RU2798462C2 - Urea-based compounds and compositions based on them as smarca2/brm atpase inhibitors - Google Patents

Abstract

FIELD: organic chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to a compound or its pharmaceutically acceptable salt of formula I, where R¹ is selected from hydrogen, amino and hydroxy-substituted C_1-2 alkyl; R² is hydrogen; R³ is selected from C_1-2 alkyl and halo-substituted C_1-2 alkyl; R⁴ is hydrogen; R⁵ is selected from hydrogen and halogen; and R⁶ is selected from hydrogen and halogen. The invention also relates to a specific compound of formula I, a pharmaceutical composition based on a compound of formula I, and a method for treating a BRM-mediated and/or BRG1-mediated disorder or disease.

EFFECT: effective treatment of a BRM-mediated and/or BRG1-mediated disorder or disease.

10 cl, 1 tbl, 8 ex

Description

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

Данная заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 30 ноября 2016 г., имеет название PAT057524-US-PSP_SL.txt, и ее размер составляет 31078 байт.This application contains a sequence listing that has been filed electronically in ASCII format and is incorporated herein by reference in its entirety. The specified ASCII copy, created on November 30, 2016, is named PAT057524-US-PSP_SL.txt and is 31078 bytes in size.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям, содержащим такие соединения, и к их применению для лечения BRM-опосредованных и/или BRG1-опосредованных нарушений или заболеваний, которые включают виды рака с мутацией в BRG1/SMARCA4.The present invention relates to compounds, compositions containing such compounds, and their use for the treatment of BRM-mediated and/or BRG1-mediated disorders or diseases, which include cancers with a mutation in BRG1/SMARCA4.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

Мультибелковые комплексы SWI/SNF млекопитающих (mSWI/SNF) контролируют структуру хроматина путем АТФ-зависимого ремоделирования нуклеосом и, тем самым, контролируют множество ключевых клеточных процессов. Несколько субъединиц комплексов mSWI/SNF играют роль супрессоров опухолей, и недавние геномные исследования выявили часто возникающие мутации в нескольких таких субъединицах с общей частотой мутаций, которая составляет примерно 20% среди всех видов рака. Каталитическая субъединица SWI/SNF BRG1, также известная как SMARCA4, часто подвергается мутации при видах аденокарциномы легкого и других видах рака.Mammalian SWI/SNF multiprotein complexes (mSWI/SNF) control chromatin structure through ATP-dependent nucleosome remodeling and thereby control many key cellular processes. Several subunits of the mSWI/SNF complexes play a tumor suppressor role, and recent genomic studies have identified frequent mutations in several of these subunits with an overall mutation rate of approximately 20% of all cancers. The SWI/SNF BRG1 catalytic subunit, also known as SMARCA4, is frequently mutated in lung adenocarcinoma and other cancers.

BRM (также известный как SMARCA2) представляет собой паралог BRG1 (или BRM/SWI2-родственный ген 1, также известный как SMARCA4), и эти два белка функционируют как взаимоисключающие АТФ-зависимые субъединицы внутри комплекса SWI/SNF ремоделирования хроматина у млекопитающих. Для клеток требуется или BRM, или BRG1, чтобы собрать каталитически активный комплекс SWI/SNF. Различные варианты комплекса SWI/SNF были охарактеризованы отличающимся составом субъединиц, но только одна каталитическая субъединица (BRM или BRG1) присутствует в каждом комплексе.BRM (also known as SMARCA2) is a paralog of BRG1 (or BRM/SWI2-related gene 1, also known as SMARCA4) and the two proteins function as mutually exclusive ATP-dependent subunits within the SWI/SNF complex of mammalian chromatin remodeling. Cells require either BRM or BRG1 to assemble the catalytically active SWI/SNF complex. Different variants of the SWI/SNF complex have been characterized by differing subunit compositions, but only one catalytic subunit (BRM or BRG1) is present in each complex.

Было показано, что BRG1 функционирует как супрессор опухолей и подвергается значительному числу мутаций при видах рака у человека. Доказательство наличия функции супрессии опухоли у BRG1 было продемонстрировано с помощью повторной экспрессии BRG1 дикого типа в клеточных линиях с мутацией в BRG1, что приводило к дифференциации и остановке клеточного цикла. У мышей с аллелями Brg1+/- развивается карцинома молочной железы с частотой возникновения 10% за один год. Мутации с потерей функции в BRG1 были идентифицированы в ~30% утвердившихся линий немелкоклеточного рака легкого, и сайленсинг BRG1 выявлен во множестве других раковых клеточных линий и образцов опухолей, включая виды рака легкого, поджелудочной железы и яичника, виды меланомы и виды детской рабдоидной саркомы. Важно, что недавние результаты из проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA) позволили идентифицировать мутации BRG1 как ген, подверженный существенному количеству мутаций в образцах опухолей, отобранных у пациентов с аденокарциномой легкого, с частотой появления в ~10% из всех образцов опухолей (величина, подобная другим в надлежащей степени охарактеризованным онкогенам и супрессорам опухолей, таким как EGFR и LKB1). В проекте TCGA подобным образом идентифицировали мутации BRM и делеции при различных видах рака, включая виды рака легкого.BRG1 has been shown to function as a tumor suppressor and undergoes a significant number of mutations in human cancers. Evidence for tumor suppressor function in BRG1 was demonstrated by re-expression of wild-type BRG1 in cell lines mutated in BRG1 , resulting in differentiation and cell cycle arrest. Mice with Brg1+/- alleles develop mammary carcinoma at a rate of 10% in one year. Loss-of-function mutations in BRG1 have been identified in ~30% of established non-small cell lung cancer lines, and BRG1 silencing has been identified in a variety of other cancer cell lines and tumor specimens, including lung, pancreatic, and ovarian cancers, melanomas, and childhood rhabdoid sarcomas. Importantly, recent results from The Cancer Genome Atlas (TCGA) project have identified BRG1 mutations as a gene susceptible to a significant number of mutations in tumor samples collected from patients with lung adenocarcinoma, with an occurrence frequency of ~10% of all tumor samples (value, similar to other well-characterized oncogenes and tumor suppressors such as EGFR and LKB1 ). The TCGA project similarly identified BRM mutations and deletions in various cancers, including lung cancers.

Понимание терапевтического нацеливания на виды рака с мутацией в SWI/SNF исходит из исследований, показывающих, что остаточные комплексы SWI/SNF играют роль в выживании видов рака с мутациями в SWI/SNF. В частности, было открыто синтетическое летальное взаимодействие между BRM и BRG1, двумя АТФазами комплекса, вследствие которого потеря одной из них приводит к зависимости от другой. Например, истощение по BRM, как было показано, способствовало подавлению роста раковых клеток с мутацией по BRG1. Кроме того, в других исследованиях было показано, что опухолевые клетки с дефицитом SNF5 (SNF5 представляет собой субъединицу комплекса SWI/SNF) являются зависимыми от BRG1. Наконец, сообщалось, что некоторые виды рака, у которых нет мутаций в SWI/SNF, также являются чувствительными к ингибированию BRG1, такие как острый миелоидный лейкоз (AML). Следовательно, ингибирование некоторых субъединиц SWI/SNF, включая BRG1 и BRM, обеспечивает возможности для развития новых терапевтических средств для лечения заболеваний человека, в том числе видов рака.Understanding the therapeutic targeting of SWI/SNF mutated cancers comes from studies showing that residual SWI/SNF complexes play a role in the survival of SWI/SNF mutated cancers. In particular, a synthetic lethal interaction has been discovered between BRM and BRG1, two ATPases of the complex, due to which the loss of one of them leads to dependence on the other. For example, BRM depletion has been shown to suppress the growth of BRG1 mutated cancer cells. In addition, other studies have shown that SNF5-deficient tumor cells (SNF5 is a subunit of the SWI/SNF complex) are BRG1 dependent. Finally, some cancers that do not have mutations in SWI/SNF have also been reported to be susceptible to BRG1 inhibition, such as acute myeloid leukemia (AML). Therefore, the inhibition of several subunits of SWI/SNF, including BRG1 and BRM, provides opportunities for the development of new therapeutic agents for the treatment of human diseases, including cancers.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

Остается необходимость в новых средствах лечения и видах терапии для опосредованных BRM и/или опосредованных BRG1 нарушений или заболеваний. В настоящем изобретении предусмотрены соединения, их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтические композиции на их основе и их комбинации, где соединения представляют собой ингибиторы BRM и/или BRG1. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ лечения опосредованных BRM и/или опосредованных BRG1 нарушений или заболеваний, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества ингибитора BRM и/или BRG1 (например, соединений по настоящему изобретению).There remains a need for new treatments and therapies for BRM mediated and/or BRG1 mediated disorders or diseases. The present invention provides compounds, their pharmaceutically acceptable salts, pharmaceutical compositions based on them and combinations thereof, where the compounds are inhibitors of BRM and/or BRG1. The present invention further provides a method for treating BRM-mediated and/or BRG1-mediated disorders or diseases, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a BRM and/or BRG1 inhibitor (eg, the compounds of the present invention).

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где R¹ - R⁶ определены в данном документе.In one aspect of the present invention, a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided, wherein R ¹ - R ⁶ are defined herein.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.In another aspect of the present invention, a pharmaceutical composition is provided comprising a therapeutically effective amount of a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more pharmaceutically acceptable carriers.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая комбинация, которая содержит терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и одно или несколько терапевтически активных средств.In yet another aspect of the present invention, a pharmaceutical combination is provided which comprises a therapeutically effective amount of a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more therapeutically active agents.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения опосредованных BRM и/или опосредованных BRG1 нарушений или заболеваний, который предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.In yet another aspect of the present invention, a method for treating BRM-mediated and/or BRG1-mediated disorders or diseases is provided, which comprises administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы получения соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей.In yet another aspect of the present invention, methods are provided for the preparation of compounds of formula (I) or pharmaceutically acceptable salts thereof.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

В данном документе описаны различные (перечисленные) варианты осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что признаки, описанные в каждом варианте осуществления, можно объединять с другими описанными признаками с получением дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения.This document describes the various (listed) embodiments of the present invention. It should be understood that the features described in each embodiment may be combined with other features described to provide additional embodiments of the present invention.

Вариант осуществления 1: соединение формулы (I): Embodiment 1 : compound of formula (I):

или его фармацевтически приемлемая соль, где: R¹ выбран из водорода, амино и гидрокси-замещенного C_1-2алкила; R² представляет собой водород; R³ выбран из C_1-2алкила и галоген-замещенного C_1-2алкила; R⁴ представляет собой водород; R⁵ выбран из водорода и галогена; и R⁶ выбран из водорода и галогена.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein: R ¹ is selected from hydrogen, amino, and hydroxy-substituted C _1-2 alkyl; R ² is hydrogen; R ³ is selected from C _1-2 alkyl and halo-substituted C _1-2 alkyl; R ⁴ is hydrogen; R ⁵ is selected from hydrogen and halogen; and R ⁶ is selected from hydrogen and halogen.

Вариант осуществления 2: Соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с вариантом осуществления 1, где: R¹ выбран из водорода, амино и гидроксиметила; R² представляет собой водород; R³ выбран из метила, дифторметила и трифторметила; R⁴ представляет собой водород; R⁵ выбран из водорода, хлора и фтора; и R⁶ выбран из водорода и фтора. Embodiment 2 : The compound or pharmaceutically acceptable salt thereof according to Embodiment 1, wherein: R ¹ is selected from hydrogen, amino and hydroxymethyl; R ² is hydrogen; R ³ is selected from methyl, difluoromethyl and trifluoromethyl; R ⁴ is hydrogen; R ⁵ is selected from hydrogen, chlorine and fluorine; and R ⁶ is selected from hydrogen and fluorine.

Вариант осуществления 3: соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с вариантом осуществления 1, выбранные из: Embodiment 3 : The compound or pharmaceutically acceptable salt thereof according to Embodiment 1, selected from:

Вариант осуществления 4: фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-3 или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Embodiment 4 : A pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound according to any of Embodiments 1-3, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more pharmaceutically acceptable carriers.

Вариант осуществления 5: фармацевтическая комбинация, содержащая терапевтически эффективное количество соединения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4 или его фармацевтически приемлемой соли и одно или несколько терапевтически активных средств. Embodiment 5 : A pharmaceutical combination containing a therapeutically effective amount of a compound according to any of Embodiments 1-4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more therapeutically active agents.

Вариант осуществления 6: фармацевтическая комбинация в соответствии с вариантом осуществления 5, где указанные одно или несколько терапевтически активных средств независимо выбраны из противораковых средств, противоаллергических средств, противорвотных средств, обезболивающих средств, иммуномодуляторов и цитопротекторных средств. Embodiment 6 : The pharmaceutical combination according to Embodiment 5, wherein said one or more therapeutically active agents are independently selected from anticancer agents, antiallergic agents, antiemetics, analgesics, immunomodulators, and cytoprotective agents.

Вариант осуществления 7: способ лечения BRM-опосредованного и/или BRG1-опосредованного нарушения или заболевания, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-27 или его фармацевтически приемлемой соли. Embodiment 7 : A method of treating a BRM-mediated and/or BRG1-mediated disorder or disease, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound according to any of Embodiments 1-27, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Вариант осуществления 8: способ в соответствии с вариантом осуществления 7, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется дефицитом BRG1 и/или дефицитом BRM. Embodiment 8 : The method according to Embodiment 7, wherein said disorder or disease is a malignancy characterized by BRG1 deficiency and/or BRM deficiency.

Вариант осуществления 9: способ в соответствии с вариантом осуществления 7 или 8, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутацией BRG1 и/или мутацией BRM. Embodiment 9 : The method according to Embodiment 7 or 8, wherein said disorder or disease is a cancer characterized by a BRG1 mutation and/or a BRM mutation.

Вариант осуществления 10: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7-9, где указанное нарушение или заболевание представляет собой солидную опухоль, лейкоз или лимфому. Embodiment 10 : The method according to any one of Embodiments 7-9, wherein said disorder or disease is a solid tumor, leukemia, or lymphoma.

Вариант осуществления 11: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7-10, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы, увеальной меланомы, мелкоклеточной карциномы яичника (гиперкальциемического типа), рабдоидной опухоли яичника, плоскоклеточной карциномы кожи, глиомы, карциносаркомы матки, карциномы тела матки и эндометрия, серозной цистаденокарциномы яичников, уротелиальной карциномы мочевого пузыря, первичной лимфомы центральной нервной системы, карциномы пищевода, рака мочевого пузыря, плазмацитоидного варианта рака мочевого пузыря, аденокарциномы желудка, аденокистозной карциномы, лимфосаркомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, рака поджелудочной железы, колоректальной аденокарциномы, холангиокарциномы, саркомы, видов рака головы и шеи, видов рака шейки матки и канала шейки матки, медуллобластомы, T-клеточной лимфомы кожи, гепатоцеллюлярной карциномы печени, папиллярной почечно-клеточной карциномы почки, рака молочной железы, лимфомы из клеток мантийной зоны, карциномы желчного пузыря, видов рака половых клеток яичек, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, рака предстательной железы, детской саркомы Юинга, тимомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, непрозрачно-клеточной карциномы почки, феохромоцитомы и параганглиомы, видов рака щитовидной железы, злокачественной опухоли оболочек периферических нервов, нейроэндокринного рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карциномы коры надпочечников, видов рака шейки матки и канала шейки матки, плоскоклеточной карциномы кожи, рака половых клеток яичек, глиобластомы, мультиформной глиобластомы, саркомы Юинга, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, нейробластомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, множественной миеломы, злокачественных рабдоидных опухолей, видов эпителиоидной саркомы, семейного шванноматоза, видов медуллярной карциномы почки, синовиальной саркомы и видов менингиомы. Embodiment 11 : The method according to any one of Embodiments 7-10, wherein said disorder or disease is selected from the group consisting of non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung carcinoma, types of large cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, squamous cell lung carcinoma, small cell lung cancer, melanoma of the skin, desmoplastic melanoma, uveal melanoma, small cell carcinoma of the ovary (hypercalcemic type), rhabdoid tumor of the ovary, squamous cell carcinoma of the skin, glioma, carcinosarcoma of the uterus, carcinoma of the body of the uterus and endometrium, serous cystadenocarcinoma of the ovaries, urothelial carcinoma of the bladder, primary central nervous system lymphoma, esophageal carcinoma, bladder cancer, plasmacytoid variant bladder cancer, gastric adenocarcinoma, adenoid cystic carcinoma, lymphosarcoma, diffuse large B-cell lymphoma, pancreatic cancer, colorectal adenocarcinoma, cholangiocarcinoma, sarcoma, head and neck cancers, types cervical and cervical canal cancer, medulloblastoma, T-cell lymphoma of the skin, hepatocellular carcinoma of the liver, papillary renal cell carcinoma of the kidney, breast cancer, mantle cell lymphoma, gallbladder carcinoma, germ cell cancers of the testis, renal cell clear cell carcinoma of the kidney, prostate cancer, childhood Ewing's sarcoma, thymoma, chromophobe renal cell carcinoma, opaque cell carcinoma of the kidney, pheochromocytoma and paraganglioma, thyroid cancers, malignant peripheral nerve sheath tumor, neuroendocrine prostate cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, adrenal cortical carcinoma, cervical and cervical canal cancers, skin squamous cell carcinoma, testicular germ cell cancer, glioblastoma, glioblastoma multiforme, Ewing's sarcoma, renal clear cell carcinoma of the kidney, neuroblastoma, diffuse large B-cell lymphoma, acute myeloid leukemia , chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, malignant rhabdoid tumors, types of epithelioid sarcoma, familial schwannomatosis, types of medullary carcinoma of the kidney, synovial sarcoma and types of meningioma.

Вариант осуществления 12: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7-11, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы и увеальной меланомы. Embodiment 12 : The method according to any one of Embodiments 7-11, wherein said disorder or disease is selected from the group consisting of non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung carcinoma, types of large cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, squamous cell lung carcinoma, small cell lung cancer, skin melanoma, desmoplastic melanoma and uveal melanoma.

Вариант осуществления 13: способ в соответствии с вариантом осуществления 7 или 8, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется дефицитом BRG1. Embodiment 13 : The method according to Embodiment 7 or 8, wherein said disorder or disease is a malignancy characterized by BRG1 deficiency.

Вариант осуществления 14: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8 или 13, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутацией BRG1. Embodiment 14 : The method according to any one of Embodiments 7, 8, or 13, wherein said disorder or disease is a cancer that is characterized by a BRG1 mutation.

Вариант осуществления 15: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8, 13 и 14, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы, увеальной меланомы, мелкоклеточной карциномы яичника, плоскоклеточной карциномы кожи, глиомы, карциносаркомы матки, карциномы тела матки и эндометрия, серозной цистаденокарциномы яичников, уротелиальной карциномы мочевого пузыря, первичной лимфомы центральной нервной системы, карциномы пищевода, рака мочевого пузыря, плазмацитоидного варианта рака мочевого пузыря, аденокарциномы желудка, аденокистозной карциномы, лимфосаркомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, рака поджелудочной железы, колоректальной аденокарциномы, холангиокарциномы, саркомы, видов рака головы и шеи, видов рака шейки матки и канала шейки матки, медуллобластомы, T-клеточной лимфомы кожи, гепатоцеллюлярной карциномы печени, папиллярной почечно-клеточной карциномы почки, рака молочной железы, лимфомы из клеток мантийной зоны, карциномы желчного пузыря, видов рака половых клеток яичек, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, рака предстательной железы, детской саркомы Юинга, тимомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, непрозрачно-клеточной карциномы почки, феохромоцитомы и параганглиомы и видов рака щитовидной железы. Embodiment 15 : The method according to any one of Embodiments 7, 8, 13, and 14, wherein said disorder or disease is selected from the group consisting of non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung carcinoma, types of large cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, lung squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, skin melanoma, desmoplastic melanoma, uveal melanoma, ovarian small cell carcinoma, skin squamous cell carcinoma, glioma, uterine carcinosarcoma, uterine and endometrial carcinoma, serous ovarian cystadenocarcinoma, bladder urothelial carcinoma, primary central nervous system lymphoma , esophageal carcinoma, bladder cancer, plasmacytoid variant bladder cancer, gastric adenocarcinoma, adenocystic carcinoma, lymphosarcoma, diffuse large B cell lymphoma, pancreatic cancer, colorectal adenocarcinoma, cholangiocarcinoma, sarcoma, head and neck cancers, cervical cancers, and cervical canal, medulloblastoma, T-cell lymphoma of the skin, hepatocellular carcinoma of the liver, papillary renal cell carcinoma of the kidney, breast cancer, mantle cell lymphoma, gallbladder carcinoma, germ cell cancers of the testis, renal clear cell carcinoma of the kidney, prostate cancer, infantile Ewing's sarcoma, thymoma, chromophobe renal cell carcinoma, opaque cell carcinoma of the kidney, pheochromocytoma and paraganglioma, and thyroid cancers.

Вариант осуществления 16: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8 и 13-15, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы и увеальной меланомы. Embodiment 16 : The method according to any one of Embodiments 7, 8, and 13-15, wherein said disorder or disease is selected from the group consisting of non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung carcinoma, types of large cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, squamous cell lung carcinoma, small cell lung cancer, skin melanoma, desmoplastic melanoma and uveal melanoma.

Вариант осуществления 17: способ в соответствии с вариантом осуществления 7 или 8, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется дефицитом BRM. Embodiment 17 : The method according to Embodiment 7 or 8, wherein said disorder or disease is a malignancy that is characterized by BRM deficiency.

Вариант осуществления 18: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8 и 17, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутацией BRM. Embodiment 18 : The method according to any one of Embodiments 7, 8 and 17, wherein said disorder or disease is a cancer that is characterized by a BRM mutation.

Вариант осуществления 19: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 8 и 17-18, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из злокачественной опухоли оболочек периферических нервов, нейроэндокринного рака предстательной железы, рака молочной железы, уротелиальной карциномы мочевого пузыря, аденокистозной карциномы, аденокарциномы желудка, видов карциномы молочной железы, серозной цистаденокарциномы яичников, карциносаркомы матки, карциномы пищевода, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, видов немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, карциномы коры надпочечников, меланомы кожи, саркомы, колоректальной аденокарциномы, видов рака шейки матки и канала шейки матки, гепатоцеллюлярной карциномы печени, плоскоклеточного рака кожи, рака половых клеток яичек, глиобластомы, мультиформной глиобластомы, холангиокарциномы, саркомы Юинга, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, нейробластомы, острого миелоидного лейкоза и диффузной B-крупноклеточной лимфомы. Embodiment 19 : The method according to any one of Embodiments 7, 8, and 17-18, wherein said disorder or disease is selected from the group consisting of peripheral nerve sheath cancer, prostate neuroendocrine cancer, breast cancer, bladder urothelial carcinoma , adenocystous carcinoma, gastric adenocarcinoma, species of breast carcinoma, serous ovarian cystadenocarcinoma, uterine carcinosarcoma, esophagus carcinoma, flat cell carcinoma, types of lung non -cell carcinoma, lung, and flat cell cell cell, small, finely, small, small cell cells lung cell cancer, pancreatic cancer, bark carcinomas adrenal, skin melanoma, sarcoma, colorectal adenocarcinoma, cervical and cervical canal cancers, hepatocellular carcinoma of the liver, squamous cell skin cancer, testicular germ cell cancer, glioblastoma, glioblastoma multiforme, cholangiocarcinoma, Ewing's sarcoma, clear cell renal cell carcinoma, neuroblastoma, acute myeloid leukemia and diffuse large B-cell lymphoma.

Вариант осуществления 20: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7-8 и 17-19, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы и увеальной меланомы. Embodiment 20 : The method according to any one of Embodiments 7-8 and 17-19, wherein said disorder or disease is selected from the group consisting of non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung carcinoma, types of large cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, squamous cell lung carcinoma, small cell lung cancer, skin melanoma, desmoplastic melanoma and uveal melanoma.

Вариант осуществления 21: способ в соответствии с вариантом осуществления 7, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутациями в субъединицах SWI/SNF, отличных от BRM или BRG1. Embodiment 21 : The method according to Embodiment 7, wherein said disorder or disease is a cancer characterized by mutations in SWI/SNF subunits other than BRM or BRG1.

Вариант осуществления 22: способ в соответствии с вариантом осуществления 7 или 21, где указанное нарушение или заболевание представляет собой солидную опухоль, лейкоз или лимфому. Embodiment 22 : The method according to Embodiment 7 or 21, wherein said disorder or disease is a solid tumor, leukemia, or lymphoma.

Вариант осуществления 23: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 21 и 22, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из злокачественных рабдоидных опухолей (характеризующихся дефицитом SNF5/SMARCB1), эпителиоидных сарком, семейного шванноматоза, видов медуллярной карциномы почки, видов саркомы Юинга, синовиальной саркомы, карциномы тела матки и эндометрия, аденокарциномы желудка, уротелиальной аденокарциномы мочевого пузыря, рака мочевого пузыря, аденокистозной карциномы, холангиокарциномы, десмопластической меланомы, плоскоклеточной карциномы кожи, рака поджелудочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы печени, меланомы, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, видов рака молочной железы, колоректального рака, светлоклеточной карциномы яичника, нейробластомы, карциномы пищевода, видов рака легкого, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, мезотелиомы, аденокистозной карциномы молочной железы, аденокистозной карциномы, видов рака щитовидной железы, видов менингиомы, видов увеальной меланомы и видов острого миелоидного лейкоза. Embodiment 23 : The method according to any one of Embodiments 7, 21, and 22, wherein said disorder or disease is selected from the group consisting of malignant rhabdoid tumors (characterized by SNF5/SMARCB1 deficiency), epithelioid sarcomas, familial schwannomatosis, medullary renal carcinoma species types of Ewing's sarcoma, synovial sarcoma, uterine and endometrial carcinoma, gastric adenocarcinoma, urothelial adenocarcinoma of the bladder, bladder cancer, adenoid cystic carcinoma, cholangiocarcinoma, desmoplastic melanoma, squamous cell carcinoma of the skin, pancreatic cancer, hepatocellular carcinoma of the liver, melanoma s, diffuse B - large cell lymphoma, types of breast cancer, colorectal cancer, clear cell carcinoma of the ovary, neuroblastoma, carcinoma of the esophagus, types of lung cancer, renal clear cell carcinoma of the kidney, mesothelioma, adenoid cystic carcinoma of the breast, adenoid cystic carcinoma, types of thyroid cancer, types of meningioma, types of uveal melanoma; and types of acute myeloid leukemia.

Вариант осуществления 24: способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 7, 21, 22 и 23, где указанное нарушение или заболевание выбрано из группы, состоящей из злокачественных рабдоидных опухолей, видов рака молочной железы, видов рака поджелудочной железы, видов рака яичника, видов светлоклеточной карциномы яичника, видов рака мочевого пузыря, видов светлоклеточной карциномы почки, колоректального рака, видов рака желудка, рака печени, меланомы, глиомы, острого миелоидного лейкоза и видов рака легкого. Embodiment 24 : The method according to any one of Embodiments 7, 21, 22, and 23, wherein said disorder or disease is selected from the group consisting of malignant rhabdoid tumors, breast cancers, pancreatic cancers, ovarian cancers, ovarian clear cell carcinoma, bladder cancer, kidney clear cell carcinoma, colorectal cancer, gastric cancer, liver cancer, melanoma, glioma, acute myeloid leukemia, and lung cancer.

Вариант осуществления 25: соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-3 или его фармацевтически приемлемая соль для применения в качестве лекарственного препарата. Embodiment 25 : A compound according to any of Embodiments 1-3, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use as a drug.

Другие признаки настоящего изобретения должны стать очевидными в ходе приведенных выше описаний иллюстративных вариантов осуществления, которые приведены для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для его ограничения.Other features of the present invention should become apparent in the course of the above descriptions of illustrative embodiments, which are provided to illustrate the present invention and are not intended to limit it.

ОПРЕДЕЛЕНИЯDEFINITIONS

Для целей толкования данного описания будут использоваться следующие определения, и при необходимости термины, используемые в единственном числе, будут также включать множественное число. Термины, используемые в описании, имеют следующие значения, если контекст явно не указывает на иное.For purposes of interpretation of this specification, the following definitions will be used and, where appropriate, terms used in the singular will also include the plural. Terms used in the description have the following meanings, unless the context clearly indicates otherwise.

Все способы, описанные в данном документе, можно осуществлять в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное, или это иным образом явно не противоречит контексту. Представленное в данном документе использование всех возможных примеров или вводных слов перед примерным объектом (например, "такой как") предназначено исключительно для лучшего освещения настоящего изобретения и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, заявленного в остальной части.All methods described herein can be performed in any suitable order, unless otherwise indicated herein, or otherwise clearly contrary to the context. Presented in this document is the use of all possible examples or introductory words before an exemplary object (for example, "such as") is intended solely to better illuminate the present invention and is not intended to limit the scope of the present invention as claimed in the remainder.

Форму единственного числа и аналогичные формы, используемые в контексте настоящего изобретения (в частности, в контексте формулы изобретения), следует истолковывать как охватывающие как форму единственного числа, так и форму множественного числа, если в данном документе не указано иное, или нет явного противоречия с контекстом.The singular form and similar forms used in the context of the present invention (in particular, in the context of the claims) should be construed as covering both the singular form and the plural form, unless otherwise indicated in this document, or there is no clear conflict with context.

Используемые в данном документе термины "алкил" означают углеводородный радикал общей формулы C_nH_2n+1. Алкановый радикал может быть прямым или разветвленным. Например, термин "C₁-C₆-алкил" или "от C₁- до C₆-алкил" означает одновалентную, прямую или разветвленную алифатическую группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода (например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, неопентил, 3,3-диметилпропил, гексил, 2-метилпентил и т. п.). Если алкил замещен еще одним заместителями, то заместители могут быть замещены при любом атоме углерода алкила.As used herein, the terms "alkyl" means a hydrocarbon radical of the general formula C _n H _2n+1 . The alkane radical may be straight or branched. For example, the term "C ₁ -C ₆ -alkyl" or "C ₁ - to C ₆ -alkyl" means a monovalent, straight or branched aliphatic group containing from 1 to 6 carbon atoms (for example, methyl, ethyl, n-propyl , isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, neopentyl, 3,3-dimethylpropyl, hexyl, 2-methylpentyl, etc. .). If the alkyl is substituted with another substituent, then the substituents may be substituted at any carbon atom of the alkyl.

"Галоген" или "галогено" может представлять собой фтор, хлор, бром или йод (предпочтительные галогены в качестве заместителей представляют собой фтор и хлор)."Halogen" or "halo" may be fluorine, chlorine, bromine or iodine (preferred halogen substituents are fluorine and chlorine).

"Галогеналкил" предназначен для включения насыщенных алифатических углеводородных групп как с разветвленной, так и с прямой цепью, содержащих определенное число атомов углерода, замещенных одним или несколькими атомами галогена. Таким образом, подразумевается, что термин "C₁-C₆галогеналкил" или "от C₁ до C₆галогеналкил" включает без ограничения фторметил, дифторметил, трифторметил, трихлорметил, пентафторэтил, пентахлорэтил, 2,2,2-трифторэтил, гептафторпропил и гептахлорпропил. "Haloalkyl" is intended to include both branched and straight chain saturated aliphatic hydrocarbon groups containing a specified number of carbon atoms substituted with one or more halogen atoms. Thus, the term "C ₁ -C ₆ haloalkyl" or "C ₁ to C ₆ haloalkyl" is intended to include, without limitation, fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, trichloromethyl, pentafluoroethyl, pentachloroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, heptafluoropropyl, and heptachloropropyl.

Используемый в данном документе термин "замещенный" означает, что по меньшей мере один атом водорода заменен группой, отличной от водорода, при условии, что сохраняются нормальные значения валентности, и что замещение приводит к образованию стабильного соединения. Если заместителем является кетогруппа (т. е. =O), то при атоме заменены 2 атома водорода. Кетозаместители не присутствуют при ароматических фрагментах.As used herein, the term "substituted" means that at least one hydrogen atom is replaced by a group other than hydrogen, provided that the normal valencies are maintained, and that the substitution results in the formation of a stable compound. If the substituent is a keto group (i.e. =O), then 2 hydrogen atoms are replaced at the atom. Keto substituents are not present on aromatic moieties.

Фраза "фармацевтически приемлемый" указывает на то, что вещество или композиция должны быть совместимы химически и/или токсикологически с другими ингредиентами, содержащимися в составе, и/или с млекопитающим, подвергающимся лечению с помощью них.The phrase "pharmaceutically acceptable" indicates that the substance or composition must be compatible chemically and/or toxicologically with the other ingredients contained in the composition and/or with the mammal being treated with them.

Если не указано иное, выражение "соединения по настоящему изобретению" означает соединения формулы (I), а также изомеры, такие как стереоизомеры (включая диастереоизомеры, энантиомеры и рацематы), геометрические изомеры, конформационные изомеры (включая ротамеры и атропоизомеры), таутомеры, изотопно-меченные соединения (включая замещенные дейтерием) и образованные сами по себе фрагменты (например, полиморфы, сольваты и/или гидраты). Если присутствует фрагмент, способный к образованию соли, то также включены соли, в частности, фармацевтически приемлемые соли.Unless otherwise indicated, the expression "compounds of the present invention" means compounds of formula (I), as well as isomers such as stereoisomers (including diastereoisomers, enantiomers and racemates), geometric isomers, conformational isomers (including rotamers and atropisomers), tautomers, isotopically -labeled compounds (including those substituted with deuterium) and self-formed fragments (eg, polymorphs, solvates and/or hydrates). Where a moiety capable of forming a salt is present, salts, in particular pharmaceutically acceptable salts, are also included.

В зависимости от условий способа, конечные продукты по настоящему изобретению получены либо в свободной (нейтральной) форме, либо в форме соли. Как свободная форма, так и соли данных конечных продуктов охватываются объемом настоящего изобретения. Если требуется, одну форму соединения можно превращать в другую форму. Свободное основание или кислота могут быть превращены в соль; соль может быть превращена в свободное соединение или другую соль; смесь изомерных соединений по настоящему изобретению может быть разделена на отдельные изомеры.Depending on the process conditions, the end products of the present invention are obtained either in free (neutral) form or in salt form. Both the free form and the salts of these end products are within the scope of the present invention. If desired, one form of the compound can be converted to another form. The free base or acid may be converted to a salt; the salt may be converted to the free compound or another salt; the mixture of isomeric compounds of the present invention can be separated into individual isomers.

Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые соли. Однако могут быть пригодными и другие соли, например, на стадиях выделения или очистки, которые можно использовать в ходе получения, и, таким образом, они охватываются объемом настоящего изобретения.Pharmaceutically acceptable salts are preferred. However, other salts may be suitable, for example, in isolation or purification steps that may be used in the course of the preparation and thus fall within the scope of the present invention.

Используемые в данном документе "фармацевтически приемлемые соли" означают производные раскрытых соединений, где исходное соединение модифицировано путем образования его кислотных или основных солей. Например, фармацевтически приемлемые соли включают без ограничения солевые формы: ацетат, аскорбат, адипат, аспартат, бензоат, безилат, бромид/гидробромид, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, камфорсульфонат, капрат, хлорид/гидрохлорид, хлортеофиллонат, цитрат, этандисульфонат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронат, глутамат, глутарат, гликолят, гиппурат, гидройодид/йодид, изетионат, лактат, лактобионат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат/гидроксималонат, манделат, мезилат, метилсульфат, муцинат, нафтоат, напсилат, никотинат, нитрат, октадеканоат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, фенилацетат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, полигалактуронат, пропионат, салицилаты, стеарат, сукцинат, сульфамат, сульфосалицилат, тартрат, тозилат, трифторацетат или ксинафоат.As used herein, "pharmaceutically acceptable salts" means derivatives of the disclosed compounds wherein the parent compound has been modified by formation of its acidic or base salts. For example, pharmaceutically acceptable salts include, without limitation, the salt forms: acetate, ascorbate, adipate, aspartate, benzoate, besylate, bromide/hydrobromide, bicarbonate/carbonate, bisulfate/sulfate, camphorsulfonate, caprate, chloride/hydrochloride, chlorotheophyllonate, citrate, ethane disulfonate, fumarate , gluceptate, gluconate, glucuronate, glutamate, glutarate, glycolate, hippurate, hydroiodide/iodide, isethionate, lactate, lactobionate, lauryl sulfate, malate, maleate, malonate/hydroxymalonate, mandelate, mesylate, methyl sulfate, mucinate, naphthoate, napsilate, nicotinate, nitrate , octadecanoate, oleate, oxalate, palmitate, pamoate, phenylacetate, phosphate/hydrophosphate/dihydrogen phosphate, polygalacturonate, propionate, salicylates, stearate, succinate, sulfamate, sulfosalicylate, tartrate, tosylate, trifluoroacetate, or xinafoate.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть образованы с применением неорганических кислот и органических кислот. Неорганические кислоты, с помощью которых могут быть получены соли, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т. п. Органические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и т. п.Pharmaceutically acceptable acid addition salts can be formed using inorganic acids and organic acids. Inorganic acids from which salts can be derived include, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and the like. Organic acids from which salts can be derived include, for example, acetic acid. , propionic acid, glycolic acid, oxalic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, sulfosalicylic acid, etc.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть образованы с помощью неорганических и органических оснований. Неорганические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, соли аммония и металлы из групп I - XII периодической таблицы элементов. В определенных вариантах осуществления соли получены из натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди; особенно подходящие соли включают соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Органические основания, с помощью которых могут быть получены соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, в том числе встречающиеся в природе замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и т. п. Определенные органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, меглюмин, пиперазин и трометамин.Pharmaceutically acceptable base addition salts can be formed with inorganic and organic bases. Inorganic bases from which salts may be derived include, for example, ammonium salts and metals from Groups I to XII of the Periodic Table of the Elements. In certain embodiments, the salts are derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, magnesium, iron, silver, zinc, and copper; particularly suitable salts include the ammonium, potassium, sodium, calcium and magnesium salts. Organic bases with which salts can be prepared include, for example, primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines, including naturally occurring substituted amines, cyclic amines, basic ion exchange resins, and the like. Certain organic amines include isopropylamine , benzathine, cholinate, diethanolamine, diethylamine, lysine, meglumine, piperazine, and tromethamine.

Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению можно синтезировать из исходного соединения, содержащего основный или кислотный фрагмент, с помощью общепринятых химических способов. Как правило, такие соли могут быть получены путем осуществления реакции форм свободной кислоты или свободного основания таких соединений со стехиометрическим количеством соответствующих основания или кислоты в воде, или в органическом растворителе, или в их смеси; как правило, предпочтительными являются неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечни пригодных солей можно найти в Allen, L.V., Jr., ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Pharmaceutical Press, London, UK (2012), раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки.Pharmaceutically acceptable salts of the present invention can be synthesized from the parent compound containing a basic or acid moiety using conventional chemical methods. Typically, such salts may be prepared by reacting the free acid or free base forms of such compounds with a stoichiometric amount of the corresponding base or acid in water, or in an organic solvent, or a mixture thereof; in general, non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile are preferred. Lists of suitable salts can be found in Allen, LV, Jr., ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 22nd Edition, Pharmaceutical Press, London, UK (2012), the disclosure of which is incorporated herein by reference.

Соединения по настоящему изобретению, которые содержат группы, способные действовать в качестве доноров и/или акцепторов в отношении водородных связей, могут быть способны к образованию сокристаллов с подходящими средствами для образования сокристаллов. Такие сокристаллы можно получать из соединений по настоящему изобретению посредством известных процедур образования сокристаллов. Такие процедуры включают измельчение, нагревание, совместную сублимацию, совместное плавление или приведение в контакт в растворе соединений по настоящему изобретению со средством для образования сокристаллов в условиях кристаллизации и выделение сокристаллов, образованных таким образом. Подходящие средства для образования сокристаллов включают средства, описанные в WO 2004/078163. Следовательно, в настоящем изобретении дополнительно предусмотрены сокристаллы, содержащие соединение по настоящему изобретению.Compounds of the present invention which contain groups capable of acting as hydrogen bond donors and/or acceptors may be capable of co-crystal formation with suitable co-crystal formation agents. Such co-crystals can be obtained from the compounds of the present invention by known co-crystal formation procedures. Such procedures include milling, heating, co-sublimation, co-melting or solution contacting the compounds of the present invention with a co-crystal forming agent under crystallization conditions and isolating the co-crystals thus formed. Suitable means for forming co-crystals include those described in WO 2004/078163. Therefore, the present invention further provides co-crystals containing the compound of the present invention.

Любая формула, приведенная в данном документе, также подразумевает присутствие немеченных форм, а также меченных изотопом форм соединений. Меченные изотопом соединения характеризуются структурами, изображенными на формулах, приведенных в данном документе, за исключением того, что один или несколько атомов замещены атомом, характеризующимся выбранными атомной массой или массовым числом. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора, хлора и йода, такие как ²H, ³H, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸F, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I соответственно. Настоящее изобретение включает различные меченные изотопом соединения, определенные в данном документе, например, соединения, в которых присутствуют радиоактивные изотопы, такие как ³H и ¹⁴C, или соединения, в которых присутствуют изотопы, не являющиеся радиоактивными, такие как ²H и ¹³C. Такие изотопно-меченные соединения являются пригодными в метаболических исследованиях (с применением ¹⁴C), в исследованиях кинетики реакций (например, с применением ²H или ³H), методиках выявления или визуализации, таких как позитронно-эмиссионная томография (PET) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT), включая анализы распределения лекарственного средства или субстрата в тканях, или при лечении пациентов радиоактивными изотопами. В частности, меченное ¹⁸F соединение может быть особенно востребованным для исследований с помощью PET или SPECT.Any formula given herein also implies the presence of unlabeled forms as well as isotopically labeled forms of the compounds. Isotopically labeled compounds are characterized by the structures depicted in the formulas given herein, except that one or more atoms are replaced by an atom characterized by the selected atomic mass or mass number. Examples of isotopes that can be included in the compounds of the present invention include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, fluorine, chlorine and iodine, such as ² H, ³ H, ¹¹ C, ¹³ C, ¹⁴ C, ¹⁵ N , ¹⁸ F, ³¹ P, ³² P, ³⁵ S, ³⁶ Cl, ¹²³ I, ¹²⁴ I, ¹²⁵ I, respectively. The present invention includes various isotopically labeled compounds as defined herein, for example, compounds in which radioactive isotopes are present, such as ³ H and ¹⁴ C, or compounds in which non-radioactive isotopes are present, such as ² H and ¹³ C Such isotopically labeled compounds are useful in metabolic studies (using ¹⁴ C), reaction kinetics studies (eg using ² H or ³ H), detection or imaging techniques such as positron emission tomography (PET) or single photon emission computed tomography (SPECT), including analyzes of the distribution of the drug or substrate in tissues, or in the treatment of patients with radioactive isotopes. In particular, the ¹⁸ F-labeled compound may be particularly useful for PET or SPECT studies.

Кроме того, замещение более тяжелыми изотопами, в частности, дейтерием (т. е. ²H или D), может обеспечивать определенные терапевтические преимущества, обусловленные более высокой метаболической стабильностью, например, увеличение периода полувыведения in vivo, или снижение требований в отношении дозировки, или улучшение в отношении терапевтического индекса. Следует понимать, что дейтерий в данном контексте рассматривается в качестве заместителя соединения по настоящему изобретению. Концентрация такого более тяжелого изотопа, в частности, дейтерия, может быть определена с помощью коэффициента обогащения изотопом. Используемый в данном документе термин "коэффициент изотопного обогащения" означает отношение содержания изотопа к распространенности в природе указанного изотопа. В случае если заместитель в соединении по настоящему изобретению представляет собой указанный дейтерий, такое соединение характеризуется коэффициентом изотопного обогащения для каждого обозначенного атома дейтерия, составляющим по меньшей мере 3500 (введение 52,5% дейтерия по каждому обозначенному атому дейтерия), по меньшей мере 4000 (введение 60% дейтерия), по меньшей мере 4500 (введение 67,5% дейтерия), по меньшей мере 5000 (введение 75% дейтерия), по меньшей мере 5500 (введение 82,5% дейтерия), по меньшей мере 6000 (введение 90% дейтерия), по меньшей мере 6333,3 (введение 95% дейтерия), по меньшей мере 6466,7 (введение 97% дейтерия), по меньшей мере 6600 (введение 99% дейтерия) или по меньшей мере 6633,3 (введение 99,5% дейтерия).In addition, substitution with heavier isotopes, in particular deuterium (i.e. ² H or D), may provide certain therapeutic advantages due to higher metabolic stability, such as increased in vivo half-life, or reduced dosage requirements, or improvement in therapeutic index. It should be understood that deuterium in this context is considered as a substituent of the compounds of the present invention. The concentration of such a heavier isotope, in particular deuterium, can be determined using the isotope enrichment factor. As used herein, the term "isotopic enrichment factor" means the ratio of the abundance of an isotope to the natural abundance of said isotope. When a substituent in a compound of the present invention is the indicated deuterium, such compound has an isotopic enrichment factor for each designated deuterium atom of at least 3500 (introduction of 52.5% deuterium per designated deuterium atom), at least 4000 ( injection of 60% deuterium), at least 4500 (introduction of 67.5% deuterium), at least 5000 (introduction of 75% deuterium), at least 5500 (introduction of 82.5% deuterium), at least 6000 (introduction of 90 % deuterium), at least 6333.3 (introduction of 95% deuterium), at least 6466.7 (introduction of 97% deuterium), at least 6600 (introduction of 99% deuterium), or at least 6633.3 (introduction of 99 .5% deuterium).

Например, дейтерированное соединение по настоящему изобретению может представлять собой:For example, the deuterated compound of the present invention may be:

Меченные изотопами соединения по настоящему изобретению в общем можно получать с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, или с помощью способов, раскрытых на схемах или в примерах и способах получения, описанных ниже (или способа, аналогичного описанным в данном документе), с заменой подходящим или легко доступным, меченным изотопом реагентом обычно применяемого, не меченного изотопом реагента. Такие соединения характеризуются рядом потенциальных вариантов применения, например, в качестве стандартов и реагентов при определении способности потенциального фармацевтического соединения связываться с белками-мишенями или целевыми рецепторами или для визуализации связывания соединений по настоящему изобретению с биологическими рецепторами in vivo или in vitro.The isotopically labeled compounds of the present invention may generally be prepared by conventional techniques known to those skilled in the art, or by the methods disclosed in the Schemes or in the Examples and Preparations described below (or in a manner similar to those described herein), replacing a suitable or readily available isotopically labeled reagent with a commonly used non-isotopically labeled reagent. Such compounds are characterized by a number of potential applications, for example, as standards and reagents in determining the ability of a potential pharmaceutical compound to bind to target proteins or target receptors or to visualize the binding of compounds of the present invention to biological receptorsin vivo orin vitro.

Термин "сольват" означает физическое объединение соединения по настоящему изобретению с одной или несколькими молекулами органического или неорганического растворителя. Это физическое объединение включает образование водородных связей. В определенных случаях сольват можно выделять, например, в тех случаях, когда одна или несколько молекул растворителя включены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. Молекулы растворителя в сольвате могут находиться в упорядоченном расположении и/или в неупорядоченном расположении. Сольват может содержать стехиометрическое или нестехиометрическое количество молекул растворителя. "Сольват" охватывает как сольваты в фазе раствора, так и поддающиеся выделению. Иллюстративные сольваты включают без ограничения гидраты, этанолаты, метанолаты и изопропанолаты. Способы сольватирования в целом являются известными из уровня техники.The term "solvate" means the physical combination of a compound of the present invention with one or more molecules of an organic or inorganic solvent. This physical association involves the formation of hydrogen bonds. In certain cases, the solvate can be isolated, for example, in cases where one or more solvent molecules are included in the crystal lattice of a crystalline solid. The solvent molecules in the solvate may be in an ordered arrangement and/or in a disordered arrangement. The solvate may contain a stoichiometric or non-stoichiometric amount of solvent molecules. "Solvate" encompasses both solvates in the solution phase and those that can be isolated. Illustrative solvates include, without limitation, hydrates, ethanolates, methanolates, and isopropanolates. Solvation methods are generally known in the art.

Используемый в данном документе термин "полиморф(-ы)" означает кристаллическуй(-ие) форму(-ы), характеризующуюся(-иеся) одной и той же химической структурой/составом, но отличающуюся(-иеся) пространственным расположением молекул и/или ионов, образующих кристаллы. Соединения по настоящему изобретению можно получать в виде аморфных твердых веществ или кристаллических твердых веществ. Для получения соединений по настоящему изобретению в виде твердого вещества можно применять лиофилизацию.As used herein, the term "polymorph(s)" means a crystalline form(s) characterized by the same chemical structure/composition but differing in the spatial arrangement of molecules and/or ions that form crystals. The compounds of the present invention can be obtained as amorphous solids or crystalline solids. Lyophilization can be used to obtain the compounds of the present invention as a solid.

"BRM" и "BRG1" означают два паралога субъединиц АТФазы в комплексе SWI/SNF, также известные как SMARCA2 и SMARCA4, соответственно. Если конкретно не указано иное, BRM, используемый в данном документе, означает BRM человека (Entrez Gene № 6595), последовательность белка которого в Swiss-Prot имеет номер доступа P51531.2; и BRG1, используемый в данном документе, означает BRG1 человека (Entrez Gene № 6597),последовательность белка которого в Swiss-Prot имеет номер доступа P51532.2. BRM, BRG1 и комплекс SWI/SNF описаны подробно в обзорах, таких как Wilson, BG, et al. Nat Rev Cancer. 2011 Jun 9;11(7):481-92. Геномная последовательность BRG1 (SMARCA4) характеризуется эталонной последовательностью в NCBI: NG_011556.1; ее mRNA являются результатом ряда сплайс-форм (т. е. вариантов транскриптов), которые включают идентификационные номера NM_001128844.1, NM_001128849.1, NM_001128845.1, NM_001128846.1, NM_001128847.1, NM_001128848.1 и NM_003072.3 в NCBI. Геномная последовательность BRM (SMARCA2) характеризуется эталонной последовательностью в NCBI: NC_000009.11; ее mRNA являются результатом двух сплайс-форм (т. е. вариантов транскриптов), которые включают идентификационные номера NM_003070.3 и NM_139045.2 в NCBI."BRM" and "BRG1" refer to the two paralogs of ATPase subunits in the SWI/SNF complex, also known as SMARCA2 and SMARCA4, respectively. Unless specifically stated otherwise, BRM as used herein means the human BRM (Entrez Gene No. 6595) whose protein sequence in Swiss-Prot is accession number P51531.2; and BRG1 as used herein is human BRG1 (Entrez Gene No. 6597), whose protein sequence is Swiss-Prot accession number P51532.2. BRM, BRG1 and the SWI/SNF complex are described in detail in reviews such as Wilson, BG, et al. Nat Rev Cancer. 2011 Jun 9;11(7):481-92. The BRG1 genomic sequence (SMARCA4) is characterized by the reference sequence in NCBI: NG_011556.1; its mRNAs are the result of a series of splice forms (i.e., transcript variants) that include identification numbers NM_001128844.1, NM_001128849.1, NM_001128845.1, NM_001128846.1, NM_001128847.1, NM_001128848.1, and NM_00 3072.3 at NCBI . The BRM genomic sequence (SMARCA2) is characterized by the reference sequence in NCBI: NC_000009.11; its mRNAs are the result of two splice forms (i.e., transcript variants) that include NCBI identification numbers NM_003070.3 and NM_139045.2.

Термин "опосредованное BRM нарушение или заболевание" означает любое нарушение или заболевание, которое непосредственно или опосредованно регулируется с помощью BRM. Термин "опосредованное BRG1 нарушение или заболевание" означает любое нарушение или заболевание, которое непосредственно или опосредованно регулируется с помощью BRG1. Опосредованное BRM или опосредованное BRG1 нарушение или заболевание может характеризоваться дефицитом BRG1 и/или дефицитом BRM. Опосредованное BRM или опосредованное BRG1 нарушение или заболевание может характеризоваться мутациями в субъединицах SWI/SNF, отличных от BRM/SMARCA2 или BRG1/SMARCA4, например, мутациями в ARID1A, ARID1B, ARID2, PBRM1, SMARCB1/SNF5, SMARCE1, SMARCC1, SMARCC2, PHF10, DPF1, DPF3, DPF2, ACTL6A, ACTL6B, SMARCD2, SMARCD3, SMARCD1, BCL11A, BCL11B, BCL7A, BCL7B, BCL7C, BRD9, BRD7, SS18 и ACTB. Опосредованное BRM или опосредованное BRG1 нарушение или заболевание может характеризоваться зависимостью от BRM, BRG1 или других субъединиц SWI/SNF, описанных выше, где указанная зависимость не связана с мутациями в BRM, BRG1 или других субъединиц SWI/SNF.The term "BRM-mediated disorder or disease" means any disorder or disease that is directly or indirectly regulated by BRM. The term "BRG1-mediated disorder or disease" means any disorder or disease that is directly or indirectly regulated by BRG1. A BRM mediated or BRG1 mediated disorder or disease may be characterized by BRG1 deficiency and/or BRM deficiency. A BRM-mediated or BRG1-mediated disorder or disease may be characterized by mutations in SWI/SNF subunits other than BRM/SMARCA2 or BRG1/SMARCA4, e.g., mutations in ARID1A, ARID1B, ARID2, PBRM1, SMARCB1/SNF5, SMARCE1, SMARCC1, SMARCC2, PHF10 , DPF1, DPF3, DPF2, ACTL6A, ACTL6B, SMARCD2, SMARCD3, SMARCD1, BCL11A, BCL11B, BCL7A, BCL7B, BCL7C, BRD9, BRD7, SS18 and ACTB. A BRM-mediated or BRG1-mediated disorder or disease may be characterized by dependence on BRM, BRG1, or other SWI/SNF subunits described above, where said dependence is not associated with mutations in BRM, BRG1, or other SWI/SNF subunits.

Термины "с дефицитом BRG1" и "дефицит BRG1" означают клетки (в том числе без ограничения раковые клетки, клеточные линии, ткани, типы тканей, опухоли и т. д.), у которых имеется мутация или делеция гена BRG1, или имеется значительное снижение в отношении продуцирования, экспрессии, уровня, стабильности и/или активности BRG1 относительно таковых в контроле, например, в референтных, или нормальных, или отличных от раковых клетках. Снижение может составлять по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления снижение составляет по меньшей мере 20%. В некоторых вариантах осуществления снижение составляет по меньшей мере 50%. Мутации в гене BRG1, которые приводят к потере функции, могут представлять собой такие как нонсенс-мутации, вставки/делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания, или миссенс-мутации. Клетки с дефицитом по BRG1 включают таковые, где ген BRG1 подвергся мутации или делеции.The terms "BRG1 deficient" and "BRG1 deficient" mean cells (including, without limitation, cancer cells, cell lines, tissues, tissue types, tumors, etc.) that have a mutation or deletion of the BRG1 gene, or have a significant a decrease in BRG1 production, expression, level, stability and/or activity relative to those in a control, eg in reference or normal or non-cancer cells. The reduction may be at least about 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%. In some embodiments, the reduction is at least 20%. In some embodiments, the reduction is at least 50%. Mutations in the BRG1 gene that result in loss of function may be such as nonsense mutations, frameshift insertions/deletions, or missense mutations. BRG1 deficient cells include those where the BRG1 gene has been mutated or deleted.

Термины "с дефицитом BRM" и "дефицит BRM" означают клетки (в том числе без ограничения раковые клетки, клеточные линии, ткани, типы тканей, опухоли и т. д.), у которых имеется мутация с потерей функции ("LOF") или делеция гена BRM, или имеется значительное снижение в отношении продуцирования, экспрессии, уровня, стабильности и/или активности BRM относительно таковых в контроле, например, в референтных, или нормальных, или отличных от раковых клетках. Снижение может составлять по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления снижение составляет по меньшей мере 20%. В некоторых вариантах осуществления снижение составляет по меньшей мере 50%. Клетки с дефицитом BRM включают таковые, где ген BRM подвергся мутации или делеции.The terms "BRM-deficient" and "BRM-deficient" mean cells (including, without limitation, cancer cells, cell lines, tissues, tissue types, tumors, etc.) that have a loss-of-function ("LOF") mutation or a deletion of the BRM gene, or there is a significant decrease in BRM production, expression, level, stability and/or activity relative to those in a control, eg in reference or normal or non-cancer cells. The reduction may be at least about 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%. In some embodiments, the reduction is at least 20%. In some embodiments, the reduction is at least 50%. BRM-deficient cells include those where the BRM gene has been mutated or deleted.

Термин "нарушение или заболевание, связанное с дефицитом BRG1" или "нарушение или заболевание, характеризующееся дефицитом BRG1" означает нарушение или заболевание, при котором клетки являются дефицитными по BRG1. Например, при нарушении или заболевании, связанном с дефицитом BRG1, одна или несколько подверженных заболеванию клеток могут характеризоваться мутацией или делецией гена BRG1, или характеризоваться значительным снижением в отношении продуцирования, экспрессии, уровня, стабильности и/или активности BRG1. У пациента, подверженного нарушению или заболеванию, связанному с дефицитом BRG1, может быть случай, в котором некоторые подверженные заболеванию клетки (например, раковые клетки) могут быть дефицитными по BRG1, в то время как остальные не будут таковыми.The term "disorder or disease associated with deficiency of BRG1" or "disorder or disease characterized by deficiency of BRG1" means a disorder or disease in which cells are deficient in BRG1. For example, in a BRG1 deficiency disorder or disease, one or more disease-prone cells may have a mutation or deletion of the BRG1 gene, or have a significant decrease in BRG1 production, expression, level, stability, and/or activity. In a patient susceptible to a disorder or disease associated with BRG1 deficiency, there may be a case in which some disease-prone cells (eg, cancer cells) may be BRG1 deficient while others are not.

Термин "нарушение или заболевание, связанное с дефицитом BRM" или "нарушение или заболевание, характеризующееся дефицитом BRM" означает нарушение или заболевание, при котором клетки являются дефицитными по BRM. Например, при нарушении или заболевании, связанном с дефицитом BRM, одна или несколько подверженных заболеванию клеток могут характеризоваться мутацией или делецией гена BRM, или характеризоваться значительным снижением в отношении продуцирования, экспрессии, уровня, стабильности и/или активности BRM. У пациента, подверженного нарушению или заболеванию, связанному с дефицитом BRM, может быть случай, в котором некоторые подверженные заболеванию клетки (например, раковые клетки) могут быть дефицитными по BRM, в то время как остальные не будут таковыми. The term "disorder or disease associated with deficiency of BRM" or "disorder or disease characterized by deficiency of BRM" means a disorder or disease in which cells are deficient in BRM. For example, in a disorder or disease associated with BRM deficiency, one or more disease-prone cells may have a BRM gene mutation or deletion, or a significant decrease in BRM production, expression, level, stability and/or activity. In a patient susceptible to a BRM deficiency disorder or disease, there may be a case in which some disease-prone cells (eg, cancer cells) may be BRM-deficient while others are not.

Термин "злокачественное новообразование", также называемое раком, означает заболевания, при которых аномальные клетки бесконтрольно делятся и могут проникать в близлежащие ткани. Злокачественные клетки также могут распространяться в другие части организма через кровеносную и лимфатическую системы. Существует несколько основных типов злокачественных новообразований. Карцинома представляет собой злокачественное новообразование, которое начинается в коже или в тканях, которые выстилают или покрывают внутренние органы. Саркома представляет собой злокачественное новообразование, которое берет начало в кости, хряще, жировой ткани, мышечной ткани, кровеносных сосудах или в другой соединительной или поддерживающей ткани. Лейкоз представляет собой злокачественное новообразование, которое начинается в кроветворной ткани, такой как костный мозг, и обуславливает выработку и попадание в кровоток большого числа аномальных клеток крови. Лимфома и множественная миелома представляют собой злокачественные новообразования, которые берут начало в клетках иммунной системы. Виды рака центральной нервной системы представляют собой злокачественные новообразования, которые берут начало в тканях головного мозга и спинного мозга.The term "malignancy," also called cancer, refers to diseases in which abnormal cells divide uncontrollably and can invade nearby tissues. Malignant cells can also spread to other parts of the body through the circulatory and lymphatic systems. There are several main types of malignant neoplasms. Carcinoma is a malignant neoplasm that begins in the skin or in the tissues that line or cover internal organs. Sarcoma is a malignant neoplasm that originates in bone, cartilage, adipose tissue, muscle tissue, blood vessels, or other connective or supporting tissue. Leukemia is a cancer that starts in blood-forming tissue, such as the bone marrow, and causes a large number of abnormal blood cells to be produced and released into the bloodstream. Lymphoma and multiple myeloma are malignant neoplasms that originate in cells of the immune system. Cancers of the central nervous system are malignant neoplasms that originate in the tissues of the brain and spinal cord.

Термин "солидная опухоль" означает злокачественные новообразования/виды рака, образованные из аномальных тканевых масс, которые обычно не содержат кист или жидких участков. Солидные опухоли называют/классифицируют в соответствии с тканью/клетками происхождения. Примеры включают без ограничения виды саркомы и виды карциномы.The term "solid tumor" means malignant neoplasms/cancers formed from abnormal tissue masses that usually do not contain cysts or fluid areas. Solid tumors are named/classified according to the tissue/cells of origin. Examples include, without limitation, sarcoma species and carcinoma species.

Термин "лейкоз" означает гематологические злокачественные новообразования/виды рака или злокачественные новообразования/виды рака клеток крови, которые берут начало в кроветворной ткани, такой как костный мозг. Примеры включают без ограничения острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелоидный лейкоз (CML), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL).The term "leukemia" means hematological malignancies/cancers or malignancies/cancers of blood cells that originate in hematopoietic tissue, such as bone marrow. Examples include, without limitation, acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia (CML), acute lymphocytic leukemia (ALL), and chronic lymphocytic leukemia (CLL).

Термин "лимфома" означает злокачественные новообразования/виды рака лимфатических клеток, которые берут начало в клетках иммунной системы. Примеры включают без ограничения неходжкинскую лимфому и множественную миелому.The term "lymphoma" refers to malignant neoplasms/cancers of the lymphatic cells that originate in cells of the immune system. Examples include, without limitation, non-Hodgkin's lymphoma and multiple myeloma.

Используемый в данном документе термин "пациент" охватывает все виды млекопитающих.As used herein, the term "patient" encompasses all mammalian species.

Используемый в данном документе термин "субъект" означает животное. Как правило, животное является млекопитающим. Субъект также означает, например, приматов (например, человека), коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей, рыб, птиц и т. п. В определенных вариантах осуществления субъектом является примат. В других вариантах осуществления субъектом является человек. Иллюстративные субъекты включают людей любого возраста с факторами риска развития онкологического заболевания. As used herein, the term "subject" means an animal. Typically, the animal is a mammal. Subject also means e.g. primates (e.g. humans), cows, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, rats, mice, fish, birds, and the like. In certain embodiments, the subject is a primate. In other embodiments, the subject is a human. Illustrative subjects include people of any age with risk factors for developing cancer.

При использовании в данном документе, субъект "нуждается" в лечении, если от такого лечения такой субъект (предпочтительно человек) получит пользу с биологической, медицинской точки зрения или с точки зрения качества его жизни.As used herein, a subject "needs" treatment if such treatment would benefit such subject (preferably a human) from a biological, medical, or quality of life point of view.

Используемые в данном документе термины "подавлять", "подавление" или "подавляющий" означают снижение или ослабление данного состояния, симптома, или нарушения, или заболевания, либо значительное снижение исходной активности в отношении биологической активности или процесса.As used herein, the terms "suppress", "inhibit", or "suppressive" means a reduction or amelioration of a given condition, symptom, or disorder, or disease, or a significant reduction in baseline activity in relation to a biological activity or process.

Используемые в данном документе термины "лечить", "осуществлять лечение" или "лечение" любого заболевания/нарушения означают лечение заболевания/нарушения у млекопитающего, в частности человека, и включают: (a) снижение тяжести заболевании/нарушении, (т. е. замедление, или остановку, или уменьшение интенсивности развития заболевания/нарушения или по меньшей мере одного из его клинических симптомов); (b) облегчение или модулирование течения заболевания/нарушения, (т. е. обеспечение регрессии заболевания/нарушения либо физически, (например, путем стабилизации явного симптома), либо физиологически (например, путем стабилизации физического параметра), либо посредством обоих из них); (c) облегчение или снижение тяжести по меньшей мере одного физического параметра, включая параметры, которые не могут быть различимы субъектом; и/или (d) предупреждение или замедление начала, или развития, или прогрессирования заболевания или нарушения у млекопитающего, в частности, если такое млекопитающее предрасположено к заболеванию или нарушению, но его наличие еще не было диагностировано.As used herein, the terms "treat", "treat" or "treat" any disease/disorder means the treatment of a disease/disorder in a mammal, in particular a human, and includes: (a) reducing the severity of the disease/disorder, (i.e. slowing down, or stopping, or reducing the intensity of the development of the disease/disorder or at least one of its clinical symptoms); (b) alleviate or modulate the course of the disease/disorder, (i.e. ensuring regression of the disease/disorder either physically, (for example, by stabilizing an overt symptom) or physiologically (for example, by stabilizing a physical parameter), or by both of them); (c) alleviating or reducing the severity of at least one physical parameter, including parameters that may not be discernible by the subject; and/or (d) preventing or slowing the onset or development or progression of a disease or disorder in a mammal, in particular if such mammal is predisposed to the disease or disorder but has not yet been diagnosed.

Термин "терапевтически эффективное количество" соединения по настоящему изобретению означает количество соединения по настоящему изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ у субъекта, например, снижение или подавление активности фермента или белка, или снижать тяжесть симптомов, облегчать состояния, замедлять или сдерживать прогрессирование заболевания, или предупреждать развитие заболевания и т. д. В одном неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению, которое при введении субъекту, является эффективным в отношении (1) по меньшей мере частичного облегчения, подавления, предупреждения и/или снижения тяжести состояния, или нарушения, или заболевания, опосредованного BRM и/или BRG1; или (2) снижения или подавления активности BRM и/или BRG1.The term "therapeutically effective amount" of a compound of the present invention means an amount of a compound of the present invention that will elicit a biological or medical response in a subject, such as reducing or inhibiting enzyme or protein activity, or reducing the severity of symptoms, alleviating conditions, slowing or controlling the progression of a disease , or prevent the development of a disease, etc. In one non-limiting embodiment, the term "therapeutically effective amount" means an amount of a compound of the present invention that, when administered to a subject, is effective in relation to (1) at least partially alleviate, suppress, prevent and /or reduce the severity of a condition or disorder or disease mediated by BRM and/or BRG1; or (2) reducing or suppressing BRM and/or BRG1 activity.

В другом неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению, которое при введении в клетку, или в ткань, или в неклеточный биологический материал, или в среду является эффективным в отношении по меньшей мере частичного снижения или подавления активности BRM и/или BRG1; или по меньшей мере частичного снижения или подавления экспрессии BRM и/или BRG1.In another non-limiting embodiment, the term "therapeutically effective amount" means an amount of a compound of the present invention which, when administered to a cell, or tissue, or non-cellular biological material, or environment, is effective in at least partially reducing or inhibiting BRM activity. and/or BRG1; or at least partially reducing or suppressing the expression of BRM and/or BRG1.

Эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как размер и вес субъекта, тип заболевания или конкретное соединение по настоящему изобретению. Специалист в данной области техники сможет изучить приведенные в данном документе факторы и принять решение в отношении эффективного количества соединения по настоящему изобретению без излишних экспериментов.The effective amount may vary depending on such factors as the size and weight of the subject, the type of disease, or the particular compound of the present invention. A person skilled in the art will be able to study the factors given herein and decide on the effective amount of the compound of the present invention without undue experimentation.

Схема приема может повлиять на то, что составляет эффективное количество. Соединение по настоящему изобретению можно вводить субъекту или до, или после начала опосредованного BRM и/или BRG1 состояния. Помимо этого, можно принимать несколько дробных доз, а также ступенчатые дозы, ежедневно или последовательно, или дозу можно вводить посредством инфузии непрерывно, или она может представлять собой болюсную инъекцию. Помимо этого, дозировки соединения(соединений) по настоящему изобретению можно пропорционально увеличивать или уменьшать в зависимости от требований терапевтической или профилактической ситуации.Dosing regimen can affect what constitutes an effective amount. The compound of the present invention can be administered to a subject either before or after the onset of a BRM and/or BRG1 mediated state. In addition, several divided doses can be taken, as well as stepwise doses, daily or sequentially, or the dose can be administered by infusion continuously, or it can be a bolus injection. In addition, dosages of the compound(s) of the present invention may be proportionally increased or decreased depending on the requirements of the therapeutic or prophylactic situation.

ПОЛУЧЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙGETTING CONNECTIONS

Соединения по настоящему изобретению можно получать с помощью ряда способов, известных специалисту в области органического синтеза, с учетом способов, реакционных схем и примеров, представленных в данном документе. Соединения по настоящему изобретению можно синтезировать с применением способов, описанных ниже, вместе со способами синтеза, известными в области химии органического синтеза, или с помощью их вариаций, понятных специалистам в данной области техники. Предпочтительные способы включают без ограничения способы, описанные ниже. Реакции проводят в растворителе или в смеси растворителей, соответствующих применяемым реагентам и материалам и пригодных для выполняемых превращений. Специалистам в области органического синтеза будет понятно, что функциональная группа, присутствующая в молекуле, должна соответствовать предполагаемым превращениям. Иногда это потребует информированного решения об изменении порядка стадий синтеза или о выборе какой-либо конкретной схемы способа вместо другой с целью получения необходимого соединения по настоящему изобретению.Compounds of the present invention can be obtained using a number of methods known to a person skilled in the field of organic synthesis, taking into account the methods, reaction schemes and examples presented in this document. The compounds of the present invention can be synthesized using the methods described below, together with methods of synthesis known in the field of organic chemistry, or using their variations, understandable to experts in this field of technology. Preferred methods include, without limitation, the methods described below. The reactions are carried out in a solvent or in a mixture of solvents appropriate to the reagents and materials employed and suitable for the transformations to be carried out. Those skilled in the art of organic synthesis will appreciate that the functional group present on the molecule must be appropriate for the intended transformations. This will sometimes require an informed decision to change the order of the steps in the synthesis, or to choose a particular process scheme over another, in order to obtain the desired compound of the present invention.

Исходные материалы обычно доступны из коммерческих источников, таких как Sigma-Aldrich или другие коммерческие поставщики, или их получают, как описано в настоящем изобретении, или их можно легко получать с применением способов, общеизвестных специалистам в данной области техники (например, получать с помощью способов, в общем описанных в Louis F. Fieser and Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, New York (1967-1999 ed.), Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations, 2^nd-ed., Wiley-VCH Weinheim, Germany (1999) или Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin, включая дополнения (также доступные с помощью онлайн-базы данных Beilstein)). Starting materials are usually available from commercial sources such as Sigma-Aldrich or other commercial suppliers, or they are obtained as described in the present invention, or they can be easily obtained using methods well known to those skilled in the art (for example, obtained using methods , generally described in Louis F. Fieser and Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, New York (1967-1999 ed.), Larock, R.C. , Comprehensive Organic Transformations , ^2nd- ed. , Wiley-VCH Weinheim, Germany (1999) or Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl.ed.Springer-Verlag, Berlin, including supplements (also available from the Beilstein online database)).

Для иллюстративных целей реакционные схемы, изображенные ниже, обеспечивают возможные пути синтеза соединений по настоящему изобретению, а также ключевых промежуточных соединений. Для более подробного описания отдельных стадий реакции см. раздел "Примеры" ниже. Специалистам в данной области техники будет понятно, что могут применяться другие пути синтеза для синтеза соединений по настоящему изобретению. Хотя конкретные исходные материалы и реагенты изображены на схемах и рассмотрены ниже, они могут быть легко заменены другими исходными материалами и реагентами для обеспечения разнообразия производных и/или условий реакции. Кроме того, многие из соединений, получаемых посредством описанных ниже способов, можно дополнительно модифицировать с учетом настоящего изобретения с применением общепринятых химических методик, общеизвестных специалистам в данной области техники.For illustrative purposes, the reaction schemes depicted below provide possible routes for the synthesis of the compounds of the present invention, as well as key intermediates. For a more detailed description of the individual reaction steps, see the "Examples" section below. Those skilled in the art will appreciate that other synthetic routes may be used to synthesize the compounds of the present invention. Although specific starting materials and reagents are depicted in the schemes and discussed below, they can be easily replaced with other starting materials and reagents to provide a variety of derivatives and/or reaction conditions. In addition, many of the compounds obtained by the methods described below can be further modified in accordance with the present invention using conventional chemical techniques well known to specialists in this field of technology.

При получении соединений по настоящему изобретению может потребоваться введение защитных групп для удаленной функциональной группы промежуточных соединений. Необходимость такого введения защитных групп будет варьироваться в зависимости от природы отдаленной функциональной группы и условий способов получения. Необходимость такого введения защитных групп легко определяется специалистом в данной области техники. Для общего описания защитных групп и их применения см. Greene, T.W. et al., Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., Wiley (2007). Защитные группы, используемые в ходе получения соединений по настоящему изобретению, такие как тритильная защитная группа, могут быть представлены в виде одного региоизомера, но также могут существовать в виде смеси региоизомеров.Upon receipt of the compounds of the present invention may require the introduction of protective groups for the remote functional group of the intermediate compounds. The need for such introduction of protecting groups will vary depending on the nature of the remote functional group and the conditions of the preparation methods. The need for such introduction of protective groups is easily determined by a person skilled in the art. For a general description of protecting groups and their applications, see Greene, TW et al., Protecting Groups in Organic Synthesis , 4th Ed., Wiley (2007). The protecting groups used in the preparation of the compounds of the present invention, such as the trityl protecting group, may be present as a single regioisomer, but may also exist as a mixture of regioisomers.

Следующие сокращения, применяемые в данном документе ниже, имеют соответствующие значения:The following abbreviations, as used in this document below, have their respective meanings:

(app) кажущийся; (br) широкий; (BSA) бычий сывороточный альбумин; (d) дублет; (dd) дублет дублетов; (DCM) дихлорметан; (DIPEA) диизопропилэтиламин; (DMF) N, N-диметилформамид; (DMSO) диметилсульфоксид; (ESI) ионизация электрораспылением; (Et) этил; (EtOAc) этилацетат; (ч.) час(ы); (HPLC) высокоэффективная жидкостная хроматография; (LAH) алюмогидрид лития; (LCMS) жидкостная хроматография и масс-спектрометрия; (LHMDS) гексаметилдисилазид лития; (MTBE) метил-трет-бутиловый эфир; (MeCN) ацетонитрил; (MeOH) метанол; (МГц) мегагерц; (MS) масс-спектрометрия; (m) мультиплет; (мг) миллиграмм; (мин.) минуты; (мл) миллилитр; (ммоль) миллимоль; (масса/заряд) соотношение массы к заряду; (ЯМР) ядерный магнитный резонанс; (Ph) фенил; (ppm) частиц на миллион; (q) квартет; (Rt) время удерживания; (к. т.) комнатная температура; (s) синглет; (t) триплет; (TBDMS) трет-бутилдиметилсилил; (трет) третичный; (TFA) трифторуксусная кислота; (THF) тетрагидрофуран; (TMAF) фторид тетраметиламмония; (TMS) триметилсилил.(app) apparent; (br) wide; (BSA) bovine serum albumin; (d) doublet; (dd) doublet of doublets; (DCM) dichloromethane; (DIPEA) diisopropylethylamine; (DMF) N,N-dimethylformamide; (DMSO) dimethyl sulfoxide; (ESI) electrospray ionization; (Et) ethyl; (EtOAc) ethyl acetate; (h) hour(s); (HPLC) high performance liquid chromatography; (LAH) lithium aluminum hydride; (LCMS) liquid chromatography and mass spectrometry; (LHMDS) lithium hexamethyldisilazide; (MTBE) methyl tert-butyl ether; (MeCN) acetonitrile; (MeOH) methanol; (MHz) megahertz; (MS) mass spectrometry; (m) multiplet; (mg) milligram; (min.) minutes; (ml) milliliter; (mmol) millimoles; (mass/charge) ratio of mass to charge; (NMR) nuclear magnetic resonance; (Ph) phenyl; (ppm) parts per million; (q) quartet; (Rt) retention time; (k. t.) room temperature; (s) singlet; (t) triplet; (TBDMS) t-butyldimethylsilyl; (tert) tertiary; (TFA) trifluoroacetic acid; (THF) tetrahydrofuran; (TMAF) tetramethylammonium fluoride; (TMS) trimethylsilyl.

Способы LC/MS, применяемые для определения характеристик в примерахLC/MS Methods Used to Characterize the Examples

Данные по LC/MS получали с применением системы 1100 HPLC от Agilent с Micromass ZQ от Waters или ACQUITY UPLC от Qaters с детектором SQ от Waters или с детектором ACQUITY Qda 25 от Waters. Способы, применяемые для получения всех данных LCMS, описаны ниже.LC/MS data were obtained using an Agilent 1100 HPLC system with Waters Micromass ZQ or Qaters ACQUITY UPLC with Waters SQ detector or Waters ACQUITY Qda 25 detector. The methods used to obtain all LCMS data are described below.

Способ LCMS 1LCMS Method 1

Колонка Sunfire C18, 3,0 × 30 мм, 3,5 мкмColumn Sunfire C18, 3.0 × 30 mm, 3.5 µm

Температура колонки 40°CColumn temperature 40°C

Элюенты A: H₂O, содержащая 0,05% TFA, B: MeCN Eluents A: H ₂ O containing 0.05% TFA, B: MeCN

Расход 2,0 мл/мин.Flow rate 2.0 ml/min.

Градиент от 5% до 95% B за 1,7 мин., в течение 0,3 мин. 95% BGradient from 5% to 95% B in 1.7 min, within 0.3 min. 95% B

Способ LCMS 2LCMS Method 2

Колонка XBridge C18, 3,0 × 30 мм, 3,5 мкмColumn XBridge C18, 3.0 × 30 mm, 3.5 µm

Температура колонки 40°CColumn temperature 40°C

Элюенты A: H₂O+5 мМ гидроксида аммония, B: MeCN Eluents A: H ₂ O + 5 mM ammonium hydroxide, B: MeCN

Расход 2,0 мл/мин.Flow rate 2.0 ml/min.

Градиент от 5% до 95% B за 1,7 мин., в течение 0,3 мин. 95% BGradient from 5% to 95% B in 1.7 min, within 0.3 min. 95% B

Способ LCMS 3LCMS Method 3

Колонка AcQuity UPLC BEH C18, 2,1 × 30 мм, 1,7 мкмColumn AcQuity UPLC BEH C18, 2.1 × 30 mm, 1.7 µm

Температура колонки 50°CColumn temperature 50°C

Элюенты A: 0,1% муравьиной кислоты в воде, B: 0,1% муравьиной кислоты в MeCN Eluents A: 0.1% formic acid in water, B: 0.1% formic acid in MeCN

Расход 1,0 мл/мин.Flow rate 1.0 ml/min.

Градиент от 2% до 98% B за 1,5 мин., в течение 0,3 мин. 98% BGradient from 2% to 98% B in 1.5 min, within 0.3 min. 98% B

Способ LCMS 4LCMS Method 4

Колонка AcQuity UPLC BEH C18, 2,1 × 30 мм, 1,7 мкмColumn AcQuity UPLC BEH C18, 2.1 × 30 mm, 1.7 µm

Температура колонки 50°CColumn temperature 50°C

Элюенты A: 5 мМ NH₄OH в воде , B: 5 мМ NH₄OH в MeCNEluents A: 5 mM NH ₄ OH in water, B: 5 mM NH ₄ OH in MeCN

Расход 1,0 мл/мин.Flow rate 1.0 ml/min.

Градиент от 1% до 30% B за 1,2 мин., от 30% до 98% B за 0,95 мин.Gradient from 1% to 30% B in 1.2 minutes, from 30% to 98% B in 0.95 minutes.

ЯМР, применяемый для определения характеристик в примерахNMR used to characterize the examples

Спектры ¹H ЯМР получали на спектрометрах с преобразованием Фурье от Bruker при следующих значениях частоты: ¹H ЯМР: 400 МГц (Bruker). Спектральные данные приведены в формате: химический сдвиг (мультиплетность, число атомов водорода). Химические сдвиги указаны в ppm в сторону слабого поля от внутреннего стандарта в виде тетраметилсилана (единицы δ, тетраметилсилан=0 ppm) и/или относительно пиков растворителя, которые в спектрах ¹H ЯМР видны при 2,50 ppm для CD₃SOCD₃, 3,31 ppm для CD₃OD, 1,94 ppm для CD₃CN, 4,79 ppm для D₂O, 5,32 ppm для CD₂Cl₂ и 7,26 ppm для CDCl₃. ¹ H NMR spectra were obtained on Bruker Fourier transform spectrometers at the following frequencies: ¹ H NMR: 400 MHz (Bruker). Spectral data are given in the format: chemical shift (multiplicity, number of hydrogen atoms). Chemical shifts are given in ppm downfield from the internal standard tetramethylsilane (δ units, tetramethylsilane=0 ppm) and/or relative to solvent peaks seen in ¹ H NMR spectra at 2.50 ppm for CD ₃ SOCD ₃ , 3 .31 ppm for CD ₃ OD, 1.94 ppm for CD ₃ CN, 4.79 ppm for D ₂ O, 5.32 ppm for CD ₂ Cl ₂ and 7.26 ppm for CDCl ₃ .

Способы, применяемые для очистки соединений из примеровMethods Used to Purify Example Compounds

Очистку промежуточных соединений и конечных продуктов проводили с помощью либо хроматографии с нормальной фазой, либо хроматографии с обращенной фазой, либо сверхкритической флюидной хроматографии (SFC). Хроматографию с нормальной фазой проводили с применением предварительно заполненных картриджей SiO₂ (например, колонки RediSep® Rf от Teledyne Isco, Inc.) с градиентами элюирования подходящими системами растворителей (например, гептан и этилацетат; DCM и MeOH; или если не указано иное). Препаративную HPLC с обращенной фазой проводили с применением способов, описанных ниже.Purification of intermediates and final products was performed using either normal phase chromatography, or reverse phase chromatography, or supercritical fluid chromatography (SFC). Normal phase chromatography was performed using pre-filled SiO ₂ cartridges (eg, RediSep® Rf columns from Teledyne Isco, Inc.) with elution gradients with suitable solvent systems (eg, heptane and ethyl acetate; DCM and MeOH; or unless otherwise noted). Preparative reverse phase HPLC was performed using the methods described below.

(1) Основной способ: колонка XBridge 5 мкм, 5 мМ NH₄OH в ацетонитриле и воде.(1) Basic method: XBridge 5 µm column, 5 mM NH ₄ OH in acetonitrile and water.

(2) Способ с применением муравьиной кислоты: колонка XBridge 5 мкм; 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле и воде.(2) Formic acid method: XBridge 5 µm column; 0.1% formic acid in acetonitrile and water.

Описанные выше способы HPLC проводят при сфокусированном градиенте от 15% ацетонитрила до 40% ацетонитрила.The HPLC methods described above are run with a focused gradient from 15% acetonitrile to 40% acetonitrile.

ОБЩИЕ СХЕМЫ СИНТЕЗАGENERAL SYNTHESIS SCHEMES

На схемах 1 и 2 (показанных ниже) описаны возможные пути получения соединений по настоящему изобретению, которые включают соединения формулы (I), где R¹-R⁶ определены в "Кратком описании изобретения". Исходные материалы для приведенной ниже реакционной схемы являются коммерчески доступными, или их можно получать в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники, или с помощью способов, раскрытых в данном документе. Соединения формулы (I) можно получать по сути оптически чистыми в результате применения либо по сути оптически чистых исходных материалов, либо разделительной хроматографии, перекристаллизации или других методик разделения, общеизвестных в уровне техники. Более подробное описание см. в разделе «Примеры» ниже.Schemes 1 and 2 (shown below) describe possible routes for the preparation of the compounds of the present invention, which include compounds of formula (I) wherein R ¹ -R ⁶ are defined in the "Summary of the Invention". Starting materials for the following reaction scheme are commercially available, or they can be obtained in accordance with methods known to a person skilled in the art, or using the methods disclosed in this document. Compounds of formula (I) can be obtained essentially optically pure using either essentially optically pure starting materials, or separation chromatography, recrystallization, or other separation techniques well known in the prior art. See the Examples section below for a more detailed description.

Схема 1Scheme 1

Стадия (a) включает осуществление реакции (не)замещенного фенилхлорформиата (например, R может представлять собой H или нитрогруппу) с (не)замещенным 4-аминопиридином в подходящем растворителе, таком как DCM или диоксан, в присутствии подходящего основания, такого как пиридин, при подходящей температуре, такой как к. т.Step (a) involves reacting an (un)substituted phenyl chloroformate (e.g. R may be H or a nitro group) with an (un)substituted 4-aminopyridine in a suitable solvent such as DCM or dioxane in the presence of a suitable base such as pyridine, at a suitable temperature, such as r.t.

Стадия (b) включает осуществление реакции замещенного 5-амино-изотиазола (или замещенных 3-аминобензотиазолов) с промежуточным соединением на основе карбамата, полученным на стадии (a), в подходящем растворителе, таком как THF или диоксан, в присутствии подходящего основания, такого как диизопропилэтиламин, при подходящей температуре, такой как 60°C. В качестве альтернативы, замещенный 5-амино-изотиазол (или замещенные 3-аминобензотиазолы) можно сначала подвергать депротонированию с помощью подходящего основания, такого как LHMDS, затем вводить в реакцию с промежуточным соединением на основе карбамата, полученным на стадии (a). После образования мочевины группы R¹ - R⁶ можно подвергать дополнительным преобразованиям, которые требуются для получения требуемых продуктов.Step (b) comprises reacting the substituted 5-aminoisothiazole (or substituted 3-aminobenzothiazoles) with the carbamate intermediate from step (a) in a suitable solvent such as THF or dioxane in the presence of a suitable base such as as diisopropylethylamine at a suitable temperature such as 60°C. Alternatively, the substituted 5-aminoisothiazole (or substituted 3-aminobenzothiazoles) can first be deprotonated with a suitable base such as LHMDS, then reacted with the carbamate intermediate from step (a). After the formation of urea groups R ¹ - R ⁶ can be subjected to additional transformations that are required to obtain the desired products.

Получение продукта мочевины включает осуществление реакции (не)замещенного 4-аминопиридина с трифосгеном, затем с замещенным 5-амино-изотиазолом в подходящем растворителе, таком как THF, в присутствии подходящего основания, такого как триэтиламин, при подходящей температуре, такой как к. т. После образования мочевины группы R¹ - R⁶ можно подвергать дополнительным преобразованиям, которые требуются для получения требуемых продуктов.Preparation of the urea product involves reacting a (un)substituted 4-aminopyridine with triphosgene, then with a substituted 5-aminoisothiazole in a suitable solvent such as THF in the presence of a suitable base such as triethylamine at a suitable temperature such as r.t. After the formation of urea, the groups R ¹ - R ⁶ can be subjected to additional transformations that are required to obtain the desired products.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Следующие примеры были получены, выделены и охарактеризованы с применением способов, раскрытых в данном документе. Следующие примеры демонстрируют частичный объем настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.The following examples were obtained, isolated and characterized using the methods disclosed in this document. The following examples demonstrate a partial scope of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

Если не указано иное, исходные материалы являются общедоступными из неограничивающих коммерческих источников, таких как TCI Fine Chemicals (Япония), Aurora Fine Chemicals LLC (Сан-Диего, Калифорния), FCH Group (Украина), Aldrich Chemicals Co. (Милуоки, Висконсин), Acros Organics (Фэрлон, Нью-Джерси), Maybridge Chemical Company, Ltd. (Корнуолл, Англия), Matrix Scientific (США), Enamine Ltd (Украина), Combi-Blocks, Inc. (Сан-Диего, США), Oakwood Products, Inc. (США), Apollo Scientific Ltd. (Великобритания).Unless otherwise noted, starting materials are publicly available from non-limiting commercial sources such as TCI Fine Chemicals (Japan), Aurora Fine Chemicals LLC (San Diego, CA), FCH Group (Ukraine), Aldrich Chemicals Co. (Milwaukee, WI), Acros Organics (Fairlon, NJ), Maybridge Chemical Company, Ltd. (Cornwall, England), Matrix Scientific (USA), Enamine Ltd (Ukraine), Combi-Blocks, Inc. (San Diego, USA), Oakwood Products, Inc. (USA), Apollo Scientific Ltd. (Great Britain).

Пример 1Example 1

1-(2-Хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина1-(2-Chloropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

К смеси 2-хлор-4-аминопиридина (1,57 г, 12,25 ммоль) и пиридина (1,38 мл, 17,05 ммоль) в DCM (100 мл) при 0°C добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (2,6 г, 12,89 ммоль). Смесь поддерживали при 0°C в течение 2 мин., затем нагревали до к. т. Еще через 20 мин. смесь концентрировали in vacuo с получением остатка, который поглощали в диоксан (80 мл). Быстро добавляли раствор 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (1,60 г, 10,66 ммоль) в диоксане (10 мл), затем DIPEA (6,51 мл, 37,3 ммоль). Смесь нагревали до 60°C. Через 3 ч. смесь охлаждали до к. т., затем добавляли воду и EtOAc. Органический слой несколько раз промывали водой, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором. Органическую фазу высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением остатка, который очищали посредством флэш-хроматографии (EtOH/EtOAc/гептан). Частично очищенный остаток растирали в порошок с использованием простого эфира, и полученное твердое вещество поглощали в воду. С помощью лиофилизации удаляли остаточный простой эфир с получением указанного в заголовке соединения. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,08 (s, 1H), 10,15 (s, 1H), 8,26 (d, J=4 Гц, 1H), 7,68 (d, J=2 Гц, 1H), 7,46 (dd, J=4, 2 Гц, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,97 (t, J=52 Гц, 1H). MS (ESI) масса/заряд 305,1 [M+H]⁺. LCMS: Rt=1,25 мин, масса/заряд 305,1 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,08 (s, 1H), 10,15 (s, 1H), 8,26 (d, J=4 Гц, 1H), 7,68 (d, J=2 Гц, 1H), 7,46 (dd, J=4, 2 Гц, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,97 (t, J=52 Гц, 1H).To a mixture of 2-chloro-4-aminopyridine (1.57 g, 12.25 mmol) and pyridine (1.38 ml, 17.05 mmol) in DCM (100 ml) was added at 0°C 6 g, 12.89 mmol). The mixture was maintained at 0°C for 2 min., then heated to rt. After another 20 min. the mixture was concentrated in vacuo to give a residue which was taken up in dioxane (80 ml). A solution of 3-(difluoromethyl)isothiazol-5-amine (intermediate 1) (1.60 g, 10.66 mmol) in dioxane (10 ml) was added rapidly, followed by DIPEA (6.51 ml, 37.3 mmol). The mixture was heated to 60°C. After 3 hours, the mixture was cooled to rt, then water and EtOAc were added. The organic layer was washed several times with water, saturated aqueous sodium bicarbonate and brine. The organic phase was dried over sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo to give a residue which was purified by flash chromatography (EtOH/EtOAc/heptane). The partially purified residue was triturated using ether and the resulting solid was taken up in water. Residual ether was removed by lyophilization to give the title compound. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.08 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 8.26 (d, J=4 Hz, 1H), 7.68 (d, J=2 Hz, 1H), 7.46 (dd, J=4, 2 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.97 (t, J=52 Hz, 1H). MS (ESI) mass/charge 305.1 [M+H] ⁺ . LCMS: Rt=1.25 min, mass/charge 305.1 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.08 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 8.26 (d, J=4 Hz, 1H), 7.68 (d , J=2 Hz, 1H), 7.46 (dd, J=4, 2 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.97 (t, J=52 Hz, 1H).

Пример 2Example 2

1-(2-Хлорпиридин-4-ил)-3-(3-метилизотиазол-5-ил)мочевина1-(2-Chloropyridin-4-yl)-3-(3-methylisothiazol-5-yl)urea

Раствор 2-хлор-4-аминопиридина (101 мг, 0,786 ммоль) в THF (2 мл) медленно добавляли к раствору трифосгена (101 мг, 0,340 ммоль) в THF (2 мл) при к. т. Затем добавляли триэтиламин (0,11 мл, 0,790 ммоль). После перемешивания смеси при к. т. в течение 20 мин. добавляли смесь 3-метил-5-амино-изотиазола гидрохлорида (120 мг, 0,797 ммоль) и триэтиламина (0,12 мл, 0,863 ммоль) в THF (2 мл). Смесь перемешивали при к. т. в течение 18 ч. и разделяли между EtOAc и водным раствором KOH. Объединенный органический экстракт высушивали над MgSO₄ и концентрировали. Остаток очищали посредством HPLC (основной способ) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,85 мин, масса/заряд 269,0 (M+H) (LCMS способ 2). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 10,78 (s, 1H), 9,87 (s, 1H), 8,24 (d, J=4 Гц, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,43 (d, J=4 Гц, 1H), 6,73 (s, 1H), 2,30 (s, 3H).A solution of 2-chloro-4-aminopyridine (101 mg, 0.786 mmol) in THF (2 mL) was slowly added to a solution of triphosgene (101 mg, 0.340 mmol) in THF (2 mL) at rt. Triethylamine (0. 11 ml, 0.790 mmol). After stirring the mixture at room temperature for 20 min. a mixture of 3-methyl-5-amino-isothiazole hydrochloride (120 mg, 0.797 mmol) and triethylamine (0.12 ml, 0.863 mmol) in THF (2 ml) was added. The mixture was stirred at RT for 18 hours and partitioned between EtOAc and aqueous KOH. The combined organic extract was dried over MgSO ₄ and concentrated. The residue was purified by HPLC (basic method) to give the title compound. LCMS: Rt=0.85 min, mass/charge 269.0 (M+H) (LCMS method 2). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 10.78 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 8.24 (d, J=4 Hz, 1H), 7.66 (s , 1H), 7.43 (d, J=4 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 2.30 (s, 3H).

Пример 3Example 3

1-(2-Хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(трифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина1-(2-Chloropyridin-4-yl)-3-(3-(trifluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

К ледяной смеси 3-(трифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 2) (70 мг, 0,41 ммоль) и фенил(2-хлорпиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 3) (104 мг, 0,41 ммоль) в DMF (1,2 мл) добавляли раствор LHMDS (1 М в THF, 0,41 мл, 0,41 ммоль). Обеспечивали нагревание смеси до к. т. и перемешивали ее в течение 16 ч. Смесь концентрировали in vacuo, затем очищали посредством HPLC (основной способ) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,38 мин, масса/заряд 323 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,21 (br s, 1H), 10,18 (br s, 1H), 8,23 (d, J=5,6 Гц, 1H), 7,69 (d, J=1,8 Гц, 1H), 7,46 (dd, J=5,7, 1,9 Гц, 1H), 7,22 (s, 1H).To an ice-cold mixture of 3-(trifluoromethyl)isothiazol-5-amine (intermediate 2) (70 mg, 0.41 mmol) and phenyl(2-chloropyridin-4-yl)carbamate (intermediate 3) (104 mg, 0.41 mmol) 41 mmol) in DMF (1.2 ml) was added a solution of LHMDS (1 M in THF, 0.41 ml, 0.41 mmol). The mixture was allowed to warm to rt and stirred for 16 h. The mixture was concentrated in vacuo, then purified by HPLC (basic method) to give the title compound. LCMS: Rt=1.38 min, mass/charge 323 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.21 (br s, 1H), 10.18 (br s, 1H), 8.23 (d, J=5.6 Hz, 1H), 7, 69 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.46 (dd, J=5.7, 1.9 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H).

Пример 4Example 4

1-(5-Амино-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина1-(5-Amino-2-chloropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

Смесь 1-(5-нитро-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (промежуточное соединение 5) (7,63 г, 21,82 ммоль), железа (4,87 г, 87 ммоль) и хлорида аммония (9,34 г, 175 ммоль) в этаноле (84 мл) и воде (25 мл) нагревали в течение 1 ч. при 50°C. Смесь фильтровали через целит, осадок на фильтре ополаскивали с помощью MeOH и фильтрат концентрировали in vacuo. Остаток поглощали в EtOAc и промывали солевым раствором. Органическую фракцию высушивали над сульфатом магния и концентрировали in vacuo с получением остатка, который очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с последующей очисткой, представляющей собой очистку с применением ISCO с обращенной фазой на колонке C18 с элюированием водой+0,1% муравьиной кислоты и ацетонитрилом+0,1% муравьиной кислоты. LCMS: Rt=0,76 мин, масса/заряд=320,2 (M+H) (LCMS способ 2). ¹H ЯМР (400 МГц, Метанол-d₄) δ 7,88 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 6,99 (s, 1H), 6,66 (t, J=54,9 Гц, 1H).1-(5-Nitro-2-chloropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea mixture (Intermediate 5) (7.63 g, 21.82 mmol), iron (4.87 g, 87 mmol) and ammonium chloride (9.34 g, 175 mmol) in ethanol (84 ml) and water (25 ml) were heated for 1 hour at 50°C. The mixture was filtered through celite, the filter cake was rinsed with MeOH and the filtrate was concentrated in vacuo. The residue was taken up in EtOAc and washed with brine. The organic layer was dried over magnesium sulfate and concentrated in vacuo to give a residue which was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) followed by purification using reverse phase ISCO on a C18 column eluting with water + 0.1% formic acid. acid and acetonitrile+0.1% formic acid. LCMS: Rt=0.76 min, mass/charge=320.2 (M+H) (LCMS method 2). ¹ H NMR (400 MHz, Methanol-d ₄ ) δ 7.88 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.66 (t, J=54, 9 Hz, 1H).

Пример 5Example 5

1-(2-Хлор-5-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина1-(2-Chloro-5-(hydroxymethyl)pyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

Стадия 1. Синтез 1-(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины Stage 1 . Synthesis of 1-(5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-chloropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

LHMDS (1 М в THF, 9,2 мл, 9,2 ммоль) по каплям добавляли к раствору фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 6) (3,46 г, 8,81 ммоль) и 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (1,15 г, 7,66 ммоль) в DMF (30 мл) и реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили с помощью MeOH (10 мл) и летучие вещества удаляли in vacuo. Остаток поглощали в EtOAc/насыщенный водный раствор NH₄Cl 1:1 и слои разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан). LCMS: Rt₌1,79 мин, масса/заряд=449,2 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,39 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,19 (s, 1H), 6,96 (t, J=54,5 Гц, 1H), 4,79 (s, 2H), 0,86 (s, 9H), 0,07 (s, 6H).LHMDS (1M in THF, 9.2 mL, 9.2 mmol) was added dropwise to a solution of phenyl (5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-chloropyridin-4-yl)carbamate (intermediate 6) (3.46 g, 8.81 mmol) and 3-(difluoromethyl)isothiazol-5-amine (intermediate 1) (1.15 g, 7.66 mmol) in DMF (30 ml) and the reaction mixture was stirred at k. t. for 30 min. The reaction mixture was quenched with MeOH (10 ml) and the volatiles were removed in vacuo. The residue was taken up in EtOAc/saturated aqueous NH ₄ Cl 1:1 and the layers were separated. The aqueous layer was extracted with EtOAc. The organic layers were combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and the volatiles were removed in vacuo. The crude residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane). LCMS: Rt ₌ 1.79 min, mass/charge=449.2 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.39 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7, 19 (s, 1H), 6.96 (t, J=54.5 Hz, 1H), 4.79 (s, 2H), 0.86 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).

Стадия 2. Синтез 1-(2-хлор-5-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины Stage 2 . Synthesis of 1-(2-chloro-5-(hydroxymethyl)pyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

TBAF (1 М в THF, 2,45 мл, 2,45 ммоль) добавляли к раствору 1-(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (полученной на стадии 1 выше) (1,1 г, 2,45 ммоль) в THF (8 мл) и смесь перемешивали при к. т. в течение 2 ч. Реакционную смесь выливали в воду и продукт экстрагировали с помощью EtOAc. Органический экстракт объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Неочищенный продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (MeOH/DCM) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,78 мин, масса/заряд=335,2 (M+H) (LCMS способ 2). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,75 (s, 1H), 9,22 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,20 (s, 1H), 6,97 (t, J=56 Гц, 1H), 5,79 (t, J=5 Гц, 1H), 4,59 (d, J=5 Гц, 2H).TBAF (1 M in THF, 2.45 ml, 2.45 mmol) was added to a solution of 1-(5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-chloropyridin-4-yl)-3-(3 -(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea (prepared in step 1 above) (1.1 g, 2.45 mmol) in THF (8 mL) and the mixture was stirred at RT for 2 h. poured into water and the product was extracted with EtOAc. The organic extract was combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and the volatiles were removed in vacuo. The crude product was purified by silica gel chromatography (MeOH/DCM) to give the title compound. LCMS: Rt=0.78 min, mass/charge=335.2 (M+H) (LCMS method 2). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.75 (s, 1H), 9.22 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7 .20 (s, 1H), 6.97 (t, J=56 Hz, 1H), 5.79 (t, J=5 Hz, 1H), 4.59 (d, J=5 Hz, 2H).

Пример 6Example 6

1-(5-Амино-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина1-(5-Amino-2-fluoropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

Смесь 1-(5-нитро-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (промежуточное соединение 5) (3,77 г, 8,62 ммоль), TMAF (3,61 г, 38,8 ммоль) и DMF (83 мл) нагревали при 75°C в течение 1 ч. Реакционную смесь гасили водой и экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фракции промывали водой, солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток затем очищали посредством флэш-хроматографии (EtOAc/гептан) с получением частично очищенного продукта (2,73 г), который поглощали в этанол (100 мл) и воду (20 мл). Добавляли хлорид аммония (2,13 г, 39,8 ммоль) и железо (1,91 г, 34,2 ммоль) и смесь нагревали до 45°C в течение 30 мин. Реакционную смесь затем фильтровали через небольшой слой целита, который промывали с помощью MeOH. Фильтрат концентрировали и затем разбавляли с помощью EtOAc и воды. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фракции промывали солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток последовательно очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан), а затем посредством очистки с помощью ISCO с обращенной фазой на колонке C18 с элюированием водой+0,1% муравьиной кислоты и ацетонитрилом+0,1% муравьиной кислоты. В заключение небольшое количество неочищенных фракций очищали посредством HPLC (способ с использованием муравьиной кислоты) и объединенные фракции предусматривали получение указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,12 мин, масса/заряд 304,2 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,15 (s, 1H), 8,92 (s, 1H), 7,63 (d, J=0,9 Гц, 1H), 7,46 (d, J=0,8 Гц, 1H), 7,14 (s, 1H), 6,95 (t, J=54,5 Гц, 1H), 4,82 (s, 2H).1-(5-Nitro-2-chloropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea mixture (Intermediate 5) (3.77 g, 8.62 mmol), TMAF (3.61 g, 38.8 mmol) and DMF (83 ml) were heated at 75°C for 1 h. The reaction mixture was quenched with water and extracted with EtOAc. The combined organic fractions were washed with water, brine, then dried with sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo. The residue was then purified by flash chromatography (EtOAc/heptane) to give a partially purified product (2.73 g) which was taken up in ethanol (100 ml) and water (20 ml). Ammonium chloride (2.13 g, 39.8 mmol) and iron (1.91 g, 34.2 mmol) were added and the mixture heated to 45° C. for 30 min. The reaction mixture was then filtered through a small pad of celite, which was washed with MeOH. The filtrate was concentrated and then diluted with EtOAc and water. The aqueous layer was extracted with EtOAc. The combined organic fractions were washed with brine, then dried with sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo. The residue was purified sequentially by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) and then by reverse phase ISCO purification on a C18 column eluting with water + 0.1% formic acid and acetonitrile + 0.1% formic acid. Finally, a small amount of the crude fractions were purified by HPLC (formic acid method) and the combined fractions provided the title compound. LCMS: Rt=1.12 min, mass/charge 304.2 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.15 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 7.63 (d, J=0.9 Hz, 1H), 7.46 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.95 (t, J=54.5 Hz, 1H), 4.82 (s, 2H).

Пример 7Example 7

1-(3-(Дифторметил)изотиазол-5-ил)-3-(2-фтор-5-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)мочевина1-(3-(Difluoromethyl)isothiazol-5-yl)-3-(2-fluoro-5-(hydroxymethyl)pyridin-4-yl)urea

Стадия 1. Синтез 1-(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины. Step 1. Synthesis of 1-(5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea.

К раствору 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (48 мг, 0,323 ммоль) и фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 7) (135 мг, 0,323 ммоль) в DMF (2 мл) добавляли LHMDS (1 М в THF, 0,484 мл, 0,484 ммоль) и полученную смесь перемешивали при к. т. в течение 30 мин. Смесь концентрировали in vacuo и продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,76 мин, масса/заряд 433,2 (M+H) (LCMS способ 1To a solution of 3-(difluoromethyl)isothiazol-5-amine (intermediate 1) (48 mg, 0.323 mmol) and phenyl(5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridin-4-yl)carbamate (intermediate 7) (135 mg, 0.323 mmol) in DMF (2 ml) was added LHMDS (1 M in THF, 0.484 ml, 0.484 mmol) and the resulting mixture was stirred at rt for 30 min. The mixture was concentrated in vacuo and the product was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.76 min, mass/charge 433.2 (M+H) (LCMS method 1

Стадия 2. Синтез 1-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)-3-(2-фтор-5-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)мочевины. Step 2. Synthesis of 1-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)-3-(2-fluoro-5-(hydroxymethyl)pyridin-4-yl)urea.

К раствору 1-(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (119 мг, 0,275 ммоль) в THF (5 мл) добавляли TBAF (1 М в THF, 0,275 мл, 0,275 ммоль) и обеспечивали перемешивание полученной смеси при к. т. в течение 2 ч. Смесь концентрировали in vacuo и очищали посредством хроматографии на силикагеле (MeOH/DCM с гидроксидом аммония в качестве модификатора) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,16 мин, масса/заряд 337 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,76 (s, 1H), 9,26 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,22-6,70 (m, 2H), 5,73 (t, J=5,4 Гц, 1H), 4,59 (d, J=5,1 Гц, 2H). To a solution of 1-(5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea (119 mg, 0.275 mmol) in THF (5 mL) was added TBAF (1 M in THF, 0.275 mL, 0.275 mmol) and the resulting mixture was allowed to stir at rt for 2 h. The mixture was concentrated in vacuo and purified by silica gel chromatography (MeOH/DCM with ammonium hydroxide as a modifier) to give the title compound. LCMS: Rt=1.16 min, mass/charge 337 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.76 (s, 1H), 9.26 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7 .22-6.70 (m, 2H), 5.73 (t, J=5.4 Hz, 1H), 4.59 (d, J=5.1 Hz, 2H).

Пример 8Example 8

1-(3-(Дифторметил)изотиазол-5-ил)-3-(2-фтор-3-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)мочевина1-(3-(Difluoromethyl)isothiazol-5-yl)-3-(2-fluoro-3-(hydroxymethyl)pyridin-4-yl)urea

Стадия 1. Синтез 1-(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины Stage 1 . Synthesis of 1-(3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

К раствору 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (1,04 г, 6,93 ммоль) и фенил(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 8) (3,39 г, 9,00 ммоль) в DMF (35 мл) добавляли LHMDS (1 М в THF, 13,8 мл, 13,8 ммоль) при 0°C. Удаляли охлаждающую баню и полученную смесь перемешивали при к. т. в течение 45 мин. Смесь концентрировали in vacuo и продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,74 мин, масса/заряд 433,3 (M+H) (LCMS способ 1).To a solution of 3-(difluoromethyl)isothiazol-5-amine (intermediate 1) (1.04 g, 6.93 mmol) and phenyl(3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridine-4 -yl)carbamate (intermediate 8) (3.39 g, 9.00 mmol) in DMF (35 ml) was added LHMDS (1 M in THF, 13.8 ml, 13.8 mmol) at 0°C. The cooling bath was removed and the resulting mixture was stirred at rt for 45 min. The mixture was concentrated in vacuo and the product was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.74 min, mass/charge 433.3 (M+H) (LCMS method 1).

Стадия 2. Синтез 1-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)-3-(2-фтор-3-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)мочевины Stage 2 . Synthesis of 1-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)-3-(2-fluoro-3-(hydroxymethyl)pyridin-4-yl)urea

К раствору 1-(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевины (2,19 г, 5,06 ммоль) в THF (40 мл) добавляли TBAF (1 М в THF, 6,6 мл, 6,6 ммоль) и обеспечивали перемешивание полученной смеси при к. т. в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили водой, затем разбавляли с помощью EtOAc. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фракции объединяли, промывали солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенную смесь очищали посредством флэш-хроматографии (MeOH/DCM) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,12 мин, масса/заряд 319,2 (M+H) (LCMS способ 1). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 11,89 (s, 1H), 9,44 (s, 1H), 8,10-8,02 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 6,95 (t, J=54,5 Гц, 1H), 5,83 (s, 1H), 4,62 (s, 2H).To a solution of 1-(3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea (2.19 g, 5 .06 mmol) in THF (40 mL) was added TBAF (1 M in THF, 6.6 mL, 6.6 mmol) and the resulting mixture was allowed to stir at rt for 30 min. The reaction mixture was quenched with water then diluted with EtOAc. The aqueous layer was extracted with EtOAc. The combined organic fractions were combined, washed with brine, then dried with sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo. The crude mixture was purified by flash chromatography (MeOH/DCM) to give the title compound. LCMS: Rt=1.12 min, mass/charge 319.2 (M+H) (LCMS method 1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.89 (s, 1H), 9.44 (s, 1H), 8.10-8.02 (m, 2H), 7.05 (s, 1H) , 6.95 (t, J=54.5 Hz, 1H), 5.83 (s, 1H), 4.62 (s, 2H).

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯINTERMEDIATE CONNECTIONS

Промежуточное соединение 1Intermediate 1

3-(Дифторметил)изотиазол-5-амин3-(Difluoromethyl)isothiazol-5-amine

Стадия 1. 3-Метил-5-нитроизотиазол Stage 1 . 3-Methyl-5-nitroisothiazole

Порошок Cu (96 г, 1,5 моль) помещали в реактор объемом 5 л. Добавляли воду (1 л), а затем NaNO₂ (104 г, 1,5 моль). Добавляли водный раствор HCl (12 М, 1,5 мл, 18 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин. Добавляли по каплям через капельную воронку раствор 3-метил-5-амино-изотиазола гидрохлорида (58 г, 507 ммоль) в 500 мл воды и водном растворе HCl (12 М, 65 мл, 0,78 моль), поддерживая температуру ниже 30°C. Добавляли дополнительные 100 мл воды. Обеспечивали перемешивание реакционной смеси в течение 3 ч. после добавления. Реакционную смесь фильтровали через целит с использованием воды и MTBE. Фильтрат переносили в реактор и слои разделяли. Водный слой промывали дважды с помощью MTBE. Объединенные органические слои высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 8,12 (s, 1H), 2,50 (s, 3H).Cu powder (96 g, 1.5 mol) was placed in a 5 L reactor. Water (1 L) was added followed by NaNO ₂ (104 g, 1.5 mol). An aqueous solution of HCl (12 M, 1.5 ml, 18 mmol) was added and the reaction mixture was stirred for 20 minutes. A solution of 3-methyl-5-amino-isothiazole hydrochloride (58 g, 507 mmol) in 500 ml of water and aqueous HCl solution (12 M, 65 ml, 0.78 mol) was added dropwise via an addition funnel, maintaining the temperature below 30° C. An additional 100 ml of water was added. The reaction mixture was allowed to stir for 3 hours after the addition. The reaction mixture was filtered through celite using water and MTBE. The filtrate was transferred to the reactor and the layers were separated. The aqueous layer was washed twice with MTBE. The combined organic layers were dried over MgSO ₄ , filtered and concentrated to give the title compound. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.12 (s, 1H), 2.50 (s, 3H).

Стадия 2. 5-Нитроизотиазол-3-карбоновая кислота Stage 2 . 5-Nitroisothiazole-3-carboxylic acid

В 3-горлую круглодонную колбу объемом 1 л на водяной бане, оснащенную механической мешалкой и устройством контроля температуры, добавляли 3-метил-5-нитроизотиазол (26,5 г, 184 ммоль), затем H₂SO₄ (350 мл) с такой скоростью, чтобы сохранять температуру ниже 30°C. Добавляли CrO₃ (55,1 г, 552 ммоль) 6 порциями каждые 20 мин., обеспечивая то, чтобы температура оставалась на уровне ниже 24°C. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при наличии водяной бани в течение 3 дней. Реакционную смесь выливали в ледяную воду (всего 1,4 л) и экстрагировали 3 раза с помощью Et₂O (1 л). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, затем высушивали над MgSO₄, фильтровали и концентрировали с получением желтого твердого вещества. Твердое вещество поглощали в гептан (80 мл) и Et₂O (20 мл) и растирали в порошок. После 2 мин. интенсивного перемешивания смесь фильтровали и затем ополаскивали с помощью смеси гептан/простой эфир 5:1 (минимальное количество) с получением указанного в заголовке соединения. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,89 (s, 1H), 8,57 (s, 1H).To a 3-necked 1 L round bottom flask in a water bath equipped with a mechanical stirrer and temperature control device was added 3-methyl-5-nitroisothiazole (26.5 g, 184 mmol) followed by H ₂ SO ₄ (350 ml) with speed to keep the temperature below 30°C. Added CrO ₃ (55.1 g, 552 mmol) 6 portions every 20 minutes, ensuring that the temperature remained below 24°C. The reaction mixture was left to stir in the presence of a water bath for 3 days. The reaction mixture was poured into ice water (total 1.4 L) and extracted 3 times with Et ₂ O (1 L). The combined organic layers were washed with brine, then dried over MgSO ₄ , filtered and concentrated to give a yellow solid. The solid was taken up in heptane (80 ml) and Et ₂ O (20 ml) and triturated. After 2 min. With vigorous stirring, the mixture was filtered and then rinsed with heptane/ether 5:1 (minimum) to give the title compound. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.89 (s, 1H), 8.57 (s, 1H).

Стадия 3. (5-Нитроизотиазол-3-ил)метанол Stage 3 . (5-Nitroisothiazol-3-yl)methanol

В колбу помещали 5-нитроизотиазол-3-карбоновую кислоту (3,0 г, 17,2 ммоль) в THF (50 мл), причем при охлаждении в бане со льдом, затем добавляли по каплям комплекс боран-тетрагидрофуран (1 М в THF) (22,4 мл, 22,4 ммоль) в течение 30 мин. и обеспечивали нагревание реакционной смеси в течение ночи. Реакционную смесь повторно охлаждали до 0°C, затем добавляли по каплям метанол (20 мл). Реакционную смесь интенсивно перемешивали при 0°C в течение 5 мин., затем обеспечивали ее нагревание до к. т. и перемешивали в течение еще 15 мин. Реакционную смесь концентрировали in vacuo до половины объема, затем разбавляли с помощью EtOAc (100 мл), насыщенного водного раствора NH₄Cl (50 мл) и воды (50 мл). Слои разделяли и водную часть экстрагировали с помощью EtOAc (2×100 мл). Органические фракции объединяли и промывали солевым раствором, затем высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. С помощью очистки посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/DCM) получали указанное в заголовке соединение. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 8,09 (s, 1H), 5,77 (t, J=6,1 Гц, 1H), 4,58 (d, J=6,1 Гц, 2H). MS (ESI) масса/заряд 161,0 [M+H]⁺.5-nitroisothiazole-3-carboxylic acid (3.0 g, 17.2 mmol) in THF (50 ml) was placed in a flask, while cooling in an ice bath, then a borane-tetrahydrofuran complex (1 M in THF ) (22.4 ml, 22.4 mmol) for 30 min. and allowed the reaction mixture to heat overnight. The reaction mixture was re-cooled to 0° C., then methanol (20 ml) was added dropwise. The reaction mixture was vigorously stirred at 0°C for 5 minutes, then warmed to rt and stirred for another 15 minutes. The reaction mixture was concentrated in vacuo to half volume, then diluted with EtOAc (100 ml), saturated aqueous NH ₄ Cl (50 ml) and water (50 ml). The layers were separated and the aqueous part was extracted with EtOAc (2×100 ml). The organic fractions were combined and washed with brine, then dried over sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo. Purification by silica gel chromatography (EtOAc/DCM) gave the title compound. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.09 (s, 1H), 5.77 (t, J=6.1 Hz, 1H), 4.58 (d, J=6.1 Hz, 2H). MS (ESI) mass/charge 161.0 [M+H] ⁺ .

Стадия 4. Синтез 5-нитроизотиазол-3-карбальдегида Stage 4 . Synthesis of 5-nitroisothiazole-3-carbaldehyde

Периодинан Десса-Мартина (2,23 г, 5,27 ммоль) небольшими порциями добавляли в течение 5 мин. к (5-нитроизотиазол-3-ил)метанолу (767 мг, 4,79 ммоль) в DCM (25 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 10 мин., нагревали до к. т. и перемешивали при к. т. в течение 20 мин. Смесь разбавляли с помощью DCM. Добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ и насыщенный водный раствор тиосульфата натрия. Смесь интенсивно перемешивали в течение 10 мин. и затем два слоя разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью DCM. Объединенный органический экстракт промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. Продукт применяли непосредственно на следующей стадии без очистки. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 9,85 (s, 1H), 8,58 (s, 1H).Dess-Martin periodinan (2.23 g, 5.27 mmol) was added in small portions over 5 minutes. to (5-nitroisothiazol-3-yl)methanol (767 mg, 4.79 mmol) in DCM (25 ml) at 0°C. The mixture was stirred at 0°C for 10 min., heated to rt and stirred at rt for 20 min. The mixture was diluted with DCM. Saturated aqueous NaHCO ₃ and saturated aqueous sodium thiosulfate were added. The mixture was vigorously stirred for 10 minutes. and then the two layers were separated. The aqueous layer was extracted with DCM. The combined organic extract was washed with brine, dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo to give the title compound. The product was used directly in the next step without purification. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 9.85 (s, 1H), 8.58 (s, 1H).

Стадия 5. Синтез 3-(дифторметил)-5-нитроизотиазола Stage 5 . Synthesis of 3-(difluoromethyl)-5-nitroisothiazole

DAST (0,201 мл, 1,518 ммоль) добавляли по каплям при 0°C к раствору 5-нитроизотиазол-3-карбальдегида (полученного на стадии 1 выше) (80 мг, 0,506 ммоль) в DCM (3,5 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 25 мин., нагревали до к. т. и перемешивали при к. т. в течение 2 ч. Смесь гасили при 0°C с помощью насыщенного водного раствора NaHCO₃ и разбавляли с помощью DCM. Смесь интенсивно перемешивали в течение 1 мин. и два слоя разделяли. Водный слой экстрагировали с помощью DCM. Объединенный органический экстракт промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. Продукт применяли непосредственно на следующей стадии без очистки. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 8,54 (s, 1H), 7,16 (t, J=52 Гц, 1H).DAST (0.201 ml, 1.518 mmol) was added dropwise at 0°C to a solution of 5-nitroisothiazole-3-carbaldehyde (prepared in step 1 above) (80 mg, 0.506 mmol) in DCM (3.5 ml). The mixture was stirred at 0°C for 25 minutes, heated to rt and stirred at rt for 2 h. The mixture was quenched at 0°C with saturated aqueous NaHCO ₃ and diluted with DCM. The mixture was vigorously stirred for 1 min. and the two layers were separated. The aqueous layer was extracted with DCM. The combined organic extract was washed with brine, dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo to give the title compound. The product was used directly in the next step without purification. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8.54 (s, 1H), 7.16 (t, J=52 Hz, 1H).

Стадия 6. Синтез 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина Stage 6 . Synthesis of 3-(difluoromethyl)isothiazol-5-amine

Смесь 3-(дифторметил)-5-нитроизотиазола (49 мг, 0,27 ммоль), порошка железа (46 мг, 0,81 ммоль) и уксусной кислоты (1,5 мл) нагревали до 50°C в течение 2 ч. Смесь разбавляли этилацетатом и повышали ее основность с помощью 30% гидроксида аммония. Органический слой отделяли и концентрировали in vacuo, затем очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,42 мин; масса/заряд 151,2 (M+H) (LCMS способ 2); ¹H ЯМР (400 МГц, метанол-d4) δ 6,46 (t, J=55,0 Гц, 1H), 6,39 (s, 1H). ¹⁹F ЯМР (376 МГц, MeOD) δ -116,06.A mixture of 3-(difluoromethyl)-5-nitroisothiazole (49 mg, 0.27 mmol), iron powder (46 mg, 0.81 mmol) and acetic acid (1.5 ml) was heated to 50°C for 2 h. The mixture was diluted with ethyl acetate and made basic with 30% ammonium hydroxide. The organic layer was separated and concentrated in vacuo, then purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=0.42 min; mass/charge 151.2 (M+H) (LCMS method 2); ¹ H NMR (400 MHz, methanol-d4) δ 6.46 (t, J=55.0 Hz, 1H), 6.39 (s, 1H). ¹⁹ F NMR (376 MHz, MeOD) δ -116.06.

Промежуточное соединение 2Intermediate 2

3-(Трифторметил)изотиазол-5-амин3-(Trifluoromethyl)isothiazol-5-amine

Стадия 1. Синтез 4,4,4-трифтор-3-оксобутаннитрила Stage 1 . Synthesis of 4,4,4-trifluoro-3-oxobutanenitrile

В сухую колбу объемом 100 мл помещали KOt-Bu (1 М в THF, 85 мл, 85 ммоль) и охлаждали ее на льду. Через 30 мин. добавляли смесь этилтрифторацетата (7,27 мл, 60,9 ммоль) и ацетонитрила (3,18 мл, 60,9 ммоль) в течение 3 мин. Реакционная смесь превращалась в суспензию. Обеспечивали медленное нагревание смеси до температуры, не превышающей к. т., и перемешивали в течение 24 ч. Смесь гасили с помощью 1 М HCl и неочищенный продукт экстрагировали с помощью простого эфира и промывали с помощью воды. Органический слой отделяли, высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли на следующей стадии без очистки. LCMS: Rt=0,22 мин, масса/заряд 136,1 (M-1) (LCMS способ 4). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 2,99 (s, 2H).KOt-Bu (1 M in THF, 85 ml, 85 mmol) was placed in a dry 100 ml flask and cooled on ice. After 30 min. a mixture of ethyl trifluoroacetate (7.27 ml, 60.9 mmol) and acetonitrile (3.18 ml, 60.9 mmol) was added over 3 minutes. The reaction mixture turned into a suspension. The mixture was allowed to warm slowly to a temperature not exceeding rt and stirred for 24 hours. The mixture was quenched with 1M HCl and the crude product was extracted with ether and washed with water. The organic layer was separated, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated in vacuo to give the title compound, which was used in the next step without purification. LCMS: Rt=0.22 min, mass/charge 136.1 (M-1) (LCMS method 4). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 2.99 (s, 2H).

Стадия 2. Синтез (Z)-3-амино-4,4,4-трифторбут-2-еннитрила Stage 2 . Synthesis of (Z)-3-amino-4,4,4-trifluorobut-2-ennitrile

Смесь 4,4,4-трифтор-3-оксобутаннитрила (полученного на стадии 1) (1,1 г, 8,03 ммоль), формиата аммония (1,518 г, 24,08 ммоль) и уксусной кислоты (0,046 мл, 0,803 ммоль) в толуоле (100 мл) нагревали до 120°C в неазеотропных условиях в течение 18 ч. Смесь концентрировали in vacuo и применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.A mixture of 4,4,4-trifluoro-3-oxobutanenitrile (prepared in step 1) (1.1 g, 8.03 mmol), ammonium formate (1.518 g, 24.08 mmol) and acetic acid (0.046 ml, 0.803 mmol ) in toluene (100 ml) was heated to 120° C. under non-azeotropic conditions for 18 h. The mixture was concentrated in vacuo and used in the next step without further purification.

Стадия 3. Синтез (Z)-3-амино-4,4,4-трифторбут-2-ентиоамида Stage 3 . Synthesis of (Z)-3-amino-4,4,4-trifluorobut-2-entioamide

Обеспечивали перемешивание смеси (Z)-3-амино-4,4,4-трифторбут-2-еннитрила (полученного на стадии 2) (1,00 г, 7,35 ммоль), MgCl₂ (0,70 г, 7,35 ммоль) и NaSH (0,824 г, 14,70 ммоль) в DMF (20 мл) при к. т. в течение 24 ч. Смесь разделяли между этилацетатом и водой. Объединенный органический экстракт высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,81 мин, масса/заряд 171 (M+H) (LCMS способ 1).A mixture of (Z)-3-amino-4,4,4-trifluorobut-2-enenitrile (prepared in step 2) (1.00 g, 7.35 mmol), MgCl ₂ (0.70 g, 7. 35 mmol) and NaSH (0.824 g, 14.70 mmol) in DMF (20 ml) at rt for 24 h. The mixture was partitioned between ethyl acetate and water. The combined organic extract was dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated in vacuo to give the title compound. LCMS: Rt=0.81 min, mass/charge 171 (M+H) (LCMS method 1).

Стадия 4. Синтез 3-(трифторметил)изотиазол-5-амина Stage 4. Synthesis of 3-(trifluoromethyl)isothiazol-5-amine

К смеси (Z)-3-амино-4,4,4-трифторбут-2-ентиоамида (полученного на стадии 3) (1,2 г, 7,05 ммоль) в пиридине (24 мл) добавляли H₂O₂ (3 мл, 29,4 ммоль) при 0-5°C, и обеспечивали нагревание смеси до температуры, не превышающей к. т., и перемешивали ее в течение 2 ч. Смесь концентрировали in vacuo и остаток подвергали хроматографии на силикагеле (этилацетат/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,97 мин, масса/заряд 169 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,21 (s, 2H), 6,44 (s, 1H).H ₂ O ₂ ( 3 ml, 29.4 mmol) at 0-5°C, and ensured that the mixture was heated to a temperature not exceeding rt, and stirred for 2 hours. The mixture was concentrated in vacuo and the residue was subjected to silica gel chromatography (ethyl acetate/ heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=0.97 min, mass/charge 169 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 7.21 (s, 2H), 6.44 (s, 1H).

Промежуточное соединение 3Intermediate 3

Фенил(2-хлорпиридин-4-ил)карбаматPhenyl(2-chloropyridin-4-yl)carbamate

К раствору 2-хлорпиридин-4-амина (12,9 г, 101 ммоль) и пиридина (8,13 мл, 101 ммоль) в DCM (315 мл) при 0°C добавляли фенилхлорформиат (13,3 мл, 106 ммоль). Обеспечивали нагревание смеси до к. т. в течение 2 ч. и концентрировали in vacuo. Добавляли воду и смесь перемешивали при к. т. Твердое вещество фильтровали через пластиковую воронку с пористой стеклянной пластинкой, ополаскивали с помощью воды и высушивали под высоким вакуумом при 40°C в течение 24 ч. с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,20 мин, масса/заряд=249,2 (M+H) (LCMS способ 2).To a solution of 2-chloropyridine-4-amine (12.9 g, 101 mmol) and pyridine (8.13 ml, 101 mmol) in DCM (315 ml) at 0°C was added phenyl chloroformate (13.3 ml, 106 mmol) . The mixture was allowed to warm to RT for 2 hours and concentrated in vacuo. Water was added and the mixture was stirred at RT. The solid was filtered through a plastic funnel with a porous glass plate, rinsed with water and dried under high vacuum at 40° C. for 24 hours to give the title compound. LCMS: Rt=1.20 min, mass/charge=249.2 (M+H) (LCMS method 2).

Промежуточное соединение 4Intermediate 4

Фенил(2-хлор-5-нитропиридин-4-ил)карбаматPhenyl(2-chloro-5-nitropyridin-4-yl)carbamate

К раствору 4-амино-2-хлор-5-нитропиридина (150 мг, 0,864 ммоль) и пиридина (0,070 мл, 0,86 ммоль) в диоксане (4 мл) при 0°C добавляли фенилхлорформиат (0,114 мл, 0,907 ммоль). Смесь нагревали при 80°C в течение 18 ч., охлаждали до к. т. и выливали в воду. Продукт экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенный органический экстракт высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,51 мин, масса/заряд=294,1 (M+H) (LCMS способ 1). To a solution of 4-amino-2-chloro-5-nitropyridine (150 mg, 0.864 mmol) and pyridine (0.070 ml, 0.86 mmol) in dioxane (4 ml) at 0°C was added phenyl chloroformate (0.114 ml, 0.907 mmol) . The mixture was heated at 80° C. for 18 hours, cooled to rt and poured into water. The product was extracted with EtOAc. The combined organic extract was dried over Na ₂ SO ₄ and concentrated in vacuo. The crude residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.51 min, mass/charge=294.1 (M+H) (LCMS method 1).

Промежуточное соединение 5Intermediate 5

1-(5-Нитро-2-хлорпиридин-4-ил)-3-(3-(дифторметил)изотиазол-5-ил)мочевина1-(5-Nitro-2-chloropyridin-4-yl)-3-(3-(difluoromethyl)isothiazol-5-yl)urea

Раствор фенил(2-хлор-5-нитропиридин-4-ил)карбамата (промежуточное соединение 4) (4,50 г, 15,32 ммоль), 3-(дифторметил)изотиазол-5-амина (промежуточное соединение 1) (2,0 г, 13,32 ммоль) и DIPEA (5,8 мл, 33,3 ммоль) в диоксане (59 мл) нагревали при 85°C в течение 16 ч. Смесь концентрировали in vacuo и остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,43 мин, масса/заряд=350,1 (M+H) (LCMS способ 1).Phenyl(2-chloro-5-nitropyridin-4-yl)carbamate solution (intermediate 4) (4.50 g, 15.32 mmol), 3-(difluoromethyl)isothiazol-5-amine (intermediate 1) (2 0 g, 13.32 mmol) and DIPEA (5.8 ml, 33.3 mmol) in dioxane (59 ml) were heated at 85°C for 16 h. The mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography ( EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.43 min, mass/charge=350.1 (M+H) (LCMS method 1).

Промежуточное соединение 6Intermediate 6

Фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)карбаматPhenyl (5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-chloropyridin-4-yl)carbamate

Стадия 1. Синтез метил-6-хлор-4-((4-метоксибензил)амино)никотината Stage 1 . Synthesis of methyl 6-chloro-4-((4-methoxybenzyl)amino)nicotinate

Смесь п-метоксибензиламина (19,0 мл, 146 ммоль), метил-4,6-дихлорникотината (25 г, 121 ммоль), триэтиламина (20,3 мл, 146 ммоль) в MeCN (60 мл) перемешивали при к. т. в течение 24 ч. Добавляли еще 4-метоксибензиламин (2,5 мл) и смесь перемешивали при к. т. в течение 72 ч. Смесь концентрировали и остаток разделяли между EtOAc и водным насыщенным раствором NH₄Cl. Органический экстракт объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,42 мин, масса/заряд=307,1 (M+H) (LCMS способ 1).A mixture of p-methoxybenzylamine (19.0 ml, 146 mmol), methyl 4,6-dichloronicotinate (25 g, 121 mmol), triethylamine (20.3 ml, 146 mmol) in MeCN (60 ml) was stirred at rt over 24 h. More 4-methoxybenzylamine (2.5 ml) was added and the mixture was stirred at RT for 72 h. The mixture was concentrated and the residue was partitioned between EtOAc and aqueous saturated NH ₄ Cl. The organic extract was combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and concentrated in vacuo. The crude residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.42 min, mass/charge=307.1 (M+H) (LCMS method 1).

Стадия 2. Синтез (6-хлор-4-((4-метоксибензил)амино)пиридин-3-ил)метанола Stage 2 . Synthesis of (6-chloro-4-((4-methoxybenzyl)amino)pyridin-3-yl)methanol

К раствору LAH (2 М в THF, 21,52 мл, 43,0 ммоль) в THF (150 мл), перемешиваемому при 0°C, добавляли по каплям раствор метил-6-хлор-4-((4-метоксибензил)амино)никотината (полученного на стадии 1) (12 г, 39,1 ммоль) в THF (100 мл). Обеспечивали нагревание реакционной смеси до к. т. и перемешивали ее в течение 30 мин. Реакционную смесь гасили с помощью медленного добавления EtOAc в бане со льдом, затем подвергали условиям Стейнхардта для гашения LAH (2 мл H₂O, затем 2 мл 15% NaOH и 6 мл H₂O). Полученный раствор перемешивали в течение 15 мин. и обеспечивали его нагревание до к. т. Смесь фильтровали через целит и фильтрат переносили в делительную воронку. Продукт дополнительно разбавляли водой и затем экстрагировали с помощью EtOAc. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,84 мин, масса/заряд=279,3 (M+H) (LCMS 1 способ 1).To a solution of LAH (2 M in THF, 21.52 ml, 43.0 mmol) in THF (150 ml) stirred at 0°C was added dropwise a solution of methyl-6-chloro-4-((4-methoxybenzyl) amino)nicotinate (prepared in step 1) (12 g, 39.1 mmol) in THF (100 ml). The reaction mixture was heated to rt and stirred for 30 min. The reaction mixture was quenched with slow addition of EtOAc in an ice bath, then subjected to Steinhardt conditions for LAH quenching (2 ml H ₂ O followed by 2 ml 15% NaOH and 6 ml H ₂ O). The resulting solution was stirred for 15 minutes. and ensured its heating to rt. The mixture was filtered through celite and the filtrate was transferred to a separating funnel. The product was further diluted with water and then extracted with EtOAc. The organic layers were combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and the volatiles were removed in vacuo to give the title compound. LCMS: Rt=0.84 min, mass/charge=279.3 (M+H) (LCMS 1 method 1).

Стадия 3. Синтез (4-амино-6-хлорпиридин-3-ил)метанола Stage 3 . Synthesis of (4-amino-6-chloropyridin-3-yl)methanol

Раствор (6-хлор-4-((4-метоксибензил)амино)пиридин-3-ил)метанола (полученного на стадии 2) (9,82 г, 35,2 ммоль) в TFA (2,71 мл, 35,2 ммоль) нагревали при 60°C в течение 18 ч. Реакционную смесь нейтрализовали с помощью 10% водного раствора K₂CO₃ до pH ~7. Смесь затем переносили в делительную воронку и экстрагировали с помощью DCM. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и in vacuo удаляли летучие вещества с получением порции указанного в заголовке соединения. Водный слой концентрировали in vacuo и полученное твердое вещество разбавляли в изопропаноле. Нерастворимые соли отфильтровывали и раствор охлаждали на льду. Дополнительные соли, которые осаждались, отфильтровали. Летучие вещества удаляли in vacuo с получением большего количества указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,26 мин, масса/заряд=159,1 (M+H) (LCMS способ 2).A solution of (6-chloro-4-((4-methoxybenzyl)amino)pyridin-3-yl)methanol (prepared in step 2) (9.82 g, 35.2 mmol) in TFA (2.71 mL, 35 2 mmol) was heated at 60°C for 18 hours, the Reaction mixture was neutralized with 10% aqueous solution of K ₂ CO ₃ to pH ~7. The mixture was then transferred to a separatory funnel and extracted with DCM. The organic layers were combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and devolatilized in vacuo to give a portion of the title compound. The aqueous layer was concentrated in vacuo and the resulting solid was diluted in isopropanol. Insoluble salts were filtered off and the solution was cooled on ice. Additional salts that precipitated were filtered off. The volatiles were removed in vacuo to give more of the title compound. LCMS: Rt=0.26 min, mass/charge=159.1 (M+H) (LCMS method 2).

Стадия 4. Синтез 5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-амина Stage 4 . Synthesis of 5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-chloropyridine-4-amine

Смесь (4-амино-6-хлорпиридин-3-ил)метанола (полученного на стадии 3) (5 г, 32 ммоль), TBDMSCl (5,23 г, 34,7 ммоль) и имидазола (5,37 г, 79 ммоль) в DMF (10 мл) перемешивали при к. т. в течение 1 ч. Реакционную смесь выливали в воду и экстрагировали с помощью EtOAc. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,52 мин, масса/заряд=273,2 (M+H) (LCMS способ 2).A mixture of (4-amino-6-chloropyridin-3-yl)methanol (prepared in step 3) (5 g, 32 mmol), TBDMSCl (5.23 g, 34.7 mmol) and imidazole (5.37 g, 79 mmol) in DMF (10 mL) was stirred at rt for 1 h. The reaction mixture was poured into water and extracted with EtOAc. The organic layers were combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and the volatiles were removed in vacuo. The crude residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.52 min, mass/charge=273.2 (M+H) (LCMS method 2).

Стадия 5. Синтез фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-ил)карбамата Stage 5 . Synthesis of phenyl(5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-chloropyridin-4-yl)carbamate

К раствору 5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-хлорпиридин-4-амина (полученного на стадии 4) (5,55 г, 20,3 ммоль) и пиридина (1,8 мл, 22,4 ммоль) в DCM (75 мл), перемешивая при к. т., добавляли фенилхлорформиат (2,68 мл, 21,4 ммоль). Обеспечивали нагревание реакционной смеси до к. т. в течение 2 ч. Летучие вещества удаляли in vacuo и остаток разбавляли с помощью EtOAc и насыщенного водного раствора NaHCO₃. Смесь затем экстрагировали с помощью EtOAc. Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Неочищенный остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,94 мин, масса/заряд=393,3 (M+H) (LCMS способ 1).To a solution of 5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-chloropyridine-4-amine (prepared in step 4) (5.55 g, 20.3 mmol) and pyridine (1.8 ml, 22 4 mmol) in DCM (75 ml), while stirring at rt, phenyl chloroformate (2.68 ml, 21.4 mmol) was added. The reaction mixture was allowed to warm to RT for 2 hours. Volatiles were removed in vacuo and the residue was diluted with EtOAc and saturated aqueous NaHCO ₃ . The mixture was then extracted with EtOAc. The organic layers were combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and the volatiles were removed in vacuo. The crude residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.94 min, mass/charge=393.3 (M+H) (LCMS method 1).

Промежуточное соединение 7Intermediate 7

Фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбаматPhenyl (5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridin-4-yl)carbamate

Стадия 1. Синтез метил-4-амино-6-фторникотината. Stage 1. Synthesis of methyl 4-amino-6-fluoronicotinate.

В колбу объемом 500 мл, содержащую метил-4,6-дихлорникотинат (6,75 г, 32,8 ммоль) и TMAF (8,0 г, 86 ммоль), добавляли DMF (100 мл) и смесь перемешивали при к. т. в течение 1,5 ч., пока согласно результатам LCMS не идентифицировали завершение образования промежуточного соединения метил-4,6-дифторникотината. К данной реакционной смеси затем добавляли 2 М раствор аммиака в изопропаноле (35 мл, 70 ммоль) и перемешивали при к. т. в течение 20 ч. Завершение образования указанного в заголовке соединения идентифицировали согласно результатам LCMS. Реакционную смесь гасили водой и неочищенный продукт экстрагировали с помощью EtOAc. Органический слой промывали солевым раствором, затем высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,97 мин, масса/заряд 174 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 8,43 (s, 1H), 7,52 (s, 2H), 6,30 (s, 1H), 3,82 (s, 3H).To a 500 ml flask containing methyl 4,6-dichloronicotinate (6.75 g, 32.8 mmol) and TMAF (8.0 g, 86 mmol) was added DMF (100 ml) and the mixture was stirred at r.t. for 1.5 hours until LCMS indicated completion of formation of the methyl 4,6-difluoronicotinate intermediate. To this reaction mixture was then added 2 M ammonia in isopropanol (35 mL, 70 mmol) and stirred at rt for 20 h. Completion of the title compound was identified by LCMS results. The reaction mixture was quenched with water and the crude product was extracted with EtOAc. The organic layer was washed with brine, then dried over sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo . The residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=0.97 min, mass/charge 174 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8.43 (s, 1H), 7.52 (s, 2H), 6.30 (s, 1H), 3.82 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез (4-амино-6-фторпиридин-3-ил)метанола. Stage 2 . Synthesis of (4-amino-6-fluoropyridin-3-yl)methanol.

К ледяному (0°C) раствору LAH (2 М в THF, 24,8 мл, 49,6 ммоль), дополнительно разбавленному с помощью THF (200 мл), добавляли посредством капельной воронки в течение 45 мин. раствор метил-4-амино-6-фторникотината (4,22 г, 24,8 ммоль) в THF (100 мл) с получением суспензии. Обеспечивали нагревание смеси до к. т. в течение 2 ч., после чего согласно результатам LCMS реакцию считали завершенной. Реакционную смесь разбавляли с помощью THF (200 мл) и охлаждали на льду. К смеси порциями добавляли декагидрат сульфата натрия до прекращения выделения пузырьков газа. Смесь перемешивали в течение 18 ч., затем фильтровали и концентрировали in vacuo. Полученный осадок очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,27 мин., масса/заряд 143 (M+H) (способ LCMS 3). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,63 (s, 1H), 6,20 (s, 2H), 6,09 (s, 1H), 5,04 (t, J=5,5 Гц, 1H), 4,35 (d, J=5,5 Гц, 2H).To an ice-cold (0°C) solution of LAH (2 M in THF, 24.8 mL, 49.6 mmol) further diluted with THF (200 mL) was added via addition funnel over 45 min. solution of methyl 4-amino-6-fluoronicotinate (4.22 g, 24.8 mmol) in THF (100 ml) to obtain a suspension. The mixture was allowed to warm to rt for 2 h, after which, according to the results of LCMS, the reaction was considered complete. The reaction mixture was diluted with THF (200 ml) and cooled on ice. Sodium sulfate decahydrate was added in portions to the mixture until the evolution of gas bubbles ceased. The mixture was stirred for 18 hours, then filtered and concentrated in vacuo . The resulting residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=0.27 min, mass/charge 143 (M+H) (LCMS method 3). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 7.63 (s, 1H), 6.20 (s, 2H), 6.09 (s, 1H), 5.04 (t, J=5, 5 Hz, 1H), 4.35 (d, J=5.5 Hz, 2H).

Стадия 3. Синтез 5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-амина. Stage 3. Synthesis of 5-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridine-4-amine.

Смесь (4-амино-6-фторпиридин-3-ил)метанола (1,52 г, 10,7 ммоль), TBDMSCl (1,77 г, 11,8 ммоль) и имидазола (1,82 г, 26,7 ммоль) в DMF (50 мл) перемешивали при к. т. в течение 1 ч., после чего согласно результатам TLC реакцию считали завершенной, 100% EtOAc. Реакционную смесь концентрировали in vacuo, затем очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,46 мин, масса/заряд 257 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,60 (s, 1H), 6,11 (s, 2H), 6,04 (s, 1H), 4,50 (s, 2H), 0,81 (s, 9H), 0,00 (s, 6H).A mixture of (4-amino-6-fluoropyridin-3-yl)methanol (1.52 g, 10.7 mmol), TBDMSCl (1.77 g, 11.8 mmol) and imidazole (1.82 g, 26.7 mmol) in DMF (50 ml) was stirred at rt for 1 h, after which the reaction was considered complete according to the results of TLC, 100% EtOAc. The reaction mixture was concentrated in vacuo then purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.46 min, mass/charge 257 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.60 (s, 1H), 6.11 (s, 2H), 6.04 (s, 1H), 4.50 (s, 2H), 0, 81 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).

Стадия 4. Синтез фенил(5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамата. Stage 4. Synthesis of phenyl (5- (((tert-butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2-fluoropyridin-4-yl) carbamate.

К смеси (4-амино-6-фторпиридин-3-ил)метанола (1,45 г, 5,66 ммоль) и пиридина (0,46 мл, 5,66 ммоль) в диоксане (30 мл) добавляли фенилхлорформиат (0,710 мл, 5,66 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 1 ч. Смесь затем разбавляли с помощью EtOAc, затем промывали бикарбонатом натрия, а затем водой. Органическую часть высушивали над сульфатом натрия и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения.LCMS: Rt=1,89 мин, масса/заряд 377 (M+H) (LCMS способ 1). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 9,66 (s, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,39-7,31 (m, 2H), 7,16-7,09 (m, 2H), 6,74-6,52 (m, 1H), 4,78 (s, 2H), 0,80 (s,9 H), 0,00 (s, 6H).Phenyl chloroformate (0.710 ml, 5.66 mmol) and the resulting mixture was stirred for 1 hour. The mixture was then diluted with EtOAc, then washed with sodium bicarbonate and then with water. The organics were dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo . The residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.89 min, mass/charge 377 (M+H) (LCMS method 1). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 9.66 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.39-7.31 (m, 2H), 7.16-7.09 (m, 2H), 6.74-6.52 (m, 1H), 4.78 (s, 2H), 0.80 (s.9H), 0. 00(s, 6H).

Промежуточное соединение 8Intermediate 8

Фенил(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбаматPhenyl(3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridin-4-yl)carbamate

Стадия 1. Синтез метил-2,4-дифторникотината Stage 1 . Synthesis of methyl 2,4-difluoronicotinate

Раствор 2,4-дифторпиридина (5 г, 43,4 ммоль) в THF (120 мл) добавляли по каплям к перемешиваемому раствору диизопропиламида лития (2 М в смеси THF/гептан/этилбензол, 26,1 мл, 52,1 ммоль) при -78°C. После перемешивания в течение 1 ч. реакционную смесь переносили с помощью канюли в перемешиваемый раствор метилхлорформиата (5,05 мл, 65,2 ммоль) в THF (120 мл) при -78°C. Обеспечивали нагревание реакционной смеси до к. т. в течение 30 мин. Реакционную смесь медленно гасили водой (100 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (3×100 мл). Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,94 мин, масса/заряд 174,1 (M+H) (LCMS способ 1).A solution of 2,4-difluoropyridine (5 g, 43.4 mmol) in THF (120 ml) was added dropwise to a stirred solution of lithium diisopropylamide (2 M in THF/heptane/ethylbenzene, 26.1 ml, 52.1 mmol) at -78°C. After stirring for 1 hour, the reaction mixture was transferred by cannula into a stirred solution of methyl chloroformate (5.05 ml, 65.2 mmol) in THF (120 ml) at -78°C. The reaction mixture was heated to RT for 30 min. The reaction mixture was slowly quenched with water (100 ml) and extracted with EtOAc (3×100 ml). The organic layers were combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and the volatiles were removed in vacuo. The product was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=0.94 min, mass/charge 174.1 (M+H) (LCMS method 1).

Стадия 2. Синтез метил-4-амино-2-фторникотината Stage 2 . Synthesis of methyl 4-amino-2-fluoronicotinate

К раствору метил-2,4-дифторникотината (полученного на стадии 1) (2 г, 11,55 ммоль) в диоксане (40 мл) добавляли аммиак в диоксане (0,5 М, 46,2 мл, 23,11 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 60°C в течение 18 ч. Реакционную смесь выливали в насыщенный раствор NaHCO_3(водн.) и экстрагировали с помощью EtOAc (3×100 мл). Органические слои объединяли, высушивали с помощью Na₂SO₄, фильтровали и летучие вещества удаляли in vacuo. Продукт очищали посредством хроматографии на силикагеле (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=0,77 мин, масса/заряд 171,1 (M+H) (LCMS способ 1).To a solution of methyl 2,4-difluoronicotinate (obtained in step 1) (2 g, 11.55 mmol) in dioxane (40 ml) was added ammonia in dioxane (0.5 M, 46.2 ml, 23.11 mmol) . The reaction mixture was stirred at 60° C. for 18 hours. The reaction mixture was poured into a saturated solution of NaHCO _{3 (aq.)} and was extracted with EtOAc (3×100 ml). The organic layers were combined, dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and the volatiles were removed in vacuo. The product was purified by silica gel chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=0.77 min, mass/charge 171.1 (M+H) (LCMS method 1).

Стадия 3. Синтез (4-амино-2-фторпиридин-3-ил)метанола Stage 3 . Synthesis of (4-amino-2-fluoropyridin-3-yl)methanol

К раствору метил-4-амино-2-фторникотината (2,02 г, 11,87 ммоль) в THF (70 мл), перемешиваемому в бане со льдом, добавляли по каплям LAH (2 М в THF, 7,1 мл, 14,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин. и реакционную смесь гасили с помощью медленного добавления декагидрата сульфата натрия (3,5 г). Смесь перемешивали в течение 15 мин. перед добавлением безводного Na₂SO₄. Смесь фильтровали через целит и летучие вещества удаляли in vacuo. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,56 (d, J=5,7 Гц, 1H), 6,47 (dd, J=5,7, 1,2 Гц, 1H), 6,29 (s, 2H), 4,96 (t, J=5,4 Гц, 1H), 4,40 (d, J=5,4 Гц, 2H).To a solution of methyl 4-amino-2-fluoronicotinate (2.02 g, 11.87 mmol) in THF (70 ml) stirred in an ice bath was added dropwise LAH (2 M in THF, 7.1 ml, 14.2 mmol). The reaction mixture was stirred at 0°C for 30 min. and the reaction mixture was quenched by the slow addition of sodium sulfate decahydrate (3.5 g). The mixture was stirred for 15 minutes. before adding anhydrous Na ₂ SO ₄ . The mixture was filtered through celite and the volatiles were removed in vacuo. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.56 (d, J=5.7 Hz, 1H), 6.47 (dd, J=5.7, 1.2 Hz, 1H), 6, 29 (s, 2H), 4.96 (t, J=5.4 Hz, 1H), 4.40 (d, J=5.4 Hz, 2H).

Стадия 4. Синтез 3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-амина Stage 4 . Synthesis of 3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridine-4-amine

Смесь (4-амино-2-фторпиридин-3-ил)метанола (1,57 г, 11,05 ммоль), TBDMSCl (2,00 г, 13,26 ммоль) и имидазола (1,88 г, 27,6 ммоль) перемешивали в DMF (30 мл) при к. т. Через 90 мин. реакционную смесь гасили с помощью насыщ. водн. раствора NaHCO₃, затем разбавляли с помощью EtOAc. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Органические фракции объединяли, промывали солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенную смесь очищали посредством флэш-хроматографии (EtOAc/гептан). LCMS: Rt=1,47 мин, масса/заряд 257,3 (M+H) (LCMS способ 1).A mixture of (4-amino-2-fluoropyridin-3-yl)methanol (1.57 g, 11.05 mmol), TBDMSCl (2.00 g, 13.26 mmol) and imidazole (1.88 g, 27.6 mmol) was stirred in DMF (30 ml) at rt. After 90 min. the reaction mixture was quenched with sat. aq. NaHCO ₃ solution, then diluted with EtOAc. The aqueous layer was extracted with EtOAc. The organic fractions were combined, washed with brine, then dried with sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo. The crude mixture was purified by flash chromatography (EtOAc/heptane). LCMS: Rt=1.47 min, mass/charge 257.3 (M+H) (LCMS method 1).

Стадия 5. Синтез фенил(3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-ил)карбамата Stage 5 . Synthesis of phenyl(3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridin-4-yl)carbamate

К раствору 3-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-фторпиридин-4-амина (2,36 г, 9,20 ммоль) и пиридина (0,89 мл, 11,0 ммоль) в диоксане (40 мл) добавляли фенилхлорформиат (1,21 мл, 9,7 ммоль) при к. т. Через 2,5 ч. реакционную смесь гасили с помощью насыщенного водного раствора NaHCO₃, затем разбавляли с помощью EtOAc. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc. Органические фракции объединяли, промывали солевым раствором, затем высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo.To a solution of 3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-2-fluoropyridine-4-amine (2.36 g, 9.20 mmol) and pyridine (0.89 ml, 11.0 mmol) in dioxane ( 40 mL) phenyl chloroformate (1.21 mL, 9.7 mmol) was added at rt. After 2.5 hours, the reaction mixture was quenched with saturated aqueous NaHCO ₃ , then diluted with EtOAc. The aqueous layer was extracted with EtOAc. The organic fractions were combined, washed with brine, then dried with sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo.

Неочищенную смесь очищали посредством флэш-хроматографии (EtOAc/гептан) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS: Rt=1,91 мин, масса/заряд 377,4 (M+H) (LCMS способ 1). 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,92 (s, 1H), 8,11 (d, J=5,7 Гц, 1H), 7,78 (d, J=5,7 Гц, 1H), 7,52-7,42 (m, 2H), 7,36-7,26 (m, 1H), 7,26-7,19 (m, 2H), 4,90 (s, 2H), 0,87 (s, 9H), 0,08 (s, 6H).The crude mixture was purified by flash chromatography (EtOAc/heptane) to give the title compound. LCMS: Rt=1.91 min, mass/charge 377.4 (M+H) (LCMS method 1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.92 (s, 1H), 8.11 (d, J=5.7 Hz, 1H), 7.78 (d, J=5.7 Hz, 1H ), 7.52-7.42 (m, 2H), 7.36-7.26 (m, 1H), 7.26-7.19 (m, 2H), 4.90 (s, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.08 (s, 6H).

Фармацевтические композиции и комбинацииPharmaceutical compositions and combinations

Соединения по настоящему изобретению, как правило, применяют в виде фармацевтической композиции (например, соединение по настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель). "Фармацевтически приемлемый носитель (разбавитель или вспомогательное вещество)" обозначает среды, общепринятые в данной области техники для доставки биологически активных средств животным, в частности млекопитающим, включая в целом признанные безопасными (GRAS) растворители, дисперсионные среды, средства для нанесения покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические средства, замедляющие абсорбцию средства, соли, консерванты, стабилизаторы лекарственных средств, связующие, буферные средства (например, малеиновая кислота, винная кислота, молочная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, бикарбонат натрия, фосфат натрия и т. п.), разрыхляющие средства, смазывающие вещества, подслащивающие вещества, ароматизаторы, красители и т. п. и их комбинации, как должно быть известно специалистам в данной области техники (см., например, Allen, L.V., Jr. et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2 Volumes), 22nd Edition, Pharmaceutical Press (2012).Compounds of the present invention are typically administered as a pharmaceutical composition (eg, a compound of the present invention and at least one pharmaceutically acceptable carrier). "A pharmaceutically acceptable carrier (diluent or excipient)" means media generally accepted in the art for the delivery of biologically active agents to animals, in particular mammals, including generally recognized as safe (GRAS) solvents, dispersion media, coating agents, surfactants. active substances, antioxidants, preservatives (for example, antibacterials, antifungals), isotonic agents, absorption delaying agents, salts, preservatives, drug stabilizers, binders, buffering agents (e.g. maleic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, acetic acid, sodium bicarbonate, sodium phosphate and etc.), leavening agents, lubricants, sweeteners, flavors, colors, and the like, and combinations thereof, as will be known to those skilled in the art (see, for example, Allen, L.V., Jr. et al. .,Remington: The Science and Practice of Pharmacy(2 Volumes), 22nd Edition, Pharmaceutical Press (2012).

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере два фармацевтически приемлемых носителя, таких как описанные в данном документе. Для целей настоящего изобретения, если не обозначено иным образом, сольваты и гидраты обычно подразумевают композиции. Предпочтительно, фармацевтически приемлемые носители являются стерильными. Фармацевтическую композицию можно составлять для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, парентеральное введение, ректальное введение и т. д. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно изготавливать в твердой форме (в том числе без ограничения в виде капсул, таблеток, пилюль, гранул, порошков или суппозиториев) или в жидкой форме (в том числе без ограничения в виде растворов, суспензий или эмульсий). Фармацевтические композиции могут подвергаться традиционным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать традиционные инертные разбавители, смазывающие средства или буферные средства, а также вспомогательные средства, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие средства, эмульгаторы и буферы и т. д. Как правило, фармацевтические композиции представляют собой таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент вместе с одним или несколькими из:In one aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier. In a further embodiment, the composition contains at least two pharmaceutically acceptable carriers such as those described herein. For the purposes of the present invention, unless otherwise indicated, solvates and hydrates generally refer to compositions. Preferably, the pharmaceutically acceptable carriers are sterile. The pharmaceutical composition may be formulated for specific routes of administration such as oral administration, parenteral administration, rectal administration, etc. In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated in solid form (including, without limitation, capsules, tablets, pills). , granules, powders or suppositories) or in liquid form (including, without limitation, solutions, suspensions or emulsions). Pharmaceutical compositions may be subjected to conventional pharmaceutical operations such as sterilization and/or may contain conventional inert diluents, lubricants or buffers, as well as adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers and buffers, etc. As as a rule, pharmaceutical compositions are tablets or gelatin capsules containing the active ingredient together with one or more of:

a) разбавителей, например, с лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином;a) thinners, e.g. with lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine;

b) смазывающих веществ, например, с диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью и/или полиэтиленгликолем; для таблеток такжеb) lubricants, e.g. silicon dioxide, talc, stearic acid, its magnesium or calcium salt and/or polyethylene glycol; also for tablets

c) связующих, например, с алюмосиликатом магния, крахмальной пастой, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, натрий-карбоксиметилцеллюлозой и/или поливинилпирролидоном; при необходимостиc) binders, for example, with magnesium aluminosilicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidone; if necessary

d) разрыхлителей, например, с видами крахмала, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью или шипучими смесями; иd) baking powder, for example, with starch species, agar, alginic acid or its sodium salt or effervescent mixtures; And

e) абсорбентов, красителей, ароматизаторов и подсластителей.e) absorbents, colors, flavors and sweeteners.

Таблетки могут быть либо покрыты пленочной оболочкой, либо покрыты кишечнорастворимой оболочкой в соответствии со способами, известными из уровня техники.Tablets can be either film-coated or enteric-coated according to methods known in the art.

Подходящие композиции для перорального введения включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению в форме таблеток, пастилок для рассасывания, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул, или сиропов, или настоек. Композиции, предназначенные для перорального применения, получают в соответствии с любым способом, известным из уровня техники, предназначенным для изготовления фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или несколько средств, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих веществ, ароматизирующих средств, красящих средств и консервирующих средств, с целью получения препаратов, которые являются фармацевтически приемлемыми и имеют привлекательный вкус. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, которые являются подходящими для изготовления таблеток. Такие вспомогательные вещества представляют собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактозу, фосфат кальция или фосфат натрия; средства для грануляции и разрыхляющие средства, например кукурузный крахмал или альгиновую кислоту; связующие средства, например, крахмал, желатин или аравийскую камедь; и смазывающие средства, например, стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. Таблетки являются непокрытыми или покрытыми посредством известных методик для замедления распада и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и обеспечения таким образом устойчивого действия в течение более длительного периода. Например, можно использовать вещество для замедленного действия, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Составы для перорального применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.Suitable compositions for oral administration include an effective amount of a compound of the present invention in the form of tablets, lozenges, aqueous or oily suspensions, dispersible powders or granules, emulsions, hard or soft capsules or syrups or tinctures. Compositions intended for oral administration are prepared according to any method known in the art for the manufacture of pharmaceutical compositions, and such compositions may contain one or more agents selected from the group consisting of sweetening agents, flavoring agents, coloring agents and preservatives, in order to obtain preparations that are pharmaceutically acceptable and have an attractive taste. The tablets may contain the active ingredient in admixture with non-toxic pharmaceutically acceptable excipients which are suitable for the manufacture of tablets. Such excipients are, for example, inert diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate, lactose, calcium phosphate or sodium phosphate; granulating agents and disintegrating agents, for example corn starch or alginic acid; binders, for example starch, gelatin or gum arabic; and lubricants, for example magnesium stearate, stearic acid or talc. The tablets are uncoated or coated by known techniques to slow down disintegration and absorption in the gastrointestinal tract and thus provide a sustained action over a longer period. For example, a delayed release agent such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate may be used. Formulations for oral administration may be presented as hard gelatin capsules wherein the active ingredient is mixed with an inert solid diluent such as calcium carbonate, calcium phosphate or kaolin, or as soft gelatin capsules wherein the active ingredient is mixed with water or an oily vehicle, for example , peanut butter, liquid paraffin or olive oil.

Определенные инъекционные композиции представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, а суппозитории преимущественно получают из жирных эмульсий или суспензий. Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или могут содержать вспомогательные средства, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие средства, ускорители растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут также содержать другие терапевтически ценные вещества. Указанные композиции получают в соответствии с традиционными способами смешивания, гранулирования или нанесения покрытия соответственно, и они содержат приблизительно 0,1-75% или содержат приблизительно 1-50% активного ингредиента.Certain injectable compositions are aqueous isotonic solutions or suspensions, and suppositories are predominantly prepared from fatty emulsions or suspensions. Said compositions may be sterilized and/or may contain adjuvants such as preserving, stabilizing, wetting or emulsifying agents, dissolution accelerators, salts for adjusting osmotic pressure and/or buffers. In addition, they may also contain other therapeutically valuable substances. Said compositions are prepared according to conventional mixing, granulating or coating methods, respectively, and contain about 0.1-75% or about 1-50% active ingredient.

Подходящие композиции для трансдермального применения содержат эффективное количество соединения по настоящему изобретению с подходящим носителем. Носители, подходящие для трансдермальной доставки, включают абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители для содействия прохождению через кожу получающего их пациента. Например, трансдермальные устройства представлены в форме перевязочного материала, содержащего поддерживающий элемент, резервуар, содержащий соединение, необязательно вместе с носителями, необязательно барьерный элемент, контролирующий скорость, для доставки соединения через кожу получающего его пациента с контролируемой и предварительно определенной скоростью в течение длительного периода времени, а также средство для прикрепления устройства к коже.Suitable compositions for transdermal use contain an effective amount of a compound of the present invention with a suitable carrier. Carriers suitable for transdermal delivery include absorbable pharmacologically acceptable solvents to facilitate passage through the skin of the patient receiving them. For example, transdermal devices are in the form of a dressing comprising a support member, a reservoir containing the compound, optionally together with carriers, optionally a rate-controlled barrier member, to deliver the compound through the skin of a receiving patient at a controlled and predetermined rate over an extended period of time. , as well as a means for attaching the device to the skin.

Подходящие композиции для местного применения, например, в отношении кожи и глаз, включают водные растворы, суспензии, мази, кремы, гели или распыляемые составы, например, для доставки посредством аэрозоля или т. п. Такие системы для местной доставки будут, в частности, подходящими для накожного применения, например для лечения рака кожи, например для профилактического применения в солнцезащитных кремах, лосьонах, аэрозолях и т. п. Таким образом, они являются особенно подходящими для применения в составах для местного применения, в том числе косметических, хорошо известных из уровня техники. Таковые могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, средства для увеличения тоничности, буферы и консерванты.Suitable compositions for topical application, for example, for the skin and eyes, include aqueous solutions, suspensions, ointments, creams, gels or spray formulations, for example, for delivery by aerosol or the like. Such topical delivery systems will be particularly suitable for dermal application, for example for the treatment of skin cancer, for example for prophylactic use in sunscreens, lotions, aerosols, and the like. Thus, they are particularly suitable for use in topical and cosmetic formulations well known in the art. These may contain solubilizers, stabilizers, tonicity enhancers, buffers and preservatives.

Используемое в данном документе "местное применение" может также относиться к ингаляционному или интраназальному применению. В целях удобства их можно доставлять в форме сухого порошка (либо отдельно, в качестве смеси, например сухой смеси с лактозой, либо частицы из смешанных компонентов, например с фосфолипидами) из ингалятора сухого порошка или подачи распыляемого аэрозоля из контейнера под давлением, диспенсера с помпой, пульвелизатора, распылителя или небулайзера с применением подходящего газа-вытеснителя или без него.As used herein, "topical application" may also refer to inhalation or intranasal administration. For convenience, they can be delivered in dry powder form (either alone, as a mixture, such as dry formula with lactose, or particles of mixed components, such as phospholipids) from a dry powder inhaler or nebulized aerosol supply from a pressurized container, pump dispenser , atomizer, nebulizer or nebulizer with or without a suitable propellant.

В настоящем изобретении дополнительно предусматриваются безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие соединения по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, поскольку вода может содействовать разрушению некоторых соединений.The present invention further provides for anhydrous pharmaceutical compositions and dosage forms containing the compounds of the present invention as active ingredients, since water may assist in the degradation of some compounds.

Безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы по настоящему изобретению можно получать с применением безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги и условий с низким содержанием влаги или низкой влажностью. Безводную фармацевтическую композицию можно получать и хранить таким образом, чтобы сохранялась ее безводная природа. Соответственно, безводные композиции упаковывают с применением материалов, которые, как известно, предотвращают воздействие воды, так что они могут быть включены в подходящие рецептурные наборы. Примеры подходящей упаковки включают без ограничения виды герметично закрываемой фольги, пластиковые материалы, контейнеры с однократной дозой (например, флаконы), блистерные упаковки и контурные безъячейковые упаковки.Anhydrous pharmaceutical compositions and dosage forms of the present invention can be prepared using anhydrous or low moisture ingredients and low moisture or low humidity conditions. The anhydrous pharmaceutical composition may be prepared and stored in a manner that maintains its anhydrous nature. Accordingly, anhydrous compositions are packaged using materials known to prevent exposure to water so that they can be included in suitable formulation kits. Examples of suitable packaging include, but are not limited to, sealable foils, plastic materials, single dose containers (e.g., vials), blister packs and blister packs.

В настоящем изобретении дополнительно предусматриваются фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие одно или несколько средств, которые снижают скорость, с которой соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента будет распадаться. Такие средства, которые упоминаются в данном документе как "стабилизаторы", включают без ограничения антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, буферы для регулирования pH или солевые буферы и т. д.The present invention further provides pharmaceutical compositions and dosage forms containing one or more agents that reduce the rate at which the compound of the present invention as an active ingredient will degrade. Such agents, which are referred to herein as "stabilizers", include, without limitation, antioxidants such as ascorbic acid, pH buffers or saline buffers, etc.

Соединение по настоящему изобретению, как правило, составляют в фармацевтических лекарственных формах для обеспечения легко контролируемого дозирования лекарственного средства и обеспечения пациента простым и легким в применении продуктом. Схема дозирования для соединений по настоящему изобретению, естественно, будет варьироваться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного средства, а также способ и путь его введения; вид, возраст, пол, состояние здоровья, медицинское показание и вес реципиента; природа и степень выраженности симптомов; вид сопутствующего лечения; частота лечения; путь введения, функция почек и печени пациента и необходимый эффект. Соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде однократной суточной дозы или общую суточную дозу можно вводить разделенными дозами два, три или четыре раза в сутки.The compound of the present invention is typically formulated into pharmaceutical dosage forms to provide an easily controlled dosage of the drug and provide the patient with a simple and easy to administer product. The dosing schedule for the compounds of the present invention will, of course, vary depending on known factors such as the pharmacodynamic characteristics of the particular agent, as well as the mode and route of its administration; type, age, gender, health status, medical indication and weight of the recipient; nature and severity of symptoms; type of concomitant treatment; frequency of treatment; the route of administration, the patient's kidney and liver function, and the desired effect. The compounds of the present invention may be administered as a single daily dose or the total daily dose may be administered in divided doses two, three or four times a day.

В некоторых случаях может быть преимущественным введение соединения по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими терапевтически активными средствами, независимо выбранными из противораковых средств, противоаллергических средств, противорвотных средств, обезболивающих средств, иммуномодуляторов и цитопротекторных средств.In some instances, it may be advantageous to administer a compound of the present invention in combination with one or more therapeutically active agents independently selected from anticancer agents, antiallergic agents, antiemetics, analgesics, immunomodulators, and cytoprotective agents.

Термин "комбинированная терапия" обозначает введение двух или более терапевтических средств для лечения терапевтического заболевания, нарушения или состояния, описанного в настоящем изобретении. Такое введение охватывает совместное введение данных терапевтических средств по сути одновременно, как, например, в одной капсуле, содержащей фиксированное соотношение активных ингредиентов. В качестве альтернативы такое введение охватывает совместное введение в составных или в отдельных контейнерах (например, капсулы, порошки и жидкости) для каждого активного ингредиента. Соединение по настоящему изобретению и дополнительные терапевтические средства можно вводить одним и тем же путем введения или разными путями введения. Порошки и/или жидкости могут быть растворены или разбавлены до необходимой дозы перед введением. Кроме того, такое введение также охватывает применение каждого типа терапевтического средства последовательно, при этом примерно в одно и то же время, либо в разное время. В любом случае схема лечения будет обеспечивать благоприятные эффекты комбинации лекарственных средств при лечении заболеваний, состояний или нарушений, описанных в данном документе. The term "combination therapy" refers to the administration of two or more therapeutic agents for the treatment of a therapeutic disease, disorder or condition described in the present invention. Such administration encompasses the co-administration of these therapeutic agents substantially simultaneously, such as in a single capsule containing a fixed ratio of active ingredients. Alternatively, such administration encompasses co-administration in multiple or separate containers (eg capsules, powders and liquids) for each active ingredient. The compound of the present invention and additional therapeutic agents can be administered by the same route of administration or by different routes of administration. Powders and/or liquids may be dissolved or diluted to the desired dose prior to administration. In addition, such administration also encompasses the use of each type of therapeutic agent sequentially, either at about the same time or at different times. In any event, the treatment regimen will provide the beneficial effects of the combination of drugs in the treatment of the diseases, conditions, or disorders described herein.

Основные химиотерапевтические средства, рассматриваемые для применения в видах комбинированной терапии, включают капецитабин (Xeloda®), N4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (Paraplatin®), цисплатин (Platinol®), кладрибин (Leustatin®), циклофосфамид (Cytoxan® или Neosar®), цитарабин, цитозин-арабинозид (Cytosar-U®), липосомальный цитарабин для инъекций (DepoCyt®), дакарбазин (DTIC-Dome®), доксорубицина гидрохлорид (Adriamycin®, Rubex®), флударабина фосфат (Fludara®), 5-фторурацил (Adrucil®, Efudex®), гемцитабин (дифтордезоксицитидин), иринотекан (Camptosar®), L-аспарагиназу (ELSPAR®), 6-меркаптопурин (Purinethol®), метотрексат (Folex®), пентостатин, 6-тиогуанин, тиотепу и топотекана гидрохлорид для инъекций (Hycamptin®).The main chemotherapy agents being considered for use in combination therapies include capecitabine (Xeloda®), N4-pentoxycarbonyl-5-deoxy-5-fluorocytidine, carboplatin (Paraplatin®), cisplatin (Platinol®), cladribine (Leustatin®), cyclophosphamide (Cytoxan® or Neosar®), cytarabine, cytosine arabinoside (Cytosar-U®), liposomal cytarabine injectable (DepoCyt®), dacarbazine (DTIC-Dome®), doxorubicin hydrochloride (Adriamycin®, Rubex®), fludarabine phosphate ( Fludara®), 5-fluorouracil (Adrucil®, Efudex®), gemcitabine (difluorodeoxycytidine), irinotecan (Camptosar®), L-asparaginase (ELSPAR®), 6-mercaptopurine (Purinethol®), methotrexate (Folex®), pentostatin, 6-thioguanine, thiotepa, and topotecan hydrochloride injection (Hycamptin®).

Представляющие особый интерес противораковые средства для комбинаций с соединениями по настоящему изобретению включают следующее.Anticancer agents of particular interest for combination with the compounds of the present invention include the following.

Ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы (PI3K): 4-[2-(1H-индазол-4-ил)-6-[[4-(метилсульфонил)пиперазин-1-ил]метил]тиено[3,2-d]пиримидин-4-ил]морфолин (также известный как GDC 0941 и описанный в публикациях согласно PCT №№ WO 09/036082 и WO 09/055730); 4-(трифторметил)-5-(2,6-диморфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амин (также известный как BKM120 или NVP-BKM120 и описанный в публикации согласно PCT № WO2007/084786); алпелисиб (BYL719): (5Z)-5-[[4-(4-пиридинил)-6-хинолинил]метилен]-2,4-тиазолидиндион (GSK1059615, CAS 958852-01-2); 5-[8-метил-9-(1-метилэтил)-2-(4-морфолинил)-9H-пурин-6-ил]-2-пиримидинамин (VS-5584, CAS 1246560-33-7) и эверолимус (AFINITOR®).Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) inhibitors: 4-[2-(1H-indazol-4-yl)-6-[[4-(methylsulfonyl)piperazin-1-yl]methyl]thieno[3,2-d] pyrimidin-4-yl]morpholine (also known as GDC 0941 and described in PCT Publication Nos. WO 09/036082 and WO 09/055730); 4-(trifluoromethyl)-5-(2,6-dimorpholinopyrimidin-4-yl)pyridine-2-amine (also known as BKM120 or NVP-BKM120 and described in PCT Publication No. WO2007/084786); alpelisib (BYL719): (5Z)-5-[[4-(4-pyridinyl)-6-quinolinyl]methylene]-2,4-thiazolidinedione (GSK1059615, CAS 958852-01-2); 5-[8-methyl-9-(1-methylethyl)-2-(4-morpholinyl)-9H-purin-6-yl]-2-pyrimidinamine (VS-5584, CAS 1246560-33-7 ) and everolimus ( AFINITOR®).

Ингибиторы митоген-активируемой протеинкиназы (MEK): XL-518 (также известный как GDC-0973, Cas № 1029872-29-4, доступный от ACC Corp.); селуметиниб (5-[(4-бром-2-хлорфенил)амино]-4-фтор-N-(2-гидроксиэтокси)-1-метил-1H-бензимидазол-6-карбоксамид, также известный как AZD6244 или ARRY 142886, описанный в публикации согласно PCT № WO2003077914); 2-[(2-хлор-4-йодфенил)амино]-N-(циклопропилметокси)-3,4-дифторбензамид (также известный как CI-1040 или PD184352 и описанный в публикации согласно PCT № WO2000035436); N-[(2R)-2,3-дигидроксипропокси]-3,4-дифтор-2-[(2-фтор-4-йодфенил)амино]-бензамид (также известный как PD0325901 и описанный в публикации согласно PCT № WO2002006213); 2,3-бис[амино[(2-аминофенил)тио]метилен]-бутандинитрил (также известный как U0126 и описанный в патенте США № 2779780); N-[3,4-дифтор-2-[(2-фтор-4-йодфенил)амино]-6-метоксифенил]-1-[(2R)-2,3-дигидроксипропил]-циклопропансульфонамид (также известный как RDEA119 или BAY869766 и описанный в публикации согласно PCT № WO2007014011); (3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(этиламино)-8,9,16-тригидрокси-3,4-диметил-3,4,9,19-тетрагидро-1H-2-бензоксациклотетрадецин-1,7(8H)-дион] (также известный как E6201 и описанный в публикации согласно PCT № WO2003076424); 2'-амино-3'-метоксифлавон (также известный как PD98059, доступный от Biaffin GmbH & Co., KG, Германия); (R)-3-(2,3-дигидроксипропил)-6-фтор-5-(2-фтор-4-йодфениламино)-8-метилпиридо[2,3-d]пиримидин-4,7(3H,8H)-дион (TAK-733, CAS 1035555-63-5); пимасертиб (AS-703026, CAS 1204531-26-9); траметиниба диметилсульфоксид (GSK-1120212, CAS 1204531-25-80); 2-(2-фтор-4-йодфениламино)-N-(2-гидроксиэтокси)-1,5-диметил-6-оксо-1,6-дигидропиридин-3-карбоксамид (AZD 8330); 3,4-дифтор-2-[(2-фтор-4-йодфенил)амино]-N-(2-гидроксиэтокси)-5-[(3-оксо-[1,2]оксазинан-2-ил)метил]бензамид (CH 4987655 или Ro 4987655); () и 5-[(4-бром-2-фторфенил)амино]-4-фтор-N-(2-гидроксиэтокси)-1-метил-1H-бензимидазол-6-карбоксамид (MEK162).Mitogen-activated protein kinase (MEK) inhibitors: XL-518 (also known as GDC-0973, Cas no. 1029872-29-4, available from ACC Corp.); selumetinib (5-[(4-bromo-2-chlorophenyl)amino]-4-fluoro-N-(2-hydroxyethoxy)-1-methyl-1H-benzimidazole-6-carboxamide, also known as AZD6244 or ARRY 142886 described in PCT Publication No. WO2003077914 ) ; 2-[(2-chloro-4-iodophenyl)amino]-N-(cyclopropylmethoxy)-3,4-difluorobenzamide (also known as CI-1040 or PD184352 and described in PCT Publication No. WO2000035436); N-[(2R)-2,3-dihydroxypropoxy]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]benzamide (also known as PD0325901 and described in PCT Publication No. WO2002006213) ; 2,3-bis[amino[(2-aminophenyl)thio]methylene]butanenitrile (also known as U0126 and described in US Pat. No. 2,779,780); N-[3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-6-methoxyphenyl]-1-[(2R)-2,3-dihydroxypropyl]cyclopropanesulfonamide (also known as RDEA119 or BAY869766 and described in PCT Publication No. WO2007014011); (3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(ethylamino)-8,9,16-trihydroxy-3,4-dimethyl-3,4,9,19-tetrahydro-1H-2-benzoxacyclotetradecin- 1,7(8H)-dione] (also known as E6201 and described in PCT Publication No. WO2003076424); 2'-amino-3'-methoxyflavone (also known as PD98059, available from Biaffin GmbH & Co., KG, Germany); (R)-3-(2,3-dihydroxypropyl)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-iodophenylamino)-8-methylpyrido[2,3-d]pyrimidine-4,7(3H,8H) -dione (TAK-733, CAS 1035555-63-5); pimacertib (AS-703026, CAS 1204531-26-9); trametinib dimethyl sulfoxide (GSK-1120212, CAS 1204531-25-80); 2-(2-fluoro-4-iodophenylamino)-N-(2-hydroxyethoxy)-1,5-dimethyl-6-oxo-1,6-dihydropyridine-3-carboxamide (AZD 8330); 3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-N-(2-hydroxyethoxy)-5-[(3-oxo-[1,2]oxazinan-2-yl)methyl] benzamide (CH 4987655 or Ro 4987655); () and 5-[(4-bromo-2-fluorophenyl)amino]-4-fluoro-N-(2-hydroxyethoxy)-1-methyl-1H-benzimidazole-6-carboxamide (MEK162).

Ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR): эрлотиниба гидрохлорид (Tarceva®), гефитиниб (Iressa®); дакомитиниб (PF299804); N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[[(3''S'')-тетрагидро-3-фуранил]окси]-6-хиназолинил]-4(диметиламино)-2-бутенамид (Tovok®); вандетаниб (Caprelsa®); лапатиниб (Tykerb®); (3R,4R)-4-амино-1-((4-((3-метоксифенил)амино)пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-5-ил)метил)пиперидин-3-ол (BMS690514); канертиниба дигидрохлорид (CI-1033); 6-[4-[(4-этил-1-пиперазинил)метил]фенил]-N-[(1R)-1-фенилэтил]-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-амин (AEE788, CAS 497839-62-0); мубритиниб (TAK165); пелитиниб (EKB569); афатиниб (BIBW2992); нератиниб (HKI-272); N-[4-[[1-[(3-фторфенил)метил]-1H-индазол-5-ил]амино]-5-метилпирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-6-ил]карбаминовой кислоты (3S)-3-морфолинилметиловый сложный эфир (BMS599626); N-(3,4-дихлор-2-фторфенил)-6-метокси-7-[[(3aα,5β,6aα)-октагидро-2-метилциклопента[c]пиррол-5-ил]метокси]-4-хиназолинамин (XL647, CAS 781613-23-8) и 4-[4-[[(1R)-1-фенилэтил]амино]-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенол (PKI166, CAS 187724-61-4).Epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors: erlotinib hydrochloride (Tarceva®), gefitinib (Iressa®); dacomitinib (PF299804); N-[4-[(3-chloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[[(3''S'')-tetrahydro-3-furanyl]oxy]-6-quinazolinyl]-4(dimethylamino)- 2-butenamide (Tovok®); vandetanib (Caprelsa®); lapatinib (Tykerb®); (3R,4R)-4-amino-1-((4-((3-methoxyphenyl)amino)pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-yl)methyl)piperidin-3 -ol (BMS690514); canertinib dihydrochloride (CI-1033); 6-[4-[(4-Ethyl-1-piperazinyl)methyl]phenyl] -N -[( 1R )-1-phenylethyl] -7H- pyrrolo[2,3- d ]pyrimidin-4-amine ( AEE788, CAS 497839-62-0); mubritinib (TAK165); pelitinib (EKB569); afatinib (BIBW2992); neratinib (HKI-272); N -[4-[[1-[(3-fluorophenyl)methyl]-1 H -indazol-5-yl]amino]-5-methylpyrrolo[2,1- f ][1,2,4]triazine-6 -yl]carbamic acid ( 3S )-3-morpholinylmethyl ester (BMS599626); N -(3,4-dichloro-2-fluorophenyl)-6-methoxy-7-[[(3aα,5β,6aα)-octahydro-2-methylcyclopenta[ c ]pyrrol-5-yl]methoxy]-4-quinazolinamine (XL647, CAS 781613-23-8) and 4-[4-[[(1 R )-1-phenylethyl]amino]-7 H -pyrrolo[2,3- d ]pyrimidin-6-yl]phenol (PKI166 , CAS 187724-61-4).

Антитела к EGFR: цетуксимаб (Erbitux®); панитумумаб (Vectibix®); матузумаб (EMD-72000); трастузумаб (Herceptin®); нимотузумаб (hR3); залутумумаб; TheraCIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1) и ch806 (mAb-806, CAS 946414-09-1).Anti-EGFR antibodies: cetuximab (Erbitux®); panitumumab (Vectibix®); matuzumab (EMD-72000); trastuzumab (Herceptin®); nimotuzumab (hR3); zalutumumab; TheraCIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1) and ch806 (mAb-806, CAS 946414-09-1).

Ингибиторы MAPK: вемурафиниб (Zelboraf®), сорафиниб (Nexavar®), дабрефиниб (Tafinlar®), траметиниб (Mekinist®) и селуметиниб (AZD6244, ARRY-142886).MAPK inhibitors: vemurafinib (Zelboraf®), sorafinib (Nexavar®), dabrefinib (Tafinlar®), trametinib (Mekinist®), and selumetinib (AZD6244, ARRY-142886).

Ингибиторы EED/EZH2: таземетостат (EPZ-6438), GSK2816126 (CAS 1346574-57-9), CPI-1205 (CAS 1621862-70-1) и DS-3201 (также известный как DS-3201b, Daiichi Sankyo, Inc).EED/EZH2 inhibitors: Tazemetostat (EPZ-6438), GSK2816126 (CAS 1346574-57-9), CPI-1205 ( CAS 1621862-70-1), and DS-3201 (also known as DS-3201b, Daiichi Sankyo, Inc) .

Модуляторы контрольных точек иммунного ответа: пембролизумаб (Keytruda®), ниволумаб (Opdivo®), атезолизумаб (Tecentriq®) и ипилумумаб (Yervoy®).Immune checkpoint modulators: pembrolizumab (Keytruda®), nivolumab (Opdivo®), atezolizumab (Tecentriq®), and ipilumumab (Yervoy®).

У некоторых пациентов могут проявиться аллергические реакции на соединения по настоящему изобретению и/или другое(-ие) противораковое(-ые) средство(-а) в ходе или после введения; в связи с этим, чтобы свести к минимуму риск возникновения аллергической реакции часто вводят противоаллергические средства. Подходящие противоаллергические средства включают кортикостероиды (Knutson, S., et al., PLoS One, DOI:10.1371/journal.pone.0111840 (2014)), такие как дексаметазон (например Decadron®), беклометазон (например Beclovent®), гидрокортизон (также известный как кортизон, гидрокортизона натрия сукцинат, гидрокортизона натрия фосфат и продаваемый под торговыми названиями Ala-Cort® гидрокортизона фосфат, Solu-Cortef®, Hydrocort Acetate® и Lanacort®), преднизолон (продаваемый под торговыми названиями Delta-Cortel®, Orapred®, Pediapred® и Prelone®), преднизон (продаваемый под торговыми названиями Deltasone®, Liquid Red®, Meticorten® и Orasone®), метилпреднизолон (также известный как 6-метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, метилпреднизолона натрия сукцинат, продаваемый под торговыми названиями Duralone®, Medralone®, Medrol®, M-Prednisol® и Solu-Medrol®); антигистаминные средства, такие как дифенгидрамин (например Benadryl®), гидроксизин и ципрогептадин; и бронхорасширяющие средства, такие как агонисты бета-адренергических рецепторов, альбутерол (например Proventil®) и тербуталин (Brethine®).Some patients may experience allergic reactions to the compounds of the present invention and/or other(s) anticancer(s) agent(s) during or after administration; therefore, antiallergic agents are often administered to minimize the risk of an allergic reaction. Suitable antiallergic agents include corticosteroids (Knutson, S., et al., PLoS One, DOI:10.1371/journal.pone.0111840 (2014)), such as dexamethasone (eg Decadron®), beclomethasone (eg Beclovent®), hydrocortisone ( also known as cortisone, hydrocortisone sodium succinate, hydrocortisone sodium phosphate and sold under the trade names Ala-Cort® hydrocortisone phosphate, Solu-Cortef®, Hydrocort Acetate® and Lanacort®), prednisolone (sold under the trade names Delta-Cortel®, Orapred® , Pediapred®, and Prelone®), prednisone (sold under the trade names Deltasone®, Liquid Red®, Meticorten®, and Orasone®), methylprednisolone (also known as 6-methylprednisolone, methylprednisolone acetate, methylprednisolone sodium succinate, sold under the trade names Duralone® , Medralone®, Medrol®, M-Prednisol® and Solu-Medrol®); antihistamines such as diphenhydramine (eg Benadryl®), hydroxyzine and cyproheptadine; and bronchodilators such as beta-adrenergic agonists, albuterol (eg Proventil®) and terbutaline (Brethine®).

Некоторые пациенты могут испытывать тошноту во время и после введения соединения по настоящему изобретению и/или другого(-их) противоракового(-ых) средства(средств); в связи с этим для предупреждения тошноты (верхняя часть желудка) и рвоты используют противорвотные средства. Подходящие противорвотные средства включают апрепитант (Emend®), ондансетрон (Zofran®), гранисетрон HCl (Kytril®), лоразепам (Ativan®), дексаметазон (Decadron®), прохлорперазин (Compazine®), казопитант (Rezonic® и Zunrisa®) и их комбинации.Some patients may experience nausea during and after administration of a compound of the present invention and/or other(s) anticancer(s) agent(s); therefore, antiemetics are used to prevent nausea (upper stomach) and vomiting. Suitable antiemetics include aprepitant (Emend®), ondansetron (Zofran®), granisetron HCl (Kytril®), lorazepam (Ativan®), dexamethasone (Decadron®), prochlorperazine (Compazine®), casopitant (Rezonic® and Zunrisa®), and their combinations.

Лекарственные препараты для облегчения боли, испытываемой в период лечения, часто прописывают для облегчения состояния пациента. Часто используют обычные отпускаемые без рецепта анальгетики, такие как Tylenol®. Однако при умеренной или сильной боли пригодны также опиоидные анальгезирующие лекарственные средства, такие как гидрокодон/парацетамол или гидрокодон/ацетаминофен (например, Vicodin®), морфин (например, Astramorph® или Avinza®), оксикодон (например, OxyContin® или Percocet®), оксиморфона гидрохлорид (Opana®) и фентанил (например, Duragesic®).Medicines to relieve pain experienced during treatment are often prescribed to alleviate the patient's condition. Common over-the-counter analgesics such as Tylenol® are often used. However, opioid analgesics such as hydrocodone/paracetamol or hydrocodone/acetaminophen (e.g. Vicodin®), morphine (e.g. Astramorph® or Avinza®), oxycodone (e.g. OxyContin® or Percocet®) are also suitable for moderate to severe pain. , oxymorphone hydrochloride (Opana®); and fentanyl (eg, Duragesic®).

Иммуномодуляторы, представляющие особый интерес для комбинаций с соединениями по настоящему изобретению, включают: афутузумаб (доступный от Roche®); пэгфилграстим (Neulasta®); леналидомид (CC-5013, Revlimid®); талидомид (Thalomid®), актимид (CC4047) и IRX-2 (смесь цитокинов человека, содержащая интерлейкин-1, интерлейкин-2 и интерферон γ, CAS 951209-71-5, доступная от IRX Therapeutics).Immunomodulators of particular interest in combination with the compounds of the present invention include: afutuzumab (available from Roche®); pegfilgrastim (Neulasta®); lenalidomide (CC-5013, Revlimid®); thalidomide (Thalomid®), actimide (CC4047) and IRX-2 (human cytokine mixture containing interleukin-1, interleukin-2 and interferon-γ, CAS 951209-71-5, available from IRX Therapeutics).

С целью защиты нормальных клеток от токсичности, обусловленной лечением, и ограничения токсичности по отношению к органам можно использовать цитопротекторные средства (такие как нейропротекторы, поглотители свободных радикалов, кардиопротекторы, нейтрализаторы антрациклина, вызывающего кровоизлияния, питательные вещества и т. п.) в качестве вспомогательной терапии. Подходящие цитопротекторные средства включают амифостин (Ethyol®), глутамин, димесну (Tavocept®), месну (Mesnex®), дексразоксан (Zinecard® или Totect®), ксалипроден (Xaprila®) и лейковорин (также известный как лейковорин кальция, цитроворум-фактор и фолиновая кислота).In order to protect normal cells from treatment-related toxicity and limit organ toxicity, cytoprotective agents (such as neuroprotectors, free radical scavengers, cardioprotectors, anthracycline hemorrhagic scavengers, nutrients, etc.) can be used as an adjuvant. therapy. Suitable cytoprotective agents include amifostine (Ethyol®), glutamine, dimesna (Tavocept®), mesna (Mesnex®), dexrazoxane (Zinecard® or Totect®), xaliproden (Xaprila®), and leucovorin (also known as leucovorin calcium, citrovorum factor and folinic acid).

Структура активных соединений, определяемая кодовыми номерами, тривиальными названиями или торговыми марками, может быть взята из актуального издания стандартного сборника "The Merck Index" или из баз данных, например, Patents International (например, IMS World Publications).The structure of active compounds, defined by code numbers, trivial names or trademarks, can be taken from the current edition of the standard collection "The Merck Index" or from databases such as Patents International (eg IMS World Publications).

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматриваются фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем, подходящим для введения субъекту-человеку или субъекту-животному либо отдельно, либо совместно с другими противораковыми средствами.In one embodiment, the present invention provides pharmaceutical compositions comprising at least one compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, together with a pharmaceutically acceptable carrier suitable for administration to a human or animal subject, either alone or together with other anticancer agents. .

В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предусматриваются способы лечения субъектов-людей или субъектов-животных, страдающих клеточным пролиферативным заболеванием, таким как злокачественное новообразование. В настоящем изобретении предусматриваются способы лечения субъекта-человека или субъекта-животного, нуждающихся в таком лечении, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли либо отдельно, либо в комбинации с другими противораковыми средствами.In another embodiment, the present invention provides methods for treating human or animal subjects suffering from a cell proliferative disease, such as cancer. The present invention provides methods of treating a human or animal subject in need of such treatment, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, either alone or in combination with other anticancer agents.

В частности, композиции будут либо составлены вместе в виде комбинированного терапевтического средства, либо вводиться отдельно.In particular, the compositions will either be formulated together as a combination therapeutic agent or administered separately.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается фармацевтическая комбинация, содержащая соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и одно или несколько терапевтически активных средств, выбранных из группы, состоящей из абитрексата (метотрексат), абраксана (состав стабилизированных альбумином наночастиц паклитаксела), афатиниба дималеата, афинитора (эверолимус), алецензы (алектиниб), алектиниба, алимты (пеметрекседа динатрий), авастина (бевацизумаб), бевацизумаба, карбоплатина, церитиниба, кризотиниба, цирамзы (рамуцирумаб), доцетаксела, эрлотиниба гидрохлорида, эверолимуса, фолекса (метотрексат), Folex PFS (метотрексат), гефитиниба, гилотрифа (афатиниба дималеат), гемцитабина гидрохлорида, гемзара (гемцитабина гидрохлорид), ирессы (гефитиниб), кейтруды (пембролизумаб), мехлорэтамина гидрохлорида, метотрексата, Methotrexate LPF (метотрексат), мексата (метотрексат), Mexate-AQ (метотрексат), мустаргена (мехлорэтамина гидрохлорид), навелбина (винорелбина тартрат), нецитумумаба, ниволумаба, опдиво (ниволумаб), осимертиниба, паклитаксела, состава стабилизированных альбумином наночастиц паклитаксела, параплата (карбоплатин), параплатина (карбоплатин), пембролизумаба, пеметрекседа динатрия, портраззы (нецитумумаб), рамуцирумаба, тагриссо (осимертиниб), тарцевы (эрлотиниба гидрохлорид), таксола (паклитаксел), таксотера (доцетаксел), винорелбина тартрата, ксалкори (кризотиниб), зикадии (церитиниб), карбоплатина-таксола и гемцитабина-цисплатина, для лечения карциномы легкого (включая без ограничения немелкоклеточную карциному легкого, аденокарциному легкого, карциному легкого, виды крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточную карциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого).In one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical combination comprising a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more therapeutically active agents selected from the group consisting of abitrexate (methotrexate), abraxane (an albumin-stabilized nanoparticle formulation of paclitaxel), afatinib dimaleate, afinitor (everolimus), alecensa (alectinib), alectinib, alimta (pemetrexed disodium), avastin (bevacizumab), bevacizumab, carboplatin, ceritinib, crizotinib, cyramza (ramucirumab), docetaxel, erlotinib hydrochloride, everolimus, folex a (methotrexate), FOLEX PFS (methotrexate), gephitinib, gilotrif (aphatiniba dimaleat), hydrocitabin hydrochloride, gemzar (hemcitabin hydrochloride), ivures (gephitinib), cakebrudes (pemblizumab), hydrochloride mechloroetamine, methotrexate, methotrexate lpf (method Tracksat), Mexata (Metotrexate), Mexate -AQ (methotrexate), mustargen (mechlorethamine hydrochloride), navelbine (vinorelbine tartrate), necitumumab, nivolumab, opdivo (nivolumab), osimertinib, paclitaxel, paclitaxel albumin-stabilized nanoparticle formulation, paraplatin (carboplatin), paraplatin (carboplatin), pembrolizumab, pemetrexed disodium, portrazza (netcitumumab), ramucirumab, tagrisso (osimertinib), tarceva (erlotinib hydrochloride), taxola (paclitaxel), taxotera (docetaxel), vinorelbine tartrate, xalkori (crizotinib), zycadia (ceritinib), carboplatin-taxol, and gemcitabine-cisplatin , for the treatment of lung carcinoma (including, without limitation, non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung carcinoma, types of large cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, squamous cell lung carcinoma, small cell lung cancer).

В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается фармацевтическая комбинация, содержащая соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и одно или несколько терапевтически активных средств, выбранных из группы, состоящей из альдеслейкина, кобиметиниба, котеллика (кобиметиниб), дабрафениба, дакарбазина, DTIC-Dome (дакарбазин), IL-2 (альдеслейкин), ImLygic (талимоген лагерпарепвек), интерлейкина-2 (альдеслейкин), Intron A (рекомбинантный интерферон альфа-2b), ипилимумаба, кейтруда (пембролизумаб), мекиниста (траметиниб), ниволумаба, опдиво (ниволумаб), пегинтерферона альфа-2b, PEG-Intron (пегинтерферон альфа-2b), пембролизумаба, пролейкина (альдеслейкин), рекомбинантного интерферона альфа-2b, силатрона (пегинтерферон альфа-2b), тафинлара (дабрафениб), талимоген лагерпарепвека, траметиниба, вемурафениба, ервоя (ипилимумаб) и зелборафа (вемурафениб), для лечения меланомы (включая без ограничения меланому кожи, десмопластическую меланому и увеальную меланому).In another embodiment, the present invention provides a pharmaceutical combination comprising a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more therapeutically active agents selected from the group consisting of aldesleukin, cobimetinib, cotellic (cobimetinib), dabrafenib, dacarbazine, DTIC- Dome (dacarbazine), IL-2 (aldesleukin), ImLygic (talimogen lagerparepvec), interleukin-2 (aldesleukin), Intron A (recombinant interferon alfa-2b), ipilimumab, keytruda (pembrolizumab), mekinista (trametinib), nivolumab, opdivo (nivolumab), peginterferon alfa-2b, PEG-Intron (peginterferon alfa-2b), pembrolizumab, proleukin (aldesleukin), recombinant interferon alfa-2b, silatron (peginterferon alfa-2b), tafinlar (dabrafenib), talimogen lagerparepvek, trametinib, vemurafenib, ervoy (ipilimumab), and zelboraf (vemurafenib), for the treatment of melanoma (including, without limitation, cutaneous melanoma, desmoplastic melanoma, and uveal melanoma).

При комбинированной терапии для лечения злокачественного новообразования соединение по настоящему изобретению и другое(-ие) противораковое(-ые) средство(-а) можно вводить одновременно, совместно или последовательно без определенных временных ограничений, при этом такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме субъекта.In combination therapy for the treatment of cancer, the compound of the present invention and other(s) anticancer(s) agent(s) can be administered simultaneously, jointly or sequentially without specific time limits, such administration provides therapeutically effective levels of the two compounds in the subject's body.

В предпочтительном варианте осуществления соединение по настоящему изобретению и другое(-ие) противораковое(-ые) средство(-а), как правило, вводят последовательно в любом порядке с помощью инфузии или перорально. Схема дозирования может варьироваться в зависимости от стадии заболевания, физического состояния пациента, профилей безопасности отдельных лекарственных средств и переносимости отдельных лекарственных средств, а также от других критериев, хорошо известных лечащему врачу и медицинскому(-им) работнику(-ам), вводящему(-им) данную комбинацию. Соединение по настоящему изобретению и другое(-ие) противораковое(-ые) средство(-а) можно вводить в пределах минутных интервалов друг от друга, с интервалом, составляющим часы, сутки или даже недели, в зависимости от определенного цикла, используемого для лечения. Кроме того, цикл может включать более частое введение одного лекарственного средства по сравнению с другим в ходе цикла лечения и в различных дозах на одно введение лекарственного средства. In a preferred embodiment, the compound of the present invention and the other(s) anticancer(s) agent(s), as a rule, are administered sequentially in any order by infusion or orally. The dosing regimen may vary depending on the stage of the disease, the physical condition of the patient, the safety profiles of individual drugs and the tolerability of individual drugs, as well as other criteria well known to the attending physician and the medical professional (s) administering (- im) this combination. The compound of the present invention and the other anticancer agent(s) may be administered within minute intervals of each other, at intervals of hours, days, or even weeks, depending on the specific cycle used for treatment. . In addition, the cycle may include more frequent administration of one drug compared to another during the course of the treatment cycle and at different doses per administration of the drug.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусматривается набор, содержащий две или более отдельных фармацевтических композиций, по меньшей мере одна из которых содержит соединение по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления набор содержит средства для раздельного содержания указанных композиций, такие как контейнер, секционная бутылка или секционный пакет из фольги. Примером такого набора является блистерная упаковка, как правило, применяемая для упаковывания таблеток, капсул и т. п.In another aspect, the present invention provides a kit containing two or more separate pharmaceutical compositions, at least one of which contains a compound of the present invention. In one embodiment, the kit contains means for separating said compositions, such as a container, sectional bottle, or sectional foil pouch. An example of such a kit is a blister pack, typically used for packaging tablets, capsules, and the like.

Набор по настоящему изобретению можно применять для введения различных лекарственных форм, например, для перорального и парентерального применения, для введения отдельных композиций с различными интервалами между введениями доз или для титрования отдельных композиций одна относительно другой. Для содействия соблюдению режима лечения набор по настоящему изобретению, как правило, содержит инструкции по введению.The kit of the present invention can be used to administer various dosage forms, for example, for oral and parenteral use, to administer individual compositions at different intervals between doses, or to titrate individual compositions against one another. To facilitate adherence to a treatment regimen, the kit of the present invention typically contains instructions for administration.

Соединение по настоящему изобретению также может успешно применяться в сочетании с известными терапевтическими процессами, например, введением гормонов или, особенно, облучением. Соединение по настоящему изобретению, в частности, может применяться в качестве радиосенсибилизатора, особенно для лечения опухолей, которые характеризуются слабой чувствительностью к лучевой терапии.The compound of the present invention can also be successfully used in combination with known therapeutic processes, such as hormone administration or, especially, radiation. The compound of the present invention, in particular, can be used as a radiosensitizer, especially for the treatment of tumors, which are characterized by low sensitivity to radiation therapy.

В видах комбинированной терапии по настоящему изобретению соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство могут быть изготовлены и/или составлены одним и тем же или разными производителями. Более того, соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое (или фармацевтическое) средство могут быть сведены в комбинированную терапию: (i) до того, как комбинированный продукт попадает к врачам (например, в случае набора, содержащего соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство); (ii) самими врачами (или под наблюдением врача) незадолго до введения; (iii) в организме пациентов, например в ходе последовательного введения соединения по настоящему изобретению и другого терапевтического средства.In the combination therapies of the present invention, the compound of the present invention and the other therapeutic agent may be manufactured and/or formulated by the same or different manufacturers. Moreover, a compound of the present invention and another therapeutic (or pharmaceutical) agent may be combined into a combination therapy: (i) before the combination product reaches physicians (e.g., in the case of a kit containing a compound of the present invention and another therapeutic agent); (ii) by physicians themselves (or under the supervision of a physician) shortly before administration; (iii) in the body of patients, for example, during the sequential administration of a compound of the present invention and another therapeutic agent.

Фармацевтическая композиция (или состав) для применения может быть упакована различными способами в зависимости от способа, применяемого для введения лекарственного средства. Как правило, изделие для распределения включает контейнер, в который помещен фармацевтический состав в соответствующей форме. Подходящие контейнеры хорошо известны специалистам в данной области техники и предусматривают такие материалы, как бутылки (пластиковые и стеклянные), саше, ампулы, пластиковые пакеты, металлические цилиндры и т. п. Контейнер также может предусматривать сборку с индикацией вскрытия для предотвращения несанкционированного доступа к содержимому упаковки. Кроме того, на контейнер нанесена этикетка, на которой описывается содержимое контейнера. Этикетка также может содержать соответствующие предупреждения.The pharmaceutical composition (or composition) for use may be packaged in various ways depending on the method used to administer the drug. As a rule, the product for distribution includes a container in which the pharmaceutical composition is placed in an appropriate form. Suitable containers are well known to those skilled in the art and include materials such as bottles (plastic and glass), sachets, ampoules, plastic bags, metal cylinders, and the like. The container may also include a tamper-evident assembly to prevent unauthorized access to the contents. packaging. In addition, the container is labeled with a description of the contents of the container. The label may also contain appropriate warnings.

Фармацевтическая композиция или комбинация по настоящему изобретению может быть представлена в однократной дозировке, составляющей приблизительно 1-1000 мг активного(-ых) ингредиента(-ов) для субъекта весом приблизительно 50-70 кг, или приблизительно 1-500 мг, или приблизительно 1-250 мг, или приблизительно 1-150 мг, или приблизительно 0,5-100 мг, или приблизительно 1-50 мг активных ингредиентов. Терапевтически эффективная дозировка соединения, фармацевтической композиции или их комбинаций зависит от вида субъекта, массы тела, возраста, а также индивидуального состояния, нарушения или заболевания, лечение которых осуществляется, или их тяжести. Лечащий врач, клиницист или ветеринар средней квалификации может легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для предупреждения, лечения или подавления прогрессирования нарушения или заболевания.The pharmaceutical composition or combination of the present invention may be presented in a single dosage of about 1-1000 mg of active ingredient(s) for a subject weighing about 50-70 kg, or about 1-500 mg, or about 1- 250 mg or about 1-150 mg or about 0.5-100 mg or about 1-50 mg of the active ingredients. A therapeutically effective dosage of a compound, pharmaceutical composition, or combinations thereof will depend on the type of subject, body weight, age, and the individual condition, disorder, or disease being treated, or their severity. The attending physician, clinician or veterinarian of ordinary skill can easily determine the effective amount of each of the active ingredients necessary to prevent, treat or inhibit the progression of the disorder or disease.

Вышеупомянутые свойства дозировки можно продемонстрировать в тестах in vitro и in vivo с применением преимущественно млекопитающих, например, мышей, крыс, собак, обезьян, или выделенных органов, тканей и препаратов на их основе. Соединения по настоящему изобретению можно применять in vitro в форме растворов, например водных растворов, и in vivo, будь то энтерально, парентерально, преимущественно внутривенно, например, в виде суспензии или в водном растворе. Дозировка in vitro может находиться в диапазоне значений концентрации от приблизительно 10^-3 моль/л до 10^-9 моль/л. В зависимости от пути введения терапевтически эффективное количество in vivo может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 до 500 мг/кг или от приблизительно 1 до 100 мг/кг.The above dosage properties can be demonstrated in testsin vitro Andin vivo using predominantly mammals, for example, mice, rats, dogs, monkeys, or isolated organs, tissues and preparations based on them. The compounds of the present invention can be usedin vitroin the form of solutions, for example aqueous solutions, andin vivo, whether enteral, parenteral, predominantly intravenous, e.g., in the form of a suspension or in an aqueous solution. Dosagein vitromay range in concentration from about 10^-3 mol/l up to 10^-9 mol/l. Depending on the route of administration, a therapeutically effective amountin vivo may range from about 0.1 to 500 mg/kg, or from about 1 to 100 mg/kg.

ФАРМАКОЛОГИЯ И ПРИМЕНИМОСТЬPHARMACOLOGY AND APPLICABILITY

Мутации в комплексах ремоделирования хроматина SWI/SNF являются широко распространенными при видах рака и появляются с частотой примерно 20% (Kadoch, C., Hargreaves, D. C., et al. 2013 Nat Genet. 45: 592-601) (Shain, A.H., and Pollack, J.R. 2013 PLoS ONE 8(1): e55119). Комплексы SWI/SNF состоят из различных субъединиц и участвуют в АТФ-зависимом ремоделировании хроматина с обеспечением контроля ключевых событий в клетках, таких как регуляция экспрессии генов. Каталитические субъединицы АТФазы внутри комплекса SWI/SNF состоят либо из BRM/SMARCA2, либо из BRG1/SMARCA4 и, таким образом, являются взаимоисключающими (Hodges, C., Kirkland, J.G., et al. 2016 Cold Spring Harb Persp Med 6(8)). С помощью функционального геномного скрининга с помощью shRNA раскрыли заметное синтетическое летальное взаимодействие между такими двумя АТФазами SWI/SNF, BRM и BRG1 (Hoffman, G.R; Rahal, R et al. 2014 PNAS 111(8): 3128-33; Wilson, B.G., Helming, K.C., et al. 2014 Molecular and Cellular Biology 34(6): 1136-44). В частности, раковые клетки, у которых отсутствует функциональный BRG1, например, вследствие мутаций с потерей функции или делеций, являются особенно чувствительными к истощению по BRM посредством опосредованного shRNA нокдауна, что приводит к подавлению роста (Hoffman, G.R., Rahal, R et al., 2014 PNAS 111(8): 3128-33; Oike, T., Ogiwara, H., et al. 2013 Cancer Research 73(17): 5508-5518); и Vangamudi, B., Paul, T.A., et al. 2015 Cancer Research 75(18): 3865-3878). Следовательно, в таких исследованиях раскрывается, что при отсутствии одной из АТФаз SWI/SNF для выживания раковые клетки могут стать высоко зависимыми от оставшейся АТФазы, что открывает уязвимость, которую можно использовать для направленной терапии. Генетические повреждения в BRG1 действительно были идентифицированы при различных видах рака, преимущественно при видах немелкоклеточного рака легкого с частотой примерно 10%, но также при других типах рака, таких как рак печени, поджелудочной железы, виды меланомы и т. д. (Imielinski, M., A. H. Berger, et al. (2012) Cell 150(6): 1107-1120); информационный портал The Cancer Genome Atlas (TCGA) и cBioPortal for Cancer Genomics). Таким образом, они составляют весьма значительные популяции пациентов с очевидными неудовлетворенными медицинскими потребностями, и ожидается, что они получат пользу от терапевтического ингибирования BRM. Так же, как некоторые раковые клетки являются зависимыми от BRM из-за потери функции BRG1, интересно, что другие типы рака, как сообщалось, являются BRG1-зависимыми, потенциально возникающими посредством различных механизмов, включая мутации в других субъединицах комплекса SWI/SNF (Shi, J; Whyte, W.A., et al. 2013 Genes and Development 27(24): 2648-2662; Xi, W., Sansam, C.G., et al. 2009 Cancer Research 69(20): 8094-8101; и Zuber, J., Shi, J., et al. 2011 Nature 478(7370), 524-528). Кроме того, сообщалось, что активность SWI/SNF изменяется при других заболеваниях, что делает его привлекательной терапевтической мишенью при других заболеваниях, помимо рака. (Han, P., Li, W., et al. 2014 Nature 514(7520): 102-06). Следовательно, способность ингибировать либо одну из АТФаз, либо обе из них может иметь множество применений при лечении различных типов рака и заболеваний.Mutations in the SWI/SNF chromatin remodeling complexes are widespread in cancers and occur at a frequency of approximately 20% (Kadoch, C., Hargreaves, D.C., et al. 2013 Nat Genet. 45: 592-601) (Shain, A.H., and Pollack, J.R. 2013 PLoS ONE 8(1): e55119). The SWI/SNF complexes consist of various subunits and are involved in ATP-dependent chromatin remodeling to control key events in cells, such as the regulation of gene expression. The ATPase catalytic subunits within the SWI/SNF complex consist of either BRM/SMARCA2 or BRG1/SMARCA4 and are thus mutually exclusive (Hodges, C., Kirkland, J.G., et al. 2016 Cold Spring Harb Persp Med 6(8) ). Functional genomic screening with shRNA revealed a marked synthetic lethal interaction between these two SWI/SNF ATPases, BRM and BRG1 (Hoffman, G.R; Rahal, R et al. 2014 PNAS 111(8): 3128-33; Wilson, B.G., Helming, K.C., et al 2014 Molecular and Cellular Biology 34(6): 1136-44). In particular, cancer cells lacking functional BRG1, for example due to loss-of-function mutations or deletions, are particularly susceptible to BRM depletion via shRNA-mediated knockdown, resulting in growth suppression (Hoffman, G. R., Rahal, R et al. , 2014 PNAS 111(8): 3128-33;Oike, T., Ogiwara, H., et al.2013 Cancer Research 73(17): 5508-5518); and Vangamudi, B., Paul, T.A., et al. 2015 Cancer Research 75(18): 3865-3878). Therefore, such studies reveal that in the absence of one of the SWI/SNF ATPases for survival, cancer cells can become highly dependent on the remaining ATPase, opening up a vulnerability that can be exploited for targeted therapy. Genetic lesions in BRG1 have indeed been identified in a variety of cancers, predominantly in non-small cell lung cancers with an incidence of approximately 10%, but also in other cancers such as liver, pancreatic, melanoma, etc. (Imielinski, M ., A. H. Berger, et al (2012) Cell 150(6): 1107-1120); information portal The Cancer Genome Atlas (TCGA) and cBioPortal for Cancer Genomics). Thus, they constitute a very significant patient population with clear unmet medical needs and are expected to benefit from therapeutic BRM inhibition. Just as some cancer cells are BRM-dependent due to loss of BRG1 function, it is interesting that other cancers have been reported to be BRG1-dependent, potentially arising through a variety of mechanisms, including mutations in other subunits of the SWI/SNF complex (Shi , J; Whyte, W. A., et al. 2013 Genes and Development 27(24): 2648-2662; Xi, W., Sansam, C. G., et al. 2009 Cancer Research 69(20): 8094-8101; and Zuber, J., Shi, J., et al 2011 Nature 478(7370), 524-528). In addition, SWI/SNF activity has been reported to be altered in other diseases, making it an attractive therapeutic target in diseases other than cancer. (Han, P., Li, W., et al. 2014 Nature 514(7520): 102-06). Therefore, the ability to inhibit either one or both of the ATPases may have many applications in the treatment of various types of cancers and diseases.

Мутации, делеции или потеря экспрессии BRG1, которые могут привести к потере функции, могут возникать при различных типах рака. (информационный портал The Cancer Genome Atlas (TCGA); cBioPortal for Cancer Genomics; Becker, T. M., S. Haferkamp, et al. (2009) Mol Cancer 8: 4.; Matsubara, D., Kishaba, Y., et al. 2013 Cancer Science 104(2): 266-273; и Yoshimoto, T., Matsubara, D., et al. 2015 Pathology International 65(11): 595-602). Примеры конкретных типов рака с мутацией, делецией или потерей экспрессии в отношении BRG1 включают без ограничения немелкоклеточную карциному легкого, аденокарциному легкого, карциному легкого, виды крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточную карциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого, меланому кожи, десмопластическую меланому, увеальную меланому, мелкоклеточную карциному яичника, плоскоклеточную карциному кожи, глиому, карциносаркому матки, карциному тела матки и эндометрия, серозную цистаденокарциному яичников, уротелиальную карциному мочевого пузыря, первичную лимфому центральной нервной системы, карциному пищевода, рак мочевого пузыря, плазмацитоидный вариант рака мочевого пузыря, аденокарциному желудка, аденокистозную карциному, лимфосаркому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, рак поджелудочной железы, колоректальную аденокарциному, холангиокарциному, саркому, виды рака головы и шеи, виды рака шейки матки и канала шейки матки, медуллобластому, T-клеточную лимфому кожи, гепатоцеллюлярную карциному печени, папиллярную почечно-клеточную карциному почки, рак молочной железы, лимфому из клеток мантийной зоны, карциному желчного пузыря, виды рака половых клеток яичек, почечно-клеточную светлоклеточную карциному почки, рак предстательной железы, детскую саркому Юинга, тимому, хромофобную почечно-клеточную карциному, непрозрачно-клеточную карциному почки, феохромоцитому и параганглиому, виды рака щитовидной железы.Mutations, deletions, or loss of BRG1 expression that can lead to loss of function can occur in various types of cancer. (Information portal The Cancer Genome Atlas (TCGA); cBioPortal for Cancer Genomics; Becker, TM, S. Haferkamp, et al. (2009) Mol Cancer 8: 4.; Matsubara, D., Kishaba, Y., et al. 2013 Cancer Science 104(2): 266-273 and Yoshimoto, T., Matsubara, D., et al 2015 Pathology International 65(11): 595-602). Examples of specific types of cancer with a mutation, deletion or loss of expression of BRG1 include, but are not limited to, non-small cell lung carcinoma, adenocarcinoma of the lung, lung carcinoma, types of large cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, squamous cell lung carcinoma, small cell lung cancer, skin melanoma, desmoplastic melanoma, uveal melanoma, small cell carcinoma of the ovary, squamous cell carcinoma of the skin, glioma, carcinosarcoma of the uterus, carcinoma of the body of the uterus and endometrium, serous ovarian cystadenocarcinoma, urothelial carcinoma of the bladder, primary lymphoma of the central nervous system, carcinoma of the esophagus, bladder cancer, plasmacytoid variant of bladder cancer, gastric adenocarcinoma, adenocystic carcinoma, lymphosarcoma, diffuse large B-cell lymphoma, pancreatic cancer, colorectal adenocarcinoma, cholangiocarcinoma, sarcoma, head and neck cancers, cervical and cervical canal cancers, medulloblastoma, skin T-cell lymphoma, hepatocellular carcinoma liver, papillary renal cell carcinoma of the kidney, breast cancer, mantle cell lymphoma, gallbladder carcinoma, germ cell cancers of the testis, renal clear cell carcinoma of the kidney, prostate cancer, childhood Ewing's sarcoma, thymoma, chromophobe renal cell carcinoma, opaque cell carcinoma of the kidney, pheochromocytoma and paraganglioma, types of thyroid cancer.

Виды рака с мутацией в SMARCB1/SNF5 включают злокачественные рабдоидные опухоли, в которых была продемонстрирована зависимость от BRG1 (Xi, W., Sansam, C.G., et al. 2009 Cancer Research 69(20): 8094-8101), а также виды эпителиоидной саркомы с мутацией в SMARCB1/SNF, семейный шванноматоз, виды медуллярной карциномы почки и виды саркомы Юинга (Jahromi, M.S; Putnam, A.R, et al. 2012 Cancer Genetics 205(7-8): 391-404; Prensner, J.R., Iyer, M.K., et al. 2013 Nature Genetics 45(11): 1392-8; и Roberts, C.W.M., and Biegel, J.A., 2009 Cancer Biology and Therapy 8(5): 412-416) и виды рака, при которых SNF5 является дефицитным в комплексе SWI/SNF, что не возникает в результате мутаций, например, при видах синовиальной саркомы. (Kadoch, C., and Crabtree, G.R., 2013 Cell 153(1): 71-85), а также BRG1-зависимые гематопоэтические злокачественные опухоли, такие как виды острого миелоидного лейкоза (AML) (Shi, J., Whyte, W.A., et al. 2013 Genes and Development 27(24): 2648-2662; и Zuber, J., Shi, J., et al. 2011 Nature 478(7370), 524-528). Виды рака с мутацией в BRM (включая делецию) или в SNF5/SMARCB1 (включая делецию) (информационный портал The Cancer Genome Atlas (TCGA) и cBioPortal for Cancer Genomics) включают без ограничения злокачественную опухоль оболочек периферических нервов, нейроэндокринный рак предстательной железы, рак молочной железы, уротелиальную карциному мочевого пузыря, аденокистозную карциному, аденокарциному желудка, серозную цистаденокарциному яичников, карциносаркому матки, карциному пищевода, плоскоклеточную карциному головы и шеи, виды немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы, карциному коры надпочечников, меланому кожи, саркому, колоректальную аденокарциному, виды рака шейки матки и канала шейки матки, гепатоцеллюлярную карциному печени, плоскоклеточный рак кожи, рак половых клеток яичек, глиобластому, мультиформную глиобластому, холангиокарциному, саркому Юинга, светлоклеточную почечно-клеточную карциному, нейробластому, тимому, диффузную B-крупноклеточную лимфому, острый миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, медуллобластому, феохромоцитому и параганглиому и множественную миелому.Cancers with a mutation in SMARCB1/SNF5 include malignant rhabdoid tumors in which BRG1 dependence has been demonstrated (Xi, W., Sansam, CG, et al. 2009 Cancer Research 69(20): 8094-8101) SMARCB1/SNF-mutated sarcomas, familial schwannomatosis, medullary renal carcinoma types, and Ewing's sarcoma types (Jahromi, MS; Putnam, AR, et al. 2012 Cancer Genetics 205(7-8): 391-404; Prensner, JR, Iyer , MK, et al 2013 Nature Genetics 45(11): 1392-8 and Roberts, CWM, and Biegel, JA, 2009 Cancer Biology and Therapy 8(5): 412-416) and cancers in which SNF5 is deficient in the SWI/SNF complex, which does not result from mutations, for example, in types of synovial sarcoma. (Kadoch, C., and Crabtree, GR, 2013 Cell 153(1): 71-85), as well as BRG1-dependent hematopoietic malignancies such as acute myeloid leukemia (AML) types (Shi, J., Whyte, WA , et al 2013 Genes and Development 27(24): 2648-2662 and Zuber, J., Shi, J., et al 2011 Nature 478(7370), 524-528). Cancers with a mutation in BRM (including a deletion) or in SNF5/SMARCB1 (including a deletion) (The Cancer Genome Atlas (TCGA) and cBioPortal for Cancer Genomics) include, but are not limited to, peripheral nerve sheath cancer, prostate neuroendocrine cancer, cancer breast, bladder urothelial carcinoma, adenocystic carcinoma, gastric adenocarcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, uterine carcinosarcoma, esophageal carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, types of non-small cell lung carcinoma, adenocarcinoma of the lung, squamous cell lung carcinoma, small cell lung cancer, pancreatic cancer, adrenocortical carcinoma, skin melanoma, sarcoma, colorectal adenocarcinoma, cervical and cervical canal cancers, hepatocellular carcinoma of the liver, squamous cell skin cancer, testicular germ cell cancer, glioblastoma, glioblastoma multiforme, cholangiocarcinoma, Ewing's sarcoma, clear cell renal cell carcinoma, neuroblastoma, thymoma, diffuse large B-cell lymphoma, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, medulloblastoma, pheochromocytoma and paraganglioma, and multiple myeloma.

Двойные ингибиторы которые обладают преимуществом ингибирования либо BRM, либо BRG1, либо и BRM, и BRG1, могут также быль пригодными при видах рака, предусматривающих мутации или дефицит субъединиц SWI/SNF, отличных от BRG1/SMARCA4, BRM/SMARCA2, или SNF5/SMARCB1, детально описанных выше, таких как ARID1A, ARID1B, ARID2, PBRM1, SMARCE1, SMARCC1, SMARCC2, PHF10, DPF1, DPF3, DPF2, ACTL6A, ACTL6B, SMARCD2, SMARCD3, SMARCD1, BCL11A, BCL11B, BCL7A, BCL7B, BCL7C, BRD9 и ACTB. В других случаях зависимость от АТФаз BRM/BRG1 может возникнуть посредством механизмов, отличных от мутаций SWI/SNF.Dual inhibitors that have the advantage of inhibiting either BRM or BRG1 or both BRM and BRG1 may also be useful in cancers involving mutations or deficiency of SWI/SNF subunits other than BRG1/SMARCA4, BRM/SMARCA2, or SNF5/SMARCB1 described in detail above, such as ARID1A, ARID1B, ARID2, PBRM1, SMARCE1, SMARCC1, SMARCC2, PHF10, DPF1, DPF3, DPF2, ACTL6A, ACTL6B, SMARCD2, SMARCD3, SMARCD1, BCL11A, BCL11B, BCL7A, BCL7B, BCL7C, B RD9 and ACTB. In other cases, dependence on BRM/BRG1 ATPases may arise through mechanisms other than SWI/SNF mutations.

Соединения по настоящему изобретению характеризуются предпочтительными терапевтическими преимуществами в отношении опосредованных BRM и/или опосредованных BRG1 нарушений или заболеваний. Соединения по настоящему изобретению в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли проявляют ценные фармакологические свойства, которые могут быть продемонстрированы по меньшей мере с применением любой из следующих процедур тестирования. Соединения по настоящему изобретению оценивали в отношении их способности к подавлению активности BRM и BRG1 с помощью биохимических анализов.The compounds of the present invention are characterized by preferred therapeutic benefits against BRM mediated and/or BRG1 mediated disorders or diseases. The compounds of the present invention, in free form or in the form of a pharmaceutically acceptable salt, exhibit valuable pharmacological properties that can be demonstrated using at least any of the following test procedures. Compounds of the present invention were evaluated for their ability to suppress the activity of BRM and BRG1 using biochemical assays.

Анализ ингибирования АТФазы BRMBRM ATPase Inhibition Assay

I. Выделение рекомбинантного домена АТФазы BRMI. Isolation of the recombinant BRM ATPase domain

A. Клонирование His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM(636-1331) в pFastBac1A. Cloning of His ₁₀ -ZZ-HCV3C-BRM(636-1331) into pFastBac1

Последовательности, кодирующие His₁₀-метку (SEQ ID NO: 1), ZZ-домен белка A, связывающий иммуноглобулин G (IgG) (Staphylococcus aureus), и сайт протеазы 3C риновируса человека, составляли выше по последовательности от остатков 636-1331 BRM с применением стандартных способов синтеза ДНК. Синтезированную конструкцию клонировали в MCS pFastBac1 (Life Technologies) путем ПЦР-амплификации с применением следующих 5'- и 3'-праймеров: 5'-GACCGAACTAGTATGGCTTCTCACCACCAT-3' (SEQ ID NO: 2) и 5'-AGCGTTAAGCTTTTAATCCTCGATGGCGCG-3' (SEQ ID NO: 3) для включения стоп-кодона и встраивали посредством лигирования в сайты SpeI и HindIII с применением стандартных методик молекулярной биологии. Конечный рекомбинантный вектор, pFB1-His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331), обеспечивает экспрессию расщепляемой протеазой HCV3C His₁₀-ZZ-метки (подчеркнуто) выше по последовательности от нативных последовательностей BRM, кодирующих АТФазу и домены SnAC.The sequences encoding the His ₁₀ tag (SEQ ID NO: 1), the ZZ domain of Staphylococcus aureus immunoglobulin G (IgG) binding protein A, and the human rhinovirus 3C protease site were upstream from BRM residues 636-1331 c using standard DNA synthesis methods. The synthesized construct was cloned into MCS pFastBac1 (Life Technologies) by PCR amplification using the following 5' and 3' primers: 5'-GACCGAACTAGTATGGCTTCTCACCACCAT-3' (SEQ ID NO: 2) and 5'-AGCGTTAAGCTTTTAATCCTCGATGGCGCG-3' (SEQ ID NO: 3) to include a stop codon and inserted by ligation into the SpeI and HindIII sites using standard molecular biology techniques. The final recombinant vector, pFB1-His ₁₀ -ZZ-HCV3C-BRM (636-1331), expresses the HCV3C protease-cleavable His ₁₀ -ZZ tag (underlined) upstream of native BRM sequences encoding ATPase and SnAC domains.

MASHHHHHHHHHHAQHDEAVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDANGGGGSGGGGSLEVLFQGPEESDSDYEEEDEEEESSRQETEEKILLDPNSEEVSEKDAKQIIETAKQDVDDEYSMQYSARGSQSYYTVAHAISERVEKQSALLINGTLKHYQLQGLEWMVSLYNNNLNGILADEMGLGKTIQTIALITYLMEHKRLNGPYLIIVPLSTLSNWTYEFDKWAPSVVKISYKGTPAMRRSLVPQLRSGKFNVLLTTYEYIIKDKHILAKIRWKYMIVDEGHRMKNHHCKLTQVLNTHYVAPRRILLTGTPLQNKLPELWALLNFLLPTIFKSCSTFEQWFNAPFAMTGERVDLNEEETILIIRRLHKVLRPFLLRRLKKEVESQLPEKVEYVIKCDMSALQKILYRHMQAKGILLTDGSEKDKKGKGGAKTLMNTIMQLRKICNHPYMFQHIEESFAEHLGYSNGVINGAELYRASGKFELLDRILPKLRATNHRVLLFCQMTSLMTIMEDYFAFRNFLYLRLDGTTKSEDRAALLKKFNEPGSQYFIFLLSTRAGGLGLNLQAADTVVIFDSDWNPHQDLQAQDRAHRIGQQNEVRVLRLCTVNSVEEKILAAAKYKLNVDQKVIQAGMFDQKSSSHERRAFLQAILEHEEENEEEDEVPDDETLNQMIARREEEFDLFMRMDMDRRREDARNPKRKPRLMEEDELPWIIKDDAEVERLTCEEEEEKIFGRGSRQRRDVDYSDALTEKQWLRAIED (SEQ ID NO: 4) MASHHHHHHHHHHAQHDEAVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDANGGGGSGGGGSLEVLFQGP (SEQ ID NO: 4)

B. Экспрессия BRM (636-1331)B. BRM expression (636-1331)

Рекомбинантный вектор, полученный выше, применяли для создания рекомбинантной бакмиды путем трансформирования в клетках DH10Bac с применением стандартных протоколов, подробно описанных производителем (Life Technologies). Большой титр вируса P3 получали путем осуществления трансфекции бакмиды в клетки Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) и амплификации вируса с применением стандартных способов, подробно описанных Life Technologies. Экспрессировали His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331) из 25 л клеток Sf9 на логарифмической фазе роста (1,5 × 10⁶ клеток/мл) в биореакторе WAVE (GE Healthcare Life Sciences) при концентрации вируса 1:100 об./об. Обеспечивали развитие инфекции в качающемся инкубаторе при 27°C и собирали через три дня после заражения после того, как жизнеспособность клеток падала до 80%, при этом повышение общего диаметра клеток соответствовало заражению. Клетки собирали при 4000 g в течение 20 мин., подвергали мгновенной заморозке и хранили при -80°C до применения.The recombinant vector obtained above was used to create a recombinant bacmid by transformation in DH10Bac cells using standard protocols detailed by the manufacturer (Life Technologies). A high titer of P3 virus was obtained by transfecting the bacmid into Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) cells and amplifying the virus using standard methods detailed by Life Technologies. His ₁₀ -ZZ-HCV3C-BRM (636-1331) was expressed from 25 L of Sf9 cells in the logarithmic growth phase (1.5 × 10 ⁶ cells/ml) in a WAVE bioreactor (GE Healthcare Life Sciences) at a virus concentration of 1:100 vol. ./about. Infection was allowed to develop in a shaking incubator at 27° C. and harvested three days post-infection after cell viability dropped to 80%, with an increase in overall cell diameter consistent with infection. Cells were harvested at 4000 g for 20 minutes, flash frozen and stored at -80° C. until use.

C. Очистка BRM (636-1331)C. BRM cleaning (636-1331)

Обеспечивали лизис клеток Sf9, экспрессирующих рекомбинантный His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331), в 50 мМ Трис (8,0), 300 мМ NaCl, 10% глицерина и 2 мМ TCEP, дополненного смесью ингибиторов протеаз (Roche cOmplete), с применением 7,5 мл буфера для лизиса на грамм пасты клеток. После оттаивания обеспечивали лизис клеток, их гомогенизировали и затем очищали в роторе JA25.50 при 50000 g в течение 30 мин. с удалением нерастворимого материала. Очищенный лизат наносили на колонку His-Trap HP объемом 5 мл (GE Healthcare Life Sciences), тщательно промывали буфером для лизиса без ингибиторов протеаз, дополненным 25 мМ имидазола. Связанный белок элюировали при градиенте на протяжении пятнадцати объемов колонки против буфера для лизиса, дополненного 500 мМ имидазола. Фракции, содержащие His₁₀-ZZ-HCV3C-BRM (636-1331), объединяли и подвергали диализу в течение ночи против 50 мМ Трис (8,0), 300 мМ NaCl, 10% глицерина и 2 мМ TCEP, дополненного протеазой HCV3C, с осуществлением удаления His₁₀-ZZ-метки. Расщепление отслеживали с помощью SDS/PAGE с окрашиванием кумасси и LC/MS. Интактная масса соответствовала остаткам 636-1331 BRM, после которых следуют две отличные от нативных аминокислоты, Gly-Pro, которые являются остатком от сайта расщепления HCV3C. Рассчитанная масса была на 160 Да большей, чем теоретическая, что соответствовало двум сайтам фосфорилирования.Sf9 cells expressing recombinant His ₁₀ -ZZ-HCV3C-BRM (636-1331) were lysed in 50 mM Tris (8.0), 300 mM NaCl, 10% glycerol, and 2 mM TCEP supplemented with a mixture of protease inhibitors (Roche cOmplete ), using 7.5 ml of lysis buffer per gram of cell paste. After thawing, cells were lysed, homogenized, and then purified in a JA25.50 rotor at 50,000 g for 30 min. with the removal of insoluble material. The purified lysate was applied to a 5 ml His-Trap HP column (GE Healthcare Life Sciences), washed thoroughly with lysis buffer without protease inhibitors, supplemented with 25 mM imidazole. Bound protein was eluted with a fifteen column volume gradient against lysis buffer supplemented with 500 mM imidazole. Fractions containing His ₁₀ -ZZ-HCV3C-BRM (636-1331) were pooled and dialyzed overnight against 50 mM Tris (8.0), 300 mM NaCl, 10% glycerol, and 2 mM TCEP supplemented with HCV3C protease, with the removal of the His ₁₀ -ZZ-tag. Digestion was monitored by SDS/PAGE with Coomassie staining and LC/MS. The intact mass corresponded to BRM residues 636-1331 followed by two non-native amino acids, Gly-Pro, which are a residue from the HCV3C cleavage site. The calculated mass was 160 Da greater than theoretical, which corresponded to two phosphorylation sites.

Расщепленный продукт разбавляли буфером для диализа без добавления соли, пока конечная концентрация NaCl не составляла 100 мМ, пропускали через шприцевой фильтр 0,2 мкм и непосредственно загружали в колонку HiTrap Q HP объемом 1 мл (GE Health Biosciences), ранее откалиброванную в 50 мМ Трис (8,0), 100 мМ NaCl, 10% глицерина и 1 мМ TCEP. После захватывания связанный белок оценивали против того же буфера, дополненного 1 М NaCl. Фракции, содержащие BRM (636-1331), объединяли и загружали в эксклюзионную колонку S200 размера 16/60, откалиброванную в 50 мМ Трис (8,0), 200 мМ NaCl, 10% глицерина и 2 мМ TCEP. Очищенную конструкцию концентрировали до 2,5 мг/мл, подвергали мгновенной заморозке и хранили при -80°C до применения в последующих анализах.The digested product was diluted with dialysis buffer without salt addition until the final NaCl concentration was 100 mM, passed through a 0.2 µm syringe filter and directly loaded onto a 1 ml HiTrap Q HP column (GE Health Biosciences) previously calibrated in 50 mM Tris (8.0), 100 mM NaCl, 10% glycerol and 1 mM TCEP. After capture, bound protein was evaluated against the same buffer supplemented with 1 M NaCl. Fractions containing BRM (636-1331) were pooled and loaded onto a size 16/60 S200 size-exclusion column calibrated in 50 mM Tris (8.0), 200 mM NaCl, 10% glycerol, and 2 mM TCEP. The purified construct was concentrated to 2.5 mg/mL, flash frozen and stored at -80° C. until used in subsequent assays.

II. Активность в отношении ингибирования АТФазы BrmII. Brm ATPase inhibitory activity

Активность ингибирования АТФазы соединением в отношении АТФазы-SnAC Brm (636-1331) измеряли с помощью набора для анализа ADP-Glo от Promega (V6930). Переносили 120 нл соединения в 100% DMSO в белый 384-луночный титрационный микропланшет для анализа с применением ATS Acoustic Transfer System от EDC Biosystems. Все последующие добавления реагентов проводили с применением многорежимного дозатора MultiFlo FX. Буфер для анализа состоял из 20 мМ HEPES pH 7,5, 1 мМ MgCl₂, 20 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0,01% BSA, 0,005% Tween 20. В планшет для анализа добавляли 4 мкл 7,5 нМ АТФазы-SnAC Brm в буфере для анализа и инкубировали с соединением при к. т. в течение 5 мин. В планшет для анализа добавляли 2 мкл 255 мкм АТФ и 6 нМ плазмиды pCMV-dR8.91 в буфере для анализа для инициирования начала реакции. Конечные значения концентрации реагентов составляли 5 нМ АТФазы-SnAC BRM, 85 мкМ АТФ и 2 нМ плазмиды pCMV-dR8.91. Реакционную смесь с АТФазой инкубировали при к. т. в течение 60 мин. Добавляли 3 мкл реагента ADP-Glo для остановки реакции и ее инкубировали в течение 30 мин. при к. т. Добавляли 3 мкл реагента для обнаружения киназ в планшет для анализа, который инкубировали в течение 90 мин. при к. т. Планшеты считывали с помощью многоканального считывающего устройства 2103 Envision с применением сверхчувствительной люминесцентной детекции. Значения IC₅₀ определяли по средним значениям точек данных из двух повторностей с помощью нелинейного регрессионного анализа зависимости значений процента ингибирования от концентрации соединения.Compound's ATPase inhibition activity against ATPase-SnAC Brm (636-1331) was measured using Promega's ADP-Glo assay kit (V6930). Transfer 120 nl of compound in 100% DMSO to a white 384-well microtiter plate for analysis using the ATS Acoustic Transfer System from EDC Biosystems. All subsequent additions of reagents were performed using a MultiFlo FX multi-mode dispenser. The assay buffer consisted of 20 mM HEPES pH 7.5, 1 mM MgCl ₂ , 20 mM KCl, 1 mM DTT, 0.01% BSA, 0.005% Tween 20. 4 μl of 7.5 nM ATPase- SnAC Brm in assay buffer and incubated with compound at rt for 5 min. To the assay plate, 2 μl of 255 μm ATP and 6 nM pCMV-dR8.91 plasmid in assay buffer were added to initiate the start of the reaction. The final reagent concentrations were 5 nM ATPase-SnAC BRM, 85 μM ATP, and 2 nM plasmid pCMV-dR8.91. The reaction mixture with ATPase was incubated at rt for 60 min. 3 µl of ADP-Glo reagent was added to stop the reaction and it was incubated for 30 min. at rt. 3 µl of kinase detection reagent was added to the assay plate, which was incubated for 90 minutes. at rt. The plates were read using a 2103 Envision multi-channel reader using ultrasensitive luminescent detection. IC ₅₀ values were determined from the mean of duplicate data points using non-linear regression analysis of percent inhibition versus compound concentration.

Анализ ингибирования АТФазы BRG1BRG1 ATPase Inhibition Assay

I. Выделение рекомбинантного домена АТФазы BRG1I. Isolation of the recombinant BRG1 ATPase domain

A. Клонирование BRG1(658-1361)-His₆ в pDEST8A. Cloning of BRG1(658-1361)-His ₆ into pDEST8

Конструкцию BRG1(658-1361)-His₆ для экспрессии в клетках насекомых субклонировали из полноразмерной плазмиды BRG1, pDONR221-BRG1-His₆ (OPS7173), с помощью ПЦР следующим образом. ATTB-фланкированный ПЦР-фрагмент, кодирующий BRG1(658-1361)-His₆, получали с применением следующих праймеров: прямой, ATTB1 BRG1(658-x) 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGAThe BRG1(658-1361)-His ₆ construct for expression in insect cells was subcloned from the full-length BRG1 plasmid, pDONR221-BRG1-His ₆ (OPS7173), by PCR as follows. An ATTB-flanked PCR fragment encoding BRG1(658-1361)-His ₆ was generated using the following primers: forward, ATTB1 BRG1(658-x) 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGA

AGAAAGTGGCTCAGAAGAAGAGGAAG (SEQ ID NO: 5); обратный, BRG1(x-1361)HISstpATTB2rev, 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGTGATGATGATGATGATGCTCCTCGATGGCCTTGAGCCACTGC (SEQ ID NO: 6). Данный ПЦР-фрагмент повторно объединяли в вектор pDEST8 с применением метода Gateway® в соответствии с протоколом производителя (Life Technologies). Вставку подтверждали путем секвенирования и вводили в базу данных OPS (OPS8023), после чего переходили к получению бакмиды.AGAAAGTGGCTCAGAAGAAGAGGAAG (SEQ ID NO: 5); reverse, BRG1(x-1361)HISstpATTB2rev, 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGTGATGATGATGATGATGCTCCTCGATGGCCTTGAGCCACTGC (SEQ ID NO: 6). This PCR fragment was recombined into the pDEST8 vector using the Gateway® method according to the manufacturer's protocol (Life Technologies). The insert was confirmed by sequencing and entered into the OPS database (OPS8023), after which proceeded to obtain bacmida.

MEESGSEEEE EEEEEEQPQA AQPPTLPVEE KKKIPDPDSD DVSEVDARHI IENAKQDVDD EYGVSQALAR GLQSYYAVAH AVTERVDKQS ALMVNGVLKQ YQIKGLEWLV SLYNNNLNGI LADEMGLGKT IQTIALITYL MEHKRINGPF LIIVPLSTLS NWAYEFDKWA PSVVKVSYKG SPAARRAFVP QLRSGKFNVL LTTYEYIIKD KHILAKIRWK YMIVDEGHRM KNHHCKLTQV LNTHYVAPRR LLLTGTPLQN KLPELWALLN FLLPTIFKSC STFEQWFNAP FAMTGEKVDL NEEETILIIR RLHKVLRPFL LRRLKKEVEA QLPEKVEYVI KCDMSALQRV LYRHMQAKGV LLTDGSEKDK KGKGGTKTLM NTIMQLRKIC NHPYMFQHIE ESFSEHLGFT GGIVQGLDLY RASGKFELLD RILPKLRATN HKVLLFCQMT SLMTIMEDYF AYRGFKYLRL DGTTKAEDRG MLLKTFNEPG SEYFIFLLST RAGGLGLNLQ SADTVIIFDS DWNPHQDLQA QDRAHRIGQQ NEVRVLRLCT VNSVEEKILA AAKYKLNVDQ KVIQAGMFDQ KSSSHERRAF LQAILEHEEQ DEEEDEVPDD ETVNQMIARH EEEFDLFMRM DLDRRREEAR NPKRKPRLME EDELPSWIIK DDAEVERLTC EEEEEKMFGR GSRHRKEVDY SDSLTEKQWL KAIEEHHHHH H (SEQ ID NO: 7)MEESGSEEEE EEEEEEQPQA AQPPTLPVEE KKKIPDPDSD DVSEVDARHI IENAKQDVDD EYGVSQALAR GLQSYYAVAH AVTERVDKQS ALMVNGVLKQ YQIKGLEWLV SLYNNNLNGI LADEMGLGKT IQTIALITYL MEHKRINGPF LIIVPLSTLS NWAYEFDKWA PSVVKVSYK G SPAARRAFVP QLRSGKFNVL LTTYEYIIKD KHILAKIRWK YMIVDEGHRM KNHHCKLTQV LNTHYVAPRR LLLTGTPLQN KLPELWALLN FLLPTIFKSC STFEQWFNAP FAMTGEKVDL NEEETILIIR RLHKVLRPFL LRRLKKEVEA QLPEKVEYVI KCDMSALQRV LYRHMQAKGV LLTDGSEKDK KGKGGTKTLM NTIMQLRKIC NHPYMFQHIE ESFSEHLGFT GGIVQGLDLY RASGKFELLD RILPKLRATN HKVLLFCQMT SLMTIMEDYF AYRGFKYLRL DGTTKAEDRG MLLKTFNEPG SEYFIFLLST RAGGLGLNLQ SADTVIIFDS DWNPHQDLQA QDRAHRIGQQ NEVRVLRLCT VNSVEEKILA AAKYKLNVDQ KVIQAGMFDQ KSSSHERRAF LQAILEHEEQ DEEEDEVPDD ETVNQMIARH EEEFDLFMRM DLDRRREEAR NPKRKPRLME EDELPSWIIK DDAEVERLTC EEEEEKMFGR GSRHRKEV DY SDSLTEKQWL KAIEEHHHHH H (SEQ ID NO: 7)

B. Экспрессия BRG1(658-1361)-His₆ B. Expression of BRG1(658-1361)-His ₆

Рекомбинантный вектор, полученный выше, применяли для создания рекомбинантной бакмиды путем трансформирования в клетках DH10Bac с применением стандартных протоколов, подробно описанных производителем (Life Technologies). Большой титр вируса P3 получали путем осуществления трансфекции бакмиды в клетки Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) и амплификации вируса с применением стандартных способов, подробно описанных Life Technologies. Экспрессировали BRG1 (658-1361)-His₆ из клеток Sf9 на логарифмической фазе роста (1,5-3,9 × 10⁶ клеток/мл) при концентрации 15 вирусов/клетка. Обеспечивали развитие инфекции в качающемся инкубаторе при 27°C и собирали через три дня после заражения после того, как жизнеспособность клеток падала до 80%, при этом повышение общего диаметра клеток соответствовало заражению. Клетки собирали при 4000 g в течение 20 мин., подвергали мгновенной заморозке и хранили при -80°C до применения.The recombinant vector obtained above was used to create a recombinant bacmid by transformation in DH10Bac cells using standard protocols detailed by the manufacturer (Life Technologies). A high titer of P3 virus was obtained by transfecting the bacmid into Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) cells and amplifying the virus using standard methods detailed by Life Technologies. Expressed BRG1 (658-1361)-His ₆ from Sf9 cells in the logarithmic growth phase (1.5-3.9 x 10 ⁶ cells/ml) at a concentration of 15 viruses/cell. Infection was allowed to develop in a shaking incubator at 27° C. and harvested three days post-infection after cell viability dropped to 80%, with an increase in overall cell diameter consistent with infection. Cells were harvested at 4000 g for 20 minutes, flash frozen and stored at -80° C. until use.

C. Очистка BRG1(658-1361)-His₆ C. Cleaning BRG1(658-1361)-His ₆

Обеспечивали лизис клеток Sf9, экспрессирующих рекомбинантный BRG1(658-1361)-His₆, в 50 мМ Трис (8,0), 300 мМ NaCl, 5% глицерина и 1 мМ TCEP, дополненном смесью ингибиторов протеаз (Roche cOmplete), с применением 7,5 мл буфера для лизиса на грамм пасты клеток. После оттаивания обеспечивали лизис клеток, их гомогенизировали и затем очищали в роторе JA25.50 при 50000 g в течение 30 мин. с удалением нерастворимого материала. Очищенный лизат наносили на колонку His-Trap HP объемом 5 мл (GE Healthcare Life Sciences), тщательно промывали буфером для лизиса без ингибиторов протеаз, дополненным 20 мМ имидазола. Связанный белок элюировали при градиенте на протяжении десяти объемов колонки против буфера для лизиса, дополненного 250 мМ имидазола. Фракции, содержащие BRG1(658-1361)-His₆, объединяли и разбавляли до тех пор, пока проводимость не достигла приблизительно 6 мСм/см (~60 мМ NaCl), с применением 50 мМ Трис pH 8,0, 5% глицерина и 1 мМ TCEP, пропускали через фильтр 0,2 мкм и непосредственно загружали в колонку HiTrap Q HP объемом 5 мл (GE Health Biosciences), ранее откалиброванную в 50 мМ Трис (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 5% глицерина и 1 мМ TCEP. После захватывания связанный белок оценивали против того же буфера, дополненного 1 М NaCl. Фракции, содержащие BRG1(658-1361)-His₆, объединяли и загружали в эксклюзионную колонку S200 размера 16/60, откалиброванную в 50 мМ Трис (8,0), 200 мМ NaCl, 5% глицерина и 1 мМ TCEP. Очищенную конструкцию концентрировали до концентрации, составляющей от 1 до 2,5 мг/мл, подвергали мгновенной заморозке и хранили при -80°C до применения в последующих анализах.Sf9 cells expressing recombinant BRG1(658-1361)-His ₆ were lysed in 50 mM Tris (8.0), 300 mM NaCl, 5% glycerol and 1 mM TCEP supplemented with a mixture of protease inhibitors (Roche cOmplete) using 7.5 ml lysis buffer per gram of cell paste. After thawing, cells were lysed, homogenized, and then purified in a JA25.50 rotor at 50,000 g for 30 min. with the removal of insoluble material. The purified lysate was applied to a 5 ml His-Trap HP column (GE Healthcare Life Sciences), washed thoroughly with lysis buffer without protease inhibitors, supplemented with 20 mM imidazole. Bound protein was eluted with a gradient over ten column volumes against lysis buffer supplemented with 250 mM imidazole. Fractions containing BRG1(658-1361)-His ₆ were pooled and diluted until the conductivity reached approximately 6 mS/cm (~60 mM NaCl) using 50 mM Tris pH 8.0, 5% glycerol and 1 mM TCEP was passed through a 0.2 µm filter and directly loaded onto a 5 ml HiTrap Q HP column (GE Health Biosciences) previously calibrated in 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5% glycerol and 1 mM TCEP. After capture, bound protein was evaluated against the same buffer supplemented with 1 M NaCl. Fractions containing BRG1(658-1361)-His ₆ were pooled and loaded onto a size 16/60 S200 size-exclusion column calibrated in 50 mM Tris (8.0), 200 mM NaCl, 5% glycerol and 1 mM TCEP. The purified construct was concentrated to a concentration of 1 to 2.5 mg/mL, flash frozen and stored at -80° C. until used in subsequent assays.

Активность в отношении ингибирования АТФазы BRG1BRG1 ATPase inhibitory activity

Активность ингибирования АТФазы соединением в отношении АТФазы-SnAC Brg1 (658-1361) измеряли с помощью набора для анализа ADP-Glo от Promega (V6930). Переносили 120 нл соединения в 100% DMSO в белый 384-луночный титрационный микропланшет для анализа с применением ATS Acoustic Transfer System от EDC Biosystems. Все последующие добавления реагентов проводили с применением многорежимного дозатора MultiFlo FX. Буфер для анализа состоял из 20 мМ HEPES pH 7,5, 1 мМ MgCl₂, 20 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0,01% BSA, 0,005% Tween 20. В планшет для анализа добавляли 4 мкл 7,5 нМ АТФазы-SnAC Brg1 в буфере для анализа и инкубировали с соединением при к. т. в течение 5 мин. В планшет для анализа добавляли 2 мкл 195 мкм АТФ и 6 нМ плазмиды pCMV-dR8.91 в буфере для анализа для инициирования начала реакции. Конечные значения концентрации реагентов составляли 5 нМ АТФазы-SnAC Brg1, 65 мкМ АТФ и 2 нМ плазмиды pCMV-dR8.91. Реакционную смесь с АТФазой инкубировали при к. т. в течение 60 мин. Добавляли 3 мкл реагента ADP-Glo для остановки реакции и ее инкубировали в течение 30 мин. при к. т. Добавляли 3 мкл реагента для обнаружения киназ в планшет для анализа, который инкубировали в течение 90 мин. при к. т. Планшеты считывали с помощью многоканального считывающего устройства 2103 Envision с применением сверхчувствительной люминесцентной детекции. Значения IC₅₀ определяли по средним значениям точек данных из двух повторностей с помощью нелинейного регрессионного анализа зависимости значений процента ингибирования от концентрации соединения.Compound's ATPase inhibition activity against ATPase-SnAC Brg1 (658-1361) was measured using Promega's ADP-Glo assay kit (V6930). Transfer 120 nl of compound in 100% DMSO to a white 384-well microtiter plate for analysis using the ATS Acoustic Transfer System from EDC Biosystems. All subsequent additions of reagents were performed using a MultiFlo FX multi-mode dispenser. The assay buffer consisted of 20 mM HEPES pH 7.5, 1 mM MgCl ₂ , 20 mM KCl, 1 mM DTT, 0.01% BSA, 0.005% Tween 20. 4 μl of 7.5 nM ATPase- SnAC Brg1 in assay buffer and incubated with compound at rt for 5 min. To the assay plate, 2 μl of 195 μm ATP and 6 nM pCMV-dR8.91 plasmid in assay buffer were added to initiate the start of the reaction. The final reagent concentrations were 5 nM ATPase-SnAC Brg1, 65 μM ATP, and 2 nM plasmid pCMV-dR8.91. The reaction mixture with ATPase was incubated at rt for 60 min. 3 µl of ADP-Glo reagent was added to stop the reaction and it was incubated for 30 min. at rt. 3 µl of kinase detection reagent was added to the assay plate, which was incubated for 90 minutes. at rt. The plates were read using a 2103 Envision multi-channel reader using ultrasensitive luminescent detection. IC ₅₀ values were determined from the mean of duplicate data points using non-linear regression analysis of percent inhibition versus compound concentration.

Плазмида pCMV-dR8.91, применяемая для анализов ингибирования АТФазы BRM/BRG1Plasmid pCMV-dR8.91 used for BRM/BRG1 ATPase inhibition assays

Плазмидную матрицу pCMV-dR8.91 (см. последовательность ниже) размножают с применением химически компетентной E. coli One Shot Stbl3 (номер по каталогу C73C7303, Invitrogen/Thermo Fisher Scientific), следуя протоколу трансформации, предоставленному с реагентом. Затем трансформированные бактериальные колонии отбирают на планшеты с LB-агаром, содержащие селекционную среду на основе антибиотика ампициллина/карбенициллина (номер по каталогу L1010, Teknova). Колонии бактерий выращивают в жидком LB-бульоне (номер по каталогу 10855001, Invitrogen), содержащем ампициллин в концентрации 100 микрограмм/мл и плазмидную ДНК, выделенную в соответствии с требуемым масштабом, в соответствии с протоколом производителя, предоставленным с наборами для выделения плазмид от Qiagen (Maxi prep, номер продукта Id 10063).Plasmid template pCMV-dR8.91 (see sequence below) is propagated using chemically competent E. coli One Shot Stbl3 (catalog number C73C7303, Invitrogen/Thermo Fisher Scientific) following the transformation protocol provided with the reagent. The transformed bacterial colonies are then selected on LB agar plates containing ampicillin/carbenicillin antibiotic selection medium (catalog number L1010, Teknova). Bacterial colonies are grown in liquid LB broth (catalog number 10855001, Invitrogen) containing ampicillin at a concentration of 100 micrograms/ml and plasmid DNA isolated according to the required scale, according to the manufacturer's protocol provided with Qiagen's plasmid isolation kits. (Maxi prep, item number Id 10063).

ttgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcgacggatcgatcccgtaataagcttcgaggtccgcggccggccgcgttgacgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattaccctatagtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtgatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtgcatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaaccaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgacacataatccacctatcccagtaggagaaatctataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaggaaccctttagagactatgtagaccgattctataaaactctaagagccgagcaagcttcacaagaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaagactattttaaaagcattgggaccaggagcgacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtggggggacccggccataaagcaagagttttggctgaagcaatgagccaagtaacaaatccagctaccataatgatacagaaaggcaattttaggaaccaaagaaagactgttaagtgtttcaattgtggcaaagaagggcacatagccaaaaattgcagggcccctaggaaaaagggctgttggaaatgtggaaaggaaggacaccaaatgaaagattgtactgagagacaggctaattttttagggaagatctggccttcccacaagggaaggccagggaattttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcttcaggtttggggaagagacaacaactccctctcagaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttagcttccctcagatcactctttggcagcgacccctcgtcacaataaagataggggggcaattaaaggaagctctattagatacaggagcagatgatacagtattagaagaaatgaatttgccaggaagatggaaaccaaaaatgatagggggaattggaggttttatcaaagtaagacagtatgatcagatactcatagaaatctgcggacataaagctataggtacagtattagtaggacctacacctgtcaacataattggaagaaatctgttgactcagattggctgcactttaaattttcccattagtcctattgagactgtaccagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagaaatggaaaaggaaggaaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagatttctgggaagttcaattaggaataccacatcctgcagggttaaaacagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggcgatgcatatttttcagttcccttagataaagacttcaggaagtatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccagtgtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagtcatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggaactgagacaacatctgttgaggtggggatttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattcctttggatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaggacagctggactgtcaatgacatacagaaattagtgggaaaattgaattgggcaagtcagatttatgcagggattaaagtaaggcaattatgtaaacttcttaggggaaccaaagcactaacagaagtagtaccactaacagaagaagcagagctagaactggcagaaaacagggagattctaaaagaaccggtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctgaaaacaggaaagtatgcaagaatgaagggtgcccacactaatgatgtgaaacaattaacagaggcagtacaaaaaatagccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaattacccatacaaaaggaaacatgggaagcatggtggacagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgtcaatacccctcccttagtgaagttatggtaccagttagagaaagaacccataataggagcagaaactttctatgtagatggggcagccaatagggaaactaaattaggaaaagcaggatatgtaactgacagaggaagacaaaaagttgtccccctaacggacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaattcatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtgacagactcacaatatgcattgggaatcattcaagcacaaccagataagagtgaatcagagttagtcagtcaaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaagtctacctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattggtcagtgctggaatcaggaaagtactatttttagatggaatagataaggcccaagaagaacatgagaaatatcacagtaattggagagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtagtagcaaaagaaatagtagccagctgtgataaatgtcagctaaaaggggaagccatgcatggacaagtagactgtagcccaggaatatggcagctagattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggaaaggaccagcaaagctcctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagataatagtgacataaaagtagtgccaagaagaaaagcaaagatcatcagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggattaacacatggaattctgcaacaactgctgtttatccatttcagaattgggtgtcgacatagcagaataggcgttactcgacagaggagagcaagaaatggagccagtagatcctagactagagccctggaagcatccaggaagtcagcctaaaactgcttgtaccaattgctattgtaaaaagtgttgctttcattgccaagtttgtttcatgacaaaagccttaggcatctcctatggcaggaagaagcggagacagcgacgaagagctcatcagaacagtcagactcatcaagcttctctatcaaagcagtaagtagtacatgtaatgcaacctataatagtagcaatagtagcattagtagtagcaataataatagcaatagttgtgtggtccatagtaatcatagaatataggaaaatggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatccttggcacttatctgggacgatctgcggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgagagacttactcttgattgtaacgaggattgtggaacttctgggacgcagggggtgggaagccctcaaatattggtggaatctcctacaatattggagtcaggagctaaagaatagtgctgttagcttgctcaatgccacagccatagcagtagctgaggggacagatagggttatagaagtagtacaaggagcttgtagagctattcgccacatacctagaagaataagacagggcttggaaaggattttgctataagctcgaggccgccccggtgaccttcagaccttggcactggaggtggcccggcagaagcgcggcatcgtggatcagtgctgcaccagcatctgctctctctaccaactggagaactactgcaactaggcccaccactaccctgtccacccctctgcaatgaataaaacctttgaaagagcactacaagttgtgtgtacatgcgtgcatgtgcatatgtggtgcggggggaacatgagtggggctggctggagtggcgatgataagctgtcaaacatgagaattaattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagtctagaattaattccgtgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtattaattgtagccgcgttctaacgacaatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttactgaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaaccttctgagtttctggtaacgccgtcccgcacccggaaatggtcagcgaaccaatcagcagggtcatcgctagccagatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttggacacaagacaggcttgcgagatatgtttgagaataccactttatcccgcgtcagggagaggcagtgcgtaaaaagacgcggactcatgtgaaatactggtttttagtgcgccagatctctataatctcgcgcaacctattttcccctcgaacactttttaagccgtagataaacaggctgggacacttcacatgagcgaaaaatacatcgtcacctgggacatgttgcagatccatgcacgtaaactcgcaagccgactgatgccttctgaacaatggaaaggcattattgccgtaagccgtggcggtctgtaccgggtgcgttactggcgcgtgaactgggtattcgtcatgtcgataccgtttgtatttccagctacgatcacgacaaccagcgcgagcttaaagtgctgaaacgcgcagaaggcgatggcgaaggcttcatcgttattgatgacctggtggataccggtggtactgcggttgcgattcgtgaaatgtatccaaaagcgcactttgtcaccatcttcgcaaaaccggctggtcgtccgctggttgatgactatgttgttgatatcccgcaagatacctggattgaacagccgtgggatatgggcgtcgtattcgtcccgccaatctccggtcgctaatcttttcaacgcctggcactgccgggcgttgttctttttaacttcaggcgggttacaatagtttccagtaagtattctggaggctgcatccatgacacaggcaaacctgagcgaaaccctgttcaaaccccgctttaaacatcctgaaacctcgacgctagtccgccgctttaatcacggcgcacaaccgcctgtgcagtcggcccttgatggtaaaaccatccctcactggtatcgcatgattaaccgtctgatgtggatctggcgcggcattgacccacgcgaaatcctcgacgtccaggcacgtattgtgatgagcgatgccgaacgtaccgacgatgatttatacgatacggtgattggctaccgtggcggcaactggatttatgagtgggccccggatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaacccggatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttgggctgcaggaattaattcgagctcgcccgaca (SEQ ID NO: 8)ttgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggca gtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccacc ccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagaacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcgacggatcgatcccgtaataagcttcgaggtccgcggccggccgcgttgacgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagagatgggtgc gagagcgtcagtattaagcggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagat cattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattaccctatagtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatg catgggtaaaagtagtagagagaaggctttcagcccagaagtgatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtgcatccagtgcatgcaggggcctattgcaccaggccagatgagaga accaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgacacataatccacctatcccagtaggagaaatctataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaggaaccctttagagactatgtagaccgattctataaaactctaagagccgagcaagcttca caagaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaagactattttaaaagcattgggaccaggagcgacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtggggggacccggccataaagcaagagttttggctgaagcaatgagccaagtaacaaatccagctaccataatgatacagaaaggcaattttaggaacca aagaaagactgttaagtgtttcaattgtggcaaagaagggcacatagccaaaaattgcagggcccctaggaaaaagggctgttggaaatgtggaaaggaaggacaccaaatgaaagattgtactgagagacaggctaattttttagggaagatctggccttcccacaagggaaggccagggaatttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccaga agagagcttcaggtttggggaagagacaacaactccctctcagaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttagcttccctcagatcactctttggcagcgacccctcgtcacaataaagataggggggcaattaaaggaagctctattagatacaggagcagatgatacagtattagaagaaatgaatttgccaggaagatggaaaccaaaaatgatagggggaat tggaggttttatcaaagtaagacagtatgatcagatactcatagaaatctgcggacataaagctataggtacagtattagtaggacctaccctgtcaacataattggaagaaatctgttgactcagattggctgcactttaaattttcccattagtcctattgagactgtaccagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattg acagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagaaatggaaaaggaaggaaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagatttctgggaagttcaattaggaataccacatcctgcagggttaaaac agaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggcgatgcatatttttcagttcccttagataaagacttcaggaagtatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccagtgtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatcca gacatagtcatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagagggaactgagacaacatctgttgaggtggggatttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattcctttggatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaaggacagctggact gtcaatgacatacagaaattagtgggaaaattgaattgggcaagtcagatttatgcagggattaaagtaaggcaattatgtaaacttcttaggggaaccaaagcactaacagaagtagtaccactaacagaagaagcagagctagaactggcagaaaacagggagattctaaaagaaccggtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaag caggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctgaaaacaggaaagtatgcaagaatgaagggtgcccacactaatgatgtgaaacaattaacagaggcagtacaaaaaatagccacagaaagcatagtaatatgggggaaagactcctaaatttaaattacccatacaaaaggaaacatgggaagcatggtggacagagtattgg caagccacctggattcctgagtgggagtttgtcaatacccctcccttagtgaagttatggtaccagttagagaaagaacccataataggagcagaaactttctatgtagatggggcagccaatagggaaactaaattaggaaaagcaggatatgtaactgacagaggaagacaaaaagttgtccccctaacggacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatt catctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtgcagactcacaatatgcattgggaatcattcaagcacaaccagataagagtgaatcagagttagtcagtcaaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaagtctacctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattggtcagtgctgga atcaggaaagtactatttttagatggaatagataaggcccaagaagaacatgagaaatatcacagtaattggagagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtagtagcaaaagaaatagtagccagctgtgataaatgtcagctaaaaggggaagccatgcatggacaagtagactgtagcccaggaatatggcagctagattgtacacatttagaaggaaaag ttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagacacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtca aggagtaatagaatctgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggttt attacagggcagcagagatccagtttggaaaggaccagcaaagctcctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagataatagtgccaagaagaaaagcaaagatcatcagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggattaacacatggaattctgcaacaactgctgtttat ccatttcagaattgggtgtcgacatagcagaataggcgttactcgacaggagagcaagaaatggagccagtagatcctagactagagccctggaagcatccaggaagtcagcctaaaactgcttgtaccaattgctattgtaaaaagtgttgctttcattgccaagtttgtttcatgacaaaagccttaggcatctcctatggcaggaagaagcggagaca gcgacgaagagctcatcagaacagtcagactcatcaagcttctctatcaaagcagtaagtagtacatgtaatgcaacctataatagtagcaatagtagcattagtagtagtagcaataataatagcaatagttgtgtggtccatagtaatcatagaatataggaaaatggccgctgatcttcagacctggaggaggagatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaa aattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcg caacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagaaattaaca attacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtataaaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcacc attatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatccttggcacttatctgggacgatctgcggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgagagacttactcttgattgtaacgaggattgtggaacttctgggacg cagggggtgggaagccctcaaatattggtggaatctcctacaatattggagtcaggagctaaagaatagtgctgttagcttgctcaatgccacagccatagcagtagctgaggggacagatagggttatagaagtagtacaaggagcttgtagagctattcgccacatacctagaagaataagacagggcttggaaaggattttgctataagctcgaggccgccccggtgacctt cagaccttggcactggaggtggcccggcagaagcgcggcatcgtggatcagtgctgcaccagcatctgctctctctaccaactggagaactactgcaactaggcccaccactaccctgtccacccctctgcaatgaataaaacctttgaaagagcactacaagttgtgtgtacatgcgtgcatgtgtgcatatgtggtgcggggggaacatgagt ggggctggctggagtggcgatgataagctgtcaaacatgagaattaattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagtctagaattaattccgtgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtattaattgtagccgcgttctaacga caatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttactgaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaaccttctgagtttctggtaacgccgtcccgcacccggaaatggtcagcgaaccaatcagcagggtcatcgctagccagatcctcgccggacgcatcgtggccggcatcaccgg cgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactactgggctg cttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacggggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcat caccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaag gaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagtttcgccccgaagaacgttttccaatgatgag cacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggag gaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagctccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcagg accacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacaccgggggagtcaggcaactatggatgaacgaaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaact gtcagaccaagtttactcatatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatccttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaac aaa a cgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaaca ggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcg ttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatt tatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctatttccagaagtagtgaggaggctttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttggacacaagacaggcttgcgagatatgtttgagaataccactttatcccgcgtcagggagaggcagtgcgtaaaaagacgcggactcatgtgaaatactggtttttagtgcgccagat ctctataatctcgcgcaacctattttcccctcgaacactttttaagccgtagataaacaggctgggacacttcacatgagcgaaaaatacatcgtcacctgggacatgttgcagatccatgcacgtaaactcgcaagccgactgatgccttctgaacaatggaaaggcattattgccgtaagccgtggcggtctgtaccgggtgcgtt actggcgcgtgaactgggtattcgtcatgtcgataccgtttgtatttccagctacgatcgacaaccagcgcgagcttaaagtgctgaaacgcgcagaaggcgatggcgaaggcttcatcgttattgatgacctggtggataccggtggtgcggttgcgattcgtgaaatgtatccaaaagcgcactttg tcaccatcttcgcaaaaccggctggtcgtccgctggttgatgactatgttgttgatatcccgcaagatacctggattgaacagccgtgggatatgggcgtcgtattcgtcccgccaatctccggtcgctaatcttttcaacgcctggcactgccgggcgttgttctttttaacttcaggcgggttacaatagtttcca gtaagtattctggaggctgcatccatgacacaggcaaacctgagcgaaaccctgttcaaaccccgctttaaacatcctgaaacctcgacgctagtccgccgctttaatcacggcgcacaaccgcctgtgcagtcggcccttgatggtaaaaccatccctcactggtatcgcatgattaaccgtctgatgtggatctggcg cggcattgacccacgcgaaatcctcgacgtccaggcacgtattgtgatgagcgatgccgaacgtaccgacgatgatttatacgatacggtgattggctaccgtggcggcaactggatttatgagtgggccccggatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctc taaggtaaatataaaatttttaacccggatctttgtgaaggaacctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtgga atgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactctgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctg cactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaaccttttaaagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatcataatcagccataccacattt gtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttgggctgcaggaattaattcgagctcgcccgaca (SEQ ID NO: 8)

Данные в отношении ингибирующей активности иллюстративных соединений по настоящему изобретению из двух анализов, описанных выше (например, анализ ингибирования АТФазы BRM; и анализ ингибирования АТФазы BRG1), представлены в следующей таблице 1.Data on the inhibitory activity of exemplary compounds of the present invention from the two assays described above (e.g., BRM ATPase inhibition assay; and BRG1 ATPase inhibition assay) are presented in the following Table 1.

Таблица 1.Table 1.

№ примераExample No. IC₅₀ BRM (мкМ)IC ₅₀ BRM (µM) IC₅₀ BRG1 (мкМ)IC ₅₀ BRG1 (µM) 11 0,0050.005 0,0060.006 22 0,0330.033 0,030.03 33 0,0100.010 0,0100.010 44 <0,005<0.005 <0,005<0.005 55 <0,005<0.005 <0,005<0.005 66 <0,005<0.005 <0,005<0.005 77 <0,005<0.005 <0,005<0.005 88 0,090.09 0,0190.019

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

<110> NOVARTIS AG<110> NOVARTIS AG

<120> СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МОЧЕВИНЫ И КОМПОЗИЦИИ НА ИХ ОСНОВЕ В КАЧЕСТВЕ<120> UREA-BASED COMPOUNDS AND COMPOSITIONS BASED ON THEM AS

ИНГИБИТОРОВ АТФАЗЫ SMARCA2/BRM ATPASE INHIBITORS SMARCA2/BRM

<130> PAT057524-US-PSP<130> PAT057524-US-PSP

<140><140>

<141><141>

<160> 8<160> 8

<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая 10xHis метка<223> Artificial sequence description: Synthetic 10xHis label

<400> 1<400> 1

His His His His His His His His His HisHis His His His His His His His His His His

1. 5 101.5 10

<210> 2<210> 2

<211> 30<211> 30

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер<223> Artificial sequence description: Synthetic primer

<400> 2<400> 2

gaccgaacta gtatggcttc tcaccaccat 30gaccgaacta gtatggcttc tcaccaccat 30

<210> 3<210> 3

<211> 30<211> 30

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер<223> Artificial sequence description: Synthetic primer

<400> 3<400> 3

agcgttaagc ttttaatcct cgatggcgcg 30agcgttaagc ttttaatcct cgatggcgcg 30

<210> 4<210> 4

<211> 852<211> 852

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид<223> Artificial sequence description: Synthetic polypeptide

<400> 4<400> 4

Met Ala Ser His His His His His His His His His His Ala Gln HisMet Ala Ser His His His His His His His His His His Ala Gln His

1. 5 10 151.5 10 15

Asp Glu Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala PheAsp Glu Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe

20 25 3020 25 30

Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn AlaTyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala

35 40 4535 40 45

Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu LeuPhe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu

50 55 6050 55 60

Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp AsnAla Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn

65 70 75 8065 70 75 80

Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His LeuLys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu

85 90 9585 90 95

Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu LysPro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys

100 105 110100 105 110

Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys LeuAsp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu

115 120 125115 120 125

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Asn Gly Gly Gly Gly SerAsn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Asn Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Glu Glu SerGly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Glu Glu Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Asp Ser Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Ser Arg GlnAsp Ser Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Ser Arg Gln

165 170 175165 170 175

Glu Thr Glu Glu Lys Ile Leu Leu Asp Pro Asn Ser Glu Glu Val SerGlu Thr Glu Glu Lys Ile Leu Leu Asp Pro Asn Ser Glu Glu Val Ser

180 185 190180 185 190

Glu Lys Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Ala Lys Gln Asp Val AspGlu Lys Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Ala Lys Gln Asp Val Asp

195 200 205195 200 205

Asp Glu Tyr Ser Met Gln Tyr Ser Ala Arg Gly Ser Gln Ser Tyr TyrAsp Glu Tyr Ser Met Gln Tyr Ser Ala Arg Gly Ser Gln Ser Tyr Tyr

210 215 220210 215 220

Thr Val Ala His Ala Ile Ser Glu Arg Val Glu Lys Gln Ser Ala LeuThr Val Ala His Ala Ile Ser Glu Arg Val Glu Lys Gln Ser Ala Leu

225 230 235 240225 230 235 240

Leu Ile Asn Gly Thr Leu Lys His Tyr Gln Leu Gln Gly Leu Glu TrpLeu Ile Asn Gly Thr Leu Lys His Tyr Gln Leu Gln Gly Leu Glu Trp

245 250 255245 250 255

Met Val Ser Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp GluMet Val Ser Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu

260 265 270260 265 270

Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Ile Thr Tyr LeuMet Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Ile Thr Tyr Leu

275 280 285275 280 285

Met Glu His Lys Arg Leu Asn Gly Pro Tyr Leu Ile Ile Val Pro LeuMet Glu His Lys Arg Leu Asn Gly Pro Tyr Leu Ile Ile Val Pro Leu

290 295 300290 295 300

Ser Thr Leu Ser Asn Trp Thr Tyr Glu Phe Asp Lys Trp Ala Pro SerSer Thr Leu Ser Asn Trp Thr Tyr Glu Phe Asp Lys Trp Ala Pro Ser

305 310 315 320305 310 315 320

Val Val Lys Ile Ser Tyr Lys Gly Thr Pro Ala Met Arg Arg Ser LeuVal Val Lys Ile Ser Tyr Lys Gly Thr Pro Ala Met Arg Arg Ser Leu

325 330 335325 330 335

Val Pro Gln Leu Arg Ser Gly Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr TyrVal Pro Gln Leu Arg Ser Gly Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr

340 345 350340 345 350

Glu Tyr Ile Ile Lys Asp Lys His Ile Leu Ala Lys Ile Arg Trp LysGlu Tyr Ile Ile Lys Asp Lys His Ile Leu Ala Lys Ile Arg Trp Lys

355 360 365355 360 365

Tyr Met Ile Val Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys LysTyr Met Ile Val Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys

370 375 380370 375 380

Leu Thr Gln Val Leu Asn Thr His Tyr Val Ala Pro Arg Arg Ile LeuLeu Thr Gln Val Leu Asn Thr His Tyr Val Ala Pro Arg Arg Ile Leu

385 390 395 400385 390 395 400

Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala LeuLeu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu

405 410 415405 410 415

Leu Asn Phe Leu Leu Pro Thr Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe GluLeu Asn Phe Leu Leu Pro Thr Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe Glu

420 425 430420 425 430

Gln Trp Phe Asn Ala Pro Phe Ala Met Thr Gly Glu Arg Val Asp LeuGln Trp Phe Asn Ala Pro Phe Ala Met Thr Gly Glu Arg Val Asp Leu

435 440 445435 440 445

Asn Glu Glu Glu Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val LeuAsn Glu Glu Glu Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu

450 455 460450 455 460

Arg Pro Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ser Gln LeuArg Pro Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ser Gln Leu

465 470 475 480465 470 475 480

Pro Glu Lys Val Glu Tyr Val Ile Lys Cys Asp Met Ser Ala Leu GlnPro Glu Lys Val Glu Tyr Val Ile Lys Cys Asp Met Ser Ala Leu Gln

485 490 495485 490 495

Lys Ile Leu Tyr Arg His Met Gln Ala Lys Gly Ile Leu Leu Thr AspLys Ile Leu Tyr Arg His Met Gln Ala Lys Gly Ile Leu Leu Thr Asp

500 505 510500 505 510

Gly Ser Glu Lys Asp Lys Lys Gly Lys Gly Gly Ala Lys Thr Leu MetGly Ser Glu Lys Asp Lys Lys Gly Lys Gly Gly Ala Lys Thr Leu Met

515 520 525515 520 525

Asn Thr Ile Met Gln Leu Arg Lys Ile Cys Asn His Pro Tyr Met PheAsn Thr Ile Met Gln Leu Arg Lys Ile Cys Asn His Pro Tyr Met Phe

530 535 540530 535 540

Gln His Ile Glu Glu Ser Phe Ala Glu His Leu Gly Tyr Ser Asn GlyGln His Ile Glu Glu Ser Phe Ala Glu His Leu Gly Tyr Ser Asn Gly

545 550 555 560545 550 555 560

Val Ile Asn Gly Ala Glu Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Lys Phe Glu LeuVal Ile Asn Gly Ala Glu Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Lys Phe Glu Leu

565 570 575565 570 575

Leu Asp Arg Ile Leu Pro Lys Leu Arg Ala Thr Asn His Arg Val LeuLeu Asp Arg Ile Leu Pro Lys Leu Arg Ala Thr Asn His Arg Val Leu

580 585 590580 585 590

Leu Phe Cys Gln Met Thr Ser Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr PheLeu Phe Cys Gln Met Thr Ser Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr Phe

595 600 605595 600 605

Ala Phe Arg Asn Phe Leu Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Thr Lys SerAla Phe Arg Asn Phe Leu Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Thr Lys Ser

610 615 620610 615 620

Glu Asp Arg Ala Ala Leu Leu Lys Lys Phe Asn Glu Pro Gly Ser GlnGlu Asp Arg Ala Ala Leu Leu Lys Lys Phe Asn Glu Pro Gly Ser Gln

625 630 635 640625 630 635 640

Tyr Phe Ile Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu AsnTyr Phe Ile Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn

645 650 655645 650 655

Leu Gln Ala Ala Asp Thr Val Val Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn ProLeu Gln Ala Ala Asp Thr Val Val Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro

660 665 670660 665 670

His Gln Asp Leu Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln GlnHis Gln Asp Leu Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Gln

675 680 685675 680 685

Asn Glu Val Arg Val Leu Arg Leu Cys Thr Val Asn Ser Val Glu GluAsn Glu Val Arg Val Leu Arg Leu Cys Thr Val Asn Ser Val Glu Glu

690 695 700690 695 700

Lys Ile Leu Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Leu Asn Val Asp Gln Lys ValLys Ile Leu Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Leu Asn Val Asp Gln Lys Val

705 710 715 720705 710 715 720

Ile Gln Ala Gly Met Phe Asp Gln Lys Ser Ser Ser His Glu Arg ArgIle Gln Ala Gly Met Phe Asp Gln Lys Ser Ser Ser His Glu Arg Arg

725 730 735725 730 735

Ala Phe Leu Gln Ala Ile Leu Glu His Glu Glu Glu Asn Glu Glu GluAla Phe Leu Gln Ala Ile Leu Glu His Glu Glu Glu Asn Glu Glu Glu

740 745 750740 745 750

Asp Glu Val Pro Asp Asp Glu Thr Leu Asn Gln Met Ile Ala Arg ArgAsp Glu Val Pro Asp Asp Glu Thr Leu Asn Gln Met Ile Ala Arg Arg

755 760 765755 760 765

Glu Glu Glu Phe Asp Leu Phe Met Arg Met Asp Met Asp Arg Arg ArgGlu Glu Glu Phe Asp Leu Phe Met Arg Met Asp Met Asp Arg Arg Arg

770 775 780770 775 780

Glu Asp Ala Arg Asn Pro Lys Arg Lys Pro Arg Leu Met Glu Glu AspGlu Asp Ala Arg Asn Pro Lys Arg Lys Pro Arg Leu Met Glu Glu Asp

785 790 795 800785 790 795 800

Glu Leu Pro Trp Ile Ile Lys Asp Asp Ala Glu Val Glu Arg Leu ThrGlu Leu Pro Trp Ile Ile Lys Asp Asp Ala Glu Val Glu Arg Leu Thr

805 810 815805 810 815

Cys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Ile Phe Gly Arg Gly Ser Arg Gln ArgCys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Ile Phe Gly Arg Gly Ser Arg Gln Arg

820 825 830820 825 830

Arg Asp Val Asp Tyr Ser Asp Ala Leu Thr Glu Lys Gln Trp Leu ArgArg Asp Val Asp Tyr Ser Asp Ala Leu Thr Glu Lys Gln Trp Leu Arg

835 840 845835 840 845

Ala Ile Glu AspAla Ile Glu Asp

850850

<210> 5<210> 5

<211> 77<211> 77

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер<223> Artificial sequence description: Synthetic primer

<400> 5<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatgg aagaaagtgg 60ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatgg aagaaagtgg 60

ctcagaagaa gaggaag 77ctcagaagaa gaggaag 77

<210> 6<210> 6

<211> 76<211> 76

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер<223> Artificial sequence description: Synthetic primer

<400> 6<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcagtgatga tgatgatgat gctcctcgat 60ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcagtgatga tgatgatgat gctcctcgat 60

ggccttgagc cactgc 76ggccttgagc cactgc 76

<210> 7<210> 7

<211> 711<211> 711

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид<223> Artificial sequence description: Synthetic polypeptide

<400> 7<400> 7

Met Glu Glu Ser Gly Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu GluMet Glu Glu Ser Gly Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

1. 5 10 151.5 10 15

Gln Pro Gln Ala Ala Gln Pro Pro Thr Leu Pro Val Glu Glu Lys LysGln Pro Gln Ala Ala Gln Pro Pro Thr Leu Pro Val Glu Glu Lys Lys

20 25 3020 25 30

Lys Ile Pro Asp Pro Asp Ser Asp Asp Val Ser Glu Val Asp Ala ArgLys Ile Pro Asp Pro Asp Ser Asp Asp Val Ser Glu Val Asp Ala Arg

35 40 4535 40 45

His Ile Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Val Asp Asp Glu Tyr Gly ValHis Ile Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Val Asp Asp Glu Tyr Gly Val

50 55 6050 55 60

Ser Gln Ala Leu Ala Arg Gly Leu Gln Ser Tyr Tyr Ala Val Ala HisSer Gln Ala Leu Ala Arg Gly Leu Gln Ser Tyr Tyr Ala Val Ala His

65 70 75 8065 70 75 80

Ala Val Thr Glu Arg Val Asp Lys Gln Ser Ala Leu Met Val Asn GlyAla Val Thr Glu Arg Val Asp Lys Gln Ser Ala Leu Met Val Asn Gly

85 90 9585 90 95

Val Leu Lys Gln Tyr Gln Ile Lys Gly Leu Glu Trp Leu Val Ser LeuVal Leu Lys Gln Tyr Gln Ile Lys Gly Leu Glu Trp Leu Val Ser Leu

100 105 110100 105 110

Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu GlyTyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly

115 120 125115 120 125

Lys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Ile Thr Tyr Leu Met Glu His LysLys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Ile Thr Tyr Leu Met Glu His Lys

130 135 140130 135 140

Arg Ile Asn Gly Pro Phe Leu Ile Ile Val Pro Leu Ser Thr Leu SerArg Ile Asn Gly Pro Phe Leu Ile Ile Val Pro Leu Ser Thr Leu Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Asn Trp Ala Tyr Glu Phe Asp Lys Trp Ala Pro Ser Val Val Lys ValAsn Trp Ala Tyr Glu Phe Asp Lys Trp Ala Pro Ser Val Val Lys Val

165 170 175165 170 175

Ser Tyr Lys Gly Ser Pro Ala Ala Arg Arg Ala Phe Val Pro Gln LeuSer Tyr Lys Gly Ser Pro Ala Ala Arg Arg Ala Phe Val Pro Gln Leu

180 185 190180 185 190

Arg Ser Gly Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr Glu Tyr Ile IleArg Ser Gly Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr Glu Tyr Ile Ile

195 200 205195 200 205

Lys Asp Lys His Ile Leu Ala Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Met Ile ValLys Asp Lys His Ile Leu Ala Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Met Ile Val

210 215 220210 215 220

Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys Leu Thr Gln ValAsp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys Leu Thr Gln Val

225 230 235 240225 230 235 240

Leu Asn Thr His Tyr Val Ala Pro Arg Arg Leu Leu Leu Thr Gly ThrLeu Asn Thr His Tyr Val Ala Pro Arg Arg Leu Leu Leu Thr Gly Thr

245 250 255245 250 255

Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn Phe LeuPro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn Phe Leu

260 265 270260 265 270

Leu Pro Thr Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe Glu Gln Trp Phe AsnLeu Pro Thr Ile Phe Lys Ser Cys Ser Thr Phe Glu Gln Trp Phe Asn

275 280 285275 280 285

Ala Pro Phe Ala Met Thr Gly Glu Lys Val Asp Leu Asn Glu Glu GluAla Pro Phe Ala Met Thr Gly Glu Lys Val Asp Leu Asn Glu Glu Glu

290 295 300290 295 300

Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu Arg Pro Phe LeuThr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu Arg Pro Phe Leu

305 310 315 320305 310 315 320

Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ala Gln Leu Pro Glu Lys ValLeu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ala Gln Leu Pro Glu Lys Val

325 330 335325 330 335

Glu Tyr Val Ile Lys Cys Asp Met Ser Ala Leu Gln Arg Val Leu TyrGlu Tyr Val Ile Lys Cys Asp Met Ser Ala Leu Gln Arg Val Leu Tyr

340 345 350340 345 350

Arg His Met Gln Ala Lys Gly Val Leu Leu Thr Asp Gly Ser Glu LysArg His Met Gln Ala Lys Gly Val Leu Leu Thr Asp Gly Ser Glu Lys

355 360 365355 360 365

Asp Lys Lys Gly Lys Gly Gly Thr Lys Thr Leu Met Asn Thr Ile MetAsp Lys Lys Gly Lys Gly Gly Thr Lys Thr Leu Met Asn Thr Ile Met

370 375 380370 375 380

Gln Leu Arg Lys Ile Cys Asn His Pro Tyr Met Phe Gln His Ile GluGln Leu Arg Lys Ile Cys Asn His Pro Tyr Met Phe Gln His Ile Glu

385 390 395 400385 390 395 400

Glu Ser Phe Ser Glu His Leu Gly Phe Thr Gly Gly Ile Val Gln GlyGlu Ser Phe Ser Glu His Leu Gly Phe Thr Gly Gly Ile Val Glyn Gly

405 410 415405 410 415

Leu Asp Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Lys Phe Glu Leu Leu Asp Arg IleLeu Asp Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Lys Phe Glu Leu Leu Asp Arg Ile

420 425 430420 425 430

Leu Pro Lys Leu Arg Ala Thr Asn His Lys Val Leu Leu Phe Cys GlnLeu Pro Lys Leu Arg Ala Thr Asn His Lys Val Leu Leu Phe Cys Gln

435 440 445435 440 445

Met Thr Ser Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr Phe Ala Tyr Arg GlyMet Thr Ser Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr Phe Ala Tyr Arg Gly

450 455 460450 455 460

Phe Lys Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Thr Lys Ala Glu Asp Arg GlyPhe Lys Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Thr Lys Ala Glu Asp Arg Gly

465 470 475 480465 470 475 480

Met Leu Leu Lys Thr Phe Asn Glu Pro Gly Ser Glu Tyr Phe Ile PheMet Leu Leu Lys Thr Phe Asn Glu Pro Gly Ser Glu Tyr Phe Ile Phe

485 490 495485 490 495

Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Ser AlaLeu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Ser Ala

500 505 510500 505 510

Asp Thr Val Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro His Gln Asp LeuAsp Thr Val Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro His Gln Asp Leu

515 520 525515 520 525

Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Gln Asn Glu Val ArgGln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Gln Asn Glu Val Arg

530 535 540530 535 540

Val Leu Arg Leu Cys Thr Val Asn Ser Val Glu Glu Lys Ile Leu AlaVal Leu Arg Leu Cys Thr Val Asn Ser Val Glu Glu Lys Ile Leu Ala

545 550 555 560545 550 555 560

Ala Ala Lys Tyr Lys Leu Asn Val Asp Gln Lys Val Ile Gln Ala GlyAla Ala Lys Tyr Lys Leu Asn Val Asp Gln Lys Val Ile Gln Ala Gly

565 570 575565 570 575

Met Phe Asp Gln Lys Ser Ser Ser His Glu Arg Arg Ala Phe Leu GlnMet Phe Asp Gln Lys Ser Ser Ser His Glu Arg Arg Ala Phe Leu Gln

580 585 590580 585 590

Ala Ile Leu Glu His Glu Glu Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Val ProAla Ile Leu Glu His Glu Glu Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Val Pro

595 600 605595 600 605

Asp Asp Glu Thr Val Asn Gln Met Ile Ala Arg His Glu Glu Glu PheAsp Asp Glu Thr Val Asn Gln Met Ile Ala Arg His Glu Glu Glu Phe

610 615 620610 615 620

Asp Leu Phe Met Arg Met Asp Leu Asp Arg Arg Arg Glu Glu Ala ArgAsp Leu Phe Met Arg Met Asp Leu Asp Arg Arg Arg Glu Glu Ala Arg

625 630 635 640625 630 635 640

Asn Pro Lys Arg Lys Pro Arg Leu Met Glu Glu Asp Glu Leu Pro SerAsn Pro Lys Arg Lys Pro Arg Leu Met Glu Glu Asp Glu Leu Pro Ser

645 650 655645 650 655

Trp Ile Ile Lys Asp Asp Ala Glu Val Glu Arg Leu Thr Cys Glu GluTrp Ile Ile Lys Asp Asp Ala Glu Val Glu Arg Leu Thr Cys Glu Glu

660 665 670660 665 670

Glu Glu Glu Lys Met Phe Gly Arg Gly Ser Arg His Arg Lys Glu ValGlu Glu Glu Lys Met Phe Gly Arg Gly Ser Arg His Arg Lys Glu Val

675 680 685675 680 685

Asp Tyr Ser Asp Ser Leu Thr Glu Lys Gln Trp Leu Lys Ala Ile GluAsp Tyr Ser Asp Ser Leu Thr Glu Lys Gln Trp Leu Lys Ala Ile Glu

690 695 700690 695 700

Glu His His His His His HisGlu His His His His His His His

705 710705 710

<210> 8<210> 8

<211> 12150<211> 12150

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид<223> Artificial sequence description: Synthetic polynucleotide

<400> 8<400> 8

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 60ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 60

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 120tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 120

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 180cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 180

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 240ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 240

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 300gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 300

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 360360

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 420catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 420

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 480tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 480

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 540ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 540

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat 600cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat 600

cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag 660cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag 660

cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag 720cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag 720

taccgcctat agagtctata ggcccacccc cttggcttct tatgcgacgg atcgatcccg 780taccgcctat agagtctata ggcccacccc cttggcttct tatgcgacgg atcgatcccg 780

taataagctt cgaggtccgc ggccggccgc gttgacgcgc acggcaagag gcgaggggcg 840taataagctt cgaggtccgc ggccggccgc gttgacgcgc acggcaagag gcgaggggcg 840

gcgactggtg agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa ttagatcgat 900gcgactggtg agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa ttagatcgat 900

gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat 960gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat 960

gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag 1020gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag 1020

gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta 1080gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta 1080

gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag 1140gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag 1140

acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag aaaaaagcac 1200acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag aaaaaagcac 1200

agcaagcagc agctgacaca ggacacagca atcaggtcag ccaaaattac cctatagtgc 1260agcaagcagc agctgacaca ggacacagca atcaggtcag ccaaaattac cctatagtgc 1260

agaacatcca ggggcaaatg gtacatcagg ccatatcacc tagaacttta aatgcatggg 1320agaacatcca ggggcaaatg gtacatcagg ccatatcacc tagaacttta aatgcatggg 1320

taaaagtagt agaagagaag gctttcagcc cagaagtgat acccatgttt tcagcattat 1380taaaagtagt agaagagaag gctttcagcc cagaagtgat acccatgttt tcagcattat 1380

cagaaggagc caccccacaa gatttaaaca ccatgctaaa cacagtgggg ggacatcaag 1440cagaaggagc caccccacaa gatttaaaca ccatgctaaa cacagtgggg ggacatcaag 1440

cagccatgca aatgttaaaa gagaccatca atgaggaagc tgcagaatgg gatagagtgc 1500cagccatgca aatgttaaaa gagaccatca atgaggaagc tgcagaatgg gatagagtgc 1500

atccagtgca tgcagggcct attgcaccag gccagatgag agaaccaagg ggaagtgaca 1560atccagtgca tgcagggcct attgcaccag gccagatgag agaaccaagg ggaagtgaca 1560

tagcaggaac tactagtacc cttcaggaac aaataggatg gatgacacat aatccaccta 1620tagcaggaac tactagtacc cttcaggaac aaataggatg gatgacacat aatccaccta 1620

tcccagtagg agaaatctat aaaagatgga taatcctggg attaaataaa atagtaagaa 1680tcccagtagg agaaatctat aaaagatgga taatcctggg attaaataaa atagtaagaa 1680

tgtatagccc taccagcatt ctggacataa gacaaggacc aaaggaaccc tttagagact 1740tgtatagccc taccagcatt ctggacataa gacaaggacc aaaggaaccc tttagagact 1740

atgtagaccg attctataaa actctaagag ccgagcaagc ttcacaagag gtaaaaaatt 1800atgtagaccg attctataaa actctaagag ccgagcaagc ttcacaagag gtaaaaaatt 1800

ggatgacaga aaccttgttg gtccaaaatg cgaacccaga ttgtaagact attttaaaag 1860ggatgacaga aaccttgttg gtccaaaatg cgaacccaga ttgtaagact attttaaaag 1860

cattgggacc aggagcgaca ctagaagaaa tgatgacagc atgtcaggga gtggggggac 1920cattgggacc aggagcgaca ctagaagaaa tgatgacagc atgtcaggga gtggggggac 1920

ccggccataa agcaagagtt ttggctgaag caatgagcca agtaacaaat ccagctacca 1980ccggccataa agcaagagtt ttggctgaag caatgagcca agtaacaaat ccagctacca 1980

taatgataca gaaaggcaat tttaggaacc aaagaaagac tgttaagtgt ttcaattgtg 2040taatgataca gaaaggcaat tttaggaacc aaagaaagac tgttaagtgt ttcaattgtg 2040

gcaaagaagg gcacatagcc aaaaattgca gggcccctag gaaaaagggc tgttggaaat 2100gcaaagaagg gcacatagcc aaaaattgca gggcccctag gaaaaagggc tgttggaaat 2100

gtggaaagga aggacaccaa atgaaagatt gtactgagag acaggctaat tttttaggga 2160gtggaaagga aggacaccaa atgaaagatt gtactgagag acaggctaat tttttaggga 2160

agatctggcc ttcccacaag ggaaggccag ggaattttct tcagagcaga ccagagccaa 2220agatctggcc ttcccacaag ggaaggccag ggaattttct tcagagcaga ccagagccaa 2220

cagccccacc agaagagagc ttcaggtttg gggaagagac aacaactccc tctcagaagc 2280cagccccacc agaagagagc ttcaggtttg gggaagagac aacaactccc tctcagaagc 2280

aggagccgat agacaaggaa ctgtatcctt tagcttccct cagatcactc tttggcagcg 2340aggagccgat agacaaggaa ctgtatcctt tagcttccct cagatcactc tttggcagcg 2340

acccctcgtc acaataaaga taggggggca attaaaggaa gctctattag atacaggagc 2400acccctcgtc acaataaaga taggggggca attaaaggaa gctctattag atacaggagc 2400

agatgataca gtattagaag aaatgaattt gccaggaaga tggaaaccaa aaatgatagg 2460agatgataca gtattagaag aaatgaattt gccaggaaga tggaaaccaa aaatgatagg 2460

gggaattgga ggttttatca aagtaagaca gtatgatcag atactcatag aaatctgcgg 2520gggaattgga ggttttatca aagtaagaca gtatgatcag atactcatag aaatctgcgg 2520

acataaagct ataggtacag tattagtagg acctacacct gtcaacataa ttggaagaaa 2580acataaagct ataggtacag tattagtagg acctacacct gtcaacataa ttggaagaaa 2580

tctgttgact cagattggct gcactttaaa ttttcccatt agtcctattg agactgtacc 2640tctgttgact cagattggct gcactttaaa ttttcccatt agtcctattg agactgtacc 2640

agtaaaatta aagccaggaa tggatggccc aaaagttaaa caatggccat tgacagaaga 27002700

aaaaataaaa gcattagtag aaatttgtac agaaatggaa aaggaaggaa aaatttcaaa 2760aaaaataaaa gcattagtag aaatttgtac agaaatggaa aaggaaggaa aaatttcaaa 2760

aattgggcct gaaaatccat acaatactcc agtatttgcc ataaagaaaa aagacagtac 2820aattgggcct gaaaatccat acaatactcc agtatttgcc ataaagaaaa aagacagtac 2820

taaatggaga aaattagtag atttcagaga acttaataag agaactcaag atttctggga 2880taaatggaga aaattagtag atttcagaga acttaataag agaactcaag atttctggga 2880

agttcaatta ggaataccac atcctgcagg gttaaaacag aaaaaatcag taacagtact 2940agttcaatta ggaataccac atcctgcagg gttaaaacag aaaaaatcag taacagtact 2940

ggatgtgggc gatgcatatt tttcagttcc cttagataaa gacttcagga agtatactgc 3000ggatgtgggc gatgcatatt tttcagttcc cttagataaa gacttcagga agtatactgc 3000

atttaccata cctagtataa acaatgagac accagggatt agatatcagt acaatgtgct 3060attaccata cctagtataa acaatgagac accagggatt agatatcagt acaatgtgct 3060

tccacaggga tggaaaggat caccagcaat attccagtgt agcatgacaa aaatcttaga 3120tccacaggga tggaaaggat caccagcaat attccagtgt agcatgacaa aaatcttaga 3120

gccttttaga aaacaaaatc cagacatagt catctatcaa tacatggatg atttgtatgt 3180gccttttaga aaacaaaatc cagacatagt catctatcaa tacatggatg atttgtatgt 3180

aggatctgac ttagaaatag ggcagcatag aacaaaaata gaggaactga gacaacatct 3240aggatctgac ttagaaatag ggcagcatag aacaaaaata gaggaactga gacaacatct 3240

gttgaggtgg ggatttacca caccagacaa aaaacatcag aaagaacctc cattcctttg 3300gttgaggtgg ggatttacca caccagacaa aaaacatcag aaagaacctc cattcctttg 3300

gatgggttat gaactccatc ctgataaatg gacagtacag cctatagtgc tgccagaaaa 3360gatgggttat gaactccatc ctgataaatg gacagtacag cctatagtgc tgccagaaaa 3360

ggacagctgg actgtcaatg acatacagaa attagtggga aaattgaatt gggcaagtca 3420ggacagctgg actgtcaatg acatacagaa attagtggga aaattgaatt gggcaagtca 3420

gatttatgca gggattaaag taaggcaatt atgtaaactt cttaggggaa ccaaagcact 3480gatttatgca gggattaaag taaggcaatt atgtaaactt cttaggggaa ccaaagcact 3480

aacagaagta gtaccactaa cagaagaagc agagctagaa ctggcagaaa acagggagat 3540aacagaagta gtaccactaa cagaagaagc agagctagaa ctggcagaaa acagggagat 3540

tctaaaagaa ccggtacatg gagtgtatta tgacccatca aaagacttaa tagcagaaat 3600tctaaaagaa ccggtacatg gagtgtatta tgacccatca aaagacttaa tagcagaaat 3600

acagaagcag gggcaaggcc aatggacata tcaaatttat caagagccat ttaaaaatct 3660acagaagcag gggcaaggcc aatggacata tcaaatttat caagagccat ttaaaaatct 3660

gaaaacagga aagtatgcaa gaatgaaggg tgcccacact aatgatgtga aacaattaac 3720gaaaacagga aagtatgcaa gaatgaaggg tgcccacact aatgatgtga aacaattaac 3720

agaggcagta caaaaaatag ccacagaaag catagtaata tggggaaaga ctcctaaatt 3780agaggcagta caaaaaatag ccacagaaag catagtaata tggggaaaga ctcctaaatt 3780

taaattaccc atacaaaagg aaacatggga agcatggtgg acagagtatt ggcaagccac 38403840

ctggattcct gagtgggagt ttgtcaatac ccctccctta gtgaagttat ggtaccagtt 3900ctggattcct gagtgggagt ttgtcaatac ccctccctta gtgaagttat ggtaccagtt 3900

agagaaagaa cccataatag gagcagaaac tttctatgta gatggggcag ccaataggga 3960agagaaagaa cccataatag gagcagaaac tttctatgta gatggggcag ccaataggga 3960

aactaaatta ggaaaagcag gatatgtaac tgacagagga agacaaaaag ttgtccccct 4020aactaaatta ggaaaagcag gatatgtaac tgacagagga agacaaaaag ttgtccccct 4020

aacggacaca acaaatcaga agactgagtt acaagcaatt catctagctt tgcaggattc 4080aacggacaca acaaatcaga agactgagtt acaagcaatt catctagctt tgcaggattc 4080

gggattagaa gtaaacatag tgacagactc acaatatgca ttgggaatca ttcaagcaca 4140gggattagaa gtaaacatag tgacagactc acaatatgca ttgggaatca ttcaagcaca 4140

accagataag agtgaatcag agttagtcag tcaaataata gagcagttaa taaaaaagga 4200accagataag agtgaatcag agttagtcag tcaaataata gagcagttaa taaaaaagga 4200

aaaagtctac ctggcatggg taccagcaca caaaggaatt ggaggaaatg aacaagtaga 4260aaaagtctac ctggcatggg taccagcaca caaaggaatt ggaggaaatg aacaagtaga 4260

taaattggtc agtgctggaa tcaggaaagt actattttta gatggaatag ataaggccca 43204320

agaagaacat gagaaatatc acagtaattg gagagcaatg gctagtgatt ttaacctacc 4380agaagaacat gagaaatatc acagtaattg gagagcaatg gctagtgatt ttaacctacc 4380

acctgtagta gcaaaagaaa tagtagccag ctgtgataaa tgtcagctaa aaggggaagc 4440acctgtagta gcaaaagaaa tagtagccag ctgtgataaa tgtcagctaa aaggggaagc 4440

catgcatgga caagtagact gtagcccagg aatatggcag ctagattgta cacatttaga 4500catgcatgga caagtagact gtagcccagg aatatggcag ctagattgta cacatttaga 4500

aggaaaagtt atcttggtag cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat 4560aggaaaagtt atcttggtag cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat 4560

tccagcagag acagggcaag aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc 4620tccagcagag acagggcaag aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc 4620

agtaaaaaca gtacatacag acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc 4680agtaaaaaca gtacatacag acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc 4680

ctgttggtgg gcggggatca agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg 4740ctgttggtgg gcggggatca agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg 4740

agtaatagaa tctatgaata aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc 4800agtaatagaa tctatgaata aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc 4800

tgaacatctt aagacagcag tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg 4860tgaacatctt aagacagcag tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg 4860

ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca 4920ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca 4920

aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga 49804980

cagcagagat ccagtttgga aaggaccagc aaagctcctc tggaaaggtg aaggggcagt 5040cagcagagat ccagtttgga aaggaccagc aaagctcctc tggaaaggtg aaggggcagt 5040

agtaatacaa gataatagtg acataaaagt agtgccaaga agaaaagcaa agatcatcag 5100agtaatacaa gataatagtg acataaaagt agtgccaaga agaaaagcaa agatcatcag 5100

ggattatgga aaacagatgg caggtgatga ttgtgtggca agtagacagg atgaggatta 5160ggattatgga aaacagatgg caggtgatga ttgtgtggca agtagacagg atgaggatta 5160

acacatggaa ttctgcaaca actgctgttt atccatttca gaattgggtg tcgacatagc 5220acacatggaa ttctgcaaca actgctgttt atccatttca gaattgggtg tcgacatagc 5220

agaataggcg ttactcgaca gaggagagca agaaatggag ccagtagatc ctagactaga 5280agaataggcg ttactcgaca gaggagagca agaaatggag ccagtagatc ctagactaga 5280

gccctggaag catccaggaa gtcagcctaa aactgcttgt accaattgct attgtaaaaa 5340gccctggaag catccaggaa gtcagcctaa aactgcttgt acccaattgct attgtaaaaa 5340

gtgttgcttt cattgccaag tttgtttcat gacaaaagcc ttaggcatct cctatggcag 5400gtgttgcttt cattgccaag tttgtttcat gacaaaagcc ttaggcatct cctatggcag 5400

gaagaagcgg agacagcgac gaagagctca tcagaacagt cagactcatc aagcttctct 5460gaagaagcgg agacagcgac gaagagctca tcagaacagt cagactcatc aagcttctct 5460

atcaaagcag taagtagtac atgtaatgca acctataata gtagcaatag tagcattagt 5520atcaaagcag taagtagtac atgtaatgca acctataata gtagcaatag tagcattagt 5520

agtagcaata ataatagcaa tagttgtgtg gtccatagta atcatagaat ataggaaaat 5580agtagcaata ataatagcaa tagttgtgtg gtccatagta atcatagaat ataggaaaat 5580

ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat 5640ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat 5640

ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa 5700ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa 5700

gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg 5760gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg 5760

gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat 5820gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat 5820

tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc 5880tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc 5880

atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg 5940atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg 5940

aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt 6000aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctggga aaactcattt 6000

gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga 6060gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga 6060

atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact 61206120

ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttggaattag 61806180

ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat 6240ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat 6240

tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta 6300tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta 6300

tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc 6360tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc 6360

cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg tggagagaga gacagagaca 64206420

gatccattcg attagtgaac ggatccttgg cacttatctg ggacgatctg cggagcctgt 6480gatccattcg attagtgaac ggatccttgg cacttatctg ggacgatctg cggagcctgt 6480

gcctcttcag ctaccaccgc ttgagagact tactcttgat tgtaacgagg attgtggaac 6540gcctcttcag ctaccaccgc ttgagagact tactcttgat tgtaacgagg attgtggaac 6540

ttctgggacg cagggggtgg gaagccctca aatattggtg gaatctccta caatattgga 6600ttctggggacg caggggggtgg gaagccctca aatattggtg gaatctccta caatattggga 6600

gtcaggagct aaagaatagt gctgttagct tgctcaatgc cacagccata gcagtagctg 6660gtcaggagct aaagaatagt gctgttagct tgctcaatgc cacagccata gcagtagctg 6660

aggggacaga tagggttata gaagtagtac aaggagcttg tagagctatt cgccacatac 6720aggggacaga tagggttata gaagtagtac aaggagcttg tagagctatt cgccacatac 6720

ctagaagaat aagacagggc ttggaaagga ttttgctata agctcgaggc cgccccggtg 6780ctagaagaat aagacagggc ttggaaagga ttttgctata agctcgaggc cgccccggtg 6780

accttcagac cttggcactg gaggtggccc ggcagaagcg cggcatcgtg gatcagtgct 6840accttcagac cttggcactg gaggtggccc ggcagaagcg cggcatcgtg gatcagtgct 6840

gcaccagcat ctgctctctc taccaactgg agaactactg caactaggcc caccactacc 6900gcaccagcat ctgctctctc taccaactgg agaactactg caactaggcc caccactacc 6900

ctgtccaccc ctctgcaatg aataaaacct ttgaaagagc actacaagtt gtgtgtacat 69606960

gcgtgcatgt gcatatgtgg tgcgggggga acatgagtgg ggctggctgg agtggcgatg 7020gcgtgcatgt gcatatgtgg tgcgggggga acatgagtgg ggctggctgg agtggcgatg 7020

ataagctgtc aaacatgaga attaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 7080ataagctgtc aaacatgaga attaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 7080

ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagtc tagaattaat tccgtgtatt 7140ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagtc tagaattaat tccgtgtatt 7140

ctatagtgtc acctaaatcg tatgtgtatg atacataagg ttatgtatta attgtagccg 7200ctatagtgtc acctaaatcg tatgtgtatg atacataagg ttatgtatta attgtagccg 7200

cgttctaacg acaatatgta caagcctaat tgtgtagcat ctggcttact gaagcagacc 7260cgttctaacg acaatatgta caagcctaat tgtgtagcat ctggcttact gaagcagacc 7260

ctatcatctc tctcgtaaac tgccgtcaga gtcggtttgg ttggacgaac cttctgagtt 7320ctatcatctc tctcgtaaac tgccgtcaga gtcggtttgg ttggacgaac cttctgagtt 7320

tctggtaacg ccgtcccgca cccggaaatg gtcagcgaac caatcagcag ggtcatcgct 7380tctggtaacg ccgtcccgca ccgggaaatg gtcagcgaac caatcagcag ggtcatcgct 7380

agccagatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt 7440agccagatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt 7440

gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca cttcgggctc 7500gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca cttcgggctc 7500

atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg actgttgggc 7560atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg actgttgggc 7560

gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct caacctacta 7620gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct caacctacta 7620

ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaatggt gcactctcag 7680ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaatggt gcactctcag 7680

tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga 7740tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga 7740

cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 7800cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 7800

cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg 7860cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg 7860

cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc 7920cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc 7920

aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 7980aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 7980

ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 8040ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 8040

aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 8100aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 8100

ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 8160ttgccttcct gttttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 8160

gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 8220gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 8220

ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 8280ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 8280

ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 8340ggtattatcc cgtattgacg cggggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 8340

gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 8400gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 8400

aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 8460aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 8460

gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 8520gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 8520

aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 8580aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 8580

caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 8640caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 8640

tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 8700tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 8700

acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 8760acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 8760

gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 8820gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 8820

agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 8880agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 8880

gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 8940gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 8940

ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 9000ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 9000

taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 9060taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 9060

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 9120agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc ttttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 9120

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 9180aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 9180

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 9240ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 9240

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 9300gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 9300

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 9360aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 9360

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 9420aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 9420

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 9480gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 9480

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 9540aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 9540

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 9600aacaggagg cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 9600

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 9660cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 9660

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 9720aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 9720

tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 9780tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 9780

tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 9840tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 9840

ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 9900ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 9900

atgcagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 9960atgcagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 9960

agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 10020agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 10020

tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 10080tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 10080

cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 10140cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 10140

ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 10200ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 10200

cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct tggacacaag 1026010260

acaggcttgc gagatatgtt tgagaatacc actttatccc gcgtcaggga gaggcagtgc 10320acaggcttgc gagatatgtt tgagaatacc actttatccc gcgtcaggga gaggcagtgc 10320

gtaaaaagac gcggactcat gtgaaatact ggtttttagt gcgccagatc tctataatct 10380gtaaaaagac gcggactcat gtgaaatact ggtttttagt gcgccagatc tctataatct 10380

cgcgcaacct attttcccct cgaacacttt ttaagccgta gataaacagg ctgggacact 1044010440

tcacatgagc gaaaaataca tcgtcacctg ggacatgttg cagatccatg cacgtaaact 10500tcacatgagc gaaaaataca tcgtcacctg ggacatgttg cagatccatg cacgtaaact 10500

cgcaagccga ctgatgcctt ctgaacaatg gaaaggcatt attgccgtaa gccgtggcgg 10560cgcaagccga ctgatgcctt ctgaacaatg gaaaggcatt attgccgtaa gccgtggcgg 10560

tctgtaccgg gtgcgttact ggcgcgtgaa ctgggtattc gtcatgtcga taccgtttgt 1062010620 tctgtaccgg gtgcgttact ggcgcgtgaa ctgggtattc

atttccagct acgatcacga caaccagcgc gagcttaaag tgctgaaacg cgcagaaggc 1068010680

gatggcgaag gcttcatcgt tattgatgac ctggtggata ccggtggtac tgcggttgcg 10740gatggcgaag gcttcatcgt tattgatgac ctggtggata ccggtggtac tgcggttgcg 10740

attcgtgaaa tgtatccaaa agcgcacttt gtcaccatct tcgcaaaacc ggctggtcgt 10800attcgtgaaa tgtatccaaa agcgcacttt gtcaccatct tcgcaaaacc ggctggtcgt 10800

ccgctggttg atgactatgt tgttgatatc ccgcaagata cctggattga acagccgtgg 10860ccgctggttg atgactatgt tgttgatatc ccgcaagata cctggattga acagccgtgg 10860

gatatgggcg tcgtattcgt cccgccaatc tccggtcgct aatcttttca acgcctggca 10920gatatgggcg tcgtattcgt cccgccaatc tccggtcgct aatcttttca acgcctggca 10920

ctgccgggcg ttgttctttt taacttcagg cgggttacaa tagtttccag taagtattct 1098010980

ggaggctgca tccatgacac aggcaaacct gagcgaaacc ctgttcaaac cccgctttaa 11040ggaggctgca tccatgacac aggcaaacct gagcgaaacc ctgttcaaac cccgctttaa 11040

acatcctgaa acctcgacgc tagtccgccg ctttaatcac ggcgcacaac cgcctgtgca 11100acatcctgaa acctcgacgc tagtccgccg ctttaatcac ggcgcacaac cgcctgtgca 11100

gtcggccctt gatggtaaaa ccatccctca ctggtatcgc atgattaacc gtctgatgtg 11160gtcggccctt gatggtaaaa ccatccctca ctggtatcgc atgattaacc gtctgatgtg 11160

gatctggcgc ggcattgacc cacgcgaaat cctcgacgtc caggcacgta ttgtgatgag 1122011220

cgatgccgaa cgtaccgacg atgatttata cgatacggtg attggctacc gtggcggcaa 11280cgatgccgaa cgtaccgacg atgatttata cgatacggtg attggctacc gtggcggcaa 11280

ctggatttat gagtgggccc cggatctttg tgaaggaacc ttacttctgt ggtgtgacat 11340ctggatttat gagtgggccc cggatctttg tgaaggaacc ttacttctgt ggtgtgacat 11340

aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa tttttaaccc 11400aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa tttttaaccc 11400

ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag 11460ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag 11460

agatttaaag ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga 11520agatttaaag ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga 11520

ttctaattgt ttgtgtattt tagattccaa cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt 1158011580

ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg 11640aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg 11640

aggctactgc tgactctcaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc 11700aggctactgc tgactctcaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc 11700

ccaaggactt tccttcagaa ttgctaagtt ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa 1176011760

ctcttgcttg ctttgctatt tacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa 1182011820

ttatggaaaa atattctgta acctttataa gtaggcataa cagttataat cataacatac 11880ttatggaaaa atattctgta acctttataa gtaggcataa cagttataat cataacatac 11880

tgttttttct tactccacac aggcatagag tgtctgctat taataactat gctcaaaaat 11940tgttttttct tactccacac aggcatagag tgtctgctat taataactat gctcaaaaat 11940

tgtgtacctt tagcttttta atttgtaaag gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg 12000tgtgtacctt tagcttttta atttgtaaag gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg 12000

ccttgactag agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa 12060ccttgactag agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa 12060

aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttggg 12120aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttggg 12120

ctgcaggaat taattcgagc tcgcccgaca 1215012150

<---<---

Claims (26)

1. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль формулы I1. Compound or pharmaceutically acceptable salt of formula I

где R¹ выбран из водорода, амино и гидрокси-замещенного C_1-2алкила;where R ¹ is selected from hydrogen, amino and hydroxy-substituted C _1-2 alkyl; R² представляет собой водород;R ² is hydrogen; R³ выбран из C_1-2алкила и галоген-замещенного C_1-2алкила;R ³ is selected from C _1-2 alkyl and halo-substituted C _1-2 alkyl; R⁴ представляет собой водород;R ⁴ is hydrogen; R⁵ выбран из водорода и галогена иR ⁵ is selected from hydrogen and halogen and R⁶ выбран из водорода и галогена. R ⁶ is selected from hydrogen and halogen. 2. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1,2. A compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1, где R¹ выбран из водорода, амино и гидроксиметила;where R ¹ is selected from hydrogen, amino and hydroxymethyl; R² представляет собой водород;R ² is hydrogen; R³ выбран из метила, дифторметила и трифторметила;R ³ is selected from methyl, difluoromethyl and trifluoromethyl; R⁴ представляет собой водород;R ⁴ is hydrogen; R⁵ выбран из водорода, хлора и фтора иR ⁵ is selected from hydrogen, chlorine and fluorine and R⁶ выбран из водорода и фтора. R ⁶ is selected from hydrogen and fluorine. 3. Соединение по п. 2 или его фармацевтически приемлемая соль, выбранные из:3. The compound according to claim 2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, selected from:

4. Соединение, имеющее структуру4. A compound having a structure

или его фармацевтически приемлемая соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 5. Фармацевтическая композиция для лечения BRM-опосредованного и/или BRG1-опосредованного нарушения или заболевания, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.5. Pharmaceutical composition for the treatment of BRM-mediated and/or BRG1-mediated disorders or diseases, containing a therapeutically effective amount of a compound according to any one of paragraphs. 1-4 or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and one or more pharmaceutically acceptable carriers. 6. Способ лечения опосредованного BRM и/или опосредованного BRG1 нарушения или заболевания, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемой соли.6. A method for treating a BRM-mediated and/or BRG1-mediated disorder or disease, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound according to any one of paragraphs. 1-4 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 7. Способ по п. 6, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется дефицитом BRG1 и/или дефицитом BRM.7. The method of claim 6 wherein said disorder or disease is a malignant neoplasm characterized by BRG1 deficiency and/or BRM deficiency. 8. Способ по п. 6, где указанное нарушение или заболевание представляет собой злокачественное новообразование, которое характеризуется мутацией BRG1 и/или мутацией BRM.8. The method of claim 6 wherein said disorder or disease is a cancer characterized by a BRG1 mutation and/or a BRM mutation. 9. Способ по п. 8, где указанное нарушение или заболевание представляет собой солидную опухоль, лейкоз или лимфому.9. The method of claim 8, wherein said disorder or disease is a solid tumor, leukemia, or lymphoma. 10. Способ по п. 9, где указанное нарушение или заболевание выбрано из немелкоклеточной карциномы легкого, аденокарциномы легкого, карциномы легкого, видов крупноклеточной карциномы легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы кожи, десмопластической меланомы, увеальной меланомы, мелкоклеточной карциномы яичника (гиперкальциемического типа), рабдоидной опухоли яичника, плоскоклеточной карциномы кожи, глиомы, карциносаркомы матки, карциномы тела матки и эндометрия, серозной цистаденокарциномы яичников, уротелиальной карциномы мочевого пузыря, первичной лимфомы центральной нервной системы, карциномы пищевода, рака мочевого пузыря, плазмацитоидного варианта рака мочевого пузыря, аденокарциномы желудка, аденокистозной карциномы, лимфосаркомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, рака поджелудочной железы, колоректальной аденокарциномы, холангиокарциномы, саркомы, видов рака головы и шеи, видов рака шейки матки и канала шейки матки, медуллобластомы, T-клеточной лимфомы кожи, гепатоцеллюлярной карциномы печени, папиллярной почечно-клеточной карциномы почки, рака молочной железы, лимфомы из клеток мантийной зоны, карциномы желчного пузыря, видов рака половых клеток яичек, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, рака предстательной железы, детской саркомы Юинга, тимомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, непрозрачно-клеточной карциномы почки, феохромоцитомы и параганглиомы, видов рака щитовидной железы, злокачественной опухоли оболочек периферических нервов, нейроэндокринного рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карциномы коры надпочечников, видов рака шейки матки и канала шейки матки, плоскоклеточной карциномы кожи, рака половых клеток яичек, глиобластомы, мультиформной глиобластомы, саркомы Юинга, почечно-клеточной светлоклеточной карциномы почки, нейробластомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, множественной миеломы, злокачественных рабдоидных опухолей, видов эпителиоидной саркомы, семейного шванноматоза, видов медуллярной карциномы почки, синовиальной саркомы и видов менингиомы.10. The method of claim 9, wherein said disorder or disease is selected from non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung carcinoma, types of large cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, squamous cell lung carcinoma, small cell lung cancer, skin melanoma, desmoplastic melanoma, uveal melanoma , small cell carcinoma of the ovary (hypercalcemic type), rhabdoid tumor of the ovary, squamous cell carcinoma of the skin, glioma, carcinosarcoma of the uterus, carcinoma of the body of the uterus and endometrium, serous cystadenocarcinoma of the ovary, urothelial carcinoma of the bladder, primary lymphoma of the central nervous system, carcinoma of the esophagus, bladder cancer, plasmacytoid variant bladder cancer, gastric adenocarcinoma, adenocystic carcinoma, lymphosarcoma, diffuse large B-cell lymphoma, pancreatic cancer, colorectal adenocarcinoma, cholangiocarcinoma, sarcoma, head and neck cancers, cervical and cervical canal cancers, medulloblastoma, T- skin cell lymphoma, hepatocellular carcinoma of the liver, papillary renal cell carcinoma of the kidney, breast cancer, mantle cell lymphoma, gallbladder carcinoma, germ cell cancers of the testis, renal clear cell carcinoma of the kidney, prostate cancer, pediatric Ewing's sarcoma, thymoma, chromophobe renal cell carcinoma, opaque cell carcinoma of the kidney, pheochromocytoma and paraganglioma, thyroid cancers, malignant peripheral nerve sheath tumor, neuroendocrine prostate cancer, head and neck squamous cell carcinoma, adrenal cortex carcinoma, cervical and canal cancers cervix, skin squamous cell carcinoma, testicular germ cell cancer, glioblastoma, glioblastoma multiforme, Ewing's sarcoma, renal clear cell carcinoma of the kidney, neuroblastoma, diffuse large B-cell lymphoma, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, malignant rhabdoid tumors, types of epithelioid sarcoma, familial schwannomatosis, types of medullary carcinoma of the kidney, synovial sarcoma and types of meningioma.