neonatal neurons, see FIG. 2.
Приведенные выше результаты показали, что PL201 может значительно способствовать нейрогенезу у мышей.The above results showed that PL201 can significantly promote neurogenesis in mice.
Пример 3. PL201 облегчает ингибирование Aβ на пролиферацию нервных стволовых клеток in vitr °. Example 3 PL201 facilitates inhibition of Aβ on neural stem cell proliferation in vitr ° .
Являясь основным патогенным белком БА, Аβ ингибирует пролиферацию нервных стволовых клеток. В этом примере изобретатели определили уровни пролиферации нервных стволовых клеток человека путем инкорпорации EdU и проверили, может ли PL201 ослабить ингибирующий эффект aβ на пролиферацию нервных стволовых клеток.Being the main pathogenic protein of AD, Aβ inhibits the proliferation of neural stem cells. In this example, the inventors determined the proliferation levels of human neural stem cells by EdU incorporation and tested whether PL201 could attenuate the inhibitory effect of aβ on neural stem cell proliferation.
Нервные стволовые клетки человека (3L) культивировали в DMEM/F12 (содержащем N2/B27 и 10 нг/мл bFGF), покрывали 96-луночными пластинами и инкубировали в течение 24 часов, затем добавляли Aβ (5 мкм) для предварительной обработки клеток в течение 30 минут, а затем добавляли PL201 (30 мкм). После совместной инкубации в течение 72 часов уровень пролиферации нервных стволовых клеток определялся методом окрашивания EdU.Human neural stem cells (3L) were cultured in DMEM/F12 (containing N2/B27 and 10 ng/ml bFGF), plated in 96-well plates and incubated for 24 hours, then Aβ (5 μm) was added to pretreat the cells for 30 minutes and then PL201 (30 µm) was added. After co-incubation for 72 hours, the level of proliferation of neural stem cells was determined by EdU staining.
Результаты показали, что лечение Аβ ингибирует пролиферацию нервных стволовых клеток, тогда как добавление PL201 может значительно ослабить ингибирующее действие Аβ на пролиферацию нервных стволовых клеток, см. Фиг. 3.The results showed that Aβ treatment inhibited neural stem cell proliferation, while the addition of PL201 could significantly attenuate the inhibitory effect of Aβ on neural stem cell proliferation, see FIG. 3.
Пример 4. PL201 ингибирует нейровоспаления.Example 4 PL201 inhibits neuroinflammation.
Нейровоспаление в головном мозге при БА является одной из причин снижения когнитивных функций. Микроглиальные клетки являются ключевыми клетками, которые опосредуют нейровоспаление. В этом примере изобретатели исследовали, обладает ли PL201 эффектом ингибирования нейровоспаления путем обнаружения экспрессии воспалительных факторов на клеточной линии мыши BV-2.Neuroinflammation in the brain in AD is one of the causes of cognitive decline. Microglial cells are key cells that mediate neuroinflammation. In this example, the inventors investigated whether PL201 has an inhibitory effect on neuroinflammation by detecting the expression of inflammatory factors in the BV-2 mouse cell line.
Клетки BV-2 культивировали в DMEM, наносили на 24 луночные пластины и культивировали в течение 24 часов, затем добавляли PL201 (0, 10, 30 и 100 мкм) и LPS (300 нг/мл). После совместной инкубации в течение 24 часов для извлечения РНК использовали Тризол, а экспрессию родственных воспалительных факторов определяли методом QPCR.BV-2 cells were cultured in DMEM, applied to 24 well plates and cultured for 24 hours, then PL201 (0, 10, 30 and 100 μm) and LPS (300 ng/ml) were added. After co-incubation for 24 hours, Trizol was used to extract RNA, and the expression of related inflammatory factors was determined by QPCR.
Результаты показали, что лечение PL201 может значительно ингибировать экспрессию воспалительных факторов TNFa и IL-1β и даже оказывать очевидный эффект при более низкой дозировке, см. Фиг. 4.The results showed that PL201 treatment can significantly inhibit the expression of inflammatory factors TNFa and IL-1β and even have a clear effect at a lower dosage, see FIG. 4.
Пример 5. PL201 уменьшает количество Аβ-бляшек in viv o . Example 5 PL201 reduces Aβ plaques in vivo .
Отложение Аβ-бляшек в головном мозге является одной из ключевых причин повреждения нервов, что, в свою очередь, приводит к снижению когнитивных способностей. Поэтому в этом варианте осуществления дополнительно исследуется, влияет ли PL201 на количество Аβ-бляшек в головном мозге.The deposition of Aβ plaques in the brain is one of the key causes of nerve damage, which in turn leads to cognitive decline. Therefore, in this embodiment, it is further investigated whether PL201 affects the amount of Aβ plaques in the brain.
Авторы настоящего изобретения выполнили коронарное замороженное срезание толщиной в 30 мкм на всем образце мозга мышей с БА после введения в Примере 2, и срезы были окрашены тиофлавином S и DAPI. Затем изображения окрашенных срезов мозга снимались с помощью Olympus FV100i или Leica SP-8.The present inventors performed a 30 μm thick coronal frozen section on the entire brain sample of AD mice after administration in Example 2, and the sections were stained with thioflavin S and DAPI. The stained brain sections were then imaged using an Olympus FV100i or Leica SP-8.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что по сравнению с контрольной группой мозг мышей, которым вводили PL201, имел меньше Аβ-бляшек, см. Фиг. 5.The present inventors found that, compared with the control group, the brains of mice injected with PL201 had fewer Aβ plaques, see FIG. 5.
Вышеприведенные результаты показали, что PL201 значительно уменьшает количество Аβ-бляшек у мышей.The above results showed that PL201 significantly reduced Aβ plaques in mice.
Пример 6. PL172 снижает синтез Аβ. Example 6 PL172 reduces Aβ synthesis .
Аβ является основным патогенным белком БА. В этом примере авторы настоящего изобретения исследовали, снижает ли PL201 синтез Aβ путем обнаружения уровня Aβ на клетках нейробластомы SK-N-SH.Aβ is the main pathogenic protein in AD. In this example, the present inventors investigated whether PL201 reduces Aβ synthesis by detecting the level of Aβ on SK-N-SH neuroblastoma cells.
Культура клеток нейробластомы SK-N-SH и обнаружение Aβ: клетки SK-N-SH культивировали в DMEM, покрывали 24-луночными пластинами и культивировали в течение 24 часов, затем добавляли PL201 (0, 30, 100 и 300 мкм). После совместной инкубации в течение 24 часов уровень белка общего Аβ в супернатанте определяли методом ИФА.SK-N-SH neuroblastoma cell culture and Aβ detection: SK-N-SH cells were cultured in DMEM, covered with 24-well plates and cultured for 24 hours, then PL201 (0, 30, 100 and 300 μm) was added. After co-incubation for 24 hours, the level of total Aβ protein in the supernatant was determined by ELISA.
Результаты показали, что обработка PL201 значительно ингибирует синтез aβ, см. Фиг. 6.The results showed that PL201 treatment significantly inhibited aβ synthesis, see FIG. 6.
Пример 7. PL201 увеличивает мембранный потенциал митохондрийExample 7 PL201 Increases Mitochondrial Membrane Potential
Мембранный потенциал митохондрий является основным параметром митохондриальной функции, а митохондриальная дисфункция является характерной чертой БА головного мозга. В этом примере изобретатели исследовали, улучшает ли PL201 функции митохондрий путем определения уровня клеточного мембранного потенциала митохондрий нервных стволовых клеток человека.Mitochondrial membrane potential is the main parameter of mitochondrial function, and mitochondrial dysfunction is a characteristic feature of brain AD. In this example, the inventors investigated whether PL201 improves mitochondrial function by measuring the cell membrane potential level of human neural stem cell mitochondria.
Митохондрии окрашивали с JC-1 в течение 20 мин и промывали промывочным буфером, затем проводили иммунофлуоресцентный анализ.Mitochondria were stained with JC-1 for 20 min and washed with wash buffer, followed by immunofluorescence analysis.
Результаты показали, что при лечении Аβ снижается мембранный потенциал митохондрий, в то время как PL201 лечение смягчает отрицательное действие Аβ, см. Фиг. 7.The results showed that Aβ treatment reduced mitochondrial membrane potential, while PL201 treatment mitigated the negative effects of Aβ, see FIG. 7.
Пример 8. PL201 улучшает уровень фосфорилирования AMPKExample 8 PL201 improves AMPK phosphorylation
Изменения функций митохондрий тесно связаны с регуляцией обмена сигнальных веществ, включая АМПК, который также считается тесно связанным с патогенезом БА. В этом примере изобретатели исследовали, влияет ли PL201 на метаболизм сигнальных веществ, обнаруживая уровень фосфорилирования AMPK в нервных стволовых клетках человека с помощью вестерн-блота.Changes in the functions of mitochondria are closely related to the regulation of the metabolism of signaling substances, including AMPK, which is also considered to be closely related to the pathogenesis of AD. In this example, the inventors investigated whether PL201 affects signaling metabolism by detecting the level of AMPK phosphorylation in human neural stem cells using Western blot.
Нервные стволовые клетки человека (3L) культивировали в DMEM/F12 (содержащем N2/B27 и 10 нг/мл bFGF), покрывали 12-луночными пластинами и инкубировали в течение 24 часов, затем добавляли Aβ (5 мкм) для предварительной обработки клеток в течение 30 минут, а затем добавляли PL201 (30 мкм). После совместной инкубации в течение 72 часов клетки промывали PBS и лизировали буфером для образцов Laemmli, затем проводили электрофорез SDS PAGE для выявления ассоциированных белковых полос с кроличьим антифосфо-АМПК и общим антителом к АМПК.Human neural stem cells (3L) were cultured in DMEM/F12 (containing N2/B27 and 10 ng/ml bFGF), plated in 12-well plates and incubated for 24 hours, then Aβ (5 μm) was added to pretreat the cells for 30 minutes and then PL201 (30 µm) was added. After co-incubation for 72 hours, cells were washed with PBS and lysed with Laemmli sample buffer, followed by SDS PAGE electrophoresis to detect associated protein bands with rabbit antiphospho-AMPK and total anti-AMPK.
Результаты показали, что лечение Аβ снижает уровень фосфорилирования АМПК, в то время как лечение PL201 уменьшает степень этого снижения, см. Фиг. 8.The results showed that treatment with Aβ reduced the level of AMPK phosphorylation, while treatment with PL201 reduced the extent of this reduction, see FIG. 8.
Пример 9. PL201 улучшает координацию мышей в тесте при восхождении на шестExample 9 PL201 Improves Mice Coordination in Pole Climbing Test
MPTP избирательно оказывает разрушающее действие на дофаминергические нейроны в черной субстанции головного мозга. MPTP-индуцированный паркинсонизм является наиболее классической животной моделью, которая воспроизводит большинство клинических и патологических признаков болезни Паркинсона. В основном БП проявляется такими симптомами, как тремор покоя, гипертония и гипомоторность. Время, чтобы развернуться и время, чтобы спуститься вниз в тесте восхождения на шест, может представлять общую двигательную координационную способность мышей.MPTP has a selective damaging effect on dopaminergic neurons in the substantia nigra of the brain. MPTP-induced parkinsonism is the most classical animal model that reproduces most of the clinical and pathological features of Parkinson's disease. The main symptoms of PD include resting tremor, hypertension, and hypomotority. The time to turn around and the time to descend in the pole climb test may represent the overall motor coordination ability of the mice.
Мыши случайным образом были разделены на 4 группы: Группа, в которой мышам вводили нормальный физиологический раствор (ФР), модельная группа MPTP, в которой мышам внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор (ФР+ MPTP), группа, в которой мышам внутрижелудочно вводили 50 мг соединения PL201 (PL201), и модельная группа MPTP, в которой мышам внутрижелудочно вводили соединение PL201 (PL201 + MPTP).Mice were randomly divided into 4 groups: Group in which mice were injected with normal saline (PS), MPTP model group, in which mice were injected intragastrically with normal saline (PS + MPTP), group in which mice were injected intragastrically with 50 mg of the compound PL201 (PL201), and the MPTP model group, in which the compound PL201 (PL201 + MPTP) was administered intragastrically to mice.
11 животных были объединены в группу, в которой мышам вводили нормальный физиологический раствор (ФР), 14 животных объединили в МФТП-модель группы, в которой мышам внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор (фр + МФТП), 4 животным в группе вводили внутрижелудочно одновременно 50 мг комплекса PL201 (PL201), и 15 животных объединили в группу и установили в МФТП-модели, в которой мышам внутрижелудочно вводили соединение PL201 (PL201+МФТП).11 animals were combined into a group in which mice were injected with normal saline (FR), 14 animals were combined into a MPTP model group in which mice were intragastrically injected with normal saline (fr + MPTP), 4 animals in the group were injected intragastrically simultaneously with 50 mg complex PL201 (PL201), and 15 animals were grouped and installed in the MPTP model, in which the compound PL201 (PL201+MPTP) was intragastrically administered to mice.
Введение начинали в день группирования животных: мышам в группе ФР и ФР+MPTP внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор, а мышам в двух других группах вводили соединение PL201 один раз в день в течение 7 последовательных дней. Начиная с 7-го дня мышам в группе ФР и PL201 внутрибрюшинно вводили 5 мл/кг нормального физиологического раствора, в то время как мышам в группе ФР + MPTP и PL201 + MPTP внутрибрюшинно вводили 25 мг/кг MPTP один раз в день в общей сложности в течение 5 дней.Administration was started on the day of grouping: mice in the FR and FR+MPTP groups were intragastrically injected with normal saline, and mice in the other two groups were treated with compound PL201 once a day for 7 consecutive days. Starting on
На 3-й день эксперимента для оценки моторно-координационной способности мышей был проведен тест на восхождение на шест. Мышку осторожно положили головой вверх на верхушку шеста с шероховатой поверхностью (1 см в диаметре и 50 см в высоту). Время, затраченное мышами на то, чтобы полностью повернуться от положения головы вверх к голове вниз, было записано как время разворота, а время, затраченное мышами от движения вниз до достижения всеми конечностями дна шеста, было записано как время спускания вниз. Время, превышающее 30 секунд, было записано как 30 секунд. Каждая мышь тестировалась 5 раз, а затем взято среднее значение.On the 3rd day of the experiment, a pole climbing test was performed to assess the motor-coordination ability of mice. The mouse was carefully placed head up on the top of a pole with a rough surface (1 cm in diameter and 50 cm in height). The time taken by the mice to turn completely from head up to head down was recorded as the turnaround time, and the time taken by the mice from moving down to reaching the bottom of the pole with all limbs was recorded as the descent time. Time exceeding 30 seconds was recorded as 30 seconds. Each mouse was tested 5 times and then an average was taken.
Результаты показали, что на 3-й день эксперимента мыши в группе ФР + MPTP тратили больше времени на разворот и спуск вниз, чем мыши в группе с нормальным физиологическим раствором (ФР). A введение PL201 сокращало время разворота и спуска в PL201 + МФТП группе по сравнению с ФР + МФТП группе.The results showed that on the 3rd day of the experiment, mice in the FR + MPTP group spent more time turning and descending than mice in the normal saline (FR) group. And the introduction of PL201 reduced the time of turn and descent in the PL201 + MPTP group compared to the PR + MPTP group.
Результаты показали, что соединение PL201 оказывает благоприятное влияние на инициацию движения и координационную способность МФТП модели мышей, см. Фиг. 9.The results showed that the PL201 compound had a beneficial effect on the movement initiation and coordination ability of the MPTP mouse model, see FIG. 9.
Пример 10. PL201 повышает уровень стриатальных дофаминергических нервных волоконExample 10 PL201 Increases Striatal Dopaminergic Nerve Fibers
Потеря дофаминергических нейронов в черной субстанции и стриатальных дофаминергических нервных волокон является основной патологической особенностью болезни Паркинсона. Вестерн-Блот может быть использован для обнаружения потери стриатальных дофаминергических нервных волокон для изучения влияния PL201 на уровень стриатальных дофаминергических нервных волокон.Loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra and striatal dopaminergic nerve fibers is a major pathological feature of Parkinson's disease. Western blot can be used to detect loss of striatal dopaminergic nerve fibers to study the effect of PL201 on striatal dopaminergic nerve fiber levels.
Мыши случайным образом были разделены на 4 группы: Группа, в которой мышам вводили нормальный физиологический раствор (ФР), модельная группа MPTP, в которой мышам внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор (ФР+MPTP), группа, в которой мышам внутрижелудочно вводили 50 мг соединения PL201 (PL201), и модельная группа MPTP, в которой мышам внутрижелудочно вводили соединение PL201 (PL201+MPTP).Mice were randomly divided into 4 groups: The group in which mice were injected with normal saline (PS), the MPTP model group in which mice were injected intragastrically with normal saline (PS + MPTP), the group in which mice were injected intragastrically with 50 mg of the compound PL201 (PL201), and an MPTP model group in which mice were intragastrically injected with compound PL201 (PL201+MPTP).
11 животных были объединены в группу, в которой мышам вводили нормальный физиологический раствор (ФР), 14 животных объединили в МФТП-модель группы, в которой мышам внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор (ФР+МФТП), 4 животным в группе вводили внутрижелудочно одновременно 50 мг комплекса PL201 (PL201), и 15 животных объединили в группу и установили в МФТП-модели, в которой мышам внутрижелудочно вводили соединение PL201 (PL201+МФТП).11 animals were combined into a group in which mice were injected with normal saline (PS), 14 animals were pooled in a MPTP model group in which mice were intragastrically injected with normal saline (PS + MPTP), 4 animals in the group were injected intragastrically simultaneously with 50 mg complex PL201 (PL201), and 15 animals were grouped and installed in the MPTP model, in which the compound PL201 (PL201+MPTP) was intragastrically administered to mice.
Введение начинали в день группирования животных: мышам в группе ФР и ФР+MPTP внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор, а мышам в двух других группах вводили соединение PL201 один раз в день в течение 7 последовательных дней. Начиная с 7-го дня мышам в группе ФР и PL201 внутрибрюшинно вводили 5 мл/кг нормального физиологического раствора, в то время как мышам в группе ФР+MPTP и PL201+MPTP внутрибрюшинно вводили 25 мг/кг MPTP один раз в день в общей сложности в течение 5 дней.Administration was started on the day of grouping: mice in the FR and FR+MPTP groups were intragastrically injected with normal saline, and mice in the other two groups were treated with compound PL201 once a day for 7 consecutive days. Starting on
На 7-й день после моделирования МПТП животных каждая группа подвергалась анестезированию с 10%-ным хлоралгидратом. После перфузии стриатум выделяли из ткани головного мозга и помещали в пробирки объемом 1,5 мл ЭП, добавляли 250 мкл лизисного буфера RIPA (Thermo Fisher) для проведения ультразвукового разрушения ткани, а супернатант собирали для определения концентрации белка. Концентрацию белка доводили до 2 мкг/мкл и добавляли 5-кратный загрузочный буфер (восстановительный), проводили кипячение для денатурации белка. Образец добавляли к 10%-ному электрофорезу SDS-полиакриламидного геля и переносили на активированную метанолом PVDF мембрану при 100 V. ТБСТ, содержащий 5% обезжиренного молока для блокирования при комнатной температуре в течение 1 ч, и добавляли первичное антитело TH (1:1000), затем инкубировали в течение ночи при 4°С. Неспецифическое связывание первичного антитела смывали буфером ТБСТ, а затем добавляли козье анти-мышиное/кроличье флуоресцентное вторичное антитело (LI-COR). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч троекратно промывали буфером ТБСТ. Флуоресцентным сканером был обнаружен флуоресцентный сигнал инфракрасного диапазона Odyssey и составлена статистика.On the 7th day after the simulation of MPTP of animals, each group was anesthetized with 10% chloral hydrate. After perfusion, the striatum was isolated from the brain tissue and placed in 1.5 ml EPO tubes, 250 μl of RIPA lysis buffer (Thermo Fisher) was added to perform ultrasonic tissue disruption, and the supernatant was collected to determine the protein concentration. The protein concentration was adjusted to 2 μg/μl and 5-fold loading buffer (reducing) was added, boiling was carried out to denature the protein. The sample was added to a 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a methanol-activated PVDF membrane at 100 V. TBST containing 5% skim milk for blocking at room temperature for 1 h and the primary antibody TH (1:1000) was added , then incubated overnight at 4°C. Non-specific binding of the primary antibody was washed out with TBST buffer and then a goat anti-mouse/rabbit fluorescent secondary antibody (LI-COR) was added. After incubation at room temperature for 1 h, it was washed three times with TBST buffer. The Odyssey infrared fluorescent signal was detected by a fluorescence scanner and statistics were compiled.
Результаты показали, что по сравнению с группой ФР+MPTP уровень стриатальных дофаминергических нервных волокон был достоверно повышен в группе PL201+MPTP после 7 дней моделирования MPTP. Соединение PL201 повышало уровень стриатальных дофаминергических нервных волокон у мышей, предполагается, что оно может защитить стриатальные дофаминергические нервные волокна от повреждения, вызванного MPTP, см. Фиг. 10. Результаты показали, что соединение PL201 способствует улучшению патогенеза болезни Паркинсона.The results showed that, compared with the RF+MPTP group, the level of striatal dopaminergic nerve fibers was significantly increased in the PL201+MPTP group after 7 days of MPTP simulation. Compound PL201 increased levels of striatal dopaminergic nerve fibers in mice, and is thought to protect striatal dopaminergic nerve fibers from MPTP-induced damage, see FIG. 10. The results showed that compound PL201 improved the pathogenesis of Parkinson's disease.
Пример 11. PL201 увеличивает количество дофаминергических нейронов в черной субстанции и уровень стриатальных дофаминергических нервных волоконExample 11 PL201 increases the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra and the level of striatal dopaminergic nerve fibers
Потеря дофаминергических нейронов в черной субстанции и стриатальных дофаминергических нервных волокон является основной патологической особенностью болезни Паркинсона. Иммуногистохимия тирозингидроксилазы (тг) может быть использована для обнаружения потери стриатальных дофаминергических нервных волокон, для исследования оказывает ли PL201 эффект увеличения числа дофаминергических нейронов в черной субстанции.Loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra and striatal dopaminergic nerve fibers is a major pathological feature of Parkinson's disease. Tyrosine hydroxylase (tg) immunohistochemistry can be used to detect loss of striatal dopaminergic nerve fibers to investigate whether PL201 has the effect of increasing the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra.
Мыши случайным образом были разделены на 4 группы: Группа, в которой мышам вводили нормальный физиологический раствор (ФР), модельная группа MPTP, в которой мышам внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор (ФР+ MPTP), группа, в которой мышам внутрижелудочно вводили 50 мг соединения PL201 (PL201), и модельная группа MPTP, в которой мышам внутрижелудочно вводили соединение PL201 (PL201 + MPTP).Mice were randomly divided into 4 groups: Group in which mice were injected with normal saline (PS), MPTP model group, in which mice were injected intragastrically with normal saline (PS + MPTP), group in which mice were injected intragastrically with 50 mg of the compound PL201 (PL201), and the MPTP model group, in which the compound PL201 (PL201 + MPTP) was administered intragastrically to mice.
11 животных были объединены в группу, в которой мышам вводили нормальный физиологический раствор (ФР), 14 животных объединили в МФТП-модель группы, в которой мышам внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор (ФР+МФТП), 4 животным в группе вводили внутрижелудочно одновременно 50 мг комплекса PL201 (PL201), и 15 животных объединили в группу и установили в МФТП-модели, в которой мышам внутрижелудочно вводили соединение PL201 (PL201+МФТП).11 animals were combined into a group in which mice were injected with normal saline (PS), 14 animals were pooled in a MPTP model group in which mice were intragastrically injected with normal saline (PS + MPTP), 4 animals in the group were injected intragastrically simultaneously with 50 mg complex PL201 (PL201), and 15 animals were grouped and installed in the MPTP model, in which the compound PL201 (PL201+MPTP) was intragastrically administered to mice.
Введение начинали в день группирования животных: мышам в группе ФР и ФР+MPTP внутрижелудочно вводили нормальный физиологический раствор, а мышам в двух других группах вводили соединение PL201 один раз в день в течение 7 последовательных дней. Начиная с 7-го дня мышам в группе ФР и PL201 внутрибрюшинно вводили 5 мл/кг нормального физиологического раствора, в то время как мышам в группе ФР+MPTP и PL201+MPTP внутрибрюшинно вводили 25 мг/кг MPTP один раз в день в общей сложности в течение 5 дней.Administration was started on the day of grouping: mice in the FR and FR+MPTP groups were intragastrically injected with normal saline, and mice in the other two groups were treated with compound PL201 once a day for 7 consecutive days. Starting on
На 7-й день после моделирования МПТП животных каждая группа подвергалась анестезированию с 10%-ным хлоралгидратом. После перфузии 4% параформальдегидом брали мозг. После фиксации в течение 24 часов 4% параформальдегидом образцы переносили в 30% раствор сахарозы до тех пор, пока они не обезвоживались (опускались на дно). Коронарные срезы среднего мозга и стриатума были сделаны в замораживающем микротоме при температуре -20°c. Толщина срезов мозга мыши составляла 30 мкм. Первичным антителом было моноклональное мышиное анти-TH (1:1000, кроличье анти-мышиное антитело). Первичное антитело использовали для инкубации при комнатной температуре в течение 2,5 часов и промывали раствором ТБСТ (8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия и 3 г Трис-основания, доводили объем до 1 л дистиллированной водой, доводили до рН 7,4 соляной кислотой) трижды, а затем вторичное антитело (козье анти-кроличье антитело), меченное пероксидазой хрена (ГПР), использовали для инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа. Diaminobenzidine (даб) был использован для визуализации ПХ сигналов, этанол использовался для градиента обезвоживание, ксилол использовался для ткани оптического просветления, а нейтральная резинка использовалась для монтажа. Для анализа окрашенных срезов использовалось программное обеспечение Image-pro plus. Общая плотность TH-позитивных клеток в черной субстанции рассматривалась как дофаминергические нейроны в черной субстанции, а средняя оптическая плотность TH-позитивного окрашивания в стриатуме использовалась в качестве меры плотности стриатальных дофаминергических нервных волокон.On the 7th day after the simulation of MPTP of animals, each group was anesthetized with 10% chloral hydrate. After perfusion with 4% paraformaldehyde, the brain was taken. After fixing for 24 hours with 4% paraformaldehyde, the samples were transferred to a 30% sucrose solution until they were dehydrated (sank to the bottom). Coronal sections of the midbrain and striatum were made in a freezing microtome at -20°C. The thickness of mouse brain sections was 30 μm. The primary antibody was monoclonal mouse anti-TH (1:1000, rabbit anti-mouse antibody). The primary antibody was used for incubation at room temperature for 2.5 hours and washed with a solution of TBST (8 g sodium chloride, 0.2 g potassium chloride and 3 g Tris base, brought to 1 L with distilled water, adjusted to
Результаты показали, что по сравнению с группой ФР+MPTP количество дофаминергических нейронов в черной субстанции и уровень стриатальных дофаминергических нервных волокон были значительно увеличены в группе PL20+MPTP. Соединение PL201 повышало уровень дофаминергических нейронов в черной субстанции и стриатальных дофаминергических нервных волокнах мышей, также предполагается? что оно может защищать дофаминергические нейроны в черной субстанции и стриатальные дофаминергические нервные волокна. Результаты показали, что соединение PL201 способствует улучшению патогенеза болезни Паркинсона, см. Фиг. 18.The results showed that, compared with the RF+MPTP group, the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra and the level of striatal dopaminergic nerve fibers were significantly increased in the PL20+MPTP group. The compound PL201 increased the level of dopaminergic neurons in the substantia nigra and striatal dopaminergic nerve fibers of mice, also suggested? that it may protect dopaminergic neurons in the substantia nigra and striatal dopaminergic nerve fibers. The results showed that compound PL201 improved the pathogenesis of Parkinson's disease, see FIG. 18.
Пример 12. PL202 снижает синтез Aβ Example 12 PL202 Reduces Aβ Synthesis
Аβ является основным патогенным белком БА. В этом примере изобретатели исследовали, оказывает ли изомер PL202 из PL201 эффект ингибирования и снижения синтеза Аβ путем обнаружения уровня Аβ на клетках нейробластомы SK-N-SH.Aβ is the main pathogenic protein in AD. In this example, the inventors investigated whether the PL202 isomer of PL201 has the effect of inhibiting and reducing Aβ synthesis by detecting the level of Aβ on SK-N-SH neuroblastoma cells.
Культура клеток нейробластомы SK-N-SH и обнаружение Aβ: клетки SK-N-SH культивировали в DMEM, покрывали 24-луночными пластинами и культивировали в течение 24 часов, затем добавляли PL201 (0, 30, 100 и 300 мкм). После совместной инкубации в течение 24 часов уровень общего белка Аβ в супернатанте определяли методом ИФА. Результаты показали, что обработка PL202 значительно ингибирует синтез Аβ, см. Фиг. 11.SK-N-SH neuroblastoma cell culture and Aβ detection: SK-N-SH cells were cultured in DMEM, covered with 24-well plates and cultured for 24 hours, then PL201 (0, 30, 100 and 300 μm) was added. After co-incubation for 24 hours, the level of total Aβ protein in the supernatant was determined by ELISA. The results showed that PL202 treatment significantly inhibited Aβ synthesis, see FIG. eleven.
Пример 13. PL202 ингибирует нейровоспаленияExample 13 PL202 Inhibits Neuroinflammation
Нейровоспаление в головном мозге при БА является одной из причин снижения когнитивных функций. Микроглиальные клетки являются ключевыми клетками, которые опосредуют нейровоспаление. В этом примере изобретатели исследовали, обладает ли PL202 эффектом ингибирования нейровоспаления путем обнаружения экспрессии воспалительных факторов на клеточной линии мыши BV-2.Neuroinflammation in the brain in AD is one of the causes of cognitive decline. Microglial cells are key cells that mediate neuroinflammation. In this example, the inventors investigated whether PL202 has an inhibitory effect on neuroinflammation by detecting the expression of inflammatory factors in the BV-2 mouse cell line.
Клетки BV-2 культивировали в DMEM, наносили на 24 луночные пластины и культивировали в течение 24 часов, затем добавляли PL202 (0, 30, 100, и 300 мкм) и LPS (300 нг/мл). После совместной инкубации в течение 24 часов для извлечения РНК использовали Тризол, а экспрессию родственных воспалительных факторов определяли методом QPCR.BV-2 cells were cultured in DMEM, plated on 24 well plates and cultured for 24 hours, then PL202 (0, 30, 100, and 300 μm) and LPS (300 ng/ml) were added. After co-incubation for 24 hours, Trizol was used to extract RNA, and the expression of related inflammatory factors was determined by QPCR.
Результаты показали, что лечение PL202 значительно ингибирует экспрессию воспалительных факторов IL-1β и iNOS, см. Фиг. 12.The results showed that PL202 treatment significantly inhibited the expression of the inflammatory factors IL-1β and iNOS, see FIG. 12.
Пример 14. PL171 снижает синтез Аβ Example 14 PL171 Reduces Aβ Synthesis
Аβ является основным патогенным белком БА. В этом примере изобретатели исследовали, эффект снижения или ингибирования веществом PL171 синтез Aβ путем обнаружения уровня Aβ на клетках нейробластомы SK-N-SH.Aβ is the main pathogenic protein in AD. In this example, the inventors investigated the effect of substance PL171 in reducing or inhibiting Aβ synthesis by detecting the level of Aβ on SK-N-SH neuroblastoma cells.
Культура клеток нейробластомы SK-N-SH и обнаружение Aβ: клетки SK-N-SH культивировали в DMEM, покрывали 24-луночными пластинами и культивировали в течение 24 часов, затем добавляли PL171 (300 мкм). После совместной инкубации в течение 24 часов уровень общего белка Аβ в супернатанте определяли методом ИФА.SK-N-SH neuroblastoma cell culture and Aβ detection: SK-N-SH cells were cultured in DMEM, covered with 24-well plates and cultured for 24 hours, then PL171 (300 μm) was added. After co-incubation for 24 hours, the level of total Aβ protein in the supernatant was determined by ELISA.
Результаты показали, что обработка PL171 значительно ингибирует синтез aβ, см. Фиг. 13.The results showed that PL171 treatment significantly inhibited aβ synthesis, see FIG. 13.
Пример 15. PL172 снижает синтез Аβ Example 15 PL172 Reduces Aβ Synthesis
Аβ является основным патогенным белком БА. В этом примере изобретатели исследовали, оказывает ли изомер PL172 из PL171 эффект ингибирования и снижения синтеза Аβ путем обнаружения уровня Аβ на клетках нейробластомы SK-N-SH.Aβ is the main pathogenic protein in AD. In this example, the inventors investigated whether the PL172 isomer of PL171 has the effect of inhibiting and reducing Aβ synthesis by detecting the level of Aβ on SK-N-SH neuroblastoma cells.
Культура клеток нейробластомы SK-N-SH и обнаружение Aβ: клетки SK-N-SH культивировали в DMEM, покрывали 24-луночными пластинами и культивировали в течение 24 часов, затем добавляли PL172 (300 мкм). После совместной инкубации в течение 24 часов уровень общего белка Аβ в супернатанте определяли методом ИФА.SK-N-SH neuroblastoma cell culture and Aβ detection: SK-N-SH cells were cultured in DMEM, covered with 24-well plates and cultured for 24 hours, then PL172 (300 μm) was added. After co-incubation for 24 hours, the level of total Aβ protein in the supernatant was determined by ELISA.
Результаты показали, что обработка PL172 значительно ингибирует синтез aβ, см. Фиг. 14.The results showed that PL172 treatment significantly inhibited aβ synthesis, see FIG. 14.
Пример 16. Синтез PL202Example 16 Synthesis of PL202
2,3,4-о-триацетилрамнозу (5,8 г, 20 ммоль) растворяли в 100 мл безводного дихлорметана, а ацилхлорид (4-О-TBS) -феруловой кислоты (6,52 г, 20 ммоль) (Free Radical Res. 2015, 102) - в 50 мл безводного раствора дихлорметана и затем по каплям добавляли 1,0 мл безводного пиридина под ледяной баней. После перемешивания реакцию останавливали в течение 2 часов при комнатной температуре. Для разбавления добавляли 200 мл дихлорметана, затем промывали насыщенным хлоридом натрия, сушили над MgSO4 и концентрировали. Продукт α-гликозилирования (9,12 г, 79%) и продукт β-гликозилирования (1,1 г, 9%) были получены соответственно методом колоночной хроматографии (петролейный эфир: этилацетат = 3:1). Продукт β-гликозилирования (490 мг, 0,85 ммоль) растворяли в высушенном ТГФ (8,0 мл), реакцию проводили под действием TBAF, разбавляли, промывали насыщенным хлоридом натрия, сушили над MgSO4 и концентрировали до получения 275 мг TBS-депротекторного продукта. 270 мг (0,58 ммоль) полученного продукта растворяли в 3,0 мл метанола, 0,5 мл 33% CH3NH2 в раствор метанола добавляли по каплям при 0°С и оставляли для реагирования в течение 1 часа при 0°С. 59 мг (0,17 ммоль) PL202 получали быстрым концентрированием при пониженном давлении и методом колоночного хроматографического разделения (этилацетат: метанол = 6:1). ESI (+)-MS: 341.3 [M + 1]+ ; 1H-ЯМР (CD3OD, 400 МГц) δ 7.80 (d, J = 12 Гц, 1H), 7.23 (d, J = 1 Гц, 1H), 7.12 (dd, J1 = 8 Гц, J2 = 1 Гц, 1H), 6.84 (d, J = 6 Гц, 1H), 6.42 (d, J = 13 Гц, 1H), 5.75 (d, J = 1 Гц, 1H), 3,99 (D, J = 2 Гц, 1 ч), 3,92 (S, 3 ч), 3,55-3,53 (M, 1 ч), 3,41-3,37 (m, 2 ч), 1,34 (D, J = 4 Гц, 3 ч).2,3,4-o-Triacetylrhamnose (5.8 g, 20 mmol) was dissolved in 100 ml anhydrous dichloromethane and (4-O-TBS)-ferulic acid acyl chloride (6.52 g, 20 mmol) (Free Radical Res 2015, 102) - in 50 ml of anhydrous dichloromethane solution and then 1.0 ml of anhydrous pyridine was added dropwise under an ice bath. After stirring, the reaction was stopped for 2 hours at room temperature. 200 ml dichloromethane was added to dilute, then washed with saturated sodium chloride, dried over MgSO 4 and concentrated. The α-glycosylation product (9.12 g, 79%) and the β-glycosylation product (1.1 g, 9%) were obtained respectively by column chromatography (petroleum ether: ethyl acetate=3:1). The β-glycosylation product (490 mg, 0.85 mmol) was dissolved in dried THF (8.0 ml), reacted with TBAF, diluted, washed with saturated sodium chloride, dried over MgSO 4 and concentrated to give 275 mg of TBS-deprotective product. 270 mg (0.58 mmol) of the obtained product was dissolved in 3.0 ml of methanol, 0.5 ml of 33% CH 3 NH 2 was added dropwise to the methanol solution at 0°C and left to react for 1 hour at 0°C . 59 mg (0.17 mmol) of PL202 was obtained by rapid concentration under reduced pressure and a column chromatographic separation method (ethyl acetate:methanol=6:1). ESI (+)-MS: 341.3 [M + 1] + ; 1 H-NMR (CD 3 OD, 400 MHz) δ 7.80 (d, J = 12 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 1 Hz, 1H), 7.12 (dd, J 1 = 8 Hz, J 2 = 1 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 6 Hz, 1H), 6.42 (d, J = 13 Hz, 1H), 5.75 (d, J = 1 Hz, 1H), 3.99 (D, J = 2 Hz, 1 h), 3.92 (S, 3 h), 3.55-3.53 (M, 1 h), 3.41-3.37 (m, 2 h), 1.34 (D , J = 4 Hz, 3 h).
Для проверки конфигурации PL202 был проведен эксперимент 1D NOE для получения спектра 1D N°E PL202, который доказал, что полученный PL202 находится в β-конфигурации, см. Фиг. 15.To verify the configuration of PL202, a 1D NOE experiment was performed to obtain a 1D N°E spectrum of PL202, which proved that the obtained PL202 is in the β-configuration, see FIG. 15.
Пример 17. Синтез PL171Example 17 Synthesis of PL171
1-амино-2,3,4-о-триацетилрамнозу (5,86 г, 19 ммоль) растворяли в 100 мл безводного дихлорметана, а (4-О-TBS) -ацилхлорид феруловой кислоты (6,5 г, 20 ммоль) (Free Radical Res. 2015, 102) в безводный раствор дихлорметана и по каплям добавляли 1,0 мл безводного пиридина под ледяной баней. После перемешивания реакцию останавливали в течение 2 часов при комнатной температуре. Для разбавления добавляли 200 мл дихлорметана, затем промывали насыщенным хлоридом натрия, сушили над MgSO4 и концентрировали. Продукт β-гликозилирования (8,22 г, 70%) и продукт α-гликозилирования (1,2 г, 10%) были получены соответственно методом колоночной хроматографии (петролейный эфир: этилацетат = 10:1-2:1). Продукт гликозилирования β (500 мг, 0,86 ммоль) растворяли в высушенном ТГФ (8,0 мл), реакцию проводили под действием TBAF, разбавляли, промывали насыщенным хлоридом натрия, сушили над MgSO4 и концентрировали до получения 300 мг TBS-депротекторного продукта. 300 мг (0,65 ммоль) полученного продукта растворяли в 3,0 мл дихлорметана, по каплям добавляли 0,5 мл 33%-ного раствора CH3NH2 в метаноле при 0°С и реагировали в течение 1 часа при 0°С. 70 мг (0,21 ммоль) PL171 получали быстрым концентрированием при пониженном давлении методом колоночного хроматографического разделения (дихлорметан: метанол = 20: 1-6: 1). ESI (+)-MS: 340.3 [M + 1]+; 1H-ЯМР (CD3°D, 400 МГц) δ 7.56 (d, J = 12 Гц, 1H) 7.19 (d, J = 4 Гц, 1H), 7.07 (dd, J1 = 6 Гц, J2 = 1 Гц, 1H), 6.82 (d, J = 4 Гц, 1H), 6.62 (d, J = 12 Гц, 1H), 5.28 (d, J = 1 Гц, 1H), 3,92 (S, 3H),3,85 (D, J = 4 Гц, 1H), 3,54-3,52 (M, 1h), 3,38-3,34 (M, 2H), 1,32 (D, J = 4 Гц, 3H).1-amino-2,3,4-o-triacetyl rhamnose (5.86 g, 19 mmol) was dissolved in 100 ml of anhydrous dichloromethane, and (4-O-TBS)-ferulic acid acyl chloride (6.5 g, 20 mmol) (Free Radical Res. 2015, 102) 1.0 ml of anhydrous pyridine was added dropwise under an ice bath to an anhydrous dichloromethane solution. After stirring, the reaction was stopped for 2 hours at room temperature. 200 ml dichloromethane was added to dilute, then washed with saturated sodium chloride, dried over MgSO 4 and concentrated. The β-glycosylation product (8.22 g, 70%) and the α-glycosylation product (1.2 g, 10%) were obtained respectively by column chromatography (petroleum ether: ethyl acetate = 10:1-2:1). Glycosylation product β (500 mg, 0.86 mmol) was dissolved in dried THF (8.0 ml), reacted under TBAF, diluted, washed with saturated sodium chloride, dried over MgSO 4 and concentrated to obtain 300 mg of TBS-deprotectant product . 300 mg (0.65 mmol) of the obtained product were dissolved in 3.0 ml of dichloromethane, 0.5 ml of a 33% solution of CH 3 NH 2 in methanol was added dropwise at 0°C and reacted for 1 hour at 0°C . 70 mg (0.21 mmol) of PL171 was obtained by rapid concentration under reduced pressure by column chromatographic separation (dichloromethane:methanol=20:1-6:1). ESI (+)-MS: 340.3 [M + 1] + ; 1 H-NMR (CD 3 °D, 400 MHz) δ 7.56 (d, J = 12 Hz, 1H) 7.19 (d, J = 4 Hz, 1H), 7.07 (dd, J 1 = 6 Hz, J 2 = 1 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 4 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 12 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 1 Hz, 1H), 3.92 (S, 3H) .3.85 (D, J = 4 Hz, 1H), 3.54-3.52 (M, 1h), 3.38-3.34 (M, 2H), 1.32 (D, J = 4 Hz, 3H).
Для проверки конфигурации PL171 были проведены эксперимент 1D NOE и эксперимент 1H-1H COSY (коррелированная спектроскопия) для получения спектров 1D NOE PL171, которые доказали, что полученный PL171 находится в конфигурации β, см. Фиг. 16.To verify the configuration of PL171, a 1D NOE experiment and a 1 H- 1 H COZY experiment (correlated spectroscopy) were performed to obtain 1D NOE spectra of PL171, which proved that the resulting PL171 is in the β configuration, see FIG. 16.
Пример 18. Синтез PL172Example 18 Synthesis of PL172
1-амино-2,3,4-о-триацетилрамнозу (5,86 г, 19 ммоль) растворяли в 100 мл безводного дихлорметана, а (4-О-TBS)-ацилхлорид феруловой кислоты (6,5 г, 20 ммоль) (Free Radical Res. 2015, 102) в безводный раствор дихлорметана и по каплям добавляли 1,0 мл безводного пиридина под ледяной баней. После перемешивания реакцию останавливали в течение 2 часов при комнатной температуре. Для разбавления добавляли 200 мл дихлорметана, затем промывали насыщенным хлоридом натрия, сушили над MgSO4 и концентрировали. Продукт β-гликозилирования (8,22 г, 70%) и продукт α-гликозилирования (1,2 г, 10%) были получены соответственно методом колоночной хроматографии (петролейный эфир:этилацетат = 10:1-2:1). Продукт β-гликозилирования (500 мг, 0,86 ммоль) растворяли в высушенном ТГФ (8,0 мл), реакцию проводили под действием TBAF, разбавляли, промывали насыщенным хлоридом натрия, сушили над MgSO4 и концентрировали до получения 250 мг TBS-депротекторного продукта. 300 мг (0,54 ммоль) полученного продукта растворяли в 3,0 мл дихлорметана, по каплям добавляли 0,5 мл 33%-ного раствора CH3NH2 в метаноле при 0°С и реагировали в течение 1 часа при 0°С. 45 мг (0,13 ммоль) PL172 получали быстрым концентрированием при пониженном давлении методом колоночного хроматографического разделения (дихлорметан: метанол = 20: 1-6: 1). ESI (+)-MS: 340.3 [M + 1]+; 1H-ЯМР (CD3OD, 400 МГц) δ 7.53 (d, J = 16 Гц, 1H) 7.14 (d, J = 41 Гц, 1H), 7.05 (dd, J1 = 8 Гц, J2 = 1 Гц, 1H), 6.80 (d, J = 8 Гц, 1H), 6.56 (d, J = 16 Гц, 1H), 5.56 (d, J = 4 Гц, 1H), 3,89 (S, 3H),3,85-3,83 (M,1H), 3,54-3,52 (M, 1H), 3,44 (T, J = 12 Гц, 1h), 3,31-3,3 (m, 1H) 1,27 (D, J = 4 Гц, 3h).1-amino-2,3,4-o-triacetylrhamnose (5.86 g, 19 mmol) was dissolved in 100 ml of anhydrous dichloromethane, and (4-O-TBS)-ferulic acid acyl chloride (6.5 g, 20 mmol) (Free Radical Res. 2015, 102) 1.0 ml of anhydrous pyridine was added dropwise under an ice bath to an anhydrous dichloromethane solution. After stirring, the reaction was stopped for 2 hours at room temperature. 200 ml dichloromethane was added to dilute, then washed with saturated sodium chloride, dried over MgSO 4 and concentrated. The β-glycosylation product (8.22 g, 70%) and the α-glycosylation product (1.2 g, 10%) were obtained respectively by column chromatography (petroleum ether:ethyl acetate = 10:1-2:1). The β-glycosylation product (500 mg, 0.86 mmol) was dissolved in dried THF (8.0 ml), reacted with TBAF, diluted, washed with saturated sodium chloride, dried over MgSO 4 and concentrated to give 250 mg of TBS-deprotective product. 300 mg (0.54 mmol) of the obtained product were dissolved in 3.0 ml of dichloromethane, 0.5 ml of a 33% solution of CH 3 NH 2 in methanol was added dropwise at 0°C and reacted for 1 hour at 0°C . 45 mg (0.13 mmol) of PL172 was obtained by rapid concentration under reduced pressure by column chromatographic separation (dichloromethane:methanol=20:1-6:1). ESI (+)-MS: 340.3 [M + 1] + ; 1 H-NMR (CD 3 OD, 400 MHz) δ 7.53 (d, J = 16 Hz, 1H) 7.14 (d, J = 41 Hz, 1H), 7.05 (dd, J 1 = 8 Hz, J 2 = 1 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 16 Hz, 1H), 5.56 (d, J = 4 Hz, 1H), 3.89 (S, 3H), 3.85-3.83 (M, 1H), 3.54-3.52 (M, 1H), 3.44 (T, J = 12 Hz, 1h), 3.31-3.3 (m, 1H) 1.27 (D, J = 4 Hz, 3h).
Все документы, указанные в этой заявке, включены сюда посредством ссылок так, как если бы каждый документ был индивидуально включен посредством ссылки. Кроме того, следует понимать, что после прочтения вышеприведенного раскрытия специалисты в данной области техники могут вносить различные изменения или модификации в изобретение, и эти эквивалентные формы также попадают под объем притязаний, определенный прилагаемой формулой изобретения.All documents referenced in this application are incorporated herein by reference as if each document were individually incorporated by reference. Furthermore, it should be understood that upon reading the above disclosure, those skilled in the art may make various changes or modifications to the invention, and these equivalent forms also fall within the scope of the appended claims.
Claims (52)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810119279.3 | 2018-02-06 | ||
| CN201810119279 | 2018-02-06 | ||
| CN201810616404 | 2018-06-14 | ||
| CN201810616404.1 | 2018-06-14 | ||
| PCT/CN2019/073773 WO2019154195A1 (en) | 2018-02-06 | 2019-01-29 | Therapeutic drug for neurodegenerative disease and application thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020128178A RU2020128178A (en) | 2022-03-09 |
| RU2799454C2 true RU2799454C2 (en) | 2023-07-05 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009093007A2 (en) * | 2008-01-21 | 2009-07-30 | The University Of York | Immune modulation by regioselectively modified glycosides |
| CN101914595A (en) * | 2010-09-07 | 2010-12-15 | 河南工业大学 | Method for synthesizing ferulic acid glycolipid derivatives by enzymatic method |
| CN104958287A (en) * | 2015-05-28 | 2015-10-07 | 四川大学 | Application of ferulic acid derivative as neuroprotective drug |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009093007A2 (en) * | 2008-01-21 | 2009-07-30 | The University Of York | Immune modulation by regioselectively modified glycosides |
| CN101914595A (en) * | 2010-09-07 | 2010-12-15 | 河南工业大学 | Method for synthesizing ferulic acid glycolipid derivatives by enzymatic method |
| CN104958287A (en) * | 2015-05-28 | 2015-10-07 | 四川大学 | Application of ferulic acid derivative as neuroprotective drug |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GROND S. et al. Structural Diversity of 1-O-Acyl α-L-Rhamnopyranosides by Precursor-Directed Biosynthesis with Streptomyces griseoviridis. European Journal of Organic Chemistry, 2000, V. 2000, N. 10, pp. 1841-2001, [онлайн], [найдено 07.06.2022]. Найдено из Интернет:https://doi.org/10.1002/(SICI)1099-0690(200005)2000:10<1875::AID-EJOC1875>3.0.CO;2-G. GROND S. et al. Novel α-L-Rhamnopyranosides from a Single Strain of Streptomyces by Supplement-Induced Biosynthetic Steps. European Journal of Organic Chemistry, 2002, V. 2002, N. 19, pp. 3213-3364, [онлайн], [найдено 07.06.2022]. Найдено из Интернет: doi.org/10.1002/1099-0690(200210)2002:19AID-EJOC3237>3.0.CO;2-T. ALLISSON B.J. et al. Peel of araticum fruit (Annona crassiflora Mart.) as a source of antioxidant compounds with α-amylase, α-glucosidase and glycation inhibitory activities. Bioorg Chem, 2016; V. 69, pp.167-182, [онлайн], [найдено 07.06.2022]. Найдено в PubMed, PMID: 27842248, doi: 10.1016/j.bioorg.2016.11.001. HIXSON J.L. et a * |
| RUKHSANA S. et al. Ferulic acid ethyl ester as a potential therapy in neurodegenerative disorders. Biochim Biophys Acta, 2012; V. 1822, N. 5, pp. 748-752, [онлайн], [найдено 07.06.2022]. Найдено в PubMed, PMID: 22064438, doi: 10.1016/j.bbadis.2011.10.015. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11426419B2 (en) | Compositions and methods for the repair of myelin | |
| US5874468A (en) | Brain targeted low molecular weight hydrophobic antioxidant compounds | |
| KR900001511B1 (en) | Catechol derivatives and preventive and remedial preparation for regressive disorders | |
| CA2517893C (en) | Use as medications of cholest-4-en-3-one derivatives, pharmaceutical compounds containing them, new derivatives and their preparation process | |
| JP2009545594A (en) | Pseudo-base benzo [c] phenanthridine with improved efficacy, stability and safety | |
| EA020496B1 (en) | Adamantyl benzamide derivative, pharmaceutical composition containing same and use thereof | |
| US20230404990A1 (en) | Neuroprotective cb2 receptor agonists | |
| KR20200120928A (en) | Derivatives of sobetirom | |
| WO2020024977A1 (en) | Compound for treating nervous system diseases and use thereof | |
| RU2799454C2 (en) | Therapeutic drug for the treatment of neurodegenerative diseases and its use | |
| US11643428B2 (en) | Therapeutic drug for neurodegenerative disease and application thereof | |
| WO2017035733A1 (en) | Conjugate of memantine and arctigenin, and composition and use thereof | |
| JP2021520413A (en) | Therapy for ophthalmic condition | |
| Shim et al. | Discovery of a NADPH oxidase inhibitor,(E)-3-cyclohexyl-5-(4-((2-hydroxyethyl)(methyl) amino) benzylidene)-1-methyl-2-thioxoimidazolidin-4-oneone, as a novel therapeutic for Parkinson's disease | |
| CN113214097B (en) | Compounds for the treatment of alzheimer's disease | |
| KR101712184B1 (en) | Dimeric Sesquiterpene Compound as Nrf2 Activator and Phamaceutical Composition Conprising the Same | |
| KR20180051430A (en) | Enantiomer of 8-hydroxyquinoline derivative and its synthesis | |
| JP2022527329A (en) | Aminoguanidine hydrazone as a retromer stabilizer useful for treating neurological disorders | |
| CN114072146A (en) | Indole compounds for use in neurorestoration | |
| CN114380883B (en) | Aminoalkoxy tripterine derivative, preparation method and application | |
| WO2020255983A1 (en) | MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION PORE (mPTP)-OPENING INHIBITOR, NOVEL COMPOUND EXHIBITING mPTP-OPENING INHIBITORY ACTIVITY, AND USE THEREFOR | |
| JP7382944B2 (en) | Novel compounds and their applications for preventing and treating neurodegenerative diseases | |
| CN116554144A (en) | SJ series aryl aniline compound and preparation method and medical application thereof | |
| KR20080051246A (en) | Pharmaceutical composition for prevention of treatment of neurodegenerative disease and inhibition of nadph oxidase | |
| JP2021520412A (en) | Therapy for protein misfolding disease |