RU2798558C1 - Macroporous matrixes for cell cultivation - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: macroporous cryogel based on carboxymethylchitosan is presented obtained by cross-linking a polymer from solutions with a concentration of 1–3 wt.% by means of glycol diglycidyl ethers at a temperature of -10°C for 7–12 days at pH 10–11.

EFFECT: invention can be used in cell and tissue engineering for 3D cell cultivation, including in biomedicine for testing the effectiveness of new pharmaceuticals, including antitumor medicinal products.

1 cl, 5 ex

Description

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений и может найти применение в клеточной и тканевой инженерии для 3D-культивирования клеток, в том числе в биомедицине для тестирования эффективности новых фармацевтических препаратов, в том числе, противоопухолевых.The invention relates to the chemistry of macromolecular compounds and can be used in cell and tissue engineering for 3D cell cultivation, including in biomedicine for testing the effectiveness of new pharmaceuticals, including antitumor drugs.

Динамика роста и морфология опухолей в значительной степени определяются эффективностью передачи сигналов между клетками, градиентами нутриентов и метаболитов, а также механическими характеристиками матрикса, окружающего опухоль in vivo, которые, как правило, сложно воспроизвести in vitro при биохимических и фармакологических испытаниях. Отсутствие взаимодействий между клетками, а также между клетками и внеклеточным матриксом в традиционных двумерных (2D) моделях в монослое приводит к значительному расхождению между доклиническими и клиническими испытаниями лекарственных препаратов. Трехмерное (3D) культивирование клеток является перспективным инструментом для имитации функций внеклеточного матрикса и разработки более адекватной модели опухолей для изучения гипоксии, агрегации, кластеризации, миграции, пролиферации клеток, а также их отклика на различные внешние стимулы, в том числе химические.The growth dynamics and morphology of tumors are largely determined by the efficiency of signaling between cells, nutrient and metabolite gradients, as well as the mechanical characteristics of the matrix surrounding the tumor in vivo, which, as a rule, are difficult to reproduce in vitro in biochemical and pharmacological tests. The lack of interactions between cells, as well as between cells and the extracellular matrix in traditional two-dimensional (2D) models in a monolayer, leads to a significant discrepancy between preclinical and clinical drug trials. Three-dimensional (3D) cell culture is a promising tool for simulating the functions of the extracellular matrix and developing a more adequate tumor model for studying hypoxia, aggregation, clustering, migration, cell proliferation, as well as their response to various external stimuli, including chemical ones.

3D-культивирование клеток обычно достигается путем иммобилизации клеток в гидрогели, состав, морфологию и жесткость которых можно варьировать в зависимости от выбора полимера и способа изготовления. Известно, что жесткость субстрата значительно влияет на пролиферацию, миграцию, выживаемость опухолевых клеток, что особенно важно для адгезивных клеточных линий. Например, при высокоинвазивном колоректальном раке, или раке молочной железы, клетки характеризуются быстрой миграцией при увеличении жесткости субстрата при культивировании в 2D-культуре, однако, обеспечить такие условия в 3D значительно сложнее, так как низкая проницаемость жестких гидрогелей существенно ограничивает рост мультиклеточных агрегатов. В связи с этим, изготовление макропористых матриц с размерами пор в несколько десятков микрометров и выше является перспективным способом обеспечения жесткости каркаса при сохранении высокой эффективности транспорта питательных веществ и клеточных метаболитов, а также достаточного внутреннего пространства для трехмерного роста конкретных линий опухолевых клеток.3D cell culture is usually achieved by immobilizing cells in hydrogels, the composition, morphology and stiffness of which can be varied depending on the choice of polymer and method of manufacture. It is known that the rigidity of the substrate significantly affects the proliferation, migration, and survival of tumor cells, which is especially important for adherent cell lines. For example, in highly invasive colorectal cancer or breast cancer, cells are characterized by rapid migration with an increase in substrate rigidity during cultivation in 2D culture; however, it is much more difficult to provide such conditions in 3D, since the low permeability of rigid hydrogels significantly limits the growth of multicellular aggregates. In this regard, the production of macroporous matrices with pore sizes of several tens of micrometers or more is a promising way to ensure scaffold rigidity while maintaining a high efficiency of transport of nutrients and cell metabolites, as well as sufficient internal space for three-dimensional growth of specific tumor cell lines.

Несмотря на то, что разнообразие синтетических полимеров позволяет получить материалы с широким диапазоном механических свойств, их применение в качестве матриксов для культивирования часто ограничено низкой адгезивностью к субстрату и наличием нежелательных клеточных реакций. Поэтому представляет интерес создание 3D матриц на основе природных полимеров, которые лучше соответствуют механике, химии и сигнальной среде природного внеклеточного матрикса.Despite the fact that a variety of synthetic polymers make it possible to obtain materials with a wide range of mechanical properties, their use as culturing matrices is often limited by low adhesion to the substrate and the presence of undesirable cellular reactions. Therefore, it is of interest to create 3D matrices based on natural polymers that better match the mechanics, chemistry, and signaling environment of the natural extracellular matrix.

Известен гидрогель на основе коллагена I типа, обладающий высокой биосовместимостью и адгезией к клеткам [Bessea, L., et al. «Production of ordered collagen matrices for three-dimensional cell culture» // Biomaterials, 2002, V.23, pp.27-36]. Его получали из кислоторастворимого коллагена кожи теленка I типа (5 мг/мл) обработкой на ультразвуковом аппарате импульсами по 10 мин с паузами по 10 мин. Обработанные ультразвуком растворы коллагена выливали в чашку Петри для кристаллизации и постепенно концентрировали до 20 и 40 мг/мл путем медленного выпаривания растворителя на столе с ламинарным потоком в стерильных условиях. Около 4 мл вязких концентрированных растворов (20 или 40 мг/мл) заливали в чашки Петри диаметром 35 мм и гелировали, помещая образцы в пары концентрированного аммиака на 1 ч при комнатной температуре. Особое внимание уделяли равномерному распределению вязкого раствора по всей поверхности чашек Петри для получения постоянной толщины геля около 4 мм и отсутствию пузырьков в препарате. Затем гели отмывали в культуральной среде в течение 4 дней до рН 7,4, и засевали на их поверхность суспензию фибробластов в количестве 2⋅10⁵ клеток/гель.Known hydrogel based on collagen type I, with high biocompatibility and adhesion to cells [Bessea, L., et al. "Production of ordered collagen matrices for three-dimensional cell culture" // Biomaterials, 2002, V.23, pp.27-36]. It was obtained from acid-soluble type I calf skin collagen (5 mg/ml) by ultrasonic treatment with 10-minute pulses with 10-minute pauses. The sonicated collagen solutions were poured into a crystallization petri dish and gradually concentrated to 20 and 40 mg/mL by slowly evaporating the solvent on a laminar flow table under sterile conditions. About 4 ml of viscous concentrated solutions (20 or 40 mg/ml) were poured into Petri dishes with a diameter of 35 mm and gelled by placing the samples in concentrated ammonia vapor for 1 h at room temperature. Particular attention was paid to the uniform distribution of the viscous solution over the entire surface of the Petri dishes to obtain a constant gel thickness of about 4 mm and the absence of bubbles in the preparation. Then the gels were washed in a culture medium for 4 days to pH 7.4, and a suspension of fibroblasts was seeded on their surface in an amount of 2⋅10 ⁵ cells/gel.

Известный гидрогель показал высокую адгезию, хорошую биосовместимость и проницаемость для клеток в течение 21 дня эксперимента. Однако, присутствие в матрице чужеродного белка животного происхождения может оказать токсическое влияние на клетки, и, как следствие, поведение и рост культуры. Помимо этого, губчатые матрицы на основе белка недостаточно жесткие и обеспечивают лишь ограниченный диапазон модулей упругости (в среднем 0,1-4 кПа), в то время как жесткость тканей с плотной опухолью рака прямой кишки человека может достигать 60 кПа.The well-known hydrogel showed high adhesion, good biocompatibility and cell permeability within 21 days of the experiment. However, the presence of a foreign protein of animal origin in the matrix can have a toxic effect on the cells, and, as a result, the behavior and growth of the culture. In addition, protein-based spongy matrices are not stiff enough and provide only a limited range of elastic moduli (average 0.1-4 kPa), while the stiffness of tissues with a dense tumor of human rectal cancer can reach 60 kPa.

В связи с этим, гидрогели на основе полисахаридов являются более привлекательной альтернативой для выращивания сфероидов раковых клеток благодаря низкой токсичности, биосовместимости и широкому диапазону жесткости, который может быть достигнут различными химическими и физическими способами сшивки.In this regard, polysaccharide-based hydrogels are a more attractive alternative for growing cancer cell spheroids due to low toxicity, biocompatibility, and a wide range of stiffness that can be achieved by various chemical and physical cross-linking methods.

Так, в работе [Crompton K.E., et al. «Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering» // Biomaterials, 2007, V.28, pp. 441-449] клетки коры мозга мыши культивировали в 3D-термочувствительных гидрогелях хитозана с бета-глицерофосфатом. Гидрогели готовили путем растворения 0,8 или 0,5 масс.% хитозана в HCl до молярного соотношения 0,9:1 с аминогруппой хитозана. Раствор помещали на ледяную баню и по каплям добавляли 3,7 М глицерофосфата в молярном соотношении 12:1 к хитозану при ионной силе, близкой внеклеточной жидкости. Полученный раствор стерилизовали ультрафильтрацией и для формирования 3D-культуры вносили по 150 мл на дно 48-луночного планшета. До добавления суспензии клеток гидрогель хранили в прохладе.So, in [Crompton K.E., et al. "Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering" // Biomaterials, 2007, V.28, pp. 441-449] mouse cerebral cortex cells were cultured in 3D thermosensitive chitosan hydrogels with beta-glycerophosphate. Hydrogels were prepared by dissolving 0.8 or 0.5 wt.% chitosan in HCl to a molar ratio of 0.9:1 with the amino group of chitosan. The solution was placed in an ice bath and 3.7 M glycerophosphate was added dropwise in a molar ratio of 12:1 to chitosan at an ionic strength close to the extracellular fluid. The resulting solution was sterilized by ultrafiltration, and 150 ml were added to the bottom of a 48-well plate to form a 3D culture. The hydrogel was kept cool until the cell suspension was added.

Полученные гидрогели показали хорошие результаты 3D культивирования по количеству прикрепленных клеток, морфологии и скорости роста нейронов. Также нейроны демонстрировали более крупные клеточные тела и выпускали одиночные нейриты внутри макропористого геля. Использование гидрогеля улучшило выживаемость клеток при концентрации полимера до 0,1%, однако дальнейшее увеличение приводило к уменьшению количества клеток и подавлению росту нейритов.The obtained hydrogels showed good results of 3D cultivation in terms of the number of attached cells, morphology, and growth rate of neurons. The neurons also exhibited larger cell bodies and released single neurites within the macroporous gel. The use of the hydrogel improved cell survival at a polymer concentration of up to 0.1%, however, a further increase resulted in a decrease in the number of cells and inhibition of neurite outgrowth.

К недостатку указанного гидрогеля можно отнести, что, как указано авторами работы, осмолярность гидрогеля при разных концентрациях глицерофосфата в составе была критическим фактором, имеющим значение для выживания клеток.The disadvantage of this hydrogel can be attributed to the fact that, as indicated by the authors of the work, the osmolarity of the hydrogel at different concentrations of glycerophosphate in the composition was a critical factor that is important for cell survival.

Описано использование гидрогеля из карбоксиметилгексаноилхитозана и Pluronic F127 с глутаровым альдегидом в качестве сшивающего агента для инкапсуляции фибробластов [Yap L.-S., Yang M.-C. «Evaluation of hydrogel composing of Pluronic F127 and carboxymethyl hexanoyl chitosan as injectable scaffold for tissue engineering applications» // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2016, V.146, pp.204-211]. Раствор гидрогеля готовили холодным методом (4°С). В начале карбоксиметилгексаноилхитозан (0,5-1,5 масс.%) растворяли в дистиллированной воде и добавляли синтетический полимер Pluronic F127 (20 масс.%). Раствор перемешивали при 4°C в течение 30 мин до достижения гомогенности, а затем оставляли на ночь в холодильнике для полного растворения F127. После этого добавляли глутаровый альдегид (0,1 об.%) и перемешивали в течение 10 мин магнитной мешалкой при 4°С. Конечный продукт хранили при 4°C. Клетки фибробластов инкапсулировали путем простого смешивания. Гелеобразование проводили, поднимая температуру до 30°C, золь-гель переход происходил в течение 90 сек. Полученная матрица оставалась в гелеобразном состоянии более 1 месяца. Исследование культуры клеток in vitro показало, что гидрогели не были цитотоксичными. При этом жизнеспособность инкапсулированных фибробластов составила 106% после инкубации в течение 5 дней.Describes the use of a hydrogel of carboxymethylhexanoylchitosan and Pluronic F127 with glutaraldehyde as a cross-linking agent for fibroblast encapsulation [Yap L.-S., Yang M.-C. "Evaluation of hydrogel composing of Pluronic F127 and carboxymethyl hexanoyl chitosan as injectable scaffold for tissue engineering applications" // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2016, V.146, pp.204-211]. The hydrogel solution was prepared by the cold method (4°С). At the beginning, carboxymethylhexanoylchitosan (0.5-1.5 wt%) was dissolved in distilled water and the synthetic polymer Pluronic F127 (20 wt%) was added. The solution was stirred at 4°C for 30 min until homogeneous, and then left overnight in the refrigerator to completely dissolve the F127. After that was added glutaraldehyde (0.1 vol.%) and stirred for 10 min with a magnetic stirrer at 4°C. The final product was stored at 4°C. Fibroblast cells were encapsulated by simple mixing. Gelation was carried out by raising the temperature to 30°C, the sol-gel transition occurred within 90 sec. The resulting matrix remained in a gel state for more than 1 month. An in vitro cell culture study showed that the hydrogels were not cytotoxic. The viability of encapsulated fibroblasts was 106% after incubation for 5 days.

Существенным недостатком описанной матрицы для культивирования является использование для гелеобразования дорогостоящего полимера Pluronic F127 в высокой концентрации, что значительно увеличивает себестоимость матрицы.A significant disadvantage of the described matrix for cultivation is the use of expensive polymer Pluronic F127 in high concentration for gelation, which significantly increases the cost of the matrix.

Среди различных типов макропористых материалов для клеточного культивирования перспективными являются макропористые криогели. Они формируются в результате полимеризации мономеров или сшивки полимеров при отрицательной температуре с последующим удалением кристаллов льда путем оттаивания.Among various types of macroporous materials for cell culture, macroporous cryogels are promising. They are formed as a result of polymerization of monomers or cross-linking of polymers at a negative temperature, followed by the removal of ice crystals by thawing.

Наиболее близким по химической сущности к заявляемому изобретению, но отличающийся по назначению, является макропористый материал на основе хитозана, полученный методом криогелирования, когда кристаллы льда в замороженном растворе полимера выступают в роли порообразователей, а ионная или ковалентная сшивка происходит при отрицательной температуре [пат. РФ №2699562, опубл. 06.09.2019]. Способ получения ковалентно-сшитых криогелей хитозана осуществляли следующим образом. Раствор хитозана с концентрацией 3% готовили растворением порошка полимера в соляной кислоте с концентрацией 0,45-0,5%. Затем рН раствора доводили до 3,5-5,5, предпочтительно до 4,5-5,0, используя растворы соляной кислоты или щелочи. В качестве сшивающих агентов выбрали диглицидиловые эфиры гликолей, которые в макропористых материалах используются для контроля жесткости, в том числе обуславливая скорость ферментативной деградации в организме. Расчетные количества диглицидилового эфира этиленгликоля или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля (соответствующие молярным отношениям к аминогруппам хитозана не менее 1:4) добавляли при тщательном перемешивании в раствор хитозана. Для получения пористого материала емкость произвольного размера и формы наполняли раствором хитозана со сшивающим агентом и помещали в морозильную камеру при температуре -10°С на 5-12 дней для ковалентной сшивки, с последующим оттаиванием.The closest in chemical essence to the claimed invention, but different in purpose, is a macroporous material based on chitosan, obtained by cryogelation, when ice crystals in a frozen polymer solution act as pore formers, and ionic or covalent crosslinking occurs at a negative temperature [US Pat. RF No. 2699562, publ. 09/06/2019]. The method for obtaining covalently cross-linked chitosan cryogels was carried out as follows. A solution of chitosan with a concentration of 3% was prepared by dissolving the polymer powder in hydrochloric acid with a concentration of 0.45-0.5%. Then the pH of the solution was adjusted to 3.5-5.5, preferably 4.5-5.0, using hydrochloric acid or alkali solutions. Diglycidyl ethers of glycols, which are used in macroporous materials to control stiffness, including the rate of enzymatic degradation in the body, were chosen as crosslinking agents. Calculated amounts of ethylene glycol diglycidyl ether or polyethylene glycol diglycidyl ether (corresponding to a molar ratio of at least 1:4 to the amino groups of chitosan) were added with thorough mixing to the chitosan solution. To obtain a porous material, a container of arbitrary size and shape was filled with a solution of chitosan with a crosslinking agent and placed in a freezer at -10°C for 5–12 days for covalent crosslinking, followed by thawing.

Недостатками известного макропористого криогеля являются необходимость жесткого контроля рН в процессе синтеза, высокие мольные отношения сшивающий агент : полимер, высокая жесткость и низкая проницаемость криогелей, полученных с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, что может оказывать влияние на динамику роста опухолевых клеток, так как в описании изобретения отсутствует информация о возможности применения заявленных криогелей для 3D культивирования клеток.The disadvantages of the known macroporous cryogel are the need for strict control of pH during synthesis, high molar ratios of the crosslinking agent : polymer, high rigidity and low permeability of cryogels obtained using polyethylene glycol diglycidyl ether as a crosslinking agent, which can affect the growth dynamics of tumor cells, so as in the description of the invention there is no information on the possibility of using the claimed cryogels for 3D cell cultivation.

В связи с этим была поставлена задача синтезировать супермакропористый криогель с использованием производного хитозана, перспективного для 3D культивирования клеток.In this regard, the task was set to synthesize a supermacroporous cryogel using a chitosan derivative promising for 3D cell cultivation.

Технический результат предлагаемого изобретения - биосовместимые, нетоксичные макропористые матрицы на основе криогелей водорастворимого карбоксиметилхитозана. Изобретение позволяет получить макропористые матрицы для 3D культивирования клеточных сфероидов, в том числе опухолевых. Заявляемые матрицы имеют хорошую проницаемость для клеток и питательных веществ за счет оптимальной жесткости.The technical result of the invention is biocompatible, non-toxic macroporous matrices based on water-soluble carboxymethylchitosan cryogels. EFFECT: invention makes it possible to obtain macroporous matrices for 3D cultivation of cell spheroids, including tumor ones. The inventive matrices have good permeability for cells and nutrients due to optimal rigidity.

Указанный технический результат достигают макропористым криогелем, полученным сшивкой карбоксиметилхитозана посредством диглицидиловых эфиров гликолей (1,4-бутандиола, этиленгликоля и полиэтиленгликоля) при температуре -10°С в течение 7-12 дней из раствора с рН 10-11 и концентрацией полимера 1-3 масс.%, пригодным для 3D-культивирования клеток.The specified technical result is achieved by a macroporous cryogel obtained by cross-linking carboxymethylchitosan with diglycidyl ethers of glycols (1,4-butanediol, ethylene glycol and polyethylene glycol) at a temperature of -10°C for 7-12 days from a solution with a pH of 10-11 and a polymer concentration of 1-3 wt.%, suitable for 3D cell culture.

Синтез макропористого геля на основе карбоксиметилхитозана заключается в следующем: 1-3%-ный раствор натриевой соли N,O-карбоксиметилхитозана (КМХ) готовили в дистиллированной воде, рН раствора составлял 10-11 ед. Рассчитанные количества сшивающих реагентов - диглицидиловых эфиров гликолей (ДГЭ), соответствующих молярным соотношениям КМХ:ДГЭ=2:1 - 1:20, добавляли по каплям при постоянном перемешивании к раствору полимера, затем растворы немедленно помещали в пластиковые шприцы и выдерживали в морозильной камере при температуре -10°C в течение 7-12 дней. После оттаивания криогели промывали дистиллированной водой для удаления непрореагировавших химических веществ.The synthesis of a macroporous gel based on carboxymethylchitosan is as follows: a 1–3% solution of the sodium salt of N,O-carboxymethylchitosan (CMC) was prepared in distilled water, the pH of the solution was 10–11 units. The calculated amounts of cross-linking reagents - glycol diglycidyl ethers (DGE), corresponding to the molar ratios of CMC:DGE=2:1 - 1:20, were added dropwise with constant stirring to the polymer solution, then the solutions were immediately placed in plastic syringes and kept in a freezer at temperature -10°C for 7-12 days. After thawing, the cryogels were washed with distilled water to remove unreacted chemicals.

Жизнеспособность и функциональную активность клеток в криогелях анализировали методом проточной цитометрии. Для открепления клеток в лунку добавляли смесь 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА на 30 минут. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 100 мкл DPBS, содержащего 10 мкМ 2',7'-дихлородигидрофлуорисцеина диацетата (H₂DCFDA) для оценки митохондриальной активности, 1 мкМ TO-PRO-3™ (Invitrogen, США) для детекции апоптозных клеток и 1 мкг/мл DAPI (GERBU Biotechnik GmbH, Германия) для окрашивания мертвых клеток. Суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте, после чего разбавляли 150 мкл DPBS и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра CytoFLEX, подключенного к компьютеру с лицензионным программным обеспечением CytExpert (версия 2.3, Beckman-Coulter). Единичные события (более 95% всех событий) выбирали треугольным гейтированием на двумерном графике FSC-A против FSC-H для исключения агрегатов из дальнейшего анализа. DAPI детектировали при экстинкции 405 нм и эмиссии 450/45 BP. H₂DCFDA детектировали при экстинкции 488 нм и эмиссии 525/40 BP. TO-PRO-3™ детектировали при экстинкции 638 нм и эмиссии 660/10 BP. В пробе анализировали не менее 20000 событий при скорости взятия образца 60 мкл/мин, 100-300 событий/секунду.The viability and functional activity of cells in cryogels were analyzed by flow cytometry. To detach the cells, a mixture of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA was added to the well for 30 minutes. Cells were pelleted by centrifugation, resuspended in 100 μl of DPBS containing 10 μM 2',7'-dichlorodihydrofluoriscein diacetate (H ₂ DCFDA) to assess mitochondrial activity, 1 μM TO-PRO-3™ (Invitrogen, USA) to detect apoptotic cells, and 1 µg/ml DAPI (GERBU Biotechnik GmbH, Germany) for staining dead cells. The suspension was incubated at room temperature for 10 minutes in the dark, after which it was diluted with 150 μl of DPBS and analyzed using a CytoFLEX flow cytometer connected to a computer with licensed CytExpert software (version 2.3, Beckman-Coulter). Single events (more than 95% of all events) were selected by triangular gating on a 2D FSC-A versus FSC-H plot to exclude aggregates from further analysis. DAPI was detected at 405 nm extinction and 450/45 BP emission. H ₂ DCFDA was detected at 488 nm extinction and 525/40 BP emission. TO-PRO-3™ was detected at 638 nm extinction and 660/10 BP emission. At least 20,000 events were analyzed per sample at a sampling rate of 60 μl/min, 100-300 events/second.

Изобретение реализовано в следующих примерах.The invention is implemented in the following examples.

Пример 1.Example 1

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 3% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира 1,4-бутандиола (ДГЭБД) в мольном отношении КМХ: ДГЭБД=1: 4, время сшивки составило 7 суток. В результате был получен макропористый криогель, имеющий значение модуля Юнга равное 3 кПа. Средний размер пор составил 167±45 мкм, степень набухания в дистиллированной воде - 6000%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ116 нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования в криогеле наблюдали многочисленные плотные сфероиды HCT 116 с ровными границами и средним размером 104±30 мкм. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 60±5%.A macroporous cryogel was prepared as described above from a 3% CMC solution using 1,4-butanediol diglycidyl ether (DHEBD) as a crosslinking agent in a CMC: DHEBD=1:4 molar ratio; the crosslinking time was 7 days. As a result, a macroporous cryogel was obtained with a Young's modulus of 3 kPa. The average pore size was 167±45 µm, the degree of swelling in distilled water was 6000%. The cryogel is suitable for 3D cell culture because more than 80% of the HCT116 cells deposited on top of the monolithic cryogel obtained in a 2 ml syringe were found in the eluate after passing 17 ml of the medium through the syringe. After seven days of cultivation in cryogel, numerous dense HCT 116 spheroids with even boundaries and an average size of 104 ± 30 μm were observed. Cell viability on the seventh day of cultivation was 60±5%.

Пример 2.Example 2

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 3% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира 1,4-бутандиола (ДГЭБД) в мольном отношении КМХ: ДГЭБД=1:2, время сшивки составило 7 суток. В результате был получен макропористый криогель, имеющий значение модуля Юнга 6 кПа. Средний размер пор составил 156±40 мкм, степень набухания в дистиллированной воде - 5700%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ 116 нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования в криогеле наблюдали многочисленные плотные сфероиды HCT 116 с ровными границами и средним размером 75±10 мкм. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 60±5%.A macroporous cryogel was prepared as described above from a 3% CMC solution using 1,4-butanediol diglycidyl ether (DHEBD) as a crosslinking agent in a CMC: DHEBD=1:2 molar ratio, the crosslinking time was 7 days. As a result, a macroporous cryogel with a Young's modulus of 6 kPa was obtained. The average pore size was 156±40 µm, the degree of swelling in distilled water was 5700%. The cryogel is suitable for 3D cell culture because more than 80% of the HCT 116 cells deposited on top of the monolithic cryogel obtained in a 2 ml syringe were found in the eluate after passing 17 ml of the medium through the syringe. After seven days of cultivation in cryogel, numerous dense HCT 116 spheroids with even boundaries and an average size of 75 ± 10 μm were observed. Cell viability on the seventh day of cultivation was 60±5%.

Пример 3.Example 3

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 2% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира полиэтиленгликоля с молекулярной массой 500 Да (ДГЭПЭГ) в мольном отношении КМХ: ДГЭПЭГ=1:8, время сшивки составило 7 суток. В результате был получен макропористый криогель со средним размером пор 240±45 мкм, степень набухания в дистиллированной воде - 6600%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ116 нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования в криогеле наблюдали многочисленные сфероиды HCT 116 с ровными границами и средним размером 105±15 мкм. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 70±5%.A macroporous cryogel was prepared as described above from a 2% CMC solution using polyethylene glycol diglycidyl ether with a molecular weight of 500 Da (DGEPEG) in the molar ratio of CMC: DGEPEG=1:8 as a crosslinking agent, the crosslinking time was 7 days. As a result, a macroporous cryogel with an average pore size of 240 ± 45 μm was obtained, the degree of swelling in distilled water was 6600%. The cryogel is suitable for 3D cell culture because more than 80% of the HCT116 cells deposited on top of the monolithic cryogel obtained in a 2 ml syringe were found in the eluate after passing 17 ml of the medium through the syringe. After seven days of cultivation in cryogel, numerous HCT 116 spheroids with even boundaries and an average size of 105 ± 15 μm were observed. Cell viability on the seventh day of cultivation was 70±5%.

Пример 4.Example 4

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 3% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира полиэтиленгликоля с молекулярной массой 500 Да (ДГЭПЭГ) в мольном отношении КМХ: ДГЭПЭГ=1:8, время сшивки составило 7 суток. В результате был получен макропористый криогель со средним размером пор 232±50 мкм, имеющий значение модуля Юнга равный 13 кПа. Степень набухания в дистиллированной воде - 5800%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ 116 и HEK 293, нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования в криогеле наблюдали многочисленные плотные сфероиды с ровными границами и средним размером 130±15 мкм при культивировании клеток HEK 293 и 140±25 мкм при культивировании клеток HCT 116. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 80±5%.A macroporous cryogel was prepared as described above from a 3% CMC solution using polyethylene glycol diglycidyl ether with a molecular weight of 500 Da (DGEPEG) as a crosslinking agent in the molar ratio of CMC: DGEPEG=1:8, the crosslinking time was 7 days. As a result, a macroporous cryogel with an average pore size of 232±50 μm was obtained, having a Young's modulus value of 13 kPa. The degree of swelling in distilled water is 5800%. The cryogel is suitable for 3D cell culture because more than 80% of HCT 116 and HEK 293 cells coated on top of a monolithic cryogel obtained in a 2 ml syringe were found in the eluate after passing 17 ml of the medium through the syringe. After seven days of cultivation in the cryogel, numerous dense spheroids with even boundaries and an average size of 130 ± 15 μm were observed when cultivating HEK 293 cells and 140 ± 25 μm when cultivating HCT 116 cells. Cell viability on the seventh day of cultivation was 80 ± 5%.

Пример 5.Example 5

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 3% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира этиленгликоля (ДГЭЭГ) в мольном отношении КМХ: ДГЭЭГ=1:5, время сшивки составило 12 суток. В результате был получен макропористый криогель со степенью набухания в дистиллированной воде - 7000%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ 116, нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования клеток HCT 116 в криогеле наблюдали многочисленные плотные сфероиды с ровными границами и средним размером 105±15. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 80±5%.A macroporous cryogel was prepared as described above from a 3% CMC solution using ethylene glycol diglycidyl ether (DGEEG) as a crosslinking agent in a CMC: DGEEG=1:5 molar ratio, the crosslinking time was 12 days. As a result, a macroporous cryogel with a degree of swelling in distilled water of 7000% was obtained. The cryogel is suitable for 3D cell culturing because more than 80% of HCT 116 cells coated on top of a monolithic cryogel obtained in a 2 ml syringe were found in the eluate after passing 17 ml of the medium through the syringe. After seven days of cultivation of HCT 116 cells in cryogel, numerous dense spheroids with even boundaries and an average size of 105±15 were observed. Cell viability on the seventh day of cultivation was 80±5%.

Claims (1)

Макропористый криогель для клеточной и тканевой инженерии на основе карбоксиметилхитозана, сшитого посредством диглицидиловых эфиров гликолей в растворе с рН=10-11 при температуре -10°С в течение 5-12 дней.Macroporous cryogel for cell and tissue engineering based on carboxymethylchitosan crosslinked by means of glycol diglycidyl ethers in solution with pH=10-11 at -10°C for 5-12 days.