RU2799410C1 - Synthetic oligonucleotide primers and a method of highly sensitive detection of african swine fever virus dna by loop isothermal amplification in the presence of internal control sample dna - Google Patents
Synthetic oligonucleotide primers and a method of highly sensitive detection of african swine fever virus dna by loop isothermal amplification in the presence of internal control sample dna Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799410C1 RU2799410C1 RU2022126146A RU2022126146A RU2799410C1 RU 2799410 C1 RU2799410 C1 RU 2799410C1 RU 2022126146 A RU2022126146 A RU 2022126146A RU 2022126146 A RU2022126146 A RU 2022126146A RU 2799410 C1 RU2799410 C1 RU 2799410C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- asf
- dna
- insdqualifier
- insdseq
- insdfeature
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной диагностики, в частности, к выявлению ДНК вируса африканской чумы свиней (АЧС) с помощью метода амплификации нуклеиновых кислот, а именно петлевой изотермической амплификации (LAMP).The invention relates to the field of molecular diagnostics, in particular, to the detection of African swine fever (ASF) virus DNA using a nucleic acid amplification method, namely loop isothermal amplification (LAMP).
Изобретение может быть использовано в ветеринарной лабораторной диагностике для выявления ДНК вируса АЧС в биологическом материале от животных - цельной/плазме/сыворотке крови, мазках со слизистых оболочек, суспензиях тканей (лимфоузлы, миндалины, селезенка, легкие, печень).The invention can be used in veterinary laboratory diagnostics to detect ASF virus DNA in biological material from animals - whole blood/plasma/serum, smears from mucous membranes, tissue suspensions (lymph nodes, tonsils, spleen, lungs, liver).
Африканская чума свиней - высококонтагиозная вирусная болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, цианозом кожи и обширными геморрагиями во внутренних органах. Относится к особо опасным заразным болезням животных, согласно списку МЭБ по Международной классификации заразных болезней животных, которые определяются как "заразные (трансмиссивные) болезни, которые имеют способность к опасному и быстрому распространению безотносительно к государственным границам, сопровождаются серьезными последствиями в области общественной экономики и здравоохранения, имеют важное значение в международной торговле животными и продуктами животноводства".African swine fever is a highly contagious viral disease of pigs, characterized by fever, cyanosis of the skin and extensive hemorrhages in the internal organs. Refers to especially dangerous contagious animal diseases, according to the OIE list according to the International Classification of Contagious Animal Diseases, which are defined as "contagious (transmissible) diseases that have the ability to dangerously and rapidly spread regardless of state borders, are accompanied by serious consequences in the field of public economy and health , are important in the international trade in animals and livestock products".
Возбудитель африканской чумы свиней - крупный ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae (диаметр вириона около 200 нм). Вирус имеет округлую или икосаэдрическую форму, структура вириона сложная, выявляются несколько слоев - внешняя суперкапсидная оболочка, происходящая из клеточной и приобретаемая в процессе выхода из клетки почкованием, икосаэдральный капсид, состоящий из субъединиц-капсомеров и сердцевина из слоя фибриллярных компонентов и нуклеотида. В виду особенностей строения вирус АЧС очень устойчив к факторам различной природы, в связи с чем его выживаемость в объектах среды и продуктах свиного происхождения необычно высока [1, 2].The causative agent of African swine fever is a large DNA-containing virus of the Asfarviridae family (virion diameter is about 200 nm). The virus has a round or icosahedral shape, the structure of the virion is complex, several layers are revealed - the outer supercapsid shell, originating from the cell and acquired in the process of leaving the cell by budding, the icosahedral capsid, consisting of subunits-capsomeres and the core of the layer of fibrillar components and nucleotide. In view of the structural features of the ASF virus, it is very resistant to factors of various nature, and therefore its survival rate in environmental objects and products of pig origin is unusually high [1, 2].
Вирус обладает высокой степенью патогенности (смертность среди животных достигает 100%). Заболевание является эндемичным для многих стран Южной Африки. В 2007 г. вирус АЧС был занесен в Кавказский регион, изначально в Грузию, затем в Армению, Азербайджан и во многие регионы Российской Федерации и Белоруссию. С начала 2014 г. вспышки африканской чумы свиней фиксируются во многих Европейских странах (Латвия, Литва, Эстония, Польша, Венгрия, Чехия, Румыния, Болгария, Словакия, Сербия, Бельгия и др.). В 2018 году, когда АЧС получила распространение в Китае, стране с огромным поголовьем свиней, ситуация значительно ухудшилась, позднее АЧС распространилась и в других странах Азиатского континента, в том числе Монголии, Вьетнаме, Камбодже, Северной Корее, Мьянме, Лаосе, Филиппинах [3].The virus has a high degree of pathogenicity (mortality among animals reaches 100%). The disease is endemic to many countries in South Africa. In 2007, the ASF virus was introduced into the Caucasus region, initially to Georgia, then to Armenia, Azerbaijan and many regions of the Russian Federation and Belarus. Since the beginning of 2014, outbreaks of African swine fever have been recorded in many European countries (Latvia, Lithuania, Estonia, Poland, Hungary, Czech Republic, Romania, Bulgaria, Slovakia, Serbia, Belgium, etc.). In 2018, when ASF spread in China, a country with a huge number of pigs, the situation worsened significantly, later ASF spread to other countries of the Asian continent, including Mongolia, Vietnam, Cambodia, North Korea, Myanmar, Laos, Philippines [3 ].
Разработанные методы лечения и специфической профилактики болезни малоэффективны, поэтому распространение АЧС наносит огромные экономические потери, обусловленные проведением ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий и убоя всего естественно восприимчивого поголовья на территории очага инфекции.The developed methods of treatment and specific prevention of the disease are ineffective, therefore, the spread of ASF causes huge economic losses due to the implementation of veterinary and sanitary and quarantine measures and the slaughter of all naturally susceptible livestock in the territory of the infection focus.
Несмотря на многолетней опыт и имеющиеся подробные рекомендации по лабораторной диагностике, идентификация вируса АЧС традиционными методами (по его биологическим свойствам) требует значительных затрат и времени. Для лабораторной диагностики Всемирной организацией здравоохранения животных (МЭБ) рекомендуются молекулярные методы, как обладающие высокой чувствительностью и специфичностью, в том числе ПЦР (полимеразная цепная реакция) с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле или ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентными зондами. Использование подобных ПЦР методик в диагностике АЧС значительно повысило эффективность своевременной расшифровки данной этиологии [4, 5]. ПЦР имеет хорошие аналитические и диагностические характеристики, однако требует дорогостоящего оборудования, а исследование занимает достаточно много времени (не менее 4-6 часов, включая этап экстракции нуклеиновых кислот). Новые методы изотермической амплификации появились в начале 21 века и успешно применяются для выявления широкого круга возбудителей инфекционных болезней. Так метод петлевой амплификации, LAMP, предложенный японским ученым Tsugunori Notomi в 2000 году [6], основывался на использовании праймеров к шести различным участкам целевой области генома. Впоследствии, метод был усовершенствован путем добавления пары петлевых праймеров [7], обеспечивающих дополнительную амплификацию с петель образующихся продуктов LAMP, что повысило эффективность реакции. Преимуществом изотермических методов является сокращение времени амплификации от нескольких часов до 15-30 минут. Другим важным преимуществом изотермических методов является возможность их применения в условиях ограниченных ресурсов без использования сложного оборудования. Изотермическая реакция может идти при постоянной температуре в термостате, а детекция результатов возможна визуальным способом, например, за счет помутнения раствора из-за появления осадка пирофосфата магния [8] или изменения цвета pH-чувствительных красителей [9].Despite many years of experience and available detailed recommendations for laboratory diagnostics, the identification of the ASF virus by traditional methods (according to its biological properties) requires significant costs and time. For laboratory diagnostics, the World Organization for Animal Health (OIE) recommends molecular methods as having high sensitivity and specificity, including PCR (polymerase chain reaction) with detection of amplification products in agarose gel or real-time PCR with hybridization fluorescent probes. The use of similar PCR techniques in the diagnosis of ASF has significantly increased the efficiency of timely interpretation of this etiology [4, 5]. PCR has good analytical and diagnostic characteristics, but requires expensive equipment, and the study takes a lot of time (at least 4-6 hours, including the nucleic acid extraction stage). New methods of isothermal amplification appeared at the beginning of the 21st century and are successfully used to detect a wide range of pathogens of infectious diseases. Thus, the loop amplification method, LAMP, proposed by the Japanese scientist Tsugunori Notomi in 2000 [6], was based on the use of primers to six different regions of the target region of the genome. Subsequently, the method was improved by adding a pair of loop primers [7], providing additional amplification from the loops of the resulting LAMP products, which increased the efficiency of the reaction. The advantage of isothermal methods is the reduction of amplification time from several hours to 15-30 minutes. Another important advantage of isothermal methods is the possibility of their application in resource-limited conditions without the use of sophisticated equipment. An isothermal reaction can proceed at a constant temperature in a thermostat, and the results can be detected visually, for example, due to the turbidity of the solution due to the appearance of a precipitate of magnesium pyrophosphate [8] or a change in the color of pH-sensitive dyes [9].
Для выявления вируса АЧС предложено несколько вариантов методик изотермической амплификации, основанных на различных технологиях (LAMP, RPA, RAA-CAS12a) однако в большинстве случаев детекция результатов амплификации осуществляется с использованием неспецифической без-зондовой детекции (например с использованием интеркалирующих и рН зависимых красителей [10, 11] либо иммунохроматографических полосок [12]). Во многих случаях заявленная аналитическая чувствительность подобных быстрых методик достаточно низкая, так чувствительность RPA с детекцией на иммунохроматографических полосках составляет 150 копий на реакцию [13], хотя в отдельных случаях авторам удается добиться чувствительности сравнимой с чувствительностью метода ПЦР, так для LAMP c колориметрической детекцией авторами [14] заявлена чувствительность до 10 копий на реакцию. Колориметрические методы имеют преимущества по сравнению с другими методами неспецифической детекции, поскольку они более чувствительны, а также более устойчивы к наличию непрозрачных веществ в реакционной смеси, в отличие от турбидиметрического анализа.To detect the ASF virus, several variants of isothermal amplification methods based on various technologies (LAMP, RPA, RAA-CAS12a) have been proposed; however, in most cases, the detection of amplification results is carried out using non-specific probeless detection (for example, using intercalating and pH-dependent dyes [10 , 11] or immunochromatographic strips [12]). In many cases, the declared analytical sensitivity of such rapid methods is quite low, so the sensitivity of RPA with detection on immunochromatographic strips is 150 copies per reaction [13], although in some cases the authors manage to achieve a sensitivity comparable to the sensitivity of the PCR method, so for LAMP with colorimetric detection, the authors [14] claimed a sensitivity of up to 10 copies per reaction. Colorimetric methods have advantages over other non-specific detection methods because they are more sensitive and also more resistant to the presence of opaque substances in the reaction mixture, in contrast to turbidimetric analysis.
Однако общим основным недостатком использования всех неспецифических методов обнаружения является повышенная вероятность неспецифических реакций [14] Флуоресцентные зонды, такие как молекулярные маяки или TaqMan зонды [15, 16], широко используются для детекции накопления продуктов амплификации при ПЦР диагностике. Данные олигонуклеотидные зонды имеют флуорофор и гаситель флуоресценции, флуоресценция испускается при отдалении молекулы-гасителя от флуорофора. В случае молекулярного маяка это происходит при разрушении шпилевидной структуры зонда при его гибридизации с последовательностью-мишенью, в случае с TaqMan-зондом, зонд разрушается при амплификации за счет экзонуклеазной активности Taq ДНК полимеразы и гаситель отщепляется от флуорофора. Однако оба типа зондов не могут использоваться для детекции результатов LAMP. Молекулярные маяки самопроизвольно разворачиваются при температуре реакции LAMP (от 60 до 65°C), что повышает фоновый сигнал, а TaqMan зонды не могут быть разрушены Bst ДНК полимеразой не имеющей экзонуклеазной активности, в отличие от Taq ДНК полимеразы.However, the general main disadvantage of using all nonspecific detection methods is the increased probability of nonspecific reactions [14]. Fluorescent probes, such as molecular beacons or TaqMan probes [15, 16], are widely used to detect the accumulation of amplification products in PCR diagnostics. These oligonucleotide probes have a fluorophore and a fluorescence quencher, fluorescence is emitted when the quencher molecule moves away from the fluorophore. In the case of a molecular beacon, this occurs when the spire-like structure of the probe is destroyed during its hybridization with the target sequence; in the case of the TaqMan probe, the probe is destroyed during amplification due to the exonuclease activity of Taq DNA polymerase and the quencher is cleaved from the fluorophore. However, both probe types cannot be used to detect LAMP results. Molecular beacons spontaneously unfold at the LAMP reaction temperature (60 to 65°C), which increases the background signal, and TaqMan probes cannot be destroyed by Bst DNA polymerase, which does not have exonuclease activity, unlike Taq DNA polymerase.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения по сути и назначению является метод петлевой изотермической амплификации с использованием интеркалирующих красителей, разработанный авторами патента RU 2710065 C1. Данный метод является экспресс тестом, позволяющим провести амплификацию в течение 30-40 минут, однако его применение в условиях хорошо оснащенных лабораторий не оправдано, из-за невозможности контролировать потери нуклеинового материала и очистку от ингибирующих реакцию амплификации веществ при экстракции ДНК. Более того амплификация в присутствии интеркалирующих красителей может давать ложноположительные результаты из-за неспецифичных реакций, что ухудшает диагностические характеристики метода. Использование внутреннего контрольного образца с этапа экстракции ДНК, предусмотренное в нашем изобретении, позволяет контролировать потери нуклеинового материала и ингибирование реакции амплификации, что значительно улучшает диагностическую чувствительность метода и снижает количество ложно-отрицательных результатов.The closest analogue of the claimed invention in essence and purpose is the method of loop isothermal amplification using intercalating dyes, developed by the authors of patent RU 2710065 C1. This method is an express test that allows amplification to be carried out within 30-40 minutes, however, its use in well-equipped laboratories is not justified, due to the inability to control the loss of nucleic material and purification from substances inhibiting the amplification reaction during DNA extraction. Moreover, amplification in the presence of intercalating dyes can give false positive results due to non-specific reactions, which impairs the diagnostic performance of the method. The use of an internal control sample from the DNA extraction step, provided in our invention, makes it possible to control the loss of nucleic material and the inhibition of the amplification reaction, which significantly improves the diagnostic sensitivity of the method and reduces the number of false negative results.
С целью устранения вышеуказанных недостатков задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и экспрессного способа выявления присутствия ДНК вируса АЧС при помощи петлевой изотермической амплификации с гибридизационно-флуоресцентными зондами. Разработанный способ является быстрой альтернативой ПЦР и позволяет мультиплексировать реакции выявления ДНК вируса АЧС и ДНК внутреннего контрольного образца в одной пробирке, используя различные флуоресцирующие метки. В качестве зондов использовали модифицированные внутренние праймеры FIP, содержащие на 5‘ конце гаситель флуоресценции в дуплексе с небольшим олигонуклеотидом, содержащим на 3’ конце флуорофор. Также в отличие от способа предложенного в патенте RU 2 710 065 C1, использующего в качестве мишени фрагмент гена кодирующего белок р22 вируса АЧС, в данной работе олигонуклеотидные праймеры подобраны к хорошо изученной и часто используемой для разработки ПЦР методик выявления вируса АЧС мишени - фрагменту гена мажорного капсидного белка p72 [17, 18, 19, 20].In order to eliminate the above disadvantages, the present invention aims to develop a highly sensitive and rapid method for detecting the presence of ASF virus DNA using loop isothermal amplification with hybridization fluorescent probes. The developed method is a fast alternative to PCR and makes it possible to multiplex the detection of ASF virus DNA and DNA of an internal control sample in one test tube using various fluorescent labels. Modified internal FIP primers containing a fluorescence quencher at the 5' end in duplex with a small oligonucleotide containing a fluorophore at the 3' end were used as probes. Also, in contrast to the method proposed in patent RU 2 710 065 C1, which uses as a target a fragment of the gene encoding the p22 protein of the ASF virus, in this work, oligonucleotide primers are selected for the well-studied and often used for the development of PCR methods for detecting the ASF virus of the target - a fragment of the major gene. capsid protein p72 [17, 18, 19, 20].
Задача по разработке высокочувствительного, специфичного и быстрого метода выявления вируса АЧС была решена благодаря созданию олигонуклеотидных праймеров комплементарных участку гена p72 вируса АЧС, а также созданию праймеров комплементарых участку правого плеча генома бактериофага лямбда и подбору условий для проведения их совместной петлевой изотермической амплификации, обеспечивающей получение результата в течение 20-30 минут.The task of developing a highly sensitive, specific and rapid method for detecting the ASF virus was solved by creating oligonucleotide primers complementary to the p72 gene region of the ASF virus, as well as creating primers complementary to the region of the right arm of the bacteriophage lambda genome and selecting conditions for their joint loop isothermal amplification, which provides the result within 20-30 minutes.
Сущность изобретения заключается в новом подходе обнаружения ДНК вируса АЧС с помощью проведения модифицированной петлевой изотермической амплификации с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров ( ASF-F3, ASF-В3, ASF-F, ASF-BL, ASF-FIP, ASF-BIP), фланкирующих специфический фрагмент генома вируса АЧС, олигонуклеотидных праймеров (IC-F3, IC-В3, IC-F, IC-BL, IC-FIP, IC-BIP) фланкирующий специфический фрагмент бактериофага лямбда, а также зондов ASF-FIP- BHQ1/ ASF-R6G, IC-FIP- BHQ1/ IC- FAM на основе внутренних праймеров FIP. Использованный в данном изобретении подход основан на применении FIP модифицированных праймеров, несущих на 5’ конце гаситель флуоресценции, в сочетании с олигонуклеотидами, комплементарными 5’ участкам FIP праймеров и несущим на 3’ конце флуорофор, как описано ранее авторами [24].The essence of the invention lies in a new approach for the detection of ASF virus DNA using a modified loop isothermal amplification using the developed oligonucleotide primers (ASF-F3, ASF-B3, ASF-F, ASF-BL, ASF-FIP, ASF-BIP) flanking a specific a fragment of the ASF virus genome, oligonucleotide primers (IC-F3, IC-B3, IC-F, IC-BL, IC-FIP, IC-BIP) flanking specific fragment of bacteriophage lambda, as well as ASF-FIP-BHQ1/ ASF-R6G probes , IC-FIP- BHQ1/ IC-FAM based on internal FIP primers. The approach used in this invention is based on the use of FIP modified primers carrying a fluorescence quencher at the 5' end in combination with oligonucleotides complementary to the 5' regions of the FIP primers and carrying a fluorophore at the 3' end, as previously described by the authors [24].
Представленный способ включает последовательности олигонуклеотидных праймеров, имеющих следующую нуклеотидный состав:The presented method includes the sequences of oligonucleotide primers having the following nucleotide composition:
ASF-F3 ATTACGTCTTATGTCCAGA,ASF-F3 ATTACGTCTTATGTCCAGA,
ASF-В3 AGACTGGATATAAGCACTTG,ASF-B3 AGACTGGATATAAGCACTTG,
ASF-F TCACAATATCCAAACAGCAGGT,ASF-F TCACAATATCCAAACAGCAGGT,
ASF-BL TAAGAATAGGTTTGCTYTGGTG,ASF-BL TAAGAATAGGTTTGCTYTGGTG,
ASF-FIP ACCAACCCGAAATTCCTTTCACTTTTTGCGTCCGTAATAGRGTRATA,ASF-FIP ACCAACCCGAAATTCCTTTCACTTTTTGCGTCCGTAATAGRGTRATA,
ASF-BIP GTTCGCTCGTATCATTTTCATTTTTAGGTATCGGTGGAGGGAACY,ASF-BIP GTTCGCTCGTATCATTTTCATTTTTAGGTATCGGTGGAGGGAACY,
IC-F3 AAACGCAACGAGGCTCTA,IC-F3 AAACGCAACGAGGCTCTA,
IC-В3 GGATTTGTTCAGAACGCTC,IC-B3 GGATTTGTTCAGAACGCTC,
IC-FL ACAGCTTCCGCTGTCTTCTCA,IC-FL ACAGCTTCCGCTGTCTTCTCA,
IC-BL GTTGACGACGACATGGCTC,IC-BL GTTGACGACGACATGGCTC,
IC-FIP CCTGCTGATCTGCGACTTATTTCGAGAGTGCGTTGCTTAAC,IC-FIP CCTGCTGATCTGCGACTTATTTCGAGAGTGCGTTGCTTAAC,
IC -BIP GGATTCCAAAGTTCTCAATGCTTTTGAGAATCGCAGCAACTTGTIC-BIP GGATTCCAAAGTTCTCAATGCTTTTGAGAATCGCAGCAACTTGT
ASF-FIP- BHQ1/ ASF-R6GASF-FIP-BHQ1/ ASF-R6G
BHQ1-ACCAACCCGAAATTCCTTTCACTTTTTGCGTCCGTAATAGRGTRATA / GTGAAAGGAATTTCGGGTTGGT-R6G,BHQ1-ACCAACCCGAAATTCCTTTCACTTTTTGCGTCCGTAATAGRGTRATA / GTGAAAGGAATTTCGGGTTGGT-R6G,
IC-FIP- BHQ1/ IC- FAMIC-FIP-BHQ1/ IC-FAM
BHQ1-CCTGCTGATCTGCGACTTATTTCGAGAGTGCGTTGCTTAAC / BHQ1-CCTGCTGATCTGCGACTTATTTCGAGAGTGCGTTGCTTAAC /
ATAAGTCGCAGATCAGCAGG-FAM.ATAAGTCGCAGATCAGCAGG-FAM.
Способ выявления ДНК вируса АЧС основан на экстракции ДНК из биологического материала совместно с ДНК экзогенного контрольного образца (бактериофага лямбда) и проведении амплификации полученной ДНК в режиме «реального времени» изотермическим способом. Амплификация фрагмента ДНК бактериофага лямбда при проведении исследования будет свидетельствовать об отсутствии ингибирования реакции и потерь ДНК при экстракции, что позволит исключить ложноотрицательные результаты.The method for detecting ASF virus DNA is based on the extraction of DNA from biological material together with the DNA of an exogenous control sample (bacteriophage lambda) and amplification of the obtained DNA in the "real time" mode by the isothermal method. Amplification of a DNA fragment of bacteriophage lambda during the study will indicate the absence of inhibition of the reaction and loss of DNA during extraction, which will eliminate false negative results.
С полученными на этапе экстракции пробами ДНК проводится изотермическая петлевая амплификация ДНК при помощи Bst ДНК полимеразы и набора специфичных праймеров олигонуклеотидов (ASF-F3, ASF-В3, ASF-F, ASF-BL, ASF-FIP, ASF-BIP, IC-F3, IC-В3, IC-F, IC-BL, IC-FIP, IC-BIP), включая меченые гасителями праймеры, связанные с флуоресцентно-меченными олигонуклеотидами (ASF-FIP-BHQ1/ ASF-R6G, IC-FIP- BHQ1/ IC- FAM). При амплификации происходит вытеснение флуоресцентно-меченого олигонуклеотида от праймера-гасителя, что приводит к нарастанию интенсивности флуоресценции.With the DNA samples obtained at the extraction stage, isothermal loop amplification of DNA is carried out using Bst DNA polymerase and a set of specific oligonucleotide primers (ASF-F3, ASF-B3, ASF-F, ASF-BL, ASF-FIP, ASF-BIP, IC-F3 , IC-B3, IC-F, IC-BL, IC-FIP, IC-BIP), including quencher-labeled primers associated with fluorescently labeled oligonucleotides (ASF-FIP-BHQ1/ ASF-R6G, IC-FIP-BHQ1/ IC-FAM). During amplification, the fluorescently labeled oligonucleotide is displaced from the quencher primer, which leads to an increase in the fluorescence intensity.
Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала. Таким образом при исследовании одновременно в одной пробирке проводятся две реакции - амплификация ДНК вируса АЧС и амплификация ДНК бактериофага лямбда, результаты регистрируются по двум каналам флуоресцентной детекции.Fluorescent signal detection is carried out using an amplifier with a fluorescent signal detection system. Thus, during the study, two reactions are carried out simultaneously in one test tube - amplification of the DNA of the ASF virus and amplification of the DNA of the bacteriophage lambda, the results are recorded using two channels of fluorescent detection.
Для разработки праймеров использовали нуклеотидные последовательности фрагментов геномов изолятов вируса АЧС из баз данных NCBI, включая отечественные опубликованные последовательности. Последовательности выравнивали относительно друг друга в программах Mega-X (алгоритм ClustalW), Ugene (алгоритм MUSCLE) для выявления специфичных и консервативных участков. Затем на выбранных достаточно консервативных для вируса АЧС участках генома выбирали праймеры для LAMP. Праймеры проверяли на отсутствие значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями всех нецелевых организмов из базы данных NCBI, которая включает в себя нуклеотидные последовательности GenBank + EMBL + DDBJ + PDB, использовали ресурс Basic Local Alignment Search Tool BLAST [22]. Также оценивали наличие полиморфизмов в областях праймеров для различных последовательностей целевого вируса, при необходимости вносили в олигонуклеотидные праймеры вырождения, чтобы учесть значимые варианты. Менее значимые полиморфизмы, расположенные внутри праймеров или на 5`-конце для праймеров F3, B3 и фрагментов F2, B2 праймеров FIP, BIP или на 3`-конце фрагментов F1c, B1c праймеров FIP, BIP оставляли без вырождения. Праймеры для LAMP подбирали с учетом следующих критериев: специфичность; температура плавления праймеров; состав праймеров; расстояние между праймерами; отсутствие значимых шпилек; отсутствие значимых димеров на 3`- концах праймеров; отсутствие значимых димеров с другими праймерами; длина праймера; GC-состав; в составе праймеров избегали динуклеотидных повторов внутри праймеров, а также повторов одинаковых нуклеотидов больше 3 раз подряд.For the development of primers, the nucleotide sequences of fragments of the genomes of ASF virus isolates from the NCBI databases, including domestic published sequences, were used. The sequences were aligned relative to each other using the Mega-X (ClustalW algorithm) and Ugene (MUSCLE algorithm) programs to identify specific and conserved regions. Then, primers for LAMP were selected on selected genome regions that were quite conservative for the ASF virus. The primers were checked for the absence of significant homology with the nucleotide sequences of all non-target organisms from the NCBI database, which includes the GenBank + EMBL + DDBJ + PDB nucleotide sequences, using the Basic Local Alignment Search Tool BLAST resource [22]. The presence of polymorphisms in the regions of the primers for different sequences of the target virus was also assessed, if necessary, introduced into the oligonucleotide degenerate primers to take into account significant variants. Less significant polymorphisms located inside the primers or at the 5'-end for the F3, B3 primers and the F2, B2 fragments of the FIP, BIP primers or at the 3'-end of the F1c, B1c fragments of the FIP, BIP primers were left without degeneration. Primers for LAMP were selected based on the following criteria: specificity; melting point of primers; composition of primers; distance between primers; absence of significant hairpins; the absence of significant dimers at the 3' ends of the primers; lack of significant dimers with other primers; primer length; GC composition; dinucleotide repeats within the primers, as well as repeats of the same nucleotides more than 3 times in a row, were avoided in the primers.
Специфичность проверяли с использованием базы данных нуклеотидных последовательностей NCBI [22]. Температуру плавления праймеров оценивали с помощью онлайн-программы Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator [23]. Для внутренних участков праймеров (F1c, B1c, FL, BL) она должна быть на несколько градусов выше, чем для внешних (F3, B3, F2, B2). Отсутствие значимых вторичных структур (шпилек и димеров) проверяли с использованием программы PrimerSelect (Dnastar, Inc., Madison, WI). Для детекции результатов LAMP использовали модифицированные праймеры, образующие дуплекс с олигонуклеотидами несущими флуоресцентную метку. В образуемом перед реакцией амплификации дуплексе модифицированного праймера и флуоресцентно меченного олигонуклеотида флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости. В процессе петлевой амплификации Bst ДНК полимераза вытесняет флуоресцентно меченный олигонуклеотид с 5’ конца модифицированного праймера, что приводит к накоплению флуоресцентного сигнала в реакционной смеси.Specificity was checked using the NCBI database of nucleotide sequences [22]. The melting point of the primers was estimated using the Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator online program [23]. For the inner regions of the primers (F1c, B1c, FL, BL) it should be several degrees higher than for the outer ones (F3, B3, F2, B2). The absence of significant secondary structures (hairpins and dimers) was checked using the PrimerSelect program (Dnastar, Inc., Madison, WI). To detect the results of LAMP, modified primers were used that formed a duplex with oligonucleotides bearing a fluorescent label. In the duplex of the modified primer and the fluorescently labeled oligonucleotide formed before the amplification reaction, the fluorophore and the quencher are in close proximity. During loop amplification, Bst DNA polymerase displaces the fluorescently labeled oligonucleotide from the 5' end of the modified primer, which leads to the accumulation of a fluorescent signal in the reaction mixture.
Использование дуплексов меченного гасителем праймера с комплементарным олигонуклеотидом меченным флуорофором, позволяет следить за реакцией изотермической амплификации за счет накопления флуоресценции при включении модифицированного праймера в процесс амплификации с последующим вытеснением комплементарного олигонуклеотида Bst ДНК полимеразой.The use of duplexes of a quencher-labeled primer with a complementary oligonucleotide labeled with a fluorophore makes it possible to monitor the reaction of isothermal amplification due to the accumulation of fluorescence when the modified primer is included in the amplification process, followed by displacement of the complementary Bst oligonucleotide by DNA polymerase.
Основная характеристика рассчитанных олигонуклеотидов представлена в таблице 1.The main characteristics of the calculated oligonucleotides are presented in Table 1.
* Обозначения вырожденных нуклеотидов: Y = C или T, R =A или G.* Designations for degenerate nucleotides: Y = C or T, R = A or G.
Готовят 2,5 x смесь LAMP, содержащую следующие компоненты: праймеры для амплификации ДНК вируса АЧС и ДНК бактериофага лямбда (табл. 1) в следующих концентрациях ASF-FIP, IC-FIP - по 1.0 μM, ASF-BIP, IC-BIP - по 2.5 μM, ASF-F3, ASF-B3, IC-F3, IC-B3 - по 0.5 μM, ASF-FL, IC-FL, ASF-BL, IC-BL - 1.0 μM, зондов-праймеров ASF-FIP-BHQ1, IC-FIP-BHQ1 по 1.5 μM, ASF-R6G , IC -FAM - 2.0 μM, 1,4 мМ каждого дНТФ (Синтол, Россия), стерильная деионизованная вода.A 2.5 x LAMP mixture is prepared containing the following components: primers for amplification of ASF virus DNA and bacteriophage lambda DNA (Table 1) in the following concentrations ASF-FIP, IC-FIP - 1.0 μM each, ASF-BIP, IC-BIP - 2.5 µM each, ASF-F3, ASF-B3, IC-F3, IC-B3 - 0.5 µM each, ASF-FL, IC-FL, ASF-BL, IC-BL - 1.0 µM, primer probes ASF-FIP- BHQ1, IC-FIP-BHQ1 at 1.5 µM, ASF-R6G , IC-FAM - 2.0 µM, 1.4 mM each dNTP (Synthol, Russia), sterile deionized water.
Для проведения LAMP предварительно осуществляют экстракцию ДНК из исследуемых проб в присутствии добавленного перед экстракцией бактериофага лямбда (из коллекции НИЦ "Курчатовский институт" ГосНИИгенетика) до концентрации 10^5 - 10^6 копий/мл. Для экстракции ДНК могут использоваться комплекты реагентов «НК-сет-ОД», «НК-сорб-ОД» ОД-Тест или другие комплекты реагентов, соответствующие по назначению к исследуемому биологическому материалу.To conduct LAMP, DNA is preliminarily extracted from the samples under study in the presence of bacteriophage lambda added before extraction (from the collection of the National Research Center "Kurchatov Institute" GosNIIgenetika) to a concentration of 10^5 - 10^6 copies/ml. For DNA extraction, reagent kits "NK-set-OD", "NK-sorb-OD" OD-Test or other kits of reagents appropriate for the purpose of the biological material under study can be used.
Параллельно с ДНК пробами, экстрагированными из биологического материала от животных, исследуют контрольные образцы - «К+», содержащий ДНК вируса АЧС, «К-» не содержащий ДНК вируса АЧС и бактериофага лямбда, а также контрольный образец этапа экстракции нуклеиновых кислот «ОК», содержащий ДНК бактериофага лямбда и не содержащий ДНК вируса АЧС.In parallel with DNA samples extracted from biological material from animals, control samples are examined - “K+”, containing DNA of the ASF virus, “K-”, not containing DNA of the ASF virus and bacteriophage lambda, as well as the control sample of the stage of extraction of nucleic acids “OK” containing the DNA of the bacteriophage lambda and not containing the DNA of the ASF virus.
Анализ LAMP предпочтительно проводят в объеме реакционной смеси 25 мкл, содержащей 10 мкл ДНК-пробы; 5 мкл 5х-буфера для LAMP (Гентерра, Россия); 8 ед.а. Bst ДНК полимеразы (Гентерра, Россия); 10 мкл 2,5 x LAMP смеси; конечный объем 25 мкл.The LAMP assay is preferably carried out in a 25 µl volume of the reaction mixture containing 10 µl of the DNA probe; 5 µl of 5x buffer for LAMP (Genterra, Russia); 8 u.a. Bst DNA polymerase (Genterra, Russia); 10 µl 2.5x LAMP mix; final volume 25 µl.
В отдельной пробирке готовят реакционную смесь на необходимое количество образцов, в число которых входит отрицательный контроль экстракции (ОК), отрицательный и положительный контроли амплификации (К-, К+) плюс запас на одну реакцию.In a separate tube, prepare the reaction mixture for the required number of samples, which include a negative extraction control (OK), negative and positive amplification controls (K-, K+) plus a margin for one reaction.
Компоненты реакционной смеси смешивают непосредственно перед проведением LAMP-исследования. Реакционную смесь аккуратно перемешивают и вносят в подготовленные для амплификации пробирки по 15 мкл. Затем в пробирки вносят по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых образцов, ставят контрольные реакции - положительный контроль (К+) - в пробирку с реакционной смесью вносят 10 мкл образца К+; отрицательный контроль (К-) - в пробирку с реакционной смесью вносят 10 мкл образца К-; отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку с реакционной смесью вносят 10 мкл пробы, экстрагированной из ОК. Общий объем реакции составляет 25 мкл.The components of the reaction mixture are mixed immediately before the LAMP study. The reaction mixture is gently mixed and added to 15 µl tubes prepared for amplification. Then, 10 μl of DNA samples obtained as a result of extraction from the studied samples are added to the test tubes, control reactions are put - positive control (K +) - 10 μl of the K + sample are added to the test tube with the reaction mixture; negative control (K-) - 10 μl of sample K- is added to the test tube with the reaction mixture; negative extraction control (OK) - 10 μl of the sample extracted from OK is added to the test tube with the reaction mixture. The total reaction volume is 25 μl.
Запрограммировать амплификатор с системой флуоресцентной детекции сигнала (например, Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH), Rotor-Gene 6000 (Corbett Research), CFX 96 (Bio-Rad), ДТпрайм (ДНК Технология)) для выполнения программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала - 65°С, 30 сек, детекция после каждого цикла на каналах FAM/Green, HEX/Yellow, установить 60 циклов. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора. По завершении амплификации проводят анализ полученных данных с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения амплификации. Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по каналам FAM/Green и HEX/Yellow. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла (Сt) в соответствующей графе таблицы результатов.Program the cycler with a fluorescent signal detection system (for example, Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH), Rotor-Gene 6000 (Corbett Research), CFX 96 (Bio-Rad), DTprime (DNA Technology)) to run a program for amplification and detection of a fluorescent signal - 65°С, 30 sec, detection after each cycle on FAM/Green, HEX/Yellow channels, set to 60 cycles. Install test tubes in the cells of the reaction module of the instrument. Upon completion of the amplification, the data obtained are analyzed using the software of the device used to carry out the amplification. Fluorescent signal accumulation curves are analyzed for FAM/Green and HEX/Yellow channels. The results are interpreted based on the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which determines the presence (or absence) of the threshold cycle value (Ct) for this DNA sample in the corresponding column of the results table.
Принципы интерпретации результатов следующие:The principles for interpreting the results are as follows:
Обнаружена ДНК вируса АЧС если определено значение Ct на канале для флуорофора HEX/Yellow, значение порогового цикла (Сt) по каналу для флуорофора FAM/Green может быть определено или отсутствовать. Не обнаружена ДНК вируса АЧС если отсутствует значение Ct на канале для флуорофора HEX/Yellow, при этом значение порогового цикла (Сt) по каналу для флуорофора FAM/Green определено менее граничного значения (Сt ≤45). Результат является невалидным если отсутствует значение Ct на канале для флуорофора HEX/Yellow, при этом значение порогового цикла (Сt) по каналу для флуорофора FAM/Green не определено или определено более граничного значения (Сt >45).ASF virus DNA detected If a Ct value per channel for the HEX/Yellow fluorophore is determined, the Cycle Threshold (Ct) value per channel for the FAM/Green fluorophore may or may not be detected. ASF virus DNA was not detected if there is no Ct value on the channel for the HEX/Yellow fluorophore, while the cycle threshold (Ct) value for the channel for the FAM/Green fluorophore is less than the boundary value (Ct ≤45). The result is invalid if there is no Ct value on the channel for the HEX/Yellow fluorophore, while the threshold cycle (Ct) value for the channel for the FAM/Green fluorophore is not determined or more than the boundary value is determined (Ct > 45).
В случае получения невалидного или сомнительного результата необходимо провести повторное исследование образца, начиная с этапа экстракции ДНК. В случае повторения результата, рекомендуется повторное взятие материала для анализа.In case of obtaining an invalid or doubtful result, it is necessary to re-examine the sample, starting from the stage of DNA extraction. If the result is repeated, it is recommended to retake the material for analysis.
Результаты подлежат учету только если получены корректные результаты для контролей этапов экстракции и амплификации ДНК : K+ - по каналу флуоресценции FAM/Green значение порогового цикла не учитывается, по каналу флуоресценции HEX/Yellow определено значение Ct <40; K - по обоим каналам флуоресценции FAM/Green, HEX/Yellow значения пороговых циклов (Сt) отсутствуют; ОК - по каналу флуоресценции FAM/Green значение порогового цикла определено Ct <40, по каналу флуоресценции HEX/Yellow значение Ct отсутствует.The results are to be taken into account only if the correct results are obtained for the controls of the stages of DNA extraction and amplification: K+ - the value of the threshold cycle is not taken into account for the FAM/Green fluorescence channel, the Ct value <40 is determined for the HEX/Yellow fluorescence channel; K - for both FAM/Green, HEX/Yellow fluorescence channels, there are no values of threshold cycles (Ct); OK - according to the FAM/Green fluorescence channel, the value of the threshold cycle is determined by Ct <40, according to the HEX/Yellow fluorescence channel, the Ct value is absent.
Если для положительного контроля K+ значение порогового цикла (Сt) по каналу для флуорофора HEX/Yellow отсутствует или превышает граничное значение необходимо повторить исследование для всех образцов (начиная с этапа экстракции ДНК). Если для отрицательного контроля (К-) определено значение порогового цикла (Сt) по каналам для флуорофоров FAM/Green, HEX/Yellow или для отрицательного контроля экстракции (ОК) определено значение порогового цикла (Сt) по каналу для флуорофора HEX/Yellow - высока вероятность контаминации лаборатории или исследуемых образцов продуктами амплификации, необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить исследование для всех образцов.If for the positive control K+ the value of the threshold cycle (Ct) for the channel for the HEX/Yellow fluorophore is absent or exceeds the limit value, it is necessary to repeat the study for all samples (starting from the stage of DNA extraction). High the likelihood of contamination of the laboratory or test samples with amplification products, it is necessary to take measures to identify and eliminate the source of contamination and repeat the study for all samples.
Все значения пороговых циклов, Ct, учитываются только для сигналов, поднявшихся выше фонового уровня шума и имеющих вид экспоненциальных кривых. Если для исследуемого образца определено значение порогового цикла (Ct), при этом на графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального подъема необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильных настройках пороговой и базовой линий, исследование для этого образца необходимо повторить.All threshold cycles, Ct, are taken into account only for signals that have risen above the background noise level and have the form of exponential curves. If the value of the threshold cycle (Ct) is determined for the test sample, and there is no characteristic exponential rise on the fluorescence plot, it is necessary to check the correctness of the selected level of the threshold line or the parameters for calculating the baseline. If the result is obtained with the correct threshold and baseline settings, the study for this sample must be repeated.
Сущность заявленного изобретения пояснена примерами осуществления изобретения.The essence of the claimed invention is illustrated by examples of the invention.
Пример 1. Определение специфичности петлевой изотермической амплификации с гибридизационно-флуоресцентными зондами для выявления генома вируса АЧС.Example 1. Determination of the specificity of loop isothermal amplification with hybridization-fluorescent probes for the detection of the ASF virus genome.
Для оценки специфичности метода использовали ДНК штамма «Ставрополь 01/08» вируса АЧС, а также ДНК гетерологичных вирусов, вызывающих болезни свиней с аналогичными клиническими признаками - ДНК штамма «Амурский-2019» вируса классической чумы свиней, ДНК штамма «Самара-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, ДНК штамма «Губкинский» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней; ДНК штамма «Арский» вируса болезни Ауески из коллекции ФГБНУ ФИЦВиМ.To assess the specificity of the method, DNA of the Stavropol 01/08 strain of the ASF virus was used, as well as DNA of heterologous viruses that cause diseases in pigs with similar clinical signs - DNA of the Amursky-2019 strain of the classical swine fever virus, DNA of the Samara-96 strain of the virus porcine reproductive and respiratory syndrome, DNA of the Gubkinsky strain of the porcine transmissible gastroenteritis virus; DNA of the strain "Arsky" of the Aujeszky's disease virus from the collection of the Federal State Budgetary Scientific Institution FITsViM.
Петлевую изотермическую амплификацию проводили по программе с увеличенным количеством циклов для исключения ложноположительных реакций, время реакции составило 50 минут (стандартное рекомендуемое время исследования 30 минут) на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad) (таблица 2).Loop isothermal amplification was performed according to the program with an increased number of cycles to exclude false positive reactions, the reaction time was 50 minutes (the standard recommended study time is 30 minutes) on a CFX 96 cycler (Bio-Rad) (table 2).
цикловQuantity
cycles
Полученные результаты представлены в таблице 3 и на фиг. 1.The results obtained are presented in Table 3 and in FIG. 1.
Результаты интерпретировали, анализируя кривые накопления флуоресцентного сигнала для каждой пробы с помощью программного обеспечения прибора. Результаты интерпретировали на основании наличия или отсутствия значения Ct. Для образца содержащего ДНК штамма АЧС и положительного контроль амплификации был получен сигнал амплификации на 14 (Ct 25,92) и 13 (Ct 24,61) минуте исследования соответственно, в то время как образцы, содержащие ДНК других возбудителей, были отрицательные вплоть до 50 минут исследования.The results were interpreted by analyzing the fluorescent signal accumulation curves for each sample using the instrument software. The results were interpreted based on the presence or absence of a Ct value. For a sample containing ASF DNA and a positive amplification control, an amplification signal was obtained at 14 (Ct 25.92) and 13 (Ct 24.61) minutes of the study, respectively, while samples containing DNA of other pathogens were negative up to 50 minutes of research.
ДНК вируса АЧСResult,
ASF virus DNA
Все образцы, содержащие ДНК гетерологичных вирусов, были определены как отрицательные, не содержащие ДНК вируса АЧС, при наличии сигнала выявления ДНК ВКО в диапазоне 14-22 минуты.All samples containing DNA of heterologous viruses were determined to be negative, not containing DNA of the ASF virus, in the presence of a signal for the detection of DNA of GTV in the range of 14-22 minutes.
Пример 2. Определение чувствительности петлевой изотермической амплификации с гибридизационно-флуоресцентными зондами для выявления генома вируса АЧС.Example 2. Determination of the sensitivity of loop isothermal amplification with hybridization-fluorescent probes for detection of the ASF virus genome.
Для определения аналитической чувствительности метода были приготовлены разведения ДНК рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагмент генома вируса АЧС с известной концентрацией.To determine the analytical sensitivity of the method, dilutions of DNA of a recombinant plasmid containing a known concentration of a fragment of the ASF virus genome were prepared.
Петлевую изотермическую амплификацию проводили при 65°С в течение 30 минут с детекцией флуоресцентного сигнала каждые 30 сек на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad). Результаты представлены на фиг. 2 и в таблице 4.Loop isothermal amplification was performed at 65°C for 30 minutes with detection of a fluorescent signal every 30 seconds on a CFX 96 amplifier (Bio-Rad). The results are shown in FIG. 2 and in table 4.
Чувствительность предложенного метода составляет 2*10^3 копий/мл (20 копий ДНК на реакцию), ДНК вируса АЧС воспроизводимо выявляется во всех образцах, содержащих ДНК рекомбинантной плазмиды.The sensitivity of the proposed method is 2*10^3 copies/ml (20 DNA copies per reaction), ASF virus DNA is reproducibly detected in all samples containing recombinant plasmid DNA.
копий/млASF virus DNA sample,
copies/ml
ДНК вируса АЧСResult,
ASF virus DNA
Пример 3. Определение диагностической чувствительности и специфичности петлевой изотермической амплификации с гибридизационно-флуоресцентными зондами.Example 3. Determination of diagnostic sensitivity and specificity of loop isothermal amplification with hybridization-fluorescent probes.
Для испытаний диагностической чувствительности и специфичности LAMP методик использовали 42 образца плазмы крови и 21 образец суспензии тканей (миндалины, селезенка, легкие). Данные образцы были исследованы предварительно с использованием двух диагностических ПЦР наборов разных производителей с заявленной аналитической чувствительностью не менее 1*10^3 копий/мл, предназначенных для выявления вируса АЧС в биологическом материале от животных. Результаты выявления ДНК вируса АЧС ПЦР наборами дали полностью сопоставимые результаты, 22 из 42 образцов плазмы и 11 из 21 образца суспензий тканей содержали ДНК вируса АЧС (таблица 5).To test the diagnostic sensitivity and specificity of LAMP methods, 42 blood plasma samples and 21 tissue suspension samples (tonsils, spleen, lungs) were used. These samples were preliminarily tested using two diagnostic PCR kits from different manufacturers with a declared analytical sensitivity of at least 1*10^3 copies/ml, designed to detect ASFV in biological material from animals. The results of detection of ASF virus DNA by PCR kits gave completely comparable results, 22 of 42 plasma samples and 11 of 21 tissue suspension samples contained ASF virus DNA (Table 5).
Среди 33 образцов биологического материала, содержащего ДНК вируса АЧС, 26 образцов имели достаточную вирусную нагрузку с пороговыми циклами ПЦР Ctсред менее 35 циклов, 7 образцов имели низкое содержание ДНК вируса АЧС в образцах, ПЦР Ctсред более 35 циклов.Among 33 samples of biological material containing ASF virus DNA, 26 samples had sufficient viral load with threshold cycles of PCR Ctmean less than 35 cycles, 7 samples had a low content of ASFV DNA in the samples, PCR Ctmean more than 35 cycles.
Петлевую изотермическую амплификацию проводили по программе с увеличенным количеством циклов для исключения ложноположительных реакций, время реакции составило 50 минут (стандартное рекомендуемое время исследования 30 минут) на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad) (таблица 2).Loop isothermal amplification was performed according to the program with an increased number of cycles to exclude false positive reactions, the reaction time was 50 minutes (the standard recommended study time is 30 minutes) on a CFX 96 cycler (Bio-Rad) (table 2).
Способ представленный в данном патенте LAMP, позволяет обнаружить ДНК вируса АЧС во всех образцах с достаточной вирусной нагрузкой, время накопления флуоресценции до порогового уровня при LAMP составляет от 12 до 22 минут. Для образцов с низкой вирусной нагрузкой (ПЦР Ct сред> 35) метод LAMP позволил обнаружить вирус в 6 (7) образцов. Все 30 ПЦР отрицательные образцы были определены верно, даже при увеличении времени реакции до 50 мин, что указывает на высокую специфичность разработанного LAMP метода. Результаты представлены в таблице 5.The method presented in this LAMP patent makes it possible to detect ASF virus DNA in all samples with sufficient viral load, the time for accumulation of fluorescence to the threshold level with LAMP is from 12 to 22 minutes. For samples with a low viral load (PCR Ct av > 35), the LAMP method allowed the detection of virus in 6 (7) samples. All 30 PCR negative samples were identified correctly, even with an increase in the reaction time to 50 min, which indicates the high specificity of the developed LAMP method. The results are presented in table 5.
Ct PCR 1
Ct
Ct PCR 2
Ct
Ct сред.PCR,
Ct avg.
Диагностические характеристики LAMP были рассчитаны с помощью интернет-ресурса MEDCALC [25] при внесении значений истинных (TP) и ложных (FP) положительных и истинных (TN) и ложных (FN) отрицательных результатов.The diagnostic characteristics of LAMP were calculated using the MEDCALC Internet resource [25] by entering the values of true (TP) and false (FP) positive and true (TN) and false (FN) negative results.
Было показано, что диагностическая чувствительность метода LAMP в реальном времени с флуоресцентными зондами практически не уступает по чувствительности ПЦР и составляет 97,0 %. При этом наблюдается диагностическая специфичность до 100%, все образцы, не содержащие ДНК вируса АЧС определены верно (табл 6).It was shown that the diagnostic sensitivity of the real-time LAMP method with fluorescent probes is practically not inferior in sensitivity to PCR and is 97.0%. At the same time, diagnostic specificity of up to 100% is observed, all samples that do not contain ASF virus DNA are identified correctly (Table 6).
Литература:Literature:
1. Chapman DAG, Darby AC, Da Silva M, Upton C, Radford AD, Dixon LK. Genomic analysis of highly virulent isolate of African swine fever virus. Emerg Infect Dis. 2011 Apr.1. Chapman DAG, Darby AC, Da Silva M, Upton C, Radford AD, Dixon LK. Genomic analysis of highly virulent isolate of African swine fever virus. Emerge Infect Dis. 2011 Apr.
2. Blome S, Gabriel C, Beer M. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar. Virus Res. 2013 Apr; 173(1):122-30. doi: 10.1016/j.virusres.2012.10.026. Epub 2012 Nov 6. PMID: 23137735.2. Blome S, Gabriel C, Beer M. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar. VirusRes. 2013 Apr; 173(1):122-30. doi: 10.1016/j.virusres.2012.10.026. Epub 2012 Nov 6. PMID: 23137735.
3. Dixon LK, Stahl K, Jori F, Vial L, Pfeiffer DU. African Swine Fever Epidemiology and Control. Annu Rev Anim Biosci. 2020 Feb 15;8:221-246. doi: 10.1146/annurev-animal-021419-083741. Epub 2020 Nov 19. PMID: 31743062.3. Dixon LK, Stahl K, Jori F, Vial L, Pfeiffer DU. African Swine Fever Epidemiology and Control. Annu Rev Anim Biosci. 2020 Feb 15;8:221-246. doi: 10.1146/annurev-animal-021419-083741. Epub 2020 Nov 19. PMID: 31743062.
4. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2022 , World Organization for Animal Health, 2022.4. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2022, World Organization for Animal Health, 2022.
5. Бельтран Алькрудо, Д., Ариас, М., Гайардо, К., Крамер, С. и Пенрит, М.Л Африканская чума свиней: обнаружение и диагностика - Руководство для ветеринаров, ФАО, 2017. Руководство по животноводству и охране здоровья животных № 19. Рим. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Организации Объединенных Наций (ФАО). 104 стр.5. Beltrán Alcrudo, D., Arias, M., Gaillardo, C., Cramer, S. and Penrith, M.L. African swine fever: detection and diagnosis - A guide for veterinarians, FAO, 2017. Animal production and health guide animals No. 19. Rome. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 104 pages
6. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12): E63. doi: 10.1093/nar/28.12.e63. PMID: 10871386; PMCID: PMC102748.6. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12): E63. doi: 10.1093/nar/28.12.e63. PMID: 10871386; PMCID: PMC102748.
7. Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002 Jun;16(3):223-9. doi: 10.1006/mcpr.2002.0415. PMID: 12144774.7. Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002 Jun;16(3):223-9. doi: 10.1006/mcpr.2002.0415. PMID: 12144774.
8. Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Nov 23;289(1):150-4. doi: 10.1006/bbrc.2001.5921. PMID: 11708792.8. Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Nov 23;289(1):150-4. doi: 10.1006/bbrc.2001.5921. PMID: 11708792.
9. Tanner NA, Zhang Y, Evans TC Jr. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. Biotechniques. 2015 Feb 1;58(2):59-68. doi: 10.2144/000114253. PMID: 25652028.9. Tanner NA, Zhang Y, Evans TC Jr. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. biotechniques. 2015 Feb 1;58(2):59-68. doi: 10.2144/000114253. PMID: 25652028.
10. Wang D, Yu J, Wang Y, Zhang M, Li P, Liu M, Liu Y. Development of a real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay and visual LAMP assay for detection of African swine fever virus (ASFV). J Virol Methods. 2020 Feb;276:113775. doi: 10.1016/j.jviromet.2019.113775. Epub 2019 Nov 11. PMID: 31726114.10. Wang D, Yu J, Wang Y, Zhang M, Li P, Liu M, Liu Y. Development of a real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay and visual LAMP assay for detection of African swine fever virus ( ASFV). J Virol Methods. Feb 2020;276:113775. doi: 10.1016/j.jviromet.2019.113775. Epub 2019 Nov 11. PMID: 31726114.
11. Wang Y, Dai J, Liu Y, Yang J, Hou Q, Ou Y, Ding Y, Ma B, Chen H, Li M, Sun Y, Zheng H, Zhang K, Wubshet AK, Zaberezhny AD, Aliper TI, Tarasiuk K, Pejsak Z, Liu Z, Zhang Y, Zhang J. Development of a Potential Penside Colorimetric LAMP Assay Using Neutral Red for Detection of African Swine Fever Virus. Front Microbiol. 2021 Apr 23;12:609821. doi: 10.3389/fmicb.2021.609821. PMID: 33967972; PMCID: PMC8102904.11. Wang Y, Dai J, Liu Y, Yang J, Hou Q, Ou Y, Ding Y, Ma B, Chen H, Li M, Sun Y, Zheng H, Zhang K, Wubshet AK, Zaberezhny AD, Aliper TI, Tarasiuk K, Pejsak Z, Liu Z, Zhang Y, Zhang J. Development of a Potential Penside Colorimetric LAMP Assay Using Neutral Red for Detection of African Swine Fever Virus. Front Microbiol. 2021 Apr 23;12:609821. doi: 10.3389/fmicb.2021.609821. PMID: 33967972; PMCID: PMC8102904.
12. - Miao, F.; Zhang, J.; Li, N.; Chen, T.; Wang, L.; Zhang, F.; Mi, L.; Zhang, J.; Wang, S.; Wang, Y.; et al. Rapid and Sensitive Recombinase Polymerase Amplification Combined with Lateral Flow Strip for Detecting African Swine Fever Virus. Front. Microbiol. 2019, 10, 1004.12. - Miao, F.; Zhang, J.; Li, N.; Chen, T.; Wang, L.; Zhang, F.; Mi, L.; Zhang, J.; Wang, S.; Wang, Y.; et al. Rapid and Sensitive Recombinase Polymerase Amplification Combined with Lateral Flow Strip for Detecting African Swine Fever Virus. front. microbiol. 2019, 10, 1004.
13.- Yu LS, Chou SY, Wu HY, Chen YC, Chen YH. Rapid and semi-quantitative colorimetric loop-mediated isothermal amplification detection of ASFV via HSV color model transformation. J Microbiol Immunol Infect. 2021 Oct;54(5):963-970. doi: 10.1016/j.jmii.2020.08.003. Epub 2020 Aug 16. PMID: 32868194.13.- Yu LS, Chou SY, Wu HY, Chen YC, Chen YH. Rapid and semi-quantitative colorimetric loop-mediated isothermal amplification detection of ASFV via HSV color model transformation. J Microbiol Immunol Infect. 2021 Oct;54(5):963-970. doi: 10.1016/j.jmii.2020.08.003. Epub 2020 Aug 16. PMID: 32868194.
14. Kubota R, Vine BG, Alvarez AM, Jenkins DM. Detection of Ralstonia solanacearum by loop-mediated isothermal amplification. Phytopathology. 2008 Sep;98(9):1045-51. doi: 10.1094/PHYTO-98-9-1045. PMID: 18943743.14. Kubota R, Vine BG, Alvarez AM, Jenkins DM. Detection of Ralstonia solanacearum by loop-mediated isothermal amplification. Phytopathology. 2008 Sep;98(9):1045-51. doi: 10.1094/PHYTO-98-9-1045. PMID: 18943743.
15. Tyagi S Kramer F. 1996. Molecular Beacons: Probes That Fluoresce Upon Hybridization. Nature biotechnology. 14. 303- 8. 10.1038/nbt0396- 303).15. Tyagi S Kramer F. 1996. Molecular Beacons: Probes That Fluoresce Upon Hybridization. nature biotechnology. 14.303-8.10.1038/nbt0396-303).
6. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, and Williams PM (1996) Real time quantitative PCR. Genome Res 6(10): 986-994.6. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, and Williams PM (1996) Real time quantitative PCR. Genome Res 6(10): 986-994.
17. - Zsak, L., Borca, M. V., Risatti, G. R., Zsak, A., French, R. A., Lu, Z., …Rock, D. L. (2005). Preclinical diagnosis of African swine fever in contact-exposed swine by a real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology, 43, 112-119. https://doi.org/10.1128/JCM.43.1.112-119.2005.17. - Zsak, L., Borca, M. V., Risatti, G. R., Zsak, A., French, R. A., Lu, Z., …Rock, D. L. (2005). Preclinical diagnosis of African swine fever in contact-exposed swine by a real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology, 43, 112-119. https://doi.org/10.1128/JCM.43.1.112-119.2005.
18. Wang Y, Xu L, Noll L, Stoy C, Porter E, Fu J, Feng Y, Peddireddi L, Liu X, Dodd KA, Jia W, Bai J. Development of a real-time PCR assay for detection of African swine fever virus with an endogenous internal control. Transbound Emerg Dis. 2020 Nov;67(6):2446-2454. doi: 10.1111/tbed.13582. Epub 2020 May 2. PMID: 32306531.18. Wang Y, Xu L, Noll L, Stoy C, Porter E, Fu J, Feng Y, Peddireddi L, Liu X, Dodd KA, Jia W, Bai J. Development of a real-time PCR assay for detection of African swine fever virus with an endogenous internal control. Transboundary Emerge Dis. 2020 Nov;67(6):2446-2454. doi: 10.1111/tbed.13582. Epub 2020 May 2. PMID: 32306531.
19. Tignon M, Gallardo C, Iscaro C, Hutet E, Van der Stede Y, Kolbasov D, De Mia GM, Le Potier MF, Bishop RP, Arias M, Koenen F. Development and inter-laboratory validation study of an improved new real-time PCR assay with internal control for detection and laboratory diagnosis of African swine fever virus. J Virol Methods. 2011 Dec;178(1-2):161-70. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.09.007. Epub 2011 Sep 17. PMID: 21946285.19. Tignon M, Gallardo C, Iscaro C, Hutet E, Van der Stede Y, Kolbasov D, De Mia GM, Le Potier MF, Bishop RP, Arias M, Koenen F. Development and inter-laboratory validation study of an improved new real-time PCR assay with internal control for detection and laboratory diagnosis of African swine fever virus. J Virol Methods. 2011 Dec;178(1-2):161-70. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.09.007. Epub 2011 Sep 17. PMID: 21946285.
20. -Pinero J, Gallardo C, Elizalde M, Robles A, C, Bishop R, Heath L, Couacy-Hymann E, Fasina FO, Pelayo V, Soler A, Arias M. Molecular diagnosis of African Swine Fever by a new real-time PCR using universal probe library. Transbound Emerg Dis. 2013 Feb;60(1):48-58. doi: 10.1111/j.1865-1682.2012.01317.x. Epub 2012 Mar 7. PMID: 22394449.20. -Pinero J, Gallardo C, Elizalde M, Robles A, C, Bishop R, Heath L, Couacy-Hymann E, Fasina FO, Pelayo V, Soler A, Arias M. Molecular diagnosis of African Swine Fever by a new real-time PCR using universal probe library. Transboundary Emerge Dis. 2013 Feb;60(1):48-58. doi: 10.1111/j.1865-1682.2012.01317.x. Epub 2012 Mar 7. PMID: 22394449.
21. Zhao, D. , Liu, R. , Zhang, X. , Li, F. , Wang, J. , Zhang, J. , Liu, X. , Wang, L. , Zhang, J. , Wu, X. , Guan, Y. , Chen, W. , Wang, X. , He, X. , & Bu, Z. (2019). Replication and virulence in pigs of the first African swine fever virus isolated in China. Emerging Microbes & Infections, 8(1), 438-447.21. Zhao, D. , Liu, R. , Zhang, X. , Li, F. , Wang, J. , Zhang, J. , Liu, X. , Wang, L. , Zhang, J. , Wu, X . , Guan, Y. , Chen, W. , Wang, X. , He, X. , & Bu, Z. (2019). Replication and virulence in pigs of the first African swine fever virus isolated in China. Emerging Microbes & Infections, 8(1), 438-447.
22. National Center for Biotechnology Information (NCBI) [Электронный ресурс] URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov.22. National Center for Biotechnology Information (NCBI) [Electronic resource] URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov.
23. Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator [Электронный ресурс] URL: http:// biotools.nubic.northwestern.edu/ OligoCalc. Html23. Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator [Electronic resource] URL: http:// biotools.nubic.northwestern.edu/ OligoCalc. HTML
24. Development of multiplexed reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of SARS-CoV-2 and influenza viral RNA Yinhua Zhang and Nathan A Tanner, BioTechniques 2021 70:3, 167-174.24. Development of multiplexed reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of SARS-CoV-2 and influenza viral RNA Yinhua Zhang and Nathan A Tanner, BioTechniques 2021 70:3, 167-174.
25. MedCalc's Diagnostic test evaluation calculator https://www.medcalc.org/calc/diagnostic-test.php25. MedCalc's Diagnostic test evaluation calculator https://www.medcalc.org/calc/diagnostic-test.php
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="СИНТЕТИЧЕСКИЕ <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="SYNTHETIC
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ.xml" softwareName="WIPO Sequence" OLIGONUCLEOTIDE.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-09-30">softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-09-30">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>EN</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate> <FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>01-09-22</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>01-09-22</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="en">Federal State
бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская budgetary educational institution of higher education "Moscow
государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MBA
имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. named after K.I. Scriabin" (FGBOU VO MGAVMiB - MVA named after K.I.
Скрябина)</ApplicantName>Scriabin)</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe <ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe
obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniia "Moskovskaia obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniia "Moskovskaia
gosudarstvennaia akademiia veterinarnoi meditsiny i biotekhnologii gosudarstvennaia akademiia veterinarnoi meditsiny i biotechnologii
MVA imeni K.I. Skriabina, FGBOU VO MGAVMiB - MVA imeni K.I. MVA imeni K.I. Skriabina, FGBOU VO MGAVMiB - MVA imeni K.I.
Skriabina</ApplicantNameLatin>Skriabina</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ <InventionTitle languageCode="en">SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE
ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ЭКСПРЕСС ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА PRIMERS AND METHOD FOR HIGHLY SENSITIVE DETECTION OF VIRUS DNA
АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ МЕТОДОМ ПЕТЛЕВОЙ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ OF AFRICAN SWINE FEVER BY THE LOOP ISOTHERMAL AMPLIFICATION METHOD
В ПРИСУТСТВИИ ДНК ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЬНОГО ОБРАЗЦА</InventionTitle>IN THE PRESENCE OF INTERNAL CONTROL DNA</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>16</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>16</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1"> <INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>attacgtcttatgtccaga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>attacgtcttatgtccaga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agactggatataagcacttg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>agactggatataagcacttg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3"> <INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcacaatatccaaacagcaggt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tcacaatatccaaacagcaggt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taagaataggtttgctytggtg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>taagaataggtttgctytggtg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5"> <INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>accaacccgaaattcctttcactttttgcgtccgtaatagrgtrata</ <INSDSeq_sequence>accaacccgaaattcctttcactttttgcgtccgtaatagrgtrata</
INSDSeq_sequence>INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>45</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>45</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..45</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..45</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gttcgctcgtatcattttcatttttaggtatcggtggagggaacy</IN <INSDSeq_sequence>gttcgctcgtatcattttcatttttaggtatcggtggagggaacy</IN
SDSeq_sequence>SDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q7"> <INSDQualifier id="q7">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aaacgcaacgaggctcta</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>aaacgcaacgaggctcta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggatttgttcagaacgctc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggatttgttcagaacgctc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9"> <INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acagcttccgctgtcttctca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>acagcttccgctgtcttctca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"> <SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gttgacgacgacatggctc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gttgacgacgacatggctc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11"> <SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>41</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>41</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q11"> <INSDQualifier id="q11">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctgctgatctgcgacttatttcgagagtgcgttgcttaac</INSDSe <INSDSeq_sequence>cctgctgatctgcgacttatttcgagagtgcgttgcttaac</INSDSe
q_sequence>q_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12"> <SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>44</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>44</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..44</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..44</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggattccaaagttctcaatgcttttgagaatcgcagcaacttgt</INS <INSDSeq_sequence>ggattccaaagttctcaatgcttttgagaatcgcagcaacttgt</INS
DSeq_sequence>DSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13"> <SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q13"> <INSDQualifier id="q13">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>accaacccgaaattcctttcactttttgcgtccgtaatagrgtrata</ <INSDSeq_sequence>accaacccgaaattcctttcactttttgcgtccgtaatagrgtrata</
INSDSeq_sequence>INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14"> <SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"> <INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtgaaaggaatttcgggttggt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gtgaaaggaatttcgggttggt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15"> <SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>41</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>41</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q15"> <INSDQualifier id="q15">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctgctgatctgcgacttatttcgagagtgcgttgcttaac</INSDSe <INSDSeq_sequence>cctgctgatctgcgacttatttcgagagtgcgttgcttaac</INSDSe
q_sequence>q_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16"> <SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"> <INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>African swine fever <INSDQualifier_value>African swine fever
virus</INSDQualifier_value>virus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ataagtcgcagatcagcagg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ataagtcgcagatcagcagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (21)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2799410C1 true RU2799410C1 (en) | 2023-07-05 |
Family
ID=
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117589739A (en) * | 2023-12-29 | 2024-02-23 | 广东医科大学 | Visual quantitative detection platform based on CRISPR Cas-portable detector-smart phone and application thereof |
RU2823776C1 (en) * | 2024-04-27 | 2024-07-30 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Set of oligonucleotide primers for detecting dna of orthopoxviruses by isothermal amplification in real time |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2645263C1 (en) * | 2017-04-05 | 2018-02-19 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction |
CN110453010A (en) * | 2019-07-08 | 2019-11-15 | 许昌学院 | It is a kind of for detecting LAMP primer group, reagent and the kit of African swine fever virus ASFV |
RU2710065C1 (en) * | 2018-12-14 | 2019-12-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting dna of asf virus by loop isothermal amplification |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2645263C1 (en) * | 2017-04-05 | 2018-02-19 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction |
RU2710065C1 (en) * | 2018-12-14 | 2019-12-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting dna of asf virus by loop isothermal amplification |
CN110453010A (en) * | 2019-07-08 | 2019-11-15 | 许昌学院 | It is a kind of for detecting LAMP primer group, reagent and the kit of African swine fever virus ASFV |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Aguero M. et al. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples //Journal of clinical microbiology. - 2003. - Vol. 41. - n. 9. - P. 4431-4434. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117589739A (en) * | 2023-12-29 | 2024-02-23 | 广东医科大学 | Visual quantitative detection platform based on CRISPR Cas-portable detector-smart phone and application thereof |
RU2823776C1 (en) * | 2024-04-27 | 2024-07-30 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Set of oligonucleotide primers for detecting dna of orthopoxviruses by isothermal amplification in real time |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106947838B (en) | African swine fever virus non-structural gene real-time fluorescence LAMP (loop-mediated isothermal amplification) detection primer group, kit and detection method | |
CN113502352B (en) | EMA-ddPCR primer and probe for detecting infectious ASFV and application | |
Yu et al. | Development of a real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus | |
CN112831598B (en) | Real-time fluorescent PCR amplification primer pair and probe primer for African swine fever virus identification and detection and prepared kit | |
CN101886138A (en) | Three-color fluorescent RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) combined detection method of enterovirus 71, Coxsackie virus A16 and other subtypes of enterovirus as well as kit thereof | |
CN111286559B (en) | Primer, probe and kit for detecting African swine fever virus | |
CN106048094B (en) | Dual real-time fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) detection kit, primers and probe for porcine pseudorabies wild strains and gene-deleted strains | |
CN115029459A (en) | Kit for visually detecting Pasteurella multocida based on CRISPR-Cas12a and application | |
CN111876502B (en) | Method for identifying Brucella S2 vaccine strain by dual real-time fluorescent quantitative PCR and kit used by same | |
CN112522444A (en) | Composition for African swine fever virus LAMP-CRISPR detection, detection kit and detection method | |
KR20110017706A (en) | Primers and its application in multiplex pcr to identify rinderpest, peste-des-petits-ruminants virus, bluetongue virus and rift valley fever | |
Gou et al. | The colorimetric isothermal multiple-self-matching-initiated amplification using cresol red for rapid and sensitive detection of porcine circovirus 3 | |
CN105886663A (en) | Locked nucleic acid sensitivity-enhanced fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) detection reagent kit for wild strains of porcine pseudorabies viruses | |
CN105907890A (en) | Primers, probe and method for rapidly distinguishing HP-PRRS (High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome) vaccine strain GDr180 from HP-PRRS wild strain | |
CN106987657B (en) | Primer combination for identifying bovine virus diarrhea virus and bovine rotavirus and application thereof | |
Bohorquez et al. | Efficient detection of African Swine Fever Virus using minimal equipment through a LAMP PCR method | |
CN116814857A (en) | Cat parvovirus and kit thereof and fluorescent recombinase polymerase amplification method | |
RU2799410C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and a method of highly sensitive detection of african swine fever virus dna by loop isothermal amplification in the presence of internal control sample dna | |
CN111676316A (en) | Primer, probe and detection method for rapidly distinguishing African swine fever virus gene type II from other genotypes | |
Wang et al. | Development of a cleaved probe-based loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of African swine fever virus | |
KR102516022B1 (en) | Detection and Differentiation of African Swine Fever Virus and Classical Swine Fever Virus by One Step Duplex Reverse Transcriptase Quantitative PCR Assay | |
CN105296668B (en) | Primer, probe and kit for specifically detecting type 3 ungulate bocavirus parvovirus | |
CN111926109B (en) | African swine fever virus fluorescence thermal convection PCR amplification primer pair, probe primer and prepared kit | |
CN114250311A (en) | CDA primer group and kit for detecting spotted fever group rickettsia and application of CDA primer group and kit | |
CN107557456B (en) | LAMP (loop-mediated isothermal amplification) detection primer group and kit for ureaplasma urealyticum |