RU2799211C2 - Agent for the treatment of dermatological diseases - Google Patents
Agent for the treatment of dermatological diseases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799211C2 RU2799211C2 RU2021110682A RU2021110682A RU2799211C2 RU 2799211 C2 RU2799211 C2 RU 2799211C2 RU 2021110682 A RU2021110682 A RU 2021110682A RU 2021110682 A RU2021110682 A RU 2021110682A RU 2799211 C2 RU2799211 C2 RU 2799211C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- ngf
- present
- administered
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES
Настоящее изобретение предоставляет средство, подходящее для лечения и профилактики дерматологических нарушений, включая, без ограничения таковыми, язвенные нарушения кожи.The present invention provides an agent suitable for the treatment and prevention of dermatological disorders, including, without limitation, skin ulcers.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
Кожные заболевания, включая хронические раны, такие как язвы, включают язвы на поверхности кожи или слизистой оболочке, часто сопровождающиеся распадом ткани. Как правило, такие кожные заболевания могут привести к потере эпидермиса, а часто и отдельных участков дермы и даже подкожного жира. Такие кожные заболевания могут быть вызваны множеством факторов, например, без ограничения таковым, нарушением кровообращения. Кожные язвы часто встречаются у людей, в том числе у пациентов с диабетом (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Том 5, стр. 129-134). Такие кожные заболевания представляют собой серьезную медицинскую и социальную проблему.Skin diseases, including chronic wounds such as ulcers, include ulcers on the surface of the skin or mucous membrane, often accompanied by tissue breakdown. As a rule, such skin diseases can lead to the loss of the epidermis, and often parts of the dermis and even subcutaneous fat. Such skin diseases can be caused by a variety of factors, such as, but not limited to, circulatory disorders. Skin ulcers are common in humans, including diabetic patients (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, pp. 129-134). Such skin diseases represent a serious medical and social problem.
В настоящее время не существует подходящего лечебного лечения дерматологических заболеваний этого типа. Согласно текущим данным, пациенты должны лечиться месяцами, а иногда и годами, что приводит к значительным экономическим затратам и высокой нагрузки для пациентов и общества (Buchberger et al., 2010, GMS Health Technol. Assess., vol. 1(6), doc. 12). В некоторых случаях альтернативные меры, такие как снижение давления за счет использования разгрузочных механических устройств, являются основным вариантом лечения таких заболеваний (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134), но такие альтернативные меры вообще не обеспечивают лечения.There is currently no suitable curative treatment for this type of dermatological disease. According to current data, patients have to be treated for months and sometimes even years, which leads to significant economic costs and a high burden on patients and society (Buchberger et al., 2010, GMS Health Technol. Assess., vol. 1(6), doc . 12). In some cases, alternative measures, such as pressure reduction through the use of mechanical relief devices, are the main treatment option for such diseases (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134) , but such alternative measures provide no cure at all.
Кожные заболевания часто возникают у пациентов с диабетом: диабет часто встречается в современном обществе, и есть статистические данные, что у каждого четвертого пациента с диабетом в течение жизни разовьется кожное заболевание, в частности язва стопы (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., vol. 5, p. 129-134). Такое расстройство часто требует длительного пребывания в больнице, реабилитации, ухода на дому и социальных услуг. Таким образом, язвы, возникшие в результате диабета, представляют собой серьезную проблему, оказывающую огромное влияние на общее глобальное бремя болезней ввиду растущей распространеннности диабета и отсутствия вариантов лечения, в настоящее время являющихся достаточными как для субъектов, так и для общества.Skin diseases often occur in diabetic patients: Diabetes is common in today's society, and there are statistics that one in four diabetic patients will develop a skin disease, in particular a foot ulcer, during their lifetime (Ndip et al., 2012, Int. J Gen. Med., vol. 5, pp. 129-134). This disorder often requires long hospital stays, rehabilitation, home care, and social services. Thus, diabetes-related ulcers are a major problem with a huge impact on the overall global burden of disease due to the increasing prevalence of diabetes and the lack of treatment options currently sufficient for both individuals and society.
В поисках лечебной обработки в прошлом предлагалось использрвание некоторых факторов роста человека для терапии и потенциального лечения кожных заболеваний, но сейчас принято считать, что существуют только ограниченные доказательства, подтверждающие эффективность использования факторов роста человека при лечении кожных язв (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., vol. 5, p. 129-134). Одним из примеров фактора роста, который в прошлом предлагался для лечения кожных заболеваний, является фактор роста, полученный из тромбоцитов (беклапермин, торговая марка Regranex), но было обнаружено, что его введение связано с серьезными побочными эффектами, включая злокачественные новообразования (Buchberger et al., 2010, GMS Health Technol. Assess., vol. 1(6), doc. 12; https://www.rxlist.com/regranex-side-effects-drug-center.htm#professional). Другим протестированным вариантом является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), но было обнаружено, что G-CSF существенно не влияет на вероятность разрешения инфекции или заживления ран (Cruciani et al., 2005, Diabetes Care, vol. 28, p. 454-460). Еще одним примером, предложенным в ходе исследований, является фактор эпидермального роста (EGF), который, по предположению, первоначально оказывает неожиданное положительное лечебное действие (например, WO/2003/075949 A1), но лечение на основе EGF по факту оказалось коммерчески недоступным, что позволяет предположить, что первоначальные надежды, возлагаемые на этого агента, не оправдались. В качестве альтернативы, человеческий фактор роста нервов (hNGF), который, как предполагалось, обладает проангиогенными свойствами и облегчает заживление ран (Graiani et al., 2004, Diabetologia, vol. 47, p. 1047-1054), был предложен для лечения определенных нейрофатических клинических состояний, но клинические испытания дали притиворечивые результаты (Apfel et al., 2000, J. Amer. Med. Assoc., vol. 284, p. 2215-2221), и, как следствие, основанное на NGF лекарственное средство не было разработано (см., например, https://www.gene.com/media/press-releases/4875/1999-04-08/phase-iii-trial-with-nerve-growth-factor). Например, хотя Graiani et al. конкретно не обсуждает аллогенный эффект NGF, общеизвестно, что человеческий NGF вызывает болевые ощущения (Dyck et al. 1997, Neurology, vol. 48, p. 501-505; Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, с. 241-247). В результате человеческий NGF не был одобрен как подходящее терапевтическое средство для лечения кожных язв; среди прочего, из-за его боль-продуцирующей активности и/или недостаточной эффективности в переносимых дозах. Следовательно, учитывая, что лечение, основанное на факторах роста, имело ограниченный успех, недостаточно доказательств излечения, и, помимо прочего, из-за нежелательных побочных эффектов, медицинское сообщество продолжало поиск других потенциальных лекарств. На основании вышеизложенного в последнее время для лечения некоторых кожных язв были предложены интерлейкины и другие молекулы, не являющиеся факторами роста. Например, Genentech предложил производные интерлейкинов, в частности r-интерлейкин 22, который, как предполагается, играет роль в модуляции иммунной системы, и, возможно, является подходящим для лечения или профилактики кожных язв, включая диабетические кожные язвы (см., например, https://www.gene.com/stories/mechanisms-of-healing), но такое лекарство недоступно для пациентов, и в настоящее время неизвестно, может ли это со временем измениться.In the search for therapeutic treatment, the use of some human growth factors for the therapy and potential treatment of skin diseases has been proposed in the past, but it is now generally accepted that there is only limited evidence supporting the effectiveness of the use of human growth factors in the treatment of skin ulcers (Ndip et al., 2012, Int J. Gen. Med., vol. 5, pp. 129-134). One example of a growth factor that has been proposed in the past for the treatment of skin diseases is a platelet-derived growth factor (beclapermin, brand name Regranex), but its administration has been found to be associated with serious side effects, including malignancies (Buchberger et al. ., 2010, GMS Health Technol. Assess., vol. 1(6), doc. 12; https://www.rxlist.com/regranex-side-effects-drug-center.htm#professional). Another variant tested is granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), but G-CSF was not found to significantly affect the likelihood of infection resolution or wound healing (Cruciani et al., 2005, Diabetes Care, vol. 28, p. 454- 460). Another example proposed in the course of research is the epidermal growth factor (EGF), which is supposed to initially have an unexpected positive therapeutic effect (for example, WO/2003/075949 A1), but the EGF-based treatment has in fact turned out to be commercially unavailable, which suggests that the initial hopes placed on this agent did not materialize. Alternatively, human nerve growth factor (hNGF), which has been proposed to have pro-angiogenic properties and facilitate wound healing (Graiani et al., 2004, Diabetologia, vol. 47, p. 1047-1054), has been proposed for the treatment of certain neuropathic clinical conditions, but clinical trials have yielded inconsistent results (Apfel et al., 2000, J. Amer. Med. Assoc., vol. 284, p. 2215-2221), and as a result, an NGF-based drug has not been developed (see, for example, https://www.gene.com/media/press-releases/4875/1999-04-08/phase-iii-trial-with-nerve-growth-factor). For example, although Graiani et al. does not specifically discuss the allogenic effect of NGF, human NGF is well known to cause pain (Dyck et al. 1997, Neurology, vol. 48, p. 501-505; Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, p. 241 -247). As a result, human NGF has not been approved as a suitable therapeutic agent for skin ulcers; inter alia, due to its pain-producing activity and/or lack of efficacy at tolerated doses. Therefore, given that growth factor-based treatments have had limited success, there is insufficient evidence for a cure, and due to undesirable side effects, among other things, the medical community has continued to search for other potential cures. Based on the foregoing, interleukins and other non-growth factor molecules have recently been proposed for the treatment of certain skin ulcers. For example, Genentech has proposed derivatives of interleukins, in particular r-
Таким образом, все еще существует потребность в эффективном лечении кожных заболеваний, при отсутствии побочных эффектов, например, полностью непереносимых или иным образом нежелательных побочных эффектов, вызываемых терапевтическим средством, подходящем для этих целей и доступном для практикующих врачей, обладающем надежной и приемлемой чистотой для введения млекопитающим, включая человека.Thus, there is still a need for an effective treatment of skin diseases, in the absence of side effects, for example, completely intolerable or otherwise undesirable side effects caused by a therapeutic agent suitable for this purpose and available to practitioners, having a reliable and acceptable purity for administration. mammals, including humans.
Проблема, подлежащая решениюProblem to be solved
Основной целью изобретения является предоставление лечения или профилактики дерматологических расстройств, включая язвы, не вызывающих нежелательных или болезненных побочных эффектов у диабетических и недиабетических субъектов. Также желательно предоставить терапевтически активный агент с достаточным выходом и чистотой, чтобы такое лечение стало возможным. Таким образом, цель настоящего изобретения включает устранение проблем, определенных на данном уровнем техники. Конкретные цели включают обеспечение надежного способа лечения субъекта с дерматологическим заболеванием без нежелательных побочных эффектов.The main object of the invention is to provide treatment or prevention of dermatological disorders, including ulcers, without causing unwanted or painful side effects in diabetic and non-diabetic subjects. It is also desirable to provide a therapeutically active agent in sufficient yield and purity to enable such treatment. Thus, the aim of the present invention is to overcome the problems identified in the prior art. Specific objectives include providing a reliable method of treating a subject with a dermatological disease without unwanted side effects.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к полипептиду для применения при лечении и/или профилактике дерматологического заболевания у млекопитающего, где полипептид выбран из полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4. Эти полипептиды характеризуются мутацией аминокислотной последовательности человеческого NGF (SEQ ID NO: 2), при этом указанная мутация связана со сниженной ноцицептивной активностью. В частности, аргинин в положении 100 hNGF замещен глутаминовой кислотой.The present invention relates to a polypeptide for use in the treatment and/or prevention of a dermatological disease in a mammal, where the polypeptide is selected from the polypeptide of SEQ ID NO: 3 and the polypeptide of SEQ ID NO: 4. These polypeptides are characterized by a mutation in the amino acid sequence of human NGF (SEQ ID NO: 2 ), while this mutation is associated with reduced nociceptive activity. In particular, the arginine at
Особенно предпочтительным полипептидом является полипептид SEQ ID NO: 4. Указанный полипептид характеризуется, по меньшей мере, отсутствием пролина в положении 61, а более предпочтительно, заменой пролина в положении 61 другой аминокислотой. В SEQ ID NO: 4 пролин в положении 61 SEQ ID NO: 3 заменен серином.A particularly preferred polypeptide is the polypeptide of SEQ ID NO: 4. Said polypeptide is characterized by at least the absence of proline at position 61, and more preferably by the replacement of proline at position 61 with another amino acid. In SEQ ID NO: 4, proline at position 61 of SEQ ID NO: 3 is replaced by serine.
Предпочтительно, чтобы субъектом-млекопитающим являлся человек.Preferably, the mammalian subject is a human.
Предпочтительно дерматологическое заболевание характеризуется поврежденной поверхностью по меньшей мере части тела субъекта. Предпочтительно, дерматологическое заболевание характеризуется поврежденной поверхностью. Более предпочтительно, дерматологическое заболевание представляет собой поражение кожи, предпочтительно характеризующееся по меньшей мере частичным разрушением дермы, хотя это и необязательно.Preferably, the dermatological disease is characterized by a damaged surface of at least a portion of the subject's body. Preferably, the dermatological disease is characterized by a damaged surface. More preferably, the dermatological disease is a skin lesion, preferably characterized by at least partial destruction of the dermis, although this is not necessary.
Предпочтительно, дерматологическое заболевание состоит из, по меньшей мере, одной язвы, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из диабетических язв, травматических язв, хирургических язв, пролежней, хронических язв и комбинаций любых из этих язв. В альтернативных, но не взаимоисключающих вариантах дерматологическое заболевание также включает ожог или механическое повреждение.Preferably, the dermatological disease consists of at least one ulcer, preferably selected from the group consisting of diabetic ulcers, traumatic ulcers, surgical ulcers, decubitus ulcers, chronic ulcers, and combinations of any of these ulcers. In alternative but not mutually exclusive embodiments, the dermatological disease also includes a burn or mechanical injury.
Предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, страдает сахарным диабетом или имеет предрасположенность к сахарному диабету. В типичных вариантах осуществления сахарный диабет выбирается из сахарного диабета 1 типа и сахарного диабета 2 типа.Preferably the mammal, preferably the human, is diabetic or has a predisposition to diabetes. In exemplary embodiments, diabetes mellitus is selected from
В одном варианте осуществления полипептид вводят однократно.In one embodiment, the polypeptide is administered once.
В альтернативном и более предпочтительном варианте полипептид вводят несколько раз. В особенно предпочтительном варианте полипептид вводят повторно от одного до пяти раз в день, предпочтительно два раза в день.In an alternative and more preferred embodiment, the polypeptide is administered multiple times. In a particularly preferred embodiment, the polypeptide is administered repeatedly from one to five times a day, preferably twice a day.
В одном варианте полипептид вводят повторно до заживления поврежденной поверхности тела. Альтернативно, полипептид вводят повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней. Необязательно, введение прекращают после завершения указанного интервала.In one embodiment, the polypeptide is administered repeatedly until the damaged body surface has healed. Alternatively, the polypeptide is administered repeatedly over a period of three to 30 days, preferably seven to 14 days. Optionally, the introduction is stopped after the specified interval.
В одном варианте осуществления полипептид вводят субъекту с диабетической нейропатической язвой стопы (DFU), предпочтительно расположенной ниже лодыжки.In one embodiment, the polypeptide is administered to a subject with a diabetic neuropathic foot ulcer (DFU), preferably below the ankle.
Предпочтительно, полипептид предназначен для местного применения. Более предпочтительно, полипептид наносят на поверхность поврежденной части тела.Preferably, the polypeptide is for topical use. More preferably, the polypeptide is applied to the surface of the injured part of the body.
Предпочтительно, доза вводимого полипептида определяется из расчета площади поврежденной поверхности тела, подлежащей лечению. Предпочтительно такое определение проводят в начале лечения. В одном варианте осуществления дозировка корректируется для более позднего введения в зависимости от поверхности поврежденной поверхности тела на момент времени такого более позднего введения. В альтернативном варианте осуществления дозировка не корректируется для более позднего введения, так что доза введения зависит исключительно от поверхности поврежденной поверхности тела, подлежащей лечению в начале лечения (первая дозировка), и последующие дозировки соответствуют первой дозе.Preferably, the dose of the administered polypeptide is determined based on the area of the damaged body surface to be treated. Preferably, such a determination is carried out at the beginning of treatment. In one embodiment, the dosage is adjusted for later administration depending on the area of the injured body surface at the time of such later administration. In an alternative embodiment, the dosage is not adjusted for later administration so that the dosage of administration depends solely on the area of the injured body surface to be treated at the start of treatment (first dosage) and subsequent dosages correspond to the first dose.
В одном варианте осуществления доза/каждая доза имеет количество от 0,3 до 6 мкг полипептида на мм2 обрабатываемой поврежденной поверхности тела (от 0,3 до 6 мкг/мм2).In one embodiment, dose/each dose has an amount of 0.3 to 6 μg of polypeptide per mm 2 of the injured body surface treated (0.3 to 6 μg/mm 2 ).
В одном осуществлении, полипептид содержится в водной среде, и в водной среде вводится млекопитающему.In one embodiment, the polypeptide is contained in an aqueous medium, and the aqueous medium is administered to a mammal.
Предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика не вызывали гипералгезии у млекопитающего.Preferably, the treatment and/or prophylaxis does not cause hyperalgesia in the mammal.
В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить из биологического источника. Это может включать очистку, то есть отделение такового от других молекул, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина. Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 или полипептид SEQ ID NO: 4 может быть получен в процессе, который включает (ре)фолдинг и/или хроматографическую очистку, и/или расщепление протеазой, возможно, доведение до конечной концентрации белка и/приготовление желаемого препарата. В одном варианте осуществления полипептид можно получить путем рекомбинантной экспрессии и очистки, где очистка включает очистку в смешанной стационарной фазе.In one embodiment, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or the polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained from a biological source. This may include purification, ie separating it from other molecules, including other proteins, such as those of the host cell. Optionally, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or the polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained in a process that includes (re)folding and/or chromatographic purification, and/or cleavage with a protease, possibly bringing to a final protein concentration and/preparation of the desired drug. In one embodiment, the polypeptide can be obtained by recombinant expression and purification, where the purification includes purification in a mixed stationary phase.
Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 из рекомбинантного источника: очищенный, как описано здесь, для использования в способе лечения поверхностей тела человека или животного с помощью терапии, как описано здесь.Thus, the present invention also provides a polypeptide of SEQ ID NO: 3 and a polypeptide of SEQ ID NO: 4 from a recombinant source: purified as described herein for use in a method of treating human or animal body surfaces with therapy as described herein.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Это описание в целом, вместе с формулой изобретения и чертежами, раскрывает конкретные и/или предпочтительные варианты осуществления и варианты индивидуальных свойств изобретения. Настоящее изобретение также рассматривает в качестве особенно предпочтительных вариантов осуществления те варианты осуществления, которые создаются путем объединения двух или более конкретных и/или предпочтительных вариантов осуществления и вариантов, описанных в данном документе для настоящего изобретения. Таким образом, настоящее раскрытие также включает все объекты, соединения, признаки, этапы, способы или композиции, упомянутые или указанные в данном описании, индивидуально или в сочетании, и любые или все комбинации таковых, или любые два или более из указанных объектов, соединений, признаков, этапов, способов или композиций. Таким образом, если в данном документе специально не указано иное или контекст не требует иного, ссылка на один объект, соединение, признак, этап, способ или композицию должна охватывать как один, так и множество (то есть более одного, например, два или более, три или более или все) этих объектов, соединений, признаков, этапов, способов или композиций. Если специально не указано иное или контекст не требует иного, каждый вариант осуществления, аспект и пример, раскрытые в данном документе, следует рассматривать как применимый к любому другому варианту осуществления, аспекту или примеру, раскрытому в данном документе, или осуществимый в комбинации с таковым.This description as a whole, together with the claims and drawings, discloses specific and/or preferred embodiments and variations of individual features of the invention. The present invention also considers as particularly preferred embodiments those embodiments that are created by combining two or more specific and/or preferred embodiments and variants described herein for the present invention. Thus, the present disclosure also includes all of the items, compounds, features, steps, methods, or compositions mentioned or referred to in this specification, alone or in combination, and any or all combinations thereof, or any two or more of these items, compounds, features, steps, methods or compositions. Thus, unless otherwise specifically noted herein or the context otherwise requires, reference to a single entity, compound, feature, step, method, or composition should encompass both one and multiple (i.e., more than one, e.g., two or more , three or more, or all) of these objects, compounds, features, steps, methods, or compositions. Unless otherwise specifically noted or the context requires otherwise, each embodiment, aspect, and example disclosed herein is to be considered as applicable to, or in combination with, any other embodiment, aspect, or example disclosed herein.
Специалист в данной области техники поймет, что описанное здесь изобретение допускает изменения и модификации, отличные от конкретно описанных. Таким образом, настоящее раскрытие не ограничено в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе, а также представленными в данном документе в целях иллюстрации и пояснения. Функционально или иным образом все эквивалентные объекты, соединения, особенности, стадии, способы или композиции включены в объем настоящего раскрытия. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что настоящее раскрытие включает все варианты и модификации сущностей, соединений, признаков, этапов, способов или композиций, описанных здесь.Those skilled in the art will appreciate that the invention described herein is susceptible to changes and modifications other than those specifically described. Thus, the present disclosure is not limited in scope to the specific embodiments described herein as well as those presented herein for purposes of illustration and explanation. Functionally or otherwise, all equivalent entities, compounds, features, steps, methods, or compositions are included within the scope of this disclosure. It will be obvious to a person skilled in the art that the present disclosure includes all variations and modifications of the entities, compounds, features, steps, methods, or compositions described herein.
Каждая из приведенных здесь ссылок (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации производителя, инструкции, презентации и т.д., приведенных в тексте), полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Ничто в данном документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права предшествовать определенному учению, и/или как признание того, что конкретная ссылка, кроме общеизвестных, не содержит информации, достаточно ясной и полной, чтобы ей не мог воспользоваться специалист в данной области техники.Each reference herein (including all patents, patent applications, scientific publications, manufacturer's specifications, instructions, presentations, etc., cited in the text) is hereby incorporated by reference in its entirety. Nothing in this document is to be construed as an admission that the present invention has no right to predate a particular doctrine and/or as an admission that a particular reference, other than those generally known, does not contain information clear and complete enough to be beyond the ability of a person skilled in the art to use. in this field of technology.
Как правило, если специально не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области (например, в медицине, дерматологии, неврологии, генетике, молекулярной биологии, экспрессии генов, клеточной биологии, культурах клеток, иммунологии, нейробиологии, хроматографии, химии белков и биохимии). Опубликованные учебники и обзорные статьи, например, на английском языке, обычно определяют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники.Generally, unless otherwise specifically defined, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning as commonly understood by one of skill in the art (e.g., medicine, dermatology, neurology, genetics, molecular biology, gene expression, cell biology, cell culture, immunology, neuroscience, chromatography, protein chemistry and biochemistry). Published textbooks and review articles, for example, in English, usually define the meaning generally understood by a person skilled in the art.
Выражение «и/или», например, «X и/или Y» должно пониматься как означающее «X и Y» или «X или Y» и должно рассматриваться как обеспечивающее явное раскрытие «и», «или», а также обоих значений одновременно (и «и» и «или»).The expression "and/or", for example, "X and/or Y" should be understood to mean "X and Y" or "X or Y" and should be considered to provide explicit disclosure of "and", "or", as well as both meanings simultaneously (and "and" and "or").
В контексте настоящего описания, если не указано иное, термины «примерно», «приблизительно». и «по существу» все означают «приблизительно» или «почти», а в контексте числового значения или диапазона, изложенного в данном документе, предпочтительно обозначают +/- 10%, более предпочтительно +/- 5% от числового значения или диапазона, указанного или заявленного.In the context of the present description, unless otherwise indicated, the terms "about", "approximately". and "substantially" all mean "approximately" or "almost", and in the context of the numerical value or range set forth herein, preferably means +/- 10%, more preferably +/- 5% of the numerical value or range specified or declared.
Если прямо не указано иное, слово «содержать», или варианты такового, такие как «содержит» или «содержащий», используются в контексте настоящего документа для указания, что дополнительные элементы могут необязательно присутствовать в дополнение к элементам списка, введенным словом «содержащий». Однако в качестве конкретного варианта осуществления настоящего изобретения предполагается, что термин «содержащий» охватывает возможность отсутствия дополнительных элементов, т.е. для целей конкретного варианта осуществления термин «содержащий» следует понимать как имеющий значение «состоящий из».Unless expressly stated otherwise, the word "comprise", or variants thereof such as "comprises" or "comprising", are used in the context of this document to indicate that additional elements may optionally be present in addition to the list elements introduced by the word "comprising" . However, as a specific embodiment of the present invention, the term "comprising" is intended to cover the possibility of the absence of additional elements, i.e. for the purposes of a particular embodiment, the term "comprising" should be understood to mean "consisting of".
Если специально не указано иное, все указания относительных количеств в отношении настоящего изобретения сделаны на основе вес/вес. Указания относительных количеств компонента, характеризующегося общим термином, предназначены для обозначения общего количества всех конкретных вариантов или элементов, охватываемых указанным общим термином. Если определенный компонент, определенный общим термином, указан как присутствующий в определенном относительном количестве, и если этот компонент дополнительно охарактеризован как конкретный вариант или элемент, охватываемый общим термином, то это означает, что никаких других вариантов или элементов, охватываемых общим термином, не присутствует дополнительно таким образом, чтобы общее относительное количество компонентов, охватываемых общим термином, превышало указанное относительное количество; более предпочтительно, чтобы другие варианты или элементы, охватываемые общим термином, вообще не присутствовали.Unless specifically stated otherwise, all indications of relative amounts in relation to the present invention are made on a weight/weight basis. Indications of the relative amounts of a component characterized by a general term are intended to indicate the total amount of all specific variants or elements covered by the specified general term. If a certain component, defined by a general term, is indicated as being present in a certain relative amount, and if this component is further characterized as a specific variant or element covered by the general term, then this means that no other variants or elements covered by the general term are additionally present. so that the total relative amount of the components covered by the general term exceeds the indicated relative amount; more preferably, other variants or elements covered by the general term are not present at all.
Все описанные здесь способы и процессы могут выполняться в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или если контекст явно не диктует иное.All methods and processes described herein may be performed in any suitable order, unless otherwise indicated herein or unless the context clearly dictates otherwise.
Используемый здесь термин «агент», если не указано иное, обычно относится к соединению или композиции, предпочтительно к соединению. Агент способен оказывать действие на живой организм и/или на клетку живого организма или происходить из живого организма, например, как воздействующий на клетку и/или на ткань тела, или на окружающую среду. Физическое состояние агента конкретно не ограничивается и, если не указано иное, таковой может находиться в газообразном, жидком и/или в твердом состоянии. Тип агента особо не ограничивается, если не указано иное, и, таким образом, агент может быть химическим веществом и/или биомолекулой, такой как белок или нуклеиновая кислота. Определенные здесь агенты используются в настоящем изобретении.The term "agent" as used herein, unless otherwise indicated, generally refers to a compound or composition, preferably a compound. The agent is capable of exerting an effect on a living organism and/or a cell of a living organism, or originating from a living organism, such as acting on a cell and/or tissue of the body, or on the environment. The physical state of the agent is not specifically limited and, unless otherwise indicated, it may be in a gaseous, liquid and/or solid state. The type of the agent is not particularly limited unless otherwise indicated, and thus the agent may be a chemical and/or a biomolecule such as a protein or a nucleic acid. The agents defined here are used in the present invention.
«Неблагоприятный эффект», как используется здесь, представляет собой нежелательный негативный эффект, возникающий в результате введения агента (лекарственного средства) субъекту. Побочные эффекты включают, без ограничения, увеличение поражения, смертность, гипералгезический синдром, боль, изменение массы тела, уровней ферментов, потерю функции или любое патологическое изменение, обнаруживаемое на микроскопическом, макроскопическом или физиологическом уровне. Неблагоприятные эффекты могут вызвать обратимые или необратимые изменения, включающие повышение или снижение восприимчивости человека к другим химическим веществам, продуктам питания или процессам, таким как лекарственные взаимодействия."Adverse effect", as used here, is an undesirable negative effect resulting from the introduction of an agent (drug) to the subject. Side effects include, without limitation, increased lesion, mortality, hyperalgesic syndrome, pain, changes in body weight, enzyme levels, loss of function, or any pathological change detectable at the microscopic, macroscopic, or physiological level. Adverse effects may cause reversible or irreversible changes, including an increase or decrease in the individual's susceptibility to other chemicals, foods, or processes such as drug interactions.
Используемые здесь термины «хроматография», «хроматографический» и т.п. обычно относятся к методике, подходящей для разделения смеси, при которой смесь добавляют к нежидкому материалу, называемому «стационарная фаза», с целью разделения, по меньшей мере, частично, одного или нескольких компонентов смеси. С этой целью стационарная фаза может подвергаться воздействию жидкости и/или смесь может быть растворена в жидкости; указанная жидкость, контактирующая со стационарной (неподвижной) фазой, также может называться «подвижной фазой». В общем, любая стадия, которая «выполняется с помощью хроматографии», как описано в данном документе, может быть синонимично обозначена как «хроматографическая стадия».The terms "chromatography", "chromatographic" and the like are used herein. generally refers to a technique suitable for separating a mixture in which the mixture is added to a non-liquid material, referred to as a "stationary phase", in order to separate, at least in part, one or more components of the mixture. To this end, the stationary phase may be exposed to the liquid and/or the mixture may be dissolved in the liquid; said liquid in contact with the stationary (stationary) phase may also be referred to as the "mobile phase". In general, any step that is "performed by chromatography" as described herein can be synonymously referred to as a "chromatographic step".
Используемый здесь термин «подвижная фаза» имеет значение, обычно используемое в данной области, и может относиться ко всем жидкостям, приведенным в контакт со стационарной (неподвижной) фазой во время хроматографии, то есть к промывочным жидкостям, а также к жидкостям (смесям), содержащим белки, представляющие интерес, такие как один или несколько белков, описанных в данном документе. В настоящем изобретении смесь, подвергнутая хроматографии, как определено в данном документе, обычно включает один или несколько белков, таких как, в частности, белки, описанные в настоящем документе, такие как полипептиды SEQ ID NO: 3 или 4, предшественники любого из них, протеазы и/или белки клетки-хозяина (HCP).As used herein, the term "mobile phase" has the meaning commonly used in the art and can refer to all liquids brought into contact with the stationary (stationary) phase during chromatography, i.e. washing liquids, as well as liquids (mixtures) containing proteins of interest, such as one or more of the proteins described herein. In the present invention, the mixture subjected to chromatography as defined herein typically includes one or more proteins, such as, in particular, the proteins described herein, such as the polypeptides of SEQ ID NO: 3 or 4, precursors of any of them, proteases and/or host cell proteins (HCPs).
«Стационарная фаза» обычно включает основную матрицу, которая представляет собой нерастворимый в воде материал, обычно находящийся в форме частиц или геля, такого как смола. Во многих случаях, включая варианты осуществления, описанные в данном документе, стационарная фаза включает основную матрицу и фрагменты, которые могут связываться по меньшей мере с одним компонентом, входящим в смесь, подлежащую хроматографии. Основная матрица обычно представляет собой нерастворимый в воде материал, обычно в форме частиц или геля. Неограничивающими примерами основных матриц являются сефароза и агароза, например, очень жесткая агароза.The "stationary phase" typically includes a base matrix, which is a water-insoluble material, usually in the form of particles or a gel, such as a resin. In many cases, including the embodiments described herein, the stationary phase includes a host matrix and moieties that can bind to at least one component of the mixture to be chromatographed. The base matrix is usually a water-insoluble material, usually in the form of particles or a gel. Non-limiting examples of base matrices are sepharose and agarose, eg very hard agarose.
«Хроматографическая стадия» в контексте настоящего описания относится к действию добавления к хроматографическому материалу (предпочтительно стационарной (неподвижной) фазе) жидкости, содержащей по меньшей мере одно соединение, подлежащее анализу и/или очистке, которое предпочтительно является белком (и в контексте настоящего изобретения указанный белок наиболее предпочтительно представляет собой полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4); возможно промывание хроматографического материала одним или несколькими промывочными растворами и элюирование, по меньшей мере, одного указанного соединения. В этом контексте процесс, характеризующийся двумя хроматографическими стадиями, предоставленный для иллюстрации, отличается тем, что жидкость, содержащая, по меньшей мере, одно такое соединение, подлежащее анализу и/или очистке, добавляется к первому хроматографическому материалу, как описано выше, и, после элюирования, жидкость, содержащую по меньшей мере одно такое соединение, добавляют ко второму хроматографическому материалу, из которого оно также элюируется, как описано выше. Цель любой «хроматографической стадии» состоит в том, чтобы по крайней мере один компонент, содержащийся в смеси, нанесенной на стационарную (неподвижную) фазу, предпочтительно используемой в хроматографии, связался со стационарной (неподвижной) фазой. Такое соединение может быть одним или несколькими белками, описанными здесь. Соединение может быть извлечено из стационарной фазы, например заменой подвижной фазы и/или продолжающимся воздействием подвижной фазы с течением времени."Chromatographic step" in the context of the present description refers to the act of adding to the chromatographic material (preferably stationary (stationary) phase) a liquid containing at least one compound to be analyzed and/or purified, which is preferably a protein (and in the context of the present invention specified the protein is most preferably a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4); possibly washing the chromatographic material with one or more wash solutions and eluting at least one of said compounds. In this context, the two chromatographic step process provided for illustration is characterized in that a liquid containing at least one such compound to be analyzed and/or purified is added to the first chromatographic material as described above and, after elution, a liquid containing at least one such compound is added to the second chromatographic material, from which it is also eluted, as described above. The purpose of any "chromatographic step" is that at least one component contained in the mixture applied to the stationary (stationary) phase, preferably used in chromatography, is associated with the stationary (stationary) phase. Such a connection may be one or more of the proteins described here. The compound can be removed from the stationary phase, for example by changing the mobile phase and/or continuing exposure to the mobile phase over time.
Термин «связывает», когда он используется по отношению к хроматографии, например для описания связывающей способности стационарной (неподвижной) фазы, особо не ограничивается, но обычно относится к нековалентному связыванию. Таким образом, обычно, по меньшей мере, один компонент, содержащийся в смеси, такой как, по меньшей мере, один белок, нековалентно связывается с неподвижной фазой. Хроматографическая стадия необязательно, но предпочтительно включает промывку неподвижной фазы, с которой связан по меньшей мере один компонент. По меньшей мере, один компонент может представлять собой, по меньшей мере, один белок, такой как один белок, описанный здесь.The term "binds" when used in relation to chromatography, for example to describe the binding capacity of a stationary (stationary) phase, is not particularly limited, but generally refers to non-covalent binding. Thus, typically at least one component contained in the mixture, such as at least one protein, is non-covalently bound to the stationary phase. The chromatographic step optionally, but preferably, includes washing the stationary phase to which at least one component is associated. At least one component may be at least one protein, such as one described here.
Используемый здесь термин «гетерологичный» описывает нечто, состоящее из множества различных элементов.The term "heterologous" as used here describes something that is made up of many different elements.
Термины «дисульфид» и «дисульфидная связь» используются в контексте настоящего изобретения в значениях, обычно используемых в данной области техники. В общем и целом, «дисульфид» относится к функциональной группе со структурой R-S-S-R'. Связь также называется «SS-связью» и обычно образуется путем сочетания двух тиоловых групп. Дисульфидные связи в белках образуются между тиоловыми группами остатков цистеина в процессе окислительного свертывания; такая специфическая дисульфидная связь между тиоловыми группами двух остатков цистеина также может называться «дисульфидным мостиком». Не полагаясь на какую-либо конкретную теорию, в данной области обычно понимают, что в эукариотических клетках дисульфидные мостики образуются в просвете эндоплазматического ретикулума (и митохондриальном межмембранном пространстве), но не в цитозоле, а в случае прокариот дисульфидные мостики образуются в периплазме (соответствующих организмов, в частности грамотрицательных бактерий); дисульфидные мостики также могут быть обнаружены в белках внеклеточной среды как эукариотических, так и прокариотических клеток.The terms "disulfide" and "disulfide bond" are used in the context of the present invention in the meanings commonly used in the art. In general, "disulfide" refers to a functional group with the structure R-S-S-R'. The bond is also referred to as an "SS bond" and is usually formed by combining two thiol groups. Disulfide bonds in proteins are formed between the thiol groups of cysteine residues during oxidative folding; such a specific disulfide bond between the thiol groups of two cysteine residues may also be referred to as a "disulfide bridge". Without relying on any particular theory, it is commonly understood in the art that in eukaryotic cells, disulfide bridges form in the lumen of the endoplasmic reticulum (and mitochondrial intermembrane space) but not in the cytosol, and in the case of prokaryotes, disulfide bridges form in the periplasm (of the relevant organisms). , in particular gram-negative bacteria); disulfide bridges can also be found in proteins of the extracellular environment of both eukaryotic and prokaryotic cells.
Термины «экспрессировать», «экспрессия», «экспрессированный», «экспрессия гена» и т.п., используемые в данном документе, относятся к преобразованию информации гена в функциональный продукт гена в ходе синтеза. Экспрессия гена включает, по меньшей мере, транскрипцию и, необязательно, включает одну или более дополнительных функций, необязательно выбранных из списка, включающего трансляцию и посттрансляционную модификацию, без ограничения таковыми. В контексте рекомбинантной экспрессии белка в клетке-хозяине этот термин обычно означает, что белок продуцируется клеткой-хозяином (в любом компартменте клетки и/или секретируется, и/или включается в тельца включения), если только контекст не диктует иное.The terms "express", "expression", "expressed", "gene expression" and the like, as used herein, refer to the conversion of gene information into a functional gene product during synthesis. Gene expression includes at least transcription and optionally includes one or more additional functions, optionally selected from a list including, but not limited to, translation and post-translational modification. In the context of recombinant expression of a protein in a host cell, this term generally means that the protein is produced by the host cell (in any cell compartment and/or secreted and/or incorporated into inclusion bodies) unless the context dictates otherwise.
Используемый здесь термин «гетерологичный» описывает нечто, состоящее из множества различных элементов или полученное из дугих источников. Например, в нечеловеческой клетке-хозяине, содержащей человеческий ген (или ген, кодирующий неприродный полипептид, такой как полипептид по изобретению), указанный ген является «гетерологичным» по отношению к клетке, и клетка может быть способна к «гетерологичной» экспрессии соответствующего гена. Гетерологичная экспрессия гена также может называться «рекомбинантной».As used here, the term "heterologous" describes something that is made up of many different elements or derived from other sources. For example, in a non-human host cell containing a human gene (or a gene encoding a non-natural polypeptide, such as a polypeptide of the invention), said gene is "heterologous" to the cell, and the cell may be capable of "heterologous" expression of the corresponding gene. Heterologous expression of a gene may also be referred to as "recombinant".
Термин «тельца включения» имеет значение, обычно используемое в данной области, и предназначен для обозначения агрегатов или частиц, обнаруженных в цитозоле или в периплазме клетки-хозяина; тельца включения обычно содержат белок, такой как, в частности, белок, рекомбинантно экспрессируемый в клетке-хозяине. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, следует понимать, что в области рекомбинантной экспрессии тельца включения обычно содержат рекомбинантно экспрессируемый белок, а также относительно небольшие количества белков клетки-хозяина (HCP), рибосомных компонентов или фрагментов ДНК/РНК. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует понимать, что тельца включения обычно содержат, по меньшей мере частично, белок, который неправильно свернут (неправильно свернутый белок), в частности неправильно свернутый рекомбинантно экспрессируемый белок. Понятно, что тельца включения обычно содержат белок в неправильно свернутой форме, то есть в контексте настоящего изобретения они обычно включают полипептид в соответствии с настоящим изобретением и/или его предшественник в неправильно свернутой форме. Термин «неправильно свернутый» обычно описывает биомолекулу, такую как нуклеиновая кислота или полипептид, которая не находится в нативной конформации, то есть находится в неправильно свернутой форме.The term "inclusion bodies" has the meaning commonly used in the art and is intended to refer to aggregates or particles found in the cytosol or periplasm of the host cell; inclusion bodies typically contain a protein, such as, in particular, a protein recombinantly expressed in the host cell. Without wishing to be bound by any particular theory, it is to be understood that in the region of recombinant expression, inclusion bodies typically contain the recombinantly expressed protein as well as relatively small amounts of host cell proteins (HCPs), ribosomal components, or DNA/RNA fragments. Without wishing to be bound by any particular theory, it is to be understood that inclusion bodies typically contain, at least in part, a misfolded protein (misfolded protein), in particular a misfolded, recombinantly expressed protein. It is understood that inclusion bodies typically contain the protein in a misfolded form, ie, in the context of the present invention, they typically include a polypeptide of the present invention and/or its precursor in a misfolded form. The term "misfolded" generally describes a biomolecule, such as a nucleic acid or polypeptide, that is not in its native conformation, ie is in a misfolded form.
Под «изолированным» подразумевается материал, который по существу или практически не содержит компонентов, обычно сопровождающих таковой в нативном состоянии. Например, «изолированный пептид» или «изолированный белок» в контексте настоящего описания относится, соответственно, к пептиду или белку, очищенному от клеточной и внеклеточной среды, такой как ткань, окружающей таковой в нативной среде, т.е. к пептиду или белку, выделеннному, например, из клетки, в которой он был экспрессирован, например, из клетки-хозяина. Альтернативно, «выделенный пептид» или «выделенный белок» и т.п. в контексте настоящего описания относятся к выделению in vitro и/или очистке пептида или белка, соответственно, из его нативного клеточного окружения и изолированного от ассоциации с другими компонентами среды, в которой обычно находится пептид или белок. В другом примере «изолированная клетка» в контексте настоящего описания относится к клетке, которая была очищена от клеточной и внеклеточной среды, такой как ткань или клеточные колонии, окружающие таковую в ее естественном состоянии, например, к клетке-хозяину, удаленной из окружающей среды, обычно прилегающей к клетке. В соответствии с приведенным выше определением термина «изолированный», «изолировать», как используется в данном документе, является термином, описывающим деятельность по получению «изолированного» материала, такого как, например, изолированная клетка или изолированный пептид или белок.By "isolated" is meant a material that is substantially or substantially free of the components normally associated with it in its native state. For example, "isolated peptide" or "isolated protein" in the context of the present description refers, respectively, to a peptide or protein purified from the cellular and extracellular environment, such as tissue, surrounding it in the native environment, i. to a peptide or protein isolated, for example, from the cell in which it was expressed, for example, from the host cell. Alternatively, "isolated peptide" or "isolated protein" and the like. in the context of the present description, refer to the in vitro isolation and/or purification of a peptide or protein, respectively, from its native cellular environment and isolated from association with other components of the environment in which the peptide or protein is usually found. In another example, "isolated cell" in the context of the present description refers to a cell that has been cleared of cellular and extracellular environment, such as tissue or cell colonies surrounding it in its natural state, for example, a host cell removed from the environment, usually adjacent to the cell. In accordance with the above definition of the term "isolated", "isolate", as used herein, is a term describing the activity of obtaining an "isolated" material, such as, for example, an isolated cell or an isolated peptide or protein.
Термины «мульти» и «несколько» в контексте настоящего описания означают множество, то есть любое количество, состоящее из двух или более.The terms "multi" and "multiple" in the context of the present description means many, that is, any number consisting of two or more.
Используемый здесь термин «мутация» относится к изменению нуклеотидной последовательности генома организма, вируса, внехромосомной ДНК или других генетических элементов. Термин также распространяется на мутации аминокислотной последовательности, в частности, аминокислотной последовательности гена, несущего, по крайней мере, одну мутацию, не являющуюся сайленс-мутацией. Если не указано иное, мутация нуклеотидной последовательности является постоянным изменением. Мутации, присутствующие в зародышевой линии, обычно наследуются. В общем и целом, мутация нуклеотидной последовательности может привести к множеству различных типов изменений последовательностей: мутации в генах могут либо не иметь эффекта, либо изменять продукт гена, либо препятствовать правильному или полному функционированию гена. Мутации также могут присутствовать в негенных областях. Если не указано иное, последовательность дикого типа используется в качестве эталонной последовательности для описания мутации. Таким образом, например, если говорится, что данный мутант характеризуется мутацией в положении 100 полипептидной последовательности, то это указывает на то, что в положении 100 мутант не имеет того же аминокислотного остатка, как полипептид дикого типа. Конкретные типы мутаций нуклеотидной последовательности и/или аминокислотной последовательности включают изменения, такие как делеции, замены, добавления, инсерции и варианты сплайсинга. «Делеция» в отношении нуклеотидной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Делеция» в отношении аминокислотной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких аминокислотных остатков в полипептиде. «Добавление» в отношении нуклеотидной последовательности относится к наличию одного или нескольких дополнительных нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Добавление» в отношении аминокислотной последовательности относится к наличию одного или нескольких дополнительных аминокислотных остатков в соответствующем полипептиде. «Замена» в отношении нуклеотидной последовательности относится к замене одного или нескольких нуклеотидов на другой(ие) нуклеотид(ы) в нуклеотидной последовательности. «Замена» в отношении аминокислотной последовательности относится к замене одного или нескольких аминокислотных остатков на другие аминокислотные остатки в полипептиде. Добавления, делеции и замены нуклеотидной последовательности, например в открытой рамке считывания, могут находиться на 5’-конце, 3’-конце и/или внутри гена. Добавления, делеции и замены полипептида могут находиться на аминоконце, карбокси-конце и/или внутри полипептида. «Инсерция» в отношении нуклеотидной последовательности и/или полипептидной последовательности представляет собой добавление одного или нескольких нуклеотидов или одного или нескольких аминокислотных остатков соответственно, именно внутрь соответствующей последовательности. Термин «вариант сплайсинга» используется для описания того варианта, когда РНК, кодирующая полипептидную последовательность, сплайсируется иначе, чем соответствующая РНК дикого типа, обычно в результате мутации на уровне нуклеиновой кислоты, обычно приводящей к продукту трансляции полипептида, который отличается от полипептида дикого типа. Термин «вариант сплайсинга» можно использовать не только в отношении соответствующей РНК, но также в отношении соответствующей последовательности матричной ДНК (обычно геномной ДНК) и в отношении последовательности полипептида, кодируемого такой РНК. Термин «мутантный» обычно предназначен для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, отличающихся от последовательности дикого типа. Таким образом, мутантная последовательность нуклеиновой кислоты или мутантная аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере одну мутацию по отношению к соответствующей последовательности дикого типа. В случаях, когда существуют полиморфизмы в последовательности нуклеиновой кислоты, которые, тем не менее, не отражаются на уровне соответствующего кодируемого полипептида (молчащие (сайленс) мутации, вырожденность генетического кода), термин «мутант» на уровне нуклеиновой кислоты конкретно относится только к тем вариантам нуклеиновой кислоты, которые кодируют мутантный полипептид. Мутанты могут содержать различные комбинации мутаций, по отдельности или в комбинации, включающей более одной мутации и/или разные типы мутаций.As used herein, the term "mutation" refers to a change in the nucleotide sequence of the genome of an organism, virus, extrachromosomal DNA, or other genetic elements. The term also covers mutations in the amino acid sequence, in particular the amino acid sequence of a gene carrying at least one non-silence mutation. Unless otherwise indicated, mutation of a nucleotide sequence is a permanent change. Mutations present in the germline are usually inherited. In general, mutation of a nucleotide sequence can result in many different types of sequence changes: mutations in genes can either have no effect, change the gene product, or prevent the gene from functioning correctly or completely. Mutations may also be present in non-gene regions. Unless otherwise indicated, the wild-type sequence is used as a reference sequence for describing a mutation. Thus, for example, if a given mutant is said to have a mutation at
Термин «фактор роста нервов», сокращенно «NGF» или «бета-NGF» обозначает нейротрофический фактор и нейропептид, участвующие в регуляции роста, поддержания, пролиферации и выживания определенных нейронов и других клеток в соответствии с общепринятыми значениями терминов в данной области техники (см., например, Levi-Montalcini, 2004, Progress in Brain Research, vol. 146, p. 525-527). Если контекст не диктует иное, термин «фактор роста нервов» обозначает только NGF дикого типа и не включает полипептиды SEQ ID NO: 3 или 4 NGF дикого типа, представляет собой 2,5S, 26-кДа бета-субъединицу, образующуюся из предшественника NGF, которая является биологически активной: NGF дикого типа связывается по меньшей мере с двумя классами рецепторов: киназой A тропомиозинового рецептора (TrkA) и рецептором NGF с низким сродством (LNGFR/p75NTR). Термин «NGF», если не указано иное, относится к NGF любых видов, предпочтительно видов млекопитающих; однако наиболее предпочтительным является человеческий NGF. «hNGF», как используется здесь, означает человеческий NGF. Если контекст не диктует иное, термины «NGF» и «hNGF» относятся к NGF дикого типа, т.е. hNGF означает NGF дикого типа. Аминокислотная последовательность человеческого NGF дикого типа соответствует положениям 121-239 SEQ ID NO: 1 (серый цвет на Фиг. 24). Последовательности нечеловеческого NGF доступны, например, в научной литературе с помощью алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, при использовании положений 121-239 SEQ ID NO: 1 в качестве точки ввода, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot.The term "nerve growth factor", abbreviated "NGF" or "beta-NGF", refers to a neurotrophic factor and neuropeptide involved in the regulation of growth, maintenance, proliferation and survival of certain neurons and other cells, in accordance with the generally accepted meanings of the terms in the art (see ., for example, Levi-Montalcini, 2004, Progress in Brain Research, vol. 146, pp. 525-527). Unless the context dictates otherwise, the term "nerve growth factor" refers only to wild-type NGF and does not include polypeptides of SEQ ID NO: 3 or 4 Wild-type NGF is a 2.5S, 26-kDa beta subunit derived from the NGF precursor, which is biologically active: wild type NGF binds to at least two classes of receptors: the tropomyosin receptor kinase A (TrkA) and the low affinity NGF receptor (LNGFR/p75NTR). The term "NGF", unless otherwise indicated, refers to NGF of any species, preferably mammalian species; however, human NGF is most preferred. "hNGF" as used herein means human NGF. Unless the context dictates otherwise, the terms "NGF" and "hNGF" refer to wild-type NGF, ie. hNGF means wild-type NGF. The amino acid sequence of wild-type human NGF corresponds to positions 121-239 of SEQ ID NO: 1 (gray in Fig. 24). Non-human NGF sequences are available, for example, in the scientific literature using a sequence search algorithm such as BLAST using positions 121-239 of SEQ ID NO: 1 as the entry point, as well as in public protein databases such as Swissprot.
Термины «мутеин NGF» и «мутеин NGF» или, со ссылкой на NGF «мутеин такового», используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полипептида, который характеризуется по меньшей мере одной мутацией по сравнению с NGF дикого типа, как далее подробно описано здесь. Полипептиды SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 являются мутеинами NGF. Предпочтительно, мутеин NGF имеет от 80 до 99,5% идентичности последовательности с NGF, особенно с человеческим NGF, более предпочтительно, мутеин имеет от 90 до 99% идентичности последовательности с NGF, особенно с человеческим NGF.The terms "NGF mutein" and "NGF mutein", or, with reference to NGF, "mutein such", are used interchangeably herein to refer to a polypeptide that has at least one mutation compared to wild-type NGF, as further detailed herein. The polypeptides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are NGF muteins. Preferably, the NGF mutein has 80 to 99.5% sequence identity with NGF, especially human NGF, more preferably, the mutein has 90 to 99% sequence identity with NGF, especially human NGF.
Термины «зрелая часть», «зрелый фрагмент» по отношению к NGF используются взаимозаменяемо с термином «бета-NGF» и относятся к полипептиду NGF, который отличается тем, что не содержит пропептид (и, следовательно, не содержит пре-пропептид) NGF. По аналогии, термин «зрелая часть» также используется для обозначения полипептидов SEQ ID NO: 3 или 4, поскольку эти полипептиды также не содержат пропептид (и, следовательно, не содержат пре-пропептида). Предпочтительно, зрелая часть также не содержит расщепляемого на С-конце пептида, кодируемого открытой рамкой считывания NGF дикого типа; такой C-концевой расщепляемый пептид, в случае человеческого NGF, состоит из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1). Более конкретно, зрелую часть можно получить расщеплением про-NGF протеазой фурин Furin (и другими протеазами, способными точно расщеплять непосредственно N-конец первого аминокислотного остатка NGF или полипептидов SEQ ID NO: 3 или 4, соответственно, без ограничения такими методами. Например, хорошо известно, что сайт расщепления фурином человеческого NGF и многих ортологов состоит из последовательности R1S2K3R4 (однобуквенный аминокислотный код; последовательности пронумерованы от N до C-конца; и заключены в рамку на Фиг.25)). В зрелом NGF обычно не присутствует ни сайт расщепления фурином, ни какая-либо аминокислота на N-конце сайта расщепления фурина. Для иллюстрации зрелая часть человеческого NGF состоит из полипептида, представленного положениями аминокислот 122-239 в SEQ ID NO: 1. Зрелая часть нечеловеческого NGF может быть идентифицирована, например, при поиске последовательностей и/или анализе последовательностей, где указанную зрелую часть человеческого NGF используют для выравнивания последовательностей.The terms "mature portion", "mature fragment" in relation to NGF are used interchangeably with the term "beta-NGF" and refer to an NGF polypeptide that is characterized in that it does not contain the propeptide (and therefore does not contain the pre-propeptide) NGF. By analogy, the term "mature portion" is also used to refer to polypeptides of SEQ ID NO: 3 or 4, since these polypeptides also do not contain a propeptide (and therefore do not contain a pre-propeptide). Preferably, the mature portion also does not contain a C-terminally cleavable peptide encoded by the wild-type NGF open reading frame; such a C-terminal cleavable peptide, in the case of human NGF, consists of two amino acid residues "RA" (240 and 241 in SEQ ID NO: 1). More specifically, the mature portion can be obtained by cleavage of pro-NGF with the furin protease Furin (and other proteases capable of accurately cleaving directly the N-terminus of the first amino acid residue of NGF or polypeptides of SEQ ID NO: 3 or 4, respectively, without being limited to such methods. For example, well the furin cleavage site of human NGF and many orthologues is known to consist of the sequence R 1 S 2 K 3 R 4 (single letter amino acid code; sequences are numbered N to C-terminus; and are boxed in Fig. 25)). In mature NGF, neither the furin cleavage site nor any amino acid at the N-terminus of the furin cleavage site is usually present. By way of illustration, the mature portion of human NGF consists of the polypeptide represented by amino acid positions 122-239 in SEQ ID NO: 1. sequence alignment.
Термин «предшественник», используемый в данном документе по отношению к NGF, относится к любой пептидной последовательности, из которой NGF может быть получен посредством протеолитического расщепления. Представленные для иллюстративных целей как про-NGF, так и пре-про-NGF, а также варианты таковых, являются типичными примерами предшественников NGF. Термин «предшественник», используемый в данном документе, может относиться к предшественникам, у которых наиболее C-концевой аминокислотный остаток является крайним C-концевым остатком NGF, а также к предшественникам, чей C-конец выходит за пределы самого крайнего C-концевого остатка NGF, при условии, что NGF может быть получен из такового протеолитическим расщеплением: хотя встречающийся в природе предшественник про-NGF человека дикого типа (SEQ ID NO: 1) содержит C-концевой дипептид (аминокислотные остатки 240 и 241 в SEQ ID NO: 1 выделены жирным шрифтом на Фиг. 1), предпочтительно, в настоящем изобретении предшественник не содержит расщепляемого на С-конце пептида, кодируемого открытой рамкой считывания NGF дикого типа; такой C-концевой отщепляемый пептид в случае человеческого NGF состоит из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1).The term "precursor" as used herein in relation to NGF refers to any peptide sequence from which NGF can be obtained by proteolytic cleavage. Presented for illustrative purposes, both pro-NGF and pre-pro-NGF, as well as variants thereof, are typical examples of NGF precursors. The term "precursor" as used herein may refer to precursors whose C-terminal amino acid residue is the C-terminal residue of NGF, as well as precursors whose C-terminus extends beyond the C-terminal residue of NGF. , provided that NGF can be obtained from it by proteolytic cleavage: although the naturally occurring wild-type human pro-NGF precursor (SEQ ID NO: 1) contains a C-terminal dipeptide (
Используемые здесь термины «препептид» или «препоследовательность» обычно взаимозаменяемо относятся к полипептидной последовательности, кодируемой частью открытой рамки считывания NGF, N-концом непосредственно примыкающей к пропептиду. Для иллюстративных целей препептид представляет собой NGF, состоящий из последовательности, содержащей непрерывную последовательность в диапазоне от остатка 1 SEQ ID NO: 1 до остатка 18 SEQ ID NO: 1. Последовательности соответствующих препептидов предшественников нечеловеческого NGF доступны, например, в научной литературе, при использовании алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 1-18 SEQ ID NO: 1 в качестве вводных данных, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot. Полипептид или белок, состоящий из препептида и про-NGF, где С-конец пре-пептида непосредственно примыкает к N-концу про-NGF, может быть обозначен здесь как «пре-про-NGF».As used herein, the terms "prepeptide" or "presequence" generally refer interchangeably to the polypeptide sequence encoded by the portion of the NGF open reading frame immediately adjacent to the propeptide at its N-terminus. For illustrative purposes, a prepeptide is an NGF consisting of a sequence containing a contiguous sequence ranging from
Термины «пропептид» или «пропоследовательность», используемые в данном документе, обычно взаимозаменяемо относятся к полипептидной последовательности, кодируемой в природе частью открытой рамки считывания NGF, на N-конце непосредственно примыкающей к последовательности зрелого NGF, полипептидная последовательность которого не включает препептид. Для иллюстрации: пропептид содержится в предшественнике NGF дикого типа. Пропептид предшественника NGF состоит из последовательности, содержащей непрерывную последовательность от остатка 19 SEQ ID NO: 1 до остатка 121 SEQ ID NO: 1. Последовательности соответствующих пропептидов нечеловеческого происхождения, или pro-NGF, доступны, например, в научной литературе при использовании алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 19-121 SEQ ID NO: 1 в качестве вводных данных, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot.The terms "propeptide" or "prosequence" as used herein generally refer interchangeably to a polypeptide sequence naturally encoded by the portion of the NGF open reading frame N-terminally immediately adjacent to a mature NGF sequence whose polypeptide sequence does not include a prepeptide. Illustratively, the propeptide is contained in the wild-type NGF precursor. The NGF precursor propeptide consists of a sequence containing a contiguous sequence from residue 19 of SEQ ID NO: 1 to residue 121 of SEQ ID NO: 1. Sequences of the corresponding propeptides of non-human origin, or pro-NGF, are available, for example, in the scientific literature using a sequence search algorithm , such as BLAST, using positions 19-121 of SEQ ID NO: 1 as input, as well as in public protein databases such as Swissprot.
«Про-NGF» в контексте настоящего описания относится к пептидной последовательности, содержащей как зрелую часть NGF, так и соответствующий про-пептид, но не включающей соответствующий пре-пептид. Про-NGF человека состоит из последовательности, содержащей непрерывную последовательность в диапазоне от остатка 19 SEQ ID NO: 1 до, по меньшей мере, остатка 239 SEQ ID NO: 1. Хотя про-NGF человека дикого типа включает С-концевой дипептид (амино кислотные остатки 240 и 241 в SEQ ID NO: 1, выделеные жирным шрифтом на Фиг.25), предпочтительно, чтобы про-NGF, получаемый и используемый в настоящем изобретении, не содержал C-концевого отсщепляемого пептида, кодируемого открытой рамкой чтения NGF дикого типа, такого как C-концевой отсщепляемый пептид, в случае человеческого NGF, состоящего из двух аминокислотных остатков «RA» (240 и 241 в SEQ ID NO: 1). Последовательности нечеловеческого про-NGF доступны, например, в научной литературе при использовании алгоритма поиска последовательностей, такого как BLAST, с использованием положений 19-121 SEQ ID NO: 1 в качестве вводных данных, а также в общедоступных базах данных белков, таких как Swissprot."Pro-NGF" in the context of the present description refers to a peptide sequence containing both the mature part of NGF and the corresponding pro-peptide, but not including the corresponding pre-peptide. Human pro-NGF consists of a sequence containing a contiguous sequence ranging from residue 19 of SEQ ID NO: 1 to at least residue 239 of SEQ ID NO: 1. Although wild-type human pro-NGF includes a C-terminal dipeptide (
Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются здесь взаимозаменяемо и относятся как к РНК, так и к ДНК, включая кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК и эквиваленты ДНК/РНК, содержащие аналоги нуклеотидов, аналоги фосфата и/или аналоги сахаров. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной или одноцепочечной (т.е. смысловой цепью или антисмысловой цепью). Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают гены, открытые рамки считывания, фрагменты генов, экзоны, интроны, информационную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, миРНК, микро-РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированные нуклеиновые кислоты любого типа, последовательности зондов нуклеиновых кислот и праймеры, а также аналоги нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты могут иметь трехмерную структуру любого типа.The terms "nucleic acid" and "polynucleotide" are used interchangeably herein and refer to both RNA and DNA, including cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, and DNA/RNA equivalents containing nucleotide analogs, phosphate analogs, and/or sugar analogs. The nucleic acid may be double-stranded or single-stranded (ie, sense strand or antisense strand). Non-limiting examples of polynucleotides include genes, open reading frames, gene fragments, exons, introns, messenger RNA (mRNA), transfer RNA, ribosomal RNA, miRNA, miRNA, ribozymes, cDNA, recombinant polynucleotides, branched polynucleotides, plasmids, vectors, isolated nucleic acids of any type, nucleic acid probe sequences and primers, and nucleic acid analogs. Nucleic acids can have any type of three-dimensional structure.
Термин «пептид» согласно изобретению включает олиго- и полипептиды и относится к веществам, включающим две или более, предпочтительно 3 или более, предпочтительно 4 или более, предпочтительно 6 или более, предпочтительно 8 или более, предпочтительно 10 или более, предпочтительно 13 или более, предпочтительно более 16, предпочтительно 21 или более и предпочтительно до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности до 100 аминокислот, ковалентно связанных в цепь пептидными связями.The term "peptide" according to the invention includes oligo- and polypeptides and refers to substances comprising two or more, preferably 3 or more, preferably 4 or more, preferably 6 or more, preferably 8 or more, preferably 10 or more, preferably 13 or more , preferably more than 16, preferably 21 or more and preferably up to 8, 10, 20, 30, 40 or 50, in particular up to 100 amino acids covalently linked in a chain by peptide bonds.
Термин «белок» предпочтительно относится к большим пептидам, предпочтительно к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но в целом термины «пептид», «полипептид» и «белок» являются синонимами и используются здесь взаимозаменяемо, если контекст не диктует иное. Таким образом, термины «полипептид SEQ ID NO: 4 и « белок SEQ ID NO: 4» имеют идентичное значение.The term "protein" preferably refers to large peptides, preferably peptides with more than 100 amino acid residues, but in general the terms "peptide", "polypeptide" and "protein" are synonymous and are used interchangeably here, unless the context dictates otherwise. Thus, the terms "polypeptide SEQ ID NO: 4" and "protein SEQ ID NO: 4" have the same meaning.
Термин «фармацевтически приемлемый» обычно описывает, что определенное вещество можно вводить субъекту, необязательно и предпочтительно в комбинации с агентом, без агента, вызывающего непереносимые побочные эффекты, в используемой дозировке.The term "pharmaceutically acceptable" generally describes that a particular substance can be administered to a subject, optionally and preferably in combination with an agent, without an agent causing intolerable side effects, at the dosage used.
Термины «фармацевтически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый эксципиент» используются для обозначения одного или нескольких из растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических агентов и агентов, замедляющих всасывание, и т.п., которые являются физиологически совместимыми и пригодными для введения субъекту, как описано в данном документе, или иным образом не мешают такому введению. Примеры таких фармацевтически приемлемых носителей включают, без ограничения, один или несколько из списка, состоящего из воды, физиологического раствора, забуференного фосфатом физиологического раствора, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также комбинации таковых. В частности, в случае жидких фармацевтических композиций может оказаться предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, увеличивающие срок хранения или эффективность агента. Фармацевтически приемлемый носитель обычно входит в композицию согласно настоящему изобретению.The terms "pharmaceutically acceptable carrier" and "pharmaceutically acceptable excipient" are used to refer to one or more of solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents and absorption delaying agents, etc., which are physiologically compatible and suitable for administration to a subject as described herein, or otherwise interfere with such administration. Examples of such pharmaceutically acceptable carriers include, without limitation, one or more of the list consisting of water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, as well as combinations thereof. In particular, in the case of liquid pharmaceutical compositions, it may be advantageous to include isotonic agents, for example sugars, polyhydric alcohols such as mannitol, sorbitol or sodium chloride, in the composition. Pharmaceutically acceptable carriers may further include adjuvants such as wetting or emulsifying agents, preservatives or buffers to increase the shelf life or effectiveness of the agent. A pharmaceutically acceptable carrier is usually included in the composition according to the present invention.
Термин «фармацевтически активный агент (средство)» относится к агенту, который можно использовать при введении субъекту таким образом, что агент способен принести пользу, например, вызвать облегчение симптомов заболевания или расстройства. Кроме того, «фармацевтически активный агент» может оказывать положительное или благоприятное воздействие на состояние или течение болезни субъекта при введении субъекту в терапевтически эффективном количестве. Предпочтительно, фармацевтически активный агент обладает лечебными свойствами и может вводиться для облегчения, уменьшения, купирования, регрессии, отсрочки начала заболевания или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный агент может обладать профилактическими свойствами и использоваться для отсрочки начала заболевания или для уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Например, заявленный агент по изобретению рассматривается здесь как фармацевтически активный ингредиент для лечения кистозного фиброза. В другом примере, фармацевтически активный белок может быть использован для лечения клетки или индивидума, которые в норме не экспрессирует белок вообще или на желаемых уровнях, или которые неправильно экспрессирует белок, например, фармацевтически активный белок может компенсировать мутации, приводящие к отсутствию достаточно высокой экспрессии, путем поставки желаемого белка. Термин «фармацевтически активный пептид или белок» включает целые белки или полипептиды, а также может относиться к их фармацевтически активным фрагментам. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка.The term "pharmaceutically active agent" refers to an agent that can be used when administered to a subject in such a way that the agent is able to provide a benefit, such as ameliorating the symptoms of a disease or disorder. In addition, a "pharmaceutically active agent" may have a beneficial or beneficial effect on a subject's condition or course of disease when administered to the subject in a therapeutically effective amount. Preferably, the pharmaceutically active agent has medicinal properties and may be administered to alleviate, reduce, arrest, regress, delay the onset of a disease, or reduce the severity of one or more symptoms of a disease or disorder. The pharmaceutically active agent may have prophylactic properties and be used to delay the onset of a disease or to lessen the severity of such a disease or condition. For example, the claimed agent of the invention is considered here as a pharmaceutically active ingredient for the treatment of cystic fibrosis. In another example, a pharmaceutically active protein can be used to treat a cell or individual that does not normally express the protein at all or at desired levels, or that does not express the protein correctly, e.g., the pharmaceutically active protein can compensate for mutations resulting in a lack of high enough expression, by supplying the desired protein. The term "pharmaceutically active peptide or protein" includes whole proteins or polypeptides, and may also refer to their pharmaceutically active fragments. It may also include pharmaceutically active analogs of the peptide or protein.
«Открытая рамка считывания» или «ORF» представляет собой непрерывный участок кодонов, начинающийся стартовым кодоном и заканчивающийся стоп-кодоном.An "open reading frame" or "ORF" is a contiguous stretch of codons beginning with a start codon and ending with a stop codon.
Термины «субъект» и «пациент» в контексте настоящего описания относятся к млекопитающему. Например, млекопитающие в контексте настоящего изобретения представляет собой человека, приматов, одомашненных животных, включая, без ограничения таковыми, собак, кошек, овец, крупный рогатый скот, коз, свиней, лошадей и т.д., лабораторных животных, а также мышей, крыс, кроликов и др., а также животных в неволе, например животных, содержащихся в зоопарках. Термины «субъект» и «пациент», используемые здесь, в частности, включают человека. Субъект (человек или животное) имеет два набора хромосом; то есть является диплоидным. Термин «пациент» относится к субъекту, который страдает от состояния, находится в группе риска и подвержен болезненному состоянию, страдает от состояния или, по прогнозам, может страдать от состояния, и который может быть подвергнут терапии, например, при введении агента. Состояние пациента может быть хроническим и/или острым. Таким образом, «пациент» также может быть описан как субъект, подвергаемый терапии и/или нуждающийся в таковой.The terms "subject" and "patient" in the context of the present description refer to a mammal. For example, mammals in the context of the present invention are humans, primates, domesticated animals, including, but not limited to, dogs, cats, sheep, cattle, goats, pigs, horses, etc., laboratory animals, as well as mice, rats, rabbits, etc., as well as animals in captivity, such as animals kept in zoos. The terms "subject" and "patient" as used herein specifically include a human. The subject (human or animal) has two sets of chromosomes; that is, it is diploid. The term "patient" refers to a subject who suffers from a condition, is at risk of and is susceptible to a disease state, suffers from a condition, or is predicted to suffer from a condition, and who can be treated, for example, by administering an agent. The patient's condition may be chronic and/or acute. Thus, a "patient" can also be described as a subject undergoing and/or in need of therapy.
Термин «терапия» следует понимать в широком смысле, таковой относится к применению к субъекту с целью предотвращения или к лечению состояния у субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления терапия, в частности, включает введение агента субъекту.The term "therapy" should be understood in a broad sense, such as the application to a subject to prevent or treat a condition in the subject. In preferred embodiments, the implementation of therapy, in particular, includes the introduction of an agent to the subject.
Используемый здесь термин «трипсин» обычно относится к протеолитическому ферменту, классифицированному как EC 3.4.21.4). Трипсин расщепляет пептидные цепи в основном на карбоксильном конце по аминокислотам лизину или аргинину, обычно за исключением случаев, когда за таковыми следует пролин. Не ограничиваясь теорией, следует понимать, что трипсин является сериновой протеазой и что трипсин естественным образом содержится в пищеварительной системе многих позвоночных, где он гидролизует белки. В настоящем изобретении предпочтительным является трипсин из рекомбинантных источников. Хотя in vivo трипсин образуется вместе с пропептидом (называемым «трипсиногеном»), используемый здесь термин «трипсин» предпочтительно относится к зрелому трипсину, лишенному какого-либо пропептида. Использование трипсина для протеолитического расщепления также может называться «трипсиновым протеолизом» или «трипсинизацией», а белки, возникающие в результате расщепления трипсином, называются «трипсинизированные».As used herein, the term "trypsin" generally refers to a proteolytic enzyme classified as EC 3.4.21.4). Trypsin cleaves peptide chains mainly at the carboxyl end at the amino acids lysine or arginine, usually except when they are followed by proline. Without being limited by theory, it should be understood that trypsin is a serine protease and that trypsin is found naturally in the digestive system of many vertebrates, where it hydrolyzes proteins. In the present invention, trypsin from recombinant sources is preferred. Although trypsin is formed in vivo with a propeptide (referred to as "trypsinogen"), the term "trypsin" as used herein preferably refers to mature trypsin lacking any propeptide. The use of trypsin for proteolytic cleavage may also be referred to as "trypsin proteolysis" or "trypsinization", and proteins resulting from trypsin cleavage are referred to as "trypsinized".
«Вариант» предшественника NGF или полипептида SEQ ID NO: 3 или 4 относится к полипептиду или белку, аминокислотная последовательность которого не соответствует части зрелого NGF (бета-NGF) или не соответствует части SEQ ID NO: 3 или 4 соответственно; характеризуется по меньшей мере одной мутацией по сравнению с предшественником NGF дикого типа, таким как про-NGF дикого типа или пре-про-NGF дикого типа; где указанная, по меньшей мере, одна мутация предпочтительно обнаруживается на N-конце аминокислотной последовательности зрелого NGF (бета-NGF). Таким образом, в контексте настоящего описания «вариант» предшественника NGF или подобного белка относится к пептиду или белку, в котором препептид и/или пропептид характеризуется, по меньшей, мере одной мутацией по отношению к аминокислотной последовательности препептида и/или пропептида, без ограничения таковым, например, представляет собой те варианты, которые описаны в WO 2013/092776 A1 и в US 2018/0086805 A1. Для иллюстративных целей в WO 2013/092776 A1 описаны «варианты» про-NGF, в которых сайт расщепления фурина (дикого типа) отсутствует из-за одной или нескольких специфических мутаций.A "variant" NGF precursor or polypeptide of SEQ ID NO: 3 or 4 refers to a polypeptide or protein whose amino acid sequence does not correspond to part of mature NGF (beta-NGF) or does not correspond to part of SEQ ID NO: 3 or 4, respectively; characterized by at least one mutation compared to a wild-type NGF precursor, such as wild-type pro-NGF or wild-type pre-pro-NGF; where the specified at least one mutation is preferably found at the N-terminus of the amino acid sequence of Mature NGF (beta-NGF). Thus, in the context of the present description, a "variant" of an NGF precursor or similar protein refers to a peptide or protein in which the prepeptide and/or propeptide is characterized by at least one mutation with respect to the amino acid sequence of the prepeptide and/or propeptide, without limitation. , for example, are those described in WO 2013/092776 A1 and US 2018/0086805 A1. For illustrative purposes, WO 2013/092776 A1 describes pro-NGF "variants" in which a furin cleavage site (wild type) is missing due to one or more specific mutations.
Термин «вектор» или «вектор клонирования» обычно относится к нуклеиновой кислоте, которая может быть введена в клетку-хозяина. Примеры векторов включают, без ограничения таковыми, плазмиды, фаги и все другие типы нуклеиновых кислот, которые могут быть введены в клетку-хозяина. Термин «вектор» следует понимать широко, как включающий векторы, кодирующие пептид или белок для гетерологичной экспрессии (такие векторы могут служить в качестве матриц для генерации транскриптов), и векторы, которые такого не осуществляют. Векторы первого типа будут содержать открытую рамку считывания, кодирующую белок или пептид, который будет экспрессироваться, если вектор присутствует в клетке-хозяине. Хотя тип вектора, который выберет специалист в данной области техники, будет зависеть от типа клетки-хозяина, выбранной специалистом, в конкретном случае векторы клонирования для всех обычных клеток-хозяев, включая E.coli, коммерчески доступны, и, таким образом, специалист в данной области техники может выбрять конкретный вектор с полным учетом характеристик выбранной клетки-хозяина.The term "vector" or "cloning vector" generally refers to a nucleic acid that can be introduced into a host cell. Examples of vectors include, but are not limited to, plasmids, phages, and all other types of nucleic acids that can be introduced into a host cell. The term "vector" should be understood broadly to include vectors encoding a peptide or protein for heterologous expression (such vectors may serve as templates for generating transcripts) and vectors that do not. Vectors of the first type will contain an open reading frame encoding a protein or peptide that will be expressed if the vector is present in the host cell. Although the type of vector chosen by one of skill in the art will depend on the type of host cell chosen by one of skill in the art, in a particular case, cloning vectors for all common host cells, including E. coli, are commercially available, and thus one of skill in of the art may choose a particular vector with full regard for the characteristics of the selected host cell.
Термин «дикий тип» используется здесь для обозначения гена или белка, обычно встречающегося в природе, предпочтительно у здорового субъекта. Ген или белок, который не является «диким типом», упоминается здесь как «мутант» или «мутировавший» или тому подобное. Для иллюстративных целей SEQ ID NO: 1 показывает аминокислотную последовательность предшественника человеческого NGF дикого типа; SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность человеческого NGF дикого типа.The term "wild type" is used here to refer to a gene or protein that is usually found in nature, preferably in a healthy subject. A gene or protein that is not "wild type" is referred to here as "mutant" or "mutated" or the like. For illustrative purposes, SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the wild-type human NGF precursor; SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of wild-type human NGF.
Настоящее изобретение основано на нескольких взаимосвязвнных открытиях, которые, вместе взятые, привели изобретателей к различным аспектам изобретения, описанных ниже индивидуально.The present invention is based on several related discoveries which, taken together, led the inventors to various aspects of the invention, described individually below.
Агент по настоящему изобретениюAgent of the present invention
Настоящее изобретение относится к агенту для лечения и/или предотвращения дерматологического заболевания у млекопитающего. Агент может быть использован для введения субъекту при необходимости, например, для облегчения симптомов заболевания или расстройства. В частности, агент, предлагаемый по настоящему изобретению, представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Таким образом, настоящее изобретение, в частности, предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для использования в терапии. Терапия обычно включает введение указанного полипептида в организм человека или животного, как описано ниже.The present invention relates to an agent for the treatment and/or prevention of a dermatological disease in a mammal. The agent may be used to administer to a subject as needed, for example, to alleviate the symptoms of a disease or disorder. In particular, the agent of the present invention is a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. Thus, the present invention specifically provides a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 for use in therapy. Therapy usually includes the introduction of the specified polypeptide in the human or animal body, as described below.
Согласно настоящему изобретению полипептиды SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 представлены в качестве фармацевтически активных агентов. В соответствии с настоящим изобретением полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 предназначен для медицинского применения, в частности, для лечения и/или предотвращения дерматологического заболевания у млекопитающего. Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 происходит из рекомбинантного источника. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет рекомбинантный полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для медицинского применения, как описано в данном документе.According to the present invention, the polypeptides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are presented as pharmaceutically active agents. In accordance with the present invention, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is intended for medical use, in particular for the treatment and/or prevention of a dermatological disease in a mammal. Optionally, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is from a recombinant source. Thus, the present invention also provides a recombinant polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 for medical use as described herein.
Агент по настоящему изобретению, также называемый здесь «полипептид SEQ ID NO: 3» или «полипептид SEQ ID NO: 4», теперь будет описан более подробно. Термин «полипептид SEQ ID NO: 3» и аналогичные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, и/или агент с эквивалентной биологической активностью. Термин «полипептид SEQ ID NO: 4» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4, и/или агент с эквивалентной биологической активностью. Таким образом, эти термины также включают функционально эквивалентные части или аналоги таких полипептидов. Одним из примеров биологически эквивалентной части полипептида может быть домен или субпоследовательность полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, который(ая) включает сайт связывания, позволяющий домену или подпоследовательности проявлять по существу такую же биологическая активность, каковой обладает полноразмерный полипептид SEQ ID NO: 3 или полноразмерный полипептид SEQ ID NO: 4, или, альтернативно, ген, кодирующий такой полипептид. Термин «практически такая же биологическая активность» относится к эквивалентной части или аналогам полипептида, имеющим не менее 50%, предпочтительно не менее 60%, более предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 75%, более предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, более предпочтительно не менее 90%, более предпочтительно не менее 95% и наиболее предпочтительно не менее 97%, не менее 98% или не менее 99% активности полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4; в анализах, описанных в Примерах 3 и 4 примером биологически эквивалентного аналога полипептида может быть слитый белок, который включает, по меньшей мере, часть аминокислотной последовательности полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, а также гомологичный аналог полипептида. Кроме того, полностью синтетические молекулы, имитирующие специфическую биологическую активность полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4, также будут являться «биологически эквивалентными аналогами».The agent of the present invention, also referred to here as "polypeptide of SEQ ID NO: 3" or "polypeptide of SEQ ID NO: 4", will now be described in more detail. The term "polypeptide of SEQ ID NO: 3" and similar terms refer here to a polypeptide containing the amino acid sequence indicated in SEQ ID NO: 3 and/or an agent with equivalent biological activity. The term "polypeptide of SEQ ID NO: 4" and similar terms refer here to a polypeptide containing the amino acid sequence indicated in SEQ ID NO: 4 and/or an agent with equivalent biological activity. Thus, these terms also include functionally equivalent parts or analogs of such polypeptides. One example of a biologically equivalent portion of a polypeptide may be a domain or subsequence of a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or a polypeptide of SEQ ID NO: 4 that includes a binding site allowing the domain or subsequence to exhibit substantially the same biological activity as the full-length polypeptide. SEQ ID NO: 3 or the full length polypeptide of SEQ ID NO: 4, or alternatively the gene encoding such a polypeptide. The term "substantially the same biological activity" refers to an equivalent portion or analogs of a polypeptide having at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95% and most preferably at least 97%, at least 98% or at least 99% of the activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or the polypeptide of SEQ ID NO: 4 ; in the assays described in Examples 3 and 4, an example of a biologically equivalent polypeptide analog would be a fusion protein that includes at least a portion of the amino acid sequence of a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or a polypeptide of SEQ ID NO: 4, as well as a homologous polypeptide analog. In addition, fully synthetic molecules that mimic the specific biological activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or the polypeptide of SEQ ID NO: 4 will also be "biologically equivalent analogues".
Более предпочтительно, термин «полипептид SEQ ID NO: 3» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3; такие агенты необязательно представляют собой слитые белки, содержащие, среди прочего, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3. Наиболее предпочтительно, термин «полипептид SEQ ID NO: 3» и подобные термины обозначают здесь полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3; в этом варианте осуществления агент состоит из полипептида, состоящего из 118 аминокислотных остатков в последовательном порядке, как указано в SEQ ID NO: 3. В этом и других вариантах осуществления полипептид необязательно несет одну, две или три внутренних цистеиновых связи, таким образом, что остатки цистеина (Cys, C) ковалентно связаны друг с другом с образованием внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Цистеиновые связи предпочтительно эквивалентны связям в NGF дикого типа человека.More preferably, the term "polypeptide of SEQ ID NO: 3" and similar terms here refer to a polypeptide containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 3; such agents are optionally fusion proteins comprising, inter alia, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Most preferably, the term "polypeptide of SEQ ID NO: 3" and similar terms herein refer to a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3; in this embodiment, the agent consists of a polypeptide consisting of 118 amino acid residues in sequential order as set forth in SEQ ID NO: 3. In this and other embodiments, the polypeptide optionally bears one, two, or three internal cysteine bonds such that the residues cysteine (Cys, C) covalently linked to each other with the formation of intramolecular disulfide bridges. The cysteine bonds are preferably equivalent to those in wild-type human NGF.
В равной степени более предпочтительно термин «полипептид SEQ ID NO: 4» и подобные термины обозначают здесь полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4; такие агенты необязательно представляют собой слитые белки, которые содержат, среди прочего, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4. Наиболее предпочтительно, термин «полипептид SEQ ID NO: 4» и аналогичные термины обозначают здесь полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4; в этом варианте осуществления агент состоит из полипептида, состоящего из 118 аминокислотных остатков в последовательном порядке как указано в SEQ ID NO: 4. В этом и других вариантах осуществления полипептид необязательно несет одну, две или три внутренних цистеиновых связи, таким образом, что остатки цистеина (Cys, C) ковалентно связаны друг с другом с образованием внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Цистеиновые связи полипептида предпочтительно эквивалентны связям в NGF человека дикого типа.Equally more preferably, the term "polypeptide of SEQ ID NO: 4" and similar terms here refer to a polypeptide containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 4; such agents are optionally fusion proteins that comprise, inter alia, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. in SEQ ID NO: 4; in this embodiment, the agent consists of a polypeptide consisting of 118 amino acid residues in the sequential order as indicated in SEQ ID NO: 4. In this and other embodiments, the polypeptide optionally bears one, two, or three internal cysteine bonds, such that the cysteine residues (Cys, C) are covalently linked to each other to form intramolecular disulfide bridges. The cysteine bonds of the polypeptide are preferably equivalent to those in wild-type human NGF.
Полипептид по настоящему изобретению необязательно может быть охарактеризован дополнительными посттрансляционными модификациями. Такие посттрансляционные модификации необязательно включают гликозилирование и/или фосфорилирование. Однако, предпочтительно, полипептид по настоящему изобретению не подвергается гликозилированию и/или фосфорилированию. Действительно, с учетом того, что приведенные здесь экспериментальные примеры демонстрируют положительный эффект на заживление кожных заболеваний и допустимое соотношение положительных и отрицательных эффектов, и при понимании, что используемый полипептид был получен путем цитозольной рекомбинантной экспрессии в бактериях, обычно не приводящей к гликозилированию и/или фосфорилированию, существует вероятность того, что положительный эффект продукта по настоящему изобретению не зависит от такого типа посттрансляционной модификации. Следовательно, в предпочтительных вариантах осуществления полипептид согласно настоящему изобретению не подвергается гликозилированию и/или фосфорилированию.The polypeptide of the present invention may optionally be characterized by additional post-translational modifications. Such post-translational modifications optionally include glycosylation and/or phosphorylation. However, preferably, the polypeptide of the present invention is not glycosylated and/or phosphorylated. Indeed, in view of the fact that the experimental examples presented here demonstrate a positive effect on the healing of skin diseases and an acceptable ratio of positive and negative effects, and with the understanding that the polypeptide used was obtained by cytosolic recombinant expression in bacteria, usually not leading to glycosylation and/or phosphorylation, there is a possibility that the beneficial effect of the product of the present invention is independent of this type of post-translational modification. Therefore, in preferred embodiments, the implementation of the polypeptide according to the present invention is not subject to glycosylation and/or phosphorylation.
Как правило, полипептид по настоящему изобретению представляет собой неприродный полипептид, который не вырабатывается в норме субъектом, которому вводят полипептид. Это не только дает преимущества при обнаружении агента у субъекта после введения, но также свидетельствует о том, что введение субъекту (из внешнего источника, такого как, например, композиции, приготовленные в соответствии с настоящим описанием) может являться необходимым для достижения успеха в лечении или профилактике расстройства.Typically, a polypeptide of the present invention is a non-natural polypeptide that is not normally produced by the subject to which the polypeptide is administered. This not only provides an advantage in detecting the agent in the subject after administration, but also suggests that administration to the subject (from an external source, such as, for example, compositions prepared in accordance with the present description) may be necessary to achieve success in treatment or disorder prevention.
Предпочтительно, полипептид согласно настоящему изобретению представляет собой отдельный (изолированный) полипептид. Более предпочтительно, если полипептид согласно настоящему изобретению по существу не содержит белков клетки-хозяина, продуктов деградации (таких как вариант des-nona, например) и протеаз (например, трипсина). Если полипептид согласно настоящему изобретению практически не содержит белков клетки-хозяина, продуктов деградации (такие, как des-nona вариант, например) и протеаз (например, трипсина), то такой полипептид также может называться «чистым полипептидом». Предпочтительно, полипептид согласно настоящему изобретению вводят в форме чистого полипептида. Более предпочтительно, чистый полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 3, и/или чистый полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 4, имеет весовой процент 90% или более, предпочтительно 92% или более, более предпочтительно 93% или более, более предпочтительно 94% или более, более предпочтительно 96% или более, более предпочтительно 97% или более, более предпочтительно 98% или более, более предпочтительно 99% или более, более предпочтительно 99,2% или более, более предпочтительно 99,4% или более, более предпочтительно 99,6% или более, более предпочтительно 99,8% или более, более предпочтительно 99,9% или более по отношению к общему белку в композиции. Такой чистый полипептид доступен в соответствии с раскрытием в данном документе, включающим Примеры 1 и 2. Наиболее предпочтительно, чистый полипептид согласно настоящему изобретению имеет степень чистоты, совместимую с надлежащей производственной практикой (GMP, Good manufacturing practices).Preferably, the polypeptide of the present invention is a single (isolated) polypeptide. More preferably, the polypeptide of the present invention is substantially free of host cell proteins, degradation products (such as the des-nona variant, for example) and proteases (eg, trypsin). If a polypeptide of the present invention is substantially free of host cell proteins, degradation products (such as des-nona variant, for example), and proteases (eg, trypsin), then such a polypeptide may also be referred to as a "pure polypeptide". Preferably, the polypeptide of the present invention is administered in the form of a pure polypeptide. More preferably, the pure polypeptide consisting of SEQ ID NO: 3 and/or the pure polypeptide consisting of SEQ ID NO: 4 has a weight percent of 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 93% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, more preferably 99.2% or more, more preferably 99.4% or more, more preferably 99.6% or more, more preferably 99.8% or more, more preferably 99.9% or more, based on the total protein in the composition. Such pure polypeptide is available in accordance with the disclosure in this document, including Examples 1 and 2. Most preferably, the pure polypeptide according to the present invention has a degree of purity that is compatible with good manufacturing practices (GMP, Good manufacturing practices).
Как продемонстрировано в экспериментах в данном документе, в частности в Примерах 3 и 4, введение агента по настоящему изобретению не вызывает гипералгезического синдрома (боли), несмотря на тот факт, что агент находился в прямом контакте с полностью обнаженными ноцицептивными волокнами (нервами); таковые считаются полностью открытыми из-за отсутствия кожи и гиперактивированными в результате поражения кожи. Отсутствие боли в этих экстремальных условиях особенно примечательно, поскольку средство вводили местно и многократно на поврежденную кожу, в том числе при хронических заболеваниях (подробности показаны в примерах). Это является особенно примечательным с учетом обескураживающих данных более ранних исследований с человеческим NGF, введенным в контакт с иннервируемой областью, то есть областью, характеризующейся обнаженными ноцицепторами (Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, p. 241-247). Вышеупомянутые неожиданные результаты не могут быть объяснены исключительно тем фактом, что агент по настоящему изобретению был ранее описан как «безболезненный», поскольку его способность вызывать боль в иннервируемой области, т.е. в области обнаженных ноцицепторов, не говоря уже о гиперактивированных нервах, как в случае поражения кожи, никогда не исследовалась экспериментально. Кроме того, даже несмотря на то, что введение агента согласно настоящему изобретению является причиной реиннервации ткани (см., например, Пример 3), само введение не связано с болью. В дополнение к этому, положительный эффект агента по настоящему изобретению на ангиогенез (см. Экспериментальные Примеры) является неожиданным и не был предсказан, основываясь на данных уровня техники. Подразумевается, что ангиогенез имеет особое значение для образования ткани и закрытия ран. Таким образом, сочетание этих выгодных эффектов является весьма неожиданным в свете современного уровня техники.As demonstrated in the experiments in this document, in particular in Examples 3 and 4, the administration of the agent of the present invention does not cause a hyperalgesic syndrome (pain), despite the fact that the agent was in direct contact with fully exposed nociceptive fibers (nerves); these are considered fully open due to lack of skin and hyperactivated as a result of skin lesions. The absence of pain under these extreme conditions is particularly remarkable as the agent has been applied topically and repeatedly to damaged skin, including in chronic conditions (details are shown in the examples). This is particularly noteworthy given the discouraging data from earlier studies with human NGF placed in contact with an innervated area, ie, an area characterized by exposed nociceptors (Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, p. 241-247). The above unexpected results cannot be explained solely by the fact that the agent of the present invention has previously been described as "painless", since its ability to cause pain in the innervated area, i. in the area of exposed nociceptors, not to mention hyperactivated nerves, as in the case of skin lesions, has never been experimentally investigated. In addition, even though the administration of the agent of the present invention causes tissue reinnervation (see, for example, Example 3), the administration itself is not associated with pain. In addition, the positive effect of the agent of the present invention on angiogenesis (see Experimental Examples) is unexpected and was not predicted based on prior art data. It is understood that angiogenesis is of particular importance for tissue formation and wound closure. Thus, the combination of these beneficial effects is highly unexpected in light of the current state of the art.
Необязательно, согласно настоящему изобретению полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 вводят в эффективном количестве субъекту, нуждающемуся в этом. Подробности введения, эффективное количество и качества субъекта, нуждающегося в этом, описаны ниже.Optionally, according to the present invention, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is administered in an effective amount to a subject in need thereof. The details of the administration, the effective amount and the quality of the subject in need thereof are described below.
Полипептиды, состоящие из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно, отличаются в одном или двух положениях от аминокислотной последовательности фактора роста нервов человека (NGF, также называемый NGF дикого типа, см. SEQ ID NO: 2). Именно отличие полипептида согласно настоящему изобретению от полипептида SEQ ID NO: 2 обуславливает заметное влияние на лечение или профилактику кожных заболеваний и отсутствие побочных эффектов, как подробно раскрыто в настоящем документе и подтверждено экспериментальными данными в приведенных примерах.The polypeptides consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively, differ in one or two positions from the amino acid sequence of human nerve growth factor (NGF, also referred to as wild-type NGF, see SEQ ID NO: 2). It is the difference between the polypeptide of the present invention and the polypeptide of SEQ ID NO: 2 that causes a significant effect on the treatment or prevention of skin diseases and the absence of side effects, as detailed herein and confirmed by experimental data in the examples.
Фактор роста нервов (NGF) - это нейротрофин, необходимый для развития и выживания определенных популяций нейронов. NGF представляет собой гомодимерный пептид, который естественным образом запускает пролиферацию и гомеостаз нейронов. В организме NGF связывается по крайней мере с двумя типами рецепторов: киназой A рецептора тропомиозина (TrkA) и рецептором нейротрофина p75 с низким сродством к NGF (LNGFR/p75NTR/p75). Оба связаны с определенными расстройствами у людей и животных, хотя соответствующие механизмы действия, вероятно, различны. Было предложено несколько терапевтических применений для NGF, но лишь немногие из них были коммерчески освоены.Nerve growth factor (NGF) is a neurotrophin required for the development and survival of certain populations of neurons. NGF is a homodimeric peptide that naturally triggers neuronal proliferation and homeostasis. In the body, NGF binds to at least two types of receptors: the tropomyosin receptor kinase A (TrkA) and the low affinity neurotrophin p75 receptor for NGF (LNGFR/p75NTR/p75). Both are associated with specific disorders in humans and animals, although the respective mechanisms of action are likely to be different. Several therapeutic uses for NGF have been proposed, but few have been commercialized.
Тем не менее, хотя многие терапевтические применения NGF предполагались в прошлом, они не были доработаны до коммерчески продаваемых терапевтических продуктов NGF, и причиной этого может быть то, что NGF, помимо желаемого эффекта на пролиферацию и гомеостаз нейронов, связан с болью: он способоен вызывать гипералгезию при местном или системном введении. (Lewin et al., 1994, Eur. J. Neurosci., том 6, стр. 1903-1912; Della Seta et al., 1994, Pharmacol. Biochem. Behav., vol. 49, p. 701; Dyck et al, 1997, Neurology, vol. 48, 501-505; McArthur, et al., 2000, Neurology, vol. 54, p. 1080-1088; Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, p. 241-247; Ruiz et al., 2004, Brain Res., Vol. 1011, p. 1-6). В качестве решения были разработаны мутантные версии NGF («мутеины»), которые связаны со сниженной ноцицептивной активностью («безболезненный NG»), и которые характеризуются по меньшей мере одной мутацией в домене NGF, взаимодействующим с рецептором TrkA (WO 2008/006893 A1, Malerba et al. PLOS One, 2015, vol. 10, e0136425). Однако такие полипептиды до сих пор недоступны для продажи населению с фармацевтически приемлемой чистотой и не были предложены или разработаны для лечения или профилактики дерматологических заболеваний кожи, возможно, из-за предубеждения и общего отрицательного опыта исследований факторов роста в этой терапевтической области в целом.However, although many therapeutic applications of NGF have been proposed in the past, they have not been developed into commercially sold NGF therapeutic products, and the reason for this may be that NGF, in addition to its desired effect on neuronal proliferation and homeostasis, is associated with pain: it is able to cause hyperalgesia with local or systemic administration. (Lewin et al., 1994, Eur. J. Neurosci., vol. 6, pp. 1903-1912; Della Seta et al., 1994, Pharmacol. Biochem. Behav., vol. 49, p. 701; Dyck et al. , 1997, Neurology, vol. 48, 501-505; McArthur, et al., 2000, Neurology, vol. 54, pp. 1080-1088; Svensson et al., 2003, Pain, vol. 104, pp. 241- 247; Ruiz et al., 2004, Brain Res., Vol. 1011, pp. 1-6). As a solution, mutant versions of NGF ("muteins") have been developed which are associated with reduced nociceptive activity ("painless NG") and which are characterized by at least one mutation in the NGF domain interacting with the TrkA receptor (WO 2008/006893 A1, Malerba et al PLOS One, 2015,
Согласно настоящему изобретению стабильность и, таким образом, долговременное сохранение чистоты полипептида с SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 могут быть достигнуты и/или улучшены на основе аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе. Таким образом, настоящее изобретение не только делает доступным новое лечение или профилактику дерматологических расстройств, но также предоставляет агент, подходящий для такого лечения или профилактики, со степенью чистоты, подходящей для терапевтического применения, включая введение млекопитающему. Агент настоящего изобретения ранее не был доступен широкой публике с такой эффективной степенью чистоты.According to the present invention, stability and thus long-term purity of the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 can be achieved and/or improved based on the aspects and embodiments described herein. Thus, the present invention not only makes available a new treatment or prevention of dermatological disorders, but also provides an agent suitable for such treatment or prevention in a purity suitable for therapeutic use, including administration to a mammal. The agent of the present invention has not previously been available to the general public with such an effective degree of purity.
Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 не встречается в природе и также может называться неприродным полипептидом. Таким образом, агент по настоящему изобретению не является NGF дикого типа и, в частности, не является NGF дикого типа человека.The polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 does not occur in nature and may also be referred to as a non-natural polypeptide. Thus, the agent of the present invention is not a wild-type NGF, and in particular is not a human wild-type NGF.
Предпочтительно неприродный полипептид по настоящему изобретению имеет высокую чистоту. Полипептид, необязательно, содержит внутренние дисульфидные мостики. Полипептид, необязательно, правильно свернут. Полипептид, необязательно, растворим в водной среде.Preferably, the non-natural polypeptide of the present invention is of high purity. The polypeptide optionally contains internal disulfide bridges. The polypeptide is optionally correctly folded. The polypeptide is optionally soluble in an aqueous medium.
Настоящее изобретение частично основано на экспериментах с двумя животными моделями кожных язв. В этих моделях кожные язвы индуцируются у мышей с диабетом с помощью круговой биопсии или циклов нагружения давлением, и полипептид по настоящему изобретению применяется местно. Полипептид вызывает значительное и дозозависимое улучшение времени заживления язв по сравнению с животными, получавшими плацебо. Это улучшение было очевидным при дозах, лишенных побочных эффектов, связанных с болью, и, таким образом, демонстрирует потенциальное преимущество по сравнению с существующим уровнем техники.The present invention is based in part on experiments with two animal models of skin ulcers. In these models, skin ulcers are induced in diabetic mice by circular biopsy or pressure cycles and the polypeptide of the present invention is applied topically. The polypeptide produced a significant and dose-dependent improvement in ulcer healing time compared to placebo-treated animals. This improvement was evident at doses devoid of side effects associated with pain, and thus demonstrates a potential advantage over the current state of the art.
В частности, данные, полученные на моделях диабетических кожных язв in vivo, продемонстрировали, что полипептид по настоящему изобретению безболезнен, но сохраняет активность, направленную на рецепторную систему NGF, и тем самым является терапевтическим средством для лечения или профилактики дерматологических заболеваний. Действительно, полипептид по изобретению сохраняет трофические свойства NGF дикого типа в отношении ангиогенеза и реиннервации, что способствует заживлению язв, не вызывая про-ноцицептивных эффектов NGF дикого типа в месте местного применения и на системном уровне.In particular, data from in vivo models of diabetic skin ulcers have demonstrated that the polypeptide of the present invention is painless but retains activity directed at the NGF receptor system and thus is a therapeutic agent for the treatment or prevention of dermatological diseases. Indeed, the polypeptide of the invention retains the angiogenesis and reinnervation trophic properties of wild-type NGF, which promotes ulcer healing without inducing the pro-nociceptive effects of wild-type NGF at the topical and systemic level.
В настоящем изобретении предложен полипептид для применения в лечении и/или профилактике дерматологических заболеваний у млекопитающего, при этом полипептид выбран из полипептида с SEQ ID NO: 3 и полипептида с SEQ ID NO: 4. Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептиду SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для использования в способе лечения человека или животного посредством терапии, как описано в данном документе.The present invention provides a polypeptide for use in the treatment and/or prevention of dermatological diseases in a mammal, the polypeptide being selected from the polypeptide of SEQ ID NO: 3 and the polypeptide of SEQ ID NO: 4. Thus, the present invention also relates to the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 for use in a method of treating a human or animal through therapy as described herein.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к конкретному терапевтическому применению полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4, где конкретное терапевтическое применение представляет собой лечение и/или профилактику дерматологического заболевания у субъектов млекопитающих. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 для использования в способе лечения человека или животного посредством терапии, где терапия включает лечение и/или предотвращение дерматологического расстройства у млекопитающего. Субъект-млекопитающее обычно является субъектом, которому требуется такое лечение.More specifically, the present invention relates to a specific therapeutic use of the polypeptide of SEQ ID NO: 3 and the polypeptide of SEQ ID NO: 4, where the specific therapeutic use is the treatment and/or prevention of a dermatological disease in mammalian subjects. Thus, the present invention also provides a polypeptide of SEQ ID NO: 3 and a polypeptide of SEQ ID NO: 4 for use in a method of treating a human or animal through therapy, wherein the therapy comprises treating and/or preventing a dermatological disorder in a mammal. A mammalian subject is typically one in need of such treatment.
Полипептид SEQ ID NO: 3, а также полипептид SEQ ID NO: 4 характеризуются мутацией аминокислотной последовательности человеческого NGF (hNGF, SEQ ID NO: 2), при этом указанная мутация связана со снижением интенсивности ноцицептивного действия. В частности, аргинин в положении 100 hNGF замещен глутаминовой кислотой. Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии того, что терапевтический эффект может быть достигнут без побочных эффектов, известных из предшествующего уровня техники.The polypeptide of SEQ ID NO: 3, as well as the polypeptide of SEQ ID NO: 4, are characterized by a mutation in the amino acid sequence of human NGF (hNGF, SEQ ID NO: 2), while this mutation is associated with a decrease in the intensity of nociceptive action. In particular, the arginine at
Без ограничения какой-либо конкретной теорией, предпочтительно, чтобы полипептид согласно настоящему изобретению содержал один или несколько дисульфидных мостиков, наиболее предпочтительно, три дисульфидных мостика. Зрелый и правильно свернутый человеческий NGF характеризуется тремя дисульфидными мостиками (при связывании в позициях 136 ↔ 201, 179 ↔ 229, 189↔ 231, где нумерация позиций относятся к SEQ ID NO: 1; см. Wiesmann et al., 1999, Nature, vol. 401, с. 184-188). Без ограничения какой-либо конкретной теорией, предпочтительно, чтобы полипептид в соответствии с настоящим изобретением включал эквивалентные дисульфидные мостики (где номера позиций для связывания понятны квалифицированному специалисту при выравнивании полипептида согласно настоящему изобретению с полипептидом SEQ ID NO: 1 и Wiesmann et al., см. выше.)Without wishing to be bound by any particular theory, it is preferred that the polypeptide of the present invention contains one or more disulfide bridges, most preferably three disulfide bridges. Mature and properly folded human NGF is characterized by three disulfide bridges (when bound at positions 136 ↔ 201, 179 ↔ 229, 189 ↔ 231, where position numbering refers to SEQ ID NO: 1; see Wiesmann et al., 1999, Nature, vol. 401, pp. 184-188). Without wishing to be bound by any particular theory, it is preferred that the polypeptide of the present invention comprise equivalent disulfide bridges (wherein the linking position numbers are clear to the skilled artisan when aligning the polypeptide of the present invention with the polypeptide of SEQ ID NO: 1 and Wiesmann et al., see . higher.)
Описание наличия и отсутствия побочных эффектовDescription of the presence and absence of side effects
Предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика не вызывали побочных или нежелательных эффектов у субъекта, которому вводят или вводили полипептид. Один из побочных эффектов или побочный эффект, который предпочтительно отсутствует в данном контексте, - это гипералгезия или боль. Таким образом, предпочтительно, введение агента по настоящему изобретению не вызывает гипералгезического синдрома (боли).Preferably, the treatment and/or prophylaxis does not cause side or undesirable effects in the subject to which the polypeptide is or has been administered. One side effect or side effect that is preferably not present in this context is hyperalgesia or pain. Thus, preferably, the administration of the agent of the present invention does not cause a hyperalgesic syndrome (pain).
Важно отметить, что отсутствие боли не просто предоставляет более приятное (или менее неприятное) лечение, чем введение эталонного соединения, связанного с болью (например, NGF дикого типа), а, по крайней мере, частично является причиной успеха лечения или профилактики кожных заболеваний как таковых: учитывая, что полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят местно, более предпочтительно вводят местно на участок, пораженный кожным заболеванием (например, при язвах), отсутствие боли позволяет субъекту, проходящему лечение, принимать введение полипептида на поверхность тела без побочных реакций, таких как соскабливание, смывание или удаление его иным способом, чтобы снять боль, в результате чего полипептид будет продолжать воздействие на пораженную поверхность тела, оказывая терапевтически положительный эффект, например, при лечении или профилактике кожного заболевания. Таким образом, отсутствие боли, связанной с полипептидом по настоящему изобретению, будет подходящим условием для преодоления сопротивления потребителей и опасений регулирующих органов. Другими словами, отсутствие боли связано со значительным увеличением соотношения польза/риск по сравнению с агентами, ассоциирующимися с болью.It is important to note that the absence of pain does not merely provide a more pleasant (or less unpleasant) treatment than administration of a reference pain-associated compound (e.g., wild-type NGF), but is at least partly responsible for the success of treating or preventing skin diseases as such: considering that the polypeptide of the present invention is preferably administered topically, more preferably administered topically to a site affected by a skin disease (e.g., ulcers), the absence of pain allows the subject to be treated to accept the administration of the polypeptide to the surface of the body without adverse reactions such as scraping, rinsing or otherwise removing it to relieve pain, whereby the polypeptide will continue to act on the affected surface of the body, providing a therapeutically beneficial effect, for example, in the treatment or prevention of a skin disease. Thus, the absence of pain associated with the polypeptide of the present invention would be an appropriate condition to overcome consumer resistance and regulatory concerns. In other words, the absence of pain is associated with a significant increase in the benefit/risk ratio compared to agents associated with pain.
В частности, предпочтительно, чтобы лечение и/или профилактика не вызывали гипералгезии у млекопитающего. В одном варианте осуществления субъект, которому вводят полипептид по изобретению, не страдает механической аллодинией. Точнее, механическая аллодиния не индуцируется у субъекта, которому вводят полипептид по изобретению, так что субъект, которому вводят полипептид, не страдает механической аллодинией.In particular, it is preferred that the treatment and/or prophylaxis does not cause hyperalgesia in the mammal. In one embodiment, the subject to which the polypeptide of the invention is administered does not suffer from mechanical allodynia. More precisely, mechanical allodynia is not induced in a subject to which a polypeptide of the invention is administered, so that a subject to which a polypeptide is administered does not suffer from mechanical allodynia.
В одном варианте осуществления субъект, которому вводят полипептид по изобретению, не страдает термальной аллодинией. Более точно, термальная аллодиния не индуцируется у субъекта, которому вводят полипептид по изобретению, так что субъект, которому вводят полипептид, не страдает термальной аллодинией.In one embodiment, the subject to which the polypeptide of the invention is administered does not suffer from thermal allodynia. More precisely, thermal allodynia is not induced in a subject to which a polypeptide of the invention is administered, so that a subject to which a polypeptide is administered does not suffer from thermal allodynia.
Другой побочный эффект или нежелательный эффект, который предпочтительно отсутствует в данном контексте, представляет собой злокачественное новообразование или рак. В частности, введение полипептида по настоящему изобретению субъекту предпочтительно не связано с аномальным ростом клеток и даже, что более предпочтительно, не связано не только с аномальным ростом клеток, но и с возможностью проникновения или распростпоражения клеток на другие части тела. Особенно предпочтительно, что введение полипептида по настоящему изобретению субъекту предпочтительно никак не связано с раком кожи, в частности дермы или эпидермиса. В этом отношении лечение или введение согласно настоящему изобретению связано со значительными преимуществами по сравнению с уровнем техники, например, по сравнению с коммерческим лечением фактором роста, полученным из тромбоцитов (беклапермин, торговая марка Regranex). Таким образом, ожидается, что отсутствие злокачественных новообразований, связанных с полипептидом по настоящему изобретению, поможет преодолеть сопротивление потребителей и опасения регулирующих органов. Другими словами, отсутствие злокачественного новообразования связано со значительным увеличением соотношения польза/риск по сравнению с таковым агентов, связаных с риском злокачественных новообразований.Another side effect or undesirable effect, which is preferably not present in this context, is a malignant neoplasm or cancer. In particular, the administration of the polypeptide of the present invention to a subject is preferably not associated with abnormal cell growth, and even more preferably not associated not only with abnormal cell growth, but also with the possibility of penetration or spread of cells to other parts of the body. It is especially preferred that the administration of the polypeptide of the present invention to a subject is preferably not associated with skin cancer, in particular of the dermis or epidermis. In this regard, the treatment or administration according to the present invention is associated with significant advantages over the prior art, for example over commercial treatment with platelet-derived growth factor (beclapermin, brand name Regranex). Thus, the absence of malignancies associated with the polypeptide of the present invention is expected to help overcome consumer resistance and regulatory concerns. In other words, the absence of malignancy is associated with a significant increase in the benefit/risk ratio compared to that of agents associated with the risk of malignancy.
Таким образом, предпочтительно, что введение полипептида по настоящему изобретению субъекту не сопровождается побочными эффектами, такими как злокачественные новообразования и/или боль.Thus, it is preferred that administration of a polypeptide of the present invention to a subject is not accompanied by side effects such as cancer and/or pain.
Обычно введение агента согласно настоящему изобретению хорошо переносится субъектом. В частности, предпочтительно, введение полипептида по настоящему изобретению не связано с образованием у субъекта антител против лекарств. Действительно, поскольку аминокислотная последовательность полипептида согласно настоящему изобретению отличается только по одной или двум аминокислотным позициям от человеческого NGF дикого типа, то вероятно, что иммунологическая переносимость у людей является особенно привлекательным фактором, и вероятно, что введение полипептида по настоящему изобретению не вызывает образования антител против лекарств у человека.Generally, administration of an agent of the present invention is well tolerated by the subject. Particularly preferably, the administration of the polypeptide of the present invention does not result in the formation of anti-drug antibodies in the subject. Indeed, since the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention differs in only one or two amino acid positions from wild-type human NGF, it is likely that immunological tolerance in humans is a particularly attractive factor, and it is likely that administration of the polypeptide of the present invention does not induce the formation of antibodies against drugs in humans.
Предпочтительно, введение согласно настоящему изобретению положительно влияет на одно или несколько из следующих: воспаление, отложение внеклеточного матрикса, иннервацию и ангиогенез.Preferably, administration according to the present invention positively affects one or more of the following: inflammation, extracellular matrix deposition, innervation, and angiogenesis.
Обнаруживаемость полипептидаPolypeptide detectability
Предпочтительно, полипептид для использования согласно настоящему изобретению может селективно распознаваться реагентом, специфичным в отношении эндогенного (например, человеческого) NGF. Термины «селективно распознаваемый» и «обнаруживаемый» используются здесь взаимозаменяемо и обычно относятся к специфичной идентификации, предпочтительно молекулярными средствами, белка в биологическом образце.Preferably, a polypeptide for use according to the present invention can be selectively recognized by a reagent specific for endogenous (eg, human) NGF. The terms "selectively recognizable" and "detectable" are used interchangeably herein and generally refer to the specific identification, preferably by molecular means, of a protein in a biological sample.
В этом отношении полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно обнаруживается антителом или другой иммунореактивной молекулой.In this regard, the polypeptide according to the present invention is preferably detected by an antibody or other immunoreactive molecule.
Белок, обнаруживаемый антителом или другой иммунореактивной молекулой, также может называться антигеном. В некоторых вариантах осуществления биологический образец может характеризоваться презентации - или отсутствием презентации одного или нескольких специфических антигенов. В контексте настоящего изобретения полипептид, вводимый субъекту, предпочтительно обнаруживается в биологическом образце, полученном от субъекта после введения полипептида. Одним из неограничивающих способов демонстрации присутствия белка является вестерн-блоттинг, но другие иммунологические методы в равной степени включаются в контекст настоящего изобретения. Антитело или другая иммунореактивная молекула либо сама помечена (например, флуорофором), либо распознается меченым вторичным антителом или другой иммунореактивной молекулой, которая добавляется для этой цели. Таким образом, в некоторых случаях вторичная молекула, способствующая обнаружению, например, необязательно, меченое вторичное антител, также добавляется для облегчения обнаружения.A protein detected by an antibody or other immunoreactive molecule may also be referred to as an antigen. In some embodiments, the implementation of the biological sample may be characterized by the presentation - or lack of presentation of one or more specific antigens. In the context of the present invention, the polypeptide administered to a subject is preferably found in a biological sample obtained from the subject after administration of the polypeptide. One non-limiting way to demonstrate the presence of a protein is Western blot, but other immunological methods are equally included in the context of the present invention. The antibody or other immunoreactive molecule is either itself labeled (eg, with a fluorophore) or is recognized by a labeled secondary antibody or other immunoreactive molecule that is added for that purpose. Thus, in some cases, a secondary detection aiding molecule, for example optionally a labeled secondary antibody, is also added to facilitate detection.
Согласно изобретению антиген считается присутствующим в биологическом образце, если его уровень выше предела обнаружения и/или если уровень достаточно высок, чтобы позволить связывание антигенспецифическими антителами, добавленными к образцу. Согласно изобретению антиген считается неэкспрессируемым в клетке, если уровень экспрессии ниже предела обнаружения и/или если уровень экспрессии слишком низок, чтобы позволить связывание антигенспецифическими антителами, добавленными к образцу.According to the invention, an antigen is considered present in a biological sample if its level is above the detection limit and/or if the level is high enough to allow binding by antigen-specific antibodies added to the sample. According to the invention, an antigen is considered unexpressed in a cell if the expression level is below the detection limit and/or if the expression level is too low to allow binding by the antigen-specific antibodies added to the sample.
Антитело или другая иммунореактивная молекула может распознавать эпитоп на клеточной поверхности. Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте молекулы, такой как антиген, т.е. к части или фрагменту молекулы, которая распознается, то есть связывается иммунной системой, например, которая распознается антителом или другой иммунореактивной молекулой. Обнаружение эпитопа, специфичного для любого конкретного антигена, обычно позволяет сделать вывод о том, что этот конкретный антиген присутствует в анализируемой клетке.An antibody or other immunoreactive molecule can recognize an epitope on a cell surface. The term "epitope" refers to an antigenic determinant of a molecule, such as an antigen, i. to a portion or fragment of a molecule that is recognized by, ie bound to, the immune system, for example, that is recognized by an antibody or other immunoreactive molecule. The detection of an epitope specific for any particular antigen will usually lead to the conclusion that that particular antigen is present in the analyzed cell.
В одном варианте осуществления образец, полученный от субъекта, в частности субъекта, которому вводили полипептид согласно настоящему изобретению, можно охарактеризовать с помощью иммунофенотипирования. «Иммунофенотипирование» обычно означает, что клетка или образец могут быть охарактеризованы антиген-специфическими молекулами, такими как антитела или другие иммунореактивные молекулы, которые добавляются к образцу для определения наличия антигена. Иммунофенотипирование включает сортировку клеток с использованием различных методов, включая проточную цитометрию, а также методы анализа лизированных клеток и лизированных образцов, такие как вестерн-блоттинг.In one embodiment, a sample obtained from a subject, in particular a subject to whom a polypeptide of the present invention has been administered, can be characterized by immunophenotyping. "Immunophenotyping" generally means that a cell or sample can be characterized by antigen-specific molecules, such as antibodies or other immunoreactive molecules, which are added to the sample to determine the presence of an antigen. Immunophenotyping involves sorting cells using a variety of techniques, including flow cytometry, as well as methods for analyzing lysed cells and lysed samples, such as Western blotting.
В настоящем изобретении особенно предпочтительным является полипептид, который может быть специфически обнаружен даже в присутствии NGF дикого типа, например человеческого NGF дикого типа. Хотя любая мутация аминокислотной последовательности, такая как, например, любая точечная мутация, может сделать полипептид специфически детектируемым даже в присутствии соответствующего немутантного полипептида дикого типа, то, следовательно, каждый полипептид SEQ ID NO: 3 и каждый полипептид SEQ ID NO: 4 могут быть, prima facie, специфически обнаружены даже в присутствии человеческого NGF дикого типа, в частности полипептид SEQ ID NO: 4, для которого уже доступно антитело, способное отличать указанный полипептид от NGF человека дикого типа (WO 2008/006893 A1).Particularly preferred in the present invention is a polypeptide that can be specifically detected even in the presence of wild-type NGF, eg, wild-type human NGF. While any amino acid sequence mutation, such as, for example, any point mutation, can make a polypeptide specifically detectable even in the presence of the corresponding wild-type wild-type polypeptide, therefore, each polypeptide of SEQ ID NO: 3 and each polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be , prima facie are specifically detected even in the presence of wild-type human NGF, in particular the polypeptide of SEQ ID NO: 4, for which an antibody is already available capable of distinguishing said polypeptide from wild-type human NGF (WO 2008/006893 A1).
Таким образом, предпочтительно, полипептид характеризуется, по меньшей мере, отсутствием пролина в положении 61 (который присутствует в положении 61 эталонной SEQ ID NO: 2), более предпочтительно заменой пролина в положении 61 другой аминокислотой. В особенно предпочтительном варианте осуществления пролин в положении 61 заменен серином. В этом предпочтительном варианте осуществления полипептид для использования согласно настоящему изобретению представляет собой полипептид SEQ ID NO: 4. Этот полипептид характеризуется по меньшей мере отсутствием пролина в положении 61, более предпочтительно заменой пролина в положении 61 на другую аминокислоту. В SEQ ID NO: 4 пролин в положении 61 из SEQ ID NO: 3 заменен серином.Thus, preferably, the polypeptide is characterized by at least the absence of the proline at position 61 (which is present at position 61 of the reference SEQ ID NO: 2), more preferably by replacing the proline at position 61 with another amino acid. In a particularly preferred embodiment, the proline at position 61 is replaced by a serine. In this preferred embodiment, the polypeptide for use according to the present invention is a polypeptide of SEQ ID NO: 4. This polypeptide is characterized by at least the absence of a proline at position 61, more preferably a replacement of the proline at position 61 with another amino acid. In SEQ ID NO: 4, proline at position 61 of SEQ ID NO: 3 is replaced by serine.
Пораженная поверхность телаAffected body surface
В соответствии с настоящим изобретением на пораженную поверхность тела вводят полипептид по изобретению.In accordance with the present invention, the polypeptide of the invention is administered to the affected body surface.
Пораженные поверхности тела включают, без ограничения таковыми, язвы (венозные язвы, артериальные язвы, пролежни, диабетические язвы), послеоперационные раны, пролежни, ожоги, разрывы, разрезы, синяки, ссадины, колотые раны) и т.п. Субъекты, имеющие такие поражения поверхности тела, будут описаны ниже, и следующее описание пораженной поверхности тела применимо ко всем таким субъектам, если контекст явно не диктует иное.Body surfaces affected include, but are not limited to, ulcers (venous ulcers, arterial ulcers, bedsores, diabetic ulcers), postoperative wounds, bedsores, burns, tears, incisions, bruises, abrasions, puncture wounds), and the like. Subjects having such body surface lesions will be described below, and the following description of the affected body surface applies to all such subjects unless the context clearly dictates otherwise.
В одном варианте осуществления агент согласно настоящему изобретению предоставляется для лечения и профилактики кожного заболевания, при этом кожное заболевание выбрано из язв, послеоперационных ран, пролежней, ожогов, разрывов, разрезов, синяков, ссадин и колотых ран.In one embodiment, an agent of the present invention is provided for the treatment and prevention of a skin disease, the skin disease being selected from ulcers, postoperative wounds, bedsores, burns, lacerations, incisions, bruises, abrasions, and puncture wounds.
В одном варианте осуществления предоставляется средство согласно настоящему изобретению в данном документе для лечения и профилактики язв, при этом язва выбрана из венозных язв, артериальных язв, пролежней и диабетических язв.In one embodiment, an agent of the present invention is provided herein for the treatment and prevention of ulcers, wherein the ulcer is selected from venous ulcers, arterial ulcers, decubitus ulcers, and diabetic ulcers.
В некоторых вариантах осуществления поверхность пораженного тела имеет диаметр 1 мм или более. В общем, когда в настоящем документе делается ссылка на «диаметр» пораженной поверхности тела, для некруглых пораженных поверхностей тела термин «диаметр» относится к наибольшему диаметру пораженной поверхности тела, измеренному от одной границы пораженной поверхности тела поперек пораженной поверхности до противоположной границы пораженной поверхности тела. Для округлых пораженных поверхностей тела диаметр, конечно, одинаков в любом направлении измерения от одной границы пораженной поверхности через пораженную поверхность до противоположной границы пораженной поверхности тела. Диаметр можно определить с помощью линейки или другого подходящего инструмента на внешней поверхности пораженной поверхности тела.In some embodiments, the implementation of the surface of the affected body has a diameter of 1 mm or more. In general, when reference is made herein to "diameter" of the affected body surface, for non-circular affected body surfaces, the term "diameter" refers to the largest diameter of the affected body surface measured from one border of the affected body surface across the affected surface to the opposite border of the affected body surface. . For round affected body surfaces, the diameter is, of course, the same in any direction of measurement from one border of the affected surface through the affected surface to the opposite border of the affected body surface. The diameter can be determined with a ruler or other suitable instrument on the outer surface of the affected body surface.
В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 1 мм до 50 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 2 мм до 20 см. Пораженные поверхности тела диаметром 0,5 см или более, предпочтительно 1 см или более, также могут называться здесь «большими» пораженными поверхностями тела. Настоящее изобретение также подходит для лечения больших пораженных поверхностей тела, таких как большие язвы (см., например, пример 4). В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 3 мм до 10 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 4 мм до 5 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 5 мм до 4 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 6 мм до 3 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 7 мм до 1 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр от 8 мм до 1 см. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр около 6 мм. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела имеет диаметр около 12 мм.In some embodiments, the affected body surface has a diameter of 1 mm to 50 cm. In some embodiments, the affected body surface has a diameter of 2 mm to 20 cm. The affected body surfaces are 0.5 cm or more in diameter, preferably 1 cm or more, also may be referred to here as "large" affected body surfaces. The present invention is also suitable for the treatment of large diseased body surfaces such as large ulcers (see, for example, Example 4). In some embodiments, the affected body surface has a diameter of 3 mm to 10 cm. In some embodiments, the affected body surface has a diameter of 4 mm to 5 cm. In some embodiments, the affected body surface has a diameter of 5 mm to 4 cm. In some embodiments, the affected body surface has a diameter of 5 mm to 4 cm. embodiments, the affected body surface has a diameter of 6 mm to 3 cm. In some embodiments, the affected body surface has a diameter of 7 mm to 1 cm. In some embodiments, the affected body surface has a diameter of 8 mm to 1 cm. In some embodiments, the implementation of the affected body surface has a diameter of 8 mm to 1 cm. the affected surface of the body has a diameter of about 6 mm. In some embodiments, the affected body surface is about 12 mm in diameter.
Субъекты, для которых агент по настоящему изобретению является особенно подходящимSubjects for which the agent of the present invention is particularly suitable
Согласно настоящему изобретению полипептид с SEQ ID NO: 3 или с SEQ ID NO: 4 можно вводить субъекту, нуждающемуся в таком введении. Субъект, нуждающийся в таком введении, может быть субъектом, диагностированным описанным здесь расстройством, субъектом с риском заболевания таким расстройством или иным образом страдающим таким расстройством. Агент вводится субъекту в терапевтически эффективном количестве. Терапевтически эффективное количество может быть определено врачом с учетом настоящего описания.According to the present invention, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 can be administered to a subject in need of such an administration. A subject in need of such an administration may be a subject diagnosed with a disorder as described herein, a subject at risk for such a disorder, or otherwise suffering from such a disorder. The agent is administered to the subject in a therapeutically effective amount. Therapeutically effective amount can be determined by the physician in view of the present description.
В частности, полипептид согласно изобретению вводят млекопитающему. Субъекта также можно называть «пациентом». Наиболее предпочтительно, чтобы субъектом-млекопитающим являлся человек.In particular, the polypeptide according to the invention is administered to a mammal. A subject may also be referred to as a "patient". Most preferably, the mammalian subject is a human.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего дерматологическим заболеванием, где способ включает введение пациенту эффективного количества полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4. Термины «пациент» и «субъект» используются здесь взаимозаменяемо, в частности, применительно к пациенту/субъекту, характеризующемуся дерматологическим заболеванием, как описано в данном документе.The present invention also relates to a method of treating a patient suffering from a dermatological disease, wherein the method comprises administering to the patient an effective amount of a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or a polypeptide of SEQ ID NO: 4. The terms "patient" and "subject" are used interchangeably herein, in particular in relation to to a patient/subject characterized by a dermatological disease as described herein.
Предпочтительно, дерматологическое заболевание характеризуется поврежденной поверхностью, по меньшей мере, на части тела субъекта. Предпочтительно, дерматологическое заболевание характеризуется пораженной поверхностью (пораженной поверхностью тела). Пораженные поверхности тела были описаны, например, выше, и последующее описание применимо ко всем таким пораженниям поверхности тела субъектов, если контекст не диктует иное.Preferably, the dermatological disorder is characterized by a damaged surface on at least a portion of the subject's body. Preferably, the dermatological disease is characterized by the affected surface (affected body surface). Affected body surfaces have been described, for example, above, and the following description applies to all such body surface lesions of subjects unless the context dictates otherwise.
Более предпочтительно дерматологическое заболевание представляет собой или включает поражение кожи, предпочтительно поражение кожи, характеризующееся, по меньшей мере, частичной абляцией дермы и необязательно дермы. В одном из вариантов осуществления пораженная поверхность тела представляет собой или содержит повреждение, в частности, повреждение кожи.More preferably, the dermatological disorder is or includes a skin lesion, preferably a skin lesion characterized by at least partial ablation of the dermis and optionally the dermis. In one embodiment, the affected body surface is or contains a lesion, in particular a skin lesion.
Хотя такие термины, как «дерматологическое заболевание», «рана», «поврежденная поверхность тела», «хроническое поражение», «язва» и другие термины используются здесь в единственном числе, настоящее изобретение также применимо к субъектам, страдающим множественными дерматологическими расстройствами, ранами, или имеющим пораженнные поверхности тела, хронические раны, язвы и другие подобные заболевания.Although terms such as "dermatological disease", "wound", "damaged body surface", "chronic lesion", "ulcer" and other terms are used here in the singular, the present invention is also applicable to subjects suffering from multiple dermatological disorders, wounds , or having affected body surfaces, chronic wounds, ulcers and other similar diseases.
Предпочтительно, чтобы пораженная поверхность тела содержала по меньшей мере одно хроническое поражение. Таким образом, введение агента по настоящему изобретению подходит для лечения или профилактики по меньшей мере одного хронического поражения. В контексте настоящего изобретения термин «хроническое поражение» следует понимать в широком смысле и он включает, без ограничений, язвы всех типов, независимо от того, упоминаются ли они явно в этом раскрытии или нет, пролежни, ожоги и механические абляции кожи. В частности, в этот термин входят раны, которые не заживают в течение временных периодов, типичных для заживления у здоровых субъектов соответствующего вида. В дополнение к этому, все раны на поверхности тела субъекта, которые не зажили и/или не закрылись в течение семи или более дней, например, 14 дней или более, 21 день или более, 1 месяц или более, или один год или более, классифицируются как «хроническое поражение». Агент по настоящему изобретению можно вводить для всех таких типов хронических поражений для лечения или предотвращения таких хронических поражений.Preferably, the affected body surface contains at least one chronic lesion. Thus, the administration of an agent of the present invention is suitable for the treatment or prevention of at least one chronic lesion. In the context of the present invention, the term "chronic lesion" should be understood in a broad sense and includes, without limitation, ulcers of all types, whether they are explicitly mentioned in this disclosure or not, bedsores, burns, and mechanical ablations of the skin. In particular, this term includes wounds that do not heal within the time periods typical for healing in healthy subjects of the corresponding species. In addition, all wounds on the subject's body surface that have not healed and/or closed for seven days or more, such as 14 days or more, 21 days or more, 1 month or more, or one year or more, classified as "chronic". The agent of the present invention can be administered for all such types of chronic lesions to treat or prevent such chronic lesions.
В контексте настоящего изобретения термин «предотвращать» следует понимать в широком смысле, где он включает не только предотвращение начала расстройства, но и предотвращение прогрессирования расстройства. В частности, в контексте пораженной поверхности тела, такой как хроническая рана, например, при язве, термин «предотвращать» также включает предотвращение дальнейшего увеличения площади пораженной поверхности тела, например, дальнейшее углубление раневой поверхности тела и/или увеличение диаметра пораженной поверхности тела.In the context of the present invention, the term "prevent" should be understood in a broad sense, where it includes not only preventing the onset of the disorder, but also preventing the progression of the disorder. In particular, in the context of an affected body surface, such as a chronic wound, such as an ulcer, the term "prevent" also includes preventing a further increase in the area of the affected body surface, for example, further deepening the wound surface of the body and/or increasing the diameter of the affected body surface.
В контексте настоящего изобретения термин «лечить» следует понимать широко. Термин включает, без ограничения, уменьшение симптомов расстройства. В самом деле, предпочтительно, чтобы достижение улучшения дерматологического расстройства, такого как, например, в случае (частичного) закрытия раны, что продемонстрировано экспериментальными примерами, являлось предпочтительной неотъемлемой частью заявленного здесь изобретения. Действительно, достижение заявленного терапевтического эффекта является функциональной технической особенностью настоящего изобретения. Приведенные здесь примеры свидетельствуют в пользу того, что указанная функциональная техническая характеристика достижима как прямой результат введения полипептида по настоящему изобретению. Другими словами, авторы настоящего изобретения установили, что полипептид по настоящему изобретению является причиной улучшения состояния у субъекта, страдающего дерматологическим заболеванием. Дерматологическое заболевание предпочтительно характеризуется поврежденной поверхностью тела.In the context of the present invention, the term "treat" should be understood broadly. The term includes, without limitation, reduction of the symptoms of a disorder. Indeed, it is preferable that the achievement of an improvement in a dermatological disorder, such as, for example, in the case of (partial) wound closure, as demonstrated by experimental examples, is a preferred integral part of the invention claimed here. Indeed, the achievement of the claimed therapeutic effect is a functional technical feature of the present invention. The examples given here demonstrate that the specified functional performance is achievable as a direct result of the introduction of the polypeptide of the present invention. In other words, the authors of the present invention have found that the polypeptide of the present invention is the cause of improvement in a subject suffering from a dermatological disease. The dermatological disease is preferably characterized by a damaged body surface.
Настоящее изобретение особенно подходит для подгрупп субъектов, страдающих дерматологическим заболеванием. Такие подгруппы описаны здесь. Также возможно, что конкретный субъект попадает в одну или несколько подгрупп, описанных в данном документе; и введение полипептида согласно настоящему изобретению субъектам, попадающим в одну из подгрупп, описанных в данном документе, в равной степени входит в настоящее изобретение, как «введение полипептида согласно настоящему изобретению субъектам, попадающим в более чем одну из подгрупп, описанных в данном документе».The present invention is particularly suitable for subgroups of subjects suffering from a dermatological disease. Such subgroups are described here. It is also possible that a particular subject falls into one or more of the subgroups described herein; and administering a polypeptide of the present invention to subjects falling within one of the subgroups described herein is equally within the scope of the present invention as "administering a polypeptide of the present invention to subjects falling within more than one of the subgroups described herein."
Изобретение не ограничивается конкретными причинами повреждения поверхности тела. Например, в изобретение включены диабетические причины, а также недиабетические причины.The invention is not limited to specific causes of damage to the surface of the body. For example, diabetic causes as well as non-diabetic causes are included in the invention.
Поверхность поражения может находиться на одной или нескольких частях тела. Предпочтительными являются пораженные поверхности тела на конечностях, таких как руки (включая пальцы) и ноги (включая ступни), но пораженные поверхности тела на туловище или голове или других частях тела также могут быть подвергнуты введению полипептида по изобретению. В некоторых вариантах осуществления пораженная поверхность тела находится на ноге или ступне, а более предпочтительно на ступне. В таких вариантах осуществления часто встречаются пациенты с диабетом, но введение на такую конкретную пораженную поверхность тела не ограничивается пациентами с диабетом.The surface of the lesion may be on one or more parts of the body. Affected body surfaces on extremities such as hands (including fingers) and legs (including feet) are preferred, but affected body surfaces on the trunk or head or other parts of the body may also be treated with a polypeptide of the invention. In some embodiments, the affected body surface is on the leg or foot, and more preferably on the foot. In such embodiments, diabetic patients are frequently encountered, but administration to such a particular affected body surface is not limited to diabetic patients.
В некоторых вариантах осуществления полипептид согласно настоящему изобретению предназначен для введения субъекту, перенесшему операцию. Соответственно, полипептид по настоящему изобретению подходит для лечения или предотвращения одного или нескольких послеоперационных осложнений, таких как пролежни, и/или для лечения хирургических ран.In some embodiments, the implementation of the polypeptide according to the present invention is intended for administration to a subject who has undergone surgery. Accordingly, the polypeptide of the present invention is suitable for the treatment or prevention of one or more postoperative complications such as pressure sores and/or for the treatment of surgical wounds.
Предпочтительно, чтобы пораженная поверхность тела содержала, по меньшей мере, одну язву. Согласно настоящему изобретению полипептид можно вводить (наносить), по меньшей мере, на часть пораженной поверхности тела. Термин «по меньшей мере, одна часть», как используется здесь, включает любое соотношение от 0 до 100%, например, от 10 до 90%, от 20 до 80%, от 30 до 70%, от 40 до 60% и примерно 50%; таким образом, полипептид можно вводить на всю поверхность поражения или на любую его часть. Необязательно, введение также включает участок кожи, прилегающий к пораженной поверхности тела.Preferably, the affected body surface contains at least one ulcer. According to the present invention, the polypeptide can be administered (applied) to at least a portion of the affected body surface. The term "at least one part" as used herein includes any ratio from 0 to 100%, such as 10 to 90%, 20 to 80%, 30 to 70%, 40 to 60%, and about 50%; thus, the polypeptide can be administered to the entire surface of the lesion or to any part of it. Optionally, the administration also includes an area of skin adjacent to the affected body surface.
Предпочтительно дерматологическое заболевание включает по меньшей мере одну язву. Согласно настоящему изобретению полипептид можно вводить по меньшей мере в часть одной язвы. «По меньшей мере, одна часть», как используется здесь, включает любое соотношение от 0 до 100%, например, от 10 до 90%, от 20 до 80%, от 30 до 70%, от 40 до 60% и примерно 50%; таким образом, полипептид можно вводить на всю поверхность язвы или в любую ее часть. Необязательно, введение также включает участок кожи, прилегающий к язве.Preferably, the dermatological disease includes at least one ulcer. According to the present invention, the polypeptide can be administered to at least a portion of one ulcer. "At least one part" as used herein includes any ratio from 0 to 100%, such as 10 to 90%, 20 to 80%, 30 to 70%, 40 to 60%, and about 50 %; thus, the polypeptide can be administered to the entire surface of the ulcer or to any part of it. Optionally, the administration also includes an area of skin adjacent to the ulcer.
Сахарный диабет - распространенное и изнурительное заболевание, поражающее множество органов, включая кожу. В настоящее время подсчитано, что от тридцати до семидесяти процентов пациентов с сахарным диабетом, как типа 1, так и типа 2, в какой-то момент в течение жизни будут иметь кожные осложнения сахарного диабета. Независимо от таких теоретических соображений, которые никоим образом не ограничивают настоящее изобретение, способы обнаружения диабета хорошо известны в данной области. Способы выявления диабета, в одном варианте осуществления, не являются частью настоящего изобретения, но они помогают в определении подгруппы субъектов, подверженых риску дерматологических заболеванией, таким как описанные в данном документе, и может это помочь в лечении или профилактике такого дерматологического расстройства в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления средство согласно настоящему изобретению предназначено для введения пациентам с диабетом, страдающим нейропатией, такой как, в частности, периферическая нейропатия. Способы выявления нейропатии и прогнозирования развития язвы стопы у людей с такими заболеваниями, как сахарный диабет, известны (например, описаны в WO/2010/128519 A1 без ограничения таковыми).Diabetes mellitus is a common and debilitating disease that affects many organs, including the skin. It is currently estimated that thirty to seventy percent of patients with both
Полипептид по изобретению можно вводить на пораженную кожу диабетического субъекта, предпочтительно на кожные поражения, характеризующиеся, по меньшей мере, частичным абляцией дермы и, необязательно (только) дермы у такого субъекта. В одном из вариантов осуществления пораженная поверхность тела представляет собой или включает поражение, в частности поражение кожи такого субъекта. Предпочтительно введение включает введение в/на язву, в частности язву стопы, у пациента с диабетом.The polypeptide of the invention can be administered to the affected skin of a diabetic subject, preferably to skin lesions characterized by at least partial ablation of the dermis and optionally (only) the dermis of such a subject. In one embodiment, the affected body surface is or includes a lesion, in particular a skin lesion, of such a subject. Preferably, administration comprises administering intravenously to an ulcer, in particular a foot ulcer, in a diabetic patient.
Диабетические язвы, в частности язвы диабетической стопы, являются серьезным осложнением сахарного диабета. В контексте настоящего изобретения термин «диабетическая язва» конкретно не ограничивается, за исключением того, что язва является язвой у диабетического субъекта. По некоторым оценкам, пациенты с диабетом могут иметь высокий риск нетравматической ампутации по сравнению с лицами, не страдающими диабетом, в пять-пятнадцать раз больше (например, WO/2003/075949 A1). При отсутствии лечения или без успешного лечения, язвы диабетической стопы могут быть трудно излечимыми у некоторых субъектов и даже могут потребовать ампутации, особенно если они сопровождаются другими осложнениями или нарушениями, такими как инфекция. Действительно, сахарный диабет может поражать несколько систем органов. Дерматологические проявления сахарного диабета имеют различные последствия для здоровья, начиная от тех, которые касаются эстетики, до тех, которые при отсутствии лечения могут стать опасными для жизни. Дерматологические последствия сахарного диабета описаны, например, в Rosen et al., 2000, Endotext, De Groot et al., Eds, South Dartmouth (MA, USA), MDText.com, Inc. Настоящее изобретение предоставляет лечение и/или профилактику таких дерматологических последствий диабета.Diabetic ulcers, in particular diabetic foot ulcers, are a serious complication of diabetes mellitus. In the context of the present invention, the term "diabetic ulcer" is not specifically limited, except that an ulcer is an ulcer in a diabetic subject. According to some estimates, diabetic patients may have a high risk of non-traumatic amputation compared to non-diabetics, five to fifteen times higher (eg, WO/2003/075949 A1). Left untreated or without successful treatment, diabetic foot ulcers can be difficult to treat in some subjects and may even require amputation, especially if they are accompanied by other complications or disorders such as infection. Indeed, diabetes can affect several organ systems. The dermatological manifestations of diabetes mellitus have a variety of health consequences, ranging from those related to aesthetics to those that, if left untreated, can become life-threatening. The dermatological consequences of diabetes mellitus are described, for example, in Rosen et al., 2000, Endotext, De Groot et al., Eds, South Dartmouth (MA, USA), MDText.com, Inc. The present invention provides treatment and/or prevention of such dermatological consequences of diabetes.
В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению предназначен для введения пациенту с диабетом, перенесшему операцию. Соответственно, полипептид по настоящему изобретению подходит для лечения или предотвращения одного или нескольких послеоперационных осложнений, таких как пролежни, у пациента с диабетом и/или для лечения хирургических ран.In some embodiments, the polypeptide of the present invention is for administration to a diabetic patient undergoing surgery. Accordingly, the polypeptide of the present invention is suitable for the treatment or prevention of one or more postoperative complications such as pressure sores in a diabetic patient and/or for the treatment of surgical wounds.
В целом, раны, помимо диабетической язвы, особенно диабетической язвы стопы, а также пролежней и обширных/глубоких хирургических ран, могут быть трудно заживаемыми даже при приеме лекарств, вероятно, из-за большого размера пораженных участков. Если вовремя не лечить такие раны, они ухудшатся и впоследствии могут стать неизлечимыми и опасными для жизни. Настоящее изобретение предоставляет лечение и/или профилактику таких дерматологических проявлений диабета. Действительно, согласно настоящему изобретению эффективное медицинское лечение может не только помочь пациентам избавиться от этих кожных осложнений, но также может обеспечить им лучшее качество жизни, сокращение расходов на медицинское обслуживание или даже увеличение продолжительности жизни.In general, wounds other than diabetic ulcers, especially diabetic foot ulcers, as well as decubitus ulcers and extensive/deep surgical wounds, can be difficult to heal even with medication, probably due to the large size of the lesions. If such wounds are not treated in time, they will worsen and subsequently become incurable and life-threatening. The present invention provides treatment and/or prevention of such dermatological manifestations of diabetes. Indeed, according to the present invention, effective medical treatment can not only help patients get rid of these skin complications, but can also provide them with a better quality of life, reduced medical costs, or even increased life expectancy.
Настоящее изобретение также подходит для лечения пораженных поверхностей тела, в частности язв большого размера, у диабетиков и недиабетиков. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение подходит для лечения больших пораженных поверхностей тела диаметром 5 мм или более, например 1 см или более. Дополнительные детали пораженной поверхности тела, включая определенные варианты диаметра пораженной поверхности тела, описаны выше.The present invention is also suitable for the treatment of affected body surfaces, in particular large ulcers, in diabetics and non-diabetics. In some embodiments, the implementation of the present invention is suitable for the treatment of large lesions of the body with a diameter of 5 mm or more, such as 1 cm or more. Additional details of the affected body surface, including certain variants of the diameter of the affected body surface, are described above.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает преимущество перед современными методами лечения, которые часто не могут обеспечить эффективный способ лечения ран большой площади. Настоящее изобретение обеспечивает лечение и/или профилактику таких дерматологических проявлений, включая раны большой площади, у субъектов с диабетом и субъектов, не страдающих диабетом.Thus, the present invention provides an advantage over current treatments, which often cannot provide an effective way to treat large wounds. The present invention provides treatment and/or prevention of such dermatological manifestations, including large wounds, in diabetic and non-diabetic subjects.
Согласно настоящему изобретению полипептид подходит для лечения или профилактики пролежней, включая хронические пролежни. В частности, пролежни (травмы давлением) включают пролежни на разных стадиях и пролежни разных типов.According to the present invention, the polypeptide is suitable for the treatment or prevention of pressure ulcers, including chronic pressure ulcers. Specifically, pressure sores (pressure injuries) include pressure sores in various stages and pressure sores of various types.
В предпочтительных вариантах осуществления средство согласно настоящему изобретению предназначено для лечения или профилактики язвы и с этой целью вводится в(на) язву. Согласно настоящему изобретению язва, в которую вводят полипептид, предпочтительно выбирается из группы, состоящей из диабетических язв, травматических язв, хирургических язв, пролежней, хронических язв и комбинаций любых из вышеперечисленных. В конкретных вариантах осуществления изобретения язвы выбраны из язв диабетической травмы, диабетических хирургических язв, диабетических пролежней, диабетических хронических язв, травматических диабетических язв, травматических хирургических язв, травматических пролежней, травматических хронических язв, хронических хирургических язв, хронических пролежней и других язв. В некоторых вариантах осуществления изобретения язвы выбраны из травматических язв, хирургических язв, пролежней и хронических язв субъектов с диабетом. В некоторых вариантах осуществления изобретения язвы выбраны из травматических язв, хирургических язв, пролежней и хронических язв субъектов, не страдающих диабетом.In preferred embodiments, the agent of the present invention is for the treatment or prevention of an ulcer and is administered to an ulcer for this purpose. According to the present invention, the ulcer into which the polypeptide is administered is preferably selected from the group consisting of diabetic ulcers, traumatic ulcers, surgical ulcers, decubitus ulcers, chronic ulcers, and combinations of any of the above. In particular embodiments, the ulcers are selected from diabetic trauma ulcers, diabetic surgical ulcers, diabetic decubitus ulcers, diabetic chronic ulcers, traumatic diabetic ulcers, traumatic surgical ulcers, traumatic decubitus ulcers, traumatic chronic ulcers, chronic surgical ulcers, chronic decubitus ulcers, and other ulcers. In some embodiments, the ulcers are selected from traumatic ulcers, surgical ulcers, decubitus ulcers, and chronic ulcers of subjects with diabetes. In some embodiments, ulcers are selected from traumatic ulcers, surgical ulcers, decubitus ulcers, and chronic ulcers in non-diabetic subjects.
Настоящее изобретение не ограничено лечением субъектов с одной язвой или субъектов с множественными язвами. Среди субъектов, страдающих множественными язвами, настоящее изобретение не ограничено ни лечением только одной из этих язв, ни лечением определенного количества этих язв, ни лечением всех этих язв. Таким образом, термины «язва» и «язвы», независимо от их использования в единственном или множественном числе в настоящем раскрытии, явно включают все эти варианты осуществления и не ограничиваются каким-либо конкретным количеством язв у субъекта или каким-либо конкретным количеством язв, подлежащих лечению.The present invention is not limited to the treatment of subjects with a single ulcer or subjects with multiple ulcers. Among subjects suffering from multiple ulcers, the present invention is not limited to treating only one of these ulcers, nor to treating a certain number of these ulcers, nor to treating all of these ulcers. Thus, the terms "ulcer" and "ulcers", whether used in the singular or plural in this disclosure, are expressly inclusive of all of these embodiments and are not limited to any particular number of ulcers in a subject, or any particular number of ulcers, to be treated.
Было установлено, что язва стопы при диабете может быть связана либо с нейропатией (нейропатическая язва), либо с заболеванием периферических сосудов (ишемическая язва), либо с обоими (нейроишемическая язва), хотя окончательный этиопатогенетический путь может включать сочетание этих основных факторов риска и других причинных факторов, таких как травма. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид по изобретению предназначен для профилактики и/или лечения ишемических язв, включая ишемические язвы стопы. В альтернативном варианте осуществления полипептид по изобретению предназначен для профилактики и/или лечения нейропатических язв, включая нейропатические язвы стопы. Наконец, полипептид по изобретению может использоваться для профилактики и/или лечения нейроишемических язв, включая нейроишемические язвы стопы. Все вышеупомянутые язвы необязательно являются диабетическими язвами, хотя это не является обязательным требованием.It has been found that diabetic foot ulcer may be associated with either neuropathy (neuropathic ulcer) or peripheral vascular disease (ischemic ulcer) or both (neuroischemic ulcer), although the ultimate etiopathogenetic pathway may involve a combination of these underlying risk factors and others. causative factors such as trauma. Thus, in one embodiment, the polypeptide of the invention is for the prevention and/or treatment of ischemic ulcers, including ischemic foot ulcers. In an alternative embodiment, the polypeptide of the invention is for the prevention and/or treatment of neuropathic ulcers, including neuropathic foot ulcers. Finally, the polypeptide of the invention can be used for the prevention and/or treatment of neuroischemic ulcers, including neuroischemic foot ulcers. All of the above ulcers are not necessarily diabetic ulcers, although this is not a requirement.
В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению вводят субъекту, страдающему ишемией. Ишемия может быть локальной или системной. В некоторых вариантах осуществления введение согласно настоящему изобретению может уменьшить ишемию у субъекта. Уменьшение ишемии может быть местным или системным.In some embodiments, a polypeptide of the present invention is administered to a subject suffering from ischemia. Ischemia can be local or systemic. In some embodiments, administration according to the present invention may reduce ischemia in a subject. Reduction of ischemia may be local or systemic.
В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению вводят субъекту, страдающему нейропатией. В предпочтительных вариантах осуществления средство согласно настоящему изобретению предназначено для введения субъекту, страдающему нейропатией, такой как, в частности, периферическая нейропатия. Такие субъекты могут быть диабетиками или недиабетиками. Действительно, сообщалось, что у большинства пациентов с диабетической язвой имеется основная нейропатия (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления полипептид согласно настоящему изобретению вводят субъекту с диабетом, страдающему нейропатией. Нейропатия может быть местной или системной. В некоторых вариантах осуществления введение согласно настоящему изобретению может уменьшить нейропатию у субъекта. Уменьшение нейропатии может быть местным и/или системным. В одном варианте осуществления уменьшение нейропатии включает уменьшение нейропатии в области, в которую введен полипептид по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления уменьшение нейропатии включает уменьшение нейропатии в органе, в который вводят полипептид по изобретению.In some embodiments, a polypeptide of the present invention is administered to a subject suffering from neuropathy. In preferred embodiments, the agent of the present invention is for administration to a subject suffering from neuropathy, such as, in particular, peripheral neuropathy. Such subjects may be diabetic or non-diabetic. Indeed, the majority of diabetic ulcer patients have been reported to have underlying neuropathy (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134). Thus, in a preferred embodiment, the polypeptide of the present invention is administered to a diabetic subject suffering from neuropathy. Neuropathy can be local or systemic. In some embodiments, the implementation of the introduction according to the present invention can reduce neuropathy in the subject. The reduction in neuropathy may be local and/or systemic. In one embodiment, the reduction of neuropathy includes the reduction of neuropathy in the area in which the polypeptide of the present invention is introduced. In one embodiment, the reduction of neuropathy includes the reduction of neuropathy in the organ into which the polypeptide of the invention is administered.
Лечение или профилактика в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться путем введения, предпочтительно местного введения, полипептида по изобретению. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляется в стационаре (лечебном учереждении). В некоторых вариантах лечение не осуществляется в стационаре.Treatment or prophylaxis in accordance with the present invention may be carried out by administration, preferably topical administration, of the polypeptide of the invention. In some embodiments, the implementation of the introduction is carried out in a hospital (hospital). In some embodiments, treatment is not carried out in a hospital.
Необязательно, но без взаимоисключения, дерматологическое заболевание включает по меньшей мере ожог или механическое повреждение. Таким образом, настоящее изобретение также включает лечение или профилактику ожогов и механических повреждений, при этом лечение таких повреждений практически более значимо, чем профилактика.Optionally, but without mutual exclusion, a dermatological disease includes at least a burn or mechanical injury. Thus, the present invention also includes the treatment or prevention of burns and mechanical injuries, and the treatment of such injuries is practically more important than prevention.
Предпочтительно млекопитающее, которому вводят полипептид по изобретению, предпочтительно человек, страдает сахарным диабетом или имеет предрасположенность к сахарному диабету; соответствующий субъект упоминается здесь как «субъект-диабетик». В типичных вариантах осуществления сахарный диабет выбирается из сахарного диабета 1 типа и сахарного диабета 2 типа.Preferably, the mammal to which the polypeptide of the invention is administered, preferably a human, is diabetic or predisposed to diabetes mellitus; the corresponding subject is referred to here as a "diabetic subject". In exemplary embodiments, diabetes mellitus is selected from
Язвы стопы и другие дерматологические заболевания часто встречаются у пациентов с диабетом. Другие дерматологические нарушения также можно лечить и/или предотвращать на основании настоящего изобретения. Одной из основных причин язв стопы у пациентов с диабетом является нейропатия (повреждение нервов), из-за которой человеку сложно идентифицировать такие повреждения стопы, как порезы, синяки и сдавливание.Foot ulcers and other dermatological conditions are common in diabetic patients. Other dermatological disorders can also be treated and/or prevented based on the present invention. One of the main causes of foot ulcers in patients with diabetes is neuropathy (nerve damage), which makes it difficult for a person to identify foot injuries such as cuts, bruises, and pressure.
Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид вводят субъекту с язвой стопы. В одном варианте осуществления полипептид вводят субъекту с диабетической язвой стопы (DFU). Действительно, язвы стопы и сопутствующие им осложнения часто встречаются у пациентов с диабетом, у большинства из которых имеется основная нейропатия (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134). Такие язвы также называются диабетической нейропатической язвой стопы. Таким образом, предпочтительно, полипептид вводят субъекту с диабетической нейропатической язвой стопы.Thus, in one embodiment, the polypeptide is administered to a subject with a foot ulcer. In one embodiment, the polypeptide is administered to a subject with a diabetic foot ulcer (DFU). Indeed, foot ulcers and their associated complications are common in diabetic patients, most of whom have underlying neuropathy (Ndip et al., 2012, Int. J. Gen. Med., Vol. 5, p. 129-134). These ulcers are also called diabetic neuropathic foot ulcers. Thus, preferably, the polypeptide is administered to a subject with a diabetic neuropathic foot ulcer.
Необязательно, введение полипептида согласно настоящему изобретению также включает аспект улучшения эстетического внешнего вида субъекта, в частности поверхности тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления закрытие раны достигается в результате введения в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления образование рубцов минимально. Таким образом, введение в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает также косметическое преимущество субъекту на излечении по сравнению с необработанными субъектами. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу косметического лечения субъекта, где способ включает введение полипептида с SEQ ID NO: 3 или 4.Optionally, the administration of the polypeptide of the present invention also includes the aspect of improving the aesthetic appearance of the subject, in particular the surface of the subject's body. In some embodiments, wound closure is achieved by administration in accordance with the present invention. In some embodiments, scarring is minimal. Thus, administration in accordance with the present invention also provides a cosmetic benefit to a treated subject compared to untreated subjects. Therefore, the present invention also provides a method for cosmetically treating a subject, wherein the method comprises administering a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or 4.
В другом варианте осуществления средство согласно настоящему изобретению предназначено для лечения или профилактики рака кожи, например, гемангиомы, и/или кожных заболеваний, связанных с такими видами рака без ограничения таковыми.In another embodiment, the agent according to the present invention is for the treatment or prevention of skin cancer, for example, hemangioma, and/or skin diseases associated with such cancers, without limitation.
В дополнительном воплощении средство по настоящему изобретению предназначено для лечения или профилактики дерматологического нарушения, которое возникает в результате генетического нарушения у субъекта или на которое влияет генетическое нарушение у субъекта.In a further embodiment, the agent of the present invention is for the treatment or prevention of a dermatological disorder that results from or is affected by a genetic disorder in a subject.
Введение агентаAgent Introduction
Настоящее изобретение предоставляет гетерологичный полипептид для введения субъекту.The present invention provides a heterologous polypeptide for administration to a subject.
Предпочтительно, полипептид предназначен для местного применения. Таким образом, предпочтительно, полипептид по изобретению вводят в(на) кожу или, если кожа повреждена или отсутствует, на поверхность тела в том месте, где кожа могла бы присутствовать, если бы она не была пораженна или отсутствовала. В некоторых вариантах осуществления полипептид вводят в эпидермис. В некоторых вариантах осуществления полипептид вводят на дерму. В некоторых вариантах осуществления полипептид вводят в ткань, которая обычно находится под эпидермисом, например, в подкожную область, без ограничения таковой.Preferably, the polypeptide is for topical use. Thus, preferably, the polypeptide of the invention is administered to the skin or, if the skin is damaged or absent, to the surface of the body at a location where the skin would be present if it were not damaged or absent. In some embodiments, the polypeptide is administered to the epidermis. In some embodiments, the polypeptide is administered to the dermis. In some embodiments, the implementation of the polypeptide is introduced into tissue, which is usually located under the epidermis, for example, in the subcutaneous region, without limitation.
Более предпочтительно, полипептид вводят на пораженную поверхность тела. Другими словами, полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят местно, более предпочтительно вводят местно на участок кожного заболевания (например, язвы).More preferably, the polypeptide is administered to the affected body surface. In other words, the polypeptide of the present invention is preferably administered topically, more preferably administered topically at the site of a skin disease (eg, ulcer).
Введение согласно настоящему изобретению обычно не связано с хирургическим вмешательством. В одном варианте осуществления введение полипептида по изобретению не является хирургическим вмешательством и не включает инвазивный этап, представляющий собой существенное физическое вмешательство в организм, которое требует профессиональных медицинских знаний и которое влечет за собой существенный риск для здоровья, даже при проведении такового с требуемым профессионализмом и опытом. Напротив, в более типичных вариантах осуществления введение полипептида по изобретению, в частности местное введение, обычно считается безопасным для субъекта, и поэтому полипептид может вводиться самим субъектом, особенно в случае субъекта-человека.The introduction according to the present invention is usually not associated with surgery. In one embodiment, the administration of a polypeptide of the invention is not a surgical intervention and does not include an invasive step that is a significant physical intervention in the body that requires professional medical knowledge and that entails a significant risk to health, even when carried out with the required professionalism and experience. . In contrast, in more typical embodiments, administration of a polypeptide of the invention, in particular topical administration, is generally considered safe for the subject, and therefore the polypeptide can be administered by the subject himself, especially in the case of a human subject.
Необязательно, язва закрывается повязкой до и/или во время и/или после введения. Огромное разнообразие доступных типов перевязочных материалов не ограничивается настоящим изобретением. Таким образом, можно использовать любую повязку, если она явно не является технически неподходящей. В некоторых вариантах осуществления полипептид согласно изобретению вводят одновременно с наложением повязки на рану; необязательно, повязка на рану содержит полипептид по изобретению, необязательно в форме водной среды, наносимой на повязку перед введением.Optionally, the ulcer is closed with a bandage before and/or during and/or after administration. The vast variety of types of dressings available is not limited to the present invention. Thus, any dressing can be used, as long as it is not clearly technically inappropriate. In some embodiments, the implementation of the polypeptide according to the invention is administered simultaneously with the imposition of a dressing on the wound; optionally, the wound dressing contains a polypeptide of the invention, optionally in the form of an aqueous medium applied to the dressing prior to administration.
Предпочтительно полипептид вводят (наносят) субъекту с язвой стопы на ступню указанного субъекта ниже лодыжки.Preferably, the polypeptide is administered (applied) to a subject with a foot ulcer on said subject's foot below the ankle.
В одном из вариантов реализации полипептид вводят однократно.In one embodiment, the polypeptide is administered once.
В альтернативном и более предпочтительном варианте полипептид вводят повторно. В особенно предпочтительном варианте полипептид вводят повторно от одного до пяти раз в день. В одном варианте полипептид вводят один раз в день (см. также Пример 3). В одном варианте полипептид вводят два раза в день (см. также Пример 5). В одном варианте полипептид вводят три раза в день. В одном варианте полипептид вводят четыре раза в день. В одном варианте полипептид вводят пять раз в день. Особенно предпочтительно, чтобы полипептид вводился человеку два раза в день. Все вышеупомянутые введения предпочтительно повторяют в течение нескольких дней, как описано в данном документе. Например, полипептид можно вводить повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней и предпочтительно от одного до пяти раз в каждый из этих дней.In an alternative and more preferred embodiment, the polypeptide is administered repeatedly. In a particularly preferred embodiment, the polypeptide is administered repeatedly from one to five times a day. In one embodiment, the polypeptide is administered once a day (see also Example 3). In one embodiment, the polypeptide is administered twice daily (see also Example 5). In one embodiment, the polypeptide is administered three times a day. In one embodiment, the polypeptide is administered four times a day. In one embodiment, the polypeptide is administered five times a day. It is particularly preferred that the polypeptide be administered to a human twice daily. All of the above introductions are preferably repeated within a few days, as described in this document. For example, the polypeptide can be administered repeatedly over a period of three to 30 days, preferably seven to 14 days, and preferably one to five times on each of those days.
В одном варианте полипептид вводят повторно до закрытия пораженной поверхности тела. Альтернативно, полипептид вводят однократно, и введение прекращают после этого однократного введения. Альтернативно полипептид вводят повторно в течение периода от трех до 30 дней, предпочтительно от семи до 14 дней. Необязательно, введение прекращают после завершения указанного интервала.In one embodiment, the polypeptide is administered repeatedly until the affected body surface is covered. Alternatively, the polypeptide is administered once and the administration is stopped after that single administration. Alternatively, the polypeptide is administered repeatedly over a period of three to 30 days, preferably seven to 14 days. Optionally, the introduction is stopped after the specified interval.
В некоторых вариантах осуществления агент вводят таким образом, чтобы он вступал в прямой контакт с ноцицептивными волокнами (нервами). В некоторых вариантах осуществления агент вводится таким образом, что он находится в прямом контакте с полностью обнаженными ноцицептивными волокнами (нервами); ноцицептивные волокна (нервы) считаются полностью обнаженными в случае отсутствия кожи, что типично для пораженной поверхности тела. В некоторых вариантах осуществления агент вводят таким образом, чтобы он вступал в прямой контакт с гиперактивированными ноцицептивными волокнами (нервами); ноцицептивные волокна (нервы) считаются гиперактивированными в результате поражения кожи. В некоторых вариантах осуществления агент вводят таким образом, чтобы он вступал в прямой контакт с гиперактивированными ноцицептивными волокнами (нервами). Предпочтительно, в частности, в таких вариантах осуществления агент не вызывает гипералгезический синдром (боль). Ранее в распоряжение медицинского сообщества не предоставлялся агент с такими свойствами. По этой и другим причинам настоящее изобретение обладает существенным преимуществом.In some embodiments, the agent is administered such that it comes into direct contact with the nociceptive fibers (nerves). In some embodiments, the agent is administered such that it is in direct contact with fully exposed nociceptive fibers (nerves); nociceptive fibers (nerves) are considered to be completely exposed in the absence of skin, which is typical of the affected body surface. In some embodiments, the agent is administered such that it comes into direct contact with hyperactivated nociceptive fibers (nerves); nociceptive fibers (nerves) are thought to be hyperactivated as a result of the skin lesion. In some embodiments, the agent is administered such that it comes into direct contact with hyperactivated nociceptive fibers (nerves). Preferably, in particular, in such embodiments, the agent does not cause a hyperalgesic syndrome (pain). Previously, an agent with such properties has not been made available to the medical community. For this and other reasons, the present invention has a significant advantage.
ДозаDose
Описанные здесь агенты и композиции вводятся в эффективных количествах. В соответствии с настоящим изобретением «эффективное количество» представляет собой такое количество или дозу, при которых достигается желаемая реакция или желаемый эффект либо после однократной дозы, либо в сочетании с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного расстройства желаемая реакция предпочтительно связана с торможением течения заболевания. Это включает замедление развития болезни и, предпочтительно, прерывание или регрессию болезни. Желаемая реакция при лечении заболевания или состояния может также включать отсрочку начала заболевания или предотвращение указанного заболевания или указанного состояния. В некоторых вариантах осуществления желаемая реакция включает полное исцеление симптомов расстройства локально и/или системно.The agents and compositions described herein are administered in effective amounts. In accordance with the present invention, an "effective amount" is that amount or dose that achieves the desired response or desired effect, either after a single dose or in combination with additional doses. In the case of treating a particular disorder, the desired response is preferably related to the inhibition of the course of the disease. This includes slowing down the progress of the disease and preferably interrupting or regressing the disease. The desired response in the treatment of a disease or condition may also include delaying the onset of the disease or preventing said disease or said condition. In some embodiments, the desired response includes complete healing of the symptoms of the disorder locally and/or systemically.
Эффективное количество агента или композиции, описанных в данном документе, будет зависеть от состояния или расстройства, подлежащего лечению, тяжести расстройства, индивидуальных параметров субъекта, которому вводят агент, таких как возраст, физиологическое состояние, сопутствующее состояние (при наличии), рост и вес, продолжительность лечения, тип сопутствующей терапии (при наличии), конкретный способ введения и другие параметры. Соответственно, вводимые дозы агентов, описанных в данном документе, могут зависеть от различных таких параметров. В случае, если реакция пациента на начальную дозу недостаточна, можно использовать более высокие дозы (или, по сути, более высокие дозы, достигаемые при другом, более локализованном пути введения).The effective amount of an agent or composition described herein will depend on the condition or disorder being treated, the severity of the disorder, the individual parameters of the subject to whom the agent is administered, such as age, physiological state, comorbid condition (if any), height and weight, duration of treatment, type of concomitant therapy (if any), specific route of administration, and other parameters. Accordingly, the administered doses of the agents described herein may depend on various such parameters. In the event that the patient's response to the initial dose is insufficient, higher doses (or, in fact, higher doses achieved with a different, more localized route of administration) can be used.
Согласно настоящему изобретению подходящие и практически эффективные дозировки для введения терапевтического агента субъекту-человеку для лечения и/или предотвращения кожного заболевания, такого как хроническая кожная язва и ожоговые раны, могут быть определены на основании экспериментально определенных подходящих и терапевтически эффективных доз для введения терапевтического агента субъекту-грызуну, в частности, мыши, для лечения и/или предотвращения кожного заболевания, такого как хроническая кожная язва и ожоговые раны. Руководство доступно в «Руководстве для промышленных хронических кожных язв и ожоговых ран - Разработка продуктов для лечения», опубликованном Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, 2006 г. (Guidance for Industry Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds - Developing Products for Treatment”, published by U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, 2006).According to the present invention, suitable and practically effective dosages for administering a therapeutic agent to a human subject for the treatment and/or prevention of a skin disease such as chronic skin ulcers and burn wounds can be determined based on experimentally determined suitable and therapeutically effective doses for administering a therapeutic agent to a subject. in a rodent, in particular a mouse, for the treatment and/or prevention of a skin disease such as chronic skin ulcers and burn wounds. Guidance is available in the "Guidance for Industry Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds - Developing Products for Treatment" published by the U.S. Food and Drug Administration, 2006 (Guidance for Industry Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds - Developing Products for Treatment”, published by U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, 2006).
Животные модели кожных поражений (ран) (Примеры 3 и 4) помогут установить фармакологические реакции, а также оценить потенциальную токсичность продуктов при обработке ран. В некоторых вариантах осуществления доза, которую следует вводить субъекту, представляет собой дозу, описанную в Примере 3, или в Примере 4, или в Примере 5.Animal models of skin lesions (wounds) (Examples 3 and 4) will help to establish pharmacological reactions, as well as to evaluate the potential toxicity of products in the treatment of wounds. In some embodiments, the dose to be administered to the subject is the dose described in Example 3, or in Example 4, or in Example 5.
Предпочтительно доза вводимого полипептида определяется на основе поверхности пораженной поверхности тела, подлежащей лечению. Предпочтительно определение проводят в начале лечения. В одном варианте осуществления дозирование корректируется для более позднего введения(й) в зависимости от размера поверхности пораженной части тела в момент времени такого более позднего введения(й). В альтернативном варианте осуществления дозирование не корректируется для более позднего введения(й), так что доза введения зависит исключительно от размера поверхности пораженной поверхности тела, подлежащей лечению в начале введения (первое дозирование), и последующие дозы соответствуют первой дозе.Preferably, the dose of the administered polypeptide is determined based on the area of the affected body surface to be treated. Preferably, the determination is carried out at the beginning of treatment. In one embodiment, the dosage is adjusted for later administration(s) depending on the surface area of the affected body part at the time of such later administration(s). In an alternative embodiment, dosing is not adjusted for later administration(s) so that the dose of administration depends solely on the size of the affected body surface area to be treated at the start of administration (first dosing) and subsequent doses correspond to the first dose.
В одном варианте осуществления доза/каждая доза составляет от 0,3 до 6 мкг полипептида на мм2 обрабатываемой поверхности пораженного тела (от 0,3 до 6 мкг/мм2).In one embodiment, the dose/each dose is from 0.3 to 6 μg of the polypeptide per mm 2 of the treated surface of the affected body (from 0.3 to 6 μg/mm 2 ).
Необязательно, во всех вариантах осуществления согласно настоящему изобретению доза рассчитывается на основе фактического размера пораженной поверхности тела (например, язвы) на момент лечения. Другими словами, доза может быть подвергнута расчету (пересчету) в каждый момент времени введения на основе фактического размера пораженной поверхности тела (например, язвы) в этот момент времени.Optionally, in all embodiments according to the present invention, the dose is calculated based on the actual size of the affected body surface (eg, ulcer) at the time of treatment. In other words, the dose can be calculated (recalculated) at each time point of administration based on the actual size of the affected body surface (eg, ulcer) at that time point.
Процесс получения полипептидаThe process of obtaining a polypeptide
В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить из биологического источника. Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить путем рекомбинантной экспрессии. Для этой цели открытую рамку считывания, кодирующую соответствующий полипептид, вводят в продуцент рекомбинантных белков, например клетку-хозяин или бесклеточную систему белковой экспрессии. Действительно, учитывая, что человеческий NGF продуцируется in vivo только в незначительных количествах, мышиный NGF обычно продуцируется как гетерогенная смесь различных белков (см. WO 2000/022119 A1), а полипептиды по настоящему изобретению являются неприродными и, следовательно, не продуцируются in vivo вообще, наиболее значимую возможность получения полипептида по настоящему изобретению предоставляет рекомбинантная экспрессия в соответствии с эквивалентными подходами для NGF дикого типа уровня техники (WO 2000/022119 A1, WO 2008/006893 A1; Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, том 268, стр. 3296-3303, US 2018/0086805 A1). Однако получение таких полипептидов со степенью чистоты, достаточной для введения млекопитающему, представляло собой постоянную проблему. Эта проблема была преодолена авторами настоящего изобретения, как подробно раскрыто в данном документе (см. также Примеры 1 и 2).In one embodiment, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 and the polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained from a biological source. Optionally, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 and the polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained by recombinant expression. For this purpose, an open reading frame encoding the corresponding polypeptide is introduced into a recombinant protein producer, such as a host cell or a cell-free protein expression system. Indeed, given that human NGF is only produced in small amounts in vivo , murine NGF is typically produced as a heterogeneous mixture of different proteins (see WO 2000/022119 A1) and the polypeptides of the present invention are non-natural and therefore not produced in vivo at all. , the most significant opportunity for obtaining the polypeptide of the present invention provides recombinant expression in accordance with equivalent approaches for wild-type NGF prior art (WO 2000/022119 A1, WO 2008/006893 A1; Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, pp. 3296-3303, US 2018/0086805 A1). However, obtaining such polypeptides of sufficient purity for administration to a mammal has been a persistent problem. This problem has been overcome by the inventors of the present invention, as detailed herein (see also Examples 1 and 2).
Предпочтительно, полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен путем рекомбинантной экспрессии в бактериях. Более предпочтительно, полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен путем цитозольной рекомбинантной экспрессии в бактериях. В целом бактериальные клетки, в частности E. coli, способны к рекомбинантной продуции значительного количества рекомбинантных белков, но, как и в случае многих других рекомбинантно экспрессируемых генов, продуцирование рекомбинантного NGF и подобных полипептидов в бактериях приводит к биологически неактивному продукту трансляции, который затем накапливается в клетке (цитозоле) в форме агрегатов (так называемых телец включения (IB)) (WO 2000/022119 A1; US2018/0086805 A1). В отличие от NGF, про-NGF известен как довольно нестабильный белок и требует значительных усилий для повторной укладки и очистки при низкой скорости восстановления, что делает процесс производства NGF через про-NGF в бактериях относительно сложным и дорогостоящим. Таким образом, основные трудности, связанные с продуцируемым бактериями NGF и сходными полипептидами, продуцируемых бактериями, через соответствующие проформы, касаются фолдинга (укладки), обработки и очистки рекомбинантного белка. Эти трудности теперь решены (см. Примеры 1 и 2). В результате полипептиды SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 становятся доступными со степенью чистоты, подходящей для введения млекопитающему, включая человека.Preferably, the polypeptide according to the present invention can be obtained by recombinant expression in bacteria. More preferably, the polypeptide according to the present invention can be obtained by cytosolic recombinant expression in bacteria. In general, bacterial cells, in particular E. coli, are capable of recombinant production of a significant amount of recombinant proteins, but, as with many other recombinantly expressed genes, the production of recombinant NGF and similar polypeptides in bacteria results in a biologically inactive translation product, which then accumulates. in the cell (cytosol) in the form of aggregates (the so-called inclusion bodies (IB)) (WO 2000/022119 A1; US2018/0086805 A1). Unlike NGF, pro-NGF is known to be a rather unstable protein and requires considerable effort to refold and purify at a low recovery rate, making the process of NGF production via pro-NGF in bacteria relatively complex and costly. Thus, the main difficulties associated with bacterially produced NGF and related bacterially produced polypeptides through the appropriate proforms relate to folding, processing and purification of the recombinant protein. These difficulties have now been resolved (see Examples 1 and 2). As a result, the polypeptides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are available in a purity suitable for administration to a mammal, including a human.
Предпочтительно, полипептид по настоящему изобретению экспрессируется вместе с пропоследовательностью. Без ограничения таковой, подходящей пропоследовательностью является пропоследовательность человеческого NGF дикого типа (позиции аминокислот с 18 по 121 SEQ ID NO: 1), обычно слитая с N-концом полипептида SEQ ID NO: 3. или 4. Для NGF дикого типа, хотя пропоследовательность не является частью зрелого NGF и, следовательно, не требуется для биологической функции NGF, присутствие ковалентно присоединенной пропоследовательности, как было показано, способствует повторному сворачиванию рекомбинантного NGF из телец включения, с сопутствующим образованием дисульфидной связи в зрелой части (бета-NGF). Таким образом, наличие ковалентно присоединенной пропоследовательности положительно влияет на выход и скорость повторного сворачивания по сравнению с повторным сворачиванием in vitro зрелого NGF из телец включения (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, т. 268, с. 3296-3303). Без связи с какой-либо конкретной теорией, то же самое является правдоподобным и постулируется здесь для полипептидов с SEQ ID NO: 3 и 4.Preferably, the polypeptide of the present invention is expressed together with the prosequence. Without limitation, a suitable prosequence is a wild-type human NGF prosequence (amino acid positions 18 to 121 of SEQ ID NO: 1), usually fused to the N-terminus of a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or 4. For wild-type NGF, although the prosequence is not is part of mature NGF and therefore not required for the biological function of NGF, the presence of a covalently attached prosequence has been shown to promote refolding of recombinant NGF from inclusion bodies, with concomitant formation of a disulfide bond in the mature portion (beta-NGF). Thus, the presence of a covalently attached prosequence has a positive effect on the yield and rate of refolding compared to the in vitro refolding of mature NGF from inclusion bodies (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, pp. 3296-3303 ). Without being bound by any particular theory, the same is plausible and is postulated here for the polypeptides of SEQ ID NOS: 3 and 4.
Таким образом, когда полипептид согласно настоящему изобретению продуцируется в тельцах включения, требуется правильная укладка, и это обычно достигается посттрансляционно, как и отщепление ковалентно присоединенной пропоследовательности; сложные методы фолдинга, расщепления и очистки были предложены в прошлом, в частности, для человеческого NGF дикого типа. Примечательно, что в большинстве опубликованных исследований NGF применяется общий режим рефолдинга, который ранее был установлен Rattenholl et al. (2001, Eur. J. Biochem, т. 268, стр. 3296-3303). В рамках этого оригинального исследования были подробно исследованы несколько параметров рефолдинга белка (например, температура, временной период рефолдинга, pH реакции рефолдинга, и концентрация белка, аргинина и глутатиона) и оценено их влияние на эффективность рефолдинга. Протокол Rattenholl et al. основан на ре-натурации проформы, которая имеет очень плохую растворимость, может быть получена из телец включения после рекомбинантного продуцирования в прокариотах, вследствии которой про-NGF солюбилизируется в растворе денатурирующего агента в денатурирующей концентрации, переносится в раствор, который не является денатурирующим в принципе или незначительно денатурирует, так что растворимость сохраняется, и таким образом растворенный денатурированный про-NGF может принимать биологически активную конформацию, включая образование дисульфидных связей, как в нативном NGF, после чего NGF очищается, а пропоследовательность удаляется протеолитически (WO 2000/022119 A1; Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, т. 268, стр. 3296-3303). Примечательно, что в рамках этого исследования было обнаружено, что низкая концентрация белка приводит к более высокому удельному выходу правильно сложенного продукта по сравнению с более высокой концентрацией белка. Примерные концентрации белка около 50 мг на литр реакции рефолдинга привели к удельному выходу примерно 25% правильно свернутого про-NGF, в то время как эта фракция снижалась до 10% при концентрациях белка 500 мг на литр. На основании этого Rattenholl et al. предполагают, что концентрация белка в растворе рефолдинга должна быть очень низкой: согласно Rattenholl et al., ожидается выход 15-20 мг правильно свернутого белка на литр реакции рефолдинга. Однако необходимо масштабирование процесса (например, за пределы лабораторных масштабов) для очистки даже нескольких сотен мг рекомбинантного белка.Thus, when a polypeptide of the present invention is produced in inclusion bodies, correct folding is required and this is usually achieved post-translationally, as is cleavage of the covalently attached prosequence; sophisticated folding, digestion and purification methods have been proposed in the past, in particular for wild-type human NGF. Notably, most of the published NGF studies use the general refolding regimen previously established by Rattenholl et al. (2001, Eur. J. Biochem, vol. 268, pp. 3296-3303). As part of this original study, several parameters of protein refolding (eg, temperature, refolding time period, pH of the refolding reaction, and concentrations of protein, arginine, and glutathione) were examined in detail and their influence on the efficiency of refolding was evaluated. The protocol of Rattenholl et al. based on re-naturation of a proform that has very poor solubility, can be obtained from inclusion bodies after recombinant production in prokaryotes, whereby pro-NGF is solubilized in a solution of a denaturing agent at a denaturing concentration, transferred to a solution that is not denaturing in principle, or slightly denatures so that solubility is maintained and thus dissolved denatured pro-NGF can assume a biologically active conformation, including disulfide bonding, as in native NGF, after which NGF is purified and the prosequence is removed proteolytically (WO 2000/022119 A1; Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, pp. 3296-3303). Notably, as part of this study, it was found that a low protein concentration resulted in a higher specific yield of properly folded product compared to a higher protein concentration. Approximate protein concentrations of about 50 mg per liter of the refolding reaction resulted in a specific yield of approximately 25% of correctly folded pro-NGF, while this fraction dropped to 10% at protein concentrations of 500 mg per liter. Based on this, Rattenholl et al. suggest that the protein concentration in the refolding solution should be very low: according to Rattenholl et al., a yield of 15-20 mg of correctly folded protein per liter of the refolding reaction is expected. However, it is necessary to scale up the process (eg, beyond laboratory scales) to purify even a few hundred mg of recombinant protein.
Хотя человеческий про-NGF содержит нативный сайт расщепления для протеазы Furin (Arg1-Ser2-Lys3-Arg4; R1S2K3R4), и фурин (Furin) расщепляет про-NGF в этом сайте in vivo, фурин недоступен коммерчески в значимой степени очистки или количестве. Согласно настоящему изобретению полипептид согласно настоящему изобретению при экспрессии вместе с пропоследовательностью, например в E. coli, предпочтительно расщепляется протеазой трипсином (EC 3.4.21.4), которая имеется в продаже. Действительно, для NGF дикого типа сообщалось, что трипсин дает удовлетворительный биологически активный зрелый NGF, который в конечном итоге может быть очищен (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, p. 3296-3303), а протеолиз рекомбинантно экспрессируемого про-NGF с помощью трипсина тем временем получил поддержку других исследователей (например, D'Onofrio et al., 2011, PLoS One, vol. 6, e20839). Однако позже было показано, что расщепление про-NGF дикого типа с помощью трипсина с образованием бета-NGF связано с несколькими недостатками, так как низкие количества трипсина могут привести к неэффективному расщеплению, тогда как высокие количества трипсина еще больше снижают селективность расщепления, поскольку трипсин способен расщеплять С-конец любого остатка по аргинину и лизину (остатки R и K), так что при расщеплении трипсином содержащего R1S2K3R4 про-NGF можно получить несколько альтернативных продуктов расщепления; таким образом, использование трипсина в качестве фермента расщепления привело бы к очень низким выходам правильно расщепленного NGF, а также к проблемам с очисткой и выходом, поскольку эти различные продукты расщепления при учете экономических затрат нерентабельно разделять в стандартных условиях. В качестве одного решения предлагалось экспрессировать вариант про-NGF, где R1S2K3R4 сайт расщепления протеазой в пропептиде содержит замены другими аминокислотами, по меньшей мере, в позициях R1 и K3, соответствующих позициям 101 и 103 последовательности про-NGF дикого типа человека (SEQ ID NO: 1) (WO 2013/092776 A1). В одном примере R1 и K3, соответственно, заменены валином (V) и аланином (A), трансформируя исходный сайт расщепления фурином R1S2K3R4 в V1S2A3R4, где трипсин способен специфически расщеплять только C-концевой R4; Опосредованное трипсином расщепление соответствующего про-NGF также может называться «методом VSAR». Хотя WO 2013/092776 A1 ничего не говорит о полипептидах SEQ ID NO: 3 или 4 согласно настоящему изобретению, метод VSAR изначально предлагался для применения к определенным вариантам про-NGF мутеинов, хотя сообщалось, что условия протеолиза необходимо балансировать с осторожностью (US 2018/0086805 A1). В ходе разработки настоящего изобретения авторы настоящего изобретения обнаружили, что технология VSAR, вопреки ранее высказанным предположениям, не решает удовлетворительным образом проблемы очистки, связанные с получением рекомбинантного полипептида по настоящему изобретению удовлетворительной степени чистоты. Действительно, очистка рекомбинантно экспрессируемого бета-NGF или мутеинов такового не только от белков клетки-хозяина (HCP), но также от трипсина (или другой протеазы, используемой для расщепления) все еще является проблемой; разумеется, требуется, чтобы протеолитический фермент (такой как трипсин) отсутствовал в конечном препарате фармацевтического белка, чтобы избежать протеолиза во время хранения полипептида, чтобы полипептид сохранялся по существу чистым и без деградации до момент введения такового субъекту согласно настоящему изобретению. Авторы настоящего изобретения решили эту задачу, как изложено в описании. Таким образом, настоящее изобретение делает полипептид согласно SEQ ID NO: 3 или 4 доступным с высокой чистотой и, таким образом, по существу свободным от трипсина и/или продуктов деградации полипептида. Хотя определенные способы получения NGF (например, WO2013092776 A1) и полипептида SEQ ID NO: 4 (например, Malerba et al., 2015, PLOS One, vol.10, e0136425) были описаны ранее, авторы настоящего изобретения, к своему удивлению, обнаружили, что ранее опубликованные способы недостаточны для получения соответствующего полипептида высокой чистоты. В качестве решения этого недостатка авторы настоящего изобретения предложили новый процесс и связанные с ним аспекты, как подробно описано в данном документе.Although human pro-NGF contains a native cleavage site for the Furin protease (Arg 1 -Ser 2 -Lys 3 -Arg 4 ; R 1 S 2 K 3 R 4 ), and Furin cleaves pro-NGF at this site in vivo , furin is not commercially available in significant purity or quantity. According to the present invention, the polypeptide of the present invention, when expressed together with a prosequence, for example in E. coli, is preferably cleaved by the protease trypsin (EC 3.4.21.4), which is commercially available. Indeed, for wild-type NGF, trypsin has been reported to produce a satisfactorily biologically active mature NGF that can eventually be purified (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem, 2001, vol. 268, p. 3296-3303) and proteolysis of recombinantly expressed pro-NGF by trypsin has meanwhile received support from other researchers (eg, D'Onofrio et al., 2011, PLoS One, vol. 6, e20839). However, it was later shown that the cleavage of wild-type pro-NGF by trypsin to form beta-NGF is associated with several disadvantages, since low amounts of trypsin can lead to inefficient cleavage, while high amounts of trypsin further reduce the selectivity of cleavage, since trypsin is able to cleave the C-terminus of any residue at arginine and lysine (R and K residues) so that pro-NGF containing R 1 S 2 K 3 R 4 can be digested with trypsin to produce several alternative cleavage products; thus, the use of trypsin as the cleavage enzyme would lead to very low yields of properly cleaved NGF, as well as purification and yield problems, since these various cleavage products are economically uneconomical to separate under standard conditions. One solution has been to express a pro-NGF variant where the R 1 S 2 K 3 R 4 protease cleavage site in the propeptide contains substitutions with other amino acids at least at positions R 1 and K 3 corresponding to
Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4 путем рекомбинантной экспрессии, например, в клетке-хозяине согласно настоящему изобретению может включать очистку. Очистка в самом широком смысле означает, что полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 должен быть отделен от других молекул, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина. Таким образом, очистка может включать отделение полипептида от одной или нескольких других молекул, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина, протеазы (например, трипсин) и/или продукты разложения полипептида согласно изобретению.The method of obtaining a polypeptide of SEQ ID NO: 3 and a polypeptide of SEQ ID NO: 4 by recombinant expression, for example, in a host cell according to the present invention may include purification. Purification in the broadest sense means that the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 must be separated from other molecules, including other proteins, such as proteins of the host cell. Thus, purification may include separating the polypeptide from one or more other molecules, including other proteins such as host cell proteins, proteases (eg, trypsin), and/or degradation products of the polypeptide of the invention.
Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 и полипептида SEQ ID NO: 4 согласно настоящему изобретению предпочтительно включает следующие стадии:The method for producing a polypeptide of SEQ ID NO: 3 and a polypeptide of SEQ ID NO: 4 according to the present invention preferably includes the following steps:
(а) получение предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или полипептида SEQ ID NO: 4,(a) obtaining a precursor of the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or the polypeptide of SEQ ID NO: 4,
(d) очистка,(d) cleaning,
где очистка на стадии (d) обычно включает очистку на стационарной фазе в смешанном режиме стационарной фазы. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 может быть получен путем рекомбинантной экспрессии и очистки, где очистка включает очистку в смешанном режиме стационарной фазы. Термин «в смешанном режиме стационарной фазы» следует понимать в широком смысле, где он означает, что смесь, содержащая полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или предшественник любого из них, вместе с другими видами молекул, подвергается воздействию в стационарной фазе в смешанном режиме, например на стадии хроматографии или другой подходящей технологической стадии. Действительно, предпочтительно смесь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или предшественник любого из них, вместе с другими видами молекулярных соединений, подвергают хроматографии, таким образом, что очистка на стадии (d) включает очистку путем смешанной хроматографии. Предпочтительно, хроматография в смешанном режиме включает использование неподвижной фазы, имеющей заряженную группу, предпочтительно отрицательно заряженную группу, ароматическую группу и/или гидрофобную группу.where cleaning in stage (d) usually includes cleaning on the stationary phase in a mixed mode of the stationary phase. Thus, in one embodiment, a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 can be obtained by recombinant expression and purification, where the purification comprises a mixed stationary phase purification. The term "in stationary phase mixed mode" should be understood in a broad sense, where it means that a mixture containing a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or a precursor of either, together with other types of molecules, is exposed to stationary phase in a mixed mode, for example at the stage of chromatography or other suitable technological stage. Indeed, preferably a mixture containing a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or a precursor of either of these, together with other kinds of molecular compounds, is subjected to chromatography, such that purification in step (d) includes purification by mixed chromatography. Preferably, mixed mode chromatography involves the use of a stationary phase having a charged group, preferably a negatively charged group, an aromatic group and/or a hydrophobic group.
Очистка в самом широком смысле в соответствии с настоящим изобретением означает, что полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 по изобретению, по меньшей мере, частично отделяется от других видов молекулярных соединений, включая другие белки, такие как белки клетки-хозяина, предшественники и/или продукты разложения. В результате можно получить полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, который по меньшей мере частично очищен. В то время как другие молекулярные частицы могут быть необязательно удалены или сохранены, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 предпочтительно извлекается и сохраняется очищенным.Purification in the broadest sense in accordance with the present invention means that the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 according to the invention is at least partially separated from other types of molecular compounds, including other proteins, such as proteins of the host cell , precursors and/or degradation products. As a result, a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 can be obtained that is at least partially purified. While other molecular entities may optionally be removed or saved, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is preferably recovered and kept purified.
Предпочтительно, хроматография в смешанном режиме включает использование стационарной (неподвижной) фазы, имеющей заряженную группу, предпочтительно отрицательно заряженную группу, ароматическую группу и/или гидрофобную группу.Preferably, mixed mode chromatography involves the use of a stationary (stationary) phase having a charged group, preferably a negatively charged group, an aromatic group and/or a hydrophobic group.
Каждый из этих этапов сам по себе может включать в себя несколько действий, которые для простоты также могут называться стадиями. Для иллюстративных целей и как подробно описано ниже, стадия (d) может включать более одной стадии очистки, например, на более чем одной стационарной фазе.Each of these stages may itself include several activities, which may also be referred to as stages for simplicity. For illustrative purposes and as detailed below, step (d) may include more than one purification step, such as on more than one stationary phase.
Любые буква или цифры, используемые здесь для обозначения одного или нескольких этапов процесса, например, (a), (b), (c), (d), (d1), (d2) не должны быть поняты как ограничение, а, скорее, как предоставленные для справки. Не следует понимать, что последовательность событий в процессе или использовании согласно настоящему изобретению может быть ограничена алфавитной последовательностью (буквами) или числовой последовательностью (числами). Несмотря на вышесказанное, настоятельно рекомендуется, чтобы последовательность событий в процессе или использовании согласно настоящему изобретению была последовательностью, описанной здесь.Any letter or number used here to refer to one or more process steps, e.g. (a), (b), (c), (d), (d1), (d2) should not be taken as a limitation, but rather as provided for your reference. It should not be understood that the sequence of events in the process or use according to the present invention may be limited to an alphabetical sequence (letters) or a numerical sequence (numbers). Notwithstanding the foregoing, it is strongly recommended that the sequence of events in the process or use of the present invention be that described herein.
Дополнительные аспекты хроматографии в смешанном режиме и наиболее подходящие стационарные фазы будут описаны более подробно ниже, но эти аспекты в целом применимы к настоящему изобретению. Таким образом, в частности, все те стационарные фазы, включая все их варианты осуществления, описаные ниже как наиболее подходящие для хроматографии в смешанном режиме на стадии (d2), обычно пригодны для очистки полипептида SEQ ID NO: 3 и/или полипептида SEQ ID NO: 4 согласно настоящему изобретению, и могут быть использованы во всех типах вариантов осуществлений, например, в сочетании со стадией (d1) улавливающей хроматографии или без нее. Действительно, в Примере 2B описывается, что некоторые преимущества могут быть достигнуты при использовании хроматографии в смешанном режиме в варианте протокола в соответствии с уровнем техники.Additional aspects of mixed mode chromatography and the most appropriate stationary phases will be described in more detail below, but these aspects are generally applicable to the present invention. Thus, in particular, all of those stationary phases, including all of their embodiments, described below as being most suitable for mixed mode chromatography in step (d2) are generally suitable for the purification of a SEQ ID NO: 3 polypeptide and/or a SEQ ID NO polypeptide : 4 according to the present invention, and can be used in all types of embodiments, for example, in combination with stage (d1) capture chromatography or without it. Indeed, Example 2B describes that some advantages can be achieved using mixed mode chromatography in a protocol variant of the prior art.
Необязательно, полипептид SEQ ID NO: 3 или полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить в процессе, который включает (ре)фолдинг и/или хроматографическую очистку и/или расщепление протеазой, и, возможно, доведение белка до конечной концентрации и/приготовление желаемого препарата.Optionally, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or the polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained in a process that includes (re)folding and/or chromatographic purification and/or cleavage with a protease, and optionally bringing the protein to the final concentration and/preparation of the desired drug.
Таким образом, введение полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 нуждающемуся в этом субъекту, как раскрыто в настоящем документе, также возможно благодаря промышленно значимой степени очистки и выходу полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID. NO: 4, осуществление которых на основании раскрытия в данном документе становится возможным для специалиста. Таким образом, настоящее раскрытие также описывает процесс получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.Thus, administration of a SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 polypeptide to a subject in need as disclosed herein is also possible due to the industrially significant degree of purification and yield of the SEQ ID NO: 3 or SEQ ID polypeptide. NO: 4, the implementation of which, based on the disclosure in this document, becomes possible for a person skilled in the art. Thus, the present disclosure also describes the process for obtaining a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
Способ получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 согласно настоящему изобретению предпочтительно включает следующие стадии:The method for producing a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 according to the present invention preferably includes the following steps:
(а) получение предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, например, путем рекомбинантной экспрессии,(a) obtaining a precursor of the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, for example, by recombinant expression,
(d) очистка, где очистка включает очистку на стационарной фазе в смешанном режиме.(d) scrubbing, where scrubbing includes scrubbing in a stationary phase in a mixed mode.
В настоящем изобретении также предпочтительно, чтобы предшественник полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 подвергался стадииIn the present invention, it is also preferred that the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is subjected to the step
(c) воздействие протеазы.(c) exposure to protease.
Указанное воздействие обычно проводят перед этапом (d).Said exposure is usually carried out before step (d).
Способ настоящего изобретения предпочтительно также отличается тем, что перед воздействием протеазы не проводят хроматографическую очистку. Действительно, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что расщепление протеазой работает хорошо и эффективно также в неочищенной фракции, полученной из клетки-хозяина, т.е. когда перед воздействием протеазы не проводится хроматографическая очистка.The method of the present invention is preferably also characterized in that no chromatographic purification is carried out prior to exposure to the protease. Indeed, the present inventors surprisingly found that protease digestion works well and efficiently also in the crude fraction derived from the host cell, ie. when chromatographic purification is not performed prior to exposure to the protease.
Предпочтительно, стадия получения (а) включает экспрессию предшественника полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, предпочтительно рекомбинантную экспрессию. Более предпочтительно рекомбинантная экспрессия осуществляется в клетке-хозяине. По завершении культивирования клеток-хозяев полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 получают во фракции клеточной культуры. Фракция может состоять из клеток-хозяев, т.е. в случае, когда белок по существу не секретируется из клеток-хозяев. Это действительно так, например, когда полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 продуцируется в тельцах включения и/или иным образом оказываются во внутриклеточном компартменте, включая цитозоль. Подходящие клетки-хозяева могут быть выбраны из прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, хотя в типичных вариантах осуществления предпочтительны прокариотические клетки-хозяева. Предпочтительные прокариотические клетки-хозяева включают Escherichia coli (E. coli), предпочтительно E. coli Rosetta (DE3). В одном варианте осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 получают в конформации, отличной от нативной конформации, и/или в агрегатах, наиболее предпочтительно в тельцах включения. Затем, предпочтительно, способ настоящего изобретения включает стадию (b) (ре)фолдинга полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Предпочтительно, чтобы стадия (c) выполнялась после стадии (b).Preferably, step (a) comprises expression of the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, preferably recombinant expression. More preferably, recombinant expression is carried out in a host cell. Upon completion of culturing the host cells, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is obtained in the cell culture fraction. The fraction may consist of host cells, i.e. in the case where the protein is essentially not secreted from the host cells. This is true, for example, when the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is produced in inclusion bodies and/or otherwise finds its way into an intracellular compartment, including the cytosol. Suitable host cells can be selected from prokaryotic and eukaryotic host cells, although prokaryotic host cells are preferred in exemplary embodiments. Preferred prokaryotic host cells include Escherichia coli (E. coli), preferably E. coli Rosetta (DE3). In one embodiment, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is produced in a conformation other than the native conformation and/or in aggregates, most preferably in inclusion bodies. Then, preferably, the method of the present invention includes step (b) of (re)folding the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. Preferably, step (c) is performed after step (b).
Предпочтительно, на стадии (c) протеаза представляет собой протеазу, способную расщеплять полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 таким образом, что освобождается (зрелый) полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. В конкретном варианте осуществления указанной протеазой является трипсин, предпочтительно трипсин свиньи, необязательно экспрессируемый рекомбинантно.Preferably, in step (c), the protease is a protease capable of cleaving the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 such that the (mature) polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is released. In a specific embodiment implementation of the specified protease is trypsin, preferably porcine trypsin, optionally expressed recombinantly.
Предпочтительно стадия очистки (d) включает следующие стадии, предпочтительно в последовательном порядке:Preferably, purification step (d) comprises the following steps, preferably in sequential order:
(d1) улавливание,(d1) capture,
(d2) полировка.(d2) polishing.
Предпочтительно, стадию улавливания (d1) проводят посредством хроматографии, предпочтительно колоночной хроматографии. Более предпочтительно, указанная стадия улавливания (d1) осуществляется с использованием стационарной фазы катионообменной хроматографии или стационарной фазы хроматографии в смешанном режиме. Наиболее предпочтительно, указанную стадию улавливания (d1) проводят с использованием стационарной фазы хроматографии в смешанном режиме, которой предпочтительно является Capto MMC.Preferably, the capture step (d1) is carried out by chromatography, preferably column chromatography. More preferably, said capture step (d1) is carried out using a cation exchange chromatography stationary phase or a mixed mode stationary phase chromatography. Most preferably, said capture step (d1) is carried out using a mixed mode chromatography stationary phase, which is preferably Capto MMC.
Предпочтительно стадию полировки (d2) проводят посредством хроматографии, предпочтительно колоночной хроматографии. Более предпочтительно, указанную стадию полировки проводят с использованием стационарной фазы катионообменной хроматографии. В еще более предпочтительном варианте, указанную стадию улавливания (d1) проводят с использованием SP-сефарозы, предпочтительно SP-сефарозы с малым размером частиц. SP является аббревиатурой названия сульфопропила.Preferably, the polishing step (d2) is carried out by chromatography, preferably column chromatography. More preferably, said polishing step is carried out using stationary phase cation exchange chromatography. In an even more preferred embodiment, said capture step (d1) is carried out using SP-Sepharose, preferably SP-Sepharose with a small particle size. SP is an abbreviation for the name sulfopropyl.
Необязательно, способ согласно настоящему изобретению включает дополнительную стадию доведения белка до конечной концентрации и приготовления желаемого препарата. В результате получается композиция согласно изобретению.Optionally, the method according to the present invention includes the additional step of bringing the protein to the final concentration and preparation of the desired drug. The result is a composition according to the invention.
Другими словами, настоящее изобретение предоставляет способ проведения хроматографии в смешанном режиме для получения полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Хроматография в смешанном режиме полезна при получении полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ. ID NO: 4. В предпочтительных вариантах осуществления предшественник полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 подвергается действию протеазы с целью расщепления, и хроматография в смешанном режиме используется на стадии, следующей за воздействием протеазы. В предпочтительных вариантах осуществления не проводят хроматографическую очистку полипептида SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 перед указанным воздействием протеазы.In other words, the present invention provides a method for performing mixed mode chromatography to obtain a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. Mixed mode chromatography is useful in obtaining a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ. ID NO: 4. In preferred embodiments, the polypeptide precursor of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is exposed to a protease to cleave, and mixed mode chromatography is used in the step following the exposure to the protease. In preferred embodiments, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is not chromatographically purified prior to said exposure to the protease.
Чистота полипептидаPolypeptide purity
Полипептид по изобретению в большей степени или по существу не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его в нативном состоянии. Полипептид по изобретению выделяют перед введением. В одном варианте осуществления «изолированный полипептид» относится к полипептиду, который был очищен от клеточной и внеклеточной среды, такой как ткань, которая окружает его в естественном состоянии, например, выделен из клетки, в которой он был экспрессирован, например, из клетки-хозяина. В другом варианте осуществления «изолированный полипептид» относится к полипептиду, выделенному и/или очищенному in vitro, соответственно, и к выделению такового из его естественного клеточного окружения, а также к очистке от ассоциации с другими компонентами окружающей среды, в которой полипептид обычно находится.The polypeptide of the invention is largely or substantially free of the components that would normally accompany it in its native state. The polypeptide of the invention is isolated prior to administration. In one embodiment, an "isolated polypeptide" refers to a polypeptide that has been purified from the cellular and extracellular environment, such as the tissue that naturally surrounds it, e.g., isolated from the cell in which it was expressed, e.g., from a host cell. . In another embodiment, "isolated polypeptide" refers to a polypeptide isolated and/or purified in vitro , respectively, and to the isolation of such from its natural cellular environment, as well as purification from association with other components of the environment in which the polypeptide is normally found.
Предпочтительно полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для использования согласно настоящему изобретению по существу не содержит примесей. Такой преимущественно чистый полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 можно получить, как описано в данном документе.Preferably, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 for use in the present invention is substantially free of impurities. Such predominantly pure polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 can be obtained as described in this document.
Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный здесь, рассматривается как фармацевтически активный пептид или белок.The polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 described herein is considered to be a pharmaceutically active peptide or protein.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид согласно настоящему изобретению получают, по существу, свободным от продуктов деградации указанного полипептида. В частности, авторы настоящего изобретения наблюдали, что, в отличие от сообщений о человеческом NGF дикого типа на данном уровне техники, воздействие трипсина на предшественник SEQ ID NO: 4 характерным образом приводит к частичному расщеплению указанного предшественника на С-конце по аргининовому (Arg, R) остатку 9 SEQ ID NO: 4 либо до, либо после очистки, в случае если очистка не приводит к полному удалению трипсина (вариант des-nona, данные не показаны). С помощью специального метода очистки, предусмотренного в настоящем изобретении, полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть получен, по существу, свободным от трипсина и/или от варианта des-nona.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the polypeptide according to the present invention is obtained essentially free from degradation products of said polypeptide. In particular, the present inventors have observed that, in contrast to prior art reports of human wild-type NGF, exposure of the precursor of SEQ ID NO: 4 to trypsin characteristically results in partial C-terminal cleavage of said precursor at the arginine (Arg, R) Residue 9 of SEQ ID NO: 4, either before or after purification, if purification does not completely remove trypsin (des-nona variant, data not shown). Using a special purification method provided in the present invention, the polypeptide in accordance with the present invention can be obtained essentially free from trypsin and/or variant des-nona.
Предпочтительно полипептид, получаемый, как описано выше, по существу не содержит продуктов деградации. В частности, настоящее описание делает полипептид по изобретению доступным с новой, улучшенной степенью очистки, и предпочтительно, чтобы полипептид вводился при той же степени чистоты. Предпочтительно полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 90%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 91%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 92%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для использования по изобретению характеризуется степенью чистоты не менее 93%. Более предпочтительно полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 94%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 95%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 96%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения по изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 97%. Более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 98%. Еще более предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью чистоты по меньшей мере 99%.Preferably, the polypeptide obtained as described above is substantially free of degradation products. In particular, the present disclosure makes the polypeptide of the invention available in a novel, improved purity, and it is preferred that the polypeptide be administered at the same purity. Preferably, the polypeptide of the invention for use according to the invention is at least 90% pure. More preferably, the polypeptide of the invention for use according to the invention is at least 91% pure. More preferably, the polypeptide of the invention for use according to the invention is at least 92% pure. More preferably, the polypeptide of the invention for use in the invention is at least 93% pure. More preferably, the polypeptide of the invention for use according to the invention is at least 94% pure. More preferably, the polypeptide of the invention for use in the invention is at least 95% pure. More preferably, the polypeptide of the invention for use in the invention is at least 96% pure. More preferably, the polypeptide of the invention for use in the invention is at least 97% pure. More preferably, the polypeptide of the invention for use according to the invention is at least 98% pure. Even more preferably, the polypeptide of the invention for use according to the invention is at least 99% pure.
Наиболее предпочтительно, полипептид по изобретению для применения согласно изобретению характеризуется степенью очистки по меньшей мере 99,0%, например степенью чистоты более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4%. %%, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8%, более 99,9%.Most preferably, the polypeptide of the invention for use according to the invention is characterized by a purity of at least 99.0%, eg a purity of greater than 99.1%, greater than 99.2%, greater than 99.3%, greater than 99.4%. %%, over 99.5%, over 99.6%, over 99.7%, over 99.8%, over 99.9%.
Здесь «степень чистоты» обычно относится к процентному содержанию (мас.) полипептида по настоящему изобретению по отношению к массе (мас.) биологического материала, отличного от полипептида согласно настоящему изобретению. Для иллюстрации, как правило, при степени чистоты 99,0% полипептид по настоящему изобретению присутствует в относительном количестве (весе) 99,0 единиц (например, 1,0 мг), а сумма весов всех биологических материалов, кроме полипептида по настоящему изобретению, составляет 1,0 единицы (например, 1,0 мг). Такой биологический материал, отличный от полипептида по настоящему изобретению, включает, без ограничения, белки клетки-хозяина, нуклеиновые кислоты, протеазы, такие как, например, трипсин, инактивированный или нет, продукты деградации полипептида по изобретению и другие макромолекулы биологического происхождения. В конкретном варианте осуществления степень «чистоты» относится к чистоте по сравнению с полипептидами, отличными от полипептидов по изобретению. Для иллюстрации, в этом варианте осуществления при степени чистоты 99,0% полипептид настоящего изобретения присутствует в относительном количестве (весе) 99,0 единиц (например, 1,0 мг), а сумма веса всех полипептидов, неидентичных полипептиду по настоящему изобретению составляет 1,0 единицы (например, 1,0 мг). Продукты деградации полипептида по настоящему изобретению, во избежание сомнений, включены в «полипептиды, неидентичные полипептиду по настоящему изобретению». Конкретным продуктом разложения является вариант des-nona (см. Примеры 1 и 2).Here, "purity" generally refers to the percentage (wt.) of the polypeptide of the present invention relative to the mass (wt.) of biological material other than the polypeptide of the present invention. To illustrate, typically at 99.0% purity, a polypeptide of the present invention is present in a relative amount (weight) of 99.0 units (e.g., 1.0 mg), and the sum of the weights of all biological materials except the polypeptide of the present invention, is 1.0 units (for example, 1.0 mg). Such biological material other than the polypeptide of the present invention includes, without limitation, host cell proteins, nucleic acids, proteases such as, for example, trypsin, inactivated or not, degradation products of the polypeptide of the invention, and other macromolecules of biological origin. In a specific embodiment, the degree of "purity" refers to purity compared to polypeptides other than the polypeptides of the invention. To illustrate, in this embodiment, at 99.0% purity, the polypeptide of the present invention is present in a relative amount (weight) of 99.0 units (e.g., 1.0 mg) and the sum of the weights of all polypeptides that are not identical to the polypeptide of the present invention is 1 .0 units (for example, 1.0 mg). Degradation products of a polypeptide of the present invention are, for the avoidance of doubt, included in "polypeptides not identical to a polypeptide of the present invention". A specific degradation product is the des-nona variant (see Examples 1 and 2).
В частности, по существу не содержат des-nona вариант полипептида. Вариант des-nona представляет собой ранее не охарактеризованный продукт деградации полипептида по настоящему изобретению, который ассоциирован с продуцированием определенных вариантов NGF, включая полипептид по настоящему изобретению, за исключением случаев, когда полипептид продуцируется новым способом, описанным в настоящем документе (см., например, Примеры 1 и 2). «Практически не содержит» в данном контексте означает, что полипептид по изобретению для использования в соответствии с изобретением характеризуется степенью очистки по сравнению с вариантом des-nona, составляющей более 99,0%, например степенью очистки более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4%, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8%, более 99,9%, по отношению к варианту des-nona. В наиболее предпочтительном варианте осуществления вариант des-nona не определяется и/или отсутствует.In particular, essentially do not contain des-nona variant of the polypeptide. The des-nona variant is a previously uncharacterized degradation product of a polypeptide of the present invention that is associated with the production of certain NGF variants, including the polypeptide of the present invention, except when the polypeptide is produced by the novel method described herein (see, for example, Examples 1 and 2). "Substantially free" in this context means that the polypeptide of the invention for use in accordance with the invention is characterized by a purity compared to the des-nona variant of more than 99.0%, for example, a purity of more than 99.1%, more than 99, 2%, more than 99.3%, more than 99.4%, more than 99.5%, more than 99.6%, more than 99.7%, more than 99.8%, more than 99.9%, in relation to option des -nona. In the most preferred embodiment, the des-nona variant is not defined and/or absent.
Также предпочтительно, чтобы полипептид понастоящему изобретению практически не содержал протеаз (например, трипсина). «Практически свободный» в данном контексте означает, что полипептид по изобретению для использования в соответствии с изобретением характеризуется степенью чистоты по отношению к сумме весов всех протеаз (включая трипсин) более 99,0%, например, степенью чистоты более 99,1%, более 99,2%, более 99,3%, более 99,4%, более 99,5%, более 99,6%, более 99,7%, более 99,8%, более 99,9% по отношению к сумме весов всех протеаз (включая трипсин). В наиболее предпочтительном варианте осуществления трипсин не определяется и/или отсутствует.It is also preferred that the polypeptide of the present invention is substantially free of proteases (eg, trypsin). "Substantially free" in this context means that the polypeptide of the invention for use in accordance with the invention is characterized by a purity relative to the sum of the weights of all proteases (including trypsin) of more than 99.0%, for example, a purity of more than 99.1%, more 99.2%, more than 99.3%, more than 99.4%, more than 99.5%, more than 99.6%, more than 99.7%, more than 99.8%, more than 99.9% in relation to the amount weights of all proteases (including trypsin). In the most preferred embodiment, trypsin is not detected and/or absent.
Такая высокая степень чистоты в описанных выше вариантах осуществления делает препарат более приемлемым для регулирующих органов и квалифицирует полипептид по настоящему изобретению как лекарственное средство для применения на млекопитающих, включая человека в частности. Таким образом, степень чистоты согласно настоящему изобретению позволяет впервые использовать этот полипептид для введения/нанесения на пораженную поверхность тела, включая пораженную поверхность тела человека и, в частности, язвы, безопасным и надежным способом. Марка высокой степени чистоты в отношении протеазы (трипсин), в частности, позволяет хранить полипептид также в незамороженной форме.Such a high degree of purity in the embodiments described above makes the formulation more acceptable to regulatory authorities and qualifies the polypeptide of the present invention as a drug for use in mammals, including humans in particular. Thus, the degree of purity according to the present invention allows for the first time to use this polypeptide for administration/application to the affected surface of the body, including the affected surface of the human body and, in particular, ulcers, in a safe and reliable way. The high purity grade for protease (trypsin) in particular allows the storage of the polypeptide also in non-frozen form.
КомпозицииCompositions
В некоторых вариантах осуществления полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в данном документе, содержится в композиции, содержащей дополнительно один или несколько носителей и/или один или несколько наполнителей. Используемый здесь термин «носитель» относится к органическому или неорганическому компоненту природного или синтетического характера, который комбинируется вместе с активным ингредиентом, чтобы сделать возможным, улучшить или облегчить применение активного ингредиента. Используемый здесь термин «наполнитель» предназначен для обозначения всех веществ, которые могут присутствовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению и которые не являются активными ингредиентами.In some embodiments, the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 described herein is contained in a composition further comprising one or more carriers and/or one or more excipients. The term "carrier" as used herein refers to an organic or inorganic component of a natural or synthetic nature that is combined with an active ingredient to enable, improve or facilitate the use of the active ingredient. As used herein, the term "filler" is intended to refer to all substances that may be present in the pharmaceutical composition of the present invention and which are not active ingredients.
Предпочтительно, композиция согласно настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, воду в качестве наполнителя. В некоторых вариантах осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит водную среду, и, более предпочтительно, композиция по настоящему изобретению находится в форме водного раствора. В одном варианте осуществления полипептид содержится в водной среде, и в водной среде вводится млекопитающему. Водная среда может быть представлена, например, водным раствором. Водные растворы ингредиентов и другие соответствующие композиции в некоторых вариантах осуществления могут быть приготовлены непосредственно после очистки NGF в водной среде. Например, когда агент по настоящему изобретению получают очисткой из биологического источника, соответствующие водные композиции могут быть получены непосредственно с последней стадии очистки, например при элюировании с последней хроматографической колонки (обычно на стадии полировки) и/или фильтрацией. Альтернативно, соответствующие композиции доступны через дополнительную стадию корректировки конечной концентрации белка и/приготовления желаемого препарата. Такая дополнительная стадия может включать, например, стадию осветления или фильтрации, как описано в данном документе, и/или добавление одного или нескольких наполнителей и/или одного или нескольких носителей. Примеры композиций, применимых в настоящем изобретении, без ограничения таковыми, описаны в настоящем документе.Preferably, the composition according to the present invention contains at least water as a filler. In some embodiments, the implementation of the composition according to the present invention contains an aqueous medium, and, more preferably, the composition of the present invention is in the form of an aqueous solution. In one embodiment, the polypeptide is contained in an aquatic environment, and the aquatic environment is administered to a mammal. The aqueous medium may be, for example, an aqueous solution. Aqueous ingredient solutions and other appropriate compositions, in some embodiments, may be prepared directly after NGF purification in an aqueous medium. For example, when the agent of the present invention is obtained by purification from a biological source, the corresponding aqueous compositions can be obtained directly from the last stage of purification, for example, by elution from the last chromatographic column (usually at the stage of polishing) and/or filtration. Alternatively, appropriate formulations are available through the additional step of adjusting the final protein concentration and/or preparing the desired formulation. Such an additional step may include, for example, a clarification or filtration step as described herein and/or the addition of one or more excipients and/or one or more carriers. Examples of compositions applicable in the present invention, without limitation, are described in this document.
Таким образом, полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в данном документе, может присутствовать в композиции, например в фармацевтическом составе. Описанные здесь композиции предпочтительно являются стерильными и предпочтительно содержат полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 в качестве фармацевтически активного пептида или белка и, возможно, другие агенты, упомянутые или не упомянутые в данном документе. Композиции могут находится в любом состоянии, например, быть жидкими, замороженными, лиофилизированными и др.Thus, a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 described herein may be present in a composition, eg in a pharmaceutical formulation. The compositions described herein are preferably sterile and preferably contain the polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 as the pharmaceutically active peptide or protein, and optionally other agents mentioned or not mentioned herein. The compositions can be in any state, for example, be liquid, frozen, lyophilized, etc.
Описанные здесь композиции могут включать соли, буферные соединения, консерванты, носители, разбавители и/или наполнители, все из которых предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми. Термин «фармацевтически приемлемый» описывает нечто нетоксичное и/или не нарушающее действие активного ингредиента фармацевтической композиции.The compositions described herein may include salts, buffer compounds, preservatives, carriers, diluents and/or excipients, all of which are preferably pharmaceutically acceptable. The term "pharmaceutically acceptable" describes something that is non-toxic and/or does not interfere with the activity of the active ingredient of a pharmaceutical composition.
Подходящие буферные соединения для использования по изобретению включают соли уксусной кислоты, соли лимонной кислоты, соли борной кислоты и соли фосфорной кислоты. Например, предпочтительно, чтобы полипептид по изобретению, в результате различных аспектов настоящего изобретения, мог быть получен в буфере, имеющем pH от 4,5 до 6,5, предпочтительно от 5,0 до 6,0. В одном марианте осуществления ацетатный буфер является подходящим буфером для таких целей и поэтому является особенно предпочтительным. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид по изобретению получают в ацетатном буфере, имеющем pH от 4,5 до 6,5, предпочтительно от 5,0 до 6,0.Suitable buffer compounds for use in the invention include acetic acid salts, citric acid salts, boric acid salts and phosphoric acid salts. For example, it is preferred that the polypeptide of the invention, as a result of the various aspects of the present invention, be prepared in a buffer having a pH of 4.5 to 6.5, preferably 5.0 to 6.0. In one embodiment, an acetate buffer is a suitable buffer for such purposes and is therefore particularly preferred. Thus, in one embodiment, the polypeptide of the invention is prepared in an acetate buffer having a pH of 4.5 to 6.5, preferably 5.0 to 6.0.
Подходящие консерванты для использования в композициях согласно настоящему изобретению включают консерванты, известные в данной области, среди которых для иллюстративных целей и без ограничения таковыми, находится бензиловый спирт, бензалконий и соли такового, М-крезол, фенол, хлорбутанол, парабен и тимеросал.Suitable preservatives for use in the compositions of the present invention include preservatives known in the art, including, for illustrative purposes and without limitation, benzyl alcohol, benzalkonium and salts thereof, M-cresol, phenol, chlorobutanol, paraben, and thimerosal.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 для терапевтического применения, то есть для применения в способе лечения организма человека или животного посредством терапии. Терапия может включать профилактику и/или лечение состояния. Принимая во внимание возможность терапевтического использования, указанный полипептид можно также называть фармацевтически активным белком или пептидом.Thus, the present invention provides a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 for therapeutic use, that is, for use in a method of treating a human or animal body through therapy. Therapy may include prevention and/or treatment of the condition. Taking into account the possibility of therapeutic use, the specified polypeptide can also be called a pharmaceutically active protein or peptide.
Необязательно, введение согласно настоящему изобретению сопровождается введением по меньшей мере одного противомикробного агента, такого как антибиотик. Противомикробный агент может быть частью композиции, содержащей полипептид согласно настоящему изобретению, или, альтернативно, может вводиться субъекту отдельно, в то же или другое место, тем же или другим путем введения.Optionally, the administration according to the present invention is accompanied by the administration of at least one antimicrobial agent, such as an antibiotic. The antimicrobial agent may be part of a composition containing a polypeptide of the present invention, or, alternatively, may be administered to the subject separately, at the same or different site, by the same or different route of administration.
Промышленная применимостьIndustrial Applicability
Полипептид SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, описанный в данном документе, подходит для различных целей, например, для применения в терапии, как описано здесь.The polypeptide of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 described herein is suitable for various purposes, for example, for use in therapy as described here.
Следующие ниже примеры и чертежи предназначены для иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления изобретение и не должны интерпретироваться как ограничивающие объем изобретения, который определяется формулой изобретения.The following examples and drawings are intended to illustrate certain preferred embodiments of the invention and should not be interpreted as limiting the scope of the invention, which is defined by the claims.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Материалы и методы, используемые для более чем одного примераMaterials and methods used for more than one example
Если не указано иное, следующие экспериментальные примеры конкретно относятся к полипептиду SEQ ID NO: 4, охарактеризованному по отношению к человеческому NGF дикого типа заменами P61S R100E (обозначаемого «NGF P61S R100E», Malerba et al. PLOS One, 2015 , vol.10, e0136425, SEQ ID NO: 4), а также проформы такового и т.д. Полипептид SEQ ID NO: 4 может также называться «мутеин NGF», но следует иметь в виду, что терапевтическая пригодность, специфичная для этого белка, в соответствии с данным изобретением и как продемонстрировано в экспериментальных примерах, особенно в Примерах 3 и 4, заметно отличается от пригодности человеческого NGF дикого типа. Аналогичным образом, как описано в Примере 2, очистка полипептида SEQ ID NO 4 отличается от опубликованных протоколов очистки для NGF дикого типа, и конкретный способ получения указанного полипептида согласно настоящему изобретению подходит для достижения высокой степени чистоты, при отсутствии варианта des-nona и трипсина, в частности.Unless otherwise noted, the following experimental examples specifically refer to a polypeptide of SEQ ID NO: 4 characterized against wild-type human NGF by substitutions P61S R100E (denoted "NGF P61S R100E", Malerba et al. PLOS One, 2015, vol. 10, e0136425, SEQ ID NO: 4), as well as pro forma thereof, etc. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 may also be referred to as "NGF mutein", but it should be understood that the therapeutic utility specific to this protein, in accordance with this invention and as demonstrated in experimental examples, especially in Examples 3 and 4, is markedly different on the suitability of wild-type human NGF. Similarly, as described in Example 2, the purification of the polypeptide of
Полипептид SEQ ID NO: 4 рекомбинантно экспрессировали в виде предшественника. С этой целью SEQ ID NO: 4 был слит с пропептидом человеческого NGF дикого типа (позиции 1-121 SEQ ID NO: 1). Другими словами, предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 состоял из предшественника человеческого NGF дикого типа (SEQ ID NO: 1), за исключением замен P61S R100E в зрелой части человеческого NGF дикого типа (кроме того, для точности, отсутствуют две самые C-концевые аминокислоты из SEQ ID NO: 1, не формирующие часть полипептидной последовательности человеческого NGF дикого типа). Экспрессию проводили в E.coli Rosetta (DE3) (штамм: E.coli Rosetta (DE3)/pET11a-hpro NGF P61S R100E) с образованием нерастворимых телец включения.The polypeptide of SEQ ID NO: 4 was recombinantly expressed as a precursor. To this end, SEQ ID NO: 4 was fused to a wild-type human NGF propeptide (positions 1-121 of SEQ ID NO: 1). In other words, the polypeptide precursor of SEQ ID NO: 4 consisted of the wild-type human NGF precursor (SEQ ID NO: 1), except for the P61S R100E substitutions in the mature portion of wild-type human NGF (in addition, for accuracy, the two most C-terminal amino acids from SEQ ID NO: 1 that do not form part of the wild-type human NGF polypeptide sequence). Expression was performed in E. coli Rosetta (DE3) (strain: E. coli Rosetta (DE3)/pET11a-hpro NGF P61S R100E) to form insoluble inclusion bodies.
ОборудованиеEquipment
Таблица 1. Список используемого оборудования Table 1. List of used equipment
Белковые параметры белков и пептидов описанных в настоящем документеProtein parameters of the proteins and peptides described herein
Теоретические значения белковых параметров соответствующих белков были рассчитаны с помощью программы ExPASy's ProtParam-Tool, доступной по адресу http://web.expasy.org/protparam. Они показаны в Таблице 2, ниже:Theoretical values of the protein parameters of the corresponding proteins were calculated using the ExPASy's ProtParam-Tool program available at http://web.expasy.org/protparam. They are shown in Table 2 below:
SEQ ID NO: 4Predecessor
SEQ ID NO: 4
мономер MW,
monomer
Таблица 2: Теоретически выведенные свойства соответствующих белков/полипептидов Table 2 : Theoretically derived properties of the respective proteins/polypeptides
Аналитические методыAnalytical Methods
SDS-PAGE и вестерн-блоттингSDS-PAGE and Western blotting
SDS-PAGE и вестерн-блоттинг проводили с использованием стандартных процедур. Для этого SDS-PAGE гели 12% Bis-TRIS NuPAGE (Article No. NP0342BOX, Thermo Fisher) помещали в восстанавливающие условия при постоянном напряжении (175 В) в рабочем буфере NuPAGE MES (Article No. NP0002, Thermo Fisher). Первичные антитела для вестерн-блоттинга были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (NGF (H-20) sc-548). Примеры результатов, показаны, например, на Фиг. 9A и Фиг. 10. SDS-PAGE and Western blot were performed using standard procedures. For this, 12% Bis-TRIS NuPAGE SDS-PAGE gels (Article No. NP0342BOX, Thermo Fisher) were placed under reducing conditions at constant voltage (175 V) in NuPAGE MES running buffer (Article No. NP0002, Thermo Fisher). Primary antibodies for Western blotting were purchased from Santa Cruz Biotechnology (NGF(H-20) sc-548). Examples of results are shown, for example, in FIG. 9A and FIG. 10.
Аналитическая хроматография CEX-HPLCAnalytical Chromatography CEX-HPLC
CEX-HPLC выполняли с использованием ProPac SCX-10 от Dionex. Колонка работала с 50 мМ цитратным буфером, pH 5,5, при 1 мл/мин. Для элюирования добавляли 1 M NaCl (B) и элюировали в линейным градиенте от 0 до 100% (B) в течение 50 минут. Пример результатов показан на Фиг. 9В.CEX-HPLC was performed using ProPac SCX-10 from Dionex. The column was run with 50 mM citrate buffer, pH 5.5, at 1 ml/min. For elution, 1 M NaCl (B) was added and eluted in a linear gradient from 0 to 100% (B) over 50 minutes. An example of the results is shown in Fig. 9B .
SE-HPLCSE-HPLC
SE-HPLC выполняли с использованием Superdex 200 Increase 10/300 GL от GE Healthcare. Колонка работала в PBS. Продукт обнаруживался при 280 нм.SE-HPLC was performed using
Эндотоксин, ДНК и HCPEndotoxin, DNA and HCP
Эндотоксин, ДНК и белки клетки-хозяина (HCP) определяли согласно стандартным протоколам.Endotoxin, DNA and host cell proteins (HCP) were determined according to standard protocols.
Пример 1: Экспрессия полипептида SEQ ID NO: 4 в форме белка-предшественникаExample 1: Expression of a polypeptide of SEQ ID NO: 4 as a precursor protein
Производственный штаммProduction Strain
Ген, кодирующий про-NGF, клонировали в экспрессионную плазмиду pET11a. Ген происходит от H. sapiens, и две точечные мутации (а именно P61S и R100E) были введены в открытую рамку считывания. Впоследствии химически индуцированные компетентные клетки Rosetta (DE3) трансформировали экспрессионной плазмидой и отбирали одну колонию (полученный штамм был назван E5901 STRAIN (= E.coli Rosetta (DE3)/pET11a-pro NGF P61S R100EThe gene encoding pro-NGF was cloned into the pET11a expression plasmid. The gene is derived from H. sapiens and two point mutations (namely P61S and R100E) have been introduced into the open reading frame. Subsequently, chemically induced Rosetta (DE3) competent cells were transformed with an expression plasmid and a single colony was selected (the resulting strain was named E5901 STRAIN (= E. coli Rosetta (DE3)/pET11a-pro NGF P61S R100E
NGF RCB C-151101)). Аликвоты хранили при температуре <-60 ° C в 1,0 мл.NGF RCB C-151101)). Aliquots were stored at <-60 °C in 1.0 ml.
В Примере 1 описано начальное развитие ферментации на основе штамма E5901 STRAIN.Example 1 describes the initial development of a fermentation based on strain E5901 STRAIN.
ОборудованиеEquipment
Культуральная средаCultural environment
Комплексная среда для броженияComplete Fermentation Environment
Сложная среда, используемая для ферментации, состояла из: 49,3 г/л дрожжевого экстракта, 0,61 г/л MgSO4*7H2O, 0.5 г/л NH4Cl, 14.2 г/л K2HPO4*3H2O и 10 г/л глюкозы. Питательное вещество, используемое для этого брожения, состояло из 263 г/л дрожжевого экстракта и 133 г/л глюкозы.The complex medium used for fermentation consisted of: 49.3 g/l yeast extract, 0.61 g/l MgSO 4 *7H 2 O, 0.5 g/l NH 4 Cl, 14.2 g/l K 2 HPO 4 *3H 2 O and 10 g/l glucose. The nutrient used for this fermentation consisted of 263 g/l yeast extract and 133 g/l glucose.
Минимальная среда (MM, Minimal Media) для ферментацииMinimal Media (MM, Minimal Media) for fermentation
На этапе культивирования клеток в обе основные среды добавляли 30 г/л глюкозы. Если не указано иное, питательное вещество имело тот же состав, что и соответствующая среда данной серии, но содержало 300 г/л соответствующего источника углерода.At the stage of cell cultivation, 30 g/l of glucose was added to both basic media. Unless otherwise noted, the nutrient had the same composition as the corresponding media in this series, but contained 300 g/l of the appropriate carbon source.
Чашки с LB-агаром с ампициллином и хлорамфениколомLB agar plates with ampicillin and chloramphenicol
Чашки были залиты свежей средой на основе LB-агара. Среда состояла из 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl и 15 г/л агара. После автоклавирования в среду добавляли 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола.The dishes were filled with fresh medium based on LB-agar. The medium consisted of 10 g/l peptone, 5 g/l yeast extract, 5 g/l NaCl and 15 g/l agar. After autoclaving, 100 μg/ml ampicillin and 30 μg/ml chloramphenicol were added to the medium.
ФерментацияFermentation
Если не указано иное, ферментацию в данном Примере 1 проводили в стеклянных биореакторах объемом 1 л с мешалкой, контролируемых устройством Biostat B от Sartorius. Обычно pO2 контролировали на уровне 30%, температуру культивирования поддерживали на 37°C, а pH доводили до 7, используя 2М фосфорную кислоту и 25% гидроксид аммония. Если не указано иное, за этапом культивирования клеток следовала экспоненциальная подача питания с F0=6 г/л/ч и μ = 0,25/ч. По практическим соображениям все экспоненциальные подачи были аппроксимированы двумя линейными подачами. Обычно индукцию экспрессии продукта проводили путем добавления 1 мМ IPTG, а после индукции применяли постоянную скорость подачи питания 10 г/л/ч. Биомассу клеток собирали центрифугированием с использованием Sorvall Evolution RC от Thermo Scientific. Центрифуга была оснащена ротором SLC-6000, и культуру центрифугировали при 8500 об/мин и 4°C в течение 30 мин.Unless otherwise indicated, the fermentation in this Example 1 was carried out in 1 liter glass bioreactors with a stirrer, controlled by the Biostat B device from Sartorius. Typically, pO 2 was controlled at 30%, the culture temperature was maintained at 37°C, and the pH was adjusted to 7 using 2M phosphoric acid and 25% ammonium hydroxide. Unless otherwise indicated, the cell culture step was followed by exponential feeding with F0=6 g/l/h and μ=0.25/h. For practical reasons, all exponential feeds were approximated by two linear feeds. Typically, product expression was induced by adding 1 mM IPTG, and after induction, a constant feed rate of 10 g/l/h was used. Cell biomass was collected by centrifugation using a Sorvall Evolution RC from Thermo Scientific. The centrifuge was equipped with an SLC-6000 rotor and the culture was centrifuged at 8500 rpm and 4° C. for 30 minutes.
Определение относительного количества продукта в образцах биомассыDetermination of the relative amount of the product in biomass samples
В заданные моменты времени образцы культур разбавляли до OD600, равного 10, и осаждали биомассу из аликвот 100 мкл этого разведения. Осадки ресуспендировали в 150 мкл (невосстанавливающего) буфера Лэммли и образцы кипятили в течение 5 мин. при 95°С. 10 мкл каждого образца анализировали на 10% геле Bis-Tris от Novex. Электрофоретическое разделение проводили в течение 90 мин при 125 В и гели окрашивали красителем Кумасси. Обесцвеченные гели сканировали, и численность полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4, количественно определяли с помощью денситометрии. Для дополнительной корректировки вариабельности используемой биомассы интенсивность полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4, была нормализована к интенсивности полосы белка домашнего хозяйства.At given time points, culture samples were diluted to an OD 600 of 10 and biomass was precipitated from 100 μl aliquots of this dilution. The pellets were resuspended in 150 µl of Laemmli's (non-reducing) buffer and the samples were boiled for 5 minutes. at 95°C. 10 μl of each sample was analyzed on a 10% Bis-Tris gel from Novex. Electrophoretic separation was carried out for 90 min at 125 V and the gels were stained with Coomassie stain. Decolorized gels were scanned and the band corresponding to the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 was quantified by densitometry. To further correct for the variability of the biomass used, the intensity of the band corresponding to the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 was normalized to the intensity of the housekeeping protein band.
Относительное накопление продукта рассчитывали по увеличению полосы, соответствующей предшественнику полипептида SEQ ID NO: 4, до и после индукции. Примечательно, что измеренное значение представляет собой конкретный выход (т.е. нормализованный до OD600=10). Для получения значения абсолютного выхода при данной ферментации необходимо учитывать фактическую плотность клеток (см. ниже).The relative accumulation of the product was calculated from the increase in the band corresponding to the precursor of the polypeptide of SEQ ID NO: 4, before and after induction. Notably, the measured value is the specific output (ie, normalized to OD 600 =10). To obtain an absolute yield value for a given fermentation, the actual cell density must be taken into account (see below).
Количественное определение абсолютного выхода продукта в образцах биомассыQuantification of absolute product yield in biomass samples
Стандарт предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 был получен из Европейского института исследований мозга (EBRI, Рим, Италия). Стандарт разбавляли до концентрации 65 мкг/мл в буфере Лэммли. Заявленная концентрация белка была определена по протоколу EBRI. Стандартная кривая была построена для 260, 520, 780, 1040 и 1300 нг стандарта для предшественника полипептида SEQ ID NO: 4. Образцы анализировали на том же геле, что и пробы для стандартной кривой, и учитывали фактор разведения образца для расчета абсолютного выхода продукта в конкретный момент времени.The polypeptide precursor standard SEQ ID NO: 4 was obtained from the European Brain Research Institute (EBRI, Rome, Italy). The standard was diluted to a concentration of 65 μg/ml in Laemmli's buffer. The declared protein concentration was determined according to the EBRI protocol. A standard curve was generated for the 260, 520, 780, 1040, and 1300 ng polypeptide precursor standard SEQ ID NO: 4. Samples were run on the same gel as the standard curve samples and the sample dilution factor was used to calculate the absolute specific point in time.
Краткое описание и выводы Примера 1Brief description and conclusions of Example 1
На основании вышеизложенного делается вывод, что штамм-продуцент (E5901 STRAIN, см. выше) был успешно использован для ферментации в масштабе 1 л. Хотя различные композиции сред были оценены на предмет их способности стимулировать рост бактерий и экспрессию продукта, минимальная среда MM I с добавлением 5 г/л дрожжевого экстракта оказалась благоприятной с точки зрения достижения экспрессии и получения желаемой плотности клеток. Что касается образования продукта, то мы не наблюдали значительных различий, когда основное культивирование проводили с антибиотиками или без таковых (ампициллин и хлорамфеникол, данные не показаны).Based on the foregoing, it is concluded that the producer strain (E5901 STRAIN, see above) was successfully used for the 1 L scale fermentation. Although various media formulations were evaluated for their ability to stimulate bacterial growth and product expression, MM I minimum medium supplemented with 5 g/L yeast extract was found to be favorable in terms of achieving expression and obtaining the desired cell density. In terms of product formation, we did not observe significant differences when the main culture was performed with or without antibiotics (ampicillin and chloramphenicol, data not shown).
Пример 1 может быть масштабирован для получения полипептида в промышленном масштабе.Example 1 can be scaled up to produce a polypeptide on an industrial scale.
Пример 2: Очистка в лабораторных условиях, создание Capto MMCExample 2: Cleaning in the laboratory, creation of Capto MMC
Предшественник SEQ ID NO: 4, использованный в этом примере, был получен в тельцах включения, как описано в Примере 1.The precursor of SEQ ID NO: 4 used in this example was prepared in inclusion bodies as described in Example 1.
Исходная точка для оптимизации с учетом уровня техникиStarting point for prior art optimization
Вначале авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что разработка процесса может, при отсутствии указаний на обратное, следовать основным концепциям очистки NGF, ранее описанным в литературе. Однако было также принято во внимание, что для эффективного производства в больших масштабах необходимо учитывать возможность адаптации, подходящей для более позднего масштабирования. Таким образом, мы пришли к выводу, основываясь на Rattenholl et al. (см. выше), WO2013092776 A1 и других публикациях, что полипептид SEQ ID NO: 4 аналогичным образом может быть получен, по меньшей мере, в лабораторных условиях, путем неспецифического расщепления его предшественника трипсином и последующей очистки. Было высказано предположение, что таким образом можно получить зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 с высокой степенью чистоты. Однако только благодаря специфическим адаптациям и модификациям, описанным в этом примере, был получен зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 с высокой степенью чистоты. Следовательно, введение полипептида SEQ ID NO: 4 нуждающемуся в этом субъекту возможно, в частности, ввиду высокой чистоты полипептида SEQ ID NO: 4, как описано в данном документе.Initially, the authors of the present invention came to the conclusion that the development of the process can, in the absence of indications to the contrary, follow the basic concepts of purification of NGF, previously described in the literature. However, it was also taken into account that for efficient production on a large scale, it is necessary to consider the possibility of adaptation suitable for later scaling. Thus, we concluded based on Rattenholl et al. (see above), WO2013092776 A1 and other publications that the polypeptide of SEQ ID NO: 4 can similarly be obtained, at least in the laboratory, by non-specific cleavage of its precursor with trypsin and subsequent purification. It has been suggested that a high purity mature polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained in this way. However, it was only through the specific adaptations and modifications described in this example that the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4 was obtained in high purity. Therefore, administration of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 to a subject in need thereof is possible, in particular, in view of the high purity of the polypeptide of SEQ ID NO: 4, as described herein.
Оборудование для производства полипептида SEQ ID NO: 4Equipment for the production of polypeptide SEQ ID NO: 4
Список оборудования, использованного в Примере 2.List of equipment used in Example 2.
Подробности производственного процесса в соответствии с этим примером, включая улучшения, описанные в примере 2B, приведены в обзоре процесса на Фиг. 1.Details of the manufacturing process according to this example, including the improvements described in example 2B, are given in the process overview of FIG. 1.
Если не указано иное, аналитические методы были такими, как описано в разделе «Аналитические методы» выше.Unless otherwise indicated, analytical methods were as described in the "Analytical Methods" section above.
Пример 2A: очистка в соответствии с ранее описанными протоколамиExample 2A: Purification According to Previously Described Protocols
Клетки E. coli, экспрессирующие предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 («биомасса»), получали, как описано в Примере 1, и лизировали добавлением лизоцима с последующей обработкой ультразвуком на ледяной бане. Тельца включения («IB») были (1) экстрагированы из клеток-хозяев и промыты раствором 6% Triton X100 (в 1,5 M NaCl, 60 мМ EDTA) и (2) солюбилизированы в 6 M гуанидиния HCl («gHCl»), 0,1 М трис-HCl pH 8,0, 1 мМ EDTA, 100 мМ (свежий) DTT. IB солюбилизировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого pH понижали до 3-4, добавляя 37% HCl. Полученный таким образом раствор, содержащий солюбилизированный предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 («солюбилизат» (solubilizate)), подвергали диализу против 6 M gHCl (pH 3-4).E. coli cells expressing the polypeptide precursor of SEQ ID NO: 4 ("biomass") were prepared as described in Example 1 and lysed by the addition of lysozyme followed by sonication in an ice bath. Inclusion bodies ("IB") were (1) extracted from host cells and washed with 6% Triton X100 solution (in 1.5 M NaCl, 60 mM EDTA) and (2) solubilized in 6 M guanidinium HCl ("gHCl") , 0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM (fresh) DTT. IB was solubilized for 2 hours at room temperature. After that, the pH was lowered to 3-4 by adding 37% HCl. The solution thus obtained, containing the solubilized precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 ("solubilizate" (solubilizate)), was subjected to dialysis against 6 M gHCl (pH 3-4).
Рефолдинг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 проводили в 0,1 М трис-HCl, 1 М L-аргинине, 5 мМ ЭДТА, 0,61 г/л окисленного глутатиона и 1,53 г/л восстановленного глутатиона, pH 9,5 при +4°С. Для этого каждый час добавляли белок в количестве 50 мкг белка на мл буфера для рефолдинга. После проведения рефолдинга реакционную смесь диализовали против 50 мМ фосфата натрия, pH 7,0. При замене буфера происходило образование значительного осадка.Refolding of the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 was performed in 0.1 M Tris-HCl, 1 M L-arginine, 5 mM EDTA, 0.61 g/l oxidized glutathione and 1.53 g/l reduced glutathione, pH 9.5 at +4°С. For this, protein was added every hour in the amount of 50 μg of protein per ml of refolding buffer. After refolding, the reaction mixture was dialyzed against 50 mM sodium phosphate, pH 7.0. When changing the buffer, a significant precipitate was formed.
Предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 очищали с использованием последовательных этапов катионообменной хроматографии (SP Sepharose HP, установлена с 50 мМ фосфатом натрия, pH 7,0 и элюирована градиентом NaCl) и последующей хроматографии гидрофобного взаимодействия (Phenyl Sepharose HP, установлена с 50 мМ фосфатом натрия, 1 M сульфатом аммония, pH 7,0). После этого использовали другой диализ для замены буфера образца на буфер 50 мМ фосфата натрия, pH 7,0 (обратите внимание, что такой второй диализ, однако, можно было не проводить в процессе, описанном в Примере 5). Снова наблюдалось преципитация значительные количества продукта в ходе снижения буферной проводимости.The polypeptide precursor of SEQ ID NO: 4 was purified using successive steps of cation exchange chromatography (SP Sepharose HP, set with 50 mM sodium phosphate, pH 7.0 and eluted with a NaCl gradient) and subsequent hydrophobic interaction chromatography (Phenyl Sepharose HP, set with 50 mM phosphate sodium, 1 M ammonium sulfate, pH 7.0). Thereafter, another dialysis was used to replace the sample buffer with 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0 (note that this second dialysis, however, could have been omitted in the process described in Example 5). Again, precipitation of significant amounts of product was observed during the decrease in buffer conductivity.
Полученный таким образом предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 подвергали ограниченному протеолизу путем добавления 1 мг трипсина на 250 мг про-NGF. Воздействие протеазы на предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 происходило в течение 14 часов при 2-8°C.The polypeptide precursor of SEQ ID NO: 4 thus obtained was subjected to limited proteolysis by the addition of 1 mg trypsin per 250 mg pro-NGF. The impact of the protease on the precursor of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 occurred within 14 hours at 2-8°C.
Зрелый NGF был окончательно очищен («отполирован») на катионообменнике (SP Sepharose XL, уравновешена 50 мМ фосфатом натрия, pH 7,0 и элюирована градиентом NaCl). Наконец, продукт концентрировали до 0,5-1 мг/мл и замораживали при температуре <65°C.Mature NGF was finally purified ("polished") on a cation exchanger (SP Sepharose XL, equilibrated with 50 mM sodium phosphate, pH 7.0 and eluted with a NaCl gradient). Finally, the product was concentrated to 0.5-1 mg/ml and frozen at <65°C.
Пример 2B: ИнновацииExample 2B: Innovation
Далее описываются несколько оптимизации по сравнению с примером 2A, которые были протестированы и реализованы авторами настоящего изобретения в ходе создания настоящего изобретения. Если контекст не диктует иное, все те детали, которые не явно указаны, были такими же, как описано выше для Примера 2A.The following describes several optimizations compared to example 2A, which were tested and implemented by the authors of the present invention during the creation of the present invention. Unless the context dictates otherwise, all those details not explicitly stated were the same as described above for Example 2A.
Оптимизация IB-солюбилизацииIB Solubilization Optimization
Хотя ранее сообщалось, что небольшие количества IB (например, полученные из культур во встряхиваемых колбах) легко растворяются в буфере для солюбилизации (6M gHCl, 0,1 M трис-HCL pH 8,0, 1 мМ EDTA, 100 мМ (свежий) DTT), оказалось, что IB, полученные в результате ферментации с высокой плотностью клеток, не могут быть полностью растворены. Авторы настоящего изобретения смогли решить эту проблему путем добавления 2М мочевины к указанному буферу для солюбилизации, что, как оказалось, значительно улучшает выход солюбилизации (данные не показаны). Во избежание сомнений: 2 M мочевина присутствовала в дополнение к 6 M gHCl и другим ингредиентам.Although it has been previously reported that small amounts of IB (e.g. obtained from shake flask cultures) readily dissolve in solubilization buffer (6M gHCl, 0.1 M Tris-HCL pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM (fresh) DTT ), it turned out that IBs obtained from high cell density fermentation could not be completely dissolved. The present inventors were able to overcome this problem by adding 2M urea to said solubilization buffer, which proved to significantly improve the solubilization yield (data not shown). For the avoidance of doubt: 2 M urea was present in addition to 6 M gHCl and other ingredients.
Оптимизация рефолдингаRefolding optimization
Было принято решение, изначально основанное на Rattenholl et al. (2001, Eur. J. Biochem, vol. 268, p. 3296-3303; Rattenholl, 2001, Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.), Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Germany)), но, при этом с учетом возможной более поздней масштабируемости, провести рефолдинг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 в количестве от 200 до 500 мг на литр реакции рефолдинга, предпочтительно в количестве от 200 до 300 мг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 на литр реакции рефолдинга. Это приводит к относительно хорошему выходу солюбилизированного предшественника полипептида SEQ ID NO: 4. В частности, важно учитывать, что вследствие увеличенного количества NGF по сравнению с объемом реакции рефолдинга и с учетом того, что реакция рефолдинга включает относительно дорогие ингредиенты как глутатион и аргинин, относительно большее количество предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 на объем реакции рефолдинга, может быть подвергнуто рефолдингу, что должно сделать рефолдинг экономически целесообразным, также в производственных масштабах.A decision was made, initially based on Rattenholl et al . (2001, Eur. J. Biochem, vol. 268, p. 3296-3303; Rattenholl, 2001, Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.), Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg ( Germany)), but taking into account possible later scalability, refold the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 in an amount of 200 to 500 mg per liter of the refolding reaction, preferably in an amount of 200 to 300 mg of the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 per liter of refolding reaction. This results in a relatively good yield of the solubilized precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4. In particular, it is important to consider that due to the increased amount of NGF compared to the volume of the refolding reaction, and given that the refolding reaction includes relatively expensive ingredients such as glutathione and arginine, relatively more of the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 per volume of refolding reaction can be refolded, which should make refolding economically viable, also on a production scale.
Очистка предшественника полипептида SEQ ID NO: 4Purification of the precursor polypeptide SEQ ID NO: 4
Очистку предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 после рефолдинга проводили с помощью подхода, в котором используется довольно высокая изоэлектрическая точка про-NGF, а для очистки используется катионообменная стационарная фаза (а именно SP-сефароза). Для проведения этого типа хроматографии по техническим причинам буфер рефолдинга надо было заменять на буфер с низкой проводимостью. При этом наблюдалась преципитация значительного количества предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 (данные не показаны). Это наблюдение можно объяснить снижением концентрации аргинина в буфере.Purification of the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 after refolding was carried out using an approach that uses a fairly high pro-NGF isoelectric point and uses a cation exchange stationary phase (namely SP-sepharose) for purification. For this type of chromatography, for technical reasons, the refolding buffer had to be replaced with a low conductivity buffer. A significant amount of the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 was observed to precipitate (data not shown). This observation can be explained by a decrease in the concentration of arginine in the buffer.
Поэтому были предприняты некоторые попытки заменить колонку улавливания колонкой другого типа (колонкой с другой селективностью), которая была бы более толерантной к присутствию аргинина в реакции рефолдинга. При первой попытке осуществления была оценена эффективность нескольких стационарных фаз, но ни один из подходов не дал удовлетворительных результатов (см. Таблицу 6). Таким образом, стационарная фаза, используемая для улавливающей колонки, была сохранена, как это было описано в предыдущем процессе. Однако из-за высокой изоэлектрической точки (pI) предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 увеличение проводимости рабочего буфера (путем добавления 250 мМ L-аргинина) без влияния на производительность стало возможным. Посредством этого подвергнутый рефолдингу предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 мог быть стабилизирован до определенной степени, и количество осаждаемого предшественника уменьшилось (данные не показаны).Therefore, some attempts have been made to replace the capture column with a different type of column (column with a different selectivity) that would be more tolerant of the presence of arginine in the refolding reaction. In the first attempt at implementation, the effectiveness of several stationary phases was evaluated, but none of the approaches gave satisfactory results (see Table 6). Thus, the stationary phase used for the capture column was retained as described in the previous process. However, due to the high isoelectric point (pI) of the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4, an increase in running buffer conductivity (by adding 250 mM L-arginine) without affecting performance was possible. Through this, the refolded precursor of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 could be stabilized to a certain extent, and the amount of precipitated precursor was reduced (data not shown).
Таблица выше: альтернативные возможности, протестированные для улавливания предшественника полипептида SEQ ID NO: 4, и их оценка. Table above : Alternative possibilities tested to capture the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 and their evaluation.
Что касается хроматографии в смешанном режиме, авторы изобретения, без привязки к конкретной теории, понимают, что при хроматографии в смешанном режиме предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 не элюируется эффективно, тогда как зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 эффективно элюируется.With regard to mixed mode chromatography, the inventors, without wishing to be bound by a particular theory, understand that in mixed mode chromatography, the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 is not efficiently eluted, while the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4 is effectively eluted.
Расщепление протеазой для получения зрелого NGFProtease Cleavage to Obtain Mature NGF
Для производства полипептида SEQ ID NO: 4 существенно важна протеаза (трипсин), и поэтому было высказано предположение, что в идеале конкретный выбранный трипсин должен соответствовать следующим критериям:For the production of the polypeptide of SEQ ID NO: 4, a protease (trypsin) is essential and therefore it has been suggested that ideally the particular trypsin selected should meet the following criteria:
1. Получен из рекомбинантного источника. Сертификация сырья, не содержащего животного материала, имеет решающее значение для обеспечения соответствия процесса требованиям GMP.1. Derived from a recombinant source. Certification of animal-free raw materials is critical to ensure that the process is GMP compliant.
2. Обладает низкой побочной активностью. Примечательно, что трипсин может подвергаться автолизу. Этот процесс может привести к так называемому псевдотрипсину, который имеет расширенный спектр субстратов и обладает химотрипсин-подобной активностью. Ca2+ (например, 1 мМ CaCl2) может быть добавлен для уменьшения автолиза. Однако в настоящее время обычно для каждого протокола применяется «модифицированный трипсин», требующий высокой специфичности последовательности (например, для пептидного фингерпринтинга). Этот модифицированный трипсин обычно получают ацилированием трипсиновых экспонированных ε-аминогрупп остатков лизина.2. Possesses low side activity. Notably, trypsin can undergo autolysis. This process can lead to the so-called pseudotrypsin, which has an extended spectrum of substrates and exhibits chymotrypsin-like activity. Ca 2+ (eg 1 mM CaCl 2 ) may be added to reduce autolysis. However, at present, a "modified trypsin" is usually used for each protocol, requiring high sequence specificity (for example, for peptide fingerprinting). This modified trypsin is usually prepared by acylation of the trypsin-exposed ε-amino groups of lysine residues.
3. Низкая вариабельность от партии к партии, что обеспечивает воспроизведение производственного процесса. С другой стороны, выбранный фермент должен обладать сертификатом, в котором указывается удельная активность соответствующей партии. Требуемое количество фермента может зависеть от активности, а не от массы.3. Low variability from batch to batch, which ensures the reproduction of the production process. On the other hand, the selected enzyme must have a certificate stating the specific activity of the respective lot. The amount of enzyme required may depend on activity rather than weight.
Несмотря на интенсивный поиск, трипсин, удовлетворяющий критериям 1 и 2, на коммерческом рынке не обнаружен. Было высказано мнение, что критерий 1 важнее всех остальных. Для уменьшения автолиза может быть достаточно добавления CaCl2. В результате в качестве сырья для процесса был выбран рекомбинантный трипсин «GMP grade» от Roche (Roche 06369880103, лот: 11534700). Последовательность этого фермента, который экспрессируется в Pichia pastoris, была получена из Sus scrofa. Согласно сертификату, партия использованного трипсина имеет удельную активность 4997 Ед/мг (определена в соответствии с USP).Despite an intensive search,
Пропуск второй стадии очистки перед трипсинизациейSkip the second purification step before trypsinization
В рамках начального скрининга для поиска оптимальных соотношений фермент/субстрат для предполагаемой трипсинизации использовали предшественник полипептида SEQ ID NO: 4, полученный на улавливающей колонке (см. выше). В отличие от ранее установленного процесса (Европейский институт исследований мозга (EBRI), подробности не опубликованы, процесс на основе Rattenholl et al., supra) авторы настоящего изобретения решили не использовать стадию дополнительной хроматографии гидрофобного взаимодействия перед трипсинизацией. Решение об исключении такой второй стадии очистки на колонке перед трипсинизацией было принято, исходя из двух соображений: с одной стороны, продукт, полученный после улавливания колонкой, уже был практически чистым согласно SDS-PAGE. С другой стороны, сама трипсинизация как таковая могла бы способствовать улучшению профиля примесей за счет переваривания оставшихся белков клетки-хозяина (HCP).As part of the initial screening to find the optimal ratios of enzyme/substrate for putative trypsinization used the precursor polypeptide SEQ ID NO: 4, obtained on the capture column (see above). In contrast to the previously established process (European Brain Research Institute (EBRI), details not published, process based on Rattenholl et al., supra ), the present inventors chose not to use an additional hydrophobic interaction chromatography step prior to trypsinization. The decision to omit this second column purification step before trypsinization was made on the basis of two considerations: on the one hand, the product obtained after column capture was already practically pure according to SDS-PAGE. On the other hand, trypsinization itself could improve the impurity profile by digesting the remaining host cell proteins (HCPs).
В Таблице 7 представлены основные условия, проверенных в первом раунде. Были исследованы результаты трипсинизации в 12% SDS-PAGE (данные не показаны). Результаты (данные не показаны) показывают, что трипсинизация воспроизводимо дает стабильный полипептид SEQ ID NO: 4 в довольно широком диапазоне соотношений фермент/субстрат (т.е. от 1 до 5 мкг трипсина на 375 мкг предшественника полипептида SEQ ID NO: 4). Сроки переваривания не имеют большого значения. Следовательно, остановка реакции и время, необходимое для загрузки объема реакции в колонну для очистки («полировки»), очевидно, не являются ограничивающими. Это открытие имеет особое значение, поскольку реакцию невозможно остановить подходящим или экономичным способом в препаративных масштабах.Table 7 presents the main conditions tested in the first round. The results of trypsinization in 12% SDS-PAGE were examined (data not shown). The results (data not shown) show that trypsinization reproducibly produces a stable polypeptide of SEQ ID NO: 4 over a fairly wide range of enzyme/substrate ratios (i.e., 1 to 5 μg trypsin per 375 μg of SEQ ID NO: 4 polypeptide precursor). Digestion time doesn't really matter. Therefore, stopping the reaction and the time required to load the reaction volume into the column for cleaning ("polishing"), obviously, are not limiting. This discovery is of particular importance because the reaction cannot be stopped in a suitable or economical manner on a preparative scale.
Некоторые дополнительные эксперименты были проведены для уточнения оптимального соотношения фермент/субстрат для предполагаемой трипсинизации, и было обнаружено, что при соотношении фермент/субстрат от 1/100 до 1/200 (вес белка/вес белка) хороший выход полипептида SEQ ID NO: 4, с одной стороны, и небольшие количества усеченных продуктов, с другой стороны, могут быть получены воспроизводимо. Следует указать, что в используемых условиях (т.е. нахождение в фосфатно-аргининовом буфере (pH 7,0) при 2-8°C и инкубации (для обработки протеазой) в течение двух-шести часов) качество переваривания не сильно зависело от соотношения фермент/субстрат. Это открытие имеет особое значение, поскольку базовое ферментативное расщепление зависимо от незначительных изменений в экспериментальной установке (например, изменение активности трипсина из-за изменчивости такового от партии к партии или хранения фермента; от времени и температуры стадии инкубации (воздействие протеазы); от ошибки в определении концентрации белка). Более того, это также является причиной, по которой расширенная точная настройка в мелком масштабе для дальнейшего уменьшения количества потенциальных усеченных продуктов кажется нецелесообразной. Если «оптимальное» условие будет идентифицировано мелкомасштабно, то еще есть хороший шанс слегка измененить схему получения продукта в следующий раз, когда фактически то же переваривание (дайджест) будет повторено в более крупном масштабе.Some additional experiments were carried out to clarify the optimal enzyme/substrate ratio for putative trypsinization, and it was found that at an enzyme/substrate ratio of 1/100 to 1/200 (protein weight/protein weight), a good yield of the polypeptide of SEQ ID NO: 4, on the one hand, and small quantities of truncated products, on the other hand, can be obtained reproducibly. It should be noted that under the conditions used (i.e. in phosphate-arginine buffer (pH 7.0) at 2-8°C and incubated (for protease treatment) for two to six hours), the quality of digestion was not strongly dependent on enzyme/substrate ratio. This finding is of particular importance because basic enzyme digestion is dependent on minor changes in the experimental setup (e.g. change in trypsin activity due to batch-to-batch variability or enzyme storage; time and temperature of the incubation step (protease exposure); error in determination of protein concentration). Moreover, this is also the reason why extended fine-scale fine-tuning to further reduce potential truncated products seems impractical. If the "optimal" condition can be identified on a small scale, then there is still a good chance of slightly changing the production scheme the next time the actual digest is repeated on a larger scale.
«Полировка» хроматографией с целью получения чистого полипептида после трипсинизации"Polishing" by chromatography to obtain a pure polypeptide after trypsinization
В отличие от ранее установленного процесса (Европейский институт исследований мозга (EBRI), подробности не опубликованы, процесс основан на Rattenholl et al., выше), в котором использовалась стационарная фаза SP-сефарозы для полировки зрелого полипептида (примечание: SP-сефароза является катионообменной стационарной фазой), авторами был проведен поиск более подходящей стационарной фазы, исходя из следующих соображений: для эффективной загрузки в колонку с SP-сефарозой снижение проводимости раствора, содержащего предшественник полипептида SEQ ID NO: 4, например, путем замены буфера, не требуется. Однако известно (например, Пример 2А), что снижение ионной силы раствора действительно приводит к осаждению целевой молекулы, и поэтому следует избегать замены буфера на буфер с низкой проводимостью. Более того, катионообменная стационарная фаза уже использовалась для улавливания (захвата) предшественника полипептида SEQ ID NO: 4, и ортогональная селективность является предпочтительной для достижения лучшего разделения оставшихся примесей. Третий и последний аргумент против использования неподвижной фазы SP для очистки реакции трипсинизации заключается в том, что потенциально оставшийся предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 будет связываться с этой колонкой и может быть отделен от зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 просто по селективности элюирования, а не по селективности связывания.In contrast to the previously established process (European Brain Research Institute (EBRI), details not published, process based on Rattenholl et al., supra), which used a stationary phase of SP-Sepharose to polish the mature polypeptide (Note: SP-Sepharose is a cation exchange stationary phase), the authors searched for a more suitable stationary phase, based on the following considerations: for efficient loading into a column with SP-Sepharose, reducing the conductivity of the solution containing the precursor of the polypeptide of SEQ ID NO: 4, for example, by changing the buffer, is not required. However, it is known (eg Example 2A) that lowering the ionic strength of the solution does lead to precipitation of the target molecule, and therefore buffer replacement with a low conductivity buffer should be avoided. Moreover, a cation exchange stationary phase has already been used to capture the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4, and orthogonal selectivity is preferred to achieve better separation of remaining impurities. The third and final argument against using the SP stationary phase to purify the trypsin reaction is that the potentially remaining precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 will bind to this column and can be separated from the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4 simply by elution selectivity, and not by selectivity of binding.
Для создания такой полировочной колонки с ортогональной селективностью для очистки зрелого полипептида SEQ ID NO: 4, в первую очередь предлагалось использовать колонку с гидрофобным взаимодействием (HIC). Эта стационарная фаза была выбрана не только потому, что она обладает ортогональной селективностью, но также потому, что замена буфера на буфер с низкой проводимостью не требуется. Несмотря на тестирование нескольких стационарных фаз и условий HIC (например, фенил- и бутил-сефарозы, работающих с 1 M (NH4) 2SO4 и 0,5 M (NH4) 2SO4, соответственно), авторы заключили, что удовлетворительная стадия полировки на основе HIC не может быть реализована (данные не показаны ).To create such a polishing column with orthogonal selectivity for purification of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4, it was first proposed to use a column with hydrophobic interaction (HIC). This stationary phase was chosen not only because it has orthogonal selectivity, but also because a buffer exchange with a low conductivity buffer is not required. Despite testing several stationary phases and HIC conditions (e.g., phenyl and butyl sepharoses operating with 1 M (NH4) 2SO4 and 0.5 M (NH4) 2SO4, respectively), the authors concluded that a satisfactory HIC-based polishing step cannot be implemented (data not shown).
Однако в следующей экспериментальной установке для этапа полировки была протестирована стационарная фаза смешанного режима Capto MMC, и она могла бы быть успешно реализована. Было обнаружено, что в оптимизированных условиях стационарная фаза обратимо связывается с полипептидом SEQ ID NO: 4, и продукт можно элюировать путем увеличения pH (данные не показаны). Напротив, предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 необратимо связывается со стационарной фазой и может быть элюирован только при использовании 1 М NaOH в качестве подвижной фазы (данные не показаны). Кроме того, можно продемонстрировать, что трипсин вообще не связывается с колонкой, работающей в таких условиях (данные не показаны). Эти результаты обеспечивают четкое доказательство того, что стационарная фаза Capto MMC способна эффективно отделять зрелый полипептид SEQ ID NO: 4 от трипсина и от оставшегося предшественника полипептида SEQ ID NO: 4.However, the Capto MMC mixed-mode stationary phase was tested in the next pilot plant for the polishing step and could be successfully implemented. It was found that under optimized conditions the stationary phase binds reversibly to the polypeptide of SEQ ID NO: 4 and the product can be eluted by increasing the pH (data not shown). In contrast, the polypeptide precursor of SEQ ID NO: 4 binds irreversibly to the stationary phase and can only be eluted using 1M NaOH as the mobile phase (data not shown). In addition, it can be demonstrated that trypsin does not bind at all to the column operating under these conditions (data not shown). These results provide clear evidence that the Capto MMC stationary phase is able to efficiently separate the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4 from trypsin and from the remaining precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4.
Установка дополнительной мембранной хроматографииInstallation of additional membrane chromatography
Для более эффективного истощения примесей эндотоксинов и ДНК, в процессе была задействована дополнительная анионообменная мембрана. Обычно, как известно, мембранная хроматография отличается тем, что раствор, содержащий компонент, подлежащий анализу или очистке (в данном случае полипептид SEQ ID NO: 4), пропускается через мембрану, в норме заряженую. Для этой цели в данном случае STIC-мембрана (Sartorius, Goettingen, Germany) была включена в систему в положениях, указанных на Фиг. 1. Было определено, что полипептид SEQ ID NO: 4 не связывается с мембраной, и, таким образом, предоставлено доказательство концепции, что мембранная хроматография подходит для очистки полипептида SEQ ID NO: 4. Для иллюстрации всего процесса, включая мембранную хроматографию, см. Фиг. 1.For more efficient depletion of endotoxin and DNA impurities, an additional anion exchange membrane was used in the process. Typically, as is known, membrane chromatography is characterized in that a solution containing the component to be analyzed or purified (in this case, the polypeptide of SEQ ID NO: 4) is passed through a normally charged membrane. For this purpose, in this case, a STIC membrane (Sartorius, Goettingen, Germany) was included in the system at the positions indicated in FIG. 1. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 was determined not to bind to the membrane, and thus provided a proof of concept that membrane chromatography is suitable for the purification of the polypeptide of SEQ ID NO: 4. For an illustration of the entire process, including membrane chromatography, see Fig. 1.
Воспроизводимость процесса, описаного в Примере 2Reproducibility of the process described in Example 2
Чтобы проверить надежность процесса, процесс был проведен пять раз, и полученные фракции были проанализированы на предмет их выхода и чистоты. На протяжении этих циклов проводилась неуклонная оптимизация деталей процесса и состава буфера, градиенты и т.д. тестировались до тех пор, пока не были установлены окончательные, оптимизированные детали осуществления процесса (см. Фиг. 1). Результаты показывают, что в лабораторном масштабе из одного последовательного производственного цикла можно получить приблизительно от 50 до 100 мг полипептида SEQ ID NO: 4. Примечательно, что с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в SDS с последующим окрашиванием Кумасси или серебром полученный продукт неизменно обнаруживался относительно чистым (присутствует менее пяти процентов загрязняющих белков клетки-хозяина и следовое количество усеченного NGF, данные не показаны).To test the reliability of the process, the process was carried out five times and the resulting fractions were analyzed for their yield and purity. Throughout these cycles, steady optimization of process details and buffer composition, gradients, etc. was carried out. were tested until the final, optimized details of the process were established (see Fig. 1). The results show that approximately 50 to 100 mg of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained from a single successive production run on a laboratory scale. (Less than five percent of host cell contaminating proteins and a trace amount of truncated NGF are present, data not shown).
Для предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 не удалось установить удовлетворительный метод SE-HPLC. Напротив, анализ SE-HPLC для зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 был простым и привел к пику гомогенного продукта приблизительно в области 16 кДа, что соответствует мономерной форме полипептида SEQ ID NO: 4 n (данные не показаны).For the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4, a satisfactory SE-HPLC method could not be established. In contrast, the SE-HPLC analysis for the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4 was simple and resulted in a peak of homogeneous product in the region of 16 kDa, which corresponds to the monomeric form of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 n (data not shown).
Краткое описание и выводыBrief description and conclusions
В этом процессе подвергшийся рефолдингу предшественник полипептида SEQ ID NO: 4 был захвачен с использованием SP-сефарозы FF («FF» означает «Fast Flow», т.е. стационарная фаза с относительно большими частицами) и впоследствии обработан трипсином для получения зрелого NGF. С этой целью концентрация аргинина в реакции рефолдинга была уменьшена с 1 М (как рекомендовано предшествующим уровнем техники) до 350 мМ.In this process, the refolded polypeptide precursor of SEQ ID NO: 4 was captured using SP-sepharose FF ("FF" stands for "Fast Flow", i.e. relatively large particle stationary phase) and subsequently trypsinized to produce mature NGF. To this end, the concentration of arginine in the refolding reaction was reduced from 1 M (as recommended by the prior art) to 350 mm.
Контроль протеолитического расщепления предшественника полипептида SEQ ID NO: 4 с получением зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 рассматривается как наиболее важный параметр процесса. Здесь были определены условия, которые воспроизводимо облегчают расщепление с высокой эффективностью, с одной стороны, и предотвращают образование продуктов деградации NGF, с другой стороны. Экспериментальные данные, представленные здесь, показали, что достаточно устойчивый производственный процесс может быть установлен в довольно широком диапазоне соотношений фермент/субстрат. Что касается трипсинизации, то выходы на данной стадии, очевидно, хорошие, и на данной стадии процесса не ожидается значительных потерь. Полученный образец продукта, по-видимому, не сильно зависит от используемых условий реакции (с точки зрения соотношения фермент/субстрат и времени инкубации (времени воздействия протеазы)). Примечательно, что даже при достаточно хорошем выходе для стадии полировки ферментом, необходимо обработать по меньшей мере 2*x грамма полипептида SEQ ID NO: 4, чтобы получить x грамм зрелого полипептида SEQ ID NO: 4.The control of proteolytic cleavage of the precursor polypeptide of SEQ ID NO: 4 to produce the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4 is regarded as the most important process parameter. Here, conditions have been determined that reproducibly facilitate cleavage with high efficiency on the one hand and prevent the formation of NGF degradation products on the other hand. The experimental data presented here has shown that a reasonably stable manufacturing process can be established over a fairly wide range of enzyme/substrate ratios. As far as trypsinization is concerned, the yields at this stage appear to be good and no significant losses are expected at this stage of the process. The product sample obtained does not appear to be strongly dependent on the reaction conditions used (in terms of enzyme/substrate ratio and incubation time (protease exposure time)). Notably, even if the yield is good enough for the enzyme polishing step, at least 2*x grams of the SEQ ID NO: 4 polypeptide must be processed to obtain x grams of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 4.
Очистка в соответствии с этим примером представляет собой экономичный процесс, состоящий всего из двух стадий хроматографической очистки. Существующий процесс очистки был дополнительно оптимизирован, и несколько аспектов процесса были модифицированы для увеличения масштаба (см. Фиг. 1). Примеры ранее использованных методов разрушения клеток были заменены гомогенизацией под высоким давлением, и все стадии диализа можно было заменить тангенциальной поточной фильтрацией. Установленный таким образом процесс позволяет производить полипептид SEQ ID NO: 4 с высокой чистотой.Purification according to this example is an economical process consisting of only two chromatographic purification steps. The existing purification process has been further optimized and several aspects of the process have been modified to scale up (see FIG. 1). Examples of previously used cell disruption techniques were replaced by high pressure homogenization and all dialysis steps could be replaced by tangential flow filtration. The process thus established allows the production of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 in high purity.
Несмотря на обозначенные проблемы, похоже, что в целом процесс позволяет получить продукт приемлемого качества.Despite the problems identified, it appears that the overall process produces a product of acceptable quality.
Полный процесс, включающий оптимизации согласно Примеру 2, включая мембранную хроматографию, схематически изображен на Фиг.1.The complete process, including optimizations according to Example 2, including membrane chromatography, is schematically depicted in Fig.1.
Пример 2 может быть масштабирован для получения полипептида в промышленном масштабе.Example 2 can be scaled up to produce a polypeptide on an industrial scale.
Пример 3: Подтверждение концепции in vitro и на млекопитающих, кроме человека. Example 3: Proof of concept in vitro and non-human mammals.
Настоящее изобретение частично основано на экспериментах с двумя животными моделями кожных язв. В этих моделях кожные язвы индуцируются у мышей с диабетом с помощью круговой биопсии или циклов нагружения давлением, и полипептид по настоящему изобретению применяется местно.The present invention is based in part on experiments with two animal models of skin ulcers. In these models, skin ulcers are induced in diabetic mice by circular biopsy or pressure cycles and the polypeptide of the present invention is applied topically.
В настоящем документе сообщается об исследовании введения полипептида SEQ ID NO: 4 животным, не являющимся человеком. Полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить с высокой чистотой путем экспрессии, как описано в Примере 1, и очистки, как описано в Примере 2.This document reports a study on the administration of a polypeptide of SEQ ID NO: 4 to non-human animals. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained in high purity by expression as described in Example 1 and purification as described in Example 2.
Целью этого примера является исследование эффективности местного применения полипептида SEQ ID NO: 4 в контексте заживления ран у мышей с диабетом, соответствующих гистопатологии, болевому порогу и уровню человеческого NGF (hNGF) в плазме. Стандартные соединения (человеческий NGF (SEQ ID NO: 2) и мышиный NGF, аминокислотная последовательность, доступная в общедоступных ресурсах) также были использованы в исследовании.The purpose of this example is to investigate the efficacy of topical application of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 in the context of wound healing in diabetic mice, consistent with histopathology, pain threshold, and human NGF (hNGF) plasma levels. Reference compounds (human NGF (SEQ ID NO: 2) and murine NGF, public domain amino acid sequence) were also used in the study.
Животные, которым вводили полипептид SEQ ID NO: 4, характеризовались кожным заболеванием, как описано в данном документе. Животные представляли собой животную модель человека, страдающего сахарным диабетом или имеющего предрасположенность к сахарному диабету, например, сахарному диабету 1 типа или сахарному диабету 2 типа.Animals treated with the polypeptide of SEQ ID NO: 4 exhibited skin disease as described herein. The animals were an animal model of a human suffering from diabetes mellitus or having a predisposition to diabetes mellitus, eg
Полипептид SEQ ID NO: 4 может быть введен в однократной дозе или в многократных дозах. Полипептид SEQ ID NO: 4 может быть введен субъектам с диабетическими язвами и животным в модели диабетических нейропатических язв стопы (DFU).The polypeptide of SEQ ID NO: 4 may be administered in a single dose or in multiple doses. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be administered to subjects with diabetic ulcers and animals in the diabetic neuropathic foot ulcer (DFU) model.
Этот пример включает следующие разделы:This example includes the following sections:
Пример 3А: тест на удлинение нейритов РС12 in vitro . Целью этого эксперимента было установить эффективность полипептида SEQ ID NO: 4. Для этой цели использовали обычный тест на удлинение нейритов in vitro в NGF-чувствительных клетках (PC12).Example 3A: In vitro PC12 neurite extension test . The purpose of this experiment was to establish the efficacy of the polypeptide of SEQ ID NO: 4. For this purpose, a conventional in vitro neurite extension test in NGF-responsive cells (PC12) was used.
Пример 3В: исследование эффективности in vivo . Целью этого раздела было определить, улучшает ли местное применение полипептида SEQ ID NO: 4 заживление ран (хирургическое поражение) у мышей с диабетом. Example 3B: in vivo efficacy study . The purpose of this section was to determine whether topical application of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 improves wound healing (surgical injury) in diabetic mice.
Были включены следующие группы:The following groups were included:
- db/db, интактные (неповрежденные) N=8, каждый момент времени- db/db, intact (intact) N=8, each time
- db/db, рана+носитель N=8, каждый момент времени - db/db, wound+carrier N=8, each time point
- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 1 мкг/день; N=8, каждый момент времени- db/db, wound + polypeptide SEQ ID NO: 4, 1 μg/day; N=8, every time
- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 10 мкг/день; N=8, каждый момент времени- db/db, wound + polypeptide SEQ ID NO: 4, 10 μg/day; N=8, every time
- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 30 мкг/день; N=8, каждый момент времени- db/db, wound + polypeptide SEQ ID NO: 4, 30 μg/day; N=8, every time
- db/db, рана+hNGF, 10 мкг/день N=8, каждый момент времени- db/db, wound+hNGF, 10 mcg/day N=8, each time point
- db/db, рана+mNGF, 10 мкг/день N=8, каждый момент времени- db/db, wound+mNGF, 10mcg/day N=8, each time point
(доза в мкг относится к соответствующим дозам, вводимым на рану (каждое животное имеет одну рану)(dose in mcg refers to the corresponding doses administered to the wound (each animal has one wound)
В этом эксперименте исследования животных умерщвляли через 7 и 30 дней после индукции раны с определением следующих конечных точек: время до закрытия; гистология (N=4) и иммуногистохимия поражений (N=4).In this study experiment, animals were sacrificed 7 and 30 days after wound induction with the following endpoints determined: time to closure; histology (N=4) and immunohistochemistry of lesions (N=4).
Пример 3C: механизм: поисковое исследование. Целью этого раздела было изучить молекулярные механизмы, поддерживающие положительный эффект полипептида SEQ ID NO: 4 на заживление ран у мышей с диабетом, уделяя особое внимание воспалению, отложению внеклеточного матрикса, иннервации и ангиогенезу. Example 3C: mechanism: exploratory study . The aim of this section was to study the molecular mechanisms supporting the positive effect of the SEQ ID NO: 4 polypeptide on wound healing in diabetic mice, focusing on inflammation, extracellular matrix deposition, innervation and angiogenesis.
Были включены следующие группы:The following groups were included:
- db/db, интактные (неповрежденные) N=6- db/db, intact (intact) N=6
- db/db, рана+транспортное средство N=6- db/db, wound+vehicle N=6
- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 1 мкг/день N=6- db/db, wound + polypeptide SEQ ID NO: 4, 1 μg/day N=6
- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 10 мкг/день N=6- db/db, wound + polypeptide SEQ ID NO: 4, 10 μg/day N=6
- db/db, рана+полипептид SEQ ID NO: 4, 30 мкг/день N=6- db/db, wound + polypeptide SEQ ID NO: 4, 30 μg/day N=6
- db/db, рана+чНГФ, 10 мкг/день N=6- db/db, wound+hNGF, 10 mcg/day N=6
- db/db, рана+mNGF, 10 мкг/день N=6- db/db, wound+mNGF, 10 mcg/day N=6
(доза в мкг относится к соответствующим дозам, вводимым на рану (каждое животное имеет одну рану)(dose in mcg refers to the corresponding doses administered to the wound (each animal has one wound)
В этом разделе исследования животных умерщвляли через 14 дней после индукции раны, что соответствует 50% заживлению раны, с определением следующей конечной точки: изучение возможных механизмов, ответственных за терапевтический эффект полипептида SEQ ID NO: 4, с учетом экспрессии и регуляции мРНК (N=252), кодирующей белки, участвующие в процессах биологии внеклеточного матрикса (N=84), ангиогенезе (N=84), факторов роста и биологии нейротрофинов (N=84).In this section of the study, animals were sacrificed 14 days after wound induction, which corresponds to 50% wound healing, with the following endpoint determined: study of possible mechanisms responsible for the therapeutic effect of the polypeptide of SEQ ID NO: 4, taking into account the expression and regulation of mRNA (N= 252), encoding proteins involved in the processes of extracellular matrix biology (N=84), angiogenesis (N=84), growth factors and neurotrophin biology (N=84).
Материалы и методы в этом ПримереMaterials and methods in this example
Животные и мониторингAnimals and monitoring
Мышей, гомозиготных по спонтанной мутации диабета (Leprdb) (генетически C57BL/6J), и мышей, соответствующих гетерозиготным контролям из той же колонии использовали в возрасте 8-12 недель (Charles River Laboratories - Calco - Lecco, T/BKS.CG- M +/+ LEPR DB/J и S/BKS.CG-M DB/+). см. «Введение для получения информации о составлении группы и умервщлении животных».Mice homozygous for the spontaneous mutation of diabetes (Leprdb) (genetically C57BL/6J) and mice matching heterozygous controls from the same colony were used at 8-12 weeks of age (Charles River Laboratories - Calco - Lecco, T/BKS.CG-M +/+ LEPR DB/J and S/BKS.CG-M DB/+). see "Introduction" for information on grouping and killing animals.
Животных содержали в одиночных клетках с гранулированным кормом и водой ad libitum и с 12-часовым циклом темноты. Все описанные здесь протоколы для животных были выполнены в соответствии с Директивами Совета Европейского сообщества (European Community Council Directives 2010/63/EU), одобрены Министерством здравоохранения (№ 350/2015-PB) и соответствуют рекомендациям, опубликованным в Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals).Animals were housed in single cages with pelleted chow and water ad libitum and with a 12 hour dark cycle. All animal protocols described here have been performed in accordance with the European Community Council Directives 2010/63/EU, approved by the Ministry of Health (No. 350/2015-PB), and comply with the recommendations published in the NIH Guidelines for Care and Use. laboratory animals (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals).
Уровень гликемии в крови измеряли до лечения, на следующий день после последнего лечения и перед умерщвлением (Contour XT, Bayer, Базель, Швейцария).Blood glycemia was measured before treatment, the day after the last treatment and before sacrifice (Contour XT, Bayer, Basel, Switzerland).
График эксперимента для 8-дневной когорты:Experiment schedule for an 8-day cohort:
График эксперимента для 30-дневной когорты:Experiment schedule for a 30-day cohort:
Первая неделя: также, как для 8-дневной когортыFirst week: same as 8-day cohort
Далее: фото два раза в неделю до умервщления.Next: photo twice a week until mortification.
Уровень гликемии на 28 деньGlycemic level on
Умервщление на 29 деньMortification on the 29th day
В этом примере эксперименты обозначены как когорты «8 дней» и «30 дней», для которых указаны дни тестирований или умервщления, как указано в графике экспериментов.In this example, the experiments are labeled as "8 days" and "30 days" cohorts, for which the days of testing or killing are indicated, as indicated in the schedule of experiments.
Поражение, лекарства и наблюдение.Defeat, drugs and observation.
Круглая рана ровной толщины диаметром 6 мм была создана путем пункционной дермальной биопсии на средней части спины мыши. Вкратце, животных анестезировали изофлуораном (+2 л/мин O2). Кожа спины была освобождена от шерсти с помощью восковой эпиляции и продезинфицирована с помощью Clorexidina 4% ("Clorexyderm" I.C.F. srl Industria Chimica Fine - CR-Italy) or Iodopovidone 10% ("Poviderm" Nuova Farmec srl - VR - Italy). Стерильный инструмент для пункционной биопсии диаметром 6 мм использовался для создания открытой раны определенной толщины на спине. Область раны немедленно покрывали полуокклюзионным препаратом Тегадерм ((Tegaderm Roll -3M Health Care, St.Paul, MN, USA), и одевали полосу защиты толщиной 1,5 см вокруг грудной клетки, чтобы мыши не могли снять раневую повязку. Игла 26 калибра использовалась для введения 50 мкл лекарства через тегадерм в ложе раны в дни после пораженния с 0 по 6. Примечательно, что повязка с тегадермом полностью предотвращала утечку раствора из очага поражения.A round wound of even thickness with a diameter of 6 mm was created by puncture dermal biopsy on the middle part of the back of a mouse. Briefly, animals were anesthetized with isofluorane (+2 L/min O2). The skin of the back was dehaired by waxing and disinfected with
Круглая рана на полную толщину диаметром 6 мм имела площадь 28,26 мм2.A full thickness round wound with a diameter of 6 mm had an area of 28.26 mm 2 .
Исходя из этого, животным вводили следующие дозы:Based on this, the following doses were administered to the animals:
Доза 1 мкг: 0,0035 мкг/мм2
Доза 10 мкг: 0,35 мкг/мм2
Доза 30 мкг: 1,05 мкг/мм2
За животными ежедневно наблюдали, проверяя целостность повязки и отсутствие инфекций. Тегадерм меняли еженедельно у всех животных до полного заживления ран.The animals were observed daily, checking the integrity of the bandage and the absence of infections. Tegaderm was changed weekly in all animals until the wounds were completely healed.
Делали фотографии раны, включая имерительную линейку, и измеряли площадь поражения с помощью компьютерного анализа изображений (NIS Elements, Nikon) трижды в течение первой недели, а затем дважды в неделю до конца эксперимента.Photographs of the wound were taken, including a ruler, and the area of the lesion was measured by computer image analysis (NIS Elements, Nikon) three times during the first week and then twice a week until the end of the experiment.
Введение полипептида SEQ ID NO: 4.Introduction of the polypeptide SEQ ID NO: 4.
Полипептид SEQ ID NO: 4 разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) и делили на ежедневные аликвоты. Все процедуры выполнялись на ледяной бане, а конечные аликвоты хранились при - 80°C.The polypeptide of SEQ ID NO: 4 was diluted in phosphate buffered saline (PBS) and divided into daily aliquots. All procedures were performed in an ice bath, and the final aliquots were stored at -80°C.
Человеческий NGF (hNGF, Recombinant, E. Coli Cat N°: N-245, Alomone, Jerusalem, Israe) и рекомбинантный мышиный NGF (mNGF, Cat N°: 1156-NG, R&D System) использовали в качестве контрольных NGF.Human NGF (hNGF, Recombinant, E. Coli Cat N°: N-245, Alomone, Jerusalem, Israe) and recombinant mouse NGF (mNGF, Cat N°: 1156-NG, R&D System) were used as NGF controls.
Тестируемые соединения вводили ежедневно в течение 7 дней, начиная со дня образования раны. 50 мкл раствора тестируемых соединений при каждой концентрации вводили под повязку Tegaderm на область раны с помощью иглы 26-го размера. Эластичность тегадерма позволяет герметизировать отверстие иглы после вытягивания иглы, при этом утечки жидкого раствора не наблюдается.The test compounds were administered daily for 7 days, starting from the day the wound was formed. 50 μl of test compound solution at each concentration was injected under the Tegaderm dressing on the wound area using a 26-gauge needle. The elasticity of the tegaderm makes it possible to seal the needle hole after the needle is withdrawn, without leakage of the liquid solution.
Мониторинг болевого порогаPain threshold monitoring
гипералгезию оценивали у свободно движущихся животных методом Харгрива с использованием прибора для термического подошвенного тестирования (Ugo Basile - Comerio, Varese). Животным давали акклиматизироваться в боксе прибора из оргстекла в течение 15 мин. Источник лучистого тепла постоянной интенсивности (диаметр луча 0,5 см и интенсивность 25 I.R.) помещали под заднюю лапу, и время отдергивания (секунды) регистрировали как время от начала приложения лучистого тепла до отдергивания лапы. Для статистического анализа использовалось среднее четырех показателей. Животных тестировали с помощью подошвенного теста на -3 день (перед операцией) и в День 7 (через 24 часа после последнего применения тестируемых соединений).hyperalgesia was assessed in freely moving animals by the Hargreave method using a thermal plantar tester (Ugo Basile - Comerio, Varese). The animals were allowed to acclimatize in a Plexiglas instrument box for 15 min. A radiant heat source of constant intensity (beam diameter 0.5 cm and
Сбор и обработка тканейCollection and processing of tissues
В день умерщвления мышей подвергали глубокой анестезии (изофлуран+2 л/мин O2) и забирали образцы кожи (1 см × 1 см) из области раны. Для Исследования B в каждой группе было собрано 4 образца для иммуногистохимии и 4 образца для гистологии. Для Исследования C с помощью эксцизионного пробойника брали 6 мм участка кожи (в области раны), забирали кольцо 8 мм вокруг этого (по периметр раны) и участок неповрежденной кожи размером 6 мм.On the day of sacrifice, mice were subjected to deep anesthesia (isoflurane+2 L/min O 2 ) and skin samples (1 cm×1 cm) were taken from the wound area. For Study B, 4 immunohistochemistry samples and 4 histology samples were collected in each group. For Study C, a 6 mm area of skin (at the wound area) was taken with an excision punch, an 8 mm ring around it (at the perimeter of the wound) and a 6 mm area of intact skin were taken.
Образцы, собранные для гистологии, заливали парафином, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E); образцы, собранные для иммуногистохимии, подвергали постфиксации, промывали сахарозным PBS, подвергали криосекции и подготавливали для непрямой иммунофлуоресценции.Samples collected for histology were embedded in paraffin, sectioned and stained with hematoxylin and eosin (H&E); samples collected for immunohistochemistry were postfixed, washed with sucrose PBS, cryosectioned and prepared for indirect immunofluorescence.
Иммуногистохимия и количественный анализImmunohistochemistry and quantitation
Кожу погружали в 4% параформальдегид (мас./об.) и насыщенный водный раствор пикриновой кислоты в 0,1 М буфере Соренсена, pH 7, на 24 часа, затем промывали в течение не менее 48 часов 5% сахарозой в 0,1 М фосфатном буфере. После замораживания в CO2 срезы (толщиной 14 мкм) вырезали с помощью криостата (HM550 Microm, Bio-Optica). Срезы собирали на покрытых желатином предметных стеклах, сначала инкубированных в 0,1 M PBS при комнатной температуре в течение 20 мин, с последующей инкубацией в течение ночи при 4°C во влажной атмосфере с первичными антителами, разведенными в 0,3% PBS-Triton X-100, об./об. В этом исследовании использовались следующие антисыворотки: ламинин (Rabbit, Sigma, 1: 1000); продукт гена белка 9,5 (PGP-9,5) (Rabbit, Boheringer, 1:2000). После ополаскивания в PBS в течение 20 минут (2×10 мин) срезы инкубировали при 37°C в течение 30 минут во влажной атмосфере со вторичной антисывороткой, конъюгированной с Rhodamine Red™-X-conjugated - affinity-pure Donkey anti-Rabbit IgG (Jackson Immunoresearch) разводили в тритоне PBS 0,3%. Затем срезы промывали PBS (как указано выше) и помещали в глицерин, содержащий 1,4-фенилендиамин (0,1 г/л).The skin was immersed in 4% paraformaldehyde (w/v) and saturated aqueous picric acid in 0.1 M Sorensen's buffer,
Иммуногистологические изображения получали с помощью микроскопа Nikon Eclipse E600, оснащенного цифровой камерой CCD Q Imaging Retiga-2000RV (Q Imaging, Surrey, BC, Canada). Анализ проводился с использованием программы Nis-Elements AR 3.2. Иммунореактивная площадь ламинина и PGP9.5 рассчитывалась как доля (процент) в слое эпидермиса через 7 дней и 30 дней после индукции поражения кожи. Индекс прорастания оценивался по количеству участков, в которых PGP9,5 IR приближался к границе язвы. Для всего морфологического анализа было проанализировано пять изображений для каждого животного и на двух уровнях /на животное. Все анализы проводились слепым методом. Среднее значение на животное использовали для статистического анализа.Immunohistological images were obtained using a Nikon Eclipse E600 microscope equipped with a CCD Q Imaging Retiga-2000RV digital camera (Q Imaging, Surrey, BC, Canada). The analysis was carried out using the Nis-Elements AR 3.2 software. The immunoreactive area of laminin and PGP9.5 was calculated as a proportion (percentage) in the epidermal layer at 7 days and 30 days after skin lesion induction. The germination index was assessed by the number of sites in which PGP9.5 IR approached the border of the canker. For the total morphological analysis, five images were analyzed for each animal and at two levels/per animal. All analyzes were performed blind. The mean value per animal was used for statistical analysis.
Количественное определение hNGFQuantification of hNGF
Кровь собирали в пробирки Vacuntainer с EDTA-K2 и в течение 30 мин центрифугировали при 3000×g в течение 10 мин при 4°C. Плазму собирали, разделяли на аликвоты в полипропиленовые пробирки и хранили при -80°C до использования.Blood was collected in Vacuntainer tubes with EDTA-K2 and centrifuged for 30 min at 3000×g for 10 min at 4°C. Plasma was collected, aliquoted into polypropylene tubes and stored at -80°C until use.
Набор Human Adipokine Magnetic Bead Panel 2 (HADK2MAG-61K, EMD Millipore Coorporation, Billerica, MA, USA) использовали для количественного определения hNGF в образцах плазмы с использованием технологии xMAP и платформы MAGPIX Luminex. Эта технология основана на использовании различных популяций гранул с цветовой кодировкой, конъюгированных с моноклональными антителами, специфичными к конкретному белку, что позволяет одновременно улавливать и обнаруживать специфические аналиты с высокой чувствительностью из небольшого объема образца. Мы использовали простую версию набора, включающую только одну популяцию шариков, конъюгированных с человеческим моноклональным антителом NGF-β. Анализ был выполнен в соответствии с техническими требованиями производителя с небольшими изменениями.The Human Adipokine
Вкратце, после инкубации популяции гранул, конъюгированных с конкретным человеческим моноклональным антителом NGF-β, с образцами плазмы (25 мкл) в течение ночи при комнатной температуре, гранулы промывали и инкубировали сначала с раствором детектирующих антител в течение 1 часа при комнатной температуре, затем с раствором стрептавидин-фикоэритрин конъюгата в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывки гранулы ресуспендировали в 100 мкл жидкости Drive и считывали на приборе MAGPIX. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения xPONENT 4.2 ®, и результаты были выражены в пг/мл. Мы получили значения в динамическом диапазоне стандартной кривой (от 10000 до 0,128 пг/мл) для всех образцов. Стандартные кривые имели значение коэффициента корреляции (R2)> 0,98. Точность полученных результатов была дополнительно проверена с помощью значений, полученных для растворов контроля качества, включенных в набор (QC1 и QC2), которые находились в пределах диапазона, указанного производителем набора. Предел обнаружения человеческого NGF-β составлял 0,3-0,7 пг/мл.Briefly, after incubating a population of beads conjugated to a specific human NGF-β monoclonal antibody with plasma samples (25 µl) overnight at room temperature, the beads were washed and incubated first with the detection antibody solution for 1 hour at room temperature, then with streptavidin-phycoerythrin conjugate solution for 30 minutes at room temperature. After washing, the beads were resuspended in 100 µl Drive liquid and read on the MAGPIX instrument. Data were analyzed using xPONENT 4.2® software and the results were expressed in pg/mL. We obtained values in the dynamic range of the standard curve (10,000 to 0.128 pg/mL) for all samples. The standard curves had a correlation coefficient value (R2) > 0.98. The accuracy of the results obtained was further verified using the values obtained for the quality control solutions included in the kit (QC1 and QC2), which were within the range specified by the kit manufacturer. The detection limit for human NGF-β was 0.3-0.7 pg/mL.
Этот анализ был выбран из-за высокой чувствительности и специфичности для hNGF по сравнению с другими методами ELISA.This assay was chosen due to its high sensitivity and specificity for hNGF compared to other ELISA methods.
Культура PC12 и обработка (лечение) таковой Culture of PC12 and processing (treatment) thereof
Клетки поддерживали в стандартных условиях культивирования в культуральной среде (DMEM, 10% лошадиной сыворотки, 5% FBS и pen/strep 1x) в колбах T25 см2 (NUNC). После проведения, по меньшей мере, двух пассажей клетки высевали (1000 клеток/лунку) на 96-луночные планшеты с плоским дном (NUNC) для клеточных культур. Через 1 день in vitro (DIV) культуральную среду удаляли и клетки поддерживали в среде депривации (DMEM, 1% лошадиной сыворотки, 0,5% FBS и pen/strep 1x). Клетки обрабатывали тремя различными концентрациями всех тестируемых соединений (50, 100 и 200 нМ) через 24 часа после лишения сыворотки. После обновления среды 2 DIV и при 7 DIV клетки фиксировали и окрашивали на антиген бета-III-тубулина с использованием непрямой иммунофлуоресценции (Фиг. 1).Cells were maintained under standard culture media conditions (DMEM, 10% horse serum, 5% FBS and pen/strep 1x) in T25 cm 2 (NUNC) flasks. After at least two passages, the cells were plated (1000 cells/well) in 96-well flat-bottomed (NUNC) cell culture plates. After 1 day in vitro (DIV), the culture medium was removed and the cells were maintained in deprivation medium (DMEM, 1% horse serum, 0.5% FBS and pen/strep 1x). Cells were treated with three different concentrations of all test compounds (50, 100 and 200 nM) 24 hours after serum deprivation. Following medium refresh at 2 DIV and at 7 DIV, cells were fixed and stained for beta-III-tubulin antigen using indirect immunofluorescence (FIG. 1).
ИммуноцитохимияImmunocytochemistry
При 7 DIV клетки фиксировали холодным 4% параформальдегидом в течение 20 минут. После обработки в течение 1 часа блокирующим раствором (PBS, тритон X-100 0,3%, BSA 1% и нормальная сыворотка осла 1%), клетки инкубировали с первичной антисывороткой (Mouse Anti-beta-III-tubulin, 1: 1000; R&D) в течение ночи при 4°C. Затем клетки инкубировали со вторичными антителами против мыши (Donkey Anti-mouse Alexa-488 conjugated; 1:500; Jackson) при 37°C в течение 30 минут. Наконец, клетки инкубировали с красителем ядер Hoechst33258 при комнатной температуре в течение 20 минут.At 7 DIV, cells were fixed with cold 4% paraformaldehyde for 20 minutes. After treatment for 1 hour with blocking solution (PBS, Triton X-100 0.3%,
Скрининговый анализ при высоком содержании клеток (высокопропускной скрининг)Screening assay at high cell counts (high throughput screening)
Анализ удлинения нейритов выполняли с помощью Cell Insight™ CX5 High Content Screening (HCS; Thermo Scientific), с использованием приложения Neuronal Profiling BioApplication. Программное обеспечение способно распознавать каждую клетку в каждой лунке по флуоресценции ядерного красителя. Каждое ядро идентифицируется как объект, и каждый объект соответствует отдельной клетке. Система распознает зеленую флуоресценцию (иммунореактивность бета-III-тубулина) вокруг ядра, идентифицируя тело клетки. Это устройство нейронного профилирования способно распознавать и отслеживать все нейриты, возникающие в каждом теле клетки. Это позволяет подсчитывать и измерять нейриты в каждой клетке. Агрегаты клеток не распознавались как объект единичной клетки и были исключены из анализа.Neurite elongation analysis was performed with Cell Insight™ CX5 High Content Screening (HCS; Thermo Scientific) using the Neuronal Profiling BioApplication. The software is able to recognize each cell in each well by nuclear dye fluorescence. Each nucleus is identified as an object, and each object corresponds to a separate cell. The system recognizes green fluorescence (beta-III-tubulin immunoreactivity) around the nucleus, identifying the cell body. This neural profiling device is capable of recognizing and tracking all neurites that originate in each cell body. This allows the neurites in each cell to be counted and measured. Cell aggregates were not recognized as a single cell object and were excluded from the analysis.
Было проанализировано отдельные клетки в количестве 2000-4000 на лунку и 6 лунок/ на каждую обработку.Individual cells were analyzed at 2000-4000 per well and 6 wells/per treatment.
ОТ-ПЦР (RT-PCR)RT-PCR (RT-PCR)
Поисковое исследование возможных механизмов, на которых основан положительный эффект полипептида SEQ ID NO: 4 на заживление ран у мышей с диабетом, было выполнено с использованием исследовательской стратегии (анализ экспрессии генов с фокусом на каскады сопряженных реакций, с использованием ПЦР-массивов RT2 Profiler), с упором на основные молекулярные каскады реакций, участвующие в заживлении ран в 50% процесса заживления, например, включающие ангиогенез, внеклеточный матрикс и адгезионные белки, факторы роста. Образцы собирали из центра поражения (диаметр 6 мм), и РНК экстрагировали у всех животных (6 животных в группе), определяли количественно (спектрофотометр Nanodrop 2000) и объединяли (100 нг на животное). Таким образом, для обратной транскрипции использовали 600 нг РНК на группу.An exploratory study of possible mechanisms underlying the beneficial effect of the SEQ ID NO: 4 polypeptide on wound healing in diabetic mice was performed using an exploratory strategy (analysis of gene expression focusing on coupled cascades using RT2 Profiler PCR arrays), with a focus on the main molecular cascades of reactions involved in wound healing in 50% of the healing process, for example, including angiogenesis, extracellular matrix and adhesion proteins, growth factors. Samples were collected from the center of the lesion (diameter 6 mm) and RNA was extracted from all animals (6 animals per group), quantified (Nanodrop 2000 spectrophotometer) and pooled (100 ng per animal). Thus, 600 ng of RNA per group was used for reverse transcription.
Для каждой группы выполняли одну ПЦР-матрицу (single PCR array) с использованием прибора для ПЦР в реальном времени CFX96 (BioRad). Для всех планшетов использовали одно и то же пороговое значение, и относительную экспрессию гена рассчитывали сравнительным методом 2-ΔΔCq. Матрицы ПЦР Rt2 Profiler™ (QIAGEN) для ангиогенеза, внеклеточного матрикса и белков адгезии (ЕСМ), а также факторов роста (GF) мыши были использованы для профилирования экспрессии 250 ключевых генов, участвующих в ангиогенезе, ЕСМ и GF (по 84 гена каждый) и синтезирована кДНК с использованием набора RT2 First Strand (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя.One single PCR array was performed for each group using a CFX96 real-time PCR instrument (BioRad). The same threshold value was used for all plates and relative gene expression was calculated by the comparative 2-ΔΔCq method. Rt2 Profiler™ (QIAGEN) PCR templates for angiogenesis, extracellular matrix and adhesion proteins (ECM), and mouse growth factors (GF) were used to profile the expression of 250 key genes involved in angiogenesis, ECM and GF (84 genes each) and synthesized cDNA using the RT2 First Strand kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions.
Полученные результатыResults
Результаты представлены в следующем порядке:The results are presented in the following order:
- Анализ PC12 in vitro - PC12 in vitro analysis
- Эффективность, 8 дней- Efficiency, 8 days
- Эффективность, 30 дней- Efficiency, 30 days
- Механизм, 14 дней- Mechanism, 14 days
Пример 3АExample 3A : Тест на удлинение нейритов РС12 in vitro.: In vitro PC12 neurite extension test.
Эффективность полипептида SEQ ID NO: 4 тестировали in vitro на клетках PC12 (см. Схему эксперимента на Фиг. 1), измеряя удлинение нейритов посредством высокопропускного клеточного скрининга, используя следующие параметры:The potency of the SEQ ID NO: 4 polypeptide was tested in vitro on PC12 cells (see Experimental Design in Fig. 1), measuring neurite elongation by high-throughput cell screening using the following parameters:
- Средняя длина нейрита: представляет собой среднюю длину нейрита на клетку;- Mean neurite length: represents the average neurite length per cell;
- Средняя общая длина нейрита: представляет собой общую длину нейрита на клетку;- Average total neurite length: represents the total neurite length per cell;
- % клеток с максимальной длиной нейрита (% High Neurite): представляет процент клеток, у которых длина нейрита равна длине тела клетки или превышает ее.- % of cells with the highest neurite length (% High Neurite): represents the percentage of cells in which the length of the neurite is equal to or greater than the length of the cell body.
Во-первых, все дозы тестируемых соединений анализировали и сравнивали с контролем (носитель) (данные не показаны). В этом отчете показаны только результаты для наиболее эффективной дозы каждого тестируемого соединения (Фиг. 1). Клетки, подвергшиеся воздействию эффективных доз всех тестируемых соединений, показали увеличение среднестатистической средней длины нейритов (A; mNGF, P=0,0394; hNGF, P=0,0196; полипептид SEQ ID NO: 4, P=0,0033) и средней общей длины нейритов (B; mNGF, P=0,0338; hNGF, P=0,0006; полипептид SEQ ID NO: 4, P=0,0211; Aloe, P <0,0001) по сравнению с клетками, обработанными носителем. Только полипептид SEQ ID NO: 4 (P=0,0367) был способен увеличивать процент клеток, демонстрирующих удлиненный нейрит.First, all doses of test compounds were analyzed and compared with a control (vehicle) (data not shown). This report only shows the results for the most effective dose of each test compound (FIG. 1). Cells exposed to effective doses of all tested compounds showed an increase in mean mean neurite length (A; mNGF, P=0.0394; hNGF, P=0.0196; polypeptide SEQ ID NO: 4, P=0.0033) and mean total neurite length (B; mNGF, P=0.0338; hNGF, P=0.0006; polypeptide SEQ ID NO: 4, P=0.0211; Aloe, P<0.0001) compared to vehicle-treated cells . Only the polypeptide of SEQ ID NO: 4 (P=0.0367) was able to increase the percentage of cells showing extended neurite.
Пример 3B:Example 3B: Исследование эффективности, 8-дневная когорта. Efficacy study, 8-day cohort.
Мониторинг животныхAnimal monitoring
В период до образования раны у животных наблюдали за уровнем глюкозы в крови. Результаты представлены на Фиг. 3. Гликемия была выше у мышей с диабетом, чем у контрольных животных, по данным пилотного исследования. Между животными, отнесенными к разным экспериментальным группам, различий не наблюдалось.In the period before the formation of the wound in animals was observed for the level of glucose in the blood. The results are presented in Fig. 3. Glycemia was higher in diabetic mice than in control animals, according to a pilot study. No differences were observed between animals assigned to different experimental groups.
Прибавка массы тела между днем 0 и днем 7 после поражения представлена на Фиг. 4. Никаких различий не наблюдалось ни по времени (день 0 против дня 7), ни по лечению.Weight gain between
ГипералгезияHyperalgesia
Термальную гипералгезию оценивали у свободно движущихся животных по методу Харгрива с использованием прибора для термического подошвенного тестирования на День -3 (до поражения кожи) и на следующий день после последнего нанесения тестируемого соединения (день 7). Результаты проиллюстрированы на Фиг. 5. Никаких различий между группами не наблюдалось в день 0. При сравнении средней латентности отдергивания лапы, измеряемой в одной и то же группе лечения, в День 0 и День 7, у животных, получавших hNGF, на 7 день наблюдалось значительное снижение. В остальных группах гипералгезии к тепловым раздражителям не наблюдалось. Примечательно, что более высокое пороговое значение наблюдался у мышей, обработанных полипептидом SEQ ID NO: 4, на 7 день, что указывает на более высокое пороговое значение боли в этой группе.Thermal hyperalgesia was assessed in freely moving animals by the Hargreave method using a thermal plantar tester on Day -3 (prior to skin lesions) and the day after the last application of test compound (Day 7). The results are illustrated in FIG. 5. No difference between groups was observed on
Время до заживления раныTime to wound healing
Оценка заживления ран проводилась путем макроскопического наблюдения по фотографиям, которые делались, начиная с дня 0 (день операции), каждые два дня в течение первой недели. «Время до заживления» было измерено на этих изображениях ран с использованием элементов NIS (Nikon). Результаты представлены на Фиг. 6, где показаны графики как внешних, так и внутренних областей. Двусторонний дисперсионный анализ показывает временной эффект (F (4 203) = 41,25, p <0,0001) и групповой эффект (F (5 203) = 2,565, P=0,0282).Wound healing was assessed by macroscopic observation of photographs taken from day 0 (day of surgery) every two days for the first week. "Time to heal" was measured on these wound images using NIS (Nikon) elements. The results are presented in Fig. 6, which shows graphs of both outer and inner regions. Two-tailed analysis of variance shows a time effect (F(4203)=41.25, p<0.0001) and a group effect (F(5203)=2.565, P=0.0282).
Время до заживления на 7 день показано на Фиг. 7. Никаких различий между группами не наблюдается, несмотря на то, что в группах, обработанных полипептидом SEQ ID NO: 4, наблюдается дозозависимая тенденция к ускорению заживления ран.The time to healing at
Уровни NGF в плазмеPlasma NGF levels
Кровь собирали при умерщвлении, то есть через 48 часов после последнего применения тестируемых соединений. Уровни NGF в плазме определяли с помощью анализа на основе антител с использованием антител, способных обнаруживать человеческий NGF, мышиный NGF, а также полипептид, указанный в SEQ ID NO: 4. В данном документе определенные таким образом уровни NGF в плазме упоминаются как «общий уровень NGF в плазме». Результаты представлены на Фиг. 8. У обработанных мышей наблюдали дозозависимое увеличение общих уровней NGF в плазме, достигающее значений более 350 пг/мл. Более того, увеличение также наблюдалось в группе, получавшей mNGF. Это неудивительно, поскольку рекомбинантный мышиный NGF-β, используемый для лечения, представляет собой гомодимер двух аминокислотных полипептидов, имеющих примерно 90% идентичности на уровне аминокислотной последовательности с человеческим NGF и распознается тем же антителом.Blood was collected at sacrifice, ie 48 hours after the last application of the test compounds. Plasma NGF levels were determined using an antibody-based assay using antibodies capable of detecting human NGF, mouse NGF, as well as the polypeptide indicated in SEQ ID NO: 4. In this document, plasma NGF levels determined in this way are referred to as "total level NGF in Plasma. The results are presented in Fig. 8. In treated mice, a dose-dependent increase in total plasma NGF levels was observed reaching values in excess of 350 pg/ml. Moreover, an increase was also observed in the mNGF treated group. This is not surprising since the recombinant mouse NGF-β used for treatment is a homodimer of two amino acid polypeptides that share approximately 90% amino acid sequence identity with human NGF and is recognized by the same antibody.
Пример 3CExample 3C : исследование эффективности, 30-дневная когорта.: efficacy study, 30-day cohort.
Мониторинг животныхAnimal monitoring
У животных отслеживали уровни глюкозы в крови до образования раны, после окончания введения тестируемых соединений и при умерщвлении. Результаты представлены на Фиг. 9. Мы наблюдали постепенное увеличение уровня глюкозы в крови в течение 28 дней наблюдения во всех экспериментальных группах. Никаких различий между группами лечения в разное время не наблюдалось.Animals were monitored for blood glucose levels prior to wound formation, after completion of test compound administration, and at sacrifice. The results are presented in Fig. 9. We observed a gradual increase in blood glucose levels during the 28 days of observation in all experimental groups. No differences were observed between treatment groups at different times.
Прибавка массы тела между 0-м и 28-м днями после индукции поражения кожи представлена на Фиг. 10. Никаких различий не наблюдалось ни по времени, ни в зависимости от лечения.The weight gain between
ГипералгезияHyperalgesia
Термальную гипералгезию оценивали у свободно движущихся животных по методу Харгрива с использованием прибора для термических подошвенных тестов на День -3 (до поражения кожи) и на День 7, через 24 часа после последнего применения NGF. Результаты проиллюстрированы на Фиг. 11. Никаких различий между группами не наблюдалось в день 0. При сравнении латентности в День 0 и День 7 в одной и той же группе лечения, наблюдалась незначительная тенденция к снижению латентности отдергивания лапы в День 7 у животных, получавших hNGF. Однако при объединении данных по 8-дневным и 30-дневным когортам у животных, получавших hNGF, наблюдалось значительное снижение болевого порога, что позволяет предположить, что именно этот состав hNGF вызывает гипералгезию. В остальных группах различий не наблюдалось. Результаты представлены на Фиг. 12.Thermal hyperalgesia was assessed in freely moving animals by the Hargreave method using a thermal plantar tester on Day -3 (before skin lesions) and on
Время до заживленияTime to healing
Оценку заживления ран проводили путем макроскопического наблюдения, фотографируя раны каждые два дня в течение первой недели, начиная с дня -3 (день операции), затем дважды в неделю до умерщвления. «Время до заживления» было измерено на этих изображениях ран с использованием элементов NIS (Nikon).Evaluation of wound healing was performed by macroscopic observation, photographing the wounds every two days during the first week, starting from day -3 (day of surgery), then twice a week until sacrifice. "Time to heal" was measured on these wound images using NIS (Nikon) elements.
Индивидуальные данные для оценки «времени до заживления» представлены в табличной форме (Фиг. 13). Последовательные измерения площади внешней раны отложены в зависимости от времени на Фиг. 14. Двусторонний дисперсионный анализ показывает временной эффект (F (50 434) = 417,3, p <0,0001), эффект лечения (F (5 434) = 21,45, p <0,0001) и корреляцию между эффектами лечения и времени (F (50 434) = 1,638, p=0,0055).Individual data for the assessment of "time to healing" are presented in tabular form (Fig. 13). Sequential measurements of external wound area are plotted against time in FIG. 14. Two-tailed analysis of variance shows time effect (F(50434)=417.3, p<0.0001), treatment effect (F(5434)=21.45, p<0.0001) and correlation between treatment effects and time (F (50,434) = 1.638, p=0.0055).
У мышей, получавших полипептид SEQ ID NO: 4, скорость заживления ран была значительно ускорена по сравнению с животными, получавшими носитель, причем дозозависимым образом.In mice treated with the polypeptide of SEQ ID NO: 4, the rate of wound healing was significantly accelerated compared to animals treated with the carrier, and in a dose-dependent manner.
Время до заживления на 8-й день показано на Фиг. 15, где объединены данные как для 8-дневных, так и для 30-дневных когорт. Значительное уменьшение времени заживления ран уже в это время наблюдается в группе, получавшей полипептид SEQ ID NO: 4 в дозе 30 мкг/день, по сравнению с группой, получавшей носитель.The time to healing on day 8 is shown in Fig. 15, which combines data for both 8-day and 30-day cohorts. A significant reduction in wound healing time already at this time is observed in the group treated with the polypeptide of SEQ ID NO: 4 at a dose of 30 μg/day, compared with the group treated with the carrier.
Уровни NGF в плазмеPlasma NGF levels
Кровь собирали при умерщвлении. Уровни NGF в плазме определяли с помощью анализа на основе антител с использованием антител, способного обнаруживать человеческий NGF, мышиный NGF, а также полипептид с SEQ ID NO: 4. В данном документе определенные таким образом уровни NGF в плазме упоминаются как «общий уровень NGF в плазме». Результаты представлены на Фиг. 16. Общие уровни NGF в плазме очень низки (по сравнению с Фиг. 8), не превышают 10 пг/мл и одинаковы во всех группах.Blood was collected at the time of sacrifice. Plasma NGF levels were determined by an antibody-based assay using antibodies capable of detecting human NGF, mouse NGF, as well as the polypeptide of SEQ ID NO: 4. In this document, plasma NGF levels thus determined are referred to as "total NGF level in plasma. The results are presented in Fig. 16. Total plasma levels of NGF are very low (compared to Fig. 8), do not exceed 10 pg/ml and are the same in all groups.
Гистология (через 8 и 30 дней) (см. также отчет пилотного исследования)Histology (after 8 and 30 days) (see also pilot study report)
Образцы кожи, содержащие область язвы, включающий край неповрежденной кожи 5 мм, вырезали, заливали парафином и делали серийные срезы в соответствии со схемой, представленной на Фиг. 17B. Затем срезы окрашивали (H&E), и репрезентативные изображения на разных уровнях глубины раны с низким увеличением представлены на Фиг. 17A. Микрофотографии с большим увеличением иллюстрируют процесс реэпителизации на границе раны (Фиг. 17D), где виден «мигрирующий эпидермальный язык» (migrating epidermal tongue (MET)), обширная грануляционная ткань в дерме ниже слоя эпидермиса, характеризующаяся воспалением, пролиферацией клеток, отложением матрикса (Фиг. 17E) и ангиогенезом (Фиг. 17F). Реэпителизацию оценивали путем измерения толщины слоя эпидермиса. Репрезентативные изображения по группам интактных животных, носителя, полипептида SEQ ID NO: 4, мышей, получавших 1 мкг/день, и мышей, получавших 30 мкг/день полипептида SEQ ID NO: 4, представлены на Фиг. 18. Полипептид SEQ ID NO: 4 вызывает дозозависимое утолщение слоя эпидермиса, которое оказывается намного выше, чем в неповрежденной коже. Базальный слой эпидермиса характеризуется гиперцеллюлярностью базального и остистого слоев, что, возможно, отражает повышенную пролиферацию клеток. Кроме того, дерма также утолщена и сильно окрашена, что свидетельствует о более высоком отложении внеклеточного матрикса, и обогащена кожными структурами (железами и волосяными фолликулами) также в зависимости от дозы. Толщина эпидермиса во всех группах представлена на графике. Полипептид SEQ ID NO: 4 вызывает дозозависимое утолщение эпидермального слоя, который становится намного толще, чем в группе носителя. Также mNGF и hNGF вызывают такой же эффект, сравнимый с группой, обработанной сходной дозой полипептида SEQ ID NO: 4.Skin samples containing an ulcer area including a 5 mm margin of intact skin were excised, embedded in paraffin, and serially sectioned according to the scheme shown in FIG. 17b. Sections were then stained (H&E) and representative images at different levels of wound depth at low magnification are shown in FIG. 17A. High magnification micrographs illustrate the process of re-epithelialization at the wound margin (Fig. 17D), showing migrating epidermal tongue (MET), extensive granulation tissue in the dermis below the epidermal layer, characterized by inflammation, cell proliferation, matrix deposition ( Fig. 17E) and angiogenesis (Fig. 17F). Re-epithelialization was assessed by measuring the thickness of the epidermal layer. Representative group images of intact animals, vehicle, polypeptide of SEQ ID NO: 4, mice treated with 1 μg/day, and mice treated with 30 μg/day of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 are shown in FIG. 18. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 causes a dose-dependent thickening of the epidermal layer, which is much higher than in intact skin. The basal layer of the epidermis is characterized by hypercellularity of the basal and spinous layers, possibly reflecting increased cell proliferation. In addition, the dermis is also thickened and strongly colored, indicative of higher extracellular matrix deposition, and enriched in skin structures (glands and hair follicles) also in a dose dependent manner. The thickness of the epidermis in all groups is presented in the graph. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 causes a dose-dependent thickening of the epidermal layer, which becomes much thicker than in the carrier group. Also, mNGF and hNGF produced the same effect, comparable to a group treated with a similar dose of the polypeptide of SEQ ID NO: 4.
Иммуногистохимия (через 8 и 30 дней)Immunohistochemistry (after 8 and 30 days)
Реиннервацию кожи анализировали с помощью иммуноокрашивания на белок PGP9.5, высокочувствительный нейроэктодермальный маркер, который широко используется для визуализации кожной иннервации. Анатомия кожной иннервации представлена на Фиг. 19, где визуализируются волокна PGP9.5 -IR в неповрежденной коже мыши. В частности, визуализируются подкожные, глубокие кожные и субэпидермальные сплетения; субэпидермальное сплетение обеспечивает эпидермис свободными эпидермальными нервными окончаниями.Skin reinnervation was analyzed by immunostaining for the PGP9.5 protein, a highly sensitive neuroectodermal marker that is widely used to visualize cutaneous innervation. The anatomy of the cutaneous innervation is shown in Fig. 19 showing PGP9.5-IR fibers in intact mouse skin. In particular, subcutaneous, deep dermal and subepidermal plexuses are visualized; the subepidermal plexus provides the epidermis with free epidermal nerve endings.
Эффект местного применения полипептида SEQ ID NO: 4 на повторный рост нервов в восстанавливающейся коже был проанализирован с использованием «индекса разрастания» на границе поражения на 8-й день после поражения и PGP9.5-IR в зоне поражения в эпидермисе и дерме восстанавливаемого участка кожи. Типичные изображения представлены на Фиг. 20. Панели A, B и C показывают графики PGP9.5-IR через 30 дней у интактных животных при обработке мышей носителем и полипептидом SEQ ID NO: 4 в количестве 30 мкг/день, соответственно. Результаты морфометрического анализа представлены на Фиг. 21. Обработка полипептидом SEQ ID NO: 4 в количестве 30 мкг/день вызывает значительное увеличение прорастания через 8 дней, такого же, как при hNGF. Через 30 дней, в то время как у животных, которым вводили носитель, иннервация еще не восстановилась, и не наблюдалось различий между интактными и обработанными (NGF) животными, которым вводили полипептид SEQ ID NO: 4 (все дозы) и mNGF. Напротив, при использовании hNGF наблюдается гиперинервация.The effect of topical application of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 on nerve regrowth in regenerating skin was analyzed using the "outgrowth index" at the lesion margin on day 8 post-lesion and PGP9.5-IR at the lesion in the epidermis and dermis of the regenerated skin area . Typical images are shown in Fig. 20. Panels A, B and C show plots of PGP9.5-IR at 30 days in intact animals when mice are treated with vehicle and SEQ ID NO: 4 polypeptide at 30 μg/day, respectively. The results of morphometric analysis are presented in Fig. 21. Treatment with the polypeptide of SEQ ID NO: 4 at 30 μg/day causes a significant increase in germination after 8 days, the same as with hNGF. After 30 days, while the animals treated with the carrier had not yet recovered innervation, and no differences were observed between intact and treated (NGF) animals that were injected with the SEQ ID NO: 4 polypeptide (all doses) and mNGF. On the contrary, when using hNGF, hyperinnervation is observed.
Эффект местного применения полипептида SEQ ID NO: 4 на ангиогенез оценивали методом с использованием ламинина в качестве маркера. Ламинин является маркером базальной мембраны, маркирующим, таким образом, несколько структур кожи, включая эндотелиальные клетки. Другие эндотелиальные маркеры, такие как PECAM (также известный как CD31), фактор фон Виллебранда, коллаген, обеспечивали окрашивание, неподходящее для количественной оценки в условиях фиксации, примененных в этом исследовании. Репрезентативные изображения представлены на Фиг. 22. Панели A иллюстрируют эпидермальный слой, визуализированный с помощью традиционной гистологии (H&E). Стрелками обозначен базальный слой. Панель B иллюстрирует базальную мембрану, лежащую под эпидермисом (стрелки); Панель C иллюстрирует сенсорную иннервацию эпидермиса, происходящую из субэпендимального сплетения; Панель D иллюстрирует границу раны и связанную с ней иннервацию через 8 дней (E) и после восстановления кожи (F). Панели G-I иллюстрируют ангиогенез через 8 дней (G, EE; H, ламинин-IR) и через 30 дней (I).The effect of topical application of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 on angiogenesis was assessed by the method using laminin as a marker. Laminin is a basement membrane marker, thus marking several skin structures, including endothelial cells. Other endothelial markers such as PECAM (also known as CD31), von Willebrand factor, collagen provided staining unsuitable for quantification under the fixation conditions used in this study. Representative images are shown in Fig. 22. Panels A illustrate the epidermal layer visualized using conventional histology (H&E). The arrows indicate the basal layer. Panel B illustrates the basement membrane underlying the epidermis (arrows); Panel C illustrates sensory innervation of the epidermis originating from the subependymal plexus; Panel D illustrates the wound boundary and associated innervation at 8 days (E) and after skin repair (F). Panels G-I illustrate angiogenesis at 8 days (G, EE; H, laminin-IR) and at 30 days (I).
Результаты морфометрического анализа представлены на Фиг. 23. Применение полипептида SEQ ID NO: 4 в дозе 30 мкг/день вызывает значительное увеличение ламинина-IR через 8 дней, такого как при hNGF, которое все еще наблюдается через 30 дней, что, возможно, отражает ангиогенез.The results of morphometric analysis are presented in Fig. 23. The use of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 at a dose of 30 μg/day causes a significant increase in laminin-IR after 8 days, such as in hNGF, which is still observed after 30 days, possibly reflecting angiogenesis.
Механизм: Поисковое исследованиеMechanism: Exploratory Research
Регуляция экспрессии геновRegulation of gene expression
Целью исследования было изучение молекулярных механизмов, поддерживающих положительный эффект полипептида SEQ ID NO: 4 на заживление ран у мышей с диабетом, при этом обращалось особое внимание на воспаление, отложение внеклеточного матрикса, иннервацию, ангиогенез. Исследовательская стратегия (анализ экспрессии генов, ориентированный на каскады реакций с использованием ПЦР-матриц RT2 Profiler был использован для определения основного молекулярного пути (каскада реакций) в ране в точке времени, соответствующей 50% заживления. Ангиогенез мыши, внеклеточный матрикс и белок адгезии (ЕСМ), и факторы роста (GF), проанализированные с помощью Rt2 Profiler™ использовали для профилирования экспрессии 252 ключевых генов, участвующих в ангиогенезе, ECM и GF (по 84 гена каждый).The aim of the study was to investigate the molecular mechanisms that support the positive effect of the SEQ ID NO: 4 polypeptide on wound healing in diabetic mice, with particular attention to inflammation, extracellular matrix deposition, innervation, angiogenesis. Research strategy (analysis of gene expression oriented to cascades of reactions using RT2 Profiler PCR arrays) was used to determine the main molecular pathway (cascade of reactions) in the wound at the time point corresponding to 50% healing. Mouse angiogenesis, extracellular matrix and adhesion protein (ECM ), and growth factors (GF) analyzed with Rt2 Profiler™ were used to profile the expression of 252 key genes involved in angiogenesis, ECM and GF (84 genes each).
Анализ экспрессии для каждой панели (ангиогенез, ЕСМ, фактор роста) включает следуещее:Expression analysis for each panel (angiogenesis, ECM, growth factor) includes the following:
- список генов;- list of genes;
- тепловую карту, обеспечивающую графическое представление данных регуляции сворачивания между двумя группами, наложенных на схему планшета с ПЦР-матрицей;a heat map providing a graphical representation of folding regulation data between the two groups superimposed on a PCR array layout;
- диаграмму разброса (скатерограмму), сравнивающую нормализованную экспрессию каждого гена в ПЦР-матрице между двумя группами путем их сопоставления друг с другом для быстрой визуализизации значительных изменений экспрессии генов, и список генов, изменения в экспрессии которых больше выбранного порогового значения (≥ 3).- a scatterplot (scatterogram) comparing the normalized expression of each gene in the PCR matrix between two groups by comparing them with each other to quickly visualize significant changes in gene expression, and a list of genes whose expression changes are greater than the selected threshold value (≥ 3).
Диаграммы разброса показывает сравнение следующих групп:Scatterplots show comparison of the following groups:
- db/db по сравнению с мышами WT (WT в качестве контрольной группы)- db/db compared to WT mice (WT as controls)
- носитель db/db по сравнению с db/db интактными мышами (db/db интактные мыши использовались в качестве контрольной группы)- vehicle db/db versus db/db intact mice (db/db intact mice were used as controls)
- db/db NGF (полипептид SEQ ID NO:, mNGF, hNGF) по сравнению с db/db носителем (группа «db/db носитель» использовалась в качестве контрольной группы)- db/db NGF (polypeptide SEQ ID NO:, mNGF, hNGF) vs. db/db vehicle (db/db vehicle group was used as control group)
- db/db NGF (полипептид SEQ ID NO:, mNGF, hNGF) по сравнению с db/db интактными мышами (db/db интактные мыши использовались в качестве контрольной группы)- db/db NGF (polypeptide SEQ ID NO:, mNGF, hNGF) compared to db/db intact mice (db/db intact mice were used as controls)
Результаты анализировались с учетом внеклеточного матрикса и молекул адгезии, факторов роста и нейротрофинов (чертежи не показаны).The results were analyzed taking into account the extracellular matrix and adhesion molecules, growth factors and neurotrophins (drawings not shown).
Основные результаты и выводы настоящего анализа следующие:The main results and conclusions of this analysis are as follows:
Эффект генотипа:Genotype effect:
- Сравнение между интактными db/db и неповрежденными мышами WT показывает, что многочисленные гены ангиогенеза и ECM по-разному регулируются в соответствии с генотипом, в то время как очень немногие гены GF по-разному экспрессируются, что позволяет предположить, что ECM и ангиогенез являются процессами, на которые в контексте заживления ран в основном влияет диабетическое состояние.- Comparison between intact db/db and intact WT mice shows that numerous angiogenesis and ECM genes are differently regulated according to genotype, while very few GF genes are differently expressed, suggesting that ECM and angiogenesis are processes that, in the context of wound healing, are mainly affected by the diabetic condition.
- Эффект поражения в db/db:- Damage effect in db/db:
- Поражение индуцировало подавление многочисленных генов ангиогенеза и ECM и повышение активации регуляции нескольких генов GF, в результате чего можно предположить, что ECM и ангиогенез являются основными процессами, управляющими заживлением ран у мышей с диабетом.- The lesion induced downregulation of numerous angiogenesis and ECM genes and upregulation of several GF genes, suggesting that ECM and angiogenesis are the main processes driving wound healing in diabetic mice.
- Эффект полипептида SEQ ID NO: 4 в db/db (по сравнению с носителем):- Effect of the polypeptide SEQ ID NO: 4 in db/db (compared to the vehicle):
- полипептид SEQ ID NO: 4 подавляет несколько генов, включая: гены ангиогенеза: akt, Ccl2 (хемокин (мотив C-C) лиганд 2), Ctgf (фактор роста соединительной ткани), Hif1a, MMP14, thbs2 (тромбоспондин 2);- polypeptide SEQ ID NO: 4 suppresses several genes, including: angiogenesis genes: akt, Ccl2 (chemokine (C-C motif) ligand 2), Ctgf (connective tissue growth factor), Hif1a, MMP14, thbs2 (thrombospondin 2);
- полипептид SEQ ID NO: 4 активирует несколько генов, и только некоторые из них также регулируются hNGF и mNGF- the polypeptide of SEQ ID NO: 4 activates several genes, and only some of them are also regulated by hNGF and mNGF
- полипептид SEQ ID NO: 4 не регулирует гены GF, и только некоторые из них регулируются hNGF и mNGF- polypeptide SEQ ID NO: 4 does not regulate GF genes, and only some of them are regulated by hNGF and mNGF
Также был проведен анализ STRING (данные не показаны). STRING представляет собой биологическую базу данных и веб-ресурс известных и прогнозируемых белок-белковых взаимодействий, который широко используется для поиска взаимосвязей взаимодействий между дифференциально экспрессируемыми генами. «Кластерный» анализ с помощью программного обеспечения STRING базируется на всех генах, которые регулируются в различных матрицах.STRING analysis was also performed (data not shown). STRING is a biological database and web resource of known and predicted protein-protein interactions that is widely used to search for interaction relationships between differentially expressed genes. "Cluster" analysis using STRING software is based on all genes that are regulated in different matrices.
ВЫВОДЫCONCLUSIONS
Основные выводы из этого примера следующие:The main takeaways from this example are:
1. Клетки PC12, в сочетании с HCS как методом аналитического подхода, представляет собой подходящий инструмент для оценки эффективности полипептида SEQ ID NO: 4 in vitro;1. PC12 cells, in combination with HCS as a method of analytical approach, is a suitable tool for evaluating the effectiveness of the polypeptide SEQ ID NO: 4 in vitro ;
2. полипептид SEQ ID NO: 4 улучшает заживление дозозависимым образом.2. polypeptide of SEQ ID NO: 4 improves healing in a dose-dependent manner.
3. Полипептид SEQ ID NO: 4 значительно увеличивает восстановление эпидермального слоя и вызывает сильное увеличение его толщины; полипептид SEQ ID NO: 4 также положительно влияет на реиннервацию и ангиогенез (по оценке с использованием ламинина-IR). Все эти параметры у мышей, обработанных полипептидом SEQ ID NO: 4, выше, чем у контрольных интактных мышей, что позволяет предположить, что фаза реконфигурации раны при заживлении должна быть оценена в дальнейшем исследовании.3. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 significantly increases the recovery of the epidermal layer and causes a strong increase in its thickness; the polypeptide of SEQ ID NO: 4 also has a positive effect on reinnervation and angiogenesis (as assessed using laminin-IR). All of these parameters are higher in mice treated with the polypeptide of SEQ ID NO: 4 than in intact control mice, suggesting that the wound reconfiguration phase of healing should be assessed in a further study.
4. Предварительное исследование предполагает, что каскад реакций AKT-mTOR может быть подвержен действию полипептида SEQ ID NO: 4. Так как Akt и mTOR считаются промоторами выживания и клеточного роста, было высказано предположение, что кратковременная фармакологическая активация PI3K-Akt-mTOR сигнального каскада может представлять собой новую стратегию клинического вмешательства для ускорения заживления. Примечательно, что нарушенный каскад AKT-mTOR был указан как возможная причина нарушения заживления ран у мышей с диабетом, и было продемонстрировано, что каскад AKT-mTOR участвует в улучшенном заживлении посредством нескольких молекул, таких как нотогинсенозид Ft1 у диабетических мышей; ацеманнан; SR-0379; семейство микроРНК-99.4. A preliminary study suggests that the AKT-mTOR cascade may be mediated by the polypeptide of SEQ ID NO: 4. Since Akt and mTOR are considered promoters of survival and cell growth, it has been suggested that short-term pharmacological activation of the PI3K-Akt-mTOR signaling cascade may represent a new strategy for clinical intervention to accelerate healing. Notably, a disrupted AKT-mTOR cascade has been pointed out as a possible cause of impaired wound healing in diabetic mice, and the AKT-mTOR cascade has been shown to be involved in improved healing through several molecules, such as notoginsenoside Ft1 in diabetic mice; acemannan; SR-0379; miRNA-99 family.
Таким образом, полипептид SEQ ID NO: 4 представляет собой рекомбинантный белок с полипептидной последовательностью, подобной фактору роста нервов человека, но имеющий, по меньшей мере, одну мутацию, которая делает его безболезненным (hNGFp) и терапевтически эффективным.Thus, the polypeptide of SEQ ID NO: 4 is a recombinant protein with a polypeptide sequence similar to human nerve growth factor, but with at least one mutation that makes it painless (hNGFp) and therapeutically effective.
Таблица выше: экспериментальный дизайн теста удлинения нейритов in vitro в клетках PC12. См. Методы для получения дополнительной информацииTable above: Experimental design of the in vitro neurite extension test in PC12 cells. See Methods for more information
Пример 4: Подтверждение концепции: модель пролежней у мышейExample 4: Proof of concept: mouse pressure ulcer model
В настоящем документе сообщается об исследовании введения полипептида SEQ ID NO: 4 животным, не являющимся человеком. Полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить с высокой чистотой путем экспрессии, как описано в Примере 1, и очистки, как описано в Примере 2.This document reports a study on the administration of a polypeptide of SEQ ID NO: 4 to non-human animals. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained in high purity by expression as described in Example 1 and purification as described in Example 2.
МетодыMethods
В эксперимент были включены контрольные (C57BL6, альбиносы) и генетически диабетические мыши C57BL/KsJ-m +/+ Leprdb (db/db), Jackson laboratories, возрастом 8-10 недель. Под газовой анестезией животным выбривали спину и тщательно очищали выбритую область для предотвращения раздражения кожи. Кожная складка была приподнята, и два магнитных керамических диска диаметром 12 мм и толщиной 5,0 мм, со средним весом 2,4 г и силой магнитного поля 1000 G (Magnetic Fountain, Castle Rock, CO), были приложены к коже, оставив «мост» из кожи толщиной примерно 5,0 мм между двумя магнитами. Этот процесс создает давление сжатия 50 мм рт.ст. между двумя пластинами, что, как это было документально подтверждено, необходимо для локальной ишемии тканей (Peirce et al., 2000, Wound Repair Regen., Vol. 8, p. 68-76). Было проведено три цикла ишемии-реперфузии (I/R), чтобы вызвать образование 2 язв однородной степени тяжести. Единичный цикл I/R состоит из 12-часового периода наложения магнитов, начинающегося в 8:00 утра, с последующим периодом отдыха продолжительностью 12 часов без магнитов. Обработку носителем и тестируемыми соединениями начинали через 3 дня после окончания циклов I/R, чтобы сделать возможным хирургическое выскабливание язв, включающее удаление экссудата фибрина и некротической ткани.The experiment included control (C57BL6, albino) and genetically diabetic mice C57BL/KsJ-m +/+ Leprdb (db/db), Jackson laboratories, 8-10 weeks old. Under gas anesthesia, the backs of the animals were shaved and the shaved area thoroughly cleaned to prevent skin irritation. The skin fold was lifted and two magnetic ceramic discs, 12 mm in diameter and 5.0 mm thick, with an average weight of 2.4 g and a magnetic field strength of 1000 G (Magnetic Fountain, Castle Rock, CO), were applied to the skin, leaving " bridge” made of approximately 5.0 mm thick leather between two magnets. This process creates a compression pressure of 50 mmHg. between two plates, which has been documented as necessary for local tissue ischemia (Peirce et al., 2000, Wound Repair Regen., Vol. 8, p. 68-76). Three ischemia-reperfusion (I/R) cycles were performed to induce 2 ulcers of uniform severity. A single I/R cycle consists of a 12-hour magnet application period starting at 8:00 AM followed by a 12-hour magnet-free rest period. Treatment with vehicle and test compounds was started 3 days after the end of the I/R cycles to allow surgical curettage of the ulcers, including removal of fibrin exudate and necrotic tissue.
Некоторых мышей подвергали тестируемому лечению полипептидом SEQ ID NO: 4, который также может называться безболезненным рекомбинантным мутантным фактором роста нервов человека (hNGFp). Подробно исследованы следующие экспериментальные группы:Some mice were subjected to test treatment with the polypeptide of SEQ ID NO: 4, which may also be referred to as painless recombinant human nerve growth factor mutant (hNGFp). The following experimental groups have been studied in detail:
- db/db, носитель- db/db, media
- db/db, полипептид SEQ ID NO: 4, 1 мкг/см2/день- db/db, polypeptide SEQ ID NO: 4, 1 μg/cm 2 /day
- db/db, полипептид SEQ ID NO: 4, 10 мкг/см2/день- db/db, polypeptide SEQ ID NO: 4, 10 μg/cm 2 /day
- db/db, полипептид SEQ ID NO: 4, 100 мкг/см2/день.- db/db, polypeptide SEQ ID NO: 4, 100 μg/cm 2 /day.
Лечение(обработку) продолжали ежедневно в течение 14 дней подряд, а затем дважды в неделю до заживления в той же дозировке (дозировка рассчитывалась в зависимости от размера язвы на момент лечения). Пролежни контролировали визуальным осмотром для установления дня закрытия. Кроме того, были сделаны снимки пролежней, включающие измерительную линейку, и измерена площадь поражения с помощью компьютерного анализа изображений, в течение периода, когда пролежни обрабатывались лекарствами два раза в неделю. Оценка пролежней проводилась по стандартной шкале и путем измерения площади пролежней с помощью компьютерного анализа изображений.Treatment (treatment) was continued daily for 14 consecutive days, and then twice a week until healing at the same dosage (the dosage was calculated depending on the size of the ulcer at the time of treatment). Pressure ulcers were monitored by visual inspection to establish the day of closure. In addition, pictures of the bedsores were taken, including a ruler, and the area of the lesion was measured by computer image analysis, during the period when the bedsores were treated with drugs twice a week. Pressure ulcers were assessed using a standard scale and by measuring the area of pressure ulcers using computer image analysis.
Влияние соединения на болевой порог оценивали у свободно движущихся животных в месте травмы с помощью электронного прибора фон Фрея Bioseb, который позволяет определять порог механической болевой чувствительности у грызунов.The effect of the compound on the pain threshold was assessed in freely moving animals at the site of injury using an electronic von Frey Bioseb device, which allows determining the threshold of mechanical pain sensitivity in rodents.
Гистология поражения, иннервация и ангиогенез были проанализированы с помощью гистологии и иммуногистохимии, а также компьютерного анализа изображений.Lesion histology, innervation, and angiogenesis were analyzed using histology and immunohistochemistry, as well as computer image analysis.
Полученные результатыResults
Размещение магнитов на кожной складке на спине мышей с диабетом вызывало необратимое повреждение всей дермоэпидермальной ткани под местом сдавливания. Как визуальный осмотр (наличие некротической и геморрагической области), так и гистологический анализ подтвердили, что 3 цикла I/R были способны вызвать поражения, сходные с пролежнями.Placing magnets on a skin fold on the back of diabetic mice caused irreversible damage to the entire dermoepidermal tissue below the compressive site. Both visual examination (presence of a necrotic and hemorrhagic area) and histological analysis confirmed that 3 cycles of I/R were capable of producing pressure sore-like lesions.
Во всех группах, получавших полипептид SEQ ID NO: 4, скорость заживления ран была увеличена по сравнению с животными, получавшими носитель. Закрытие пролежней у животных, получавших полипептид SEQ ID NO: 4, было очевидным, начиная с 17 и 21 дня, тогда как животные, получавшие носитель, излечивались, начиная с 23 дня.In all groups treated with the polypeptide of SEQ ID NO: 4, the rate of wound healing was increased compared to animals treated with the carrier. Closing of bedsores in animals treated with the polypeptide of SEQ ID NO: 4 was evident from
На 28 день, в последний день наблюдения, у более чем 80% животных, получавших полипептид SEQ ID NO: 4, кожные пролежни полностью закрылись; как показано на Фиг. 25; по сравнению с животными, которым вводили носитель, эффект был статистически значимым при всех дозах полипептида SEQ ID NO: 4, тогда как вероятность заживления в первой группе составляла менее 60%. Эти данные согласуются с литературными данными, показывающими, что в животных моделях диабета скорость заживления ран нарушена, и вместе с данными, полученными на модели хирургической язвы (Пример 3), они предполагают, что полипептид SEQ ID NO: 4 может нормализовывать замедленный процесс заживления у мышей с диабетом.On
Помимо положительного воздействия на заживление ран, гистологические и иммуногистохимические данные предоставляют дополнительные доказательства того, что полипептид SEQ ID NO: 4 обладает биологической способностью улучшать степень заживления ран у мышей с диабетом с нарушенным заживлением. На гистологическом уровне в восстановленной области наблюдалась полная реэпителизация и восстановление нормальной анатомии кожи после обработки полипептидом SEQ ID NO: 4. Иммуногистохимия показала, что полипептид SEQ ID NO: 4 также положительно влияет на реиннервацию (как измерено иммунореактивностью PGP 9.5 в эпидермисе) и неоангиогенез (как измерено иммунореактивностью PECAM в дерме) (Фиг. 26 A и B).In addition to the positive effect on wound healing, histological and immunohistochemical data provide additional evidence that the polypeptide of SEQ ID NO: 4 has a biological ability to improve the degree of wound healing in diabetic mice with impaired healing. At the histological level, the repaired area showed complete re-epithelialization and restoration of normal skin anatomy after treatment with the polypeptide of SEQ ID NO: 4. Immunohistochemistry showed that the polypeptide of SEQ ID NO: 4 also had a positive effect on reinnervation (as measured by PGP 9.5 immunoreactivity in the epidermis) and neoangiogenesis ( as measured by PECAM immunoreactivity in the dermis) (FIGS. 26 A and B).
Поскольку сообщалось, что NGF дикого типа увеличивает болевую чувствительность в месте введения, порог механической боли оценивали через 14 дней подряд лечения полипептидом SEQ ID NO: 4 путем наложения механического стимула на границе пролежней. Никаких изменений болевого механического порога не наблюдалось по сравнению с диабетическими мышами, получавшими носитель, что позволяет предположить, что полипептид SEQ ID NO: 4 после хронического местного лечения может оказывать положительное трофическое действие на кожу в большом интервале доз, не вызывая сенсибилизации ноцицепторов ( Фиг.27).Since wild-type NGF has been reported to increase pain sensitivity at the injection site, mechanical pain threshold was assessed after 14 consecutive days of treatment with the polypeptide of SEQ ID NO: 4 by applying a mechanical stimulus at the pressure ulcer margin. No changes in pain mechanical threshold were observed compared to vehicle-treated diabetic mice, suggesting that the SEQ ID NO: 4 polypeptide after chronic topical treatment may have a positive trophic effect on the skin over a wide dose range without causing nociceptor sensitization (Fig. 27).
Пример 5: Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование для изучения безопасности, переносимости, фармакокинетических и фармакодинамических профилей полипептида SEQ ID NO: 4 после однократного и многократного увеличения доз у субъектов с диабетическими нейропатическими язвами стопы (DFU)Example 5: Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Study to Study the Safety, Tolerability, Pharmacokinetic, and Pharmacodynamic Profiles of the Polypeptide of SEQ ID NO: 4 after Single and Multiple Dose Escalations in Subjects with Diabetic Neuropathic Foot Ulcers (DFU)
В настоящем документе сообщается об исследовании введения полипептида SEQ ID NO: 4 в однократных и многократных возрастающих дозах участникам с диабетическими нейропатическими язвами стопы (DFU). Участниками были люди.This document reports a study on the administration of a polypeptide of SEQ ID NO: 4 at single and multiple escalating doses to participants with diabetic neuropathic foot ulcers (DFU). The participants were people.
Исследование, описанное в этом примере, было этически одобрено соответствующими органами.The study described in this example has been ethically approved by the relevant authorities.
Полипептид SEQ ID NO: 4 можно также называть рекомбинантным мутантным человеческим безболезненным фактором роста нервов (hNGFp). Полипептид SEQ ID NO: 4 альтернативно называют «РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР РОСТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО НЕРВА (RHNGF)» или «SUB77552», а полная молекулярная формула такового представляет собой C580H895N163O176S8. Полипептид SEQ ID NO: 4 может быть биологического/биотехнологического происхождения (кроме Advanced Therapy IMP (ATIMP). Это рекомбинантный лекарственный продукт (см. также Пример 1). В частности, полипептид SEQ ID NO: 4 можно получить экспрессией такового, как описано в Примере 1, и очисткой, как описано в Примере 2. В частности, высокая чистота такового, которую можно достигнуть, как описано в Примере 2, предпочтительно в соответствии со стандартами GMP, позволяет использовать полипептид SEQ ID NO: 4 в качестве лекарственного средства.The polypeptide of SEQ ID NO: 4 may also be referred to as recombinant mutant human painless nerve growth factor (hNGFp). The polypeptide of SEQ ID NO: 4 is alternatively referred to as "RECOMBINANT HUMAN NERVE GROWTH FACTOR (RHNGF)" or "SUB77552" and the full molecular formula of the same is C580H895N163O176S8. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 may be of biological/biotechnological origin (except Advanced Therapy IMP (ATIMP). This is a recombinant drug product (see also Example 1). In particular, the polypeptide of SEQ ID NO: 4 can be obtained by expression as described in Example 1, and purification as described in Example 2. In particular, the high purity that can be achieved as described in Example 2, preferably in accordance with GMP standards, allows the use of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 as a drug.
В данном примере полипептид SEQ ID NO: 4 представляет собой исследуемый лекарственный препарат (Investigational Medicinal Product (IMP)). Согласно Директиве 2001/20/EC, «IMP» - это «фармацевтическая форма активного вещества или плацебо, тестируемая или используемая в качестве эталона в клинических исследованиях, включая продукты, уже имеющие разрешение на продажу, но используемые или собранные (сформулированные или упакованые) способом, отличным от авторизованной формы, или при использовании для неавторизованного применения, или если используется для получения дополнительной информации о авторизованной форме». В данном случае полипептид SEQ ID NO: 4 представляет собой IMP для использования в первом клиническом испытании на людях. Таким образом, этот пример описывает первое клиническое испытание на людях. Факторов риска в соответствии с руководством по «первому применению на людях» выявлено не было.In this example, the polypeptide of SEQ ID NO: 4 is an investigational drug (Investigational Medicinal Product (IMP)). According to Directive 2001/20/EC, "IMP" is "a pharmaceutical form of the active substance or placebo tested or used as a reference in clinical trials, including products already marketed but used or assembled (formulated or packaged) in a manner other than the authorized form, or when used for unauthorized use, or when used to obtain additional information about an authorized form." In this case, the polypeptide of SEQ ID NO: 4 is an IMP for use in the first human clinical trial. Thus, this example describes the first human clinical trial. No risk factors were identified according to the "first use in humans" guidelines.
IMP, используемый в этом примере, представляет собой прозрачный бесцветный раствор hNGFp, приготовленный с концентрацией 1 мг/мл полипептида SEQ ID NO: 4. Полипептид SEQ ID NO: 4 доводят до желаемой концентрации и заполняют таковым стеклянный флакон. Концентрация раствора - 1 мг/мл.The IMP used in this example is a clear, colorless solution of hNGFp prepared at a concentration of 1 mg/ml of the polypeptide of SEQ ID NO: 4. The polypeptide of SEQ ID NO: 4 is adjusted to the desired concentration and filled into a glass vial. Solution concentration - 1 mg/ml.
Полипептид SEQ ID NO: 4 вводят людям, нуждающимся в этом. Указанный полипептид SEQ ID NO: 4 вводят в виде кожного раствора. Таковой не является специальным педиатрическим составом.The polypeptide of SEQ ID NO: 4 is administered to people in need thereof. The specified polypeptide of SEQ ID NO: 4 is administered as a skin solution. This is not a special pediatric formulation.
Люди, нуждающиеся в введении полипептида SEQ ID NO: 4, являются субъектами с диабетическими нейропатическими язвами стопы (DFU). Факторов риска согласно руководству о «первом применении на человеке» не выявлено.Humans in need of administration of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 are subjects with diabetic neuropathic foot ulcers (DFU). No risk factors have been identified according to the "first use in human" guidelines.
Полипептид SEQ ID NO: 4 вводят местно (наружно). Таким образом, полипептид SEQ ID NO: 4 предназначен для местного применения (не в настоящее время).The polypeptide of SEQ ID NO: 4 is administered topically (externally). Thus, the polypeptide of SEQ ID NO: 4 is intended for topical use (not currently).
Полипептид SEQ ID NO: 4 вводят в общей дозе от 0,3 до 6 мкг/мм2. «мм2» относится к области язвы. Указанное количество (в мкг) относится к количеству полипептида, которое вводится в день.The polypeptide of SEQ ID NO: 4 is administered at a total dose of 0.3 to 6 μg/mm 2 . "mm 2 " refers to the area of the ulcer. The indicated amount (in µg) refers to the amount of polypeptide that is administered per day.
Полипептид SEQ ID NO: 4 вводят два раза в день в течение 14 дней подряд. После этого прием прекращают.The polypeptide of SEQ ID NO: 4 was administered twice a day for 14 consecutive days. After that, the reception is stopped.
В этом исследовании присутствует плацебо. Плацебо обозначается как PL1. Плацебо является кожным раствором. Плацебо предназначено для местного применения (не в настоящее время). Плацебо представляет собой плацебо по полипептиду SEQ ID NO: 4 (PR1). В остальном плацебо идентично IMP (PR1). Плацебо вводят идентично полипептиду SEQ ID NO: 4.There is a placebo in this study. The placebo is designated as PL1. The placebo is a skin solution. The placebo is for topical use (not currently). The placebo is a placebo according to the polypeptide of SEQ ID NO: 4 (PR1). Otherwise placebo is identical to IMP (PR1). The placebo is administered identically to the polypeptide of SEQ ID NO: 4.
PR1 и плацебо 1 подготовлены для исследования в Klifo A/S, Smedeland 36, 2600 Glostrup, Denmark.PR1 and
В данном исследовании нет другого (сравнительного) лекарственного средства.There is no other (comparative) drug in this study.
Субъекты, участвующие в этом исследовании, страдают, поражены или предрасположены к заболеванию, которое представляет собой заболевание кожи и соединительной ткани. В частности, в этом исследовании участвуют субъекты, страдающие диабетической нейропатической язвой стопы (DFU). Язва диабетической стопы - серьезное осложнение сахарного диабета, незаживающая или плохо заживающая полнослойная рана, поражающая дерму ниже лодыжки у человека с диабетом.Subjects participating in this study suffer from, are affected by, or are predisposed to a disease, which is a disease of the skin and connective tissue. In particular, subjects suffering from diabetic neuropathic foot ulcer (DFU) participate in this study. A diabetic foot ulcer is a serious complication of diabetes mellitus, a non-healing or poorly healing full-thickness wound that affects the dermis below the ankle in a person with diabetes.
Для данного исследования был образован независимый комитет по мониторингу данных.An independent data monitoring committee was formed for this study.
Первоначальная оценка продолжительности испытания - 2 года 1 месяц.The initial estimate of the trial duration is 2
Планируемое количество субъектов - 92 (из них 60 в возрастном диапазоне 18-64 года; 32 из которых в возрастном диапазоне 65 лет и старше). Группа испытуемых состоит из пациентов и не включает здоровых добровольцев. Включены конкретные уязвимые группы населения.The planned number of subjects is 92 (of which 60 are in the age range of 18-64 years; 32 of which are in the age range of 65 years and older). The study group consists of patients and does not include healthy volunteers. Specific vulnerable populations included.
Лечение или уход после того, как субъект завершил свое участие в исследовании, представляет собой стандартное лечение.Treatment or care after the subject has completed their participation in the study is standard care.
Получено одобрение властей по вопросам этики. Выдано положительное заключение.Ethics approval obtained. A positive conclusion was issued.
Цель исследования:Purpose of the study:
Основная цель: оценить безопасность и переносимость полипептида SEQ ID NO: 4 у субъектов с DFU при одно- и многодневном местном дозировании.Primary Objective: To evaluate the safety and tolerability of the SEQ ID NO: 4 polypeptide in DFU subjects at single and multi-day topical dosing.
Вторичные цели:Secondary Goals:
(a) Оценить фармакокинетический профиль системно доступного лекарственного средства после одно- и многодневного местного введения полипептида SEQ ID NO: 4 у субъектов с DFU;(a) Assess the pharmacokinetic profile of a systemically available drug after one- and many-day topical administration of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 in subjects with DFU;
(b) Оценить фармакодинамические эффекты многодневного местного дозирования полипептида SEQ ID NO: 4 на заживление DFU в течение 12-недельного периода.(b) To evaluate the pharmacodynamic effects of multi-day topical dosing of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 on DFU healing over a 12 week period.
Дополнительных исследований не проводилось.No additional studies have been conducted.
Основные критерии включения:Main inclusion criteria:
Часть 1 SD и Часть 2 MD:
Субъекты должны соответствовать всем следующим критериям для получения права на участие в исследовании:Subjects must meet all of the following criteria to be eligible to participate in the study:
1. Письменное информированное согласие субъекта, полученное до любой процедуры, связанной с исследованием;1. Written informed consent of the subject obtained prior to any study-related procedure;
2. Субъект мужского или женского пола в возрасте от 18 до 80 лет (включительно) с диагнозом сахарный диабет I или II типа с гликозилированным гемоглобином (HbA1c) ≤10%.2. Male or female subject aged 18 to 80 years (inclusive) diagnosed with type I or II diabetes mellitus with glycosylated hemoglobin (HbA1c) ≤10%.
3. Субъекты женского пола, не способные к деторождению (WONCBP): -женщины должны сообщить о хирургической стерилизации (проведенной не менее чем за 6 месяцев до скрининга) или - менопаузе (не должно быть регулярных менструальных кровотечений в течение как минимум одного года до скрининга, возраст ≥45 лет и уровень ФСГ при скрининге ≥40 мМЕ/мл).3. Female subjects of childbearing potential (WONCBP): - females must report surgical sterilization (performed at least 6 months prior to screening) or - menopause (must have had no regular menstrual bleeding for at least one year prior to screening , age ≥45 years, and FSH levels at screening ≥40 mIU/mL).
4. Субъекты женского пола с детородным потенциалом (WOCBP): женщины должны использовать один или несколько из следующих надежных методов контрацепции в течение периода исследования и, по крайней мере, в течение 90 дней после последнего введения исследуемого препарата, таких как: a) установка внутриматочной спирали (ВМС) или внутриматочная система (ВМС); b) гормональная контрацепция (имплантируемая, пластырь, оральная); c) барьерные методы контрацепции: презерватив или закрывающий колпачок (диафрагма или шейные своды/колпачки) со спермицидной пеной/гелем/пленкой/кремом/суппозиторием; d) стерилизация партнера-мужчины (с соответствующей документацией после вазектомии об отсутствии сперматозоидов в эякуляте).4. Female Subjects of Childbearing Potential (WOCBP): Women must use one or more of the following reliable methods of contraception during the study period and for at least 90 days after the last administration of study drug, such as: a) insertion of an intrauterine device spirals (IUD) or intrauterine system (IUD); b) hormonal contraception (implantable, patch, oral); c) barrier methods of contraception: condom or closure cap (diaphragm or cervical vaults/caps) with spermicidal foam/gel/film/cream/suppository; d) sterilization of the male partner (with appropriate documentation after vasectomy of the absence of spermatozoa in the ejaculate).
5. Субъекты мужского пола должны использовать два эффективных метода контрацепции в течение всего периода исследования и не сдавать сперму в течение 90 дней после последнего введения исследуемого препарата.5. Male subjects must use two effective methods of contraception throughout the study period and not donate semen for 90 days after the last administration of study drug.
6. Наличие хотя бы одной язвы диабетической стопы, отвечающей следующим критериям:6. Presence of at least one diabetic foot ulcer that meets the following criteria:
а) Установлен диагноз полнослойной нейропатической DFU, расположенной на лодыжке или дистальнее от нее (за исключением язв между пальцами ног, но включая язвы на пятке).a) Diagnosed with full-thickness neuropathic DFU located at or distal to the ankle (excluding ulcers between the toes, but including ulcers on the heel).
b) SD: язва присутствует от 6 недель до 12 месяцев и имеет площадь 3-5 см2 после иссечения язвы, подтверждается при скрининге.b) SD: The ulcer is present for 6 weeks to 12 months and has an area of 3-5 cm 2 after excision of the ulcer, confirmed by screening.
MD: язва присутствует от 6 недель до 12 месяцев и имеет площадь 3-5 см2 после иссечения язвы, подтверждается при скрининге после 2-недельного подготовительного периода.MD: The ulcer is present for 6 weeks to 12 months and has an area of 3-5 cm 2 after excision of the ulcer, confirmed at screening after a 2-week preparatory period.
c) Минимальное расстояние в 2 см между язвой, подходящей для исследования, и любыми другими язвами на указанной стопе.c) A minimum distance of 2 cm between an ulcer suitable for examination and any other ulcers on the specified foot.
d) Глубина ≥5 мм и степень 1А в соответствии с «Системой стадирования язв диабетической стопы Техасского университета» (22) ("The University of Texas Staging System for Diabetic Foot Ulcers" (22)), без обнаженных капсул, сухожилий или костей, а также без туннелей, подрывов или пазух, обнаруживаемых после первоначального иссечения язвы.d) Depth ≥5 mm and Grade 1A according to The University of Texas Staging System for Diabetic Foot Ulcers (22) with no exposed capsules, tendons or bones, and without tunnels, ruptures, or sinuses found after initial excision of the ulcer.
7. Субъект должен иметь возможность удерживать целевую язву в таком положении и ориентации, чтобы исследуемое лекарство можно было применять без значительной потери вещества из-за стекания, пока не будет наложена повязка.7. The subject must be able to hold the target ulcer in such a position and orientation that the investigational drug can be applied without significant loss of substance due to runoff until a dressing is applied.
8. Адекватная перфузия сосудов пораженной конечности, продемонстрированная в течение 30 дней до скрининга, что определяется по крайней мере одним из следующих критериев:8. Adequate vascular perfusion of the affected limb, demonstrated within 30 days prior to screening, as determined by at least one of the following criteria:
a) Лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ)≥0,9 и ≤1,2, подтвержденный путем чрескожного парциального давления кислорода (TcPO2)> 50 мм рт.a) Ankle-brachial index (ABI) ≥0.9 and ≤1.2, confirmed by transcutaneous oxygen partial pressure (TcPO2) > 50 mmHg.
b) Давление на пальцах ног (плетизмография)> 50 мм рт.b) Toe pressure (plethysmography) > 50 mmHg.
c) Допплеровское ультразвуковое исследование (двухфазные или трехфазные волны) не менее двух сосудов на лодыжке, где результат соответствует адекватному кровотоку к пораженной конечности, как определено SoC.c) Doppler ultrasound (biphasic or triphasic) of at least two vessels in the ankle, where the result is consistent with adequate blood flow to the affected limb, as determined by SoC.
Основные критерии исключения:Main exclusion criteria:
Часть 1 SD и Часть 2 MD:
Субъекты не должны соответствовать ни одному из следующих критериев для получения права участия в эксперименте:Subjects must not meet any of the following criteria to be eligible to participate in the experiment:
1. Только для субъектов женского пола: беременность, подтвержденная положительным результатом сывороточного теста на беременность при скрининге и анализом мочи, проведенным в День-1 или кормление грудью.1. For female subjects only: Pregnancy confirmed by a positive serum pregnancy test result at screening and urinalysis performed on Day-1 or breastfeeding.
2. У субъекта имеется:2. The subject has:
a) Язва(ы), сопровождающаяся инфицированным целлюлитом, остеомиелитом или клиническими признаками или симптомами инфекции в соответствии с рекомендациями Общества по инфекционным заболеваниям Америки (IDSA) (19) (Infectious Diseases Society of the America's Guidelines (IDSA) (19).a) Ulcer(s) with infected cellulitis, osteomyelitis, or clinical signs or symptoms of infection as recommended by the Infectious Diseases Society of the America's Guidelines (IDSA) (19).
b) Гангрена или некроз любой части пораженной конечности.b) Gangrene or necrosis of any part of the affected limb.
c) Активная или хроническая стопа Шарко на исследуемой конечности.c) Active or chronic Charcot foot on the limb under study.
d) Запланированная сосудистая хирургия, ангиопластика, тромболизис или процедура реваскуляризации, выполненная в течение 1 месяца до включения в исследование.d) Planned vascular surgery, angioplasty, thrombolysis, or revascularization procedure performed within 1 month prior to enrollment in the study.
e) Язвы с обнажением сухожилия, кости или суставной капсулы (допустимо наличие язв, распространяющихся через дерму и подкожную ткань с наличием грануляционной ткани).e) Ulcers with exposure of the tendon, bone or joint capsule (ulcers extending through the dermis and subcutaneous tissue with granulation tissue are acceptable).
f) Язва(ы) недиабетической этиологии.f) Ulcer(s) of non-diabetic etiology.
g) Предыдущие обширные ампутации той же целевой стопы.g) Previous major amputations of the same target foot.
h) Фактическая или недавняя (3 недели) терапия антибиотиками по любой причине.h) Current or recent (3 weeks) antibiotic therapy for any reason.
i) а также прикованные к постели субъекты или субъекты с ожидаемой продолжительностью жизни менее одного года.i) as well as bedridden subjects or subjects with a life expectancy of less than one year.
3. Использование любой другой терапии факторами роста в течение 6 месяцев до скрининга.3. Use of any other growth factor therapy within 6 months prior to screening.
4. Злокачественные новообразования в анамнезе за 5 лет до скрининга или лица с выраженным семейным анамнезом рака (например, семейные раковые заболевания), за исключением плоскоклеточного или базально-клеточного рака кожи, который был успешно излечен.4. History of malignancy in the 5 years prior to screening, or individuals with a strong family history of cancer (eg, familial cancers), excluding squamous cell or basal cell skin cancer that has been successfully treated.
5. Клинически значимое сердечно-сосудистое, легочное, почечное, эндокринное, печеночное, неврологическое, психиатрическое, иммунологическое, желудочно-кишечное, гематологическое или метаболическое заболевание, которое, по мнению исследователя, не может быть стабилизировано или может иным образом повлиять на безопасность субъекта или результаты исследования (в случае сомнений следует проконсультироваться с врачом по клиническим исследованиям, назначаемым спонсором).5. Clinically significant cardiovascular, pulmonary, renal, endocrine, hepatic, neurological, psychiatric, immunological, gastrointestinal, hematological, or metabolic disease which, in the opinion of the Investigator, cannot be stabilized or may otherwise affect the safety of the subject or results of the study (in case of doubt, the doctor of the clinical trial appointed by the sponsor should be consulted).
6. Субъект, находящийся на гемодиализе или перитонеальном диализе, или с хронической почечной недостаточностью (креатинин плазмы > 2 мг/дл).6. Subject on hemodialysis or peritoneal dialysis, or with chronic renal failure (plasma creatinine > 2 mg/dL).
7. Субъект со значительно отклоняющимися от нормы ключевыми лабораторными параметрами, влияющими на безопасность пациента в соответствии с оценкой PI.7. Subject with significantly abnormal key laboratory parameters affecting patient safety as assessed by PI.
Объем исследований/части исследования:Scope of studies / parts of the study:
Исследование состоит из двух частей:The study consists of two parts:
- Часть 1 SD - однократная возрастающая доза-
- Часть 2 МД - многократная возрастающая доза-
Дозировки:Dosages:
SD: 0,3, 1, 3 и 6 мкг/мм2 SD: 0.3, 1, 3 and 6 µg/ mm2
MD: 1 и 3 мкг/мм2 MD: 1 and 3 µg/ mm2
Конечные точки эксперимента:Endpoints of the experiment:
Первичная конечная точка:Primary Endpoint:
Часть 1 SD:
Безопасность:Safety:
Нежелательные явления (AE) и нежелательные реакции на лекарства (ADR)Adverse Events (AE) and Adverse Drug Reactions (ADR)
Показатели жизнедеятельности: систолическое (SBP) и диастолическое (DBP) артериальное давление.Vital signs: systolic (SBP) and diastolic (DBP) blood pressure.
Параметры ЭКГ в 12 отведениях, полученные по Холтеру (HR, PR, QRS, QTcF, QT)12-Lead Holter ECG Parameters (HR, PR, QRS, QTcF, QT)
Клинические лабораторные исследования (химия, гематологию и анализ мочи).Clinical laboratory studies (chemistry, hematology and urinalysis).
Часть 2 МД:
Безопасность:Safety:
AE и ADR;AE and ADR;
Показатели жизнедеятельности: SBP, DBP; температура;Vital Signs: SBP, DBP; temperature;
Трехкратная ЭКГ в 12 отведениях;Triple ECG in 12 leads;
(В случае если какие-либо данные ЭКГ/сердечно-сосудистой системы проявятся в Части 1 исследования, SAC может также применить мониторинг по Холтеру для части или всей Части 2, как указано);(In the event that any ECG/cardiovascular findings appear in
Параметры ЭКГ в 12 отведениях, полученные по Холтеру (ЧСС, PR, QRS, QTcF, QT);12-lead ECG parameters obtained by Holter (HR, PR, QRS, QTcF, QT);
Отклонения от нормы на 24-часовой холтеровской ЭКГ (общие паузы > 2,5 секунд, фибрилляция предсердий и трепетание предсердий, желудочковые запуски, преждевременные сокращения предсердий (PAC), преждевременные сокращения желудочков (PVC), аберрантная морфология); частота сердечных сокращений 0-24 часа (по 24-часовой холтеровской ЭКГ) и среднечасовая ЧСС;Abnormalities on 24-hour Holter ECG (general pauses > 2.5 seconds, atrial fibrillation and atrial flutter, ventricular starts, premature atrial contractions (PAC), premature ventricular contractions (PVC), aberrant morphology); heart rate 0-24 hours (according to 24-hour Holter ECG) and average hourly heart rate;
Клинические лабораторные исследования (химия, гематология и анализ мочи).Clinical laboratory studies (chemistry, hematology and urinalysis).
Временные точки(ы) времени для характеристики этой конечной точки эксперимента: указаны выше.Time point(s) of time to characterize this end point of the experiment: indicated above.
Вторичная конечная точка:Secondary Endpoint:
Часть 1 SD:
Фармакокинетические (PK) переменные:Pharmacokinetic (PK) variables:
Следующие параметры PK будут получены на основе сывороточных концентраций полипептида SEQ ID NO: 4:The following PK parameters will be derived based on serum concentrations of the polypeptide of SEQ ID NO: 4:
AUC 0-12 ч, AUC00-24ч, AUC0-t, AUC0-∞, Cmax, tmax, t½, CL/F, Vd/F;AUC 0-12h, AUC00-24h, AUC0-t, AUC0-∞, Cmax, tmax, t½, CL/F, Vd/F;
AUC 0-12h DN, AUC00-24h DN, AUC0-t DN, AUC0-∞ DN, Cmax DN.AUC 0-12h DN, AUC00-24h DN, AUC0-t DN, AUC0-∞ DN, Cmax DN.
Переменные параметры иммуногенности: ADA CtImmunogenicity variables: ADA Ct
Часть 2 МД:
Фармакокинетические (PK) переменные:Pharmacokinetic (PK) variables:
Следующие параметры PK будут получены из сывороточных концентраций полипептида SEQ ID NO: 4:The following PK parameters will be derived from serum concentrations of the polypeptide of SEQ ID NO: 4:
В день 1: AUC 0-12 ч, Cmax и tmax;Day 1: AUC 0-12 h, Cmax and tmax;
Со 2 по 13 день: Ctrough
В последний день приема препарата (День 14): AUC 0-12 ч, AUC0-t, AUC0-∞, Ctrough, Cmax , Cmin, tmax, tmin, Cav и Rac, t½, CL/F, и Vd/F.Last day of dosing (Day 14): AUC 0-12 h, AUC0-t, AUC0-∞, Ctrough, Cmax , Cmin, tmax, tmin, Cav and Rac, t½, CL/F, and Vd/F.
Переменные параметры иммуногенности:Variable parameters of immunogenicity:
Концентрации антилекарственных антител (ADA) в сыворотке крови будут оцениваться в День 1 до введения первой дозы, в День 15 перед выпиской, в День 24 (4-я неделя), в День 52-й (8-я неделя) и 80-й день (12-я неделя).Serum anti-drug antibody (ADA) concentrations will be assessed on
CtCt
Переменные фармакодинамики/эффективности:Pharmacodynamic/Efficacy Variables:
Среднее уменьшение площади и объема целевой язвы от исходного уровня до D14, D21, D28, D56 и D84;Mean reduction in target ulcer area and volume from baseline to D14, D21, D28, D56, and D84;
Время до заживления целевой области и объема язвы. Излечение будет определяться как «полное выздоровление». Также будут применяться различные определения «излечения» (частичная редукция: 50%, 66%, 75%).Time to healing of the target area and ulcer volume. Cure will be defined as "complete recovery". Different definitions of "cure" will also apply (partial reduction: 50%, 66%, 75%).
Временные точки оценки данной конечной точки эксперимента: указаны выше.Time points for evaluation of this end point of the experiment: as above.
Разовая возрастающая доза (SAD) осуществляется в следующих дозировках: Когорта A: 0,3 мкг/мм2; Когорта B: 1 мкг/мм2; Когорта СА: 3 мкг/мм2; Когорта D: 6 мкг/мм2. Каждая когорта состоит из субъектов с нативной последовательностью SEQ ID NO: 4, чтобы избежать возможности переноса эффектов между когортами. Это особенно важно в отношении гипералгезии, известной для человеческого NGF дикого типа. При необходимости уровни доз корректируются, и при необходимости для достижения целей исследования могут быть включены периоды вымывания.Single incremental dose (SAD) is carried out at the following dosages: Cohort A: 0.3 μg/mm 2 ; Cohort B: 1 µg/mm 2 ; CA cohort: 3 µg/mm 2 ; Cohort D: 6 µg/mm 2 . Each cohort consists of subjects with a native sequence of SEQ ID NO: 4 to avoid the possibility of transferring effects between cohorts. This is especially important in relation to the hyperalgesia known for wild-type human NGF. Dose levels are adjusted as necessary, and washout periods may be included as necessary to achieve study objectives.
При однократной возрастающей дозе (single ascending dose, SAD) стандарт лечения (Standard of Care, SOC) применялся при скрининге и при каждом последующем посещении до конца периода наблюдения, если не произошла полная реэпителизация/заживление, сохраняющаяся в течение 2 последовательных посещений. В этом случае SoC можно было бы прекратить, а ногу субъекта лечить в соответствии с оценкой/решением исследователя. SoC состоял из следующих процедур:At single ascending dose (SAD), Standard of Care (SOC) was applied at screening and at each subsequent visit until the end of the follow-up period unless complete re-epithelialization/healing persisted for 2 consecutive visits. In this case, the SoC could be terminated and the subject's leg treated according to the investigator's judgment/decision. SoC consisted of the following procedures:
обработка целевой язвы (любое возможное кровотечение, вызванное обработкой раны, контролировалось только путем сжатия и подъема ноги),treatment of the target ulcer (any possible bleeding caused by the treatment of the wound was controlled only by squeezing and raising the leg),
перевязка поражения парафиновой марлей и наложение защитной повязки из стерильных марлевых салфеток,dressing the lesion with paraffin gauze and applying a protective dressing from sterile gauze wipes,
использование разгрузочных съемных ходунков (не снимаемых в течение периода наблюдения) после перевязки.use of unloading removable walkers (not removed during the observation period) after dressing.
В случае инфицирования очага во время исследования, из очага должен был быть взят образец для микробиологического посева, и субъекту была назначена системная эмпирическая антибактериальная терапия в соответствии с решением исследователя, который должен скорректировать терапию в соответствии с результатом исследования культуры. Каждая инфекция, особенно тяжелая, должна быть оценена на предмет серьезности в соответствии с ее интенсивностью.In the event of a lesion becoming infected during the study, a sample for microbiological culture was to be taken from the lesion and systemic empiric antibiotic therapy was administered to the subject, as determined by the investigator, who should adjust therapy according to the result of the culture study. Every infection, especially a severe one, should be assessed for severity according to its intensity.
При множественной возрастающей дозе (multiple ascending dose, MAD), исследование проводится последовательно в двух когортах, каждая с нативными субъектами. Целевые уровни суточной дозы составляют 1 мкг/мм2 и 3 мкг/мм2 для полипептида SEQ ID NO: 4 (20) или плацебо (10). После скрининга подходящие субъекты проходят лечение в соответствии со стандартом лечения (SOC; вводный период); регистрация подтверждается после измерения размера язвы. Если в течение этого подготовительного периода площадь язвы уменьшится на 50% или более, пациенты не будут включены в исследование.With multiple ascending dose (MAD), the study is conducted sequentially in two cohorts, each with native subjects. Target daily dose levels are 1 μg/mm 2 and 3 μg/mm 2 for polypeptide SEQ ID NO: 4 (20) or placebo (10). After screening, eligible subjects are treated according to standard of care (SOC; lead-in period); registration is confirmed after measuring the size of the ulcer. If the ulcer area decreases by 50% or more during this preparatory period, patients will not be included in the study.
Объем исследования: Scope of study :
Определение безопасности, фармакокинетики, фармакодинамики и других (переносимости) IMP у человека.Determination of safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics and other (tolerability) IMPs in humans.
Результатыresults
Однократная возрастающая доза (SOC)Single incremental dose (SOC)
Однократная возрастающая доза (SAD) применялась в четырех последовательных когортах в следующих дозировках: Когорта A: 0,3 мкг/мм2; Когорта B: 1 мкг/мм2; Когорта СА: 3 мкг/мм2; Когорта D: 6 мкг/мм2, сверх стандартного лечения. Во всех этих когортах количественно определяемые уровни полипептида SEQ ID NO: 4 обнаруживались в системном кровотоке соответствующих субъектов. Таким образом, введенный полипептид присутствует в организме субъектов после введения.Single dose incremental dose (SAD) was used in four consecutive cohorts at the following dosages: Cohort A: 0.3 μg/mm 2 ; Cohort B: 1 µg/mm 2 ; CA cohort: 3 µg/mm 2 ; Cohort D: 6 µg/mm 2 above standard treatment. In all of these cohorts, quantifiable levels of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 were detected in the systemic circulation of the respective subjects. Thus, the administered polypeptide is present in the subjects after administration.
Субъектов наблюдали на предмет нежелательных явлений в течение 28 дней после введения препарата в разовой дозе. Никаких нежелательных явлений, связанных с введением полипептида SEQ ID NO: 4 не наблюдалось. Таким образом, введение полипептида SEQ ID NO: 4 не было связано с какой-либо наблюдаемой нежелательной реакцией на лекарство. В результате отсутствия побочных реакций на лекарства можно сделать вывод, что полипептид SEQ ID NO: 4 безопасен и хорошо переносится человеком.Subjects were monitored for adverse events for 28 days following single dose administration. No adverse events associated with the administration of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 were observed. Thus, administration of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 was not associated with any observed adverse drug reaction. As a result of the absence of adverse drug reactions, it can be concluded that the polypeptide of SEQ ID NO: 4 is safe and well tolerated by humans.
Перспективыprospects
Биологическая активность полипептида SEQ ID NO: 4 проистекает из его способности стимулировать рост, а также обеспечивать поддержание, пролиферацию и выживание клеток, особенно нервных клеток.The biological activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 stems from its ability to stimulate growth, as well as to ensure the maintenance, proliferation and survival of cells, especially nerve cells.
В результате этого примера исследуются и подтверждаются профили безопасности, переносимости, фармакокинетики и фармакодинамики полипептида SEQ ID NO: 4 после введения однократных и многократных доз человеку.As a result of this example, the profiles of safety, tolerability, pharmacokinetics and pharmacodynamics of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 are investigated and confirmed after administration of single and multiple doses to a person.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фиг. 1. Схема процесса согласно Примеру 2, включающая модиикации (оптимизации), описанные в Примере 2B. Fig. 1. Process scheme according to Example 2, including modifications (optimizations) described in Example 2B.
Фиг. 2. ТЕСТ НА УДЛИНЕНИЕ НЕЙРИТА Fig. 2. NEURITE EXTENSION TEST IN VITROIN VITRO PC12. PC12.
Иллюстрация средней длины нейрита (A; средняя длина в лунке), общей длины нейрита (B; средняя общая длина на клетку) и процента клеток, у которых длина нейрита превышает длину тела клетки (C).Illustration of mean neurite length (A; mean length per well), total neurite length (B; mean total length per cell), and percentage of cells whose neurite length exceeds cell body length (C).
Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с последующим апостериорным методом Тьюки по сравнению с группой, обработанной носителем (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001)Bars represent the mean ± standard error of the mean. Statistical analysis: One-way ANOVA followed by Tukey's post hoc method compared to vehicle-treated group (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТАFig. 3. EFFICACY STUDY, 8-DAY COHORT
Уровни глюкозы в крови у мышей db/db, измеренные во время взятия биопсии кожи. Никаких различий между животными, отнесенными к разным экспериментальным группам, не наблюдалось.Blood glucose levels in db/db mice measured during skin biopsy. No differences were observed between animals assigned to different experimental groups.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 4. EFFICACY STUDY, 8-DAY COHORT.
Увеличение массы тела за время эксперимента (День 0 и День 7 после поражения кожи).Weight gain during the experiment (
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 5. EFFICACY STUDY, 8-DAY COHORT.
Термальное пороговое значение. Задержка отдергивания лапы при подошвенном тесте, проведенном в Дни-3 и 7 после биопсии кожи и введения NGF. Данные представлены как среднее+SEM. Статистический анализ выполнен по критерию Стьюдента, *p <0,05.Thermal threshold. Delayed paw withdrawal on a plantar test performed on
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 6. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 6. EFFICACY STUDY, 8-DAY COHORT.
«Время до заживления» измеряется как внешняя и внутренняя площадь язвы (подробности см. в отчете пилотного исследования) до 8 дня после биопсии кожи. Результаты выражаются в процентах от пораженной области в День 0; данные представлены как среднее значение+SEM. См. текст для двустороннего статистического анализа ANOVA."Time to heal" is measured as the outer and inner area of the ulcer (see the pilot study report for details) up to day 8 after skin biopsy. Results are expressed as a percentage of the affected area on
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 7. EFFICACY STUDY, 8-DAY COHORT.
Время до заживления язвы (наружная область) на 8-й День, выраженное как процент закрытия язвы по сравнению с Днем 0. Данные представлены как среднее значение+SEM.Time to ulcer healing (outer area) on Day 8, expressed as percentage of ulcer closure compared to
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 8. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 8-ДНЕВНАЯ КОГОРТАFig. 8. EFFICACY STUDY, 8-DAY COHORT
Уровни NGF в плазме при умерщвлении. Данные представляют собой среднее значение+SEM; Статистический анализ: односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета. * р <0,05, ** р <0,01.Plasma NGF levels at sacrifice. Data are mean+SEM; Statistical Analysis: One-way ANOVA followed by Dunnett's post hoc test. *p<0.05, **p<0.01.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 9. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТАFig. 9. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT
Концентрацию глюкозы в крови измеряли при взятии биопсии кожи (d-1), после окончания лечения полипептидом SEQ ID NO: 4 (d-8) и при умерщвлении (d28). Подробности см. в тексте.Blood glucose concentration was measured at skin biopsy (d-1), after treatment with the polypeptide of SEQ ID NO: 4 (d-8) and at sacrifice (d28). See text for details.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 10. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТАFig. 10. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT
Увеличение массы тела за экспериментальное время. Никаких различий между экспериментальными группами не наблюдалось.Increase in body weight during the experimental time. No differences were observed between the experimental groups.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 11. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТАFig. 11. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT
Результаты подошвенного теста через 0 и 7 дней после взятия биопсии кожи и введения полипептида SEQ ID NO: 4 (N=8 в каждой группе). Данные, полученные в 30-дневной когорте, представлены как среднее значение+SEM; статистический анализ выполнен по критерию Стьюдента.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 12. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТАFig. 12. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT
Термальная гипералгезия, измеренная в 0-й и 7-й День после пункционной биопсии. На этом графике объединены данные, полученные как в 8-дневных, так и 30-дневных экспериментах (N=16 в каждой группе); данные представляют собой средние значения+SEM. Статистический анализ: t-критерий Стьюдента, * p <0,05.Thermal hyperalgesia measured on
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 13. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 13. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT.
В таблице указан день заживления за время наблюдения, полученный из клинических наблюдений. «Нет» означает, что заживления не наблюдалось.The table shows the day of healing during the follow-up, obtained from clinical observations. "No" means that healing was not observed.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 14. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 14. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT.
Динамика процесса заживления, измеренная как внешняя область язвы, до 29 дня после биопсии кожи. Результаты выражаются в процентах от площади поражения в День 0; данные представляют собой средние значения+SEM. См. текст для статистического анализа.Dynamics of the healing process, measured as the outer area of the ulcer, up to 29 days after skin biopsy. Results are expressed as a percentage of the affected area on
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 15. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, когорты 8+30 днейFig. 15. EFFICACY STUDY, cohorts 8+30 days
Время-до-заживления язвы (внешней области) на 8-й День. Данные, представленные на графике, были получены путем объединения значений как для 8-дневных, так и для 30-дневных экспериментов; N=16. Данные представлены как среднее значение+SEM. Статистический анализ: односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом множественных сравнений Даннета: F (5, 77) = 3,007, P=0,0156.Time-to-heal of ulcer (outer area) on Day 8. The data presented in the graph was obtained by combining the values for both the 8-day and 30-day experiments; N=16. Data are presented as mean+SEM. Statistical Analysis: One-way analysis of variance followed by Dunnett's multiple comparison post hoc test: F(5, 77)=3.007, P=0.0156.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 16. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 16. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT.
Уровни NGF в плазме измеряли на 30 день. Данные представлены как среднее значение+SEM; статистический анализ: односторонний дисперсионный анализ и апостериорный тест Даннета.Plasma NGF levels were measured on
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 17. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 17. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT.
A. Микрофотографии, иллюстрирующие гистологию раны (окрашивание H&E) через 7 дней, взятые в соответствии со схемой, представленной в B.A. Photomicrographs illustrating the histology of the wound (H&E stain) after 7 days, taken according to the scheme presented in B.
D-F. Микрофотографии границы раны, иллюстрирующие MET (migrating epidermal tongue, мигрирующий эпидермальный язык) (D, E) и ангиогенез (F).D-F. Micrographs of the wound border illustrating MET (migrating epidermal tongue, migrating epidermal tongue) (D, E) and angiogenesis (F).
Фиг. 18. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 18. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT.
Типичные микрофотографии процесса реэпителизации мышей, обработанных носителем, SEQ ID NO: 4 (1, 10 и 30 мкг/день). Для сравнения приводится микрофотография неповрежденной кожи. Толщина эпидермального слоя в разных группах представлена на графике. Данные представлены как среднее значение+SEM; статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным критерием Тьюки, ** p <0,01; ****p <0,0001.Representative photomicrographs of the re-epithelialization process in mice treated with vehicle, SEQ ID NO: 4 (1, 10 and 30 μg/day). For comparison, a micrograph of intact skin is provided. The thickness of the epidermal layer in different groups is shown in the graph. Data are presented as mean+SEM; statistical analysis: one-way analysis of variance followed by Tukey's post hoc test, **p<0.01; ****p<0.0001.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 19. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, 30-ДНЕВНАЯ КОГОРТА.Fig. 19. EFFICACY STUDY, 30-DAY COHORT.
Анатомия иннервации кожи спины мыши, визуализированная с помощью иммуноокрашивания PGP-9.5.Mouse dorsal skin innervation anatomy visualized with PGP-9.5 immunostaining.
Фиг. 20. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, КОГОРТЫ 8+30 ДНЕЙ.Fig. 20. EFFICACY STUDY, COHORT 8+30 DAYS.
PGP9.5-IR в коже интактных животных (A), мышей, обработанных носителем (B) и SEQ ID NO: 4 (30 мкг/день) (C), через 30 дней после индукции поражения. D, E: ROI (интересующая область, D) и настройка порогового значения (E) для компьютерной процедуры анализа изображений, используемой для оценки иннервации кожи через 30 дней.PGP9.5-IR in the skin of intact animals (A), mice treated with vehicle (B) and SEQ ID NO: 4 (30 μg/day) (C), 30 days after induction of the lesion. D, E: ROI (region of interest, D) and cutoff setting (E) for a computer-aided image analysis procedure used to evaluate skin innervation after 30 days.
Фиг. 21. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, КОГОРТЫ 8+30 ДНЕЙ.Fig. 21. EFFICACY STUDY, 8+30 DAY COHORS.
Морфометрический анализ PGP9.5-IR в коже через 8 (A) и 30 (B) дней после индукции язвы. Данные выражены как среднее значение+SEM; статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета; * р <0,05; ** р <0,01.Morphometric analysis of PGP9.5-IR in skin 8 (A) and 30 (B) days after ulcer induction. Data are expressed as mean+SEM; statistical analysis: one-way ANOVA followed by Dunnett's post hoc test; *p<0.05; ** p<0.01.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 22. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, КОГОРТЫ 8+30 ДНЕЙ.Fig. 22. EFFICACY STUDY, 8+30 DAY COHORS.
Гистологический (окрашивание H&E) и иммуногистохимический анализ заживленной (восстановленной) кожи в группе, обработанной SEQ ID NO: 4 (30 мкг/день). A-B: восстановленные слои кожи на базальной мембране, на что указывает окрашивание ламинином (B, стрелки); реиннервация исходит из субэпидермального сплетения и проецируется вверх через базальную мембрану (C). MET (D) значительно иннервирован как через 8 дней (E), так и через 30 (F) дней после поражения; ангиогенез наблюдается в MET, что визуализируется окрашиванием H&E (G), ламинином-IR при низком (H) и высоком (I) увеличениях.Histological (H&E staining) and immunohistochemical analysis of healed (repaired) skin in the group treated with SEQ ID NO: 4 (30 μg/day). A-B: Repaired skin layers on basement membrane as indicated by laminin staining (B, arrows); reinnervation originates from the subepidermal plexus and projects upward through the basement membrane (C). MET (D) is significantly innervated both 8 days (E) and 30 (F) days after the lesion; angiogenesis is observed in MET as visualized by H&E (G), laminin-IR staining at low (H) and high (I) magnifications.
Сокращения: ep - эпидермальный слой; MET- мигрирующий эпидермальный языкAbbreviations: ep, epidermal layer; MET- migratory epidermal tongue
Фиг. 23. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ, КОГОРТЫ 8+30 ДНЕЙ.Fig. 23. EFFICACY STUDY, 8+30 DAY COHORS.
Морфометрический анализ Laminin-IR в коже через 8 дней (A) и 30 дней (B) после индукции язвы. Серая горизонтальная полоса на графике B представляет ламинин-IR в неповрежденной коже. Данные выражены как среднее значение+SEM; статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета; *р <0,05; ***p <0,001; ****p <0,0001.Morphometric analysis of Laminin-IR in skin 8 days (A) and 30 days (B) after ulcer induction. The gray horizontal bar in plot B represents laminin-IR in intact skin. Data are expressed as mean+SEM; statistical analysis: one-way ANOVA followed by Dunnett's post hoc test; *p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001.
ФИГ. 24. ПОЛИПЕПТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ. ЗВЕЗДОЧКА (*) = ПОЛОЖЕНИЕ 61 В ЗРЕЛОМ ЧЕЛОВЕЧЕСКОМ NGF; КРЕСТ (+): ПОЛОЖЕНИЕ 100 В ЗРЕЛОМ ЧЕЛОВЕЧЕСКОМ NGF.FIG. 24. POLYPEPTIDE SEQUENCES. Asterisk (*) = POSITION 61 IN MATURE HUMAN NGF; CROSS (+):
A: SEQ ID NO: 1: последовательность пре-про-человеческого NGF, кодируемая соответствующей открытой рамкой считывания гена человека. A : SEQ ID NO: 1: pre-pro-human NGF sequence encoded by the corresponding open reading frame of the human gene.
Препептид: положения аминокислот 1-18; пропептид: положения аминокислот 19-121; зрелый NGF: положения аминокислот 122-239; С-концевой дипептид: положения аминокислот 240-241. Pre peptide: amino acid positions 1-18; pro peptide: amino acid positions 19-121; mature NGF: amino acid positions 122-239; C-terminal dipeptide: amino acid positions 240-241.
Дисульфидные связи (в правильно сложенной зрелой части): связывающие положения аминокислот 136 ↔201, 179 ↔ 229, 189 ↔ 231.Disulfide bonds (in a properly folded mature part): linking positions of amino acids 136 ↔201, 179 ↔ 229, 189 ↔ 231.
Сайт расщепления фурином (RSKR): положения аминокислот 118-121.Furin cleavage site (RSKR): amino acid positions 118-121.
B: схематический обзор препептида, пропептида и зрелого NGF. B : Schematic overview of prepeptide, propeptide and mature NGF.
C: SEQ ID NO: 2: последовательность зрелого человеческого NGF. C : SEQ ID NO: 2: mature human NGF sequence.
D: SEQ ID NO: 3 D : SEQ ID NO: 3
E: SEQ ID NO: 4 E : SEQ ID NO: 4
Фиг. 25. Скорость заживления ран после обработки носителем или полипептидом SEQ ID NO: 4 (1-10-100 мкг/см2/день) у диабетических мышей представлена как «Доля мышей с незажившей поверхностью» в течение всего курса исследования. Статистический анализ: оценка кривой выживаемости Каплана-Мейера. Fig. 25. The rate of wound healing after treatment with vehicle or polypeptide of SEQ ID NO: 4 (1-10-100 μg/cm 2 /day) in diabetic mice is presented as the "Proportion of mice with a non-healed surface" during the entire course of the study. Statistical Analysis: Kaplan-Meier Survival Curve Estimation.
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 26. Морфометрический анализ PGP9.5-IR (A) и PECAM1-IR (A) в восстановленной коже через 28 дней после индукции язвы. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n=15-18). Статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета; *р <0,05; **р <0,01. Fig. 26.Morphometric analysis of PGP9.5-IR (A) and PECAM1-IR (A) in repaired
CHF6467=полипептид SEQ ID NO: 4CHF6467=polypeptide SEQ ID NO: 4
Фиг. 27. Эффект полипептида SEQ ID NO: 4 на механический болевой порог в области, окружающей границу язвы, оценивали через 14 дней хронического местного лечения с помощью электронного аппарата фон Фрея Bioseb. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n=15-18). Статистический анализ: односторонний дисперсионный анализ. Fig. 27.The effect of the polypeptide SEQ ID NO: 4 on the mechanical pain threshold in the area surrounding the ulcer margin was assessed after 14 days of chronic topical treatment using the Bioseb von Frey electronic apparatus. Data are expressed as mean ± standard error of the mean (n=15-18). Statistical analysis: one-way analysis of variance.
--->--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> Киези Фармачукичи С.п.А (S.p.A.)<110> Kiesi Farmacukici S.p.A.
<120> Средство для лечения дерматологических заболеваний <120> Drug for the treatment of dermatological diseases
<130> D411P2<130> D411P2
<140> <140>
<141> <141>
<150> EP18194930.6<150>EP18194930.6
<151> 2018-09-17<151> 2018-09-17
<150> EP18203665.7<150>EP18203665.7
<151> 2018-10-31<151> 2018-10-31
<160> 4<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1<210> 1
<211> 241<211> 241
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<220> <220>
<223> Последовательность человеческого пре-про-NGF,<223> Human pre-pro-NGF sequence,
кодируемая соответствующей открытой рамкой считывания человека. encoded by the corresponding human open reading frame.
<400> 1<400> 1
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30 20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45 35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60 50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95 85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110 100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125 115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140 130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175 165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190 180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205 195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220 210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
225 230 235 240 225 230 235 240
Ala Ala
<210> 2<210> 2
<211> 118<211> 118
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<220> <220>
<223> SEQ ID NO: 2: Последовательность зрелого NGF человека<223> SEQ ID NO: 2: Mature human NGF sequence
<400> 2<400> 2
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30 20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45 35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60 50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95 85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110 100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Ser Arg Lys Ala Val Arg
115 115
<210> 3<210> 3
<211> 118<211> 118
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220> <220>
<223> SEQ ID NO: 3<223> SEQ ID NO: 3
<400> 3<400> 3
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30 20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45 35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60 50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95 85 90 95
Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110 100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Ser Arg Lys Ala Val Arg
115 115
<210> 4<210> 4
<211> 118<211> 118
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220> <220>
<223> SEQ ID NO: 4<223> SEQ ID NO: 4
<400> 4<400> 4
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30 20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45 35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Ser Asn Pro Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Ser Asn Pro Val
50 55 60 50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95 85 90 95
Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110 100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Ser Arg Lys Ala Val Arg
115 115
<---<---
Claims (12)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18194930.6 | 2018-09-17 | ||
| EP18203665.7 | 2018-10-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021110682A RU2021110682A (en) | 2022-10-19 |
| RU2799211C2 true RU2799211C2 (en) | 2023-07-04 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008006893A1 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Lay Line Genomics S.P.A. | Muteins of hngf, therapeutic uses and pharmaceutical compositions |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008006893A1 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Lay Line Genomics S.P.A. | Muteins of hngf, therapeutic uses and pharmaceutical compositions |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ПИЛЬЩИКОВА В.В. и др. Профилактика заболеваний: учебное пособие для студентов лечебного и педиатрического факультетов. - Краснодар, ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, 2016. КУНГУРОВ Н.В. Болезни кожи: монография [атлас], Екатеринбург: УрНИИДВиИ, 2014. - 176 с. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20080031405A (en) | Promotion of epithelial regeneration | |
| CN105705160B (en) | Use of IL-22 dimer in the manufacture of a medicament for the treatment of pancreatitis | |
| CA2413141C (en) | Peptides with wound healing activity | |
| US20210038690A1 (en) | Promoting epithelial regeneration using heparin binding epidermal growth factor like growth factor | |
| WO2001068125A2 (en) | Methods and compositions for the treatment and prevention of erectile dysfunction | |
| JP6846063B2 (en) | Treatment of abnormal skin scarring | |
| US20220064243A1 (en) | Agent for treatment of dermatological disorders | |
| JP2020100648A (en) | Use of apc analogue for wound healing | |
| US20220401517A1 (en) | Agent for use in treatment or prevention of ophthalmic disorders | |
| RU2799211C2 (en) | Agent for the treatment of dermatological diseases | |
| US20190376053A1 (en) | Collagen-binding agent compositions and methods of using the same | |
| JP2023515916A (en) | Methods for treating nerve damage and related disorders | |
| CA3008495A1 (en) | Method for preventing and treating cervical erosion | |
| RU2812055C1 (en) | Agent for use in treatment or prevention of ophthalmological disorders | |
| JP4610142B2 (en) | Composition for promoting passive extension of bladder smooth muscle | |
| WO2022204331A1 (en) | Compositions comprising branched kgf-2 derived peptides and methods for use in ocular treatment | |
| TW202228766A (en) | Method for treating nerve injury and related disease capable of administering to a subject a therapeutically effective amount of a plasminogen activation pathway component |